ES2675047T3 - Sistemas para análisis de secuencia mediante síntesis - Google Patents
Sistemas para análisis de secuencia mediante síntesis Download PDFInfo
- Publication number
- ES2675047T3 ES2675047T3 ES07754505.1T ES07754505T ES2675047T3 ES 2675047 T3 ES2675047 T3 ES 2675047T3 ES 07754505 T ES07754505 T ES 07754505T ES 2675047 T3 ES2675047 T3 ES 2675047T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- flow cell
- optionally
- laser
- flow
- reagents
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
- B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L9/00—Supporting devices; Holding devices
- B01L9/52—Supports specially adapted for flat sample carriers, e.g. for plates, slides, chips
- B01L9/527—Supports specially adapted for flat sample carriers, e.g. for plates, slides, chips for microfluidic devices, e.g. used for lab-on-a-chip
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
- C12Q2535/122—Massive parallel sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Sistema configurado para secuenciar uno o más polinucleótidos que comprende: a) plataforma configurada para contener un sustrato sólido que tiene uno o más polinucleótidos unidos a este; b) sistema de dirección de fluido para poner, de manera que se pueda controlar, uno o más reactivos que tengan etiquetas fluorescentes en contacto con los polinucleótidos; c) sistema de control de temperatura para regular una temperatura de al menos uno del sustrato sólido o de los reactivos; d) sistema de iluminación para excitar las etiquetas fluorescentes a través de reflexión interna total (TIR) que comprende al menos un láser de excitación acoplado a través de una fibra óptica multimodal con un índice de refracción que cambia de forma dinámica para obtener una huella de iluminación sustancialmente uniforme; e) componente de detección configurado para aproximarse al soporte sólido para detectar la fluorescencia producida por la excitación de las etiquetas fluorescentes mediante el sistema de iluminación; f) sistema informático acoplado de forma operativa al componente de detección en donde el sistema informático comprende un conjunto de instrucciones para adquirir imágenes de fluorescencia del componente de detección y determinar una secuencia de polinucleótidos a partir de la fluorescencia detectada.
Description
Sistemas para análisis de secuencia mediante síntesis
Campo de la invención
La presente invención hace referencia al campo de la secuenciación de ácidos nucleicos. Más específicamente, la presente invención provee sistemas para secuenciar uno o más polinucleótidos.
Antecedentes de la invención
Los métodos mejorados de análisis y secuenciación de ácidos nucleicos han sido beneficiosos para varios avances recientes en la investigación biológica. Por ejemplo, el Proyecto de genoma humano determinó la secuencia completa del genoma humano, lo que se espera que lleve a hallazgos adicionales en campos que abarcan desde el tratamiento de enfermedades a avances científicos básicos. Aunque se ha determinado la secuencia del genoma humano, aún existe una gran cantidad de material genómico para analizar, por ejemplo, la variación genética entre diferentes individuos, tejidos, especies adicionales, etc.
Los primeros dispositivos de secuenciación de ADN con base en la separación de fragmentos de longitud diferente se desarrollaron en la década de 1980 y se han comercializado durante varios años. Sin embargo, tal tecnología implica el pasaje de muestras individuales por columnas capilares rellenas con geles de poliacrilamida y, por lo tanto, tiene un rendimiento limitado debido al tiempo que toma el pasaje de cada muestra. Recientemente, se ha informado sobre varias tecnologías de secuenciación de ADN nuevas que se basan en el análisis paralelo masivo de moléculas simples no amplificadas (W000006770; Proceedings of the National Academy of Sciences LIS. A, 100, 3960-3964 (2003)) o amplificadas, ya sea en forma de arreglos planos (W09H44151) o en esferas (W004069849; Nature, 437, 376-380 (2005); Science, 309, 5741, 1728-1732 (2005); Nat Biotechnol 6, 630-6344 (2000)).
A menudo, la metodología utilizada para analizar la secuencia de los ácidos nucleicos en tales técnicas de secuenciación nuevas se basa en la detección de nucleótidos u oligonucleótidos fluorescentes. Los instrumentos de detección utilizados para leer las señales de fluorescencia en dichos arreglos se suelen basar en epifluorescencia o en microscopía de reflexión interna total, por ejemplo, tal como se describe en W09641011, W000006770 o W002072892. A pesar de que se ha empleado microscopía de reflexión interna total para obtener imágenes de moléculas de ADN tanto simples como amplificadas en superficies, se describe en la presente por primera vez una plataforma de secuenciación de ADN de cuatro colores confiable y robusta (por ejemplo, que comprende sistemas de calefacción, controles de fluidos, iluminación uniforme, control de la forma del haz óptico, un sistema de autofoco y un control total mediante software de todos los componentes).
WO 00/053805 describe un método en donde se inmovilizan múltiples moléculas de polimerasa en un soporte sólido. Se introducen una muestra de ácido nucleico y cebadores de oligonucleótidos en una cámara de reacción en una solución amortiguada que contiene los cuatro terminadores de nucleósido trifosfato atrapados y enjaulados. Las polimerasas unidas median la elongación de un ácido nucleico conforme a una plantilla con los terminadores de nucleósido trifosfato enjaulados y etiquetados. Se monitorean los centros de reacción mediante sistemas de microscopio hasta que una mayoría de sitios contiene polimerasa inmovilizada enlazada a una plantilla de ácido nucleico con un terminador de nucleótido enjaulado etiquetado incorporado simple. En la etapa siguiente, se enjuaga la cámara de reacción con un amortiguador de lavado y se determina la incorporación de nucleótido específico para cada centro de reacción activo. El documento indica el uso de un sistema de iluminación para excitar el resto fluorescente mediante reflexión interna total a través de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM).
Siguen siendo necesarios dispositivos y sistemas mejores, más robustos y más económicos para la secuenciación rápida y confiable de ácidos nucleicos. La presente invención brinda estos y otros beneficios, lo que resultará evidente al analizar las presentes memoria descriptiva, reivindicaciones y figuras.
Compendio de la invención
La invención comprende un sistema configurado para la secuenciación de uno o más polinucleótidos, y el sistema comprende a) una plataforma configurada como soporte de un sustrato sólido con uno o más polinucleótidos unidos a este y b) un sistema de dirección de fluidos para desplazar de forma controlada uno o más reactivos con etiquetas fluorescentes hasta que queden en contacto con los polinucleótidos. El sistema también comprende c) un sistema de control de temperatura para regular una temperatura de al menos uno del sustrato sólido o de los reactivos y d) un sistema de iluminación para excitar las etiquetas fluorescentes mediante reflexión interna total (TIR). El sistema de iluminación comprende al menos un láser de excitación acoplado a través de una fibra óptica multimodal con un índice de refracción que cambia de forma dinámica para obtener una huella de iluminación sustancialmente uniforme. El sistema también comprende e) un componente de detección configurado para estar próximo al sustrato sólido para detectar la fluorescencia producida por la excitación de las etiquetas fluorescentes mediante el sistema de iluminación. Además, el sistema comprende f) un sistema informático acoplado de forma operativa al componente de detección. El sistema informático comprende un conjunto de instrucciones para adquirir imágenes de fluorescencia del componente de detección y determinar una secuencia de polinucleótidos a partir de la
fluorescencia detectada.
En algunas de dichas realizaciones, el sustrato sólido se puede desplazar en una dirección distal respecto al componente de detección con el objetivo de que el sistema de control de temperatura regule la temperatura del sustrato sólido. En algunas de dichas realizaciones, el sustrato sólido comprende una celda de flujo con uno o más canales de fluido en los que se unen los polinucleótidos. En algunas de dichas realizaciones, el sustrato sólido es un arreglo de esferas.
En algunas de dichas realizaciones, los reactivos comprenden componentes para extender una segunda secuencia complementaria al uno o más polinucleótidos. Opcionalmente, los reactivos son nucleósido trifosfatos etiquetados por fluorescencia. Opcionalmente, los reactivos son oligonucleótidos etiquetados por fluorescencia. En algunas de dichas realizaciones, el sistema de iluminación comprende múltiples láseres de excitación acoplados a través de la fibra óptica multimodal, en donde dicha fibra óptica mulitmodal se deforma físicamente para obtener la huella de iluminación sustancialmente uniforme. Opcionalmente, la deformación física es consecuencia de compresión o vibración.
En algunas de dichas realizaciones, el componente de detección comprende una cámara de CCD o dos cámaras de CCD. En algunas de dichas realizaciones, el componente de detección comprende un mecanismo de autofoco.
En algunas de dichas realizaciones, el sistema incluye dos estaciones de fluido para operar en dos celdas de flujo de forma simultánea. En algunas de dichas realizaciones, el sistema de iluminación comprende dos láseres de excitación acoplados a través de un dispositivo de fibra óptica, en donde dichos dos láseres de excitación iluminan al menos parte de una misma área. En algunas de dichas realizaciones, los reactivos incluyen cuatro nucleótidos diferentes con etiquetas fluorescentes respectivas.
El componente de detección también comprende cuatro filtros ópticos adecuados para una emisión de fluorescencia de los cuatro nucleótidos etiquetados por fluorescencia y para la longitud de onda de los láseres.
Estos y otros rasgos de la invención resultarán más evidentes al leer la descripción detallada que se encuentra a continuación junto con las figuras y las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una vista general de los componentes principales de un ejemplo de sistema de la invención.
La Figura 2 es una fotografía de un ejemplo de sistema de la invención sin cubierta o chasis exterior.
La Figura 3 es una fotografía de un ejemplo de arreglo de celda de flujo, lente objetivo, láser y fibra óptica en un sistema de la invención.
Los paneles A-D de la Figura 4 muestran ejemplos de configuraciones de celdas de flujo.
Los paneles A y B de la Figura 5 ilustran un método para formar una celda de flujo del sistema (Panel A) y un espectro de transmisión de vidrio Foturan (Panel B).
Los paneles A-E de la Figura 6 ilustran un ejemplo de posible método de grabado para construir celdas de flujo en la presente.
Los paneles A-C de la Figura 7 presentan ejemplos de diagramas esquemáticos de posibles arreglos o componentes de flujo de fluido del sistema en configuraciones de atracción (Panel A) o empuje (Paneles B y C).
La Figura 8 muestra un ejemplo de componente de calefacción/refrigeración del sistema aislado de otros aspectos de la invención.
Los paneles A-D de la Figura 9 presentan diagramas esquemáticos de posibles configuraciones de celdas de flujo y soporte de celda de flujo de la invención.
Los paneles A y B de la Figura 10 presentan fotografías de un ejemplo de realización de la invención que muestran el movimiento del componente de calefacción/refrigeración y el soporte de celda de flujo (Panel A) y un esquema de los componentes de calefacción/refrigeración respecto a otros componentes de un ejemplo de sistema (Panel B).
Los paneles A y B de la Figura 11 muestran esquemas que ilustran un ejemplo de marco que incluye los componentes ópticos, de soporte para láser de fibra óptica, de calefacción/refrigeración y de soporte de celda de flujo (A) y un ejemplo de configuración de ajuste de nivelación de celda de flujo (B).
La Figura 12 presenta una imagen de un ejemplo de realización del sistema que muestra el marco y la cubierta del sistema.
Las Figuras 13-16 presentan varias configuraciones opcionales de cámaras, fuentes de luz y otros componentes en los sistemas de la presente.
Las Figuras 17-19 muestran varios esquemas de forma y dimensiones de haz de láseres TIRF en varias
realizaciones de los sistemas de la presente.
La Figura 20 muestra una realización opcional de un prisma de TIRF a utilizar con los sistemas y dispositivos de la
presente.
La Figura 21 ilustra la creación de un haz de láser cuadrado al pulir el extremo de una emisión de fibra multimodal.
Los paneles A y B de la Figura 22 ilustran un ejemplo de configuración de filtros y rueda de filtro opcionalmente en
varias realizaciones de la presente (A), así como el espectro de dichos filtros respecto a cuatro ejemplos de
fluoróforos excitados a las longitudes de onda de láseres (B).
La Figura 23 ilustra un ejemplo de diseño 1G nominal de 30X K4 System Ray de los componentes ópticos de un
sistema de la invención.
La Figura 24 muestra el rendimiento de obtención de imágenes 30X K4 de un ejemplo de sistema de la invención.
La Figura 25 presenta un diagrama esquemático de un rasgo de autofoco de un ejemplo de sistema de la presente.
Las Figuras 26-27 son fotografías de medidas enfocadas y no enfocadas tomadas por varias realizaciones de los
sistemas o dispositivos de la presente.
La Figura 28 presenta un diagrama de un haz de láser con autofoco.
La Figura 29 muestra una gráfica de una variedad de cúmulos de ácidos nucleicos detectados en función de una
cantidad total de cúmulos y el área de cúmulos mínima, tal como lo detecte una realización de la invención.
Las Figuras 30-32 presentan bosquejos de cúmulos de ácidos nucleicos y su secuenciación con los sistemas o
dispositivos de la invención.
Los paneles A-D de la Figura 33 muestran los efectos de tres formas diferentes de deformación física de una fibra
óptica circular en el haz que emerge de la fibra. El someter la fibra a vibración o compresión hace que la luz que
emerge de la fibra sea uniforme durante el tiempo de integración de la imagen.
Los paneles A-D de la Figura 34 muestran los efectos de tres formas diferentes de deformación física de una fibra
óptica rectangular en el haz que emerge de la fibra. El someter la fibra a vibración o compresión hace que la luz que
emerge de la fibra sea uniforme durante el tiempo de integración de la imagen.
Los paneles A-L de la Figura 35 muestran los efectos de varios esquemas de codificación de modo en la luz
emergente de múltiples fibras ópticas diferentes.
La Figura 36 muestra un arreglo posible para una realización de sistema de cámara dual de la invención.
La Figura 37 muestra un ejemplo de realización de la invención que contiene 2 cámaras para registrar
simultáneamente 2 colores en la misma imagen.
La Figura 38 muestra un esquema de una lámina de onda λ/2.
La Figura 39 muestra un esquema de una lámina de onda λ/2 modificada que comprende múltiples secciones
orientadas de forma diferente.
La Figura 40 muestra un bosquejo de un sistema de mezcla modulado con lámina de onda de modo de una
realización de la invención.
Los paneles A-D de la Figura 41 son fotografías de un área de huella iluminada a partir de una fibra óptica
multimodal y generada por la mezcla de modos ópticos a través del uso de láminas de onda.
Los paneles A y B de la Figura 42 muestran la uniformidad sustancial de un área de huella de láser debido a la
mezcla multimodal mediante el uso de láminas de onda.
La Figura 43 muestra una realización de soporte de celda de flujo dual de la invención, de forma tal que sea posible
llevar a cabo las operaciones químicas en paralelo con el fin de maximizar el tiempo de análisis del instrumento.
Los paneles A—F de la Figura 44 muestran ejemplos de realizaciones de celdas de flujo con flujo inferior, prismas e
iluminación TIRF lateral/superior.
La Figura 45 muestra un ejemplo de componente de regulación de temperatura bajo una celda de flujo y un prisma.
La Figura 46 muestra un ejemplo de válvula de fluido y ejemplos de colectores (por ejemplo, para utilizar con celdas
de flujo con flujo inferior).
La Figura 47 muestra un ejemplo de válvula de fluido de la invención.
Los paneles A y B de la Figura 48 muestran una posible configuración de celda de flujo dual de la invención.
Los paneles A-F de la Figura 49 muestran varios ejemplos de configuraciones de regulación de temperatura inferior que se pueden utilizar con celdas de flujo con flujo inferior de la invención.
Descripción detallada
También se discuten en la presente sistemas y dispositivos para la secuenciación de uno o más polinucleótidos. Los sistemas se pueden utilizar para obtener imágenes de los sustratos planos, en donde los sustratos pueden comprender moléculas simples no amplificadas, moléculas simples amplificadas, uno o más conjuntos de esferas ordenadas o varias combinaciones de estos. Cuando se utilizan para secuenciación, los sistemas pueden comprender opcionalmente un sustrato sólido plano con uno o más polinucleótidos en este, por ejemplo, ya sea directamente unidos o unidos a esferas opcionalmente dispuestas en el sustrato; un sistema de dirección de fluidos que desplaza de forma controlada varios reactivos (por ejemplo, amortiguadores, enzimas, oligonucleótidos o nucleótidos etiquetados por fluorescencia, etc.) hasta que queden en contacto con los polinucleótidos; un sistema de control de temperatura que regula la temperatura del sustrato y/o de los reactivos; un sistema óptico para obtener iluminación por reflexión interna total del sustrato con una huella de haz uniforme (en cuyo caso se controla opcionalmente la forma de la huella), una fuente de luz (por ejemplo, una que comprende uno o más láseres) para excitar los restos fluorescentes; un componente de detección (por ejemplo, una cámara de CCD y lentes objetivo, etc.) próximo al sustrato y que captura y detecta fluorescencia del resto o los restos excitados; una computadora conectada al detector, la que tiene conjuntos de instrucciones para controlar los diversos componentes del sistema, adquirir datos de fluorescencia del detector y, opcionalmente, determinar la secuencia del polinucleótido a partir de los datos de fluorescencia. Tal como se discute en la presente, los sustratos se pueden alejar del detector para interactuar con el sistema de control de temperatura, de forma de regular la temperatura del sustrato (por ejemplo, para permitir que las reacciones de polimerasa continúen, etc.). En dichas realizaciones, el sistema puede comprender una plataforma de análisis o una plataforma móvil opcionalmente controlada por computadora. El dispositivo de calefacción puede ser un dispositivo de Peltier controlado por computadora u otro componente de calefacción/refrigeración que se desplaza respecto a la plataforma de análisis o la plataforma se puede desplazar opcionalmente para garantizar que el dispositivo de Peltier se encuentre en contacto con el sustrato. Tal como se discute en la presente, el sustrato puede comprender una celda de flujo. Las celdas de flujo pueden tener uno o más canales de fluido en los que se encuentre el polinucleótido (por ejemplo, en donde los polinucleótidos se unen directamente a la celda de flujo o en donde los polinucleótidos se unen a una o más esferas dispuestas en la celda de flujo) y pueden comprender vidrio, silicio, plástico o varias combinaciones de estos. Los reactivos incluyen componentes para sintetizar una segunda secuencia complementaria al uno o más polinucleótidos. La síntesis se puede llevar a cabo con nucleótidos etiquetados que se pueden agregar individualmente o como una mezcla de nucleótidos, o como oligonucleótidos etiquetados. En el caso de oligonucleótidos etiquetados, es posible determinar la identidad de una o más bases complementarias al oligonucleótido etiquetado. Los nucleótidos etiquetados se pueden encontrar en forma de trifosfatos etiquetados por fluorescencia, los que pueden contener un resto de bloqueo para controlar la adición y garantizar que se agregue un único nucleótido a cada polinucleótido. El fluoróforo se puede unir al resto de bloqueo, el que se puede encontrar en la posición 3' del azúcar, o se puede unir a través de la base de nucleótido a través de un enlazador que se puede escindir opcionalmente con las mismas condiciones que la remoción del resto de bloqueo. Es posible escindir el enlazador y el resto de bloqueo con los mismos reactivos. Tal como se discute en la presente, el sistema de reflexión interna total (TIRF) puede comprender, por ejemplo, una lámpara o un láser. El sistema puede comprender más de un láser de excitación que se puede acoplar a través de un dispositivo de fibra óptica. Tales láseres pueden iluminar al menos parte de la misma área (es decir, con superposición). Los láseres de TIRF de la presente también comprenden opcionalmente un codificador de modo de fibra comprimido mediante accionador piezoeléctrico o modulado por láminas de onda, con agitación y con vibración para producir la intensidad óptica sustancialmente uniforme en toda una huella de iluminación del láser. Se describen en la presente varios mecanismos para controlar la intensidad y la uniformidad de iluminación. También es posible emplear la forma de la fibra para controlar la forma de la huella de iluminación. En las diversas realizaciones de la presente, el componente de detección puede comprender uno o más lentes objetivo, lentes de tubo adicionales, un sistema de autofoco que ajusta ya sea la posición de la plataforma y/o la posición de los lentes objetivo para garantizar que el sustrato se mantenga en foco, filtros ópticos adecuados para transmitir la longitud de onda de emisión de los fluoróforos y bloquear la luz de la fuente de excitación, y un sistema para registrar la emisión de fluorescencia de los fluoróforos, por ejemplo, un dispositivo de carga acoplada (CCD) o una cámara similar.
La presente invención comprende sistemas para secuenciar uno o más polinucleótidos, por ejemplo, a partir de arreglos de ADN de molécula simple amplificada mediante clonación en celdas de flujo o a partir de una arreglo de esferas inmovilizadas. Los sistemas de la presente son opcionalmente útiles, por ejemplo, en la secuenciación genómica comparativa (tal como para genotipado, descubrimiento de SNP, secuenciación de extremo SAC, mapeo de punto de ruptura de cromosoma, arreglo de secuencia de genoma completo), rastreo de expresión génica, análisis de secuencia de microARN, epigenómica (por ejemplo, con mapeo de sitio con hipersensibilidad a DNasa 1 de mapeo de metilación o inmunoprecipitación de cromatina), caracterización de biblioteca de expresión antifágica y antiaptamérica. Los sistemas de la presente comprenden varias combinaciones de aspectos o dispositivos informáticos, ópticos, mecánicos, fluidos, térmicos y eléctricos que se describen de forma más detallada más
adelante. La invención se describe en sentido general en la reivindicación independiente 1.
En resumen, los aspectos generales de la invención se bosquejan en la Figura 1, la que ilustra un ejemplo de configuración de obtención de imágenes mediante TIRF de una realización de diseño con retroiluminación. Tal como se puede ver en la Figura 1, el dispositivo o módulo de administración de fluidos 100 dirige el flujo de reactivos (por ejemplo, nucleótidos fluorescentes, amortiguadores, enzimas, reactivos de escisión, etc.) a una celda de flujo 110 y una válvula de descarte 120 (y a través de estas). En realizaciones particulares, la celda de flujo comprende cúmulos de secuencias de ácidos nucleicos (por ejemplo, de alrededor de 200-1000 bases de longitud) a secuenciar que se unen de forma opcional al sustrato de la celda de flujo, así como opcionalmente otros componentes. La celda de flujo también puede comprender un arreglo de esferas, cada una de las cuales contiene opcionalmente múltiples copias de una única secuencia. La preparación de dichas esferas se puede llevar a cabo según una variedad de técnicas, por ejemplo, tal como se describe en USPN 6 172 218 o WO04069849 (Bead emulsion nucleic acid amplification).
El sistema también comprende un accionador de estación de temperatura 130 y un componente de calefacción/refrigeración 135 que puede regular opcionalmente la temperatura de las condiciones de los fluidos en la celda de flujo. Tal como se explica más adelante, varias realizaciones pueden comprender configuraciones diferentes de los componentes de calefacción/refrigeración. Se monitorea la celda de flujo y se hace seguimiento de la secuenciación mediante el sistema de cámara 140 (por ejemplo, una cámara de CCD) que puede interactuar con varios filtros en el arreglo de codificación de filtro 145, lente objetivo 142 y enfoque láser o arreglo de enfoque láser
150. El dispositivo láser 160 (por ejemplo, un láser de excitación en un arreglo que opcionalmente comprende múltiples láseres) actúa de forma de iluminar reacciones de secuenciación fluorescentes en la celda de flujo mediante iluminación láser a través de fibra óptica 161 (lo que opcionalmente puede comprender uno o más lentes para volver a obtener imágenes, un soporte de fibra óptica, etc. La realización ilustrada también presenta una lámpara de baja potencia 165, espejo 180 y dicroica inversa 185. Remitirse al texto a continuación. De manera adicional, la plataforma de soporte 170 permite la alineación y el desplazamiento correctos de la celda de flujo, el accionador de temperatura, la cámara, etc. respecto a los diversos componentes de la invención. El componente de enfoque (eje z) 175 también puede favorecer la manipulación y la ubicación de varios componentes (por ejemplo, un lente objetivo). Tales componentes se organizan opcionalmente en un marco y/o se encuentran dentro de una estructura de cubierta. Se observará que las ilustraciones de la presente ilustran ejemplos de realizaciones y no se deben tomar necesariamente como taxativas. Por lo tanto, por ejemplo, realizaciones diferentes pueden comprender la ubicación diferente de componentes uno respecto a otro (por ejemplo, la realización A comprende un componente de calefacción/refrigeración tal como en la Figura 1, al tiempo que la realización B comprende un componente de calefacción/refrigeración debajo de su celda de flujo, etc.).
Definiciones
Tal como se utilizan en la presente, «polinucleótido» y «ácido nucleico» hacen referencia a ácido desoxirribonucleico (ADN), pero el experto en la técnica reconocerá que los sistemas y dispositivos de la presente también se pueden utilizar con ácido ribonucleico (ARN) cuando sea adecuado. Se debería entender que los términos incluyen, como equivalentes, análogos ya sea de ADN o ARN a partir de análogos de nucleótidos. Los términos o expresiones tal como se utilizan en la presente también comprenden ADNc que es ADN complementario, o una copia, producido a partir de una plantilla de ARN, por ejemplo, mediante la acción de transcriptasa inversa.
Las moléculas de polinucleótido de cadena simple secuenciadas por los sistemas y dispositivos de la presente se pueden haber originado en forma de cadena simple como ADN o ARN, o en forma de ADN de doble cadena (ADNdc) (por ejemplo, fragmentos de ADN genómico, productos de amplificación y PCR, y similares). Por lo tanto, un polinucleótido de cadena simple puede ser la cadena sentido o antisentido de un dúplex de polinucleótidos. Se conocen en la técnica métodos de preparación de moléculas de polinucleótido de cadena simple adecuadas para uso en el método de la invención con técnicas estándares. En general, la secuencia precisa de las moléculas de polinucleótido primario no es importante para la invención y se puede conocer o no. Las moléculas de polinucleótido de cadena simple pueden representar moléculas de ADN genómico (por ejemplo, ADN genómico humano) que incluyen tanto secuencias de intrón como de exón (secuencia codificante), así como secuencias reguladoras no codificantes, tales como secuencias promotoras y potenciadoras.
En determinadas realizaciones, el ácido nucleico a secuenciar mediante el uso de la presente invención se inmoviliza en un sustrato (por ejemplo, un sustrato en una celda de flujo o una o más esferas en un sustrato tal como una celda de flujo, etc.). Tal como se utiliza en la presente, se pretende que el término «inmovilizado» abarque la unión covalente o no covalente, directa o indirecta, a menos que se indique lo contrario de forma explícita o mediante el contexto. En determinadas realizaciones de la invención, se puede preferir la unión covalente, pero, en general, lo que se requiere es que las moléculas (por ejemplo, ácidos nucleicos) permanezcan inmóviles o unidas al soporte en condiciones en las que se pretende usar el soporte, por ejemplo, en aplicaciones que requieren la secuenciación de ácidos nucleicos.
Tal como se usa en la presente, la expresión «soporte sólido» (o «sustrato» en determinados usos) hace referencia a cualquier arreglo o sustrato inerte al que se pueden unir ácidos nucleicos, tal como, por ejemplo, superficies de vidrio, superficies de plástico, látex, dextrano, superficies de poliestireno, superficies de polipropileno, geles de
poliacrilamida, superficies de oro y obleas de silicio. A efectos descriptivos, el soporte sólido puede ser una superficie de vidrio (por ejemplo, la superficie plana de un canal de celda de flujo). A efectos descriptivos, el soporte sólido puede comprender un arreglo o sustrato inerte que se «funcionalizó», por ejemplo, mediante la aplicación de una capa o revestimiento de un material intermedio que comprende grupos reactivos que permiten la unión covalente a moléculas tales como polinucleótidos. A modo de ejemplo no taxativo, dichos soportes pueden incluir hidrogeles de poliacrilamida en un sustrato inerte tal como vidrio. Las moléculas (polinucleótidos) se pueden enlazar de forma covalente directa al material intermedio (por ejemplo, el hidrogel), pero el material intermedio se puede enlazar de forma no covalente al sustrato o arreglo (por ejemplo, el sustrato de vidrio). Por consiguiente, se debe interpretar que la unión covalente a un soporte sólido comprende este tipo de arreglo.
Descripción general del sistema
Tal como se indicó anteriormente, la presente invención comprende sistemas y dispositivos novedosos para la secuenciación de ácidos nucleicos. Como resultará evidente para los expertos en la técnica, de acuerdo con el contexto, las referencias en la presente a una secuencia de ácido nucleico particular también pueden hacer referencia a moléculas de ácido nucleico que comprenden tal secuencia de ácido nucleico. La secuenciación de un fragmento diana significa que se establece una lectura del orden cronológico de las bases. No es necesario que las bases leídas sean contiguas, aunque es preferible, ni es necesario secuenciar cada base del fragmento completo durante la secuenciación. La secuenciación se puede llevar a cabo con cualquier técnica de secuenciación adecuada, en donde los nucleótidos u oligonucleótidos se agregan de forma sucesiva a un grupo hidroxilo 3' libre, lo que genera la síntesis de una cadena de polinucleótidos en dirección 5' a 3'. Preferiblemente, la naturaleza del nucleótido agregado se determina luego de cada adición de nucleótido. Las técnicas de secuenciación que emplean secuenciación mediante ligadura en donde no se secuencia cada base contigua y las técnicas tales como la secuenciación paralela masiva característica (MPSS) en la que se eliminan, en lugar de agregar, bases a las cadenas en la superficie también se pueden utilizar con los sistemas y dispositivos de la invención.
En determinadas realizaciones, la presente invención utiliza secuenciación mediante síntesis (SBS). En SBS, se utilizan cuatro nucleótidos modificados etiquetados por fluorescencia para determinar la secuencia de cúmulos densos de ADN amplificado (posiblemente, millones de cúmulos) presentes en la superficie de un sustrato (por ejemplo, una celda de flujo). Los inventores y otros empleados han descrito varios aspectos adicionales respecto a métodos y procedimientos de SBS que se pueden utilizar con los sistemas y dispositivos de la presente. Vea, por ejemplo, W004018497, W004018493 y US7057026 (nucleótidos), W005024010 y W006120433 (polimerasas), W005065814 (técnicas de unión a la superficie) y WO 9844151, W006064199 y W007010251.
A efectos descriptivos, las celdas de flujo que contienen las muestras de ácido nucleico para secuenciación se colocan en el soporte de celda de flujo adecuado. Las muestras para secuenciación se pueden encontrar en forma de moléculas simples, moléculas simples amplificadas en forma de cúmulos o esferas que comprenden moléculas de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos se preparan de forma tal que comprenden un cebador oligonucleótido adyacente a una secuencia diana desconocida. Para iniciar el primer ciclo de secuenciación SBS, el subsistema de flujo de fluido (del que se describen varias realizaciones en la presente) provoca el flujo de uno o más nucleótidos etiquetados de forma diferente y ADN polimerasa, etc., hacia el interior o a través de la celda de flujo. Es posible agregar ya sea un único nucleótido a la vez o diseñar los nucleótidos utilizados en el procedimiento de secuenciación especialmente para que posean una propiedad de terminación reversible, lo que permite que cada ciclo de la reacción de secuenciación se produzca de forma simultánea en presencia de los cuatro nucleótidos etiquetados (A, C, T, G). En el caso de que los cuatro nucleótidos se mezclen, la polimerasa es capaz de seleccionar la base correcta a incorporar y cada secuencia se extiende una única base. En tales métodos de uso de los sistemas de la invención, la competencia natural entre las cuatro alternativas lleva a una mayor precisión que si únicamente un nucleótido se encuentra presente en la mezcla de reacción (donde, por consiguiente, la mayoría de las secuencias no se expone al nucleótido correcto). Se trata a las secuencias en las que se repite una base particular una tras otra (por ejemplo, homopolímeros) como a cualquier otra secuencia y con precisión elevada.
El subsistema de flujo de fluido también provoca el flujo de los reactivos adecuados para remover el extremo 3' bloqueado (si correspondiera) y el fluoróforo de cada base incorporada. El sustrato se puede exponer ya sea a una segunda ronda de los cuatro nucleótidos bloqueados o, de forma opcional, a una segunda ronda con un nucleótido individual diferente. Entonces, se repiten dichos ciclos y se lee la secuencia de cada cúmulo en los múltiples ciclos químicos. El aspecto informático de la presente invención puede alinear opcionalmente los datos de secuencia recopilados a partir de cada molécula, cúmulo o esfera individual para determinar la secuencia de polímeros más extensos, etc. De manera alternativa, es posible llevar a cabo el procesamiento de imágenes y la alineación en una computadora separada.
Los componentes de calefacción/refrigeración del sistema regulan las condiciones de reacción en los canales de la celda de flujo y las áreas o recipientes de almacenamiento de reactivos (y, opcionalmente, la cámara, dispositivos ópticos y/u otros componentes), mientras que los componentes de flujo de fluido hacen posible que la superficie de sustrato se exponga a reactivos adecuados para incorporación (por ejemplo, los nucleótidos etiquetados por fluorescencia de forma adecuada a incorporar), al tiempo que se eliminan mediante enjuague los reactivos no incorporados. Una plataforma móvil opcional sobre la que se coloca la celda de flujo permite orientar de forma adecuada la celda de flujo para la excitación por láser (u otra luz) del sustrato y, opcionalmente, desplazarla
respecto a un lente objetivo para que sea posible la lectura de áreas diferentes del sustrato. De manera adicional, otros componentes del sistema también son opcionalmente móviles o ajustables (por ejemplo, la cámara, el lente objetivo, el componente de calefacción/refrigeración, etc.). Durante la excitación con láser, el componente de cámara capta la imagen o ubicación de la fluorescencia emitida desde los ácidos nucleicos en el sustrato, de forma que se registra en el componente informático la identidad de la primera base para cada molécula, cúmulo o esfera individual.
La Figura 2 muestra una fotografía de un ejemplo de arreglo de un sistema de la invención. Tal como se puede observar, es posible dividir el sistema en varios grupos básicos, por ejemplo, el área 200 que comprende el almacenamiento de reactivos y fluidos (lo que incluye bombas y motores, o similares, para producir y regular el flujo de fluido, componentes de calefacción/refrigeración para temperaturas de reactivo adecuadas, etc.), el área 210 que comprende la celda de flujo y detección (lo que incluye una o más cámaras o dispositivos similares, uno o más láseres u otras fuentes lumínicas, uno o más filtros ópticos y lentes adecuados, un accionador de control de temperatura, por ejemplo, con componentes de calefacción/refrigeración de Peltier para controlar las condiciones de temperatura de la celda de flujo, una plataforma de presentación móvil y motores que la controlan para ubicar correctamente los diversos dispositivos o componentes en el sistema) y el área 220 que comprende un módulo informático (lo que incluye una memoria y una interfaz para usuario, tal como un panel de visualización y un teclado, etc.).
La Figura 3 muestra una fotografía de una celda de flujo (celda de flujo 300) en un ejemplo de sistema. Se ubica un láser acoplado a través de fibra óptica 320 para iluminar la celda de flujo (la que contiene las muestras de ácido nucleico a secuenciar), mientras que un componente de lente objetivo (componente 310) capta y monitorea las diversas emisiones fluorescentes una vez que un láser u otra luz ilumina los fluoróforos. También como se puede ver en la Figura 3, se hace fluir los reactivos a través de la celda de flujo y a través de uno o más tubos (tubos 330) que se conectan con el almacenamiento de reactivo adecuado, etc. La celda de flujo en la Figura 3 se coloca en un soporte de celda de flujo 340 (que, a su vez, se coloca sobre el área de presentación móvil 350). El soporte de celda de flujo mantiene la celda de flujo fija en la posición adecuada respecto al láser, el prisma (que dirige la iluminación láser a la superficie de obtención de imágenes) y el sistema de cámaras mientras que se produce la secuenciación. A continuación, se exponen otras celdas de flujo y configuraciones de celdas de flujo.
Las diversas realizaciones de la presente invención exhiben varios rasgos novedosos (nuevamente, se observará que no todos los rasgos se encuentran necesariamente presentes en todas las realizaciones, a menos que se indique específicamente). Por ejemplo, los sistemas de la presente pueden utilizar dos láseres de excitación acoplados a través de un dispositivo de fibra óptica para garantizar que iluminen la misma área (es decir, que las áreas iluminadas, o huellas, de los láseres se superpongan). De manera adicional, la presente invención puede contener una fibra modulada con láminas de onda, con agitación o comprimida (codificador de modo), de forma que se uniformice la intensidad óptica de un haz multimodal en toda la huella de iluminación. Es posible ajustar la forma de la fibra, por ejemplo, para que sea cuadrada o rectangular, para que la forma de la iluminación corresponda a la forma del dispositivo de recopilación de datos (por ejemplo, un CCD con píxeles cuadrados). Además, en determinadas realizaciones, un único láser excita dos fluoróforos, uno con un filtro de emisión estrecho cercano a la longitud de onda y uno con un filtro de emisión de banda más ancha a longitud de onda mayor. Tal arreglo normaliza las intensidades relativas de los tintes (con los mismos filtros de ancho de banda, el tinte más lejano a la longitud de onda del láser sería mucho más débil). Las realizaciones de la presente también pueden comprender una plataforma móvil para que la reacción química (la que requiere calefacción y refrigeración) se pueda producir en el mismo instrumento, pero fuera del tren óptico. A menudo, los sistemas de la presente también comprenden un sistema de autofoco que permite obtener imágenes de forma automática de muchos mosaicos y contiene un sistema de fluido para llevar a cambio modificaciones de fluidos en línea. Opcionalmente, cada uno de los componentes individuales del sistema o dispositivo (por ejemplo, fuente lumínica, cámara, etc.) puede tener su propio suministro o fuente de energía, o todo se puede accionar opcionalmente mediante una fuente. Tal como se observará, aunque los componentes de la presente se describen a menudo aislados o en relación únicamente a uno o dos componentes más, los diversos componentes en las realizaciones suelen estar conectados de forma operativa y/o funcional y actúan en conjunto en los sistemas o dispositivos de la presente.
