KR20180099903A - 뉴클레오타이드-특이적 삼원 복합체 형성의 향상된 검출을 사용하는 핵산 서열 결정 방법 및 시스템 - Google Patents
뉴클레오타이드-특이적 삼원 복합체 형성의 향상된 검출을 사용하는 핵산 서열 결정 방법 및 시스템 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 DNA 중합 효소, 핵산, 및 프라이밍된 주형 핵산의 주형 염기에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드-특이적 삼원 복합체의 형성을 검출하는 방법 및 시스템에 관한 것이다. 상기 방법 및 시스템은 뉴클레오타이드의 화학적 혼입을 요구하지 않고, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 결정을 용이하게 한다. 이는 유리하게는 신호 대 잡음 비율을 개선하고 결합에 의한 서열 결정 프로토콜에서 획득가능한 결과의 품질을 향상시키고, 판독 길이를 연장할 수 있다. 이러한 결과는 비표지된, 천연 뉴클레오타이드를 사용하는 절차에서도 달성될 수 있다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2016년 4월 22일자 출원된 미국 가출원 제62/326,356호를 우선권 주장한다. 상기 선출원의 전체 개시 내용은 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 생명 공학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 핵산 서열 결정 기술에 관한 것이다.
주형 핵산 가닥의 정확한 서열 결정은 게놈 분석, 분자 진단 등에서 다수의 중요한 적용을 발견한다. 심지어 공지된 위치에서 대안들 중에서 단일 뉴클레오타이드 염기의 식별은 단일 뉴클레오타이드 다형성(즉, "SNP")의 분석에 대한 기초로서 역할을 할 수 있다. 공지된 핵산 서열의 짧은 신전부(stretch)의 검출은 임상 또는 환경적 원인으로부터 박테리아, 곰팡이, 및 바이러스 병원체를 식별하는데 사용되어왔다. 공지된 핵산 서열에서 유전된 또는 획득된 유전적 변이체(예컨대, 변화 또는 돌연변이)의 검출은 또한, 예를 들어 특정 약물에 대한 감수성의 변화와 관련된 중요한 정보를 제공한다. 마지막으로, 게놈 규모의 서열 결정은 하나 이상의 인접한 서열 내로 조립될 수 있는 수백만 개의 뉴클레오타이드의 정확한 식별에 의존한다. 이러한 각각의 경우는 주형 핵산 가닥을 따라 상이한 위치에서 한 번에 하나씩 개별적인 뉴클레오타이드의 정확한 식별에 매우 의존한다.
인간 게놈 프로젝트는 종래의 형광 Sanger 다이디옥시리보뉴클레오타이드(dideoxyribonucleotide) 서열 결정 기법을 사용하여 완전히 완성되었다. 그 이후로, 후속의 기술은 게놈 분석을 일상적인 임상 및 산업 실험실 응용 분야에 접목시키기 위해 폴리뉴클레오타이드 서열 정보를 획득하는 절차를 간소화하였다.
대안의 핵산 서열 결정 플랫폼은 혼성화에 의한 서열 결정 및 합성에 의한 서열 결정(sequencing-by-synthesis)을 포함한다. 첫 번째 경우에, DNA의 검출 가능하게 표지된 가닥은 혼성화 조건하에서 고체 지지체에 고정된 최대 수천 개의 정의된 프로브 서열의 어레이(array)와 접촉된다. 이러한 절차에서 형성된 짧은 이중 가닥(duplex)은 인접한 서열 내로 조립(assembly)을 위해 컴퓨터에 의해 검출 및 분석될 수 있다. 합성에 의한 서열 결정 절차는 다양한 형태로 이루어졌으며 또한 성공적이었다. 표지된 뉴클레오타이드 첨가, 검출, 및 및 화학적 처리의 화학적 자동화 및 개선은 미처리된 서열 정보의 획득을 위한 절차에 혁신을 가져왔다. 일부 경우에, 비교적 짧은 신전부의 핵산 서열만 결정되지만, 대량의 병렬 처리는 게놈 규모에서 핵산 서열을 추론하는데 요구되는 정보를 제공한다.
일반적으로 말하면, 상이한 서열 결정 플랫폼에 걸쳐 개선된 염기 확정(base-calling) 정확도를 가지는 확장된 서열 결정 판독 길이에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은 이러한 필요성을 해결한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 시험 뉴클레오타이드가, 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 바로 하류에 위치하며 주형 가닥의 프라이머 바로 다음의(next) 염기에 상보적인 염기를 포함하는, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드(next correct nucleotide)인지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 프라이밍된 주형 핵산과 DNA 중합 효소를 포함하는 제1 반응 혼합물을 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)로부터 프라이밍된 주형 핵산과 DNA 중합 효소 및 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제2 반응 혼합물을 접촉시키는 단계; (c) 시험 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키지 않고, 각 단계 (a) 및 (b) 동안, 각각 하나 이상의 지점에서, 제1 및 제2 반응 혼합물의 DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 측정하는 단계; 및 (d) 단계 (c)로부터 측정된 결합 결과를 사용하여 시험 뉴클레오타이드가 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드인지 여부를 결정하는 단계. 일반적으로 바람직한 하나의 구체예에 따르면, 시험 뉴클레오타이드는 임의의 첨가된 형광 표지를 포함하지 않는 천연 뉴클레오타이드일 수 있고, 단계 (c)는 시험 뉴클레오타이드에 결합하는 DNA 중합 효소의 결과로서 광학 성질을 변화시키는 입체 구조 감응성 염료로부터 형광 또는 흡광 신호의 차이를 측정하는 것을 포함하지 않는다. 또 다른 일반적으로 바람직한 구체예에 따르면, 제1 반응 혼합물은 시험 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 바람직하게, 상기 방법은 (e) 포스포다이에스터(phosphodiester) 결합을 형성함으로써, 시험 뉴클레오타이드를 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 바람직하게, 상기 방법은 단계 (a) 내지 (e)를 반복하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 단계 (a) 내지 (e)는 50회 이상 반복될 수 있다. 택일적으로, 상기 방법은 (f) 시험 뉴클레오타이드 대신에 제2 시험 뉴클레오타이드를 사용하여 단계 (a) 내지 (e)를 반복하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 이러한 시험 뉴클레오타이드 및 제2 시험 뉴클레오타이드는 서로 상이하다. 다른 구체예에서, 제1 반응 혼합물이 시험 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 경우, 상기 방법은 (e) 제2 반응 혼합물을, 가역적 종결자 모이어티, 및 제2 반응 혼합물의 DNA 중합 효소와 상이한 DNA 중합 효소를 가지는 가역적 종결자 뉴클레오타이드를 포함하는 제3 반응 혼합물로 대체하는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 바람직하게, 상기 방법은 (f) 포스포다이에스터 결합을 형성함으로써 가역적 종결자 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 혼입시키는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 바람직하게, 상기 방법은 (g) 프라이머 내로 혼입된 가역적 종결자 뉴클레오타이드로부터 가역적 종결자 모이어티를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 더 바람직하게, 상기 방법은 단계 (a) 내지 (g)를 50회 이상 반복하는 것을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 제1 반응 혼합물이 시험 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 경우, 프라이밍된 주형 핵산은 고체 지지체에 고정될 수 있고, 단계 (b)는 제1 반응 혼합물을 포함하는 용기로부터 제2 반응 혼합물을 포함하는 상이한 용기로 고체 지지체를 이동시키는 것을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 제1 반응 혼합물이 시험 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 경우, 프라이밍된 주형 핵산은 고체 지지체에 고정될 수 있고, 단계 (a) 및 (b) 각각은 반응 혼합물을 프라이밍된 주형 핵산상으로 유동시키는 것을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 제1 반응 혼합물이 시험 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 경우, 단계 (c)는 각 단계 (a) 및 (b) 동안 DNA 중합 효소에 결합하는 프라이밍된 주형 핵산을 연속적으로 측정하는 것을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 제1 반응 혼합물이 시험 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 경우, 단계 (c)는 DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 나타내는 광학 신호를 측정하고, 이어서 단계 (b)로부터 측정된 결합이 단계 (a)로부터 측정된 결합을 초과하는지 여부를 결정하기 위해, 측정된 광학 신호들 사이의 차이를 계산하는 것을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 제1 반응 혼합물이 시험 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 경우, 단계 (c)는 DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 나타내는 광학 신호를 측정하고, 이어서 단계 (b)로부터 측정된 결합이 단계 (a)로부터 측정된 결합을 초과하는지 여부를 결정하기 위해, 측정된 광학 신호들의 비율을 계산하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 제1 반응 혼합물이 시험 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 경우, 단계 (c)는 DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 나타내는 광학 신호를 측정하고, 이어서 단계 (b)로부터 측정된 결합이 단계 (a)로부터 측정된 결합을 초과하는지 여부를 결정하기 위해, 측정된 광학 신호들의 시간에 따른 변화율을 계산하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 제1 반응 혼합물이 시험 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 경우, 시험 뉴클레오타이드는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 및 dUTP로 구성된 군으로부터 선택되는 천연 뉴클레오타이드일 수 있다. 다른 구체예에서, 제1 반응 혼합물이 시험 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 경우, 시험 뉴클레오타이드는 외인성 형광 표지를 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 제1 반응 혼합물이 시험 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 경우, 시험 뉴클레오타이드는 외인성 표지를 포함하지 않는 비표지된 시험 뉴클레오타이드일 수 있다. 다른 구체예에서, 제1 반응 혼합물이 시험 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 경우, 시험 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 유사체이다. 더욱 바람직하게, 뉴클레오타이드 유사체는 가역적 종결자 모이어티를 포함한다. 더욱 더 바람직하게, 가역적 종결자 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드 유사체는 형광 표지를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 제1 반응 혼합물이 시험 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 경우, 프라이밍된 주형 핵산은 표면에 고정되며, 단계 (c)는 DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 측정하기 위해 굴절률 변화를 측정하는 것을 포함한다. 더욱 바람직하게, 단계 (c)는 간섭계 또는 표면 플라즈몬 공명 감지에 의해 굴절률 변화를 측정하는 것을 포함한다. 일반적으로 상이한 바람직한 구체예에 따르면, 제1 반응 혼합물의 DNA 중합 효소는 첨가된 형광 표지를 가지지 않는다. 일반적으로 상이한 바람직한 구체예에 따르면, 제1 반응 혼합물의 DNA 중합 효소는 DNA 중합 효소가 뉴클레오타이드에 결합한 이후 성질을 변화시키는 첨가된 형광 표지를 가지지 않는다. 다른 구체예에서, 제1 반응 혼합물이 시험 뉴클레오타이드를 포함하지 않고, 시험 뉴클레오타이드가 외인성 표지를 포함하지 않는 비표지된 시험 뉴클레오타이드인 경우, 제1 반응 혼합물의 DNA 중합 효소는 DNA 중합 효소가 뉴클레오타이드에 결합한 이후 성질을 변화시키는 첨가된 형광 표지를 가지지 않는다. 더욱 바람직하게, 프라이밍된 주형 핵산은 표면에 고정되며, 단계 (c)는 DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 측정하기 위해 굴절률 변화를 측정하는 것을 포함한다. 일반적으로 상이한 바람직한 구체예에 따르면, 제1 반응 혼합물은 시험 뉴클레오타이드가 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드인 경우, 최대 삼원 복합체 형성을 달성하는데 필요한 농도 이하로 시험 뉴클레오타이드를 추가로 포함하며, 제2 반응 혼합물은 시험 뉴클레오타이드가 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드인 경우 최대 삼원 복합체 형성을 달성하는데 충분한 농도로 시험 뉴클레오타이드를 포함한다. 일반적으로 상이한 바람직한 구체예에 따르면, 단계 (d)는 단계 (b)로부터 측정된 결합이 단계 (a)로부터 측정된 결합을 초과하는 경우, 시험 뉴클레오타이드가 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드임을 결정하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 바로 하류에 위치하며, 주형 가닥의 프라이머 바로 다음의 염기에 상보적인 염기를 포함하는, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 식별하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 프라이밍된 주형 핵산과 DNA 중합 효소를 포함하는 제1 반응 혼합물을 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)로부터의 프라이밍된 주형 핵산과 DNA 중합 효소 및 제1 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제2 반응 혼합물을 접촉시키는 단계; (c) 단계 (b)로부터의 프라이밍된 주형 핵산과 DNA 중합 효소, 제1 시험 뉴클레오타이드, 및 제2 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제3 반응 혼합물을 접촉시키는 단계; (d) 단계 (c)로부터의 프라이밍된 주형 핵산과 DNA 중합 효소, 제1 시험 뉴클레오타이드, 제2 시험 뉴클레오타이드, 및 제3 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제4 반응 혼합물을 접촉시키는 단계; (e) 단계 (d)로부터의 프라이밍된 주형 핵산과 DNA 중합 효소, 제1 시험 뉴클레오타이드, 제2 시험 뉴클레오타이드, 제3 시험 뉴클레오타이드, 및 제4 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제5 반응 혼합물을 접촉시키는 단계; (f) 제1 시험 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키지 않고, 각 단계 (a) 내지 (e) 동안 하나 이상의 지점에서 DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 측정하는 단계; 및 (g) 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 다음과 같이 식별하는 단계: (i) 단계 (b)로부터 측정된 결합이 단계 (a)로부터 측정된 결합을 초과하는 경우에는, 제1 시험 뉴클레오타이드, 또는 (ii) 단계 (c)로부터 측정된 결합이 단계 (b)로부터 측정된 결합을 초과하는 경우에는, 제2 시험 뉴클레오타이드, 또는 (iii) 단계 (d)로부터 측정된 결합이 단계 (c)로부터 측정된 결합을 초과하는 경우에는, 제3 시험 뉴클레오타이드, 또는 (iv) 단계 (e)로부터 측정된 결합이 단계 (d)로부터 측정된 결합을 초과하는 경우에는, 제4 시험 뉴클레오타이드. 일반적으로 바람직한 하나의 구체예에 따르면, 상기 방법은, 단계 (f) 이후, (h) 포스포다이에스터 결합 형성에 의해, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 바람직하게, 시험 뉴클레오타이드 각각은 서로 상이하며, 시험 뉴클레오타이드 각각은 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 및 dUTP로 구성된 군으로부터 선택된다. 택일적으로, 시험 뉴클레오타이드 각각은 서로 상이하며, 각각의 시험 뉴클레오타이드는 dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP로 구성된 군으로부터 선택되는 천연 뉴클레오타이드이다. 택일적으로, 시험 뉴클레오타이드 각각은 서로 상이하며, 어떠한 시험 뉴클레오타이드도 외인성 형광 표지를 포함하지 않는다. 택일적으로, 시험 뉴클레오타이드 각각은 서로 상이하며, 이러한 각각의 시험 뉴클레오타이드는 가역적 종결자 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드 유사체이다. 택일적으로, 프라이머 내로 혼입된 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 가역적 종결자 모이어티를 포함한다. 바람직하게, 프라이머 내로 혼입된 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 가역적 종결자 모이어티를 포함한다. 일반적으로 상이한 바람직한 구체예에 따르면, 상기 방법이 단계 (f) 이후, (h) 포스포다이에스터 결합 형성에 의해 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키는 단계를 추가로 포함하는 경우, 어떠한 시험 뉴클레오타이드도 가역적 종결자 모이어티를 포함하지 않고, 단계 (f)와 단계 (h) 사이, (i) 프라이밍된 주형 핵산에 결합된 임의의 시험 뉴클레오타이드를 제거하는 단계, 이후 가역적 종결자 모이어티를 포함하는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 첨가하는 단계가 존재한다. 일반적으로 상이한 바람직한 구체예에 따르면, 상기 방법이 단계 (f) 이후, (h) 포스포다이에스터 결합 형성에 의해 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키는 단계를 추가로 포함하는 경우, 단계 (a) 내지 (e)에서 사용되는 중합 효소는 단계 (h)에서 사용되는 중합 효소와 상이할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 시험 뉴클레오타이드가, 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 바로 하류에 위치하며 주형 가닥의 프라이머 바로 다음의 염기에 상보적인 염기를 포함하는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드인지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 프라이밍된 주형 핵산과 제1 DNA 중합 효소를 포함하는 제1 반응 혼합물을 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)로부터 프라이밍된 주형 핵산과 제2 DNA 중합 효소 및 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제2 반응 혼합물을 접촉시키는 단계로서, 이러한 제2 DNA 중합 효소는 제1 DNA 중합 효소로부터 부재하는 표지를 포함하는 단계; (c) 시험 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키지 않고, 각 단계 (a) 및 (b) 동안 하나 이상의 지점에서 프라이밍된 주형 핵산을 포함하는 복합체 내에 존재하는 표지를 검출함으로써, 제2 DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 측정하는 단계; 및 (d) 단계 (c)로부터 측정된 결합 결과를 사용하여 시험 뉴클레오타이드가 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드인지 여부를 결정하는 단계. 일반적으로 바람직한 하나의 구체예에 따르면, 제1 및 제2 DNA 중합 효소의 아미노산 서열은 동일할 수 있다. 일반적으로 상이한 바람직한 구체예에 따르면, 단계 (a) 및 (b) 각각은, 삼원 복합체의 형성을 안정화하고 이원 복합체의 형성을 불안정화하는 완충 조건하에서 일어난다. 바람직하게, 단계 (a) 및 (b) 각각은 고염 완충 조건하에서 일어난다. 더욱 더 바람직하게, 제1 DNA 중합 효소는 외인성 검출가능한 표지를 포함하지 않는다. 일반적으로 상이한 바람직한 구체예에 따르면, 상기 방법은 단계 (a) 내지 (c)를 각각 매회 상이한 시험 뉴클레오타이드로 3회 반복하는 것을 추가로 포함한다. 바람직하게, 제2 DNA 중합 효소의 표지는 형광 표지이다. 더욱 바람직하게, 단계 (c)는 동족 뉴클레오타이드에 결합하는 제2 DNA 중합 효소의 결과로서 광학 성질을 변화시키는 입체 구조 감응성 염료로부터 형광 신호를 측정하는 것을 포함하지 않는다. 일반적으로 상이한 바람직한 구체예에 따르면, 상기 방법은 시험 뉴클레오타이드 및 프라이밍된 주형 핵산에 결합된 임의의 중합 효소를 제거하는 것을 추가로 포함한다. 바람직하게, 프라이밍된 주형 핵산을 제3 DNA 중합 효소 및 가역적 종결자 뉴클레오타이드를 포함하는 제3 반응 혼합물과 접촉시키는 단계, 이후 제3 DNA 중합 효소를 사용하여 가역적 종결자 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 혼입시켜 가역적으로 종결된 프라이머를 제조하는 단계가 추가적으로 존재한다. 더욱 바람직하게, 상기 방법은 단계 (a) 내지 (c) 각각에서, 가역적으로 종결된 프라이머를 포함하는 프라이밍된 주형 핵산을 사용하여 단계 (a) 내지 (d)를 반복하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 뉴클레오타이드와 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 바로 하류에 위치하는 주형 가닥의 프라이머 바로 다음의 염기에 상보적인 염기 분자를 혼입시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 프라이밍된 주형 핵산 분자와 DNA 중합 효소를 포함하는 제1 반응 혼합물을 접촉시키는 단계; (b) 제1 시험 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 혼입시키지 않고, 단계 (a)로부터의 프라이밍된 주형 핵산 분자와 DNA 중합 효소 및 제1 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제2 반응 혼합물을 접촉시키는 단계; (c) 제1 시험 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키지 않고, 각 단계 (a) 및 (b) 동안 하나 이상의 지점에서, DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산 분자의 결합을 측정하여, 단계 (b)에서 삼원 복합체의 형성 여부를 확인하는 단계; 및 (d) 다음의 두 가지 옵션 중 하나를 선택하는 단계: (i) 삼원 복합체가 단계 (b)에서 형성되지 않은 것을 단계 (c)에서 확인하는 경우, 단계 (b)로부터의 프라이밍된 주형 핵산 분자와 DNA 중합 효소와 조합으로 제1 시험 뉴클레오타이드 및 제2 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제3 반응 혼합물을 접촉시키는 옵션으로서, 여기서 제2 시험 뉴클레오타이드는 제1 시험 뉴클레오타이드와 상이한 옵션; 및 (ii) 삼원 복합체가 단계 (b)에서 형성된 것을 단계 (c)에서 확인한 경우, 단계 (b)로부터의 프라이밍된 주형 핵산 분자와 제4 반응 혼합물을 접촉시키고, 단계 (b)로부터의 프라이밍된 주형 핵산 분자와 제3 반응 혼합물을 먼저 접촉시키지 않고, 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 혼입시키는 혼입 반응을 수행하는 옵션. 일반적으로 바람직한 하나의 구체예에 따르면, 프라이밍된 주형 핵산 분자는 고체 지지체에 고정된다. 바람직하게, 제4 반응 혼합물은 제1 및 제2 반응 혼합물의 중합 효소와 상이한 중합 효소를 포함한다. 택일적으로, 제4 반응 혼합물은 제1 및 제2 반응 혼합물의 중합 효소와 상이한 중합 효소를 포함하며, 단계 (d)(ii)에서 프라이머 내로 혼입된 뉴클레오타이드는 가역적 종결자 모이어티를 포함한다. 일반적으로 상이한 바람직한 구체예에 따르면, 프라이밍된 주형 핵산 분자는 고체 지지체에 고정되며, 접촉 단계 (a) 및 (b) 각각은 반응 혼합물을 고체 지지체에 고정된 프라이밍된 주형 핵산 분자 상으로 유동시키는 것을 포함한다. 일반적으로 상이한 바람직한 구체예에 따르면, 프라이밍된 주형 핵산 분자는 고체 지지체에 고정되며, 접촉 단계 (a) 및 (b) 각각은 제1 반응 혼합물을 포함하는 용기로부터 제2 반응 혼합물을 포함하는 용기로 고체 지지체를 이동시키는 것을 포함한다. 일반적으로 상이한 바람직한 구체예에 따르면, 제1 및 제2 반응 혼합물 각각은 동일한 농도의 중합 효소를 포함한다. 일반적으로 상이한 바람직한 구체예에 따르면, 제4 반응 혼합물은 제1 및 제2 반응 혼합물의 중합 효소와 상이한 중합 효소를 포함한다. 일반적으로 상이한 바람직한 구체예에 따르면, 단계 (c)는 간섭계 또는 표면 플라즈몬 공명 감지 중 하나에 의해 측정하는 것을 포함한다. 일반적으로 상이한 바람직한 구체예에 따르면, 제1 시험 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드이다. 일반적으로 상이한 바람직한 구체예에 따르면, 제1 시험 뉴클레오타이드는 가역적 종결자 모이어티를 포함한다. 일반적으로 상이한 바람직한 구체예에 따르면, 단계 (d)(ii)에서 혼입된 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드, 및 가역적 종결자를 포함하는 뉴클레오타이드 중 어느 하나이다.
도 1은 조사된 dNTP 정체(수평축)의 함수로서 측정된 결합 신호(수직축)를 나타내는 일련의 막대 그래프를 나타낸다. 도면은 삼원 복합체 형성에 대해 측정된 신호(즉, 동족 뉴클레오타이드의 존재를 나타냄)는 감소하는 추세이지만, 이원 복합체 형성에 대해 측정된 신호(즉, 비동족 뉴클레오타이드의 존재를 나타냄)는 일정하게 유지되는 것을 그래프로 설명한다. 빈 막대는 정확한 양성 확정과 관련된 신호를 나타내는 반면, 점으로 표시된 막대는 정확한 음성 확정과 관련된 신호를 나타낸다. 두꺼운 대각선 채움은 위음성 염기 확정(T)을 나타내고, 가는 대각선 채움은 위음성 염기 확정을 나타낸다(C가 없음).
도 2a 및 2b는 시간(수직축)함수로서 결합 활성(수평축)을 나타내는 그래프 기록이다. 도 2a에 도시된 분할은 각 주기를 완료하기 위한 4 개의 부분: 결합, 혼입, 소광, 및 재생을 나타낸다. 도 2b는 각 주기를 완료하기 위한 5 개 부분을 나타내며, 추가의 제1(즉, 초기) 부분은 중합 효소 및 제1(낮은) 농도의 뉴클레오타이드와의 접촉을 포함하는 2 단계 결합 절차에 기인한다. 제2, 4, 8, 10, 12, 16, 및 20 주기에 나타난 빈 화살표는 정확한 염기 확정을 나타내는 반면; 제6, 14, 및 18 주기에 나타난 채운 화살표는 부정확한 염기 확정을 나타낸다. 두 그래프 기록 모두에서, "주기 번호"는 프라이밍된 주형 핵산을 식별된 뉴클레오타이드와 접촉시키기 위한 독립적인 단계를 식별한다.
도 3a 및 3b는 결합에 의한 서열 결정 절차에서 조사된 dNTP 정체(수직축)함수로서 측정된 결합 신호(수평축)를 그래프로 도시하는 막대 그래프를 나타낸다. 도 3a는 오직 단일-단계 검사 단계만을 사용한 표준 결합에 의한 서열 결정 절차를 사용하여 획득된 결과를 나타낸다. 높은 신호는 삼원 복합체 형성을 나타내는 반면, 낮은 신호는 이원 복합체 형성과 관련된다. 도 3b는 2 단계로 프라이밍된 주형 핵산과 중합 효소 및 뉴클레오타이드의 결합에 대한 2 단계 프로토콜을 사용하여 획득된 결과를 나타낸다. 빈 막대는 정확한 양성 확정과 관련된 신호를 나타내는 반면, 점으로 표시된 막대는 정확한 음성 확정과 관련된 신호를 나타낸다. 하나의 위음성 확정(두꺼운 대각선 채움), 및 하나의 위-양성 확정(가는 대각선 채움)이 도 3a의 화살표에 의해 나타난다.
도 4는 공정 파라미터(수평축)의 함수로서 측정된 결합 신호(수직축)를 나타내는 그래프 기록이다. 12개의 진행 간격 시간(초 단위로 측정)이 플롯 위에 표시된다. 제1 및 제2 진행 간격은 각각 프라이머/주형 담지 및 세척 단계를 나타낸다. 제3 진행 간격은 2단계 프로토콜 중 제1 단계에 상응한다(즉, 프라이밍된 주형 핵산은 첨가된 뉴클레오타이드의 부재하에 중합 효소와 상호 작용한다). 간격 4 내지 7은, 각각 20 초간 지속되며, 2단계 프로토콜 중 제2 단계에 상응한다(즉, 프라이밍된 주형 핵산이 중합 효소 존재하에 첨가된 뉴클레오타이드와 상호 작용한다). 진행 간격 4 내지 7 동안 존재하는 뉴클레오타이드(들)는 각각 다음과 같다: dTTP; dTTP 및 dATP; dTTP, dATP, 및 dCTP; 및 dTTP, dATP, dCTP, 및 dGTP. 조합에 사용되는 제3 뉴클레오타이드는 삼원 복합체 형성을 촉진하였고, 동족 뉴클레오타이드(dCTP)에 상응하였다. 진행 간격 8은 EDTA 세척 단계였다. 진행 간격는 9 및 10은, 각각, 혼입에 예비하는 재생 새척, 및 혼입 단계이었다. 진행 간격 11 및 12는 EDTA 세척, 및 후속 검사를 예비하는 재생 세척이었다.
도 2a 및 2b는 시간(수직축)함수로서 결합 활성(수평축)을 나타내는 그래프 기록이다. 도 2a에 도시된 분할은 각 주기를 완료하기 위한 4 개의 부분: 결합, 혼입, 소광, 및 재생을 나타낸다. 도 2b는 각 주기를 완료하기 위한 5 개 부분을 나타내며, 추가의 제1(즉, 초기) 부분은 중합 효소 및 제1(낮은) 농도의 뉴클레오타이드와의 접촉을 포함하는 2 단계 결합 절차에 기인한다. 제2, 4, 8, 10, 12, 16, 및 20 주기에 나타난 빈 화살표는 정확한 염기 확정을 나타내는 반면; 제6, 14, 및 18 주기에 나타난 채운 화살표는 부정확한 염기 확정을 나타낸다. 두 그래프 기록 모두에서, "주기 번호"는 프라이밍된 주형 핵산을 식별된 뉴클레오타이드와 접촉시키기 위한 독립적인 단계를 식별한다.
도 3a 및 3b는 결합에 의한 서열 결정 절차에서 조사된 dNTP 정체(수직축)함수로서 측정된 결합 신호(수평축)를 그래프로 도시하는 막대 그래프를 나타낸다. 도 3a는 오직 단일-단계 검사 단계만을 사용한 표준 결합에 의한 서열 결정 절차를 사용하여 획득된 결과를 나타낸다. 높은 신호는 삼원 복합체 형성을 나타내는 반면, 낮은 신호는 이원 복합체 형성과 관련된다. 도 3b는 2 단계로 프라이밍된 주형 핵산과 중합 효소 및 뉴클레오타이드의 결합에 대한 2 단계 프로토콜을 사용하여 획득된 결과를 나타낸다. 빈 막대는 정확한 양성 확정과 관련된 신호를 나타내는 반면, 점으로 표시된 막대는 정확한 음성 확정과 관련된 신호를 나타낸다. 하나의 위음성 확정(두꺼운 대각선 채움), 및 하나의 위-양성 확정(가는 대각선 채움)이 도 3a의 화살표에 의해 나타난다.
도 4는 공정 파라미터(수평축)의 함수로서 측정된 결합 신호(수직축)를 나타내는 그래프 기록이다. 12개의 진행 간격 시간(초 단위로 측정)이 플롯 위에 표시된다. 제1 및 제2 진행 간격은 각각 프라이머/주형 담지 및 세척 단계를 나타낸다. 제3 진행 간격은 2단계 프로토콜 중 제1 단계에 상응한다(즉, 프라이밍된 주형 핵산은 첨가된 뉴클레오타이드의 부재하에 중합 효소와 상호 작용한다). 간격 4 내지 7은, 각각 20 초간 지속되며, 2단계 프로토콜 중 제2 단계에 상응한다(즉, 프라이밍된 주형 핵산이 중합 효소 존재하에 첨가된 뉴클레오타이드와 상호 작용한다). 진행 간격 4 내지 7 동안 존재하는 뉴클레오타이드(들)는 각각 다음과 같다: dTTP; dTTP 및 dATP; dTTP, dATP, 및 dCTP; 및 dTTP, dATP, dCTP, 및 dGTP. 조합에 사용되는 제3 뉴클레오타이드는 삼원 복합체 형성을 촉진하였고, 동족 뉴클레오타이드(dCTP)에 상응하였다. 진행 간격 8은 EDTA 세척 단계였다. 진행 간격는 9 및 10은, 각각, 혼입에 예비하는 재생 새척, 및 혼입 단계이었다. 진행 간격 11 및 12는 EDTA 세척, 및 후속 검사를 예비하는 재생 세척이었다.
프라이밍된 주형 핵산 분자, 중합 효소, 및 프라이머의 바로 하류에 있으며 프라이밍된 주형 핵산의 주형 가닥에 상보적인 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 삼원 복합체를 검출하는 기법이 개시된다. 뉴클레오타이드에 독립적인 이원 복합체의 형성을 촉진하는 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 사이의 상호 작용에도 불구하고 명백하고 명확한 검출을 달성하였다. 이러한 접근법은 비특이적 이원 복합체가 뉴클레오타이드의 부재하에서도 프라이밍된 주형 핵산 상에 포화되도록 만들어질 수 있는 본 명세서에 개시된 관찰에 따른다. 대조적으로, 뉴클레오타이드-특이적 삼원 복합체 형성은 용량 의존적 결합을 나타내며 이원 복합체 형성에 참여하는 분자 이외에도 중합 효소 분자를 모집한다. 뉴클레오타이드-특이적 삼원 복합체 및 비특이적 이원 복합체의 형성은 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자 사이 상이한 상호 작용을 포함할 수 있지만, 임의의 특정 작동 이론에 구속되고자 함은 아니다. 결합에 의한 서열 결정 기법에서, 삼원 복합체 형성을 야기하는 특이적 상호 작용만이 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드에 대해 유용하다.
삼원 복합체 형성의 향상된 검출 기법은 시험을 거치는 후보 뉴클레오타이드의 존재에 따라 또는 이의 양에 따라 달라지는 결합 조건하에서, 중합 효소 상호 작용과 프라이밍된 주형 핵산을 비교하는 것을 포함한다. 예를 들어, 시험 뉴클레오타이드(예컨대, 천연 dATP, dGTP, dCTP 또는 dTTP; 또는 뉴클레오타이드 유사체)는 상이한 두 농도로 존재할 수 있지만, 중합 효소 농도 실질적으로 일정하게 유지된다. 두 가지의 시험 뉴클레오타이드 농도는 서로 비교하여 상대적으로 낮거나 높을 수 있다(즉, 시험 뉴클레오타이드는 두 조건하에 모두 포함됨). 택일적으로, 두 상이한 결합 조건은 시험 뉴클레오타이드의 존재 및 부재(즉, 0 농도)를 포함할 수 있지만, 중합 효소 농도는 모든 경우에 실질적으로 일정하게 유지된다.
유리하게는, 이러한 기법은 천연(예컨대, 비표지된) 뉴클레오타이드, 검출가능한 표지(예컨대, 형광 또는 다른 광학 검출가능한 표지)를 가지는 뉴클레오타이드, 또는 표지된 또는 비표지된 뉴클레오타이드 유사체(예컨대, 가역적 종결자 모이어티를 포함하는 변형된 뉴클레오타이드)를 포함하는 다양한 유형의 뉴클레오타이드를 사용하여 실시될 수 있다. 추가적으로, 이러한 기법은 제어된 반응 조건, 명확한 서열 결정, 긴 판독 길이, 낮은 전체 시약 비용, 및 낮은 기구 비용을 제공한다.
개시된 기법은 임의의 수단에 의해 및 어떠한 이유로든 프라이밍된 주형 핵산의 바로 다음의 염기의 정체를 결정하는데 사용되는 결합 반응에 적용될 수 있다. 이러한 기법은 DNA 중합 효소 및 프라이밍된 주형 핵산에 상보적인 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드(예컨대, dNTP)의 특이적 결합을 모니터링하고, 비특이적 결합과 특이적 결합을 구분하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 기법은 단일 뉴클레오타이드 결정(예컨대, SNP 결정), 또는 택일적으로 한 번에 하나의 뉴클레오타이드를 식별하는 반복 사이클을 사용하는, 더욱 연장된 핵산 서열 결정 절차에 적용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 방법은, 공동으로 소유된 미국 특허 출원 제14/805,381호(미국 특허 출원 공개 US 2017/0022553 A1로서 출원)에 기재된 결합에 의한 서열 결정 절차와 관련하여 사용될 수 있고, 상기 문헌은 본 명세서에 그 전체가 참조 문헌으로 포함된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 명확성을 위해, 다음의 특정 용어는 명시된 의미를 가진다. 다른 용어는 본 발명의 다른 부분에 정의된다.
단수형 용어는 문맥이 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 상세한 설명 및 청구범위에서 사용된 근사치는, 관련된 기본 기능을 수정하지 않고 허용될 수 있는 양적 표현을 수정하는데 적용될 수 있다. 따라서, "약"과 같은 용어에 의해 수식된 값은 명시된 정확한 값에 제한되지 않는다. 달리 지시되지 않는 한, 성분의 양, 분자량과 같은 성질, 반응 조건을 지칭하기 위해 본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 모든 수치는, 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 다음의 설명 및 첨부된 청구범위에 기재된 모든 수치 파라미터는 본 발명의 조성물, 장치, 또는 방법에 의해 획득하고자 하는 원하는 성질에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 최소한의 각 수치 매개 변수는 적어도 보고된 유효 자릿수의 수와 일반적인 반올림 기법을 적용하여 해석되어야 한다.
본 명세서에서 사용 시, "결합에 의한 서열 결정"은 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 가닥 내로 혼입되는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 식별하기 위해 프라이밍된 주형 핵산 분자(예컨대, 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자)에 대한 중합 효소 및 동족 뉴클레오타이드의 특이적 결합이 사용되는 서열 결정 기법을 지칭한다. 특이적 결합 상호 작용은 뉴클레오타이드의 프라이머 내로의 화학적 혼입을 야기시킬 필요가 없다. 일부 구체예에서, 특이적 결합 상호 작용은 뉴클레오타이드의 프라이머 가닥 내로의 화학적 혼입을 선행할 수 있거나, 유사한, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 프라이머 내로 화학적 혼입을 선행할 수 있다. 이에 따라, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 검출은 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 혼입 없이 일어날 수 있다.
본 명세서에서 사용 시, "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 본 명세서에서 사용되는 문법적 등가물은 함께 공유 결합된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 의미한다. 이에 따라, "핵산"은 핵산 합성 동안 중합 효소에 의해 작용될 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 DNA, RNA, 또는 임의의 이의 조합이다. 용어 "핵산"은 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥의 DNA, RNA 및 이의 유사체(유도체)를 포함한다. 이중-가닥의 핵산은, 유리하게는 핵산 합성을 방해할 수 있는 2차 구조를 최소화할 수 있다. 이중 가닥 핵산은 닉(nick) 또는 단일-가닥의 갭(gap)을 보유할 수 있다.
