JP6828140B2 - 核酸をシーケンシングするための方法及びシステム - Google Patents
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Description
本出願は、2017年1月17日に出願された、米国仮出願第62/447,319号及び、2016年8月15日に出願された、同第62/375,379号の利益を主張する。これらの先願の開示は、参照によりこれらの全体において本明細書に組み込まれる。
本開示は、一般に、バイオテクノロジーの分野に関する。より特定すると、本開示は、核酸シーケンシング技術に関する。さらにより特定すると、本開示は、ヌクレオチドの組込みに依存せずに、次の適正なヌクレオチドを同定する、結合によるシーケンシング法に関する。
本明細書において、鋳型核酸の配列分子を決定するための方法であって、指定された条件下で実行される結合反応に基づく方法が提示される。この方法は、一般に、ヌクレオチドの組込みの前に、精査ステップを含む。精査ステップは、プライマーによりプライミングされた鋳型核酸分子を用意するステップ;プライミングされた鋳型核酸分子を、ポリメラーゼ及び少なくとも1つのヌクレオチド分子を含む第1の反応混合物と接触させるステップ;ヌクレオチド分子の存在下における、ポリメラーゼとプライミングされた鋳型核酸分子との、ヌクレオチド分子のプライミングされた鋳型核酸分子への化学的組込みを伴わない相互作用を、モニタリングするステップ;及びヌクレオチド分子の存在下においてモニタリングされた、ポリメラーゼとプライミングされた鋳型核酸分子との相互作用を使用して、鋳型核酸内の次の塩基を同定するステップを、含む。この手順では、三元複合体の安定化及び二元複合体の不安定化が、適正なヌクレオチドと不適正なヌクレオチドとの弁別を、有利に増強する。
核酸分子との相互作用を指し示すシグナルの強度を測定することを含み、ステップ(d)は、測定されたシグナルの強度が、所定の閾値を超える場合に、第1の反応混合物の、被験ヌクレオチドのうちの1つが、プライミングされた鋳型核酸分子の、次の適正なヌクレオチドであることを決定する。より好ましくは、ステップ(c)の後であり、かつ、ステップ(e)の前に、固定されたプライミングされた鋳型核酸分子を洗浄して、第1の反応混合物の成分のうちの少なくとも1つを除去する、さらなるステップが存在する。一般に好ましい別の実施形態に従い、ステップ(a)の、プライミングされた鋳型核酸分子は、フローセル内に含有された、固体支持体上の点において固定され、該方法は、ステップ(c)の後において、固定されたプライミングされた鋳型核酸分子を洗浄して、第1の反応混合物の、少なくとも1つの被験ヌクレオチドのうちの1つ以上を除去するステップ;及び洗浄ステップの後において、ポリメラーゼの、固定されたプライミングされた鋳型核酸分子との相互作用を検出して(例えば、モニタリングして)、ステップ(b)において形成されえた三元複合体のうちのいずれかが、依然として存在するのかどうかを決定するステップを、さらに含む。
本明細書において、プライミングされた鋳型核酸分子のヌクレオチド配列を決定するために使用されうる技法であって、配列内の次の適正なヌクレオチドの同定が、ヌクレオチドの組込みから完全に独立である技法が、開示される。より特定すると、開示された結合によるシーケンシング法は、三元複合体の形成及び検出に依拠して、次の適正なヌクレオチドを同定する。これは、組み込まれたヌクレオチドを同定することに依拠して配列情報を決定する、合成によるシーケンシング手順と、顕著に異なる。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書において使用される、全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。明確さのために述べると、以下の具体的用語は、指定された意味を有する。他の用語は、本明細書の、他の節において定義されている。
本明細書において、ポリメラーゼベースの、結合反応による核酸のシーケンシングであって、ポリメラーゼが、反応の個別のステップにおいて、オープンコンフォメーション及びクローズドコンフォメーションの間のコンフォメーション転移を受けるシーケンシングが、記載される。1つのステップにおいて、ポリメラーゼは、プライミングされた鋳型核酸に結合して、本明細書においてプレインサーションコンフォメーションともまた称される、二元複合体を形成する。後続のステップにおいて、新来のヌクレオチドが結合し、ポリメラーゼフィンガーが閉じ、ポリメラーゼとプライミングされた鋳型核酸とヌクレオチドとを含む、プレケミストリーコンフォメーションを形成するが、この場合、結合したヌクレオチドは組み込まれていない。本明細書において、精査ステップとも称されるこのステップに、化学的組込みステップが後続しうるが、この場合、ヌクレオチドからの共時的なピロリン酸の切断により、ホスホジエステル結合が形成される(ヌクレオチドの組込み)。ポリメラーゼとプライミングされた鋳型核酸と新たに組み込まれたヌクレオチドとは、ポストケミストリーコンフォメーションである、プレトランスレーションコンフォメーションをもたらす。プレケミストリーコンフォメーション及びプレトランスロケーションコンフォメーションのいずれも、ポリメラーゼとプライミングされた鋳型核酸とヌクレオチドとを含み、この場合、ポリメラーゼは閉じた状態にあるので、本明細書において、いずれのコンフォメーションも、三元複合体と称されうる。しかし、言及された三元複合体が必然的にプレケミストリーコンフォメーションにあるように、ホスホジエステル結合の形成が本明細書で記載された手法により回避されうることは、注目に値する。閉じた挿入前状態において、Mg2+のような、二価の触媒性金属イオンは、プライマー末端の3’−ヒドロキシルによる、ピロリン酸(PPi)の求核置換を含む、急速な化学的ステップを媒介する。PPiが放出されると、ポリメラーゼは開いた状態に戻り(ポストトランスロケーションステップ)、トランスロケーションが反応の次のラウンドを誘発する。三元複合体は、二価の触媒性金属イオン(例えば、Mg2+)の非存在下において形成されうるが、二価の金属イオンの存在下において、ヌクレオチドの化学的付加が活発である。Mg2+のような触媒性金属イオンが、低レベル又は欠損レベルであることは、緊密な三元複合体における、次の適正なヌクレオチドの非共有結合的(物理的)捕捉をもたらす傾向がある。この三元複合体は、安定化させた三元複合体又はトラップされた三元複合体と称されうる。上記で記載された、任意の反応ステップにおいて、ポリメラーゼの立体配置及び/又は核酸との相互作用は、核酸配列内の、次の適正な塩基を同定するように、精査ステップにおいてモニタリングされうる。組込みの前において、又はこの後において、反応条件は、ポリメラーゼを、プライミングされた鋳型核酸から解除するように変化させる場合があり、局所的な環境から、ポリメラーゼの結合を阻害する任意の試薬を除去するように再び変化させる場合がある。
精査ステップは、典型的に、以下のサブステップ:(1)プライミングされた鋳型核酸(すなわち、その3’末端において、任意選択的に、伸長をブロッキングされうるプライマーとハイブリダイズされた鋳型核酸分子)を用意するサブステップ;(2)プライミングされた鋳型核酸を、ポリメラーゼ及び少なくとも1つのヌクレオチドを含む反応混合物と接触させるサブステップ;(3)ヌクレオチドの存在下において、かつ、プライミングされた鋳型核酸へのヌクレオチドの化学的組込みを伴わずに、ポリメラーゼのプライミングされた鋳型核酸分子との相互作用をモニタリングするサブステップ;並びに(4)モニタリングされた相互作用から、鋳型核酸内の次の塩基のアイデンティティー(すなわち、次の適正なヌクレオチド)を決定するサブステップを、含む。任意選択的に、プライミングされた鋳型核酸分子を、ヌクレオチドに接触させる前に、ヌクレオチドの非存在下において、まず、ポリメラーゼと接触させうる。プライミングされた鋳型核酸のプライマーは、伸長可能なプライマーでありうる。被験ヌクレオチドの塩基が、プライミングされた鋳型核酸分子の次の塩基と相補的である場合に、プライミングされた鋳型核酸とポリメラーゼと被験ヌクレオチとドは、三元複合体を形成することが可能である。被験ヌクレオチドの塩基が、プライミングされた鋳型核酸分子の次の塩基と相補的ではない場合に、プライミングされた鋳型核酸とポリメラーゼとは、二元複合体を形成することが可能である。任意選択的に、接触させるサブステップは、二元複合体の形成より、三元複合体の形成に優先的な条件下において行われる。任意選択的に、三元複合体の形成に優先的な条件又は三元複合体を安定化させる条件は、(1)プライミングされた鋳型核酸分子のプライマーの3’ヌクレオチド上の、可逆性のターミネーター部分の存在;又は(2)非触媒性イオン(例えば、二価の非触媒性金属イオン)の存在により、もたらされる。任意選択的に、二元複合体の形成を優先しない条件又は二元複合体を不安定化させる条件は、精査ステップにおける、反応混合物中の1つ以上の一価のカチオン及び/又はグルタミン酸アニオンの存在によりもたらされる。決定するサブステップ又は同定するサブステップは、プライミングされた鋳型核酸の次の塩基と相補的なヌクレオチドの塩基を同定することを含みうる。任意選択的に、これは、三元複合体が選択的に維持されること又は解離することを可能とする異なるヌクレオチド組成を有する1つ以上の洗浄液と、三元複合体を接触させることを含む。
提示された方法において、プライミングされた鋳型核酸分子を、ポリメラーゼ及び1つ以上のヌクレオチド分子を含む反応混合物と接触させるステップは、好ましくは、三元複合体の形成を安定化させ、二元複合体の形成を不安定化させる条件下において行われる。これらの条件は、エンドユーザーによる選択の問題である、代替的な手法によりもたらされうる。
ヌクレオチド分子の存在下において、ポリメラーゼの、プライミングされた鋳型核酸分子との相互作用をモニタリング又は測定するステップは、多くの異なる方式で達せられうる。例えば、モニタリングするステップは、プライミングされた鋳型核酸とポリメラーゼと4つのヌクレオチド分子のうちのいずれか1つとの間の相互作用についての会合反応速度を測定することを含みうる。ヌクレオチド分子の存在下において、ポリメラーゼの、プライミングされた鋳型核酸分子との相互作用をモニタリングするステップは、ポリメラーゼとプライミングされた鋳型核酸分子との平衡結合定数(すなわち、4つのヌクレオチドのうちのいずれか1つの存在下における、鋳型核酸に対する、ポリメラーゼの平衡結合定数)を測定することを含みうる。したがって、例えば、モニタリングするステップは、4つのヌクレオチドのうちのいずれか1つの存在下において、プライミングされた鋳型核酸に対するポリメラーゼの平衡結合定数を測定することを含む。ヌクレオチド分子の存在下において、ポリメラーゼの、プライミングされた鋳型核酸分子との相互作用をモニタリングするステップは、4つのヌクレオチドのうちのいずれか1つの存在下において、ポリメラーゼの、プライミングされた鋳型核酸からの解離反応速度を測定することを含む。任意選択的に、ヌクレオチド分子の存在下において、ポリメラーゼの、プライミングされた鋳型核酸分子との相互作用をモニタリングするステップは、閉じた複合体の解離(すなわち、プライミングされた鋳型核酸とポリメラーゼと4つのヌクレオチド分子のうちのいずれか1つとの解離)についての解離反応速度を測定することを含む。任意選択的に、測定される会合反応速度は、ヌクレオチド分子のアイデンティティーに応じて異なる。任意選択的に、ポリメラーゼは、4種類のヌクレオチド分子の各々に対して、異なるアフィニティーを有する。任意選択的に、ポリメラーゼは、各種の三元複合体における、4種類のヌクレオチド分子の各々について、異なる解離定数を有する。会合反応速度、平衡反応速度及び解離反応速度は、公知であり、当業者によりたやすく決定されうる。例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれた、Markiewiczら、Nucleic Acids Research、40(16):7975〜84(2012);Xiaら、J.Am.Chem.Soc.135(1):193〜202(2013);Brownら、J.Nucleic Acids、Article ID 871939、11頁(2010);Washingtonら、Mol.Cell.Biol.24(2):936〜43(2004);Walsh及びBeuning、J.Nucleic Acids、Article ID 530963、17頁(2012);並びにRoettgerら、Biochemistry、47(37):9718〜9727(2008)を参照されたい。
次の適正な塩基又はヌクレオチドのアイデンティティーは、三元複合体の存在、形成及び/又は解離をモニタリングすることにより決定されうる。次の塩基のアイデンティティーは、プライマーの3’末端へ次の適正なヌクレオチドを化学的に組み込むことなく決定されうる。任意選択的に、次の塩基のアイデンティティーは、付加されるヌクレオチドの存在下において、プライミングされた核酸鋳型に対する、ポリメラーゼのアフィニティーをモニタリングすることにより決定される。任意選択的に、次の適正なヌクレオチドの存在下において、プライミングされた鋳型核酸に対するポリメラーゼのアフィニティーは、鋳型核酸上の、次の適正な塩基を決定するのに使用されうる。任意選択的に、不適正なヌクレオチドの存在下における、プライミングされた核酸鋳型に対するポリメラーゼのアフィニティーは、鋳型核酸上の、次の適正な塩基を決定するのに使用されうる。
本明細書で記載されたシーケンシング法は、任意選択的に、組込みステップを含む。組込みステップは、鋳型核酸に結合したプライマーの3’末端において、1つ以上のヌクレオチドを、化学的に組み込むことを含む。任意選択的に、1つ以上のヌクレオチドが、プライマーの3’末端に組み込まれる。好ましい実施形態では、単一のヌクレオチドだけが、プライマーの3’末端に組み込まれる。任意選択的に、同じ種類の複数のヌクレオチドが、プライマーの3’末端に組み込まれる。任意選択的に、異なる種類の複数のヌクレオチドが、プライマーの3’末端に組み込まれる。組み込まれるヌクレオチドは、代替的に、非標識化ヌクレオチドの場合もあり、可逆性のターミネーターヌクレオチドの場合もあり、検出可能に標識化されたヌクレオチド類似体の場合もある。ポリメラーゼは、ヌクレオチド組込みの後において、重合化開始部位から解離する場合もあり、組込みの後において、重合化開始部位に保持される場合もある。
核酸シーケンシング反応混合物、又は単に「反応混合物」は、典型的に、ポリメラーゼベースの核酸合成反応において一般に存在する試薬を含む。反応混合物中の試薬は、酵素(例えば、ポリメラーゼ)、dNTP、鋳型核酸、プライマー核酸、塩、緩衝液、低分子、共因子、金属及びイオンを含むがこれらに限定されない。イオンは、触媒性イオン、二価の触媒性イオン、非触媒性イオン、非共有結合的金属イオン又はこれらの組合せでありうる。反応混合物は、水溶液中においてイオン化して、一価のカチオンをもたらすNaCl、KCl、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、グルタミン酸カリウム、NH4Cl、又は(NH4HSO4)のような塩を含みうる。反応混合物は、Mg2+イオン又はMn2+イオン、Co2+イオン、Cd2+イオン又はBa2+イオンのようなイオンの供給源を含みうる。反応混合物は、スズ、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Fe(II)SO4若しくはNi2+又はプライミングされた鋳型核酸分子及びコグネイトのヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の形成を阻害することにより、三元複合体を安定化させる、他の二価の非触媒性金属カチオンを含みうる。
任意選択的に、精査ステップの三元複合体は、三元複合体の安定化を容易とする、天然ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体又は修飾ヌクレオチドを含む。任意選択的に、ヌクレオチド類似体は、窒素性塩基、五炭糖及びリン酸基を含み、この場合、ヌクレオチドの任意の成分は、修飾され、かつ/又は置きかえられうる。ヌクレオチド類似体は、組込み不可能なヌクレオチドでありうる。組込み不可能なヌクレオチドは、シーケンシング法の中の任意の時点において、組込み可能となるように修飾されうる。
開示された、結合によるシーケンシング法は、精査ステップの各サイクルにおいて、1つを超えるヌクレオチドを使用して実施されうる。例えば、単一の精査ステップは、任意選択的に、2つ、3つなお又は4つの異なるヌクレオチドを使用して行われうる。任意選択的に、ヌクレオチドの各々は、天然ヌクレオチド(すなわち、dATP、dGTP、dCTP、dTTP又はdUTP)のような、非標識化ヌクレオチドである。好ましくは、プライミングされた鋳型核酸分子は、ヌクレオチドの、プライミングされた鋳型核酸への組込みを伴わずに、逐次的に、複数の反応混合物と接触される。任意選択的に、異なる反応混合物の各々は、ポリメラーゼ及び2つ又は3つの異なるヌクレオチドの異なる組合せを含む。例えば、異なるヌクレオチドの各々(例えば、dATP、dGTP、dCTP及びdTTP)が、合計2回にわたり存在する、4つの異なる反応混合物が存在しうる。これは、例えば、ヌクレオチドの以下の4つの組合せ:(dATP及びdTTP)、(dATP及びdGTP)、(dTTP及びdCTP)及び(dGTP及びdCTP)を使用することにより達せられうる。代替的な組合せは、組合せ:(dGTP及びdCTP)、(dGTP及びdTTP)、(dATP及びdCTP)及び(dATP及びdTTP)である。さらに別の代替的な組合せは、組合せ:(dATP及びdGTP)、(dATP及びdCTP)、(dGTP及びdTTP)及び(dCTP及びdTTP)である。精査ステップは、2つの異なるヌクレオチドの、順次4つの組合せ(すなわち、第1の組合せは、第2の組合せにより置きかえられ、第2の組合せは、第3の組合せにより置きかえられ、第3の組合せは、第4の組合せにより置きかえられるように)を使用して行われうる。この場合及びポリメラーゼの、プライミングされた鋳型核酸との相互作用のモニタリングが、結合相互作用を確認するシグナルをもたらす場合、次の適正なヌクレオチドは、陽性の結合シグナルをもたらす、2つの異なるヌクレオチドの組合せに共通なヌクレオチドとして同定されうる。ヌクレオチドの組合せのコレクション間において、3回にわたり、異なるヌクレオチドの各々を表すことが所望される場合、例示的な組合せは、(dATP及びdTTP)、(dATP及びdGTP)、(dATP及びdCTP)、(dTTP及びdGTP)、(dTTP及びdCTP)及び(dGTP及びdCTP)でありうる。精査ステップは、2つの異なるヌクレオチドの、順次6つの組合せ(すなわち、第1の組合せは、第2の組合せにより置きかえられ、第2の組合せは、第3の組合せにより置きかえられ、第3の組合せは、第4の組合せにより置きかえられ、第4の組合せは、第5の組合せにより置きかえられ、第5の組合せは、第6の組合せにより置きかえられるように)を使用して行われうる。この場合及びポリメラーゼの、プライミングされた鋳型核酸との相互作用のモニタリングが、結合相互作用を確認するシグナルをもたらす場合、次の適正なヌクレオチドは、陽性の結合シグナルをもたらす、3つの異なるヌクレオチドの組合せに共通なヌクレオチドとして同定されうる。
