CN115836135A - 用于修饰聚合酶-核酸复合物的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供的公开内容包括一种用于修饰聚合酶‑核酸复合物的方法，包括(a)在容器中提供多于一种表面固定的聚合酶‑核酸复合物，其中所述核酸包括引发的模板核酸，其中至少一个亚组的所述表面固定的聚合酶‑核酸复合物包括还包含核苷酸的三元复合物；以及(b)将表面用包含二醇、亚砜或多元醇的水性溶液洗涤，从而将核苷酸从所述容器中去除并且将所述表面固定的聚合酶‑核酸复合物保留在所述容器中。

Description

用于修饰聚合酶-核酸复合物的组合物和方法

相关申请

本申请要求2020年5月5日提交的美国临时申请第63/020,115号的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。

背景

本公开内容大体上涉及核酸的检测，并且对核酸测序技术具有特定的适用性。

模板核酸链的准确序列确定对于分子诊断是重要的。从多种可选物中鉴定已知位置处的单核苷酸碱基可以用作单核苷酸多态性(SNP)分析的基础。SNP继而可以用于确定个体的表型，诸如对疾病的易感性或具有所期望性状的倾向。检测患者中的遗传变异可以提供某些药物治疗患者的疗效或用某些药物治疗患者时不良副作用风险的指示。

商购可得的核酸测序平台已经极大地增加了我们对可操作性状的遗传基础的了解。测序生物化学和检测硬件的改进仍在继续。然而，许多平台仅实现了相对较短的读段，并且读段中的错误是长期的困难。大规模并行处理允许获得许多短读段，并且然后编织在一起，组装更大的基因组序列。可以增加读段的数目以实现改进的准确性。例如，各自长度仅几百个核苷酸的数百万个读段可以组装在一起，以得到约30亿个核苷酸长的人类基因组。通过增加测序读段的长度和准确性，将减少实现DNA的大规模并行处理和数据的高通量组装所需的时间和资源。本发明解决了这种需要并且还提供了相关优点。

概述

本公开内容提供了一种组合物，包含聚合酶-核酸复合物，其中核酸包括与水性溶液接触的引发的模板核酸(primed-template nucleic acid)，其中水性溶液包含多元醇、二醇、砜或亚砜。

本公开内容提供了一种用于修饰聚合酶-核酸复合物的方法。所述方法可以例如包括以下步骤：(a)提供多于一种聚合酶-核酸复合物，每种聚合酶-核酸复合物包含聚合酶和引发的模板核酸，其中至少一个亚组的聚合酶-核酸复合物是还包含核苷酸的三元复合物；以及(b)使多于一种聚合酶-核酸复合物与包含多元醇、醇、脂肪族二醇、砜、亚砜或其组合的水性溶液接触，从而将核苷酸从所述亚组的聚合酶-核酸复合物解离。水性溶液可以还包含另外的组分，诸如锂、甜菜碱或两者。多于一种聚合酶-核酸复合物可以被固定在表面上，存在于容器中，或者两者。所述方法可以包括以下步骤：(a)在容器中提供多于一种表面固定的聚合酶-核酸复合物，其中核酸包括引发的模板核酸，其中至少一个亚组的表面固定的聚合酶-核酸复合物包括还包含核苷酸的三元复合物；以及(b)将表面用包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液洗涤，从而将核苷酸从容器中去除并且将表面固定的聚合酶-核酸复合物保留在容器中。

用于修饰聚合酶-核酸复合物的方法可以包括以下步骤：(a)使多于一种聚合酶与多于一种引发的模板核酸并与多于一种核苷酸接触，从而在容器中提供多于一种表面固定的聚合酶-核酸复合物，表面固定的聚合酶-核酸复合物中的每一种包含多于一种聚合酶中的聚合酶和多于一种引发的模板核酸中的引发的模板核酸，三元复合物中的核苷酸包括多于一种核苷酸中的核苷酸；和(b)将表面用包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液洗涤，从而将核苷酸从容器中去除并且将表面固定的聚合酶-核酸复合物保留在容器中。

用于修饰聚合酶-核酸复合物的方法可以包括以下步骤：(a)在容器中提供多于一种表面固定的聚合酶-核酸复合物，其中核酸包括引发的模板核酸，其中至少一个亚组的表面固定的聚合酶-核酸复合物包括还包含核苷酸的三元复合物；(b)将表面用包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液洗涤，从而将核苷酸从容器中去除并且将表面固定的聚合酶-核酸复合物保留在容器中；以及(c)将包含多于一种第二核苷酸的溶液递送至容器，从而至少第二亚组的表面固定的聚合酶-核酸复合物包括还包含来自多于一种第二核苷酸的第二核苷酸的三元复合物。

本公开内容还提供了一种用于鉴定引发的模板核酸中的核苷酸的方法。所述方法可以包括以下步骤：(a)提供具有引发的模板核酸、聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物(cognate)的容器；(b)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第一碱基类型的核苷酸同源物；(c)将容器用包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液洗涤，从而将核苷酸从容器中去除并且保留来自步骤(b)中的引发的模板核酸和聚合酶；(d)在步骤(c)之后将第二碱基类型的核苷酸同源物递送至容器；(e)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第二碱基类型的核苷酸同源物；以及(f)鉴定引发的模板核酸的碱基位置处的核苷酸类型。任选地，所述方法可以还包括以下步骤：(g)将核苷酸添加至引发的模板核酸的引物中，从而容器包含延伸的引发的模板核酸；(h)将第二聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物递送至容器；以及(i)使用延伸的引发的模板核酸代替引发的模板核酸并使用第二聚合酶代替聚合酶重复步骤(b)至(f)。

在一些实施方案中，用于鉴定引发的模板核酸中的核苷酸的方法可以包括以下步骤：(a)提供具有引发的模板核酸、聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物的容器；(b)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第一碱基类型的核苷酸同源物；(c)将容器用包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液洗涤，从而将核苷酸从容器中去除并且保留来自步骤(b)中的引发的模板核酸和聚合酶；(d)在步骤(c)之后将第二碱基类型的核苷酸同源物递送至容器；(e)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第二碱基类型的核苷酸同源物；(f)鉴定引发的模板核酸的碱基位置处的核苷酸类型；(g)将第三碱基类型的核苷酸同源物递送至容器，从而容器保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和聚合酶；以及(h)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物具有聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第三碱基类型的核苷酸同源物。任选地，所述方法可以还包括以下步骤：(i)将核苷酸添加至引发的模板核酸的引物中，从而容器包含延伸的引发的模板核酸；(j)将第二聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物递送至容器；以及(k)使用延伸的引发的模板核酸代替引发的模板核酸并使用第二聚合酶代替聚合酶重复步骤(b)至(h)。

在一些实施方案中，用于鉴定引发的模板核酸中的核苷酸的方法可以包括以下步骤：(a)提供具有引发的模板核酸、聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物的容器；(b)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第一碱基类型的核苷酸同源物；(c)将容器用包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液洗涤，从而将核苷酸从容器中去除并且保留来自步骤(b)中的引发的模板核酸和聚合酶；(d)在步骤(c)之后将第二碱基类型的核苷酸同源物递送至容器；(e)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第二碱基类型的核苷酸同源物；(f)鉴定引发的模板核酸的碱基位置处的核苷酸类型；(g)将第三碱基类型的核苷酸同源物递送至容器，从而容器保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和聚合酶；(h)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物具有聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第三碱基类型的核苷酸同源物；(i)将第四碱基类型的核苷酸同源物递送至容器，从而容器保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和聚合酶；以及(j)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第四碱基类型的核苷酸同源物。任选地，所述方法可以还包括以下步骤：(k)将核苷酸添加至引发的模板核酸的引物中，从而容器包含延伸的引发的模板核酸；(l)将第二聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物递送至容器；以及(m)使用延伸的引发的模板核酸代替引发的模板核酸并使用第二聚合酶代替聚合酶重复步骤(b)至(j)。

本文的公开内容还包括一种组合物，所述组合物包含与水性溶液接触的多于一种聚合酶-核酸复合物，其中多于一种聚合酶-核酸复合物中的每一种包含聚合酶和引发的模板核酸，并且其中水性溶液包含多元醇、醇、脂肪族二醇、砜、亚砜或其组合。水性溶液可以还包含锂、甜菜碱或两者。

附图简述

图1示出了测序方法的检查子例程的流程图。

图2是比较含异丙醇(SOP)的NSB测量的串扰度量与含1,6己二醇的NSB测量的串扰度量相比的图。

图3是比较含异丙醇(SOP)的NSB测量的串扰度量与含1,7庚二醇的NSB测量的串扰度量相比的图。

图4是比较含异丙醇(SOP)的NSB测量的串扰度量与含1,5戊二醇的NSB测量的串扰度量相比的图。

图5是比较含异丙醇(SOP)的NSB测量的串扰度量与含DMSO的NSB测量的串扰度量相比的图。

图6是比较含异丙醇(SOP)的NSB测量的串扰度量与含乙基甲基砜的NSB测量的串扰度量相比的图。

图7是比较含异丙醇(SOP)的NSB测量的串扰度量与含环丁砜的NSB测量的串扰度量相比的图。

图8是比较含异丙醇(SOP)的NSB测量的串扰度量与含PEG的NSB测量的串扰度量相比的图。

图9是比较含异丙醇(SOP)的NSB测量的串扰度量与含PVA的NSB测量的串扰度量相比的图。

图10A示出了对于具有28％1,6己二醇的NSB流体泡沫获取的第一图像；图10B示出了在对于具有28％1,6己二醇的NSB流体泡沫的第一图像之后1分钟获取的第二图像；图10C示出了对于具有20％异丙醇(SOP)的NSB流体泡沫获取的第一图像；并且图10D示出了在对于具有20％异丙醇(SOP)的NSB流体泡沫的第一图像之后1分钟获取的第二图像。

详细描述

本公开内容提供了可以例如通过解离参与三元复合物的聚合酶、核酸和核苷酸中的两种或更多种之间的相互作用用于修饰分子复合物的组合物和方法。组合物和方法可以用于多种目的，包括：例如，检测复合物；鉴定复合物的特征，诸如参与复合物的核酸中一个或更多个碱基的身份；产生用于用途诸如治疗用途或诊断用途的复合物；修饰复合物以从复合物中去除组分或完全去除复合物。

在一些实施方案中，本文示出的方法和组合物可以用于鉴定引发的模板核酸中的核苷酸。核苷酸可以基于三元复合物的形成来鉴定，所述三元复合物包含引发的模板核酸、在引物3’末端处与模板结合的聚合酶和与聚合酶结合以与模板中与引物3’末端相邻的核苷酸配对的同源核苷酸。可以评价各种不同核苷酸类型形成三元复合物的能力。观察到参与三元复合物形成的核苷酸类型可以被鉴定为正在查询的模板位置的同源核苷酸。基于这一观察和已知的核苷酸配对规则(即，腺嘌呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶配对，并且胞嘧啶与鸟嘌呤配对)，可以推断模板位置处的核苷酸类型。

用于表征引发的模板核酸的有用方法是将聚合酶和第一类型的核苷酸递送至固定的核酸，检查固体支持物以确定固定的核酸对三元复合物组分的募集，将聚合酶和核苷酸从核苷酸被固定的固体支持物上去除，并且然后对不同类型的核苷酸重复该循环。尽管这种方法对于表征核酸是有用的，但是递送和从固体支持物中去除试剂可能是耗时的。此外，这种替代循环消耗相对大量的对生产可能是昂贵试剂的聚合酶。

本公开内容提供了一种方法，其中不同的核苷酸类型可以被连续递送，并且然后从三元复合物被形成和检查的容器中去除。例如，每次递送可以仅包括单一类型的核苷酸或仅包括与预期存在于核酸中的单一类型碱基同源的核苷酸。在另一个实例中，每次递送可以包括一组至少2种、3种、4种或更多种核苷酸类型或一组包括预期存在于核酸中的至少2种、3种、4种或更多种碱基类型的同源物的核苷酸。一种或更多种核苷酸可以在将核苷酸从三元复合物解离的条件下从容器中去除，从而允许核苷酸与引发的模板核酸分离，而不会引起聚合酶的大量(substantial)去除。然后可以将另一种核苷酸递送至引发的模板核酸。如果聚合酶没有从引发的模板核酸的存在中大量去除，则不需要递送更多的聚合酶。这提供了对制备更多聚合酶本来将消耗的时间和资源的节省。

令人惊讶的是，多元醇、二醇和亚砜已经显示出将核苷酸从聚合酶-核酸复合物解离，同时保留聚合酶与核酸之间的缔合。因此，可以使用包含这些化合物的水性溶液将核苷酸从聚合酶-核酸复合物中去除或者用一种核苷酸替代聚合酶-核酸复合物中的另一种核苷酸。更具体地，包含引发的模板核酸、聚合酶和下一个正确核苷酸的三元复合物可以与包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液接触，以便将核苷酸解离同时聚合酶保持与核酸缔合。对于将聚合酶-核酸复合物固定在容器中的表面上的实施方案，然后可以通过将溶液从容器中去除来去除解离的核苷酸。然后可以在三元复合物形成的条件下，将包含与被去除的核苷酸相同或不同类型的核苷酸的新溶液添加至容器中。

该方法可以以多重方式进行，使得不同的核苷酸或核苷酸组被依次递送并且从具有多于一种聚合酶-核酸复合物的容器或固体支持物中去除。例如，包含聚合酶-核酸复合物阵列的容器可以包含与第一类型的核苷酸形成三元复合物的复合物的亚组，第一类型的核苷酸可以使用包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液从三元复合物解离并且从容器中去除，并且然后第二类型的核苷酸可以被递送至容器中，使得已经保留在容器中的聚合酶-核酸复合物的亚组可以与第二类型的核苷酸形成三元复合物。

尽管上述实施方案例示了在每个步骤中递送单一类型的核苷酸，但应当理解，可以在一个或更多个步骤中递送两种或更多种核苷酸类型。核苷酸可以例如使用分别附接至每种类型的核苷酸的不同标记物来区分。

除非另外指明，否则本文使用的术语将被理解为具有它们在相关领域中的普通含义。以下示出了本文使用的若干术语和它们的含义。

如本文使用，术语“阵列”是指附接至一个或更多个固体支持物使得在一个特征处的分子可以与在其他特征处的分子区分开的分子群体。阵列可以包括各自位于固体支持物上的不同可寻址特征的不同分子。可选地，阵列可以包括单独的固体支持物，每个固体支持物起携带不同分子的特征的作用，其中不同的分子可以根据固体支持物在固体支持物被附接的表面上的位置，或者根据固体支持物在液体诸如流体流中的位置来标识。阵列的分子可以是例如核苷酸、核酸引物、核酸模板、引发的模板核酸或核酸酶，诸如聚合酶、连接酶、外切核酸酶或其组合。

如本文使用的，术语“附接”是指两个物体彼此连接、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，反应组分，诸如引发的模板核酸或聚合酶，可以通过共价键或非共价键附接至固相组分。共价键以原子间共有电子对为特征。非共价键是不涉及共有电子对的化学键，并且可以包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水性相互作用和疏水性相互作用。

如本文使用的，术语“二元复合物”是指聚合酶与核酸(例如，引发的模板核酸)(不包括任何核苷酸分子，诸如用于引发的模板核酸的下一个正确核苷酸)之间的分子间缔合物(association)。

如本文使用的，术语“封闭部分”在提及核苷酸使用时，意指在核酸聚合反应期间抑制或阻止核苷酸的3’氧与下一个正确核苷酸形成共价连接的核苷酸的一部分。“可逆地终止的”核苷酸的封闭部分可以从核苷酸类似物中去除，或者以其他方式修饰，以允许核苷酸的3’氧共价连接至下一个正确核苷酸。这样的封闭部分在本文中被称为“可逆终止子部分”。示例性可逆终止子部分在以下中示出：美国专利第7,427,673号；第7,414,116号；第7,057,026号；第7,544,794号或第8,034,923号；或1991年5月16日公布的PCT公布WO 91/06678或2007年11月1日公布的WO 07/123744，所述文献的每一个通过引用并入本文。具有封闭部分或可逆终止子部分的核苷酸可以是核酸诸如引物3’末端处的亚单位，或者核苷酸可以是不共价附接至核酸的单体分子。特别有用的封闭部分将存在于参与形成稳定的三元复合物的核酸的3’末端处。

如本文使用的，术语“催化金属离子”是指通过聚合酶促进核酸(例如，引物)的3’氧与进入核苷酸的磷酸之间的磷酸二酯键形成的金属离子。“二价催化金属阳离子”是具有2的化合价的催化金属离子。催化金属离子可以以稳定聚合酶、核苷酸与引发的模板核酸之间复合物形成的浓度存在，只要不发生磷酸二酯键形成，称为金属离子的非催化浓度。金属离子的催化浓度是指足以使聚合酶催化核酸(例如，引物)的3’氧与进入核苷酸的磷酸部分之间的反应的金属离子的量。

在本文中术语“包含”意图是开放式的，不仅包括所引用的要素，而且还包括任何另外的要素。

如本文使用的，术语“去封闭(deblock)”意指去除或修饰核苷酸的可逆终止子部分，以使核苷酸可延伸。例如，核苷酸可以存在于引物的3’末端，使得去封闭使引物可延伸。示例性去封闭试剂和方法在以下中示出：美国专利第7,427,673号；第7,414,116号；第7,057,026号；第7,544,794号或第8,034,923号；或1991年5月16日公布的PCT公布WO 91/06678或2007年11月1日公布的WO 07/123744，所述文献的每一个通过引用并入本文。