본 명세서에서 사용 시, "주형 핵산"은 본 명세서에 개시된 방법 또는 장치를 사용하여 검출, 서열 결정, 평가 또는 그렇지 않으면 분석되는 핵산이다.
본 명세서에서 사용 시, "프라이밍된 주형 핵산"(또는 택일적으로, "프라이밍된 주형 핵산 분자")은 프라이머와 프라이밍된(즉, 이에 혼성화된) 주형 핵산이며, 이러한 프라이머는 3'-말단을 가지며, 주형 핵산의 일부에 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드이다. 프라이머는 선택적으로 유리 5'-말단를 가질 수 있거나(예컨대, 프라이머가 주형과 비공유적으로 연결), 프라이머는 (예컨대, 헤어핀 구조를 통해) 주형과 연속될 수 있다. 프라이밍된 주형 핵산은 상보적인 프라이머 및 결합되는 주형 핵산을 포함한다. 프라이밍된 주형 핵산 분자는 중합 반응에서 연장될 수 있거나, 택일적으로, 연장을 방지하는 차단 모이어티를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용 시, "뉴클레오타이드"는 질소 함유 염기, 5-탄소 당(리보스 또는 디옥시리보스), 및 하나 이상의 포스페이트 기를 포함하는 분자이다. 이러한 용어는 리보뉴클레오타이드, 디옥시리보뉴클레오타이드, 및 외인성 표지 또는 가역적 종결자, 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함하도록 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 명세서에서 사용 시, "천연" 뉴클레오타이드는 외인성 표지(예컨대, 형광 염료, 또는 다른 표지) 또는 뉴클레오타이드 유사체를 특성화할 수 있는 화학적 변형을 포함하지 않는, 천연에 존재하는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 결합에 의한 서열 결정 절차에 유용한 천연 뉴클레오타이드의 예로는 다음을 포함한다: dATP(2'-디옥시아데노신-5'-트라이포스페이트); dGTP(2'-디옥시구아노신-5'-트라이포스페이트); dCTP(2'-디옥시사이토신-5'-트라이포스페이트); dTTP(2'-디옥시티미딘-5'-트라이포스페이트); 및 dUTP(2'-디옥시우리딘-5'-트라이포스페이트).
본 명세서에서 사용 시, "뉴클레오타이드 유사체"는 천연 뉴클레오타이드 중 임의의 성분(예컨대, 질소 함유 염기, 5-탄소 당, 또는 포스페이트 기(들))을 대체, 제거 및/또는 변형시키는, 화학적 모이어티와 같은 하나 이상의 변이체를 가진다. 뉴클레오타이드 유사체는 핵산 중합 반응에서 중합 효소에 의해 혼입될 수 있거나 혼입되지 않을 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체의 3'-OH 기는 모이어티를 사용하여 변형된다. 모이어티는 중합 효소 연장의 3' 가역적 또는 비가역적 종결자일 수 있다. 뉴클레오타이드의 염기는 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티미딘, 또는 우라실, 또는 이의 유사체 중 어느 하나일 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드는 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 아이소사이토신, 아이소구아닌, 나이트로피롤(3-나이트로피롤 포함) 또는 나이트로인돌(5-나이트로인돌 포함) 염기를 가진다. 뉴클레오타이드는, ATP, UTP, CTP, GTP, ADP, UDP, CDP, GDP, AMP, UMP, CMP, GMP, dATP, dTTP, dUTP, dCTP, dGTP, dADP, dTDP, dCDP, dGDP, dAMP, dTMP, dCMP, 및 dGMP를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 뉴클레오타이드는 또한 DNA 중합 효소의 종결 억제제, 다이디옥시뉴클레오타이드 또는 2',3' 다이디옥시뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 이는 ddNTP(ddGTP, ddATP, ddTTP, ddUTP 및 ddCTP)로 약칭된다.
본 명세서에서 사용 시, "바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드"(종종 "동족 뉴클레오타이드로서 지칭되는)는 바로 다음의 주형 뉴클레오타이드의 염기에 상보적인 염기를 가지는 뉴클레오타이드이다. 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 프라이머의 3'-말단에서 혼성화하여 바로 다음의 주형 뉴클레오타이드를 상보할 것이다. 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 프라이머의 3' 말단에 혼입될 수 있지만, 반드시 필요한 것은 아니다. 예를 들어, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 혼입 반응을 완료할 삼원 복합체의 구성원일 수 있거나, 택일적으로, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 혼입 반응에 촉매 작용을 하지 않는 안정화된 삼원 복합체의 구성원일 수 있다. 바로 다음의 주형 염기에 상보적이지 않은 염기를 가지는 뉴클레오타이드는 "부정확한"(또는 "비동족") 뉴클레오타이드로서 지칭된다.
본 명세서에서 사용 시, "차단 모이어티"는 뉴클레오타이드 유사체에 대하여 사용되는 경우, 핵산 중합 반응의 혼입 단계 동안 뉴클레오타이드가 (예컨대, 프라이머 뉴클레오타이드의 3'-OH를 통해) 제2 뉴클레오타이드에 공유 결합을 형성하는 것을 억제 또는 방지하는 뉴클레오타이드의 일부이다. "가역적 종결자" 뉴클레오타이드의 차단 모이어티는 뉴클레오타이드 유사체로부터 제거되어 뉴클레오타이드 혼입을 허용할 수 있다. 이러한 차단 모이어티는 본 명세서에서 "가역적 종결자 모이어티"로서 지칭된다. 예시적인 가역적 종결자 모이어티는 미국 특허 제7,427,673호; 제7,414,116호; 및 제7,057,026호 및 PCT 공개 WO 91/06678 및 WO 07/123744에 기재되어 있으며, 상기 특허 각각은 참조 문헌으로 포함된다.
본 명세서에서 사용 시, "시험 뉴클레오타이드"는 프라이밍된 주형 핵산(또는 차단된 프라이밍된 주형 핵산) 및 중합 효소를 추가로 포함하는 삼원 복합체의 형성에 참여하는 능력에 대해 연구되는 뉴클레오타이드이다.
본 명세서에서 사용 시, "중합 효소"는 동족 뉴클레오타이드 및 프라이밍된 주형 핵산(또는 차단된 프라이밍된 주형 핵산)과 함께 삼원 복합체를 형성하는 단백질 또는 다른 분자에 대한 일반적인 용어이며, DNA 중합 효소, RNA 중합 효소, 역전사 효소, 프리메이스(primase) 및 전이 효소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 중합 효소는 뉴클레오타이드 결합이 일어나는 하나 이상의 활성 부위를 포함한다. 선택적으로 중합 효소는 뉴클레오타이드 중합의 촉매 작용이 일어날 수 있는 하나 이상의 활성 부위를 포함한다. 선택적으로 중합 효소는, 예를 들어, 돌연변이 또는 화학적 변형과 같은 변형으로 인해, 촉매 뉴클레오타이드 중합 기능을 가지지 않는다. 택일적으로, 중합 효소는 이의 상보적인 핵산 가닥에 결합된 프라이머의 3'-말단에 대한 뉴클레오타이드의 중합을 촉매화할 수 있다. 예를 들어, 중합 효소는 포스포다이에스터 결합을 통해 프라이머의 3'-OH 기에 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 첨가를 촉매화하여, 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 화학적으로 혼입시킨다. 선택적으로, 제공된 방법에 사용되는 중합 효소는 진행형 중합 효소이다. 선택적으로, 제공된 방법에서 사용되는 중합 효소는 분배형 중합 효소이다.
본 명세서에서 사용 시, "2 단계(biphasic)"는 프라이밍된 주형 핵산은 중합 효소 및 시험 뉴클레오타이드와 접촉되는 2 단계 공정을 지칭한다. 공정의 제1 단계는 준포화 수준의 뉴클레오타이드(들)의 존재하에, 또는 심지어 뉴클레오타이드의 부재하에 프라이밍된 주형 핵산과 중합 효소를 접촉하는 단계를 포함한다. 용어 "준포화(sub-saturating)"는 수용체에 결합하는 리간드(예컨대, 중합 효소에 결합하는 뉴클레오타이드)에 관련하여 사용되는 경우, 평형에서 리간드에 결합되는 수용체의 적어도 90%를 야기하기 위해 요구되는 농도 이하의 리간드의 농도를 지칭한다. 예를 들어, 준포화 양의 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드에 결합되는 중합 효소의 적어도 90%, 95%, 99% 이상을 산출할 수 있다. 공정의 제2 단계는, 제1 단계에서 사용된 농도보다 높은 농도의 뉴클레오타이드(들)의 존재하에 제1 단계로부터의 프라이밍된 주형 핵산과 중합 효소를 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 반응의 뉴클레오타이드가 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드인 경우, 더 높은 농도는 최대 삼원 복합체 형성을 산출하기 충분하다.
본 명세서에서 사용 시, 주형, 프라이머, 또는 프라이밍된 주형 핵산을 "제공"하는 것은, 예를 들어 반응 혼합물 또는 반응 챔버에, 하나의 또는 여러 핵산 중합체를 제조 및 전달하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용 시, "모니터링"(또는 종종 "측정")은, 분자 결합 현상과 관련되어 사용되는 경우, 두 분자의 종 사이 측정가능한 상호 작용 또는 결합을 검출하는 공정을 지칭한다. 예를 들어, 모니터링은, 일반적으로 절차에 걸쳐 다양한 지점에서 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산(또는 차단된 프라이밍된 주형 핵산) 사이에 측정가능한 상호 작용을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 모니터링은 간헐적(예컨대, 주기적) 또는 연속적(예컨대, 중단 없이)일 수 있으며, 정량적 결과의 획득을 포함할 수 있다. 모니터링은 결합 현상 동안 일정 기간에 걸쳐 다중 신호를 검출함으로써, 또는, 택일적으로, 결합 현상 동안 또는 그 이후 단일 시점에서 신호(들)를 검출함으로써 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용 시, "접촉(contacting)"은 물리적 결합 반응 또는 화학적 반응이 일어날 수 있도록 시약을 함께 혼합(예컨대, 고정된 주형 핵산 및 중합 효소를 포함하는 완충 용액, 또는 중합 효소 및 시험 뉴클레오타이드의 조합 중 하나와 혼합)하는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용 시, "혼입" 또는 "화학적 혼입"은, 핵산 및 뉴클레오타이드와 관련하여 사용되는 경우, 포스포다이에스터 결합을 형성함으로써 동족 뉴클레오타이드를 핵산 프라이머에 결합시키는 공정을 지칭한다.
본 명세서에서 사용 시, "이원 복합체(binary complex)"는 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산(또는 차단된 프라이밍된 주형 핵산) 사이 복합체이며, 이러한 복합체는 뉴클레오타이드 분자, 예컨대 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
본 명세서에서 사용 시, "삼원 복합체(ternary complex)"는 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산(또는 차단된 프라이밍된 주형 핵산), 및 프라이머의 바로 하류에 위치하며 프라이밍된 주형 핵산의 주형 가닥 또는 차단된 프라이밍된 주형 핵산에 상보적인 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드 사이의 복합체이다. 프라이밍된 주형 핵산은, 예를 들어, 유리 3'-OH를 가지는 프라이머 또는 차단된 프라이머(예컨대, 3' 말단 뉴클레오타이드의 염기 또는 당 모이어티에 화학적 변형을 가지는 프라이머, 이러한 변형은 효소적 포스포다이에스터 결합 형성을 배제함)를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용 시, "촉매 금속 이온"은 중합 효소에 의해 핵산(예컨대, 프라이머)의 3'-OH와 도입되는(incoming) 뉴클레오타이드의 포스페이트 사이에 포스포다이에스터 결합 형성을 촉진하는 금속 이온을 지칭한다. "2가 촉매 금속 양이온"은 2가의 원자가를 가지는 촉매 금속 이온이다. 촉매 금속 이온은 중합 효소, 뉴클레오타이드, 및 프라이밍된 주형 핵산 사이의 복합체 형성을 안정화하기 위해 필요한 농도로 존재할 수 있으며, 이러한 농도는 금속 이온의 비촉매 농도로 지칭된다. 금속 이온의 촉매 농도는 핵산(예컨대, 프라이머)의 3'-OH 기와 도입되는 뉴클레오타이드의 포스페이트 기 사이에 반응을 촉매화하기에 충분한 금속 이온의 양을 지칭한다.
본 명세서에서 사용 시, "비촉매 금속 이온"은, 중합 효소가 존재하는 경우, 뉴클레오타이드의 프라이머 내로의 화학적 혼입에 요구되는 포스포다이에스터 결합 형성을 용이하게 하지 않는 금속 이온을 지칭한다. 일반적으로, 비촉매 금속 이온은 양이온이다. 비촉매 금속 이온은 중합 효소에 의한 포스포다이에스터 결합 형성을 억제할 수 있고, 따라서 뉴클레오타이드 혼입을 방지함으로써 삼원 복합체를 안정화시킬 수 있다. 비촉매 금속 이온은, 예를 들어, 촉매 금속 이온과 비교하여, 경쟁적인 결합을 통해 중합 효소와 상호작용할 수 있다. "2가 비촉매 금속 이온"은 2가의 원자가를 가지는 비촉매 금속 이온이다. 2가 비촉매 금속 이온의 예로는, Ca2+, Zn2+, Co2+, Ni2+, 및 Sr2+를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 3가 Eu3+ 및 Tb3+ 이온은 3가의 원자가를 가지는 비촉매 금속 이온이다.
본 명세서에서 사용 시, "외인성 표지"는 서열 결정 시약의 천연 유사체에 존재하지 않는 서열 결정 시약의 검출가능한 화학적 모이어티, 예컨대 합성 뉴클레오타이드 유사체 또는 합성 중합 효소 유사체(예컨대, DNA 중합 효소) 상에 존재하는 비천연 발생의 표지를 지칭한다. 천연 dNTP는 특성이 제한된 형광 프로파일을 가질 수 있지만, 천연 dNTP는 임의의 첨가된 비색 또는 형광 모이어티를 포함하지 않는다. 대조적으로, 화학적 링커 및 감마 포스페이트에 부착된 형광 모이어티를 포함하기 위해 변형된 dATP(2'-디옥시아데노신-5'-트라이포스페이트) 분자는, 부착된 화학적 성분이 정상적으로 뉴클레오타이드의 일부가 아니기 때문에, 외인성 표지를 포함하는 것으로 말할 수 있다. 물론, 뉴클레오타이드 염기에 검출가능한 표지를 첨가하는 화학적 변형 또한 외인성 표지로 간주될 것이다. 마찬가지로, 형광 염료를 포함하기 위해(예컨대, 효소의 1차 서열의 일부인 시스테인 잔기에 부착함으로써) 변형된 DNA 중합 효소도, 이러한 표지가 중합 효소의 일부가 아니기 때문에, 외인성 표지를 포함하는 것으로 또한 말할 수 있다.
본 명세서에서 사용 시, "비표지된(unlabeled)"은 첨가된 또는 외인성 표지(들) 또는 태그(들)를 가지지 않는 분자 종을 지칭한다. 물론, 비표지된 뉴클레오타이드는 외인성 형광 표지, 또는 외인성 라만 산란 태그를 포함하지 않을 것이다. 천연 뉴클레오타이드는 비표지된 분자 종의 또 다른 예이다. 비표지된 분자 종은 본 명세서에 기재되거나 핵산 서열 결정 또는 분석 생화학에 관련된 기술 분야 내 공지된 하나 이상의 표지를 배제할 수 있다.
결합에 의한 서열 결정
중합 효소-기반의, 핵산 결합에 의한 서열 결정(SBB) 반응이 본 명세서에 기재되며, 이러한 중합 효소는 반응의 개별적인 단계 동안 개방 및 폐쇄된 입체 구조 사이에 입체 구조적 전이를 거친다. 하나의 단계에서, 중합 효소는 프라이밍된 주형 핵산에 결합하여 이원 복합체를 형성하며, 이는 또한 본 명세서에서 주입-전 입체 구조로서 지칭된다. 후속 단계에서, 도입되는 뉴클레오타이드는 결합되고 중합 효소는 손가락 패쇄(finger close)하여, 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산 및 뉴클레오타이드를 포함하는 예비-화학적 입체 구조를 형성하며; 이러한 결합된 뉴클레오타이드는 혼입되지 않았다. 상기 단계는, 본 명세서에서 또한 "검사" 단계로서 지칭되며, 포스포다이에스터 결합이 뉴클레오타이드로부터 동시 파이로포스페이트 절단(즉, 뉴클레오타이드 혼입)으로 형성되는 화학적 단계가 수행될 수 있다. 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산 및 새롭게 혼입된 뉴클레오타이드는 화학반응-후(post-chemistry), 번역-전(pre-translation) 입체 구조를 생성한다. 화학반응-전(pre-chemistry) 입체 구조 및 전좌-전(pre-translocation) 입체 구조 모두는 중합 효소(중합 효소는 폐쇄 상태임), 프라이밍된 주형 핵산 및 뉴클레오타이드를 포함하므로, 본 명세서에서 입체 구조 중 하나는 폐쇄 복합체 또는 폐쇄된 삼원 복합체로서 지칭될 수 있다. 폐쇄된 주입-전 상태에서, Mg2+와 같은 2가 촉매 금속 이온은 프라이머의 3' 하이드록실에 의한 파이로포스페이트(PPi)의 친핵성 치환을 포함하는 급속한 화학 반응을 일으킨다. 중합 효소는 PPi의 방출, 전좌-후 단계 시 개방 상태로 복귀하며, 전좌는 다음 반응을 개시한다. 폐쇄 복합체는 2가 촉매 금속 이온(예컨대, Mg2+)의 부재하에 형성될 수 있는 반면, 폐쇄된 복합체의 중합 효소는 2가 금속 이온의 뉴클레오타이드의 존재하에 뉴클레오타이드의 화학적 첨가에 능숙하다. Mg2+와 같은 촉매 금속 이온의 수준이 낮거나 결핍되면, 폐쇄 복합체에 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 비공유적(예컨대, 물리적) 격리를 야기한다. 이러한 폐쇄 복합체는 안정화된 또는 포획된 폐쇄 복합체로서 지칭될 수 있다. 상기 기재된 임의의 반응 단계에서, 핵산과 중합 효소 배열 및/또는 상호 작용은 주형 핵산 서열에서 바로 다음의 정확한 염기를 식별하기 위해 검사 단계 동안 모니터링될 수 있다. 혼입 이전 또는 이후에, 반응 조건은 프라이밍된 주형 핵산으로부터 중합 효소를 분리시키기 위해 변경될 수 있고, 국소적인 환경으로부터 중합 효소 결합을 억제하는 임의의 시약을 제거하기 위해 다시 변경될 수 있다.
일반적으로 말하면, SBB 절차는 바로 다음의 주형 염기를 식별하는 "검사" 단계, 및 선택적으로 하나 이상의 상보적인 뉴클레오타이드를 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 성분의 3'-말단에 첨가하는 "혼입" 단계를 포함한다. 첨가될 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 정체는 공유 결합을 통한 뉴클레오타이드의 프라이머의 3'-말단에 대한 화학적 결합 없이, 또는 이전에 결정된다. 검사 단계는 절차에 사용되는 프라이밍된 주형 핵산을 제공하는 단계, 및 프라이밍된 주형 핵산과 중합 효소(예컨대, DNA 중합 효소) 및 가능한 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드로서 조사되고 있는 하나 이상의 시험 뉴클레오타이드를 접촉시키는 단계를 포함한다. 추가적으로, 시험 뉴클레오타이드의 존재하에 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 사이의 상호 작용을 모니터링 또는 측정하는 것을 포함하는 단계가 있다. 선택적으로, 상호 작용은 안정화제의 존재하에 일어날 수 있고, 이러한 중합 효소-핵산 상호 작용은 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 안정화된다. 다시, 검사 단계는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 정체를, 상기 뉴클레오타이드의 혼입을 요구하지 않으면서 식별 또는 결정한다. 달리 말하면, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 정체는, 하나 이상의 검사 주기가 표지된 또는 비표지된 뉴클레오타이드를 사용하여 수행되는 경우, 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키지 않고 확인할 수 있다.
단일 주형 핵산 분자를 포함하는 방법이 편의상 기재될 수 있지만, 이러한 방법은 단지 예시이다. 본 명세서에 제공되는 서열 결정 방법은 복수의 주형 핵산을 용이하게 포함하며, 이러한 복수의 핵산은 단일 핵산, 또는 이종 핵산의 클론에 의해 증폭된 복제물을 비롯한, 조합물, 예컨대 클론에 의해 증폭된 이종 핵산의 집단일 수 있다. 이에 따라, 이러한 서열 결정 방법이 본 명세서에 자세히 개시된다.
검사 단계
본 명세서에 기재된 기법에 따른 검사 단계는 일반적으로 다음의 하위 단계를 포함한다: (1) 프라이밍된 주형 핵산(즉, 프라이머와 혼성화된 주형 핵산 분자)을 제공하는 단계; (2) 프라이밍된 주형 핵산과, 중합 효소 및 하나 이상의 시험 뉴클레오타이드의 농도에 대하여 상이한 두 가지 조건("제1" 및 "제2" 조건)을 제공하는 반응 혼합물을 접촉시키는 단계; (3) 임의의 뉴클레오타이드를 프라이밍된 주형 핵산 내로 화학적으로 혼입시키지 않고 뉴클레오타이드(들)의 존재하에 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자의 상호 작용을 모니터링하는 단계; 및 (4) 모니터링된 상호 작용을 사용하여 주형 핵산(즉, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드) 내 바로 다음의 염기를 식별하는 단계. 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머는 연장가능한 프라이머일 수 있다. 시험 뉴클레오타이드의 염기가 프라이밍된 주형 핵산 분자의 바로 다음의 염기에 상보적인 경우, 프라이밍된 주형 핵산, 중합 효소 및 시험 뉴클레오타이드는 삼원 복합체를 형성할 수 있다. 상기 언급된 접촉 단계의 제2 조건하에서, 시험 뉴클레오타이드가 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드인 경우, 중합 효소 및 시험 뉴클레오타이드 모두는 삼원 복합체를 형성하기 충분한 시험 뉴클레오타이드의 농도로 존재한다. 상기 언급된 접촉 단계의 제1 조건하에서, 중합 효소는 일반적으로 제2 조건과 실질적으로 동일한 농도로 존재하지만, 시험 뉴클레오타이드는 부재하거나, 제2 조건에서 사용되는 농도의 30%, 더욱 바람직하게 20%, 또는 더욱 더 바람직하게 10% 이하의 농도로 존재한다. 시험 뉴클레오타이드의 염기가 프라이밍된 주형 핵산 분자의 바로 다음의 염기에 상보적이지 않은 경우, 프라이밍된 주형 핵산 및 중합 효소는 이원 복합체를 형성할 수 있다. 선택적으로, 이원 복합체의 형성보다 삼원 복합체의 형성에 유리한 조건하에서 접촉이 일어난다. 식별 단계는 프라이밍된 주형 핵산의 바로 다음의 염기에 상보적인 뉴클레오타이드의 염기를 식별하는 것을 포함한다.
상기 모든 단계는 연장된 서열 정보를 획득하기 위해 1회 이상 반복될 수 있다. 예를 들어, 접촉 및 모니터링 단계는 1회 이상 반복될 있다. 선택적으로, 접촉 및 모니터링 단계는 중합 효소 및 제1 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물을 사용하여 반복된다. 선택적으로, 접촉 및 모니터링 단계는 중합 효소 및 제2 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물을 사용하여 반복된다. 선택적으로, 접촉 및 모니터링 단계는 중합 효소 및 제3 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물을 사용하여 반복된다. 선택적으로, 접촉 및 모니터링 단계는 중합 효소 및 제4 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물을 사용하여 반복된다. 중합 효소 및 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 각각의 접촉 단계는 중합 효소 및 더 낮은 농도(예컨대, 10배 이상 낮은)의 동일한 시험 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드의 부재를 포함하는 접촉 단계가 선행되는 것을 이해해야 한다. 이에 따라, 선행 접촉 단계는 시험 뉴클레오타이드의 부재하에 중합 효소와 접촉하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에 제공되는 서열 결정 방법에서, DNA 중합 효소 및 하나 이상의 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물은 1, 2, 3, 또는 4 유형의 뉴클레오타이드 분자(예컨대, 표지된 또는 비표지된 뉴클레오타이드 중 하나)를 포함할 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드는 dATP, dTTP, dCTP, 및 dGTP로부터 선택되는 천연 뉴클레오타이드이다. 선택적으로, 반응 혼합물은 하나 이상의 트라이포스페이트 뉴클레오타이드 및 하나 이상의 다이포스페이트 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 폐쇄 복합체는 프라이밍된 주형 핵산, 중합 효소, 및 반응 혼합물에 포함된 4 종류의 뉴클레오타이드 분자 중 하나 사이에서 형성된다.
제공되는 방법의 특정 실시예에서, 프라이밍된 주형 핵산은 중합 효소를 포함하지만 첨가된 시험 뉴클레오타이드를 가지지 않는 반응 혼합물과 초기에 접촉된다. 그 후, 프라이밍된 주형 핵산은 중합 효소 및 제1 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물; 다음으로, 제1 시험 뉴클레오타이드 및 제2 시험 뉴클레오타이드의 조합물을 포함하는 반응 혼합물; 다음으로, 중합 효소 및 제1 시험 뉴클레오타이드, 제2 시험 뉴클레오타이드, 및 제3 시험 뉴클레오타이드의 조합물을 포함하는 반응 혼합물; 및 다음으로 중합 효소 및 제1 시험 뉴클레오타이드, 제2 시험 뉴클레오타이드, 제3 시험 뉴클레오타이드, 및 제4 시험 뉴클레오타이드의 조합물을 포함하는 반응 혼합물과 접촉된다. 모니터링은 연속적으로, 또는 각 반응 혼합물을 변경시킨 후 일어날 수 있다.
검사 단계는 뉴클레오타이드 혼입이 약화되거나, 달성되도록 제어될 수 있다. 검사 단계 동안 뉴클레오타이드 혼입이 약화되는 경우, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 정체를 결정한 후 별도의 혼입 단계가 수행될 수 있다. 검사 단계 동안 염기가 이미 식별되었음에 따라, 별도의 혼입 단계는 모니터링을 필요로 하지 않고 수행될 수 있다. 검사 동안 뉴클레오타이드 혼입이 선행하는 경우, 혼입 이후 핵산에 중합 효소를 포획하는 안정화제를 사용하여 후속 뉴클레오타이드 혼입이 약화될 수 있다. 가역적으로 종결된 뉴클레오타이드(즉, 가역적 종결자 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드)는 또한 후속 뉴클레오타이드의 첨가를 방지하도록 사용될 수 있다. 중합 효소와 주형 핵산 사이의 상호 작용은 뉴클레오타이드 상의 표지 없이 모니터링될 수 있음에 따라, SBB 방법은 주형 핵산 염기의 표지된 뉴클레오타이드의 사용을 필요로 하지 않고 제어된 결정을 가능하게 한다. 그러나, 분명히 하자면, 표지된 뉴클레오타이드(예컨대, 형광 뉴클레오타이드)의 사용은 결합된 뉴클레오타이드의 형광 검출을 가능하게 하기 위해 현재 개시된 절차를 수행하는 경우 선택적이다.
본 명세서에 제공되는 서열 결정 방법에서, 시험 뉴클레오타이드(예컨대, 하나 이상의 시험 뉴클레오타이드) 3' 하이드록실 기를 포함하며, 이는 예를 들어, 유리 3' 하이드록실 기일 수 있다. 선택적으로, 시험 뉴클레오타이드 분자의 3' 하이드록실 기는 3' 차단 모이어티를 포함하도록 변형된다. 3' 종결자 모이어티는 가역적 종결자일 수 있거나, 비가역적 종결자일 수 있다. 선택적으로, 하나 이상의 뉴클레오타이드 분자의 가역적 종결자는 가역적 종결자를 포함했던 시험 뉴클레오타이드를 사용하는 검사 단계 이후 일부 지점에서 대체 또는 제거된다.
접촉 단계
개시된 방법은 프라이밍된 주형 핵산과 DNA 중합 효소 및 하나 이상의 시험 뉴클레오타이드를 접촉시키는 두 단계를 사용한다. 제1 단계(본 명세서에서 종종 "1 단계," 또는 "단계 1"로서 지칭됨)는 프라이밍된 주형 핵산을, 첨가된 뉴클레오타이드의 부재 하에 중합 효소와, 또는 뉴클레오타이드가 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드인 경우, 중합 효소 및 삼원 폐쇄 복합체의 최대 형성을 달성하기 위해 요구되는 양 또는 농도 이하의 양 또는 농도의 뉴클레오타이드와 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 시험 뉴클레오타이드는 제2 단계에 사용되는 농도의 30%, 더욱 바람직하게 20%, 또는 더욱 더 바람직하게 10% 이하의 농도로 사용될 수 있다. 제2 단계(본 명세서에서 종종 "2 단계," 또는 "단계 2"로서 지칭됨)는, 시험 뉴클레오타이드가 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드인 경우, 프라이밍된 주형 핵산을 중합 효소와, 최대 삼원 복합체 형성을 생성하기에 충분한 양 또는 농도의 뉴클레오타이드와 조합하여 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 "포화" 수준의 뉴클레오타이드는 오직 합리적인 시험을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다. 지침으로서, 제1 단계에서 사용되는 중합 효소의 농도는 제1 단계에서 400 nM 이상 및 제2 단계에서 400 nM 이하일 수 있다. 추가적인 지침으로서, 제1 단계에서 사용되는 dNTP의 농도는 0 내지 10 μM, 및 제2 단계에서 20 내지 400 μM일 수 있다. 절차의 제1 및 제2 단계가 단일 농도의 중합 효소를 사용할 수 있지만, 중합 효소 농도가 상이하여 제1 단계에 사용된 농도보다 높은 경우 또한 우수한 결과가 달성되었다. 바람직하게, 중합 효소 농도는 상이한 두 접촉 단계에서 실질적으로 동일하여, 시험 뉴클레오타이드의 농도가 절차의 변수로서 분리된다. 이에 따라, 일반적으로 말하면, 제2 접촉 단계 동안의 시험 뉴클레오타이드의 농도는 초기(즉, 제1) 접촉 단계에서 사용될 수 있는 시험 뉴클레오타이드의 농도보다 높을 것이다. 선택적으로, 시험 뉴클레오타이드는 초기 프라이밍된 주형 핵산 접촉에 사용되는 용액으로부터 완전히 제거될 수 있다. 이러한 예시에서, 시험 뉴클레오타이드의 제1 농도는 0 μM일 것이다. 선택적으로, 초기(즉, 제1) 접촉 단계의 시험 뉴클레오타이드의 농도는 종래의 수단에 의해 검출되지 않을 정도로 낮다.
프라이밍된 주형 핵산 분자와 중합 효소 및 하나 이상의 시험 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 반응 혼합물의 접촉은 삼원 복합체의 형성을 안정화 및/또는 이원 복합체의 형성을 불안정화시키는 조건하에서 일어날 수 있다. 선택적으로, 반응 혼합물은 칼륨 글루타메이트를 포함한다. 선택적으로, 삼원 복합체의 형성을 안정화시키는 조건은 프라이밍된 주형 핵산과 안정화제의 접촉을 포함한다. 선택적으로, 반응 혼합물은 안정화제를 포함한다. 안정화제는 하나 이상의 비촉매 금속 이온일 수 있다. 예시적인 비촉매 금속 이온은 스트론튬 이온, 주석 이온, 니켈 이온, 및 유로퓸 이온을 포함한다. 예를 들어, 프라이밍된 주형 핵산, 중합 효소, 및 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 검사 단계의 반응 혼합물은 또한 안정화제로서 0.01 mM 내지 30 mM 스트론튬 클로라이드를 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 프라이밍된 주형 핵산은 고체 지지체의 표면에 고정된다. 고정화는 프라이밍된 주형 핵산 중 하나의 가닥, 다른 가닥, 또는 심지어 두 가닥 모두와 고체 지지체 사이의 공유 또는 비공유 결합을 사용할 수 있다. 예를 들어, 프라이밍된 주형 핵산의 주형 및 프라이머 가닥이 상이한 분자인 경우, 주형 가닥은, 예를 들어 5'-말단을 통해 고정될 수 있다. 그러나, 중합 효소와 상호 작용을 할 수 있는 프라이머의 3' 말단이 필요하다.
프라이밍된 주형 핵산이 고체 지지체에 고정된 경우, 접촉 단계가 수행되는 방법에 대한 대안이 존재한다. 예를 들어, 고체 지지체는 상이한 시약 용액을 함유하는 상이한 용기(예컨대, 멀티웰 플레이트의 개별적인 웰) 사이에 물리적으로 전달될 수 있다. 이는 자동화 또는 로봇식 기구를 사용하여 편리하게 수행된다. 또 다른 예에서, 프라이밍된 주형 핵산은 플로우 셀 또는 챔버 내부 고체 지지체에 고정된다. 이러한 예시에서, 상이한 접촉 단계는 챔버를 통해, 또는 고정된 프라이밍된 주형 핵산을 가로 질러 상이한 액체 시약의 제어된 흐름에 의해 수행될 수 있다.
모니터링 단계
뉴클레오타이드 분자의 존재하에 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자의 상호 작용의 모니터링 또는 측정은 여러 상이한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 모니터링은 프라이밍된 주형 핵산, 중합 효소, 및 뉴클레오타이드 사이의 상호 작용에 대한 결합(association) 동역학 측정을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 분자의 존재하에 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자의 상호 작용 모니터링은 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자 사이의 평형 결합 상수(즉, 뉴클레오타이드의 존재하에 주형 핵산에 대한 중합 효소의 평형 결합 상수)를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 이에 따라, 예를 들어, 모니터링은 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합 효소의 평형 결합 상수를 측정하는 것을 포함한다. 뉴클레오타이드 분자의 존재하에 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자의 상호 작용 모니터링은 4 종류의 뉴클레오타이드 중 임의의 하나의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산으로부터 중합 효소의 해리 동역학을 측정하는 것을 포함한다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 분자의 존재하에 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자의 상호 작용 모니터링은 폐쇄 복합체의 동역학(즉, 프라이밍된 주형 핵산, 중합 효소, 및 뉴클레오타이드의 해리)을 측정하는 것을 포함한다. 선택적으로, 측정된 결합 동역학은 뉴클레오타이드 분자의 정체에 따라 달라진다. 선택적으로, 중합 효소는 사용되는 뉴클레오타이드 각 유형에 대해 상이한 친화력을 가진다. 선택적으로, 중합 효소는 폐쇄 복합체 각 유형에서 뉴클레오타이드 각 유형에 대한 상이한 해리 상수를 가진다. 결합, 평형 및 해리 동역학은 공지되어 있으며 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Markiewicz et al., Nucleic Acids Research 40(16):7975-84 (2012); Xia et al., J. Am. Chem. Soc. 135(1):193-202 (2013); Brown et al., J. Nucleic Acids, Article ID 871939, 11 pages (2010); Washington, et al., Mol. Cell. Biol. 24(2):936-43 (2004); Walsh and Beuning, J. Nucleic Acids, Article ID 530963, 17 pages (2012); 및 Roettger, et al., Biochemistry 47(37):9718-9727 (2008)]을 참조하며, 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
모니터링 단계는, 제1 뉴클레오타이드를 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키지 않고, 제1 뉴클레오타이드의 존재하에 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산의 정상 상태 상호 작용을 모니터링하는 것을 포함할 수 있다. 선택적으로, 모니터링은 제1 뉴클레오타이드를 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키지 않고, 제1 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산으로부터 중합 효소의 해리를 모니터링하는 것을 포함한다. 선택적으로, 모니터링은 제1 뉴클레오타이드를 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키지 않고, 제1 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산과 중합 효소의 결합을 모니터링하는 것을 포함한다. 또한, 상기 절차의 시험 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드(즉, 비표지된), 표지된 뉴클레오타이드(예컨대, 형광 표지된 뉴클레오타이드), 또는 뉴클레오타이드 유사체(예컨대, 가역적 또는 비가역적 종결자 모이어티를 포함하기 위해 변형된 뉴클레오타이드)일 수 있다.
본 명세서에 제공되는 서열 결정 방법에서, 반응 혼합물 내 촉매 금속 이온의 부재 또는 중합 효소의 활성 부위 내 촉매 금속 이온의 부재는 뉴클레오타이드의 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 내로의 화학적 혼입을 방지한다. 선택적으로, 접촉 단계의 반응 혼합물에서 촉매 금속 이온의 킬레이트화는 뉴클레오타이드의 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 내로의 화학적 혼입을 방지한다. 선택적으로, 비촉매 금속 이온은 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 삼원 폐쇄 복합체에 대한 안정화제로서 작용한다. 선택적으로, 접촉 단계의 반응 혼합물에서 촉매 금속 이온을 비촉매 금속 이온으로 치환하면 뉴클레오타이드 분자의 프라이밍된 주형 핵산으로의 화학적 혼입을 방지한다. 선택적으로, 촉매 금속 이온은 마그네슘이다. 중합 효소의 금속 이온 메커니즘은 낮은 농도의 금속 이온이 중합 효소-뉴클레오타이드-DNA 결합 상호 작용을 안정화시키기 위해 필요할 수 있다고 가정한다. 예를 들어, 문헌[Section 27.2.2, Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L, Biochemistry 5th Edition, WH Freeman Press, 2002]을 참조한다.