開示された技法を実行するのに使用されうるポリメラーゼは、自然におけるポリメラーゼ並びに突然変異体、組換え体、融合体、遺伝子改変、化学修飾、合成体及び類似体を含むがこれらに限定されない、これらの任意の修飾されたバリエーションを含む。自然におけるポリメラーゼ及びこれらの修飾されたバリエーションは、重合化反応を触媒する能力を保持するポリメラーゼに限定されない。任意選択的に、自然における及び/又はこれらの修飾されたバリエーションは、重合化反応を触媒する能力を保持する。任意選択的に、自然における及び/又は修飾されたバリエーションは、DNAをシーケンシングするそれらの能力を増強する、特殊な特性であって、核酸に対する結合アフィニティーの増強、核酸に対する結合アフィニティーの低減、触媒速度の増強、触媒速度の低減などを含む特性を有する。突然変異体ポリメラーゼは、ポリメラーゼを含み、この場合、1つ以上のアミノ酸は、他のアミノ酸(自然における又は自然にはないアミノ酸)及び1つ以上のアミノ酸の挿入又は欠失により置きかえられる。
一態様において、開示された技法は、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを、固定された核酸の特徴の集団へと送達する方法であって、各特徴が、1つ以上の、プライミングされた鋳型核酸分子を含む方法に関する。方法は、固定された核酸の特徴の集団を、ポリメラーゼ、第1のヌクレオチド及び溶液中において遊離している、少なくとも1つの固定されていないプライミングされた鋳型核酸分子を含む第1の試薬と接触させるステップを含む。第1の試薬の第1のヌクレオチドは、第1の試薬の、固定されていないプライミングされた鋳型核酸分子のいずれについても、次の適正なヌクレオチドではない。同様に、接触させるステップは、三元複合体を安定化させ、ポリメラーゼによる、ホスホジエステル結合の形成の触媒を阻害又は回避する条件下において行われる。この手順により、第1の試薬の、固定されていないプライミングされた鋳型核酸分子の非存在下における、ポリメラーゼ及び第1のヌクレオチドを含む試薬の使用と比較して、二元複合体を形成するプライミングされた鋳型核酸分子へのヌクレオチド非依存性のポリメラーゼの結合は、低減される。技法についての一実施形態において、第1の試薬を、同じ種類の、第1の試薬のポリメラーゼと第2のヌクレオチドと溶液中において遊離している少なくとも1つの固定されていないプライミングされた鋳型核酸分子とを含む第2の試薬により置きかえる、さらなるステップが存在する。ここで、第1のヌクレオチドと、第2のヌクレオチドとは、互いと異なる。第2のヌクレオチドは、第2の試薬の、固定されていないプライミングされた鋳型核酸分子のいずれについても、コグネイトのヌクレオチドではない。同様に、置きかえるステップは、三元複合体を安定化させ、ポリメラーゼによる、ホスホジエステル結合の形成の触媒を阻害又は回避する条件下において行われる。この場合、第2の試薬の、固定されていないプライミングされた鋳型核酸分子の非存在下における、ポリメラーゼ及び第2のヌクレオチドを含む試薬の使用と比較して、二元複合体を形成するプライミングされた鋳型核酸分子へのヌクレオチド非依存性のポリメラーゼの結合は、低減される。任意選択的に、第1の試薬の、固定されていないプライミングされた鋳型核酸分子と、第2の試薬の、固定されていないプライミングされた鋳型核酸分子とは、互いと異なる。
三元複合体は、ポリメラーゼ阻害剤の精査反応混合物への添加により、形成されかつ/又は安定化しうる。阻害剤分子であるホスホノ酢酸塩(ホスホノ酢酸)及びホスホノギ酸塩(ホスホノギ酸、一般名:ホスカルネット)、スラミン、アミノグリコシド、INDOPY−1及びタゲチトキシンは、ポリメラーゼ活性に対する不競合的又は非競合的阻害剤の非限定的な例である。酵素の活性部位の近傍における阻害剤分子の結合は、ヌクレオチドの組込みサイクルのプレトランスロケーションステップ又はポストトランスロケーションステップにおいて、ポリメラーゼをトラップし、ヌクレオチドの組込みの前又は後において、その三元複合体コンフォメーションにおいて、ポリメラーゼを安定化させ、阻害剤分子が、除去、希釈又はキレート化により反応混合物中において利用可能でなくなるまで、ポリメラーゼを鋳型核酸に結合させる。
本明細書で使用された、三元複合体は、ポリメラーゼとプライミングされた鋳型核酸とヌクレオチドとを含む。三元複合体は、プレケミストリーコンフォメーションにありうるが、この場合、ヌクレオチドは、捕捉されているが、組み込まれていない。任意選択的に、三元複合体は、プライミングされた鋳型核酸分子のプライマーの3’ヌクレオチド上の化学的ブロック(例えば、ヌクレオチドの塩基上又は糖上の、可逆性のターミネーター部分)の存在により安定化させうる。三元複合体は、プレトランスロケーションコンフォメーションにありうるが、この場合、ヌクレオチドは、プライミングされた鋳型核酸内の、プライマーの3’末端とのホスホジエステル結合の形成により組み込まれる。三元複合体は、触媒性金属イオンの非存在下において、又は触媒性金属イオンの欠損レベル下において形成される可能性があり、これにより、化学的組込みを伴わずに、次の適正なヌクレオチドを、ポリメラーゼの活性部位内に物理的に捕捉する。任意選択的に、捕捉されたヌクレオチドは、組込み不可能なヌクレオチドでありうる。三元複合体は、触媒性金属イオンの存在下において形成され得、この場合、三元複合体は、組み込まれるヌクレオチド類似体を含むが、PPiは放出不能である。この場合、三元複合体は、プレトランスロケーションコンフォメーションにおいて安定化する。任意選択的に、プレトランスロケーションコンフォメーションは、ポリメラーゼを、化学的に架橋することにより安定化する。任意選択的に、三元複合体は、外部の手段により安定化させうる。場合によって、三元複合体は、低分子のアロステリック結合により安定化させうる。任意選択的に、三元複合体は、活性部位に、高アフィニティーにより、緊密に結合し、ポリメラーゼのトランスロケーションを防止するホスホノギ酸塩を含むがこれらに限定されないピロリン酸類似体により安定化させうる。
ヌクレオチドの存在下における、ポリメラーゼと鋳型核酸との間の相互作用は、タグ付けされた標識の使用を伴ってモニタリングされてもよく、これを用いずにモニタリングされてもよい。例えば、シーケンシング反応は、屈折率の変化の検出、電荷検出、ラマン散乱検出、偏光解析検出、pHの検出、サイズ検出、質量検出、表面プラズモン共鳴、導波モード共鳴、ナノ小孔光学的干渉法、ウィスパリングギャラリーモード共鳴、ナノ粒子散乱、光子結晶、石英結晶微量天秤、Biolayer干渉法、振動検出、圧力検出及び三元複合体内の、ポリメラーゼの、鋳型核酸との結合に起因する質量又は屈折率の付加を検出する、他の無標識検出スキームによりモニタリングされうる。
提示された方法は、プラットフォーム上において実施されうるが、この場合、核酸重合化反応の任意の成分は、表面へと局在化される。任意選択的に、鋳型核酸は、平面基質、ナノホールアレイ、マイクロ粒子又はナノ粒子へと接合される。任意選択的に、全ての反応成分は、反応混合物中に、遊離して懸濁される。
三元複合体の形成を介して、次の塩基のアイデンティティーが同定された精査ステップに続き、反応条件は、適宜、任意選択の組込みステップ又はさらなる精査ステップのための調製物中において、リセット、リチャージ又は修飾されてもよい。任意選択的に、次の塩基のアイデンティティーは、ヌクレオチドを化学的に組み込まずに同定されている。任意選択的に、次の塩基のアイデンティティーは、ヌクレオチドの化学的組込みにより同定されるが、この場合、後続のヌクレオチドの組込みは、阻害されている。任意選択的に、シーケンシングされる鋳型核酸を除く、精査ステップの全ての成分は、除去されるか又は洗い流されて、システムを、精査前の状態に戻す。任意選択的に、精査ステップの一部の成分は、除去される。任意選択的に、さらなる成分が、精査ステップへと添加される。
結合ステップにおいて、マグネシウムを用いるか又は用いない塩基配列の決定
手順において使用された材料及び方法は、以下の通りであった。ポリメラーゼ緩衝液:20mMのトリス、pH 8.0、300mMのNaCl、5mMのDTT、100μMのdNTP、150nMのクレノウ、0.01%のBSA、0.02%のTween−20、10mMのMgCl2。精査緩衝液:20mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、300mMのNaCl、5mMのDTT、100μMのdNTP、150nMのクレノウ、0.01%のBSA、0.02%のTween−20。組込み緩衝液:20mMのトリス緩衝液(pH 8)、300mMのNaCl、5mMのDTT、0.01%のBSA、0.02%のTween−20、10mMのMgCl2。洗浄緩衝液:20mMのトリス緩衝液(pH 8)、300mMのNaCl、5mMのDTT、0.01%のBSA、0.02%のTween−20。
Bst酵素の結合反応速度を使用するシーケンシング
手順において使用された材料及び方法は、以下の通りであった。FORTEBIO(登録商標)(Menlo Park、CA)Octet測定器(Red384又はQK)は、Biolayer干渉法を使用して、光ファイバーチップの表面における結合反応を測定する。チップは、ストレプトアビジン(SA)により機能化して、鋳型の3’末端近傍の配列と相補的なプライマーとハイブリダイズした、5’ビオチン標識化DNA鋳型への結合を可能とした。phiX_matchC及びphiX_matchAを、個々のチップへとロードした。0.01〜0.02%のBSA及び0.01〜0.02%のTween−20を含有する1〜2倍濃度のPBS(ローディング緩衝液)中100〜500nMの間のプライマー−鋳型を、チップへとロードした。FP2プライマーは、鋳型に対して、1.25〜2倍の過剰量であった。ローディングは、シグナルの変化によりモニタリングしたが、通例、30℃において、5分以内にプラトーに達した。チップを、ローディング緩衝液中に、1〜5分間にわたり浸漬して、結合しなかったDNA材料を除去した。塩基判定のために、チップを、典型的に、0.01〜0.02%のBSA及び0.01〜0.02%のTween−20(LS緩衝液)、100nMのポリメラーゼ酵素、100μMのヌクレオチド及び50〜300mMにおいて濃度を変化させる、さらなるNaClを補充した、1倍濃度のTaq緩衝液(25℃の10mMのトリス−HCl(pH 8.3)、50mMのKCl、マグネシウム非含有)を含有する溶液中に浸漬した。この実験では、適正な塩基を決定するために、30nMのBst2.0酵素、100μMのdNTP及び150mMのNaClを含有するLS緩衝液を使用した。phiX_matchC二重鎖は、三元複合体を形成し、適正な次のヌクレオチド(コグネイト)が提示されるため、結合シグナルの増大を示す。phiX_matchAは、不適正な(非コグネイト)であるため、結合シグナルの増大を示さない。精査ステップの後、センサーを、5mMのMg2+を含有するLS緩衝液中に浸漬して、ポリメラーゼが、ヌクレオチドを組み込むことを可能とするのに続き、150mMのNaClを含有するLS緩衝液により洗浄した。
結合によるシーケンシング
手順において使用された材料及び方法は、以下の通りであった。この場合に使用された結合/精査緩衝液は、250mMのNaCl、100μMのdGTP、dCTP、dATP、又はdTTP、1.5mMのSr2+、100nMのクレノウexo(−)ポリメラーゼを有するLS緩衝液であった。組込み緩衝液は、50mMのNaCl、50mMのMgCl2を含むLS緩衝液であり、洗浄緩衝液は、250mMのNaClを含むLS緩衝液であった。FORTEBIO(登録商標)Octet Red384システム(Menlo Park、CA)を使用して、SAセンサーチップへと接合させた、ビオチンphiX_matchC鋳型及びFP2プライマー配列を使用するシーケンシングサイクルを実施した。シーケンシングステップは、以下:(a)dATPによる精査、(b)組込み、(c)洗浄;(d)dGTPによる精査、(e)組込み、(f)洗浄;(g)dCTPによる精査、(h)組込み、(i)洗浄;(j)dTTPによる精査、(k)組込み、(l)洗浄に続く、(a)以降のこれらのステップの反復からなった。塩基判定のために、精査ステップは、前の洗浄ステップに由来するベースラインを上回る、検出可能なシグナル及び/又は対照配列と比べた、検出可能なシグナルをもたらした。
マッチ/ミスマッチ塩基の弁別に対する塩濃度の効果
手順において使用された材料及び方法は、以下の通りであった。phiX_matchC及びphiX_matchAを、個々のチップへとロードした。0.01〜0.02%のBSA及び0.01〜0.02%のTween−20を含有する1〜2倍濃度のPBS(ローディング緩衝液)中100〜500nMの間のプライマー−鋳型を、チップへとロードした。FP2プライマーは、鋳型に対して、1.25〜2倍の過剰量であった。ローディングは、シグナルの変化によりモニタリングしたが、通例、30℃において、5分以内にプラトーに達した。チップを、ローディング緩衝液中に、1〜5分間にわたり浸漬して、結合しなかったDNA材料を除去した。塩基判定のために、チップを、典型的に、0.01〜0.02%のBSA及び0.01〜0.02%のTween−20(LS緩衝液)、100nMのポリメラーゼ酵素、100μMのdNTP及び50〜300mMにおいて濃度を変化させる、さらなるNaClを補充した、1倍濃度のTaq緩衝液(25℃の10mMのトリス−HCl、50mMのKCl、pH 8.3、マグネシウム非含有)を含有する溶液中に浸漬した。phiX_matchC二重鎖は、三元複合体を形成し、適正な次のヌクレオチド(コグネイト)が提示されるため、結合シグナルの増大を示す。phiX_matchAは、不適正な(非コグネイト)ヌクレオチドであるため、結合シグナルの増大を引き起こさない。
解離/洗浄ステップにおける塩基の弁別
手順において使用された材料及び方法は、以下の通りであった。この実験では、phiX_matchC及びFP2プライマーを、上記で記載した通り、SAセンサーチップへとロードした。ポリメラーゼ複合体を、100μMのdGTP、dCTP、dATP又はdTTP及び100nMのクレノウ又はBst2.0酵素及び1mMのSrCl2を含むLS緩衝液中において形成した。
洗浄緩衝液中の、核酸:ポリメラーゼ複合体の安定化
ホモポリマー領域内の複数の組込みの可能性を最小化するために、洗浄ステップを、組込みの前に実施することができる。カルシウム及びストロンチウムのような金属カチオンは、ポリメラーゼ複合体を安定化させうる(マグネシウムと同様に)が、ヌクレオチドの組込みを生じる、ホスホジエステル結合の触媒を支援できない。この実験では、濃度を変動させるSrCl2(0mM〜14mM)を、洗浄緩衝液(LS緩衝液)へと添加した。ポリメラーゼ複合体は、洗浄緩衝液中に3.5mMという低濃度のSr2+イオン(最低濃度)の存在下においても、はるかにより安定的であった。さらに、結合ステップにおいて、適正なヌクレオチド又は不適正なヌクレオチドが存在した場合も、複合体の安定性がそれほど効果を受けなかったことから、Sr2+に関連する、ポリメラーゼの安定性が、三元複合体に限定されなかったことが示される。結果を、図5に示す。
3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を伴わないDNA pol Iの使用
手順において使用された材料及び方法は、以下の通りであった。3’末端のミスマッチを含むプライマーを、フレイド(frayed)末端又はフラップ構築物を創出する鋳型とハイブリダイズさせた。クレノウexo(−)ポリメラーゼは、この末端を伸長させることができない。しかし、DNA pol Iの大型断片は、エキソヌクレアーゼ活性を有し、ミスマッチ塩基を除去しうる。除去されると、プライマーは、通常、クレノウexo(−)ポリメラーゼ又はDNAポリメラーゼにより伸長させることができる。シーケンシングのために、固定されたフラップ構造を有する2つのセンサーを、DNAポリメラーゼ又はクレノウexo(−)へと曝露した。次いで、センサーを、適正な順序において、鋳型配列へと曝露した。DNAポリメラーゼのセンサーが塩基を付加することが可能であるのに対し、クレノウ断片のセンサーは、フラップ構造のために、塩基を付加することが不可能であった。DNAポリメラーゼの3’−5’exo活性は、塩基の添加を、配列と同期させない。
HIV逆転写酵素(RT)並びに非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NNRTI)である、化合物7及び18を使用するシーケンシング