Celdas de flujo
A efectos descriptivos, los sistemas de la presente comprenden uno o más sustratos en los que se enlazan, se unen
o se asocian los ácidos nucleicos a secuenciar. Vea, por ejemplo, WO 9844151 o W00246456. El sustrato se encuentra en un canal u otra área como parte de una celda de flujo. Las celdas de flujo utilizadas pueden comprender millones de cúmulos de ácidos nucleicos individuales, por ejemplo, alrededor de 2-8 millones de cúmulos por canal. Cada uno de tales cúmulos puede tener lecturas de extensiones de al menos 25 bases para secuenciación de ADN y 20 bases para análisis de expresión génica. Los sistemas de la presente pueden generar mil millones de bases (gigabase) de secuencia por operación (por ejemplo, 5 millones de cúmulos de ácidos nucleicos por canal, 8 canales por celda de flujo, 25 bases por polinucleótido).
A efectos descriptivos, las Figuras 4A y 4B muestran una celda de flujo. Tal como se puede ver, la celda de flujo 400 comprende una capa base 410 (por ejemplo, un vidrio de borosilicato de 1000 ium de profundidad), una capa de canal 420 (por ejemplo, de silicio grabado de 100 pm de profundidad) superpuesta en la capa base y una capa de
cubierta o superior 430 (por ejemplo, de 300 µm de profundidad). Cuando las capas se disponen juntas, se forman canales cerrados con entradas o salidas en cualquiera de los extremos a través de la cubierta. Tal como resultará evidente a partir de la descripción que se encuentra más adelante, algunas celdas de flujo pueden comprender aberturas para los canales en la parte inferior de la celda de flujo.
Opcionalmente, es posible construir la capa con canales mediante métodos fotolitográficos estándares que son conocidos por los expertos en la técnica. Un método tal que se puede utilizar en la presente invención implica la exposición de una capa de 100 µm de silicio y el grabado del canal expuesto con grabado iónico reactivo profundo o grabado húmedo.
Se observará que, aunque se encuentran en la presente configuraciones de celda de flujo particulares, tales configuraciones no se deberían interpretar como limitantes. Por lo tanto, por ejemplo, varias celdas de flujo de la presente pueden comprender cantidades diferentes de canales (por ejemplo, un canal, 2 canales o más, 4 canales o más, o 6, 8, 10, 16 o más canales, etc.). De manera adicional, varias celdas de flujo pueden comprender canales de profundidades y/o anchos diferentes (tanto diferentes entre canales en celdas de flujo diferentes y diferentes entre canales en la misma celda de flujo). Por ejemplo, aunque los canales formados en la celda en la Figura 4B tienen 100 gm de profundidad, otras celdas de flujo pueden comprender opcionalmente canales de mayor profundidad (por ejemplo, 500 µm) o menor profundidad (por ejemplo, 50 pm). Se ilustran ejemplos adicionales de celdas de flujo en las Figuras 4C y 4D (por ejemplo, una celda de flujo con canales amplios, tales como los canales 440 en la Figura 4C, con dos canales con 8 puertos de entrada y salida (puertos 445 -8 de entrada y 8 de salida) para mantener la uniformidad de flujo y una pared central, tal como la pared 450, para soporte estructural adicional, o una celda de flujo con canales desfasados, tales como los 16 canales desfasados (canales 480), etc.). Es posible diseñar las celdas de flujo para maximizar la recolección de fluorescencia de la superficie iluminada y obtener imágenes limitadas por difracción. Por ejemplo, en el diseño ilustrado en la figura 4C, la luz ingresa al canal a través de una capa inferior 460 de 1000 µm de espesor, la que puede ser de vidrio de borosilicato, silicio fusionado u otro material descrito en la presente, y la luz emitida viaja a través de 100 gm de profundidad de solución acuosa en el canal y 300 i-tm de profundidad de material de capa superior 470. Sin embargo, en algunas celdas de flujo, el espesor de la capa superior puede ser menor de 300 gm para prevenir aberraciones esféricas y para obtener imágenes de un punto limitado por difracción. Por ejemplo, el espesor de la capa superior puede ser de alrededor de 170 pm para uso con un sistema óptico limitado por difracción estándar. Opcionalmente, se puede diseñar el objetivo a medida, por ejemplo, tal como se describe en la presente, para utilizar la capa superior de mayor espesor sin sufrir las aberraciones esféricas.
A efectos descriptivos, las celdas de flujo se pueden crear a partir de una variedad de materiales posibles o con estos. Por ejemplo, las celdas de flujo pueden comprender vidrio fotosensible, tal como Foturan® (Mikroglas, Mainz, Alemania) o Fotoform® (Hoya, Tokio, Japón), que se puede producir y manipular según sea necesario. Otros materiales posibles pueden incluir plásticos tales como copolímeros de olefina cíclica (por ejemplo, Topas® (Ticona, Florence, KY) o Zeonor® (Zeon Chemicals, Louisville, KY)) que tienen excelentes propiedades ópticas y pueden resistir temperaturas elevadas si fuera necesario (por ejemplo, hasta 100°C). Tal como resultará evidente a partir de la Figura 4, las celdas de flujo pueden comprender una variedad de materiales diferentes en la misma celda. Por lo tanto, la capa base, las paredes de los canales y la capa superior o de cubierta pueden, opcionalmente, ser de materiales diferentes.
Aunque el ejemplo en la Figura 4B muestra una celda de flujo que comprende 3 capas, otras celdas de flujo pueden comprender 2 capas, por ejemplo, una capa base con canales grabados, cortados o formados en ella y una capa superior, etc. De manera adicional, otras celdas de flujo pueden tener una única capa que comprende el canal de flujo grabado, cortado o formado de otra manera en esta.
Las celdas de flujo pueden comprender Foturan®. Foturan es un vidrio fotosensible que se puede estructurar para varios fines. Esta combina varias propiedades de vidrio deseadas (por ejemplo, transparencia, dureza, resistencia química y térmica, etc.) y la capacidad para lograr estructuras muy finas con tolerancias elevadas y relaciones de aspecto elevadas (profundidad de orificio/ancho de orificio). Usualmente, las estructuras más pequeñas posibles con Foturan® son, por ejemplo, de 25 1,1.m con una aspereza de 1 µm.
La Figura 5A es un diagrama esquemático de una posible forma para determinar el patrón de una celda de flujo (por ejemplo, una que comprende Foturan®). En primer lugar, se enmascara el patrón deseado con las máscaras 500 en la superficie del sustrato 510 que luego se expone a luz UV. En dicha etapa de exposición, el vidrio se expone a luz UV a una longitud de onda de entre 290 y 330 nm. Puede ser posible iluminar espesores de material de hasta 2 mm. Usualmente, una densidad energética de aproximadamente 20 J/cm2 es suficiente para estructurar una placa de Foturan® de 1 mm de espesor. Durante la etapa de exposición UV, los átomos de plata u otros átomos contaminados se combinan en las áreas iluminadas (áreas 520). Luego, durante un tratamiento térmico entre 500°C y 600°C, el vidrio se cristaliza alrededor de los átomos de plata en el área 520. Finalmente, cuando se graban con una solución de ácido fluorhídrico al 10 % a temperatura ambiente (grabado anisotrópico), las regiones cristalinas tienen una tasa de grabado hasta 20 veces mayor que las regiones vítreas, lo que produce los canales 530. Si se agregan grabado ultrasónico o grabado por pulverización al grabado químico húmedo, las estructuras resultantes presentan una relación de aspecto elevada. La Figura 5B muestra un espectro de transmisión de una muestra de vidrio Foturan (d = 1 mm).
Los paneles A a E de la Figura 6 muestran un ejemplo de proceso de grabado para producir una celda de flujo de muestra tal como se usa en la presente. En la Figura 6A, los canales 600 (tal como se ven en una vista de extremo) y los orificios 605 (tal como se ve en una vista de extremo) se exponen o se graban en la capa 630. La capa 630 es la capa superior de una celda de flujo de dos capas tal como se puede ver en la Figura 6E (con la capa inferior 620). Es posible grabar los orificios (en los que fluidos o reactivos ingresan en los canales de la celda de flujo) y los canales en la capa 630 mediante un proceso tridimensional tal como los disponibles de Invenios (Santa Barbara, CA). La capa superior 630 puede comprender Foturan, el que, tal como se describe, se puede grabar con luz UV. Cuando se expone a luz UV, Foturan cambia de color y se vuelve ópticamente opaco (o pseudoopaco). Por lo tanto, en la Figura 6B, se enmascaró la capa 630 y se expuso a luz para producir áreas oscurecidas 610 en la capa (de forma similar al enmascaramiento en la Figura 5A, pero sin grabado adicional). Tales áreas ópticamente opacas pueden ayudar a bloquear luz con orientación errónea, dispersión de luz u otros reflejos no deseables que, de lo contrario, podrían afectar la calidad de la lectura de secuencia de la presente. A efectos descriptivos, se deposita opcionalmente una capa delgada (por ejemplo, 100-500 nm) de un metal, tal como cromo o níquel, entre las capas de la celda de flujo (por ejemplo, entre las capas superior e inferior en la Figura 6E) para ayudar a bloquear la dispersión de luz no deseada. Las Figuras 6C y 6D ilustran el acoplamiento de la capa inferior 620 con la capa de canales 630 y la Figura 6E muestra una vista de corte de estas.
A efectos descriptivos, las capas de las celdas de flujo se unen entre sí en una variedad de formas diferentes. Por ejemplo, las capas se pueden unir mediante adhesivos, enlaces (por ejemplo, térmicos, químicos, etc.) y/o métodos mecánicos. Los expertos en la técnica conocerán diversos métodos y técnicas para unir varias capas de vidrio, plástico o silicio entre sí.
Nuevamente, aunque en la presente se describen diseños y construcciones de celdas de flujo particulares, no se deben interpretar tales descripciones como taxativas. Otras celdas de flujo pueden comprender materiales y diseños diferentes a los incluidos en la presente y/o se pueden crear mediante técnicas de grabado o corte diferentes u otros métodos de creación diferentes a aquellos descritos en la presente.
Flujo de fluido
En las diversas realizaciones de la presente, los reactivos, amortiguadores, etc. que se utilizan en la secuenciación de los ácidos nucleicos se regulan y se suministran mediante un aspecto o subsistema de flujo de fluido. Las Figuras 7A-C presentan diagramas generales de ejemplos de arreglos de flujo de fluido de la invención configurados en configuraciones para empuje unidireccional, atracción en ocho direcciones y atracción unidireccional, respectivamente. En general, el subsistema de flujo de fluido transporta los reactivos adecuados (por ejemplo, enzimas, amortiguadores, tintes, nucleótidos, etc.) a la velocidad adecuada y, opcionalmente, a la temperatura adecuada desde las áreas de almacenamiento de reactivo (por ejemplo, botellas u otros recipientes para almacenamiento) a través de la celda de flujo y, opcionalmente, a un área de recepción de desechos.
El aspecto de flujo de fluido se controla opcionalmente por computadora y puede controlar opcionalmente la temperatura de los diversos componentes reactivos. Por ejemplo, opcionalmente, se mantienen determinados componentes a temperaturas bajas, tales como 4°C +/-1°C (por ejemplo, en el caso de soluciones que contienen enzimas), mientras que otros reactivos se mantienen opcionalmente a temperaturas elevadas (por ejemplo, amortiguadores que fluirán a través de la celda de flujo cuando se produzca una reacción enzimática particular a la temperatura elevada).
En algunas realizaciones, se mezclan opcionalmente varias soluciones antes de que fluyan a través de la celda de flujo (por ejemplo, un amortiguador concentrado mezclado con un diluyente, nucleótidos adecuados, etc.). El aspecto de flujo de fluido de la invención también controla opcionalmente tal mezcla y regulación. Es beneficioso que la distancia entre los fluidos mezclados y la celda de flujo se minimice en varias realizaciones. Por consiguiente, es posible colocar la bomba posteriormente a la celda de flujo y utilizarla para atraer los reactivos al interior de la celda de flujo (Figura 7B y 7C), en lugar de hacer que la bomba empuje los reactivos al interior de la celda de flujo (tal como en la Figura 7A). Tales configuraciones de atracción significan que cualesquiera materiales atrapados en volúmenes muertos en la bomba no contaminan la celda de flujo. La bomba puede ser una bomba tipo jeringa y se puede configurar para tener una jeringa por canal de flujo para garantizar el flujo uniforme a través de cada canal de la celda de flujo. La bomba puede ser una bomba de 8 direcciones si se desea utilizar una celda de flujo de 8 direcciones, tal como, por ejemplo, una bomba de jeringa de 8 direcciones Kloehn (Kloehn, Las Vegas, NV). En la Figura 7B se muestra un diagrama de flujo de una configuración de atracción de 8 direcciones. En la Figura 7A, los reactivos fluidos se almacenan en recipientes para reactivos 700 (por ejemplo, amortiguadores a temperatura ambiente, amortiguador SSC 5X, amortiguador de enzimología, agua, amortiguador de escisión, etc.) y 710 (por ejemplo, recipientes refrigerados para enzimas, mezclas de enzimas, agua, mezcla de análisis, etc.). La bomba 730 desplaza los fluidos desde los recipientes para reactivos a través de la válvula740, válvula de desechos/cebado 770 y hacia el interior o a través de la celda de flujo 760.
En la Figura 7B, los reactivos fluidos se almacenan en recipientes para reactivos 702 (por ejemplo, amortiguadores a temperatura ambiente similares a los anteriormente enumerados) y 703 (por ejemplo, recipientes refrigerados para enzimas, etc. similares a los anteriormente mencionados) vinculados mediante la válvula para reactivos 701. Los expertos en la técnica conocen válvulas multidireccionales (tales como las válvulas para reactivos) utilizadas para
permitir el acceso controlado desde o hacia múltiples líneas o recipientes. La válvula para reactivo se vincula con la celda de flujo 705 a través de una válvula de cebado opcional (o válvula de desechos) 704 conectada a una bomba de cebado opcional 706. Opcionalmente, la bomba de cebado puede extraer reactivos de los recipientes a través de la tubería para que estén prontos para su uso en la celda de flujo. Por lo tanto, se evitarán reactivos a temperatura equivocada sin circulación (por ejemplo, debido a estar estacionados dentro de la tubería), etc. Cuando la bomba de cebado realiza la extracción, se deriva el flujo saliente al área de desecho. Durante acciones no de cebado, es posible atraer los reactivos a través de la celda de flujo con una bomba de 8 canales 707 que se conecta a un depósito de desechos 708.
En cualquier realización (empuje o atracción), las configuraciones para fluidos pueden comprender tubos de absorción o similares que se extienden hacia el interior de varios recipientes para reactivos con el fin de extraer los reactivos de los recipientes. La Figura 7C muestra una bomba con un único canal, en lugar de una bomba de 8 canales. La bomba con un único canal 726 también puede actuar como la bomba de cebado opcional y, por lo tanto, la bomba de cebado o válvula de desechos 723 se puede conectar directamente a la bomba 726 a través de una derivación 725. El arreglo de los componentes es similar en esta realización al de la Figura 7B. Por lo tanto, comprende recipientes para reactivos 721 y 722, una válvula de selección multidireccional 720, una celda de flujo 724, etc.
Cualquiera de una variedad de tipos de bombas (por ejemplo, de desplazamiento positivo/negativo, de vacío, peristálticas, etc.), tales como una bomba Encynova® 2-1 (Encynova, Greeley, CO) o una bomba de jeringa Kloehn® V3 (Kloehn, Las Vegas, NV), puede guiar opcionalmente el flujo de fluido en sí mismo. Nuevamente, se observará que no se debe interpretar la mención específica de bombas particulares, etc. en la presente como necesariamente limitante y varias realizaciones pueden comprender bombas y/o tipos de bombas diferentes a los mencionados en la presente. En determinadas realizaciones, la tasa de suministro de fluido es de alrededor de 50 µL a alrededor de 500 µL/min (por ejemplo, +/-2 µL controlada) para los 8 canales. En la configuración de atracción en 8 direcciones, el flujo puede ser de 10-100 µl/min/canal conforme al proceso. En algunas realizaciones, el volumen máximo de reactivos de nucleótidos requerido para la secuenciación de un polinucleótido de 25 bases es de alrededor de 12 mL.
Independientemente del tipo de bomba que se utilice en la presente, los reactivos se transportan opcionalmente desde sus áreas de almacenamiento a la celda de flujo a través de tubería. Tal tubería, tal como PTFE, se puede seleccionar para, por ejemplo, minimizar la interacción con los reactivos. El diámetro de la tubería puede variar entre realizaciones (y/u opcionalmente entre áreas de almacenamiento de reactivos diferentes), pero se puede seleccionar, por ejemplo, con base en el deseo de reducir el volumen muerto o la cantidad de fluido remanente en las líneas. Asimismo, el tamaño de la tubería puede variar opcionalmente entre áreas de una vía de flujo. Por ejemplo, el tamaño de la tubería de un área de almacenamiento de reactivos puede tener un diámetro diferente al del tubo de la bomba a la celda de flujo, etc.
El subsistema de flujo de fluido de la invención también puede controlar la velocidad de flujo de los reactivos implicados. Opcionalmente, la velocidad de flujo se puede ajustar para cada vía de flujo (por ejemplo, algunas vías de flujo pueden proceder a velocidades de flujo mayores que otras, se pueden invertir las velocidades de flujo, canales diferentes pueden recibir flujos de reactivos diferentes o tener flujos de reactivos en momentos diferentes, etc.). La velocidad de flujo se puede fijar junto con el diámetro de tubo para cada vía de flujo con el fin de tener el volumen adecuado de reactivo, etc., en la celda de flujo en un momento dado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la tubería a través de la que fluyen los reactivos tiene un ID de 0,3 mm, 0,5 mm o 1,0 mm, al tiempo que la velocidad de flujo es de 480 µL/min o 120 µL/min. En algunas realizaciones, la velocidad de flujo se equilibra opcionalmente para optimizar las reacciones de interés. Un flujo elevado puede despejar de forma eficiente las líneas y minimizar el tiempo dedicado al cambio de reactivos en un volumen de celda de flujo dado, pero también puede provocar un nivel mayor de flujo de corte en la superficie de sustrato y puede generar un mayor problema con pérdidas o burbujas. En algunas realizaciones, una velocidad de flujo usual para la introducción de reactivos puede ser de 15 αµl/min/canal.
Además, se puede equipar el sistema con sensores de presión que detectan e informan automáticamente rasgos del rendimiento de fluidos del sistema, tal como pérdidas, obstrucciones y volúmenes de flujo. Tales sensores de presión
o flujo pueden ser útiles para el mantenimiento de instrumentos y la resolución de problemas. Uno o más componentes informáticos, por ejemplo, tal como se describe más adelante, pueden controlar el sistema de fluidos. Se observará que las configuraciones de flujo de fluido en las diversas realizaciones de la invención pueden variar, por ejemplo, en lo que respecta a la cantidad de recipientes para reactivos, composición, diámetro o extensión de la tubería, tipos de bombas y válvulas de selección, etc.
Calefacción/refrigeración
En algunas realizaciones, los sistemas de la presente comprenden un componente de control de calefacción/refrigeración con capacidad de calefacción/refrigeración, por ejemplo, mediante dispositivos de Peltier, etc. Opcionalmente, es posible calentar los diversos componentes de la presente (por ejemplo, la celda de flujo y sus contenidos) mediante un elemento de calefacción resistivo y enfriarlos mediante convección para crear condiciones de reacción por encima de la temperatura ambiente. Dichos componentes de calefacción/refrigeración pueden
controlar la temperatura de las celdas de flujo (y los fluidos en su interior) durante las diversas reacciones necesarias en la secuenciación mediante síntesis. Se muestra en la Figura 8 un ejemplo de sistema de control de temperatura de celda de flujo (aislado de los demás componentes del sistema). En la Figura 8, se ilustra un ventilador de Peltier 800 respecto a un disipador térmico 810 y un componente de calefacción Peltier 820. Opcionalmente, el componente de calefacción/refrigeración se puede ubicar y/o mover respecto a los demás componentes del sistema (por ejemplo, la celda de flujo y el soporte de la celda de flujo, etc.). Por lo tanto, es posible colocar el componente de calefacción/refrigeración en el lugar necesario (por ejemplo, para elevar la temperatura de los reactivos en la celda de flujo para permitir la actividad enzimática, etc.) y alejarlo cuando no es necesario. De manera adicional y/o alternativa, se puede mover la celda de flujo o soporte de celda de flujo opcionalmente respecto al componente de calefacción/refrigeración. Vea las Figuras 10A y 10B más adelante. En varias realizaciones, los elementos de control de temperatura controlan la temperatura de la celda de flujo, por ejemplo, de alrededor de 20°C a alrededor de 60°C
o cualquier otra temperatura o rango de temperatura según sea necesario para que las reacciones se produzcan en los sistemas o dispositivos. Se puede ajustar la temperatura del elemento de calefacción para controlar la temperatura de la celda de flujo y los reactivos en esta. Cuando la celda de flujo se expone a un flujo de reactivos refrigerados, la temperatura del elemento de calefacción puede ser mayor que la temperatura deseada en la superficie de la celda de flujo. Por ejemplo, se puede configurar el elemento de calefacción a 55°C para obtener una temperatura de celda de flujo de 45°C.
Los expertos en la técnica conocen los dispositivos de Peltier utilizados para controlar la temperatura (los que se pueden usar opcionalmente en los sistemas de la presente). Nuevamente, se observará que se mencionan determinados dispositivos de calefacción/refrigeración en la presente, los que no se deben interpretar como necesariamente limitantes. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, la presente invención opcionalmente comprende dispositivos de calefacción/refrigeración diferentes a dispositivos de Peltier. En realizaciones usuales, independientemente del tipo de dispositivo, el componente informático (vea más adelante) controla opcionalmente el dispositivo de calefacción/refrigeración (por ejemplo, en términos de temperatura, tiempo a temperaturas particulares, movimiento del componente y/o movimiento de otros dispositivos, tales como el soporte de celda de flujo para el componente de calefacción/refrigeración).
En algunas realizaciones, elementos de calefacción/refrigeración adicionales pueden regular opcionalmente la temperatura de otros componentes además de la celda de flujo o como alternativa a esta. Por ejemplo, los componentes de calefacción/refrigeración puede regular opcionalmente la temperatura de la cámara, los depósitos de reactivos, los que se pueden enfriar, por ejemplo, a 4°C, para extender la vida útil de los reactivos durante operaciones de secuenciación largas, la temperatura de la atmósfera dentro del instrumento, etc.
Múltiples celdas de flujo y enfoques de calefacción/refrigeración y TIRF alternativos
En determinadas realizaciones de la presente, los sistemas o dispositivos pueden comprender enfoques adicionales de configuración de celda de flujo, iluminación mediante TIRF, configuraciones de calefacción/refrigeración de las celdas de flujo y de cómo se mantienen o se estabilizan las celdas de flujo en el dispositivo. Aunque es posible emplear opcionalmente estos enfoques en conjunto en determinadas realizaciones, se observará que es posible emplear cada uno en cualquier combinación, por ejemplo, entre sí, con cualesquiera otros enfoques descritos en la presente, etc.
A efectos descriptivos, las celdas de flujo de la presente pueden ser celdas de flujo con flujo inferior. Por lo tanto, en oposición a las celdas de flujo, por ejemplo, tal como se muestra en las Figuras 4, 6 y 9 en las que las celdas de flujo se fijan y el flujo de fluido ingresa desde la parte superior de la celda de flujo, algunas celdas de flujo pueden comprender configuraciones que permiten el ingreso de flujo de fluido desde el fondo de la celda de flujo. Dichas celdas de flujo inferiores pueden tener construcción y composiciones similares a las celdas de flujo con flujo superior. Las celdas de flujo con flujo inferior pueden comprender menos volumen muerto de fluido (y utilizar más de la extensión del canal completo que las celdas de flujo con flujo superior, por ejemplo, dado que los extremos de las celdas de flujo no se cubren con abrazaderas/colectores, etc.). Vea, por ejemplo, las Figuras 44-49.
Opcionalmente, se pueden mantener las celdas de flujo con flujo inferior en el soporte de celda de flujo mediante vacío en lugar de abrazaderas. Por lo tanto, un vacío puede mantener la celda de flujo en la posición correcta en el dispositivo para iluminación y obtención de imágenes correctas. Cf, Figuras 44-49 y Figura 9. Por lo tanto, a efectos descriptivos, uno o más dispositivos de creación de vacío para crear un vacío (o vacío parcial, etc.) para mantener la celda de flujo y/o prisma en el soporte de celda de flujo, plataforma XY, etc.
Se muestran varios ejemplos de colectores de soporte de celda de flujo en la Figura 46 que se pueden utilizar con celdas de flujo con flujo inferior. Tal como se puede ver, se dirigen los fluidos que fluyen hacia el interior, a través o hacia el exterior de la celda de flujo a través de varios tubos ramificados en los colectores desde o hacia canales específicos en la celda de flujo. Nuevamente, tales realizaciones pueden opcionalmente no obstruir nada (o sustancialmente nada) de la superficie superior de la celda de flujo que puede interferir con la iluminación o la obtención de imágenes de la extensión total de los canales. La Figura 47 ilustra un ejemplo de válvula de fluido. Tal válvula no tiene partes móviles o vibraciones y tiene un volumen muerto bajo. En tales arreglos, cada botella o recipiente para reactivos puede tener una válvula de apertura/cierre. Luego de extraer un fluido, se puede inyectar aire antes de cerrar la válvula del depósito, de forma de forzar una válvula de espacio para aire entre los reactivos.
En caso de un cierre del sistema, se pueden devolver reactivos refrigerados a sus depósitos y todos los reactivos. Además, se puede agregar una bomba de inyección a la bomba de empuje/atracción (por ejemplo, una bomba Kloehn).
Otro enfoque de iluminación puede comprender iluminación descendente. Tal enfoque descendente puede ser útil cuando se utiliza en conjunto con prensado con vacío (y control de temperatura inferior). Opcionalmente, la iluminación desde la parte inferior (por ejemplo, tal como en la Figura 1, etc.) puede ser problemática en configuraciones con prensado con vacío y control de temperatura inferior debido a que tales realizaciones a menudo emplean el espacio debajo de la celda de flujo. Tal como se puede ver en la Figura 44, la iluminación descendente o lateral ilumina desde arriba el prisma 4401 sobre el que se encuentra la celda de flujo 4402 (y, opcionalmente, se fija en el lugar mediante vacío). Además, tal arreglo puede ayudar a evitar que la celda de flujo se arquee, cuya presentación puede favorecer el autofoco y la obtención de imágenes de campo plano y puede ayudar en la configuración con múltiples celdas de flujo con lecturas simultáneas, etc. También se muestra la incidencia de la iluminación con láser 4400 en el prisma en la Figura 44, al igual que el espejo 4405 y el colector o conector de fluidos 4404.
La Figura 45 muestra otro enfoque de control termodinámico de una celda de flujo (y los reactivos y las reacciones en esta). La Figura 45 muestra un ejemplo de realización de un dispositivo con temperatura controlada inferior. En algunas de dichas realizaciones, el aspecto puede comprender una mesada refrigerada con agua que puede ayudar a garantizar la estabilidad dimensional durante ciclos de lectura y temperatura de amortiguador de análisis controlada. Una placa térmica se puede extender más allá del prisma y la celda de flujo y debajo de los colectores para, opcionalmente, el control de temperatura uniforme. Opcionalmente, es posible precalentar los fluidos cuando pasan a través del colector de entrada. Además, una respuesta de temperatura de RTD se puede insertar en la parte superior del prisma para garantizar que la celda de flujo se encuentre a la temperatura configurada deseada y que se minimicen los efectos de resistencia térmica del prisma.
Se muestran configuraciones con múltiples celdas de flujo en un soporte de celda de flujo en la Figura 48. Tal como se puede ver, es posible cargar hasta cuatro celdas de flujo en el soporte en la Figura 48A (o dos celdas de flujo de doble ancho, por ejemplo, cada una con 18-20 canales). Los dispositivos de Peltier u otros dispositivos similares se pueden encontrar debajo de las celdas de flujo y, opcionalmente, se pueden refrigerar con agua mediante el aspecto de mesada de soporte (la que, opcionalmente, se puede mantener a temperatura ambiente).
Soporte de celda de flujo y plataforma
Se controlan y se garantizan la ubicación y el movimiento de la celda de flujo (y, por lo tanto, los ácidos nucleicos a secuenciar), por ejemplo, mediante una plataforma móvil en la que se ubican la celda de flujo y el soporte de celda de flujo (u otro sustrato). Tal plataforma móvil puede, opcionalmente, permitir el movimiento de la celda de flujo respecto a la iluminación láser y el lente objetivo para la lectura de reacciones de secuenciación en los canales. Si se deseara, es posible refrigerar activamente la plataforma de análisis u otros componentes durante el ciclo de análisis para controlar la temperatura del sustrato durante los ciclos de obtención de imágenes.
Los paneles A a D de la Figura 9 muestran diagramas esquemáticos de un ejemplo de soporte de celda de flujo del sistema actual. La Figura 9A muestra el soporte de celda de flujo 900 antes de que se coloque una celda de flujo sobre este. Tal como se puede observar, el soporte comprende abrazaderas ajustables 910 (opcionalmente accionadas por resortes) para fijar de forma segura la celda de flujo al soporte y, opcionalmente, uno o más colectores (por ejemplo, opcionalmente en las abrazaderas) para conectar de forma fluida los canales de la celda de flujo al resto del sistema de fluidos. Un colector se puede conectar individualmente a cada uno de los canales en paralelo. De manera alternativa, un colector puede conectar los canales de forma que se conecten mediante una única línea de entrada que se divide para fluir en paralelo a cada canal o se puede configurar como una configuración de serpentina para producir un único flujo de fluido. Tal colector se puede configurar para contener una única división 1-8 o puede comprender un divisor binario, en donde cada canal de fluido se divide solamente en 2 para obtener una división de 1-2-4-8 con el fin de obtener un flujo más uniforme a lo largo de los 8 canales. En la configuración de atracción en 8 direcciones, el colector de salida desde la celda de flujo puede comprender 8 puertos individuales, cada uno conectado a un barril de una bomba de jeringa de 8 direcciones, al tiempo que el colector de entrada puede contener un único tubo de entrada para reducir la extensión de tubo necesaria para llenar la celda de flujo. El colector de entrada puede contener un divisor 1-8 o un divisor 1-2-4-8 binario para dividir el flujo de forma equitativa en cada uno de los 8 canales. La Figura 9B también muestra la presencia de un prisma ajustable 920 que se puede elevar o hacer descender opcionalmente para ponerlo en contacto con el lado inferior de la celda de flujo. El prisma se usa en conjunto con los láseres en la actividad de TIRF. En realizaciones particulares, se coloca aceite (por ejemplo, aceite de inmersión tal como el disponible de Cargille, n.o de catálogo 19 750 o similar) entre el prisma y la celda de flujo en una capa uniforme y continua para generar reflexión interna total en la capa de aire entre el prisma y el vidrio de la celda de flujo. La Figura 9C muestra la ubicación de la celda de flujo 930 en el soporte y el prisma, y la Figura 9D muestra la celda de flujo fijada al soporte de celda de flujo con la introducción de una agarradera/abrazadera 940 para fijar las abrazaderas y la celda de flujo.
La celda de flujo y el soporte de celda de flujo se pueden ubicar sobre una plataforma o plataforma móvil. Opcionalmente, tal plataforma se puede ajustar opcionalmente a lo largo de los ejes X, Y y Z. Esto hace posible
ajustar la ubicación y altura con precisión de la celda de flujo respecto a los láseres, cámara, lentes ópticos, etc. y permite mantener la superficie de la celda de flujo en foco respecto al dispositivo para obtener imágenes. Asimismo, la plataforma móvil puede permitir opcionalmente el desplazamiento de la celda de flujo en ambas direcciones entre el componente de calefacción/refrigeración y los componentes láser/ópticos (es decir, para permitir las reacciones enzimáticas cuando se calienta y para cuantificar el resultado de tales reacciones con los componentes láser/cámara). La Figura 10 muestra fotografías que ilustran el movimiento de la celda de flujo 1020 y el soporte de celda de flujo 1010 entre el elemento de calefacción/refrigeración (imagen a la izquierda) y los elementos láser/cámaras (imagen a la derecha). Por lo tanto, los componentes x e y pueden permitir el movimiento lateral (por ejemplo, decenas de centímetros) de la celda de flujo, al tiempo que se puede ajustar la altura (por ejemplo, decenas de centímetros) verticalmente para permitir el enfoque de las imágenes. De manera alternativa, la plataforma también puede ser simplemente una plataforma XY sin configuración vertical y el lente objetivo se puede ajustar en el plano Z para garantizar que se mantenga el enfoque. Se observará que los elementos de calefacción/refrigeración también son opcionalmente móviles, por ejemplo, para acercarse más a la celda de flujo, etc. Cf., la imagen a la izquierda de la Figura 10 (dispositivo de calefacción/refrigeración elevado) y la imagen a la derecha de la Figura 10 (dispositivo de calefacción/refrigeración que se acerca a la celda de flujo).
La Figura 10A muestra una fotografía del instrumento antes de la etapa de calentamiento y durante esta. El dispositivo de Peltier 1000 (el que comprende un ventilador 1001, un disipador térmico 1002 y una unidad de calefacción 1003) se desplaza en dirección vertical para ponerse en contacto con la celda de flujo 1020 y el soporte de celda de flujo 1010 colocado en la plataforma XY 1050. Se introducen reactivos en la celda de flujo a través del tubo 1040. La celda de flujo se puede desplazar a una posición ubicada bajo la cámara 1030 para obtener imágenes. En la Figura 10B se ilustra una representación esquemática del dispositivo en la ubicación para obtener imágenes, en la que el dispositivo de Peltier 1070 se encuentra en posición elevada (con el ventilador 1071, disipador térmico 1072 y el dispositivo de calefacción 1073), la celda de flujo 1085 y la plataforma 1086 se ubican junto al soporte de fibra óptica 1090 y debajo del lente objetivo 1080. El soporte de fibra óptica se conecta a la plataforma Z 1075, la que también controla la altura del lente objetivo 1080. Se fija la celda de flujo en el soporte de celda de flujo mediante el colector/agarradera 1095.
De manera adicional, se observará que los diversos componentes de la presente, por ejemplo, componentes láser, componentes de calefacción/refrigeración, etc., se disponen usualmente en una estructura, chasis o marco y, opcionalmente, se encierran dentro de una cubierta que cubre total o parcialmente el instrumento. La configuración particular de tal marco y/o cubierta puede variar opcionalmente en realizaciones diferentes con base, por ejemplo, en los componentes particulares, su tamaño, etc. En realizaciones usuales, sin embargo, el marco mantiene seguros los diversos componentes y en la ubicación y la orientación adecuadas, al tiempo que opcionalmente favorecen el desplazamiento de los componentes cuando es necesario. El marco debería ser lo suficientemente rígido para evitar vibraciones en el instrumento y los diversos componentes. Por ejemplo, el movimiento puede impedir el codificador de modo y se puede aislar por vibración de la plataforma para evitar la agitación de la celda de flujo durante la obtención de imágenes. La Figura 11A muestra un esquema que ilustra un ejemplo de estructura que da soporte a la cámara (1100), componentes de calefacción/refrigeración 1110 (cf., Figura 8), la celda de flujo y el soporte de celda de flujo, y la plataforma móvil 1120. Aspectos adicionales de marco y soporte que ayudan a unir los varios componentes y aspectos del dispositivo o sistema incluyen varios puntos o ubicaciones de fijación y alineación que se pueden ver en la Figura 11B, la que muestra el cojinete de deslizamiento para ajuste vertical de la pieza láser 1165 y el componente de ajuste de nivelación de la celda de flujo 1175. Se pueden ver otros marcos y cubierta, lo que incluye cubiertas externas (carcasas) para la cubierta, en la Figura 12 junto con un monitor para computadora 1201.
Excitación y observación
Se realiza un seguimiento de la incorporación de bases de ácidos nucleicos específicas con sus fluorescencias específicas mediante excitación con láser y observación con cámara. La iluminación se lleva a cabo con reflexión interna total (TIR) que comprende un componente láser. Se entenderá que «láser TIRF», «sistema de láser TIRF», «láser TIR» y otra terminología similar en la presente hace referencia a un sistema o instrumento de detección con base en TIRF (fluorescencia de reflexión interna total), por ejemplo, láseres u otros tipos de excitación no láser de fuentes tales como lámparas LED, de halógeno y xenón (las cuales se incluyen todas en la presente descripción de TIRF, láser TIRE, sistema de láser TIRF, etc.). Por lo tanto, un láser TIRF es un láser que se utiliza con un sistema de TIRF, mientras que un sistema de láser TIRF es un sistema de TIRF que utiliza un láser, etc. Sin embargo, se debería entender que los sistemas TIRF de la presente (incluso cuando se describen en términos de uso de láser, etc.) incluyen aquellos instrumentos o sistemas de TIRF que comprenden fuentes de excitación no láser. Los expertos en la técnica conocerán aspectos diferentes de sistemas de TIRF y su uso general. En varias realizaciones, el componente de cámara comprende una cámara de CCD. En algunas realizaciones, el láser comprende láseres semiconductores y/o de estado sólido de 50 mW a 500 mW individualmente modulados duales acoplados a un prisma de TIRF, opcionalmente con longitudes de onda de excitación de 532 nm y 660 nm. El láser se puede acoplar en el instrumento mediante una fibra óptica para ayudar a garantizar que las huellas de los dos láseres se enfoquen en la misma área del sustrato (es decir, se superpongan).
