CN117858959A - 滚环扩增期间的dna扩增缓冲液补充 - Google Patents
滚环扩增期间的dna扩增缓冲液补充 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117858959A CN117858959A CN202280048778.2A CN202280048778A CN117858959A CN 117858959 A CN117858959 A CN 117858959A CN 202280048778 A CN202280048778 A CN 202280048778A CN 117858959 A CN117858959 A CN 117858959A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fold
- buffer
- polymerase
- amplification
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 215
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 215
- 239000000872 buffer Substances 0.000 title claims abstract description 187
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 title claims description 29
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 title description 14
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 title description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 193
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 191
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 191
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 124
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 122
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 92
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 89
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 89
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 89
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 claims abstract description 83
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 claims abstract description 72
- 229920000962 poly(amidoamine) Polymers 0.000 claims description 60
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 claims description 51
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 claims description 49
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 claims description 49
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 43
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 28
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 27
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 19
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 claims description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 10
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 7
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229940096405 magnesium cation Drugs 0.000 claims description 6
- SENLDUJVTGGYIH-UHFFFAOYSA-N n-(2-aminoethyl)-3-[[3-(2-aminoethylamino)-3-oxopropyl]-[2-[bis[3-(2-aminoethylamino)-3-oxopropyl]amino]ethyl]amino]propanamide Chemical compound NCCNC(=O)CCN(CCC(=O)NCCN)CCN(CCC(=O)NCCN)CCC(=O)NCCN SENLDUJVTGGYIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 84
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 abstract 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 94
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 92
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 41
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 40
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 33
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 32
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 23
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 23
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- -1 nucleotide Triphosphates Chemical class 0.000 description 17
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 16
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 12
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 11
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 9
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 9
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 7
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 7
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 7
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 5
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 4
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000195597 Chlamydomonas reinhardtii Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 2
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 2
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000203407 Methanocaldococcus jannaschii Species 0.000 description 2
- 241000203353 Methanococcus Species 0.000 description 2
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 2
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 2
- 241000193448 Ruminiclostridium thermocellum Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000205098 Sulfolobus acidocaldarius Species 0.000 description 2
- 241000205091 Sulfolobus solfataricus Species 0.000 description 2
- 241001441722 Takifugu rubripes Species 0.000 description 2
- 241000205188 Thermococcus Species 0.000 description 2
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 description 2
- 229920000333 poly(propyleneimine) Polymers 0.000 description 2
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical group O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- OZDGMOYKSFPLSE-UHFFFAOYSA-N 2-Methylaziridine Chemical compound CC1CN1 OZDGMOYKSFPLSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007991 ACES buffer Substances 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000567139 Aeropyrum pernix Species 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000256844 Apis mellifera Species 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 108020004634 Archaeal DNA Proteins 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 235000007558 Avena sp Nutrition 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N Cu+ Chemical compound [Cu+] VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010063113 DNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000010567 DNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 241000605829 Desulfococcus Species 0.000 description 1
- 241000168726 Dictyostelium discoideum Species 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 108010001584 Human immunodeficiency virus 2 reverse transcriptase Proteins 0.000 description 1
- 101900297506 Human immunodeficiency virus type 1 group M subtype B Reverse transcriptase/ribonuclease H Proteins 0.000 description 1
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical compound [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000203375 Methanococcus voltae Species 0.000 description 1
- 241001302042 Methanothermobacter thermautotrophicus Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- DBXNUXBLKRLWFA-UHFFFAOYSA-N N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound NC(=O)CNCCS(O)(=O)=O DBXNUXBLKRLWFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 241000233870 Pneumocystis Species 0.000 description 1
- 241000233872 Pneumocystis carinii Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004642 Polyimide Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241001148023 Pyrococcus abyssi Species 0.000 description 1
- 241000522615 Pyrococcus horikoshii Species 0.000 description 1
- 108010021713 Pyrococcus sp GB-D DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000205192 Pyrococcus woesei Species 0.000 description 1
- 241000204670 Pyrodictium occultum Species 0.000 description 1