手順において使用された材料及び方法は、以下の通りであった。3’反転dTを含む鋳型オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509SのDNA配列は、ビオチン−5’−GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGCTGGAGCTCATGGCGGG−3’−(3’−dT−5’)(配列番号9)であった。プライマーオリゴヌクレオチドである4496−4509ASのDNA配列は、5’−CCCGCCATGAGCTC−3’(配列番号10)であった。鋳型オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509S及びプライマーオリゴヌクレオチドである4496−4509ASは、Integrated DNA Technologies(Coralville、IA)により、合成及び解析された(液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)及びエレクトロスプレーイオン化(ESI))。オリゴヌクレオチドを、TE緩衝液(10mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、0.1mMのEDTA)中において、100μMへと調製した。プライマー及び鋳型オリゴヌクレオチドを、アニーリング緩衝液(10mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、0.1mMのEDTA、80mMのKCl)を含有する試験管中において(各鎖10μMずつ)組み合わせた。プライマー−鋳型溶液を含有する試験管を、乾燥ヒートブロックへとロードし(95℃5分間にわたり)、ブロックを、ベンチトップへと移して、周囲温度へと、徐々に冷却することにより、鎖をアニールさせた。不競合的NNRTI化合物(参照によりその全体において本明細書に組み込まれた、Pittaら、J.Enzyme Inhib.Med.Chem.、28(10):113〜22(2013))は、Epigen Biosciences,Inc. (San Diego、CA)製であった。NNRTI化合物7(3−4−クロロ−ベンゾ[d]チアゾール−2−イル)−2−(2−クロロ−6−フルオロフェニル)チアゾリジン−4−オン)及び18(3−(6−エトキシ−ベンゾ[d]チアゾール−2−イル)−2−(2−クロロ−6−フルオロフェニル)チアゾリジン−4−オン)を、それぞれ、ジメチルスルホキシド(DMSO)中、25.0mM及び15.0mMの濃度へと溶解させた。組換え精製HIV逆転写酵素(HIV RT)は、Worthington Biochemical Corp(Lakewood、NJ)製であった。超高純度ウシ血清アルブミン(BSA)は、Ambion(Foster City、CA)製であった。全ての試薬及び溶液は、分子生物学グレードであった。プライマー−鋳型二重鎖を、アニーリング緩衝液へと希釈した(100nM)。使用の直前に、HIV逆転写酵素を、酵素希釈液(50mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、8mMのMgCl2)へとあらかじめ希釈した。結合緩衝液は、50mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、160mMのKCl、0.5mMのEDTA、11mMのMgCl2、0.3%(v/v)のTriton X−100、5.3mMのジチオトレイトール(DTT)、100μg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)、100μMのdNTP(dATP、dTTP、dGTP又はdCTP)、100nMのHIV RTであった。NNRTI化合物を、結合緩衝液へとスパイクする直前に、DMSOによりあらかじめ希釈した。反応緩衝液は、NNRTI、dNTP又はHIV RT酵素を伴わない結合緩衝液であった。プライマー−鋳型(PT)を含有する緩衝液、PT洗浄緩衝液、1つのdNTPを含有する結合緩衝液及び反応緩衝液を、Greiner 96−well black microplate(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;型番M9685)へとロードした(ウェル1つ当たり200μL)。ストレプトアビジン(SA)バイオセンサー(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA;型番18−5019)を、使用の前に、約10分間にわたり、アニーリング緩衝液中において再水和させた。Octet QKバイオセンサーシステム(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA)を、30℃の作動のために設定し、プライマー−鋳型によりバイオセンサーをコーティングし、PT洗浄緩衝液により結合しなかったプライマー−鋳型を洗い流すようにプログラムした。バイオセンサーを、HIV RT及びdCTP±NNRTIを含有する結合緩衝液(会合相)へと移し、続いて、反応緩衝液へと移した(dCTPの組込み及び解離相)。同様に、バイオセンサーを、表示の通り、循環的に、個々のデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dATP、dGTP、dCTP又はdTTP)を含有する溶液へと移した。結合及び組込みのサイクルを、複数回反復した。提示のために、Octet干渉法測定器により生成されたモニタリングデータを、Microsoft Excel及びPrismソフトウェア(GraphPad Software、San Diego、CA)へとインポートした。結合反応及び解離反応の進行を、19.4秒間の時間窓内において平均することにより、又はPrismソフトウェア(19.4秒間の時間窓及び6次の平滑化多項式)により平滑化した。
表面プラズモン共鳴(SPR)イメージングバイオセンサー上の、DNAシーケンシング
手順において使用された材料及び方法は、以下の通りであった。SPRセンサーチップ:20mm×20mm×1mmの高屈折率(1.61)スライド(NanoSPR、Chicago、IL)。アルカンチオール、PEG6:モノチオアルカン(C11)PEG6−OH(11−メルカプトウンデシルヘキサエチレングリコール(型番:SPT−0011P6);及びBAT:ビオチニル化アルカンPEGチオール(型番:SPT−0012D)は、Sensopath technologies(Bozeman、MT)から得た。塩基緩衝液(洗浄):300mMのKCl、20mMのトリスHCl(pH 8.0)、0.01%のTween−20、1mMのSrCl2。精査緩衝液:塩基緩衝液+50nMのクレノウ断片及び100nMのdNTP。組込み緩衝液:塩基緩衝液+10mMのMgCl2。実験の前に、金コーティングされたSPRスライドを、18%のBATの、82%のPEG6との混合SAMであって、1×10−4Mの、100%のEtOH中最終組合せ濃度へと希釈された混合SAMによりコーティングした。SPRスライドを、アルカンチオール溶液中、室温において、一晩にわたりインキュベートした。インキュベーションの後において、SPRスライドを、未使用の100%のEtOH中に続き、脱塩水中50%のEtOH中及び脱塩水中においてすすいだ。次いで、スライドを、空気中において乾燥させた。スライドを、流体の制御、画像の収集及びデータの定量化をもたらす、特注のSPRイメージングシステム上に載せた。塩基緩衝液中10μg/mlのストレプトアビジンを含有する溶液を、フローセルへと注入した。結果として得られるストレプトアビジン層の結合を、SPRチップから反射される光の変化を約180秒間にわたり測定することにより、モニタリングした。これに続き、過剰量の塩基緩衝液により洗浄した。次いで、あらかじめハイブリダイズさせたプライマーFP2/phiX_matchA鋳型DNAをフローセルへと注入し、約180秒間にわたり、ストレプトアビジン層へ結合させるのに続き、過剰量の塩基緩衝液により洗浄した。シーケンシングのために、50nMのクレノウ断片を含有する溶液は、100nMのdATP、dCTP、dTTP又はdGTPを含む塩基緩衝液中において調製した。dNTP溶液を、フローセルへと、個別に(G、A、A、T、C、Gの順序において)注入し、SPRi応答について精査するために、約180秒間にわたりインキュベートした。シグナルの変化が見られない/小さい場合、フローセルを、過剰量の塩基緩衝液により洗浄した。SPRシグナルが塩基のマッチを示した場合、フローセルを、組込み緩衝液(10mMのMg2+を含有する)により30秒間にわたり洗浄して、適正なdNTPを組み込ませ、続いて、塩基緩衝液により洗浄した。精査ステップ、組込みステップ及び洗浄ステップを反復した。
ニックトランスレーションによる、二本鎖DNAのシーケンシング
手順において使用された材料及び方法は、以下の通りであった。3’反転dTのDNA配列を有する鋳型オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509Sは、ビオチン−5’−GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGCTGGAGCTCATGGCGGG−3’−(3’−dT−5’)(配列番号9)であった。プライマーオリゴヌクレオチドである4496−4509ASのDNA配列は、5’−CCCGCCATGAGCTC−3’(配列番号10)であった。オリゴヌクレオチドである4460−4494ASのDNA配列は、5’−AGCAGGATGAACCGGG/i5NitInd/CAGGGATTGCAGGCTCAC−3’(配列番号11)[配列中、「/i5NitInd/」は、5−ニトロインドール−2’デオキシリボース残基である。]であった。この文脈において、5−ニトロインドールは、グアニンテトラッドの形成を防止し、ユニバーサル塩基として用いられることが意図される。オリゴヌクレオチドを、TE緩衝液(10mMのトリスpH 8.0、0.1mMのEDTA)において、100μMに調製した。ssDNAプライマー/鋳型を調製するために、オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509S及び4496−4509ASを、アニーリング緩衝液(10mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、0.1mMのEDTA、80mMのKCl)を含有する試験管中において(各鎖10μMずつ)組み合わせた。1塩基対のギャップを含むdsDNAプライマー/鋳型を調製するために、オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509S、4496−4509AS及び4460−4494ASを、アニーリング緩衝液を含有する試験管中において(各鎖10μMずつ)組み合わせた。オリゴヌクレオチド溶液を含有する試験管を、乾燥ヒートブロックにロードし(95℃5分間にわたり)、ブロックを、ベンチトップへと移して、周囲温度へと徐々に冷却することにより、鎖をアニールさせた。バチルス・ステアロテルモフィルスによりコードされた全長DNAポリメラーゼ(エシェリキア・コリー(Escherichia coli)から精製された組換え酵素である「Bst DNAポリメラーゼ」)を、New England Biolabs(Ipswich、MA;型番M0328L)から購入した。超高純度ウシ血清アルブミン(BSA)を、Ambion(Foster City、CA)から購入した。全ての試薬及び溶液は、分子生物学グレードであった。プライマー−鋳型二重鎖を、アニーリング緩衝液に希釈した(100μM)。結合緩衝液は、50mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、300mMのKCl、0.1%(v/v)のTriton−X100、100μg/mLのウシ血清アルブミンであった。反応緩衝液は、10mMのMgCl2を含有する結合緩衝液であった。プライマー−鋳型(PT)を含有する緩衝液、1つのdNTPを含有する結合緩衝液及び反応緩衝液を、Greiner 96−well black microplate(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;型番M9685)へとロードし(ウェル1つ当たり200μL)、PCR−grade mineral oil(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;型番M8662)を適用した(ウェル1つ当たり75μL)。ストレプトアビジン(SA)バイオセンサー(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA;型番18−5019)を、使用の前に約10分間にわたり、アニーリング緩衝液中において再水和させた。Octet QKバイオセンサーシステム(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA)を、30℃の作動のために設定し、プライマー−鋳型によりバイオセンサーをコーティングし、結合緩衝液により結合しなかったプライマー−鋳型を洗い流すようにプログラムした。バイオセンサーを、表示の通り、1mL当たり136単位のBst DNAポリメラーゼ及び200μMのdNTP(dATP、dTTP、dGTP又はdCTP)を含有する結合緩衝液(会合相)に移し、続いて、dNTPの組込みのために反応緩衝液に移した。バイオセンサーを、dNTPを含まずBst DNAポリメラーゼ(1mL当たり136単位)を含有する反応緩衝液に移して、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を介するニックトランスレーションを促進した。バイオセンサーを、酵素又はマグネシウムを伴わない反応緩衝液に移した(解離相)。同様に、バイオセンサーを、表示の通り、循環的に、個々のデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dATP、dGTP、dCTP又はdTTP)を含有する溶液へと移した。結合及び組込み並びに5’−3’エキソヌクレアーゼによる切断のサイクルを、複数回にわたり反復して、シーケンシングについて評価した。提示のために、Octet干渉法測定器により生成されたモニタリングデータを、Microsoft Excel及びPrismソフトウェア(GraphPad Software、San Diego、CA)へとインポートした。
鎖置換による、二本鎖DNAのシーケンシング
手順において使用された材料及び方法は、以下の通りであった。3’反転dTを含む鋳型オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509SのDNA配列は、ビオチン−5’−GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGCTGGAGCTCATGGCGGG−3’−(3’−dT−5’)(配列番号9)であった。プライマーオリゴヌクレオチドである4496−4509ASのDNA配列は、5’−CCCGCCATGAGCTC−3’(配列番号10)であった。オリゴヌクレオチドである4460−4494ASのDNA配列は、5’−AGCAGGATGAACCGGG/i5NitInd/CAGGGATTGCAGGCTCAC−3’(配列番号11)[配列中、「/i5NitInd/」は、5−ニトロインドール−2’デオキシリボース残基である。]であった。この文脈において、5−ニトロインドールは、グアニンテトラッドの形成を防止し、ユニバーサル塩基として用いられることが意図される。オリゴヌクレオチドである4460−4494AS−T8のDNA配列は、5’−TTTTTTTTAGCAGGATGAACCGGG/i5NitInd/CAGGGATTGCAGGCTCAC−3’(配列番号12)[配列中、「/i5NitInd/」は、5−ニトロインドール−2’デオキシリボース残基である。]であった。この文脈において、5−ニトロインドールは、グアニンテトラッドの形成を防止し、ユニバーサル塩基として用いられることが意図される。オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509S、4460−4494AS、4496−4509AS及び4460−4494AS−T8は、Integrated DNA Technologies(Coralville、IA)により、合成及び解析された(液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)及びエレクトロスプレーイオン化(ESI))。オリゴヌクレオチドは、TE緩衝液(10mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、0.1mMのEDTA)中において、100μMへと調製した。ssDNAプライマー/鋳型を調製するために、オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509S及び4496−4509ASを、アニーリング緩衝液(10mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、0.1mMのEDTA、80mMのKCl)を含有する試験管中において(各鎖10μMずつ)組み合わせた。1塩基のギャップを含むdsDNAプライマー/鋳型を調製するために、オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509S、4496−4509AS及び4460−4494ASを、アニーリング緩衝液を含有する試験管中において(各鎖10μMずつ)組み合わせた。