Codificación de modo
Usualmente, se desea que el área en donde los láseres u otras fuentes de excitación iluminan la muestra (se hace referencia al área de iluminación como la huella) sea espacialmente plana y uniforme. Los sistemas o dispositivos de la presente se benefician de las propiedades de fibras multimodales que permiten la propagación de todos los modos ópticos a través de sus núcleos con prácticamente la misma amplitud para producir una huella de iluminación de perfil plano desde el láser en la superficie de sustrato iluminada (por ejemplo, la superficie de una celda de flujo), etc. Sin embargo, la cantidad finita de modos presentes en dichas fibras puede interferir de forma constructiva y destructiva entre estos y producir mínimos y máximos locales en el perfil de intensidad del láser (u otra luz). Vea, por ejemplo, las Figuras 33A y 34A que muestran mínimos y máximos producidos por la emisión no corregida de fibras multimodales. Con el fin de mejorar dicho problema, se produce una huella sustancialmente uniforme con codificación de modo dinámica mediante el cambio constante del índice de refracción en el haz de iluminación, por ejemplo, mediante la modulación del haz con una lámina de onda o mediante agitación, constricción o compresión de una o más áreas de una fibra que porta el haz de iluminación. Por lo tanto, se producen una emisión plana sustancialmente uniforme (es decir, una huella de excitación/iluminación sustancialmente uniforme desde una fuente de luz o láser) mediante la codificación dinámica de los modos en un haz de iluminación, por ejemplo, mediante la contracción/compresión de una fibra que porta el haz en una o más áreas en su extensión. Las Figuras 33 y 34 resumen varias realizaciones de codificación de modo, tal como se describe en la presente. Remitirse al texto a continuación.
Codificación de modo dinámica y configuración de haces con poca pérdida
En determinadas realizaciones, los dispositivos de la presente comprenden componentes para producir una iluminación plana, por ejemplo, una iluminación uniforme o sustancialmente uniforme en una huella de iluminación particular, tal como se ve en la Figura 35. Tales realizaciones comprenden uno o más aspectos que modifican de forma dinámica el índice de refracción en el medio que transmite la iluminación (por ejemplo, una fibra) en uno o más nodos. Por ejemplo, una fibra se puede comprimir en varias ubicaciones a lo largo de su extensión para inducir índice de refracción que cambia de forma continua. Tal compresión de la fibra, por ejemplo, una fibra con salto de índice, se puede utilizar para codificar espacial o temporalmente los modos en la fibra para provocar suficiente superposición durante un período de integración deseado de la iluminación emitida. Tal como se explica en la presente (vea más adelante) también se puede agitar, rotar, hacer vibrar o deformar físicamente de otra forma la fibra para cambiar la vía óptica a través de la fibra.
En general, la codificación dinámica de los modos en las fibras hace posible lograr una iluminación espacialmente uniforme en un período de integración mínimo definido por el usuario. Esto evita la interferencia de modos de propagación de luz monocromática en fibras multimodales, lo que produciría patrones de luz y oscuridad en el haz resultante. Opcionalmente, es suficiente que estos modos desaparezcan durante el período de integración mínimo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las longitudes de vías relativas de dichos modos en el haz de iluminación varían rápidamente con la introducción de variaciones de índice y curvatura variable en función de tiempo en la fibra, por ejemplo, mediante medios mecánicos.
Se observará que, opcionalmente, se pueden variar múltiples parámetros de la codificación de modo dinámica o pueden comprender una gama de configuraciones diferentes. Sin embargo, en general, la codificación de modo dinámica comprende uno o más aspectos o componentes utilizados para cambiar de forma dinámica el índice de refracción de un haz de iluminación con el fin de compensar una huella de iluminación final. Aunque muchos conceptos ópticos de refracción existentes requieren un haz gaussiano de entrada y, a menudo, los conceptos ópticos de difracción existentes dependen de la longitud de onda, la presente realización no requiere una entrada de haz gaussiano y es independiente de la longitud de onda.
Se desea un campo iluminado de manera uniforme para la excitación (medida de las reacciones de secuenciación, etc. Por lo tanto, los patrones de luz y oscuridad asimétricos producidos por la interferencia de modos de propagación de luz monocromática en una fibra multimodal suelen no ser deseables. La compensación de la emisión de luz sobre una huella de iluminación (durante un período de tiempo de observación, tal como el tiempo captado por una cámara durante una obtención de imágenes) para permitir la integración de la luz implica que los patrones de luz y oscuridad «desaparecen» o se compensan y, por lo tanto, la intensidad de excitación observada por cada fluoróforo en la superficie debería ser uniforme.
La codificación de modo dinámica subyacente es la variación constante del índice de refracción en un punto o nodo del haz de luz en función de tiempo (por ejemplo, mediante la compresión física de una fibra durante un período de tiempo), lo que provoca la codificación de la luz y que tome vías diferentes, por lo que compensa la emisión de luz en la huella de iluminación. Por lo tanto, la posición de los mínimos y máximos de interferencia cambia al cambiar el índice de refracción del haz de entrada. Si el índice de refracción cambiara a una frecuencia más rápida que el tiempo de adquisición de imágenes, entonces se podría producir una imagen espacialmente uniforme en la escala de tiempo de la observación.
Se entenderá que no se debe confundir esto con el uso común de «codificación de modo» que más usualmente hace referencia a la aleatorización de un modo o modos de entrada respecto a la emisión. La función deseada de la
presente realización es la de aleatorizar temporal y espacialmente modos, es decir, producir la codificación dinámica.
También se puede emplear la codificación de modo dinámica en conjunto con fibras que comprenden núcleos de formas particulares para lograr una forma de haz con iluminación uniforme. Por ejemplo, la compresión de una fibra con un núcleo cuadrado producirá un haz cuadrado con iluminación uniforme. Se puede dar forma al haz a lo largo del eje particular para producir una forma rectangular u oval, y la imagen de dicho haz es cuadrada o circular cuando incide en la superficie para obtener imágenes. Vea las Figuras 17-18. Por ejemplo, los haces rectangulares se pueden generar a partir de fibras ópticas, tal como se ilustra en la Figura 34.
La Figura 35 muestra la emisión óptica de una variedad de láseres, fibras y aspectos de codificación de modo diferentes, etc. Durante la operación del dispositivo, se obtuvieron nuevas imágenes de los extremos de las fibras en un perfilador de haces. La Figura 35 muestra el efecto de la codificación de modos dinámica (es decir, mediante la manipulación de las fibras en uno o más nodos, por ejemplo, con accionadores piezoeléctricos) mediante la comparación de las imágenes de láseres a longitudes de onda diferentes (por ejemplo, 532 nm y 550 nm) y tiempos de láser (estado sólido y diodo) en conjunto con dispositivos de forma de haz diferentes (dos versiones de rectángulos y un círculo) al ilustrar la emisión cuando se activa la codificación de modo dinámica contra la emisión de luz cuando la codificación de modo no se encuentra activada para cada tipo de láser, etc.
En el sistema tal como se reivindica, el índice de refracción se modifica de forma dinámica para obtener una huella de iluminación sustancialmente uniforme. La variación dinámica del índice de refracción provoca la superposición de los modos en el período de tiempo de integración deseado. El índice de refracción se modifica constantemente en una o más ubicaciones (nodo). Por ejemplo, se comprime constantemente una fibra que transmite la iluminación en un punto con un grado variable de intensidad (por ejemplo, de sin compresión a compresión máxima y otra vez). Tal compresión puede deformar temporalmente la fibra, de manera que su forma cambie de un círculo a una elipsis a un círculo, etc., lo que, a su vez, cambia el índice de refracción. En cuanto se detiene la compresión, se detiene la codificación de modo.
La eficiencia de la compensación de la emisión de iluminación en una huella depende de la extensión de la captura de imagen, el grado de cambio del índice de refracción, el tipo/potencia de la fuente de luz, etc. Por lo tanto, es una variable que puede controlar el usuario y no se debería tomar necesariamente como limitante. Opcionalmente, el usuario puede controlar el grado de codificación para ajustar con precisión la compensación de la emisión de luz en una huella.
Por lo tanto, el período de tiempo durante el cual se mide la compensación de la emisión de luz es variable, por ejemplo, puede ser el período durante el que se capta una imagen del área iluminada por la emisión de luz (por ejemplo, mosaicos (áreas de captura de imagen específicas) en las celdas de flujo en determinadas realizaciones de secuenciación de la presente). En determinadas realizaciones, el período de tiempo de eficiencia de codificación es equivalente o sustancialmente equivalente al período de exposición para cada imagen captada por una cámara (por ejemplo, la cámara de CCD en realizaciones de secuenciación particulares de la presente). Se observará que tales tiempos de exposición pueden variar entre realizaciones, por ejemplo, de menos de 1 milisegundo a más de 1 hora o más conforme a los requisitos particulares de la modalidad (por ejemplo, al menos 1, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 o más microsegundos; al menos 1, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 o más milisegundos; al menos 1, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 o más segundos, etc.). En el caso de las reacciones de secuenciación descritas en la presente, el tiempo de obtención de imágenes puede ser de 50-500 milisegundos por exposición.
En varias realizaciones, se puede utilizar el dispositivo de codificación de modo dinámica actual puede, independientemente del sistema general con el que se use, con tipos/fuentes de luz diferentes, medios de haz diferentes, formas diferentes para cambiar el índice de refracción, cantidades diferentes de nodos en los que se cambia el índice de refracción, etc.
La iluminación/luz particular utilizada no limita la codificación de modo dinámica. Por lo tanto, por ejemplo, aunque varias realizaciones de la presente emplean opcionalmente láseres de longitud de onda particular (por ejemplo, 532 y/o 660 nm), otras realizaciones pueden emplear iluminación de longitud de onda completamente diferente. Los láseres utilizados con codificación de modo dinámica pueden ser, por ejemplo, láseres IR, láseres de alineación estrecha, láseres de ancho de línea amplios, etc. Nuevamente, aunque se mencionan longitudes de onda de láseres particulares en la presente, no se debe interpretar tal mención como necesariamente limitante. Por supuesto, se observará para cada potencia/tipo de láser diferente utilizado que otros parámetros se ajustan opcionalmente para lograr una iluminación sustancialmente uniforme. Por ejemplo, se cambia la cantidad de nodos en los que se cambia el índice de refracción y/o la tasa de cambio del índice en dichos nodos es opcionalmente diferente para fuentes de luz diferentes para lograr el mismo grado de uniformidad de la huella.
Además, aunque se hace referencia a los ejemplos de la presente en términos de codificación de modo en líneas de fibra óptica, también se emplea codificación de modo dinámico con luz transmitida a través de vidrio, plástico, líneas no de fibra óptica, aire, vacío, etc. Por lo tanto, el medio en el que se transmite la luz no limita la codificación de modo dinámica. En este caso, las diferencias en el medio de transmisión también pueden opcionalmente coincidir con una diferencia en otros aspectos del dispositivo de mezcla de modo necesarios para lograr una emisión sustancialmente uniforme. Por ejemplo, en el caso de luz transmitida a través de aire/vacío (es decir, no contenida
en una fibra, etc.), opcionalmente se cambia o se varía el índice de refracción mediante cambios en la temperatura, en lugar de cualquier cambio mecánico en el medio de transporte.
Opcionalmente, es posible variar el índice de refracción mediante diversas formas. Por ejemplo, tal como se mencionó anteriormente, cuando la luz no se transmite a través de un cable o fibra, sino que atraviesa aire o vacío, el índice de refracción del haz de luz puede variar debido a cambios de temperatura. Por lo tanto, es posible utilizar uno o más dispositivos de calefacción/refrigeración para modificar la temperatura de uno o más nodos del haz de luz para cambiar el índice de refracción. En el caso de haces que se desplazan a través de una fibra o cable, es posible cambiar las propiedades físicas de la fibra para variar el índice de refracción. Por ejemplo, se puede doblar, agitar, retorcer, oprimir, comprimir, tirar o calentar/enfriar en uno o más nodos para cambiar el índice de refracción en dichos puntos. La interacción física con la fibra se puede producir mediante manipulación mecánica (por ejemplo, mediante rodillos, tenazas, etc. y/o mediante accionadores piezoeléctricos que comprimen la fibra (por ejemplo, similares a los disponibles de General Photonics (Chino, CA)), etc.). En general, se puede emplear cualquier medio para variar el índice de refracción.
Además de las formas diferentes para cambiar el índice de refracción, también son opcionalmente variables la tasa de cambio del índice, la cantidad de nodos, etc. Por lo tanto, en realizaciones diferentes, la codificación de modo dinámica puede comprender uno o más nodos (es decir, el área en la que se varía el índice) en un haz de iluminación, y dichos nodos pueden ser fijos o móviles a lo largo del haz de luz. En un sentido general, pero no taxativo, cuanto mayor es la cantidad de nodos, más codificación se produce. De manera similar, en el caso de múltiples nodos, se suele preferir que los cambios en la refracción no se sincronicen entre sí (es decir, se prefiere que la variación del índice de refracción sea aleatoria).
Las Figuras 33-35 muestran ejemplos de codificación de modo con varias formas de fibra y varias fuentes de luz. Tal como se puede ver en las imágenes, se logra una iluminación plana sustancialmente uniforme cuando la codificación de modo dinámica se lleva a cabo con una fibra con vibración o comprimida. Las figuras también ilustran que es posible dar forma a las imágenes mediante el uso de fibras con núcleo con forma determinada. La Figura 33 muestra una emisión de haz no codificado (A) en comparación con emisiones de haces en donde se agitó la fibra, por ejemplo, mediante el uso de MKHI MS de Point Source (Hamble, RU) (B), se sometió a vibración, por ejemplo, con MKIV MS de Point Source (C), o se sometió a compresión, por ejemplo, mediante el uso de uno o más compresores piezoeléctricos (por ejemplo, se comprimieron más de 6 nodos a alrededor de 500-600 Htz por nodo) (D). Todos los resultados que se muestran en la Figura 33 se obtuvieron con los mismos tipos de láser y fibra (por ejemplo, fibra con salto de índice de 15 micrones y un láser de estado sólido de 532 nm). Se ilustran resultados similares en la Figura 34 A-D para una fibra de núcleo rectangular: sin codificación (A), con agitación (B), con vibración (C) o con compresión (D). En la Figura 34, todos los ejemplos se llevaron a cabo con los mismos tipos de láser/fibra. La Figura 35 muestra resultados similares en una variedad de fuentes de láser y procedimientos de codificación diferentes. Por lo tanto, los paneles en la Figura 35 corresponden a: láser de diodo a una longitud de onda de 660 um en una fibra de núcleo rectangular sin codificación de modo (A) y la misma fibra con codificación de modo dinámica (B); un láser de estado sólido a una longitud de onda de 532 um sin codificación de modo (C) y la misma fibra con codificación de modo dinámica (D); un láser de diodo a una longitud de onda de 660 um (un segundo rectangular) sin codificación de modo (E) y la misma fibra con codificación de modo dinámica (F); una segunda fibra rectangular de estado sólido 532 sin mezcla (G) y con codificación de modo dinámica (H); un láser de diodo a 660 um (circular) sin codificación de modo (I) y con codificación de modo dinámica (J); un láser de estado sólido a 532 um sin codificación de modo (K) y con codificación de modo dinámica (L).
Dispositivos de configuración de haces con poca pérdida
En algunas realizaciones de la presente, se utilizan opcionalmente formas de haz específicas, tales como haces de láser cuadrado o rectangular. Dicha iluminación configurada hace posible la exposición y formación de mosaicos eficientes en una superficie, por ejemplo, que comprende una muestra de ácido nucleico, lo que puede generar rendimientos mayores en varios dispositivos de la presente. Esto puede ser beneficioso en casos en los que las imágenes se obtienen con un dispositivo de CCD con píxeles cuadrados, dado que se pueden formar mosaicos de la huella de iluminación y el área de la que se obtienen imágenes para evitar la iluminación, y de fotoblanqueo de áreas fuera del área de captura de imágenes.
En algunas realizaciones de la presente, en lugar de emplear una máscara para configurar el haz y obtener una nueva imagen de la máscara en la superficie de muestra (que, opcionalmente, puede desperdiciar energía fuera de la máscara), el láser se acopla en una fibra de núcleo cuadrado o rectangular (o de otra forma). Por lo tanto, toda la potencia láser disponible se utiliza de forma eficiente para iluminación. La propagación a lo largo de una extensión suficiente de dicha fibra configurada llena el núcleo de forma eficiente para producir la forma de iluminación deseada. Es posible obtener nuevas imágenes del extremo de dicha fibra en una muestra, por ejemplo, un sustrato de celda de flujo. En realizaciones particulares, se suele desear que la obtención de nuevas imágenes de la iluminación de la fibra no perturbe sustancialmente la forma del haz y/o perfil plano logrado mediante la codificación y/o la configuración del haz (o incluso distorsione el haz cuando no se ha codificado o no se ha configurado). Por lo tanto, se seleccionan de forma adecuada aspectos para obtención de nuevas imágenes (por ejemplo, lentes, etc.) para no distorsionar el perfil obtenido y, opcionalmente, para amplificar correctamente la emisión de luz en la celda de flujo, etc. En realizaciones particulares, también se puede seleccionar la obtención de nuevas imágenes
acromática (es decir, capaz de funcionar con luz a cualquier longitud de onda). En algunas realizaciones, también es posible mover los componentes para los que se obtienen nuevas imágenes mediante un movimiento leve para tener el área de iluminación en áreas particulares de la celda de flujo.
En tales realizaciones, la condición del haz emitido en la fibra configurada acoplada con la extensión de la fibra puede controlar opcionalmente la uniformidad de iluminación. Opcionalmente, se puede mejorar la uniformidad de la iluminación mediante la codificación dinámica de los modos en la fibra a la que se dio forma. Por ejemplo, mediante la utilización de un dispositivo que comprime de forma continua la fibra de núcleo configurado en varias ubicaciones. Véase arriba. Lentes para obtención de imágenes puede manipular opcionalmente las dimensiones del haz suministrado en la superficie de muestra.
Las Figuras 34 y 35 muestran los resultados del uso de una fibra óptica de núcleo rectangular. Se obtuvieron nuevas imágenes del extremo de la fibra en un perfilador de haces. La imagen del perfil de haz ilustra el haz rectangular deseada con iluminación uniforme en las dimensiones vertical y horizontal.
Los sistemas de configuración de haces y/o de codificación de modo dinámica comprenden componentes para generar y administrar un haz evanescente de longitud de onda intercambiable y sustancialmente uniforme a la superficie inferior de un canal de celda de flujo (u otro sustrato) en un instrumento de lectura de SBS. Tal como resulta evidente, se establece una interfaz entre tales componentes y varios otros módulos/componentes en el sistema de SBS general (por ejemplo, los diversos componentes ópticos descritos anteriormente, etc.) y la pueden controlar o dirigir uno o más componentes informáticos.
A pesar de que las realizaciones de configuración de haz y codificación de modo dinámica actuales incluyen sistemas de secuenciación de ácidos nucleicos (por ejemplo, varias configuraciones de secuenciación mediante síntesis, tal como se describe en la presente), y se describen en términos de su interacción con estos, los expertos en la técnica observarán que dichas realizaciones también se pueden aplicar a una amplia gama de otros usos o sistemas. Por lo tanto, se puede incluir la codificación de modo dinámica en una variedad de sistemas que comprenden uno o más aspectos para variar de forma dinámica el índice de refracción de un haz de iluminación para mezclar los modos ópticos de una fibra óptico multimodal con el fin de producir una imagen sustancialmente uniforme o emisión en un marco temporal deseado (por ejemplo, tal como durante el tiempo de captura de imágenes para una cámara o similares). Es posible emplear la codificación de modo dinámica opcionalmente con sistemas tales como aquellos para realizar el seguimiento de fluorescencia en una placa o micromatriz, o similares, es decir, usos que no comprenden el seguimiento de reacciones de secuenciación.
Codificación de modo con láminas de onda
En varios aspectos de la presente, la invención comprende un sistema para mezclar modos ópticos en una fibra óptica multimodal mediante el uso de láminas de onda. Tales sistemas comprenden una fuente de luz (por ejemplo, un láser) que envía luz a través de una fibra óptica multimodal y, opcionalmente, también a través de al menos una lámina de onda y luego, opcionalmente, a través de lentes para obtener nuevas imágenes, un prisma y en un sustrato (celda de flujo)). Las láminas de onda en dichos sistemas pueden comprender láminas de onda destructivas. En algunas realizaciones, las láminas de onda giran físicamente a varias rpm, mientras que en otras realizaciones, tal como con láminas de onda de cristal líquido, la placa gira y altera la polarización de la luz que atraviesa mediante la variación del voltaje en el cristal líquido. En determinadas realizaciones, la lámina de onda comprende dos secciones o más de retardantes orientados, cada uno de los cuales gira la polarización en direcciones diferentes. En realizaciones usuales, la emisión de luz de la fibra comprende una emisión de luz sustancialmente uniforme en una superficie durante un período de tiempo determinado. En varias realizaciones de la presente, la emisión de luz en las superficies comprende mínimos de intensidad reducidos y máximos de intensidad reducidos en comparación con la emisión de una fibra óptica multimodal que no comprende una o más láminas de onda giratorias.
En otros aspectos, la invención comprende métodos para la ecualización de la salida de luz de una fibra óptica multimodal sobre una superficie en un período de tiempo definido al enviar luz de una fuente de luz (por ejemplo, un láser) a través de una fibra óptica multimodal y a través de una o más láminas de onda giratorias. En algunas realizaciones, la salida sobre la superficie comprende reducción de mínimos de intensidad y reducción de máximos de intensidad en comparación con la salida de una fibra óptica multimodal que no comprende una o más láminas de onda giratorias. En algunas realizaciones, las láminas de onda rotan físicamente a varias rpm en la realidad, mientras que en otras realizaciones, tal como sucede con las láminas de onda de cristal líquido, la lámina «rota» y altera la polarización de la luz que la atraviesa al variar el voltaje a través del cristal líquido. En determinadas realizaciones, la lámina de onda comprende dos o más secciones de retardantes, cada una de las cuales rota la polarización en diferentes direcciones.
Tal como se utiliza en la presente en algunas realizaciones, una «lámina de onda» (o lámina de retardo, cambiador de fase o similar) hace referencia a un dispositivo óptico que altera la velocidad de los rayos de luz cuando lo atraviesan, de manera que generan una diferencia de fase. Las láminas de onda suelen estar compuestas por un cristal birrefringente. Algunas realizaciones pueden comprender una lámina de onda de cristal líquido.
Tal como se describió anteriormente, en realizaciones particulares que comprenden láser u otra excitación fuente, la iluminación de la muestra (a cuya área de iluminación se hace referencia como la «huella») es espacialmente plana y uniforme. Los instrumentos ópticos de la presente explotan las propiedades de fibras multimodales que hacen posible la propagación de todos los modos ópticos a través de su núcleo con amplitud casi idéntica, lo que produce un perfil plano o rectangular de la huella. Sin embargo, la cantidad finita de modos presentes en dichas fibras pueden interferir de manera constructiva y destructiva entre sí, de forma de producir mínimos y máximos locales en el perfil de intensidad del láser (u otra luz). Algunas realizaciones producen una huella uniforme al agitar físicamente la fibra en un plazo menos extenso que el tiempo de exposición de la cámara que captura las imágenes, lo que promedia los mínimos y las máximas de intensidad, y produce una huella superior plana uniforme. Esta agitación puede requerir un motor de CC desbalanceado que rota y agita la fibra, lo que en algunos casos puede provocar ruidos y vibraciones no deseados que se tienen que amortiguar para evitar causar problemas en la obtención de imágenes. La agitación también puede afectar negativamente la fiabilidad dado que los motores de CC desbalanceados presentan un tiempo promedio entre fallas más corto que los motores balanceados, y puede aumentar el desgaste físico en la fibra. Debido a estos factores, la mezcla de modos en una fibra óptica multimodal sin vibraciones mecánicas y, en algunos casos, sin partes móviles, puede ser beneficiosa al utilizar láminas de onda en algunos casos.
Una realización de la presente invención produce un haz superior plano sustancialmente uniforme (es decir, huella o área de iluminación/excitación) al mezclar los modos de la fibra óptica multimodal mediante el uso de una lámina de onda λ/2 giratoria (lámina retardante). El contenido espacial de los modos depende del estado de polarización de la luz de entrada. Al tiempo que cambia la polarización, cambia el contenido espacial. Por lo tanto, la posición de mínimos y máximos de interferencia cambia al tiempo que cambia la polarización del haz de entrada. Si se rota la lámina de onda a una frecuencia angular más rápida que el tiempo de adquisición de imágenes, entonces se puede producir una imagen espacialmente uniforme en el plazo de la observación. Por lo tanto, en realizaciones particulares, la lámina de onda completa una o más rotaciones durante un período de tiempo determinado. El período de tiempo es, por ejemplo, uno durante el que se captura una imagen del área iluminada por la salida de luz (por ejemplo, áreas del sustrato de las celdas de flujo en determinadas realizaciones de secuenciación de la presente). Por lo tanto, en determinadas realizaciones, el período de tiempo es equivalente o sustancialmente equivalente al período de exposición para cada imagen capturada por una cámara (por ejemplo, una cámara CCD en realizaciones de secuenciación particulares de la presente). Se apreciará que dichos tiempos de exposición pueden variar de realización a realización, por ejemplo, de menos de 1 mseg a más de 1 hora o más según los requisitos particulares de la realización (por ejemplo, al menos 1, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 o más µseg; al menos 1, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 o más mseg; al menos 1, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 o más segundos, etc.). En el caso de las cámaras utilizadas en la presente, el tiempo de exposición puede ser de 50-500 milisegundos. En determinadas realizaciones, las láminas de onda pueden rotar menos o más que una rotación completa durante el período de tiempo, por lo tanto, en algunas realizaciones, también se puede incluir el aliasing [solapamiento].
Si bien es posible lograr la rotación de la polarización de distintas maneras, las realizaciones típicas rotan la lámina de onda. En realizaciones particulares de la presente, se rota una lámina de onda λ/2 (ver la lámina de onda 3800 en la Figura 38) en una cubierta adecuada mediante un motor de CC adecuado o similar, el que opera a una velocidad lo suficientemente rápida como para que se produzca una imagen espacial y sustancialmente uniforme durante el tiempo de captura de imágenes apropiado. Otras realizaciones comprenden láminas de onda modificadas que consisten en varias secciones de láminas de onda o piezas más pequeñas orientadas, con el eje rápido también orientado, en direcciones diferentes (ver la lámina de onda 3900 en la Figura 39). Dado que las secciones rotan la polarización en cantidades/formas diferentes, puede tener lugar una mezcla mucho más rápida de los modos y, opcionalmente, el motor de CC no rota tan rápido como en las realizaciones con varias secciones. En aun otras realizaciones, se pueden utilizar otros dispositivos, tales como cristales líquidos (tales como, de modo no taxativo, los fabricados por Meadowlark Optics (Frederick, CO)) para rotar la polarización del láser. Con dichos cristales líquidos, es posible rotar la polarización mediante la variación del voltaje en todo el dispositivo.
La Figura 40 muestra un diagrama esquemático que representa un ejemplo de arreglo de una realización de la invención. En la Figura 40, se atenúa la luz polarizada linealmente 4100 (200 mW, 532 nm) del láser en estado sólido bombeado por diodos (4200) mediante el uso de varios filtros OD. La intensidad del haz se controla adicionalmente mediante la lámina de onda λ/2 4900 (por ejemplo, Casix, Fuzhou, Fujian, China) y el cubo divisor de haces polarizante 4300 (por ejemplo, Thorlabs, Newton, NJ). En varias realizaciones, no es necesaria la totalidad de la intensidad del láser, por lo tanto, en el ejemplo descrito solo se utiliza alrededor de 0,1 µW. La rotación de la lámina de onda 4900 hace posible un control preciso de la potencia del láser de entrada al tiempo que la polarización se mantiene fija. Luego, el haz atraviesa una segunda lámina de onda retardante λ/2 4400 y se guía mediante dos espejos 4500 y 4600 hacia el objetivo del microscopio 4700 (por ejemplo, Nikon, 20x NA 0,3). El objetivo del microscopio reduce el haz al tamaño requerido para que sea aceptado por la fibra óptica multimodal, 4800, núcleo 200 pm, 0,22 NA (por ejemplo, OZ optics, Ottawa, Canadá). Se coloca el extremo de salida de la fibra en la realización que se muestra directamente en el chip de la cámara CCD 4905 (por ejemplo, Cascade 512, Photometries, Tucson, AZ). En el ejemplo de realización que se muestra, la cámara se operó en modo de transferencia de marco y se adecuaron las exposiciones de 100 ms para capturar el perfil del haz tal como se explica en la presente.
En varias realizaciones, la presente invención, independientemente del sistema general en el que se utilice, puede comprender láminas de onda diferentes (por ejemplo, diferentes en términos de tipo, colocación, arreglo, construcción, etc.), diferentes espejos y divisores de haz (por ejemplo, diferentes en términos de tipo, ubicación, ángulo, etc.). Por lo tanto, las realizaciones diferentes pueden comprender, por ejemplo, láminas de onda λ/2, láminas de onda λ/4 (por ejemplo, cuando la polarización de entrada es circular), las láminas de onda λ/n de otro retardo específico, etc., y pueden comprender al menos 1 lámina de onda, al menos 2 láminas de onda, al menos 3 láminas de onda o al menos 5 o más láminas de onda en varios arreglos. Las láminas de onda de la invención no se encuentran necesariamente limitadas por su construcción. Por lo tanto, en la presente se incluyen láminas de onda de cristal sólido (por ejemplo, cristal de cuarzo o cualquier otra sustancia apropiada) y láminas de onda de cristal líquido.
Si bien la realización actual incluye sistemas de secuenciación de ácidos nucleicos (por ejemplo, varias secuenciaciones mediante configuraciones de síntesis, tal como se describen en la presente), y en este documento se describen con referencia a su interacción con ellos, los expertos en la técnica entenderán que la invención actual también se puede aplicar a una amplia variedad de usos/sistemas distintos. Por lo tanto, las realizaciones pueden incluir sistemas que comprenden una o más láminas de onda (normalmente en rotación) que mezclan los modos ópticos de una fibra óptica multimodal con el fin de producir una salida o imagen espacial y sustancialmente uniforme en un período de tiempo deseado (por ejemplo, tal como durante el tiempo de captura de imágenes para una cámara o similares). Los aspectos actuales de la lámina de onda se pueden utilizar opcionalmente con sistemas, tales como aquellos que rastrean la fluorescencia en una lámina, micromatriz o similar, que no sean una reacción de secuenciación. En consecuencia, los aspectos de la lámina de onda también pueden incluir métodos para generar una salida o imagen sustancialmente uniforme desde una fibra óptica multimodal es un período de tiempo deseado al pasar los modos ópticos de la fibra a través de una o más láminas de onda (habitualmente con rotación y habitualmente con rotación a una velocidad mayor que el tiempo de captura de imágenes o período de tiempo deseado).
En la Figura 41 se ilustran varias imágenes obtenidas a partir de la exposición de una cámara de dichos ejemplos de realizaciones. A partir de una única exposición, las regiones prominentes de píxeles brillantes y oscuros son evidentes en la Figura 41A. Las imágenes brillantes/oscuras resultan de la interferencia constructiva y destructiva de varios modos que se encuentran presentes en la fibra óptica multimodal. La rotación de las láminas de onda resulta en la redistribución espacial de las regiones oscuras y brillantes, tal como se ilustra en la serie de imágenes en la Figura 41B. En dichas Figuras, cada imagen se tomó en una configuración de lámina de onda diferente. Tal como se mencionó anteriormente, si la lámina de onda rota más rápido que el tiempo de adquisición de imágenes, entonces se promedia el perfil espacial y esto resulta en el ajuste uniforme de la imagen. Dicho ajuste uniforme se puede comparar con la obtención de una gran cantidad de imágenes y el realizar un promedio de ellas. Las Figuras 41C y 41D muestran una única imagen con su perfil lineal (41C) y un promedio de 54 imágenes con perfil lineal asociado (41D). La Figura 42 muestra la uniformidad sustancial de la huella producida por el uso de las láminas de onda.
Otros métodos para garantizar que el haz óptico sea uniforme en la huella de obtención de imágenes incluyen el uso de solenoides, la rotación del haz de luz en un campo eléctrico o magnético con celdas Faraday o Pockel, y la obtención de imágenes de la luz nuevamente luego de que atraviese un difusor. El difusor puede ser un difusor holográfico que superpondría ondas de luz que se originen en el extremo de la fibra (si la fibra está acoplada) o en el láser (si no hay fibra presente) de manera que las ondas se superpongan y produzcan la forma de haz requerida. Un ejemplo tal es un difusor con un perfil de intensidad de sinc (x)^2 (sinc es sen(x)/x) lo que transformará un haz gaussiano en un haz rectangular.
Los diversos aspectos de codificación de modos en la presente se pueden controlar/manipular opcionalmente mediante uno o más componentes informáticos y se suelen coordinar/sincronizar con los componentes de iluminación con luz y de detección con luz (normalmente también mediante los aspectos informáticos de la presente).
Dispositivos para detectar la fluorescencia
Existen varios dispositivos para detectar la fluorescencia, por ejemplo, ejemplos de fotodiodos y cámaras, que pueden comprender los componentes de detección/detector de la presente invención. En algunas realizaciones de la presente, el componente de detección puede comprender un sistema de obtención de imágenes óptico con base en CCD de 1 megapíxel, tal como una cámara CCD 1024 x 1024 con iluminación trasera con píxeles de 8 µm, la que a una ampliación de 40x puede opcionalmente obtener una imagen de un área de 0,33 x 0,33 mm por mosaico con un tamaño de punto de láser de 0,5 x 0,5 mm (por ejemplo, un punto cuadrado o un círculo con un diámetro de 0,5 mm
o un punto elíptico, etc.). Las cámaras pueden tener opcionalmente más o menos que 1 millón de píxeles, por ejemplo, se puede utilizar una cámara de 4 megapíxeles. En muchas realizaciones, se desea que la velocidad de lectura de la cámara sea tan rápida como sea posible, por ejemplo, la velocidad de transferencia puede ser de 10 MHz o más, por ejemplo, 20 o 30 MHz. En general, más píxeles significa que se pueden obtener imágenes de forma simultánea para una única exposición de un área de superficie más grande y, por lo tanto, de más reacciones de secuenciación. Esto tiene la ventaja de requerir menos desplazamientos de la plataforma y cambios de la rueda de filtro, y ayuda a acelerar la obtención de imágenes. En realizaciones particulares, la cámara CCD/láseres TIRF de la presente son capaces de recabar alrededor de 6400 imágenes para consultar 1600 mosaicos (dado que las
imágenes se pueden realizar opcionalmente en 4 colores diferentes con filtros opcionalmente diferentes en su lugar) por ciclo. En el caso de una CDD de 1 megapíxel, determinadas imágenes pueden contener opcionalmente entre alrededor de 5000 y 50 000 cúmulos de ácido nucleico únicos espaciados de forma aleatoria (es decir, imágenes sobre la superficie de la celda de flujo). La densidad teórica de cúmulos que se pueden resolver por área unitaria (o imagen) depende del tamaño de los cúmulos, tal como se ilustra en la Figura 29 que muestra una imagen de 1mpix de la cantidad de cúmulos detectados en función de la cantidad de cúmulos total y el área de cúmulos mínima. A una velocidad de obtención de imágenes de 2 segundos por mosaico para los cuatro colores, y una densidad de 25 000 cúmulos por mosaico, los sistemas de la presente pueden cuantificar opcionalmente alrededor de 45 millones de características por hora. A una velocidad de obtención de imágenes más rápida, una densidad de cúmulos más elevada, es posible mejorar significativamente la velocidad de obtención de imágenes. Por ejemplo, a una velocidad de lectura máxima de una cámara de 20 MHz, y un cúmulo resuelto cada 20 píxeles, la lectura puede ser de 1 millón de cúmulos por segundo. Es posible configurar el instrumento para que tenga más de una sola cámara. La luz se puede dividir para obtener imágenes de forma simultánea de dos colores en dos cámaras o incluso cuatro colores en cuatro cámaras. Si se utilizan cuatro cámaras en paralelo, es por lo tanto posible secuenciar 1 millón de bases por segundo u 86,4 mil millones de bases por día.