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 235000017899 Spathodea campanulata Nutrition 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 102100032938 Telomerase reverse transcriptase Human genes 0.000 description 1
- 241000204103 Thermococcus fumicolans Species 0.000 description 1
- 241001235254 Thermococcus kodakarensis Species 0.000 description 1
- 241000205180 Thermococcus litoralis Species 0.000 description 1
- 241001495444 Thermococcus sp. Species 0.000 description 1
- 241000589498 Thermus filiformis Species 0.000 description 1
- 108010085671 Thermus thermophilus DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241001655237 Thiococcus Species 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 108700002693 Viral Replicase Complex Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193445 [Clostridium] stercorarium Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229920006397 acrylic thermoplastic Polymers 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940006463 cadmium cation Drugs 0.000 description 1
- WLZRMCYVCSSEQC-UHFFFAOYSA-N cadmium(2+) Chemical compound [Cd+2] WLZRMCYVCSSEQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000008876 conformational transition Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WDRWZVWLVBXVOI-QTNFYWBSSA-L dipotassium;(2s)-2-aminopentanedioate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O WDRWZVWLVBXVOI-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229920000578 graft copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229920000587 hyperbranched polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 235000013919 monopotassium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 201000000317 pneumocystosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001748 polybutylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001721 polyimide Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- WJKYOQDIQYJXSD-UHFFFAOYSA-N propan-1-imine Chemical compound CCC=N WJKYOQDIQYJXSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 1
- ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N tert-butyl prop-2-enoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)C=C ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000012780 transparent material Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229940006486 zinc cation Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
提供的内容包括用于在容器中补充滚环扩增(RCA)反应的方法、组合物、试剂盒和系统。RCA反应可以通过使核酸模板和引物与包含DNA聚合酶和包括二价金属阳离子和聚电解质的聚合酶延伸剂的上样缓冲液接触来引发,随后补充扩增缓冲液以通过引物延伸来继续核酸扩增。扩增缓冲液在组成上不同于上样缓冲液,并且不包含任何DNA聚合酶。
Description
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2021年5月10日提交的美国临时专利申请序列号63/186,675的权益,该相关申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
背景
领域
本申请总体上涉及分子生物学,并且更具体地涉及核酸的扩增和测序。
相关技术的描述
滚环扩增(RCA)是扩增环状模板核酸以产生包含模板核酸序列组成的串联拷贝的长单链线性核酸分子的高效方法。RCA已经被用于许多应用,诸如核酸测序。
概述
本文公开的内容包括核酸的滚环扩增(RCA)的方法。在一些实施方案中,该方法包括:(a)在容器中使环状DNA模板和捕获引物与RCA混合物接触持续第一持续时间,以形成DNA模板的扩增的多联体,其中RCA混合物包含DNA聚合酶、dNTP混合物、包含二价金属阳离子和支链聚电解质物质的上样缓冲液,以及(b)在第一持续时间之后将扩增缓冲液引入容器中,以形成DNA模板的扩增的多联体,其中扩增缓冲液不包含任何DNA聚合酶,并且包含二价金属阳离子和支链聚电解质物质。
容器可以是例如流通池。DNA模板可以是例如单链DNA。在一些实施方案中,二价金属阳离子是镁阳离子。在一些实施方案中,支链聚电解质物质是树枝状聚合物物质,例如聚(酰氨基胺)(PAMAM)树枝状聚合物。PAMAM树枝状聚合物可以是例如G1 PAMAM、G2PAMAM、G3PAMAM、G4 PAMAM、G5 PAMAM或其组合。在一些实施方案中,支链聚电解质物质是聚阳离子。
在一些实施方案中,在将扩增缓冲液引入容器中之前,使环状DNA模板与第一RCA混合物接触持续约10分钟至约60分钟。在一些实施方案中,第一持续时间是约10分钟至约60分钟,例如约30分钟。
步骤(b)中DNA模板的扩增的多联体的形成可以比步骤(a)中DNA模板的扩增的多联体的形成更快,例如步骤(b)中DNA模板的扩增的多联体的形成可以比步骤(a)中DNA模板的扩增的多联体的形成快至少约25%。
在一些实施方案中,方法还包括在步骤(b)之后至少一次将一种或更多种另外的扩增缓冲液顺序引入容器中,其中所述另外的扩增缓冲液不包含任何DNA聚合酶,并且包含二价金属阳离子和支链聚电解质物质。在一些实施方案中,方法在步骤(b)之后两次、三次或更多次将另外的扩增缓冲液顺序引入容器中。在一些实施方案中,一种或更多种另外的扩增缓冲液中的至少一种或两者不包含任何酶。
在一些实施方案中,将另外的扩增缓冲液中的第一种引入容器中与步骤(b)中扩增缓冲液的引入相隔约10分钟至约60分钟,例如约30分钟。在一些实施方案中,将另外的扩增缓冲液中的每一种引入容器中与上一种另外的扩增缓冲液的引入相隔约10分钟至约60分钟,例如约30分钟。在一些实施方案中,另外的扩增缓冲液向容器中的每次引入彼此相隔约10分钟至约60分钟,例如约30分钟。
扩增缓冲液在组成上可以不同于另外的扩增缓冲液中的至少一种。在一些实施方案中,另外的扩增缓冲液中的每一种在组成上不同于任何其他另外的扩增缓冲液。在一些实施方案中,扩增缓冲液和另外的扩增缓冲液中的一种或更多种具有与上样缓冲液相同的组成,除了扩增缓冲液和另外的扩增缓冲液不包含DNA聚合酶。在一些实施方案中,与上样缓冲液相比,扩增缓冲液和另外的扩增缓冲液中的一种或更多种具有更高浓度的二价金属阳离子、更高浓度的支链聚电解质物质或两者。
在一些实施方案中,方法在约37℃进行。捕获引物可以固定在容器的表面上。在一些实施方案中,上样缓冲液、扩增缓冲液和/或另外的扩增缓冲液包含DTT、甘油、一种或更多种表面活性剂或其组合。在一些实施方案中,扩增缓冲液中的二价金属阳离子处于至少10mM的浓度。扩增缓冲液中的二价金属阳离子可以处于例如比上样缓冲液中高至少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的浓度。在一些实施方案中,上样缓冲液中的二价金属阳离子处于从约0.001mM至约10mM的浓度。在一些实施方案中,扩增缓冲液中的支链聚电解质处于至少5μM的浓度。扩增缓冲液中的支链聚电解质可以处于例如比上样缓冲液中高至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍或150倍的浓度。在一些实施方案中,上样缓冲液中的支链聚电解质处于从约0.001μM至约1μM的浓度。
在一些实施方案中,使环状DNA模板和捕获引物与RCA混合物接触包括聚合酶-核酸复合物的形成,并且在将扩增缓冲液引入容器中之后,与聚合酶-核酸复合物结合的DNA聚合酶的至少约50%被保留。在一些实施方案中,在将扩增缓冲液引入容器中之后,与聚合酶-核酸复合物结合的聚合酶的至少90%被保留。在一些实施方案中,使环状DNA模板和捕获引物与RCA混合物接触包括聚合酶-核酸复合物的形成,并且在将扩增缓冲液引入容器中之后,DNA聚合酶的至多5%从聚合酶-核酸复合物解离。在一些实施方案中,将扩增缓冲液引入容器中从容器中去除不在聚合酶-核酸复合物中的DNA聚合酶。聚合酶可以是例如Phi29聚合酶。在一些实施方案中,扩增缓冲液包含dNTP。
本文还公开的内容包括用于滚环扩增的试剂盒。在一些实施方案中,试剂盒包括包含二价金属阳离子、支链聚电解质物质和DNA聚合酶的第一缓冲液,以及不包含任何DNA聚合酶并且包含二价金属阳离子和支链聚电解质物质的第二缓冲液。
二价金属阳离子可以是镁阳离子。在一些实施方案中,支链聚电解质物质是树枝状聚合物物质。第二缓冲液中的二价金属阳离子可以处于例如比第一缓冲液中高至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的浓度。第二缓冲液中的支链聚电解质可以处于例如比第一缓冲液中高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍或150倍的浓度。
在一些实施方案中,试剂盒还包括一种或更多种另外的缓冲液,其中所述另外的缓冲液中的每一种不包含任何DNA聚合酶,并且包含浓度不同于第二缓冲液和每一种其他另外的缓冲液的二价金属阳离子和支链聚电解质物质。
附图简述
图1A示出了产生与固定的核酸引物(例如捕获引物)杂交的环状模板核酸的非限制性示意图。
图1B示出了经由滚环扩增沿着环状模板核酸延伸固定的捕获引物以产生扩增的多联体的非限制性示意图。
图2是在滚环扩增期间缓冲液补充的非限制性示意图。
图3是示出针对具有相同Mg2+浓度(10mM)和不同PAMAM浓度的引发混合物的RCA反应测量的背景斑点计数(下图)、簇强度(中图)和所有斑点计数(上图)的示例性图。
图4是示出针对在具有不同组成的引发混合物和补充混合物中进行的RCA反应测量的簇强度的示例性图。
图5是示出针对在具有不同组成的引发混合物和补充混合物中进行的RCA反应测量的簇强度(下图)和斑点计数(上图)的示例性图。
图6是示出3小时滚环扩增反应中每个簇的探针数目的示例性图。
图7是示出8小时滚环扩增反应中每个簇的探针数目的示例性图。图6和图7展示了添加补充缓冲液后每个斑点的单一聚合酶扩增的持续活性。
详述
在以下详述中,参考了构成其一部分的附图。在附图中,相似的符号通常标识相似的组分,除非上下文另外指定。详述、附图和权利要求中描述的说明性实施方案不意图是限制性的。在不偏离本文提出的主题的精神或范围的情况下,可以利用其他实施方案,并且可以做出其他改变。将容易地理解的是,如本文一般描述的和附图中图示的,本公开内容的方面可以以各种不同的配置被布置、替代、组合、分离和设计,其全部在本文中被明确地预期并且构成本文的公开内容的一部分。
所有专利、公布的专利申请、其他出版物以及来自GenBank和本文提及的其他数据库的序列关于相关技术通过引用以其整体并入。
定义
除非另外定义,否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。参见,例如,Singleton等人,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology,第2版,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994);Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor,NY 1989)。出于本公开内容的目的,以下术语在下文定义。
如本文使用的,术语“固定的”在提及分子使用时,指的是分子直接或间接、共价或非共价附接至表面,诸如固体支持物的表面。在一些配置中,共价附接可以是优选的,但是通常所有需要的仅是分子(例如,核酸)在期望表面保留的条件下保持固定或附接至表面。
如本文使用的,术语“核苷酸”指的是天然核苷酸或其类似物。核苷酸的实例包括但不限于核苷酸三磷酸(NTP)诸如核糖核苷酸三磷酸(rNTP)、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)、其非天然类似物诸如二脱氧核糖核苷酸三磷酸(ddNTP)和可逆终止的核苷酸三磷酸(rtNTP)。
如本文使用的,术语“引物”指的是具有在模板序列处或靠近模板序列处与核酸结合的序列的核酸。通常,引物以允许例如经由引物的聚合酶延伸复制模板的构型结合。引物可以是核酸分子的第一部分,该第一部分与所述核酸分子的第二部分结合,第一部分是引物序列并且第二部分是引物结合序列(例如,发夹引物)。在一些实施方案中,引物可以是与具有模板序列的第二核酸分子结合的第一核酸分子。引物可以由DNA、RNA或其类似物组成,或包括DNA、RNA或其类似物。例如,引物可以具有可延伸的3’末端或被阻断引物延伸的3’末端。
如本文使用的,术语“引发的模板核酸”指的是具有双链区使得其中一条链起引物作用而另一条链起模板作用的核酸。
如本文使用的,术语“聚合酶-核酸复合物”指的是聚合酶(例如,DNA聚合酶)和核酸(例如,模板核酸)之间的分子间缔合。聚合酶-核酸复合物还可以包含例如核苷酸(例如,经由Watson-Crick氢键合与模板核酸相互作用的核苷酸)。在一些实施方案中,包含聚合酶、核酸和核苷酸的聚合酶-核酸复合物也被称为三元复合物。
如本文使用的,术语“聚合酶”指的是合成核酸的酶,包括但不限于DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、引物酶和转移酶。通常,聚合酶具有一个或更多个活性位点,在该一个或更多个活性位点处可以发生核苷酸结合和/或核苷酸聚合的催化。聚合酶可以催化核苷酸聚合到双链核酸分子的第一链的3’末端。例如,聚合酶催化下一个正确的核苷酸经由磷酸二酯键添加至双链核酸分子的第一链的3’氧部分,从而将核苷酸共价掺入双链核酸分子的第一链。在一些实施方案中,聚合酶不需要能够在本文阐述的方法中使用的一种或更多种条件下进行核苷酸掺入。例如,突变聚合酶可以能够形成三元复合物,但不能催化核苷酸掺入。