선택적으로, 검사 단계의 반응 혼합물에서 낮은 농도의 촉매 이온(즉, 시험 뉴클레오타이드의 존재 또는 부재하에 결합 중합 효소에 사용되는 이온)은 시험 뉴클레오타이드의 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 내로의 화학적 혼입을 방지한다. 선택적으로, 낮은 농도의 촉매 이온(예컨대, 마그네슘 이온)은 약 1 μM 내지 약 100 μM이다. 선택적으로, 낮은 농도는 약 0.5 μM 내지 약 5 μM이다. 선택적으로, 검사 단계의 반응 혼합물은 코발트를 포함하며, 혼입 단계는 검사 단계의 반응 혼합물 내 코발트의 농도와 비교하여 높은 농도의 코발트룰 포함하는 혼입 반응 혼합물과 접촉하는 것을 포함한다.
검사 단계는 뉴클레오타이드의 화학적 혼입을 방지하는 조건을 제공하면서 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 사이의 상호 작용을 모니터링하여, 핵산 주형 가닥의 프라이머 바로 다음의 염기의 정체를 결정할 수 있도록 부분적으로 제어될 수 있다. 이러한 반응 조건은 "검사 반응 조건"으로 지칭될 수 있다. 선택적으로, 삼원 복합체 또는 폐쇄 복합체는 검사 조건하에 형성된다. 선택적으로, 안정화된 삼원 복합체 또는 폐쇄 복합체는 검사 조건하에서 또는 화학반응-전 입체 구조에서 형성된다. 선택적으로, 안정화된 폐쇄 복합체는 전좌-전 입체 구조이며, 여기서 둘러싸인 뉴클레오타이드는 혼입되지만, 폐쇄 복합체는 후속 뉴클레오타이드의 혼입을 허용하지 않는다. 선택적으로, 검사 조건은 상이한 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합 효소의 친화력 차이를 두드러지게 한다. 선택적으로, 검사 조건은 상이한 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합 효소의 상이한 친화력을 유발한다. 예시로서, 상이한 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합 효소의 상이한 친화력을 유발하는 검사 조건은, 고염(high salt) 및 칼륨 글루타메이트의 포함을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합 효소 친화력을 변형시키도록 사용될 수 있는 칼륨 글루타메이트의 농도는 10 mM 내지 1.6 M의 칼륨 글루타메이트, 또는 10 mM 내지 1.6 M 중 임의의 양을 포함한다. 선택적으로, 고염은 50 mM 내지 1,500 mM 염의 염 농도를 지칭한다.
검사는 일반적으로, 모니터링 단계에서, 주형 핵산과의, 또는 주형 핵산 및 뉴클레오타이드의 조합과의 중합 효소 상호 작용을 검출하는 것을 포함한다. 검출은 광학, 전기, 열, 음향, 화학적 및 기계적 수단을 포함할 수 있다. 선택적으로, 모니터링은 완충제 변경 또는 세척 단계 이후에 수행되며, 이러한 세척 단계는 관찰 영역으로부터 임의의 결합하지 않은 시약(예컨대, 결합되지 않은 중합 효소 및/또는 뉴클레오타이드)을 제거한다. 선택적으로, 모니터링은 완충제 변경 또는 세척 단계 동안 수행되어, 바로 다음의 염기의 정체를 결정하기 위해 중합 효소-핵산 또는 중합 효소-핵산-뉴클레오타이드 복합체의 해리 동역학이 사용될 수 있다. 선택적으로, 모니터링은 검사 반응 혼합물 또는 제1 반응 혼합물의 첨가 과정 동안 수행되어, 핵산의 바로 다음의 염기의 정체를 결정하기 위해 핵산에 대한 중합 효소의 결합 동역학이 사용될 수 있다. 선택적으로, 모니터링은 중합 효소 및 프라이밍된 주형 핵산의 이원 복합체로부터 폐쇄 복합체를 구별하는 것을 포함한다. 선택적으로, 모니터링은 측정된 친화력이 평형 친화력인 평형 조건하에서 수행된다. 상이한 또는 유사한 검사 시약을 포함하는 다수의 검사 단계는, 바로 다음의 주형 염기의 정체를 확인하기 위해 순차적으로 수행될 수 있다. 다수의 검사 단계는 다수의 주형 핵산이 하나의 서열 결정 반응에서 동시에 서열 결정되는 경우에 사용될 수 있으며, 여기서 상이한 핵산이 상이한 검사 시약에 대해 상이하게 반응한다. 선택적으로, 다수의 검사 단계는 바로 다음의 염기 결정의 정확도를 개선할 수 있다.
예시적인 서열 결정 반응에서, 검사 단계는 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 폐쇄 복합체의 형성 및/또는 안정화를 포함한다. 폐쇄 복합체의 형성 및/또는 방출 특성은 둘러싸인 뉴클레오타이드 및 이에 따른 주형 핵산 내 바로 다음의 염기를 식별하기 위해 모니터링된다. 폐쇄 복합체 특성은 서열 결정 반응 성분(예컨대, 중합 효소, 프라이머, 주형 핵산, 뉴클레오타이드) 및/또는 반응 혼합물 성분 및/또는 조건에 따라 달라질 수 있다. 선택적으로, 폐쇄 복합체는 화학반응-전 입체 구조이다. 선택적으로, 폐쇄 복합체는 전좌-전 입체 구조이다. 선택적으로, 폐쇄 복합체는 전좌-후 입체 구조이다.
검사 단계는 시험 뉴클레오타이드의 존재하에 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산의 상호 작용을 모니터링하는 것을 포함한다. 폐쇄 복합체의 형성은 모니터링될 수 있다. 선택적으로, 폐쇄 복합체의 형성의 부재가 모니터링된다. 선택적으로, 폐쇄 복합체의 해리가 모니터링된다. 선택적으로, 혼입 단계는 뉴클레오타이드의 혼입을 모니터링하는 것을 포함한다. 선택적으로, 혼입 단계는 뉴클레오타이드 혼입의 부재를 모니터링하는 것을 포함한다.
검사 및/또는 혼입 단계 중 임의의 공정이 모니터링될 수 있다. 선택적으로, 중합 효소는 외인성 표지 또는 "태그"를 가진다. 선택적으로, 중합 효소의 검출가능한 태그 또는 표지는 제거될 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 또는 중합 효소는 검출가능한 표지를 가지지만, 그러나, 서열 결정 동안 표지는 검출되지 않는다. 선택적으로, 서열 결정 반응의 어떠한 성분도 외인성 표지를 사용하여 검출 가능하게 표지되지 않는다.
뉴클레오타이드의 혼입을 가능하게 하거나, 가능하지 않게 하는 조건하에서 정확한 및 부정확한 뉴클레오타이드의 존재하에, 주형 핵산에 대한 중합 효소의 친화력의 다양성을 모니터링하여, 핵산의 서열을 결정할 수 있다. 변형된 또는 표지된 뉴클레오타이드를 포함하는 상이한 뉴클레오타이드의 존재하에 주형 핵산에 대한 중합 효소의 친화력은 다양한 뉴클레오타이드의 존재하에 중합 효소-핵산 상호 작용의 해리 속도(off-rate)로서 모니터링될 수 있다. 다양한 일치된/정확한, 불일치된/부정확한 및 변형된 뉴클레오타이드에 대한 다수의 표준 중합 효소의 친화력 및 해리 속도는 기술 분야 내에 공지되어 있다. Klenow 중합 효소의 단일 분자 촬상은, 혼입이 방지되는 상이한 뉴클레오타이드 유형에 대한 주형 핵산의 해리 속도가, 명백하며 상이하게 측정됨을 나타낸다.
선택적으로, 특정 유형의 뉴클레오타이드는 프라이밍된 주형 핵산의 존재하에 중합 효소에 이용 가능하다. 반응이 모니터링되어, 뉴클레오타이드가 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드인 경우, 중합 효소는 안정화되어 폐쇄 복합체를 형성할 수 있다. 뉴클레오타이드가 부정확한 뉴클레오타이드인 경우, 폐쇄 복합체가 여전히 형성될 수 있지만; 추가적인 안정화제 또는 반응 조건(예컨대, 촉매 이온, 중합 효소 억제제, 염의 부재)의 도움이 없으면, 폐쇄 복합체는 해리될 수 있다. 해리 속도는 중합 효소, 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드, 뿐만 아니라 반응 조건의 특정 조합의 친화력에 따라 달라진다. 선택적으로, 친화력은 해리 속도로서 측정된다. 선택적으로, 친화력은 폐쇄 복합체에 대해 상이한 뉴클레오타이드 사이에 상이하다. 예를 들어, 프라이머의 3'-말단의 주형 핵산의 하류에서 바로 다음의 염기가 G인 경우, 해리 속도로서 측정되는 중합 효소-핵산의 친화력은 dATP, dCTP, dGTP 또는 dTTP가 첨가되는 여부에 따라 상이할 것으로 예상된다. 이러한 경우, dCTP가 가장 느린 해리 속도를 가질 것이며, 다른 뉴클레오타이드는 상호 작용에 대해 상이한 해리 속도를 제공한다. 선택적으로, 해리 속도는 반응 조건, 예를 들어, 안정화제의 존재(예컨대, 마그네슘 또는 억제 화합물의 부재) 또는 반응 조건(예컨대, 뉴클레오타이드 변이체 또는 변형된 중합 효소)에 따라 상이할 수 있다. 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 정해지면, 1, 2, 3, 4 종류 이상의 뉴클레오타이드 유형이 특이적으로 폐쇄 복합체의 형성을 표적화하는 조건하에서 반응 혼합물에 동시에 도입될 수 있다. 과량의 뉴클레오타이드는 폐쇄 복합체의 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드에 혼입시키기 위해 조절된 반응 혼합물 및 반응 조건으로부터 제거될 수 있다. 이러한 서열 결정 반응은 서열 결정 사이클 당 오직 하나의 뉴클레오타이드가 혼입됨을 확실시한다.
뉴클레오타이드의 존재하에 주형 핵산에 대한 중합 효소의 친화력은 당업자에게 공지되어 있는 복수의 방법으로 측정될 수 있다. 선택적으로, 친화력은 해리 속도로서 측정되며, 이러한 해리 속도는 반응이 세척 완충액에 의해 세척될 때 주형 핵산으로부터 중합 효소의 방출을 모니터링함으로써 측정된다. 선택적으로, 친화력은 해리 속도로서 측정되며, 이러한 해리 속도는 평형 결합 조건, 특히 중합 효소 결합 속도가 낮거나 제한된 확산의 평형 결합 조건하에서, 주형 핵산으로부터 중합 효소의 방출을 모니터링함으로써 측정된다. 중합 효소 결합 속도는 충분히 낮은 농도의 중합 효소에서 확산이 제한될 수 있고, 여기서 중합 효소가 DNA-중합 효소 복합체로부터 떨어져 나가면, 즉시 다시 로딩되지 않고, 복합체로부터 방출된 중합 효소를 검출할 수 있을 만큼 충분한 시간을 허용한다. 보다 높은 친화력 상호 작용에 있어서, 중합 효소는 핵산으로부터 천천히 방출되는 반면, 낮은 친화력의 상호 작용은 중합 효소가 더욱 빠르게 방출되도록 한다. 이러한 경우에, 친화력의 스펙트럼은 상이한 해리 속도를 의미하며, 이러한 해리 속도는 동적인 세척 조건하에서 또는 평형에서 측정된다. 가장 낮은 해리 속도는 첨가된 뉴클레오타이드에 상보적인 염기에 상응하는 반면, 다른 해리 속도는 중합 효소 및 선택되는 뉴클레오타이드의 조합에 따라, 공지된 방식으로 달라진다.
선택적으로, 해리 속도는 중합 효소 및 뉴클레오타이드가 반응 혼합물에 제공된 이후 평형 신호 강도로서 측정되며, 가장 낮은 해리 속도(가장 높은 친화력)의 뉴클레오타이드와의 상호 작용은 가장 강한 신호를 생성하는 반면, 다른, 다양한, 해리 속도 뉴클레오타이드와의 상호 작용은 측정가능한 상이한 강도의 신호를 생성한다. 비제한적인 예시로서, 바람직하게 내부 전반사(TIRF) 조건하에서 측정된 형광 표지된 중합 효소는 적절하게 선택된 시간 구간에서 표면-고정된 핵산 분자에 결합된 중합 효소 분자의 수에 따라 달라지는, 상이한 측정된 형광 강도를 생성한다. 중합 효소의 고유 형광, 예를 들어, 트립토판 형광이 또한 사용될 수 있다. 높은 해리 속도 상호 작용은, 선택된 시간 구간에서 결합된 중합 효소 분자의 수가 매우 작음에 따라 낮은 측정된 강도를 생성하며, 높은 해리 속도는 대부분의 중합 효소가 핵산으로부터 결합되지 않음을 나타낸다. 표지된 또는 형광 방식을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 표면 국소화 측정 방식이 사용될 수 있다. 평형 조건하에서 친화력을 측정하는 적합한 측정 방식으로는, 결합 질량, 굴절률, 표면 전하, 유전체 상수, 및 분야 내 공지된 다른 방식을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 선택적으로, 결합 속도 및 해리 속도 조작의 조합은 제안된 방식에서 높은 정확도의 검출을 산출한다. 비제한적인 예시로서, 균일하게 낮은 결합 속도의, 염기-의존적인, 다양한 해리 속도는 결합되지 않은 중합 효소를 연장된 기간 동안 결합되지 않은 채로 남아있게 하여, 해리 속도 및 측정된 강도에서의 변화의 식별을 향상시킨다. 결합 속도는 첨가된 중합 효소, 뉴클레오타이드, 또는 중합 효소 및 뉴클레오타이드 둘 모두의 농도를 낮춤으로써 조작될 수 있다.
선택적으로, 중합 효소과 핵산 사이의 상호 작용은 중합 효소에 부착된 검출가능한 태그를 통해 모니터링된다. 태그는 비제한적으로 광학, 전기, 열, 질량, 크기, 전하, 진동, 및 압력을 포함하는 검출 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 표지는 자기, 형광 또는 하전될 수 있다. 외부 및 내부 표지 방식에 있어서, 폐쇄 복합체에서 핵산에 대한 중합 효소의 안정한 결합을 측정하도록 형광 비등방성이 사용될 수 있다.
예시로서, 중합 효소는 형광단(fluorophore)을 사용하여 태그되며, 폐쇄 복합체 형성은 안정한 형광 신호로서 모니터링된다. 부정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 중합 효소와 주형 핵산의 불안정한 상호 작용은 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 형성된 폐쇄 복합체와 비교하여 측정가능한 약한 신호를 초래한다. 그러나, 바람직한 특정 구체예에서, 결합에 의한 서열 결정 절차는 중합 효소에 결합된 임의의 외인성 표지(예컨대, 형광 표지)의 검출에 의존하지 않는다. 예를 들어, 중합 효소는 천연 중합 효소일 수 있다.
식별 단계
바로 다음의 정확한 염기 또는 뉴클레오타이드의 정체는 삼원 복합체 또는 폐쇄 복합체의 존재, 형성 및/또는 해리를 모니터링함으로써 결정될 수 있다. 바로 다음의 염기의 정체는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 프라이머의 3'-말단에 화학적으로 혼입시키지 않고 결정될 수 있다. 선택적으로, 바로 다음의 염기의 정체는 첨가된 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합 효소의 친화력을 모니터링함으로써 결정된다. 선택적으로, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합 효소의 친화력은 주형 핵산 상의 바로 다음의 정확한 염기를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 부정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합 효소의 친화력은 주형 핵산 상의 바로 다음의 정확한 염기를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
혼입 단계
선택적으로, 본 명세서에 제공된 방법은 혼입 단계를 추가로 포함한다. 예시로서, 혼입 단계는 주형 핵산의 바로 다음의 염기에 상보적인 단일 뉴클레오타이드(예컨대, 비표지된 뉴클레오타이드, 가역적 종결자 뉴클레오타이드, 또는 검출 가능하게 표지된 뉴클레오타이드 유사체)를 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 분자 내로 혼입시키는 것을 포함한다. 선택적으로, 혼입 단계는 프라이밍된 주형 핵산 분자, 중합 효소 및 뉴클레오타이드와 혼입 반응 혼합물을 접촉시키는 것을 포함한다. 혼입 반응 혼합물은, 일반적으로 촉매 금속 이온을 포함한다.
제공된 방법은 혼입 단계 이후 다음 검사 단계를 위해 프라이밍된 주형 핵산 분자를 제조하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 선택적으로, 제조 단계는 프라이밍된 주형 핵산 또는 핵산/중합 효소 복합체를, 세척 단계; 온도 변화; 기계적 진동; pH 변화; 염 또는 완충 조성물 변화, 광학적 자극 또는 이의 조합 중 하나 이상으로 처리하는 것을 포함한다. 선택적으로, 세척 단계는 프라이밍된 주형 핵산 또는 프라이밍된 주형 핵산/중합 효소 복합체와 하나 이상의 완충액, 청정제, 단백질 변성제, 프로테아제(protease), 산화제, 환원제, 또는 중합 효소 내의 내부 가교 또는 중합 효소와 핵산 사이의 가교를 해제할 수 있는 다른 제제 중 하나 이상과 접촉시키는 것을 포함한다.
선택적으로, 상기 방법은 주형 핵산 분자의 서열을 결정하기 위해 검사 단계 및 혼입 단계를 반복하는 것을 추가로 포함한다. 검사 단계는 혼입 단계을 수행하기 전 1회 이상 반복될 수 있다. 선택적으로, 두 가지의 연속적인 검사 단계는 상이한 뉴클레오타이드 분자(예컨대, 표지된 또는 비표지된 상이한 뉴클레오타이드)를 가지는 반응 혼합물을 포함한다. 선택적으로, 단일 뉴클레오타이드를 프라이밍된 주형 핵산 분자 내로 혼입시키기 전, 제1 반응 혼합물은 중합 효소 및 1, 2, 3, 또는 4가지 유형의 뉴클레오타이드 분자(예컨대, 상이한 비표지된 뉴클레오타이드)를 포함하는 제2 반응 혼합물로 대체된다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 분자는 dATP, dTTP, dCTP, 및 dGTP로부터 선택되는 천연 뉴클레오타이드이다.
혼입 반응은 혼입 반응 혼합물에 의해 가능해 질 수 있다. 선택적으로, 혼입 반응 혼합물은 검사 반응과 상이한 조성의 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 검사 반응은 하나의 유형의 뉴클레오타이드를 포함하며, 혼입 반응은 또 다른 유형의 뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 예시로서, 검사 반응은 하나의 유형의 뉴클레오타이드를 포함하며 혼입 반응은 4가지 유형의 뉴클레오타이드를 포함하거나, 그 반대이다. 선택적으로, 검사 반응 혼합물은 혼입 반응 혼합물로 변경 또는 대체된다. 선택적으로, 혼입 반응 혼합물은 촉매 금속 이온, 칼륨 클로라이드, 또는 이의 조합을 포함한다.
반응 혼합물 내 존재하지만 폐쇄 복합체 내 격리되지 않은 뉴클레오타이드는 다중 뉴클레오타이드 주입을 야기할 수 있다. 이에 따라, 포획된 폐쇄 복합체 내에 격리된 뉴클레오타이드 만이 혼입 단계 동안 혼입될 수 있도록 하기 위해, 세척 단계는 화학적 혼입 단계 전에 사용될 수 있다. 선택적으로, 유리 뉴클레오타이드는 포스파타제(phosphatase)와 같은 효소에 의해 제거될 수 있다. 포획된 중합 효소 복합체는 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산 및 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 폐쇄 복합체, 안정화된 폐쇄 복합체 또는 삼원 복합체일 수 있다.
선택적으로, 검사 단계의 폐쇄 복합체 내에 둘러싸인 뉴클레오타이드는 혼입 단계 동안 주형 핵산 프라이머의 3'-말단 내로 혼입된다. 선택적으로, 검사 단계의 폐쇄 복합체 내에 둘러싸인 뉴클레오타이드는 검사 단계 동안 혼입되지만, 폐쇄 복합체는 후속 뉴클레오타이드의 혼입을 허용하지 않으며; 이러한 예시에서, 폐쇄 복합체는 혼입 단계 동안 해제되어, 후속 뉴클레오타이드가 혼입되도록 한다.
선택적으로, 혼입 단계는 검사 단계의 뉴클레오타이드를 대체하고, 또 다른 뉴클레오타이드를 주형 핵산 프라이머의 3'-말단 내로 혼입시키는 것을 포함한다. 혼입 단계는 폐쇄 복합체내로부터 뉴클레오타이드를 방출하고(예컨대, 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체임), 상이한 종류의 뉴클레오타이드를 주형 핵산 프라이머의 3'-말단으로 혼입시키는 것을 추가로 포함한다. 선택적으로, 방출된 뉴클레오타이드는 제거되고 옆의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 혼입 반응 혼합물로 대체된다.
혼입에 적합한 반응 조건은 검사 반응 혼합물을 혼입 반응 혼합물로 교체하는 것을 포함할 수 있다. 선택적으로, 검사 반응 혼합물 내 존재하는 뉴클레오타이드는 혼입 반응 혼합물 중 하나 이상의 뉴클레오타이드로 대체된다. 선택적으로, 검사 단계 동안 존재하는 중합 효소는 혼입 단계 동안 대체된다. 선택적으로, 검사 단계 동안 존재하는 중합 효소는 혼입 단계 동안 변형된다. 선택적으로, 검사 단계 동안 존재하는 하나 이상의 뉴클레오타이드는 혼입 단계 동안 변형된다. 검사 단계 동안 존재하는 반응 혼합물 및/또는 반응 조건은 혼입 단계 동안 임의의 수단에 의해 변경될 수 있다. 이러한 수단은, 시약 제거, 시약 킬레이트화, 시약 희석, 시약 첨가, 전도성 또는 pH와 같은 반응 조건 변경, 및 임의의 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드의 임의의 조합을 포함하는 반응 혼합물 내 시약은 검사 단계 및/또는 혼입 단계 동안 변형될 수 있다.
선택적으로, 혼입 단계의 반응 혼합물은 경쟁적인 억제제를 포함하며, 이러한 경쟁적인 억제제는 다중 혼입의 발생을 감소시킨다. 특정 구체예에서, 경쟁적인 억제제는 혼입이 불가능한 뉴클레오타이드이다. 특정 구체예에서, 경쟁적인 억제제는 아미노글리코사이드(aminoglycoside)이다. 경쟁적인 억제제는 활성 부위의 뉴클레오타이드 또는 촉매 금속 이온를 대체할 수 있어, 제1 혼입 이후 경쟁적인 억제제가 활성 부위를 점유하여 제2 혼입을 방지한다. 일부 구체예에서, 혼입가능한 뉴클레오타이드 및 경쟁적인 억제제 둘 모두는 혼입 단계에 도입되어, 프라이머의 3'-말단에서 단일 뉴클레오타이드의 혼입을 보장하도록 혼입가능한 뉴클레오타이드 및 억제제의 비율이 조정될 수 있다.
선택적으로, 혼입 반응 혼합물을 포함하는 제공되는 반응 혼합물은, 혼입가능한 뉴클레오타이드가 아닌 하나 이상의 비표지된 뉴클레오타이드 분자를 포함한다. 달리 말하여, 제공되는 반응 혼합물은 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 분자 내로 혼입이 불가능한 하나 이상의 비표지된 뉴클레오타이드 분자를 포함할 수 있다. 혼입가능한 뉴클레오타이드는, 예를 들어, 다이포스페이트 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드를 혼입이 불가능하도록 만드는 트라이포스페이트 기의 변형을 포함할 수 있다. 혼입이 불가능한 뉴클레오타이드의 예는 미국 특허 제7,482,120호에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 그 전체가 참조 문헌으로 포함된다. 선택적으로, 프라이머는 이의 3'-말단에 유리 하이드록실 기를 포함하지 않을 수 있고, 따라서 프라이머가 임의의 뉴클레오타이드를 혼입하지 못하게 하여, 임의의 뉴클레오타이드를 혼입이 불가능하도록 만들 수 있다.
중합 효소 억제제는, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드와 결합할 때 핵산에 중합 효소를 포획하기 위해, 검사 단계에서 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물과 함께 선택적으로 포함될 수 있다. 선택적으로, 중합 효소 억제제는 파이로포스페이트 유사체이다. 선택적으로, 중합 효소 억제제는 알로스테릭(allosteric) 억제제이다. 선택적으로, 중합 효소 억제제는 DNA 또는 RNA 압타머이다. 선택적으로, 중합 효소 억제제는 중합 효소 내 촉매-이온 결합 부위와 경쟁한다. 선택적으로, 중합 효소 억제제는 역전사 효소 억제제이다. 중합 효소 억제제는 HIV-1 역전사 효소 억제제 또는 HIV-2 역전사 효소 억제제일 수 있다. HIV-1 역전사 효소 억제제는 (4/6-할로겐/MeO/EtO-치환된 벤조[d]싸이아졸-2-일)싸이아졸리딘-4-온일 수 있다.
제고되는 서열 결정 방법에서, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 혼입 단계 이전에 식별되어, 혼입 단계가 표지된 시약 및/또는 모니터링을 필요로 하지 않도록 한다. 이에 따라, 제공된 방법에서, 뉴클레오타이드는, 선택적으로, 부착된 검출가능한 태그 또는 표지를 포함하지 않는다. 선택적으로, 뉴클레오타이드는 검출가능한 표지를 포함하지만, 이러한 표지는 상기 방법에서 검출되지 않는다. 선택적으로, 정확한 뉴클레오타이드는 검출가능한 표지를 포함하지 않지만; 부정확한 또는 바로 다음의 염기에 비상보적인 뉴클레오타이드는 검출가능한 표지를 포함한다.
서열 결정 반응 중 검사 단계는 혼입 단계 이전에 1, 2, 3, 4회 이상 반복될 수 있다. 검사 및 혼입 단계는 주형 핵산의 원하는 서열이 획득될 때까지 반복될 수 있다.
폐쇄 복합체 또는 안정화된 폐쇄 복합체의 형성은 서열 결정 사이클 당 오직 하나의 뉴클레오타이드가 주형 핵산 프라이머에 첨가되는 것을 확실시하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 첨가된 뉴클레오타이드는 폐쇄 복합체내에 격리된다. 서열 결정 사이클 당 단일 뉴클레오타이드의 제어된 혼입은 동종 중합체 반복을 포함하는 핵산 영역에 대한 서열 결정 정확도를 향상시킨다.
반응 혼합물
핵산 서열 결정 반응 혼합물, 또는 간단하게 "반응 혼합물"은 일반적으로 중합 효소-기반의 핵산 합성 반응에 흔히 존재하는 시약을 포함한다. 반응 혼합물 시약은, 효소(예컨대, 중합 효소), dNTP, 주형 핵산, 프라이머 핵산, 염, 완충액, 소분자, 보조 인자, 금속, 및 이온을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이온은 촉매 이온, 2가 촉매 이온, 비촉매 이온, 비공유 금속 이온, 또는 이의 조합일 수 있다. 반응 혼합물은 염, 예컨대 NaCl, KCl, 칼륨 아세테이트, 암모늄 아세테이트, 글루타메이트, NH4Cl, 또는 NH4HSO4를 포함할 수 있다. 반응 혼합물은 이온의 공급원, 예컨대 Mg2+ 또는 Mn2+ Mg-아세테이트, Co2+ 또는 Ba2+를 포함할 수 있다. 반응 혼합물은 주석 이온, Ca2+, Zn2+, Cu2+, Co2+, Fe2+, Ni2+, 또는 Eu+3을 포함할 수 있다. 완충액은 Tris, Tricine, HEPES, MOPS, ACES, MES, 포스페이트-기반의 완충액, 및 아세테이트-기반의 완충액을 포함할 수 있다. 반응 혼합물은 킬레이트화제, 예컨대 EDTA, EGTA 등을 포함할 수 있다. 선택적으로, 반응 혼합물은 가교 시약을 포함한다. 선택적으로, 전술한 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있는, 검사 단계 동안 사용되는 반응 혼합물, 뿐만 아니라 뉴클레오타이드 혼입 동안 사용되는 혼입 반응 혼합물이 본 명세서에 제공된다. 반응 혼합물이 검사 동안 사용되는 경우 본 명세서에서 검사 반응 혼합물로서 지칭될 수 있다. 선택적으로, 검사 반응 혼합물은 높은 농도의 염; 높은 pH; 1, 2, 3, 4 가지 이상 유형의 비표지된 뉴클레오타이드; 칼륨 글루타메이트; 킬레이트화제; 중합 효소 억제제; 촉매 금속 이온; 비촉매 금속 이온; 또는 임의의 이의 조합을 포함한다. 검사 반응 혼합물은 10 mM 내지 1.6 M 또는 10 mM 내지 1.6 M 중 임의의 양의 칼륨 글루타메이트를 포함할 수 있다. 선택적으로, 혼입 반응 혼합물은 촉매 금속 이온; 1, 2, 3, 4가지 이상 유형의 뉴클레오타이드(예컨대, 비표지된 뉴클레오타이드); 칼륨 클로라이드; 비촉매 금속 이온; 또는 임의의 이의 조합을 포함한다.
선택적으로, 반응 혼합물은 개시된 기법에 따라 검사 단계 동안 폐쇄 복합체의 형성 및 안정화를 조절한다. 예를 들어, 검사 단계의 반응 조건은 선택적으로 뉴클레오타이드를 캡슐화하는 폐쇄 복합체의 형성 및/또는 안정화를 유리하게 하고, 이원 복합체의 형성 및/또는 안정화를 방해할 수 있다. 중합 효소와 주형 핵산 사이의 이원 상호 작용은 서열 결정 반응 파라미터, 예컨대 이온 강도, pH, 온도, 또는 임의의 이의 조합을 조절함으로써, 또는 반응에 이원 복합체 불안정화제를 첨가함으로써 조작될 수 있다. 선택적으로, 고염(예컨대, 50 mM 내지 1,500 mM) 및/또는 pH 변화가 이원 복합체를 불안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 이원 복합체는 뉴클레오타이드의 존재 여부와 상관 없이 서열 결정 반응의 검사 또는 혼입 단계 동안 중합 효소와 주형 핵산 사이에 형성될 수 있다. 선택적으로, 반응 조건은 폐쇄된 삼원 복합체의 안정화 및 이원 복합체의 불안정화를 유리하게 한다. 예시로서, 검사 반응 혼합물의 pH는 pH 4.0 내지 pH 10.0으로 조정되어, 폐쇄된 삼원 복합체의 안정화 및 이원 복합체의 불안정화를 유리하게 할 수 있다. 선택적으로, 검사 반응 혼합물의 pH는 pH 4.0 내지 pH 6.0이다. 선택적으로, 검사 반응 혼합물의 pH는 pH 6.0 내지 pH 10.0이다.
본 명세서에 개시된 제공된 반응 혼합물 및 서열 결정 방법은 뉴클레오타이드의 화학적 첨가를 제어하면서 바로 다음의 염기의 정체를 밝히는 방식으로 뉴클레오타이드 및 주형 핵산과 중합 효소 상호 작용을 촉진한다. 선택적으로, 상기 방법은 검출가능하게 표지된 뉴클레오타이드의 부재하에 또는 표지된 뉴클레오타이드의 존재하에 수행되며, 이러한 표지는 검출되지 않는다.
검사 반응 혼합물 조건하에서, 프라이밍된 주형 핵산에 결합된 중합 효소 및 중합 효소-주형 핵산 복합체 내에 둘러싸인 뉴클레오타이드를 포함하는 폐쇄 복합체의 형성 및/또는 안정화를 촉진하는 반응 혼합물 및 방법이 본 명세서에 제공된다. 검사 반응 조건은 뉴클레오타이드 혼입을 억제 또는 약화시킬 수 있다. 선택적으로, 둘러싸인 뉴클레오타이드의 혼입이 억제되며, 복합체는 안정화되거나 화학반응-전 입체 구조 또는 삼원 복합체 내에 포획된다. 선택적으로, 둘러싸인 뉴클레오타이드가 혼입되며 후속 뉴클레오타이드 혼입은 억제된다. 이러한 예시에서, 복합체는 안정화되거나, 전좌-전 입체 구조내에 포획된다. 본 명세서에 제공된 서열 결정 반응에 있어서, 폐쇄 복합체는 검사 단계 동안 안정화되어, 제어된 뉴클레오타이드 혼입을 가능하게 한다. 선택적으로, 안정화된 폐쇄 복합체는 검사 단계 동안 둘러싸인 뉴클레오타이드의 혼입이, 일시적으로(예컨대, 복합체를 검사하고, 이어서 뉴클레오타이드를 혼입시키기 위해) 또는 영구적으로(예컨대, 오직 검사만을 위해) 약화된 복합체이다. 선택적으로, 안정화된 폐쇄 복합체는 둘러싸인 뉴클레오타이드가 혼입되도록 하지만, 후속 뉴클레오타이드가 혼입되도록 하지 않는다. 선택적으로, 폐쇄 복합체는, 주형 핵산의 바로 다음의 염기를 식별하기 위해 안정화되어, 뉴클레오타이드의 존재하에 주형 핵산과 임의의 중합 효소 상호 작용을 모니터링한다.
선택적으로, 둘러싸인 뉴클레오타이드는 폐쇄 복합체의 주형 핵산에 대한 결합을 매우 감소되거나 억제된다. 선택적으로, 둘러싸인 뉴클레오타이드는 바로 다음의 염기에서 주형 핵산에 대해 염기-쌍을 이룬다. 선택적으로, 중합 효소, 뉴클레오타이드, 프라이머, 주형 핵산, 또는 임의의 이의 조합의 정체는, 폐쇄 복합체 내의 둘러싸인 뉴클레오타이드와 주형 핵산 사이의 상호 작용에 영향을 미친다.
선택적으로, 둘러싸인 뉴클레오타이드는 폐쇄 복합체의 중합 효소에 결합된다. 선택적으로, 둘러싸인 뉴클레오타이드는 폐쇄 복합체의 중합 효소에 약하게 연결된다. 선택적으로, 중합 효소, 뉴클레오타이드, 프라이머, 주형 핵산, 또는 임의의 이의 조합의 정체는, 폐쇄 복합체 내의 둘러싸인 뉴클레오타이드와 중합 효소 사이의 상호 작용에 영향을 미친다. 주어진 중합 효소에 대해, 각각의 뉴클레오타이드는 또 다른 뉴클레오타이드보다 중합 효소에 대해 상이한 친화력을 가진다. 선택적으로, 이러한 친화력은, 부분적으로, 주형 핵산 및/또는 프라이머에 의존한다.
폐쇄 복합체는 일시적으로 형성될 수 있다. 선택적으로, 둘러싸인 뉴클레오타이드는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드이다. 일부 방법에서, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재는, 부분적으로, 폐쇄 복합체의 안정화에 기여한다. 선택적으로, 둘러싸인 뉴클레오타이드는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 아니다.
선택적으로, 검사 반응 조건은 복수의 프라이밍된 주형 핵산, 중합 효소, 뉴클레오타이드, 또는 임의의 이의 조합을 포함한다. 선택적으로, 복수의 뉴클레오타이드는 1, 2, 3, 4가지 이상 유형의 상이한 뉴클레오타이드, 예를 들어 dATP, dTTP, dGTP, 및 dCTP를 포함한다. 선택적으로, 복수의 주형 핵산은 주형 핵산의 클론 집단이다.
폐쇄 복합체의 안정성을 조절할 수 있는 반응 조건으로는 촉매 금속 이온의 이용가능성, 차선의 또는 억제 금속 이온, 이온 강도, pH, 온도, 중합 효소 억제제, 가교 시약, 및 임의의 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 폐쇄 복합체의 안정성을 조절할 수 있는 반응 시약으로는 혼입이 불가능한 뉴클레오타이드, 부정확한 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 변형된 중합 효소, 연장 불가능한 중합 개시 부위를 가지는 주형 핵산, 및 임의의 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
검사 반응 혼합물은 다른 분자를 포함할 수 있으며, 이는 효소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 선택적으로, 검사 반응 혼합물은 핵산 중합 반응 내 일반적으로 존재하는 임의의 시약 또는 생체 분자를 포함한다. 반응 성분은 염, 완충액, 소분자, 금속, 및 이온을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 선택적으로, 반응 혼합물의 성질은, 예를 들어, 전기적, 자기적, 및/또는 진동을 이용하여 조작될 수 있다.
뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체
본 명세서에 기재된 결합에 의한 서열 결정 절차를 수행하는데 유용한 뉴클레오타이드는, 천연 뉴클레오타이드, 표지된 뉴클레오타이드(예컨대, 천연 뉴클레오타이드에서 발견되지 않는 외인성 형광 염료 또는 다른 표지를 포함하는 뉴클레오타이드), 및 뉴클레오타이드 유사체(예컨대, 가역적 종결자 모이어티를 가지는 뉴클레오타이드)를 포함한다.