Existen dos formas de dividir las señales ópticas para un sistema de dos cámaras. Si se utilizan dos láseres, puede haber una excitación roja y una excitación verde con la mitad de la luz de emisión dividida hacia cada cámara. De manera alternativa, se pueden utilizar ambos láseres en ambos ciclos de iluminación, y la luz puede atravesar un espejo dicroico adecuado, de manera que envía la luz roja en una dirección, y la luz verde en una dirección diferente, tal como se ilustra en la Figura 36. Dicho sistema previene las pérdidas de señal asociadas a la división del haz, pero significa que dos de los tintes se exponen al láser antes del registro de su intensidad. En algunas realizaciones, el bloqueador de excitación, por ejemplo, tal como se ilustra en la Figura 36, puede comprender un filtro de muesca (por ejemplo 532 y 660 nm). En la Figura 37 se muestra una imagen de un instrumento con dos cámaras de detección 3700 y dos sistemas de fluido 3701 (y dos celdas de flujo 3702).
En la presente, un «mosaico» es funcionalmente equivalente al tamaño de imagen mapeado en la superficie del sustrato. Los mosaicos pueden ser, por ejemplo, de 0,33 mm2, 0,5 mm2, 1 mm2, 2 mm2, etc., aunque el tamaño del mosaico dependerá en gran medida de la cantidad y el tamaño de los píxeles en la cámara y el nivel de aumento deseado. Asimismo, se entenderá que el mosaico no tiene que ser del mismo tamaño o la misma forma que la huella de iluminación del láser (u otra fuente de luz), aunque esto puede ser beneficioso si se desea la minimización del fotoblanqueo.
Tal como se estableció anteriormente en las diversas realizaciones de la presente, los sistemas de cámara/láser recogen fluorescencia de 4 tintes fluorescentes distintos (es decir, uno por cada tipo de base de nucleótido agregado a la celda de flujo). Nuevamente, es posible encontrar material adicional sobre otros aspectos y otros conceptos de la secuenciación SBS en las solicitudes en trámite conjunto de los solicitantes, por ejemplo, WO04018497, WO04018493 y US7057026 (nucleótidos), WO05024010 y WO06120433 (polimerasas), WO05065814 (técnicas de unión a la superficie), y WO 9844151, WO06064199 y WO07010251 (secuenciación y preparación de cúmulos).
Las Figuras 1 y 13-16 muestran varias configuraciones posibles de las cámaras y láseres de la presente invención, las que incluyen un diseño con retroiluminación, una configuración de obtención de imágenes mediante TIRF, una configuración de enfoque láser, una configuración de visualización con luz blanca y un diseño con enfoque láser alternativo. La fuente de excitación con luz blanca es opcional y se puede utilizar al igual que los láseres de excitación o en su lugar. La Figura 1 muestra el sistema de diseño con retroiluminación al tiempo que registra una imagen en la configuración de obtención de imágenes mediante TIRF. La configuración en la Figura 1 para la obtención de imágenes mediante TIRF es opcionalmente una configuración del diseño con retroiluminación que se ilustra en la Figura 13. En la Figura 1, se utiliza uno de los dos láseres (en el arreglo de láser 160) para iluminar la muestra (en la celda de flujo 110), y se selecciona solo uno de los cuatro filtros de emisión (en el arreglo de intercambio de filtro 145) para registrar una única longitud de onda de emisión y para cortar cualquier luz de láser desviada. Durante la obtención de imágenes, tanto el láser de foco (150) como la lámpara de luz blanca opcional
(165) no iluminan la muestra ya que se encuentran bloqueados con una rejilla o apagados. También se muestran la iluminación láser 101 y la iluminación desde la celda de flujo a través del lente objetivo y la cámara 102. La Figura 13 muestra todos los componentes del sistema en el diseño con retroiluminación pero sin la configuración de obtención de imágenes mediante TIRF específica. Cf. Figuras 1 y 13. Por lo tanto, la Figura 13 ilustra: módulo de suministro de fluido 1300, celda de flujo 1310, válvula de desechos 1320, accionador de temperatura 1330, componente de calefacción/refrigeración (por ejemplo, Peltier) 1335, cámara (por ejemplo, cámara CCD) 1340, lente objetivo 1342, arreglo de intercambio de filtro 1345, arreglo de enfoque láser 1350, arreglo de láseres de excitación 1360, lámpara de baja potencia1365, plataforma XY de precisión 1370, dispositivo de enfoque (eje z) 1375, espejo 1380, dicroica inversa 1385 y fibra óptica de láser 1390.
La Figura 14 muestra un sistema similar al de la Figura 1, pero en la configuración de enfoque láser donde los láseres de excitación (en el arreglo de láser 1460) y la luz blanca opcional 1465 se encuentran apagados. El enfoque láser 1450 se encuentra encendido e ilumina el sistema, llega al divisor de haces 1485 (por ejemplo, un espejo extraíble 1 % divisor de haces) que dirige un haz apenas visible 1402 por el objetivo para llegar a un pequeño punto de la muestra (en la celda de flujo 1410). La luz dispersa de la muestra regresa por el objetivo (1442) a través de una ranura vacía en el arreglo de intercambio de la rueda de filtro 1445 y las imágenes se obtienen mediante la
cámara CCD 1440. La posición del punto en la cámara se utiliza para garantizar que la muestra se encuentre a la distancia correcta del objetivo y, por lo tanto, la imagen estará en foco. La numeración de los elementos en la Figura 14 es similar a la de los elementos en la Figura 13, pero se enumeran como «14» en lugar de «13», por ejemplo, 1460 corresponde a un elemento similar como 1360, etc. El sistema de autofoco se describe en más detalle a continuación.
La Figura 15 ilustra la configuración de visualización de luz blanca opcional, donde el láser de foco 1550 y los láseres de iluminación1560 se encuentran apagados. En dicha configuración, la luz blanca de la lámpara de baja potencia 1565 ingresa al sistema como el haz 1503 y las imágenes se obtienen directamente en la cámara. En este caso también, la numeración de los elementos, excepto por el haz 1503, etc., sigue la numeración de las Figuras 13 y 14. La Figura 16 muestra una configuración de foco alternativo donde el sistema contiene la segunda cámara de enfoque 1641, la que puede ser un detector de cuadrante, PSD o detector similar para medir la ubicación del haz disperso reflejado desde la superficie. Esta configuración hace posible el control del foco junto con la recopilación de datos. La longitud de onda del láser de foco es opcionalmente más larga que el filtro de emisión de tinte más rojo.
Las Figuras 17-19 muestran varios esquemas para determinar la forma y las dimensiones del haz en los ensayos de TIRF que se llevan a cabo mediante el uso de los sistemas actuales de la presente, mientras que la Figura 20 exhibe una realización opcional de un prisma de TIRF para su uso con los sistemas de la presente. Por lo tanto, se entenderá que la forma (por ejemplo, redonda, cuadrada, etc.) de los haces de láser y/o de las áreas de obtención de imágenes iluminadas por los haces de láser pueden variar de forma opcional entre las diferentes realizaciones. La Figura 17 muestra las dimensiones y geometrías del haz a medida que sale de la fibra. A efectos de iluminar un círculo en el sustrato, el haz se debe proyectar desde la fibra como una elipse dado que el haz llega a la superficie del sustrato en un ángulo respecto al normal. La vista del borde 1700 del círculo proyectado por la elipse 1730 (por ejemplo, una forma de haz elíptica requerida en la salida de la fibra (la línea central de la fibra a 22° vista desde arriba). El contorno parcial de la cara del prisma 1710 no es a escala y la vista del borde 1720 de la elipsis 1730 se muestra en el eje menor. Asimismo, a efectos de iluminar un cuadrado en el sustrato, el haz se debe proyectar en la superficie como un rectángulo, tal como se ilustra en la Figura 18. En la Figura 18, se muestra el rectángulo 1830. Se requiere una forma de haz elíptica rectangular en la salida de la fibra (la línea central de la fibra a 22° vista desde arriba). La vista del borde 1800 del cuadrado proyectado por el rectángulo 1830 también se indica como el contorno parcial de la cara del prisma 1830 (no a escala) y la vista del borde 1820 de la elipsis rectangular 1830 (eje menor).
Tal como se ilustra en la Figura 19, se diseña el prisma para permitir que el haz de obtención de imágenes llegue a la superficie del sustrato a aproximadamente 68° (respecto al normal) para lograr una reflexión interna total y generar un haz evanescente que excite los fluoróforos en la superficie. Con el fin de controlar la vía del haz a través del prisma y, por lo tanto, mantener la huella de iluminación directamente sobre un lente objetivo fijo al tiempo que se desplaza la celda de flujo, el prisma puede tener una geometría donde el ángulo del prisma respecto a la superficie también sea de 68°, de forma de garantizar que la luz siempre llegue al prisma a 90°. La geometría deseada del prisma se describe de manera más completa en la solicitud WO03062897, y el ejemplo de tamaño y geometría se muestra en la Figura 20, etc.
La forma de haz de los láseres de la presente se puede controlar opcionalmente mediante el pulido del extremo de salida de la fibra multimodal a efectos de crear, por ejemplo, un haz cuadrado. Ver, por ejemplo, la Figura 21. La Figura 21 muestra los resultados de imágenes obtenidas del haz por dicho pulido. En otras realizaciones, el haz es opcionalmente redondo. En algunos casos, las propiedades del haz pueden ser un perfil gaussiano con las siguientes propiedades: un tamaño de imagen nominal de 0,17 mm de radio, un tamaño de punto máximo de 0,25 mm de radio y 0,32 mm como el punto luego del cual efectivamente no hay intensidad del láser. En determinadas realizaciones, la intensidad del haz es mayor de 90 % de intensidad máxima en todas las posiciones en el tamaño de imagen nominal; 80% de intensidad máxima en todas las posiciones en el tamaño de punto máximo, y no más de 1 % de intensidad máxima fuera del radio de 0,32. En varias realizaciones (en ausencia de un codificador de modos dinámico), la intensidad en cualquier punto no varía en más de 5 % RMS en el período de tiempo de 1s-1h y la variación en la potencia del láser total (integrada) no es más de 3 % RMS con medición durante 24 horas.
Sistemas de iluminación
En los dispositivos se puede utilizar una variedad de sistemas de iluminación de acuerdo con la presente invención. Los sistemas de iluminación pueden comprender lámparas y/o láseres. Los sistemas pueden contener uno o más láseres de iluminación de diferentes longitudes de onda. Por ejemplo, los sistemas de la presente pueden contener dos láseres de 532 nm y 660 nm, aunque también se pueden utilizar láseres con otras longitudes de onda. De manera adicional, en diversas realizaciones, los láseres en los sistemas de la presente se controlan por temperatura activamente hasta 0,1°C, tienen modulación de TTL para el diodo láser de 660 nm con tiempo de aumento menor de 100 ms; tienen rejillas manuales integradas para la modulación rápida del láser de 532 nm, tienen elementos ópticos que dan forma al haz para garantizar que se mantenga la relación de aspecto de haz óptima en la interfaz del instrumento para maximizar la relación señal respecto a ruido, tienen codificador de modos integrado para reducir las ondas en la salida de la fibra multimodal, y tienen generación de calor mínima. Se utilizan las rejillas y la modulación de TTL para garantizar que la iluminación solo ocurra sobre la superficie de la muestra mientras que la cámara registra las imágenes. La iluminación de fluoróforos puede provocar fotoblanqueo y, por lo tanto, la exposición de sustratos al láser se suele minimizar cuando no es necesario, en especial antes del registro de las imágenes.
Las Figuras 22A y B proveen varios arreglos de rueda de filtro de determinadas realizaciones para su uso con varias configuraciones ópticas. El uso de un sistema de excitación de dos láseres para detectar cuatro fluoróforos significa que dos de los fluoróforos se excitan más allá de su longitud de onda de absorción máxima, tal como se ilustra en la figura 22B. Si los filtros de emisión utilizados en los cuatro canales tenían el mismo ancho de banda, entonces los dos fluoróforos más cercanos a los láseres de 532 y 660 nm serían significativamente más brillantes que los dos fluoróforos excitados más allá de los láseres. Sin embargo, es posible anular este factor al cambiar el ancho de banda de los filtros. Por ejemplo, tal como se ilustra en la figura 22B, en el caso del láser de 532 nm, ambos tintes que absorben a, por ejemplo, 530 y 560 nm, se pueden excitar mediante el láser de 532. El uso de un filtro estrecho cercano al láser, por ejemplo, un 560/20 que deja pasar la luz del 550-570 nm solo permite que pase la luz del tinte de 532 nm. El uso de un filtro con paso de banda más ancho más allá del láser, por ejemplo, un 610/75 que deja pasar la luz a través del 572 nm al 647 nm, deja pasar la luz de ambos fluoróforos. La intensidad del fluoróforo de 532 a través del filtro 560/20 es similar a la intensidad del fluoróforo de 560 a través del filtro 610/75. Por lo tanto, es posible distinguir claramente los dos fluoróforos con un único láser y dos filtros de emisión.
El efecto no es específico de la longitud de onda y se puede llevar a cabo con cualquier longitud de onda de excitación. Por lo tanto, se puede lograr el mismo efecto con el láser rojo. Es posible distinguir dos fluoróforos que absorben a 650 nm y 680 nm con un filtro estrecho cercano al láser (por ejemplo, un 682/22), y un filtro más ancho más alejado, por ejemplo, un paso largo de 700. Nuevamente, las intensidades de los dos tintes a través de sus filtros respectivos son similares, mientras que se reduce mucho la señal del tinte de 680 en el filtro 682/22. Ambos tintes emiten en el canal de paso largo de 700, pero es posible determinar claramente las señales debido al nivel diferente de emisión en el filtro estrecho. Se pueden utilizar la adaptación de las longitudes de onda del láser, las selecciones de fluoróforos y los anchos de banda del filtro para obtener un conjunto de cuatro fluoróforos con cualquier cantidad de longitudes de onda, y se pueden normalizar las intensidades de la emisión a través de cada canal con el ancho de banda de los filtros para controlar cuánta luz se transmite.
La Figura 23 muestra un diseño nominal para una realización del trazado de rayos del sistema de 30x, mientras que la Figura 24 muestra el rendimiento de la obtención de imágenes de 30x. El rendimiento de la obtención de imágenes del sistema depende de la amplificación del lente objetivo y los demás lentes en el sistema. Una amplificación más pequeña permitirá que se obtengan imágenes de un área del sustrato más grande, pero a un costo de resolución de cúmulos muy estrechamente comprimidos y del brillo de cada cúmulo. Una amplificación preferida se encuentra opcionalmente entre 10X-40X, por ejemplo, 20X o 30X. El objetivo se puede diseñar específicamente para permitir que se capture la obtención de imágenes limitada por difracción cuando se observan objetos de fluorescencia a través de geometría no estándar (por ejemplo, sustratos de cristal más grueso) y, por lo tanto, se elimina la anomalía esférica que de otro modo estaría presente. El lente objetivo se puede conectar al dispositivo de detección a través de un lente de tubo adicional.
Sistema de autofoco
En realizaciones particulares, los sistemas de la presente pueden comprender componentes para auxiliar en el enfoque apropiado para la obtención de imágenes de cúmulos. En general, en realizaciones particulares de la presente, en una configuración de autfoco, un haz de láser de autofoco ilumina una muestra a través de un lente objetivo, se refleja desde la superficie de la celda de flujo, regresa al lente y luego a la cámara, de forma de generar un punto en la imagen. Cuando el objetivo se desplaza hacia arriba/hacia abajo con una muestra fija, los centroides del punto se alinean alrededor de una línea recta en la imagen (curva de calibración). El desplazamiento de «dr» a lo largo de esta línea de calibración es proporcional al cambio «d(z-zf)» en la distancia entre el objetivo y el plano focal. En muchas realizaciones, antes de la operación, el software establece la orientación de la línea de calibración (su pendiente) y la «sensibilidad»: dz/dr (nm/píxel). Esto se logra al tomar 21 imágenes con la etapa de 1000 nm en dirección z alrededor de la posición de foco que se establece visualmente. El software también puede requerir las coordenadas de píxeles x, y del punto cuando la muestra se encuentra en foco: xf, yf, esto se determina a partir de la primera imagen en foco (central) del conjunto de las 21 imágenes de calibración. Por ejemplo, los dispositivos de la presente comprenden opcionalmente un objetivo con función de autofoco que logra una resolución de 100 nm montado con un desplazamiento de eje Z de hasta 50 mm. El lente objetivo se puede desplazar opcionalmente de forma vertical con respecto al sustrato y el láser de iluminación se puede acoplar al desplazamiento de eje Z de manera que las entradas de iluminación también se desplacen respecto al sustrato. En el caso de las realizaciones con capacidad de autofoco, un haz de autofoco se envía opcionalmente a lo largo del borde del lente objetivo del microscopio (opcionalmente, tan lejos del eje como sea posible con el fin de corresponder a la sensibilidad máxima). El haz de autofoco puede proceder de los láseres de iluminación o de una fuente independiente que es opcionalmente una longitud de onda diferente al láser de iluminación, por ejemplo, de 488 nm, 630 nm o un láser infrarrojo de 700 nm o más rojo. Luego, el haz reflejado se monitorea opcionalmente ya sea mediante una celda cuadrupolar o mediante la filtración a través de un divisor de haces dicroicos en la cámara de obtención de imágenes por fluorescencia. En dichas realizaciones, el lente y la cámara son opcionalmente los mismos a los utilizados en el instrumento (por ejemplo, lente de 20X). Previamente se han descrito sistemas de autofoco similares que se incluyen opcionalmente en los sistemas y dispositivos actuales, por ejemplo, en WO03060589.
Con aspectos de autofoco particulares en la presente, al tiempo que el plano de obtención de imágenes se desplaza con respecto al lente objetivo, el haz de monitoreo reflejado también se desplaza opcionalmente de forma lateral (es decir, la línea punteada es el plano en foco mientras que la línea continua representa un plano fuera de foco, lo que
genera un cambio lateral en el haz detectado en la Figura 25). El espejo dicrónico elegido en tales realizaciones suele ser uno que refleja el haz de autofoco. La pequeña filtración que se transmite realmente (c.a. <5 %) es más que adecuada para observarse en una cámara CCD sin filtro de emisión en la vía de emisión. La Figura 26 exhibe fotografías de la muestra tanto de imágenes fuera de foco como en foco donde el punto se observa en la cámara de obtención de imágenes. Las imágenes inferiores muestran el punto de autofoco detectado en la cámara de obtención de imágenes. El punto también se puede observar en un detector independiente, tal como se ilustra en la Figura 27.
En las realizaciones que comprenden aspectos de autofoco, el componente informático comprende opcionalmente un algoritmo de autofoco. Dichos algoritmos ayudan opcionalmente en la determinación del foco correcto (por ejemplo, al monitorear las mediciones anteriores y realizar ajustes en consecuencia). Se puede hacer que el punto de autofoco se desplace de manera 1D, por ejemplo, solo en la dirección y en lugar de x e y, de forma de simplificar el procedimiento. Se asume que la posición del foco del lente objetivo se desplaza en la dirección z.
La primera etapa en algunas realizaciones del análisis de autofoco es una «función de respuesta a la configuración» donde las posiciones del punto de autofoco (y1, y2....yn) se miden en la cámara de obtención de imágenes para varias posiciones del lente objetivo (z1,z2...zn). Normalmente, 5 posiciones son adecuadas. En la Figura 27 se muestra un análisis con solo 3 posiciones. El desplazamiento del punto reflejado se muestra como imagen obtenida en una cámara de fluorescencia en los paneles inferiores. Para cada plano Z existe una posición y asociada del punto reflejado (centroide) en la cámara. Estos cinco puntos de datos (z1, y1), (z2, y2), (z3, y3), (z4, y4), (z5, y5) se pueden describir mediante una línea.
Ecuación 1
z = my0 + c
Los valores m y c se obtienen de los puntos de datos de ajustes de cuadrados mínimos como:
Ecuación 2
Ecuación 3
Ecuación 4
Por lo tanto, de los 5 puntos de datos, se determinan los valores de c, m e y0 que dan una función de respuesta conocida.
La siguiente etapa en dichas realizaciones del análisis de autofoco comprende «calcular C nueva (para la posición fuera de foco)», en donde c es constante para cada posición, es decir, no cambia para una posición fuera de foco o en foco. Sin embargo, sí cambia para posiciones diferentes. Por lo tanto, a medida que la plataforma se desplaza a una posición nueva, se calcula nuevaC a partir de los valores Z e y modificados como:
Ecuación 5
La tercera etapa en el proceso es utilizar C nueva para el cálculo de la posición Z requerida (nuevaZ) para obtener la posición y en foco (y0). Se sabe que:
Ecuación 6
Por lo tanto, Ecuación 7:
M e y0 se miden de la etapa 1 (una vez por chip), nuevaC se mide de la etapa 2 (cada posición). Por lo tanto, se puede calcular nuevaZ.
Otro aspecto en componentes en autofoco de la invención comprende requisitos de estabilidad del señalador láser. A efectos de evaluar cuánto se puede tolerar el error de puntero en el láser de autofoco, uno puede observar el objetivo como un lente delgado simple con la longitud focal adecuada, tal como se ilustra en el dibujo exagerado en la Figura 28.
Luego, la geometría y simple produce que el ángulo Φ que haría que el haz de láser con autofoco aparezca desplazado en un píxel se encuentre simplemente en (Δ/F) que es aproximadamente Δ/F para ángulos pequeños.
Para un objetivo de 20X (con la combinación de lente de tubo y lente de relé presente en algunas realizaciones), el tamaño del píxel es de aproximadamente 0,3 µm. La longitud focal de ese lente es de 10 mm. Por lo tanto, el ángulo de error que corresponde a 1 píxel es de aproximadamente 30 µrad. Algunas realizaciones del sistema tienen su autofoco configurado para una sensibilidad de desplazamiento de alrededor de 4 píxeles del punto de láser con autofoco por micrón de desplazamiento z.
Si se asume que es posible tolerar 0,5 µm de error de foco (que corresponde a un desplazamiento de dos píxeles en la posición del punto de láser), se observa que el cambio más grande del puntero que se puede tolerar en el caso del láser de autofoco es de 60 µrad.
A efectos de cumplir con ese tipo de requisito de estabilidad a variaciones de temperatura ambiente normales, es muy recomendable utilizar un láser de fibra ópticamente acoplado. Salvo que un láser en estado sólido sea controlado por temperatura de forma muy cuidadosa, será difícil mantener este tipo de precisión de puntero en un rango de especificación de temperatura ambiente (por ejemplo, 20-30°C).
A efectos de proveer información y teoría adicional respecto a los algoritmos de seguimiento de foco, a continuación, se provee un ejemplo más detallado para poner en práctica el sistema de autofoco.
La primera etapa en algunas realizaciones del procedimiento de seguimiento de foco es para obtener la imagen del punto de láser con autofoco en un dispositivo de obtención de imágenes, el cual puede ser la cámara de obtención de imágenes. Los datos de este punto primario se extraen en dos pasos, un primer paso grueso que determina la posición y el tamaño aproximados del punto, seguido de un segundo paso fino que determina los límites del punto correctamente antes de determinar el COL (centro de luz) y otras características del punto. El análisis del primer paso se puede llevar a cabo en 5 etapas: (1) la imagen de 16 bits se convierte en una imagen de 8 bits, con el máximo de la imagen fijado en 255, el mínimo de la imagen fijado en 0, y todos los demás valores en la escala de grises linealmente entre ellos; (2) se calcula la calidad de fotografía de la imagen. La calidad de fotografía se define como el promedio de la autocorrelación normalizada de la imagen con sí misma con desplazamientos de píxeles unitarios a la izquierda y píxeles unitarios hacia abajo. Si la imagen tiene ruido, entonces, dado que el ruido no se correlaciona consigo mismo, esta medición será baja; (3) a continuación, esta imagen se ubica en el umbral de 128. Todo por encima de este valor se considerará como primer plano, mientras que todo por debajo de este valor se considerará el fondo. A partir de la escala de grises 255 (es decir, los puntos de interés), la región crece para encontrar los 8 componentes de primer plano conectados; (4) de todos estos componentes de primer plano candidatos, se elige el componente con el brillo promedio más elevado como «el» componente que especifica la posición y el tamaño aproximados del punto primario; y (5) se calcula el cuadro delimitador de este componente.
El segundo análisis de paso (fino) se lleva a cabo en tres etapas: (1) la subimagen que corresponde a dos veces el área del cuadro delimitador se corta de la imagen en escala de grises de 8 bits. Esto hace que la población de píxeles del primer plano y del fondo sean aproximadamente iguales, de forma de hacer que sea más fácil funcionar de forma confiable para las técnicas de umbral con base en el histograma de la imagen estándar; (2) se calcula el histograma de la subimagen y se determina el «mejor» umbral en escala de grises que separa el primer plano del fondo. El umbral utilizado se denomina «umbral de Otsu» (ver IEEE Trans. Systems, Man, and Cybernetics, tomo 9, págs. 62-66, 1979, o Computer and Robot Vision, tomo 1. Addison-Wesley, 1992); y (3) la imagen se coloca en un umbral en el umbral de Otsu y se determinan los 8 componentes de primer plano conectados. Este es el blob del punto primario en el que se lleva a cabo cada extracción de característica posterior.
Se puede llevar a cabo un paso adicional para extraer la posición del punto secundario. Se pueden realizar cuatro etapas para llevar a cabo dicho paso adicional: (1) la imagen de 8 bits (del primer paso) se coloca en un umbral bajo de 16; (2) cabe destacar que en este umbral más bajo, aumenta la cantidad de píxeles (área) del componente de punto primario. Se registra esta área del punto primario y se utiliza para determinar qué tan ajustado o difuso es; (3) el componente (de tamaño suficiente) más cercano en distancia al componente de punto primario se identifica como el punto secundario; (4) se registra el centroide geométrico del punto secundario.
Determinación del centro de luz A efectos de determinar el centro de luz (COL) para el enfoque automático, se indica
como el centro de luz
del punto primario. Luego, esto se calcula para el blob del punto primario como:
5 donde la sumatoria toma todos los píxeles i en el blob con coordenadas con base en la imagen
y escala de grises gi (por encima del umbral).
Otras características del punto
Además de la calidad fotográfica y el centro de luz, la lista de características calculadas para el blob del punto primario incluye el área, la cual es una medición de qué tan difuso (no ajustado) es el blob primario. Esto se
10 configura en el área (conteo en píxeles) del blob primario en el umbral inferior dividido por su área en el umbral de Otsu. Otras características calculadas incluyen volumen (el brillo promedio, por encima del umbral, X área del blob primario); brillo promedio, que es la suma de los valores grises de los píxeles en el blob dividido por su área; y brillo máximo:valor gris máximo.
Luego, los datos extraídos se pueden utilizar para calibrar los 2 focos y, de esa manera, determinar cuánto
15 desplazar el objetivo con el fin de que la imagen quede en foco. El resumen del procedimiento de calibración es el siguiente: (1) se realiza la calibración para el foco Z (con ayuda del usuario) al inicio de cada operación; (2) al inicio de la calibración, el usuario se asegura de que la imagen se encuentre en foco, es decir, en el plano focal. Por lo tanto, ellos configuran el punto de foco Z, ZF ; (3) esta realización de autofoco depende del aporte del usuario y de las coordenadas del punto de láser de autofoco en una imagen; (4) a medida que cambia z durante el proceso de
20 calibración, el punto se desplaza en proporción lineal con el cambio de z a lo largo de una línea.
El procedimiento algorítmico de calibración inicia con una secuencia de centro de luces (x, y) extraída de la secuencia de imágenes de punto de autofoco adquiridas a medida que cambia z. De manera ideal, cuando estos puntos se grafican, deberían seguir una línea recta, como se observa a continuación.
Un centro ideal de secuencia de luz
Desafortunadamente, debido a varias fuentes de ruido, tanto físicos como informáticos, los puntos se desplazan de 25 la línea recta ideal, tal como se muestra:
Un centro real de secuencia de luz
Por lo tanto, se lleva a cabo un análisis de componente principal XY (ver, por ejemplo, LT. Jolliffe, Principal Component Analysis, 2.a ed. Springer Series in Statistics, 2002) con base en la regresión entre X e Y, lo que lleva a un nuevo sistema de coordenadas R y Q, tal como se muestra:
El espacio de coordenadas (R, Q)
Cabe destacar que: (1) el origen del sistema (R, Q) se encuentra en el centro de la masa de los puntos (x, y); (2) una mejor línea de ajuste (componente principal) define el eje R; y (3) la línea ortogonal respecto al eje R define el eje Q. El modelo requiere correlación elevada entre X e Y. Los valores de coordenada Q, por lo tanto, se pueden considerar como errores «residuales» de la mejor línea de ajuste, la idea es eliminar estos residuos y corregir las observaciones.
Por último, dado que el modelo requiere una relación lineal entre las coordenadas espaciales y los valores z (tal como se ilustró), se realiza una regresión lineal entre r y z para determinar los coeficientes de esta línea:
La relación lineal R-Z Además, el seguimiento del autofoco puede implicar varios entrenamientos de motores de regresión. 10 Entrenamiento del motor de regresión PCA XY
- Entrada:
- Una secuencia de centro de luces (x, y) extraída de la secuencia de imágenes de punto de autofoco adquiridas a medida que cambia z.
- Salida:
- Los coeficientes de regresión del PCA, es decir, transformación en el espacio de coordenadas (R, Q).
- Descripción:
- Llevar a cabo el análisis del componente principal y guardar los coeficientes. Asimismo, dada la posición de centroide del punto secundario, determinar si se encuentra a la izquierda o a la derecha del punto primario a lo largo del eje principal.
Entrenamiento del motor de regresión lineal RZ
- Entrada:
- Las coordenadas r obtenidas de la regresión del PCA, los valores z correspondientes, y el punto de foco Z, ZF.
- Salida:
- Los coeficientes de regresión lineal que relacionan (z-zF) con r.
- Descripción:
- Llevar a cabo el análisis de regresión lineal y guardar los coeficientes.
Entrenamiento del detector atípico
15 Se utiliza un esquema de detección atípico para advertir sobre la presencia de una burbuja o para señalar un problema con la rueda de filtro.
- Entrada:
- Las coordenadas q obtenidas de la regresión del PCA, junto con las características del punto para cada punto en la secuencia de calibración, se utilizan para entrenar un clasificador a detectar puntos atípicos.
- Salida:
- Configuraciones internas del detector atípico.
- Descripción:
- Para cada característica φ, el promedio µφ y la desviación estándar σφ se calculan a partir de los puntos utilizados durante la calibración. La idea general es que un punto se declararía un punto atípico si la característica φ se encuentra fuera de los límites de µφ ±3 σφ Sin embargo, en la puesta en práctica actual, solo las características de volumen y área se utilizan de esta manera, de hecho, solo los límites superiores se utilizan actualmente para estas dos características. Se establecen límites especiales para invalidar estos valores tanto para la calidad fotográfica como la característica de residuo q. Para la calidad fotográfica, se utiliza un límite inferior. Para el residuo, se utiliza un límite superior.
Operación del sistema de autofoco
Una operación comienza desde una imagen del punto de láser de autofoco y utiliza los coeficientes de las transformaciones aprendidas durante el proceso de calibración para realizar el mejor estimado para el desplazamiento de z requerido para quedar en foco.
- Entrada:
- Una imagen del punto de láser de autofoco.
- Salida:
- (z-zF) para quedar en foco. También se provee la recomendación de si desplazarse o no en función de la detección atípica.
- Descripción:
- Deriva el mejor estimado de (z-zF) con: 1. El algoritmo de extracción del punto. 2. Los coeficientes de regresión XY con base en PCA. 3. Los coeficientes de regresión RZ lineales. En una puesta en práctica, el esquema de detección atípico permite un desplazamiento únicamente en el caso de un residuo q grande. En el caso de calidad de fotografía baja, volumen elevado o área elevada, se recomienda el no desplazamiento. Si durante períodos extensos de no desplazamiento de z, tal como puede ser el desencadenado por los contaminantes/burbujas grandes en la celda de flujo, la superficie de la celda de flujo cambia lo suficiente como para hacer que el punto secundario ocurra localmente en todos los respectos con relación al punto primario visto en calibración, dicho algoritmo se acoplaría a dicho punto durante el resto del ciclo aunque la contaminación/burbuja dejaran de existir en el interior de la celda de flujo. A efectos de recuperarse de dicho problema, se pueden seguir los siguientes pasos: en caso de que un desplazamiento sea recomendado, se puede llevar a cabo una verificación adicional para ver si existe un punto secundario en la dirección opuesta a donde el entrenamiento dice que debería estar. Si es así, entonces un desplazamiento puede ser recomendado para esta mutación con los coeficientes de la regresión XY con base en PCA y la regresión RZ lineal.
Computadora
Tal como se observó anteriormente, los diversos componentes del presente sistema se acoplan a un procesador o una computadora programados de forma adecuada y que funcionan para indicar la operación de estos instrumentos
10 de acuerdo con instrucciones de entrada preprogramadas o del usuario, recibir datos e información desde estos instrumentos, e interpretar, manipular e informar sobre esta información al usuario. Como tal, la computadora se suele encontrar acoplada de forma adecuada a estos instrumentos/componentes (por ejemplo, que incluyen un convertidor de analógico a digital o de digital a analógico).
La computadora incluye opcionalmente el software apropiado para recibir instrucciones del usuario, ya sea en la
15 forma de entrada del usuario en campos de parámetros configurados, por ejemplo, en un GUI, o en la forma de instrucciones preprogramadas, por ejemplo, preprogramadas para una diversidad de operaciones específicas diferentes (por ejemplo, autofoco, secuenciación SBS. Luego, el software convierte estas instrucciones en lenguaje apropiado para indicar la operación correcta para llevar a cabo la operación deseada (por ejemplo, de dirección de fluido y transporte, autofoco, etc.).
Por ejemplo, la computadora se utiliza opcionalmente para dirigir un componente de flujo de fluido con el fin de controlar el flujo de fluido, por ejemplo, a través de una variedad de tuberías. Opcionalmente, el componente de flujo de fluido dirige el desplazamiento de los amortiguadores, nucleótidos, enzimas, etc. apropiados, hacia el interior y a través de la celda de flujo.
Opcionalmente, la computadora también recibe los datos de uno o más sensores/detectores incluidos en el sistema e interpreta los datos, ya sea que los provee en un formato que el usuario comprende o usa esos datos para iniciar más instrucciones del controlador, de acuerdo con la programación, por ejemplo, tal como en el monitoreo y el control de velocidades de flujo, temperaturas, y similares.
En la presente invención, la computadora suele incluir software para el monitoreo y el control de materiales en las celdas de flujo. De manera adicional, el software se utiliza opcionalmente para controlar la excitación de las etiquetas fluorescentes y monitorear las emisiones resultantes. La computadora también suele proveer instrucciones, por ejemplo, al componente de calefacción/refrigeración y el sistema de autofoco, etc.
Cualquier controlador o computadora incluye opcionalmente un monitor que suele ser una pantalla con tubo de rayos catódicos (CRT), una pantalla de panel plano (por ejemplo, una pantalla de cristal líquido de matriz activa, pantalla de cristal líquido) o similares. Los datos producidos a partir de los sistemas actuales, por ejemplo, los resultados de la secuencia de ácido nucleico, se visualizan de forma opcional en formato electrónico en el monitor. De manera adicional, los datos, por ejemplo, los perfiles de emisión de luz de los arreglos de ácido nucleico u otros datos recopilados del sistema, se pueden emitir en formato impreso. Los datos, ya sea en formato impreso o electrónico (por ejemplo, tal como se visualizan en un monitor), se pueden encontrar en diversos o múltiples formatos, por ejemplo, curvas, histogramas, series numéricas, tablas, gráficas y similares.
El circuito de computadora se suele ubicar en una caja que incluye, por ejemplo, varios chips de circuito integrado, tales como un microprocesador, memoria y circuitos de interfaz. La caja también incluye, opcionalmente, una unidad de disco duro, una unidad de disquete, una unidad extraíble de alta capacidad tal como un CD-ROM grabable, y otros elementos periféricos comunes. Los dispositivos de entrada, tales como el teclado o el mouse, proporcionan opcionalmente entrada desde un usuario y selección del usuario de las secuencias a ser comparadas o de otro modo manipuladas en el sistema informático pertinente.
Ejemplos de uso y variación de componente
Los sistemas SBS de la presente, en muchas realizaciones, comprenden subsistemas de obtención de imágenes y excitación con base en láser CCD/TIRF que pueden tomar imágenes de millones de cúmulos de ácido nucleico por muestra (normalmente en una celda de flujo) y que pueden detectar cada uno de los cuatro tintes fluorescentes (uno para cada una de las cuatro bases). Los componentes químicos de SBS, por ejemplo, nucleótidos, WO04018497, WO04018493 y US7057026, polimerasas, WO05024010 y WO06120433, técnicas de unión a la superficie, WO05065814, preparación y secuenciación del cúmulo, WO 9844151, WO06064199 y WO07010251, son compatibles con los componentes de celda de flujo canalizados de la presente, etc. Los aspectos del sistema de análisis de datos o computadora del sistema son opcionalmente capaces de procesar miles de imágenes por hora en información de secuencia.