如本文使用的,“容器”是用于将一种化学过程(例如,结合事件;掺入反应;等)与另一种化学过程分开的容器,或者用于提供化学过程可以发生在其中的空间的容器。可用于所公开的技术的容器的实例包括但不限于流通池、多孔板的孔;显微镜载玻片;管(例如,毛细管);液滴、囊泡、试管、托盘、离心管、阵列中的特征、管道(tubing)和基底中的通道。
如本文使用的,术语“环状”,当用于提及核酸链时,意指该链不具有末端(即,该链缺少3’末端和5’末端)。因此,环状链中每个核苷酸单体的3’氧和5’磷酸部分共价附接到链中相邻的核苷酸单体。环状DNA链可以用作经由滚环扩增(RCA)产生多联体扩增子的模板,其中多联体扩增子的每个序列单元是环状核酸链的反向互补物。环状核酸可以是双链的或单链的。双链核酸中的一条链或两条链可以缺少3’末端和5’末端。双链核酸中的一条链可以具有缺口(相对于另一条链不存在至少一个核苷酸单体)或切口(两个核苷酸单体之间不存在磷酸二酯键),只要另一条链是环状的。在一些实施方案中,环状核酸是双链DNA。
如本文使用的,术语“多联体”,当用于提及核酸分子时,指的是包含串联连接的共同序列的多个拷贝的连续核酸分子。类似地,术语“多联体”,当用于提及核苷酸序列时,意指包含串联的共同序列的多个拷贝的连续核苷酸序列。序列的每个拷贝可以被称为多联体的“序列单元”。序列单元可以具有至少10个碱基、50个碱基、100个碱基、250个碱基、500个碱基或更多碱基的长度。多联体可以包含至少2个、5个、10个、50个、100个或更多个序列单元。序列单元可以包含具有多种功能中的任一种的子区域,诸如引物结合区、靶序列区、标签区、独特分子标识符(UMI)等。
如本文使用的,术语“标记”指的是提供可检测特征的分子或其部分。可检测的特征可以是,例如,光学信号诸如辐射的吸光度、荧光发射、发光发射、荧光寿命、发光寿命、荧光偏振、发光偏振等;瑞利(Rayleigh)散射或米氏(Mie)散射;对配体或受体的结合亲和力;磁性质;电性质;电荷;质量;和放射性等。示例性标记包括但不限于荧光团、发光团、生色团、纳米颗粒(例如,金、银、碳纳米管)、重原子、放射性同位素、质量标记、电荷标记、自旋标记、受体、配体等。
本文提供的内容包括用于针对核酸进行滚环扩增(RCA)反应的方法、组合物、试剂盒和系统。例如,方法、组合物、试剂盒和系统可以实现更高效的RCA反应。方法可以包括,例如(a)在容器中使环状DNA模板和捕获引物与RCA混合物接触持续一段持续时间,以形成DNA模板的扩增的多联体,其中RCA混合物包含DNA聚合酶、dNTP混合物、包含二价金属阳离子和支链聚电解质物质的上样缓冲液,以及(b)在第一持续时间之后将一种或更多种扩增缓冲液引入容器中,以形成DNA模板的扩增的多联体,其中扩增缓冲液包含二价金属阳离子和支链聚电解质物质,并且不包含任何DNA聚合酶(例如,上样缓冲液中的DNA聚合酶),或者包含浓度低于上样缓冲液中的浓度的DNA聚合酶。
滚环扩增(RCA)是用于在固体支持物上产生多联体核酸的有用方法(参见例如图1A-图1B)。在RCA期间,DNA聚合酶耗尽DNA的扩增所需要的试剂,特别是dNTP。聚合酶的持续性和保真度以及其形成确定的簇的能力取决于dNTP浓度以及其他因素诸如镁二价阳离子浓度,并且也可能受到另外的试剂诸如PAMAM的存在的影响。随着扩增反应的继续,因为测序流通池中可用的试剂的低体积,这些因素的丰度由于它们的相对有限的局部可用性而受到限制。由于RCA反应中高初始镁或dNTP浓度的拮抗作用,简单地增加浓度以克服这种有限的丰度是抑制性的。
本文公开的内容包括用于补充RCA反应所需要的试剂,使得RCA反应可以持续长时间段,同时聚合酶活性损失最小或减少,并且聚合酶成本最小的方法。在一些实施方案中,这种补充方法可以冲洗出对酶有拮抗作用的试剂,包括酶接种抑制剂;酶储存缓冲液中的PCR抑制剂,诸如焦磷酸盐和过量的DTT、甘油和表面活性剂;或其任何组合。
在该方法中,聚合酶上样到DNA上可以在与补充混合物不同的试剂混合物中进行(参见例如图2)。原始溶液(本文也被称为上样缓冲液)可以包含较低浓度的镁和PAMAM(与用于补充的扩增缓冲液相比),以促进附接至流通池的表面的酶:DNA-环复合物的高效上样(例如,图2,左图)。在其中RCA开始的上样缓冲液中初始孵育之后,引入包含较高浓度的聚合酶延伸试剂诸如镁和PAMAM且不含DNA聚合酶或任何酶的扩增缓冲液的冲洗液(本文也被称为补充溶液)。这种向流通池补充修改的溶液不去除已经与DNA环结合的DNA聚合酶,但可以去除过量的未结合的DNA聚合酶。在此期间RCA反应不停止,产生连续的扩增反应,产生具有动态和可变二级结构的核酸簇(例如,图2中示出的DNA簇,右图)。每个斑点的单一聚合酶可以发挥作用持续长时间段,例如至少8小时。此外,可能通过延伸聚合酶的活性耗尽的试剂被补充,以便促进正在进行的滚环延伸。在一些实施方案中,仅使用聚合酶上样混合物的RCA反应本身是有效的,然而,当与补充溶液中的扩增相比时,DNA的延伸速率较低,或者随着延伸试剂耗尽,延伸速率随时间降低。如果将补充溶液作为上样缓冲液处理可能是不希望的,这可能显著减少所形成的酶:DNA-环复合物的数目。不受任何理论的束缚,据信在补充的情况下,RCA反应可以比没有补充的情况持续长得多的时间,并且给定相同时间量,经补充的反应可以产生显著更多的扩增产物,包括DNA环的拷贝。此外,可以以有利于聚合酶延伸但可能抑制聚合酶与引发的模板的初始结合的浓度在补充溶液中添加试剂。
与目前可用的RCA方法相比,本文描述的RCA方法可以用于降低核酸扩增的成本。例如,聚合酶是反应混合物中最昂贵的组分,因此在RCA反应开始时上样一次酶并且补充无酶混合物在一些情况下可以显著降低成本。
本文公开的RCA方法可以用于多种测序平台,包括但不限于合成测序、结合测序、基于pH的测序、通过聚合酶监测测序、通过杂交测序以及大规模平行测序或下一代测序的其他方法。在一些实施方案中,如美国专利第10,077,470号中描述的进行测序,该美国专利通过引用以其整体并入本文。用于进行测序的合适的表面包括但不限于平面基底、水凝胶、纳米孔阵列、微粒或纳米颗粒。在一些实施方案中,本文公开的用于进行RCA的方法、组合物和系统用于合成测序(SBS)方法、组合物和系统。
二价金属阳离子
如本文使用的,术语“二价金属阳离子”指的是具有2的化合价的催化金属阳离子。二价金属阳离子是核酸的3’-OH(例如,捕获引物)和进入的核苷酸的磷酸之间形成磷酸二酯键所需要的。
二价金属阳离子可以在滚环扩增反应的不同阶段包括但不限于上样阶段和扩增阶段以不同浓度存在。在一些实施方案中,上样缓冲液中的二价金属阳离子可以以促进聚合酶(例如,DNA聚合酶)高效上样到模板核酸上形成聚合酶-模板核酸复合物从而引发扩增所必需的低浓度存在。在一些实施方案中,扩增缓冲液中的二价金属阳离子可以以如本文描述的有利于引物延伸和核酸扩增的较高的浓度存在。二价金属阳离子的浓度也可以取决于二价金属阳离子、聚合酶和/或模板核酸的选择而变化。二价金属阳离子的选择可以基于扩增反应中的聚合酶和/或核苷酸。二价金属阳离子可以是例如镁阳离子(Mg2+)、锰阳离子(Mn2+)、铜阳离子(Cu2+)、镉阳离子(Cd2+)和锌阳离子(Zn2+)。在一些实施方案中,二价金属阳离子是Mg2+。在本文描述的方法、组合物和系统中可以使用多于一种扩增缓冲液。在一些实施方案中,二价金属阳离子的类型和/或二价金属阳离子的浓度在一些(例如,两种、三种、四种、五种或六种)或所有扩增缓冲液中可以不同。
支链聚电解质物质
如本文使用的,术语“聚电解质物质”或“聚电解质”指的是当溶解在极性溶剂诸如水中时,具有许多共价连接至其的带电基团的聚合物。聚电解质可以是聚阴离子、聚阳离子和聚盐。支链聚电解质指的是具有连接至一级主链的次级聚合物链的聚电解质,得到多种聚合物结构,诸如球形、H形、绒球形(pom-pom)和梳形的聚合物。
支链聚电解质包括通常被称为“树枝状聚合物”的物质,树枝状聚合物是具有纳米尺度尺寸的重复支化的大致球形的三维分子。因此,本文使用的术语“树枝状聚合物”指的是具有三个基本结构组分的重复支化的分子,所述三个基本结构组分即树枝状聚合物核心、重复分支胞体单元(repetitive branch cell units)和末端官能团。树枝状聚合物核心可以是呈现主链和至少两个锚定原子的化学部分,每个锚定原子定义了与分支胞体单元的头部附接原子的键合位置。在树枝状聚合物核心中,树枝状聚合物核心的主链可以是任何稳定的化学部分,该化学部分具有为分支胞体单元的附接提供锚定位置的能力。在一些实施方案中,核心主链结构可以是芳香族、杂芳香族环、脂肪族或杂脂肪族环或链中的一种。在一些实施方案中,树枝状聚合物核心的主链可以是一种单一原子,包括但不限于C、N、O、S、Si或P。“分支胞体单元”是呈现一个头部附接原子和至少两个尾部附接原子的化学结构。头部附接原子定义了与树枝状聚合物核心的锚定原子或另一个分支胞体单元的尾部附接原子的键合位置。尾部附接原子定义了与另一个分支胞体单元的头部附接原子或末端官能团的键合位置,附接可能直接或间接地进行。树枝状聚合物内分支胞体单元的世代定义了树枝状聚合物的壳,如技术人员将理解的(参见Jean M.J.Frechet和Donald A.Tomalia的“Dendrimers and other Dendritic polymers”2001)。一个世代的分支胞体单元通常定义树枝状聚合物内的内部空间,本文也指示为壳的内部,如技术人员将理解的。树枝状聚合物的“末端官能团”是附接至分支胞体单元的末端的树枝状聚合物最外面的部分上呈现的官能团。附接末端官能团的分支胞体单元通常提供树枝状聚合物的外壳或外围。树枝状聚合物可以包括球状树枝状聚合物,dendrons、超支化的聚合物,树枝状接枝聚合物(dendrigraft polymers),结构树枝状聚合物(tecto-dendrimers),核-壳树枝状聚合物和本领域技术人员可鉴定的其他类型的树枝状聚合物。
树枝状聚合物可以按世代号分类。这种分类的通用符号是GX,其中X是指示世代号的数字。例如,零代树枝状聚合物被注释为G0,第一代树枝状聚合物被注释为G1,等等。分支胞体单元的总数(或分支数目)作为世代号的函数以指数方式增长。在一些实施方案中,树枝状聚合物的物质作为第0代(G0)直至第10代(G10)可得,每一代具有上一代两倍的分支数目。例如,G0 PAMAM具有4个分支,G1 PAMAM具有8个分支,等等。在一些实施方案中,本文使用的树枝状聚合物是G0树枝状聚合物、G1树枝状聚合物、G2树枝状聚合物、G3树枝状聚合物、G4树枝状聚合物或G5树枝状聚合物,诸如G0 PAMAM、G1 PAMAM、G2 PAMAM、G3 PAMAM、G4PAMAM或G5 PAMAM。
树枝状聚合物物质可以包含具有一个或更多个官能团的受控末端表面化学,所述官能团包括但不限于胺、羧基和羟基基团。在不同的末端表面基团的情况下,树枝状聚合物可以带正电荷、带负电荷或呈中性。
本文描述的树枝状聚合物可以通过化学反应来修饰,化学反应修饰它们的官能团,使得它们具有特定的结合性质。例如,这些树枝状聚合物中氮或氧配体的高密度,以及将多种官能团附接至它们的可能性,使得这些树枝状聚合物(例如,PAMAM、PPI和PEI)作为金属离子(诸如RCA扩增反应中使用的金属离子)的高容量螯合剂具有吸引力。
在一些实施方案中,本文使用的树枝状聚合物包含带正电荷的末端表面基团。例如,包含质子化结构的支链聚胺可以与带负电荷的DNA主链相互作用并且形成复合物。应理解,在本文描述的实施方案中,衔接子元件可以与支链聚胺一起使用,用于替代目的或提供树枝状聚合物物质与核酸的改善的结合特性。
可以用于本文公开的方法、组合物和系统中的树枝状聚合物的种类包括但不限于聚(酰氨基胺)(PAMAM)、聚(丙亚胺)(poly(propylenimine),PPI)、聚乙烯亚胺(PEI)。在一些实施方案中,支链聚电解质是PAMAM,例如,具有16个具有胺(NH2)末端表面化学的分支的G2 PAMAM树枝状聚合物分子或者具有32个具有胺(NH2)末端表面化学的分支的G3PAMAM树枝状聚合物分子。支链聚电解质的非限制性实例还包括G4(64个具有胺末端基团的分支)和G5(128个具有胺末端基团的分支)PAMAM树枝状聚合物物质。
类似于二价金属阳离子,支链聚电解质可以在滚环扩增反应的不同阶段以不同的浓度存在。在一些实施方案中,上样缓冲液中的支链聚电解质可以以促进聚合酶高效上样到模板核酸上以形成初始酶-模板核酸复合物所必需的低浓度存在。扩增缓冲液中的支链聚电解质可以以促进由引物延伸反应形成的核酸簇的形成和稳定的较高的浓度存在,引物延伸反应如下文详细描述。在本文描述的方法、组合物和系统中可以使用多于一种扩增缓冲液。在一些实施方案中,支链聚电解质的类型和/或支链聚电解质的浓度在一些(例如,两种、三种、四种、五种或六种)或所有扩增缓冲液中可以不同。
聚合酶
多种聚合酶(例如,DNA聚合酶)中的任何一种都可以用于本文阐述的方法或组合物中,例如,以形成聚合酶-核酸复合物或进行引物延伸。聚合酶的实例包括天然存在的聚合酶及其修饰的变体,包括但不限于突变体、重组体、融合体、遗传修饰、化学修饰、合成物和类似物。天然存在的聚合酶及其修饰的变体不限于具有催化聚合反应能力的聚合酶。在一些实施方案中,天然存在的和/或其修饰的变体具有在至少一种在稳定化的三元复合物的形成或检查期间不使用的条件下催化聚合反应的能力。在一些实施方案中,参与聚合酶-核酸复合物的天然存在的和/或修饰的变体具有修饰的性质,例如,增强的与核酸的结合亲和力、降低的与核酸的结合亲和力、增强的与核苷酸的结合亲和力、降低的与核苷酸的结合亲和力、增强的对下一个正确核苷酸的特异性、降低的对下一个正确核苷酸的特异性、降低的催化速率、无催化活性等。突变体聚合酶包括例如其中一个或更多个氨基酸被其他氨基酸替换或者一个或更多个氨基酸的插入或缺失的聚合酶。可以用于形成稳定化的三元复合物的示例性聚合酶突变体包括,例如,在以下中阐述的那些:2020年3月19日公布的美国专利申请公布第2020/0087637A1号和美国专利第10,584,379号和第10,597,643号,它们的每一个通过引用并入本文。在一些实施方案中,聚合酶单独地或与链置换因子诸如解旋酶组合具有链置换活性。
本文使用的聚合酶可以附接外源性标记部分(例如外源性荧光团),该外源性标记部分可以用于检测聚合酶。在一些实施方案中,标记部分可以在使用蛋白质分离技术至少部分地纯化聚合酶之后附接。例如,可以使用聚合酶的游离巯基或游离胺部分将外源性标记部分共价连接至聚合酶。这可以涉及通过半胱氨酸残基的侧链或通过N-末端的游离氨基部分与聚合酶的共价连接。外源性标记部分也可以经由蛋白质融合附接至聚合酶。可以经由蛋白质融合附接的示例性标记部分包括绿色荧光蛋白(GFP)、藻胆蛋白(例如,藻蓝蛋白和藻红蛋白)或GFP或藻胆蛋白的波长移位变体。在一些实施方案中,聚合酶不附接至外源性标记。
聚合酶可以从多种来源获得。聚合酶可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶或其他类型的聚合酶诸如逆转录酶。