5’オリゴdTフラップ及び1塩基のギャップを含むdsDNAプライマー/鋳型を調製するために、オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509S、4496−4509AS及び4460−4494−AS−T8を、アニーリング緩衝液を含有する試験管中において(各鎖10μMずつ)組み合わせた。オリゴヌクレオチド溶液を含有する試験管を、乾燥ヒートブロックへとロードし(95℃5分間にわたり)、ブロックを、ベンチトップへと移して、周囲温度へと、徐々に冷却することにより、鎖をアニールさせた。E.コリーDNAポリメラーゼのクレノウ(3’→5’exo(−))断片は、Enzymatics(Beverly、MA;型番P7010−LC−L)から購入した。超高純度ウシ血清アルブミン(BSA)は、Ambion(Foster City、CA)から購入した。全ての試薬及び溶液は、分子生物学グレードであった。プライマー−鋳型二重鎖を、アニーリング緩衝液へと希釈した(50nM)。結合緩衝液は、20mMのトリス、pH 8.0、300mMのKCl、0.01%(v/v)のTween−20、100μg/mLのウシ血清アルブミン、1.0mMのジチオトレイトールであった。反応緩衝液は、50mMのKCl及び10mMのMgCl2を含有する結合緩衝液であった。プライマー−鋳型(PT)を含有する緩衝液、1つのdNTPを含有する結合緩衝液及び反応緩衝液を、Greiner 96−well black microplate(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;型番M9685)へとロードし(ウェル1つ当たり200μL)、PCR−grade mineral oil(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;型番M8662)を適用した(ウェル1つ当たり75μL)。ストレプトアビジン(SA)バイオセンサー(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA;型番18−5019)を、使用の前に、約10分間にわたり、アニーリング緩衝液中において再水和させた。Octet QKバイオセンサーシステム(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA)を、30℃の作動のために設定し、プライマー−鋳型によりバイオセンサーをコーティングし、結合緩衝液により結合しなかったプライマー−鋳型を洗い流すようにプログラムした。バイオセンサーを、表示の通り、クレノウexo(−)(1mL当たり68単位)及び100μMのdNTP(dATP、dTTP、dGTP又はdCTP)を含有する結合緩衝液(会合相)へと移し、続いて、dNTPの組込みのために反応緩衝液へと移した。バイオセンサーを、酵素又はマグネシウムを含まない反応緩衝液へと移した(解離相)。同様に、バイオセンサーを、表示の通り、循環的に個々のデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dATP、dGTP、dCTP又はdTTP)を含有する溶液へと移した。結合及び組込みのサイクルを、複数回にわたり反復して、シーケンシングについて評価した。提示のために、Octet干渉法測定器により生成されたモニタリングデータを、Microsoft Excel及びPrismソフトウェア(GraphPad Software、San Diego、CA)へとインポートした。
一本鎖DNAシーケンシングに対する、アニオンの効果
ssDNAプライマー/鋳型を調製するために、オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509S(配列番号9)及び4496−4509AS(配列番号10)を、アニーリング緩衝液(10mMのトリスpH 8.0、0.1mMのEDTA、80mMのKCl)を含有する試験管中において(各鎖10μMずつ)組み合わせた。オリゴヌクレオチド溶液を含有する試験管を、乾燥ヒートブロックへとロードし(95℃5分間にわたり)、ブロックを、ベンチトップへと移して、周囲温度へと、徐々に冷却することにより、鎖をアニールさせた。E.コリーDNAポリメラーゼのクレノウ(3’→5’exo(−))断片を、Enzymatics(Beverly、MA;型番P7010−LC−L)から購入した。グルタミン酸カリウムを、(Teknova、Hollister、CA;型番P2000)から購入した。超高純度ウシ血清アルブミン(BSA)を、Ambion(Foster City、CA)から購入した。全ての試薬及び溶液は、分子生物学グレードであった。結合緩衝液は、20mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、300mMのKCl、0.01%(v/v)のTween−20、100μg/mLのウシ血清アルブミン、1.0mMのジチオトレイトールであった。反応緩衝液は、50mMのKCl及び10mMのMgCl2を含有する結合緩衝液であった。試験した各レベルのグルタミン酸カリウムについて、0、50、100又は200mMのグルタミン酸カリウムを含有するように、結合緩衝液を調製した。反応緩衝液は、グルタミン酸カリウムを含有しなかった。Octet QKバイオセンサーシステムを、実施例11において記載された通りに設定し、バイオセンサーを、表示の通り、クレノウexo(−)(1mL当たり68単位)及び100μMのdNTP(dATP、dTTP、dGTP又はdCTP)を含有する結合緩衝液(会合相)へと移し、続いて、dNTPの組込みのために反応緩衝液へと移した。バイオセンサーを、酵素を含まずマグネシウムを含有する反応緩衝液へと移した(解離相)。バイオセンサーを、酵素又はdNTPを含まずそれぞれの濃度のグルタミン酸カリウムを含有する結合緩衝液へと移して、再平衡化させた。同様に、バイオセンサーを、表示の通り、循環的に、個々のデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dATP、dGTP、dCTP又はdTTP)を含有する溶液へと移した。結合及び組込みのサイクルを、複数回にわたり反復して、シーケンシングについて評価した。提示のために、Octet干渉法測定器により生成されたモニタリングデータを、Microsoft Excel及びPrismソフトウェア(GraphPad Software、San Diego、CA)へとインポートした。
一本鎖DNA及び二本鎖5’フラップDNAをシーケンシングすることによる、野生型バックグラウンド内の点突然変異の検出
手順において使用された材料及び方法は、以下の通りであった。3’反転dTを含む鋳型オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509SのDNA配列は、ビオチン−5’−GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGCTGGAGCTCATGGCGGG−3’−(3’−dT−5’)(配列番号9)であった。3’反転dTのDNA配列を含む鋳型オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509SC4493Aは、ビオチン−5’−GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGATGGAGCTCATGGCGGG−3’−(3’−dT−5’)(配列番号21)であった。プライマーオリゴヌクレオチドである4496−4509ASのDNA配列は、5’−CCCGCCATGAGCTC−3’(配列番号10)であった。オリゴヌクレオチドである4460−4494AS−T8のDNA配列は、5’−TTTTTTTTAGCAGGATGAACCGGG/i5NitInd/CAGGGATTGCAGGCTCAC−3’(配列番号12)[配列中、「/i5NitInd/」は、5−ニトロインドール−2’デオキシリボース残基である。]であった。この文脈において、5−ニトロインドールは、グアニンテトラッドの形成を防止し、ユニバーサル塩基として用いられることが意図される。オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509S、Btn−4460−4509S C4493A、4496−4509AS及び4460−4494AS−T8は、Integrated DNA Technologies(Coralville、IA)により、合成及び解析された(液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)及びエレクトロスプレーイオン化(ESI))。オリゴヌクレオチドは、TE緩衝液(10mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、0.1mMのEDTA)中において、100μMへと調製した。ssDNAプライマー/鋳型を調製するために、オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509S(又はC4493A)及び4496−4509ASを、アニーリング緩衝液(10mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、0.1mMのEDTA、80mMのKCl)を含有する試験管中において(各鎖10μMずつ)組み合わせた。5’オリゴdTフラップ及び1塩基のギャップを含むdsDNAプライマー/鋳型を調製するために、オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509S(又はC4493A)、4496−4509AS及び4460−4494−AS−T8を、アニーリング緩衝液を含有する試験管中において(各鎖10μMずつ)組み合わせた。オリゴヌクレオチド溶液を含有する試験管を、乾燥ヒートブロックへとロードし(95℃5分間にわたり)、ブロックを、ベンチトップへと移して、周囲温度へと徐々に冷却することにより、鎖をアニールさせた。E.コリーDNAポリメラーゼのクレノウ(3’→5’exo(−))断片を、Enzymatics(Beverly、MA;型番P7010−LC−L)から購入した。超高純度ウシ血清アルブミン(BSA)及びUltraPure Salmon Sperm DNA Solutionを、Life Technologies(Foster City、CA)から購入した。硫酸ニッケル(II)六水和物(型番467901)、dCDP、dGDP及びdTDPを、Sigma(St.Louis、MO)から購入した。全ての試薬及び溶液は、分子生物学グレードであった。プライマー−鋳型二重鎖を、アニーリング緩衝液へと希釈した(50nM)。洗浄緩衝液は、20mMのトリス、pH 8.0、200mMのKCl、200mMのグルタミン酸カリウム、0.01%(v/v)のTween−20、100μg/mLのウシ血清アルブミン、1.0mMのジチオトレイトールであった。結合緩衝液は、2.0mMのNi(II)SO4を含有する洗浄緩衝液であった。反応緩衝液は、20mMのトリス、pH 8.0、50mMのKCl、MgCl2(10mM)、0.01%(v/v)のTween−20、100μg/mLのウシ血清アルブミン、1.0mMのジチオトレイトールであった。EDTA洗浄緩衝液は、100μMのEDTAを含有する結合緩衝液であった。プライマー−鋳型(PT)を含有する緩衝液、1つのdNTPを含有する結合緩衝液及び反応緩衝液を、Greiner 96−well black microplate(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;型番M9685)へとロードし(ウェル1つ当たり200μL)、PCR−grade mineral oil(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;型番M8662)を適用した(ウェル1つ当たり75μL)。高精度ストレプトアビジンバイオセンサー(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA;型番18−5117)を、使用の前に、約10分間にわたり、アニーリング緩衝液中において再水和させた。Octet QKバイオセンサーシステム(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA)を、30℃の作動のために設定し、プライマー−鋳型によりバイオセンサーをコーティングし、洗浄緩衝液により結合しなかったプライマー−鋳型を洗い流すようにプログラムした。バイオセンサーを、表示の通り、クレノウexo(−)(1mL当たり68単位)、Ni(II)SO4(1.5mM)及び100μMのdNTP(dATP、dTTP、dGTP又はdCTP)を含有する結合緩衝液(会合相)へと移し、続いて、MgCl2(10mM)を含有する反応緩衝液中においてdNTPの組込みを行った(解離相)。バイオセンサーを、EDTA洗浄緩衝液へと移し、続いて、酵素、ヌクレオチド又は二価カチオンを伴わない反応緩衝液中において、再平衡化を行った。同様に、バイオセンサーを、表示の通り、循環的に、個々のデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dATP、dGTP、dCTP又はdTTP)を含有する溶液へと移した。結合及び組込みのサイクルを、各dNTPについて反復して、シーケンシングについて評価した。提示のために、Octet干渉法測定器により生成されたモニタリングデータを、Microsoft Excel及びPrismソフトウェア(GraphPad Software、San Diego、CA)へとインポートした。
三元複合体の安定化及びポリメラーゼの触媒に対する、二価カチオンの効果
手順において使用された材料及び方法は、以下の通りであった。3’反転dTのDNA配列を含む鋳型オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509S C4493Aは、ビオチン−5’−GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGATGGAGCTCATGGCGGG−3’−(3’−dT−5’)(配列番号21)であった。プライマーオリゴヌクレオチドである4496−4509ASのDNA配列は、5’−CCCGCCATGAGCTC−3’(配列番号10)であった。オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509S C4493A及び4496−4509ASは、Integrated DNA Technologies(Coralville、IA)により、合成及び解析された(液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)及びエレクトロスプレーイオン化(ESI))。オリゴヌクレオチドは、TE緩衝液(10mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、0.1mMのEDTA)中において、100μMへと調製した。ssDNAプライマー/鋳型を調製するために、オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509S C4493A及び4496−4509ASを、アニーリング緩衝液(10mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、0.1mMのEDTA、80mMのKCl)を含有する試験管中において(各鎖10μMずつ)組み合わせた。オリゴヌクレオチド溶液を含有する試験管を、乾燥ヒートブロックへとロードし(95℃5分間にわたり)、ブロックを、ベンチトップへと移して、周囲温度へと、徐々に冷却することにより、鎖をアニールさせた。E.コリーDNAポリメラーゼのクレノウ(3’→5’exo(−))断片を、Enzymatics(Beverly、MA;型番P7010−LC−L)から購入した。超高純度ウシ血清アルブミン(BSA)及びUltraPure Salmon Sperm DNA Solutionを、Life Technologies(Foster City、CA)から購入した。塩化ストロンチウム、塩化カルシウム、塩化マンガン、塩化バリウム、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化銅(II)、硫酸第一鉄アンモニウム、硫酸アンモニウム、硫酸ニッケル(II)六水和物、dCDP、dGDP及びdTDPを、Sigma(St.Louis、MO)から購入した。全ての試薬及び溶液は、分子生物学グレードであった。プライマー−鋳型二重鎖を、アニーリング緩衝液へと希釈した(100nM)。洗浄緩衝液は、20mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、50mMのKCl、0.01%(v/v)のTween−20、100μg/mLのウシ血清アルブミン、1.0mMのジチオトレイトールであった。結合緩衝液は、20mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、200mMのKCl、200mMのグルタミン酸カリウム、0.01%(v/v)のTween−20、100μg/mLのウシ血清アルブミン、1.0mMのジチオトレイトールであった。反応緩衝液は、20mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、50mMのKCl、0.01%(v/v)のTween−20、100μg/mLのウシ血清アルブミン、1.0mMのジチオトレイトール及び表示の二価カチオンであった。EDTA洗浄緩衝液は、100μMのEDTAを含有する結合緩衝液であった。