A modo de resumen, en ejemplos particulares de secuenciación mediante SBS, el ADN genómico se fragmenta de forma aleatoria, tiene un casquete en el extremo con secuencias conocidas, y se une de forma covalente a un sustrato (tal como el canal en una celda de flujo), por ejemplo, mediante hibridación con un cebador covalente. A partir de dicha unión de ADN, se genera un arreglo de cúmulos de ácido nucleico, tal como se describe en WO9844141 y WO07010251. El análisis de SBS (por ejemplo, con los sistemas y dispositivos de la presente) puede generar una serie de imágenes de los cúmulos, las que luego se pueden procesar para leer la secuencia de los ácidos nucleicos en cada cúmulo que luego se pueden alinear en función de una secuencia de referencia para determinar las diferencias entre secuencias, una secuencia general más extensa o similares. Los algoritmos para el alineamiento de lecturas cortas de ácidos nucleicos se describen en WO05068089.
Tal como se describe anteriormente, cada ciclo de secuenciación incluirá una ronda de incorporación en la cadena de ácido nucleico en crecimiento. Dicho ciclo se suele llevar a cabo mediante una adición de los cuatro dNTP, cada uno modificado de forma que se pueda identificar cada base mediante un fluoróforo único. De manera adicional, los trifosfatos se modifican en la posición 3', de manera que se controla la extensión y no más de una sola base se puede agregar a cada molécula en cada ciclo. El concepto genérico de realizar cúmulos amplificados a partir de una única molécula de plantilla en un arreglo aleatoria, y la secuenciación posterior de dicho arreglo, se muestra en las Figuras 30-32, las que ilustran esquemáticamente varios aspectos de los procedimientos de secuenciación y métodos que llevan a cabo los sistemas de la presente. Por ejemplo, se presentan las etapas generales básicas de formación de cúmulos de ácido nucleico, los arreglos de cúmulos producidos (y una comparación de dichos arreglos de cúmulos con un arreglo más «tradicional») y un esquema de la metodología de secuenciación. La Figura 30 muestra los esquemas básicos de la creación de cúmulos de ácido nucleico y su secuenciación, mientras que la Figura 31 compara la densidad de ácido nucleico entre un arreglo (a la izquierda) y en un sustrato de cúmulo de ácido nucleico, tal como aquellos capaces de ser utilizados con los sistemas/dispositivos de la invención (a la derecha). La Figura 32 provee un dibujo que resume el procedimiento de secuenciación SBS, por ejemplo, tal como
lo llevan a cabo las realizaciones de la invención.
Tras la etapa de incorporación en donde un nucleótido etiquetado con fluorescencia se une al ácido nucleico de los miembros de los cúmulos a través de un enlazador escindible, se lavan los canales de la celda de flujo con el subsistema de flujo de fluido a efectos de eliminar cualquier nucleósido y enzima no incorporado.
A continuación, el sistema lleva a cabo una etapa de lectura, con la cual se registra la identidad de las etiquetas individuales (lectura como un grupo en cada cúmulo) incorporadas en la etapa de incorporación con microscopía óptica y se observa la base correspondiente incorporada. El sistema de secuenciación puede leer los cuatro fluoróforos diferentes con dos láseres en longitudes de onda distintas a través de la microscopía de reflexión interna total (TIRF) y cuatro filtros de emisión distintos en partes del espectro diferentes. Las imágenes se registran en una cámara CCD y se informan en el módulo de computadora acoplado.
Luego de que se lee la incorporación específica, una etapa de desprotección elimina el bloque y resto etiquetado del ADN unido a la superficie. La desprotección permite la repetición de la incorporación anterior y de las etapas de lectura hasta que se obtienen ciclos suficientes de información para ubicar exclusivamente la secuencia de cada cúmulo de ácido nucleico (presente en la celda de flujo) en su contexto genómico. Por ejemplo, en el caso del genoma humano, este será de >16 ciclos, por ejemplo, alrededor de 25-50 ciclos. Las imágenes se pueden almacenar fuera de línea o se pueden procesar en tiempo real, de manera que las bases individuales se lean durante el proceso de secuenciación. El procesamiento de imágenes provee una base de datos de una lectura de secuencia de cada cúmulo, donde cada cúmulo deriva de una posición aleatoria en alguna parte de la totalidad de la muestra (por ejemplo, un genoma). Por lo tanto, durante el transcurso del procedimiento, se suele construir una base de datos de millones de lecturas de secuencia que cubren cada parte del genoma. Dicha base de datos se puede comparar, por ejemplo, con una base de datos de cada secuencia derivada de una secuencia de referencia, etc. En diversas realizaciones, el análisis de imágenes, la determinación de secuencias y/o el alineamiento de secuencias se llevan a cabo opcionalmente «fuera de línea», luego de la captura de imágenes fluorescentes. Dichos procedimientos también se llevan a cabo de forma opcional mediante una computadora independiente de la que se encuentra presente en los sistemas actuales.
Tal como se mencionó en la presente, la presente invención puede variar entre realizaciones (por ejemplo, en cantidad y tipo de componentes o subsistemas). Por ejemplo, en una realización de la invención (realización «b»), los componentes pueden comprender: láseres de iluminación (utilizados para excitar los fluoróforos en las reacciones de secuenciación) de 532 y 660 nm cada uno con potencia de 75 mW (u opcionalmente más) que se proyectan como un círculo de 0,5 mm en el fondo del canal en una celda de flujo; un prisma TIR de vidrio (68 grados
o 71 grados); una celda de flujo de vidrio con canales que tienen un área de 1x61 mm y 8 canales con una profundidad de 100 µm (se pueden utilizar 39x1 mm o acceder a estos para la observación); un lente objetivo en el componente de la cámara que comprende una Nikon Plan Apo 20x, 0,75 NA (corregida para el espesor del vidrio); filtros de emisión que comprenden el filtro de paso de banda de 557±11 nm, 615±40 nm, 684±11 nm y 740±50nm (u opcionalmente, filtros tales como los ilustrados o similares a aquellos ilustrados en la Figura 22); relé óptico que comprende un adaptador Navitar 1,33x para una amplificación neta de alrededor de 23x, o un lente de tubo no amplificado; y una cámara CCD digital que comprende una cámara de 1 mpíx o 1K Photometries Cascade, con píxeles de 8 µm de tamaño, y una velocidad de lectura de 10 MHz, y un objetivo de microscopio de amplificación 20x con 0,75 NA (apertura numérica). La realización «b» de Cascade puede proveer una realización neta de campo de 0,35 mm con resolución óptica de aproximadamente 0,8 μm (algo mayor que el límite de difracción).
Dichas realizaciones de 1 megapíxel pueden iluminar un círculo de 0,5 mm y detectar un cuadrado de 0,35 mm en su interior. La celda de flujo en dichas realizaciones puede tener un total de 156 mosaicos no superpuestos en un canal o más. Los cúmulos se pueden encontrar en el orden de 1 µm. El NA del microscopio puede proveer opcionalmente un PSF de aproximadamente 0,6 µm a 700 nm. Por lo tanto, un cúmulo «típico» adquiere un diámetro aparente de aproximadamente 1,2 µm. En el plano de la imagen, 1 píxel representa aproximadamente 0,35 µm, así que un cúmulo típico tendría alrededor de 3,5 píxeles de diámetro. El área de un cúmulo es de alrededor de 9,25 píxeles. La distribución de Poisson de objetos con área de 10 píxeles en una CCD de 1 mpíxel muestra que un máximo de alrededor de 38 000 objetos no se superpondrán, tal como se ilustra en la Figura 29. La Figura 29 provee un ejemplo de rendimiento de información de un ejemplo de configuración de un sistema de la invención. La cantidad de cúmulos detectados es en función de la cantidad total de cúmulos y el área de cúmulos mínima.
En el caso de los ejemplos de realizaciones «b», el límite de resolución (mediante el uso del criterio de Rayleigh) es de alrededor de 0,6 µm y los cúmulos son de alrededor de 1 µm para un tamaño aparente de alrededor de 1,2 µm. Los píxeles se mapean a alrededor de 0,35 µm en el plano de la imagen, así que un cúmulo es de alrededor de 3,5 píxeles a lo ancho y alrededor de 10 píxeles en el área. En el caso de cúmulos distribuidos de forma aleatoria, la cantidad máxima de cúmulos no confundidos en la cámara de 1 mpíx será de alrededor de 38 000 en un mosaico cuadrado de 0,35 mm, las celdas de flujo «b» admiten 250 mosaicos de iluminación no superpuestos por canal para un total de 1200 mosaicos por celda de flujo. Esto es 45,6 M bases por ciclo y alrededor de 1 GBase en una operación de 25 ciclos. La superposición de la iluminación y la compresión estrecha de los mosaicos significan que se pueden obtener imágenes de 200 mosaicos por canal y, por lo tanto, 1600 por celda de flujo.
Para el rendimiento del subsistema de iluminación «b», las longitudes de onda láser son: longitud de onda láser verde de 532 nm; potencia del láser verde de opcionalmente 75 mW; longitud de onda láser rojo de 660 nm; potencia del láser rojo de opcionalmente 75 mW; diámetro de haz de TIRF proyectado de 0,5 mm; y variación permitida a través del haz de 20 %.
En otra realización (realización «g»), el sistema de la invención puede comprender: láseres de iluminación de 532 y 660 nm, cada uno con una potencia de 500 mW (proyectado idealmente como un cuadrado de 0,5 mm), un prisma de vidrio TIR (68 grados); una celda de flujo de vidrio con 8 canales de 100 µm de profundidad y un área de 1 x 61 mm con 50 mm utilizables; un lente objetivo que comprende una Nikon Plan Fluor 40x, collar ajustable 0,6 NA, o 40x personalizado, 0,75 NA corregido para una celda de flujo SBS; filtros de emisión que comprenden filtros de paso de banda de 557±11 nm, 615±40 nm, 684±11 nm y 740±50 nm; óptica de imagen que comprende un doblete acromático de 150 mm para la amplificación del sistema de 30x; y una cámara CCD digital que comprende una cámara Photometries CoolSNAP K4, 2048 por 2048 píxeles, 4 mpíx, tamaño del píxel 7,4 µm, lectura a 20 MHz. Dicha realización puede proveer un rendimiento neto de campo de 0,5 mm con menos de 0,7 µm de límite de difracción. Puede comprender un lente de relé de 0,75x para un sistema de amplificación de 30x totales.
En algunas de dichas realizaciones «g», se desea que un cuadrado de 0,5 mm se ilumine de forma uniforme y que el mismo cuadrado de 0,5 mm sea detectado (2048 x 7,4 / 30 000). Los cúmulos en las celdas de flujo en la presente pueden ser tan pequeños como 0,5 µm. PSF a 700 nm es de aproximadamente 0,7 µm. Por lo tanto, los cúmulos aparecen como de 0,86 µm, donde 1 píxel representa 0,25 µm. El cúmulo típico, por lo tanto, es de 3,5 píxeles y el área de un cúmulo es de 9,25 píxeles. Una CCD de 4 mpíxeles provee un máximo de alrededor de 135 000 cúmulos no sobrepuestos detectables por mosaico.
La huella de iluminación es cuatro veces más grande, lo cual quiere decir que se necesita un incremento en 4 veces de las potencias del láser para obtener el mismo nivel de señal en el mismo tiempo de exposición. Para minimizar los tiempos de exposición, la potencia del láser se puede incrementar más. Por lo tanto, dicho sistema es capaz de generar 2 mil millones de bases de secuencia por experimento, si se utilizan los siguientes parámetros: Objetivo con apertura numérica 0,8; amplificación de 20x; cámara de 4 mpíxel; mosaicos de iluminación de 760 µm x 760 µm; 1 carril de obtención de imágenes por canal de flujo; 48 mosaicos por carril; 8 canales por chip; cúmulos de tamaño promedio de 0,7 µm; y longitud de lectura de 40 bases. Por lo tanto, rendimiento total = 8 canales x 48 mosaicos x 135 000 cúmulos/mosaico x 40 ciclos = 2,07 mil millones de bases (G).
El aumento del tamaño de la celda de flujo para aumentar la cantidad de mosaicos de los que se obtienen imágenes, la densidad de los cúmulos o la longitud de lectura, permitirá mejoras en la cantidad de bases generadas por celda de flujo. Es posible montar dos o cuatro cámaras en paralelo para obtener un sistema con dos o cuatro veces el rendimiento. En las Figuras 36 y 37 se muestra una configuración de dos cámaras. Es posible reducir el tiempo de análisis mediante el uso de técnicas tales como la integración con retraso de tiempo (TDI), lo que significa que la superficie se analiza de forma continua en lugar de obtener imágenes en mosaicos discretos. El instrumento se puede configurar para que lleve a cabo múltiples etapas del proceso químico con múltiples sistemas de fluido acoplados a un único sistema óptico. En el único sistema de proceso químico, el sistema óptico no obtiene imágenes cuando tienen lugar las etapas del proceso químico. Si las partes del proceso químico u obtención de imágenes del ciclo tienen extensiones similares, entonces durante 50 % del tiempo, el instrumento no registra ningún dato. Si se acelera más la parte de análisis del sistema, entonces un porcentaje aún mayor del tiempo de operación experimental se destina a realizar los procesos químicos. Esto puede disminuir si el sistema se configura de manera que múltiples celdas de flujo sean procesadas de forma simultánea, con una celda de flujo siempre sometida a la obtención de imágenes. Las representaciones esquemáticas de un portador de celda de flujo dual se ilustran en la Figura 43.
Si bien el sistema tal como se describe se muestra con la iluminación desde abajo y el objetivo en la parte superior, el sistema tal como se ilustra se puede invertir para iluminar desde la parte superior y tener el sistema de detección debajo. Véase anteriormente. La calefacción y la iluminación se pueden llevar a cabo de cualquier lado del sustrato, de manera que la calefacción del lado inferior y la iluminación del lado superior también se encuentren comprendidas por el alcance de la invención. La operación de sistemas comprendidos por el alcance de la invención se describe adicionalmente en los siguientes métodos generales.
Ejemplos para el uso del sistema en la secuenciación
Los siguientes son ejemplos de técnicas generales y similares (por ejemplo, para la formación de cúmulos de ácido nucleico) que se pueden poner en uso con los sistemas de la invención. Se entenderá que dichas descripciones y ejemplos no son necesariamente limitantes en cuanto a los sistemas actuales y su uso salvo que esto se establezca específicamente. Los métodos para formar y secuenciar cúmulos de ácido nucleico se describen en su totalidad en la solicitud de patente WO07010251, pero algunos elementos de estos protocolos se resumen a continuación.
Preparación de sustratos y formación de cúmulos de ácido nucleico
Recubrimiento de acrilamida de los chips de vidrio
Los soportes sólidos utilizados para el acoplamiento del ácido nucleico a ser secuenciado son opcionalmente chips de vidrio de 8 canales, tal como los provistos por Silex Microsystems (Suecia). Sin embargo, las condiciones y los procedimientos experimentales también se pueden aplicar fácilmente a otros soportes sólidos. En algunas realizaciones, los chips se lavaron de la siguiente manera: Decon puro durante 30 minutos, milliQ H2O durante 30 minutos, NaOH 1N durante 15 minutos, milliQ H2O durante 30 minutos, FIC1 0,1N durante 15 minutos, milliQ H2O durante 30 minutos. La preparación de la solución de polímero conllevó:
Para 10 ml de mezcla de polimerización al 2 %,
- -
- 10 ml de solución de acrilamida al 2 % en milliQ H2O;
- -
- 165 Al de una solución de 100mg/m 1N-(5-bromoacetamidilpentil) acrilamida (BRAPA) en DMF (23,5 mg en 235 µl de DMF);
- -
- 11.5 µl de TEMED; y,
- -
- 100 µl de una solución de 50 mg/ml de persulfato de potasio en milliQ H2O (20 mg en 400 µl de H2O).
En dichas realizaciones, la solución de 10 ml de acrilamida se desgasificó en primer lugar con argón durante 15 minutos. Las soluciones de BRAPA, TEMED y persulfato de potasio se agregaron de forma sucesiva a la solución de acrilamida. Luego, la mezcla se mezcló en vórtex y se utilizó inmediatamente. Luego, la polimerización se llevó a cabo durante 1h 30 a temperatura ambiente. Después, los canales se lavaron con milliQ H2O durante 30 minutos y se rellenaron con solución amortiguadora de fosfato de potasio 0,1 M para su almacenamiento hasta que sea necesario.
Síntesis de N-(5-bromoacetamidilpentil)acrilamida (BRAPA)
Se obtuvo ácido sulfónico N-Boc-1,5-diaminopentano tolueno de Novabiochem. El cloruro de bromoacetilo y el cloruro de acriloilo se obtuvieron de Fluka. Todos los demás reactivos fueron productos Aldrich.
Se agregó cloruro de acriloilo (1,13 ml, 1 eq) a una suspensión agitada de ácido sulfónico de N-Boc-1,5diaminopentano tolueno (5,2 g, 13,88 mmol) y trietilamina (4,83 ml, 2,5 eq) en THF (120 ml) a 0°C a través de un embudo de adición con ecualización de presión en el transcurso de una hora. Luego, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente y el avance de la reacción se verificó mediante TLC (éter de petróleo: acetato de etilo, 1:1). Luego de dos horas, se filtraron las sales formadas durante la reacción y el filtrado se evaporó hasta la sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (éter de petróleo puro seguido de un gradiente de acetato de etilo hasta 60 %) para proporcionar 2,56 g (9,98 mmol, 71 %) del producto 2 como un sólido beige. 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) : 1,20-1,22 (m, 2H, CH2), 1,29-1,43 (m, 13H; tBu, 2xCH2), 2,86 (q, 2H, J = 6,8 Hz y 12,9 Hz, CH2), 3,07 (q, 2H, J = 6,8 Hz y 12,9 Hz, CH2), 5,53 (dd, 1H, J = 2,3 Hz y 10,1 Hz, CH), 6,05 (dd, 1H, J = 2,3 Hz y 17,2 Hz, CH), 6,20 (dd, 1H, J = 10,1 Hz y 17,2Hz, CH), 6,77 (t, 1H, J = 5,3 Hz, NH), 8,04 (bs, 1H, NH). Masa (electrospray+) calculada para C13H24N203 256, se observó 279 (256+Na+).
Se disolvió el producto 2 (2,56g, 10 mmol) en ácido trifluoroacético:diclorometano (1:9, 100 ml) y se agitó a temperatura ambiente. El progreso de la reacción se monitoreó mediante TLC (diclorometano: metanol 9:1). Al completarse, la mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad, el residuo se co-evaporó tres veces con tolueno y luego se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (diclorometano puro seguido de un gradiente de metanol hasta 20 %). Se obtuvo el producto 3 como un polvo blanco (2,43 g, 9 mmol, 90 %). 1H NMR (400 MHz, D20): 1,29-1,40 (m, 2H, CH2), 1,52 (quint., 2H, J = Hz, CH2), 1,61 (quint., 2H, J = 7,7 Hz, CH2), 2,92 (t, 2H, J = 7,6 Hz, CH2), 3,21 (t, 2H, J = 6,8 Hz, CH2), 5,68 (dd, 1H, J = 1,5 Hz y 10,1 Hz, CH), 6,10 (dd, 1H, J =: 1,5 Hz y 17,2 Hz, CH), 6,20 (dd, 1H, J = 10,1 Hz y 17,2 Hz, CH). Masa (electrospray+) calculada para C8H16N20 156, se observó 179 (L56+Na+).
Se agregó cloruro de bromoacetilo (2,07 ml, 1,1eq) a una suspensión del producto 3 (6,12 g, 22,64 mmol) y trietilamina (6,94 ml, 2,2 eq) en THF (120 ml), a través de un embudo de adición con ecualización de presión, en el transcurso de una hora y a -60°C (baño de hielo seco e isopropanol en un vaso Dewar). Luego, la mezcla de
reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y la reacción completa se verificó mediante TLC (diclorometano:metanol, 9:1) al día siguiente. Se filtraron las sales formadas durante la reacción y la mezcla de reacción se evaporó hasta la sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía (diclorometano puro seguido de un gradiente de metanol hasta 5 %).
Se obtuvieron 3,2 g (11,55 mmol, 51 %) del producto 1 (BRAPA) como un polvo blanco. Una recristalización adicional que se llevó a cabo en éter de petróleo:acetato de etilo proporcionó 3 g del producto 1. 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) : 1,21-1,30 (m, 2H, CH2), 1,34-1,48 (m, 4H, 2xCH2), 3,02-3,12 (m, 4H, 2xCH2), 3,81 (s, 2H, CH2), 5,56 (d, 1H, J = 9,85 Hz, CH), 6,07 (d, 1H, J = 16,9 Hz, CH), 6,20 (dd, 1H, J = 10,1 Hz y 16,9 Hz, CH), 8,07 (bs, 1H, NH), 8,27 (bs, 1H, NH). Masa (electrospray+) calculada para C10H17BrN2O2 276 o 278, se observó 279 (278+H+), 299 (276+Na+).
El proceso de formación del cúmulo
Fluidos
En el caso de todas las etapas del fluido durante el proceso de formación del cúmulo, se utiliza opcionalmente una bomba peristáltica Ismatec IPC equipada con tubería Ismatec Ref 070534-051 (naranja/amarilla, diámetro interno de 0,51 mm). La bomba se inserta en dirección hacia delante (retirando los fluidos). Se instala una placa de desechos para recoger solución usada en la salida de la tubería de la bomba peristáltica. Durante cada etapa del proceso, se distribuyen las diferentes soluciones utilizadas en 8 tiras del microtubo del tubo con 1 tubo por tubería de entrada del chip a efectos de monitorear el bombeo correcto de las soluciones en cada canal. El volumen requerido por canal se especifica en cada etapa.
Control térmico
Con el fin de hacer posible la incubación a temperaturas diferentes durante el proceso de formación de cúmulos, el chip Silex se coloca en la parte superior de un termociclador MJ-Research. El chip se coloca en la parte superior de un bloque de cobre hecho a medida, el que se acopla al bloque de calefacción plano del termociclador. El chip se encuentra cubierto con un pequeño bloque Perspex y se mantiene en su lugar con cinta adhesiva. Tanto la bomba como el termociclador son controlados por secuencias de comandos informáticos que hacen que el usuario cambie soluciones entre cada etapa.
Injerto de cebadores en la superficie del chip recubierto por SFA
Un chip recubierto por SFA se coloca en un termociclador MJ-Research modificado y se acopla a una bomba peristáltica, tal como se describe anteriormente. La mezcla de injertos que consiste en 0,5 µM de un cebador directo y 0,5 µM de un cebador inverso en solución amortiguadora de fosfato 10 mM (pH 7,0) se bombea al interior de los canales del chip a una velocidad de flujo de 60 µl/min durante 75 segundos a 20°C. Luego, el termociclador se calienta hasta 51,6°C, y el chip se incuba a esta temperatura durante 1 hora. Durante este tiempo, la mezcla de injertos se somete a 18 ciclos de bombeo: la mezcla de injertos se bombea a 15 µl/min durante 20 segundos, luego la solución se bombea hacia adelante y hacia atrás (5 segundos hacia adelante a 15 µl/min, luego 5 segundos hacia atrás a 15 µl/min) durante 180 segundos. Luego de 18 ciclos de bombeo, el chip se lava mediante bombeo en 5x SSC/5 mM EDTA a 15 µl/min durante 300 segundos a 51,6°C. Luego, el termociclador se enfría hasta 20°C.
Hibridación de plantilla de ADN
Las plantillas de ADN a ser hibridadas al chip injertado se diluyen a la concentración requerida (actualmente, 0,5-2 µM) en 5x SSC/Tween 0,1 %. El ADN diluido se calienta en un bloque de calefacción a 100°C durante 5 minutos para desnaturalizar el ADN de cadena doble en cadenas simples adecuadas para la hibridación. Luego, el ADN se refrigera en el momento de forma inmediata en un baño de hielo/agua durante 3 minutos. Se giran brevemente los tubos que contienen el ADN en una centrífuga para recoger cualquier condensación y luego se transfiere a una tira de 8 tubos refrigerada previamente y se utiliza de inmediato.
El chip injertado que se mencionó anteriormente es cebado al bombear 5x SSC/Tween 0,1 % a 60 µl/min durante 75 segundos a 20°C. Luego, se calienta el termociclador hasta 98,5°C, y el ADN desnaturalizado se bombea a 15 µl/min durante 300 segundos. Se pone en uso una bomba adicional a 100 µl/min durante 10 segundos para eliminar las burbujas formadas al calentar la mezcla de hibridación. Luego, la temperatura se mantiene a 98,5°C durante 30 segundos, antes de enfriarse lentamente hasta 40,2°C en 19,5 minutos. El chip luego se lava mediante bombeo 0,3x SSC/Tween 0,1 % a 15 µl/min durante 300 segundos a 40,2°C. Luego se corre la secuencia de comandos sin interrupciones hasta la siguiente etapa.
Amplificación
Las moléculas de plantilla hibridada se amplifican mediante la unión de una reacción en cadena de la polimerasa con los cebadores injertados y una polimerasa termoestable. El amortiguador de amplificación que consiste en Tris 10 mM (pH 9,0), KCl 50 mM, MgC12 1,5 mM, betaína 1 M y DMSO 1,3% se bombea en el chip a 15 µl/min durante 200 segundos a 40,2°C. Luego, la mezcla de amplificación del amortiguador mencionado anteriormente
complementado con dNTP 200 µM y 25 U/ml de Taq polimerasa se bombea a 60 µl/min durante 75 segundos a 40,2°C. Luego, el termociclador se calienta hasta 74°C y se mantiene a esta temperatura durante 90 segundos. Esta etapa hace posible la extensión de los cebadores unidos a la superficie con los que se hibridan las cadenas de la plantilla de ADN. Luego, el termociclador lleva a cabo 50 ciclos de amplificación mediante el calentamiento hasta 98,5°C durante 45 segundos (desnaturalización de cadenas unidas), 58°C durante 90 segundos (hibridación de cadenas con cebadores de la superficie) y 74°C durante 90 segundos (extensión del cebador). Al finalizar cada incubación a 98,5°C, se bombea una mezcla fresca de PCR en los canales del chip a 15 µl/min durante 10 segundos. Así como provee reactivos frescos para cada ciclo de la PCR, esta etapa también remueve las cadenas de ADN y cebadores que se han desacoplado de la superficie y que podrían llevar a la contaminación entre los cúmulos. Al finalizar el termociclado, el chip se enfría hasta 20°C. Luego, el chip se lava al bombear 0,3x SSC/0,1 % Tween a 15 µl/min durante 300 segundos a 74°C. El termociclador luego se enfría hasta 20°C.
Linealización
La mezcla de linealización que consiste en periodato de sodio 0,1 M y etanolamina 0,1 M se bombea en el chip a 15 µl/min durante 1 hora a 20°C. Luego el chip se lava mediante bombeo en agua a 15 µl/min durante 300 segundos a 20°C.
Bloqueo (opcional)
Esta etapa utiliza la transferasa terminal para incorporar un didesoxinucleótido en los extremos de OH en 3’ libres de cadenas de ADN (tanto cebadores injertados como moléculas de cúmulo amplificado).
La solución amortiguadora de bloqueo que consiste en acetato de potasio 50 mM, Tris-acetato 20 mM, acetato de magnesio 10 mM, ditiotreitol 1 mM (pH 7,9) y 250 µM de CoC12 se bombea en el chip a 15 µl/min durante 200 segundos a 20°C. Luego, la mezcla de bloqueo de la solución amortiguadora mencionada anteriormente complementada con 2,4 µM de ddNTP y 250 U/ml de transferasa terminal se bombea a 15 µl/min durante 300 segundos a 37,7°C. El termociclador se mantiene a 37,7°C durante 30 minutos, mientras que la mezcla de bloqueo se bombea en el chip a 15 µl/min durante 20 segundos cada 3 minutos. Luego del bloqueo, el chip se lava al bombear 0,3x SSC/Tween 0,1 % a 15 µl/min durante 300 segundos a 20°C.
Desnaturalización de cúmulos e hibridación de cebador de secuenciación
Esta etapa utiliza NaOH para desnaturalizar y lavar una de las cadenas de los cúmulos amplificados, linealizados y bloqueados. Luego de un lavado para eliminar el NaOH, se hibrida el cebador de secuenciación con las cadenas simples que quedan en la superficie.
Luego del bloqueo, se desnaturaliza el ADN de cadena doble en los cúmulos al bombear NaOH 0,1N a 15 µl/min durante 300 segundos a 20°C. El chip luego se lava al bombear TE (Tris 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM) a 15 µl/min durante 300 segundos a 20°C. El cebador de secuenciación se diluye a 0,5 µM en 5x SSC/Tween 0,1 %, y se bombea en los canales a 15 µl/min durante 300 segundos a 20°C. El termociclador luego se calienta hasta 60°C y se mantiene a esta temperatura durante 15 minutos. Luego, el termociclador se enfría hasta 40,2°C y el chip se lava al bombear 0,3x SSC/Tween 0,1 % a 15 µl/min durante 300 segundos.
En ese momento, los cúmulos están preparados para la enzimología de secuenciación del primer ciclo, por ejemplo, con los sistemas y los dispositivos de la presente invención.
La secuencia de ADN utilizada en este proceso fue una monoplantilla de secuencia simple de 400 bases con extremos complementarios a los cebadores injertados. El ADN dúplex se desnaturalizó tal como se describe anteriormente.
Injertos de cebadores
Los cebadores suelen ser oligonucleótidos de 5,-fosforotioato que incorporan cualquier secuencia específica o modificación necesaria para la escisión. Sus secuencias y proveedores varían de acuerdo con el experimento en el que se usarán y, en este caso, eran complementarias a los extremos en 5’ del dúplex de plantilla.
Secuenciación de cúmulos linealizados
Los cúmulos amplificados contenían un enlace diol en uno de los cebadores injertados. Los enlaces diol se pueden introducir al incluir un enlace adecuado en uno de los cebadores utilizados para la amplificación de fase sólida.
Los cebadores adecuados que incluyen cualquier secuencia específica de la plantilla deseada se pueden producir mediante técnicas estándar de síntesis de ADN automática con componentes disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Fidelity Systems Inc., ATD).
Un cebador que contiene diol escindible tendría normalmente la siguiente estructura:
5’-fosforotioato-arm 26-diol 22A-secuencia-3’ OH.
En donde «secuencia» representa una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar con la plantilla a ser amplificada. Las estructuras de los componentes de arm26 y diol22A (de Fidelity Systems Inc, MD, EUA) son las siguientes:
Los productos que contienen dichos enlaces diol se pueden escindir con periodato, tal como se describió
anteriormente, y los polinucleótidos de cadena simple resultantes se hibridan tal como se describió anteriormente.
Ciclos de secuenciación de ADN
La secuenciación se llevó a cabo con nucleótidos modificados preparados tal como se describe en la solicitud de
patente internacional WO 2004/018493, y etiquetados con cuatro fluoróforos distintos disponibles comercialmente
(Molecular Probes Inc.).
Se utilizó una enzima de la 9°N polimerasa con mutación (una exo-variante que incluye la mutación triple
L408Y/Y409A/P410V y C223S) para las etapas de incorporación de nucleótidos.
La mezcla de incorporación, la solución amortiguadora de incorporación (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, MgSO4 6 mM,
EDTA 1 mM, 0,05 % (v/v) Tween-20, NaCl 50 mM) además de YAV exo-C223S 110 nM, y 1µM cada uno de los
cuatro nucleótidos etiquetados, se aplicó a las plantillas en cúmulos y se calentó hasta 45°C.
Las plantillas se mantuvieron a 45°C durante 30 minutos, se enfriaron hasta 20°C y se lavaron con solución
amortiguadora de incorporación, luego con 5x SSC/Tween 20 0,05 % . Luego, las plantillas se expusieron a solución
amortiguadora para la obtención de imágenes (Tris 100 mM pH7,0, NaCl 30 mM, Tween 20 0,05 %, ascorbato de
sodio 50 mM, recién disuelto).
Las plantillas se analizaron en 4 colores a temperatura ambiente.
Luego, las plantillas se expusieron a ciclos de secuenciación de escisión e incorporación de la siguiente manera:
Escisión
Cebador con solución amortiguadora de escisión (Tris 0,1 M pH 7,4, NaCl 0,1 M y Tween 20 0,05 %). Calentar hasta
60°C
Tratar los cúmulos con mezcla de escisión (TCEP 100 mM en solución amortiguadora de escisión).
Esperar un total de 15 minutos además de bombear solución amortiguadora fresca cada 4 minutos,
Enfriar hasta 20°C.
Lavar con solución amortiguadora de enzimología.
Lavar con 5X SSC/Tween 20 0,05 %.
Cebador con solución amortiguadora para la obtención de imágenes.
Analizar en 4 colores a temperatura ambiente
Incorporación
Cebadora con solución amortiguadora de incorporación. Calentar hasta 60°C.
Tratar con mezcla de incorporación. Esperar un total de 15 minutos además de bombear mezcla de incorporación
fresca cada 4 minutos,
Enfriar hasta 20°C.
Lavar con solución amortiguadora de incorporación.
Lavar con 5X SSC/Tween 20 0,05 %.
Cebador con solución amortiguadora para la obtención de imágenes.
Analizar en 4 colores a temperatura ambiente
Repetir el proceso de incorporación y escisión durante tantos ciclos como sea necesario. Los nucleótidos
incorporados se detectaron con el aparato de obtención de imágenes por fluorescencia descrito anteriormente.
De manera alternativa, la celda de flujo se puede secuenciar de forma completamente automática, con la primera
incorporación realizada en este instrumento, tal como se describe a continuación.
Luego de configurar la celda de flujo en el colector del instrumento, las plantillas se pueden exponer a los ciclos de
secuenciación descritos a continuación: incorporación de primera base, obtención de imágenes luego escisión
alternante, obtención de imágenes e incorporación, etapas de obtención de imágenes para tantos ciclos de
secuenciación como sea necesario.
Incorporación de primera base
Bombear 1000 ul de solución amortiguadora de incorporación a temperatura ambiente
Fijar la temperatura a 55°C y mantenerla
Esperar durante 2 minutos
Bombear 600 ul de mezcla de incorporación
Esperar durante 4 minutos
Bombear 200 ul de mezcla de incorporación
Esperar durante 4 minutos
Bombear 200 ul de mezcla de incorporación
Esperar durante 4 minutos
Fijar la temperatura a 22°C
Esperar durante 2 minutos
Bombear 600 ul de solución amortiguadora de incorporación
Bombear 600 ul de solución amortiguadora de sal elevada
Bombear 800 ul de mezcla de análisis
Detener refrigeración activa
Etapa de obtención de imágenes
Escisión
Bombear 1000 ul de solución amortiguadora de escisión a temperatura ambiente
Fijar la temperatura a 55°C y mantenerla
Esperar durante 2 minutos
Bombear 600 ul de mezcla de escisión
Esperar durante 4 minutos
Bombear 200 ul de mezcla de escisión
Esperar durante 4 minutos
Bombear 200 ul de mezcla de escisión
Esperar durante 4 minutos
Bombear 600 ul de solución amortiguadora de incorporación Bombear 600 ul de solución amortiguadora de sal elevada Bombear 800 ul de mezcla de análisis Detener refrigeración activa Etapa de obtención de imágenes Incorporación Bombear 1000 ul de solución amortiguadora de incorporación a temperatura ambiente Fijar la temperatura a 55°C y mantenerla Esperar durante 2 minutos Bombear 600 ul de mezcla de incorporación Esperar durante 4 minutos Bombear 200 ul de mezcla de incorporación Esperar durante 4 minutos Bombear 200 ul de mezcla de incorporación Esperar durante 4 minutos Fijar la temperatura a 22°C y mantenerla Esperar durante 2 minutos Bombear 600 ul de solución amortiguadora de incorporación Bombear 600 ul de solución amortiguadora de sal elevada Bombear 800 ul de mezcla de análisis Detener refrigeración activa. Se registró cada mosaico de cada chip para el proceso no completamente automático mencionado anteriormente en
cada uno de los cuatro colores que corresponden a los nucleótidos etiquetados. Las imágenes se analizaron para
elegir el color más brillante para cada cúmulo y este análisis de intensidad de la imagen se utilizó para identificar la
base para cada cúmulo en cada ciclo. Las imágenes de cada ciclo se colocalizaron para obtener la secuencia que
corresponde a cada cúmulo. Al conocerse la secuencia de cada cúmulo, y ser la misma para cada cúmulo en el
experimento precedente, se podrían analizar las tasas de error (es decir, los cúmulos no identificados como la
secuencia correcta) para cada ciclo de incorporación de nucleótidos. Las tasas de error fueron menos de 1 % para
los primeros 20 ciclos del experimento, lo que quiere decir que la secuencia conocida de la monoplantilla se
identificó correctamente.
Claims (15)
- REIVINDICACIONES1. sistema configurado para secuenciar uno o más polinucleótidos que comprende:a) plataforma configurada para contener un sustrato sólido que tiene uno o más polinucleótidos unidos a este;b) sistema de dirección de fluido para poner, de manera que se pueda controlar, uno o más reactivos que tengan etiquetas fluorescentes en contacto con los polinucleótidos;c) sistema de control de temperatura para regular una temperatura de al menos uno del sustrato sólido o de los reactivos;d) sistema de iluminación para excitar las etiquetas fluorescentes a través de reflexión interna total (TIR) que comprende al menos un láser de excitación acoplado a través de una fibra óptica multimodal con un índice de refracción que cambia de forma dinámica para obtener una huella de iluminación sustancialmente uniforme;e) componente de detección configurado para aproximarse al soporte sólido para detectar la fluorescencia producida por la excitación de las etiquetas fluorescentes mediante el sistema de iluminación;f) sistema informático acoplado de forma operativa al componente de detección en donde el sistema informático comprende un conjunto de instrucciones para adquirir imágenes de fluorescencia del componente de detección y determinar una secuencia de polinucleótidos a partir de la fluorescencia detectada.