示例性DNA聚合酶包括但不限于细菌DNA聚合酶、真核生物DNA聚合酶、古菌DNA聚合酶、病毒DNA聚合酶和噬菌体DNA聚合酶。细菌DNA聚合酶包括但不限于大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、II和III、IV和V,大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段,粪堆梭菌(Clostridiumstercorarium)(Cst)DNA聚合酶,热纤梭菌(Clostridium thermocellum)(Cth)DNA聚合酶和硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)(Sso)DNA聚合酶。真核生物DNA聚合酶包括但不限于DNA聚合酶α、β、γ、δ、€、η、ζ、λ、σ、μ和k,以及Revl聚合酶(末端脱氧胞苷转移酶)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。病毒DNA聚合酶包括但不限于T4 DNA聚合酶、phi-29DNA聚合酶、GA-l、phi-29样DNA聚合酶、PZA DNA聚合酶、phi-15DNA聚合酶、Cpl DNA聚合酶、Cp7DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶和T4聚合酶。DNA聚合酶的另外的实例包括但不限于热稳定DNA聚合酶和/或嗜热DNA聚合酶,诸如水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶、丝状栖热菌(Thermus filiformis)(Tfi)DNA聚合酶、兹氏热球菌(Thermococcus zilligi)(Tzi)DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶、黄栖热菌(Thermusflavusu)(Tfl)DNA聚合酶、沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)(Pwo)DNA聚合酶、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNA聚合酶和Turbo Pfu DNA聚合酶、滨海嗜热球菌(Thermococcus litoralis)(Tli)DNA聚合酶、火球菌属物种(Pyrococcus sp.)GB-D聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(Tma)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)(Bst)DNA聚合酶、Pyrococcus Kodakaraensis)(KOD)DNA聚合酶、PfxDNA聚合酶、热球菌属物种(Thermococcus sp.)JDF-3(JDF-3)DNA聚合酶、高氏热球菌(Thermococcus gorgonarius)(Tgo)DNA聚合酶、嗜酸热球菌(Thermococcusacidophilium)DNA聚合酶;嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)DNA聚合酶;热球菌属物种9°(Thermococcus sp.9°)N-7DNA聚合酶;隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)DNA聚合酶;沃氏甲烷球菌(Methanococcus voltae)DNA聚合酶;热自养甲烷杆菌(Methanococcus thermoautotrophicum)DNA聚合酶;詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)DNA聚合酶;硫还原球菌属(Desulfurococcus)菌株TOK DNA聚合酶(D.TokPol);深海火球菌(Pyrococcus abyssi)DNA聚合酶;堀越火球菌(Pyrococcus horikoshii)DNA聚合酶;海岛火球菌(Pyrococcus islandicum)DNA聚合酶;烟生热球菌(Thermococcusfumicolans)DNA聚合酶;敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)DNA聚合酶;和异二聚体DNA聚合酶DP1/DP2。工程化和修饰的聚合酶也可以用于本文公开的方法、组合物、试剂盒和系统。例如,可以使用极端嗜热的海洋古菌热球菌属物种9°N(例如,来自New England BioLabsInc.;Ipswich,MA的Therminator DNA聚合酶)的修饰变体。
示例性RNA聚合酶包括,但不限于,病毒RNA聚合酶诸如T7 RNA聚合酶、T3聚合酶、SP6聚合酶和Kll聚合酶;真核生物RNA聚合酶,诸如RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、RNA聚合酶IV和RNA聚合酶V;以及古菌RNA聚合酶。
示例性逆转录酶包括但不限于来自人类免疫缺陷病毒1型(PDB 1HMV)的HIV-1逆转录酶、来自人类免疫缺陷病毒2型的HIV-2逆转录酶、来自Moloney鼠白血病病毒的M-MLV逆转录酶、来自禽成髓细胞血症病毒的AMV逆转录酶和维持真核生物染色体端粒的端粒酶逆转录酶。
模板核酸
本文使用的模板核酸或核酸模板包括靶序列和与本文使用的捕获引物互补的引物结合区,使得在模板核酸的引物结合区和捕获引物之间互补结合时,可以使用模板核酸作为模板来延伸捕获引物。
本文使用的模板核酸可以是DNA,包括但不限于基因组DNA、合成DNA、扩增的DNA、互补DNA(cDNA)等。本文使用的模板核酸也可以是RNA,包括但不限于mRNA、核糖体RNA、tRNA等。模板核酸可以是被标记的或未被标记的(例如,缺乏外源性标记)。
本文使用的模板核酸可以包括包含对核苷酸类似物的磷酸部分、糖部分和/或含氮碱基的修饰的核酸类似物。在一些实施方案中,核酸类似物可以包括可逆地阻止随后在引物的3’-末端的核苷酸掺入的终止子。在一些实施方案中,诸如在结合测序或合成测序中,可逆终止子部分可以在被称为“去封闭”的过程中被修饰或从引物中去除,允许随后的核苷酸掺入。
在一些实施方案中,模板核酸包含基因组片段。本文公开的用于RCA反应的模板核酸可以是单链核酸或双链核酸。在一些实施方案中,模板核酸是单链DNA环。
模板核酸可以是环状核酸模板(例如,dsDNA或ssDNA)。在一些实施方案中,模板核酸可以是线性核酸,该线性核酸可以被环化以形成环状核酸模板。可以使用多种方法由用于RCA的线性核酸模板制备环状模板核酸。例如,线性核酸模板的环化可以通过酶促反应产生,例如通过与连接酶(例如,DNA连接酶)孵育。在一些实施方案中,线性核酸模板的末端可以与核酸序列杂交,使得末端靠近(参见例如,图1A)。然后与连接酶一起孵育可以导致杂交的线性核酸模板的环化,以产生环状核酸模板。环状核酸也可以通过化学合成合适的线性寡核苷酸,随后将合成的寡核苷酸环化来产生。
可以选择模板核酸的长度以适合本文阐述的方法的特定应用。例如,长度可以是约、至少、至少约、至多、至多约50个、100个、250个、500个、750个、1000个、1×104个、1×105个或更多个核苷酸或碱基对。
本文使用的靶核酸可以源自生物来源、合成来源或扩增产物。可以从其衍生模板核酸的示例性生物体包括例如,哺乳动物诸如啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、有蹄类动物、马、绵羊、猪、山羊、牛、猫、狗、灵长类动物、人类或非人类灵长类动物;植物诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米、高粱、燕麦、小麦、稻、油菜或大豆;藻类诸如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii);线虫诸如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans);昆虫诸如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、蚊子、果蝇、蜜蜂或蜘蛛;鱼诸如斑马鱼;爬行动物;两栖动物诸如蛙类动物或非洲爪蟾(Xenopus laevis);盘基网柄菌(dictyosteliumdiscoideum);真菌诸如卡氏肺孢子虫(pneumocystis carinii)、红鳍东方鲀(Takifugurubripes)、酵母、酿酒酵母(Saccharamoyces cerevisiae)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe);或恶性疟原虫(plasmodium falciparum)。核酸可以源自原核生物诸如细菌、大肠杆菌(Escherichia coli)、葡萄球菌(staphylococci)或肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae);古菌;病毒诸如丙型肝炎病毒、流感病毒、冠状病毒或人类免疫缺陷病毒;或类病毒。核酸可以源自以上生物体的同质培养物或群体,或可选择地源自例如一个群落或生态系统中若干种不同生物体的集合。可以使用本领域已知的方法分离核酸,包括例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,ColdSpring Harbor Laboratory,New York(2001)或Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1998)中描述的那些,这些文献中的每一篇通过引用并入本文。
滚环扩增
本文提供的内容包括用于核酸的有效滚环扩增的方法、试剂盒、系统和组合物。通常,RCA方法包括聚合酶延伸退火到环状模板的引物,使得聚合酶绕环状模板多于一圈产生包含多个串联重复的多联体单链核酸,每个重复与环状模板互补。
图1A-图1B提供了针对核酸进行滚环扩增的非限制性示意图。如图1A中示出的,核酸引物(通过空心矩形和划线矩形指示)经由接头(通过灰线指示)附接至固体支持物(通过有斑点的矩形指示)上。引物可以用于经由与引物互补的引物结合位点捕获靶核酸。在图1A中示出的一种配置中,固定的引物可以与存在于靶序列的相对末端的引物结合位点的部分杂交(分别地,靶序列通过虚线指示,并且侧翼引物结合位点区域通过空心矩形和划线矩形指示)。因此,固定的引物起到将靶核酸的两个末端聚集在一起的夹板的作用。两个末端可以在与夹板核酸杂交的同时连接以形成靶核酸的环状形式。在图1A中示出的另一种配置中,在与固体支持物上的固定的引物杂交之前,将靶核酸环化。因此,靶序列可以是线性核酸或环状核酸。
图1B提供了经由与固定的引物杂交的引发的环状模板的滚环扩增产生的单链多联体的非限制性示意图。引物以3’末端可用于聚合酶延伸的方式固定(例如,引物可以在其5’末端处或靠近其5’末端处附接)。第一子步骤的产物示出为已经进展到产生了环状模板的两个拷贝(两个序列单元),并且环状模板与正在复制的第三拷贝(第三序列单元)的一部分杂交的程度。每个序列单元包含与靶序列互补的区域(通过黑色实线指示)和与引物互补的区域(通过空心矩形和划线矩形指示)。第二子步骤的产物已经进展到产生了环状模板的近六个拷贝的程度。图1B示出了在第三子步骤中环状模板不存在(例如,已经被去除)之后RCA反应的最终产物。为了说明目的,示出了最终产物的两个区域:描绘了序列单元的区域(指示扩增的链的多联体一级结构),和没有指定序列单元的数目和构象的区域(指示整个簇的动态和可变二级结构)。
RCA反应可以通过使聚合酶变性来终止,例如通过在60℃、65℃、70℃、75℃、80℃或更高温度加热样品。RCA反应也可以通过去除RCA的一种或更多种组分来终止,所述组分诸如聚合酶、dNTP或其任何组合。RCA的组分可以通过例如用洗涤试剂洗涤来去除。
上样
本文公开的内容包括补充用于RCA反应的试剂使得核酸扩增可以以最小聚合酶活性损失以加速的速率发生的方法。本文描述的方法可以包括上样步骤,在该上样步骤期间,在容器中核酸模板(例如DNA模板)和捕获引物与RCA混合物接触持续足以允许聚合酶上样到核酸模板上以形成聚合酶-核酸复合物的持续时间,从而引发RCA扩增。上样步骤中使用的RCA混合物可以包含聚合酶(例如,DNA聚合酶)、脱氧核糖核苷三磷酸(例如,dNTP混合物)和包含二价金属阳离子和支链聚电解质物质的上样缓冲液。
在一些实施方案中,方法包括提供核酸模板、捕获引物和RCA混合物。如本文使用的术语“提供”指的是将一种或更多种组分准备或递送至容器。模板核酸和捕获引物可以以多种方式中的任一种提供。在一些实施方案中,模板核酸和捕获引物可以以溶液提供,并且然后通过任何合适的手段递送至容器。在一些实施方案中,捕获引物可以在与模板核酸和RCA混合物接触之前附接至固体支持物,例如使用本领域已知的共价或非共价附接化学(例如,在图1A-图1B中)。如本文使用的,术语“固体支持物”指的是大体上不溶于其接触的液体的刚性基底。基底可以是无孔的或多孔的。基底可以任选地能够吸收液体(例如,由于孔隙率)但通常将是足够刚性的,使得基底在吸收液体时大体上不会膨胀,并且在通过干燥去除液体时大体上不会收缩。无孔固体支持物通常是液体或气体不可渗透的。示例性的固体支持物包括但不限于玻璃和改性或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯以及苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonTM、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂、Zeonor、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性的硅)、碳、金属、无机玻璃、光纤束和聚合物。多种液体中的任一种,包括但不限于本文阐述的液体,都可以与固体支持物接触。
在一些实施方案中,模板核酸与捕获引物和RCA混合物接触的容器是流通池。如本文使用的,“流通池”是包括一个或更多个通道的反应室,该一个或更多个通道以预定方式引导流体以进行期望的反应。流通池可以耦接至检测器,使得可以观察到发生在反应室中的反应。例如,流通池可以包含例如拴系至固体支持物的引发的模板核酸分子,向其迭代地施加核苷酸和辅助试剂并且洗掉。流通池可以包括透明材料,该透明材料允许在期望的反应发生之后对样品成像。例如,流通池可以包括包含小流体通道的载玻片,聚合酶、dNTP和缓冲液可以泵送通过该小流体通道。通道内部的玻璃用一个或更多个待测序的引发的模板核酸分子装饰。可以放置外部成像系统以检测玻璃的表面上的分子。流通池中的试剂交换是通过泵送、抽取或以其他方式使不同的液体试剂“流动”通过流通池来完成的。示例性流通池、它们的制造方法和它们的使用方法在以下中描述:2010年5月6日公布的美国专利申请公布第2010/0111768A1号,或2012年10月25日公布的美国专利申请公布第2012/0270305A1号;或2005年7月21日公布的WO 05/065814,其中每一篇通过引用并入本文。
因此,在一些实施方案中,接触步骤可以通过使用流通池来促进。典型的流通池包括微流体阀,该微流体阀允许通过入口递送液体试剂(例如,RCA混合物的组分),并且通过从出口排出来去除液体试剂。使液体试剂流动通过流通池可以允许试剂混合和交换。例如,使核酸模板和捕获引物与RCA混合物接触可以包括使包含聚合酶、dNTP混合物和上样缓冲液的RCA混合物流动通过流通池。
模板核酸、捕获引物和RCA混合物可以同时接触。可选择地,模板核酸、捕获引物和RCA混合物可以顺序接触。例如,模板核酸可以与捕获引物接触以形成引发的模板核酸(例如,在图1A中),然后使其与包含聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)或其修饰的类似物和上样缓冲液的RCA混合物接触。在一些实施方案中,模板核酸可以与RCA混合物接触,并且然后与捕获引物接触。
在不同的实施方案中,RCA程序的上样步骤的温度和孵育时间的长度可以变化,例如,取决于所使用的聚合酶、反应条件等。在一些实施方案中,在上样步骤中使模板核酸、捕获引物与RCA混合物接触的持续时间可以是约10分钟至约60分钟。例如,持续时间可以是以下、约以下、至多以下、至多约以下、至少以下、至少约以下:10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中,接触持续时间可以是约30分钟。RCA混合物可以在有利于聚合酶活性的任何温度与捕获引物和模板核酸一起孵育。在一些实施方案中,使模板核酸和捕获引物与RCA混合物接触是在大体上等温的反应温度进行的,例如,变化不超过给定温度以上或以下约2℃-3℃的温度。反应温度可以在20℃和70℃之间,例如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃,或者这些值中的任两个之间的数字或范围。在一些实施方案中,反应温度在20℃和60℃之间,例如在20℃和50℃之间。例如,反应温度可以是30℃,或者是约30℃。在一些实施方案中,反应温度是37℃,或者是约37℃。
使模板核酸和捕获引物与RCA混合物在一定条件下接触持续一段持续时间可以形成模板核酸的扩增的多联体,诸如图1B中示出的多联体。在一些实施方案中,使模板核酸和捕获引物与RCA混合物接触可以包括将模板核酸和捕获引物杂交(例如,通过模板核酸中对应的引物结合区)以形成引发的模板核酸,并且沿着模板核酸延伸捕获引物。