如本文使用的，术语“二醇”是指包含两个且仅两个羟基部分的化学化合物。术语“脂肪族二醇”是指包含两个且仅两个羟基部分的烃。烃可以是饱和的(即，不具有碳-碳双键)或不饱和(即，具有至少一个碳-碳双键)。无论是饱和的还是不饱和的，烃可以是线性的、支链的或环状的。烃可以包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多碳原子。可选地或另外地，烃可以包括至多8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个碳原子。脂肪族二醇也可以称为“乙二醇”。二醇可以是其中两个羟基被附接至同一碳原子上的偕二醇、其中羟基被附接至不同碳原子上的非偕二醇、其中羟基被附接至相邻碳原子上的邻位二醇、其中羟基不附接至相邻碳原子上的非邻位二醇或其中羟基被附接至线性烃末端处的端位二醇。脂肪族二醇的烃不是芳香族的。具有芳香族烃的二醇在本文中称为“芳香族二醇”。

如本文使用的在提及项的集合使用时，术语“每一个(each)”旨在标识集合中的单个项，但不一定指的是集合中的每个项。如果明确披露或上下文另外明确规定，则可能发生例外。

如本文使用的，术语“外源”在提及分子的部分使用时，意指不存在于该分子的天然类似物中的化学部分。例如，核苷酸的外源标记物是天然存在的核苷酸上不存在的标记物。类似地，存在于聚合酶上的外源标记物不存在于在其天然环境中的聚合酶上。

如本文使用的，术语“可延伸的”在提及核苷酸使用时，意味着该核苷酸在3’位置处具有氧或羟基部分，并且如果且在掺入核酸时，能够与下一个正确核苷酸形成共价连接。可延伸的核苷酸可以是引物3’位置处的亚基，或者它可以是单体分子。可延伸的核苷酸将缺乏封闭部分，诸如可逆终止子部分。

如本文使用的，术语“延伸的”在提及引物或其他核酸使用时，是指在至少一个核苷酸掺入至核酸之后的核酸。掺入事件可以是，例如，聚合酶催化的将一个或更多个核苷酸添加至核酸的3’末端，或者连接酶催化的将寡核苷酸添加至核酸。

如本文使用的，术语“延伸”在提及核酸使用时，意指将至少一个核苷酸添加至核酸的3’末端或5’末端的过程。术语“聚合酶延伸”在提及核酸使用时，是指将至少一个核苷酸添加至核酸3’末端的聚合酶催化过程。通过延伸添加至核酸的核苷酸或寡核苷酸被称为掺入核酸中。因此，术语“掺入”可以用于指通过形成磷酸二酯键将核苷酸或寡核苷酸连接至核酸的3’末端或5’末端的过程。

如本文使用的，术语“特征”在提及阵列使用时，意指阵列中存在特定分子的位置。特征可以仅包含单个分子，或者它可以包含同一种类的数个分子的群体(即，分子的集群(ensemble))。可选地，特征可以包括不同种类的分子群体(例如，具有不同模板序列的三元复合物群体)。阵列的特征通常是离散的。离散的特征可以是连续的或它们彼此之间可具有距离。在本文有用的阵列可以具有例如间隔少于100微米、50微米、10微米、5微米、1微米或0.5微米的特征。可选地或另外地，阵列可以具有间隔大于0.5微米、1微米、5微米、10微米、50微米或100微米的特征。特征可以各自具有少于1平方毫米、500平方微米、100平方微米、25平方微米、1平方微米或更少的面积。

如本文使用的，“流通池”是具有检测区的包括一个或更多个通道的容器。检测区可以耦合至检测器，使得可以观察到容器中发生的反应。例如，流通池可以包含拴系至固体支持物的引发的模板核酸分子，向所述固体支持物反复地施用核苷酸和辅助试剂并洗掉。检测区可以包括透明材料，其允许在期望的反应发生之后对样品成像。例如，流通池可以包括包含小流体通道的玻璃或塑料载玻片，聚合酶、dNTP和缓冲液可以泵送通过该通道。通道内的玻璃或塑料可以用一个或更多个待测序的引发的模板核酸分子装饰。外部成像系统可以定位为在检测区处检测分子。示例性流通池、其制造方法和其使用方法在以下中描述：2010年5月6日公布的美国专利申请公布第2010/0111768 A1号或2012年10月5日公布的第2012-0270305 A1号；或2005年7月21日公布的WO 05/065814，所述文献的每一个通过引用并入本文。

如本文使用的，术语“固定的”在提及分子使用时，是指分子直接或间接、共价或非共价附接至表面，诸如固体支持物的表面。在一些实施方案中，共价附接可以是优选的，但是通常所有需要的仅是分子(例如，核酸)在期望表面保留的条件下保持固定或附接至表面。

如本文使用的，术语“标记物”是指提供可检测特性的分子或其部分。可检测的特征可以是，例如，光学信号诸如辐射的吸光度、荧光发射、发光发射、荧光寿命、发光寿命、荧光偏振、发光偏振等；瑞利(Rayleigh)散射或米氏(Mie)散射；对配体或受体的结合亲和力；磁性特性；电特性；电荷；质量；放射性等。示例性标记物包括但不限于荧光团、发光团、发色团、纳米颗粒(例如，金、银、碳纳米管)、重原子、放射性同位素、质量标记物、电荷标记物、自旋标记物、受体、配体等。

如本文使用的，术语“下一个正确核苷酸”是指将在引物的3’末端处结合和/或掺入以补充引物与其杂交的模板链中的碱基的核苷酸(或核苷酸类型)。模板链中的碱基被称为“下一个碱基”，并且紧邻与引物3’末端杂交的模板中碱基的5’。下一个正确核苷酸可以被称为下一个碱基的“同源物”，并且反之亦然。在三元复合物或双链核酸中彼此相互作用的同源核苷酸被称为彼此“配对”。根据Watson-Crick配对规则，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)配对，并且胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)配对。具有与下一个模板碱基不互补的碱基的核苷酸被称为下一个模板碱基的“不正确”、“错配”或“非同源”核苷酸。

如本文使用的，术语“非催化金属离子”是指在聚合酶存在时，不促进核苷酸化学掺入引物所需的磷酸二酯键形成的金属离子。与催化金属离子相比，非催化金属离子可以例如经由竞争性结合与聚合酶相互作用。因此，非催化金属离子可以充当抑制性金属离子。“二价非催化金属离子”是具有2的化合价的非催化金属离子。二价非催化金属离子的实例包括但不限于Ca²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺和Sr²⁺。三价Eu³⁺和Tb³⁺离子是具有3的化合价的非催化金属离子。

如本文使用的，术语“核苷酸”可以用于指天然核苷酸或其类似物。实例包括但不限于核苷酸三磷酸(NTP)诸如核糖核苷酸三磷酸(rNTP)、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)或其非天然类似物诸如二脱氧核糖核苷酸三磷酸(ddNTP)或可逆终止的核苷酸三磷酸(rtNTP)。

如本文使用的，术语“聚合酶”可以用于指核酸合成酶，包括但不限于DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、引发酶和转移酶。通常，聚合酶具有在其处可以发生核苷酸结合和/或核苷酸聚合催化的一个或更多个活性位点。聚合酶可以催化将核苷酸聚合至双链核酸分子的第一条链3’末端。例如，聚合酶催化下一个正确的核苷酸经由磷酸二酯键添加至双链核酸分子的第一链的3’氧部分，从而将核苷酸共价掺入双链核酸分子的第一链。任选地，聚合酶不需要能够在本文所示出方法中使用的一种或更多种条件下掺入核苷酸。例如，突变体聚合酶可以能够形成三元复合物，但不能催化核苷酸掺入。

如本文使用的，术语“聚合酶-核酸复合物”是指聚合酶与核酸之间的分子间缔合。示例性聚合酶-核酸复合物包括但不限于二元复合物、三元复合物或稳定的三元复合物。

如本文使用的，术语“多元醇”是指包含多个羟基部分的有机化合物。示例性多元醇包括二醇(即，具有2个和仅2个羟基部分)、三醇(即，具有3个和仅3个羟基部分)和四醇(即，具有4个和仅4个羟基部分)。

如本文使用的，术语“引发的模板核酸”或“引发的模板”是指具有双链区使得其中一条链起引物作用而另一条链起模板作用的核酸。两条链可以是连续核酸分子的部分(例如，发夹结构)或者两条链可以是彼此不共价附接的可分离分子。

如本文使用的，术语“引物”是指具有与模板序列处或附近的核酸结合的序列的核酸。通常，引物以允许例如经由引物的聚合酶延伸复制模板的构型结合。引物可以是核酸分子的第一部分，所述核酸分子的第一部分与核酸分子的第二部分结合，第一部分是引物序列且第二部分是引物结合序列(例如，发夹引物)。可选地，引物可以是第一核酸分子，所述第一核酸分子与具有模板序列的第二核酸分子结合。引物可以由DNA、RNA或其类似物组成。引物可以具有可延伸的3’末端或阻断引物延伸的3’末端。

如本文使用的，术语“信号”是指与其他能量或信息诸如背景能量或噪声相比可以选择性地观察到的能量或编码信息。信号可以具有期望的或预定义的特征。例如，光学信号可以通过强度、波长、能量、频率、功率、亮度等中的一个或更多个来表征或观察。其他信号可以根据特征诸如电压、电流、电场强度、磁场强度、频率、功率、温度等来表征。光学信号可以以特定的强度、波长或颜色来检测；电信号可以在特定的频率、功率或场强来检测；或者其他信号可以基于与光谱学和分析检测相关的领域中已知的特征来检测。信号不存在被理解为零的信号水平或与背景噪声未有意义地区分的信号水平。

如本文使用的，术语“固体支持物”是指大体上不溶于其接触的液体的刚性基底。基底可以是无孔的或多孔的。基底可以任选地能够吸收液体(例如，由于孔隙率)但通常将是足够刚性的，使得基底在吸收液体时大体上不会膨胀，并且在通过干燥去除液体时大体上不会收缩。无孔固体支持物通常对液体或气体是不可渗透的。示例性的固体支持物包括但不限于玻璃和改性或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯和苯乙烯与其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、Teflon^TM、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂、Zeonor、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、光纤束和聚合物。各种液体中的任何一种，包括但不限于本文所示出的液体，都可以与固体支持物接触。

如本文使用的，术语“亚组”意指一个或更多个事物的集合，所有这些事物都被包含在更大的事物集合中。更大的事物集合可以被称为“组”。亚组可以包括至少1种、2种、10种、100种、1×10³种、1×10⁶种、1×10⁹种或者更多个事物。亚组可以包括组中事物的至少10％、25％、50％、75％、90％、99％或更多。可选地或另外地，亚组可以包括组中的事物的至多99％、90％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、40％、30％、25％、10％或更少。这些事物可以是例如核酸，诸如引物、模板或引物-模板核酸；三元复合物，诸如稳定的三元复合物、聚合酶、核苷酸或本文所示出的其他组合物。

如本文使用的，术语“砜”是指具有结构R-S(＝O)₂-R’的化合物，其中R和R’是有机部分。有机部分可以任选地是烃，诸如脂族链或芳香族链。脂族链或芳香族链可以是线性的、支链的或环状的。有机部分可以包含杂原子诸如氮、氧等。R和R’可以是相同类型的部分，不同类型的部分，或者与单个部分的附接，诸如环状结构。

如本文使用的，术语“亚砜”是指具有结构R-S(＝O)-R’的化合物，其中R和R’是有机部分。有机部分可以任选地是烃，诸如脂族链或芳香族链。脂族链或芳香族链可以是线性的、支链的或环状的。有机部分可以包含杂原子诸如氮、氧等。R和R’可以是相同类型的部分，不同类型的部分，或者与单个部分的附接，诸如环状结构。

如本文使用的，术语“三元复合物”是指聚合酶、双链核酸与核苷酸之间的分子间缔合物。通常，聚合酶促进下一个正确核苷酸与引发的核酸的模板链之间的相互作用。下一个正确核苷酸可以经由Watson-Crick氢键合与模板链相互作用。术语“稳定的三元复合物”意指已经促进或延长存在的三元复合物或者对其的破坏已经被抑制的三元复合物。通常，三元复合物的稳定阻止三元复合物的核苷酸组分共价掺入到三元复合物的引发的核酸组分中。

如本文使用的，术语“类型”用于标识共有相同化学结构的分子。例如，核苷酸的混合物可包括数个dCTP分子。dCTP分子将被理解为彼此相同类型的核苷酸但与dATP、dGTP、dTTP等相比不同类型的核苷酸。类似地，具有相同核苷酸序列的单独DNA分子是相同类型，而具有不同序列的DNA分子是不同类型。术语“类型”也可以标识共有相同化学结构的部分。例如，模板核酸中的胞嘧啶碱基将被理解为彼此相同类型的碱基，与它们在模板序列中的位置无关。

如本文使用的，“容器”是用于将一种化学过程(例如，结合事件；掺入反应；等)与另一种化学过程分离的容器，或者提供化学过程可以发生在其中的空间。结合所公开的技术有用的容器的实例包括但不限于流通池、多孔板的孔；显微镜载玻片；管(例如，毛细管)；液滴、囊泡、试管、托盘、离心管、阵列中的特征、管道(tubing)、基底中的通道等。如本文使用的，“制造容器”是人造的或人为改造的容器，并且其用于将一种化学过程(例如，结合事件；掺入反应；等)与另一种化学过程分离，或者提供化学过程可以发生在其中的空间。

鉴于以上定义，下文示出的以及在权利要求中引述的实施方案能够被理解。

本公开内容提供了一种组合物，包含聚合酶-核酸复合物，其中核酸包括与水性溶液接触的引发的模板核酸，其中水性溶液包含多元醇、二醇、砜或亚砜。聚合酶-核酸复合物可以包含聚合酶和引发的模板核酸，以及任选地三元复合物中的核苷酸。

本文所示出组合物或方法的聚合酶-核酸复合物可以处于多种状态中的任何一种。例如，复合物可以是包含与核酸结合的聚合酶的二元复合物。核酸可以是引发的模板核酸，并且任选地聚合酶可以结合在引发的模板的引物组分的3’末端处或附近。聚合酶-核酸复合物的另一个实例是包含与核酸结合的聚合酶并且还包含核苷酸的三元复合物。核酸通常是引发的模板核酸，并且聚合酶通常结合在引物的3’末端处或附近，使得核苷酸碱基与模板核酸的下一个模板碱基配对。在这种构型中，核苷酸是下一个正确核苷酸，是下一个模板碱基的同源物。

在本文所示出的组合物和方法的一些实施方案中，聚合酶-核酸复合物是三元复合物(例如，稳定的三元复合物)。存在于稳定的三元复合物中的引发的模板核酸分子的引物链在化学上不被在本文所示出方法的一个或更多个步骤期间存在的聚合酶改变。例如，在本文所示出方法的一个或更多个步骤期间，例如在形成稳定的三元复合物、解离稳定的三元复合物或检测稳定的三元复合物的步骤期间，稳定的三元复合物中的引物不需要通过形成新的磷酸二酯键延伸，也不需要通过核溶解降解缩短。

三元复合物可以通过各种方法中的任何一种来稳定。虽然在不存在某些催化金属离子(例如，Mn²⁺或Mg²⁺)的情况下，聚合酶、引发的模板核酸与下一个正确核苷酸之间可以形成三元复合物，在不存在催化金属离子的情况下，核苷酸的化学添加被抑制。低水平或不足水平的催化金属离子引起稳定的三元复合物中下一个正确核苷酸的非共价螯合。

任选地，在引发的模板核酸的引物包含阻止进入核苷酸酶促掺入到引物中的封闭部分(例如，可逆终止子部分)时，可以形成稳定的三元复合物。这种相互作用可以在存在稳定剂的情况下发生，由此聚合酶-核酸相互作用在存在下一个正确核苷酸的情况下是稳定的。引发的模板核酸的引物任选地可以是可延伸引物，或者在其3’末端被阻断延伸的引物(例如，封闭可以通过在引物的3’末端上存在可逆终止子部分来实现)。在下一个正确核苷酸的碱基与引发的模板核酸的下一个碱基互补时，引发的模板核酸、聚合酶和同源核苷酸能够形成稳定的三元复合物。

如上所示出的，有利于或稳定三元复合物的条件可以通过封闭部分(所述封闭部分阻止进入核苷酸酶促掺入到引物中(例如，引物的3’核苷酸上的可逆终止子部分))的存在或者催化金属离子的不存在来提供。其他有用的条件包括三元复合物稳定剂诸如抑制核苷酸掺入的非催化离子(例如，二价或三价非催化金属离子)的存在。非催化金属离子包括但不限于钙离子、锶离子、钪离子、钛离子、钒离子、铬离子、铁离子、钴离子、镍离子、铜离子、锌离子、镓离子、锗离子、砷离子、硒离子、铑离子、铕离子和铽离子。作为另外的选择，可以使用被工程化为阻止催化活性的聚合酶。如此工程化的聚合酶的实例在美国专利第10,584,379号和第10,597,643号中示出，所述专利的每一个通过引用并入本文。

应当理解，本文示出的用于稳定三元复合物的选项不需要相互排斥，而是可以以各种组合使用。例如，三元复合物可以通过一种方法或多种方法的组合来稳定，这些方法包括但不限于聚合酶结构域的交联、聚合酶与核酸的交联、稳定三元复合物的聚合酶突变、聚合酶活性的别构抑制剂、聚合酶活性的无竞争性抑制剂、聚合酶活性的竞争性抑制剂、聚合酶活性的非竞争性抑制剂、不存在催化金属离子、引物上存在封闭部分以及本文示出的其他方法。在本文示出的方法或组合物的一些实施方案中，聚合酶不共价附接至三元复合物的其他组分。此外，聚合酶可以但不需要被共价附接至固体支持物，诸如用于核酸阵列的基底。例如，聚合酶可以在溶液中自由地扩散，但它对附接至固体支持物的三元复合物的组分没有共价亲和力。