-
- 2.
- El sistema de la reivindicación 1, en donde el sustrato sólido se puede desplazar en una dirección distal al componente de detección con el objetivo de que el sistema de control de temperatura regule la temperatura del sustrato sólido.
-
- 3.
- El sistema de la reivindicación 1, en donde el sustrato sólido comprende una celda de flujo con uno o más canales de fluido en los que se unen los polinucleótidos.
-
- 4.
- El sistema según la reivindicación 1, en donde dicho sustrato sólido es un arreglo de esferas.
-
- 5.
- El sistema de la reivindicación 1, en donde los reactivos comprenden componentes para extender una segunda secuencia complementaria a uno o más polinucleótidos.
-
- 6.
- El sistema según la reivindicación 5, en donde dichos reactivos son nucleósido trifosfatos etiquetados por fluorescencia.
-
- 7.
- El sistema según la reivindicación 5, en donde dichos reactivos son oligonucleótidos etiquetados por fluorescencia.
-
- 8.
- El sistema de la reivindicación 1, en donde el sistema de iluminación comprende múltiples láseres de excitación acoplados a través de la fibra óptica multimodal, en donde dicha fibra óptica multimodal se deforma físicamente para obtener la huella de iluminación sustancialmente uniforme.
-
- 9.
- El sistema según la reivindicación 8, en donde dicha deformación física es consecuencia de compresión o vibración.
-
- 10.
- El sistema de la reivindicación 1, en donde el componente de detección comprende una cámara CCD.
-
- 11.
- El sistema de la reivindicación 1, en donde dicho componente de detección comprende dos cámaras CCD.
-
- 12.
- El sistema de la reivindicación 1, en donde el componente de detección comprende un mecanismo de autofoco.
-
- 13.
- El sistema de la reivindicación 1 que comprende dos estaciones de fluido para operar en dos celdas de flujo de forma simultánea.
-
- 14.
- El sistema de la reivindicación 1, en donde el sistema de iluminación comprende dos láseres de excitación acoplados a través de un dispositivo de fibra óptica, en donde dichos dos láseres de excitación iluminan al menos parte de una misma área.
-
- 15.
- El sistema de la reivindicación 11, en donde los reactivos incluyen cuatro nucleótidos diferentes con etiquetas fluorescentes respectivas, el componente de detección también comprende cuatro filtros ópticos adecuados para una emisión de fluorescencia de los cuatro nucleótidos etiquetados por fluorescencia y para la longitud de onda de la luz de los láseres.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US78824806P | 2006-03-31 | 2006-03-31 | |
| US788248P | 2006-03-31 | ||
| US79536806P | 2006-04-26 | 2006-04-26 | |
| US795368P | 2006-04-26 | ||
| PCT/US2007/007991 WO2007123744A2 (en) | 2006-03-31 | 2007-03-30 | Systems and devices for sequence by synthesis analysis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2675047T3 true ES2675047T3 (es) | 2018-07-06 |
Family
ID=38625484
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES07754505.1T Active ES2675047T3 (es) | 2006-03-31 | 2007-03-30 | Sistemas para análisis de secuencia mediante síntesis |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8241573B2 (es) |
| EP (4) | EP2018622B1 (es) |
| JP (1) | JP5122555B2 (es) |
| CN (1) | CN101460953B (es) |
| CA (1) | CA2648149A1 (es) |
| ES (1) | ES2675047T3 (es) |
| SG (1) | SG170802A1 (es) |
| WO (1) | WO2007123744A2 (es) |
Families Citing this family (676)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2510166A1 (en) * | 2002-12-20 | 2004-09-30 | Caliper Life Sciences, Inc. | Single molecule amplification and detection of dna |
| US20060078893A1 (en) | 2004-10-12 | 2006-04-13 | Medical Research Council | Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control |
| GB0307428D0 (en) | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Compartmentalised combinatorial chemistry |
| GB0307403D0 (en) | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Selection by compartmentalised screening |
| US20050221339A1 (en) | 2004-03-31 | 2005-10-06 | Medical Research Council Harvard University | Compartmentalised screening by microfluidic control |
| US7968287B2 (en) | 2004-10-08 | 2011-06-28 | Medical Research Council Harvard University | In vitro evolution in microfluidic systems |
| JP2009536313A (ja) | 2006-01-11 | 2009-10-08 | レインダンス テクノロジーズ， インコーポレイテッド | ナノリアクターの形成および制御において使用するマイクロ流体デバイスおよび方法 |
| US9562837B2 (en) | 2006-05-11 | 2017-02-07 | Raindance Technologies, Inc. | Systems for handling microfludic droplets |
| US20080014589A1 (en) | 2006-05-11 | 2008-01-17 | Link Darren R | Microfluidic devices and methods of use thereof |
| US8921073B2 (en) | 2006-06-23 | 2014-12-30 | Illumina, Inc. | Devices and systems for creation of DNA cluster arrays |
| US9012390B2 (en) | 2006-08-07 | 2015-04-21 | Raindance Technologies, Inc. | Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants |
| WO2008092150A1 (en) | 2007-01-26 | 2008-07-31 | Illumina, Inc. | Nucleic acid sequencing system and method |
| US8315817B2 (en) | 2007-01-26 | 2012-11-20 | Illumina, Inc. | Independently removable nucleic acid sequencing system and method |
| US11940413B2 (en) * | 2007-02-05 | 2024-03-26 | IsoPlexis Corporation | Methods and devices for sequencing nucleic acids in smaller batches |
| US8772046B2 (en) | 2007-02-06 | 2014-07-08 | Brandeis University | Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems |
| JP4843543B2 (ja) * | 2007-03-28 | 2011-12-21 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 蛍光検出装置及び方法 |
| US8592221B2 (en) | 2007-04-19 | 2013-11-26 | Brandeis University | Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems |
| WO2009042862A1 (en) | 2007-09-28 | 2009-04-02 | Illumina, Inc | Fluorescence excitation and detection system and method |
| JP5766948B2 (ja) | 2007-10-12 | 2015-08-19 | カリス ライフ サイエンシズ スウィッツァーランド ホールディングスゲーエムベーハー | プロテオミクスにおけるアプタマーの使用 |
| US20170022558A1 (en) * | 2007-10-30 | 2017-01-26 | Complete Genomics, Inc. | Integrated system for nucleic acid sequence and analysis |
| US8854595B2 (en) | 2008-03-03 | 2014-10-07 | Manufacturing Resources International, Inc. | Constricted convection cooling system for an electronic display |
| US8263367B2 (en) | 2008-01-25 | 2012-09-11 | Agency For Science, Technology And Research | Nucleic acid interaction analysis |
| WO2009097368A2 (en) | 2008-01-28 | 2009-08-06 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions |
| US8173080B2 (en) | 2008-02-14 | 2012-05-08 | Illumina, Inc. | Flow cells and manifolds having an electroosmotic pump |
| US9173325B2 (en) | 2008-03-26 | 2015-10-27 | Manufacturing Resources International, Inc. | Heat exchanger for back to back electronic displays |
| US8497972B2 (en) | 2009-11-13 | 2013-07-30 | Manufacturing Resources International, Inc. | Thermal plate with optional cooling loop in electronic display |
| US8654302B2 (en) | 2008-03-03 | 2014-02-18 | Manufacturing Resources International, Inc. | Heat exchanger for an electronic display |
| US8773633B2 (en) | 2008-03-03 | 2014-07-08 | Manufacturing Resources International, Inc. | Expanded heat sink for electronic displays |
| WO2011025477A1 (en) | 2009-08-25 | 2011-03-03 | Illumina, Inc. | Methods for selecting and amplifying polynucleotides |
| US8367976B2 (en) * | 2008-03-21 | 2013-02-05 | Lawrence Livermore National Security, Llc | Laser heating of aqueous samples on a micro-optical-electro-mechanical system |
| US8693185B2 (en) | 2008-03-26 | 2014-04-08 | Manufacturing Resources International, Inc. | System and method for maintaining a consistent temperature gradient across an electronic display |
| JP5072688B2 (ja) | 2008-04-02 | 2012-11-14 | キヤノン株式会社 | 走査型撮像装置 |
| US8975572B2 (en) * | 2008-04-04 | 2015-03-10 | Cvi Laser, Llc | Compact, thermally stable fiber-optic array mountable to flow cell |
| US10114213B2 (en) | 2008-04-04 | 2018-10-30 | Cvi Laser, Llc | Laser systems and optical devices for manipulating laser beams |
| US7903706B2 (en) * | 2008-04-04 | 2011-03-08 | O'shaughnessy John | Compact, thermally stable multi-laser engine |
| US9413130B2 (en) | 2012-12-12 | 2016-08-09 | Cvi Laser, Llc | Optical systems |
| US8039817B2 (en) | 2008-05-05 | 2011-10-18 | Illumina, Inc. | Compensator for multiple surface imaging |
| US8711484B2 (en) | 2008-05-06 | 2014-04-29 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Fabrication of thin pellicle beam splitters |
| WO2010003132A1 (en) | 2008-07-02 | 2010-01-07 | Illumina Cambridge Ltd. | Using populations of beads for the fabrication of arrays on surfaces |
| WO2010009365A1 (en) | 2008-07-18 | 2010-01-21 | Raindance Technologies, Inc. | Droplet libraries |
| US12038438B2 (en) | 2008-07-18 | 2024-07-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Enzyme quantification |
| JP2010022315A (ja) * | 2008-07-23 | 2010-02-04 | Sony Corp | 核酸量検出装置及び核酸量検出方法 |
| US8736751B2 (en) * | 2008-08-26 | 2014-05-27 | Empire Technology Development Llc | Digital presenter for displaying image captured by camera with illumination system |
| US8383345B2 (en) | 2008-09-12 | 2013-02-26 | University Of Washington | Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads |
| US8728764B2 (en) | 2008-10-02 | 2014-05-20 | Illumina Cambridge Limited | Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications |
| WO2010048337A2 (en) | 2008-10-22 | 2010-04-29 | Illumina, Inc. | Preservation of information related to genomic dna methylation |
| AU2009319907B2 (en) | 2008-11-03 | 2015-10-01 | The Regents Of The University Of California | Methods for detecting modification resistant nucleic acids |
| US8252250B2 (en) | 2008-11-26 | 2012-08-28 | Illumina, Inc. | Electroosmotic pump with improved gas management |
| US20100157086A1 (en) | 2008-12-15 | 2010-06-24 | Illumina, Inc | Dynamic autofocus method and system for assay imager |
| US10827656B2 (en) | 2008-12-18 | 2020-11-03 | Manufacturing Resources International, Inc. | System for cooling an electronic image assembly with circulating gas and ambient gas |
| US8749749B2 (en) | 2008-12-18 | 2014-06-10 | Manufacturing Resources International, Inc. | System for cooling an electronic image assembly with manifolds and ambient gas |
| WO2010075188A2 (en) | 2008-12-23 | 2010-07-01 | Illumina Inc. | Multibase delivery for long reads in sequencing by synthesis protocols |
| US8528589B2 (en) | 2009-03-23 | 2013-09-10 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulation of microfluidic droplets |
| CA2760439A1 (en) | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Good Start Genetics, Inc. | Methods and compositions for evaluating genetic markers |
| EP2427572B1 (en) * | 2009-05-01 | 2013-08-28 | Illumina, Inc. | Sequencing methods |
| WO2010137543A1 (ja) * | 2009-05-27 | 2010-12-02 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸分析用デバイス、核酸分析装置、及び核酸分析方法 |
| GB2483402B (en) | 2009-06-04 | 2014-04-09 | Lockheed Corp | Multiple-sample microfluidic chip for DNA analysis |
| DK2456892T3 (en) | 2009-07-24 | 2014-12-08 | Illumina Inc | Procedure for sequencing of a polynukleotidskabelon |
| US8182994B2 (en) | 2009-09-15 | 2012-05-22 | Illumina Cambridge Limited | Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing |
| WO2011042564A1 (en) | 2009-10-09 | 2011-04-14 | Universite De Strasbourg | Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof |
| US10837883B2 (en) | 2009-12-23 | 2020-11-17 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets |
| DK2531880T3 (da) | 2010-02-01 | 2016-11-07 | Illumina Inc | Fokuseringsmetoder og optiske systemer samt anordninger dermed |
| US9399797B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-07-26 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
| US10351905B2 (en) | 2010-02-12 | 2019-07-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analyte analysis |
| US9366632B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-06-14 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
| WO2011100604A2 (en) | 2010-02-12 | 2011-08-18 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
| WO2011103467A2 (en) | 2010-02-19 | 2011-08-25 | Life Technologies Corporation | Methods and systems for nucleic acid sequencing validation, calibration and normalization |
| US8481903B2 (en) | 2010-03-06 | 2013-07-09 | Alexander Triener | Systems, methods, and apparatuses including a moveable optical component for detecting optical signals from a sample |
| KR101866401B1 (ko) | 2010-04-05 | 2018-06-11 | 프로그노시스 바이오사이언스, 인코포레이티드 | 공간적으로 엔코딩된 생물학적 검정 |
| US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
| WO2011159942A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Illumina, Inc. | Conformational probes and methods for sequencing nucleic acids |
| US8465922B2 (en) * | 2010-08-26 | 2013-06-18 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and systems for monitoring reactions |
| US9029103B2 (en) | 2010-08-27 | 2015-05-12 | Illumina Cambridge Limited | Methods for sequencing polynucleotides |
| WO2012050920A1 (en) * | 2010-09-29 | 2012-04-19 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for sequencing nucleic acids |
| US9562897B2 (en) | 2010-09-30 | 2017-02-07 | Raindance Technologies, Inc. | Sandwich assays in droplets |
| CA2814720C (en) | 2010-10-15 | 2016-12-13 | Lockheed Martin Corporation | Micro fluidic optic design |
| EP2633069B1 (en) | 2010-10-26 | 2015-07-01 | Illumina, Inc. | Sequencing methods |
| US8575071B2 (en) | 2010-11-03 | 2013-11-05 | Illumina, Inc. | Reducing adapter dimer formation |
| EP2635679B1 (en) | 2010-11-05 | 2017-04-19 | Illumina, Inc. | Linking sequence reads using paired code tags |
| US9074251B2 (en) | 2011-02-10 | 2015-07-07 | Illumina, Inc. | Linking sequence reads using paired code tags |
| EP2643484A4 (en) | 2010-11-22 | 2014-04-16 | Univ California | METHOD OF IDENTIFYING AN RNA TRANSCRIPTION OF CELLULAR ORIGIN |
| US9163281B2 (en) | 2010-12-23 | 2015-10-20 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction |
| US8951781B2 (en) | 2011-01-10 | 2015-02-10 | Illumina, Inc. | Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis |
| EP2670864B1 (en) | 2011-01-31 | 2017-03-08 | Illumina, Inc. | Methods for reducing nucleic acid damage |
| JP6017458B2 (ja) | 2011-02-02 | 2016-11-02 | ユニヴァーシティ・オブ・ワシントン・スルー・イッツ・センター・フォー・コマーシャリゼーション | 大量並列連続性マッピング |
| US9364803B2 (en) | 2011-02-11 | 2016-06-14 | Raindance Technologies, Inc. | Methods for forming mixed droplets |
| EP3736281A1 (en) | 2011-02-18 | 2020-11-11 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Compositions and methods for molecular labeling |
| CN102250751B (zh) * | 2011-03-22 | 2013-05-22 | 博奥生物有限公司 | 一种用于生物芯片的接口装置 |
| GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
| EP2715445A4 (en) * | 2011-05-25 | 2014-12-10 | Obzerv Technologies Inc | DEVICE FOR ACTIVE IMAGING WITH A VIEW FIELD AND A LIGHTING FIELD WITH CORRESPONDING RECTANGULAR SIDE RATIO |
| US8841071B2 (en) | 2011-06-02 | 2014-09-23 | Raindance Technologies, Inc. | Sample multiplexing |
| EP2714970B1 (en) | 2011-06-02 | 2017-04-19 | Raindance Technologies, Inc. | Enzyme quantification |
| EP2718465B1 (en) | 2011-06-09 | 2022-04-13 | Illumina, Inc. | Method of making an analyte array |
| WO2012175245A2 (en) | 2011-06-21 | 2012-12-27 | Illumina Cambridge Limited | Methods and systems for data analysis |
| US8658430B2 (en) | 2011-07-20 | 2014-02-25 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulating droplet size |
| KR102048274B1 (ko) * | 2011-09-13 | 2019-11-25 | 애질런트 테크놀로지스, 인크. | 핵산 시퀀싱을 위하여 5-메톡시, 3'-oh 차단안된, 신속하게 광절단가능한 종료 뉴클레오티드 및 핵산 시퀀싱 방법 |
| US9453258B2 (en) | 2011-09-23 | 2016-09-27 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
| WO2013049135A1 (en) | 2011-09-26 | 2013-04-04 | Gen-Probe Incorporated | Algorithms for sequence determinations |
| US10378051B2 (en) | 2011-09-29 | 2019-08-13 | Illumina Cambridge Limited | Continuous extension and deblocking in reactions for nucleic acids synthesis and sequencing |
| EP3604555A1 (en) | 2011-10-14 | 2020-02-05 | President and Fellows of Harvard College | Sequencing by structure assembly |
| WO2013058907A1 (en) | 2011-10-17 | 2013-04-25 | Good Start Genetics, Inc. | Analysis methods |
| CA2856163C (en) | 2011-10-28 | 2019-05-07 | Illumina, Inc. | Microarray fabrication system and method |
| EP2776165A2 (en) | 2011-11-07 | 2014-09-17 | Illumina, Inc. | Integrated sequencing apparatuses and methods of use |
| US9200274B2 (en) | 2011-12-09 | 2015-12-01 | Illumina, Inc. | Expanded radix for polymeric tags |
| US9279154B2 (en) | 2011-12-21 | 2016-03-08 | Illumina, Inc. | Apparatus and methods for kinetic analysis and determination of nucleic acid sequences |
| US11021737B2 (en) | 2011-12-22 | 2021-06-01 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for analyte detection |
| EP4108782B1 (en) | 2011-12-22 | 2023-06-07 | President and Fellows of Harvard College | Compositions and methods for analyte detection |
| WO2013117595A2 (en) | 2012-02-07 | 2013-08-15 | Illumina Cambridge Limited | Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support |
| WO2013126741A1 (en) | 2012-02-24 | 2013-08-29 | Raindance Technologies, Inc. | Labeling and sample preparation for sequencing |
| NO2694769T3 (es) | 2012-03-06 | 2018-03-03 | ||
| CN102591100B (zh) * | 2012-03-16 | 2015-09-02 | 盛司潼 | 一种测序采图设备的自动聚焦系统及其方法 |
| US20130261984A1 (en) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | Illumina, Inc. | Methods and systems for determining fetal chromosomal abnormalities |
| KR102118211B1 (ko) | 2012-04-03 | 2020-06-02 | 일루미나, 인코포레이티드 | 핵산 서열분석에 유용한 통합 광전자 판독 헤드 및 유체 카트리지 |
| US8209130B1 (en) | 2012-04-04 | 2012-06-26 | Good Start Genetics, Inc. | Sequence assembly |
| US8812422B2 (en) | 2012-04-09 | 2014-08-19 | Good Start Genetics, Inc. | Variant database |
| US20130274148A1 (en) | 2012-04-11 | 2013-10-17 | Illumina, Inc. | Portable genetic detection and analysis system and method |
| US9444880B2 (en) | 2012-04-11 | 2016-09-13 | Illumina, Inc. | Cloud computing environment for biological data |
| US10227635B2 (en) | 2012-04-16 | 2019-03-12 | Molecular Loop Biosolutions, Llc | Capture reactions |
| CN102703310B (zh) * | 2012-05-24 | 2013-10-16 | 中国科学院北京基因组研究所 | 与测序芯片直接耦合的ccd相机 |
| US20140163900A1 (en) * | 2012-06-02 | 2014-06-12 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Analyzing short tandem repeats from high throughput sequencing data for genetic applications |
| US9914967B2 (en) | 2012-06-05 | 2018-03-13 | President And Fellows Of Harvard College | Spatial sequencing of nucleic acids using DNA origami probes |
| US9012022B2 (en) | 2012-06-08 | 2015-04-21 | Illumina, Inc. | Polymer coatings |
| US8895249B2 (en) | 2012-06-15 | 2014-11-25 | Illumina, Inc. | Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries |
| EP2870264A4 (en) | 2012-07-03 | 2016-03-02 | Sloan Kettering Inst Cancer | QUANTITATIVE ASSESSMENT OF THE RECOVERY OF HUMAN T-CELL REPERTOIR AFTER TRANSPLANTATION OF ALLOGENIC BLOOD-GENERATING STEM CELLS |
| CN104812947B (zh) | 2012-07-17 | 2018-04-27 | 考希尔股份有限公司 | 检测遗传变异的系统和方法 |
| US9092401B2 (en) | 2012-10-31 | 2015-07-28 | Counsyl, Inc. | System and methods for detecting genetic variation |
| US9977861B2 (en) | 2012-07-18 | 2018-05-22 | Illumina Cambridge Limited | Methods and systems for determining haplotypes and phasing of haplotypes |
| NL2017959B1 (en) | 2016-12-08 | 2018-06-19 | Illumina Inc | Cartridge assembly |
| CA3040684C (en) | 2012-08-20 | 2023-02-07 | Hod Finkelstein | Method and system for fluorescence lifetime based sequencing |
| JPWO2014034275A1 (ja) * | 2012-08-30 | 2016-08-08 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸分析装置 |
| WO2014062815A1 (en) | 2012-10-16 | 2014-04-24 | Manufacturing Resources International, Inc. | Back pan cooling assembly for electric display |
| EP2909337B1 (en) | 2012-10-17 | 2019-01-09 | Spatial Transcriptomics AB | Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample |
| EP4170031A1 (en) | 2012-10-23 | 2023-04-26 | Caris Science, Inc. | Aptamers and uses thereof |
| US10942184B2 (en) | 2012-10-23 | 2021-03-09 | Caris Science, Inc. | Aptamers and uses thereof |
| US9181583B2 (en) | 2012-10-23 | 2015-11-10 | Illumina, Inc. | HLA typing using selective amplification and sequencing |
| AU2013361323B2 (en) | 2012-12-19 | 2018-09-06 | Caris Science, Inc. | Compositions and methods for aptamer screening |
| US9683230B2 (en) | 2013-01-09 | 2017-06-20 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation on a solid support |
| US9805407B2 (en) | 2013-01-25 | 2017-10-31 | Illumina, Inc. | Methods and systems for using a cloud computing environment to configure and sell a biological sample preparation cartridge and share related data |
| US9512422B2 (en) | 2013-02-26 | 2016-12-06 | Illumina, Inc. | Gel patterned surfaces |
| EP2964785B8 (en) | 2013-03-04 | 2020-10-21 | Fry Laboratories LLC | Method and kit for characterizing microorganisms |
| EP2971184B1 (en) | 2013-03-12 | 2019-04-17 | President and Fellows of Harvard College | Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix |
| ES2878525T3 (es) | 2013-03-13 | 2021-11-19 | Illumina Inc | Dispositivos fluídicos multicapa y procedimientos para su fabricación |
| WO2014143158A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-09-18 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for labeling of agents |
| DK3553175T3 (da) | 2013-03-13 | 2021-08-23 | Illumina Inc | Fremgangsmåde til fremstilling af et nukleinsyresekvenseringsbibliotek |
| ES2674043T5 (es) | 2013-03-14 | 2021-11-03 | Illumina Inc | Polimerasas modificadas para una incorporación mejorada de análogos de nucleótidos |
| US9146248B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-09-29 | Intelligent Bio-Systems, Inc. | Apparatus and methods for purging flow cells in nucleic acid sequencing instruments |
| US8778609B1 (en) | 2013-03-14 | 2014-07-15 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for analyzing nucleic acids |
| EP2970356B1 (en) | 2013-03-15 | 2018-05-30 | Illumina Cambridge Limited | Modified nucleosides or nucleotides |
| US9193998B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-11-24 | Illumina, Inc. | Super resolution imaging |
| US10767221B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-09-08 | Illumina, Inc. | Enzyme-linked nucleotides |
| US9591268B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-03-07 | Qiagen Waltham, Inc. | Flow cell alignment methods and systems |
| US9648790B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-05-09 | Manufacturing Resources International, Inc. | Heat exchanger assembly for an electronic display |
| US10429292B2 (en) * | 2013-03-15 | 2019-10-01 | Iris International, Inc. | Dynamic range extension systems and methods for particle analysis in blood samples |
| US20140274747A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Illumina, Inc. | Super resolution imaging |
| US10524384B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-12-31 | Manufacturing Resources International, Inc. | Cooling assembly for an electronic display |
| EP3005200A2 (en) | 2013-06-03 | 2016-04-13 | Good Start Genetics, Inc. | Methods and systems for storing sequence read data |
| EP3003392B1 (en) | 2013-06-04 | 2019-10-23 | President and Fellows of Harvard College | Rna-guideded transcriptional regulation |
| LT3013983T (lt) | 2013-06-25 | 2023-05-10 | Prognosys Biosciences, Inc. | Erdviniai koduoti biologiniai tyrimai, naudojant mikrofluidinį įrenginį |
| AU2014284584B2 (en) | 2013-07-01 | 2019-08-01 | Illumina, Inc. | Catalyst-free surface functionalization and polymer grafting |
| CN105358715B (zh) | 2013-07-03 | 2018-09-18 | 伊鲁米那股份有限公司 | 正交合成测序 |
| AU2014287438B2 (en) | 2013-07-08 | 2017-09-28 | Manufacturing Resources International, Inc. | Figure eight closed loop cooling system for electronic display |
| US10112195B2 (en) * | 2013-07-31 | 2018-10-30 | Hitachi High-Technologies Corporation | Flow cell for nucleic acid analysis and nucleic acid analyzer |
| DK3030682T3 (da) * | 2013-08-05 | 2020-09-14 | Twist Bioscience Corp | De novo synthesized gene libraries |
| FI3030645T3 (fi) | 2013-08-08 | 2023-02-10 | Fluidijärjestelmä reagenssien toimittamiseen virtauskennoon | |
| US9540690B2 (en) | 2013-08-28 | 2017-01-10 | Illumina, Inc. | Optical alignment tool |
| AU2014312043A1 (en) | 2013-08-30 | 2016-02-25 | Illumina France | Manipulation of droplets on hydrophilic or variegated-hydrophilic surfaces |
| US9352315B2 (en) | 2013-09-27 | 2016-05-31 | Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. | Method to produce chemical pattern in micro-fluidic structure |
| US11901041B2 (en) | 2013-10-04 | 2024-02-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analysis of nucleic acid modification |
| US9990723B2 (en) * | 2013-10-18 | 2018-06-05 | Koninklijke Philips N.V. | Image based ROI tracking for MDX |
| WO2015057565A1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-23 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for assessing a genomic region of a subject |
| US10851414B2 (en) | 2013-10-18 | 2020-12-01 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for determining carrier status |
| GB201318919D0 (en) * | 2013-10-25 | 2013-12-11 | Isis Innovation | Compact microscope |
| CN104570813A (zh) * | 2013-10-25 | 2015-04-29 | 仲兆准 | 喷雾干燥仪集成控制器 |
| JP6477488B2 (ja) * | 2013-10-31 | 2019-03-06 | コニカミノルタ株式会社 | 検出装置および当該検出装置を用いた検出方法 |
| US10540783B2 (en) | 2013-11-01 | 2020-01-21 | Illumina, Inc. | Image analysis useful for patterned objects |
| RU2675502C1 (ru) | 2013-11-29 | 2018-12-19 | Конинклейке Филипс Н.В. | Оптический контроль химической реакции |
| HUE050641T2 (hu) | 2013-12-03 | 2020-12-28 | Illumina Inc | Eljárások és rendszerek képadat elemzésére |
| CA3133543C (en) | 2013-12-10 | 2023-05-02 | Illumina, Inc. | Biosensors for biological or chemical analysis and methods of manufacturing the same |
| US9944977B2 (en) | 2013-12-12 | 2018-04-17 | Raindance Technologies, Inc. | Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample |
| US10682829B2 (en) | 2013-12-19 | 2020-06-16 | Illumina, Inc. | Substrates comprising nano-patterning surfaces and methods of preparing thereof |
| DK3083994T3 (da) | 2013-12-20 | 2021-09-13 | Illumina Inc | Bevarelse af genomisk konnektivitetsinformation i fragmenterede genomiske DNA-prøver |
| CA2933548C (en) | 2013-12-23 | 2023-07-11 | Illumina, Inc. | Structured substrates for improving detection of light emissions and methods relating to the same |
| US11193176B2 (en) | 2013-12-31 | 2021-12-07 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Method for detecting and quantifying latent retroviral RNA species |
| WO2015103225A1 (en) | 2013-12-31 | 2015-07-09 | Illumina, Inc. | Addressable flow cell using patterned electrodes |
| WO2015105993A1 (en) | 2014-01-09 | 2015-07-16 | AgBiome, Inc. | High throughput discovery of new genes from complex mixtures of environmental microbes |
| US9677132B2 (en) | 2014-01-16 | 2017-06-13 | Illumina, Inc. | Polynucleotide modification on solid support |
| AU2014377537B2 (en) | 2014-01-16 | 2021-02-25 | Illumina, Inc. | Amplicon preparation and sequencing on solid supports |
| JP6430703B2 (ja) * | 2014-01-31 | 2018-11-28 | 三菱電線工業株式会社 | 光ファイバデバイス |
| ES2866044T3 (es) | 2014-02-18 | 2021-10-19 | Illumina Inc | Métodos y composiciones para la elaboración de perfiles de ADN |
| ES2876252T3 (es) | 2014-03-11 | 2021-11-12 | Mri Inc | Procedimiento para montar una pantalla en una pared |
| US10767219B2 (en) | 2014-03-11 | 2020-09-08 | Illumina, Inc. | Disposable, integrated microfluidic cartridge and methods of making and using same |
| EP3137601B1 (en) | 2014-04-29 | 2020-04-08 | Illumina, Inc. | Multiplexed single cell gene expression analysis using template switch and tagmentation |
| WO2015168375A1 (en) | 2014-04-30 | 2015-11-05 | Manufacturing Resources International, Inc. | Back to back electronic display assembly |
| WO2015172080A1 (en) * | 2014-05-08 | 2015-11-12 | Fluidigm Corporation | Integrated single cell sequencing |
| WO2015175530A1 (en) | 2014-05-12 | 2015-11-19 | Gore Athurva | Methods for detecting aneuploidy |
| CN106536734B (zh) | 2014-05-16 | 2020-12-22 | Illumina公司 | 核酸合成技术 |
| EP3148697A1 (en) | 2014-05-27 | 2017-04-05 | Illumina, Inc. | Systems and methods for biochemical analysis including a base instrument and a removable cartridge |
| GB201409777D0 (en) | 2014-06-02 | 2014-07-16 | Illumina Cambridge Ltd | Methods of reducing density-dependent GC bias in isothermal amplification |
| SG11201609692SA (en) | 2014-06-03 | 2016-12-29 | Illumina Inc | Compositions, systems, and methods for detecting events using tethers anchored to or adjacent to nanopores |
| US20150353989A1 (en) | 2014-06-09 | 2015-12-10 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation for nucleic acid amplification |
| AU2015273232B2 (en) | 2014-06-13 | 2021-09-16 | Illumina Cambridge Limited | Methods and compositions for preparing sequencing libraries |
| WO2015195831A1 (en) * | 2014-06-17 | 2015-12-23 | Life Technologies Corporation | Sequencing device |
| US10017759B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-07-10 | Illumina, Inc. | Library preparation of tagged nucleic acid |
| CN106536728A (zh) | 2014-06-27 | 2017-03-22 | 伊鲁米那股份有限公司 | 用于核苷酸类似物的改进的掺入的修饰的聚合酶 |
| ES2713153T3 (es) | 2014-06-30 | 2019-05-20 | Illumina Inc | Métodos y composiciones que utilizan la transposición unilateral |
| DK3460075T3 (da) | 2014-07-15 | 2021-02-01 | Illumina Inc | Biokemisk aktiveret elektronisk anordning |
| CA2955382C (en) | 2014-07-21 | 2023-07-18 | Illumina, Inc. | Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems |
| GB201414098D0 (en) | 2014-08-08 | 2014-09-24 | Illumina Cambridge Ltd | Modified nucleotide linkers |
| EP3183577B1 (en) | 2014-08-21 | 2020-08-19 | Illumina Cambridge Limited | Reversible surface functionalization |
| WO2016040446A1 (en) | 2014-09-10 | 2016-03-17 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for selectively suppressing non-target sequences |
| WO2016040602A1 (en) | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Epicentre Technologies Corporation | Reduced representation bisulfite sequencing using uracil n-glycosylase (ung) and endonuclease iv |
| US10633694B2 (en) | 2014-09-12 | 2020-04-28 | Illumina, Inc. | Compositions, systems, and methods for detecting the presence of polymer subunits using chemiluminescence |
| CA2960840A1 (en) | 2014-09-18 | 2016-03-24 | Illumina, Inc. | Methods and systems for analyzing nucleic acid sequencing data |
| CA2999708A1 (en) | 2014-09-24 | 2016-03-31 | Good Start Genetics, Inc. | Process control for increased robustness of genetic assays |
| EP3201355B1 (en) | 2014-09-30 | 2019-07-31 | Illumina, Inc. | Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues |
| KR20170066540A (ko) | 2014-10-09 | 2017-06-14 | 일루미나, 인코포레이티드 | 액체 중 적어도 하나를 효과적으로 격리시키기 위해 비혼화성 액체를 분리하기 위한 방법 및 디바이스 |
| US9897791B2 (en) | 2014-10-16 | 2018-02-20 | Illumina, Inc. | Optical scanning systems for in situ genetic analysis |
| KR102643955B1 (ko) | 2014-10-17 | 2024-03-07 | 일루미나 케임브리지 리미티드 | 근접 보존 전위 |
| JP6800845B2 (ja) * | 2014-10-29 | 2020-12-16 | ルーメンコア インコーポレイテッド | 統合型蛍光スキャニングシステム |
| ES2905706T3 (es) | 2014-10-31 | 2022-04-11 | Illumina Cambridge Ltd | Polímeros y recubrimientos de copolímeros de ADN |
| US10000799B2 (en) | 2014-11-04 | 2018-06-19 | Boreal Genomics, Inc. | Methods of sequencing with linked fragments |
| US10181190B2 (en) * | 2014-11-04 | 2019-01-15 | Olympus Corporation | Microscope and microscope image acquisition method |
| ES2768762T3 (es) | 2014-11-05 | 2020-06-23 | Illumina Cambridge Ltd | Reducción del daño al ADN durante la preparación de muestras y secuenciación usando agentes quelantes sideróforos |
| GB201419731D0 (en) | 2014-11-05 | 2014-12-17 | Illumina Cambridge Ltd | Sequencing from multiple primers to increase data rate and density |
| KR102590448B1 (ko) | 2014-11-11 | 2023-10-17 | 일루미나 케임브리지 리미티드 | 핵산의 모노클로날 클러스터를 형성시키고 시퀀싱하기 위한 방법 및 어레이 |
| AU2015346514B2 (en) | 2014-11-11 | 2021-04-08 | Illumina, Inc. | Polynucleotide amplification using CRISPR-Cas systems |
| CN114438172A (zh) | 2014-12-15 | 2022-05-06 | 亿明达股份有限公司 | 用于基底上的单分子放置的组合物和方法 |
| WO2016103473A1 (ja) * | 2014-12-26 | 2016-06-30 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸分析用基板、核酸分析用フローセルおよび核酸分析装置 |
| US10066259B2 (en) | 2015-01-06 | 2018-09-04 | Good Start Genetics, Inc. | Screening for structural variants |
| WO2016112172A1 (en) | 2015-01-07 | 2016-07-14 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Microfluidic cell culture of patient-derived tumor cell spheroids |
| WO2016126882A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-11 | Twist Bioscience Corporation | Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly |
| WO2016125281A1 (ja) * | 2015-02-05 | 2016-08-11 | 株式会社ニコン | 構造化照明顕微鏡、観察方法、及び制御プログラム |
| US20160231550A1 (en) * | 2015-02-06 | 2016-08-11 | Intelligent Imaging Innovations, Inc. | Illuminator for multi-focus confocal imaging and optimized filling of a spatial light modulator for microscopy |
| KR20200020997A (ko) | 2015-02-10 | 2020-02-26 | 일루미나, 인코포레이티드 | 세포 성분을 분석하기 위한 방법 및 조성물 |
| US9723765B2 (en) | 2015-02-17 | 2017-08-01 | Manufacturing Resources International, Inc. | Perimeter ventilation system for electronic display |
| CN107847930B (zh) | 2015-03-20 | 2020-06-30 | 亿明达股份有限公司 | 在竖直或大致竖直的位置中使用的流体盒 |
| EP3274692B1 (en) | 2015-03-24 | 2022-08-10 | Illumina, Inc. | Methods for imaging samples for biological or chemical analysis |
| US20180100192A1 (en) | 2015-03-31 | 2018-04-12 | lllumina Cambridge Limited | Surface concatemerization of templates |
| EP4321627A3 (en) | 2015-04-10 | 2024-04-17 | 10x Genomics Sweden AB | Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens |
| EP3283870B1 (en) | 2015-04-14 | 2020-05-06 | Illumina, Inc. | Structured substrates for improving detection of light emissions and methods relating to the same |
| US9981239B2 (en) | 2015-04-21 | 2018-05-29 | Twist Bioscience Corporation | Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis |
| GB201507021D0 (en) | 2015-04-24 | 2015-06-10 | Isis Innovation | Compact microscope |
| US10844428B2 (en) | 2015-04-28 | 2020-11-24 | Illumina, Inc. | Error suppression in sequenced DNA fragments using redundant reads with unique molecular indices (UMIS) |
| WO2016178856A1 (en) * | 2015-05-01 | 2016-11-10 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Uniform and scalable light-sheets generated by extended focusing |
| KR102333255B1 (ko) | 2015-05-11 | 2021-12-01 | 일루미나, 인코포레이티드 | 치료제의 발견 및 분석을 위한 플랫폼 |
| IL255446B2 (en) | 2015-05-12 | 2024-01-01 | Illumina Inc | Field effect device and method for sequencing amino acids |
| CN107849598B (zh) | 2015-05-29 | 2021-12-14 | 伊卢米纳剑桥有限公司 | 簇中的表面引物的增强利用 |
| ES2927121T3 (es) | 2015-05-29 | 2022-11-02 | Illumina Inc | Portamuestras y sistema de ensayo para realizar reacciones designadas |
| WO2016196358A1 (en) | 2015-05-29 | 2016-12-08 | Epicentre Technologies Corporation | Methods of analyzing nucleic acids |
| RU2713396C2 (ru) | 2015-06-03 | 2020-02-05 | Иллюмина, Инк. | Композиции, системы и способы секвенирования полинуклеотидов с применением соединительных структур, прикрепленных к полимеразам, расположенным вблизи нанопор |
| US10889861B2 (en) | 2015-06-17 | 2021-01-12 | The Translational Genomics Research Institute | Systems and methods for obtaining biological molecules from a sample |
| WO2016210340A1 (en) * | 2015-06-26 | 2016-12-29 | Li-Cor, Inc. | Fluorescence biopsy specimen imager and methods |
| WO2017007757A1 (en) | 2015-07-06 | 2017-01-12 | Illumina, Inc. | Balanced ac modulation for driving droplet operations electrodes |
| WO2017006108A1 (en) | 2015-07-06 | 2017-01-12 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation for nucleic acid amplification |
| CN107924121B (zh) | 2015-07-07 | 2021-06-08 | 亿明达股份有限公司 | 经由纳米压印的选择性表面图案化 |
| WO2017015018A1 (en) | 2015-07-17 | 2017-01-26 | Illumina, Inc. | Polymer sheets for sequencing applications |
| CA2993463A1 (en) | 2015-07-27 | 2017-02-02 | Illumina, Inc. | Spatial mapping of nucleic acid sequence information |
| EP3329007B1 (en) | 2015-07-30 | 2021-02-24 | Illumina, Inc. | Orthogonal deblocking of nucleotides |
| CN115369155A (zh) | 2015-08-14 | 2022-11-22 | 亿明达股份有限公司 | 使用磁响应式传感器确定遗传特征的系统和方法 |
| EP3338096B1 (en) | 2015-08-24 | 2024-03-06 | Illumina, Inc. | In-line pressure accumulator and flow-control system for biological or chemical assays |
| JP6743150B2 (ja) | 2015-08-28 | 2020-08-19 | イルミナ インコーポレイテッド | 単一細胞の核酸配列分析 |
| EP3344389B1 (en) | 2015-09-02 | 2020-06-10 | Illumina Cambridge Limited | Method of fixing defects in a hydrophobic surface of a droplet actuator |
| US10647981B1 (en) | 2015-09-08 | 2020-05-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Nucleic acid library generation methods and compositions |
| US10450598B2 (en) | 2015-09-11 | 2019-10-22 | Illumina, Inc. | Systems and methods for obtaining a droplet having a designated concentration of a substance-of-interest |
| IL258164B (en) | 2015-09-18 | 2022-09-01 | Twist Bioscience Corp | Methods to regulate the activity of proteins and cells and a method for the production of nucleic acids |
| US11512347B2 (en) | 2015-09-22 | 2022-11-29 | Twist Bioscience Corporation | Flexible substrates for nucleic acid synthesis |
| AU2016349288A1 (en) | 2015-11-03 | 2018-05-31 | President And Fellows Of Harvard College | Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix |
| US10675627B2 (en) * | 2015-11-17 | 2020-06-09 | The Regents Of The University Of California | Ferromagnet infused microstructure array |
| US10253352B2 (en) | 2015-11-17 | 2019-04-09 | Omniome, Inc. | Methods for determining sequence profiles |
| US10377538B2 (en) | 2015-12-01 | 2019-08-13 | Illumina, Inc. | Liquid storage and delivery mechanisms and methods |
| EP3384046B1 (en) | 2015-12-01 | 2021-04-28 | Illumina, Inc. | Digital microfluidic system for single-cell isolation and characterization of analytes |
| EP3390657B1 (en) | 2015-12-17 | 2020-09-16 | Illumina, Inc. | Distinguishing methylation levels in complex biological samples |
| TW201730563A (zh) | 2016-01-11 | 2017-09-01 | 伊路米納有限公司 | 具有顯微螢光計、流體系統和流動單元閂鎖夾持模組的檢測裝置 |
| KR102104342B1 (ko) | 2016-03-04 | 2020-04-24 | 매뉴팩처링 리소시스 인터내셔널 인코포레이티드 | 양면 표시장치 조립체를 위한 냉각 시스템 |
| US10509215B2 (en) * | 2016-03-14 | 2019-12-17 | Olympus Corporation | Light-field microscope |
| CN110702652A (zh) | 2016-03-24 | 2020-01-17 | 伊鲁米那股份有限公司 | 在发光成像中使用的设备和组成物及其使用方法 |
| US10961568B2 (en) | 2016-03-28 | 2021-03-30 | Boreal Genomics, Inc. | Linked target capture |
| ES2861350T3 (es) | 2016-03-28 | 2021-10-06 | Illumina Inc | Micromatrices de planos múltiples |
| US10961573B2 (en) | 2016-03-28 | 2021-03-30 | Boreal Genomics, Inc. | Linked duplex target capture |
| CN105861293B (zh) * | 2016-04-06 | 2017-11-07 | 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 | 单分子基因测序仪 |
| CN109312396A (zh) | 2016-04-07 | 2019-02-05 | 伊鲁米那股份有限公司 | 用于构建标准化核酸文库的方法和系统 |
| US11326206B2 (en) | 2016-04-07 | 2022-05-10 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods of quantifying target nucleic acids and identifying sequence variants |
| WO2017180680A1 (en) | 2016-04-12 | 2017-10-19 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | LIGHT-SHEET MICROSCOPE WITH PARALLELIZED 3D lMAGE ACQUISITION |
| AU2017254688B2 (en) | 2016-04-22 | 2020-05-14 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Nucleic acid sequencing method and system employing enhanced detection of nucleotide-specific ternary complex formation |
| KR102356022B1 (ko) | 2016-04-22 | 2022-01-27 | 일루미나, 인코포레이티드 | 픽셀 내의 복수의 부위의 발광 이미징에서 사용하기 위한 광자 구조체-기반 디바이스 및 조성물, 및 이를 사용하는 방법 |
| CN116200465A (zh) | 2016-04-25 | 2023-06-02 | 哈佛学院董事及会员团体 | 用于原位分子检测的杂交链反应方法 |
| CA3021769C (en) | 2016-04-29 | 2021-11-23 | Omniome, Inc. | Sequencing method employing ternary complex destabilization to identify cognate nucleotides |
| EP3449011B1 (en) | 2016-04-29 | 2020-11-04 | Omniome, Inc. | Method of nucleic acid sequence determination |
| US10597643B2 (en) | 2016-04-29 | 2020-03-24 | Omniome, Inc. | Polymerases engineered to reduce nucleotide-independent DNA binding |
| CN116397007A (zh) | 2016-05-11 | 2023-07-07 | 伊鲁米那股份有限公司 | 使用argonaute系统的多核苷酸富集和扩增 |
| JP6650342B2 (ja) | 2016-05-16 | 2020-02-19 | オリンパス株式会社 | 顕微鏡システム |
| EP3458913B1 (en) | 2016-05-18 | 2020-12-23 | Illumina, Inc. | Self assembled patterning using patterned hydrophobic surfaces |
| WO2017218908A2 (en) | 2016-06-16 | 2017-12-21 | The Johns Hopkins University | Methods and system for epigenetic analysis |
| EP3475919A1 (en) | 2016-06-23 | 2019-05-01 | Li-Cor, Inc. | Complementary color flashing for multichannel image presentation |
| KR102475710B1 (ko) | 2016-07-22 | 2022-12-08 | 오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티 | 단일 세포 전체 게놈 라이브러리 및 이의 제조를 위한 조합 인덱싱 방법 |
| JP6828140B2 (ja) | 2016-08-15 | 2021-02-10 | オムニオム インコーポレイテッドＯｍｎｉｏｍｅ， Ｉｎｃ． | 核酸をシーケンシングするための方法及びシステム |
| US10428378B2 (en) | 2016-08-15 | 2019-10-01 | Omniome, Inc. | Sequencing method for rapid identification and processing of cognate nucleotide pairs |
| CN118389650A (zh) | 2016-08-31 | 2024-07-26 | 哈佛学院董事及会员团体 | 生成用于通过荧光原位测序检测的核酸序列文库的方法 |
| WO2018045186A1 (en) | 2016-08-31 | 2018-03-08 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of combining the detection of biomolecules into a single assay using fluorescent in situ sequencing |
| US10417457B2 (en) | 2016-09-21 | 2019-09-17 | Twist Bioscience Corporation | Nucleic acid based data storage |
| WO2018064116A1 (en) | 2016-09-28 | 2018-04-05 | Illumina, Inc. | Methods and systems for data compression |
| EP3522713B1 (en) | 2016-10-03 | 2022-11-30 | Illumina, Inc. | Fluorescent detection of amines and hydrazines and assaying methods thereof |
| MY194951A (en) | 2016-10-14 | 2022-12-28 | Illumina Inc | Cartridge assembly |
| CA3038347A1 (en) | 2016-10-19 | 2018-04-26 | Illumina, Inc. | Methods for chemical ligation of nucleic acids |
| AU2017360993A1 (en) | 2016-11-16 | 2019-06-13 | Illumina, Inc. | Validation methods and systems for sequence variant calls |
| GB201619458D0 (en) | 2016-11-17 | 2017-01-04 | Spatial Transcriptomics Ab | Method for spatial tagging and analysing nucleic acids in a biological specimen |
| WO2018098162A1 (en) | 2016-11-23 | 2018-05-31 | Li-Cor, Inc. | Motion-adaptive interactive imaging method |
| WO2018104908A2 (en) | 2016-12-09 | 2018-06-14 | Boreal Genomics, Inc. | Linked ligation |
| CA3049961A1 (en) | 2016-12-09 | 2018-06-14 | The Broad Institute, Inc. | Crispr effector system based diagnostics |
| WO2018119053A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Illumina, Inc. | Arrays including a resin film and a patterned polymer layer |
| PT3558510T (pt) | 2016-12-22 | 2023-01-30 | Illumina Inc | Matriz que inclui iniciador de sequenciação e entidade não sequenciável |
| US20180195115A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-07-12 | Illumina, Inc. | Arrays with quality control tracers |
| EP3562962B1 (en) | 2016-12-30 | 2022-01-05 | Omniome, Inc. | Method and system employing distinguishable polymerases for detecting ternary complexes and identifying cognate nucleotides |
| CN108265112B (zh) * | 2016-12-30 | 2023-04-25 | 深圳市真迈生物科技有限公司 | 对序列测定反应进行控制的方法、序列测定系统和控制装置 |
| CN108265003A (zh) * | 2016-12-30 | 2018-07-10 | 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 | 多通道基因测序反应小室及多通道基因测序反应装置 |
| CN108265004A (zh) * | 2016-12-30 | 2018-07-10 | 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 | 多通道测序反应小室的转接座 |
| CN106676654A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-05-17 | 广东工业大学 | 一种3d打印精度控制系统 |
| GB201704766D0 (en) | 2017-01-05 | 2017-05-10 | Illumia Inc | System and methods for selective effluent collection |
| GB201704761D0 (en) * | 2017-01-05 | 2017-05-10 | Illumina Inc | Common line selector valve for a system |
| GB201704747D0 (en) | 2017-01-05 | 2017-05-10 | Illumina Inc | Reagent mixing system and methods |
| GB201704768D0 (en) | 2017-01-05 | 2017-05-10 | Illumina Inc | Flow cell liquid degassing systema and method |
| GB201704754D0 (en) | 2017-01-05 | 2017-05-10 | Illumina Inc | Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries |
| GB201704772D0 (en) * | 2017-01-05 | 2017-05-10 | Illumina Inc | Automated volumetric reagent delivery testing |
| GB201704763D0 (es) | 2017-01-05 | 2017-05-10 | Illumina Inc | |
| GB201704758D0 (en) | 2017-01-05 | 2017-05-10 | Illumina Inc | Reagent channel mixing systema and method |
| WO2018128544A1 (en) | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Agendia N.V. | Biomarkers for selecting patient groups, and uses thereof. |
| PL3566158T3 (pl) | 2017-01-06 | 2022-08-08 | Illumina, Inc. | Korekcja fazowania |
| EP3568490B1 (en) | 2017-01-10 | 2021-03-10 | Omniome, Inc. | Polymerases engineered to reduce nucleotide-independent dna binding |
| BR112019014042A2 (pt) | 2017-01-17 | 2020-02-04 | Illumina Inc | determinação de variante de splice oncogênica |
| KR20240135859A (ko) | 2017-01-18 | 2024-09-12 | 일루미나, 인코포레이티드 | 이종 분자 길이를 가진 고유 분자 인덱스 세트의 생성 및 오류 수정 방법 및 시스템 |
| CN110249059B (zh) | 2017-01-20 | 2021-04-13 | 欧姆尼欧美公司 | 核酸的等位基因特异性捕获 |
| US10975427B2 (en) | 2017-01-20 | 2021-04-13 | Omniome, Inc. | Process for cognate nucleotide detection in a nucleic acid sequencing workflow |
| SG11201906569XA (en) | 2017-01-20 | 2019-08-27 | Omniome Inc | Genotyping by polymerase binding |
| GB201701686D0 (en) | 2017-02-01 | 2017-03-15 | Illunina Inc | System & method with fiducials having offset layouts |
| GB201701688D0 (en) * | 2017-02-01 | 2017-03-15 | Illumia Inc | System and method with fiducials in non-recliner layouts |
| WO2018144531A1 (en) | 2017-02-01 | 2018-08-09 | Illumina, Inc. | System and method with fiducials responding to multiple excitation frequencies |
| GB201701689D0 (en) | 2017-02-01 | 2017-03-15 | Illumia Inc | System and method with fiducials of non-closed shapes |
| GB201701691D0 (en) | 2017-02-01 | 2017-03-15 | Illumina Inc | System and method with reflective fiducials |
| US11492666B2 (en) | 2017-02-15 | 2022-11-08 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Distinguishing sequences by detecting polymerase dissociation |
| WO2018151601A1 (en) | 2017-02-17 | 2018-08-23 | Stichting Vumc | Swarm intelligence-enhanced diagnosis and therapy selection for cancer using tumor- educated platelets |
| DK3452621T3 (da) | 2017-02-21 | 2022-12-12 | Illumina Inc | Tagmentation ved brug af immobiliserede transposomer med linkere |
| CN118116478A (zh) | 2017-02-22 | 2024-05-31 | 特韦斯特生物科学公司 | 基于核酸的数据存储 |
| US11104937B2 (en) | 2017-03-15 | 2021-08-31 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR effector system based diagnostics |
| JP2020513815A (ja) | 2017-03-15 | 2020-05-21 | ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド | クラスター化短鎖反復回文配列エフェクター系に基づくウイルス検出用診断法 |
| US11174515B2 (en) | 2017-03-15 | 2021-11-16 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR effector system based diagnostics |
| US11021740B2 (en) | 2017-03-15 | 2021-06-01 | The Broad Institute, Inc. | Devices for CRISPR effector system based diagnostics |
| AU2018239186B2 (en) | 2017-03-20 | 2024-07-25 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for preparing nuclelic acid libraries |
| EP3601611B1 (en) | 2017-03-24 | 2022-01-05 | Life Technologies Corporation | Polynucleotide adapters and methods of use thereof |
| CN110603596B (zh) | 2017-03-30 | 2023-09-29 | Illumina公司 | 基因组数据分析系统和方法 |
| US11572590B2 (en) | 2017-03-31 | 2023-02-07 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for evaluating tumor cell spheroids using 3D microfluidic cell culture device |
| EP3607087A4 (en) | 2017-04-04 | 2020-12-30 | Omniome, Inc. | FLUIDIC APPARATUS AND USEFUL METHODS FOR CHEMICAL AND BIOLOGICAL REACTIONS |
| US11351541B2 (en) | 2017-04-06 | 2022-06-07 | Illumina, Inc. | In-situ fluidic inspection |
| CN110785497A (zh) | 2017-04-23 | 2020-02-11 | 伊鲁米纳剑桥有限公司 | 用于改进编索引的核酸文库中的样品鉴定的组合物和方法 |
| FI3842545T3 (fi) | 2017-04-23 | 2023-01-31 | Koostumuksia ja menetelmiä näytteiden tunnistuksen parantamiseksi indeksoiduissa nukleiinihappokirjastoissa | |
| EP3615671B1 (en) | 2017-04-23 | 2021-07-21 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries |
| SG11201909918XA (en) | 2017-04-23 | 2019-11-28 | Illumina Cambridge Ltd | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries |
| US9951385B1 (en) | 2017-04-25 | 2018-04-24 | Omniome, Inc. | Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency |
| US10386301B2 (en) | 2017-04-25 | 2019-08-20 | Li-Cor, Inc. | Top-down and rotational side view biopsy specimen imager and methods |
| US10161003B2 (en) | 2017-04-25 | 2018-12-25 | Omniome, Inc. | Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency |
| US10485113B2 (en) | 2017-04-27 | 2019-11-19 | Manufacturing Resources International, Inc. | Field serviceable and replaceable display |
| KR102262912B1 (ko) | 2017-04-27 | 2021-06-10 | 매뉴팩처링 리소시스 인터내셔널 인코포레이티드 | 표시장치의 휘어짐을 방지하기 위한 시스템 및 방법 |
| AU2018261332A1 (en) | 2017-05-01 | 2019-11-07 | Illumina, Inc. | Optimal index sequences for multiplex massively parallel sequencing |
| CA3062174A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Illumina, Inc. | Universal short adapters for indexing of polynucleotide samples |
| RU2770879C2 (ru) | 2017-06-07 | 2022-04-22 | Орегон Хэлт Энд Сайенс Юниверсити | Полногеномные библиотеки отдельных клеток для бисульфитного секвенирования |
| WO2018231864A1 (en) | 2017-06-12 | 2018-12-20 | Twist Bioscience Corporation | Methods for seamless nucleic acid assembly |
| WO2018231872A1 (en) | 2017-06-12 | 2018-12-20 | Twist Bioscience Corporation | Methods for seamless nucleic acid assembly |
| CN111032882A (zh) | 2017-06-20 | 2020-04-17 | 伊鲁米那股份有限公司 | 解决扩增反应中低效的方法和组合物 |
| EP3655153B1 (en) * | 2017-07-18 | 2020-09-16 | Omniome, Inc. | Method of chemically modifying plastic surfaces |
| WO2019020153A2 (en) * | 2017-07-26 | 2019-01-31 | El Sokkary Mohamed Mohamed Adel | DNA SEQUENCING MACHINE BASED ON CONCENTRATION |
| CN110785813A (zh) | 2017-07-31 | 2020-02-11 | 伊鲁米那股份有限公司 | 具有多路生物样本聚合的测序系统 |
| CN111108219A (zh) | 2017-08-01 | 2020-05-05 | 伊鲁米纳公司 | 使用的水凝胶珠和流动池的遗传物质的空间索引和文库制备 |
| EP4209597A1 (en) | 2017-08-01 | 2023-07-12 | MGI Tech Co., Ltd. | Nucleic acid sequencing method |
| EP3545106B1 (en) | 2017-08-01 | 2022-01-19 | Helitec Limited | Methods of enriching and determining target nucleotide sequences |
| AU2018312560B2 (en) | 2017-08-01 | 2022-03-10 | Illumina, Inc. | Hydrogel beads for nucleotide sequencing |
| CA3072136A1 (en) | 2017-08-15 | 2019-02-21 | Omniome, Inc. | Scanning apparatus and methods useful for detection of chemical and biological analytes |
| EP3669018A4 (en) | 2017-08-18 | 2021-05-26 | Nautilus Biotechnology, Inc. | Binding reagent selection methods |
| US11407837B2 (en) | 2017-09-11 | 2022-08-09 | Twist Bioscience Corporation | GPCR binding proteins and synthesis thereof |
| US11447818B2 (en) | 2017-09-15 | 2022-09-20 | Illumina, Inc. | Universal short adapters with variable length non-random unique molecular identifiers |
| US10559965B2 (en) | 2017-09-21 | 2020-02-11 | Manufacturing Resources International, Inc. | Display assembly having multiple charging ports |
| SG11201912781TA (en) | 2017-10-16 | 2020-01-30 | Illumina Inc | Aberrant splicing detection using convolutional neural networks (cnns) |
| WO2020081122A1 (en) | 2018-10-15 | 2020-04-23 | Illumina, Inc. | Deep learning-based techniques for pre-training deep convolutional neural networks |
| US10423861B2 (en) | 2017-10-16 | 2019-09-24 | Illumina, Inc. | Deep learning-based techniques for training deep convolutional neural networks |
| EP3697932A1 (en) | 2017-10-19 | 2020-08-26 | Omniome, Inc. | Simultaneous background reduction and complex stabilization in binding assay workflows |
| CA3079613A1 (en) | 2017-10-20 | 2019-04-25 | Twist Bioscience Corporation | Heated nanowells for polynucleotide synthesis |
| EP3710277A4 (en) | 2017-11-14 | 2021-08-04 | Illumina, Inc. | DISTRIBUTION OF DROPS |
| WO2019136175A1 (en) | 2018-01-04 | 2019-07-11 | Twist Bioscience Corporation | Dna-based digital information storage |
| KR102588004B1 (ko) | 2018-01-08 | 2023-10-11 | 일루미나, 인코포레이티드 | 반도체-기반 검출을 사용한 고-처리율 서열분석 |
| WO2019136376A1 (en) | 2018-01-08 | 2019-07-11 | Illumina, Inc. | High-throughput sequencing with semiconductor-based detection |
| NL2020618B1 (en) * | 2018-01-12 | 2019-07-18 | Illumina Inc | Real time controller switching |
| KR102273717B1 (ko) | 2018-01-15 | 2021-07-06 | 일루미나, 인코포레이티드 | 심층 학습 기반 변이체 분류자 |
| BR112020015093A2 (pt) | 2018-01-29 | 2020-12-08 | The Broad Institute, Inc. | Diagnóstico baseado no sistema de efetor crispr |
| WO2019156910A1 (en) | 2018-02-06 | 2019-08-15 | Omniome, Inc. | Compositions and techniques for nucleic acid primer extension |
| US10976533B2 (en) | 2018-02-12 | 2021-04-13 | Intelligent Imaging Innovations, Inc. | Tiling light sheet selective plane illumination microscopy using discontinuous light sheets |
| EP4253562A3 (en) | 2018-02-13 | 2023-10-25 | Illumina, Inc. | Dna sequencing using hydrogel beads |
| CA3067433C (en) | 2018-02-16 | 2022-11-22 | Illumina, Inc. | Charge-tagged nucleotides and methods of use thereof |
| SG11201912279RA (en) | 2018-03-29 | 2020-01-30 | Illumina Inc | Illumination for fluorescence imaging using objective lens |
| KR102383799B1 (ko) | 2018-04-02 | 2022-04-05 | 일루미나, 인코포레이티드 | 서열-기반의 유전 검사용 대조군을 제조하기 위한 조성물 및 방법 |
| WO2019195379A1 (en) | 2018-04-04 | 2019-10-10 | Lifeedit, Inc. | Methods and compositions to identify novel crispr systems |
| WO2019200338A1 (en) | 2018-04-12 | 2019-10-17 | Illumina, Inc. | Variant classifier based on deep neural networks |
| EP3782158A1 (en) | 2018-04-19 | 2021-02-24 | Omniome, Inc. | Improving accuracy of base calls in nucleic acid sequencing methods |
| KR102481869B1 (ko) | 2018-04-20 | 2022-12-27 | 일루미나, 인코포레이티드 | 단일 세포를 캡슐화하는 방법, 캡슐화된 세포 및 이의 용도 |
| CA3098296A1 (en) | 2018-04-26 | 2019-10-31 | Omniome, Inc. | Methods and compositions for stabilizing nucleic acid-nucleotide-polymerase complexes |
| US11752500B2 (en) | 2018-04-27 | 2023-09-12 | Corning Incorporated | Microfluidic devices and methods for manufacturing microfluidic devices |
| EP3794012B1 (en) | 2018-05-15 | 2023-10-18 | Illumina Inc. | Compositions and methods for chemical cleavage and deprotection of surface-bound oligonucleotides |
| WO2019221913A1 (en) * | 2018-05-15 | 2019-11-21 | Illumina, Inc. | Flow cell with flexible connection |
| AU2019270185A1 (en) | 2018-05-17 | 2020-01-16 | Illumina, Inc. | High-throughput single-cell sequencing with reduced amplification bias |
| AU2019270243A1 (en) | 2018-05-18 | 2021-01-07 | Twist Bioscience Corporation | Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization |
| CA3062226A1 (en) | 2018-05-25 | 2019-11-25 | Illumina, Inc. | Circulating rna signatures specific to preeclampsia |
| AU2019276719A1 (en) | 2018-05-31 | 2020-11-26 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Increased signal to noise in nucleic acid sequencing |
| US11180794B2 (en) | 2018-05-31 | 2021-11-23 | Omniome, Inc. | Methods and compositions for capping nucleic acids |
| ES2966028T3 (es) | 2018-06-04 | 2024-04-18 | Illumina Inc | Bibliotecas de transcriptomas unicelulares de alto rendimiento y métodos de preparación y de uso |
| NL2021377B1 (en) | 2018-07-03 | 2020-01-08 | Illumina Inc | Interposer with first and second adhesive layers |
| US10690486B2 (en) | 2018-07-03 | 2020-06-23 | Amo Development, Llc | Water-immersed high precision laser focus spot size measurement apparatus |
| US12073922B2 (en) | 2018-07-11 | 2024-08-27 | Illumina, Inc. | Deep learning-based framework for identifying sequence patterns that cause sequence-specific errors (SSEs) |
| US11378808B2 (en) | 2018-07-18 | 2022-07-05 | Idex Health & Science Llc | Laser systems and optical devices for laser beam shaping |
| CA3107165A1 (en) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Omniome, Inc. | Serial formation of ternary complex species |
| WO2020022891A2 (en) | 2018-07-26 | 2020-01-30 | Stichting Vumc | Biomarkers for atrial fibrillation |
| SG11202101934SA (en) | 2018-07-30 | 2021-03-30 | Readcoor Llc | Methods and systems for sample processing or analysis |
| US10602626B2 (en) | 2018-07-30 | 2020-03-24 | Manufacturing Resources International, Inc. | Housing assembly for an integrated display unit |
| EP3833761A1 (en) | 2018-08-07 | 2021-06-16 | The Broad Institute, Inc. | Novel cas12b enzymes and systems |
| AU2019320771A1 (en) | 2018-08-15 | 2021-02-25 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for improving library enrichment |
| US12098419B2 (en) | 2018-08-23 | 2024-09-24 | Ncan Genomics, Inc. | Linked target capture and ligation |
| EP3853358A1 (en) | 2018-09-17 | 2021-07-28 | Omniome, Inc. | Engineered polymerases for improved sequencing |
| WO2020072816A1 (en) | 2018-10-03 | 2020-04-09 | The Broad Institute, Inc. | Crispr effector system based diagnostics for hemorrhagic fever detection |
| WO2020076976A1 (en) | 2018-10-10 | 2020-04-16 | Readcoor, Inc. | Three-dimensional spatial molecular indexing |
| MX2021003772A (es) | 2018-10-26 | 2021-05-27 | Illumina Inc | Modulacion de globulos de polimero para procesamiento de adn. |
| CN112673098B (zh) | 2018-10-31 | 2023-01-06 | 亿明达股份有限公司 | 聚合酶、组合物及使用方法 |
| JP2022043362A (ja) * | 2018-11-12 | 2022-03-16 | 株式会社日立ハイテク | 核酸分析装置 |
| WO2020101795A1 (en) | 2018-11-15 | 2020-05-22 | Omniome, Inc. | Electronic detection of nucleic acid structure |
| EP3884048A4 (en) | 2018-11-20 | 2022-08-17 | Nautilus Biotechnology, Inc. | DESIGN AND SELECTION OF AFFINITY REAGENTS |
| NL2022043B1 (en) | 2018-11-21 | 2020-06-03 | Akershus Univ Hf | Tagmentation-Associated Multiplex PCR Enrichment Sequencing |
| KR20210098432A (ko) | 2018-11-30 | 2021-08-10 | 일루미나, 인코포레이티드 | 단일 검정을 이용한 다수의 분석물의 분석 |
| EP3891304A1 (en) | 2018-12-04 | 2021-10-13 | Omniome, Inc. | Mixed-phase fluids for nucleic acid sequencing and other analytical assays |
| JP7569690B2 (ja) | 2018-12-05 | 2024-10-18 | イルミナ ケンブリッジ リミテッド | ブリッジ増幅によるクラスタ生成のための方法および組成物 |
| US11001816B2 (en) | 2018-12-05 | 2021-05-11 | Illumina, Inc. | Polymerases, compositions, and methods of use |
| GB201820341D0 (en) | 2018-12-13 | 2019-01-30 | 10X Genomics Inc | Method for transposase-mediated spatial tagging and analysing genomic DNA in a biological specimen |
| GB201820300D0 (en) | 2018-12-13 | 2019-01-30 | 10X Genomics Inc | Method for spatial tagging and analysing genomic DNA in a biological specimen |
| CA3103520A1 (en) | 2018-12-14 | 2020-06-18 | Illumina Cambridge Limited | Decreasing phasing with unlabeled nucleotides during sequencing |
| AU2019411267A1 (en) | 2018-12-17 | 2021-01-07 | Illumina Cambridge Limited | Primer oligonucleotide for sequencing |
| CA3103744A1 (en) | 2018-12-17 | 2020-06-25 | Pietro GATTI-LAFRANCONI | Compositions for use in polynucleotide sequencing |
| JP2022513546A (ja) | 2018-12-18 | 2022-02-09 | イルミナ ケンブリッジ リミテッド | 単一表面プライマーを使用したペアエンドシーケンシングのための方法および組成物 |
| MX2020013379A (es) | 2018-12-19 | 2021-04-28 | Illumina Inc | Métodos para mejorar la clonalidad de grupos de polinucleótidos. |
| US11041199B2 (en) | 2018-12-20 | 2021-06-22 | Omniome, Inc. | Temperature control for analysis of nucleic acids and other analytes |
| MX2020014061A (es) * | 2018-12-21 | 2021-05-27 | Illumina Inc | Sistemas de deteccion. |
| US11293061B2 (en) | 2018-12-26 | 2022-04-05 | Illumina Cambridge Limited | Sequencing methods using nucleotides with 3′ AOM blocking group |
| EP3884071A4 (en) | 2019-01-03 | 2022-04-06 | Boreal Genomics, Inc. | LINKED TARGET CAPTURE |
| IL281664B2 (en) | 2019-01-11 | 2024-07-01 | Illumina Cambridge Ltd | A complex bound to the surface of transposome complexes |
| US11543353B2 (en) * | 2019-01-18 | 2023-01-03 | Essenlix Corporation | Multi-mode illumination system |
| WO2020159795A2 (en) | 2019-01-29 | 2020-08-06 | Illumina, Inc. | Sequencing kits |
| KR20210120820A (ko) | 2019-01-29 | 2021-10-07 | 일루미나, 인코포레이티드 | 플로우 셀 |
| EP3924513B1 (en) | 2019-02-14 | 2023-04-12 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Mitigating adverse impacts of detection systems on nucleic acids and other biological analytes |
| CN113613787B (zh) | 2019-02-20 | 2023-06-13 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 用于检测化学和生物分析物的扫描装置和方法 |
| US11096317B2 (en) | 2019-02-26 | 2021-08-17 | Manufacturing Resources International, Inc. | Display assembly with loopback cooling |
| WO2020176680A1 (en) | 2019-02-26 | 2020-09-03 | Twist Bioscience Corporation | Variant nucleic acid libraries for antibody optimization |
| AU2020232618A1 (en) | 2019-03-01 | 2021-04-08 | Illumina, Inc. | High-throughput single-nuclei and single-cell libraries and methods of making and of using |
| US11210554B2 (en) | 2019-03-21 | 2021-12-28 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata |
| NL2023316B1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-28 | Illumina Inc | Artificial intelligence-based sequencing |
| NL2023314B1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-28 | Illumina Inc | Artificial intelligence-based quality scoring |
| NL2023311B9 (en) | 2019-03-21 | 2021-03-12 | Illumina Inc | Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata |
| NL2023310B1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-28 | Illumina Inc | Training data generation for artificial intelligence-based sequencing |
| US11783917B2 (en) | 2019-03-21 | 2023-10-10 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based base calling |
| NL2023312B1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-28 | Illumina Inc | Artificial intelligence-based base calling |
| WO2020191389A1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-24 | Illumina, Inc. | Training data generation for artificial intelligence-based sequencing |
| SG10201902905UA (en) * | 2019-04-01 | 2020-11-27 | Delta Electronics Int’L Singapore Pte Ltd | Thermal cycling system |
| US10795413B1 (en) | 2019-04-03 | 2020-10-06 | Manufacturing Resources International, Inc. | Electronic display assembly with a channel for ambient air in an access panel |
| US11609208B2 (en) | 2019-04-12 | 2023-03-21 | Western Digital Technologies, Inc. | Devices and methods for molecule detection based on thermal stabilities of magnetic nanoparticles |
| US11112468B2 (en) | 2019-04-12 | 2021-09-07 | Western Digital Technologies, Inc. | Magnetoresistive sensor array for molecule detection and related detection schemes |
| US11738336B2 (en) | 2019-04-12 | 2023-08-29 | Western Digital Technologies, Inc. | Spin torque oscillator (STO) sensors used in nucleic acid sequencing arrays and detection schemes for nucleic acid sequencing |
| US11579217B2 (en) | 2019-04-12 | 2023-02-14 | Western Digital Technologies, Inc. | Devices and methods for frequency- and phase-based detection of magnetically-labeled molecules using spin torque oscillator (STO) sensors |
| US11327073B2 (en) | 2019-04-12 | 2022-05-10 | Western Digital Technologies, Inc. | Thermal sensor array for molecule detection and related detection schemes |
| US11423306B2 (en) | 2019-05-16 | 2022-08-23 | Illumina, Inc. | Systems and devices for characterization and performance analysis of pixel-based sequencing |
| US11593649B2 (en) | 2019-05-16 | 2023-02-28 | Illumina, Inc. | Base calling using convolutions |
| WO2020252186A1 (en) | 2019-06-11 | 2020-12-17 | Omniome, Inc. | Calibrated focus sensing |
| TW202104901A (zh) * | 2019-06-19 | 2021-02-01 | 美商伊路米納有限公司 | 儀器中的試劑交換 |
| AU2020298294A1 (en) | 2019-06-21 | 2022-02-17 | Twist Bioscience Corporation | Barcode-based nucleic acid sequence assembly |
| BR112021012751A2 (pt) | 2019-07-12 | 2021-12-14 | Illumina Cambridge Ltd | Preparação de biblioteca de ácidos nucleicos usando eletroforese |
| CN113260711A (zh) | 2019-07-12 | 2021-08-13 | Illumina剑桥有限公司 | 使用固定在固体载体上的crispr/cas9制备核酸测序文库的组合物和方法 |
| WO2021011803A1 (en) | 2019-07-16 | 2021-01-21 | Omniome, Inc. | Synthetic nucleic acids having non-natural structures |
| US10656368B1 (en) | 2019-07-24 | 2020-05-19 | Omniome, Inc. | Method and system for biological imaging using a wide field objective lens |
| EP4028407B1 (en) | 2019-09-10 | 2023-08-16 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Reversible modification of nucleotides |
| US20220290245A1 (en) | 2019-09-11 | 2022-09-15 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic | Cancer detection and classification |
| US11208682B2 (en) | 2019-09-13 | 2021-12-28 | Western Digital Technologies, Inc. | Enhanced optical detection for nucleic acid sequencing using thermally-dependent fluorophore tags |
| US12091777B2 (en) | 2019-09-23 | 2024-09-17 | Twist Bioscience Corporation | Variant nucleic acid libraries for CRTH2 |
| CN118348265A (zh) * | 2019-09-24 | 2024-07-16 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 生化物质分析系统、方法及装置 |
| CN118186063A (zh) | 2019-10-18 | 2024-06-14 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 用于对核酸加帽的方法和组合物 |
| WO2021080811A1 (en) * | 2019-10-23 | 2021-04-29 | Corning Incorporated | Glass articles including flow channels and methods of making the same |
| US20210139867A1 (en) | 2019-11-08 | 2021-05-13 | Omniome, Inc. | Engineered polymerases for improved sequencing by binding |