模板核酸的扩增的多联体可以包含模板核酸的两个或更多个拷贝。例如,在上样步骤之后形成的扩增的多联体可以包含模板核酸的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个拷贝。模板核酸的扩增的多联体可以作为使用模板核酸作为模板的引物延伸反应的产物产生,诸如在图1B中图示的RCA反应。
在RCA的上样步骤中使用的RCA混合物可以包含聚合酶(例如DNA聚合酶)和dNTP混合物(包含dGTP、dATP、dTTP、dCTP或其任何组合)。RCA混合物可以包含上样缓冲液,该上样缓冲液包含二价金属阳离子和支链聚电解质物质。
聚合酶可以以促进核酸扩增所必需的浓度存在,如对于技术人员而言将明显的。在一些实施方案中,引物与模板核酸的摩尔比可以是约1015:1或更低。例如,引物与模板核酸的摩尔比可以是约1015:1、5×1014:1、1014:1、1013:1、1012:1、1011:1、1010:1、109:1、108:1、107:1或106:1。在一些实施方案中,聚合酶与模板核酸的摩尔比可以是约1.5×1010:1或更低。例如,聚合酶与模板核酸的摩尔比可以是约3×109:1、109:1、108:1、107:1、107:1、106:1、106:1、105:1、104:1、103:1、102:1或50:1。
RCA混合物中的dNTP可以在约10μM至约10mM的范围内,如对于技术人员而言将明显的。在一些实施方案中,dNTP浓度小于10mM,以避免由扩增的多联体形成水凝胶,并且保持在低于或等于RCA混合物中存在的二价金属阳离子(例如镁)的量的浓度。
上样缓冲液中的二价金属阳离子可以以促进聚合酶高效上样到模板核酸上以形成聚合酶-核酸复合物所必需的浓度存在,从而引发扩增。在一些实施方案中,二价金属阳离子是镁阳离子。在一些实施方案中,允许引发RCA反应所必需的上样缓冲液中二价金属阳离子(例如Mg2+)的浓度是从约0.001mM至约10mM、约0.1mM至20mM或约1mM至20mM。例如,上样缓冲液中二价金属阳离子的浓度可以是约以下、至多以下或至多约以下:0.001mM、0.05mM、0.1mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM、5.5mM、6.0mM、6.5mM、7.0mM、7.5mM、8.0mM、8.5mM、9.0mM、9.5mM、10mM,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围。任选地,上样缓冲液中二价金属阳离子的浓度可以是约0.01mM至约10mM、从约0.1mM至约10mM、从约1mM至约10mM。任选地,上样缓冲液中二价金属阳离子的浓度是从5mM至10mM。
上样缓冲液中的支链聚电解质可以以引发RCA扩增所必需的浓度存在。在一些实施方案中,上样缓冲液中使用的支链聚电解质包括PAMAM(例如G3 PAMAM)。在一些实施方案中,允许引发RCA反应所必需的上样缓冲液中支链聚电解质的浓度是从约0.001μM至约1μM。例如,上样缓冲液中支链聚电解质的浓度可以是约以下、至多以下或至多约以下:0.001μM、0.01μM、0.02μM、0.04μM、0.06μM、0.08μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μM,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围。任选地,上样缓冲液中支链聚电解质的浓度可以是约0.01μM至约1.0μM、约0.01μM至约0.5μM或约0.1μM。
上样缓冲液中二价金属阳离子和/或支链聚电解质的低浓度可以促进聚合酶与核苷酸和模板核酸相互作用和结合,以形成聚合酶-核酸复合物。因此,在一些实施方案中,增加上样缓冲液中二价金属阳离子和支链聚电解质中的一种或两种的浓度可以抑制聚合酶和引发的模板核酸之间的结合,由此减少形成的聚合酶-核酸模板复合物的数目(例如,参见图3-图5)。例如,增加上样缓冲液中二价金属阳离子和/或支链聚电解质的浓度可以将形成的聚合酶-核酸模板复合物的数目减少至少以下或至少约以下:10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、40%、50%、75%、100%,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围。因此,增加上样缓冲液中二价金属阳离子和/或支链聚电解质的浓度可以将扩增收率(amplification yield)降低至少以下或至少约以下:10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、40%、50%、75%、100%,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围。
上样缓冲液还可以包含进行RCA反应所必需的其他辅助试剂,诸如盐、缓冲剂、小分子、辅因子、金属和离子,如对于技术人员而言将明显的。例如,上样缓冲液可以包括Tris、Tricine、HEPES、MOPS、ACES、MES、基于磷酸盐的缓冲液和基于乙酸盐的缓冲液。在一些实施方案中,上样缓冲液可以包含一种或更多种表面活性剂(例如吐温20、NP-40)、一种或更多种还原剂(例如二硫苏糖醇)、甘油或其组合。上样缓冲液可以包含盐,诸如NaCl、KCl、乙酸钾、乙酸铵、谷氨酸钾、NH4Cl或NH4HSO4,它们在水溶液中电离以产生单价阳离子。上样缓冲液可以包含螯合剂,诸如EDTA、EGTA等。
补充
本文描述的方法可以包括在上样缓冲液中孵育后的补充步骤,在该补充步骤期间将扩增缓冲液引入容器中。扩增缓冲液可以在有利于核酸延伸反应的条件下引入。在补充步骤中引入的扩增缓冲液在组成上不同于在上样步骤中引入的上样缓冲液。在一些实施方案中,引入扩增缓冲液发生在上样步骤的持续时间之后。例如,可以在上样缓冲液引入容器中之后10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟将扩增缓冲液引入容器中。
扩增缓冲液可以通过泵送、抽取或以其他方式使扩增缓冲液中的不同液体试剂以组合或分开的溶液顺序或同时流动通过容器(例如流通池)而引入容器中。扩增缓冲液可以根据需要多次补充至容器,以将模板核酸扩增至足够的拷贝数。在一些实施方案中,可以将一种或更多种另外的扩增缓冲液顺序引入容器中。例如,在引入第一扩增缓冲液后,可以将一种或更多种另外的扩增缓冲液引入容器中一次、两次或更多次。扩增缓冲液的每次引入可以与另外的扩增缓冲液的引入相隔一个时间段,诸如约10分钟至约60分钟,并且任选地约30分钟。
每种扩增缓冲液可以在有利于酶活性的任何温度,在容器中与聚合酶-核酸复合物一起孵育持续期望的时间量(例如,5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围)。补充步骤的孵育温度可以与上样步骤使用的孵育温度相同或不同。扩增缓冲液可以在约20℃和约60℃之间或约20℃和约50℃之间的温度在容器中孵育。任选地,反应温度在约30℃和40℃之间(例如,约37℃)。
试剂去除或洗涤程序可以在本文阐述的多种步骤中的任何步骤之间进行。例如,洗涤步骤可以被包括在上样步骤之后和补充步骤之前。洗涤步骤也可以在任何两个补充步骤之间进行。洗涤步骤可以用于去除反应容器中存在的试剂中的一种或更多种。在洗涤步骤中待从容器中去除的一种或更多种试剂可以包括对聚合酶活性有拮抗作用的试剂,包括例如酶储存缓冲液中的酶接种抑制剂和PCR抑制剂,诸如焦磷酸盐和过量的DTT、甘油和表面活性剂。在一些实施方案中,在洗涤步骤中待从容器中去除的试剂可以是溶液中过量的聚合酶。聚合酶可以在将洗掉溶液中过量的聚合酶而不引起与模板核酸结合的聚合酶去除的条件下从容器中去除。
本文使用的一种或更多种扩增缓冲液中的每一种相对于彼此可以具有相同或不同的组成。例如,一种或更多种扩增缓冲液中的每一种可以具有相同或不同浓度的二价金属阳离子和/或相同或不同浓度的聚电解质。
递送另外的聚合酶在补充步骤中不是必需的,这在降低制备另外的聚合酶所需要的成本和时间方面提供了优势。因此,一种或更多种扩增缓冲液(包括一种或更多种另外的扩增缓冲液)不包含聚合酶。例如,扩增缓冲液和另外的扩增缓冲液中的一种或更多种可以具有与上样缓冲液相同的组成,除了扩增缓冲液和另外的扩增缓冲液不包含聚合酶(例如DNA聚合酶),由此减少了进行RCA反应所需要的聚合酶的总量。在一些实施方案中,在扩增缓冲液中补充聚合酶不仅增加成本,而且还可能降低扩增的效率。例如,在一些实施方案中,扩增效率可以降低约以下、至少以下、至少约以下:20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围(例如,参见图4)。在一些实施方案中,扩增缓冲液的补充可以去除溶液中过量的聚合酶,但不去除已经与核酸模板(例如DNA环)结合的聚合酶。
在一些实施方案中,扩增缓冲液和另外的扩增缓冲液中的一种或更多种具有与上样缓冲液不同的组成。例如,扩增缓冲液中的二价金属阳离子和支链聚电解质中的一种或两种可以处于比上样缓冲液中更高的浓度。
扩增缓冲液和/或一种或更多种另外的扩增缓冲液中的二价金属阳离子可以以有利于核酸扩增的浓度存在。在一些实施方案中,扩增缓冲液中二价金属阳离子(例如Mg2+)的浓度是从约10mM至约50mM。例如,扩增缓冲液中二价金属阳离子的浓度可以是约以下、至少以下、或至少约以下:10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中,扩增缓冲液中二价金属阳离子的浓度比上样缓冲液中二价金属阳离子的浓度高约以下、至少以下、或至少约以下:50%、75%、100%、150%、200%、250%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%、700%、750%、800%、850%、900%、950%、1000%,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围。任选地,扩增缓冲液中二价金属阳离子的浓度比上样缓冲液中二价金属阳离子的浓度高约以下、至少以下、或至少约以下:100%、200%、300%、400%或500%。在一些实施方案中,扩增缓冲液中二价金属阳离子的浓度比上样缓冲液中二价金属阳离子的浓度高约以下、至少以下、或至少约以下:1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围。
扩增缓冲液和/或一种或更多种另外的扩增缓冲液中的支链聚电解质可以以有利于核酸扩增并且进一步稳定形成的核酸簇的浓度存在。在一些实施方案中,扩增缓冲液中支链聚电解质(例如,PAMAM)的浓度是从约0.5μM至20μM、约1μM至50μM或约2μM至100μM。例如,扩增缓冲液中支链聚电解质的浓度可以是约以下、至少以下、或至少约以下:0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、20μM,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中,扩增缓冲液中支链聚电解质的浓度比上样缓冲液中支链聚电解质的浓度高约以下、至少以下、或至少约以下:2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围。
本文使用的扩增缓冲液还可以包含可以通过延伸聚合酶的活性耗尽以便促进正在进行的滚环延伸的试剂,包括例如dNTP。
在一些实施方案中,补充步骤中在引入扩增缓冲液后核酸模板的扩增的多联体的形成比在引入扩增缓冲液之前(例如,在上样步骤中)核酸模板的扩增的多联体的形成更快。在一些实施方案中,通过用包含比上样缓冲液浓度更高的二价金属阳离子和支链聚电解质的扩增缓冲液补充RCA反应,RCA反应的扩增速率可以增加2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围。如本文使用的,术语“扩增速率”是扩增反应诸如RCA反应发生的速度,并且可以定义为与每单位时间产物浓度的增加和/或每单位时间反应物浓度的降低成比例。在一些实施方案中,RCA反应中的扩增速率可以通过在给定时间段内产生的扩增的多联体中重复单元(或模板核酸的拷贝)的数目来测量。在一些实施方案中,通过在RCA反应中补充扩增缓冲液,在给定时间段内产生的模板核酸的拷贝数可以增加2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围。
在一些实施方案中,用本文描述的扩增缓冲液补充RCA反应可以去除溶液中过量的聚合酶,同时最小限度地去除已经与模板核酸结合的聚合酶。例如,使用本文公开的方法和组合物,在将扩增缓冲液引入容器中之后,聚合酶的约以下、至少以下或至少约以下可以保留在多个聚合酶-核酸复合物中:50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%,或者这些数字中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中,使用本文公开的方法和组合物,聚合酶的约以下、至多以下或至多约以下可以从多个聚合酶-核酸复合物中解离:5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。在一些实施方案中,聚合酶的至多5%、10%或20%可以从多个聚合酶-核酸复合物中解离。在一些实施方案中,扩增缓冲液中高浓度的二价金属阳离子和/或支链聚电解质可以防止聚合酶从聚合酶-核酸复合物中解离。因此,当聚合酶大体上保留在聚合酶-核酸复合物中时,在上样步骤后将更多的聚合酶递送至容器中是不必需的,由此节省了本来将花费在制备更多聚合酶上的时间和资源。
因此,在一些实施方案中,用包含比上样缓冲液浓度更高的二价金属阳离子和支链聚电解质的扩增缓冲液补充RCA反应可以增加聚合酶的持续性。术语“持续性”,当用于提及扩增反应时,被定义为聚合酶(例如DNA聚合酶)在模板核酸上进行连续的核酸扩增反应而不频繁解离的能力。持续性可以通过聚合酶在单个缔合/解离事件中掺入的核苷酸的平均数来测量。在一些实施方案中,使用本文公开的方法和组合物,在扩增反应中聚合酶的持续性可以增加2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围。在非限制性实例中,使用本文公开的方法和组合物,Phi29聚合酶的持续性可以从约70kb(参见例如,thermofisher.com/order/catalog/product/EP0091#/EP0091的描述)增加到超过2Mb(例如,约2Mb-6.6Mb)(参见例如,实施例3)。
在一些实施方案中,本文描述的RCA最初是在低浓度的试剂(例如,二价金属阳离子和支链聚电解质)存在的情况下进行的,这有利于聚合酶-核酸复合物的初始形成。然后用更高浓度的二价金属阳离子和支链聚电解质补充RCA,而不需要任何另外的聚合酶,这可以以加速的扩增速率继续扩增过程,同时大体上保留与引发的模板核酸结合的聚合酶(参见例如图5)。此外,随着扩增缓冲液的补充,扩增反应可以在聚合酶活性损失最小的情况下继续持续延长的时间段(参见例如,图6-图7)。例如,在一些实施方案中,本文描述的RCA反应可以继续持续1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时,而不需要补充任何另外的聚合酶。
本文描述的方法和组合物可以实现在给定的时间段内至少约2倍(例如,2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围)的核酸扩增的更高收率。