プライマー−鋳型(PT)を含有する緩衝液、1つのdNTPを含有する結合緩衝液及び反応緩衝液を、Greiner 96−well black microplate(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;型番M9685)へとロードし(ウェル1つ当たり200μL)、PCR−grade mineral oil(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;型番M8662)を適用した(ウェル1つ当たり75μL)。高精度ストレプトアビジンバイオセンサー(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA;型番18−5117)を、使用の前に約10分間にわたり、アニーリング緩衝液中において再水和させた。Octet QKバイオセンサーシステム(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA)を、30℃の作動のために設定し、プライマー−鋳型によりバイオセンサーをコーティングし、洗浄緩衝液により結合しなかったプライマー−鋳型を洗い流すようにプログラムした。組み込まれなかったプライマー/鋳型の初期レベルを測定するため、バイオセンサーを、クレノウexo(−)(1mL当たり68単位)、SrCl2(2.0mM)及び100μMのdCTPを含有する結合緩衝液(会合相)へと移し、続いて、MgCl2を伴わずに、SrCl2(2.0mM)及びサケ精子DNAトラップ(500μg/mL)を含有する洗浄緩衝液へと移した。センサーを、MgCl2を伴わずに、サケ精子DNAトラップ(500μg/mL)を含有する洗浄緩衝液へと移し、続いて、EDTA洗浄緩衝液へと移し、結合緩衝液中において、再平衡化を行った。組み込まれなかったプライマー/鋳型への結合を測定し、二価カチオン非含有の結合緩衝液中の、三元複合体の安定性をモニタリングした。バイオセンサーを、クレノウexo(−)(1mL当たり68単位)、CoCl2(1.0mM)又は表示の二価カチオン(2.0mM)及び100μMのdCTPを含有する結合緩衝液(会合相)へと移し、続いて、MgCl2を伴わずに、同じ濃度の、同じ二価カチオン及びサケ精子DNAトラップ(500μg/mL)を含有する洗浄緩衝液へと移した。センサーを、MgCl2を伴わずに、サケ精子DNAトラップ(500μg/mL)を含有する洗浄緩衝液へと移し、続いて、EDTA洗浄緩衝液へと移し、結合緩衝液中において、再平衡化を行った。dNTPを含まず多様な二価カチオンを含有する結合緩衝液中の、三元複合体の安定化を測定した。バイオセンサーを、クレノウexo(−)(1mL当たり68単位)、CoCl2(1.0mM)又は表示の二価カチオン(2.0mM)及び100μMのdCTPを含有する結合緩衝液(会合相)へと移し、続いて、MgCl2を伴わずに、同じ二価カチオン及びサケ精子DNAトラップ(500μg/mL)を含有する洗浄緩衝液へと移した。センサーを、10mMのMgCl2を伴い、サケ精子DNAトラップ(500μg/mL)を含有する洗浄緩衝液へと移し、続いて、EDTA洗浄緩衝液へと移し、結合緩衝液中において、再平衡化を行った。最後に、組み込まれなかった、残りのプライマー/鋳型を測定することにより、ヌクレオチドの組込みを決定した。バイオセンサーを、クレノウexo(−)(1mL当たり68単位)、SrCl2(2.0mM)及び100μMのdCTPを含有する結合緩衝液(会合相)へと移し、続いて、MgCl2を伴わずに、SrCl2(2.0mM)及びサケ精子DNAトラップ(500μg/mL)を含有する洗浄緩衝液へと移した。センサーを、MgCl2を伴わずに、サケ精子DNAトラップ(500μg/mL)を含有する洗浄緩衝液へと移し、続いて、EDTA洗浄緩衝液へと移し、結合緩衝液中において、再平衡化を行った。提示のために、Octet干渉法測定器により生成されたモニタリングデータを、Microsoft Excel及びPrismソフトウェア(GraphPad Software、San Diego、CA)へとインポートした。
CoCl2により媒介される結合及び触媒を使用する、一本鎖DNAのシーケンシングによる長いリード長
手順において使用された材料及び方法は、以下の通りであった。鋳型オリゴヌクレオチドphiX_100mismatchのDNA配列は、ビオチン−5’−GGCAAATCACCAGAAGGCGGTTCCTGAATGAATGGGAAGCCTTCAAGAA−GGTGATAAGCAGGAGAAACATACGAAGCATCATAACGATACCACTGACCC−3’(配列番号22)であった。プライマーオリゴヌクレオチドであるFP2のDNA配列は、5’−GAGGGTCAGTGGTATCGTTATG−3’(配列番号5)であった。オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies(Coralville、IA)により、合成及び解析された(液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)及びエレクトロスプレーイオン化(ESI))。オリゴヌクレオチドは、TE緩衝液(10mMのトリスpH 8.0、0.1mMのEDTA)において、100μMへと調製した。ssDNAプライマー/鋳型を調製するために、オリゴヌクレオチドである「phiX_100mismatch」及び「FP2」を、アニーリング緩衝液(10mMのトリスpH 8.0、0.1mMのEDTA、80mMのKCl)を含有する試験管中において(各鎖10μMずつ)組み合わせた。オリゴヌクレオチド溶液を含有する試験管を、乾燥ヒートブロックへとロードし(95℃5分間にわたり)、ブロックをベンチトップへと移して、周囲温度へと徐々に冷却することにより、鎖をアニールさせた。E.コリーDNAポリメラーゼのクレノウ(3’→5’exo(−))断片を、Enzymatics(Beverly、MA;型番P7010−LC−L)から購入した。超高純度ウシ血清アルブミン(BSA)及びUltraPure Salmon Sperm DNA Solutionを、Life Technologies(Foster City、CA)から購入した。サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)ヌクレオシド二リン酸キナーゼ(NDPK)酵素(型番N0379)、アデノシン二リン酸(ADP)及び塩化コバルト(II)六水和物(型番255599)を、Sigma(St.Louis、MO)から購入した。全ての試薬及び溶液は、分子生物学グレードであった。プライマー−鋳型二重鎖を、アニーリング緩衝液へと希釈した(100nM)。洗浄緩衝液は、20mMのトリス、pH 8.0、200mMのKCl、200mMのグルタミン酸カリウム、0.01%(v/v)のTween−20、100μg/mLのウシ血清アルブミン、1.0mMのジチオトレイトールであった。結合緩衝液は、低CoCl2(0.050mM)を含有する洗浄緩衝液であった。反応緩衝液は、高CoCl2(15mM)を含有する結合緩衝液であった。EDTA洗浄緩衝液は、1.0mMのEDTAを含有する結合緩衝液であった。プライマー−鋳型(PT)を含有する緩衝液、1つのdNTPを含有する結合緩衝液及び反応緩衝液を、Greiner 96−well black microplate(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;型番M9685)へとロードし(ウェル1つ当たり200μL)、PCR−grade mineral oil(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;型番M8662)を適用した(ウェル1つ当たり75μL)。高精度ストレプトアビジンバイオセンサー(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA;型番18−5117)を、使用の前に約10分間にわたり、アニーリング緩衝液中において再水和させた。Octet QKバイオセンサーシステム(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA)を、30℃の作動のために設定し、プライマー−鋳型によりバイオセンサーをコーティングし、洗浄緩衝液により結合しなかったプライマー−鋳型を洗い流すようにプログラムした。バイオセンサーを、表示の通り、クレノウexo(−)(1mL当たり68単位)、CoCl2(100μM)及び100μMのdNTP(dATP、dTTP、dGTP又はdCTP)を含有する結合緩衝液(会合相)へと移し、続いて、CoCl2(15mM)、NDPK、ADP(1mM)及びサケ精子DNA(500μg/mL)を含有する反応緩衝液中において、dNTPの組込みを行った(解離相)。バイオセンサーを、EDTA洗浄緩衝液へと移し、続いて、酵素、ヌクレオチド又は二価カチオンを含まない反応緩衝液中において、再平衡化を行った。同様に、バイオセンサーを、表示の通り、循環的に、個々のデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dATP、dGTP、dCTP又はdTTP)を含有する溶液へと移した。結合及び組込みの、二連のサイクルを、各dNTPについて反復して、シーケンシングについて評価した。提示のために、Octet干渉法測定器により生成されたモニタリングデータを、Microsoft Excel及びPrismソフトウェア(GraphPad Software、San Diego、CA)へとインポートした。
ポリメラーゼトラップ及びdNTPスカベンジング酵素の存在下において、ニッケルにより増強された結合、マグネシウムの交換及び触媒を使用する、一本鎖DNAのシーケンシングによる長いリード長
手順において使用された材料及び方法は、以下の通りであった。3’反転dTのDNA配列を含む鋳型オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509S C4493Aは、ビオチン−5’−GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGATGGAGCTCATGGCGGG−3’−(3’−dT−5’)(配列番号21)であった。プライマーオリゴヌクレオチドである4496−4509ASのDNA配列は、5’−CCCGCCATGAGCTC−3’(配列番号10)であった。オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies(Coralville、IA)により、合成及び解析された(液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)及びエレクトロスプレーイオン化(ESI))。オリゴヌクレオチドは、TE緩衝液(10mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、0.1mMのEDTA)中において、100μMへと調製した。ssDNAプライマー/鋳型を調製するために、オリゴヌクレオチドである「Btn−4460−4509S C4493A」及び「4496−4509AS」を、アニーリング緩衝液(10mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、0.1mMのEDTA、80mMのKCl)を含有する試験管中において(各鎖10μMずつ)組み合わせた。オリゴヌクレオチド溶液を含有する試験管を、乾燥ヒートブロックへとロードし(95℃5分間にわたり)、ブロックをベンチトップへと移して、周囲温度へと徐々に冷却することにより、鎖をアニールさせた。E.コリーDNAポリメラーゼのクレノウ(3’→5’exo(−))断片を、Enzymatics(Beverly、MA;型番P7010−LC−L)から購入した。超高純度ウシ血清アルブミン(BSA)及びUltraPure Salmon Sperm DNA Solutionを、Life Technologies(Foster City、CA)から購入した。サッカロミセス・セレビシエヌクレオシド二リン酸キナーゼ(NDPK)酵素(型番N0379)、アデノシン二リン酸(ADP)及び硫酸ニッケル(II)六水和物(型番467901)を、Sigma(St.Louis、MO)から購入した。全ての試薬及び溶液は、分子生物学グレードであった。プライマー−鋳型二重鎖を、アニーリング緩衝液へと希釈した(100nM)。洗浄緩衝液は、20mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、200mMのKCl、200mMのグルタミン酸カリウム、0.01%(v/v)のTween−20、100μg/mLのウシ血清アルブミン、1.0mMのジチオトレイトールであった。結合緩衝液は、2.0mMのNi(II)SO4を含有する洗浄緩衝液であった。反応緩衝液は、MgCl2(10mM)を含有する結合緩衝液であった。EDTA洗浄緩衝液は、1.0mMのEDTAを含有する結合緩衝液であった。プライマー−鋳型(PT)を含有する緩衝液、1つのdNTPを含有する結合緩衝液及び反応緩衝液を、Greiner 96−well black microplate(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;型番M9685)へとロードし(ウェル1つ当たり200μL)、PCR−grade mineral oil(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;型番M8662)を適用した(ウェル1つ当たり75μL)。高精度ストレプトアビジンバイオセンサー(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA;型番18−5117)を、使用の前に約10分間にわたり、アニーリング緩衝液中において再水和させた。OCTET(登録商標)QKバイオセンサーシステム(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA)を、30℃の作動のために設定し、プライマー−鋳型によりバイオセンサーをコーティングし、洗浄緩衝液により結合しなかったプライマー−鋳型を洗い流すようにプログラムした。バイオセンサーを、表示の通り、クレノウexo(−)(1mL当たり68単位)、Ni(II)SO4(2.0mM)及び100μMのdNTP(dATP、dTTP、dGTP又はdCTP)を含有する結合緩衝液(会合相)へと移し、続いて、MgCl2(10mM)、NDPK、ADP(1mM)及びサケ精子DNA(500μg/mL)を含有する反応緩衝液中において、dNTPの組込みを行った(解離相)。バイオセンサーを、EDTA洗浄緩衝液へと移し、続いて、酵素、ヌクレオチド又は二価カチオンを含まない反応緩衝液中において、再平衡化を行った。同様に、バイオセンサーを、表示の通り、循環的に、個々のデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dATP、dGTP、dCTP又はdTTP)を含有する溶液へと移した。結合及び組込みの二連のサイクルを、各dNTPについて反復して、シーケンシングについて評価した。提示のために、Octet干渉法測定器により生成されたモニタリングデータを、Microsoft Excel及びPrismソフトウェア(GraphPad Software、San Diego、CA)へとインポートした。
ポリメラーゼトラップ及び2’−デオキシリボヌクレオシド二リン酸の存在下において、ニッケル(II)により増強された結合、マグネシウムの交換及び触媒を使用する、一本鎖DNAのシーケンシングによるホモポリマーの分解