| US11747329B2 (en) | 2019-11-22 | 2023-09-05 | Western Digital Technologies, Inc. | Magnetic gradient concentrator/reluctance detector for molecule detection |
| CN113677807A (zh) | 2019-11-22 | 2021-11-19 | 因美纳有限公司 | 先兆子痫特异性的循环rna标记 |
| DE202019106694U1 (de) | 2019-12-02 | 2020-03-19 | Omniome, Inc. | System zur Sequenzierung von Nukleinsäuren in Fluidschaum |
| US11714848B2 (en) | 2019-12-02 | 2023-08-01 | Illumina Cambridge Limited | Time-based cluster imaging of amplified contiguity-preserved library fragments of genomic DNA |
| DE202019106695U1 (de) | 2019-12-02 | 2020-03-19 | Omniome, Inc. | System zur Sequenzierung von Nukleinsäuren in Fluidschaum |
| CA3131632A1 (en) | 2019-12-04 | 2021-06-10 | Tong Liu | Preparation of dna sequencing libraries for detection of dna pathogens in plasma |
| WO2021118349A1 (en) | 2019-12-10 | 2021-06-17 | Prinses Máxima Centrum Voor Kinderoncologie B.V. | Methods of typing germ cell tumors |
| JP7500727B2 (ja) | 2019-12-18 | 2024-06-17 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 連続的な標識スキームを使用した合成による配列決定方法 |
| US20210187503A1 (en) * | 2019-12-19 | 2021-06-24 | Personal Genomics Taiwan, Inc. | Apparatus and system for single-molecule nucleic acids detection |
| CA3134746A1 (en) | 2019-12-19 | 2021-06-24 | Illumina, Inc. | High-throughput single-cell libraries and methods of making and of using |
| US11498078B2 (en) | 2019-12-23 | 2022-11-15 | Singular Genomics Systems, Inc. | Flow cell receiver and methods of use |
| US20210189483A1 (en) | 2019-12-23 | 2021-06-24 | Mgi Tech Co. Ltd. | Controlled strand-displacement for paired end sequencing |
| US11747262B2 (en) * | 2019-12-23 | 2023-09-05 | Singular Genomics Systems, Inc. | Flow cell carrier and methods of use |
| US12110548B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-10-08 | 10X Genomics, Inc. | Bi-directional in situ analysis |
| US20230054204A1 (en) | 2020-02-04 | 2023-02-23 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Flow cells and methods for their manufacture and use |
| US20210265015A1 (en) | 2020-02-20 | 2021-08-26 | Illumina, Inc. | Hardware Execution and Acceleration of Artificial Intelligence-Based Base Caller |
| EP4107735A2 (en) | 2020-02-20 | 2022-12-28 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based many-to-many base calling |
| US20210265018A1 (en) | 2020-02-20 | 2021-08-26 | Illumina, Inc. | Knowledge Distillation and Gradient Pruning-Based Compression of Artificial Intelligence-Based Base Caller |
| US20210265016A1 (en) | 2020-02-20 | 2021-08-26 | Illumina, Inc. | Data Compression for Artificial Intelligence-Based Base Calling |
| AU2021230282A1 (en) | 2020-03-03 | 2022-09-22 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for sequencing double stranded nucleic acids |
| BR112022021789A2 (pt) | 2020-04-27 | 2023-03-07 | Twist Bioscience Corp | Bibliotecas de ácido nucléico variantes para coronavírus |
| US20230330223A1 (en) | 2020-04-27 | 2023-10-19 | Agendia N.V. | Treatment of her2 negative, mammaprint high risk 2 breast cancer |
| EP4144745A4 (en) * | 2020-04-30 | 2024-02-21 | GeneMind Biosciences Company Limited | SEQUENCING METHOD, ANALYSIS METHOD AND ANALYSIS SYSTEM, COMPUTER READABLE STORAGE MEDIUM AND ELECTRONIC DEVICE |
| US11188778B1 (en) | 2020-05-05 | 2021-11-30 | Illumina, Inc. | Equalization-based image processing and spatial crosstalk attenuator |
| US20230203592A1 (en) | 2020-05-05 | 2023-06-29 | Akershus Universitetssykehus Hf | Compositions and methods for characterizing bowel cancer |
| CN115836135A (zh) | 2020-05-05 | 2023-03-21 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 用于修饰聚合酶-核酸复合物的组合物和方法 |
| JP2023526062A (ja) | 2020-05-12 | 2023-06-20 | イルミナ インコーポレイテッド | 組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して修飾塩基を有する核酸の生成 |
| EP4153775B1 (en) | 2020-05-22 | 2024-07-24 | 10X Genomics, Inc. | Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity |
| EP4163357A4 (en) * | 2020-06-03 | 2024-02-28 | Hitachi High-Tech Corporation | NUCLEIC ACID ANALYZER |
| US12031177B1 (en) | 2020-06-04 | 2024-07-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods of enhancing spatial resolution of transcripts |
| WO2021252617A1 (en) | 2020-06-09 | 2021-12-16 | Illumina, Inc. | Methods for increasing yield of sequencing libraries |
| AU2021288692A1 (en) | 2020-06-11 | 2023-02-02 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Methods and systems for computational decoding of biological, chemical, and physical entities |
| CN115867560A (zh) | 2020-06-22 | 2023-03-28 | 伊鲁米纳剑桥有限公司 | 具有3’缩醛封端基团的核苷与核苷酸 |
| AU2021299216A1 (en) | 2020-06-30 | 2022-12-08 | Illumina, Inc. | Catalytically controlled sequencing by synthesis to produce scarless DNA |
| US20230242967A1 (en) | 2020-07-02 | 2023-08-03 | Illumina, Inc. | A method to calibrate nucleic acid library seeding efficiency in flowcells |
| MX2023000345A (es) | 2020-07-08 | 2023-02-13 | Illumina Inc | Globulos como portadores de transposomas. |
| CN116171330A (zh) | 2020-08-06 | 2023-05-26 | Illumina公司 | 使用小珠连接的转座体制备rna和dna测序文库 |
| CN116323971A (zh) | 2020-08-18 | 2023-06-23 | Illumina公司 | 核酸的序列特异性靶向转座和选择以及分选 |
| GB202013141D0 (en) | 2020-08-21 | 2020-10-07 | Univ College Cardiff Consultants Ltd | A screening method for the detection of DNA damage |
| US20220067489A1 (en) | 2020-08-28 | 2022-03-03 | Illumina, Inc. | Detecting and Filtering Clusters Based on Artificial Intelligence-Predicted Base Calls |
| IL300983A (en) | 2020-09-11 | 2023-04-01 | Illumina Cambridge Ltd | Methods for enriching a target sequence from a sequence library using hairpin adapters |
| US11477923B2 (en) | 2020-10-02 | 2022-10-18 | Manufacturing Resources International, Inc. | Field customizable airflow system for a communications box |
| EP4229210A1 (en) | 2020-10-19 | 2023-08-23 | Twist Bioscience Corporation | Methods of synthesizing oligonucleotides using tethered nucleotides |
| EP4232600A2 (en) | 2020-10-21 | 2023-08-30 | Illumina, Inc. | Sequencing templates comprising multiple inserts and compositions and methods for improving sequencing throughput |
| US11470749B2 (en) | 2020-10-23 | 2022-10-11 | Manufacturing Resources International, Inc. | Forced air cooling for display assemblies using centrifugal fans |
| US11778757B2 (en) | 2020-10-23 | 2023-10-03 | Manufacturing Resources International, Inc. | Display assemblies incorporating electric vehicle charging equipment |
| EP4200444A4 (en) | 2020-10-30 | 2024-09-25 | Singular Genomics Systems Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR REDUCING NUCLEOTIDE IMPURITIES |
| KR20230118570A (ko) | 2020-11-11 | 2023-08-11 | 노틸러스 서브시디어리, 인크. | 강화된 결합 및 검출 특성을 갖는 친화성 시약 |
| WO2022108790A1 (en) | 2020-11-17 | 2022-05-27 | Singular Genomics Systems, Inc. | Multiport disconnect couplings |
| EP4264231A1 (en) | 2020-12-16 | 2023-10-25 | Singular Genomics Systems, Inc. | Kinematic imaging system |
| JP2024501232A (ja) | 2020-12-21 | 2024-01-11 | シンギュラー・ゲノミクス・システムズ・インコーポレイテッド | 多色撮像のためのシステム及び方法 |
| US20220298568A1 (en) | 2021-01-13 | 2022-09-22 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Surface structuring with colloidal assembly |
| WO2022159663A1 (en) | 2021-01-21 | 2022-07-28 | Nautilus Biotechnology, Inc. | Systems and methods for biomolecule preparation |
| CA3206511A1 (en) | 2021-01-29 | 2022-08-04 | Yir-Shyuan WU | Methods, compositions and kits to improve seeding efficiency of flow cells with polynucleotides |
| JP2024506304A (ja) | 2021-02-04 | 2024-02-13 | イルミナ インコーポレイテッド | トランスポソーム結合ビーズ上でのロングインデックス付き連結リード生成 |
| WO2022174054A1 (en) | 2021-02-13 | 2022-08-18 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions for in situ macromolecule detection and uses thereof |
| EP4421491A2 (en) | 2021-02-19 | 2024-08-28 | 10X Genomics, Inc. | Method of using a modular assay support device |
| WO2022192591A1 (en) | 2021-03-11 | 2022-09-15 | Nautilus Biotechnology, Inc. | Systems and methods for biomolecule retention |
| US11884977B2 (en) | 2021-03-12 | 2024-01-30 | Singular Genomics Systems, Inc. | Nanoarrays and methods of use thereof |
| WO2022192671A1 (en) | 2021-03-12 | 2022-09-15 | Singular Genomics Systems, Inc. | Nanoarrays and methods of use thereof |
| WO2022197752A1 (en) | 2021-03-16 | 2022-09-22 | Illumina, Inc. | Tile location and/or cycle based weight set selection for base calling |
| CA3210451A1 (en) | 2021-03-22 | 2022-09-29 | Illumina Cambridge Limited | Methods for improving nucleic acid cluster clonality |
| IL307177A (en) | 2021-03-29 | 2023-11-01 | Illumina Inc | Compounds and methods for assessing DNA damage in the library and normalizing amplicon size bias |
| WO2022212269A1 (en) | 2021-03-29 | 2022-10-06 | Illumina, Inc. | Improved methods of library preparation |
| EP4314282A1 (en) | 2021-03-30 | 2024-02-07 | Illumina, Inc. | Improved methods of isothermal complementary dna and library preparation |
| WO2022212180A1 (en) | 2021-03-31 | 2022-10-06 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based base caller with contextual awareness |
| CA3211172A1 (en) | 2021-03-31 | 2022-10-06 | Illumina, Inc. | Methods of preparing directional tagmentation sequencing libraries using transposon-based technology with unique molecular identifiers for error correction |
| CN117043867A (zh) | 2021-04-02 | 2023-11-10 | 因美纳有限公司 | 用于检测用于测序的核苷酸样品玻片内的气泡的机器学习模型 |
| US20220336054A1 (en) | 2021-04-15 | 2022-10-20 | Illumina, Inc. | Deep Convolutional Neural Networks to Predict Variant Pathogenicity using Three-Dimensional (3D) Protein Structures |
| FR3121936A1 (fr) | 2021-04-20 | 2022-10-21 | Naos Institute Of Life Science | Methode de criblage d’ingredients et de compositions topiques ecobiologiques, et son utilisation pour realiser un soin cosmetique de restauration du microbiote cutane |
| US12070744B2 (en) | 2021-04-22 | 2024-08-27 | Illumina, Inc. | Valve assemblies and related systems |
| EP4334475A1 (en) | 2021-05-07 | 2024-03-13 | Agendia N.V. | Endocrine treatment of hormone receptor positive breast cancer typed as having a low risk of recurrence |
| CN117858959A (zh) | 2021-05-10 | 2024-04-09 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 滚环扩增期间的dna扩增缓冲液补充 |
| WO2022240764A1 (en) | 2021-05-10 | 2022-11-17 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Single-molecule seeding and amplification on a surface |
| AU2022277632A1 (en) | 2021-05-20 | 2023-11-09 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for sequencing by synthesis |
| WO2022265994A1 (en) | 2021-06-15 | 2022-12-22 | Illumina, Inc. | Hydrogel-free surface functionalization for sequencing |
| WO2022272260A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-29 | Illumina, Inc. | Compositions, methods, kits, cartridges, and systems for sequencing reagents |
| WO2022271983A1 (en) | 2021-06-24 | 2022-12-29 | Nautilus Biotechnology, Inc. | Methods and systems for assay refinement |
| AU2022296802A1 (en) | 2021-06-25 | 2024-01-04 | Illumina, Inc. | Linear fourier fiducial |
| WO2022271689A1 (en) | 2021-06-25 | 2022-12-29 | Illumina, Inc. | Fiducials for use in registration of a patterned surface |
| CN117730372A (zh) | 2021-06-29 | 2024-03-19 | 因美纳有限公司 | 用于确定核苷酸碱基检出和碱基检出质量的信噪比度量 |
| WO2023278184A1 (en) | 2021-06-29 | 2023-01-05 | Illumina, Inc. | Methods and systems to correct crosstalk in illumination emitted from reaction sites |
| WO2023278966A1 (en) | 2021-06-29 | 2023-01-05 | Illumina, Inc. | Machine-learning model for generating confidence classifications for genomic coordinates |
| KR20240027599A (ko) | 2021-06-29 | 2024-03-04 | 일루미나, 인코포레이티드 | 올리고 서열을 사용하여 훈련된 자체-학습 염기 호출자 |
| US20230005253A1 (en) | 2021-07-01 | 2023-01-05 | Illumina, Inc. | Efficient artificial intelligence-based base calling of index sequences |
| US20230027409A1 (en) | 2021-07-13 | 2023-01-26 | Illumina, Inc. | Methods and systems for real time extraction of crosstalk in illumination emitted from reaction sites |
| WO2023003757A1 (en) | 2021-07-19 | 2023-01-26 | Illumina Software, Inc. | Intensity extraction with interpolation and adaptation for base calling |
| US11455487B1 (en) | 2021-10-26 | 2022-09-27 | Illumina Software, Inc. | Intensity extraction and crosstalk attenuation using interpolation and adaptation for base calling |
| CA3226482A1 (en) * | 2021-07-21 | 2023-01-26 | Element Biosciences, Inc. | Optical systems for nucleic acid sequencing and methods thereof |
| US20230021577A1 (en) | 2021-07-23 | 2023-01-26 | Illumina Software, Inc. | Machine-learning model for recalibrating nucleotide-base calls |
| CN117813391A (zh) | 2021-07-23 | 2024-04-02 | 因美纳有限公司 | 制备用于dna测序的基底表面的方法 |
| US11966263B2 (en) | 2021-07-28 | 2024-04-23 | Manufacturing Resources International, Inc. | Display assemblies for providing compressive forces at electronic display layers |
| JP2024532049A (ja) | 2021-07-28 | 2024-09-05 | イルミナ インコーポレイテッド | ベースコールシステムの品質スコア較正 |
| WO2023014741A1 (en) | 2021-08-03 | 2023-02-09 | Illumina Software, Inc. | Base calling using multiple base caller models |
| US12077789B2 (en) | 2021-08-14 | 2024-09-03 | Illumina, Inc. | Polymerases, compositions, and methods of use |
| US20240271185A1 (en) | 2021-08-17 | 2024-08-15 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for identifying methylated cytosines |
| US11919393B2 (en) | 2021-08-23 | 2024-03-05 | Manufacturing Resources International, Inc. | Display assemblies inducing relatively turbulent flow and integrating electric vehicle charging equipment |
| US11744054B2 (en) | 2021-08-23 | 2023-08-29 | Manufacturing Resources International, Inc. | Fan unit for providing improved airflow within display assemblies |
| US11762231B2 (en) | 2021-08-23 | 2023-09-19 | Manufacturing Resources International, Inc. | Display assemblies inducing turbulent flow |
| EP4399528A1 (en) | 2021-09-09 | 2024-07-17 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Characterization and localization of protein modifications |
| GB202112907D0 (en) | 2021-09-10 | 2021-10-27 | Res & Innovation Uk | Methods of biomolecule display |
| US20230088338A1 (en) | 2021-09-10 | 2023-03-23 | Illumina, Inc. | Sequencer focus quality metrics and focus tracking for periodically patterned surfaces |
| US20230093253A1 (en) | 2021-09-17 | 2023-03-23 | Illumina, Inc. | Automatically identifying failure sources in nucleotide sequencing from base-call-error patterns |
| US20230095961A1 (en) | 2021-09-21 | 2023-03-30 | Illumina, Inc. | Graph reference genome and base-calling approach using imputed haplotypes |
| WO2023049215A1 (en) | 2021-09-22 | 2023-03-30 | Illumina, Inc. | Compressed state-based base calling |
| AU2022352593A1 (en) | 2021-09-22 | 2024-02-15 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Methods and systems for determining polypeptide interactions |
| US20230096386A1 (en) | 2021-09-30 | 2023-03-30 | Illumina Cambridge Limited | Polynucleotide sequencing |
| WO2023056328A2 (en) | 2021-09-30 | 2023-04-06 | Illumina, Inc. | Solid supports and methods for depleting and/or enriching library fragments prepared from biosamples |
| EP4416731A1 (en) | 2021-10-11 | 2024-08-21 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Highly multiplexable analysis of proteins and proteomes |
| CA3234961A1 (en) | 2021-10-20 | 2023-04-27 | Illumina, Inc. | Methods for capturing library dna for sequencing |
| US20230149883A1 (en) | 2021-11-03 | 2023-05-18 | Nautilus Biotechnology, Inc. | Systems and methods for surface structuring |
| WO2023081485A1 (en) | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Stepwise sequencing of a polynucleotide with a homogenous reaction mixture |
| WO2023085932A1 (en) | 2021-11-10 | 2023-05-19 | Omnigen B.V. | Prediction of response following folfirinox treatment in cancer patients |
| US11968813B2 (en) | 2021-11-23 | 2024-04-23 | Manufacturing Resources International, Inc. | Display assembly with divided interior space |
| EP4441743A1 (en) | 2021-12-02 | 2024-10-09 | Illumina, Inc. | Generating cluster-specific-signal corrections for determining nucleotide-base calls |
| WO2023107622A1 (en) | 2021-12-10 | 2023-06-15 | Illumina, Inc. | Parallel sample and index sequencing |
| CN117813397A (zh) | 2021-12-21 | 2024-04-02 | 因美纳有限公司 | 蜡-微球基质组合物及其制备和使用方法 |
| US20230215515A1 (en) | 2021-12-23 | 2023-07-06 | Illumina Software, Inc. | Facilitating secure execution of external workflows for genomic sequencing diagnostics |
| WO2023122363A1 (en) | 2021-12-23 | 2023-06-29 | Illumina Software, Inc. | Dynamic graphical status summaries for nucelotide sequencing |
| US20230207050A1 (en) | 2021-12-28 | 2023-06-29 | Illumina Software, Inc. | Machine learning model for recalibrating nucleotide base calls corresponding to target variants |
| AU2022425440A1 (en) | 2021-12-29 | 2024-07-11 | Illumina, Inc. | Automatically switching variant analysis model versions for genomic analysis applications |
| CA3223362A1 (en) | 2022-01-20 | 2023-07-27 | Xiaolin Wu | Methods of detecting methylcytosine and hydroxymethylcytosine by sequencing |
| US20230313271A1 (en) | 2022-02-25 | 2023-10-05 | Illumina, Inc. | Machine-learning models for detecting and adjusting values for nucleotide methylation levels |
| US20230410944A1 (en) | 2022-02-25 | 2023-12-21 | Illumina, Inc. | Calibration sequences for nucelotide sequencing |
| WO2023172665A2 (en) | 2022-03-10 | 2023-09-14 | Singular Genomics Systems, Inc. | Nucleic acid delivery scaffolds |
| WO2023175024A1 (en) | 2022-03-15 | 2023-09-21 | Illumina, Inc. | Paired-end sequencing |
| CA3222807A1 (en) | 2022-03-22 | 2023-09-28 | Alexandra SZEMJONOV | Substrate with orthogonally functional nanodomains |
| US20230343414A1 (en) | 2022-03-25 | 2023-10-26 | Illumina, Inc. | Sequence-to-sequence base calling |
| WO2023192917A1 (en) | 2022-03-29 | 2023-10-05 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Integrated arrays for single-analyte processes |
| AU2023248405A1 (en) | 2022-04-07 | 2024-01-04 | Illumina, Inc. | Altered cytidine deaminases and methods of use |
| WO2023212490A1 (en) | 2022-04-25 | 2023-11-02 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Systems and methods for assessing and improving the quality of multiplex molecular assays |
| WO2023212601A1 (en) | 2022-04-26 | 2023-11-02 | Illumina, Inc. | Machine-learning models for selecting oligonucleotide probes for array technologies |
| WO2023209606A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Illumina Cambridge Limited | Methods and systems for encapsulating lyophilised microspheres |
| US20230368866A1 (en) | 2022-05-10 | 2023-11-16 | Illumina Software, Inc. | Adaptive neural network for nucelotide sequencing |
| WO2023224487A1 (en) | 2022-05-19 | 2023-11-23 | Agendia N.V. | Prediction of response to immune therapy in breast cancer patients |
| WO2023224488A1 (en) | 2022-05-19 | 2023-11-23 | Agendia N.V. | Dna repair signature and prediction of response following cancer therapy |
| US20230392207A1 (en) | 2022-06-03 | 2023-12-07 | Illumina, Inc. | Circulating rna biomarkers for preeclampsia |
| WO2023239917A1 (en) | 2022-06-09 | 2023-12-14 | Illumina, Inc. | Dependence of base calling on flow cell tilt |
| WO2023250364A1 (en) | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Method for detecting analytes at sites of optically non-resolvable distances |
| GB202209189D0 (en) | 2022-06-22 | 2022-08-10 | Broken String Biosciences Ltd | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
| US20230420080A1 (en) | 2022-06-24 | 2023-12-28 | Illumina Software, Inc. | Split-read alignment by intelligently identifying and scoring candidate split groups |
| US20230420082A1 (en) | 2022-06-27 | 2023-12-28 | Illumina Software, Inc. | Generating and implementing a structural variation graph genome |
| US20230420075A1 (en) | 2022-06-27 | 2023-12-28 | Illumina Software, Inc. | Accelerators for a genotype imputation model |
| WO2024006705A1 (en) | 2022-06-27 | 2024-01-04 | Illumina Software, Inc. | Improved human leukocyte antigen (hla) genotyping |
| WO2024006284A1 (en) * | 2022-07-01 | 2024-01-04 | Illumina Cambridge Limited | Multiband scanning and fiber bundle to enable reduced light source intensity and improved imaging quality |
| WO2024015962A1 (en) | 2022-07-15 | 2024-01-18 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Blocked asymmetric hairpin adaptors |
| US12010813B2 (en) | 2022-07-22 | 2024-06-11 | Manufacturing Resources International, Inc. | Self-contained electronic display assembly, mounting structure and methods for the same |
| US12072561B2 (en) | 2022-07-22 | 2024-08-27 | Manufacturing Resources International, Inc. | Self-contained electronic display assembly, mounting structure and methods for the same |
| US12035486B1 (en) | 2022-07-25 | 2024-07-09 | Manufacturing Resources International, Inc. | Electronic display assembly with fabric panel communications box |
| WO2024026356A1 (en) | 2022-07-26 | 2024-02-01 | Illumina, Inc. | Rapid single-cell multiomics processing using an executable file |
| WO2024025806A1 (en) | 2022-07-27 | 2024-02-01 | Illumina, Inc. | Motion feedback using patterned flowcells |
| WO2024039516A1 (en) | 2022-08-19 | 2024-02-22 | Illumina, Inc. | Third dna base pair site-specific dna detection |
| WO2024059655A1 (en) | 2022-09-15 | 2024-03-21 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Characterizing accessibility of macromolecule structures |
| US20240100518A1 (en) | 2022-09-26 | 2024-03-28 | Illumina, Inc. | Flow cell based motion system calibration and control methods |
| WO2024073516A1 (en) | 2022-09-29 | 2024-04-04 | Illumina, Inc. | A target-variant-reference panel for imputing target variants |
| AU2023353465A1 (en) * | 2022-09-29 | 2024-10-03 | Illumina, Inc. | Dynamic optical system calibration |
| WO2024073599A1 (en) | 2022-09-29 | 2024-04-04 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Preparation of array surfaces for single-analyte processes |
| US20240141427A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-05-02 | Illumina, Inc. | Polymerases, compositions, and methods of use |
| WO2024073047A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina, Inc. | Cytidine deaminases and methods of use in mapping modified cytosine nucleotides |
| WO2024069581A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina Singapore Pte. Ltd. | Helicase-cytidine deaminase complexes and methods of use |
| WO2024073043A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Illumina, Inc. | Methods of using cpg binding proteins in mapping modified cytosine nucleotides |
| US20240120027A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-11 | Illumina, Inc. | Machine-learning model for refining structural variant calls |
| WO2024077096A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-11 | Illumina, Inc. | Integrating variant calls from multiple sequencing pipelines utilizing a machine learning architecture |
| WO2024077202A2 (en) | 2022-10-06 | 2024-04-11 | Illumina, Inc. | Probes for improving environmental sample surveillance |
| WO2024077152A1 (en) | 2022-10-06 | 2024-04-11 | Illumina, Inc. | Probes for depleting abundant small noncoding rna |
| WO2024077162A2 (en) | 2022-10-06 | 2024-04-11 | Illumina, Inc. | Probes for improving coronavirus sample surveillance |
| WO2024081649A1 (en) | 2022-10-11 | 2024-04-18 | Illumina, Inc. | Detecting and correcting methylation values from methylation sequencing assays |
| WO2024113148A1 (zh) * | 2022-11-29 | 2024-06-06 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 流体系统、生化分析检测平台和流体操作方法 |
| US20240177802A1 (en) | 2022-11-30 | 2024-05-30 | Illumina, Inc. | Accurately predicting variants from methylation sequencing data |
| WO2024118903A1 (en) | 2022-11-30 | 2024-06-06 | Illumina, Inc. | Chemoenzymatic correction of false positive uracil transformations |
| WO2024123748A1 (en) | 2022-12-07 | 2024-06-13 | Illumina, Inc. | Etch-free photoresist patterning in multi-depth nanowells |
| WO2024123917A1 (en) | 2022-12-07 | 2024-06-13 | Illumina, Inc. | Monoclonal clustering using double stranded dna size exclusion with patterned seeding |
| WO2024124073A1 (en) | 2022-12-09 | 2024-06-13 | Nautilus Subsidiary, Inc. | A method comprising performing on a single-analyte array at least 50 cycles of a process |
| WO2024129672A1 (en) | 2022-12-12 | 2024-06-20 | The Broad Institute, Inc. | Trafficked rnas for assessment of cell-cell connectivity and neuroanatomy |
| WO2024129969A1 (en) | 2022-12-14 | 2024-06-20 | Illumina, Inc. | Systems and methods for capture and enrichment of clustered beads on flow cell substrates |
| US20240201182A1 (en) | 2022-12-15 | 2024-06-20 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Inhibition of photon phenomena on single molecule arrays |
| WO2024130031A1 (en) | 2022-12-16 | 2024-06-20 | Illumina, Inc. | Boranes on solid supports |
| WO2024137774A1 (en) | 2022-12-22 | 2024-06-27 | Illumina, Inc. | Palladium catalyst compositions and methods for sequencing by synthesis |
| AU2023409138A1 (en) | 2022-12-22 | 2024-10-03 | Illumina, Inc. | Transition-metal catalyst compositions and methods for sequencing by synthesis |
| US20240271206A1 (en) | 2022-12-27 | 2024-08-15 | Illumina, Inc. | Methods of sequencing using 3' allyl blocked nucleotides |
| AU2023421715A1 (en) | 2023-01-06 | 2024-09-26 | Illumina, Inc. | Reducing uracils by polymerase |
| US20240241110A1 (en) | 2023-01-12 | 2024-07-18 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Characterization of glycans and glycoconjugates |
| WO2024158538A1 (en) | 2023-01-27 | 2024-08-02 | Illumina, Inc. | Jitter correction image analysis |
| WO2024167954A1 (en) | 2023-02-06 | 2024-08-15 | Illumina, Inc. | Determining and removing inter-cluster light interference |
| WO2024173756A1 (en) | 2023-02-17 | 2024-08-22 | Illumina, Inc. | Cell-free dna signals as biomarkers of preeclampsia |
| WO2024206122A1 (en) | 2023-03-24 | 2024-10-03 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Improved transfer of nanoparticles to array surfaces |
| US20240327909A1 (en) | 2023-03-30 | 2024-10-03 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for nucleic acid sequencing |
| WO2024206848A1 (en) | 2023-03-30 | 2024-10-03 | Illumina, Inc. | Tandem repeat genotyping |
Family Cites Families (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58145912A (ja) * | 1982-02-25 | 1983-08-31 | Nobuhiro Satou | レ−ザ光照明装置 |
| US5846719A (en) | 1994-10-13 | 1998-12-08 | Lynx Therapeutics, Inc. | Oligonucleotide tags for sorting and identification |
| HUP9900910A2 (hu) | 1995-06-07 | 1999-07-28 | Lynx Therapeutics, Inc. | Oligonukleotid jelzések osztályozáshoz és azonosításhoz |
| AU4665597A (en) * | 1996-10-04 | 1998-04-24 | Spectrumedix Corporation | Capillary tube holder for electrophoretic applications |
| US6136543A (en) | 1997-01-31 | 2000-10-24 | Hitachi, Ltd. | Method for determining nucleic acids base sequence and apparatus therefor |
| ES2239387T3 (es) | 1997-03-27 | 2005-09-16 | The University Of British Columbia | Vectores de expresion de insecto. |
| AU6846698A (en) | 1997-04-01 | 1998-10-22 | Glaxo Group Limited | Method of nucleic acid amplification |
| IL141148A0 (en) | 1998-07-30 | 2002-02-10 | Solexa Ltd | Arrayed biomolecules and their use in sequencing |
| US7270951B1 (en) * | 1999-03-10 | 2007-09-18 | Asm Scientific, Inc. | Method for direct nucleic acid sequencing |
| EE04249B1 (et) * | 1999-04-21 | 2004-02-16 | Asper O� | Meetod biopolümeermaatriksi lugemiseks ja fluorestsentsdetektor |
| US6548796B1 (en) * | 1999-06-23 | 2003-04-15 | Regents Of The University Of Minnesota | Confocal macroscope |
| GB9923644D0 (en) * | 1999-10-06 | 1999-12-08 | Medical Biosystems Ltd | DNA sequencing |
| GB0002389D0 (en) | 2000-02-02 | 2000-03-22 | Solexa Ltd | Molecular arrays |
| US6661937B2 (en) * | 2000-06-07 | 2003-12-09 | Corning, Incorporated | Fiber squeezing device |
| AR031640A1 (es) | 2000-12-08 | 2003-09-24 | Applied Research Systems | Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido |
| US7297518B2 (en) | 2001-03-12 | 2007-11-20 | California Institute Of Technology | Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences by asynchronous base extension |
| FI114399B (fi) * | 2001-06-06 | 2004-10-15 | Biohit Oyj | Menetelmä ekstensiotuotteiden määrittämiseksi |
| US6744955B2 (en) * | 2001-06-29 | 2004-06-01 | Alcatel | Buffer tube having a high fiber count ribbon stack packaging configuration and corner cushions |
| US7057026B2 (en) | 2001-12-04 | 2006-06-06 | Solexa Limited | Labelled nucleotides |
| GB0200844D0 (en) | 2002-01-15 | 2002-03-06 | Solexa Ltd | Linear response auto focussing device and method |
| GB0200938D0 (en) | 2002-01-16 | 2002-03-06 | Solexa Ltd | Prism design for scanning applications |
| DK3363809T3 (da) | 2002-08-23 | 2020-05-04 | Illumina Cambridge Ltd | Modificerede nukleotider til polynukleotidsekvensering |
| DK3147292T3 (en) | 2002-08-23 | 2018-12-03 | Illumina Cambridge Ltd | LABELED NUCLEOTIDES |
| US7122384B2 (en) * | 2002-11-06 | 2006-10-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Resonant light scattering microparticle methods |
| DE602004036672C5 (de) | 2003-01-29 | 2012-11-29 | 454 Life Sciences Corporation | Nukleinsäureamplifikation auf Basis von Kügelchenemulsion |
| CA2515938A1 (en) * | 2003-02-12 | 2004-08-26 | Genizon Svenska Ab | Methods and means for nucleic acid sequencing |
| CA2897376A1 (en) | 2003-02-26 | 2004-09-10 | Radoje T. Drmanac | Modular system and probes for dna analysis |
| GB0321306D0 (en) | 2003-09-11 | 2003-10-15 | Solexa Ltd | Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues |
| JP4407271B2 (ja) * | 2003-12-19 | 2010-02-03 | 株式会社日立製作所 | チップ、反応分析装置、反応分析方法 |
| US20110059865A1 (en) | 2004-01-07 | 2011-03-10 | Mark Edward Brennan Smith | Modified Molecular Arrays |
| GB0400974D0 (en) | 2004-01-16 | 2004-02-18 | Solexa Ltd | Multiple inexact matching |
| US7276720B2 (en) * | 2004-07-19 | 2007-10-02 | Helicos Biosciences Corporation | Apparatus and methods for analyzing samples |
| US20060110756A1 (en) * | 2004-10-25 | 2006-05-25 | Tom Tang | Large-scale parallelized DNA sequencing |
| EP1828412B2 (en) | 2004-12-13 | 2019-01-09 | Illumina Cambridge Limited | Improved method of nucleotide detection |
| JP4990886B2 (ja) | 2005-05-10 | 2012-08-01 | ソレックサ リミテッド | 改良ポリメラーゼ |
| GB0514936D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Preparation of templates for nucleic acid sequencing |
| WO2007019479A2 (en) * | 2005-08-04 | 2007-02-15 | Helicos Biosciences Corporation | Multi-channel flow cells |
| WO2007038260A2 (en) * | 2005-09-23 | 2007-04-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Systems and methods for force-fluorescence microscopy |
-
2007
- 2007-03-30 CA CA002648149A patent/CA2648149A1/en not_active Abandoned
- 2007-03-30 EP EP07754505.1A patent/EP2018622B1/en active Active
- 2007-03-30 WO PCT/US2007/007991 patent/WO2007123744A2/en active Application Filing
- 2007-03-30 EP EP22177074.6A patent/EP4105644A3/en active Pending
- 2007-03-30 EP EP18168962.1A patent/EP3373174A1/en not_active Withdrawn
- 2007-03-30 US US12/295,337 patent/US8241573B2/en active Active
- 2007-03-30 ES ES07754505.1T patent/ES2675047T3/es active Active
- 2007-03-30 SG SG201102250-6A patent/SG170802A1/en unknown
- 2007-03-30 CN CN2007800201225A patent/CN101460953B/zh active Active
- 2007-03-30 EP EP20158102.2A patent/EP3722409A1/en not_active Ceased
- 2007-03-30 JP JP2009503048A patent/JP5122555B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4105644A2 (en) | 2022-12-21 |
| CN101460953A (zh) | 2009-06-17 |
| WO2007123744A3 (en) | 2008-11-27 |
| US8241573B2 (en) | 2012-08-14 |
| EP2018622A4 (en) | 2013-03-20 |
| WO2007123744A2 (en) | 2007-11-01 |
| US20100111768A1 (en) | 2010-05-06 |
| EP3722409A1 (en) | 2020-10-14 |
| EP4105644A3 (en) | 2022-12-28 |
| EP2018622B1 (en) | 2018-04-25 |
| CA2648149A1 (en) | 2007-11-01 |
| SG170802A1 (en) | 2011-05-30 |
| CN101460953B (zh) | 2012-05-30 |
| EP3373174A1 (en) | 2018-09-12 |
| JP5122555B2 (ja) | 2013-01-16 |
| EP2018622A2 (en) | 2009-01-28 |
| JP2009532031A (ja) | 2009-09-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2675047T3 (es) | Sistemas para análisis de secuencia mediante síntesis | |
| US11542554B2 (en) | Method and apparatus for volumetric imaging | |
| US20220267842A1 (en) | High performance fluorescence imaging module for genomic testing assay | |
| CN101910399B (zh) | 用于核酸高通量测序的装置 | |
| US11686681B2 (en) | Systems and methods for multicolor imaging | |
| US20240201088A1 (en) | Optical systems for nucleic acid sequencing and methods thereof | |
| US20200393353A1 (en) | Calibrated focus sensing | |
| CN217981206U (zh) | 成像系统、检测装置和核酸分子测序系统 | |
| JP5171668B2 (ja) | 基板の位置ずれを補正する方法 | |
| WO2024118641A1 (en) | Flow cell devices and optical systems for nucleic acid sequencing |