本文公开了用于针对核酸进行RCA的方法、组合物和系统的非限制性实例。例如,可以将包含DNA聚合酶、dNTP混合物以及含有低浓度的镁和PAMAM(例如,7mM氯化镁和0.1μMPAMAM G3;或10mM氯化镁和合意浓度的PAMAM G3)的上样缓冲液的滚环扩增(RCA)混合物引入容器(例如,流通池)中,该容器含有与单链DNA(ssDNA)环杂交的引物(例如,3D表面中嵌入的捕获引物)。上样缓冲液可以包含例如酶储存缓冲液中的1000U/mL酶,所述酶储存缓冲液含有5%甘油、5mM Tris-HCl pH 7.5、0.01mM EDTA、0.1mM DTT、10mM KCl、0.05% NP-40、0.05%吐温20。RCA混合物可以在期望的温度(例如,37℃)例如等温地孵育持续期望的设定时间段(例如,5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围)以产生扩增产物。在该时间段期间,DNA聚合酶可以与ssDNA环复合,并且开始滚环扩增过程,多次拷贝环的DNA,形成DNA簇的开端。在设定的孵育时间之后,可以将不含有酶(或在一些情况下含有低于初始反应的浓度的酶)的新溶液(例如,具有与上样缓冲液相同的基础缓冲液但含有更高浓度的有利于延伸的试剂的扩增缓冲液,所述试剂诸如镁和PAMAM(例如30mM氯化镁和10μM PAMAM G3))引入容器中,以补充或替换上样缓冲液。在一些实施方案中,新溶液可以含有30mM氯化镁、10μM PAMAM G3并且不含有酶。将新溶液在期望的温度(例如,约37℃或有利于酶活性的其他温度)在容器中孵育持续期望的设定的时间量(例如,5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围),以允许在容器内发生进一步的RCA反应。可以有利的是,在新溶液存在的情况下,DNA扩增以比在上样缓冲液中第一次孵育更快的速率发生。然后这种新溶液(扩增缓冲液)可以根据需要多次补充至容器,以将DNA扩增到足够的拷贝数。在实施例2-实施例3中也示出了本文公开的方法的示例性优点,这些实施例证明了使用本文公开的补充方法的DNA扩增的更高的收率。
如本文公开的,用于补充的方法和组合物可以增加例如聚合酶(例如,Phi29聚合酶)的持续性。不受任何特定理论的束缚,据信在一些情况下,高PAMAM可以阻断聚合酶的结合,并且引发缓冲液中的低PAMAM可以允许酶更容易地结合。一旦聚合酶被结合(在引发缓冲液存在的情况下)并且提供补充缓冲液以替换引发缓冲液,在一些实施方案中,高PAMAM可以保持簇有组织,并且高盐屏蔽电荷以帮助DNA保持紧密。
测序中的应用
在一些实施方案中,本文描述的RCA可以产生线性多联体核酸分子,其呈随机线圈的形式,通常被称为“微微球(picosphere)”。微微球可以被固定至适合用于测序的表面(例如,经由与测序基底表面上的通用捕获寡核苷酸杂交)。通用捕获寡核苷酸具有与任何感兴趣的特定靶序列无关的序列,并且因此可以用于捕获任何靶序列。在一些实施方案中,通用捕获寡核苷酸可以与微微球中的通用引发序列杂交。在一些实施方案中,通用捕获寡核苷酸是条形码测序引物。在一些实施方案中,微微球通过离子相互作用、经由共价连接或通过附接的配体(例如,生物素和链霉亲和素)的结合介导来附接至表面。在一些实施方案中,一个或若干个测序引物在附接至用于测序的表面之前或之后与微微球杂交。
因此,本文公开的用于进行滚环扩增的方法、组合物和系统可以用于核酸测序例如用于结合测序(SBB)或合成测序(SBS)的方法、组合物和系统。
“结合测序”指的是这样的测序技术:其中聚合酶和同源核苷酸与引发的模板核酸的特异性结合用于鉴定下一个正确的核苷酸,该核苷酸将被掺入引发的模板核酸的引物链中。特异性结合相互作用不需要导致核苷酸化学掺入到引物中。特异性结合相互作用可以先于核苷酸向引物链中的化学掺入,或者先于类似的下一个正确的核苷酸向引物中的化学掺入。因此,可以在不掺入下一个正确的核苷酸的情况下进行下一个正确的核苷酸的鉴定。
例如,在美国专利第10,443,098号和第10,246,744号;以及在2018年2月15日公布的美国专利申请公布第2018/0044727号中描述了结合测序;每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。简言之,在SBB中,聚合酶在反应的离散步骤期间经历开放构象和封闭构象之间的构象转变。在一个步骤中,聚合酶与引发的模板核酸结合以形成二元复合物,本文也被称为插入前构象。在随后的步骤中,进入的核苷酸被结合,并且聚合酶指关闭,形成包含聚合酶、引发的模板核酸和核苷酸的化学前构象,其中结合的核苷酸尚未被掺入。该步骤(在本文中也被称为检查步骤)之后是去除未掺入的核苷酸(可以是标记的或未标记的核苷酸),并且然后是延伸的链3’末端的去封闭,以便使其适合于延伸。然后添加未标记的3’封闭的核苷酸,随后进行化学掺入步骤,其中形成磷酸二酯键,伴随着从核苷酸的焦磷酸裂解(核苷酸掺入),以形成延伸链,该延伸链已经延伸了一个碱基,并且在没有修饰的情况下不能进一步延伸。去除未掺入的封闭的延伸碱基并且添加标记的碱基,使得它们可以在与模板碱基配对的位置形成三元复合物。测定这些三元复合物的荧光或其他输出,以确定配对碱基的身份,并且然后通过去除标记的碱基,化学修饰延伸链以暴露3’OH,并且与3’封闭的未标记的核苷酸的群体接触以获得另一个单碱基延伸,重复该过程。
检查步骤可以例如涉及提供引发的模板核酸,并且使引发的模板核酸与聚合酶(例如,DNA聚合酶)和一个或更多个被研究作为可能的下一个正确核苷酸的测试核苷酸接触。可以在检查步骤期间监测聚合酶构型和/或与引发的模板核酸以及进一步与核苷酸的相互作用,以鉴定模板核酸中的下一个正确碱基。在一些实施方案中,SBB程序包括监测步骤,该监测步骤在测试核苷酸存在的情况下监测或测量聚合酶和引发的模板核酸之间的相互作用。在一些实施方案中,检查步骤确定下一个正确核苷酸的身份,而不需要掺入该核苷酸(例如,不存在该核苷酸通过共价键与引物的3’-末端化学连接,或在这之前)。例如,引发的模板核酸分子的引物可以包括封闭基团,该封闭基团阻止进入的核苷酸酶促掺入到引物中。在一些实施方案中,检查步骤中使用的反应混合物包含低水平或不足水平的催化金属离子,以防止核苷酸化学掺入到引发的模板核酸的引物中。在一些实施方案中,检查步骤中使用的反应混合物包含稳定三元复合物,同时阻止任何核苷酸掺入到引物中的稳定剂,诸如抑制聚合的非催化金属离子。
通常,检查步骤涉及在包含一种或更多种核苷酸的反应混合物中将聚合酶结合至引发的模板核酸的聚合引发位点,以及监测相互作用。例如,检查步骤可以包括以下子步骤中的一个或更多个:(1)提供引发的模板核酸(即,与可以任选地在其3’-末端被阻断延伸的引物杂交的模板核酸分子);(2)使引发的模板核酸与包含聚合酶和至少一种核苷酸的反应混合物接触;(3)在存在核苷酸并且没有任何核苷酸化学掺入到引发的模板核酸中的情况下,监测聚合酶与引发的模板核酸分子的相互作用;以及(4)根据监测的相互作用确定模板核酸中下一个碱基的身份(即,下一个正确的核苷酸)。检查通常涉及检测聚合酶与模板核酸的相互作用。检测可以包括光学手段、电学手段、热学手段、声学手段、化学手段和机械手段。测序反应的检查步骤可以在任选的掺入步骤之前重复1次、2次、3次、4次或更多次。
在SBB中,用于检查步骤的反应混合物可以包含1种、2种、3种或4种类型的核苷酸分子。核苷酸可以选自dATP、dTTP(或dUTP)、dCTP和dGTP。检查反应混合物可以包含一种或更多种三磷酸核苷酸和一种或更多种二磷酸核苷酸。三元复合物可以在引发的模板核酸、聚合酶和四种核苷酸分子中的任何一种之间形成,使得可以形成四种类型的三元复合物。
掺入步骤可以与检查步骤同时,或者可以与检查步骤分开。在SBB程序的一些实施方案中,检查步骤之后是掺入步骤,该掺入步骤将一个或更多个互补核苷酸添加至引发的模板核酸的引物组分的3’末端。聚合酶、引发的模板核酸和新掺入的核苷酸产生化学后构象。化学前构象和化学后构象两者都可以被称为三元复合物,各自都包含聚合酶、引发的模板核酸和核苷酸,其中聚合酶处于封闭状态,并且促进下一个正确的核苷酸和引发的模板核酸之间的相互作用。在掺入步骤期间,二价催化金属离子,诸如Mg2+,介导涉及引物末端的3’-羟基对焦磷酸(PPi)的亲核置换的化学步骤。聚合酶在PPi释放后返回开放状态。
掺入步骤可以通过掺入反应混合物促进。掺入反应混合物可以具有不同于检查反应的核苷酸的组成。例如,检查反应可以包括一种类型的核苷酸,并且掺入反应可以包括另一种类型的核苷酸。通过另一个实例的方式,检查反应包括一种类型的核苷酸,并且掺入反应包括四种类型的核苷酸,反之亦然。检查反应混合物可以被掺入反应混合物改变或替换。
在一些实施方案中,检查步骤之后是去除未掺入的标记的核苷酸,并且然后是引发的模板核酸的引物(或延伸的引物)的3’末端的去封闭,以便使其适合于延伸。然后添加未标记的3’封闭的核苷酸,随后进行化学掺入步骤,其中形成磷酸二酯键,伴随着从核苷酸的焦磷酸裂解(核苷酸掺入),以形成延伸链,该延伸链已经延伸了一个碱基,并且在没有修饰的情况下不能进一步延伸。去除未掺入的封闭的延伸碱基并且添加标记的碱基,使得它们可以在与模板碱基配对的位置形成三元复合物。测定这些三元复合物的荧光或其他输出,以确定配对碱基的身份,并且然后通过去除标记的碱基,化学修饰延伸链以暴露3’OH,并且与3’封闭的未标记的核苷酸的群体接触以获得另一个单碱基延伸,重复该过程。
在一些实施方案中,本文公开的方法、组合物和系统可以用于涉及核苷酸掺入的SBB程序的一个或更多个步骤。例如,本文公开的方法、系统和组合物可以用于SBB程序的掺入步骤(在检查步骤后或与检查步骤同时进行),以允许核苷酸掺入和引物延伸。
在一些实施方案中,SBB程序使用两种不同的反应混合物:检查步骤中的检查反应混合物和掺入步骤中的掺入反应混合物。反应混合物通常包含通常存在于基于聚合酶的核酸合成反应中的试剂。反应混合物试剂可以包括但不限于酶(例如聚合酶)、dNTP、模板核酸、引物、盐、缓冲液、小分子、辅因子、金属和离子。
掺入反应混合物可以例如包含一种或更多种核苷酸(例如,相同或不同类型)和聚合酶延伸试剂,该聚合酶延伸试剂包括二价金属阳离子和支链聚电解质,其中二价金属阳离子和支链聚电解质中的一种或两种处于与检查反应混合物相比更高的浓度。例如,掺入反应混合物中二价金属阳离子的浓度比检查反应混合物中二价金属阳离子的浓度高约以下、至少以下、或至少约以下:1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中,掺入反应混合物中支链聚电解质的浓度比检查反应混合物中支链聚电解质的浓度高约以下、至少以下、或至少约以下:2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中,掺入反应混合物中二价金属阳离子(例如,Mg2+)的浓度是从约10mM至约50mM(例如,10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围)。在一些实施方案中,掺入反应混合物中支链聚电解质(例如,PAMAM)的浓度是从约0.5μM至20μM(例如0.5μM、1μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、14μM、16μM、18μM、20μM,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围)。在一些实施方案中,掺入反应混合物不包含聚合酶。
因此,在一些实施方案中,结合测序的方法可以包括用本文在掺入步骤中描述的掺入反应混合物替换在检查步骤中使用的检查反应混合物。在一些实施方案中,结合测序的方法可以包括在引入掺入反应混合物之前洗涤固定的引发的模板核酸分子,以去除检查反应混合物的一种或更多种组分(例如过量的聚合酶和对聚合酶活性有拮抗作用的试剂)。
SBB程序的方法、系统和组合物中使用的检查反应混合物和掺入反应混合物可以包含通常存在于核酸聚合反应中的其他分子或试剂。SBB反应混合物和相关的方法以及在SBB程序中的使用的描述可以例如在美国专利第10,443,098号和第10,246,744号中找到,所述美国专利中的每一篇通过引用并入本文。
在一些实施方案中,本文公开的方法、系统和组合物可以用于产生(或合成)核酸多联体的一条或更多条链,用于结合测序。核酸多联体的一条或更多条链可以使用本文描述的滚环扩增方法产生,该方法利用具有不同组成的上样缓冲液和扩增缓冲液。例如,可以用具有低浓度的二价金属阳离子和支链聚电解质的上样缓冲液引发滚环扩增反应,并且然后用具有高浓度的二价金属阳离子和支链聚电解质的扩增缓冲液补充。递送另外的聚合酶在任何补充步骤中不是必需的,这在降低制备另外的聚合酶所需要的成本和时间方面提供了优势。然后可以通过将测序引物与多联体的序列单元中的引物结合位点杂交并且沿着多联体延伸引物以确定序列,对产生的多联体进行测序。在一些实施方案中,核酸多联体的一条或更多条链可以形成核酸簇,该核酸簇可以通过支链聚电解质携带的正电荷和核酸簇携带的负电荷之间的相互作用来稳定。核酸簇可以包括多个第一链多联体以及与第一链多联体互补的多个第二链多联体。可以例如通过滚环扩增或通过在第一链多联体上进行的多重置换扩增来产生第二链多联体。产生的链中的任何一条都可以进行测序。例如,多联体的第一链和多联体的一条或更多条第二链可以用不同的测序引物顺序或同时地进行测序。
本文公开的方法、系统和组合物也可以用于合成测序(SBS)。SBS通常涉及通过针对与引物杂交的模板链迭代添加核苷酸来对新生引物进行酶促延伸。SBS与上述SBB的不同之处在于,标记的核苷酸被掺入到延伸链中,被测定,并且然后标记被去除或失活,并且3’封闭被去除,以迭代地测序模板。在SBB中,标记的碱基不需要被掺入到延伸链中。相反,三元复合物的形成被测定,通常是针对标记的碱基的存在,但有时是针对标记的聚合酶的存在或其他特征,之后复合物被分解,并且3’封闭的未标记的碱基用于延伸引物链。简言之,SBS可以通过使附接至流通池中的位点的靶核酸与一个或更多个标记的核苷酸、DNA聚合酶等接触来引发。那些使用靶核酸作为模板延伸引物的位点将掺入可以检测的标记的核苷酸。检测可以包括使用本文阐述的设备或方法进行扫描。任选地,标记的核苷酸还可以包括在核苷酸已经被添加到引物之后使进一步的引物延伸终止的可逆终止性质。例如,具有可逆终止子部分的核苷酸类似物可以被添加到引物,使得随后的延伸不能发生,直到去封闭剂被递送以去除该部分。因此,对于使用可逆终止的实施方案,去封闭试剂可以被递送到容器(在检测发生之前或之后)。可以在各递送步骤之间进行洗涤。循环可以进行n次,以将引物延伸n个核苷酸,从而检测长度n的序列。例如,在Bentley等人,Nature 456:53-59(2008),WO 04/018497;WO 91/06678;WO 07/123744;美国专利第7,057,026号;第7,329,492号;第7,211,414号;第7,315,019号或第7,405,281号,以及美国专利申请公布第2008/0108082A1号中描述了可以容易地适用于本公开内容的方法、系统或设备的示例性SBS程序、试剂和检测部件,文献中每一篇都通过引用并入本文。
因此,合成测序的方法可以包括将包含本文描述的高浓度(例如,扩增缓冲液中使用的浓度)的二价金属阳离子和支链聚电解质中的一种或两种的补充混合物引入容器(例如,流通池)中。例如,合成测序的方法可以包括将测序引物与多联体的序列单元中的引物结合位点杂交并且沿着多联体延伸测序引物以确定多联体的模板核酸的序列。可以在测序引物与多联体的序列单元中的引物结合位点杂交之后和在引物延伸发生之前引入补充混合物。在一些实施方案中,在引物延伸发生之后引入补充混合物。在一些实施方案中,引物延伸可以包括向测序引物添加可逆终止的核苷酸以及将在测序引物上的可逆终止的核苷酸去封闭的重复循环。补充混合物可以根据需要多次递送至容器,以适应测序多联体所需要的循环次数。在任何补充步骤中递送另外的聚合酶都不是必需的。
在一些实施方案中,用包含本文描述的低浓度(例如,上样缓冲液中使用的浓度)的二价金属阳离子和支链聚电解质中的一种或两种的引发混合物引发SBS程序,并且然后用包含本文描述的高浓度(例如,扩增缓冲液中使用的浓度)的二价金属阳离子和支链聚电解质中的一种或两种的补充混合物进行补充。例如,在一些实施方案中,在SBS程序的一个或更多个步骤中使用的补充混合物的二价金属阳离子(例如,Mg2+)的浓度可以从约10mM至约50mM(例如,10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围)。在一些实施方案中,在SBS程序的一个或更多个步骤中使用的补充混合物的支链聚电解质(例如,G3 PAMAM)的浓度可以从约0.5μM至20μM(例如,0.5μM、1μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、14μM、16μM、18μM、20μM,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围)。在一些实施方案中,SBB程序中使用的补充混合物不包含聚合酶。在一些实施方案中,合成测序的方法可以包括在引物杂交之后,用补充混合物或补充混合物的一种或更多种组分替换或改变引发混合物,以实现如本文描述的一种或更多种组分(例如二价金属阳离子和/或支链聚电解质)的期望的浓度。
类似于上文描述的SBB,本文公开的方法、系统和组合物也可以用于产生(或合成)核酸多联体的一条或更多条链,用于合成测序。