本公开内容的三元复合物，无论是否稳定，可以任选地包含一个或更多个外源标记物。标记物可以在形成三元复合物之前附接至三元复合物的组分(例如，附接至聚合酶、模板核酸、引物和/或同源核苷酸)。示例性附接包括共价附接或非共价附接，诸如本文示出的那些、本文引用的参考文献中或本领域已知的那些。在一些实施方案中，将标记的组分以溶液形式递送至未标记的组分附接的固体支持物，从而通过形成三元复合物(例如，稳定的三元复合物)将标记物募集至固体支持物。因此，支持物附接的组分可以基于对募集的标记物的观察来检测或鉴定。无论是在溶液相中使用还是在固体支持物上使用，外源标记物可以对于，例如，在本文示出的方法中检查稳定的三元复合物的步骤期间检测三元复合物或其单独组分是有用的。在组分从稳定的三元复合物解离后，外源标记物可以保持附接至组分。示例性标记物、用于附接标记物的方法和用于使用标记组分的方法在以下中示出：2017年1月26日公布的美国专利申请公布第2017/0022553 A1号；2018年2月15日公布的第2018/0044727 A1号；2018年7月5日公布的第2018/0187245 A1号；以及2018年7月26日公布的第2018/0208983 A1号，所述专利申请的每一个通过引用并入本文。

多种聚合酶中的任何一种都可以用于本文示出的方法或组合物中，例如，形成聚合酶-核酸复合物或进行引物延伸。可以使用的聚合酶包括天然存在的聚合酶及其修饰的变异，包括但不限于突变体、重组体、融合体、遗传修饰、化学修饰、合成物和类似物。天然存在的聚合酶及其修饰的变异不限于具有催化聚合反应能力的聚合酶。任选地，天然存在的和/或其修饰的变异具有在稳定的三元络合物的形成或检查期间不被使用的至少一种条件下催化聚合反应的能力。任选地，参与聚合酶-核酸复合物的天然存在的和/或修饰的变异具有修饰的特性，例如，增强的与核酸的结合亲和力、降低的与核酸的结合亲和力、增强的与核苷酸的结合亲和力、降低的与核苷酸的结合亲和力、增强的对下一个正确核苷酸的特异性、降低的对下一个正确核苷酸的特异性、降低的催化速率、催化无活性等。突变体聚合酶包括例如其中一个或更多个氨基酸被其他氨基酸代替或者一个或更多个氨基酸的插入或缺失的聚合酶。可以用于形成稳定的三元复合物的示例性聚合酶突变体包括，例如，在以下中示出的那些：2020年3月19日公布的美国专利申请公布第2020/0087637 A1号和美国专利第10,584,379号和第10,597,643号，所述专利申请的每一个通过引用并入本文。

修饰的聚合酶包括包含可以用于检测聚合酶的外源标记物部分(例如，外源荧光团)的聚合酶。任选地，可以在使用蛋白分离技术至少部分地纯化聚合酶之后附接标记物部分。例如，外源标记物部分可以使用聚合酶的游离巯基或游离胺部分共价连接至聚合酶。这可涉及通过半胱氨酸残基的侧链或通过N末端的游离氨基部分与聚合酶的共价连接。外源标记物部分也可以经由蛋白融合附接至聚合酶。可以经由蛋白融合附接的示例性标记物部分包括例如绿色荧光蛋白(GFP)、藻胆蛋白(例如，藻蓝蛋白和藻红蛋白)或GFP或藻胆蛋白的波长移位变体。

可选地，参与聚合酶-核酸复合物的聚合酶或用于延伸引物的聚合酶不需要附接至外源标记物。例如，聚合酶不需要共价附接至外源标记物。而是，聚合酶可以缺少任何标记物，直到它任选地与标记的核苷酸和/或标记的核酸(例如，标记的引物和/或标记的模板)缔合。

聚合酶的不同活性可以用于本文示出的方法中。聚合酶可以例如在引物延伸步骤、检查步骤或其组合中是有用的。不同的活性可能由结构的不同(例如，经由自然活性、突变或化学修饰)产生。然而，聚合酶可以从各种已知来源获得，并且根据本文示出的教导和公认的聚合酶活性应用。有用的DNA聚合酶包括但不限于细菌DNA聚合酶、真核生物DNA聚合酶、古细菌DNA聚合酶、病毒DNA聚合酶和噬菌体DNA聚合酶。细菌DNA聚合酶包括大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、II和III、IV和V，大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段，粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)(Cst)DNA聚合酶，热纤梭菌(Clostridium thermocellum)(Cth)DNA聚合酶和硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)(Sso)DNA聚合酶。真核生物DNA聚合酶包括DNA聚合酶α、β、γ、δ、€、η、ζ、λ、σ、μ和κ，以及Revl聚合酶(末端脱氧胞苷转移酶)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。病毒DNA聚合酶包括T4 DNA聚合酶、phi-29DNA聚合酶、GA-l、phi-29样DNA聚合酶、PZA DNA聚合酶、phi-15DNA聚合酶、Cpl DNA聚合酶、Cp7DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶和T4聚合酶。其他有用的DNA聚合酶包括热稳定和/或嗜热DNA聚合酶，诸如水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶、丝状栖热菌(Thermusfiliformis)(Tfi)DNA聚合酶、速生高温球菌(Thermococcus zilligi)(Tzi)DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavusu)(Tfl)DNA聚合酶、乌兹炽热球菌(Pyrococcus woesei)(Pwo)DNA聚合酶、激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)(Pfu)DNA聚合酶和Turbo Pfu DNA聚合酶、海滨嗜热球菌(Thermococcuslitoralis)(Tli)DNA聚合酶、热球菌属物种(Pyrococcus sp.)GB-D聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(Tma)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)(Bst)DNA聚合酶、科达卡拉热球菌(Pyrococcus Kodakaraensis)(KOD)DNA聚合酶、Pfx DNA聚合酶、嗜热球菌属物种(Thermococcus sp.)JDF-3(JDF-3)DNA聚合酶、珊瑚高温球菌(Thermococcus gorgonarius)(Tgo)DNA聚合酶、嗜酸高温球菌(Thermococcus acidophilium)DNA聚合酶；嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)DNA聚合酶；高温球菌属物种(Thermococcus sp.)go N-7DNA聚合酶；隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)DNA聚合酶；沃氏甲烷球菌(Methanococcus voltae)DNA聚合酶；热自养甲烷球菌(Methanococcusthermoautotrophicum)DNA聚合酶；詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)DNA聚合酶；除硫球菌属(Desulfurococcus)菌株TOK DNA聚合酶(D.Tok Pol)；深海热球菌(Pyrococcus abyssi)DNA聚合酶；掘越热球菌(Pyrococcushorikoshii)DNA聚合酶；海岛热球菌(Pyrococcus islandicum)DNA聚合酶；栖烟囱高温球菌(Thermococcus fumicolans)DNA聚合酶；敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)DNA聚合酶；和异二聚体DNA聚合酶DP1/DP2。结合公开的技术，工程化和修饰的聚合酶也是有用的。例如，可以使用极端嗜热的海洋古细菌嗜热球菌属物种(Thermococcus species)9°N的修饰形式(例如，来自New England BioLabs Inc.；Ipswich,MA的Therminator DNA聚合酶)。

有用的RNA聚合酶包括，但不限于，病毒RNA聚合酶诸如T7 RNA聚合酶、T3聚合酶、SP6聚合酶和Kll聚合酶；真核生物RNA聚合酶，诸如RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、RNA聚合酶IV、和RNA聚合酶V；以及古生菌RNA聚合酶。

另一种有用类型的聚合酶是逆转录酶。示例性逆转录酶包括但不限于来自人类免疫缺陷病毒1型的HIV-1逆转录酶(PDB 1HMV)、来自人类免疫缺陷病毒2型的HIV-2逆转录酶、来自莫洛尼鼠白血病病毒的M-MLV逆转录酶、来自禽成髓细胞病病毒的AMV逆转录酶和维持真核生物染色体端粒的端粒酶逆转录酶。

具有固有的3’-5’校正外切核酸酶活性的聚合酶对于一些实施方案可以是有用的。实质上缺少3’-5’校正外切核酸酶活性的聚合酶在一些实施方案例如在大多数基因分型和测序实施方案中也是有用的。外切核酸酶活性的不存在可以是野生型特征或由变体或工程化的聚合酶结构赋予的特征。例如，exo-Klenow片段是突变形式的Klenow片段，其缺少3’-5’校正外切核酸酶活性。Klenow片段和其exo-变体在本文示出的方法或组合物中可以是有用的。

在本文示出的方法或组合物中使用的核酸可以是DNA，诸如基因组DNA、合成DNA、扩增的DNA、互补DNA(cDNA)等。也可以使用RNA，诸如mRNA、核糖体RNA、tRNA等。核酸类似物也可以用作本文的模板。因此，本文使用的模板核酸可以来源于生物来源、合成来源或扩增产物。本文使用的引物可以是DNA、RNA或其类似物。

特别有用的核酸模板是各自包含与基因组的一部分相同的序列的基因组片段。基因组片段群体可以覆盖特定基因组的全部或部分序列。例如，基因组片段群体可以包括基因组的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列。基因组片段可以具有例如与基因组的至少约25个、50个、70个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000或更多个连续核苷酸大体上相同的序列。可选地或另外地，基因组片段可以具有与基因组的不多于1×10⁵个、1×10⁴个、1×10³个、800个、600个、400个、200个、100个、75个、50个或25个连续核苷酸大体上相同的序列。基因组片段可以是DNA、RNA或其类似物。

核酸所源自的示例性生物体包括例如，哺乳动物诸如啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、有蹄类动物、马、绵羊、猪、山羊、牛、猫、犬、灵长类动物、人类或非人类灵长类动物；植物诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米、高粱、燕麦、小麦、稻、油菜或大豆；藻类诸如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)；线虫诸如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)；昆虫诸如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、蚊子、果蝇、蜜蜂或蜘蛛；鱼诸如斑马鱼；爬行动物；两栖动物诸如蛙类动物或非洲爪蟾(Xenopus laevis)；盘基网柄菌(dictyostelium discoideum)；真菌诸如卡氏肺孢子虫(pneumocystis carinii)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、酵母、酿酒酵母(Saccharamoyces cerevisiae)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；或恶性疟原虫(plasmodium falciparum)。核酸还可以来源于原核生物诸如细菌、大肠杆菌(Escherichia coli)、葡萄球菌(staphylococci)或肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae)；古细菌；病毒诸如丙型肝炎病毒、流感病毒、冠状病毒或人类免疫缺陷病毒；或类病毒。核酸可以来源于以上生物体的同质培养物或群体，或者可选地来源于例如一个群落或生态系统中数种不同生物体的集合。可以使用本领域已知的方法分离核酸，所述方法包括例如，在以下中描述的那些：Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)或Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1998)，所述文献的每一个通过引用并入本文。

核酸可以从制备方法，诸如基因组分离、基因组片段化、基因克隆和/或扩增获得。核酸可以由扩增技术诸如聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)等获得。用于分离、扩增和片段化核酸以产生用于分子分析的模板的示例性方法在美国专利第6,355,431号或第9,045,796号中示出，所述专利的每一个通过引用并入本文。也可以使用以下中示出的方法进行扩增：Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)或Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1998)，所述文献的每一个通过引用并入本文。

本文示出的组合物或方法可以根据期望包括天然核苷酸、核苷酸类似物或修饰的核苷酸，以适合特定应用或方法的一些实施方案。任选地，核苷酸类似物具有含氮碱基、五碳糖和磷酸部分，其中与天然核苷酸相比，核苷酸的任何部分都可以被修饰、去除和/或替代。核苷酸类似物可以是不可掺入的核苷酸(即，不能与引物的3’氧反应形成共价连接的核苷酸)。这样的不能掺入的核苷酸包括例如一磷酸核苷酸和二磷酸核苷酸。在另一个实例中，核苷酸可以在5’位置处(例如，在三磷酸部分处)包含使核苷酸不可掺入的一个或更多个修饰。不可掺入核苷酸的实例可以见于美国专利第7,482,120号或第8,632,975号中，所述专利的每一个通过引用并入本文。在一些实施方案中，不可掺入的核苷酸可以随后被修饰为可掺入的。不可掺入的核苷酸类似物包括但不限于α-磷酸修饰的核苷酸、α-β核苷酸类似物、β-磷酸修饰的核苷酸、β-γ核苷酸类似物、γ-磷酸修饰的核苷酸、具有5’硫代磷酸酯部分的核苷酸或笼状核苷酸。核苷酸类似物的另外的实例在美国专利第8,071,755号中描述，所述专利通过引用并入本文。

核苷酸类似物可以包括终止子，其在类似物已经掺入引物之后可逆地阻止随后的核苷酸掺入引物的3’末端处。例如，美国专利第7,544,794号和第8,034,923号(这些专利的公开内容通过引用并入本文)描述了其中3’-OH部分被3’-ONH₂部分替代的可逆终止子。另一种类型的可逆终止子连接至核苷酸的含氮碱基，如例如在美国8,808,989(所述专利的公开内容通过引用并入本文)中示出的。类似地可以与本文描述的方法结合使用的其他可逆终止子包括叠氮基甲基部分或在本文别处引用的参考文献或美国专利第7,956,171号；第8,071,755号和第9,399,798号中描述的其他部分；所述专利的每一个通过引用并入本文。在某些实施方案中，可逆终止子部分可以在称为“去封闭”的过程中被修饰或从引物中去除，允许随后的核苷酸掺入。用于去封闭的组合物和方法在本文引用的关于可逆终止子的参考文献中示出。

可选地，核苷酸类似物不可逆地阻止核苷酸掺入它们已经掺入的引物的3’末端处。不可逆核苷酸类似物包括2’,3’-双脱氧核苷酸(ddNTP，诸如ddGTP、ddATP、ddTTP、ddCTP)。双脱氧核苷酸缺乏dNTP的3’-OH部分，否则该部分将参与聚合酶介导的引物延伸。因此，3’位置具有氢部分而不是天然羟基部分。不可逆地终止的核苷酸可以对于基因分型应用或不需要沿模板核酸的引物延伸或顺序检测的其他应用是特别有用的。

在一些实施方案中，在本文示出的方法或组合物中使用的核苷酸可以包含外源标记物，例如发光团。任选地，外源标记的核苷酸可以包括可逆或不可逆的终止子部分，外源标记的核苷酸可以是不可掺入的，外源标记的核苷酸可以缺乏封闭部分，外源标记的核苷酸可以是可掺入的，或者外源标记的核苷酸可以是可掺入的和非终止的两者。在用于与未标记的聚合酶形成稳定的三元复合物时，外源标记的核苷酸可以是特别有用的。例如，标记物可以产生在本文示出的方法中检测到的发光。可选地，核苷酸上的外源标记物可以提供荧光共振能量转移(FRET)对中的一个配偶体，并且聚合酶上的外源标记物可以提供该对中的第二个配偶体。因此，FRET检测可以用于鉴定包含两个配偶体的稳定的三元复合物。

可选地，参与形成三元复合物的核苷酸可以缺乏外源标记物(即，核苷酸可以是“未标记的”)。任选地，未标记的核苷酸可以包括可逆或不可逆的终止子部分，未标记的核苷酸可以是不可掺入的，未标记的核苷酸可以缺乏终止子部分，未标记的核苷酸可以是可掺入的，或者未标记的核苷酸可以是可掺入的和非终止的两者。在聚合酶上的标记物用于检测稳定的三元复合物时，未标记的核苷酸可以是有用的。未标记的核苷酸也可以在本文示出的方法的延伸步骤中是有用的。应当理解，核苷酸的部分或功能的不存在是指大体上没有这样的功能或部分的核苷酸。还应当理解，本文示出的核苷酸或其类似物的一种或更多种功能或部分，或本领域以其他方式已知的核苷酸或其类似物的一种或更多种功能或部分，可以在本文示出的方法或组合物中具体省略。

任选地，本文示出的组合物或方法包括一种或更多种不同类型的核苷酸(例如，天然核苷酸或合成核苷酸类似物)。例如，可以存在至少1种、2种、3种、4种或更多种核苷酸类型。可选地或另外地，可以存在至多4种、3种、2种或1种核苷酸类型。类似地，存在的一种或更多种核苷酸类型可以是模板核酸中至少1种、2种、3种或4种碱基类型的同源物。可选地或另外地，存在的一种或更多种核苷酸类型可以是模板核酸中至多4种、3种、2种或1种碱基类型的同源物。

在一些实施方案中，核苷酸将不具有阻止参与三元复合物(例如，稳定的三元复合物)的修饰。核苷酸可以永久地或短暂地与聚合酶结合。任选地，核苷酸类似物例如经由共价接头与聚合酶融合。任选地，将多于一种核苷酸类似物与多于一种聚合酶融合，其中每种核苷酸类似物与不同的聚合酶融合。任选地，存在于稳定的三元复合物中的核苷酸不是稳定三元复合物的手段。因此，在利用核苷酸类似物的反应中，可以组合多种其他三元复合物稳定方法中的任何一种。

在本文示出的方法或组合物的一些实施方案中，聚合酶-核酸复合物或复合物的组分诸如核苷酸、聚合酶或核酸可以包含外源标记物。外源标记物可以附接至待检测的各种分子、试剂、固体支持物、容器或其他物品中的任何一种或与之缔合。

有用的外源标记物的实例包括但不限于放射性标记物部分、发光团部分、荧光团部分、量子点部分、发色团部分、酶部分、电磁自旋标记部分、纳米颗粒光散射部分和本领域已知的各种其他信号产生部分中的任何一种。合适的酶部分包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。示例性荧光团部分包括但不限于伞形花内酯、荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、绿色荧光蛋白及其波长偏移变体、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、二苯乙烯、Lucifer Yellow^TM、Cascade Blue^TM、TexasRed^TM、

染料、

染料、丹磺酰氯、藻红蛋白、藻蓝蛋白、荧光镧系复合物诸如包括铕和铽的那些、Cy3、Cy5、Cy7、Alexa

染料和本领域已知的其他染料，诸如以下中描述的那些：Principles of Fluorescence Spectroscopy,Joseph R.Lakowicz(编者),Plenum Pub Corp,第2版(July 1999)和Richard P.Hoagland的第6版的Molecular Probes Handbook。

二级标记物可以是有用的。二级标记物是可以与配偶体部分特异性结合的结合部分。例如，配体部分可以附接至聚合酶、核酸或核苷酸，以允许经由配体对可检测受体诸如标记的受体的特异性亲和力进行检测。可以使用的示例性结合部分对包括但不限于抗原和免疫球蛋白或其活性片段，诸如单链可变片段(scFv)或抗原结合片段(Fab)；免疫球蛋白和免疫球蛋白(或分别为活性片段)；抗生物素蛋白和生物素，或其对抗生物素蛋白具有特异性的类似物；链霉抗生物素蛋白和生物素，或其对链霉抗生物素蛋白具有特异性的类似物；互补寡核苷酸；或者碳水化合物和凝集素。

在一些实施方案中，二级标记物可以是化学可修饰的部分。在该实施方案中，具有反应性官能团部分的标记物可以掺入稳定的三元复合物中。随后，官能团部分可以与初级标记物部分共价反应。合适的官能团部分包括但不限于氨基部分、羧基部分、马来酰亚胺部分、氧代部分和硫醇部分。

在一些实施方案中，聚合酶-核酸复合物或参与形成这样的复合物的组分可以缺乏外源标记物。例如，三元复合体和参与三元复合体的所有组分(例如，聚合酶、模板核酸、引物和/或同源核苷酸)可以缺少本文或以上并入的参考文献中描述的一个、几个或所有外源标记物。在这样的实施方案中，三元复合物(例如，稳定的三元复合物)可以基于三元复合物的固有特性，诸如质量、电荷、固有光学特性等来检测。用于检测未标记的三元复合物的示例性方法在以下中示出：2017年1月26日公布的美国专利申请公布第2017/0022553 A1号和2018年2月15日公布的第2018/0044727 A1号；以及2017年7月6日公布的WO 2017/117243，所述公布的每一个通过引用并入本文。

稳定的三元复合物或能够参与三元复合物形成的组分可以附接至表面，诸如固体支持物中或其上的表面。固体支持物可以由用于分析生物化学的各种材料中的任何一种制成。合适的材料可以包括玻璃、聚合物材料、硅、石英(熔融二氧化硅)、borofloat玻璃、二氧化硅、二氧化硅基材料、碳、金属、光纤或光纤束、蓝宝石或塑料材料。可以基于特定用途所期望的特性来选择材料。例如，对期望的辐射波长透明的材料对于将利用该波长辐射的分析技术是有用的。相反，可能期望的是，选择不通过特定波长辐射的材料(例如，不透明的、吸收性的或反射性的)。可以利用的材料的其他特性是对特定方法中使用的某些试剂的惰性或反应性、易于操作或低制造成本。

特别有用的固体支持物是颗粒，诸如珠或微球。珠群体可以用于聚合酶-核酸复合物群体或能够形成复合物的组分(例如，聚合酶、模板、引物或核苷酸)的附接。使用这样的配置可能是有用的，其中每个珠具有单一类型的复合物或能够形成复合物的单一类型的组分。例如，单个珠可以附接至单一类型的二元复合物、单一类型的三元复合物、单一类型的引发的模板核酸、单一类型的引物、单一类型的模板、单一类型的聚合酶或单一类型的核苷酸。在一些实施方案中，不同类型的组分不需要在逐个珠的基础上分离。因此，单个珠可以携带多种不同类型的聚合酶-核酸复合物、模板核酸、引物、引发的模板核酸和/或核苷酸。

珠的组成可以变化，这取决于例如待使用的附接的形式、化学和/或方法。示例性珠组合物包括用于蛋白和核酸捕获方法的固体支持物和赋予其的化学功能。这样的组合物包括例如塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、三聚氰胺、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁材料、二氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、胶乳或交联的右旋糖酐诸如Sepharose^TM、纤维素、尼龙、交联胶束和Teflon^TM以及来自Bangs Laboratories,Fishers Ind.的”MicrosphereDetection Guide”中示出的其他材料，所述文献通过引用并入本文。

在一些实施方案中，珠可以成阵列或以其他方式在空间上被区分。可以被使用的示例性的基于珠的阵列包括但不限于从Illumina,Inc.(San Diego,CA)可得的BeadChip^TMArray或诸如在以下中描述的那些阵列：美国专利第6,266,459号、第6,355,431号、第6,770,441号、第6,859,570号和第7,622,294号或2000年10月26日公布的PCT公布第WO 00/63437号，所述文献的每一个通过引用并入本文。珠可以位于固体支持物上的离散位置，诸如孔，从而每个位置容纳单个珠。可选地，珠驻留的离散位置可以各自包括多于一个珠，如例如在以下中描述的：2004年12月30日公布的美国专利申请公布第2004/0263923 A1号、2004年11月25日公布的第2004/0233485 A1号、2004年7月8日公布的第2004/0132205 A1号和2004年7月1日公布的第2004/0125424 A1号，所述文献的每一个通过引用并入本文。

从以上珠阵列实施方案可以认识到，本公开内容的方法可以以多重形式进行，从而并行操作多种不同的分析物。操作可以是例如分析物的检测、分析物的合成、分析物的修饰、复合分析物的解离、分析物缔合为复合物等。尽管还可能的是，使用本文示出方法的一个或更多个步骤连续操作不同类型的分析物，但并行处理可以提供成本节约、时间节约和条件的均匀性。本公开内容的设备或方法可以包括至少2种、10种、100种、1×10³种、1×10⁴种、1×10⁵种、1×10⁶种、1×10⁹种或更多种不同的分析物。可选地或另外地，本公开内容的设备或方法可以包括至多1×10⁹种、1×10⁶种、1×10⁵种、1×10⁴种、1×10³种、100种、10种、2种或更少种不同的分析物。可以使用多种分析物中的任何一种，诸如聚合酶-核酸复合物或参与复合物形成的组分。因此，本文示出的在设备或方法中有用的各种试剂或产物(例如，引发的模板核酸、聚合酶、核苷酸或稳定的三元复合物)可以被多重化以在这些范围内具有不同的类型或种类。存在于阵列中的不同分析物可以位于阵列的不同特征处。因此，从特征获取的信号将指示存在于该特征处的特定分析物(例如，不同的核酸序列)。

可以使用的商购可得阵列的另外的实例包括例如Affymetrix GeneChip^TM阵列。点样阵列根据一些实施方案也可以被使用。示例性点样阵列是由Amersham Biosciences商业化的CodeLink^TM阵列。另一个有用的阵列是使用喷墨印刷方法制造的阵列，所述喷墨印刷技术诸如由Agilent Technologies商业化的SurePrint^TM技术。

其他有用的阵列包括在核酸测序应用中使用的那些。例如，用于附接基因组片段扩增子(通常称为簇)的阵列可以是特别有用的。可以在本文使用的核酸测序阵列的实例包括以下中描述的那些：Bentley等人，Nature456:53-59(2008)，1991年5月16日公布的PCT公布第WO 91/06678号；2004年3月4日公布的第WO 04/018497号，和2007年11月11日公布的第WO 07/123744号；美国专利第7,057,026号；第7,211,414号；第7,315,019号；第7,329,492号和第7,405,281号；或2008年5月8日公布的美国专利申请公布第2008/0108082号，所述文献的每一个通过引用并入本文。

分析物，诸如核酸，可以以在单个分子水平或集群水平上提供分析物检测的方式附接至支持物。例如，多于一种不同的核酸可以以使得在支持物上的一个核酸分子上形成的单个稳定的三元复合物可以与在支持物的核酸分子上形成的所有相邻三元复合物区分开的方式附接至固体支持物。因此，一种或更多种不同的核酸可以以下面的格式附接至固体支持物：每个单个核酸分子以使得将单个核酸分子与固体支持物上的所有其他核酸分子分辨开的方式物理分离和检测。类似地，一种或更多种不同的聚合酶-核酸复合物可以以下面的格式附接至固体支持物：每个单个聚合酶-核酸复合物以使得将单个聚合酶-核酸复合物与固体支持物上的所有其他聚合酶-核酸复合物分辨开的方式物理分离和检测。

在一些实施方案中，本公开内容的方法可以针对一个或更多个核酸集群进行，核酸集群是具有共同模板序列的核酸群体。集群可以包括例如至少2个、10个、50个、100个、500个、1000个或更多个具有共同模板序列的核酸。可选地或另外地，集群可以包括至多、至多约、至少、至少约或1000个、500个、100个、50个、10个、2个或这些值中任何两个之间的范围的具有共同模板序列的核酸。存在于阵列特征处的集群可以是克隆的，使得该特征处的大体上所有核酸具有共同的模板序列。然而，特征不需要包含核酸的克隆群体。而是，特征可以包含核酸的混合群体，其中特定模板序列存在于大多数核酸中。例如，处于特定特征处的核酸群体可以包括具有特定模板序列的至少51％、60％、75％、90％、95％或99％或更多种类。具有非克隆核酸群体的特征可以在允许群体作为集群被检测的条件下被检测，从而从该特征获取的总信号代表由非克隆群体产生的信号的平均值。只要污染核酸作为少数存在于感兴趣的特征处，平均信号就可以提供表征该特征处大多数模板核酸的手段。

可以使用聚簇方法将一个或更多个集群附接至固体支持物。因此，阵列可以具有多于一个集群，每个集群被称为该格式的聚簇或阵列特征。可以使用本领域已知的方法诸如桥接扩增或乳液PCR形成聚簇。有用的桥接扩增方法在以下中描述：例如，美国专利第5,641,658号和第7,115,400号；2002年5月9日公布的美国专利公布第2002/0055100 A1号；2004年1月1日公布的第2004/0002090 A1号；2004年5月20日公布的第2004/0096853 A1号；2007年6月7日公布的第2007/0128624A1号；及2008年1月10日公布的第2008/0009420 A1号。乳液PCR方法包括例如以下中描述的方法：Dressman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:8817-8822(2003)，WO 05/010145或2005年6月16日公布的美国专利公布第2005/0130173 A1号和2005年3月24日公布的第2005/0064460 A1号，所述文献的每一个通过引用以其整体并入本文。另一种用于在表面上扩增核酸的有用方法是滚环扩增(RCA)，例如，如以下中描述的：Lizardi等人，Nat.Genet.19:225-232(1998)或2007年5月3日公布的美国2007/0099208 A1，所述文献的每一个通过引用并入本文。

在一些实施方案中，聚合酶-核酸复合物、聚合酶、引物、模板、引发的模板核酸和核苷酸中的一种或更多种附接至流通池表面或流通池中的固体支持物。流通池通过使溶液通过进出(into and out)接触支持物结合的分析物的流体室，允许方便的流体操作。流通池还提供对流体操纵的一个或更多个分析物的检测。例如，检测器可以被定位为检测来自固体支持物的信号，诸如来自由于稳定的三元复合物的形成而被募集至固体支持物的标记物的信号。可以使用的示例性流通池在例如以下中描述：美国专利申请公布第2010/0111768 A1号或第2012/0270305 A1号或第WO 05/065814号，所述专利申请的每一个通过引用并入本文。

在一些实施方案中，聚合酶-核酸复合物(例如，三元复合物)的组分中仅一种被独立地固定。在一些实施方案中，聚合酶-核酸复合物(例如，三元复合物)的组分中的两种或更多种被独立地固定。例如，引发的模板核酸可以独立地固定在固体支持物上，使得它不依赖于与聚合酶核酸复合物的其他组分缔合而保持固定。类似地，聚合酶可以独立地固定在固体支持物上，使得它不依赖于与聚合酶核酸复合物的其他组分缔合而保持固定。固定可以由用于将分析物附接至如本文示出或结合本文阵列引用的参考文献中的阵列的化学品介导。在这样的实施方案中，三元复合物可以使用本文示出的试剂来解离，所述试剂选择性地将核苷酸从聚合酶和引发的模板核酸解离，同时维持聚合酶和引发的模板核酸之间的缔合。只要聚合酶和引发的模板核酸中的一个独立地固定至固体支持物，这种缔合就可以用来保留聚合酶和引发的模板核酸。然后核苷酸可以通过将包含核苷酸的流体与固体支持物分离来去除。

在一些实施方案中，表面固定的聚合酶-核酸复合物共价附接至表面。例如，表面固定的聚合酶-核酸复合物的聚合酶可以共价附接至表面。可选地或另外地，表面固定的聚合酶-核酸复合物的引发的模板核酸可以共价地附接至表面。可选地或另外地，表面固定的聚合酶-核酸复合物非共价地附接至表面。例如，附接可以由配体与受体的结合引起，其中配体附接至聚合酶-核酸复合物且受体附接至表面，或者反之亦然。在用于包括将核苷酸从聚合酶-核酸复合物解离的步骤的方法中时，附接手段可以对用于解离的试剂和条件是惰性的。以该方式，聚合酶-核酸复合物可以在核苷酸解离时被保留。

各种容器中的任何一种都可以用于本文示出的方法或组合物。例如，容器可以选自由以下组成的组：流通池、多孔板中的孔、液滴、囊泡、试管、托盘、离心管、管道和基底中的通道。在认为适当的情况下，可以使用分子生物学、生物化学、分析化学或其他相关领域中已知的其他容器。

在本文示出的组合物和方法的一些实施方案中，聚合酶-核酸复合物或能够形成该复合物的至少一种组分可以与包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液接触。相对于溶液中的一种或更多种其他溶剂，水性溶液可以包括以体积比体积(v/v)基础的至少25％的水。例如，水性溶液可以包括至少35％、51％、75％、90％、95％、99％或更多(v/v)的水。通常，水性溶液将是单相溶液。然而，多相溶液诸如泡沫(水性溶液中的气泡)、乳液(水性溶液中的水不混溶溶剂液滴)或浆料(水性溶液中的固相颗粒)在本文示出的一些方法和组合物中可以是有用的。参见，例如，2020年6月4日公布为US20200171498的美国专利申请系列第16/700,422号和2019年4月25日公布的美国专利申请公布第2019/0119740 A1号，所述专利申请的每一个通过引用并入本文。

水性溶液可以包含用于通过将核苷酸从复合物解离而不将聚合酶从引发的模板解离来修饰三元复合物(即，在引发的模板、聚合酶与核苷酸之间的复合物)的一种或更多种剂。有用的剂包括多元醇、二醇、砜、亚砜及其任意组合。

有用的多元醇包括例如低分子量多元醇诸如本文示出的二醇或聚合物二醇诸如聚乙二醇(PEG)和聚乙烯醇(PVA)。有用的多元醇可以具有至多100千道尔顿(kDa)、50kDa、30kDa、20kDa、10kDa或更少的分子量。可选地或另外地，多元醇可以具有至少10kDa、20kDa、30kDa、50kDa、100kDa或更多的分子量。

在本文的方法或组合物中使用的水性溶液可以包含溶液的至少约0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的量的多元醇。可选地或另外地，水性溶液可以包含至多约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％、0.5％或更少的多元醇。

有用的二醇包括例如脂肪族二醇、饱和脂肪族二醇、不饱和脂肪族二醇、芳香族二醇、偕二醇、邻位二醇或端位二醇。任选地，二醇可以具有线性碳链。任选地，二醇可以具有非支链碳链。任选地，二醇可以具有支链碳链。具有烃链的二醇可以包括具有至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多碳原子的线性链或支链链。可选地或另外地，二醇的线性或支链烃链可以包括至多8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个碳原子。

特别有用的脂肪族二醇包括例如丙二醇、1,3丁二醇、1,5戊二醇、1,6己二醇和1,7庚二醇。

在本文的方法或组合物中使用的水性溶液可以包含溶液的至少约0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的量的二醇。可选地或另外地，水性溶液可以包含至多约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％、0.5％或更少的二醇。

有用的亚砜包括例如砜。示例性亚砜包括但不限于二甲基亚砜、乙基甲基砜和环丁砜。

在本文的方法或组合物中使用的水性溶液可以包含溶液的至少约0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的量的亚砜。可选地或另外地，水性溶液可以包含至多约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％、0.5％或更少的亚砜。

通常，水性溶液将包含可混溶于水或以可溶于水性溶液的量存在的多元醇、二醇、砜或亚砜。在一些实施方案中，盐和有机溶剂(例如，醇)两者例如各自以本文示出的量存在。

用于将核苷酸从三元复合物解离的另外的有用的化学条件是生理范围外的pH(例如，处于或低于pH 6、5或4；处于或高于pH 8、9或10)。其他可以是有用的试剂包括但不限于氧化还原试剂，诸如二硫苏糖醇、谷胱甘肽或2-巯基乙醇；去垢剂，诸如阴离子、阳离子或两性离子去垢剂；或者与核苷酸结合的蛋白(例如，与聚合酶竞争与核苷酸结合的蛋白)。本文示出的用于将核苷酸从三元复合物解离的化学条件可以以各种组合使用(例如，水性溶液可以具有生理范围内或生理范围外的pH，并且还可以包括可混溶的有机溶剂)。作为另外的选择，用于将核苷酸从三元复合物解离的一种或更多种化学条件可以与用于将核苷酸从三元复合物解离的物理条件组合。

包含多元醇、二醇、砜、亚砜或其组合的水性溶液可以还包含锂和/或甜菜碱。在一些实施方案中，水性溶液包含锂。锂可以处于以下的浓度：至少5mM、10mM、25mM、50mM、100mM、250mM或更高。可选地或另外地，锂可以以至多250mM、100mM、50mM、25mM、10mM、5mM或更少的浓度存在。在一些实施方案中，水性溶液包含甜菜碱。甜菜碱可以以至少1mM、10mM、50mM、100mM、500mM、1M、2M、3M、3.5M或更高的浓度存在。可选地或另外地，甜菜碱可以以至多3.5M、2M、1M、500mM、100mM、50mM、10mM、1mM或更少的浓度存在。在一些实施方案中，水性溶液包含锂和甜菜碱。例如，可以使用锂或甜菜碱，如美国专利第10,400,272号中示出的，所述专利通过引用并入本文。

特别有用的多元醇、二醇、砜或亚砜是不易燃的那些。因此，剂本身或包含该剂的水性溶液可以具有高于100℉(38℃)的闪点。可选地或另外地，剂或包含该剂的水性溶液可以具有在监管机构(诸如美国政府管辖下的那些)所使用的危险材料鉴定系统(HMIS)中的0、1或2的易燃性评定。

另一个可以是有用的特征是多元醇、二醇、砜或亚砜维持流体泡沫的能力。因此，包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液可以能够维持泡沫中最小数量的气泡、泡沫中最小尺寸的气泡、泡沫中最大尺寸的气泡等。例如，气泡的数量可以定量为流体泡沫中气泡浓度(即，体积分数)并且浓度可以是特定容器中流体泡沫总体积的至少0.01％、0.1％、1％、5％、10％、25％、50％、75％、90％、95％、99％或更多。关于气泡尺寸，包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液可以支持具有大于10nm、50nm、100nm、1μm、10μm、100μm、500μm或更大的有效直径的气泡。可选地或另外地，包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液可以支持具有小于500μm、100μm、10μm、1μm、100nm、50nm、10nm或更小的有效直径的气泡。任选地，包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液可以支持具有小于气泡所驻留的通道或其他容器的直径的有效直径的气泡。乳液中液滴的数量和/或尺寸可以在本文关于泡沫中的气泡示出的范围内。可以制造和使用泡沫和乳液，例如，如2020年6月4日公布为US20200171498的美国专利申请系列第16/700,422号中示出的，所述专利申请通过引用并入本文。

应当理解，本公开内容的组合物或方法可以配置为包括本文示出的多元醇、二醇、砜或亚砜中的两种或更多种的组合。例如，在期望一种化合物用于将一种类型的核苷酸从聚合酶-核酸复合物中去除，并且期望第二种类型的化合物用于将第二种类型的核苷酸从聚合酶-核酸复合物中去除时，组合可以是有用的。

化合物的组合可以包含共有特定特征(诸如是同一类型的化合物)的两种或更多种化合物。例如，组合可以包括两种或更多种多元醇、两种或更多种三醇、两种或更多种四醇、两种或更多种二醇、两种或更多种脂肪族二醇、两种或更多种芳香族二醇、两种或更多种端位二醇、两种或更多种具有四至七个碳原子的二醇、两种或更多种具有五至七个碳原子的二醇、两种或更多种亚砜、两种或更多种砜等。在一些实施方案中，组合可以包括具有不同特征(诸如是不同类型的化合物)的两种或更多种化合物。例如，组合可以包括二醇和本文示出的亚砜、砜、多元醇或其他类型化合物中的至少一种；脂肪族二醇和本文示出的亚砜、砜、多元醇或其他类型化合物中的至少一种；端位二醇和本文示出的亚砜、砜、多元醇或其他类型化合物中的至少一种；具有四至七个碳原子的碳链的二醇和本文示出的亚砜、砜、多元醇或其他类型化合物中的至少一种；具有五至七个碳原子的碳链的二醇和本文示出的亚砜、砜、多元醇或其他类型化合物中的至少一种；等。

因此，在本文的方法或组合物中使用的水性溶液可以包含两种或更多种化合物，其组合相当于水性溶液的至少约0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。可选地或另外地，在本文的方法或组合物中使用的水性溶液可以包含两种或更多种化合物，其组合相当于水性溶液的至多约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或0.5％。

应当理解，本公开内容的组合物或方法可以配置为缺乏多元醇、二醇、砜或亚砜，包括但不限于本文示出的特定类型的多元醇、二醇、砜或亚砜；具有本文示出的特定特征的多元醇、二醇、砜或亚砜；或本文示出的特定多元醇种类、二醇种类、砜种类或亚砜种类。

本公开内容提供了一种用于修饰聚合酶-核酸复合物的方法。所述方法可以包括以下步骤：(a)提供多于一种聚合酶-核酸复合物，各自包含聚合酶和引发的模板核酸，其中至少一个亚组的聚合酶-核酸复合物是还包含核苷酸的三元复合物；以及(b)使多于一种聚合酶-核酸复合物与包含多元醇、醇、脂肪族二醇、砜、亚砜或其组合的水性溶液接触，从而将核苷酸从聚合酶-核酸复合物的亚组解离。水性溶液可以例如还包含锂、甜菜碱或两者。在一些实施方案中，多于一种聚合酶-核酸复合物可以被固定在表面上，存在于容器中，或者两者。步骤(b)使多于一种聚合酶-核酸复合物与水性溶液接触可以包括将上面固定有多于一种聚合酶-核酸复合物的表面用水性溶液洗涤，从而将核苷酸从容器中的所述亚组的是三元复合物的聚合酶-核酸复合物中去除。在一些实施方案中，所述方法可以包括以下步骤：(a)在容器中提供多于一种表面固定的聚合酶-核酸复合物，其中核酸包括引发的模板核酸，其中至少一个亚组的表面固定的聚合酶-核酸复合物包括还包含核苷酸的三元复合物；以及(b)将表面用包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液洗涤，从而将核苷酸从容器中去除并且将表面固定的聚合酶-核酸复合物保留在容器中。

如本文描述的，在一些情况下，将核苷酸从三元复合物解离是有利的，从而允许核苷酸从引发的模板核酸中分离，而不会引起聚合酶的实质上去除，而聚合酶的产生和递送至引发的模板核酸是昂贵且耗时的。本文公开的方法和组合物能够节省时间和资源。例如，使用本文公开的方法和组合物，在使多于一种聚合酶-核酸复合物与水性溶液接触之后，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些数字中任何两个之间的数字或范围的聚合酶可以保留在多于一种聚合酶-核酸复合物中。使用本文公开的方法和组合物，在将多于一种聚合酶-核酸复合物与水性溶液接触之后，至少或至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的聚合酶可以保留在多于一种聚合酶-核酸复合物中。在一些实施方案中，在使多于一种聚合酶-核酸复合物与水性溶液接触之后，至少50％的聚合酶保留在多于一种聚合酶-核酸复合物中。在一些实施方案中，在使多于一种聚合酶-核酸复合物与水性溶液接触之后，至少70％的聚合酶保留在多于一种聚合酶-核酸复合物中。例如，使用本文公开的方法和组合物，在使多于一种聚合酶-核酸复合物与水性溶液接触之后，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的聚合酶可以从多于一种聚合酶-核酸复合物解离。使用本文公开的方法和组合物，在使多于一种聚合酶-核酸复合物与水性溶液接触之后，至多或至多约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的聚合酶从多于一种聚合酶-核酸复合物解离。在一些实施方案中，至多5％的聚合酶从多于一种聚合酶-核酸复合物解离。在一些实施方案中，至多20％的聚合酶从多于一种聚合酶-核酸复合物解离。

使用本文公开的方法和组合物，在使多于一种聚合酶-核酸复合物与水性溶液接触之后，40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些数字中任何两个之间的数字或范围的来自三元复合物的核苷酸可以从该三元复合物解离。使用本文公开的方法和组合物，在使多于一种聚合酶-核酸复合物与水性溶液接触之后，至少或至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些数字中任何两个之间的数字或范围的来自三元复合物的核苷酸可以从该三元复合物解离。在一些实施方案中，至少50％的核苷酸从三元复合物解离。在一些实施方案中，至少70％的核苷酸从三元复合物解离。避免核苷酸在三元复合物中的实质保留可以是有利的。例如，使用本文公开的方法和组合物，在使多于一种聚合酶-核酸复合物与水性溶液接触之后，0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％，或这些数字中任何两个之间的数字或范围的来自三元复合物的核苷酸可以从该三元复合物解离。使用本文公开的方法和组合物，在使多于一种聚合酶-核酸复合物与水性溶液接触之后，至多或至多约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％的来自三元复合物的核苷酸可以从该三元复合物解离。

可以以多种方式中的任何一种提供多于一种表面固定的聚合酶-核酸复合物。例如，复合物可以在进行其修饰的方法之前已经被形成和/或固定。复合物可以在另一位置处生产，并且运送至使用该复合物例如来进行本文示出的方法的个体。因此，在本文示出的方法中使用之前，可以从储存位置(例如，冷藏或冷冻储存位置)取回多于一种表面固定的聚合酶-核酸复合物。

在一些实施方案中，多于一种表面固定的聚合酶-核酸复合物可以被制备为本文示出的方法的一部分。在这方面，用于修饰聚合酶-核酸复合物的方法可以包括以下步骤：(a)在容器中提供多于一种表面固定的聚合酶-核酸复合物，其中核酸包括引发的模板核酸，其中至少一个亚组的表面固定的聚合酶-核酸复合物包括还包含核苷酸的三元复合物；以及(b)将表面用包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液洗涤，从而将核苷酸从容器中去除并且将表面固定的聚合酶-核酸复合物保留在容器中，其中步骤(a)包括使多于一种聚合酶与多于一种引发的模板核酸并与多于一种核苷酸接触，从而在容器中提供多于一种表面固定的聚合酶-核酸复合物，表面固定的聚合酶-核酸复合物中的每一种包含多于一种聚合酶中的聚合酶和多于一种引发的模板核酸中的引发的模板核酸，三元复合物中的核苷酸是多于一种核苷酸中的核苷酸。

在以上方法(或本文示出的其他方法)的一些实施方案中，在与多于一种引发的模板核酸接触之前，可以将多于一种聚合酶附接至表面。可选地，在与多于一种聚合酶接触之前，可以将多于一种引发的模板核酸附接至表面。通常，在结合在一起形成聚合酶-核酸复合物之前，聚合酶和核酸中仅一种被表面固定。因此，第二组分由于产生表面固定的聚合酶-核酸复合物的结合事件而变得固定。

在以上方法(或本文示出的其他方法)的一些实施方案中，多于一种表面固定的聚合酶-核酸复合物通过使多于一种聚合酶与多于一种引发的模板核酸和与多于一种核苷酸同时接触来形成。可选地，多于一种表面固定的聚合酶-核酸复合物通过使多于一种聚合酶与多于一种引发的模板核酸并与多于一种核苷酸依次接触来形成。例如，多于一种引发的模板核酸可以最初与多于一种聚合酶接触，并且然后与多于一种核苷酸接触。在另一个实例中，多于一种聚合酶可以最初与多于一种核苷酸接触，并且然后与多于一种引发的模板核酸接触。

任选地，一种或更多种不同类型的核苷酸可以与聚合酶、核酸(例如，引发的模板核酸)或聚合酶-核酸复合物接触。例如，可以使用至少1种、2种、3种、4种或更多种核苷酸类型。可选地或另外地，可以使用至多4种、3种、2种或1种核苷酸类型。由于确定Watson-Crick碱基配对的结构特征，核苷酸类型可以不同。因此，存在的一种或更多种核苷酸类型可以是本文示出的方法中使用的模板核酸中至少1种、2种、3种或4种碱基类型的同源物。可选地或另外地，存在的一种或更多种核苷酸类型可以是本文示出的方法中使用的模板核酸中至多4种、3种、2种或1种碱基类型的同源物。在核苷酸类型之间可以不同的其他结构和功能特征包括但不限于标记物部分的存在或不存在、附接至各自核苷酸的标记物部分的结构、附接至各自核苷酸的标记物部分的可检测特征、封闭部分的存在或不存在、附接至各自核苷酸的封闭部分的结构或附接至各自核苷酸的封闭部分的反应性。应当理解，两种核苷酸类型可以基于这些特征的一种或组合而不同。

为了便于解释，本公开内容的方法在本文示例了在存在一种碱基类型的核苷酸同源物的情况下形成的一种或更多种稳定的三元复合物。应当理解，一种或更多种三元复合物可以在存在仅针对一种碱基类型的一种或更多种核苷酸同源物的情况下形成，例如，在存在仅单一类型的核苷酸的情况下或存在为同一碱基类型同源物的多种核苷酸类型的情况下形成。可选地，一种或更多种三元复合物可以在存在核苷酸类型的混合物的情况下形成，所述核苷酸类型是预期存在于模板核酸中的多于一种碱基类型的同源物。例如，在本文示出的方法的特定步骤期间存在的核苷酸类型可以是预期存在于模板核酸中的至少2种、3种或4种不同碱基类型的同源物。可选地或另外地，在本文示出的方法的特定步骤期间存在的核苷酸类型可以是至多4种、3种或2种不同碱基类型的同源物。不同的核苷酸类型可以在被递送至存在引发的模板核酸的容器之前彼此混合。在其他实施方案中，不同的核苷酸类型可以连续递送至存在引发的模板核酸的容器中。因此，不同的核苷酸将积累以产生反应混合物，其中不同类型的核苷酸与引发的模板核酸同时存在。

本公开内容的方法可以包括其中一种或更多种分析物或试剂从固体支持物和/或容器中去除的洗涤步骤。洗涤溶液可以包含二醇、多元醇、砜或亚砜。在一些实施方案中，分析物是从三元复合物解离的核苷酸。核苷酸可以在将核苷酸从三元复合物解离的条件下从容器中去除，从而允许核苷酸与引发的模板核酸分离，而不会引起聚合酶从模板核酸中的大量去除。例如，解离的核苷酸可以经由以下来去除：离开引发的模板核酸的流体流(例如，通过流通池)，将流体远离引发的模板核酸倾析，将附接至引发的模板核酸的固体支持物与流体分离(例如，经由附接至引发的模板核酸的颗粒的基于磁性或重力的分离)等。然后可以将另一核苷酸递送至引发的模板核酸。该其他核苷酸可以是，但不一定需要是，与先前被去除的核苷酸不同类型的核苷酸。如果聚合酶没有从引发的模板核酸的存在中大量去除，则不需要递送更多的聚合酶。这提供了对制备更多聚合酶本来将消耗的时间和资源的节省。

本公开内容的方法可以包括检测聚合酶-核酸复合物诸如三元复合物(例如，稳定的三元复合物)的步骤。因此，用于修饰聚合酶-核酸复合物的方法可以包括以下步骤：(a)在容器中提供多于一种表面固定的聚合酶-核酸复合物，其中核酸包括引发的模板核酸，其中至少一个亚组的表面固定的聚合酶-核酸复合物包括还包含核苷酸的三元复合物；(b)检测表面固定的聚合酶-核酸复合物；以及(c)将表面用包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液洗涤，从而将核苷酸从容器中去除并且将表面固定的聚合酶-核酸复合物保留在容器中。

聚合酶-核酸复合物的检测，无论是固定的还是溶液相中的，都可以通过附接至核苷酸、聚合酶或核酸的外源标记物来促进。可以检测由外源标记物产生的信号，以确定包含该外源标记物的聚合酶-核酸复合物的存在。在一些实施方案中，可以进行检测以获取区分三元复合物中至少2种、3种、4种或更多种类型核苷酸的信号。在一些实施方案中，可以进行检测以获取区分已知或疑似存在于模板核酸中的至少2种、3种、4种或更多种类型碱基的核苷酸同源物的信号。

本公开内容的方法可以以其中不同的核苷酸类型被连续递送并且然后从三元复合物将被形成和检查的容器中去除的模式进行。在这种模式下，可以将第一核苷酸类型递送至容器中的聚合酶-核酸复合物，并且然后在将第二核苷酸类型递送至容器之前，可以将第一核苷酸类型从容器中去除。去除第一核苷酸后，聚合酶可以保留在容器中。因此，聚合酶可以最初递送至流通池以产生促进与第一核苷酸形成三元复合物的条件，并且可以但不需要在随后的递送中添加新的聚合酶以促进与随后递送的核苷酸形成三元复合物。

因此，用于修饰聚合酶-核酸复合物的方法可以包括以下步骤：(a)使多于一种聚合酶与多于一种引发的模板核酸和与多于一种核苷酸接触，从而在容器中提供多于一种表面固定的聚合酶-核酸复合物，表面固定的聚合酶-核酸复合物中的每一种包含多于一种聚合酶中的聚合酶和多于一种引发的模板核酸中的引发的模板核酸，三元复合物中的核苷酸包括多于一种核苷酸中的核苷酸；(b)将表面用包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液洗涤，从而将核苷酸从容器中去除并且将表面固定的聚合酶-核酸复合物保留在容器中；以及(c)将包含多于一种第二核苷酸的溶液递送至容器，其中至少第二亚组的表面固定的聚合酶-核酸复合物包括还包含来自多于一种第二核苷酸中的第二核苷酸的三元复合物。

任选地，与核苷酸相比，以上方法中使用的第二核苷酸是不同类型的核苷酸。然而，应当理解，第二核苷酸可以包括与多于一种核苷酸中的核苷酸类型相同的至少一种核苷酸类型。任选地，以上方法可以还包括检测还包含第二核苷酸的三元复合物的步骤。例如，第二核苷酸可以具有外源标记物，并且第二核苷酸的外源标记物可以在还具有第二核苷酸的三元复合物中检测到。任选地，还具有第二核苷酸的三元复合物可以通过获取区分至少2种、3种或4种核苷酸的信号来检测。

在其中以将不同核苷酸类型连续递送至反应容器并且然后从容器中去除的模式执行本公开内容的方法时，可以在每次递送之后对容器进行三元复合物的检查。在这种模式下，不同类型的三元复合物(即，存在的核苷酸类型不同的三元复合物)将在每次递送之后形成。由于其他类型的核苷酸已经被去除，在先前递送其他类型的核苷酸中已经形成的三元复合物将已经解离(例如，为二元复合物形式)。因此，由每种类型的核苷酸形成的三元复合物可以基于每次检查中一种类型的三元复合物最显著的预期来鉴定。例如，在三元复合物基于标记的聚合酶或标记的核苷酸向阵列中引发的模板核酸的募集来检测时，具有最高信号的阵列特征可以被鉴定为已经形成三元复合物的特征。在每个特征处形成的三元复合体的类型(例如，存在于三元复合物中的核苷酸类型)可以从检查步骤之前被递送的核苷酸的知识来推导。

在这种模式下，不同类型的三元复合物不需要通过独特的标记物来区分。而是，不同类型的三元复合物可以基于关于它们何时形成的时间信息以及哪种核苷酸类型被递送以诱导形成来区分。如果期望，可以区分地标记不同类型的三元复合物。例如，每种核苷酸类型都可以具有产生与使用的所有其他核苷酸类型区分开的信号的标记物。可区分的标记物可以提供增加检测速度的优点，因为在多种不同类型的核苷酸已经被递送之后可以进行单个检查步骤。通过在本文示出的方法中同时递送两种或更多种可区分地标记的核苷酸类型，可以实现时间节省。如果期望，即使在使用可区分的标记物来鉴定不同类型的三元复合物时，也可以在每次核苷酸递送之后进行检查。

本公开内容的方法可以以其中不同的核苷酸类型被连续递送至三元复合物将被形成和检查的容器的模式进行。在这种模式下，第一核苷酸类型可以被递送至反应容器，并且然后第二核苷酸类型可以被递送至容器，使得两种核苷酸类型在容器中积累。在容器包含各种不同的引发的模板核酸，例如阵列或其他多重格式时，多种不同类型的三元复合物可以在容器中积累。最初可以添加聚合酶以产生促进与第一核苷酸形成三元复合物的条件。可以但不需要在随后的递送中添加新的聚合酶，以促进与随后递送的核苷酸形成三元复合物。

在其中以将不同核苷酸类型连续递送至反应容器使得不同核苷酸积累的模式进行所述方法时，可以在每次递送之后对容器进行三元复合物的检查。在这种模式下，不同类型的三元复合物(例如，存在的核苷酸类型不同的三元复合物)将在每次递送之后形成。在先前递送其他类型的核苷酸时已经形成的三元复合物也将存在于容器中。因此，由每种类型的核苷酸形成的三元复合物可以基于从一次检查至下一次检查新形成的三元复合物的出现来鉴定。例如，在三元复合物基于标记的聚合酶或标记的核苷酸向阵列中引发的模板核酸的募集来检测时，与先前检查中为特征检测到的信号强度相比具有增加的信号强度的阵列特征可以被鉴定为已经形成新的三元复合物的特征。在每个特征处形成的三元复合物的类型(例如，存在于三元复合物中的核苷酸类型)可以从出现新的三元复合物信号的检查步骤之前被递送的核苷酸的知识来推导。

因此，不同类型的三元复合物不需要通过独特的标记物来区分。而是，不同类型的三元复合物可以基于关于它们何时形成的时间信息以及哪种核苷酸类型被递送以诱导三元复合物的形成来区分。如果期望，可以区分地标记不同类型的三元复合物。例如，两种或更多种核苷酸类型可以具有产生彼此区分的信号的标记物。在一些实施方案中，所有核苷酸类型可以基于独特的标记物来区分。因此，标记物可以区分与模板中一种类型的核苷酸配对的核苷酸和与模板中所有其他类型的核苷酸配对的核苷酸。可区分的标记物可以提供增加检测速度的优点，因为在所有核苷酸已经被连续递送之后可以进行单个检查步骤。如果期望，即使在使用可区分的标记物来鉴定不同类型的三元复合物时，也可以在每次核苷酸递送之后进行检查。

本公开内容还提供了一种用于鉴定引发的模板核酸中的核苷酸的方法。所述方法可以包括以下步骤：(a)提供具有引发的模板核酸、聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物的容器；(b)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第一碱基类型的核苷酸同源物；(c)将容器用包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液洗涤，从而将核苷酸从容器中去除并且保留来自步骤(b)中的引发的模板核酸和聚合酶；(d)在步骤(c)之后将第二碱基类型的核苷酸同源物递送至容器；(e)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第二碱基类型的核苷酸同源物；以及(f)鉴定引发的模板核酸的碱基位置处的核苷酸类型。

本公开内容的方法可以包括用于检测三元复合物的步骤。所述方法的实施方案利用了聚合酶可以与引发的模板核酸和下一个正确核苷酸形成稳定的三元复合物的特异性。下一个正确核苷酸可以仅经由非共价相互作用与复合物的其他成员相互作用与稳定的三元复合物非共价结合。用于形成稳定的三元复合物的有用方法和组合物在下文和以下中更详细示出：2017年1月26日公布的美国专利申请公布第2017/0022553 A1号；2018年2月15日公布的第2018/0044727 A1号；2018年7月5日公布的第2018/0187245 A1号；以及2018年7月26日公布的第2018/0208983 A1号，所述专利申请的每一个通过引用并入本文。

通常，检查与引物延伸单独地且离散地进行，例如，由于介入检查和延伸的试剂交换或清洗。可选地，在一些实施方案中，检查和引物延伸步骤可以在同一混合物中进行。

通常，检测可以在检查步骤中通过感测三元复合物或连接至其的标记部分固有的特性的方法来实现。检测可以基于的示例性特性包括但不限于质量、电导率、能量吸收率、发光(例如，荧光)等。发光的检测可以使用与核酸阵列相关的领域中已知的方法进行。可以基于包括例如发射波长、激发波长、荧光共振能量转移(FRET)强度、猝灭、各向异性或寿命的各种发光特性中的任何一种来检测发光团。可以在本文示出的方法中使用的其他检测技术包括，例如，可以用于感测质量的质谱；可以用于感测表面处结合的表面等离子体共振；可以用于感测标记物吸收的能量波长的吸光度；可以用于感测由于标记物存在而引起的温度变化的量热法；可以用于感测标记物的电特性的电导或阻抗，或其他已知的分析技术。可以用于产生、操作和检测稳定的三元复合物的试剂和条件的实例包括，例如，在以下中示出的那些：2017年1月26日公布的美国专利申请公布第2017/0022553 A1号；2018年2月15日公布的第2018/0044727 A1号；2018年7月5日公布的第2018/0187245 A1号；以及2018年7月26日公布的第2018/0208983 A1号，所述专利申请的每一个通过引用并入本文。

本文示出的方法的一些实施方案利用两种或更多种可区分的信号将稳定的三元复合物彼此区分开和/或区分模板核酸中的一种碱基类型与另一种碱基类型。例如，两个或更多个发光团可以基于独特的光学特性诸如用于激发的独特波长或发射的独特波长彼此区分开。在一些实施方案中，方法可以基于发光强度的差异来区分不同的稳定三元复合物。例如，第一三元复合物可以在其发射比第二三元复合物少的强度的条件下被检测到。这样的强度缩放(有时称为“灰度缩放”)可以利用可区分的强度差异。示例性差异包括具有与待检测的另一种稳定的三元复合物的强度相比至多10％、25％、33％、50％、66％或75％的强度的特定的稳定的三元复合物。

强度差异可以由于使用不同的发光团而产生，例如，每个发光团具有不同的消光系数(即，导致不同的激发特性)和/或不同的发光量子产率(即，导致不同的发射特性)。可选地，可以使用相同的发光团类型，但可以以不同的量存在。例如，三元复合物的第一群体的所有成员都可以用特定的发光团标记，而第二群体仅其一半的成员用发光团标记。在该实例中，将预计第二群体产生第一群体的一半信号。第二群体可以例如通过使用标记的核苷酸和未标记的核苷酸的混合物(不同于主要包含标记的核苷酸的第一群体)来产生。类似地，第二群体可以例如通过使用标记的聚合酶和未标记的聚合酶的混合物(不同于主要包含标记的聚合酶的第一群体)来产生。在替代的标记方案中，三元复合物的第一群体可以包括具有产生特定发光信号的多个标记物的聚合酶分子，并且三元复合物的第二群体可以包括各自仅具有产生发光信号的标记物之一的聚合酶分子。

用于鉴定引发的模板核酸中的核苷酸的方法可以包括以下步骤：(a)提供具有引发的模板核酸、聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物的容器；(b)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第一碱基类型的核苷酸同源物；(c)将容器用包含多元醇、二醇、砜、亚砜或其组合的水性溶液洗涤，从而将核苷酸从容器中去除并且保留来自步骤(b)中的引发的模板核酸和聚合酶；(d)在步骤(c)之后将第二碱基类型的核苷酸同源物递送至容器；(e)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第二碱基类型的核苷酸同源物；以及(f)鉴定引发的模板核酸的碱基位置处的核苷酸类型，其中步骤(a)的容器还包含第三碱基类型的核苷酸同源物，并且其中步骤(b)包括对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物具有聚合酶和(i)结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第一碱基类型的核苷酸同源物或(ii)结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第三碱基类型的核苷酸同源物。

任选地，以上方法可以配置为使得第一碱基类型的核苷酸同源物具有外源标记物，并且第三碱基类型的核苷酸同源物具有外源标记物。第一碱基类型的核苷酸同源物的外源标记物可以不同于第三碱基类型的核苷酸同源物的外源标记物。在这种配置中，可以进行步骤(b)来区分来自不同外源标记物的信号。作为另外的选择，步骤(c)还可以包括将第四碱基类型的核苷酸同源物递送至容器，并且步骤(d)可以包括对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物具有聚合酶和(i)结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第二碱基类型的核苷酸同源物或(ii)结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第四碱基类型的核苷酸同源物。第二碱基类型可以具有外源标记物，并且第四碱基类型的核苷酸同源物可以具有外源标记物。第二碱基类型的核苷酸同源物上的外源标记物可以不同于第四碱基类型的核苷酸同源物上的外源标记物。在这种配置中，步骤(b)可以还包括区分来自不同外源标记物的信号。

可选地或另外地，第一碱基类型的核苷酸同源物上的外源标记物可以产生与第三碱基类型的核苷酸同源物上的外源标记物相同的信号。可选地或另外地，第二碱基类型的核苷酸同源物上的外源标记物可以产生与第四碱基类型的核苷酸同源物上的外源标记物产生的信号没有区分的信号。

在一些实施方案中，检查步骤以估算至少一种核苷酸类型的身份的方式进行，例如，如美国专利第9,951,385号和第10,161,003号中示出的，所述专利的每一个通过引用并入本文。作为使用估算的可选方式或另外方式，检查步骤可以使用歧义消除来鉴定一种或更多种核苷酸类型，例如，如美国专利第9,951,385号和第10,161,003号中示出的，所述专利的每一个通过引用并入本文。

用于鉴定引发的模板核酸中的核苷酸的方法可以以其中不同的核苷酸类型被连续递送并且然后从三元复合物将被形成和检查的容器中去除的模式进行。因此，所述方法可以包括以下步骤：(a)提供具有引发的模板核酸、聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物的容器；(b)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第一碱基类型的核苷酸同源物；(c)将容器用包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液洗涤，从而将核苷酸从容器中去除并且保留来自步骤(b)中的引发的模板核酸和聚合酶；(d)在步骤(c)之后将第二碱基类型的核苷酸同源物递送至容器；(e)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第二碱基类型的核苷酸同源物；以及(f)鉴定引发的模板核酸的碱基位置处的核苷酸类型。

在一些实施方案中，用于鉴定引发的模板核酸中的核苷酸的方法可以包括以下步骤：(a)提供具有引发的模板核酸、聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物的容器；(b)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第一碱基类型的核苷酸同源物；(c)将容器用包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液洗涤，从而将核苷酸从容器中去除并且保留来自步骤(b)中的引发的模板核酸和聚合酶；(d)在步骤(c)之后将第二碱基类型的核苷酸同源物递送至容器；(e)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第二碱基类型的核苷酸同源物；(f)鉴定引发的模板核酸的碱基位置处的核苷酸类型；(g)将第三碱基类型的核苷酸同源物递送至容器，从而容器保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和聚合酶；以及(h)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物具有聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第三碱基类型的核苷酸同源物。

在一些实施方案中，用于鉴定引发的模板核酸中的核苷酸的方法可以包括以下步骤：(a)提供具有引发的模板核酸、聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物的容器；(b)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第一碱基类型的核苷酸同源物；(c)将容器用包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液洗涤，从而将核苷酸从容器中去除并且保留来自步骤(b)中的引发的模板核酸和聚合酶；(d)在步骤(c)之后将第二碱基类型的核苷酸同源物递送至容器；(e)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第二碱基类型的核苷酸同源物；(f)鉴定引发的模板核酸的碱基位置处的核苷酸类型；(g)将第三碱基类型的核苷酸同源物递送至容器，从而容器保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和聚合酶；(h)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物具有聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第三碱基类型的核苷酸同源物；(i)将第四碱基类型的核苷酸同源物递送至容器，从而容器保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和聚合酶；以及(j)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第四碱基类型的核苷酸同源物。

本公开内容的方法可以包括修饰引物的步骤，例如，通过添加一个或更多个核苷酸来延伸引物。在一些实施方案中，添加至引物的核苷酸将包括可逆终止子部分。可逆终止子部分可以提供非限制性的益处，即在延伸过程期间防止多于一个核苷酸被添加至引物，并且在检查过程期间稳定引物3’末端处的三元复合物形成。

通常，在本文示出的方法中添加至引物的核苷酸，诸如可逆地终止的核苷酸，不具有外源标记物。这是因为延伸的引物不需要在本文示出的方法中检测。然而，如果期望，可以例如，经由附接至核苷酸的外源标记物检测本文示出的方法中使用的一种或更多种类型的可逆地终止的核苷酸。

引物延伸过程或形成三元复合物的过程不需要使用标记的聚合酶。例如，用于延伸步骤的聚合酶不需要附接至外源标记物(例如，共价或以其他方式)。可选地，用于引物延伸的聚合酶可以包含外源标记物，例如，在先前或随后的检查步骤中使用的标记物。

可以用于基于聚合酶的引物延伸步骤的试剂和条件的实例包括，例如，在以下中示出的那些：2017年1月26日公布的美国专利申请公布第2017/0022553 A1号；2018年2月15日公布的第2018/0044727 A1号；以及2018年7月5日公布的2018/0187245 A1，所述专利申请的每一个通过引用并入本文。示例性的可逆终止子部分、将它们掺入引物的方法和用于修饰引物以进一步延伸的方法(通常称为“去封闭”)在以下中示出：美国专利第7,544,794号；第7,956,171号；第8,034,923号；第8,071,755号；第8,808,989号；和第9,399,798号。另外的实例在以下中示出：Bentley等人，Nature 456:53-59(2008)，2004年3月4日公布的WO04/018497；美国专利第7,057,026号；1991年5月16日公布的WO 91/06678；2007年11月11日公布的WO 07/123744；美国专利第7,329,492号；美国专利第7,211,414号；美国专利第7,315,019号；美国专利第7,405,281号，以及2008年5月8日公布的美国专利申请公布第2008/0108082 A1号，所述文献的每一个通过引用并入本文。

因此，用于鉴定引发的模板核酸中的核苷酸的方法可以包括以下步骤：(a)提供具有引发的模板核酸、聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物的容器；(b)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第一碱基类型的核苷酸同源物；(c)将容器用包含多元醇、二醇、砜或亚砜的水性溶液洗涤，从而将核苷酸从容器中去除并且保留来自步骤(b)中的引发的模板核酸和聚合酶；(d)在步骤(c)之后将第二碱基类型的核苷酸同源物递送至容器；(e)对容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第二碱基类型的核苷酸同源物；(f)鉴定引发的模板核酸的碱基位置处的核苷酸类型；(g)将核苷酸添加至引发的模板核酸的引物，从而容器包含延伸的引发的模板核酸；(h)将第二聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物递送至容器；以及(i)使用延伸的引发的模板核酸代替引发的模板核酸并使用第二聚合酶代替聚合酶重复步骤(b)至(f)。

本文示出方法的一些实施方案可以采用可逆地终止的引物和/或可逆地终止的核苷酸。这些物质上的可逆终止子部分可以经由去封闭过程被去除或修饰为可延伸的形式。在被包括在本文示出的方法中时，去封闭过程可以促进引发的模板核酸的测序。去封闭过程可以用于将可逆地终止的引物转化为可延伸的引物。然后，引物延伸可以用于将三元复合物形成的位点沿着模板核酸移动至不同的位置。延伸、检查和去封闭的重复循环可以用于揭示模板核酸的序列。每个循环揭示模板核酸中的随后碱基。通过封闭和去封闭引物沿着模板步移的测序技术被称为使用循环可逆终止(CRT)。这样的CRT技术可以用于例如通过结合测序(Sequencing By Binding)^TM、通过合成测序、通过连接测序或Pyrosequencing^TM测序方法。示例性的可逆终止子部分、将它们掺入引物的方法和用于修饰引物以进一步延伸的方法(通常称为“去封闭”)在以下中示出：美国专利第7,427,673号；第7,414,116号；第7,544,794号；第7,956,171号；第8,034,923号；第8,071,755号；第8,808,989号；和第9,399,798号。另外的实例在以下中示出：Bentley等人，Nature 456:53-59(2008)，2004年3月4日公布的WO 04/018497；美国专利第7,057,026号；1991年5月16日公布的WO 91/06678；2007年11月1日公布的WO 07/123744；美国专利第7,329,492号；美国专利第7,211,414号；美国专利第7,315,019号；美国专利第7,405,281号，以及2008年5月8日公布的US 2008/0108082，所述文献通过引用并入本文。

测序方法可以包括本文示出的循环的多次重复或循环内的步骤。例如，包括检查和引物延伸步骤的循环可以重复多次，以检测沿着模板核酸的核苷酸位置。任选地，循环可以还包括使引物去封闭的步骤，或者在各个步骤之间洗去未使用的反应物或用过的产物。因此，引发的模板核酸可以经历本文示出方法的至少2个、5个、10个、25个、50个、100个、150个、200个或更多个重复循环。在较短的读段长度足够时，可以进行较少的循环。因此，引发的模板核酸可以经历本文示出方法的至多200个、150个、100个、50个、25个、10个、5个或2个循环。

在一些实施方案中，可以对预定数量的重复循环进行测序方法。可选地，可以重复这些循环，直到达到特定的经验观察到的状态。例如，只要信号高于可观察阈值、噪声低于可观察阈值或信噪比高于可观察阈值，就可以重复循环。

尽管本公开内容的实施方案在本文示例了采用重复循环的测序反应，但循环不需要重复，循环也不需要包括引物延伸步骤。例如，基因分型可以经由形成稳定的三元复合物来检查模板核酸中的单个核苷酸位置来进行。基因分型可以使用不同碱基类型的核苷酸同源物的连续递送和/或积累来进行。可以修改以采用本文示出的核苷酸递送方法的基因分型技术的实例包括美国专利第9,932,631号中示出的那些，所述专利通过引用并入本文。

本文的公开内容包括一种组合物，所述组合物包含与水性溶液接触的多于一种聚合酶-核酸复合物，其中多于一种聚合酶-核酸复合物中的每一种包含聚合酶，并且核酸包括与水性溶液接触的引发的模板核酸，其中水性溶液包含多元醇、醇、脂肪族二醇、砜或亚砜或其组合。在组合物中，聚合酶-核酸复合物的至少多个(例如，亚组)可以是还包含核苷酸的三元复合物，例如聚合酶-核酸复合物的至少20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％可以是还包含核苷酸的三元复合物。例如，聚合酶-核酸复合物的25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或这些值中任何两个之间的数字或范围是还包含核苷酸的三元复合物。在一些实施方案中，聚合酶-核酸复合物的至少多个(例如，亚组)不包含核苷酸，例如聚合酶-核酸复合物的至多50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％不包含核苷酸。例如，聚合酶-核酸复合物的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或这些值中任何两个之间的数字或范围不包含核苷酸。水性溶液可以还包含锂、甜菜碱或两者。

本公开内容还提供了一种用于检测本文示出的分析物诸如三元复合物或能够形成三元复合物的组分的系统。本公开内容的系统可以被配置为进行本文示出的一种或更多种方法。例如，系统可以被配置为在存在核苷酸的情况下产生和检测聚合酶与引发的模板核酸之间形成的三元复合物，以鉴定模板核酸序列中的一个或更多个碱基。任选地，系统包括用于进行本文示出的一个或更多个步骤的组分和试剂，所述步骤包括但不限于在引发的模板核酸、聚合酶和下一个正确核苷酸之间形成至少一种稳定的三元复合物；检测一种或更多种稳定的三元复合物；延伸一种或更多种引物-模板杂交体的引物；去封闭一个或更多个可逆地终止的引物；和/或鉴定一个或更多个模板中的核苷酸或核苷酸序列。

本公开内容的系统可以包括用于进行核酸检测方法的容器、固体支持物或其他设备。例如，系统可以包括阵列、流通池、多孔板、试管、基底中的通道、液滴或囊泡的集合、托盘、离心管、管道或其他方便的设备。设备可以是可移除的，从而允许其被放置到系统中或从系统中去除。因此，系统可以被配置为依次或并行地处理多于一个设备(例如，容器或固体支持物)。系统可以包括流体组件，所述流体组分具有用于包含本文示出的一种或更多种试剂(例如，聚合酶、引物、模板核酸、用于三元复合物形成的一种或更多种核苷酸、用于引物延伸的核苷酸、去封闭试剂、三元复合物抑制剂或这样的组分的混合物)的储库。流体系统可以被配置为例如经由通道或液滴转移装置(例如，电润湿设备)将试剂递送至容器或固体支持物。各种检测设备中的任何一种都可以被配置为检测试剂相互作用的容器或固体支持物。实例包括发光检测器、表面等离子体共振检测器和本领域已知的其他检测器。可以容易地修改以用于在本文的系统中使用的具有流体和检测组件的示例性系统，包括但不限于以下中示出的那些：2018年10月4日公布的美国专利申请公布第2018/0280975 A1号；美国专利第8,241,573号；第7,329,860号和第8,039,817号；或者2009年11月5日公布的美国专利申请公布第2009/0272914 A1号和2012年10月25日公布的第2012/0270305 A1号，所述专利申请的每一个通过引用并入本文。

任选地，本公开内容的系统还包括被配置为操作系统组件的计算机处理单元(CPU)。相同或不同的CPU可以与系统交互以获取、存储和处理信号(例如，在本文示出的方法中检测到的信号)。在一些实施方案中，CPU可以用于从信号确定存在于模板核酸中特定位置处的核苷酸的身份。在一些情况下，CPU将从检测到的信号鉴定模板的核苷酸序列。

有用的CPU可以包括以下中的一个或更多个：个人计算机系统、服务器计算机系统、瘦客户机、胖客户机、手持或膝上型装置、多处理器系统、基于微处理器的系统、机顶盒(set top box)、可编程消费电子产品、网络PC、小型计算机系统、大型计算机系统、智能电话和包括任何以上系统或装置的分布式云计算环境，等。CPU可以包括一个或更多个处理器或处理单元、可以包括RAM和非易失性存储器的存储器架构。存储器架构还可以包括可移除/不可移除、易失性/非易失性计算机系统存储介质。此外，存储器架构可以包括一个或更多个用于从不可移除、非易失性磁介质(诸如硬盘驱动器)读取和写入的读取器，用于从可移除、非易失性磁盘读取和写入的磁盘驱动器，和/或用于从可移除、非易失性光盘(诸如CD-ROM或DVD-ROM)读取或写入的光盘驱动器。CPU还可以包括各种计算机系统可读介质。这样的介质可以是云计算环境可访问的任何可用介质，诸如易失性和非易失性介质，以及可移除和不可移除介质。

存储器架构可以包括至少一个程序产品，该至少一个程序产品具有被实现为可执行指令的至少一个程序模块，该可执行指令被配置为执行本文示出的方法的一个或更多个步骤。例如，可执行指令可以包括操作系统、一个或更多个应用程序、其他程序模块和程序数据。通常，程序模块可以包括执行本文示出的特定任务的例程、程序、对象、组件、逻辑、数据结构等。

CPU的组件可以通过内部总线耦合，该内部总线可以被实现为几种类型的总线结构中的任何一种中的一种或更多种，包括存储器总线或存储器控制器、外围总线、加速图形端口以及使用各种总线架构中的任何一种的处理器或本地总线。例如但不限于，这样的架构包括工业标准架构(ISA)总线、微通道架构(MCA)总线、增强型ISA(EISA)总线、视频电子标准协会(VESA)本地总线和外围组件互连(PCI)总线。

CPU可以任选地与一个或更多个外部装置通信，该外部装置诸如键盘、指向装置(例如，鼠标)、显示器诸如图形用户界面(GUI)或有助于与核酸检测系统交互的其他装置。类似地，CPU可以与其他装置通信(例如，经由网卡、Bluetooth^TM、WiFi、调制解调器等)。这样的通信可以经由I/O接口发生。再者，本文的系统的CPU可以经由合适的网络适配器与一个或更多个网络通信，该网络诸如局域网(LAN)、广域网(WAN)和/或公共网络(例如，互联网)。

实施例I

评价用于将核苷酸从三元复合物中剥离的化合物

该实施例显示了各种化合物对将核苷酸从聚合酶-核酸复合物中剥离的影响。

材料和方法

测序如以下中示出的进行：2020年6月4日公布为美国专利申请公布第20200171498号的美国专利申请系列第16/700,422号(所述公布通过引用并入本文)，具有如以下描述中示出的某些细节和修改。

制备在12个PCR反应中合成的模板核酸链，并且然后独立与珠结合。这产生了12个珠类型的群体，其中每个珠携带12个模板链之一的同质集合。然后将携带固定的模板链的珠附接至流通池的内部表面。测序进行了22个循环，其中每个循环包括以下子例程：(i)延伸：将可逆地终止的核苷酸添加至与固定的模板杂交的引物，(ii)检查：在可逆地终止的固定的引物-模板杂交体上形成和检测稳定的三元复合物，以及(iii)激活：从延伸的引物裂解可逆终止子。

延伸和激活子例程基本上如美国专利申请系列第16/700,422号的实施例1示出的进行。检查子例程以2×2格式进行，如图1中所示。具体地，将Cy5标记的dATP、Cy7标记的dCTP、未标记的dTTP和未标记的dGTP的混合物递送至珠上包含聚合酶-核酸复合物的流通池，系统暂停流体流动以允许核苷酸结合在模板的同源物位置处，从而形成三元复合物。将游离核苷酸通过流动IMG试剂从流通池中去除。IMG试剂包括LiCl、甜菜碱、Tween-80、KCl、硫酸铵、羟胺和EDTA，其在去除游离核苷酸之后稳定三元复合物(参见美国专利第10,400,272号，所述专利通过引用并入本文)。然后将流通池经由荧光显微术成像，以检测包含标记的核苷酸的三元复合物，该标记的核苷酸是模板核酸的每一个中下一个正确核苷酸的同源物。然后将流通池用具有如下文示出的各种组成的NSB溶液洗涤。在NSB洗涤之后，将Cy5标记的dTTP、Cy7标记的dGTP、未标记的dCTP和未标记的dATP的混合物递送至流通池，并且系统暂停流体流动以允许核苷酸结合，从而形成三元复合物。游离核苷酸通过流动IMG试剂去除，并且然后将流通池再次成像。

NSB溶液由50mM Tricine、43.75mM KCl、6.25mM KOH、5mM邻叔丁基羟胺盐酸盐、100μM EDTA、0.05％(v/v)ProClin 950(Sigma，目录号46878-U)、0.1％吐温-80和表1中示出的候选剥离剂之一组成。

表1

表1的第二列列出了产生图2-图9中示出的结果的各自候选化合物的浓度。浓度以化合物的重量百分比/NSB的总体积(w/v)或化合物的体积/NSB的总体积(v/v)提供。浓度也可以表示为摩尔浓度，并且这可以是有帮助的，例如，作为比较每种测试化合物的量的方式。例如，NSB中1,6己二醇和1,7戊二醇的摩尔浓度低于SOP NSB中异丙醇的摩尔浓度。NSB中1,5戊二醇、丙二醇、己二醇、环丁砜、DMSO、乙基甲基砜和2-甲氧基乙醇的摩尔浓度与SOPNSB中异丙醇的摩尔浓度相似。

每种候选化合物的有效性由以下串扰度量确定。A_T串扰度量指示从第一次检查遗留多少Cy5-dATP使得在第二次检查中检测到它。类似地，C_G串扰度量指示从第一次检查遗留多少Cy7-dCTP使得在第二次检查中检测到它。串扰度量的较低值指示较少的遗留，并且与改进的测序结果相关。在另一方面，串扰度量的较高值指示更多的遗留和较低质量的测序结果。

结果

将结果评价为对具有20％v/v/异丙醇(SOP)的NSB测量的串扰度量与对具有每种各自候选化合物的NSB测量的串扰度量相比的比较。在所有情况下，比较都是基于在流通池的单通道中进行测序运行所获得的数据。运行格式如下：循环_1(SOP)＝>循环_2(候选物)＝>循环_3(SOP)＝>循环_4(候选物)，等。分别为SOP和候选物循环确定串扰度量。在SOP与每个候选物之间比较时，该格式用于最小化运行间(run-to-run)差异的混杂影响。

单羟基醇

醇诸如乙醇、甲醇和异丙醇是用于将核苷酸从三元复合物中剥离而不使聚合酶从引发的模板核酸解离的有用化合物。有用的醇包括水溶性(例如，至至少50％v/v)的那些醇，仅具有单一羟基的那些醇，是伯醇的那些醇，是脂肪族的那些醇，和/或具有低于约100g/mol的分子量的那些醇。醇的非限制性实例在2020年1月30日公布的美国专利申请公布第2020/0032317 A1号中描述，所述专利通过引用并入本文。

二醇

1,6己二醇的结果示于图2中。SOP和1,6己二醇的三个单独柱分别代表同一测序运行的不同循环的结果。显示由于C信号从第一次检查进入第二次检查的G通道遗留的串扰的C_G数据，对于基于1,6己二醇的NSB显著较低。基于1,6己二醇的NSB的A_T串扰也稍低。因此，即使在比异丙醇更低的摩尔浓度，具有1,6己二醇的NSB也优于具有异丙醇的NSB。1,6己二醇的另一个优点是它不易燃，因此它不需要像异丙醇那样的特殊储存。

1,7庚二醇的结果示于图3中。显示由于C信号从第一次检查进入第二次检查的G通道遗留的串扰的C_G数据，对于基于1,7庚二醇的NSB较好。基于1,7庚二醇的NSB的A_T串扰也较好。因此，即使在比异丙醇更低的摩尔浓度，具有1,7庚二醇的NSB也优于具有异丙醇的NSB。

1,5戊二醇的结果示于图4中。具有1,5戊二醇的NSB的C_G串扰和A_T串扰与具有异丙醇的NSB相比更强。然而，对于C_G串扰和A_T串扰，具有1,5戊二醇的NSB仍然能够维持约0.16的相对低的串扰度量。

还测试了丙二醇、1,3丁二醇和己二醇，并且尽管它们能够将核苷酸从三元复合物中剥离，同时保留聚合酶与引发的模板核酸的缔合，但在NSB中的表现不如异丙醇。1,8辛二醇不立即溶解在NSB中，并且因此没有在测序仪中测试。

亚砜和砜

二甲基亚砜(DMSO)的结果示于图5中。具有DMSO的NSB的A_T串扰与具有异丙醇的NSB相比更强。然而，对于A_T串扰，具有DMSO的NSB仍然能够维持低于约0.35的串扰度量(G_C串扰数据不可得)。

图6示出了乙基甲基砜的结果。具有乙基甲基砜的NSB的A_T串扰与具有异丙醇的NSB相比更强。然而，对于A_T串扰，具有乙基甲基砜的NSB仍然能够维持低于约0.2的串扰度量(G_C串扰数据不可得)。

环丁砜的结果示于图7中。显示由于C信号从第一次检查进入第二次检查的G通道遗留的串扰的C_G数据，对于基于环丁砜的NSB较好。基于环丁砜的NSB和基于异丙醇的NSB的A_T串扰相当。因此，具有环丁砜的NSB优于具有异丙醇的NSB。

多元醇

聚乙二醇(PEG)的结果示于图8中。具有PEG的NSB的A_T串扰与具有异丙醇的NSB相比更强。然而，对于A_T串扰，具有PEG的NSB仍然能够维持低于约0.6的串扰度量(G_C串扰数据不可得)。使用35K PEG聚合物用于这些分析。设想，只要其他尺寸的聚合物可溶于水性溶液，它们也是有用的。

图9示出了聚乙烯醇(PVA)的结果。具有PVA的NSB的C_G串扰和A_T串扰与具有异丙醇的NSB相比更强。然而，对于A_T串扰和G_C串扰，具有PVA的NSB仍然能够维持低于约0.45的串扰度量。

具有羟基部分和另一杂原子部分两者的脂肪族化合物

另外的测试指示，2-甲氧基乙醇、四乙二醇、3-氨基-1-丙醇也可以对于将核苷酸从聚合酶-核酸复合物中剥离而不将聚合酶从核酸解离是有用的。因此，结果显示烷氧基醇、醚醇和氨基醇可以是有用的化合物。

其他测试浓度

除了表1中列出的制剂之外，还测试了几种候选化合物的其他浓度。异丙醇在以16％-20％的范围存在时是有效的，1,6己二醇在以10％-31％的范围存在时是有效的，1,5戊二醇在以25％-35％的范围存在时是有效的，环丁砜在以25％-35％的范围存在时是有效的，DMSO在以21％-26％的范围存在时是有效的，并且乙基甲基砜在以1.4％-2.8％的范围存在时是有效的。设想，其他浓度诸如本文别处示出的浓度也可以是有用的。

实施例II

评价存在异丙醇和1,6己二醇的情况下泡沫的稳定性

该实施例显示，与具有异丙醇的水性溶液相比，具有1,6己二醇的水性溶液改进了流体泡沫的稳定性。

将具有20％异丙醇(SOP)或28％1,6己二醇的NSB流体泡沫流过流通池(40μl/s流速，300μl体积，35psi正压，55℃)。暂停流动，并且立即获取泡沫的第一图像。允许泡沫静置60秒，并且然后拍摄第二图像。

图10A示出了对于具有28％1,6己二醇的NSB流体泡沫获取的第一图像；图10B示出了对于具有28％1,6己二醇的NSB流体泡沫获取的第二图像；图10C示出了对于具有20％异丙醇(SOP)的NSB流体泡沫获取的第一图像；图10D示出了对于具有20％异丙醇(SOP)的NSB流体泡沫获取的第二图像。结果指示，在异丙醇中虽然可以维持一定程度的泡沫，但在1,6己二醇中观察到更大的泡沫稳定性，无论是在流动暂停之前还是1分钟之后。

遍及本申请已参考多个出版物、专利和/或专利申请。这些文献的公开内容以其整体通过引用特此并入本申请。

已经描述了许多实施方案。然而，应当理解的是，可以进行各种修改。因此，其他实施方案在所附权利要求书的范围之内。

Claims (102)

1.一种用于修饰聚合酶-核酸复合物的方法，包括：

(a)提供多于一种聚合酶-核酸复合物，每种聚合酶-核酸复合物包含聚合酶和引发的模板核酸，其中至少一个亚组的所述聚合酶-核酸复合物是还包含核苷酸的三元复合物；以及

(b)使所述多于一种聚合酶-核酸复合物与包含多元醇、醇、脂肪族二醇、砜、亚砜或其组合的水性溶液接触，从而使所述核苷酸从所述亚组的所述聚合酶-核酸复合物解离。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述水性溶液还包含锂、甜菜碱或两者。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多于一种聚合酶-核酸复合物被固定在表面上。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述多于一种聚合酶-核酸复合物存在于容器中。

5.根据权利要求4所述的方法，其中使所述多于一种聚合酶-核酸复合物与所述水性溶液接触包括将上面固定有所述多于一种聚合酶-核酸复合物的表面用所述水性溶液洗涤，从而将所述核苷酸从所述容器中的所述亚组的所述聚合酶-核酸复合物中去除。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在使所述多于一种聚合酶-核酸复合物与所述水性溶液接触之后，至少50％的所述聚合酶保留在所述多于一种聚合酶-核酸复合物中。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在使所述多于一种聚合酶-核酸复合物与所述水性溶液接触之后，至少70％的所述聚合酶保留在所述多于一种聚合酶-核酸复合物中。

8.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在使所述多于一种聚合酶-核酸复合物与所述水性溶液接触之后，至多5％的所述聚合酶从所述多于一种聚合酶-核酸复合物解离。

9.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在使所述多于一种聚合酶-核酸复合物与所述水性溶液接触之后，至多20％的所述聚合酶从所述多于一种聚合酶-核酸复合物解离。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中使所述核苷酸从所述聚合酶-核酸复合物的亚组解离包括使至少50％的所述核苷酸从所述三元复合物解离。

11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中使所述核苷酸从所述聚合酶-核酸复合物的亚组解离包括使至少70％的所述核苷酸从所述三元复合物解离。

12.根据权利要求4-11中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括使多于一种聚合酶与多于一种引发的模板核酸和多于一种核苷酸接触，从而在所述容器中提供多于一种表面固定的聚合酶-核酸复合物，所述表面固定的聚合酶-核酸复合物中的每一种包含所述多于一种聚合酶中的聚合酶和所述多于一种引发的模板核酸中的引发的模板核酸，所述三元复合物中的核苷酸包括所述多于一种核苷酸中的核苷酸。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述多于一种聚合酶在与所述多于一种引发的模板核酸接触之前被附接至所述表面。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述多于一种引发的模板核酸在与所述多于一种聚合酶接触之前被附接至所述表面。

15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述多于一种聚合酶同时与所述多于一种引发的模板核酸和所述多于一种核苷酸接触。

16.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述多于一种引发的模板核酸依次与所述多于一种聚合酶，并且然后与所述多于一种核苷酸接触。

17.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述多于一种聚合酶依次与所述多于一种核苷酸，并且然后与所述多于一种引发的模板核酸接触。

18.根据权利要求12-17中任一项所述的方法，其中所述多于一种核苷酸包括至少两种不同类型碱基的同源物。

19.根据权利要求12-17中任一项所述的方法，其中所述多于一种核苷酸包括至少四种不同类型碱基的同源物。

20.根据权利要求3-19中任一项所述的方法，其中所述表面固定的聚合酶-核酸复合物的引发的模板核酸被共价附接至所述表面。

21.根据权利要求3-20中任一项所述的方法，其中所述表面固定的聚合酶-核酸复合物的聚合酶被共价附接至所述表面。

22.根据权利要求3-21中任一项所述的方法，其中所述三元复合物中的核苷酸包括至少两种不同碱基类型的同源核苷酸。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述三元复合物中的核苷酸包括至少四种不同碱基类型的同源核苷酸。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，还包括检测所述三元复合物。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述核苷酸包含外源标记物，并且所述方法还包括检测所述三元复合物中的外源标记物。

26.根据权利要求25所述的方法，其中检测所述三元复合物中的外源标记物包括获取区分所述三元复合物中至少两种类型的核苷酸的信号。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，还包括(c)在步骤(b)之后使多于一种第二核苷酸与所述多于一种聚合酶-核酸复合物接触，任选地所述接触在所述容器中，从而形成至少第二亚组的所述聚合酶-核酸复合物，所述至少第二亚组的所述聚合酶-核酸复合物包括包含来自所述多于一种第二核苷酸中的第二核苷酸的三元复合物。

28.根据权利要求27所述的方法，其中步骤(c)包括将包含所述多于一种第二核苷酸的溶液递送至所述容器，从而形成至少第二亚组的所述表面固定的聚合酶-核酸复合物，所述至少第二亚组的所述表面固定的聚合酶-核酸复合物包括包含来自所述多于一种第二核苷酸中的第二核苷酸的三元复合物。

29.根据权利要求27-28中任一项所述的方法，其中所述第二核苷酸包括与所述核苷酸相比至少一种不同类型的核苷酸。

30.根据权利要求27-28中任一项所述的方法，其中所述第二核苷酸包括与所述核苷酸相比至少一种相同类型的核苷酸。

31.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，还包括检测还包含所述第二核苷酸的三元复合物。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述第二核苷酸包含外源标记物，并且所述方法还包括检测还包含所述第二核苷酸的所述三元复合物中的外源标记物。

33.根据权利要求32所述的方法，其中还包含所述第二核苷酸的三元复合物通过获取区分至少两种类型的核苷酸的信号来检测。

34.根据权利要求32所述的方法，其中还包含所述第二核苷酸的三元复合物通过获取区分至少四种类型的核苷酸的信号来检测。

35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述水性溶液包含多元醇。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述多元醇包括聚乙二醇或聚乙烯醇。

37.根据权利要求35所述的方法，其中所述多元醇包括聚合物。

38.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述水性溶液包含脂肪族二醇。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述脂肪族二醇包括无支链的碳链。

40.根据权利要求38-39中任一项所述的方法，其中所述脂肪族二醇包括包含七个或更少碳原子的碳链。

41.根据权利要求38所述的方法，其中所述脂肪族二醇选自由以下组成的组：丙二醇、1,3丁二醇、1,5戊二醇、1,6己二醇和1,7庚二醇。

42.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述水性溶液包含亚砜。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述亚砜是二甲基亚砜。

44.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述水性溶液包含砜。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述砜是乙基甲基砜或环丁砜。

46.一种用于鉴定引发的模板核酸中的核苷酸的方法，包括：

(a)提供包含引发的模板核酸、聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物的容器；

(b)对所述容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含所述聚合酶和结合在所述引发的模板核酸的碱基位置处的所述第一碱基类型的核苷酸同源物；

(c)将所述容器用包含多元醇、醇、脂肪族二醇、砜、亚砜或其组合的水性溶液洗涤，从而使所述第一碱基类型的核苷酸同源物从所述三元复合物解离，将所述第一碱基类型的核苷酸同源物从所述容器中去除，并且保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和聚合酶；

(d)在步骤(c)之后将第二碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器；

(e)对所述容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含所述聚合酶和结合在所述引发的模板核酸的碱基位置处的所述第二碱基类型的核苷酸同源物；以及

(f)鉴定所述引发的模板核酸碱基位置处的核苷酸类型。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述水性溶液还包含锂、甜菜碱或两者。

48.根据权利要求46-47中任一项所述的方法，其中所述引发的模板核酸是表面固定的。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述引发的模板核酸是阵列中多于一种不同的表面固定的引发的模板核酸中的一种，并且其中所述方法包括鉴定在不同的表面固定的引发的模板核酸中的每一个中的碱基位置处的核苷酸类型。

50.根据权利要求46-49中任一项所述的方法，其中所述容器选自由以下组成的组：流通池、多孔板中的孔、液滴、囊泡、试管、托盘、离心管、管道和基底中的通道。

51.根据权利要求46-50中任一项所述的方法，其中所述第一碱基类型的核苷酸同源物包含外源标记物，并且所述第二碱基类型的核苷酸同源物包含外源标记物。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述第一碱基类型的核苷酸同源物的外源标记物不同于所述第二碱基类型的核苷酸同源物的外源标记物。

53.根据权利要求52所述的方法，其中步骤(e)还包括区分来自所述不同外源标记物的信号。

54.根据权利要求51所述的方法，其中所述第一碱基类型的核苷酸同源物上的外源标记物产生与所述第二碱基类型的核苷酸同源物上的外源标记物相同的信号。

55.根据权利要求46-54中任一项所述的方法，还包括：

(g)将第三碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器，从而所述容器保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和聚合酶；以及

(h)对所述容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含所述聚合酶和结合在所述引发的模板核酸的碱基位置处的所述第三碱基类型的核苷酸同源物。

56.根据权利要求55所述的方法，还包括：

(i)将第四碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器，从而所述容器保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和聚合酶；以及

(j)对所述容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含所述聚合酶和结合在所述引发的模板核酸的碱基位置处的所述第四碱基类型的核苷酸同源物。

57.根据权利要求56所述的方法，还包括：

(k)将核苷酸添加至所述引发的模板核酸的引物中，从而所述容器包含延伸的引发的模板核酸；

(l)将第二聚合酶和所述第一碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器；以及

(m)使用延伸的引发的模板核酸代替所述引发的模板核酸并使用所述第二聚合酶代替所述聚合酶重复步骤(b)至(i)。

58.根据权利要求46-57中任一项所述的方法，其中步骤(a)的容器还包含第三碱基类型的核苷酸同源物，并且其中步骤(b)包括对所述容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和(i)结合在所述引发的模板核酸的碱基位置处的所述第一碱基类型的核苷酸同源物或(ii)结合在所述引发的模板核酸的碱基位置处的所述第三碱基类型的核苷酸同源物。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述第一碱基类型的核苷酸同源物包含外源标记物，并且所述第三碱基类型的核苷酸同源物包含外源标记物。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述第一碱基类型的核苷酸同源物的外源标记物不同于所述第三碱基类型的核苷酸同源物的外源标记物。

61.根据权利要求60所述的方法，其中步骤(b)还包括区分来自所述不同外源标记物的信号。

62.根据权利要求59所述的方法，其中所述第一碱基类型的核苷酸同源物上的外源标记物产生与所述第三碱基类型的核苷酸同源物上的外源标记物相同的信号。

63.根据权利要求62所述的方法，其中步骤(b)的检查包括检测所述信号。

64.根据权利要求46-63中任一项所述的方法，其中步骤(c)还包括将第四碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器，并且其中步骤(d)包括对所述容器进行稳定的三元复合物的检查，所述稳定的三元复合物包含聚合酶和(i)结合在所述引发的模板核酸的碱基位置处的所述第二碱基类型的核苷酸同源物或(ii)结合在所述引发的模板核酸的碱基位置处的所述第四碱基类型的核苷酸同源物。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述第二碱基类型的核苷酸同源物包含外源标记物，并且所述第四碱基类型的核苷酸同源物包含外源标记物。

66.根据权利要求65所述的方法，其中所述第二碱基类型的核苷酸同源物上的外源标记物不同于所述第四碱基类型的核苷酸同源物上的外源标记物。

67.根据权利要求66所述的方法，其中步骤(b)还包括区分来自所述不同外源标记物的信号。

68.根据权利要求65所述的方法，其中所述第二碱基类型的核苷酸同源物上的外源标记物产生与所述第四碱基类型的核苷酸同源物上的外源标记物产生的信号没有区分的信号。

69.根据权利要求68所述的方法，其中步骤(b)的检查包括检测所述信号。

70.根据权利要求46-69中任一项所述的方法，还包括：

(g)将核苷酸添加至所述引发的模板核酸的引物中，从而所述容器包含延伸的引发的模板核酸；

(h)将第二聚合酶和所述第一碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器；以及

(i)使用延伸的引发的模板核酸代替所述引发的模板核酸并使用所述第二聚合酶代替所述聚合酶重复步骤(b)至(e)。

71.根据权利要求70所述的方法，其中所述聚合酶和所述第二聚合酶是相同类型的聚合酶。

72.根据权利要求70所述的方法，其中所述引物包含可逆终止子部分，并且其中步骤(f)包括使所述引物去封闭并且将所述核苷酸添加至去封闭的引物中，从而所述容器包含延伸的引发的模板核酸。

73.根据权利要求72所述的方法，其中添加至所述引物的核苷酸包含可逆终止子部分，从而所述延伸的引物包含可逆终止子部分。

74.根据权利要求46-73中任一项所述的方法，其中所述水性溶液包含多元醇。

75.根据权利要求74所述的方法，其中所述多元醇包括聚乙二醇或聚乙烯醇。

76.根据权利要求74所述的方法，其中所述多元醇包括聚合物。

77.根据权利要求46-73中任一项所述的方法，其中所述水性溶液包含脂肪族二醇。

78.根据权利要求77所述的方法，其中所述脂肪族二醇包括无支链的碳链。

79.根据权利要求77-78中任一项所述的方法，其中所述脂肪族二醇包括包含七个或更少碳原子的碳链。

80.根据权利要求77所述的方法，其中所述脂肪族二醇选自由以下组成的组：丙二醇、1,3丁二醇、1,5戊二醇、1,6己二醇和1,7庚二醇。

81.根据权利要求46-73中任一项所述的方法，其中所述水性溶液包含亚砜。

82.根据权利要求81所述的方法，其中所述亚砜是二甲基亚砜。

83.根据权利要求46-73中任一项所述的方法，其中所述水性溶液包含砜。

84.根据权利要求83所述的方法，其中所述砜是乙基甲基砜或环丁砜。

85.一种组合物，包含与水性溶液接触的多于一种聚合酶-核酸复合物，其中所述多于一种聚合酶-核酸复合物中的每一种包含聚合酶和引发的模板核酸，其中所述水性溶液包含多元醇、醇、脂肪族二醇、砜、亚砜或其组合。

86.根据权利要求85所述的组合物，其中至少一个亚组的所述聚合酶-核酸复合物是还包含核苷酸的三元复合物。

87.根据权利要求85-86中任一项所述的组合物，其中所述聚合酶-核酸复合物的至多50％是还包含核苷酸的三元复合物。

88.根据权利要求85-86所述的组合物，其中所述聚合酶-核酸复合物的至少50％不包含核苷酸。

89.根据权利要求85-88中任一项所述的组合物，其中所述水性溶液还包含锂、甜菜碱或两者。

90.根据权利要求85-89中任一项所述的组合物，其中所述水性溶液包含多元醇。

91.根据权利要求90所述的组合物，其中所述多元醇选自由以下组成的组：聚乙二醇和聚乙烯醇。

92.根据权利要求90所述的组合物，其中所述多元醇包括聚合物。

93.根据权利要求85-89中任一项所述的组合物，其中所述水性溶液包含脂肪族二醇。

94.根据权利要求93所述的组合物，其中所述脂肪族二醇包括无支链的碳链。

95.根据权利要求93-94中任一项所述的组合物，其中所述脂肪族二醇包括包含七个或更少碳原子的碳链。

96.根据权利要求93所述的组合物，其中所述脂肪族二醇选自由以下组成的组：丙二醇、1,3丁二醇、1,5戊二醇、1,6己二醇和1,7庚二醇。

97.根据权利要求85-89中任一项所述的组合物，其中所述水性溶液包含亚砜，任选地所述亚砜是二甲基亚砜。

98.根据权利要求85-89中任一项所述的组合物，其中所述水性溶液包含砜，任选地所述砜是乙基甲基砜或环丁砜。

99.根据权利要求85-98中任一项所述的组合物，其中所述聚合酶-核酸复合物是表面固定的，并且任选地，所述表面固定的聚合酶-核酸复合物被共价附接至所述表面。

100.根据权利要求99所述的组合物，其中所述表面固定的聚合酶-核酸复合物的聚合酶、所述表面固定的聚合酶-核酸复合物的引发的模板核酸或两者共价附接至所述表面。

101.根据权利要求86-100中任一项所述的组合物，其中所述核苷酸包含至少两种不同类型碱基的同源物或包含至少四种不同类型碱基的同源物。

102.根据权利要求86-101中任一项所述的组合物，其中所述核苷酸、所述聚合酶、所述引发的模板核酸中的一种或更多种包含外源标记物。

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