현재 기재된 기법과 관련하여 사용될 수 있는 뉴클레오타이드의 성질에는 유연성이 있다. 뉴클레오타이드는 다음 염기 중 어느 하나의 질소 함유 염기를 포함할 수 있다: 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티미딘, 또는 우라실. 선택적으로, 뉴클레오타이드는 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 아이소사이토신, 아이소구아닌, 나이트로피롤(3-나이트로피롤 포함) 또는 나이트로인돌(5-나이트로인돌 포함) 염기를 포함한다. 유용한 뉴클레오타이드는, ATP, UTP, CTP, GTP, ADP, UDP, CDP, GDP, AMP, UMP, CMP, GMP, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dUTP, dADP, dTDP, dCDP, dGDP, dUDP, dAMP, dTMP, dCMP, dGMP, 및 dUMP를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 선택적으로, 포스페이트 기는 모이어티를 사용하여 변형된다. 모이어티는 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드의 3' OH 기는 모이어티를 사용하여 변형된다. 모이어티는 3' 가역적 또는 비가역적 종결자일 수 있다. 뉴클레오타이드는 또한 DNA 중합 효소의 종결 억제제, 다이디옥시뉴클레오타이드 또는 2',3' 다이디옥시뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 이는 ddNTP(ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP 및 ddUTP)로 약칭된다.
선택적으로, 검사 단계의 폐쇄 복합체는 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함하여 폐쇄 복합체의 안정화를 용이하게 한다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 질소 함유 염기, 5 탄소 당, 및 포스페이트 기를 포함하며, 뉴클레오타이드의 임의의 성분은 변형 및/또는 대체될 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 혼입이 불가능한 뉴클레오타이드일 수 있다. 혼입이 불가능한 뉴클레오타이드는 변형되어, 서열 결정 방법 동안 임의의 지점에서 혼입 가능해질 수 있다.
뉴클레오타이드 유사체로는, 알파-포스페이트 변형된 뉴클레오타이드, 알파-베타 뉴클레오타이드 유사체, 베타-포스페이트 변형된 뉴클레오타이드, 베타-감마 뉴클레오타이드 유사체, 감마-포스페이트 변형된 뉴클레오타이드, 갇힌(caged) 뉴클레오타이드, 또는 ddNTP를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 뉴클레오타이드 유사체의 예가 미국 특허 제8,071,755호에 기재되어 있으며, 상기 특허는 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
뉴클레오타이드 유사체는 프라이머의 3'-말단에서 뉴클레오타이드 혼입을 가역적으로 방지하는 종결자를 포함할 수 있다. 가역적 종결자 중 하나의 유형은 3'-O-차단된 가역적 종결자이다. 여기서 종결자 모이어티는 뉴클레오타이드의 5-탄소 당의 3'-OH 말단의 산소 원자에 연결된다. 예를 들어, 미국 특허 제7,544,794호 및 제8,034,923호(상기 발명의 개시 내용은 참조 문헌으로 포함됨)는 3'-OH 기가 3'-ONH2 기로 대체된 가역적 종결자 dNTP를 기재한다. 이러한 유형의 가역적 종결자 모이어티는 (예컨대, "차단 해제(deblocking)" 단계에서) NaNO2를 포함하는 아세테이트-완충 용액을 사용하여 편리하게 제거될 수 있다. 또 다른 유형의 가역적 종결자 뉴클레오타이드는 EP 1 974 057에 기재된 2'-변형된 가역적 종결자이다. 또 다른 유형의 가역적 종결자는 종결자 모이어티가 뉴클레오타이드의 질소 함유 염기에 연결된 3'-비차단된 가역적 종결자이다. 예를 들어, 미국 특허 제8,808,989호(상기 발명의 개시 내용은 참조 문헌으로 포함됨)는 본 명세서에 기재된 방법과 관련하여 사용될 수 있는 염기-변형된 가역적 종결자 뉴클레오타이드의 특정 예시를 개시한다. 본 명세서에 기재된 방법과 관련하여 유사하게 사용될 수 있는 다른 가역적 종결자는 미국 특허 제7,956,171호, 제8,071,755호, 및 제9,399,798호에 기재된 가역적 종결자를 포함한다(상기 미국 특허의 개시 내용은 참조 문헌으로 포함됨). 종결자를 가지는 뉴클레오타이드 유사체에 대한 검토는, 예를 들어, 문헌[Mu, R., et al., "The History and Advances of Reversible Terminators Used in New Generations of Sequencing Technology," Genomics, Proteomics & Bioinformatics 11(1):34-40 (2013)]을 참조한다. 선택적으로, 검사 단계 동안 사용되는 하나 이상의 천연 뉴클레오타이드는 혼입 단계 동안 혼입되는 제2 유형의 뉴클레오타이드로 대체된다. 예를 들어, 검사 단계 동안 사용되는 반응 혼합물 내 존재하는 뉴클레오타이드는 가역적 종결자 모이어티를 포함하는(예컨대, 뉴클레오타이드 분자의 염기 또는 당에 위치) 뉴클레오타이드 유사체로 대체될 수 있다.
선택적으로, 뉴클레오타이드는 프라이머의 3'-말단으로의 뉴클레오타이드 혼입을 비가역적으로 예방하는 종결자를 가지는 변형된 뉴클레오타이드 유사체로 치환된다. 비가역적 뉴클레오타이드 유사체는 다이디옥시뉴클레오타이드, ddNTP(ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP)를 포함한다. 다이디옥시뉴클레오타이드는 중합 효소-매개 합성에 필수적인 dNTP의 3'-OH 기를 가지지 않는다.
선택적으로, 혼입이 불가능한 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드가 핵산 중합 반응의 혼입 단계 동안 제2 뉴클레오타이드(프라이머의 3' OH)에 공유 결합을 형성하는 것을 억제 또는 방지하는 차단 모이어티를 포함한다. 차단 모이어티는 뉴클레오타이드로부터 제거되어, 뉴클레오타이드 혼입을 가능하게 할 수 있다.
선택적으로, 폐쇄 복합체에 존재하는 뉴클레오타이드 유사체는 폐쇄 복합체를 안정하게 한다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 혼입이 불가능하다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 방출되며 및 천연 뉴클레오타이드가 혼입된다. 선택적으로, 폐쇄 복합체가 풀리고, 뉴클레오타이드 유사체가 변형되어 변형된 뉴클레오타이드 유사체가 혼입된다. 선택적으로, 폐쇄 복합체는 폐쇄 복합체 내 뉴클레오타이드 유사체를 변형 및/또는 불안정화시키는 반응 조건하에서 해제된다.
선택적으로, 폐쇄 복합체에 존재하는 뉴클레오타이드 유사체가 혼입되며 폐쇄 복합체는 안정화된다. 폐쇄 복합체는 뉴클레오타이드 유사체에 의해, 또는 예를 들어, 본 명세서에 개시된 임의의 안정화 방법에 의해 안정화될 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 후속 뉴클레오타이드가 혼입되도록 하지 않는다. 폐쇄 복합체는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 해제될 수 있고, 뉴클레오타이드 유사체는 변형된다. 변형된 뉴클레오타이드 유사체는 이의 3'-말단에 뉴클레오타이드의 후속 혼입을 가능하게 할 수 있다.
선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 검사 단계 동안 반응 혼합물에 존재한다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4가지 이상 뉴클레오타이드 유사체가 검사 단계 동안 반응 혼합물에 존재한다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 혼입 단계 동안 대체, 희석, 또는 격리된다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 천연 뉴클레오타이드로 대체된다. 천연 뉴클레오타이드는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 혼입 단계 동안 변형된다. 변형된 뉴클레오타이드 유사체는 천연 뉴클레오타이드와 유사하거나 동일할 수 있다.
선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 천연 뉴클레오타이드보다 중합 효소에 대해 상이한 결합 친화력을 가진다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 천연 뉴클레오타이드보다 바로 다음의 염기와 상이한 상호 작용을 가진다. 뉴클레오타이드 유사체 및/또는 혼입이 불가능한 뉴클레오타이드는 주형 핵산의 상보적인 염기와 염기쌍을 이룰 수 있다.
선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 중합 효소에 접합된 변형된 또는 천연의 뉴클레오타이드이다. 선택적으로, 복수의 뉴클레오타이드 유사체는 복수의 중합 효소에 대한 융합체를 포함하며, 이러한 각각의 뉴클레오타이드 유사체는 상이한 중합 효소를 포함한다.
뉴클레오타이드는 이원 복합체의 형성보다는 폐쇄 복합체의 형성에 유리하게 변형될 수 있다. 뉴클레오타이드는 중합 효소에 대해 높은 친화력을 가지도록 선택 또는 변형될 수 있고, 이러한 중합 효소는 주형 핵산에 결합하기 전에 뉴클레오타이드에 결합한다.
폐쇄 복합체에 중합 효소를 포획하는 임의의 뉴클레오타이드 변이체는 본 명세서에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 뉴클레오타이드는 영구적으로 또는 일시적으로 포획될 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 폐쇄 복합체가 안정화되는 수단이 아니다. 임의의 폐쇄 복합체 안정화 방법은 뉴클레오타이드 유사체를 사용하는 반응에 조합될 수 있다.
선택적으로, 폐쇄 복합체를 안정화하는 뉴클레오타이드 유사체는 폐쇄 복합체를 해제하는 반응 조건과 보통 조합된다. 이러한 조건은 해제 시약(예컨대, 마그네슘 또는 망간과 같은 촉매 금속 이온)의 존재를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 선택적으로, 폐쇄 복합체는 심지어 촉매 금속 이온의 존재하에 안정화된다. 선택적으로, 폐쇄 복합체는 심지어 뉴클레오타이드 유사체의 존재하에서도 해제된다. 선택적으로, 폐쇄 복합체의 안정화는 안정화 시약 및/또는 해제 시약의 농도 및/또는 정체, 및 임의의 이의 조합에 부분적으로 의존한다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체를 사용하는 폐쇄 복합체의 안정화는 폐쇄 복합체를 안정화하는 역할을 하는 추가적인 반응 조건과 조합되며, 이러한 조건은, 촉매 금속 이온의 격리, 제거, 감소, 생략, 및/또는 킬레이트화; 중합 효소 억제제, 가교제의 존재; 및 임의의 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
선택적으로, 하나 이상의 뉴클레오타이드는 구별되는 및/또는 검출가능한 태그 또는 표지로 표지될 수 있지만; 이러한 태그 또는 표지는 염기의 검사, 식별 또는 염기의 혼입 동안 검출되지 않으며, 본 명세서에 개시된 서열 결정 방법 동안 검출되지 않는다. 태그는 형광, 라만 스펙트럼, 전하, 질량, 굴절률, 발광도, 길이, 또는 임의의 다른 측정가능한 성질의 차이에 의해 구별 가능하다. 태그는 뉴클레오타이드의 하나 이상의 상이한 위치에 부착되어, 중합 효소-핵산 복합체에 대한 결합의 정확도는 충분히 유지되는 한, 주형 핵산 상의 상보적인 염기를 정확하게 식별할 수 있다. 선택적으로, 태그는 뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 위치에 부착된다. 적합한 반응 조건하에서, 태그된 뉴클레오타이드는 중합 효소 및 프라이밍된 주형 핵산을 가지는 폐쇄 복합체에 둘러싸일 수 있다. 택일적으로, 태그는 뉴클레오타이드의 감마 포스페이트 위치에 부착된다.
중합 효소
개시된 결합에 의한 서열 결정 기법을 수행하는데 유용한 중합 효소는 천연에 존재하는 중합 효소 및 변형된 이의 변이체를 포함하며, 이러한 변이체는, 돌연변이, 재조합체, 융합체, 유전적 변이체, 화학적 변이체, 합성 물질, 및 유사체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 천연에 존재하는 중합 효소 및 변형된 이의 변이체는 중합 반응을 촉매화하는 능력을 보유하는 중합 효소에 제한되지 않는다. 선택적으로, 천연에 존재하는 및/또는 변형된 이의 변이체는 중합 반응을 촉매화하는 능력을 보유한다. 선택적으로, 천연에 존재하는 및/또는 변형된 변이체는 DNA의 서열 결정을 할 수 있는 능력을 향상시키는 특별한 성질을 가지며, 이는 핵산에 대해 향상된 결합 친화력, 핵산에 대해 감소된 결합 친화력, 향상된 촉매 작용 속도, 감소된 촉매 작용 속도 등을 포함한다. 돌연변이 중합 효소는 하나 이상의 아미노산이 다른 (천연에 존재하거나 존재하지 않는) 아미노산으로 대체된 중합 효소를 포함하고, 하나 이상의 아미노산 주입 또는 결실을 포함한다. 변형된 중합 효소는 외부 태그를 포함하는 중합 효소를 포함할 수 있으며, 이는 중합 효소의 존재 및 상호 작용을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 중합 효소로부터의 고유 신호는 이들의 존재 및 상호 작용을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 이에 따라, 제공된 방법은 중합 효소로부터의 고유 신호를 검출함으로써 중합 효소, 뉴클레오타이드 및 주형 핵산의 상호 작용을 모니터링하는 것을 포함할 수 있다. 선택적으로, 고유 신호는 광산란 신호이다. 예를 들어, 고유 신호는 트립토판과 같은 특정 아미노산의 천연 형광을 포함하며, 여기서 중합 효소로부터의 고유 신호의 변화는 폐쇄 복합체의 형성을 나타낼 수 있다. 이에 따라, 제공된 방법에서, 중합 효소는 비표지된 중합 효소이며, 모니터링은 중합 효소와 관련된 검출가능한 표지의 부재하에 수행된다. 일부 변형된 중합 효소 또는 천연에 존재하는 중합 효소는, 특정 반응 조건하에서, 오직 단일 뉴클레오타이드를 혼입시킬 수 있고, 단일 뉴클레오타이드의 혼입 이후 프라이머-주형에 결합된 채로 유지될 수 있다. 선택적으로, 중합 효소의 엄지 및 손가락 도메인은 중합 효소의 폐쇄된 형태에서 물리적 인접함으로 인해 일시적인 또는 공유 가교를 형성할 수 있다. 가교는, 예를 들어 엄지 및 손가락 도메인 상의 적합한 위치에서 천연 또는 조작된 시스테인에 의해 형성될 수 있다.
용어 중합 효소 및 이의 변이체는, 본 명세서에서 사용 시, 또한 서로 연결된 적어도 두 부분을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 예를 들어, 뉴클레오타이드의 핵산 가닥 내로 중합을 촉매화할 수 있는 펩타이드를 포함하는 하나의 부분은, 리포터 효소(reporter enzyme) 또는 진행성-변형 도메인과 같은 제2 모이어티를 포함하는 또 다른 부분에 연결된다. 예를 들어, T7 DNA 중합 효소는 핵산 중합 도메인 및 싸이오레독신(thioredoxin) 결합 도메인을 포함하며, 이러한 싸이오레독신 결합은 중합 효소의 진행성을 향상시킨다. 싸이오레독신 결합이 없으면, T7 DNA 중합 효소는 오직 하나 내지 수 개의 염기의 진행성을 가지는 분배형 중합 효소이다. DNA 중합 효소는 세부적으로 다르지만, 손가락, 손바닥, 및 엄지로서 지칭되는 특정 영역을 가지는, 전반적으로 유사한 손의 모양; 및 핵산의 합성 동안 엄지 및/또는 손가락 도메인의 이동을 포함하여 전반적으로 유사한 구조적 전이를 가진다.
DNA 중합 효소는 박테리아 DNA 중합 효소, 진핵 DNA 중합 효소, 고세균 DNA 중합 효소, 바이러스 DNA 중합 효소 및 파지 DNA 중합 효소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 박테리아 DNA 중합 효소는 대장균 DNA 중합 효소 I, II 및 III, IV 및 V, 대장균 DNA 중합 효소의 클레노브 절편(Klenow fragment), 클로스트리디움 스터코랄리움(Clostridium stercorarium, Cst) DNA 중합 효소, 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum, Cth) DNA 중합 효소 및 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus, Sso) DNA 중합 효소를 포함한다. 진핵 DNA 중합 효소는 DNA 중합 효소 α, β, γ, δ, €, η, ζ, λ, σ, μ, 및 k, 뿐만 아니라 Revl 중합 효소(말단 디옥시시티딜 전이 효소) 및 말단 디옥시뉴클레오티딜 전이 효소(TdT)를 포함한다. 바이러스 DNA 중합 효소는 T4 DNA 중합 효소, phi-29 DNA 중합 효소, GA-l, phi-29-유형 DNA 중합 효소, PZA DNA 중합 효소, phi-15 DNA 중합 효소, Cpl DNA 중합 효소, Cp7 DNA 중합 효소, T7 DNA 중합 효소, 및 T4 DNA 중합 효소를 포함한다. 다른 DNA 중합 효소는 내열성 및/또는 호열성 DNA 중합 효소, 예컨대 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus, Taq) DNA 중합 효소, 써무스 필리포미스(Thermus filiformis, Tfi) DNA 중합 효소, 써모코쿠스 질리기(Thermococcus zilligi, Tzi) DNA 중합 효소, 써머스 테르모필루스(Thermus thermophilus, Tth) DNA 중합 효소, 써머스 플라버스(Thermus flavusu, Tfl) DNA 중합 효소, 파이로코커스 워세이(Pyrococcus woesei, Pwo) DNA 중합 효소, 파이로코커스 퓨리어서스(Pyrococcus furiosus, Pfu) DNA 중합 효소 및 Turbo Pfu DNA 중합 효소, 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis, Tli) DNA 중합 효소, 파이로코커스 종(Pyrococcus sp.) GB-D 중합 효소, 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima, Tma) DNA 중합 효소, 바실루스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus, Bst) DNA 중합 효소, 파이로코커스 코다카라엔시스(Pyrococcus Kodakaraensis, KOD) DNA 중합 효소, Pfx DNA 중합 효소, 써모코커스 종(Thermococcus sp.) JDF-3(JDF-3) DNA 중합 효소, 써모코커스 고르고나리우스(Thermococcus gorgonarius, Tgo) DNA 중합 효소, 써모코커스 아시디필리엄(Thermococcus acidophilium) DNA 중합 효소; 설포로부스 아키도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius) DNA 중합 효소; 써모코커스 종 고(Thermococcus sp. go) N-7 DNA 중합 효소; 피로딕티움 옥쿨툼(Pyrodictium occultum) DNA 중합 효소; 메타노코커스 볼태(Methanococcus voltae) DNA 중합 효소; 메타노코커스 써모오토트로피쿰(Methanococcus thermoautotrophicum) DNA 중합 효소; 메타노코커스 잔나쉬이(Methanococcus jannaschii) DNA 중합 효소; 디설퍼로코커스 균주(Desulfurococcus strain) TOK DNA 중합 효소(D. Tok Pol); 파이로코커스 아비시(Pyrococcus abyssi) DNA 중합 효소; 파이로코커스 호리코쉬이(Pyrococcus horikoshii) DNA 중합 효소; 파이로코커스 아이슬란디쿰(Pyrococcus islandicum) DNA 중합 효소; 써모코커스 퓨미콜란스(Thermococcus fumicolans) DNA 중합 효소; 에로피룸 페르닉스(Aeropyrum pernix) DNA 중합 효소; 및 이종 이합체 DNA 중합 효소 DP1/DP2로부터 분리된 DNA 중합 효소를 포함한다. 조작된 변형된 중합 효소는 또한 개시된 기법과 관련하여 유용하다. 예를 들어, 매우 호열성인 해양 고세균 써모코커스 종 9°N의 변형된 버전(예컨대, MA, Ipswich 소재의 New England BioLabs Inc. 사의 Therminator DNA 중합 효소)이 사용될 수 있다.
RNA 중합 효소는, 바이러스 RNA 중합 효소, 예컨대 T7 RNA 중합 효소, T3 중합 효소, SP6 중합 효소, 및 Kll 중합 효소; 진핵 RNA 중합 효소 예컨대 RNA 중합 효소 I, RNA 중합 효소 II, RNA 중합 효소 III, RNA 중합 효소 IV, 및 RNA 중합 효소 V; 및 고세균 RNA 중합 효소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
역전사 효소는, 인간 면역 결핍 바이러스 1형(PDB 1HMV) 유래의 HIV-1 역전사 효소, 인간 면역 결핍 바이러스 2형 유래의 HIV-2 역전사 효소, 모로니 마우스 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus) 유래의 M-MLV 역전사 효소, 조류 골수아세포증 바이러스(avian myeloblastosis virus) 유래의 AMV 역전사 효소, 및 진핵 세포 염색체의 텔로미어를 유지하는 텔로머레이스 역전사 효소(telomerase reverse transcriptase)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
선택적으로, 중합 효소는 화학 발광 태그로 태그되며, 여기서 패쇄 복합체 형성은 적절한 발광 트리거의 존재하에 안정한 발광 신호로서 모니터링된다. 부정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 중합 효소와 주형 핵산의 불안정한 상호 작용은 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 형성된 폐쇄 복합체와 비교하여 측정가능한 약한 신호를 초래한다. 또한, 발광 유발 이전에 세척 단계는 안정한 폐쇄 복합체에 결합되지 않은 모든 중합 효소 분자를 제거할 수 있다.
선택적으로, 중합 효소는 광학 산란 태그로 태그되어, 폐쇄 복합체 형성은 안정한 광학 산란 신호로서 모니터링된다. 부정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 중합 효소와 핵산의 불안정한 상호 작용은 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 형성된 폐쇄 복합체와 비교하여 측정가능한 약한 신호를 초래한다.
선택적으로, 중합 효소는 플라즈몬 나노 입자 태그로 태그되어, 폐쇄 복합체 형성은, 폐쇄 복합체의 부재하에 또는 부정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 폐쇄 복합체의 존재하에 플라즈몬 공명으로부터 상이한, 플라즈몬 공명의 이동으로서 모니터링된다. 플라즈몬 공명의 변화는 폐쇄 복합체에서 국소적인 유전체 환경의 변화에 기인할 수 있거나, 클론에 의해 증폭된 핵산 분자의 클러스터 상에서 플라즈몬 나노 입자의 동시 응집, 또는 폐쇄 복합체 배열에서 플라즈몬에 상이하게 영향을 미치는 또 다른 수단에 기인할 수 있다.
선택적으로, 중합 효소는 라만 산란 태그로 태그되어, 폐쇄 복합체 형성은 안정한 라만 산란 신호로서 모니터링된다. 부정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 중합 효소와 핵산의 불안정한 상호 작용은 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 형성된 폐쇄 복합체와 비교하여 측정가능한 약한 신호를 초래한다.
선택적으로, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드에 대해 높은 친화력을 가지도록 선택 또는 변형된 중합 효소 상의 태그에 의해 식별되며, 이러한 중합 효소는 주형 핵산에 결합하기 전 뉴클레오타이드에 결합한다. 예를 들어, 아프리카 돼지 열병 바이러스(African Swine Fever virus) 유래의 DNA 중합 효소 X는 변경된 기질 결합 순서를 가지며, 이 때 중합 효소 먼저 뉴클레오타이드에 결합하고, 이어서, 주형 핵산에 결합한다. 선택적으로, 중합 효소는 별도의 구획에서 각 유형의 뉴클레오타이드를 사용하여 배양되며, 이러한 각 구획은 상이한 유형의 뉴클레오타이드를 포함하고, 중합 효소는 배양되는 뉴클레오타이드에 따른 태그로 상이하게 표지된다. 이러한 조건에서, 비표지된 뉴클레오타이드는 표지된 중합 효소에 상이하게 결합된다. 중합 효소는 각 뉴클레오타이드 유형에 결합되는 동일한 종류의 중합 효소, 또는 각 뉴클레오타이드 유형에 결합되는 상이한 중합 효소일 수 있다. 상이하게 태그된 중합 효소-뉴클레오타이드 복합체는 서열 결정 반응의 임의의 단계에 동시에 첨가될 수 있다. 각 중합 효소-뉴클레오타이드 복합체는 바로 다음의 염기가 중합 효소-뉴클레오타이드 복합체의 뉴클레오타이드에 상보적인 주형 핵산에 결합된다. 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드를 운반하는 중합 효소 상의 태그에 의해 식별된다. 표지된 중합 효소-뉴클레오타이드 복합체에 의한 바로 다음의 주형 염기의 조사(interrogation)는 비혼입 및/또는 검사 조건하에서 수행될 수 있고, 여기서 바로 다음의 주형 염기의 정체가 결정되면, 복합체는 불안정화되고 제거, 격리, 및/또는 희석되어, 오직 하나의 뉴클레오타이드가 혼입되는 것을 보장하는 방식으로 별도의 혼입 단계가 수행된다.
중합 효소에 검출가능한 태그를 도입하는 일반적인 방법은 선택적으로 중합 효소의 비활성 영역 내 존재하는 아민 또는 시스테인에 대한 화학적 접합(conjugation)을 포함한다. 이러한 접합 방법은 기술 분야 내에 공지되어 있다. 비제한적인 예시로서, n-하이드록시석신이미드 에스터(NHS 에스터)가 효소에서 발견될 수 있는 표지 아민 기에 일반적으로 사용된다. 시스테인은 싸이올 또는 말레이미드 기와 용이하게 반응할 수 있지만, 카복실 기는 EDC(1-에틸-3-[3-다이메틸아미노프로필]카보다이이미드 하이드로클로라이드)를 사용하여 활성화하여 아민과 반응될 수 있다. 선택적으로, N-하이드록시석신이미드(NHS) 화학반응은 오직 N-말단 아민이 반응성이 있는(예를 들어, pH 7) pH 범위에서 사용되어, 중합 효소 마다 오직 단일 태그가 첨가된다.
선택적으로, 중합 효소에 부착된 태그는 전하 태그(charge tag)이며, 안정한 폐쇄 복합체의 형성은 주형 핵산 주변의 국소적인 전하 밀도의 변화 측정에 의한 전기적 수단에 의해 검출될 수 있다. 전기 전하의 검출 방법은 기술 분야 내에 공지되어 있으며, 이러한 방법은, 예컨대 전계 효과 트랜지스터(field-effect transistor), 유전체 분광법, 임피던스 측정, 및 pH 측정 등을 포함한다. 전계 효과 트랜지스터는, 이온 감응형 전계 효과 트랜지스터(ion-sensitive field-effect transistor, ISFET), 전하 조절 전계 효과 트랜지스터(charge-modulated field-effect transistor), 저항층 게이트 전계 효과 트랜지스터(insulated-gate field-effect transistor), 금속 산화물 반도체 전계 효과 트랜지스터(metal oxide semiconductor field-effect transistor) 및 반도성 단일 벽 탄소 나노튜브를 사용하여 제조된 전계 효과 트랜지스터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
선택적으로, 전하 태그는 약 4 이하 또는 약 10 이상의 등전점을 가지는 펩타이드 태그이다. 선택적으로, 중합 효소는 약 5 이하 또는 약 9 이상의 등전점을 가지는 펩타이드 태그를 가진다. 전하 태그는 양으로 또는 음으로 하전될 수 있는 임의의 모이어티일 수 있다. 전하 태그는 염료로서 질량 및/또는 표지를 포함하는 추가적인 모이어티를 포함할 수 있다. 선택적으로, 전하 태그는 pH의 변화와 같은 특정 반응 조건하에서 양전하 또는 음전하를 보유한다.
중합 효소는 형광단 및/또는 소광제(quencher)로 표지될 수 있다. 선택적으로, 핵산은 형광단 및/또는 소광제로 표지된다. 선택적으로, 하나 이상의 뉴클레오타이드는 형광단 및/또는 소광제로 표지된다. 예시적인 형광단은, 형광 나노 결정; 퀀텀 닷(quantum dot); 다이클로로[R110], 다이클로로[R6G], 다이클로로[TAMRA], 다이클로로[ROX] 등을 포함하는 d-로다민(Rhodamine) 수용체 염료; 플루오레세인, 6-FAM 등을 포함하는 플루오레세인 공여체 염료; 시아닌(Cyanine) 염료, 예컨대 Cy3B; 알렉사(Alexa) 염료, SETA 염료, Atto 염료 예컨대 Cy3B와 FRET 쌍을 형성하는 atto 647N 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 형광단은, MDCC(7-다이에틸아미노-3-[([(2-말레이미딜)에틸]아미노)카보닐]쿠마린), TET, 헥스, Cy3, TMR, ROX, Texas Red, Cy5, LC red 705 및 LC red 640을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 중합 효소 및 다른 분자에 부착을 포함하는 이들의 사용에 대한 형광단 및 방법은 문헌[The Molecular Probes® Handbook(Life Technologies; Carlsbad Calif.)] 및 문헌[Fluorophores Guide(Promega; Madison, WI)]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다. 예시적인 소광제로는, ZEN, IBFQ, BHQ-1, BHQ-2, DDQ-I, DDQ-11, Dabcyl, Qxl 소광제, Iowa Black RQ, 및 IRDye QC-1을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
선택적으로, 입체 구조 감응성 염료는 중합 효소의 중합 능력 또는 정확도에 영향을 미치지 않으면서 중합 효소의 활성 부위 가까이에 부착될 수 있고; 여기서 폐쇄 복합체의 형성으로 인한 입체 구조의 변화, 또는 극성 환경의 변화는 염료의 형광 또는 흡광도 성질의 변화로서 반영된다. Cy3 및 플루오레세인과 같은 일반적인 형광단은, 폐쇄 복합체의 형성이 이원 중합 효소-핵산 복합체와 명백하게 구별될 수 있는 정도로, 중합 효소 결합 및 폐쇄 복합체 형성에 대한 강한 용매화 변색 반응을 가지는 것으로 공지되어 있다. 선택적으로, 폐쇄 복합체는 입체 구조 감응성 염료로부터 형광 또는 흡광 신호의 차이를 기반으로 이원 복합체로부터 구별될 수 있다. 선택적으로, 용매화 변색 염료는 입체 구조 전이를 모니터링하기 위해 사용될 수 있고; 여기서 입체 구조 변화로 인해 유도된 국소적 극성 환경 변화가 리포터 신호로서 사용될 수 있다. 용매화 변색 염료는, Reichart 염료, IR44, 메로사이아닌 염료(예컨대, 메로사이아닌(merocyanine) 540), 4-[2-N-치환된-1,4-하이드로피리딘-4-일리딘)에틸리덴]클로로헥사-2,5-다이엔-1-온, 적색 피라졸론 염료, 아조메틴 염료, 인도아닐린 염료, 다이아자메로사이아닌 염료, 인디고로 예시되는 인디고이드 염료 등 뿐만 아니라 이의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 중합 효소의 특이적 부위에 염료 또는 형광단을 도입하는 방법은 기술 분야 내에 공지되어 있다. 비제한적인 예시로서, 염료를 사용한 T7 DNA 중합 효소의 부위 특이적 표지 절차가 문헌[Tsai et al., "Site-Specific Labeling of T7 DNA Polymerase with a Conformationally Sensitive Fluorophore and Its Use in Detecting Single-Nucleotide Polymorphisms," Analytical Biochemistry 384: 136-144 (2009)]에 제공되며, 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
선택적으로, 중합 효소는 반응을 방해하지 않고 폐쇄 복합체 형성을 감지할 수 있는 위치에 형광단으로 태그된다. 중합 효소는 천연 또는 변형된 중합 효소일 수 있다. 변형된 중합 효소는 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 첨가, 및/또는 결실을 가지는 중합 효소를 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의, 그러나 전부는 아닌, 시스테인 아미노산은 또 다른 아미노산, 예컨대 알라닌으로 돌연변이화된다. 이러한 경우에, 잔여의 하나 이상의 시스테인은 형광단에 대한 부위-특이적 접합에 사용된다. 택일적으로, 하나 이상의 아미노산은 형광단 접합에 적합한 반응성 아미노산, 예컨대 시스테인 또는 1차 아민을 포함하는 아미노산으로 돌연변이화된다.
선택적으로, 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 중합 효소와 주형 핵산 사이의 결합은 형광 감소를 유도할 수 있는 반면, 부정확한 뉴클레오타이드와의 결합은 형광 증가를 야기한다. 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 중합 효소와 주형 핵산 사이의 결합은 형광 증가를 유도할 수 있는 반면, 부정확한 뉴클레오타이드와의 결합은 형광 감소를 야기한다. 형광 신호는 뉴클레오타이드-유도 입체 구조 변화의 동역학을 모니터링하고 주형 핵산 서열의 바로 다음의 염기를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
선택적으로, 중합 효소/핵산 상호 작용은 중합 효소로부터 유래하는 산란 신호, 또는 중합 효소에 부착된 태그, 예를 들어, 나노 입자 태그에 의해 모니터링될 수 있다.
폐쇄 복합체 형성 및 조작 조건
본 명세서에서 사용 시, 폐쇄 복합체는 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드를 포함하는 삼원 복합체일 수 있다. 폐쇄 복합체는, 뉴클레오타이드가 격리되었지만 혼입되지 않은, 화학반응-전 입체 구조일 수 있다. 폐쇄 복합체는, 택일적으로, 뉴클레오타이드가 프라이머의 3'-말단과 포스포다이에스터 결합을 형성함으로써 프라이밍된 주형 핵산에 혼입된, 전좌-전 입체 구조일 수 있다. 폐쇄 복합체는 촉매 금속 이온의 부재 또는 촉매 금속 이온의 결핍 수준하에서 형성될 수 있고, 화학적 혼입 없이 중합 효소 활성 부위 내에 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 물리적으로 격리시킨다. 선택적으로, 격리된 뉴클레오타이드는 혼입이 불가능한 뉴클레오타이드일 수 있다. 폐쇄 복합체는 촉매 금속 이온의 존재하에 형성될 수 있고, 이러한 폐쇄 복합체는 혼입되는 뉴클레오타이드 유사체는 포함하지만, PPi는 방출할 수 없다. 이러한 예시에서, 폐쇄 복합체는 전좌-전 입체 구조로 안정화된다. 선택적으로, 전좌-전 입체 구조는 중합 효소를 화학적으로 가교하여 안정화된다. 선택적으로, 폐쇄 복합체는 외부 수단에 의해 안정화될 수 있다. 일부 예시에서, 폐쇄 복합체는 소분자, 또는 항체 또는 압타머와 같은 거대분자의 알로스테릭 결합에 의해 안정화될 수 있다. 선택적으로, 폐쇄 복합체는 높은 친화력으로 활성 부위 가까이에 결합하여, 중합 효소의 전좌를 방지하는 파이로포스페이트 유사체에 의해 안정화될 수 있다.
본 명세서에서 사용 시, 안정화된 폐쇄 복합체 또는 안정화된 삼원 복합체는 하나의 수단 또는 수단의 조합에 의해 프라이밍된 주형 핵산의 중합 개시 부위(프라이머의 3'-말단)에 포획된 중합 효소를 지칭하며, 이러한 수단으로는, 폐쇄된 입체 구조에서 엄지 및 손가락 도메인의 가교, 중합 효소의 개방된 입체 구조로 복귀를 방지하는 알로스테릭 억제제의 결합, 전좌-전 단계에서 중합 효소를 포획하는 파이로포스페이트 유사체의 결합, 중합 효소의 활성 부위 내 촉매 금속 이온의 부재, 및 촉매 금속 이온의 치환체로서 니켈, 주석 및 Sr2+ 과 같은 금속 이온의 첨가를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이와 같이, 중합 효소는 심지어 뉴클레오타이드의 혼입 이후 중합 개시 부위에 포획될 수 있다. 그러므로, 중합 효소는 화학반응-전 입체 구조, 전좌-전 단계, 전좌-후 단계 또는 이의 임의의 중간 단계에서 포획될 수 있다. 이에 따라, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드 또는 염기의 충분한 검사 및 식별이 가능하다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 중합 효소-기반의, 결합에 의한 서열 결정 반응은 일반적으로 프라이밍된 주형 핵산에 중합 효소 및 하나 이상의 유형의 뉴클레오타이드를 제공하는 단계, 이러한 뉴클레오타이드는 프라이밍된 주형 핵산의 바로 다음의 염기에 상보적이거나, 상보적이지 않을 수 있음, 및 화학반응-전 입체 구조에서 프라이밍된 주형 핵산 내로 뉴클레오타이드의 화학적 혼입이 불가하거나 심각하게 억제되거나, 하나 이상의 상보적인 뉴클레오타이드 혼입 프라이머의 3'-말단에서 일어나는 조건하에서, 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산의 상호 작용을 검사하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 화학반응-전 입체 구조가 바람직하게 안정화제를 사용하여 뉴클레오타이드 혼입 이전에 안정화되면, 별도의 혼입 단계는 단일 뉴클레오타이드를 프라이머의 3'-말단에 혼입시키는 검사 단계가 후속할 수 있다. 선택적으로, 단일 뉴클레오타이드 혼입이 일어나는 경우, 전좌-전 입체 구조는 후속 뉴클레오타이드 혼입의 검사 및/또는 방지하도록 안정화될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 핵산의 서열 결정 방법은 검사 단계를 포함한다. 검사 단계는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물에서 중합 효소를 프라이밍된 주형 핵산의 중합 개시 부위에 결합시키는 것, 및 상호 작용을 모니터링하는 것을 포함한다. 선택적으로, 뉴클레오타이드는 중합 효소-프라이밍된 주형 핵산 복합체 내에서 격리되어, 중합 효소에 의해 둘러싸인 뉴클레오타이드의 혼입이 약화 또는 억제되는 조건하에서, 폐쇄 복합체를 형성한다. 선택적으로, 안정화제는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 첨가되어 삼원 복합체를 안정화한다. 이러한 폐쇄 복합체는 안정화된 구조 또는 중합 효소-포획된 화학반응-전 입체 구조이다. 폐쇄 복합체는 둘러싸인 뉴클레오타이드가 혼입되도록 하지만, 후속 뉴클레오타이드가 혼입되도록 하지 않는다. 이러한 폐쇄 복합체는 안정화된 구조 또는 포획된 전좌-전 입체 구조이다. 선택적으로, 중합 효소는, 하나의 수단 또는 수단의 조합에 의해, 이의 폐쇄복합체의 중합 부위에 포획되며, 이러한 수단으로는, 중합 효소 도메인의 가교, 핵산에 대한 중합 효소의 가교, 소분자에 의한 알로스테릭 억제, 비경쟁적인 억제제, 경쟁적인 억제제, 비경쟁적인 억제제, 및 변성을 포함하지만, 이에 제한되지 않고; 여기서 포획된 폐쇄 복합체의 형성은 핵산 주형의 바로 다음의 염기의 정체의 정보를 제공한다.
선택적으로, 폐쇄 복합체는 이의 포획된 또는 안정화된 입체 구조로부터 해제되어, 뉴클레오타이드가 주형 핵산 프라이머의 3'-말단에 혼입되도록 할 수 있다. 폐쇄 복합체는 반응 조건의 조성을 조절함으로써 불안정화 및/또는 해제될 수 있다. 또한, 폐쇄 복합체는 전기, 자기, 및/또는 기계적 수단에 의해 불안정화될 수 있다. 기계적 수단은 예를 들어, 초음파 교반의 사용에 의한 기계적 교반을 포함한다. 기계적 진동은 폐쇄 복합체를 불안정화시키고 DNA에 대한 중합 효소의 결합을 억제한다. 이에 따라, 검사 반응 혼합물이 혼입 혼합물로 대체되는 세척 단계보다는 기계적 교반이 사용되어 주형 핵산으로부터 중합 효소를 제거하고, 단계마다 단일 뉴클레오타이드를 첨가하여 성공적인 혼입 단계가 순환하도록 할 수 있다.
폐쇄 복합체 안정화 또는 폐쇄 복합체 해제 반응 조건 및/또는 방법의 임의의 조합이 조합될 수 있다. 예를 들어, 폐쇄 복합체를 안정화하는 중합 효소 억제제는 촉매 이온과 함께 검사 반응에 존재하여, 폐쇄 복합체를 해제하는 역할을 할 수 있다. 전술한 예시에서, 폐쇄 복합체는 중합 효소 억제제 성질 및 농도, 촉매 금속 이온, 다른 시약의 농도 및/또는 반응 혼합물의 조건, 및 이의 임의의 조합에 따라, 안정화 또는 해제될 수 있다.
폐쇄 복합체는, 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 3'-말단에 대한 뉴클레오타이드의 공유 결합이 약화되는 반응 조건하에서 안정화될 수 있다. 선택적으로, 폐쇄 복합체는 화학반응-전 입체 구조 또는 삼원 복합체이다. 선택적으로, 폐쇄 복합체는 전좌-전 입체 구조이다. 이러한 폐쇄 복합체의 형성은, 반응 혼합물에서 폐쇄 복합체 해제 및/또는 프라이머에 대한 뉴클레오타이드의 화학적 혼입을 허용하는 촉매 금속 이온의 이용가능성을 조절함으로써 억제 및/또는 안정화될 수 있다. 예시적인 금속 이온은 마그네슘, 망간, 코발트, 및 바륨을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 촉매 이온은 임의의 배합물, 예를 들어, MgCl2, Mg(CH3CO2)2, 및 MnCl2와 같은 염일 수 있다
촉매 금속 이온의 선택 및/또는 농도는 서열 결정 반응에서 중합 효소 및/또는 뉴클레오타이드에 기초할 수 있다. 예를 들어, HIV 역전사 효소는 뉴클레오타이드 혼입에 마그네슘을 사용한다(N Kaushik, Biochemistry 35:11536-11546 (1996), 및 H P Patel, Biochemistry 34:5351-5363 (1995), 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함됨). 마그네슘을 사용하는 폐쇄 복합체 형성 대 망간을 사용하는 형성 비율은 중합 효소 및 뉴클레오타이드의 정체에 따라 상이할 수 있다. 이에 따라, 폐쇄 복합체의 안정성은 촉매 금속 이온, 중합 효소, 및/또는 뉴클레오타이드 정체에 따라 상이할 수 있다. 추가적으로, 폐쇄 복합체 안정화에 필요한 촉매 이온의 농도는 촉매 금속 이온, 중합 효소, 및/또는 뉴클레오타이드 정체에 따라 달라질 수 있으며, 본 명세서에 제공되는 지침을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 혼입은 하나의 금속 이온의 높은 촉매 이온 농도에서 일어나지만, 동일한 금속 이온의 낮은 농도에서는 일어나지 않거나, 그 반대이다. 그러므로, 금속 이온 정체, 금속 이온 농도, 중합 효소 정체, 및/또는 뉴클레오타이드 정체를 조절하면 검사 반응 조건이 제어된다.
폐쇄 복합체는 서열 결정 반응의 검사 단계 동안 촉매 금속 이온을 격리, 제거, 감소, 생략, 및/또는 킬레이트화하여, 폐쇄 복합체 해제 및/또는 화학적 혼입이 일어나지 않도록, 형성 및/또는 안정화될 수 있다. 킬레이트화는 EDTA 및/또는 EGTA를 사용을 포함하여, 촉매 금속 이온을 뉴클레오타이드 혼입에 사용하지 못하도록 하는 임의의 절차를 포함한다. 환원은 반응 혼합물의 촉매 금속 이온의 농도를 희석시키는 것을 포함한다. 반응 혼합물은 폐쇄 복합체 형성은 가능하지만, 뉴클레오타이드 혼입을 억제하는, 비촉매 이온을 포함하는 용액으로 희석되거나 대체된다. 비촉매 이온은, 칼슘, 스트론튬, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 크로뮴, 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 갈륨, 저마늄, 비소, 셀리늄, 로듐, 및 스트론튬을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 선택적으로, 검사 반응에 Ni2+가 제공되어 폐쇄 복합체 형성을 촉진한다. 선택적으로, 검사 반응에 Sr2+가 제공되어 폐쇄 복합체 형성을 촉진한다. 선택적으로, 비촉매 금속 이온 및 촉매 금속 이온 모두가 반응 혼합물에 존재하며, 하나의 이온은 다른 이온보다 효과적인 높은 농도로 존재한다. 제공된 방법에서, 코발트와 같은 비촉매 이온이 높은 농도에서 촉매로 작용(즉, 뉴클레오타이드 혼입을 촉진)할 수 있다. 이에 따라, 선택적으로, 낮은 농도의 비촉매 금속 이온은 삼원 복합체 형성을 촉진하도록 사용되며 높은 농도의 비촉매 금속 이온은 혼입을 촉진하도록 사용된다.
비촉매 이온은 검사 조건하에서 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 반응은 이미 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 선택적으로, 비촉매 이온은 하나 이상의 뉴클레오타이드에 복합체를 형성하고, 복합체가 된 뉴클레오타이드가 반응 혼합물에 첨가된다. 비촉매 이온은 고온(약 80 ℃)에서 뉴클레오타이드와 비촉매 이온을 혼합함으로써, 뉴클레오타이드와 복합체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 크로뮴 뉴클레오타이드 복합체는 혼합물에 첨가되어 폐쇄 복합체 형성 및 안정화를 촉진할 수 있다. 선택적으로, 크로뮴 뉴클레오타이드 복합체는 크로뮴 한 자리 결합 리간드(monodentate), 두 자리 결합 리간드(bidentate), 또는 세 자리 결합 리간드(tridentate) 복합체이다. 선택적으로, 크로뮴 뉴클레오타이드 복합체는 α-한 자리, 또는 β-γ-두 자리 결합 뉴클레오타이드이다.
선택적으로, 폐쇄 복합체는 Sr2+를 포함하며, 이러한 Sr2+가 폐쇄 복합체의 형성을 촉진하는 반응 조건하에서, 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드 사이에 형성된다. Sr2+의 존재는 부정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 복합체를 형성하는 것보다, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 폐쇄 복합체를 형성하는 것을 유리하게 할 수 있다. Sr2+ 이온은 약 0.01 mM 내지 약 30 mM의 농도로 존재할 수 있다. 선택적으로, Sr2+는 10 mM SrCl2로서 존재한다. 폐쇄 복합체의 형성은 폐쇄 복합체의 주형 핵산에서 바로 다음의 염기를 식별하는 검사 조건하에서 모니터링된다. dNTP(예컨대, dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 각각에 대한 중합 효소(예컨대, 대장균 DNA 중합 효소 I, Bst의 클레노브 절편)의 친화력은 Sr2+의 존재하에 상이할 수 있다. 그러므로, 검사는 dNTP에 대한 중합 효소-주형 핵산의 결합 친화력을 측정하는 것을 포함할 수 있고; 이러한 결합 친화력은 주형 핵산의 바로 다음의 염기를 나타낸다. 선택적으로, 결합 상호 작용은 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 사이의 이원 상호 작용을 불안정화시키는 조건하에서 수행될 수 있다. 선택적으로, 결합 상호 작용은 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드 사이의 삼원 상호 작용을 안정화시키는 조건하에서 수행될 수 있다. 검사 이후, 세척 단계는 결합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거하며, 파이로포스페이트(PPi) 절단 및 뉴클레오타이드 혼입을 유도하기 위해 Mg2+가 반응에 첨가된다. 선택적으로, 세척 단계는 삼원 복합체의 안정성을 유지하기 위해 Sr2+를 포함하여, 삼원 복합체의 해리를 방지한다. 반응은 원하는 서열 판독 길이를 수득할 때까지 반복될 수 있다.
선택적으로, 폐쇄 복합체는 Ni2+를 포함하며, 이러한 Ni2+가 폐쇄 복합체의 형성을 촉진하는 반응 조건하에서, 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드 사이에 형성된다. Ni2+의 존재는 부정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 복합체를 형성하는 것보다, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 폐쇄 복합체를 형성하는 것을 유리하게 할 수 있다. Ni2+ 이온은 약 0.01 mM 내지 약 30 mM의 농도로 존재할 수 있다. 선택적으로, Ni2+는 10 mM NiCl2로서 존재한다. 폐쇄 복합체의 형성은 폐쇄 복합체의 주형 핵산에서 바로 다음의 염기를 식별하는 검사 조건하에서 모니터링된다. dNTP(예컨대, dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 각각에 대한 중합 효소(예컨대, 대장균 DNA 중합 효소 I, Bst의 클레노브 절편)의 친화력은 Sr2+의 존재하에 상이할 수 있다. 그러므로, 검사는 dNTP에 대한 중합 효소-주형 핵산의 결합 친화력을 측정하는 것을 포함할 수 있고; 이러한 결합 친화력은 주형 핵산의 바로 다음의 염기를 나타낸다. 선택적으로, 결합 상호 작용은 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 사이의 이원 상호 작용을 불안정화시키는 조건하에서 수행될 수 있다. 선택적으로, 결합 상호 작용은 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드 사이의 삼원 상호 작용을 안정화시키는 조건하에서 수행될 수 있다. 검사 이후, 세척 단계는 결합되지 않은 뉴클레오타이드 중합 효소를 제거하며, 파이로포스페이트(PPi) 절단 및 뉴클레오타이드 혼입을 유도하기 위해 Mg2+가 반응에 첨가된다. 선택적으로, 세척 완충액은 삼원 복합체의 안정성을 유지하기 위해 Ni2+를 포함하여, 삼원 복합체의 해리를 방지한다. 반응은 원하는 서열 판독 길이를 수득할 때까지 반복될 수 있다.
선택적으로, 폐쇄 복합체는 비촉매 농도의 Co2+를 포함하며, 이러한 Co2+가 폐쇄 복합체의 형성을 촉진하는 반응 조건하에서, 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드 사이에 형성된다. 비촉매 농도의 Co2+의 존재는 부정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 복합체를 형성하는 것보다, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 폐쇄 복합체를 형성하는 것을 유리하게 할 수 있다. Co2+ 이온은 약 0.01 mM 내지 약 0.5 mM의 농도로 존재할 수 있다. 선택적으로, Co2+는 0.5 mM CoCl2로서 존재한다. 폐쇄 복합체의 형성은 폐쇄 복합체의 주형 핵산에서 바로 다음의 염기를 식별하는 검사 조건하에서 모니터링된다. dNTP(예컨대, dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 각각에 대한 중합 효소(예컨대, 대장균 DNA 중합 효소 I, Bst의 클레노브 절편)의 친화력은 Co2+의 존재하에 상이할 수 있다. 그러므로, 검사는 dNTP에 대한 중합 효소-주형 핵산의 결합 친화력을 측정하는 것을 포함할 수 있고; 이러한 결합 친화력은 주형 핵산의 바로 다음의 염기를 나타낸다. 선택적으로, 결합 상호 작용은 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 사이의 이원 상호 작용을 불안정화시키는 조건하에서 수행될 수 있다. 선택적으로, 결합 상호 작용은 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드 사이의 삼원 상호 작용을 안정화시키는 조건하에서 수행될 수 있다. 검사 이후, 세척 단계는 결합되지 않은 뉴클레오타이드 중합 효소를 제거하며, 파이로포스페이트(PPi) 절단 및 뉴클레오타이드 혼입을 유도하기 위해 촉매 농도의 Co2+가 반응에 첨가된다. 선택적으로, 세척 완충액은 삼원 복합체의 안정성을 유지하기 위해 비촉매 농도의 Co2+를 포함하여, 삼원 복합체의 해리를 방지한다. 반응은 원하는 서열 판독 길이를 수득할 때까지 반복될 수 있다.
선택적으로, 촉매 금속 이온은, 후속 뉴클레오타이드 혼입 및 폐쇄 복합체 해제 없이, 폐쇄 복합체의 형성을 촉진할 수 있다. 선택적으로, 반응 혼합물 중 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 μM 농도의 Mg2+는 중합 효소의 입체 구조 변화를 유도하여, 후속 뉴클레오타이드 혼입, PPi 및 폐쇄 복합체 해제 없이, 폐쇄 복합체를 형성할 수 있다. 선택적으로, Mg2+의 농도는 약 0.5 μM 내지 약 10 μM, 약 0.5 μM 내지 약 5 μM, 약 0.5 μM 내지 약 4 μM, 약 0.5 μM 내지 약 3 μM, 약 μM 내지 약 5 μM, 약 1 μM 내지 약 4 μM, 및 약 1 μM 내지 약 3 μM이다.
선택적으로, 서열 결정 반응에서 뉴클레오타이드 혼입을 허용하기 위해 필요한 이용가능한 촉매 금속 이온의 농도는 약 0.001 mM 내지 약 10 mM, 약 0.01 mM 내지 약 5 mM, 약 0.01 mM 내지 약 3 mM, 약 0.01 mM 내지 약 2 mM, 약 0.01 mM 내지 약 1 mM, 약 0.05 mM 내지 약 10 mM, 약 0.05 mM 내지 약 5 mM, 약 0.05 mM 내지 약 3 mM, 약 0.05 내지 약 2 mM, 또는 약 0.05 mM 내지 약 1 mM이다. 선택적으로, 촉매 금속 이온의 농도는 5 mM 내지 50 mM이다. 선택적으로, 촉매 금속 이온의 농도는 5 mM 내지 15 mM, 또는 약 10 mM이다.
비촉매 이온은 다음의 반응 단계 중 임의의 단계 이전, 동안, 또는 이후를 포함하는 임의의 단계에 반응 혼합물로 첨가될 수 있다: 프라이밍된 주형 핵산 제공 단계, 중합 효소 제공 단계, 이원 복합체 형성 단계, 뉴클레오타이드 제공 단계, 화학반응-전 폐쇄 복합체 형성 단계, 뉴클레오타이드 혼입 단계, 전좌-전 폐쇄 복합체 형성 단계, 및 전좌-후 입체 구조 형성 단계. 비촉매 이온은 세척 단계 동안 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 비촉매 이온은 반응을 통해 반응 혼합물에 존재할 수 있다. 예를 들어, 촉매 이온은 비촉매 금속 이온을 희석시켜, 뉴클레오타이드 혼입을 허용하는 농도로 반응 혼합물에 첨가된다.
뉴클레오타이드 혼입을 조절하는 촉매 및 비촉매 이온의 능력은 반응 혼합물의 조건에 따라 달라지며, 이러한 조건은, pH, 이온 강도, 킬레이트화제, 화학적 가교, 변형된 중합 효소, 혼입이 불가능한 뉴클레오타이드, 기계적 또는 진동 에너지, 및 전기장을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
선택적으로, 서열 결정 반응에서 뉴클레오타이드 혼입 없이 폐쇄 복합체 형성을 허용하기 위해 필요한 비촉매 금속 이온의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 50 mM, 약 0.1 mM 내지 약 40 mM, 약 0.1 mM 내지 약 30 mM, 약 0.1 mM 내지 약 20 mM, 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 약 0.1 mM 내지 약 5 mM, 약 0.1 내지 약 1 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 내지 약 40 mM, 약 1 mM 내지 약 30 mM, 약 1 mM 내지 약 20 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 5 mM, 약 2 mM 내지 약 30 mM, 약 2 mM 내지 약 20 mM, 약 2 mM 내지 약 10 mM, 또는 상기 범위 내의 임의의 농도이다.
폐쇄 복합체는 중합 효소 억제제를 검사 반응 혼합물에 첨가하여 형성 및/또는 안정화될 수 있다. 억제제 분자 포스포노아세테이트(포스포노아세트산) 및 포스포노포메이트(포스포노폼산, 일반명 Foscarnet), Suramin, 아미노글리코사이드, INDOPY-1 및 Tagetitoxin이 중합 효소 활성의 경쟁하지 않는 또는 비경쟁적인 억제제의 비제한적인 예시이다. 효소의 활성 부위의 근처에서 억제제 분자의 결합은, 뉴클레오타이드 혼입 주기의 전좌-전 또는 전좌-후 단계에서 중합 효소를 포획하여, 뉴클레오타이드의 혼입 이전 또는 이후에 이의 폐쇄 복합체 입체 구조에 중합 효소를 안정화시키고, 반응 혼합물에서 억제제 분자가 제거, 희석 또는 킬레이트화에 의해 사용불가능해질 때까지 중합 효소가 주형 핵산에 결합되도록 한다.
이에 따라, 주형 핵산 분자의 서열 결정 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 검사 단계를 포함한다: 프라이밍된 주형 핵산 분자에 프라이머를 제공하는 단계; 프라이밍된 주형 핵산 분자와, 중합 효소, 중합 효소 억제제 및 하나 이상의 비표지된 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 제1 반응 혼합물을 접촉시키는 단계; 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 분자 내로 뉴클레오타이드를 혼입시키지 않고, 비표지된 뉴클레오타이드 분자의 존재하에, 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자의 상호 작용을 모니터링하는 단계; 및 모니터링된 상호 작용에 의해, 프라이밍된 주형 핵산 분자의 바로 다음의 염기에 상보적인 뉴클레오타이드를 식별하는 단계를 포함한다. 중합 효소 억제제는 비표지된 뉴클레오타이드 분자가 프라이머 주형 핵산의 프라이머 내로 혼입되는 것을 방지한다. 선택적으로, 억제제는 비경쟁적인 억제제, 알로스테릭 억제제, 또는 경쟁하지 않는 알로스테릭 억제제이다. 선택적으로, 중합 효소 억제제는 중합 효소 내의 촉매 이온 결합 부위와 경쟁한다.
검출 플랫폼: 폐쇄 복합체의 검출을 위한 계측
뉴클레오타이드의 존재하에, 중합 효소와 주형 핵산 사이의 상호 작용은 외인성 표지를 사용하지 않고 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 서열 결정 반응은 굴절률 변화 검출, 전하 검출, 라만 산란 검출, 타원 편광법(ellipsometry) 검출, pH 검출, 크기 검출, 질량 검출, 표면 플라즈몬 공명, 도파 모드(guided mode) 공명, 나노 기공 광학 간섭계, 속삭임의 회랑 모드(whispering gallery mode) 공명, 나노 입자 산란, 광자 결정, 수정 진동자 미세저울(quartz crystal microbalance), 바이오층 간섭계(bio-layer interferometry), 진동 검출, 압력 검출 및 폐쇄 복합체에서 주형 핵산과 중합 효소 결합으로 인한 첨가된 질량 또는 굴절률을 검출하는 다른 무표지(label-free) 검출 방식에 의해 모니터링될 수 있다.
선택적으로, 굴절률 변화의 검출은 하나의 수단 또는 수단의 조합에 의해 수행되며, 이러한 수단은, 표면 플라즈몬 공명 감지, 국소화 플라즈몬 공명 감지, 플라즈몬-광자 결합 감지, 부파장 나노 홀을 통한 투과 감지(향상된 광학 투과), 광자 결정 감지, 간섭계 감지, 굴절 감지, 도파 모드 공명 감지, 고리 공진기 감지, 또는 타원 편광법 감지를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 선택적으로, 핵산 분자는 표면에 국소화될 수 있고, 다양한 뉴클레오타이드의 존재하에 중합 효소와 핵산의 상호 작용은 국부 굴절률 변화로서 측정될 수 있다.
선택적으로, 주형 핵산은 표면 상에 또는 표면 근처에 적절하게 연결(tether) 또는 국소화되어, 뉴클레오타이드의 존재하에 중합 효소와 주형 핵산의 상호 작용이 표면을 통해 투과된, 또는 반사된 광을 변화시킨다. 표면은 나노 구조체를 포함할 수 있다. 선택적으로, 표면은 플라즈몬 또는 플라즈몬 공명을 유지할 수 있다. 선택적으로, 표면은 광 기질(photonic substrate)이며, 공동 공진기(resonant cavity), 고리 공진기 또는 광자 결정 슬래브에 제한되지 않는다. 선택적으로, 표면은 도파 모드 공명 센서이다. 선택적으로, 핵산은 나노 홀 어레이(nanohole array), 나노 입자 또는 미세 입자 상에 또는 근처에 적절하게 연결 또는 국소화되어, 뉴클레오타이드의 존재하에 중합 효소와 주형 핵산의 상호 작용이 흡광도, 산란, 미세 입자 또는 나노 입자와의 상호 작용하는 광의 굴절 또는 공명을 변화시킨다.
선택적으로, 금 표면 상의 나노 홀 어레이가 굴절률 센서로서 사용된다. 주형 핵산은 표준 싸이올 화학 반응에 의해 금속 표면에 부착되어, PCR 반응에 사용되는 프라이머 중 하나의 싸이올 기를 혼입시켜 DNA를 증폭시킬 수 있다. 나노 홀 어레이의 크기가 입사광으로 적절하게 조절되는 경우, 뉴클레오타이드의 존재하에 주형 핵산에 대한 중합 효소의 결합은 나노 홀을 가로질러 투과하는 광의 변화로서 모니터링될 수 있다. 표지된 및 무표지 방식 모두에 있어서, 간단하고 직접적인 평형 신호 강도의 측정은 안정한 폐쇄 복합체의 형성을 나타낼 수 있다.
선택적으로, 핵산 분자는 표면 플라즈몬을 유지할 수 있는 표면에 국소화되고, 여기서 국소화 핵산과의 중합 효소 상호 작용으로 인해 야기된 굴절률 변화는 표면 플라즈몬 성질의 변화를 통해 모니터링될 수 있고, 추가적으로, 표면 플라즈몬의 상기 성질은 표면 플라즈몬 공명을 포함할 수 있다. 표면 플라즈몬, 국소화 표면 플라즈몬(LSP), 또는 표면 플라즈몬 폴라리톤(SPP)은 전자기파와 표면 전하의 플라즈마 진동의 결합으로부터 발생한다. LSP는 나노 입자 표면에 국한되는 반면, SPP는 높은 전자 이동도 표면과 유전체 매개체 사이의 계면에서 전자 밀도가 높은 표면으로 국한된다. 표면 플라즈몬은 계면의 방향을 따라 전파될 수 있는 반면, 감쇠하는 방식으로 유전체 매개체 내로 침투한다. 표면 플라즈몬 공명 조건은 입사 전자기 복사의 주파수가 표면 전자의 진동의 자연 주파수와 일치할 때 성립된다. 예를 들어, 결합 또는 분자 군집으로 인한 계면에서 유전체 성질의 변화는 표면 전자의 진동에 영향을 주어, 표면 플라즈몬 공명 파장을 변화시킨다. 표면 플라즈몬 공명이 가능한 표면은 나노 입자, 나노 입자의 클러스터 및 응집체, 연속적인 평면 표면, 나노구조화된 표면, 및 미세구조화된 표면을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 금, 은, 알루미늄, 높은 전도성 금속 산화물(예컨대, 인듐 주석 옥사이드, 아연 옥사이드, 텅스텐 옥사이드)과 같은 재료가 표면에서 표면 플라즈몬 공명을 지원할 수 있다.
선택적으로, 단일 핵산 분자, 또는 핵산의 다중 클론 복제물이 나노 입자에 부착되어, 핵산에 대한 중합 효소의 결합이 국소화 표면 플라즈몬 공명(LSPR)의 이동을 야기한다. 나노 입자에 입사한 광은 나노 입자의 크기, 모양 및 조성에 따라 달라지는 공명 주파수를 사용하여, 전도 전자가 공진 주파수로 집합적으로 진동하도록 유도한다. 해당 나노 입자는 구형 나노 입자, 나노 막대, 나노 피라미드, 나노 다이아몬드, 및 나노 디스크를 포함하는 상이한 모양을 취한다. 이러한 LSPR 모드의 결과로서, 나노 입자는 광을 매우 강하게 흡수하고 산란시켜, 단일 나노 입자가 암시야(광학 산란) 현미경을 사용하여 육안으로 쉽게 관찰된다. 예를 들어, 단일 80-nm의 은 나노구형은 산란 단면적으로 3 x 10-2 m2인 445-nm 청색광을 산란시키며, 이는 플루오레세인 분자의 형광 단면적을 백만 배 초과, 및 자가 소광 제한으로 플루오레세인으로 채워진 유사한 크기의 나노구형의 단면을 수천 배 초과한다. 선택적으로, 나노 입자는 가시광선 스펙트럼의 어느 곳에서나 산란 피크(scattering peak)를 가지는 초고광의 나노 크기의 광학 산란기(opticalizer)로 구성된 플라즈몬-공진 입자이다. 플라즈몬-공진 입자는 표백(bleach)하지 않으므로 유리하다. 선택적으로, 플라즈몬-공진 입자가 제공되고, 주형 핵산으로 코팅되고, 중합 효소 및 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물에 제공되며, 여기서 중합 효소-주형 핵산-입자 상호 작용이 검출된다. 전술한 단계 중 하나 이상은 문헌[Schultz et al., PNAS 97:996-1001 (2000)]에 개시된 방법 중 하나 이상에 기초하거나 이로부터 유래하며, 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
공진 파장에서 매우 큰 흡광 계수는 비금속 나노 입자가 표면-근처 상호 작용에 대한 매우 강렬한 표지 역할을 할 수 있도록 한다. 선택적으로, 나노 입자-국소화 DNA와의 중합 효소 상호 작용은 공진 파장의 이동을 야기한다. 결합 또는 결합 상호 작용으로 인한 공진 파장의 변화는 여러 방법 중 하나에 의해 측정될 수 있다. 선택적으로, 조명 최대 산란이 촬상 장치에서 관찰되는 파장을 식별하기 위해 파장의 범위를 통해 스캐닝된다. 선택적으로, 광대역 조명은 공진 피크가 분광학적으로 식별되도록 촬상 장치 근처의 분산 소자와 관련하여 이용된다. 선택적으로, 나노 입자 시스템은 이의 공진 파장, 또는 이의 공진 파장 근처에서 조명될 수 있고, 임의의 결합 상호 작용은 새로운 공진 파장이 조명 파장으로부터 이동함에 따라 산란된 광의 강도 저하로서 관찰될 수 있다. 조명 파장의 위치에 따라, 상호 작용은 심지어 공명 피크가 조명 파장을 향해 이동함에 따라 나노 입자 산라의 증가로 나타날 수 있다. 선택적으로, DNA-부착-나노 입자는 표면에 국소화될 수 있거나, 택일적으로, DNA-부착-나노 입자는 용액에 현탁될 수 있다. 나노 입자를 사용하는 바이오센싱에 대한 포괄적인 고찰은 문헌[Anker et al., Nature Materials 7: 442-453 (2008)]에 기재되며, 상기 문헌은 본 명세서에 그 전체가 참조 문헌으로 포함된다.
선택적으로, LSPR이 가능한 나노 특징부(nano-feature)는 평면 기판 상에 리소그래피 방식으로 패터닝된다. 나노 특징부의 2차원 패터닝은 다수의 상이한 핵산 분자의 다중화(multiplexing) 및 대규모 고효율(high-throughput) 분석의 이점을 가진다. 선택적으로, 금 나노포스트(nanopost)는 중합 효소-주형 핵산 상호 작용의 표면 플라즈몬 공명 촬상 검출을 위한 기판이며, 여기서 핵산은 나노포스트에 부착된다. 나노구조물 크기 및 기간은 표면 플라즈몬 공명 신호 향상에 영향을 주어, 선택적으로, 대조 필름과 비교하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8배 이상의 신호 증폭을 제공할 수 있다.
선택적으로, 표면 플라즈몬 공명은 평면 표면에서 유지될 수 있다. Kretschmann 배열(예컨대, Biacore, Uppsala, Sweden) 및 표면 플라즈몬 공명 촬상(예컨대, GWC Technologies; Madison, WI; 또는 Horiba; Kyoto, Japan)에 기반한 다수의 상업용 기기가 입수가능하며, 단일 지점 및 다중 배열 패턴으로서 표면에 DNA를 부착하는 프로토콜이 확립되어 있다. Kretschmann 배열에서, 금속 필름, 일반적으로 금이 프리즘의 측면 상에 증착되고, 입사 복사선은 표면 플라즈몬을 여기시키는 각도로 입사된다. 소멸파(evanescent wave)는 다른 면에서 플라즈몬을 여기시키는 금속 필름을 통해 침투하여, 금 필름 근처에서 표면 근처 및 표면 상호 작용을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 공진 각도에서, 프리즘-금 계면으로부터 반사된 광은 심각하게 감쇠된다. 고정된 파장 조명을 가정하면, 공진 각도에 가까운 고정된 각도에서 반사된 광의 강도를 모니터링할 뿐만 아니라, 표면 플라즈몬 공명 조건(최소 반사율)을 확립하기 위해 요구되는 입사각의 변화를 모니터링함으로써, 결합 상호 작용을 검사할 수 있다. CCD 또는 CMOS 카메라와 같은 2D 촬상 장치가 반사된 광을 모니터링하기 위해 사용되는 경우, 전체 조명 영역은 고해상도로 촬상될 수 있다. 이러한 방법은 표면 플라즈몬 공명 영상(SPRi)이라고 한다. 이는 표면상의 독립적인 영역에 대한 높은 처리량을 동시에 분석할 수 있다. 광대역 조명은 또한, 고정된 각도 배열로 사용될 수 있고, 여기서 표면 플라즈몬 공명과 결합된 파장은 반사된 스펙트럼에서의 딥(dip)을 관찰함으로써 분광학적으로 식별된다. 표면 상호 작용은 공진 파장의 이동을 토해 모니터링된다.
표면 플라즈몬 공명은 모니터링 단백질-핵산 상호 작용을 모니터링하는 확립된 방법이며, 핵산 부착, 뿐만 아니라 데이터 분석 모두에 대한 다수의 표준 프로토콜이 존재한다. 문헌으로부터 예시적인 참조 문헌은 문헌[Cho et al., "Binding Kinetics of DNA-Protein Interaction Using Surface Plasmon Resonance," Protocol Exchange, May 22, 2013]; 및 문헌[Brockman et al., "A Multistep Chemical Modification Procedure To Create DNA Arrays on Gold Surfaces for the Study of Protein-DNA Interactions with Surface Plasmon Resonance Imaging," Journal of the American Chemical Society 121: 8044-51 (1999)]을 포함하며, 상기 문헌 모두는 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
중합 효소/핵산 상호 작용은 국소화 표면 플라즈몬을 유지할 수 있는 나노 구조화된 표면에서 모니터링될 수 있다. 선택적으로, 중합 효소/핵산 상호 작용은 표면 플라즈몬 폴라리톤을 유지할 수 있는 나노구조화된 표면에서 모니터링될 수 있다.
선택적으로, 중합 효소/핵산 상호 작용은 국소화 표면 플라즈몬을 유지할 수 있는 나노구조화된 표면에서 모니터링될 수 있다. 선택적으로, 중합 효소/핵산 상호 작용은 표면 플라즈몬 폴라리톤을 유지할 수 있는 나노구조화된 표면에서 모니터링될 수 있다.
선택적으로, 핵산/중합 효소 상호 작용을 모니터링하기 위해 나노 홀 어레이를 통한 특이 광 투과 현상(extraordinary optical transmission, EOT)이 사용될 수 있다. 플라즈몬 금속 박막에서 부파장 나노 홀을 통해 전달되는 광은 고전적인 전자기 이론에서 예측된 것보다 높다. 이러한 향상된 광 투과는 입사 복사선에 대한 플라즈몬 공진 결합을 고려함으로써 설명될 수 있으며, 이는 공진 파장에서 예상보다 큰 광 분획이 금속 나노 홀을 통해 전송된다. 향상된 광 투과는 향상된 광전송은 나노 홀의 크기와 피치, 금속의 성질, 뿐만 아니라 나노 홀을 지닌 금속 필름의 양쪽 면에 있는 매개체의 유전체 성질에 따라 달라진다. 바이오센서와 관련하여, 금속 나노 홀 어레이의 투과율은 금속 필름에 접촉하는 매개체의 굴절률에 따라 달라지며, 이에 따라, 예를 들어, 중합 효소와 금속 표면에 부착된 핵산의 상호 작용은 나노 홀 어레이를 가로질러 투과된 광의 강도 변화로서 모니터링될 수 있다. 표면 플라즈몬 공명의 EOT/플라즈몬 나노 홀 어레이 접근법을 사용하는 경우 계측 및 정렬 요건은 매우 압축된 광학 및 촬상 소자를 사용하여 적용될 수 있다. 저전력 LED 조명 및 CMOS 또는 CCD 카메라는 강력한 EOT 플라즈몬 센서를 구현하기에 충분할 수 있다. 예시적인 나노 홀 어레이-기반의 표면 플라즈몬 공명 감지 장치가 문헌[Escobedo et al., "Integrated Nanohole Array Surface Plasmon Resonance Sensing Device Using a Dual-Wavelength Source," Journal of Micromechanics and Microengineering 21: 115001 (2011)]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 그 전체가 참조 문헌으로 포함된다.
플라즈몬 나노 홀 어레이는 유리 표면에 증착된 광학적으로 불투명한 금 레이어(50 nm 초과 두께)에 패터닝될 수 있다. 선택적으로, 플라즈몬 나노 홀 어레이는 유리 상에 증착된 광학적으로 두꺼운 알루미늄 또는 은 필름에 패터닝될 수 있다. 선택적으로, 나노 홀 어레이는 낮은 굴절률의 플라스틱 상에 증착된 광학적으로 두꺼운 금속 레이어에 패터닝될 수 있다. 낮은 굴절률의 플라스틱 상에 플라즈몬 나노 홀 어레이를 패터닝하면 금속 레이어의 양면에 굴절률을 더욱 일치시킴으로써 굴절률 변화에 대한 장치의 감도를 향상시킨다. 선택적으로, 나노 홀 어레이의 굴절률 감도는 홀 사이의 거리를 증가시킴으로써 증가된다. 선택적으로, 나노 홀 어레이는, 예를 들어 엠보싱, 캐스팅, 임프린트-리소그래피(imprint-lithography) 또는 주형-스트리핑(template-stripping)에 의한 복제에 의해 제조된다. 선택적으로, 나노 홀 어레이는 콜로이드를 사용하여 자체 조립에 의해 제조된다. 선택적으로, 나노 홀 어레이는 레이저 간섭 리소그래피와 같은 투영 직접 패터닝에 의해 제조된다.
나노 버킷(nano-bucket) 배열이 나노 홀 배열보다 바람직할 수 있다. 나노 홀 배열에서, 나노 특징부의 바닥은 유리 또는 플라스틱 또는 다른 적절한 유전체인 반면, 나노 버킷 배열에서, 나노 특징부의 바닥은 플라즈몬 금속을 포함한다. 나노 버킷 어레이는 유리하게는 국부 굴절률에 대한 투과 감도를 유지하면서 제조하기에 상대적으로 간단하다.
선택적으로, 나노 홀 어레이 플라즈몬 감지는 대면적 촬상을 위해 저렴한 방식으로 렌즈-유리 홀로그램 촬상과 조합된다. 선택적으로, 플라즈몬 바이오센싱 플랫폼은 나노 홀 어레이를 가지는 플라즈몬 칩, 칩을 조명하도록 구성된 발광 다이오드 공급원, 및 표면 상의 분자 결합 현상에 의해 조절되는 나노 홀의 회절 패턴을 기록하는 CMOS 이미지 칩(imager chip)을 포함한다. 결합 현상은 뉴클레오타이드의 존재하에 중합 효소와 주형 핵산 사이에서의 폐쇄 복합체의 형성일 수 있다.
표면 플라즈몬 공명 감지를 위해(핵산 부착을 위해) 표면을 작용기화하는 방법은 두 가지 감지 방식 모두 핵산이 부착되어야 하는 유사한 금속 표면을 사용하기 때문에 EOT 나노 홀 어레이에 직접 적용될 수 있다.
선택적으로, 중합 효소/핵산 상호 작용과 관련된 굴절률 변화는 플라즈몬을 지지하지 않는 나노구조화된 표면 상에서 모니터링될 수 있다. 선택적으로, 도파 모드 공명은 중합 효소/핵산 상호 작용을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 도파 모드 공명 또는 도파관(waveguide-mode)공명은 광학 도파관의 도파 모드가 회절 격자 또는 프리즘과 같은 위상-정합 소자의 도입에 의해 여기됨과 동시에 추출될 수 있는 현상이다. 이러한 도파 모드는 도파를 유지하지 않고 1차원 및 2차원 광자 결정 슬래브에서 관찰됨에 따라 또한 "손실 모드(leaky mode)"라고도 한다. 도파 모드 공명은, 회절된 모드와, 인접하거나 서로 위에 놓여있는 2개의 광학적으로 구조화된 도파관 모드의 결합으로 간주할 수 있다. 예를 들어, 광 도파관의 상부에 배치된 회절 격자의 경우, 회절 된 모드 중 하나가 광 도파관의 도파 모드에 정확히 결합하여, 도파관을 따라 이러한 모드가 전파될 수 있다. 이탈 공명 조건의 경우, 도파관 내로 광이 결합되지 않아, 구조가 완전히 투명하게 보일 수 있다(유전체 도파관이 사용되는 경우). 공명에서, 공진 파장은 도파관 내로 강하게 결합되어, 구조로부터 격자-도파관 계면으로부터 다운스트림 소자에 의존하여 결합될 수 있다. 격자 결합기(grating coupler)가 도파관의 전체 표면으로 확장되는 경우, 임의의 결합된 광이 다음 격자 소자에서 해제되기 때문에, 광은 도파될 수 없다. 그러므로, 격자 도파관 구조에서, 공명은 강한 굴절 피크로서 관찰되는 반면, 구조는 이탈 공명 조건에 대해 투명하다. 공명 조건은 각도, 격자 성질, 편광 및 입사광의 파장에 의존한다. 예를 들어, 도파관의 전페 표면에 대한 격자 결합으로 인해 도파 모드 전파가 존재하지 않는 경우, 공진 모드는 또한 강한 광집중(optical confinement) 및 도파관 레이어로부터 횡방향으로 복사선의 소산 전파에 비추어, 손실-모드 공명이라고도 한다. 예를 들어, 생체 분자의 결합으로 인한 격자 근처 유전체 성질의 변화는 도파관 내로의 결합에 영향을 미치며, 이에 따라 공진 조건을 변경시킨다. 선택적으로, 핵산 분자가 격자 도파관 구조의 표면에 부착되는 경우, 중합 효소/핵산 상호 작용은 손실 모드 공명의 파장 변화로서 모니터링될 수 있다.
회절 소자는 도파관 소자에 대한 명시적인 필요없이 투명 기판 상에 직접 사용될 수 있다. 격자 나노 구조 근처의 상호 작용으로 인한 공진 조건의 변화는 반사되거나 투과된 복사에서 공진 파장 이동으로 모니터링될 수 있다.
핵산이 부착된 도파 모드 공진 센서로부터의 반사광은 중합 효소/핵산 상호 작용을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 광대역 조명 광원은 조명을 위해 사용될 수 있고, 반사광의 분광 검사는 중합 효소 결합으로 인한 국부 굴절률 변화를 나타낼 수 있다.
선택적으로, 광대역 조명이 사용될 수 있고, 중합 효소 상호 작용으로 인한 공진 이동을 식별하기 위해 투과된 광이 검사될 수 있다. 선형 편광된 협대역 조명이 사용될 수 있으며, 투과된 광은 교차-편광기를 통해 필터링될 수 있으며; 투과된 광은 편광이 변경된 손실 모드 응답을 제외하고 교차 편광기로 인해 완전히 감쇠된다. 이러한 구현은 굴절률 모니터링을 저렴한 촬상 시스템에서 모니터링될 수 있는 간단한 투과 분석으로 전환한다. 개시된 자료는 광학 성분의 조립을 기재한다. 문헌[Nazirizadeh et al., "Low-Cost Label-Free Biosensors Using Photonic Crystals Embedded between Crossed Polarizers," Optics Express 18: 19120-19128 (2010)]을 참조하며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
나노구조화된 표면 이외에도, 굴절률 변조 모니터링을 위해, 일반적이고 구조화되지 않은 표면을 유리하게 사용할 수 있다. 선택적으로, 간섭계는 구조화되지 않은 광학적으로 투명한 기질에 결합된 핵산과 중합 효소의 상호 작용을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 핵산 분자는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 유리 슬라이드의 상부 표면에 부착될 수 있으며, 상기 시스템은 유리 슬라이드의 바닥 표면으로부터 조명된다. 이러한 구성에는 2개의 반사 표면이 있으며, 하나는 유리 슬라이드의 바닥 표면에서의 반사이고, 다른 하나는 핵산 분자가 부착된 상단 표면입니다. 2개의 반사파는 서로 간섭하여, 경로 길이 차이에 기초한 보강 또는 상쇄 간섭을 일으키고, 결합된 핵산 분자로 인한(및 이후 중합 효소와 결합된 핵산 분자의 상호 작용으로 인한) 유전 상수의 변화에 의해 변조된 상단 표면에서 반사된 파동을 일으킬 수 있다. 하부 표면으로부터의 반사가 변경되지 않으면, 핵산 분자에 대한 어떠한 결합도 상면 및 하면으로부터 반사된 빔 사이의 위상차에 반영될 수 있으며, 이는 관찰되는 간섭 패턴에 영향을 미친다. 선택적으로, 바이오-레이어 간섭계가 핵산/중합 효소 상호 작용을 모니터링하기 위해 사용된다. 바이오-레이어 간섭계는 상용의 장치, 예컨대 Pall Forte Bio corporation(Menlo Park, CA)에 의해 판매되는 장치에서 수행될 수 있다.
선택적으로, 상부 표면으로부터의 반사광은 초점 광학체(focusing optic)를 사용하여 선택적으로 선택될 수 있다. 하부 표면으로부터의 반사광은 초점면에 없기 때문에 무시된다. 오직 핵산이 부착된 상부 표면에만 초점을 맞추면, 초점 렌즈에 의해 수집된 광은, 부분적으로 반사된 입사 복사선에 상응하는 평면파, 및 초점면에서 분자에 의해 수집 방향으로 산란된 복사선에 상응하는 산란파를 포함한다. 이러한 두 성분은 입사 복사선이 간섭성이 있는 경우 간섭을 일으킬 수 있다. 이러한 산란 기반의 간섭계 검출은 극도로 민감하며 단일 단백질 분자까지 검출하는데 사용할 수 있다.
선택적으로, 전계 효과 트랜지스터(FET)는 폐쇄 복합체의 검출을 위한 바이오센서로 구성된다. FET의 게이트 말단은 주형 핵산의 첨가에 의해 변형된다. 하전된 태그를 포함하는 중합 효소의 결합은 전기화학적 신호의 변화를 야기한다. 주형 핵산에 대한 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드와 중합 효소와 결합은, 다른 부정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 주형 핵산에 대한 중합 효소 결합과는 상이한 신호를 제공하며, 각각의 부정확한 뉴클레오타이드는 또한 상이한 신호를 제공할 수 있다. 선택적으로, 주형 핵산과의 중합 효소 상호 작용은 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산, 또는 뉴클레오타이드 상에 외인성 표지를 사용하지 않고 FET를 사용하여 모니터링될 수 있다. 선택적으로, 혼입 반응 동안 H+ 이온 방출로 인한 pH 변화가 FET를 사용하여 검출될 수 있다. 선택적으로, 중합 효소는 연속적 H+ 이온을 생성하는 태그를 포함하며, 이러한 태그는 FET에 의해 검출된다. 선택적으로, 연속적 H+ 이온 생성 태그는 ATP 합성 효소이다. 선택적으로, 연속적 H+ 이온 생성 태그는 팔라듐, 구리 또는 또 다른 촉매이다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 혼입 이후 PPi의 방출은 FET를 사용하여 검출된다. 예를 들어, 하나의 유형의 뉴클레오타이드는 한 번에 반응에 제공될 수 있다. 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 첨가되고, 조건이 혼입을 허용하면, PPi는 절단되고, 방출되어, FET를 사용하여 검출되고, 따라서 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드 및 바로 다음의 염기를 식별한다. 선택적으로, 주형 핵산은 나노튜브의 벽에 결합된다. 선택적으로, 중합 효소는 나노튜브의 벽에 결합된다. FET는 크기가 작고 중량이 낮아, 서열 결정 센서로서의 사용에 유리하여, 휴대용 서열 결정 모니터링 부품으로서 사용에 적합하다. 분자 상호작용의 FET 검출에 대한 세부사항은 문헌[Kim et al., "An FET-Type Charge Sensor for Highly Sensitive Detection of DNA Sequence," Biosensors and Bioelectronics, Microsensors and Microsystems 20: 69-74 (2004), doi:10.1016/j.bios.2004.01.025]; 및 문헌[Star et al., "Electronic Detection of Specific Protein Binding Using Nanotube FET Devices," Nano Letters 3: 459-63 (2003), doi:10.1021/nl0340172]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
예시로서, 중합 효소는 형광 태그를 포함한다. 높은 신호 대 잡음(signal-to-noise)으로 중합 효소-핵산 상호 작용을 모니터링하기 위해, 소멸 조명 또는 공초점 현미경(confocal imaging)이 사용될 수 있다. 국소화된 주형 핵산에서 폐쇄 복합체의 형성은 배경과 비교하여 증가된 형광으로서 관찰될 수 있지만, 예를 들어, 일부 경우에 소광 또는 국소적인 극성 환경의 변화로 인한 감소된 형광으로서도 또한 관찰될 수 있다. 선택적으로, 중합 효소 분자의 분획이 형광단으로 태그될 수 있는 반면, 또 다른 분획은 동일한 반응 혼합물에서 소광제로 태그될 수 있고; 핵산의 국소화된, 클론 집단에서 폐쇄 복합체의 형성은 배경과 비교하여 형광 감소로 나타난다. 핵산의 클론 집단은 평면 기질, 미세 입자, 또는 나노 입자과 같은 지지체 표면에 부착될 수 있다. 선택적으로, 중합 효소는 형광단, 발광단(luminophore), 화학발광단(chemiluminophore), 발색단(chromophore), 또는 생물발광단(bioluminophore)으로 태그된다.
선택적으로, 복수의 주형 핵산이 표면에 연결되며, 하나(또는 하나 이상)의 dNTP가 순차적으로 유입된다. 친화력의 스펙트럼은 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드 및 이에 따른 주형 핵산 내 바로 다음의 염기의 정체를 나타낸다. 선택적으로, 친화력은 반응 혼합물 조건을 제거 및 대체(즉, 세척 단계)할 필요 없이 측정된다. 예를 들어, 결합 상호 작용의 측정된 강도의 자기 상관(autocorrelation)은 핵산 서열의 동역학을 쉽게 나타낼 수 있다. 선택적으로, 검사는 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합 효소의 친화력을 모니터링하는 것을 포함한다. 선택적으로, 중합 효소는 일시적으로 핵산과 결합하며, 결합 동역학 및 친화력은 주형 핵산 상의 바로 다음의 염기의 정체에 대한 정보를 제공한다. 선택적으로, 폐쇄 복합체가 형성되고, 이러한 폐쇄 복합체의 형성에 포함되는 반응 조건은 핵산 상의 바로 다음의 염기에 대한 정보를 제공한다. 선택적으로, 중합 효소는 이의 상호 작용으로 중합 부위에 포획되어, 해리 속도를 측정하기 위해 세척 단계를 필요로 하지 않으면서 친화력을 나타낸다.
중합 효소와 핵산 사이의 동적 상호작용을 측정할 수 있는 임의의 기법이 친화력을 측정하고 본 명세서에 개시된 서열 결정 반응 방법을 가능하게 하도록 사용될 수 있다.
뉴클레오타이드-특이적 삼원 복합체 형성의 검출을 위한 시스템
제공되는 방법은 핵산 중합 반응의 임의의 성분이 표면에 국소화되는 플랫폼을 사용하여 수행될 수 있다. 선택적으로, 주형 핵산은 평면 기질, 나노 홀 어레이, 미세 입자, 또는 나노 입자에 부착된다. 선택적으로, 모든 반응 성분은 반응 혼합물 중에 자유롭게 현탁되며, 고체 지지체 기질에 고정되지 않는다.
선택적으로, 주형 핵산은 표면에 고정된다. 표면은 평면 기질, 하이드로겔, 나노 홀 어레이, 미세 입자, 또는 나노 입자일 수 있다. 선택적으로, 반응 혼합물은 복수의 클론에 의해 증폭된 주형 핵산 분자를 포함한다. 선택적으로, 반응 혼합물은 복수의 구별가능한 주형 핵산을 포함한다.
특히, 뉴클레오타이드의 존재하에 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 사이의 상호 작용을 하나의 수단 또는 수단의 조합에 의해 검사하여 주형 폐쇄 복합체에서 바로 다음의 염기를 식별하는 것을 포함하는 서열 결정 반응을 수행하는 시스템이 본 명세서에 제공되며, 이러한 수단으로는, 중합 효소 도메인의 가교, 핵산에 대한 중합 효소의 가교, 소분자에 의한 알로스테릭 억제, 비경쟁적인 억제제, 경쟁적인 억제제, 비경쟁적인 억제제, 및 변성을 포함하지만, 이에 제한되지 않고; 여기서 포획된 중합 효소 복합체의 형성은 핵산 주형의 바로 다음의 염기의 정체의 정보를 제공한다.
또한, 본 명세서에 개시된 임의의 서열 결정 방법 중 하나 이상의 단계를 수행하는 시스템이 제공된다. 선택적으로, 시스템은 핵산의 존재하에 중합 효소 및 주형 핵산 결합 분석을 수행하는데 필요한 성분 및 시약을 포함하며, 이러한 주형 핵산은 나노 구조물 상에 제공된다. 선택적으로, 시스템은 나노 구조물 상에 주형 DNA 분자를 결합시키기 위해 필요한 하나 이상의 시약 및 설명서를 포함한다. 예를 들어, 시스템은 결합 동역학을 결정하기 위해 표면 플라즈몬 공명과 함께 사용하도록 구성된 칩과 같은 나노 구조물을 제공한다. 이러한 칩의 예로는 CM5 센서 S 칩(GE Healthcare; Piscatawany, N.J.)이 있다. 시스템은 표면 플라즈몬 공명 기구와 같은 계측 장치를 제공할 수 있다. 시스템은 스트렙타비딘 및/또는 비오틴을 제공할 수 있다. 선택적으로, 시스템은 비오틴화된 주형 DNA 제조를 위해 비오틴-DNA, DNA 연결 효소, 완충액, 및/또는 DNA 중합 효소를 제공한다. 선택적으로, 시스템은 비오틴화된 DNA 정제를 위해 겔 또는 시약(예컨대, 페놀:클로로폼)을 제공한다. 택일적으로, 시스템은 비오틴화된 주형 DNA 특징 분석, 예를 들어, 질량 분석기 또는 HPLC를 위한 시약을 제공한다. 선택적으로, 시스템은 칩 상에 스트렙타비딘 고정화를 위해 스트렙타비딘, 칩, 시약, 계측, 및/또는 설명서를 포함한다. 선택적으로, 주형 DNA 코팅을 위해 이미 구성된 시스템에 칩이 제공되며, 이러한 칩은 주형 핵산 또는 변형된 주형 핵산(예컨대, 비오틴화된 주형 DNA)을 결합시킬 수 있는 시약에 고정된다. 선택적으로, 시스템은 칩 재생을 위한 시약을 제공한다.
또한, 본 명세서에 개시된 임의의 서열 결정 방법 중 하나 이상의 단계를 수행하는 시스템이 제공된다. 선택적으로, 시스템은 핵산의 존재하에 중합 효소 및 주형 핵산 결합 분석을 수행하는데 필요한 성분 및 시약을 포함하며, 이러한 주형 핵산은 나노 입자 상에 제공된다. 선택적으로, 시스템은 나노 입자 상에 주형 DNA 분자를 결합시키기 위해 필요한 하나 이상의 시약 및 설명서를 포함한다. 나노 입자는 예를 들어, 금 나노 입자를 사용하여, 핵산-중합 효소 상호 작용의 전기화학적 검출을 위해 구성될 수 있다. 선택적으로, DNA-나노 입자 접합체는 금 콜로이드 수용액과 예를 들어, 말단에 유리 싸이올 또는 다이설파이드 기를 포함하는 주형 DNA 분자 사이에 형성된다. 이러한 접합체는 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 나노 입자 접합체는 높은 온도(예컨대, 60 ℃ 초과) 및 높은 이온 강도(예컨대, 1M Na+)에서 응집 및 침전에 대해 안정화된다. 선택적으로, 시스템은 나노 입자 부착을 위한 주형 DNA 분자를 제조하는 시약을 제공하며, 다이설파이드 또는 싸이올을 가지는 주형 DNA 분자를 생성하는 것을 포함한다. 다이설파이드 함유 주형 핵산은, 예를 들어, 3'-싸이올 개질제 제어된-공극 유리(CPG)를 사용하여, 또는 보편적인 지지체 CPG로 시작하고 서열 내 제1 단량체로서 다이설파이드 개질제 포스포아미다이트를 첨가함으로써 합성될 수 있다. 시스템은 다이설파이드-변형된 주형 핵산을 수득하기 위한 핵산 합성 시약 및/또는 설명서를 제공할 수 있다. 싸이올 함유 주형 핵산은 또한 핵산 합성 동안 5'-트라이틸싸이올 개질제 포스포아미다이트를 사용하여 생성될 수 있다. 시스템은 예를 들어, 전기영동 또는 원심분리를 사용하는 나노 입자 접합체 정제를 위한 시약 및/또는 설명서를 제공할 수 있다. 선택적으로, 나노 입자 접합체는 중합 효소-주형 핵산 상호 작용을 비색 분석으로 모니터링하기 위해 사용된다. 이러한 예시에서, 나노 입자 접합체의 용융 온도가 강한 중합 효소 결합의 존재하에 증가한다. 그러므로, DNA 결합의 강도는 색 변화로 관찰할 수 있는 이러한 용융 전이의 변화에 의해 결정될 수 있다. 시스템은 선택적으로 용융 전이의 검출을 위한 시약 및 기기를 포함한다.
또한, 본 명세서에 개시된 임의의 서열 결정 방법 중 하나 이상의 단계를 수행하는 시스템이 제공된다. 선택적으로, 시스템은 검출가능한 중합 효소를 사용하여, 핵산의 존재하에 중합 효소 및 주형 핵산 결합 분석을 수행하는데 필요한 성분 및 시약을 포함한다. 선택적으로, 중합 효소는 검출가능하게 표지된다. 선택적으로, 중합 효소는 중합 효소, 예를 들어, 방향족 아미노산의 고유 성질을 사용하여 검출된다. 선택적으로, 시스템 내 존재하는 중합 효소 및 주형 핵산은 지지체에 접합되지 않고 용액에서의 사용을 위해 구성된다. 중합 효소 상의 검출가능한 표지는 형광단일 수 있고, 여기서 형광은 중합 효소-주형 핵산 결합 현상을 모니터링하기 위해 사용된다. 선택적으로, 검출가능한 중합 효소는 용액 상태의 주형 핵산, 또는 지지체 구조에 접합된 주형 핵산과의 조합으로 사용될 수 있다. 선택적으로, 중합 효소의 시스테인 잔기 중 하나 이상은 Cy3-말레이미드로 표지된다. 선택적으로, 시스템은 형광 표지된 중합 효소 분자를 제조하기 위해 필요한 시약 및/또는 설명서를 포함한다. 시스템은 형광 표지된 중합 효소 정제를 위한 시약 및/또는 설명서를 포함할 수 있다.
방법의 절차적 특징
검사 단계를 거쳐, 폐쇄 복합체의 형성을 통해 바로 다음의 염기의 정체가 식별되면, 반응 조건은 선택적 혼입 단계 또는 추가의 검사 단계를 준비하기 위해 적절하게 재설정, 재충전, 또는 변형될 수 있다. 선택적으로, 바로 다음의 염기의 정체는 뉴클레오타이드를 화학적으로 혼입시키지 않고 식별되었다. 선택적으로, 바로 다음의 염기의 정체는 뉴클레오타이드를 화학적으로 혼입하여 식별되고, 후속 뉴클레오타이드 혼입이 억제된다. 선택적으로, 서열 결정된 주형 핵산을 제외한 검사 단계의 모든 성분은 제거 또는 세척되어, 시스템을 검사-전 조건으로 복귀시킨다. 선택적으로, 검사 단계의 일부 성분이 제거된다. 선택적으로, 추가 성분이 검사 단계에 첨가된다.
선택적으로, 가역적 종결자 뉴클레오타이드는 혼입 단계에서 주기 당 하나, 및 오직 하나의 뉴클레오타이드가 혼입됨을 확실시하기 위해 사용된다. 검사 단계로부터 염기 정체를 알 수 있으므로, 가역적 종결자 뉴클레오타이드 상에는 표지가 요구되지 않는다. 형광 비표지된 가역적 종결자는 상업적 공급 업체로부터 용이하게 입수할 수 있다. 비표지된 가역적 종결자 뉴클레오타이드는 표지된 가역적 종결자와 비교하여 훨씬 작은 입체 크기(steric footprint), 및 천연 뉴클레오타이드와 유사한 크기로 인해 훨씬 빠른 혼입 동역학을 가질 것으로 예상된다.
부분적으로, 시약 순환 서열 결정 방법이 본 명세서에 개시되며, 이러한 서열 결정 시약은, 검사 및/또는 혼입의 매 주기마다 차례로 도입된다. 선택적으로, 서열 결정 반응 혼합물은 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 하나 이상의 유형의 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 및/또는 중합 효소는 주기적으로 서열 결정 반응 혼합물에 도입된다. 선택적으로, 서열 결정 반응 혼합물은 복수의 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 복수의 뉴클레오타이드 및/또는 복수의 중합 효소는 주기적으로 서열 결정 반응 혼합물에 도입된다. 선택적으로, 서열 결정 반응의 검사 단계는 서열 결정 반응의 혼입 단계와는 상이한 조성물을 가진다.
선택적으로, 하나 이상의 뉴클레오타이드는 서열 결정 반응에 순차적으로 첨가되며, 이로부터 제거된다. 선택적으로, 1, 2, 3, 4가지 이상 유형의 뉴클레오타이드가 반응 혼합물에 첨가되고 이로부터 제거된다. 예를 들어, 하나의 유형의 뉴클레오타이드가 서열 결정 반응에 첨가되고, 제거되고, 또 다른 유형의 뉴클레오타이드로 대체된다. 선택적으로, 검사 단계 동안 존재하는 뉴클레오타이드 유형은 혼입 단계 동안 존재하는 뉴클레오타이드 유형과 상이하다. 선택적으로, 검사 단계 동안 존재하는 뉴클레오타이드 유형은 후속 검사 단계 동안 존재하는 뉴클레오타이드 유형과 상이하다(즉, 혼입 단계 이전에 후속 검사 단계가 수행됨). 선택적으로, 1, 2, 3, 4가지 이상 유형의 뉴클레오타이드가 검사 반응 혼합물 내 존재하고, 1, 2, 3, 4가지 이상 유형의 뉴클레오타이드가 혼입 반응 혼합물 내 존재한다.
선택적으로, 중합 효소는 서열 결정 반응에 주기적으로 첨가되고, 이로부터 제거된다. 하나 이상의 상이한 유형의 중합 효소는 서열 결정 반응에 주기적으로 첨가되고, 이로부터 제거될 수 있다. 선택적으로, 검사 단계 동안 존재하는 중합 효소 유형은 혼입 단계 동안 존재하는 중합 효소 유형과 상이하다. 검사 단계 동안 존재하는 중합 효소 유형은 후속 검사 단계 동안 존재하는 중합 효소 유형과 상이할 수 있다(즉, 혼입 단계 이전에 후속 검사 단계가 수행됨).
선택적으로, 시약의 존재, pH, 온도, 및 이온 강도와 같은 조건은 서열 결정 반응에 걸쳐 달라진다. 선택적으로, 금속은 서열 결정 반응에 주기적으로 첨가되고, 이로부터 제거된다. 예를 들어, 촉매 금속 이온는 검사 단계 동안 부재하고 혼입 단계 동안 존재할 수 있다. 택일적으로, 중합 효소 억제제는 검사 단계 동안 존재하고 혼입 단계 동안 부재할 수 있다. 선택적으로, 서열 결정 반응 동안 소비되는 반응 성분은 서열 결정 반응 동안 임의의 지점에서 새로운 성분의 첨가로 보충된다.
뉴클레오타이드는 중합 효소와 함께, 한 번에, 하나의 유형으로, 폐쇄 복합체 형성을 유리하게 하는 반응 조건에 첨가될 수 있다. 중합 효소는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 존재하는 경우 오직 주형 핵산에 결합한다. 모든 뉴클레오타이드 첨가 이후 세척 단계는 폐쇄 복합체에 포함되지 않는 과량의 중합 효소 및 뉴클레오타이드 모두가 반응 혼합물로부터 제거되도록 한다. 뉴클레오타이드가 공지된 순서로 한 번에 하나씩 첨가되면, 첨가된 뉴클레오타이드가 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드일 때, 폐쇄 복합체의 형성에 의해 주형 핵산 상의 바로 다음의 염기가 결정된다. 폐쇄 복합체는 입체 구조 변화 및 중합 효소-주형 핵산-뉴클레오타이드 상호 작용의 안정성 증가, 둘 모두에 의해 식별될 수 있다. 선택적으로, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 형성된 폐쇄 복합체의 안정성은 부정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 중합 효소와 주형 핵산의 불안정한 상호 작용을 적어도 열 배 초과한다. 세척 단계를 사용하면, 결합되지 않은 뉴클레오타이드 및 중합 효소가 존재하지 않으며, 오직 반응에 존재하는 뉴클레오타이드는 중합 효소 및 주형 핵산과 함께 폐쇄 복합체에 격리된 뉴클레오타이드임을 보장한다. 주형 핵산 상의 바로 다음의 염기가 결정되면, 폐쇄 복합체 내에 격리된 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드는, 폐쇄 복합체의 해리 또는 불안정화를 유리하게 하는 반응 조건으로 유입하고, 하나의 염기만큼 주형 핵산 프라이머 가닥을 연장(혼입)시킴으로써 혼입될 수 있다. 그러므로, 세척 단계는 오직 혼입된 뉴클레오타이드는 폐쇄 복합체로부터 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드임을 보장한다. 이러한 시약 순환 방법은 반복될 수 있고 핵산 서열이 결정될 수 있다. 이러한 시약 순환 방법은 단일 주형 핵산 분자에, 또는 클론 집단의 개체군, 예컨대 PCR 생성물 또는 회전환(rolling-circle) 증폭 DNA에 적용될 수 있다. 다수의 상이한 주형이 예를 들어, 고체 지지체에 배열되는 경우 동시에 서열 결정될 수 있다. 선택적으로, 세척 단계는 이원 복합체 형성을 불안정화시킨다. 선택적으로, 세척은 이원 복합체가 제거되어, 반응 혼합물에 안정화된 폐쇄 복합체가 남았음을 보장하는 기간 동안 수행된다. 선택적으로, 세척 단계는 높은 이온 강도 또는 높은 pH 용액으로 반응을 세척하는 것을 포함한다.
선택적으로, 혼입 단계는 세 단계 공정이다. 제1 단계에서, 4가지 뉴클레오타이드 유형 모두가 높은 정확도의 중합 효소와 함께, 폐쇄 복합체의 형성을 유리하게 하는 반응 조건으로 프라이밍된 주형 핵산을 포함하는 반응 내로 도입되고, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 주형 핵산과 함께 안정한 폐쇄 복합체를 형성하도록 허용된다. 제2 단계에서, 과량의 뉴클레오타이드 및 결합되지 않은 중합 효소가 씻겨 나간다. 제3 단계에서, 폐쇄 복합체가 불안정화되고 폐쇄 복합체 내의 격리된 뉴클레오타이드가 주형 핵산 프라이머의 3'-말단 내로 혼입되도록 반응 조건이 변형된다. 택일적인 접근법에서, 제2 단계는 폐쇄 복합체에 존재할 수 있는 임의의 높은 정확도 중합 효소 및 동족 뉴클레오타이드를 완전히 제거하도록 변형되고, 제거된 성분은 제2 중합 효소 및 하나 이상의 뉴클레오타이드(예컨대, 가역적 종결자 뉴클레오타이드)로 대체된다. 혼입 단계에서 단단한 중합 효소-핵산 복합체의 형성은, 중합 효소(예컨대, Phusion 중합 효소; MA, Waltham 소재의 Thermo Fisher Scientific으로부터 입수가능)에 대한 비특이적 DNA 결합 도메인 융합, 및 고농도의 뉴클레오타이드 사용과 같은 표준 기법에 의해, 정확한 뉴클레오타이드가 폐쇄 복합체 내에 항상 존재하도록 보장할 수 있다.
중합 효소 합성 반응에 일반적으로 요구되는 2가 금속 이온의 부재하에서도, 중합 효소 분자는 손가락-폐쇄된 입체 구조에서 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산 분자에 결합한다. 입체 구조 변화는 중합 효소의 활성 부위 내의 바로 다음의 주형 염기에 상보적인 뉴클레오타이드를 포획한다. 선택적으로, 폐쇄 복합체의 형성은 주형 핵산 상의 바로 다음의 염기의 정체를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 프라이밍된 주형 핵산은 중합 효소의 존재, 및 촉매 2가 금속 이온의 부재하에 상이한 뉴클레오타이드와 연속적으로 접촉될 수 있고; 이러한 폐쇄 복합체의 형성은 주형 핵산과 현재 접촉하는 뉴클레오타이드가 핵산 상의 바로 다음의 염기에 상보적인 뉴클레오타이드임을 나타낸다. (중합 효소의 존재, 및 촉매 금속 이온의 부재하에) 주형 핵산과 접촉하게 되는 뉴클레오타이드의 공지된 순서는 폐쇄 복합체 형성을 유도하는 순서로 특정 위치에 기초하여 상보적인 뉴클레오타이드의 용이한 식별을 보장한다. 선택적으로, 적절한 세척 단계는 모든 과량의 효소 및 뉴클레오타이드의 제거를 보장하기 위해 뉴클레오타이드 첨가 이후 마다 수행되어, 활성 부위에서 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드와 함께 폐쇄 복합체 내 핵산에 결합된 중합 효소만이 남아있을 수 있다. 폐쇄 복합체는, 이원 중합 효소-핵산 복합체와 비교하여, 또는 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산 및 부정확한 뉴클레오타이드 사이의 불안정한 상호 작용과 비교하여, 폐쇄된 입체 구조 내 중합 효소의 입체 구조 변화를 나타내는 수단에 의해, 또는 중합 효소/핵산/바로 다음의-정확한-뉴클레오타이드 복합체의 안정성 증가를 나타내는 수단에 의해 식별될 수 있다.
선택적으로, 바로 다음의 상보적인 뉴클레오타이드를 식별하는 공정(검사 단계)은 뉴클레오타이드의 화학적 혼입을 억제하는 조건하에서, 고정된 프라이밍된 주형 핵산과, 중합 효소 및 한 종류의 뉴클레오타이드를 포함하는 검사 혼합물을 접촉시키는 단계, 세척 단계에 의해 결합되지 않은 시약을 제거하는 단계, 고정된 핵산 상에서 중합 효소 폐쇄 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계, 및 폐쇄 복합체 형성이 검출될 때까지 상이한 종류의 뉴클레오타이드를 사용하여 상기 단계들을 연속적으로 반복하는 단계를 포함한다. 폐쇄 복합체는 입체 구조 변화 및 중합 효소/핵산/바로 다음의-정확한-뉴클레오타이드 복합체의 안정성 증가, 둘 모두에 의해 식별될 수 있다. 성공적인 뉴클레오타이드 첨가 사이의 세척 단계는 높은 정확도로 폐쇄 복합체의 형성을 검출할 수 있는 검출 메커니즘, 예를 들어, 소멸파 감지 방법 또는 폐쇄 복합체로부터 신호를 선택적으로 모니터링하는 방법을 사용함으로써 제거될 수 있다. 상기 언급된 검사 단계 이후 폐쇄 복합체와 촉매 금속 이온을 접촉시켜, 폐쇄 복합체 내에 격리된 뉴클레오타이드를 프라이머의 3'-말단에 공유적으로 첨가하는 것을 포함하는 혼입 단계가 수반될 수 있다. 선택적으로, 혼입 단계는 뉴클레오타이드의 화학적 혼입을 억제하는 조건하에서 고정된 핵산과, 여러 유형의 뉴클레오타이드 및 중합 효소의 조합물을 포함하는 혼입-전 혼합물을 접촉시키는 것을 포함할 수 있고; 혼입-전 혼합물은 매우 효과적인 폐쇄 복합체 형성을 보장하는 첨가제 및 용액 조건(예컨대, 저염 조건)을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 또한 결합되지 않은 시약을 제거하기 위한 세척 단계를 수행하고, 고정된 복합체에 촉매 금속 이온을 포함하는 혼입 혼합물을 제공하여, 중합 효소의 활성 부위 내에 격리된 뉴클레오타이드를 화학적으로 혼입시키는 것을 포함할 수 있다. 혼입-전 혼합물은 매우 효과적인 폐쇄 복합체 형성을 보장하는 반면, 세척 단계 및 혼입 혼합물은 프라이머의 3'-말단에 대한 단일 뉴클레오타이드의 첨가를 보장한다. 선택적으로, 혼입 단계는 한 유형의 뉴클레오타이드의 첨가를 검사한 후 직접 일어날 수 있다. 예를 들어, 서열 결정을 위해 사용되는 반복 패턴은 다음의 유동 패턴을 포함할 수 있다: (i) dATP+/중합 효소, (ii) 세척, (iii) Mg+2, (iv) 세척, (v) dTTP+/중합 효소, (vi) 세척, (vii) Mg+2, (viii) 세척, (ix) dCTP+/중합 효소, (x) 세척, (xi) Mg+2, (xii) 세척, (xiii) dGTP+/중합 효소, (xiv) 세척, (xv) Mg+2, (xvi)세척. 선택적으로, 서열 결정을 위해 사용되는 반복 패턴은 다음을 포함할 수 있다: (i) dATP+/중합 효소, (ii) 세척, (iii) dTTP+/중합 효소, (iv) 세척, (v) dGTP+/중합 효소, (vi) 세척, (vii) dCTP+/중합 효소, (viii) 세척, (ix) 혼입-전 혼합물, (x) 세척, (xi) Mg, (xii) 세척. 세척 단계는 검사 단계 동안 의도하지 않은 혼입을 방지하기 위해 일반적으로 금속 이온 킬레이트화제 및 다른 소분자를 포함한다. 혼입 단계 이후, 프라이머 가닥은 일반적으로 하나의 염기 만큼 연장된다. 상기 공정을 반복하여, 핵산의 순차적인 뉴클레오염기가 식별되어, 효과적으로 핵산 서열을 결정할 수 있다. 선택적으로, 검사 단계는 고염 조건, 예를 들어, 50 mM 내지 1,500 mM 염의 조건하에서 수행된다.
서열 결정 응용 분야에서, 유동체 및 시약 교환을 최소화 또는 제거하는 것이 유리할 수 있다. 펌프, 밸브 및 시약 용기를 제거하면 소형 장치를 간편하게 제조할 수 있다. 부분적으로, "올 인(all-in)" 서열 결정 방법이 본 명세서에 개시되며, 이는 검사 및/또는 혼입의 매 주기마다, 차례로 시약을 도입해야 하는 필요성이 제거된다. 시약은 반응에 오직 한버 첨가되며, 서열 결정 반응 내에 이미 둘러싸인 시약을 조작하여 합성에 의한 서열 결정이 수행된다. 이러한 방식은 상이한 뉴클레오타이드를 구별하는 방법, 핵산의 클론 집단을 통해 및/또는 상이한 핵산 분자를 통해 뉴클레오타이드의 혼입을 동기화시키는 방법, 및 주기마다 오직 하나의 뉴클레오타이드가 첨가되는 것을 보장하는 방법을 필요로 한다.
선택적으로, 서열 결정 반응 혼합물은 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 하나 이상의 유형의 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 서열 결정 반응 혼합물은 복수의 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명에 제공된 바와 같이, 중합 효소는 단일 중합 효소 또는 복수의 중합 효소를 지칭한다. 본 발명에 제공된 바와 같이, 프라이밍된 주형 핵산 또는 주형 핵산은 단일 프라이밍된 주형 핵산 또는 단일 주형 핵산, 또는 복수의 프라이밍된 주형 핵산 또는 복수의 주형 핵산을 지칭한다. 본 발명에 제공된 바와 같이, 뉴클레오타이드는 하나의 뉴클레오타이드 또는 복수의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 본 발명에 제공된 바와 같이, 단일 뉴클레오타이드는 하나의 뉴클레오타이드이다. 선택적으로, 서열 결정 반응 뉴클레오타이드는 다음의 1, 2, 3, 또는 4 종류의 뉴클레오타이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: dATP, dGTP, dCTP, dTTP 및 dUTP.
선택적으로, 검사 단계 및 혼입 단계는 단일 서열 결정 반응 혼합물에서 일어날 수 있다.
선택적으로, 1, 2, 3, 4가지 이상 유형의 뉴클레오타이드(예컨대, dATP, dGTP, dCTP, dTTP)는 반응 혼합물 내에 동시에 함께 존재하며, 여기서 한 유형의 뉴클레오타이드는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드이다. 반응 혼합물은 추가적으로 하나 이상의 중합 효소 및 하나 이상의 프라이밍된 주형 핵산을 포함한다. 선택적으로, 주형 핵산은 주형 핵산의 클론 집단이다. 선택적으로, 중합 효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드는 검사 반응 조건하에서 폐쇄 복합체를 형성한다.
제공된 방법에서, 4가지 유형의 뉴클레오타이드는 구별되며 상이한 농도로 존재할 수 있고, 4가지 뉴클레오타이드의 상이한 농도로 인해, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드인 경우 주형 핵산에 대한 중합 효소의 확산 및 결합 시간은 4가지 뉴클레오타이드 각각에 대해 상이하다. 예를 들어, 가장 높은 농도의 뉴클레오타이드는 빠른 시간에 주형 핵산 상의 상보적인 염기에 결합할 것이고, 가장 낮은 농도의 뉴클레오타이드는 보다 느린 시간에 주형 핵산 상의 상보적인 염기에 결합할 것이며; 여기서 주형 핵산 상의 상보적인 염기에 대한 결합은 폐쇄된 폐쇄 복합체에서 주형 핵산과 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드에 대한 중합 효소 결합을 지칭한다. 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 정체는 이에 따라 폐쇄 복합체에서 주형 핵산에 대한 중합 효소의 결합 속도 또는 시간을 모니터링함으로써 결정된다. 선택적으로, 4가지 유형의 뉴클레오타이드는 이들의 농도로 구별될 수 있고, 뉴클레오타이드의 상이한 농도는 핵산에 대한 중합 효소 결합에 대해 측정가능한 상이한 결합 속도를 야기한다. 선택적으로, 4가지 유형의 뉴클레오타이드는 이들의 농도로 구별될 수 있고, 뉴클레오타이드의 상이한 농도는 안정화된 폐쇄 복합체의 형성에 대해 측정가능한 상이한 결합 속도를 야기한다.
선택적으로, 중합 효소는 표지된다. 일부 예시에서, 중합 효소는 표지되지 않고(즉, 형광 표지와 같은 외인성 표지를 보유하지 않고) 본 명세서에 개시된 또는 기술 분야 내 공지된 임의의 무표지 검출 방법이 사용된다. 선택적으로, 핵산에 대한 중합 효소의 결합은 중합 효소의 검출가능한 특징을 퉁해 모니터링된다. 선택적으로, 안정화된 폐쇄 복합체의 형성은 중합 효소의 검출가능한 특징을 통해 모니터링된다. 중합 효소의 검출가능한 특징은, 광학, 전기, 열, 비색 분석, 질량, 및 임의의 이의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
선택적으로, 1, 2, 3, 4가지 이상의 뉴클레오타이드 유형(예컨대, dATP, dTTP, dCTP, dGTP)이 1, 2, 3, 4가지 이상의 상이한 중합 효소에 연결되고; 여기서 각 뉴클레오타이드 유형은 상이한 중합 효소에 연결되고, 각 중합 효소는 식별을 가능하게 하는 다른 중합 효소와 상이한 외인성 표지 또는 검출가능한 특징을 가진다. 모든 연결된 뉴클레오타이드 유형은 서열 결정 반응 혼합물에 함께 첨가되어 연결된 뉴클레오타이드-중합 효소를 포함하는 폐쇄 복합체를 형성 할 수 있고; 폐쇄 복합체는 중합 효소를 식별하기 위해 모니터링되어, 중합 효소가 접촉되는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 식별한다. 이러한 연결은 여러-포스페이트 기 및 링커 분자를 통해 뉴클레오타이드의 감마 포스페이트에서 일어날 수 있다. 이러한 감마-포스페이트 연결 방법은 형광단이 감마 포스페이트 링커에 부착되는 기술 분야의 표준이다. 선택적으로, 상이한 뉴클레오타이드 유형은 구별가능한 외인성 표지에 의해 식별된다. 선택적으로, 구별가능한 외인성 표지는 각 뉴클레오타이드의 감마 포스페이트에 부착된다.
선택적으로, 서열 결정 반응 혼합물은 촉매 금속 이온을 포함한다. 선택적으로, 촉매 금속 이온은 임의의 지점에서 일시적인 방식으로 서열 결정 반응에서 중합 효소와 반응할 수 있다. 견고한 서열 결정을 보장하기 위해, 촉매 금속 이온은 단기간 동안 사용 가능하여, 혼입 단계 동안 주형 핵산의 바로 다음의 염기에 상보적인 단일 뉴클레오타이드가 프라이머의 3'-말단 내로 혼입되도록 한다. 이러한 예시에서, 다른 뉴클레오타이드, 예를 들어, 주형 핵산의 바로 다음의 염기의 염기 하류에 상보적인 뉴클레오타이드는 혼입되지 않는다. 선택적으로, 촉매 금속 이온 마그네슘은 서열 결정 반응 혼합물에 포토케이지(photocaged) 복합체(예컨대, DM-나이트로펜(DM-Nitrophen))로서 존재하여, 국소화 UV 조명이 마그네슘을 방출하여, 뉴클레오타이드 혼입을 위한 중합 효소로 사용할 수 있도록 한다. 게다가, 서열 결정 반응 혼합물은 EDTA를 포함할 수 있으며, 마그네슘은 촉매 뉴클레오타이드 혼입 이후 중합 효소 활성 부위로부터 방출되고 서열 결정 반응 혼합물에서 EDTA에 의해 포획되어, 마그네슘이 후속 뉴클레오타이드 혼입을 촉매화할 수 없게 한다.
이에 따라, 제공된 방법에서, 촉매 금속 이온은 서열 결정 반응에서 트리거에 의해 방출될 수 있는 킬레이트화 또는 갇힌 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 촉매 금속 이온은 폐쇄 복합체 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 혼입을 촉매화하고, 촉매 금속 이온은 활성 부위로부터 방출됨에 따라, 제2의 킬레이트화제 또는 포획제에 의해 격리되어, 후속 혼입을 촉매화하지 않도록 한다. 킬레이트화 또는 갇힌 복합체로부터 촉매 이온의 국소화된 방출은 국소화 비포획화(uncaging) 또는 비-킬레이트화(un-chelating) 방식, 예컨대 소멸파 조명 또는 구조화된 조명을 사용하여 보장된다. 촉매 금속 이온의 제어된 방출은 예를 들어, 열적 수단에 의해 일어날 수 있다. 포토케이지 복합체로부터 촉매 금속 이온의 제어된 방출은 제한된 광학 장에 의해, 예를 들어 도파관 또는 내부 전반사 현미경과 같은 소멸 조명에 의해, 주형 핵산 근처에 국부적으로 방출될 수 있다. 촉매 금속 이온의 제어된 방출은 예를 들어, 주형 핵산 근처 용액의 pH를 변경시킴으로써 일어날 수 있다. EDTA 및 EGTA와 같은 킬레이트화제는 pH 의존적이다. pH 5 이하에서, 2가 양이온 Mg2+ 및 Mn2+는 EDTA에 의해 효과적으로 킬레이트화되지 않는다. 주형 핵산 근처의 pH를 제어가능하게 조작하는 방법은 킬레이트화제로부터 촉매 금속 이온의 제어된 방출을 가능하게 한다. 선택적으로, 국소적인 pH 변화는 핵산이 부착되는 표면에 전압을 인가함으로써 유도된다. pH 방법은 pH가 킬레이트화 범위로 다시 복귀하는 경우 금속이 이의 킬레이트화된 형태로 돌아오는 이점을 제공한다.
선택적으로, 촉매 금속 이온은 중합 효소의 활성 부위에 강하게 결합되어, 단일 뉴클레오타이드 혼입 이후 주형 핵산으로부터 중합 효소의 제거가 필요하다. 중합 효소의 제거는 고분배형 중합 효소의 사용에 의해 수행될 수 있고, 이는 모든 뉴클레오타이드의 첨가 이후 합성되는 가닥(예컨대, 프라이머)의 3'-말단에서 탈락한다. 결합되지 않은 중합 효소는 추가적으로 전기장 또는 자기장에 적용되어 핵산 분자 부근으로부터 이를 제거할 수 있다. 중합 효소에 결합된 임의의 금속 이온은 서열 결정 반응 혼합물 내 존재하는 킬레이트화제에 의해, 또는 폐쇄 복합체의 형성을 방해하지 않고 중합 효소의 활성 부위에 결합하기 위해 금속 이온과 경쟁하는 분자에 의해 격리될 수 있다. 주형 핵산으로부터 중합 효소를 제거 또는 이동시키기 위한 힘(예컨대, 전기장, 자기장, 및/또는 킬레이트화제)은 종결되어, 중합 효소가 또 다른 차례의 서열 결정(즉, 검사 및 혼입)을 위한 주형 핵산에 접근하도록 할 수 있다. 다음 차례의 서열 결정은, 비제한적인 예시에서, 폐쇄 복합체를 형성하는 단계, 주형 핵산 및/또는 폐쇄 복합체의 부근에서 결합되지 않은 중합 효소를 제거하는 단계, 촉매 금속 이온의 방출을 제어하여 폐쇄 복합체 내에 격리된 단일 뉴클레오타이드을 혼입시키는 단계, 주형 핵산으로부터 해리된 중합 효소를 제거하는 단계, 킬레이트화제 또는 경쟁정 결합제의 사용을 통해 임의의 유리 촉매 금속 이온을 격리하는 단계, 및 중합 효소가 주형 핵산에 접근하여 서열 결정의 다음 주기를 수행하도록 하는 단계를 포함한다.
핵산 서열의 식별을 위한 중합 효소-핵산 결합 반응이 상기 개시된다. 그러나, 핵산 서열 식별은 메틸화 및 하이드록시메틸화를 비롯한 핵산 변형에 대한 정보를 포함할 수 있다. 메틸화는 주형 핵산의 사이토신 염기에서 일어날 수 있다. DNA 메틸화는 유전자 발현을 안정하게 변형한다. DNA 메틸화는 또한 다양한 유형의 암, 죽상동맥경화증, 및 노화의 진행에서도 나타난다. 그러므로, DNA 메틸화는 인간 질병의 후성적 바이오마커로서 역할을 할 수 있다.
선택적으로, 주형 핵산에서 하나 이상의 사이토신 메틸화는 본 명세서에 제공되는 결합에 의한 서열 결정 방법 동안 식별된다. 주형 핵산은 서열 결정 전에 클론에 의해 증폭될 수 있고, 여기서 증폭산물(amplicon)은 주형 핵산으로서 동일한 메틸화를 포함한다. 주형 핵산의 증폭은 증폭산물 메틸화를 달성하기 위한 DNA 메틸 전이 효소의 사용을 포함할 수 있다. 주형 핵산 또는 증폭된 주형 핵산은 중합 효소 및 하나 이상의 뉴클레오타이드 유형을 포함하는 반응 혼합물에 제공되며, 여기서 중합 효소와 핵산 사이의 상호 작용은 모니터링된다. 선택적으로, 메틸화된 사이토신의 존재하에 중합 효소와 주형 핵산 사이의 상호 작용은 변형되지 않은 사이토신의 존재하에서의 상호 작용과는 상이하다. 그러므로, 중합 효소-핵산 상호 작용 검사에 기초하여, 변형된 뉴클레오타이드의 정체가 결정된다.
선택적으로, 하나 이상의 검사 및/또는 혼입 단계 이후, 하위 세트의 뉴클레오타이드가 첨가되어 페이징(phasing)을 제거 또는 재설정한다. 이에 따라, 이러한 방법은 서열 결정되는 주형 핵산 분자를, 하위 세트의 뉴클레오타이드 및 핵산 분자의 주형 가닥의 반대 가닥 내로 혼입시키기 위한 효소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 이러한 접촉은 핵산 분자에서 페이징을 감소시키는 조건하에서 일어날 수 있다. 선택적으로, 주형 핵산 분자의 접촉 단계는 혼입 단계 이후 및/또는 검사 단계 이후에 일어난다. 선택적으로, 접촉은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100회 이상의 서열 결정, 즉, 검사 및 혼입 이후 일어난다. 선택적으로, 접촉은 30 내지 60회의 서열 결정 이후 일어난다. 선택적으로, 접촉은 매 회의 서열 결정 이후(즉, 한 세트의 검사 및 혼입 단계 이후) 일어난다. 선택적으로, 다중 접촉 단계가 매 회의 서열 결정 이후 일어나며, 각 접촉 단계는 상이한 하위 세트의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 선택적으로, 이러한 방법은 추가적으로 접촉 이후 하나 이상의 세척 단계를 포함한다. 선택적으로, 하위 세트는 2 또는 3개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 하위 세트는 3개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 하위 세트의 뉴클레오타이드는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는 이의 유도체 중 3개로부터 선택된다. 선택적으로, 3개의 뉴클레오타이드는 아데노신, 사이토신, 및 구아닌을 포함한다. 선택적으로, 3개의 뉴클레오타이드는 아데노신, 사이토신, 및 티미딘을 포함한다. 선택적으로, 3개의 뉴클레오타이드는 사이토신, 구아닌 및 티미딘을 포함한다. 선택적으로, 3개의 뉴클레오타이드는 아데노신, 구아닌 및 티미딘을 포함한다. 선택적으로, 매 회의 접촉은 동일한 하위 세트 또는 상이한 하위 세트의 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 핵산 주형의 서열 결정은 모니터링되며, 하위 세트의 뉴클레오타이드와의 접촉은 페이징의 검출 시 일어난다. 또한 예를 들어, 미국 특허 제8,236,532호를 참조하며, 상기 문헌은 본 명세서에 그 전체가 참조 문헌으로 포함된다.
선택적으로, 서열 결정 반응은 복수의 주형 핵산, 중합 효소 및/또는 뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서 복수의 폐쇄 복합체가 모니터링된다. 클론에 의해 증폭된 주형 핵산이 함께 서열 결정될 수 있고, 클론은 가까이에서 국소화되어 서열 결정 동안 향상된 모니터링을 가능하게 한다. 선택적으로, 폐쇄 복합체의 형성은 복수의 클론에 의해 증폭된 주형 핵산에 걸친 염기 연장의 동시성을 보장한다. 염기 연장의 동시성은 서열 결정 주기 당 오직 하나의 염기의 첨가를 가능하게 한다.
실시예
예비 시험은 프라이밍된 주형 핵산, 중합 효소, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드(즉, 동족 뉴클레오타이드)의 특정 상호 작용이 유용한 서열 정보를 나타내는 삼원 복합체를 어떻게 형성하는지 입증하였다. 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 정체는 유리하게는 천연 뉴클레오타이드(예컨대, dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP로 구성된 비표지된 뉴클레오타이드)를 사용하여 프라이머 연장 생성물 내로의 화학적 혼입 전에 결정된다. 변형된 뉴클레오타이드(예컨대, 뉴클레오타이드 유사체, 또는 형광 또는 다른 표지를 혼입한 뉴클레오타이드)가 절차에 사용될 수 있지만, 천연 뉴클레오타이드 서열 결정 프로토콜 동안 표지 또는 다른 화학적 모이어티를 제거해야 하는 필요성을 제거하여 더 빠른 순환을 용이하게 하였다. 일치/불일치 염기 구별을 향상시키기 위한 접근법과 관련하여 상기 기재된 바와 같이, 염 농도는 검사 단계 동안 삼원 복합체의 형성을 유리하게 하도록 조작될 수 있다. 이것은 삼원 복합체 형성으로 인해 신호 대 잡음 비율을 증가시켰고, 정확한 염기 확정을 개선하였다. 정확한 염기 확정을 개선하고 판독 길이를 연장하는 다른 접근법이 하기 기재된다.
도 1은 동종 중합체가 프라이밍된 주형 핵산과 중합 효소 및 뉴클레오타이드의 결합을 위한 2 단계 프로토콜을 사용하지 않는, 동종 중합체 압축을 사용하는 표준 SBB 절차를 사용하여 획득된 결과를 나타낸다. 대략 28 주기의 모든 4개의 dNTP의 검사 및 혼입(단일 염기 조사를 사용)을 사용하여 100개 이상의 뉴클레오타이드의 서열 데이터를 수득하였다. 삼원 복합체 형성(동족 뉴클레오타이드의 식별과 관련)을 나타내는 측정된 신호(수직축)는 주기 번호(수평축)가 증가함에 따라 감소하는 경향을 나타냈다. 대조적으로, 이원 복합체의 검출을 나타내는 측정된 신호(비동족 뉴클레오타이드의 식별과 관련)는 유사하게 감소하지 않았다. 더욱 구체적으로, 이원 복합체의 배경 검출과 관련된 신호는 서열 결정 절차 기간 동안 실질적으로 일정하게 유지되었다. 결과적으로, 정확한 염기 확정에 대한 신호:잡음 비율은 도면에 도시된 것보다 긴 서열 판독으로부터 정확한 염기 확정을 유리하게 하지 않는 경향을 나타냈다. 따라서, SBB 절차에서 염기 확정에 유용한 신호:잡음 비율을 개선하기 위한 목적을 위해 이원 복합체와 관련된 배경 신호를 감소시키기 위해 사용될 수 있는 방법을 조사하는 것이 중요하였다.
다음의 실시예는 두 가지의 상이한 중합 효소 결합 조건하에서 모니터링된 상호 작용을 비교하는 기법을 예시하며, 여기서 중합 효소 농도는 일정하게 유지되며 시험 뉴클레오타이드(예컨대, dATP, dGTP, dCTP, dTTP; 뉴클레오타이드 유사체; 또는 표지된 뉴클레오타이드)는 상이한 두 농도로 존재한다. 두 뉴클레오타이드의 농도는 서로 비교하여 상대적으로 낮거나 높을 수 있다. 예를 들어, 두 뉴클레오타이드의 농도는 10 배 이상 차이가 날 수 있다. 사실 상, 두 상이한 결합 조건은 시험 뉴클레오타이드(들)의 존재 및 부재(즉, 0 농도)에 따라 상이할 수 있다. 두 조건 중 두 번째에 사용되는 뉴클레오타이드 농도가 항상 높을 것이며, 프라이밍된 주형 핵산이 중합 효소 및 두 뉴클레오타이드 농도 중 더 낮은 농도에 먼저 노출된다. 용어, "2 단계"는 하기에서 프라이밍된 주형 핵산과 중합 효소 및 뉴클레오타이드의 결합을 지칭하는 경우, 뉴클레오타이드가 먼저 낮은 농도(또는 심지어 0 농도)로 존재하고, 이어서 높은 농도로 존재하는 경우에 사용된다. 이러한 절차로부터 결과는 예상외로 이원 및 삼원 복합체에서 DNA 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 사이의 상호 작용이 매우 상이함을 나타냈다. 또한, 이러한 기법은 예상외로 서열 결정되는 주형에서 동종 중합체 신전부의 검출에 유용한 것으로 밝혀졌다.
실시예 1은 결합에 의한 서열 결정 절차를 수행할 때 2 단계 프로토콜에 따른 프라이밍된 주형 핵산과 중합 효소의 접촉의 이점을 설명한다. 정확한 염기 확정을 혼란시킬 수 있는 이원 복합체의 형성을 억제하기 보다는, 중합 효소의 농도가 일정하고 뉴클레오타이드 농도가 증가할 때 결합 신호를 비교하는 접근법에 의존하였다. 염기 확정에 사용되는 신호의 품질은 2 단계 프로토콜을 사용하여 극적으로 증가하였다. 더욱 구체적으로, 프로토콜 본질적으로 비특이적 중합 효소 결합의 기준선을 확립하였다.
실시예 1
DNA 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 사이의 뉴클레오타이드-특이적 상호 작용의 배경 감소 향상된 검출
광섬유 팁(fiber optic tip)의 표면에서 결합 반응을 측정하기 위해 바이오레이어 간섭계를 사용하는 FORTEBIO®(Menlo Park, CA) Octet 기구를 멀티웰 플레이트 형식으로 사용하여 배경 감소 기법을 설명하였다. 5'-말단에서 비오틴화된 주형 가닥을 사용하여, 표준 절차에 따라 스트렙타비딘(SA)으로 작용기화된 광섬유 팁 상에 프라이밍된 주형 핵산을 고정하였다. 비오틴화된 ALK100 주형 DNA로부터 예상되는 서열 판독은 서열번호 1의 서열을 가졌으며(잠재적 판독 길이 86 뉴클레오타이드), 혼성화된 DNA 프라이머는 서열번호 2의 서열을 가졌다. 팁을 200 mM KCl, 160 mM 칼륨 글루타메이트, 및 0.01% Tween-20을 포함하는 Tris-완충 용액에서 세척하고, 이어서, 프로토콜 순환을 시작하였다. 4개의 시험 뉴클레오타이드 각각에 대한 독립적인 결합 반응은, Tris-HCl(pH 8.0), 160 mM KCl, 160 mM 칼륨 글루타메이트, 0.01% Tween-20, 3% DMSO, 300 mM 베타인, 1 mM β-머캅토에탄올, 100 μg/ml BSA, 1 mM NiSO4, 280 U/ml Bsu DNA 중합 효소 대형 단편 및 100 μM(dCTP, dATP, 및 dGTP) 또는 400 μM(dTTP) 농도의 뉴클레오타이드 중 하나를 포함하는 검사 완충액을 사용하여 연속적으로 수행하였다. 상기 절차에서 검사 완충액은 DNA 2차 구조를 제어하기 위해 DMSO 및 베타인으로 보충된다. 시약 변경 사이에 세척 단계는 요구되지 않았다. 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합 효소 및 뉴클레오타이드의 결합을 수행하기 위해 단일 접촉 단계를 사용하는 경우, 결합 단계는 200 초 길이이며, 결합 상호 작용의 모니터링은 연속적이었다. 이는 프라이밍된 주형 핵산과, 중합 효소 및 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 단일 용액을 접촉시킴으로서 달성되었다. 2 단계 결합 프로토콜 중 하나의 시험에서, 절차는 먼저 프라이밍된 주형 핵산과, 중합 효소 및 10 μM 농도의 하나의 뉴클레오타이드를 포함하는 용액을 45 초간 접촉시키는 단계, 이후 프라이밍된 주형 핵산과, 중합 효소 및 더 높은 농도의 동일한 뉴클레오타이드(dCTP, dATP, dGTP에 대한 100 μM; 및 dTTP에 대한 400 μM)를 포함하는 용액을 30 초간 접촉시키는 단계를 포함하였다. 2 단계 결합 프로토콜 중 또 다른 시험에서, 제1 접촉 단계에서 사용된 용액은 중합 효소를 포함하였지만, 가능한 결합 상호 작용에 대해 조사되는 임의의 뉴클레오타이드를 포함하지 않았으며; 제2 접촉 단계에서 사용된 용액은 중합 효소 및 하나의 뉴클레오타이드(dCTP, dATP, dGTP에 대한 100 μM; 및 dTTP에 대한 400 μM)를 포함하였다. 2 단계 결합 프로토콜 중 상기 후자 시험에서, 제1 및 제2 접촉 단계를 각각 15 초간 수행하였다. 2 단계 결합 프로토콜 중 두 시험 모두에서, 제1 및 제2 접촉 단계에서 사용된 중합 효소 함유 용액은 중합 효소를 일정한 농도(즉, 280 U/ml)로 포함하였다. 그 다음, 혼입 단계에서, 삼원 복합체에 포함되는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 프라이머 가닥 내로 화학적으로 혼입되었다. 이것은 화학적 혼입을 촉진하기 위해, 50 mM KCl, 0.01% Tween-20, 3% DMSO, 300 mM 베타인, 1 mM β-머캅도에탄올, 100 μg/ml 소혈청 알부민(BSA), 1 U/ml의 Bsu DNA 중합 효소 대형 단편, 및 2 mM의 최종 농도의 MgCl2를 포함하는 Tris-완충 용액으로 팁을 옮김으로써 수행하였다. 그 다음, 2가 양이온을 킬레이트화하여 혼입 반응을 ?칭하는 단계가 존재한다. ?칭은 팁을 혼입 완충액으로부터 500 mM KCl, 0.02% Tween-20, 및 2 mM EDTA를 포함하는 Tris-완충 세척 용액으로 옮김으로써 수행하였다. 최종적으로, 각 주기를 200 mM KCl, 160 mM 칼륨 글루타메이트, 및 0.01% Tween-20을 포함하는 Tris-완충 재생 용액에 팁을 담금으로써 완료하였다. 간섭계 모니터링으로부터 결과를 분석하여, 정확한 및 부정확한 뉴클레오타이드를 식별하였다. 2 단계 결합 절차의 사용으로부터 획득된 결과의 경우에, 이러한 결과는 중합 효소를 포함하는 제1 및 제2 접촉 단계 이후 측정된 신호를 비교하는 것을 포함하며, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드로서 시험 뉴클레오타이드를 식별하기 위해 제2 접촉 단계 이후 측정된 신호가 제1 접촉 단계 이후 측정된 신호를 초과할 것을 필요로 하였다. 예를 들어, 제2 접촉 단계 이후 측정된 신호는 제1 접촉 단계 이후 측정된 신호 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드로서 기록되도록 최소 임계값으로 초과해야 한다. 주형 핵산에 대한 광범위한 서열 정보를 획득하기 위해 단계를 반복하였다.
도 2a 및 2b는, 각각, 프라이밍된 주형 핵산과 중합 효소 및 뉴클레오타이드를 동시에 접촉시키는 것을 포함하는 표준 단일 결합 단계를 사용하여 획득된 간섭계 기록; 및 프라이밍된 주형 핵산과, 먼저 중합 효소 및 10 μM의 뉴클레오타이드, 그 다음으로 중합 효소 및 보다 높은 뉴클레오타이드 농도의 뉴클레오타이드를 접촉시키는 것을 포함하는 2 단계 결합 단계를 사용하여 획득된 간섭계 기록을 나타낸다. 도 2a의 제3 주기(dTTP를 사용하여 수행)가 부정적인 결과인 반면, 제4 주기(dGTP를 사용하여 수행)는 긍정적인 결과임에도 불구하고, 제3 및 제4 주기에 대한 기록은 매우 유사하다. 이것은 제3 주기에서의 어려운 확정을 설명하며, 제3 주기에서 모니터링된 위치에서 T를 나타내는 위양성(false-positive) 결과를 생성할 수 있다. 또한, 중요한 것은, 제9 주기가 사실상 동종 중합체 트리플렛(triplet)(즉, GGG)의 검출을 나타냄에도 불구하고 제9 주기는 다른 진양성(true-positive) 확정과 매우 유사한 점이다. 대조적으로 도 2b에 나타낸 기록은 음성 확정으로부터 양성 확정을 명백하게 구별하였다. 모든 경우에, 양성 확정은, 제2(즉, 높은) 농도의 뉴클레오타이드를 사용하는 경우, 높은 신호에 의해 나타났다. 대조적으로, 음성 확정은 제1 접촉 단계 동안 측정된 최대 신호와, 보다 높은 뉴클레오타이드 농도에서 사용되는 제2 접촉 단계 동안 측정된 신호 사이의 실질적인 변화를 나타내지 않는다. 간단하게 언급하면, 제1 접촉 단계 동안 모니터링된 최대 신호와 비교하여 모니터링된 신호가 제2 접촉 단계에서 높은 경우, 양성 결과가 나타났다. 이것은 또한 제2 및 제1 접촉 단계에서 측정된 신호의 최소 비율을 요구함으로써 처리될 수 있다. 특정 뉴클레오티드 노출 기간의 첫 번째 및 마지막 지점을 연결하는 선 또는 벡터의 기울기를 분석하여, 양성 염기를 확정하기 위한 최소값이 초과되었는지 여부를 결정할 수 있다. 데이터 분석을 계속하여, (제15 및 16 주기에서 검출되는) 염기 지점 8에서 시작하는 더블렛(doublet) G는 제2 접촉 단계 동안 비정상적으로 높은 신호를 산출하여, 2 단계 결합 절차가 동종 중합체 신전부의 존재로부터 독특한, 단일 염기를 구별할 수 있음을 나타낸다. 최종적으로, 도 2a 및 2b의 기록은 혼입 단계(즉, 도 2a에서 단일 염기의 각 주기에 대한 제2 단계; 도 2b에서 단일 염기의 각 주기에 대한 제3 단계) 동안 관찰된 응답에 대해 정성적으로 상이하다. 더욱 구체적으로, 도 2a에서 신호는 혼입 단계의 지속 시간 동안 균일하게 증가했지만, 도 2b에서 혼입 단계 동안 감소하였다. 이러한 차이는 상이한 결합 단계 접근법에 의해 형성된 복합체가 동일하지 않음을 나타낸다. 달리 말하면, 2 단계 결합 접근법은 동일한 결과를 산출하는 단일-단계 결합 접근법의 변형이 아니었다. 대신에, 상이한 기록 패턴의 프로파일은 중합 효소와 프라이밍된 주형 핵산 사이의 상호 작용에서 기계적인 차이를 반영하였다.
실시예 2는 2 단계 중합 효소 결합 프로토콜이 도입된, 결합에 의한 서열 결정 절차에서 획득된 서열 정보의 품질을 평가하는데 사용되는 기법을 기재한다.
실시예 2
결합에 의한 서열 결정 프로토콜에서 획득된 데이터의 삼원 복합체 형성 개선된 정확도의 향상된 검출
프라이밍된 주형 핵산을 광섬유 팁에 고정시키고, 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 FORTEBIO®(Menlo Park, CA) Octet 기구를 사용하기 위한 준비로 팁을 세척하였다. 또한, 절차에서 사용된 검사 완충액, 혼입 완충액, ?칭 완충액, 및 재생 완충액의 조성은 실시예 1과 동일하였다. 프라이밍된 주형 핵산과 중합 효소의 접촉을 위한 단일 단게를 사용하여 수행된 대조 시험은 Bsu DNA 중합 효소 대형 단편과 100 μM(dCTP, dATP, 및 dGTP) 또는 400 μM(dTTP)의 농도의 시험 뉴클레오타이드 중 하나와 조합하여 수행하였다. 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합 효소 및 뉴클레오타이드의 접촉 단계는 이러한 대조 시험에서 200 초간 진행하였고, 결합 상호 작용의 모니터링은 연속적이었다. 프라이밍된 주형 핵산에 대한 2 단계 중합 효소 결합을 혼입시키는 시험은 중합 효소 및 2 μM 농도의 하나의 뉴클레오타이드를 포함하는 용액을 사용하여 45 초간 제1 접촉 단계를 사용하였다. 이어서, 중합 효소 및 더 높은 농도(dCTP, dATP, dGTP에 대한 100 μM; 및 dTTP에 대한 400 μM)의 동일한 뉴클레오타이드를 포함하는 용액을 사용하여 30 초간 제2 접촉 단계를 사용하였다. 제1 및 제2 접촉 단계에서 사용된 용액은 일정한 농도(즉, 280 U/ml)의 중합 효소를 포함하였다. 그 다음, 혼입 단계에서, 삼원 복합체에 포함되는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 프라이머 가닥 내로 화학적으로 혼입되었다. 이것은 화학적 혼입을 촉진하기 위해, 50 mM KCl, 0.01% Tween-20, 3% DMSO, 베타인, 베타-머캅도에탄올, 소혈청 알부민(BSA), Bsu DNA 중합 효소 대형 단편, 및 2 mM의 최종 농도의 MgCl2를 포함하는 Tris-완충 용액으로 팁을 옮김으로써 수행하였다. 특히, 검사 및 혼입 단계에서 사용되는 완충액은 DNA 2차 구조를 제어하기 위해 DMSO 및 베타인으로 보충된다. 그 다음, 혼입 반응을 ?칭하기 위해 2가 양이온을 킬레이트화하는 단계가 존재하였다. ?칭은 팁을 혼입 완충액으로부터 500 mM KCl, 0.02% Tween-20, 및 2 mM EDTA를 포함하는 Tris-완충 세척 용액으로 옮김으로써 수행하였다. 최종적으로, 각 주기를 KCl, 칼륨 글루타메이트, 및 Tween-20을 포함하는 Tris-완충 재생 용액에 팁을 담금으로써 완료하였다. 모니터링된 간섭계 결과에 기초하여 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 식별하는 절차는 실시예 1에 기재된 바와 같다. 프라이밍된 주형 핵산과 상이한 용액의 접촉 단계를 반복하여 주형 핵산에 대한 서열 정보를 획득하였다.
도 3a 및 3b는, 각각, 동종 중합체 압축으로 결합에 의한 서열 결정 절차가 적용된 동일한 프라이밍된 주형 핵산에 대한 약 60개의 뉴클레오타이드 길이에 대한 염기 확정 결과를 나타내며, 여기서 중합 효소는 단일 단계, 또는 2 단계 결합 프로토콜를 사용하였다. 도 3a의 플롯은 50개 이상의 뉴클레오타이드 서열에서 하나의 위음성(false-negative) 확정, 및 하나의 위-양성 확정을 포함한다. 정확한 음성 확정은 일반적으로 양성 결과를 확정하기 위해 필요한 임의의 임계값 이하인 검출가능한 신호와 관련되었다. 흥미롭게도, 정확한 양성 확정에 대한 판독 길이의 증가에 따라 신호 크기가 감소하는 경향을 보인 반면, 정확한 음성 확정과 관련된 배경 신호는 실질적으로 안정한 상태를 유지했다. 결과적으로, 신호 대 잡음 비율은 판독 길이가 증가함에 따라 감소했다. 일부 수단에 의해 감소되거나 제어되지 않으면, 판독 길이에 상한이 존재한다. 대조적으로, 도 3b는 정확한 음성 확정과 관련된 검출가능한 신호가 2 단계 중합 효소 결합 절차에 의해 실질적으로 제거되었음을 나타낸다. 정확한 확정에 대한 신호 대 잡음 비율은 2 단계 결합 절차에서 극적으로 훨씬 유리하였다. 추가적으로, 2 단계 결합 절차를 사용하여 획득된 결과에서 서열 결정 오류는 검출되지 않았다.
바로 위에 기재된 절차와 약간 다른 2 단계 결합 기법을 사용하여, 정확한 염기 확정 결과를 200개 이상 염기의 판독 길이를 오류 없이 달성하였다. 보다 구체적으로, 프라이밍된 주형 핵산은 먼저 시험 뉴클레오타이드의 부재하에 DNA 중합 효소와 접촉된 다음, DNA 중합 효소 및 시험 뉴클레오타이드의 조합물과 접촉된다. 상기와 같이, 주기는 결합(즉, 중합 효소 함유 용액을 사용하는 제1 및 제2 접촉 단계), 혼입(즉, 촉매 2가 양이온의 첨가), ?칭(즉, 2가 양이온 및 중합 효소 반응의 생성물 제거), 및 완충액 재생으로 수행되었다. 결과는 230개의 뉴클레오타이드의 판독 길이에 대해 단지 2개의 에러가 관찰되었음을 나타내었다. 이러한 극적인 개선은 2 단계 결합 기법의 이점을 설명한다.
실시예 3은 혼입 반응을 수행하기 전 복수의 시험 뉴클레오타이드의 검사를 위해 2 단계 검사 절차가 어떻게 사용되는지 입증한다. 이러한 기법은 유리하게는 이원 복합체의 검출과 관련된 배경 신호를 감소시켜, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 삼원 복합체의 특이적인 검출을 향상시킨다. 또한, 비생산적인 혼입 반응을 피함으로써 분석 시간이 단축되었다. 혼입 반응에 사용된 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드 또는 비표지된 뉴클레오타이드 유사체일 수 있다. 택일적으로, 혼입 반응의 뉴클레오타이드는 표지된 또는 비표지된, 및/또는 가역적 종결자 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드 유사체일 수 있다.
실시예 3
혼입 반응 이후 복수의 시험 뉴클레오타이드의 점진적 결합 및 검사
프라이밍된 주형 핵산을 광섬유 팁에 고정시키고, 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 FORTEBIO®(Menlo Park, CA) Octet 기구를 사용하기 위한 준비로 팁을 세척하였고, 200초에 걸쳐 프라이밍된 주형 핵산의 고정화 과정을 진행하였다. 100 μg/ml의 초순수 소혈청 알부민(BSA)이 보충된 결합 완충액에서 45 초간 센서 팁을 세척하였다. 그 다음, 팁을 검사 완충액(Tris-HCl(pH 8.0), 160 mM KCl, 160 mM 칼륨 글루타메이트, 0.01% Tween-20, 100 μg/mL 초순수 BSA, 1 mM NiSO4, 및 400 nM Bsu 중합 효소 대형 단편을 포함하는 용액)에 30 초간 노출시켜 dNTP의 부재하에 이원 복합체 형성을 가능하게 하였다. 팁을 단일 dNTP(100 μM dTTP)로 보충된 검사 완충액에 20 초간 노출시키고; 이어서 2종류의 dNTP(100 μM dTTP 및 100 μM dATP)로 보충된 검사 완충액에 20 초간 노출시키고; 이어서 3종류의 dNTP(100 μM dTTP, 100 μM dATP, 및 100 μM dCTP)로 보충된 검사 완충액에 20 초간 노출시키고; 마지막으로 모든 네 가지 dNTP(dTTP, dATP, dCTP 및 dGTP 각각 100 μM)로 보충된 검사 완충액에 20 초간 노출시켰다. 팁을 최종 용액으로부터 제거하고, EDTA 세척 완충액(30 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM KCl, 0.02% Tween-20, 2 mM EDTA) 내로 20 초간 직접 투입하여 프라이밍된 주형 핵산과 함께 형성된 임의의 복합체로부터 중합 효소 및 뉴클레오타이드를 제거하였다. EDTA 세척 동안 중합 효소, dNTP, Ni2+, 및 칼륨 글루타메이트를 제거하고, 이어서, 중합 효소 또는 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 효소 완충액에서 20 초의 기간 동안 팁을 평형시켰다. 이러한 선택적인 평형 단계는, 선행 단계로부터 계속 이어질 수 있는 임의의 시약을 팁으로부터 제거하는 역할을 하였다. 그 후, 팁은 중합 효소 및 하나 이상의 dNTP(예컨대, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 공지된 경우 단일 dNTP, 또는 모든 4 가지 가역적 종결자 dNTP), 및 주형 가닥의 프라이머 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드에 대한 응답으로 dNTP 혼입 및 프라이머의 연장을 촉진하기에 충분한 양의 촉매 금속 이온(예컨대, Mg2+)으로 보충된 혼입 완충액에 5 초간 노출시킨다. 팁을 다시 EDTA 세척 완충액에 20 초간 노출시켜 중합 효소 및 가역적 종결자를 제거하고, 검사 재생 용액에 20 초간 노출시킨 다음, dNTP 검사 단계(즉, 2 단계 중합 효소 결합 프로토콜의 제1 단계) 없이 시작하는 주기를 반복하였다. 검사 재생 용액은 200 mM KCl, 160 mM 칼륨 글루타메이트, 및 0.01% Tween-20이 포함된 Tris-완충 용액이었다. 정기적인 모니터링이 좋은 결과를 산출했지만, 이러한 입증에서 모니터링을 지속하였다. 모든 단계는 30 ℃에서, 500 rpm으로 진탕하여 수행하였다.
도 4는 개시된 접근법이 삼원 복합체 검출을 위한 신호:잡음 비율을 증가시킴을 명백하게 확인시키는 간섭계 기록을 나타낸다 . 프라이밍된 주형 핵산이 첨가된 뉴클레오타이드의 부재하에 중합 효소와 접촉되는 중합 효소 결합의 초기 단계가 30 초 처리 동안 결합 신호를 실질적으로 증가시켰다. 이것은 프라이밍된 주형 핵산과 중합 효소 사이의 이원 복합체 형성을 나타냈다. 중합 효소 및 dTTP의 존재하에 수행된 검사는 선행 단계에서 측정된 신호와 비교하여 실질적으로 변하지 않았다. 이것은 오직 이원 복합체가 dTTP의 존재하에 형성되며, 이러한 dTTP는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 아님을 나타냈다. 중합 효소, dTTP 및 dATP의 존재하에 순차적으로 수행된 검사는 선행 단계와 비교하여 유사한 결과를 제공하였다. 오직 이원 복합체가 형성되었기 때문에, 이것은 dTTP 및 dATP 모두 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 아님을 나타낸다. 대조적으로, 중합 효소, dTTP, dATP, 및 dCTP의 존재하에 수행된 검사 단계는 선행 단계와 비교하여 결합 신호가 실질적으로 증가함을 나타내어, dCTP가 포함된 삼원 복합체의 형성을 나타낸다. dCTP가 포함된 시약을 접촉한 이후 삼원 복합체의 형성은 바로 다음의 정확한 염기로서 dCTP를 식별하였다. 최종적으로, 중합 효소, dTTP, dATP, dCTP, 및 dGTP의 존재하에 수행된 검사 단계는, 예상한 대로, 선행 단계와 비교하여 결합 신호의 임의의 추가적인 증가를 나타내지 않았다. 이에 따라, 삼원 복합체가 형성되면 비동족 dGTP의 포함은 결합 신호를 변화시키지 않는다. 특히, 도 4에 나타난 결과를 획득하기 위해 사용된 절차는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 혼입시키기 위해 정상적으로 사용되는 5초 단계에서 임의의 뉴클레오타이드를 포함하지 않았다. 따라서, 상기 단계 동안 결합 신호의 변화는 없다. 반응 간격은 혼입 반응을 포함하는 워크플로우(workflow)를 설명하기 위해 도 4에 나타난다.
상기 기재된 무표지 시스템을 사용하도록 하는 발견은 다음으로 외인성 검출가능한 표지에 의존하는 서열 결정 시스템에 적용되었다. 특정 구체적인 예시에서, 하나 이상의 형광 중합 효소를 사용하는 시스템을 사용하여, 혼입 없이 동족 뉴클레오타이드를 식별하였다. 예시적인 실시예에 사용된 중합 효소는 첨가된 뉴클레오타이드의 존재 및 부재하에서 균일하게 형광성이었다. 입체 구조 감응성의 형광 중합 효소가 이러한 절차에 사용될 수 있지만, 이것이 요구되는 경우는 아니다. 특정 구체예에서, 검출가능하게 표지된 중합 효소는 동족 뉴클레오타이드의 존재 또는 부재하에 프라이밍된 주형 핵산에 결합되는 경우 실질적으로 상이한 신호를 생성하지 않는다.
바람직하게, 시험 뉴클레오타이드(즉, 동족 뉴클레오타이드 후보)의 존재 및 부재하에 프라이밍된 주형 핵산과의 접촉을 위해 별도의 단계에서 사용되는 중합 효소는 동일한 아미노산 서열을 가진다. 예를 들어, 2개의 중합 효소는 뉴클레오타이드의 존재하에 사용되는 중합 효소 상에 외인성 검출가능한 표지의 존재에 의해서만 상이할 수 있다. 더욱 구체적으로, 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제2 접촉 단계에 사용된 중합 효소는, 네 종류의 상이한 뉴클레오타이드를 시험하는 완전한 주기 동안 시험되는 임의의 뉴클레오타이드를 포함하지 않는, 초기 접촉 단계에 사용된 중합 효소의 화학적 변형 버전일 수 있다.
일반적으로 말하면, 중합 효소-기반의 서열 결정 절차에서 중합 효소 결합을 위한 2 단계 접근법을 사용하는 이점이 존재한다. 제1 및 제2 접촉 단계에서 동일한 중합 효소를 사용하여 배경 신호의 감소에 초점을 둔 무표지 시스템과 관련된 2 단계 접근법에 대한 선행 논의에서, 검출가능하게 표지된 중합 효소를 사용하는 서열 결정 절차는, 바람직하게 동일하지 않은 중합 효소를 사용한다. 더욱 구체적으로, 제1 반응 혼합물은 바람직하게 동족 뉴클레오타이드를 혼입시키지 않고 동족 뉴클레오타이드를 나타내기 위해 사용되는 외인성 표지를 가지지 않는 중합 효소를 포함한다. 제2 접촉 단계에서 사용되는 제2 반응 혼합물은, 또한 혼입 없이, 동족 뉴클레오타이드 결합을 나타내는 외인성 표지를 가지는 중합 효소를 포함한다. 2 단계 결합 기법을 사용하여, 프라이밍된 주형 핵산은 먼저 중합 효소의 형광 표지를 가지지 않는 중합 효소를 포함하는 제1 반응 혼합물과 접촉되고, 이러한 중합 효소는 제2 반응 혼합물에 존재하며, 제2 접촉 단계에서 프라이밍된 주형 핵산과 접촉한다.
바람직한 특정 구체예에서, 제2 접촉 단계에 사용되는 중합 효소는 외인성 화학 표지, 예컨대 외인성 형광 표지를 포함함으로써 제1 접촉 단계에 사용된 중합 효소와 상이하다. 예를 들어, 프라이밍된 주형 핵산과의 접촉을 위해(즉, 동족 뉴클레오타이드 후보를 포함하지 않는 제1 반응 혼합물을 사용하여) 초기 단계에 사용된 중합 효소는 외인성 형광 모이어티를 가지지 않는 중합 효소일 수 있다. 따라서, 프라이밍된 주형 핵산과 접촉하는 제1 중합 효소는 바람직하게 형광 신호에 실질적으로 기여하지 않는다. 제2 반응 혼합물에 의해 제공되는 중합 효소는, 제2 접촉 단계에서 사용되며, 바람직하게 제1 반응 혼합물의 중합 효소에 부재하는 외인성 형광 표지를 포함한다. 결합에 의한 서열 결정 절차에서 혼입 없이 동족 뉴클레오타이드를 식별하는 것은, 검출가능한 신호를 삼원 복합체 형성에 연관지음을 이해해야 한다.
뉴클레오타이드의 연속적인 첨가에 의존하는 절차에서(즉, 프라이밍된 주형과 제2 뉴클레오타이드가 접촉한 후, 먼저-첨가된 뉴클레오타이드를 포함하는 임의의 복합체가 제거됨), 후속 단계의 중합 효소는 선택적으로 동일한 표지, 또는 상이한 표지(예컨대, 동일한 또는 상이한 형광 표지)를 포함한다. 중요한 것은, 초기 접촉 단계(본 명세서에서 제1 접촉 단계로서 지칭됨)의 중합 효소는 동족 뉴클레오타이드 결합을 나타내기 위해 사용되는 임의의 후속 단계(들) 형광 표지를 가지지 않는 것이다. 달리 말하면, 하나 이상의 표지된 중합 효소를 사용하여 동족 뉴클레오타이드를 식별하는 결합에 의한 서열 결정 절차에서, 프라이밍된 주형 핵산은, 뉴클레오타이드 조사의 각각의 완전한 주기마다, 동족 뉴클레오타이드 후보의 부재하에 중합 효소와 초기에 접촉해야 한다. 4 단계의 뉴클레오타이드 결합이 조사되는 경우, 검사 단계에 선행하는 초기 단계는, 임의의 4개의 시험 뉴클레오타이드의 부재하에 프라이밍된 주형 핵산과 중합 효소의 접촉을 포함해야 한다.
2 단계 접근법은 유리하게는 단일 표지된 중합 효소, 또는 복수의 상이하게 표지된 중합 효소를 사용하는 절차에서 획득되는 결과를 개선한다. 개선된 결과는 접촉 임의의 뉴클레오타이드의 접촉 전에 중합 효소의 존재로 인해 결합 신호의 감소로부터 발생한다.
특정 검출가능한 표지가 동족 뉴클레오타이드 결합을 나타내기 위해 사용되는 경우 일반적으로(즉, 삼원 복합체 형성을 나타내게 위해 사용되는 단일 표지), 특정 검출가능한 표지는 임의의 동족 뉴클레오타이드 후보의 부재하에 프라이밍된 주형 핵산과 접촉한 중합 효소로부터 부재해야 한다. 이러한 예시에서 동일한 검출 가능하게 표지된 중합 효소는 각각의 상이한 뉴클레오타이드를 첨가하는 동안 존재할 것이며, 이러한 상이한 뉴클레오타이드는 한 번에 하나씩 첨가된다. 명확하게 하기 위해, 프라이밍된 주형 핵산은 뉴클레오타이드의 부재하에 중합 효소와 초기에 접촉되어야 하며, 여기서 중합 효소는 삼원 복합체 형성을 나타내기 위해 사용되는 검출가능한 표지를 포함하지 않는다. 제 1 뉴클레오타이드 결합 단계에서, 초기 단계로부터의 프라이밍된 주형 핵산은, 초기 접촉 단계로부터의 중합 효소(예컨대, "비표지된" 중합 효소)의 부재하에, 표지된 중합 효소 및 제 1 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물과 접촉한다. 제 2 뉴클레오타이드 결합 단계에서, 이전 단계로부터의 프라이밍된 주형 핵산은, 또한 초기 접촉 단계로부터의 중합 효소의 부재하에, 표지된 중합 효소 및 제2 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물과 접촉한다. 선택적으로, 제1 뉴클레오타이드는 표지된 중합 효소를 포함하지만, 초기 접촉 단계로부터의 중합 효소는 포함하지 않는 반응 혼합물에 제2 뉴클레오타이드와 함께 포함된다. 상기 공정은 제3 및 제4 뉴클레오타이드에 대해 반복되며, 매 번 반응 혼합물을 점진적으로 변화시키거나 한 번에 하나의 뉴클레오타이드를 첨가하고, 이러한 표지된 중합 효소는 포함되지만 초기 접촉 단계로부터의 중합 효소는 생략된다.
혼입 없이 동족 뉴클레오타이드를 식별하기 위해 복수의 상이하게 표지된 중합 효소를 사용하는 경우 유사한 이점이 실현된다. 상기와 같이, 프라이밍된 주형 핵산 접촉을 위한 초기 단계는 잠재적 동족 뉴클레오타이드로서 시험되는 임의의 첨가된 뉴클레오타이드의 부재하에 중합 효소를 포함하는 반응 혼합물을 사용하여 수행되어야 한다. 또한, 상기와 같이, 초기 접촉 단계의 중합 효소는 동족 뉴클레오타이드 결합을 나타내기 위해 순차적으로 사용되는 임의의 중합 효소로서 동일한 검출가능한 표지를 포함하지 않아야 한다. 그 다음, 뉴클레오타이드 조사는 이전 단계로부터 프라이밍된 주형 핵산과, 제1 표지된 중합 효소 및 동족 뉴클레오타이드로서 시험되는 제1 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물과 접촉함으로써 시작한다. 그 다음, 이전 단계로부터 프라이밍된 주형 핵산과, 제2 표지된 중합 효소 및 동족 뉴클레오타이드로서 시험되는 제2 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물과 접촉될 수 있다. 이러한 반응은 오직 제2 표지된 중합 효소만을 포함하며, 초기 접촉 단계의 중합 효소, 또는 제1 표지된 중합 효소를 포함하지 않는다. 이러한 방식으로, 뉴클레오타이드 결합은 중합 효소 상의 표지와 결합에 의해 코딩될 수 있다. 그 다음, 이전 단계로부터 프라이밍된 주형 핵산과, 제3 표지된 중합 효소 및 동족 뉴클레오타이드로서 시험되는 제3 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물과 접촉될 수 있다. 이러한 반응은 오직 제3 표지된 중합 효소만을 포함하며, 초기 접촉 단계의 중합 효소, 제1 표지된 중합 효소, 또는 제2 표지된 중합 효소를 포함하지 않는다. 다시, 뉴클레오타이드 결합은 중합 효소 상의 표지와 결합에 의해 코딩될 수 있다. 마지막으로, 이전 단계로부터 프라이밍된 주형 핵산과, 제4 표지된 중합 효소 및 동족 뉴클레오타이드로서 시험되는 제4 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물과 접촉될 수 있다. 이러한 반응은 오직 제4 표지된 중합 효소만을 포함하며, 초기 접촉 단계의 중합 효소, 제1 표지된 중합 효소, 제2 표지된 중합 효소, 또는 제3 표지된 중합 효소를 포함하지 않는다. 다시, 뉴클레오타이드 결합은 중합 효소 상의 표지와 결합에 의해 코딩될 수 있다. 제1, 제2, 제3, 및 제4 중합 효소 모두는 구별가능한 표지를 포함할 수 있다. 이러한 접근법에 의해, 단일 스캔이 검사 단계의 일부로서 수행될 수 있다. 예를 들어, 단일 형광 스캔을 수행하여, 상이하게 표지된 중합 효소 각각을 포함하는 삼원 복합체를 검출할 수 있다.
개시된 방법 및 조성물의 생성물을 위해 사용될 수 있거나, 이와 함께 사용될 수 있거나, 이의 제조에 사용될 수 있거나, 개시된 방법 및 조성물의 생성물인, 재료, 조성물, 및 성분이 상기 개시된다. 이러한 재료의 조합물, 하위세트, 상호 작용, 그룹 등이 개시되는 경우, 이러한 화합물의 각각의 다양한 개별적인 및 집단적인 순열 조합에 대한 구체적인 언급이 명시적으로 개시되지 않을 수 있지만, 각각은 구체적으로 고려되며 본 명세서에 기재되는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 방법이 개시되며 논의되고, 상기 방법 비롯한 다수의 분자에 이루어질 수 있는 다수의 변형이 논의되는 경우, 구체적으로 달리 이에 반하게 지시되지 않는 한, 가능한 방법의 각각의 및 모든 순열 조합이 구체적으로 고려된다. 마찬가지로, 이들의 임의의 부분 집합 또는 조합이 또한 구체적으로 고려되며 개시된다. 이러한 개념은 개시된 조성물을 사용하는 방법의 단계를 포함하는 상기 개시의 모든 양태에 적용된다. 이에 따라, 수행될 수 있는 다양한 추가적 단계가 존재하는 경우, 이러한 추가적 단계 각각은 개시된 방법의 임의의 특정 방법 단계 또는 방법 단계의 조합으로 수행될 수 있으며, 이러한 각각의 조합 또는 하위세트는 조합이 구체적으로 고려되며 공개된 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서에 인용된 간행물과 인용된 자료는 그 전체가 구체적으로 참조 문헌으로 포함된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되도록 지시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조 문헌으로 인용된다.
본 명세서에 사용된 표제는 단지 조직적인 목적을 위한 것이며, 상세한 설명이나 청구범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다.
다수의 구체예가 개시되어 있다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 다른 구체예가 청구범위에 속한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Omniome, Inc.
<120> Nucleic Acid Sequencing Method and System Employing Enhanced
Detection of Nucleotide-Specific Ternary Complex Formation
<130> OMNI-006.PCT
<140> PCT/US2017/028878
<141> 2017-04-21
<150> US 62/326,356
<151> 2016-04-22
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 86
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
cagcaggatg aaccggggca gggattgcag gctcacccca atgcagcgaa caatgttctg 60
gtggttgaat ttgctgatga tcaggg 86
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequencing primer
<400> 2
cccgccatga gctc 14
Claims (64)
- (a) 프라이밍된 주형 핵산을, DNA 중합 효소를 포함하는 제1 반응 혼합물과 접촉시키는 단계;
(b) 단계 (a)로부터의 프라이밍된 주형 핵산을, DNA 중합 효소 및 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제2 반응 혼합물과 접촉시키는 단계;
(c) 시험 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키지 않고, 각 단계 (a) 및 (b) 동안 하나 이상의 지점에서, 제1 및 제2 반응 혼합물의 DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 측정하는 단계; 및
(d) 단계 (c)로부터 측정된 결합 결과를 사용하여 시험 뉴클레오타이드가 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드(next correct nucleotide)인지 여부를 결정하는 단계
를 포함하는, 시험 뉴클레오타이드가 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 바로 하류에 위치하는 주형 가닥의 프라이머 바로 다음의 염기에 상보적인 염기를 포함하는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드인지 여부를 결정하는 방법. - 제1항에 있어서,
시험 뉴클레오타이드가 임의의 첨가된 형광 표지를 포함하지 않는 천연 뉴클레오타이드이고, 단계 (c)가 시험 뉴클레오타이드에 대한 DNA 중합 효소 결합의 결과로서 광학 성질을 변화시키는 입체 구조 감응성 염료로부터 형광 또는 흡광 신호의 차이를 측정하는 것을 포함하지 않는, 방법. - 제1항에 있어서,
제1 반응 혼합물이 시험 뉴클레오타이드를 포함하지 않는, 방법. - 제3항에 있어서,
(e) 포스포다이에스터 결합을 형성함으로써, 시험 뉴클레오타이드를 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제4항에 있어서,
단계 (a) 내지 (e)를 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제5항에 있어서,
단계 (a) 내지 (e)가 50회 이상 반복되는, 방법. - 제4항에 있어서,
(f) 시험 뉴클레오타이드 대신에 제2 시험 뉴클레오타이드를 사용하여 단계 (a) 내지 (e)를 반복하는 단계를 추가로 포함하고, 시험 뉴클레오타이드 및 제2 시험 뉴클레오타이드가 서로 상이한, 방법. - 제3항에 있어서,
(e) 제2 반응 혼합물을 가역적 종결자 모이어티를 포함하는 가역적 종결자 뉴클레오타이드, 및 제2 반응 혼합물의 DNA 중합 효소와 상이한 DNA 중합 효소를 포함하는 제3 반응 혼합물로 대체하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제8항에 있어서,
(f) 포스포다이에스터 결합을 형성함으로써, 가역적 종결자 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 혼입시키는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제9항에 있어서,
(g) 프라이머 내로 혼입된 가역적 종결자 뉴클레오타이드로부터 가역적 종결자 모이어티를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제10항에 있어서,
단계 (a) 내지 (g)를 50회 이상 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제3항에 있어서,
프라이밍된 주형 핵산이 고체 지지체에 고정되고, 단계 (b)가 고체 지지체를 제1 반응 혼합물을 포함하는 용기로부터 제2 반응 혼합물을 포함하는 상이한 용기로 이동시키는 것을 포함하는, 방법. - 제3항에 있어서,
프라이밍된 주형 핵산이 고체 지지체에 고정되고, 단계 (a) 및 (b)가 각각 반응 혼합물을 프라이밍된 주형 핵산 상으로 유동시키는 것을 포함하는, 방법. - 제3항에 있어서,
단계 (c)가 각 단계 (a) 및 (b) 동안 DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 연속적으로 측정하는 것을 포함하는, 방법. - 제3항에 있어서,
단계 (c)가 DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 나타내는 광학 신호를 측정하고, 이어서 단계 (b)로부터 측정된 결합이 단계 (a)로부터 측정된 결합을 초과하는지 여부를 결정하기 위해, 측정된 광학 신호 사이의 차이를 계산하는 것을 포함하는, 방법. - 제3항에 있어서,
단계 (c)가 DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 나타내는 광학 신호를 측정하고, 이어서 단계 (b)로부터 측정된 결합이 단계 (a)로부터 측정된 결합을 초과하는지 여부를 결정하기 위해, 측정된 광학 신호의 비율을 계산하는 것을 포함하는, 방법. - 제3항에 있어서,
단계 (c)가 DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 나타내는 광학 신호를 측정하고, 이어서 단계 (b)로부터 측정된 결합이 단계 (a)로부터 측정된 결합을 초과하는지 여부를 결정하기 위해, 측정된 광학 신호의 시간에 따른 변화율을 계산하는 것을 포함하는, 방법. - 제3항에 있어서,
시험 뉴클레오타이드가 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 및 dUTP로 구성된 군으로부터 선택되는 천연 뉴클레오타이드인, 방법. - 제3항에 있어서,
시험 뉴클레오타이드가 외인성 형광 표지를 포함하지 않는, 방법. - 제3항에 있어서,
시험 뉴클레오타이드가 외인성 표지를 포함하지 않는 비표지된 시험 뉴클레오타이드인, 방법. - 제3항에 있어서,
시험 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드 유사체인, 방법. - 제21항에 있어서,
뉴클레오타이드 유사체가 가역적 종결자 모이어티를 포함하는, 방법. - 제22항에 있어서,
가역적 종결자 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드 유사체가 형광 표지를 추가로 포함하는, 방법. - 제3항에 있어서,
프라이밍된 주형 핵산이 표면에 고정되고, 단계 (c)가 DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 측정하기 위해 굴절률 변화를 측정하는 것을 포함하는, 방법. - 제24항에 있어서,
단계 (c)가 간섭계 또는 표면 플라즈몬 공명 감지에 의해 굴절률 변화를 측정하는 것을 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
제1 반응 혼합물의 DNA 중합 효소가 첨가된 형광 표지를 포함하지 않는, 방법. - 제1항에 있어서,
제1 반응 혼합물의 DNA 중합 효소가, DNA 중합 효소가 뉴클레오타이드에 결합한 이후 특성을 변화시키는 첨가된 형광 표지를 포함하지 않는, 방법. - 제20항에 있어서,
제1 반응 혼합물의 DNA 중합 효소가, DNA 중합 효소가 뉴클레오타이드에 결합한 이후 특성을 변화시키는 첨가된 형광 표지를 포함하지 않는, 방법. - 제28항에 있어서,
프라이밍된 주형 핵산이 표면에 고정되고, 단계 (c)가 DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 측정하기 위해 굴절률 변화를 측정하는 것을 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
제1 반응 혼합물이, 시험 뉴클레오타이드가 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드일 때, 최대 삼원 복합체 형성을 달성하는데 필요한 농도보다 낮은 농도의 시험 뉴클레오타이드를 포함하고, 제2 반응 혼합물이, 시험 뉴클레오타이드가 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드일 때, 최대 삼원 복합체 형성을 달성하는데 충분한 농도로 시험 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
단계 (d)가, 단계 (b)로부터 측정된 결합이 단계 (a)로부터 측정된 결합을 초과할 때, 시험 뉴클레오타이드가 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드임을 결정하는 것을 포함하는, 방법. - (a) 프라이밍된 주형 핵산을 DNA 중합 효소를 포함하는 제1 반응 혼합물과 접촉시키는 단계;
(b) 단계 (a)로부터의 프라이밍된 주형 핵산을, DNA 중합 효소 및 제1 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제2 반응 혼합물과 접촉시키는 단계;
(c) 단계 (b)로부터의 프라이밍된 주형 핵산을, DNA 중합 효소, 제1 시험 뉴클레오타이드 및 제2 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제3 반응 혼합물과 접촉시키는 단계;
(d) 단계 (c)로부터의 프라이밍된 주형 핵산을, DNA 중합 효소, 제1 시험 뉴클레오타이드, 제2 시험 뉴클레오타이드 및 제3 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제4 반응 혼합물과 접촉시키는 단계;
(e) 단계 (d)로부터의 프라이밍된 주형 핵산을, DNA 중합 효소, 제1 시험 뉴클레오타이드, 제2 시험 뉴클레오타이드, 제3 시험 뉴클레오타이드 및 제4 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제5 반응 혼합물과 접촉시키는 단계;
(f) 제1 시험 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키지 않고, 각 단계 (a) 내지 (e) 동안 하나 이상의 지점에서, DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 측정하는 단계; 및
(g) 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 (i) 단계 (b)로부터 측정된 결합이 단계 (a)로부터 측정된 결합을 초과할 때, 제1 시험 뉴클레오타이드; (ii) 단계 (c)로부터 측정된 결합이 단계 (b)로부터 측정된 결합을 초과할 때, 제2 시험 뉴클레오타이드; (iii) 단계 (d)로부터 측정된 결합이 단계 (c)로부터 측정된 결합을 초과할 때, 제3 시험 뉴클레오타이드; 또는 (iv) 단계 (e)로부터 측정된 결합이 단계 (d)로부터 측정된 결합을 초과할 때, 제4 시험 뉴클레오타이드로서 식별하는 단계
를 포함하는, 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 바로 하류에 위치하는 주형 가닥의 바로 다음의 염기에 상보적인 염기를 포함하는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 식별하는 방법. - 제32항에 있어서,
단계 (f) 이후, (h) 포스포다이에스터 결합을 형성함으로써, 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제33항에 있어서,
시험 뉴클레오타이드가 각각 서로 상이하고, 시험 뉴클레오타이드가 각각 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 및 dUTP로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법. - 제33항에 있어서,
시험 뉴클레오타이드가 각각 서로 상이하고, 시험 뉴클레오타이드가 각각 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP로 구성된 군으로부터 선택되는 천연 뉴클레오타이드인, 방법. - 제33항에 있어서,
시험 뉴클레오타이드가 각각 서로 상이하고, 어떠한 시험 뉴클레오타이드도 외인성 형광 표지를 포함하지 않는, 방법. - 제33항에 있어서,
시험 뉴클레오타이드가 각각 서로 상이하고, 시험 뉴클레오타이드가 각각 가역적 종결자 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드 유사체인, 방법. - 제33항에 있어서,
프라이머 내로 혼입된 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 가역적 종결자 모이어티를 포함하는, 방법. - 제34항에 있어서,
프라이머 내로 혼입된 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 가역적 종결자 모이어티를 포함하는, 방법. - 제33항에 있어서,
어떠한 시험 뉴클레오타이드도 가역적 종결자 모이어티를 포함하지 않고, 단계 (f)와 단계 (h) 사이에, (i) 프라이밍된 주형 핵산에 결합된 임의의 시험 뉴클레오타이드를 제거하고, 이어서 가역적 종결자 모이어티를 포함하는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 첨가하는 단계가 존재하는, 방법. - 제33항에 있어서,
단계 (a) 내지 (e)에서 사용되는 중합 효소가 단계 (h)에서 사용되는 중합 효소와 상이한, 방법. - (a) 프라이밍된 주형 핵산을, 제1 DNA 중합 효소를 포함하는 제1 반응 혼합물과 접촉시키는 단계;
(b) 단계 (a)로부터의 프라이밍된 주형 핵산을, 제1 DNA 중합 효소에 부재하는 표지를 포함하는 제2 DNA 중합 효소, 및 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제2 반응 혼합물과 접촉시키는 단계;
(c) 시험 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키지 않고, 각 단계 (a) 및 (b) 동안 하나 이상의 지점에서 프라이밍된 주형 핵산을 포함하는 복합체에 존재하는 표지를 검출함으로써, 제2 DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산의 결합을 측정하는 단계; 및
(d) 단계 (c)로부터 측정된 결합 결과를 사용하여 시험 뉴클레오타이드가 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드인지 여부를 결정하는 단계
를 포함하는, 시험 뉴클레오타이드가 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 바로 하류에 위치하는 주형 가닥의 바로 다음의 염기에 상보적인 염기를 포함하는 바로 다음의 정확한 뉴클레오타이드인지 여부를 결정하는 방법. - 제42항에 있어서,
제1 및 제2 DNA 중합 효소의 아미노산 서열이 동일한, 방법. - 제42항에 있어서,
단계 (a) 및 (b)가 각각 삼원 복합체의 형성을 안정화하고, 이원 복합체의 형성을 불안정화하는 완충 조건하에서 수행되는, 방법. - 제44항에 있어서,
단계 (a) 및 (b)가 각각 고염 완충 조건하에서 수행되는, 방법. - 제45항에 있어서,
제1 DNA 중합 효소가 외인성 검출가능한 표지를 포함하지 않는, 방법. - 제42항에 있어서,
단계 (a) 내지 (c)를 각각 매회 상이한 시험 뉴클레오타이드로 3회 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제47항에 있어서,
제2 DNA 중합 효소의 표지가 형광 표지인, 방법. - 제48항에 있어서,
단계 (c)가 동족 뉴클레오타이드에 결합하는 제2 DNA 중합 효소의 결과로서 광학 성질을 변화시키는 입체 구조 감응성 염료로부터 형광 신호를 측정하는 것을 포함하지 않는, 방법. - 제42항에 있어서,
시험 뉴클레오타이드, 및 프라이밍된 주형 핵산에 결합된 임의의 중합 효소를 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법. - 제50항에 있어서,
프라이밍된 주형 핵산을, 제3 DNA 중합 효소 및 가역적 종결자 뉴클레오타이드를 포함하는 제3 반응 혼합물과 접촉시키고, 이어서 제3 DNA 중합 효소를 사용하여 가역적 종결자 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 혼입시켜 가역적으로 종결된 프라이머를 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제51항에 있어서,
단계 (a) 내지 (c) 각각에서 가역적으로 종결된 프라이머를 포함하는 프라이밍된 주형 핵산을 사용하여 단계 (a) 내지 (d)를 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - (a) 프라이밍된 주형 핵산 분자를, DNA 중합 효소를 포함하는 제1 반응 혼합물과 접촉시키는 단계;
(b) 제1 시험 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 혼입시키지 않고, 단계 (a)로부터의 프라이밍된 주형 핵산 분자를, DNA 중합 효소 및 제1 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제2 반응 혼합물과 접촉시키는 단계;
(c) 제1 시험 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 화학적으로 혼입시키지 않고, 각 단계 (a) 및 (b) 동안 하나 이상의 지점에서, DNA 중합 효소에 대한 프라이밍된 주형 핵산 분자의 결합을 측정하여, 삼원 복합체가 단계 (b)에서 형성되는지 여부를 확립하는 단계; 및
(d) (i) 단계 (c)에서 삼원 복합체가 단계 (b)에서 형성되지 않음이 확립될 때, 단계 (b)로부터의 프라이밍된 주형 핵산 분자를, 제1 시험 뉴클레오타이드 및 제2 시험 뉴클레오타이드와 조합하여 DNA 중합 효소를 포함하는 제3 반응 혼합물과 접촉시키는 옵션으로서, 제2 시험 뉴클레오타이드가 제1 시험 뉴클레오타이드와 상이한, 옵션; 및 (ii) 단계 (c)에서 삼원 복합체가 단계 (b)에서 형성되지 않음이 확립될 때, 단계 (b)로부터의 프라이밍된 주형 핵산 분자를 제4 반응 혼합물과 접촉시키고, 단계 (b)로부터의 프라이밍된 주형 핵산 분자를 제3 반응 혼합물과 먼저 접촉시키지 않고, 뉴클레오타이드를 프라이머 내로 혼입시키는 혼입 반응을 수행하는 옵션 중 하나를 선택하는 단계
를 포함하는, 뉴클레오타이드를 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 바로 하류에 위치하는 주형 가닥의 바로 다음의 염기에 상보적인 염기에 혼입시키는 방법. - 제53항에 있어서,
프라이밍된 주형 핵산 분자가 고체 지지체에 고정되는, 방법. - 제54항에 있어서,
제4 반응 혼합물이 제1 및 제2 반응 혼합물의 중합 효소와 상이한 중합 효소를 포함하는, 방법. - 제54항에 있어서,
제4 반응 혼합물이 제1 및 제2 반응 혼합물의 중합 효소와 상이한 중합 효소를 포함하고, 단계 (d)(ii)에서 프라이머 내로 혼입되는 뉴클레오타이드가 가역적 종결자 모이어티를 포함하는, 방법. - 제53항에 있어서,
프라이밍된 주형 핵산 분자가 고체 지지체에 고정되고, 접촉 단계 (a) 및 (b)가 각각 반응 혼합물을 고체 지지체에 고정된 프라이밍된 주형 핵산 분자 상으로 유동시키는 것을 포함하는, 방법. - 제53항에 있어서,
프라이밍된 주형 핵산 분자가 고체 지지체에 고정되고, 접촉 단계 (a) 및 (b)가 각각 고체 지지체를 제1 반응 혼합물을 포함하는 용기로부터 제2 반응 혼합물을 포함하는 용기로 이동시키는 것을 포함하는, 방법. - 제53항에 있어서,
제1 및 제2 반응 혼합물이 각각 동일한 농도의 중합 효소를 포함하는, 방법. - 제53항에 있어서,
제4 반응 혼합물이 제1 및 제2 반응 혼합물의 중합 효소와 상이한 중합 효소를 포함하는, 방법. - 제53항에 있어서,
단계 (c)가 간섭계 또는 표면 플라즈몬 공명 감지에 의한 측정을 포함하는, 방법. - 제53항에 있어서,
제1 시험 뉴클레오타이드가 천연 뉴클레오타이드인, 방법. - 제53항에 있어서,
제1 시험 뉴클레오타이드가 가역적 종결자 모이어티를 포함하는, 방법. - 제53항에 있어서,
단계 (d)(ii)에서 혼입되는 뉴클레오타이드가 천연 뉴클레오타이드 및 가역적 종결자를 포함하는 뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
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