系统和试剂盒
本文提供的内容还包括用于进行核酸的滚环扩增的系统和试剂盒。本文公开的系统可以包括用于进行核酸扩增的容器、固体支持物或其他设备。例如,系统可以包括阵列、流通池、多孔板、试管、基底中的通道、液滴或囊泡的集合、托盘、离心管、管道或其他方便的设备。设备可以是可移除的,从而允许其被放置到系统中或从系统中去除。因此,系统可以被配置为顺序地或并行地处理多个设备(例如容器或固体支持物)。该系统可以包括流体部件,该流体部件被配置为递送本文阐述的一种或更多种试剂(例如,聚合酶、引物、模板核酸、核苷酸、上样缓冲液、扩增缓冲液或这样的组分的混合物)。流体系统可以被配置为例如经由通道或液滴转移设备(例如,电润湿设备)将试剂递送至容器或固体支持物。多种检测设备中的任何一种都可以被配置为检测其中试剂相互作用的容器或固体支持物。示例性系统具有流体部件和检测部件,这些部件在以下中阐述:2018年10月4日公布的美国专利申请公布第2018/0280975A1号;美国专利第8,241,573号;第7,329,860号或第8,039,817号;或2009年11月5日公布的美国专利申请公布第2009/0272914A1号或2012年10月25日公布的美国专利申请公布第2012/0270305A1号,这些文献中的每一篇都通过引用并入本文。
本文描述的组合物可以一起包装为用于进行本文公开的任何方法的试剂盒。在本文公开的一些实施方案中,试剂盒可以包括如上文公开的滚环扩增混合物、上样缓冲液和扩增缓冲液的一种或更多种组分。例如,试剂盒可以包括上样缓冲液,该上样缓冲液包含本文描述的低浓度的二价金属阳离子和支链聚电解质。上样缓冲液还可以包含聚合酶、缓冲剂、试剂和用于进行滚环扩增反应的基底溶液。试剂盒还可以包括扩增缓冲液,该扩增缓冲液包含本文描述的较高浓度的二价金属阳离子和支链聚电解质。试剂盒可以包括适合用于检测、纯化和进一步处理下游应用(例如测序)中扩增的核酸(例如多联体)的另外的试剂。试剂盒可以在单独的容器中包含组合物。试剂盒可以包括适当的包装材料、用于容纳试剂盒组分的容器以及用于实践本文公开的方法的指导材料中的一种或更多种。
实施例
上文讨论的实施方案的一些方面在以下实施例中被更详细地公开,这些实施例不以任何方式意图限制本公开内容的范围。
实施例1
在不存在补充缓冲液的情况下使用引发缓冲液的RCA反应的非限制性实例
本实施例展示了在不存在补充缓冲液(或扩增缓冲液)的情况下在单一引发缓冲液(或上样缓冲液)中进行的一组RCA扩增反应的非限制性实验。特别地,本实施例展示了高浓度的PAMAM对簇强度和斑点计数的影响。
在本实施例中,RCA扩增在没有补充的单一引发缓冲液中进行。图3图示了示例性图,该示例性图示出针对具有相同Mg2+浓度(10mM)和增加的PAMAM浓度(横向标度从左到右)的引发混合物的RCA反应测量的背景斑点计数(下图)、簇强度(中图)和所有斑点计数(上图)。聚合酶可以以1000U/ml提供,并且在包含例如5%甘油、5mM Tris-HCl pH 7.5、0.01mMEDTA、0.1mM DTT、10mM KCl、0.05% NP-40和0.05%吐温20的酶储存缓冲液中供应。
结果表明增加RCA反应中PAMAM的浓度导致较高的簇强度和斑点计数的减少。使用较高浓度的PAMAM来改善簇强度的益处受到产生的总簇的减少的阻碍。
实施例2
使用具有不同组成的引发缓冲液和补充缓冲液的RCA反应的非限制性实例
本实施例展示了在具有不同组成的引发缓冲液和补充缓冲液中进行的RCA反应的非限制性实验的组,所述不同组成诸如不同浓度的金属离子(例如Mg2+)和树枝状聚合物(例如PAMAM)以及具有或不具有扩增酶(例如聚合酶)。
图4图示了示出针对在具有不同组成的引发混合物和补充混合物中进行的RCA反应测量的簇强度的示例性图。
特别地,如图4中示出的,在一组实验中,引发混合物包含30mM的MgCl2而没有PAMAM(在图4中的左三列)。在另一组实验中,引发混合物包含5mM的MgCl2以及PAMAM(在图4中的右三列)。在所有实验中使用的补充混合物包含30mM的MgCl2以及PAMAM,除了在没有补充的情况下进行的两个对照实验。补充混合物可以具有或可以不具有酶(即聚合酶)。
数据表明,引发混合物中Mg2+的较高浓度不利于簇强度。数据还示出,具有酶的补充不如不具有酶的补充有效,并且由于使用酶,还导致显著的成本。结果还表明,增加补充混合物中的Mg2+浓度可以有利于簇强度。
图5图示了示出针对在具有不同组成的引发混合物和补充混合物进行的RCA反应测量的簇强度(下图)和斑点计数(上图)的示例性图。
特别地,如图5中示出的,在一组实验中,补充混合物包含30mM的MgCl2而没有PAMAM(在图5中的左两列)。在另一组实验中,引发混合物包含30mM的MgCl2以及PAMAM(在图5中的右两列)。在两组实验中,补充混合物不包含酶。在每组实验中,测试了两种不同的引发混合物:一种引发混合物包含30mM的MgCl2并且另一种引发混合物包含5mM的MgCl2。两种引发混合物都含有PAMAM。
两种不同引发缓冲液的比较指示,引发缓冲液中高浓度的Mg2+显著不利于斑点计数。两种不同补充缓冲液的比较指示,补充缓冲液中高浓度的Mg2+和PAMAM有利于簇强度。
实施例3
在示例性RCA扩增反应中测量聚合酶持续性
本实施例展示了使用具有不同组成的引发混合物和补充混合物的RCA反应中为测量聚合酶持续性而进行的非限制性实验。特别地,本实施例展示了为测量每个核酸簇的文库拷贝数而进行的示例性实验的组。
使用类似于以下步骤的程序来确定每个簇的拷贝数:(1)使用3小时和8小时扩增和杂交cy3探针的簇RPC:进行文库输入滴定,并且每个簇的拷贝应是相同的,而无论文库输入如何;(2)用FMD洗脱cy3探针;(3)在CE上运行样品,以及每个探针的标准曲线;(4)使用尺寸标准对峰进行归一化;(5)使用标准曲线和洗脱体积来计算洗脱的探针数;(6)用cy5探针对簇/珠进行重新杂交;(7)采集图像,分析以得到每个区块的斑点计数,并且将中值斑点计数外推至整个泳道;以及(8)计算每个簇的探针数。
图6-图7是示出扩增的结果的两个图。图6示出了具有3小时滚环扩增的每个簇的探针数。数据指示,在3小时滚环扩增之后,每个簇的平均拷贝数是约5k。图7示出了具有8小时滚环扩增的每个簇的探针数。数据指示,在8小时RCA扩增之后,每个簇的平均拷贝数是约11k-16k。
给定414个碱基的平均文库大小,在3小时滚环扩增中可以实现超过2M(2,070,000)个碱基簇的持续性(基于测量每个簇的文库拷贝数和平均文库大小),并且在8小时滚环扩增中可以实现超过4M(4,554,000)至6M(6,624,000)个碱基的持续性。图6-图7中示出的数据展示了添加补充缓冲液后每个斑点的单一聚合酶扩增的持续活性。
应理解,通过RCA的聚合酶延伸被提供作为受益于试剂补充的酶促反应的实例。然而,本文的公开内容适用于广泛的酶促反应,这些酶促反应中试剂耗尽限制了反应产物的形成。在至少一些先前描述的实施方案中,在实施方案中使用的一个或更多个要素可以可互换地用于另一种实施方案中,除非这样的替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解,在不偏离所要求保护的主题的范围的情况下,可以对上文描述的方法和结构进行多种其他的省略、添加和修改。所有这样的修改和改变都旨在落在由所附权利要求限定的主题的范围内。
关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用,在对于上下文和/或应用适当的情况下,本领域技术人员可以从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见,可以在本文明确阐述各种单数/复数排列。如本说明书和所附权利要求中使用的,单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物,除非上下文另外明确指示。除非另外说明,否则在本文中对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”。
本领域技术人员将理解,通常,本文使用的术语,并且特别是所附权利要求(例如,所附权利要求书的主体)中的术语,通常旨在作为“开放性的”术语(例如,术语“包括/包含(including)”应解释为“包括但不限于(including but not limited to)”,术语“具有(having)”应解释为“具有至少(having at least)”,术语“包括/包含(includes)”应解释为“包括但不限于(includes but is not limited to)”等)。本领域技术人员将进一步理解,如果意图所介绍的权利要求陈述中的特定数字,则这样的意图将明确地陈述于权利要求中,并且在这种陈述不存在的情况下,不存在这种意图。例如,作为对理解的帮助,以下所附权利要求可以包含介绍性措辞“至少一种”和“一种或更多种”的使用,以介绍权利要求陈述。然而,此类措辞的使用不应解释为意味着由不定冠词“一(a)”或“一(an)”介绍权利要求陈述会将任何包含此类介绍的权利要求陈述的具体权利要求限制到包含仅一种此类陈述的实施方案,甚至当同一权利要求包括介绍性措辞“一种或更多种”或“至少一种”以及不定冠词诸如“一(a)”或“一(an)”时也是如此(例如,“一(a)”和/或“一(an)”应解释为意指“至少一种”或“一种或更多种”);这对于使用定冠词来介绍权利要求陈述同样适用。此外,即使明确地陈述了介绍的权利要求陈述的特定数字,本领域技术人员将认识到,此类陈述应解释为意指至少所陈述的数字(例如,仅陈述“两种陈述”而没有其他修饰词意指至少两种陈述或两种或更多种陈述)。此外,在使用类似于“A、B和C等中的至少一种”的惯例的那些情况下,通常这种句法结构意图为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如,“具有A、B和C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A,具有单独的B,具有单独的C,A和B一起,A和C一起,B和C一起,和/或A、B和C一起等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一种”的惯例的那些情况下,通常这种句法结构意图为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如,“具有A、B或C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A,具有单独的B,具有单独的C,A和B一起,A和C一起,B和C一起,和/或A、B和C一起等的系统)。本领域技术人员将进一步理解,实际上,无论在说明书、权利要求书还是在附图中,呈现两个或更多个替代术语的任何分离性词语和/或措辞应被理解为考虑到包括术语之一、任一术语或两个术语的可能性。
此外,当本公开内容的特征或方面以马库什组(Markush group)描述时,本领域技术人员将意识到本公开内容还由此以马库什组的任何个体成员或成员子组描述。
如本领域技术人员将理解的,为了任何和所有目的,诸如在提供书面描述方面,本文公开的所有范围还包括该范围的任何和所有可能的子范围和子范围的组合。任何列出的范围都可以容易地被识别为充分描述并使相同的范围能被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例,本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的,所有语言,诸如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所陈述的数字,并且指可以随后分解为如上文讨论的子范围的范围。最后,如本领域技术人员将理解的,范围包括每个单独的成员。因此,例如,具有1-3个物品的组指的是具有1个、2个或3个物品的组。类似地,具有1-5个物品的组指的是具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组,等等。
尽管本文已经公开了各种方面和实施方案,但其他方面和实施方案对本领域技术人员将是明显的。本文公开的各种方面和实施方案用于说明的目的而并不旨在限制,且实际范围和精神由附随权利要求指示。
Claims (45)
1.一种核酸的滚环扩增(RCA)的方法,包括:
(a)在容器中使环状DNA模板和捕获引物与RCA混合物接触持续第一持续时间,以形成DNA模板的扩增的多联体,其中所述RCA混合物包含DNA聚合酶、dNTP混合物、包含二价金属阳离子和支链聚电解质物质的上样缓冲液,以及
(b)在所述第一持续时间之后将扩增缓冲液引入所述容器中,以形成所述DNA模板的扩增的多联体,其中所述扩增缓冲液不包含任何DNA聚合酶,并且包含所述二价金属阳离子和所述支链聚电解质物质。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述容器是流通池。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法,其中所述DNA模板是单链DNA。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述二价金属阳离子是镁阳离子。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述支链聚电解质物质是树枝状聚合物物质。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述支链聚电解质物质是聚阳离子。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述树枝状聚合物物质是聚(酰氨基胺)(PAMAM)树枝状聚合物。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述PAMAM树枝状聚合物是G1 PAMAM、G2PAMAM、G3PAMAM、G4 PAMAM、G5 PAMAM或其组合。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其中所述PAMAM树枝状聚合物是G3 PAMAM。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中在将所述扩增缓冲液引入所述容器中之前,使所述环状DNA模板与所述第一RCA混合物接触持续约10分钟至约60分钟。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法,其中所述第一持续时间是约10分钟至约60分钟。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述第一持续时间是约30分钟。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其中步骤(b)中所述DNA模板的扩增的多联体的形成比步骤(a)中所述DNA模板的扩增的多联体的形成更快。
14.根据权利要求13所述的方法,其中步骤(b)中所述DNA模板的扩增的多联体的形成比步骤(a)中所述DNA模板的扩增的多联体的形成快至少约25%。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法,还包括在步骤(b)之后至少一次将一种或更多种另外的扩增缓冲液顺序引入所述容器中,其中所述另外的扩增缓冲液不包含任何DNA聚合酶,并且包含所述二价金属阳离子和所述支链聚电解质物质。
16.根据权利要求15所述的方法,包括在步骤(b)之后两次、三次或更多次将所述另外的扩增缓冲液顺序引入所述容器中。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法,所述一种或更多种另外的扩增缓冲液中的至少一种或两者不包含任何酶。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法,其中将所述另外的扩增缓冲液中的第一种引入所述容器中与步骤(b)中所述扩增缓冲液的引入相隔约10分钟至约60分钟,并且任选地约30分钟。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法,其中将所述另外的扩增缓冲液中的每一种引入所述容器中与上一种另外的扩增缓冲液的引入相隔约10分钟至约60分钟,并且任选地约30分钟。