手順において使用された材料及び方法は、以下の通りであった。3’反転dTのDNA配列を含む鋳型オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509S C4493Aは、ビオチン−5’−GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGATGGAGCTCATGGCGGG−3’−(3’−dT−5’)(配列番号21)であった。プライマーオリゴヌクレオチドである4496−4509ASのDNA配列は、5’−CCCGCCATGAGCTC−3’(配列番号10)であった。オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies(Coralville、IA)により、合成及び解析された(液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)及びエレクトロスプレーイオン化(ESI))。オリゴヌクレオチドは、TE緩衝液(10mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、0.1mMのEDTA)中において、100μMへと調製した。ssDNAプライマー/鋳型を調製するために、オリゴヌクレオチドである「Btn−4460−4509S C4493A」及び「4496−4509AS」を、アニーリング緩衝液(10mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、0.1mMのEDTA、80mMのKCl)を含有する試験管中において(各鎖10μMずつ)組み合わせた。オリゴヌクレオチド溶液を含有する試験管を、乾燥ヒートブロックへとロードし(95℃5分間にわたり)、ブロックを、ベンチトップへと移して、周囲温度へと、徐々に冷却することにより、鎖をアニールさせた。バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)に由来するBsu DNAポリメラーゼI(大型断片)であって、エキソヌクレアーゼ活性を欠くBsu DNAポリメラーゼI(大型断片)を、New England Biolabs(Ipswich、MA;型番M0330L)から購入した。超高純度ウシ血清アルブミン(BSA)及びUltraPure Salmon Sperm DNA Solutionを、Life Technologies(Foster City、CA)から購入した。硫酸ニッケル(II)六水和物(型番467901)、dCDP、dGDP及びdTDPを、Sigma(St.Louis、MO)から購入した。全ての試薬及び溶液は、分子生物学グレードであった。プライマー−鋳型二重鎖を、アニーリング緩衝液へと希釈した(100nM)。洗浄緩衝液は、20mMのトリス、pH 8.0、200mMのKCl、200mMのグルタミン酸カリウム、0.01%(v/v)のTween−20、100μg/mLのウシ血清アルブミン、1.0mMのジチオトレイトールであった。結合緩衝液は、2.0mMのNi(II)SO4を含有する洗浄緩衝液であった。反応緩衝液は、20mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、50mMのKCl、MgCl2(10mM)、0.01%(v/v)のTween−20、100μg/mLのウシ血清アルブミン、1.0mMのジチオトレイトールであった。EDTA洗浄緩衝液は、1.0mMのEDTAを含有する結合緩衝液であった。プライマー−鋳型(PT)を含有する緩衝液、1つのdNTPを含有する結合緩衝液及び反応緩衝液を、Greiner 96−well black microplate(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;型番M9685)へとロードし(ウェル1つ当たり200μL)、PCR−grade mineral oil(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;型番M8662)を適用した(ウェル1つ当たり75μL)。高精度ストレプトアビジンバイオセンサー(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA;型番18−5117)を、使用の前に約10分間にわたり、アニーリング緩衝液中において再水和させた。Octet QKバイオセンサーシステム(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA)を、30℃の作動のために設定し、プライマー−鋳型によりバイオセンサーをコーティングし、洗浄緩衝液により結合しなかったプライマー−鋳型を洗い流すようにプログラムした。バイオセンサーを、表示の通り、Bsu Pol I(1mL当たり68単位)、Ni(II)SO4(1.0mM)及び100μMのdNTP(dATP、dTTP、dGTP又はdCTP)を含有する結合緩衝液(会合相)へと移し、続いて、MgCl2(10mM)、サケ精子DNA(500μg/mL)及び対応するdNDP(使用されなかったdADPを除く)を含有する反応緩衝液中において、dNTPの組込みを行った(解離相)。バイオセンサーを、EDTA洗浄緩衝液へと移し、続いて、酵素、ヌクレオチド又は二価カチオンを伴わない反応緩衝液中において、再平衡化を行った。同様に、バイオセンサーを、表示の通り、循環的に、個々のデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dATP、dGTP、dCTP又はdTTP)を含有する溶液へと移した。結合及び組込みのサイクルを、各dNTPについて反復して、シーケンシングについて評価した。提示のために、Octet干渉法測定器により生成されたモニタリングデータを、Microsoft Excel及びPrismソフトウェア(GraphPad Software、San Diego、CA)へとインポートした。
2’−デオキシリボヌクレオシド二リン酸及び競合基質の存在下において、ニッケル(II)により増強された結合、マグネシウムの交換及び触媒を使用する、一本鎖DNAのシーケンシングによるホモポリマーの分解のための反応速度法
手順において使用された材料及び方法は、以下の通りであった。反転dTを含む野生型ALK3’鋳型オリゴヌクレオチドであるBtn−4460−4509SのDNA配列は、ビオチン−5’−GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGCTGGAGCTCATGGCGGG−3’−(3’−dT−5’)(配列番号7)であった。ALK−G1プライマーオリゴヌクレオチドである4494−4509ASのDNA配列は、5’−CCCGCCATGAGCTCCA−3’(配列番号26)であった。ALK−G2プライマーオリゴヌクレオチドである4491−4509ASのDNA配列は、5’−CCCGCCATGAGCTCCAGCA−3’(配列番号27)であった。ALK−G3プライマーオリゴヌクレオチドである4476−4509ASのDNA配列は、5’−CCCGCCATGAGCTCCAGCAGGATGAACC/ideoxyI/GGGCA−3’(配列番号28)[配列中、「/ideoxyI/」は、2’−デオキシイノシン残基である。]であった。ALK−G4プライマーオリゴヌクレオチドである4482−4509ASのDNA配列は、5’−CCCGCCATGAGCTCCAGCAGGATGAACC−3’(配列番号29)であった。オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies(Coralville、IA)により、合成及び解析された(液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)及びエレクトロスプレーイオン化(ESI))。オリゴヌクレオチドは、TE緩衝液(10mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、0.1mMのEDTA)中において、100μMへと調製した。ssDNAプライマー/鋳型を調製するために、オリゴヌクレオチドである「Btn−4460−4509S」及び「4494−4509AS」、「4491−4509AS」、「4476−4509AS」又は「4482−4509AS」(それぞれ、ALK−G1、ALK−G2、ALK−G3又はALK−G4の二重鎖)を、アニーリング緩衝液(10mMのトリス緩衝液(pH 8.0)、0.1mMのEDTA、80mMのKCl)を含有する試験管中において(各鎖10μMずつ)組み合わせた。オリゴヌクレオチド溶液を含有する試験管を、乾燥ヒートブロックへとロードし(95℃5分間にわたり)、ブロックをベンチトップへと移して、周囲温度へと徐々に冷却することにより、鎖をアニールさせた。バチルス・スブチリスに由来するBsu DNAポリメラーゼI(大型断片)であって、エキソヌクレアーゼ活性を欠くBsu DNAポリメラーゼI(大型断片)を、New England Biolabs(Ipswich、MA;型番M0330L)から購入した。超高純度ウシ血清アルブミン(BSA)及びUltraPure Salmon Sperm DNA Solutionを、Life Technologies(Foster City、CA)から購入した。基質類似体である2’−デオキシアデノシン−5’−O−(1−チオ三リン酸)(「α−S−dATP」)、2’−デオキシシチジン−5’−O−(1−チオ三リン酸)(「α−S−dCTP」)、2’−デオキシグアノシン−5’−O−(1−チオ三リン酸)(「α−S−dGTP」)及び2’−デオキシチミジン−5’−O−(1−チオ三リン酸)(「α−S−dTTP」)を、TriLink Biotechnologies,Inc.(San Diego、CA)から購入した。硫酸ニッケル(II)六水和物(型番467901)を、Sigma(St.Louis、MO)から購入した。全ての試薬及び溶液は、分子生物学グレードであった。プライマー−鋳型二重鎖を、アニーリング緩衝液へと希釈した(100nM)。洗浄緩衝液は、30mMのトリス、pH 8.0、160mMのKCl、160mMのグルタミン酸カリウム、0.01%(v/v)のTween−20、100μg/mLのウシ血清アルブミン、1.0mMのジチオトレイトールであった。結合緩衝液は、Bsu Pol I(1mL当たり68単位)、100μMのdGTP+1.0mMのNi(II)SO4を含有する洗浄緩衝液であった。反応緩衝液は、Bsu(1U/mL)、MgCl2(80μM)、dGTP(28.1μM)、α−S−dGTP(162μM)を含有する洗浄緩衝液であった。EDTA洗浄緩衝液は、Ni(II)SO4を含まないが、1.0mMのEDTAを含有する洗浄緩衝液であった。プライマー−鋳型(PT)を含有する緩衝液、結合緩衝液及び反応緩衝液を、Greiner 96−well black microplate(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;型番M9685)へとロードし(ウェル1つ当たり200μL)、PCR−grade mineral oil(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;型番M8662)を適用した(ウェル1つ当たり75μL)。高精度ストレプトアビジンバイオセンサー(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA;型番18−5117)を、使用の前に約10分間にわたり、アニーリング緩衝液中において再水和させた。Octet QKバイオセンサーシステム(Pall ForteBio Corp.、Menlo Park、CA)を、30℃の作動のために設定し、プライマー−鋳型によりバイオセンサーをコーティングし、洗浄緩衝液により結合しなかったプライマー−鋳型を洗い流すようにプログラムした。バイオセンサーを、結合緩衝液(会合相)へと移し、続いて、反応緩衝液中において、dNTPの組込みを行った(解離相)。バイオセンサーを、EDTA洗浄緩衝液へと移し、続いて、酵素、ヌクレオチド又はMgCl2を伴わない反応緩衝液中において、再平衡化を行った。提示のために、Octet干渉法測定器により生成されたモニタリングデータを、Microsoft Excel及びPrismソフトウェア(GraphPad Software、San Diego、CA)へとインポートした。Prismソフトウェアを使用して、会合相の時系列を、単一の指数関数会合式へと当てはめた。会合相の反応速度パラメータ(ノブ及び振幅)を、Gの単一の組込みを対照状態とするダネットの検定を使用する、InStat統計学ソフトウェア(GraphPad Software、San Diego、CA)により解析した。Prismソフトウェアを使用して、解離相の時系列を、二重の指数関数解離式へと当てはめた。
二元複合体の形成を優先的に不安定化させることを介する、ポリメラーゼによる、コグネイトのヌクレオチドと、非コグネイトのヌクレオチドとの弁別の増強
手順において使用された材料及び方法は、以下の通りであった。Biolayer干渉法を利用して、光ファイバーチップの表面における結合反応を測定するFORTEBIO(登録商標)(Menlo Park、CA)OCTET(登録商標)測定器を、マルチウェルプレートフォーマットにおいて使用して、二元複合体と三元複合体との示差的安定性について探索した。標準的な手順に従い、それらの5’末端においてビオチニル化された鋳型鎖を使用して、プライミングされた鋳型核酸を、ストレプトアビジン(SA)により機能化された光ファイバーチップへと固定させた。ビオチニル化された鋳型DNAから予測された配列リードは、86ヌクレオチドの潜在的なリード長を有し、この場合、プライマーへと付加される次の適正なヌクレオチドは、dCTPであった。サイクリングプロトコールを開始する前に、まず、チップを、30mMのトリス−HCl(pH 8.0)及び0.1mMのEDTAを含有するトリス緩衝溶液中において平衡化させた。2つの被験ヌクレオチド(すなわち、コグネイトのヌクレオチド及び非コグネイトのヌクレオチド)について独立の結合反応を、50mM〜500mMにおいて変動させた濃度のNaCl、KCl又はグルタミン酸カリウムの存在下において実行した。第4の試行は、160mMの固定濃度のグルタミン酸カリウムを使用して行ったが、KClの濃度は、50mM〜500mMにおいて変動させた。全ての場合に、精査ステップにおいて使用される反応混合物は、トリス−HCl(pH 8.0)、0.01%のTween−20、100μg/mlのBSA、2mMのNiSO4、350U/mlのBsu DNAポリメラーゼ大型断片及び濃度を100μMとするヌクレオチドのうちの1つ(dCTPを、コグネイトのヌクレオチドとして使用し、dGTPを、非コグネイトのヌクレオチドとして使用した)を含有した。各精査ステップに続き、チップを、30mMのトリス−HCl(pH 8.0)、500mMのKCl、2mMのEDTA及び0.05%のTween−20を含有する緩衝液へと、20秒間にわたり曝露して、酵素複合体を、プライミングされた鋳型核酸からはがした。ストリッピングステップに続き、酵素、dNTP又は二価カチオンを含まない精査緩衝液への、15秒間にわたる曝露であって、次の精査サイクルのために、チップを再生させる曝露を行った。単一の接触させるステップを使用して、ポリメラーゼ及びヌクレオチドのプライミングされた鋳型核酸への結合を行う場合、結合ステップは、45秒間であり、結合相互作用を、持続的にモニタリングした。これは、プライミングされた鋳型核酸を、ポリメラーゼ及び被験ヌクレオチドを含んだ単一の溶液と接触させることにより達せられた。干渉法によるモニタリングからの結果を解析して、三元複合体の形成(すなわち、コグネイトのヌクレオチドを同定すること)又は二元複合体(すなわち、非コグネイトのヌクレオチドを同定すること)を同定した。干渉法試験からの数値結果を、表5〜8に提示する。丸められた二元複合体についての測定値の一部は、表中において、0.00と見えるほどに低値であったが、なお増強倍数の計算が可能であった。
結合によるシーケンシング手順における二元複合体の形成を低減するためのポリメラーゼ送達試薬(PDR)
4つのストレプトアビジンによりコーティングされたOctetチップを、プライマーとハイブリダイズさせたビオチニル化鋳型DNA鎖を含有する結合緩衝液と接触させて、固定されたプライミングされた鋳型核酸分子を調製した。この手順では、結合緩衝液は、KCl、グルタミン酸カリウム、TbCl3、Tween−80及びBSAを含む、ACES緩衝(pH 7.5)液であった。その後、核酸を含まない結合緩衝液を使用して、バイオセンサーチップを洗浄した。二元複合体の形成は、バイオセンサーチップを、付加されたシステイン残基を含有するように操作された1μMのBst DNAポリメラーゼを、0nM、10nM、100nM又は1,000nMのいずれかの可溶性相すなわち液相の(すなわち、溶液中に遊離している)ビオチニル化されていないプライミングされた鋳型核酸と一緒に含有する結合緩衝液と接触させることにより、達成した。バックグラウンドシグナルを表す二元複合体を形成するのに使用された溶液は、コグネイトのヌクレオチドを含まなかった。液相のプライミングされた鋳型核酸が、バイオセンサーチップへと固定されたプライミングされた鋳型核酸の配列と異なる配列を有したことは、注目に値する。最後に、三元複合体は、バイオセンサーチップを、0nM、10nM、100nM又は1,000nMの可溶性相又は液相の(すなわち、溶液中に遊離している)プライミングされた鋳型核酸を、固定されたプライミングされた鋳型核酸分子の次の適正なヌクレオチドである、100μMのヌクレオチドと一緒に含む結合緩衝液と接触させることにより、形成した。結合緩衝液中に含まれた液相ヌクレオチドは、液相の、プライミングされた鋳型核酸に対する、コグネイトのヌクレオチドではなかった。固定された核酸の特徴(例えば、フローセル内の表面へと、直接的に、又は間接的に固定されたプライミングされた鋳型核酸)に対する、コグネイトのヌクレオチドとして調べられる液相ヌクレオチドを含有する異なる試薬を使用する場合、液相ヌクレオチドは、液相のプライミングされた鋳型核酸に対する、コグネイトのヌクレオチドであってはならない。このようにすると、三元複合体ではなく二元複合体だけが、液相ヌクレオチド及び液相のプライミングされた鋳型核酸分子の間において形成されうる。任意選択的に、液相ヌクレオチドを含有する試薬溶液中に、1つを超える液相のプライミングされた鋳型核酸分子が存在しうる。より特定すると、単一の液相ヌクレオチドを含有する試薬溶液中に、最大3つの、異なる液相のプライミングされた鋳型核酸が存在する場合があり、この場合、液相ヌクレオチドは、液相の、プライミングされた鋳型核酸のうちのいずれかに対する、コグネイトのヌクレオチドではない。
標識化されたポリメラーゼシーケンシング
フローセルを、公知の配列の、合成の、プライミングされた鋳型核酸を提示する、1μMの磁気マイクロビーズを使用して調製した。略述すると、ストレプトアビジンによりコーティングされたMyOne C1磁気ビーズ(ThermoFisher Scientific;Waltham、MA)を、ストレプトアビジン上の遊離アミン部分と反応するTCO−PEG4−NHS(トランスシクロオクテン−ポリエチレングリコール−N−ヒドロキシスクシンイミド)部分により官能化した。次いで、TCOにより修飾されたビーズを、所望のプライミングされた鋳型核酸分子を100nMの濃度において含有する溶液中において、インキュベートした。次に、ビーズを、TCO修飾ビーズに共有結合的に結合するようにNHS−テトラジンエステル試薬により修飾された、アミノシランによりコーティングされたカバースリップにより構築されたフローセルへと導入した。ビーズを表面へと沈着させ、約15分間にわたり結合させ、ビーズの密度を光学顕微鏡により点検した。大きなビーズ密度が要求された場合、多くのビーズを流入させ、結合させた。フローセルの内容物は、SuperBlock(ThermoFisher Scientific)により「ブロッキング」して、試薬の、ビーズ又はバックグラウンド表面への非特異的結合を最小化した。
Claims (20)
- プライミングされた鋳型核酸分子の、次の適正なヌクレオチドのアイデンティティーを決定する方法であって、
(a)プライマーによりプライミングされた鋳型核酸分子を用意するステップ;
(b)プライミングされた鋳型核酸分子、ポリメラーゼ及び次の適正なヌクレオチドを含む三元複合体を安定化させる条件下において、いかなるヌクレオチドの、プライマーへの組込みをも回避しながら、プライミングされた鋳型核酸分子を、反応混合物の各々が、ポリメラーゼ及び2つ又は3つの異なる被験ヌクレオチドの異なる組合せを含む複数の反応混合物と、逐次的に接触させるステップ;
(c)いかなるヌクレオチドの、プライミングされた鋳型核酸分子のプライマーへの化学的組込みをも伴わずに、ポリメラーゼの、プライミングされた鋳型核酸分子との相互作用を検出して、三元複合体が形成されるのかどうかを決定するステップ;並びに
(d)検出された相互作用を使用して、反応混合物のうちの少なくとも2つに共通な被験ヌクレオチドが、プライミングされた鋳型核酸分子の、次の適正なヌクレオチドであると決定するステップ
を含む方法。 - ステップ(d)が、検出された相互作用を使用して、反応混合物のうちの2つに共通な被験ヌクレオチドが、プライミングされた鋳型核酸分子の、次の適正なヌクレオチドであるのかどうかを決定することを含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)において、4つの異なる反応混合物が、プライミングされた鋳型核酸分子と、逐次的に接触され、異なるヌクレオチドの各々が、合計2つの反応混合物中に存在する、請求項2に記載の方法。
- ステップ(d)が、検出された相互作用を使用して、反応混合物のうちの3つに共通な被験ヌクレオチドが、プライミングされた鋳型核酸分子の、次の適正なヌクレオチドであるのかどうかを決定することを含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)において、6つの異なる反応混合物が、プライミングされた鋳型核酸分子と、逐次的に接触され、異なるヌクレオチドの各々が、合計3つの反応混合物中に存在する、請求項4に記載の方法。
- 前記条件が、プライミングされた鋳型核酸分子及びポリメラーゼを含むが次の適正なヌクレオチドを含まない二元複合体をも不安定化させる、請求項1に記載の方法。
- 前記三元複合体が、プライマーの3’末端のヌクレオチド上の、可逆性のターミネーター部分の存在により安定化される、請求項1に記載の方法。
- ステップ(c)の後において、プライマーの3’末端のヌクレオチド上の、可逆性のターミネーター部分を除去するステップをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 被験ヌクレオチドの各々が、非標識化ヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
- ポリメラーゼが、ステップ(c)において検出される外因性標識を含む、請求項9に記載の方法。
- 次の適正なヌクレオチドが、ステップ(c)において検出される外因性標識を含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(c)の後において、プライマーの3’端に、ヌクレオチドを組み込むステップ(e)をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 組み込まれるヌクレオチドが、非標識化ヌクレオチドである、請求項12に記載の方法。
- 組み込まれるヌクレオチドが、可逆性の非標識化ターミネーターヌクレオチドである、請求項12に記載の方法。
- ステップ(b)〜(e)を反復して、プライミングされた鋳型核酸分子をシーケンシングするステップをさらに含む、請求項12に記載の方法。
- プライミングされた鋳型核酸をシーケンシングする方法であって、
(a)ポリメラーゼ、プライミングされた鋳型核酸及びプライミングされた鋳型核酸の次の塩基と相補的な被験ヌクレオチドの間において安定化した三元複合体を形成する条件下において、プライミングされた鋳型核酸を、ポリメラーゼ及び2種類又は3種類の被験ヌクレオチドの第1の組合せと接触させるステップ;
(b)被験ヌクレオチドの、プライマーへの組込みを回避しながら、三元複合体を検出するステップ;
(c)プライミングされた鋳型核酸、ポリメラーゼ及び2種類又は3種類の被験ヌクレオチドの第2の組合せを使用して、ステップ(a)及び(b)を反復するステップであって、第2の組合せが、第1の組合せと異なるステップ;
(d)ステップ(c)の後において、プライマーへと、次の塩基と相補的なヌクレオチドを組み込むステップ;並びに
(e)ステップ(a)〜(d)を反復して、プライミングされた鋳型核酸の配列を同定するステップ
を含む方法。 - 第1の組合せが、2種類の被験ヌクレオチドを含む、請求項16に記載の方法。
- 第2の組合せが、2種類の被験ヌクレオチドを含む、請求項17に記載の方法。
- ステップ(a)及び(b)が、2種類の被験ヌクレオチドの、4つの異なる組合せについて、逐次的に実行され、異なるヌクレオチド種類の各々が、プライミングされた鋳型核酸と、合計2回にわたり接触される、請求項18に記載の方法。
- ステップ(a)及び(b)が、2種類の被験ヌクレオチドの、6つの異なる組合せについて、逐次的に実行され、異なるヌクレオチド種類の各々が、合計3回にわたり存在する、請求項18に記載の方法。
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DE202019106694U1 (de) | 2019-12-02 | 2020-03-19 | Omniome, Inc. | System zur Sequenzierung von Nukleinsäuren in Fluidschaum |
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CN115516104A (zh) | 2020-03-03 | 2022-12-23 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 用于对双链核酸进行测序的方法和组合物 |
CN115836135A (zh) | 2020-05-05 | 2023-03-21 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 用于修饰聚合酶-核酸复合物的组合物和方法 |
US20230279483A1 (en) | 2022-03-04 | 2023-09-07 | Element Biosciences, Inc. | Double-stranded splint adaptors and methods of use |
US11200446B1 (en) | 2020-08-31 | 2021-12-14 | Element Biosciences, Inc. | Single-pass primary analysis |
US20230279382A1 (en) | 2022-03-04 | 2023-09-07 | Element Biosciences, Inc. | Single-stranded splint strands and methods of use |
CA3204784A1 (en) | 2021-01-13 | 2022-07-21 | Alex Nemiroski | Surface structuring with colloidal assembly |
US20220356519A1 (en) | 2021-05-10 | 2022-11-10 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Single-molecule seeding and amplification on a surface |
US20220356515A1 (en) | 2021-05-10 | 2022-11-10 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Dna amplification buffer replenishment during rolling circle amplification |
US11859241B2 (en) | 2021-06-17 | 2024-01-02 | Element Biosciences, Inc. | Compositions and methods for pairwise sequencing |
US11427855B1 (en) | 2021-06-17 | 2022-08-30 | Element Biosciences, Inc. | Compositions and methods for pairwise sequencing |
TW202317760A (zh) | 2021-06-18 | 2023-05-01 | 美商元素生物科學股份有限公司 | 經工程化之聚合酶 |
WO2023081485A1 (en) | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Stepwise sequencing of a polynucleotide with a homogenous reaction mixture |
WO2023235865A1 (en) | 2022-06-03 | 2023-12-07 | Element Biosciences, Inc. | Compositions and methods for reducing base call errors by removing deaminated nucleotides from a nucleic acid library |
WO2023240093A1 (en) | 2022-06-06 | 2023-12-14 | Element Biosciences, Inc. | Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations |
US20240011022A1 (en) | 2022-07-05 | 2024-01-11 | Element Biosciences, Inc. | Pcr-free library preparation using double-stranded splint adaptors and methods of use |
WO2024015962A1 (en) | 2022-07-15 | 2024-01-18 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Blocked asymmetric hairpin adaptors |
WO2024040068A1 (en) | 2022-08-15 | 2024-02-22 | Element Biosciences, Inc. | Spatially resolved surface capture of nucleic acids |
WO2024040058A1 (en) | 2022-08-15 | 2024-02-22 | Element Biosciences, Inc. | Methods for preparing nucleic acid nanostructures using compaction oligonucleotides |
WO2024059550A1 (en) | 2022-09-12 | 2024-03-21 | Element Biosciences, Inc. | Double-stranded splint adaptors with universal long splint strands and methods of use |
Family Cites Families (81)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8910880D0 (en) | 1989-05-11 | 1989-06-28 | Amersham Int Plc | Sequencing method |
US5302509A (en) | 1989-08-14 | 1994-04-12 | Beckman Instruments, Inc. | Method for sequencing polynucleotides |
WO1991006678A1 (en) | 1989-10-26 | 1991-05-16 | Sri International | Dna sequencing |
US5614365A (en) | 1994-10-17 | 1997-03-25 | President & Fellow Of Harvard College | DNA polymerase having modified nucleotide binding site for DNA sequencing |
US6165765A (en) | 1995-10-18 | 2000-12-26 | Shanghai Institute Of Biochemistry, Chinese Academy Of Sciences | DNA polymerase having ability to reduce innate selective discrimination against fluorescent dye-labeled dideoxynucleotides |
US6828094B2 (en) | 1996-12-20 | 2004-12-07 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for the uncoupled, direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules with the addition of a second thermostable DNA polymerase and its application |
ATE225858T1 (de) | 1997-07-28 | 2002-10-15 | Medical Biosystems Ltd | Sequenzanalyse von nukleinsäuren |
US6248539B1 (en) | 1997-09-05 | 2001-06-19 | The Scripps Research Institute | Porous semiconductor-based optical interferometric sensor |
EP1090293B2 (en) | 1998-06-24 | 2019-01-23 | Illumina, Inc. | Decoding of array sensors with microspheres |
NO986133D0 (no) | 1998-12-23 | 1998-12-23 | Preben Lexow | FremgangsmÕte for DNA-sekvensering |
AU7086800A (en) | 1999-08-30 | 2001-03-26 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | High speed parallel molecular nucleic acid sequencing |
US6982146B1 (en) | 1999-08-30 | 2006-01-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | High speed parallel molecular nucleic acid sequencing |
GB9923644D0 (en) | 1999-10-06 | 1999-12-08 | Medical Biosystems Ltd | DNA sequencing |
US6908736B1 (en) | 1999-10-06 | 2005-06-21 | Medical Biosystems, Ltd. | DNA sequencing method |
AU2001282881B2 (en) | 2000-07-07 | 2007-06-14 | Visigen Biotechnologies, Inc. | Real-time sequence determination |
EP1337541B1 (en) | 2000-10-06 | 2007-03-07 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Massive parallel method for decoding DNA and RNA |
US20020155476A1 (en) | 2000-10-20 | 2002-10-24 | Nader Pourmand | Transient electrical signal based methods and devices for characterizing molecular interaction and/or motion in a sample |
US7371562B2 (en) | 2000-10-30 | 2008-05-13 | Sru Biosystems, Inc. | Guided mode resonant filter biosensor using a linear grating surface structure |
US7057026B2 (en) | 2001-12-04 | 2006-06-06 | Solexa Limited | Labelled nucleotides |
US7414116B2 (en) | 2002-08-23 | 2008-08-19 | Illumina Cambridge Limited | Labelled nucleotides |
GB2398383B (en) * | 2003-02-12 | 2005-03-09 | Global Genomics Ab | Method and means for nucleic acid sequencing |
WO2004074503A2 (en) | 2003-02-21 | 2004-09-02 | Hoser Mark J | Nucleic acid sequencing methods, kits and reagents |
GB0317343D0 (en) | 2003-07-24 | 2003-08-27 | Medical Biosystems Ltd | Polynucleotide sequencing |
AU2003269991A1 (en) * | 2003-08-20 | 2005-03-10 | Applera Corporation | Polymerase compositions |
EP3673986A1 (en) | 2004-01-07 | 2020-07-01 | Illumina Cambridge Limited | Improvements in or relating to molecular arrays |
US8071755B2 (en) | 2004-05-25 | 2011-12-06 | Helicos Biosciences Corporation | Nucleotide analogs |
EP1766075B1 (en) | 2004-06-10 | 2010-03-17 | Amersham Biosciences Corp. | Method for nucleic acid analysis |
US7264934B2 (en) | 2004-06-10 | 2007-09-04 | Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. | Rapid parallel nucleic acid analysis |
GB0413082D0 (en) | 2004-06-11 | 2004-07-14 | Medical Biosystems Ltd | Method |
US7302146B2 (en) | 2004-09-17 | 2007-11-27 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Apparatus and method for analysis of molecules |
US7482120B2 (en) | 2005-01-28 | 2009-01-27 | Helicos Biosciences Corporation | Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction |
US7544794B1 (en) | 2005-03-11 | 2009-06-09 | Steven Albert Benner | Method for sequencing DNA and RNA by synthesis |
US7449297B2 (en) | 2005-04-14 | 2008-11-11 | Euclid Diagnostics Llc | Methods of copying the methylation pattern of DNA during isothermal amplification and microarrays |
US20070009925A1 (en) | 2005-05-05 | 2007-01-11 | Applera Corporation | Genomic dna sequencing methods and kits |
DK1987159T4 (da) * | 2006-02-08 | 2020-11-16 | Illumina Cambridge Ltd | Fremgangsmåde til sekventering af en polynukleotidtemplate |
SG170802A1 (en) | 2006-03-31 | 2011-05-30 | Solexa Inc | Systems and devices for sequence by synthesis analysis |
DE112007002932B4 (de) | 2006-12-01 | 2015-08-06 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Vierfarben DNA-Sequenzierung mittels Synthese unter Verwendung von abspaltbaren, reversiblen, fluoreszierenden Nucleotidterminatoren |
US7678894B2 (en) | 2007-05-18 | 2010-03-16 | Helicos Biosciences Corporation | Nucleotide analogs |
US8617811B2 (en) | 2008-01-28 | 2013-12-31 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions |
CN101434988B (zh) | 2007-11-16 | 2013-05-01 | 深圳华因康基因科技有限公司 | 一种高通量寡核苷酸测序方法 |
US8652781B2 (en) | 2008-02-12 | 2014-02-18 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Cognate sampling kinetics |
US8628940B2 (en) | 2008-09-24 | 2014-01-14 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Intermittent detection during analytical reactions |
US8999676B2 (en) | 2008-03-31 | 2015-04-07 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Recombinant polymerases for improved single molecule sequencing |
EP2942404B1 (en) | 2008-03-31 | 2016-11-23 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Generation of modified polymerases for improved accuracy in single molecule sequencing |
EP2274446B1 (en) | 2008-03-31 | 2015-09-09 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Two slow-step polymerase enzyme systems and methods |
US20100092960A1 (en) | 2008-07-25 | 2010-04-15 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Helicase-assisted sequencing with molecular beacons |
TWI408888B (zh) * | 2008-08-07 | 2013-09-11 | Ind Tech Res Inst | 超音波線性馬達 |
WO2010068884A2 (en) | 2008-12-11 | 2010-06-17 | The Regents Of The University Of California | Methods and systems for direct sequencing of single dna molecules |
US8236532B2 (en) | 2008-12-23 | 2012-08-07 | Illumina, Inc. | Multibase delivery for long reads in sequencing by synthesis protocols |
US20110014612A1 (en) | 2009-03-27 | 2011-01-20 | Life Technologies Corporation | Polymerase compositions & methods |
US8034923B1 (en) | 2009-03-27 | 2011-10-11 | Steven Albert Benner | Reagents for reversibly terminating primer extension |
US20100311144A1 (en) | 2009-06-05 | 2010-12-09 | Life Technologies Corporation | Mutant dna polymerases |
US20130053252A1 (en) | 2009-09-25 | 2013-02-28 | President & Fellows Of Harvard College | Nucleic acid amplification and sequencing by synthesis with fluorogenic nucleotides |
US8911972B2 (en) | 2009-12-16 | 2014-12-16 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Sequencing methods using enzyme conformation |
US8603741B2 (en) | 2010-02-18 | 2013-12-10 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Single molecule sequencing with two distinct chemistry steps |
WO2011159942A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Illumina, Inc. | Conformational probes and methods for sequencing nucleic acids |
WO2012009206A2 (en) | 2010-07-12 | 2012-01-19 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Sequencing reactions with alkali metal cations for pulse width control |
CN110079588B (zh) * | 2010-12-17 | 2024-03-15 | 生命技术公司 | 用于核酸扩增的方法、组合物、系统、仪器和试剂盒 |
US8951781B2 (en) | 2011-01-10 | 2015-02-10 | Illumina, Inc. | Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis |
AU2012262364B2 (en) | 2011-05-27 | 2016-02-11 | Sequencing Health, Inc. | Systems and methods for genetic and biological analysis |
US20150087537A1 (en) | 2011-08-31 | 2015-03-26 | Life Technologies Corporation | Methods, Systems, Computer Readable Media, and Kits for Sample Identification |
CA2848049C (en) | 2011-09-13 | 2021-01-26 | Lasergen, Inc. | 5-methoxy, 3'-oh unblocked, fast photocleavable terminating nucleotides and methods for nucleic acid sequencing |
EP3981886A1 (en) | 2011-09-23 | 2022-04-13 | Illumina, Inc. | Compositions for nucleic acid sequencing |
WO2013096692A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Illumina, Inc. | Apparatus and methods for kinetic analysis and determination of nucleic acid sequences |
CN102634586B (zh) | 2012-04-27 | 2013-10-30 | 东南大学 | 一种两核苷酸实时合成dna解码测序方法 |
ES2683707T3 (es) | 2012-05-02 | 2018-09-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Secuenciación de ADN |
GB201301178D0 (en) | 2013-01-23 | 2013-03-06 | Dynamic Biosensors Gmbh | Method for sequencing a template nucleic acid immobilized on a substrate |
EP3919617A1 (en) | 2013-03-13 | 2021-12-08 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
EP2971071B1 (en) | 2013-03-15 | 2018-02-28 | Illumina, Inc. | Enzyme-linked nucleotides |
US8808989B1 (en) | 2013-04-02 | 2014-08-19 | Molecular Assemblies, Inc. | Methods and apparatus for synthesizing nucleic acids |
ES2719579T3 (es) | 2013-07-03 | 2019-07-11 | Illumina Inc | Sistema para secuenciación por síntesis ortogonal |
WO2015095066A1 (en) | 2013-12-16 | 2015-06-25 | Complete Genomics, Inc. | Basecaller for dna sequencing using machine learning |
EP3325642B1 (en) * | 2015-07-21 | 2020-05-27 | Omniome, Inc. | Nucleic acid sequencing method |
US10077470B2 (en) | 2015-07-21 | 2018-09-18 | Omniome, Inc. | Nucleic acid sequencing methods and systems |
WO2017087724A1 (en) | 2015-11-17 | 2017-05-26 | Omniome, Inc. | Methods for determining sequence profiles |
CN109072297B (zh) * | 2016-04-22 | 2022-09-13 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 使用增强的核苷酸特异性三元复合物形成检测的核酸测序方法和系统 |
SG11201809522WA (en) * | 2016-04-29 | 2018-11-29 | Omniome Inc | Method of nucleic acid sequence determination |
AU2017258619B2 (en) * | 2016-04-29 | 2020-05-14 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Sequencing method employing ternary complex destabilization to identify cognate nucleotides |
WO2018035134A1 (en) | 2016-08-15 | 2018-02-22 | Omniome, Inc. | Method and system for sequencing nucleic acids |
US10161003B2 (en) | 2017-04-25 | 2018-12-25 | Omniome, Inc. | Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency |
US9951385B1 (en) | 2017-04-25 | 2018-04-24 | Omniome, Inc. | Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021072816A (ja) * | 2016-08-15 | 2021-05-13 | オムニオム インコーポレイテッドOmniome, Inc. | 核酸をシーケンシングするための方法及びシステム |
JP7198295B2 (ja) | 2016-08-15 | 2022-12-28 | パシフィック・バイオサイエンシズ・オブ・カリフォルニア・インク. | 核酸をシーケンシングするための方法及びシステム |
Also Published As
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