20.根据权利要求14-18中任一项所述的方法,其中所述另外的扩增缓冲液向所述容器中的每次引入彼此相隔约10分钟至约60分钟,并且任选地约30分钟。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法,其中所述扩增缓冲液在组成上不同于所述另外的扩增缓冲液中的至少一种。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法,其中所述另外的扩增缓冲液中的每一种在组成上不同于任何其他另外的扩增缓冲液。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法,其中所述扩增缓冲液和所述另外的扩增缓冲液中的一种或更多种具有与所述上样缓冲液相同的组成,除了所述扩增缓冲液和所述另外的扩增缓冲液不包含所述DNA聚合酶。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法,其中与所述上样缓冲液相比,所述扩增缓冲液和所述另外的扩增缓冲液中的一种或更多种具有更高浓度的所述二价金属阳离子、更高浓度的所述支链聚电解质物质或两者。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法,其中所述方法在约37℃进行。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法,其中所述捕获引物被固定在所述容器的表面上。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法,其中所述上样缓冲液、所述扩增缓冲液和/或所述另外的扩增缓冲液包含DTT、甘油、一种或更多种表面活性剂或其组合。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法,其中所述扩增缓冲液中的二价金属阳离子处于至少10mM的浓度。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法,其中所述扩增缓冲液中的二价金属阳离子处于比所述上样缓冲液中高至少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的浓度。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法,其中所述上样缓冲液中的二价金属阳离子处于从约0.001mM至约10mM的浓度。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法,其中所述扩增缓冲液中的支链聚电解质处于至少5μM的浓度。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法,其中所述扩增缓冲液中的支链聚电解质处于比所述上样缓冲液中高至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍或150倍的浓度。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法,其中所述上样缓冲液中的支链聚电解质处于从约0.001μM至约1μM的浓度。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法,其中使所述环状DNA模板和所述捕获引物与所述RCA混合物接触包括聚合酶-核酸复合物的形成,并且在将所述扩增缓冲液引入所述容器中之后,与所述聚合酶-核酸复合物结合的DNA聚合酶的至少约50%被保留。
35.根据权利要求34所述的方法,其中在将所述扩增缓冲液引入所述容器中之后,与聚合酶-核酸复合物结合的聚合酶的至少90%被保留。
36.根据权利要求1-33中任一项所述的方法,其中使所述环状DNA模板和所述捕获引物与所述RCA混合物接触包括聚合酶-核酸复合物的形成,并且在将所述扩增缓冲液引入所述容器中之后,DNA聚合酶的至多5%从所述聚合酶-核酸复合物解离。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法,其中将所述扩增缓冲液引入所述容器中从所述容器中去除不在所述聚合酶-核酸复合物中的DNA聚合酶。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法,其中所述聚合酶是Phi29聚合酶。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法,其中所述扩增缓冲液包含dNTP。
40.一种用于滚环扩增的试剂盒,包括:
第一缓冲液,所述第一缓冲液包含二价金属阳离子、支链聚电解质物质和DNA聚合酶,以及
第二缓冲液,所述第二缓冲液不包含任何DNA聚合酶并且包含所述二价金属阳离子和所述支链聚电解质物质。
41.根据权利要求40所述的试剂盒,其中所述二价金属阳离子是镁阳离子。
42.根据权利要求40或41所述的试剂盒,其中所述支链聚电解质物质是树枝状聚合物物质。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的试剂盒,其中所述第二缓冲液中的二价金属阳离子处于比所述第一缓冲液中大至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的浓度。
44.根据权利要求40-43中任一项所述的试剂盒,其中所述第二缓冲液中的支链聚电解质处于比所述第一缓冲液中大至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍或150倍的浓度。
45.根据权利要求40-44中任一项所述的试剂盒,还包括一种或更多种另外的缓冲液,其中所述另外的缓冲液中的每一种不包含任何DNA聚合酶,并且包含浓度不同于所述第二缓冲液和每一种其他另外的缓冲液的二价金属阳离子和支链聚电解质物质。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US202163186675P | 2021-05-10 | 2021-05-10 | |
US63/186,675 | 2021-05-10 | ||
PCT/US2022/028367 WO2022240766A1 (en) | 2021-05-10 | 2022-05-09 | Dna amplification buffer replenishment during rolling circle amplification |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117858959A true CN117858959A (zh) | 2024-04-09 |
Family
ID=82016606
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202280048778.2A Pending CN117858959A (zh) | 2021-05-10 | 2022-05-09 | 滚环扩增期间的dna扩增缓冲液补充 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220356515A1 (zh) |
EP (1) | EP4337789A1 (zh) |
CN (1) | CN117858959A (zh) |
WO (1) | WO2022240766A1 (zh) |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2044616A1 (en) | 1989-10-26 | 1991-04-27 | Roger Y. Tsien | Dna sequencing |
EP1975251A3 (en) | 2000-07-07 | 2009-03-25 | Visigen Biotechnologies, Inc. | Real-time sequence determination |
EP1354064A2 (en) | 2000-12-01 | 2003-10-22 | Visigen Biotechnologies, Inc. | Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity |
US7057026B2 (en) | 2001-12-04 | 2006-06-06 | Solexa Limited | Labelled nucleotides |
ES2407681T3 (es) | 2002-08-23 | 2013-06-13 | Illumina Cambridge Limited | Nucleótidos modificados para la secuenciación de polinucleótidos. |
JP2007525571A (ja) | 2004-01-07 | 2007-09-06 | ソレクサ リミテッド | 修飾分子アレイ |
CA2579150C (en) | 2004-09-17 | 2014-11-25 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Apparatus and method for analysis of molecules |
US7405281B2 (en) | 2005-09-29 | 2008-07-29 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor |
US7329860B2 (en) | 2005-11-23 | 2008-02-12 | Illumina, Inc. | Confocal imaging methods and apparatus |
EP3373174A1 (en) | 2006-03-31 | 2018-09-12 | Illumina, Inc. | Systems and devices for sequence by synthesis analysis |
WO2008051530A2 (en) | 2006-10-23 | 2008-05-02 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing |
US8039817B2 (en) | 2008-05-05 | 2011-10-18 | Illumina, Inc. | Compensator for multiple surface imaging |
US8951781B2 (en) | 2011-01-10 | 2015-02-10 | Illumina, Inc. | Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis |
US20130217023A1 (en) * | 2012-02-22 | 2013-08-22 | 454 Life Sciences Corporation | System And Method For Generation And Use Of Compact Clonally Amplified Products |
GB201415789D0 (en) * | 2014-09-05 | 2014-10-22 | Touchlight Genetics Ltd | Synthesis of DNA |
US10077470B2 (en) | 2015-07-21 | 2018-09-18 | Omniome, Inc. | Nucleic acid sequencing methods and systems |
US10597643B2 (en) | 2016-04-29 | 2020-03-24 | Omniome, Inc. | Polymerases engineered to reduce nucleotide-independent DNA binding |
SG11201809522WA (en) | 2016-04-29 | 2018-11-29 | Omniome Inc | Method of nucleic acid sequence determination |
JP6828140B2 (ja) | 2016-08-15 | 2021-02-10 | オムニオム インコーポレイテッドOmniome, Inc. | 核酸をシーケンシングするための方法及びシステム |
WO2018187013A1 (en) | 2017-04-04 | 2018-10-11 | Omniome, Inc. | Fluidic apparatus and methods useful for chemical and biological reactions |
US10731141B2 (en) | 2018-09-17 | 2020-08-04 | Omniome, Inc. | Engineered polymerases for improved sequencing |
-
2022
- 2022-05-09 CN CN202280048778.2A patent/CN117858959A/zh active Pending
- 2022-05-09 EP EP22729343.8A patent/EP4337789A1/en active Pending
- 2022-05-09 WO PCT/US2022/028367 patent/WO2022240766A1/en active Application Filing
- 2022-05-09 US US17/740,072 patent/US20220356515A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2022240766A1 (en) | 2022-11-17 |
US20220356515A1 (en) | 2022-11-10 |
EP4337789A1 (en) | 2024-03-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10597705B2 (en) | Enhanced ligation reactions | |
US8808989B1 (en) | Methods and apparatus for synthesizing nucleic acids | |
CN109486902B (zh) | 核酸扩增 | |
US11608528B2 (en) | Methods and compositions for sequencing double stranded nucleic acids using RCA and MDA | |
US20200032317A1 (en) | Serial formation of ternary complex species | |
US11180749B2 (en) | Allele-specific capture of nucleic acids | |
AU2019276719A1 (en) | Increased signal to noise in nucleic acid sequencing | |
US20230183682A1 (en) | Preparation of RNA and DNA Sequencing Libraries Using Bead-Linked Transposomes | |
US20220356519A1 (en) | Single-molecule seeding and amplification on a surface | |
CN117858959A (zh) | 滚环扩增期间的dna扩增缓冲液补充 | |
WO2020167574A1 (en) | Mitigating adverse impacts of detection systems on nucleic acids and other biological analytes | |
CN114599795A (zh) | 用于对核酸加帽的方法和组合物 | |
CN110177884A (zh) | 通过聚合酶结合进行的基因分型 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |