KR20190034344A - 핵산을 시퀀싱하기 위한 방법 및 시스템 - Google Patents
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Abstract
중합효소 기반의 결합에 의한 시퀀싱 절차를 이용하여 주형 핵산의 서열을 결정하기 위한 조성물, 방법 및 시스템이 제공된다. 검사 단계는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소와 주형 핵산 사이의 상호작용을 모니터링하는 단계를 포함한다. 서열에서 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 실체는 포스포디에스테르 결합의 형성에 의해 프라이머의 구조 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입 없이 결정된다. 선택적인 도입 단계가 검사 단계 후에 사용되어 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 프라이머 연장시킬 수 있고, 이로써 후속 검사 단계에서 검사될 수 있는 주형 뉴클레오타이드를 증가시킨다. 결합에 의한 시퀀싱 절차는 표지된 뉴클레오타이드 또는 중합효소의 사용을 필요로 하지 않지만, 선택적으로 이들 시약을 사용할 수 있다.
Description
관련 출원
본원은 2017년 1월 17일에 출원된 미국 가출원 제62/447,319호; 및 2016년 8월 15일에 출원된 미국 가출원 제62/375,379호의 이익을 주장한다. 이들 선출원의 개시 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 생명공학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 핵산 시퀀싱 기술에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 뉴클레오타이드 도입에 비의존적으로 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 확인하는 결합에 의한 시퀀싱(sequencing-by-binding) 기술에 관한 것이다.
핵산 서열 정보의 결정은 현재 생물학적 및 의학적 연구의 중요한 부분이다. 예를 들어, 핵산 서열 정보는 특정 질병 및 표현형과 관련된 유전자를 확인하고, 잠재적인 약물 표적을 확인하며, 질환 발달 및 진행의 기전을 이해하는데 도움이 된다. 서열 정보는 또한 개인 맞춤형 의료의 중요한 부분으로, 특정 대상에서 질병의 진단, 치료, 또는 예방을 최적화하는 데 사용될 수 있다.
고처리량의 비용 효율적인 핵산 시퀀싱은 연구 및 개인 맞춤형 의료의 새로운 시대를 안내할 잠재력이 있다. 몇 가지 상업적인 시퀀싱 플랫폼을 이용할 수 있지만, 대중 시장에서 유전적 분석에 여전히 상당한 비용이 들어간다.
현재 다양한 시퀀싱 기술은 대안으로 "합성에 의한 시퀀싱(sequencing-by-synthesis)"(SBS) 또는 "도입에 의한 시퀀싱"으로 알려진 방법을 이용한다. 이 방법은 흔히 중합효소를 사용하여 시퀀싱될 주형 가닥에 상보적인 DNA 가닥을 합성한다. 이것은 식별 태그가 수식된 뉴클레오타이드 또는 짧은 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 것을 포함할 수 있으며, 이로써 합성이 진행됨에 따라 도입된 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 염기 유형이 검출된다. 검출은 뉴클레오타이드가 도입되면서 검출되는 실시간일 수 있다. 불행하게도, 실시간 절차는 때때로 매우 반복적인 서열 및 동종중합체성 지역을 함유하는 영역의 부정확한 판독으로 인해 어려움을 겪을 수 있다. 검출은 또한 제어된 반응 조건 및/또는 시약이 합성 동안 주어진 시간에 반응을 가역적으로 중지시키고 시작하는 중지 및 진행 단계를 반복하여 진행될 수 있다.
많은 합성에 의한 시퀀싱 기술은 형광 검출에 기초하므로, 뉴클레오타이드의 형광 표지화가 필요하다. 필요한 조명 및 광학 시스템은 시스템의 복잡성과 비용을 증가시킬 수 있다. 예로서, SBS 방법은 종종 도입된 뉴클레오타이드를 검출하고 주형 핵산 서열을 확인하기 위해 형광 표지된 dNTP를 필요로 한다. 그러나, 표지된 뉴클레오타이드의 사용은 정확도에 한계가 있는데, 표지된 뉴클레오타이드를 사용하는 현재의 SBS 반응이 수백 개 염기 이후에 오류를 발생시키기 때문이다. 전체 게놈이 분석될 때 1% 오류율조차도 시퀀싱 결과의 유의성을 손상시킬 수 있다. 단일 표지의 검출 실패가 결실 오류를 초래하는 경우 또는 표유 분자(stray molecule)의 검출이 삽입 오류를 초래하는 경우, 정확도가 감소할 수 있다. 표백된(bleached) 형광단은 위음성을 유발한다. 또한, 표지되지 않은 dNTP(예컨대, 불순물 또는 가수분해 생성물)에 의한 표지된 dNTP의 오염 또한 위음성을 유발할 수 있다. 또한, 구조화된 표면에 비특이적으로 결합된 표지된 dNTP로부터의 표유 신호는 삽입 오류 또는 높은 신호 대 노이즈 비율의 원인이 된다. 변형된 뉴클레오타이드의 사용은 효소 동역학을 유의하게 늦추어 시퀀싱 반응을 매우 느리게 만든다. SBS 절차에서 표지된 뉴클레오타이드의 또 다른 문제점은, 다음의 부가를 백그라운드 신호 없이 관찰할 수 있도록 표지가 도입되고 검출된 후에 표지를 제거하거나 비활성화할 필요가 있다는 점이다. 따라서, 긴 리드 길이를 얻기 위해서는, 다음의 부가를 위해 기질을 차단 해제하거나 염료를 제거하는 거의 100% 화학적, 효소적 또는 광분해 단계가 각각의 부가 단계 다음에 이어져야 한다.
종래의 시퀀싱 기술과 전형적으로 관련된 많은 문제점을 극복하는 기술적 접근법이 하기에 개시되어 있다.
주형 핵산 분자의 서열을 결정하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 특정 조건하에 수행된 결합 반응에 기초한다. 방법은 일반적으로 뉴클레오타이드의 도입 전에 검사 단계를 포함한다. 검사 단계는 프라이머로 프라이밍된 주형 핵산 분자를 제공하는 단계; 프라이밍된 주형 핵산 분자를 중합효소 및 적어도 하나의 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 제1 반응 혼합물과 접촉시키는 단계; 프라이밍된 주형 핵산 내로 뉴클레오타이드 분자의 화학적 도입 없이, 뉴클레오타이드 분자의 존재하에 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자와의 상호작용을 모니터링하는 단계; 및 뉴클레오타이드 분자의 존재하에 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자와의 모니터링된 상호작용을 이용하여 주형 핵산에서 다음의 염기를 확인하는 단계를 포함한다. 이 절차에서, 삼성분 복합체 안정화 및 이성분 복합체 불안정화가 유리하게도 정확한 뉴클레오타이드와 부정확한 뉴클레오타이드 사이의 구별을 향상시킨다.
프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 방법이 본원에 또한 제공된다. 방법은 (a) 프라이머로 프라이밍된 주형 핵산 분자를 제공하는 단계; (b) 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서, 프라이밍된 주형 핵산 분자, 중합효소 및 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건하에, 프라이밍된 주형 핵산 분자를 중합효소 및 2종 또는 3종의 상이한 시험 뉴클레오타이드의 상이한 조합을 각각 포함하는 반응 혼합물과 순차적으로 접촉시키는 단계; (c) 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 화학적 도입 없이, 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자와의 상호작용을 검출하여, 삼성분 복합체가 형성되는지 여부를 결정하는 단계; 및 (d) 검출된 상호작용을 이용하여 반응 혼합물 중 적어도 2개에 공통인 시험 뉴클레오타이드가 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드인지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 선택적으로, 방법은 (e) 단계 (c) 후 프라이머의 3' 말단에 뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 선택사항에서, 도입된 뉴클레오타이드는 표지되지 않은 뉴클레오타이드 또는 표지되지 않은 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드이다. 선택적으로, 단계 (b) 내지 (e)는 프라이밍된 주형 핵산 분자의 서열을 시퀀싱하기 위해 반복될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법의 단계 (d)는 검출된 상호작용을 이용하여 반응 혼합물 중 2개에 공통인 시험 뉴클레오타이드가 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드인지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 이 구현예에서, 단계 (b)에서 4개의 상이한 반응 혼합물이 프라이밍된 주형 핵산 분자와 순차적으로 접촉될 수 있고, 전체적으로 각각의 상이한 뉴클레오타이드가 2개의 반응 혼합물 중에 존재한다.
다른 구현예에서, 상기 방법의 단계 (d)는 검출된 상호작용을 이용하여 반응 혼합물 중 3개에 공통인 시험 뉴클레오타이드가 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드인지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 이 구현예에서, 단계 (b)에서 6개의 상이한 반응 혼합물이 프라이밍된 주형 핵산 분자와 순차적으로 접촉될 수 있고, 전체적으로 각각의 상이한 뉴클레오타이드가 3개의 반응 혼합물 중에 존재한다.
특정 구현예에서, 단계 (b)의 조건은 또한 프라이밍된 주형 핵산 분자 및 중합효소를 포함하나 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 이성분 복합체를 불안정화시킨다.
단계 (b)의 삼성분 복합체는 프라이머의 3' 말단 뉴클레오타이드 상에 가역적 터미네이터 모이어티의 존재에 의해 안정화될 수 있다. 선택적으로, 단계 (c) 후, 방법은 프라이머의 3' 말단 뉴클레오타이드 상의 가역적 터미네이터 모이어티를 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 상기 방법의 일부 구현예에서, 시험 뉴클레오타이드 각각은 표지되지 않은 뉴클레오타이드이다. 선택적으로, 중합효소는 단계 (c)에서 검출되는 외인성 표지를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 단계 (c)에서 검출되는 외인성 표지를 포함한다.
프라이밍된 주형 핵산을 시퀀싱하는 방법이 추가로 제공된다. 방법은 (a) 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산 및 프라이밍된 주형 핵산의 다음의 염기에 상보적인 시험 뉴클레오타이드 사이의 안정화된 삼성분 복합체를 형성하는 조건하에 프라이밍된 주형 핵산을 중합효소 및 2개 또는 3개 유형의 시험 뉴클레오타이드의 제1 조합과 접촉시키는 단계; (b) 프라이머 내로의 시험 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서 삼성분 복합체를 검출하는 단계; (c) 프라이밍된 주형 핵산, 중합효소 및 2개 또는 3개 유형의 시험 뉴클레오타이드의 제2 조합을 사용하여 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계로서, 제2 조합은 제1 조합과 상이한 것인 단계; (d) 단계 (c) 후, 프라이머 내로 다음의 염기에 상보적인 뉴클레오타이드를 도입하는 단계; 및 (e) 단계 (a) 내지 (d)를 반복하여 프라이밍된 주형 핵산의 서열을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 시퀀싱 방법의 일부 구현예에서의, 제1 조합은 2개, 및 오직 2개 유형의 시험 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 제2 조합은 또한 2개, 및 오직 2개 유형의 시험 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 시퀀싱 방법의 일부 구현예에서, 단계 (a) 및 (b)는 2개 유형의 시험 뉴클레오타이드의 4개의 상이한 조합에 대해 순차적으로 수행되며, 각각의 상이한 뉴클레오타이드 유형은 프라이밍된 주형 핵산과 합계하여 2회 접촉된다. 대안적으로, 단계 (a) 및 (b)는 2개 유형의 시험 뉴클레오타이드의 6개의 상이한 조합에 대해 순차적으로 수행될 수 있으며, 각각의 상이한 뉴클레오타이드 유형은 합계하여 3회 존재한다.
프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 결정하는 방법이 추가로 제공된다. 방법은 (a) 프라이머로 프라이밍된 주형 핵산 분자를 제공하는 단계; (b) (i) 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서, 프라이밍된 주형 핵산 분자, 중합효소 및 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 삼성분 복합체를 안정화시키고, (ii) 프라이밍된 주형 핵산 분자 및 중합효소를 포함하나 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 이성분 복합체를 불안정화시키는 조건하에, 단계 (a)로부터의 프라이밍된 주형 핵산 분자를 중합효소 및 적어도 하나의 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제1 반응 혼합물과 접촉시키는 단계; (c) 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 화학적 도입 없이 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자와의 상호작용을 검출(예컨대, 모니터링)하여, 단계 (b)에서 삼성분 복합체가 형성되었는지 여부를 결정하는 단계; 및 (d) 단계 (c)의 결과를 사용하여 임의의 시험 뉴클레오타이드가 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드인지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 하나의 일반적으로 바람직한 구현예에 따르면, 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건은 중합을 억제하는 비촉매성 금속 이온을 제1 반응 혼합물에 포함시킴으로써 제공될 수 있다. 또 다른 일반적으로 바람직한 구현예에 따르면, 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건은 알로스테릭 중합효소 억제제, 경쟁력 없는(uncompetitive) 중합효소 억제제, 경쟁적 중합효소 억제제, 및 비경쟁적(non-competitive) 중합효소 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 중합효소 억제제를 제1 반응 혼합물에 포함시킴으로써 제공될 수 있다. 또 다른 일반적으로 바람직한 구현예에 따르면, 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건은 단계 (b)를 수행하기 전에 프라이머를 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드를 이용하여 종결시킴으로써 제공될 수 있다. 또 다른 일반적으로 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (b)에서 이성분 복합체를 불안정화시키는 조건은 50 mM 내지 1,500 mM의 농도의 1가 양이온을 제공하는 염을 포함할 수 있고, 염은 제1 반응 혼합물에 포함된다. 보다 바람직하게는, 단계 (b)에서 삼성분 복합체를 안정화시키고 이성분 복합체를 불안정화시키는 반응 조건은 이성분 복합체 형성보다 삼성분 복합체 형성을 적어도 2배 향상시킬 수 있다. 보다 바람직하게는, 단계 (b)에서 삼성분 복합체를 안정화시키고 이성분 복합체를 불안정화시키는 반응 조건은 이성분 복합체 형성보다 삼성분 복합체 형성을 적어도 5배 향상시킬 수 있다. 대안적으로, 단계 (b)가 제1 반응 혼합물에서 50 mM 내지 1,500 mM의 농도의 1가 양이온을 제공하는 염을 포함하는 경우, 1가 양이온을 제공하는 염은 글루타메이트 음이온을 추가로 제공할 수 있다. 대안적으로, 단계 (b)가 제1 반응 혼합물에서 50 mM 내지 1,500 mM의 농도의 1가 양이온을 제공하는 염을 포함하는 경우, 1가 양이온을 제공하는 염의 농도는 50 mM 내지 500 mM일 수 있다. 보다 바람직하게는, 1가 양이온을 제공하는 염의 농도는 100 mM 내지 300 mM일 수 있다. 대안적으로, 단계 (b)가 제1 반응 혼합물에서 50 mM 내지 500 mM의 농도의 1가 양이온을 제공하는 염을 포함하는 경우, 제1 반응 혼합물은 10 mM 내지 1.6 M의 농도로 글루타메이트 염을 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 글루타메이트 염의 농도는 80 mM 내지 320 mM일 수 있다. 대안적으로, 단계 (b)가 제1 반응 혼합물에서 50 mM 내지 500 mM의 농도의 1가 양이온을 제공하는 염을 포함하는 경우, 염은 글루타메이트 염일 수 있다. 대안적으로, 단계 (b)가 제1 반응 혼합물에서 50 mM 내지 500 mM의 농도의 1가 양이온을 제공하는 염을 포함하는 경우, 염은 NaCl, KCl, NH2(SO4), 및 칼륨 글루타메이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 구현예에 따르면, 단계 (b)가 제1 반응 혼합물에서 50 mM 내지 1,500 mM의 농도의 1가 양이온을 제공하는 염을 포함하는 경우, 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건은 중합을 억제하는 비촉매성 금속 이온에 의해 제공될 수 있다. 또 다른 구현예에 따르면, 단계 (b)가 제1 반응 혼합물에서 50 mM 내지 1,500 mM의 농도의 1가 양이온을 제공하는 염을 포함하는 경우, 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건은 단계 (b)를 수행하기 전에 프라이머를 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드를 사용하여 종결시킴으로써 제공될 수 있다. 또 다른 구현예에 따르면, 단계 (b)가 제1 반응 혼합물에서 50 mM 내지 500 mM의 농도의 1가 양이온을 제공하는 염을 포함하는 경우, 단계 (b)에서 이성분 복합체를 불안정화시키는 조건은 200 mM의 1가 양이온을 제공하는 염을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 염은 NaCl, KCl, NH2(SO4), 및 칼륨 글루타메이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건은 중합을 억제하는 비촉매성 금속 이온에 의해 제공될 수 있다. 보다 바람직하게는, 제1 반응 혼합물은 10 mM 내지 1.6 M의 농도로 칼륨 글루타메이트를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에 따르면, 단계 (b)가 제1 반응 혼합물에서 50 mM 내지 500 mM의 농도의 1가 양이온을 제공하는 염을 포함하는 경우, 및 단계 (b)에서 이성분 복합체를 불안정화시키는 조건이 200 mM의 1가 양이온을 제공하는 염을 포함하는 경우, 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건은 단계 (b)를 수행하기 전에 프라이머를 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드를 사용하여 종결시킴으로써 제공될 수 있다. 또 다른 일반적으로 바람직한 구현예에 따르면, 제1 반응 혼합물의 각각의 시험 뉴클레오타이드는 상이한 표지되지 않은 뉴클레오타이드이다. 보다 바람직하게는, 각각의 상이한 표지되지 않은 뉴클레오타이드는 상이한 천연 뉴클레오타이드일 수 있다. 대안적으로, 중합효소는 외인성의 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 예를 들어, 외인성의 검출 가능한 표지는 형광 표지를 포함할 수 있다. 상이한 바람직한 구현예에 따르면, 제1 반응 혼합물의 시험 뉴클레오타이드 각각이 상이한 표지되지 않은 뉴클레오타이드인 경우, 중합효소는 신호를 방출하는 검출 가능한 표지를 포함할 수 있고, 검출 가능한 표지에 의한 신호의 방출은 중합효소가 임의의 뉴클레오타이드의 존재 또는 부재하에 프라이밍된 주형 핵산 분자와 복합체화될 때 실질적으로 균일할 수 있다. 또 다른 일반적으로 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)의 프라이밍된 주형 핵산 분자는 고체 지지체 상의 위치(locus)에 고정화되고, 중합효소는 신호를 방출하는 검출 가능한 표지를 포함하며, 검출 가능한 표지에 의한 신호의 방출은 임의의 뉴클레오타이드의 존재 또는 부재하에 프라이밍된 주형 핵산 분자와 복합체화될 때 실질적으로 균일하며, 단계 (c)는 고체 지지체 상의 위치에서 신호의 강도를 측정하는 것을 포함하고, 단계 (b)에서 삼성분 복합체의 형성 증가는 위치에서 신호의 강도 증가에 의해 나타난다. 이 경우, 고체 지지체는 플로우 셀(flow cell) 내에 함유될 수 있고, 검출 가능한 표지는 검출 가능한 형광 표지일 수 있다. 대안적으로, 방법은 (e) 제1 반응 혼합물을 중합효소, 하나 이상의 뉴클레오타이드, 및 촉매성 양이온을 포함하는 제2 반응 혼합물로 대체하여 하나 이상의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 프라이머 내로 도입되는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 제2 반응 혼합물의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 적어도 하나의 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드를 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체는 플로우 셀 내에 함유되며, 단계 (e)는 플로우 셀을 통과하는 유체 유동에 의해 제1 반응 혼합물을 대체하는 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)의 프라이밍된 주형 핵산 분자가 고체 지지체 상의 위치에 고정화되는 경우, 중합효소가 신호를 방출하는 검출 가능한 표지를 포함하며, 검출 가능한 표지에 의한 신호의 방출은 임의의 뉴클레오타이드의 존재 또는 부재하에 프라이밍된 주형 핵산 분자과 복합체화될 때 실질적으로 균일한 경우, 단계(c)가 고체 지지체 상의 위치에서 신호의 강도를 측정하는 것을 포함하는 경우, 단계 (b)에서 삼성분 복합체의 형성 증가가 위치에서 신호 강도의 증가에 의해 나타나는 경우, 및 방법이 (e) 제1 반응 혼합물을 중합효소, 하나 이상의 뉴클레오타이드, 및 촉매성 양이온을 포함하는 제2 반응 혼합물으로 대체하는 단계를 추가로 포함하고, 이로써 하나 이상의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 프라이머 내로 도입되는 경우, 제2 반응 혼합물은 100 mM 미만의 각각의 NaCl 및 KCl을 포함할 수 있다. 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)의 프라이밍된 주형 핵산 분자가 고체 지지체 상의 위치에 고정화되는 경우, 중합효소가 신호를 방출하는 검출 가능한 표지를 포함하고, 이로써 검출 가능한 표지에 의한 신호의 방출이 중합효소가 임의의 뉴클레오타이드의 존재 또는 부재하에 프라이밍된 주형 핵산 분자와 복합체화될 때 실질적으로 균일한 경우, 단계 (c)가 고체 지지체 상의 위치에서 신호의 강도를 측정하는 단계를 포함하는 경우, 단계 (b)에서 삼성분 복합체의 형성 증가가 위치에서 신호 강도 증가에 의해 나타나는 경우, 및 방법이 (e) 제1 반응 혼합물을 중합효소, 하나 이상의 뉴클레오타이드, 및 촉매성 양이온을 포함하는 제2 반응 혼합물로 대체하여, 하나 이상의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 프라이머 내로 도입되는 단계를 추가로 포함하는 경우, 제2 반응 혼합물의 중합효소는 제1 반응 혼합물의 중합효소와 상이한 중합효소일 수 있다. 일부 구현예에서, 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드는 형광 표지를 포함하지 않는다. 또 다른 일반적으로 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)의 프라이밍된 주형 핵산 분자는 플로우 셀 내에 함유된 고체 지지체 상의 위치에 고정화될 수 있고, 방법은 (e) 플로우 셀을 통한 유체 유동에 의해, 제1 반응 혼합물을 중합효소, 하나 이상의 뉴클레오타이드, 및 촉매성 양이온을 포함하는 제2 반응 혼합물로 대체하여 하나 이상의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 프라이머 내로 도입되는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 바람직한 구현예에 따르면, 제2 반응 혼합물의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 적어도 하나의 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상이한 바람직한 구현예에 따르면, 제2 반응 혼합물은 100 mM 미만의 각각의 NaCl 및 KCl을 포함한다. 상이한 바람직한 구현예에 따르면, 방법은 단계 (c) 및 단계 (e) 사이에 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 세척하여 제1 반응 혼합물의 성분 중 적어도 하나를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 제2 반응 혼합물의 중합효소는 제1 반응 혼합물의 중합효소와 상이한 중합효소이다. 일부 구현예에서, 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드는 형광 표지를 포함하지 않는다. 또 다른 일반적으로 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)의 프라이밍된 주형 핵산 분자는 고체 지지체 상의 위치에 고정화되고, 단계 (c)는 고체 지지체 상의 위치에서 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자와의 상호작용을 나타내는 신호의 강도를 측정하는 단계를 포함하며, 단계 (d)는 측정된 신호의 강도가 소정의 역치를 초과할 경우 제1 반응 혼합물의 시험 뉴클레오타이드 중 하나가 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드인지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 보다 바람직하게는, 단계 (c) 후 및 단계 (e) 전에 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 세척하여 제1 반응 혼합물의 성분 중 적어도 하나를 제거하는 추가 단계가 있다. 또 다른 일반적으로 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)의 프라이밍된 주형 핵산 분자는 플로우 셀 내에 함유된 고체 지지체 상의 위치에 고정화되고, 방법은 단계 (c) 후 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 세척하여 제1 반응 혼합물의 적어도 하나의 시험 뉴클레오타이드 중 하나 이상을 제거하는 단계; 및 세척 단계 후 중합효소와 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자와의 상호작용을 검출(예컨대, 모니터링)하여 단계 (b)에서 형성되었을 수 있는 임의의 삼성분 복합체가 남아있는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
고정화된 핵산 피처(feature)의 집단에 중합효소 및 뉴클레오타이드를 전달하는 방법이 추가로 제공되며, 각각의 특징은 프라이밍된 주형 핵산 분자를 포함한다. 방법은 (a) 고정화된 핵산 피처의 집단을 중합효소, 제1 뉴클레오타이드, 및 적어도 하나의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 포함하는 제1 시약과 접촉시키는 단계를 포함하며, 제1 뉴클레오타이드는 제1 시약의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자 중 어느 것에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 아니고, 접촉은 삼성분 복합체를 안정화시키고 중합효소에 의한 포스포디에스테르 결합 형성의 촉매 작용을 억제하거나 배제하는 조건하에서 발생하며, 이로써, 제1 시약의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자의 부재하에 중합효소 및 제1 뉴클레오타이드를 포함하는 시약의 사용과 비교하여, 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 뉴클레오타이드 비의존적 중합효소 결합이 감소된다. 일부 구현예에서, 단계 (a) 후 제1 시약을 제1 시약의 중합효소, 제2 뉴클레오타이드, 및 적어도 하나의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 포함하는 제2 시약으로 대체하는 추가 단계가 있으며, 제1 뉴클레오타이드와 제2 뉴클레오타이드는 서로 상이하고, 제2 뉴클레오타이드는 제2 시약의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자 중 어느 것에 대한 동족 뉴클레오타이드가 아니며, 대체는 삼성분 복합체를 안정화시키고 중합효소에 의한 포스포디에스테르 결합 형성의 촉매 작용을 억제하거나 배제하는 조건하에서 발생하며, 이로써, 제2 시약의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자의 부재하에 중합효소 및 제2 뉴클레오타이드를 포함하는 시약의 사용과 비교하여, 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 뉴클레오타이드 비의존적 중합효소 결합이 감소된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 시약의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자는 서로 상이하다.
(a) 고정화된 프라이밍된 주형 핵산을 각각 포함하는 복수의 고정화된 핵산 피처; (b) 중합효소; (c) 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자; 및 (d) 뉴클레오타이드 각각을 포함하는 반응 혼합물이 추가로 제공되며, 뉴클레오타이드는 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 동족 뉴클레오타이드가 아니고, 고정화된 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합효소의 뉴클레오타이드 비의존적 결합은 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자의 존재에 의해 감소된다. 일부 구현예에서, 중합효소, 고정화된 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드는 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 내로 뉴클레오타이드를 도입하는 것이 억제되거나 배제된 안정화된 삼성분 복합체를 형성한다.
(a) 중합효소; (b) 적어도 하나의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자; 및 (c) 적어도 하나의 뉴클레오타이드 각각을 포함하는 중합효소 전달 시약이 추가로 제공되며, 뉴클레오타이드 중 어느 것도 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자 중 어느 것에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 아니다. 일부 구현예에서, 중합효소 전달 시약은 (d) 용액상 중합효소에 의해 포스포디에스테르 결합 형성을 억제하는 삼성분 복합체 안정화제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오타이드는 적어도 하나의 천연 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액상 프라이밍된 주형 핵산 분자는 각각 상이한 3' 말단 뉴클레오타이드를 갖는 3종 이하의 상이한 유형의 프라이밍된 주형 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 중합효소는 Mg2+ 이온의 존재하에 촉매성 포스포디에스테르 결합 형성 활성이 없는 돌연변이체 중합효소이다.
프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 확인하는 방법이 추가로 제공된다. 방법은 (a) 프라이머로 프라이밍된 주형 핵산 분자를 제공하는 단계를 포함하며, 프라이머는 그의 3' 말단 뉴클레오타이드에 부착된 가역적 터미네이터 모이어티를 포함한다. 또한 (b) 촉매성 금속 이온의 존재하에, 그리고 임의의 뉴클레오타이드를 도입하지 않고, 프라이밍된 주형 핵산 분자를 복수의 중합효소-뉴클레오타이드 조합와 순차적으로 접촉시키는 단계가 있을 수 있다. 각각의 조합은 중합효소 및 상이한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 순차적 접촉의 결과로서, 상이한 뉴클레오타이드 중 하나가 다음의 정확한 뉴클레오타이드일 때, 중합효소, 중합효소와 조합하여 전달된 상이한 뉴클레오타이드 중 하나, 및 프라이밍된 주형 핵산 분자를 포함하는 삼성분 복합체가 형성된다. 또한 (c) 삼성분 복합체를 검출함으로써, 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 삼성분 복합체를 형성하기 위해 중합효소와 조합된 프라이밍된 주형 핵산 분자와 접촉된 상이한 뉴클레오타이드 중 하나로서 확인하는 단계가 있을 수 있다. 하나의 일반적으로 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (b)는 촉매성 금속 이온의 존재하에 그리고 도입을 억제하는 임의의 비촉매성 이온의 부재하에 프라이밍된 주형 핵산 분자를 복수의 중합효소-뉴클레오타이드 조합과 순차적으로 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 촉매성 금속 이온은 마그네슘 이온이다. 일부 구현예에서, 중합효소는 신호를 생성하는 외인성의 검출 가능한 표지를 포함하는 표지된 중합효소이며, 표지된 중합효소의 표지에 의해 생성된 신호는 임의의 뉴클레오타이드의 존재 또는 부재하에 실질적으로 변화하지 않고, 단계 (c)는 표지된 중합효소의 외인성의 검출 가능한 표지를 검출함으로써 삼성분 복합체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표지된 중합효소의 외인성의 검출 가능한 표지는 형태적으로 민감한 표지일 필요가 없다. 여기서, 단계 (a)에서 조합의 상이한 뉴클레오타이드 각각은, 예를 들어, 상이한 천연 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 단계 (b)가 촉매성 금속 이온의 존재하에 그리고 도입을 억제하는 임의의 비촉매성 이온의 부재하에 프라이밍된 주형 핵산 분자를 복수의 중합효소-뉴클레오타이드 조합과 순차적으로 접촉시키는 단계를 포함하는 경우, 조합의 각각의 상이한 뉴클레오타이드는 신호를 생성하는 외인성의 검출 가능한 표지를 갖는 상이한 표지된 뉴클레오타이드일 수 있고, 상이한 표지된 뉴클레오타이드에 의해 생성된 신호는 삼성분 복합체의 형성 전과 후에 실질적으로 동일하다. 일부 다른 구현예에서, 단계 (b)가 촉매성 금속 이온의 존재하에 그리고 도입을 억제하는 임의의 비촉매성 이온의 부재하에 프라이밍된 주형 핵산 분자를 복수의 중합효소-뉴클레오타이드 조합와 순차적으로 접촉시키는 단계를 포함하는 경우, 프라이밍된 주형 핵산 분자는 플로우 셀 내에 함유될 수 있고, 단계 (b)는 복수의 중합효소-뉴클레오타이드 조합 중 하나를 각각 포함하는 복수의 시약 용액을 한 번에 하나씩 플로우 셀을 통해 유동시킴으로써 프라이밍된 주형 핵산 분자를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 프라이밍된 주형 핵산 분자는 플로우 셀 내에 함유된 비드 상에 배치된다. 상이한 바람직한 구현예에 따르면, 방법은 삼성분 복합체를 형성하기 위해 프라이밍된 주형 핵산 분자와 조합되지 않은 임의의 중합효소 및 상이한 뉴클레오타이드를 제거하는 세척 완충액을 복수의 시약 용액 각각의 유동 사이에 플로우 셀을 통해 유동시키는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 상이한 바람직한 구현예에 따르면, 방법은 (d) 삼성분 복합체를 해리시키는 스트리핑(stripping) 완충액을 플로우 셀을 통해 유동시켜 프라이밍된 주형 핵산 분자로부터 중합효소 및 상이한 뉴클레오타이드 중 하나를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 개시된 방법은 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머의 3' 말단 뉴클레오타이드에 부착된 가역적 터미네이터 모이어티를 제거하여 연장 가능한 프라이머를 포함하는 프라이밍된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 보다 바람직하게는, 방법은 (e) 연장 가능한 프라이머 내로 뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 이 경우, 단계 (e)는 단계 (a)의 중합효소와 상이한 중합효소를 사용하여 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 연장 가능한 프라이머 내로 도입된 뉴클레오타이드는 가역적 터미네이터 모이어티를 포함할 수 있고, 도입은 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 생성한다. 또 다른 일반적으로 바람직한 구현예에 따르면, 중합효소는 외인성의 검출 가능한 표지를 포함하는 표지된 중합효소이다. 또 다른 일반적으로 바람직한 구현예에 따르면, 조합의 상이한 뉴클레오타이드 각각은 상이한 천연 뉴클레오타이드, 또는 임의의 외인성 형광 모이어티가 없는 상이한 표지되지 않은 뉴클레오타이드 유사체이다. 또 다른 일반적으로 바람직한 구현예에 따르면, 조합의 각각의 상이한 뉴클레오타이드는 신호를 생성하는 외인성의 검출 가능한 표지를 포함하는 상이한 표지된 뉴클레오타이드이며, 상이한 표지된 뉴클레오타이드 각각에 의해 생성된 신호는 삼성분 복합체의 형성 전과 후에 실질적으로 동일하다. 또 다른 일반적으로 바람직한 구현예에 따르면, 복수의 중합효소-뉴클레오타이드 조합은 4개의 중합효소-뉴클레오타이드 조합으로 구성된다. 또 다른 일반적으로 바람직한 구현예에 따르면, 프라이밍된 주형 핵산 분자는 플로우 셀 내에 함유되며, 단계 (b)는 각각 복수의 중합효소-뉴클레오타이드 조합 중 하나를 포함하는 복수의 시약 용액을 한 번에 하나씩 플로우 셀을 통해 유동시킴으로써 프라이밍된 주형 핵산 분자를 순차적으로 접촉시키는 단계를 포함한다. 또 다른 일반적으로 바람직한 구현예에 따르면, 방법은 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머의 3' 뉴클레오타이드로부터 가역적 터미네이터 모이어티를 제거하여 연장 가능한 프라이머를 포함하는 프라이밍된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 일반적으로 바람직한 구현예에 따르면, 방법은 (d) 삼성분 복합체를 해리시키는 스트리핑 완충액을 플로우 셀을 통해 유동시켜 프라이밍된 주형 핵산 분자로부터 중합효소 및 상이한 뉴클레오타이드 중 하나를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 보다 바람직하게는, 방법은 (e) 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머의 3' 말단 뉴클레오타이드에 부착된 가역적 터미네이터 모이어티를 제거하여 연장 가능한 프라이머를 포함하는 프라이밍된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 보다 바람직하게는, 방법은 (f) 연장 가능한 프라이머 내로 뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 보다 바람직하게는, 연장 가능한 프라이머 내로 도입된 뉴클레오타이드는 가역적 터미네이터 모이어티를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 방법은 단계 (a)-(f)를 적어도 1회 반복하여 주형 핵산 분자에 대한 서열 정보를 얻는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
도 1은 결합 또는 검사 단계 동안 마그네슘이 존재하거나 부재하는 비표지된 광학 검출 방법을 사용한 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 Bst2.0 효소 및 dNTP를 사용하여 정확한 염기를 결정하기 위한 Bst 효소 결합 동역학을 사용한 시퀀싱을 나타내는 그래프이다.
도 3은 FORTEBIO® 옥텟 기구(Menlo Park, CA)에서 생물층 간섭계를 사용하여 매치 및 미스매치 염기 구별 효과에 대한 염 농도의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 phiX_matchC 및 FP2 프라이머 및 클레나우 또는 Bst2.0 효소, 및 SrCl2를 사용하여 세척 단계 동안, 즉, 중합효소의 해리 동안의 염기 구별을 나타내는 그래프이다.
도 5는 다양한 농도의 SrCl2(0 mM-14 mM)를 사용하여 핵산, 중합효소 복합체의 안정화에 대한 세척의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 시퀀싱에 대한 DNA pol I의 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7A 및 7B는 HIV-1 역전사효소, NNRTI 화합물 7 및 표시된 dNTP를 사용한 인간 ALK 게이트키퍼 영역의 시퀀싱을 나타내는 그래프이다. 도 7A는 시퀀싱의 연속 사이클에 대한 시간 경과를 나타내는 그래프이다. 도 7B는 이전 사이클로부터 백그라운드를 차감한 후 개별 패널에서 사이클 1-12를 나타내는 그래프이다. 예상된 서열 판독은 CAGCAGGA(서열번호:1)이고, 관찰된 서열 판독은 CAGCAGG(서열번호:2)였다.
도 8은 HIV-1 역전사효소, NNRTI 화합물 18 및 다양한 dNTP를 사용한 인간 ALK 게이트키퍼 영역의 시퀀싱을 나타내는 그래프이다.
도 9는 SPRi 바이오센서를 사용한 phiX_matchA 주형의 시퀀싱을 나타내는 센서그램이다. 회색 부위는 정확한 염기 호출(base call)에 해당한다. 점선은 정확한 클레나우/dNTP 조합의 결합을 결정하는 데 사용된 강도 변화 역치(intensity change threshold)를 나타낸다.
도 10A, 10B, 및 10C는 바실러스 스테아로써모필러스로부터의 Bst DNA 중합효소를 사용한 닉(nick) 번역에 의한 dsDNA의 시퀀싱을 나타내는 그래프이다. 하나의 염기 갭을 갖는 이중 가닥의 DNA를 결합 완충액 중에 표시된 dNTP를 갖거나 갖지 않는 Bst DNA Pol로 처리하였다. 바이오센서를 dNTP 도입을 위한 반응 완충액으로 옮긴 다음, 120초(도 10A) 또는 60초(도 10B) 동안 비주형 가닥의 5'-3' 엑소핵산분해 절단을 위한 dNTP가 없는 Bst DNA Pol을 함유하는 반응 완충액으로 옮겼다. 대조군으로서, Bst DNA Pol을 프라이밍된 ssDNA 주형의 결합에 의한 시퀀싱, dNTP 도입, 이어서 5'-3' 엑소핵산분해 처리에 사용하였다(도 10C).
도 11A, 11B, 및 11C는 E. coli DNA 중합효소의 클레나우(3'→5' 엑소(-)) 단편을 사용한 가닥 치환에 의한 5'-플랩을 갖는 dsDNA의 시퀀싱을 나타내는 그래프이다. DNA 주형을 MgCl2가 없는 결합 완충액 중에 표시된 dNTP를 갖거나 갖지 않는 클레나우 엑소(-) DNA Pol로 처리하였다. 바이오센서를 촉매 작용을 위해 MgCl2를 갖는 세척 완충액으로 옮긴 다음, 효소 또는 dNTP가 없는 결합 완충액에서 재평형화하였다. 사이클을 표시된 바와 같이 각각의 개별 dNTP에 대해 반복하였다. 도 11A: 단일 가닥의 DNA. 도 11B: 하나의 염기 갭을 갖는 이중 가닥의 DNA. 도 11C: 하나의 염기 쌍 갭의 하류에 5'-올리고-dT 플랩을 갖는 이중 가닥의 DNA.
도 12A, 12B, 및 12C는 E. coli DNA 중합효소의 클레나우(3'→5' 엑소(-)) 단편에 의한 ssDNA의 시퀀싱이 염 성분에 의해 촉진된다는 것을 나타내는 그래프이다. 결합 완충액은 200 mM 글루타메이트(도 12A), 100 mM 글루타메이트(도 12B) 및 50 mM 글루타메이트(도 12C)를 함유한다. 반응 완충액은 글루타메이트가 없는 MgCl2를 함유한다. 각각의 사이클에 대해 적용된 dNTP("dNTP")가 도 12A, 12B, 및 12C 각각의 상부 텍스트 행(서열번호:14)에 나타나 있다. 클레나우(엑소(-))의 결합은 도 12A(서열번호:15), 12B(서열번호:17), 및 12C(서열번호:19)의 두 번째 행에서 관찰된 서열("관찰")을 나타낸다. 주형에 기초한 "예상" 서열은 도 12A(서열번호:16), 12B(서열번호:18), 및 12C(서열번호:20)의 세 번째 텍스트 행에 나타나 있다.
도 13A, 13B, 및 13C는 클레나우 엑소(-) DNA 중합효소에 의한 ALK 야생형의 백그라운드에서 인간 ALK C4493A 돌연변이체의 센스 가닥의 시퀀싱 그래프이다. 도 13A는 야생형 및 C4493A 돌연변이체의 ssDNA 혼합물에서의 시퀀싱을 나타내는 센서그램이다. 도 13B는 ssDNA 혼합물에서, 사이클 4(T)에 나타난 C4493A 돌연변이체의 선형 정량, 및 사이클 3(G)에 나타난 야생형 ALK의 선형 정량을 나타내는 그래프이다. 도 13C는 dsDNA-플랩 혼합물에서, C4493A 돌연변이체의 선형 정량이 사이클 4(T)에 나타나 있고 야생형 ALK의 대략적인 선형 양이 사이클 3(G)에 나타나 있음을 나타내는 그래프이다.
도 14A 및 14B는 인간 ALK C4493A 돌연변이체에 대한 클레나우 엑소(-) 및 dCTP의 2가 양이온 매개된 결합 및 촉매성 금속(MgCl2)을 갖거나 갖지 않는 해리의 그래프이다. 도 14A는 비촉매성 금속의 존재하에 프라이머/주형에의 결합 및 해리를 나타내는 그래프이다. 도 14B는 촉매성 금속의 존재하에 프라이머/주형에의 결합 및 해리를 나타내는 그래프이다.
도 15는 결합이 저농도의 CoCl2에 의해 매개되고 도입이 고농도의 CoCl2에 의해 매개되는, 인간 ALK C4493A 돌연변이체의 클레나우 엑소(-) 시퀀싱의 그래프이다.
도 16은 결합이 Ni(II)SO4에 의해 매개되고 도입이 MgCl2에 의해 영향을 받는, 인간 ALK C4493A 돌연변이체의 클레나우 엑소(-) 시퀀싱의 그래프이다. 기저선으로의 해리는 뉴클레오사이드 이인산 키나아제 및 ADP의 존재하에서만 관찰되며, 이는 유리 dNTP를 제거하여 dNTP가 클레나우 엑소(-) 및 프라이머/주형의 복합체 내로 재결합하는 것을 방지한다.
도 17A 및 17B는 인간 ALK C4493A 돌연변이체의 Bsu Pol I(큰 단편) 시퀀싱 동안 동종중합체(homopolymer) 분해능을 나타내는 그래프이다. 결합은 Ni(II)SO4, MgCl2에 의한 도입, 및 dNDP의 존재 또는 부재하에서의 해리에 의해 매개된다. 도 17A는 옥텟 QK 시스템을 사용한 시퀀싱의 센서그램이다. 도 17B는 2개의 연속적인 G 피크의 분해능이 반응 완충액 중의 dNDP의 농도에 의존한다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 18A, 18B, 18C, 18D 및 18E는 인간 야생형 ALK의 Bsu Pol I(큰 단편) 시퀀싱 동안 동종중합체 분해능을 나타내는 그래프이다. 도 18A는 주형 ALK-G1, ALK-G2 및 ALK-G3 상의 중합효소의 Ni 향상된 결합의 센서그램이다. 도 18B는 주형 ALK-G4 상의 중합효소의 Ni 향상된 결합의 센서그램이다. 도 18C는 Ni 및 Mg를 함유하는 반응 완충액의 첨가 후 도입/해리 시간의 센서그램이다. 도 18D는 주형의 C 동종중합체를 채우는데 필요한 프라이머 가닥 내의 G 뉴클레오타이드의 수에 대해 플롯팅된 검사 단계 매개변수를 나타내는 그래프이다. 대조군은 단일 G 도입(G)이며, "**"는 p<0.01을 갖는 통계학적으로 유의한 결과를 나타낸다. 도 18E는 표시된 Bsu 중합효소 농도에 대해 플롯팅된 도입/해리 단계 동안 관찰된 초기 속도를 나타내는 그래프이다. 대조군은 단일 G 도입(G)이다.
도 19는 반응 진행(수평축)의 함수로서 중합효소 결합(수직축)의 크기를 나타내는 그래프 간섭계 흔적(trace)이다. 흔적은 중합효소 전달 시약(PDR)에서 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산의 상이한 농도를 사용하여 4개의 상이한 바이오센서 팁에 대한 결합을 나타낸다. PDR에서 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자가 농도가 증가함에 따라(즉, 0 nM, 10 nM, 100 nM, 및 1,000 nM 농도에 상응하는 흔적), 이성분 복합체 형성의 기간의 말기에 측정된 신호는 더 낮게 진행되었다.
도 20은 PDR에서 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산의 표시된 농도를 사용하여 달성된 이성분(binary) 및 삼성분(ternary) 복합체 신호의 크기의 차이를 플롯팅하는 막대 그래프이다. 100 nM의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 포함하는 PDR이 가장 극적인 신호 크기 차이를 나타내었다.
도 21은 검출 가능하게 표지된 중합효소를 사용하는 결합에 의한 시퀀싱 프로토콜을 예시하는 작업 흐름 다이어그램이다.
도 22는 사이클 번호(수평축)의 함수로서 형광 강도(수직축)를 나타내는 막대 그래프이며, 각각의 사이클은 표지된 중합효소 및 한 번에 하나의 뉴클레오타이드의 결합을 포함하였다.
도 2는 Bst2.0 효소 및 dNTP를 사용하여 정확한 염기를 결정하기 위한 Bst 효소 결합 동역학을 사용한 시퀀싱을 나타내는 그래프이다.
도 3은 FORTEBIO® 옥텟 기구(Menlo Park, CA)에서 생물층 간섭계를 사용하여 매치 및 미스매치 염기 구별 효과에 대한 염 농도의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 phiX_matchC 및 FP2 프라이머 및 클레나우 또는 Bst2.0 효소, 및 SrCl2를 사용하여 세척 단계 동안, 즉, 중합효소의 해리 동안의 염기 구별을 나타내는 그래프이다.
도 5는 다양한 농도의 SrCl2(0 mM-14 mM)를 사용하여 핵산, 중합효소 복합체의 안정화에 대한 세척의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 시퀀싱에 대한 DNA pol I의 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7A 및 7B는 HIV-1 역전사효소, NNRTI 화합물 7 및 표시된 dNTP를 사용한 인간 ALK 게이트키퍼 영역의 시퀀싱을 나타내는 그래프이다. 도 7A는 시퀀싱의 연속 사이클에 대한 시간 경과를 나타내는 그래프이다. 도 7B는 이전 사이클로부터 백그라운드를 차감한 후 개별 패널에서 사이클 1-12를 나타내는 그래프이다. 예상된 서열 판독은 CAGCAGGA(서열번호:1)이고, 관찰된 서열 판독은 CAGCAGG(서열번호:2)였다.
도 8은 HIV-1 역전사효소, NNRTI 화합물 18 및 다양한 dNTP를 사용한 인간 ALK 게이트키퍼 영역의 시퀀싱을 나타내는 그래프이다.
도 9는 SPRi 바이오센서를 사용한 phiX_matchA 주형의 시퀀싱을 나타내는 센서그램이다. 회색 부위는 정확한 염기 호출(base call)에 해당한다. 점선은 정확한 클레나우/dNTP 조합의 결합을 결정하는 데 사용된 강도 변화 역치(intensity change threshold)를 나타낸다.
도 10A, 10B, 및 10C는 바실러스 스테아로써모필러스로부터의 Bst DNA 중합효소를 사용한 닉(nick) 번역에 의한 dsDNA의 시퀀싱을 나타내는 그래프이다. 하나의 염기 갭을 갖는 이중 가닥의 DNA를 결합 완충액 중에 표시된 dNTP를 갖거나 갖지 않는 Bst DNA Pol로 처리하였다. 바이오센서를 dNTP 도입을 위한 반응 완충액으로 옮긴 다음, 120초(도 10A) 또는 60초(도 10B) 동안 비주형 가닥의 5'-3' 엑소핵산분해 절단을 위한 dNTP가 없는 Bst DNA Pol을 함유하는 반응 완충액으로 옮겼다. 대조군으로서, Bst DNA Pol을 프라이밍된 ssDNA 주형의 결합에 의한 시퀀싱, dNTP 도입, 이어서 5'-3' 엑소핵산분해 처리에 사용하였다(도 10C).
도 11A, 11B, 및 11C는 E. coli DNA 중합효소의 클레나우(3'→5' 엑소(-)) 단편을 사용한 가닥 치환에 의한 5'-플랩을 갖는 dsDNA의 시퀀싱을 나타내는 그래프이다. DNA 주형을 MgCl2가 없는 결합 완충액 중에 표시된 dNTP를 갖거나 갖지 않는 클레나우 엑소(-) DNA Pol로 처리하였다. 바이오센서를 촉매 작용을 위해 MgCl2를 갖는 세척 완충액으로 옮긴 다음, 효소 또는 dNTP가 없는 결합 완충액에서 재평형화하였다. 사이클을 표시된 바와 같이 각각의 개별 dNTP에 대해 반복하였다. 도 11A: 단일 가닥의 DNA. 도 11B: 하나의 염기 갭을 갖는 이중 가닥의 DNA. 도 11C: 하나의 염기 쌍 갭의 하류에 5'-올리고-dT 플랩을 갖는 이중 가닥의 DNA.
도 12A, 12B, 및 12C는 E. coli DNA 중합효소의 클레나우(3'→5' 엑소(-)) 단편에 의한 ssDNA의 시퀀싱이 염 성분에 의해 촉진된다는 것을 나타내는 그래프이다. 결합 완충액은 200 mM 글루타메이트(도 12A), 100 mM 글루타메이트(도 12B) 및 50 mM 글루타메이트(도 12C)를 함유한다. 반응 완충액은 글루타메이트가 없는 MgCl2를 함유한다. 각각의 사이클에 대해 적용된 dNTP("dNTP")가 도 12A, 12B, 및 12C 각각의 상부 텍스트 행(서열번호:14)에 나타나 있다. 클레나우(엑소(-))의 결합은 도 12A(서열번호:15), 12B(서열번호:17), 및 12C(서열번호:19)의 두 번째 행에서 관찰된 서열("관찰")을 나타낸다. 주형에 기초한 "예상" 서열은 도 12A(서열번호:16), 12B(서열번호:18), 및 12C(서열번호:20)의 세 번째 텍스트 행에 나타나 있다.
도 13A, 13B, 및 13C는 클레나우 엑소(-) DNA 중합효소에 의한 ALK 야생형의 백그라운드에서 인간 ALK C4493A 돌연변이체의 센스 가닥의 시퀀싱 그래프이다. 도 13A는 야생형 및 C4493A 돌연변이체의 ssDNA 혼합물에서의 시퀀싱을 나타내는 센서그램이다. 도 13B는 ssDNA 혼합물에서, 사이클 4(T)에 나타난 C4493A 돌연변이체의 선형 정량, 및 사이클 3(G)에 나타난 야생형 ALK의 선형 정량을 나타내는 그래프이다. 도 13C는 dsDNA-플랩 혼합물에서, C4493A 돌연변이체의 선형 정량이 사이클 4(T)에 나타나 있고 야생형 ALK의 대략적인 선형 양이 사이클 3(G)에 나타나 있음을 나타내는 그래프이다.
도 14A 및 14B는 인간 ALK C4493A 돌연변이체에 대한 클레나우 엑소(-) 및 dCTP의 2가 양이온 매개된 결합 및 촉매성 금속(MgCl2)을 갖거나 갖지 않는 해리의 그래프이다. 도 14A는 비촉매성 금속의 존재하에 프라이머/주형에의 결합 및 해리를 나타내는 그래프이다. 도 14B는 촉매성 금속의 존재하에 프라이머/주형에의 결합 및 해리를 나타내는 그래프이다.
도 15는 결합이 저농도의 CoCl2에 의해 매개되고 도입이 고농도의 CoCl2에 의해 매개되는, 인간 ALK C4493A 돌연변이체의 클레나우 엑소(-) 시퀀싱의 그래프이다.
도 16은 결합이 Ni(II)SO4에 의해 매개되고 도입이 MgCl2에 의해 영향을 받는, 인간 ALK C4493A 돌연변이체의 클레나우 엑소(-) 시퀀싱의 그래프이다. 기저선으로의 해리는 뉴클레오사이드 이인산 키나아제 및 ADP의 존재하에서만 관찰되며, 이는 유리 dNTP를 제거하여 dNTP가 클레나우 엑소(-) 및 프라이머/주형의 복합체 내로 재결합하는 것을 방지한다.
도 17A 및 17B는 인간 ALK C4493A 돌연변이체의 Bsu Pol I(큰 단편) 시퀀싱 동안 동종중합체(homopolymer) 분해능을 나타내는 그래프이다. 결합은 Ni(II)SO4, MgCl2에 의한 도입, 및 dNDP의 존재 또는 부재하에서의 해리에 의해 매개된다. 도 17A는 옥텟 QK 시스템을 사용한 시퀀싱의 센서그램이다. 도 17B는 2개의 연속적인 G 피크의 분해능이 반응 완충액 중의 dNDP의 농도에 의존한다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 18A, 18B, 18C, 18D 및 18E는 인간 야생형 ALK의 Bsu Pol I(큰 단편) 시퀀싱 동안 동종중합체 분해능을 나타내는 그래프이다. 도 18A는 주형 ALK-G1, ALK-G2 및 ALK-G3 상의 중합효소의 Ni 향상된 결합의 센서그램이다. 도 18B는 주형 ALK-G4 상의 중합효소의 Ni 향상된 결합의 센서그램이다. 도 18C는 Ni 및 Mg를 함유하는 반응 완충액의 첨가 후 도입/해리 시간의 센서그램이다. 도 18D는 주형의 C 동종중합체를 채우는데 필요한 프라이머 가닥 내의 G 뉴클레오타이드의 수에 대해 플롯팅된 검사 단계 매개변수를 나타내는 그래프이다. 대조군은 단일 G 도입(G)이며, "**"는 p<0.01을 갖는 통계학적으로 유의한 결과를 나타낸다. 도 18E는 표시된 Bsu 중합효소 농도에 대해 플롯팅된 도입/해리 단계 동안 관찰된 초기 속도를 나타내는 그래프이다. 대조군은 단일 G 도입(G)이다.
도 19는 반응 진행(수평축)의 함수로서 중합효소 결합(수직축)의 크기를 나타내는 그래프 간섭계 흔적(trace)이다. 흔적은 중합효소 전달 시약(PDR)에서 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산의 상이한 농도를 사용하여 4개의 상이한 바이오센서 팁에 대한 결합을 나타낸다. PDR에서 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자가 농도가 증가함에 따라(즉, 0 nM, 10 nM, 100 nM, 및 1,000 nM 농도에 상응하는 흔적), 이성분 복합체 형성의 기간의 말기에 측정된 신호는 더 낮게 진행되었다.
도 20은 PDR에서 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산의 표시된 농도를 사용하여 달성된 이성분(binary) 및 삼성분(ternary) 복합체 신호의 크기의 차이를 플롯팅하는 막대 그래프이다. 100 nM의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 포함하는 PDR이 가장 극적인 신호 크기 차이를 나타내었다.
도 21은 검출 가능하게 표지된 중합효소를 사용하는 결합에 의한 시퀀싱 프로토콜을 예시하는 작업 흐름 다이어그램이다.
도 22는 사이클 번호(수평축)의 함수로서 형광 강도(수직축)를 나타내는 막대 그래프이며, 각각의 사이클은 표지된 중합효소 및 한 번에 하나의 뉴클레오타이드의 결합을 포함하였다.
프라이밍된 주형 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 데 사용될 수 있는 기술이 본원에 개시되며, 서열에서 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 확인은 뉴클레오타이드 도입에 완전히 비의존적이다. 보다 특히, 개시된 결합에 의한 시퀀싱 접근법은 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 확인하기 위해 삼성분 복합체의 형성 및 검출에 의존한다. 이것은 서열 정보를 결정하기 위해 도입된 뉴클레오타이드를 확인하는 것에 의존하는 합성에 의한 시퀀싱 절차와 구별된다.
결합에 의한 시퀀싱 절차는 다음의 주형 염기를 확인하는 "검사" 단계, 및 프라이머의 3'-말단에 하나 이상의 상보적 뉴클레오타이드를 부가하는 선택적인 "도입" 단계를 포함한다. 도입 단계는 검사 단계와 동시이거나 분리될 수 있다. 검사 단계는 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소 및 시퀀싱될 핵산(주형 핵산) 사이의 상호작용을 모니터링하는 것을 포함한다. 선택적으로, 상호작용은 안정화제의 존재하에서일 수 있으며, 이로써 중합효소-핵산 상호작용은 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 안정화된다. 대안적으로, 차단된 3' 말단 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머는 삼성분 복합체를 안정화시키고 도입 반응이 진행되는 것을 방지하는 데 사용될 수 있다. 프라이밍된 주형 핵산 및 중합효소 사이의 이성분 복합체는 유리하게도 높은 1가 양이온 농도, 글루타메이트 이온의 농도, 및 이의 조합의 조건을 제공하는 것과 같은 많은 상이한 접근법에 의해 불안정화될 수 있다.
유리하게도, 기술은 표지되지 않은(예컨대, 천연) 뉴클레오타이드, 검출 가능한 표지(예컨대, 형광 또는 다른 광학적으로 검출 가능한 표지)를 갖는 뉴클레오타이드, 또는 표지되거나 표지되지 않은 뉴클레오타이드 유사체(예컨대, 가역적 터미네이터 모이어티를 함유하는 변형된 뉴클레오타이드)를 포함하는, 다양한 유형의 뉴클레오타이드를 사용하여 실시될 수 있다. 또한, 기술은 제어된 반응 조건, 서열의 분명한 결정, 시약의 낮은 전체 비용, 및 낮은 기구 비용을 제공한다.
개시된 기술은 임의의 수단에 의해 그리고 임의의 이유로 프라이밍된 주형 핵산의 다음의 염기의 실체를 결정하는 데 사용되는 결합 반응에 적용될 수 있다. 기술은 DNA 중합효소 및 프라이밍된 주형 핵산에 상보적인 다음의 정확한 뉴클레오타이드(예컨대, dNTP)의 특이적 결합을 모니터링하고, 특이적 결합과 비특이적 결합을 구별하는 데 사용될 수 있다. 기술은 단일 뉴클레오타이드 결정(예컨대, SNP 결정)에 적용될 수 있거나, 또는 대안적으로 한 번에 하나의 뉴클레오타이드를 확인하는 반복 사이클을 사용하는 보다 광범위한 핵산 시퀀싱 절차에 적용될 수 있다.
본원에 제공된 조성물, 시스템, 및 방법은 현재의 합성에 의한 시퀀싱 방법과 관련된 하나 이상의 문제를 극복하거나 감소시킨다. 제공된 방법은 임의의 외인성의 검출 가능한 표지가 결여된 천연 뉴클레오타이드를 사용하여 수행될 수도 있다. 선택적으로, 방법은 임의의 검출 가능한 표지(예컨대, 뉴클레오타이드, 중합효소 또는 시퀀싱되는 주형 상에)의 부재하에 수행된다. 물론, 표지된 뉴클레오타이드 및/또는 표지된 중합효소가 또한 개시된 절차에 사용될 수 있다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해된 것과 동일한 의미를 갖는다. 명확성을 위해, 하기 특정 용어는 지정된 의미를 갖는다. 다른 용어는 본원의 다른 섹션에 정의되어 있다.
단수 형태 "a" "an" 및 "the"는 문장이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수형을 포함한다. 명세서 및 청구항에서 사용된 바와 같은 근사 표현은 관련된 기본 기능을 변화시키지 않으면서 허용가능하게 달라질 수 있는 임의의 양적 표현을 수식하는데 적용될 수 있다. 따라서, "약"과 같은 용어에 의해 수식된 값은 명시된 정확한 값으로 제한되지 않는다. 달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 사용된 성분의 양, 분자량과 같은 특성, 반응 조건 등을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 명확히 나타내지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치적 매개변수는 본 발명에 의해 수득하고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 적어도 각각의 수치적 매개변수는 적어도 보고된 유효 자릿수의 수에 비추어 그리고 일반적인 반올림 기법을 적용하여 해석되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 항목의 집합과 관련하여 사용될 때 용어 "각각"은 집합 내의 개별 항목을 식별하기 위한 것이지, 반드시 집합 내의 모든 항목을 지칭하는 것은 아니다. 만약 명시적인 개시 또는 문맥이 달리 명확하게 나타내면, 예외가 발생할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "결합에 의한 시퀀싱(sequencing-by-binding)"은 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합효소 및 동족 뉴클레오타이드의 특이적 결합이 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 가닥 내로 도입될 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 확인하는 데 사용되는 시퀀싱 기술을 지칭한다. 특이적 결합 상호작용은 프라이머 내로 뉴클레오타이드의 화학적 도입을 초래할 필요는 없다. 일부 구현예에서, 특이적 결합 상호작용은 프라이머 가닥 내로 뉴클레오타이드의 화학적 도입보다 선행하거나, 프라이머 내로 유사한 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 화학적 도입보다 선행한다. 따라서, 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 확인은 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 도입 없이 발생할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "안정화시키다" 및 그의 문법적 변형은 꾸준함을 유지하거나 변동을 제한하는 것을 의미한다. 삼성분 복합체를 "안정화시키는" 것은 삼성분 복합체의 존재를 촉진하는 과정 및 뉴클레오타이드의 도입을 방지하는 과정을 지칭한다. 용어는, 비제한적으로 이성분 복합체 또는 삼성분 복합체를 포함하는 다양한 복합체 중 어느 것에 적용될 수 있다. 예를 들어, 안정화된 복합체는 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산 분자 및 동족 뉴클레오타이드 사이의 삼성분 복합체일 수 있다. 일반적으로, 삼성분 복합체의 안정화는 삼성분 복합체의 프라이밍된 핵산 성분 내로 삼성분 복합체의 뉴클레오타이드 성분의 도입을 방지한다. 따라서, 삼성분 복합체를 안정화시키는 것은 삼성분 복합체의 성분에 결합하는 비공유 상호작용을 촉진하거나 연장하는 것, 또는 삼성분 복합체의 성분에 결합하는 비공유 상호작용의 파괴를 억제하는 것을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "불안정화시키다" 및 그의 문법적 변형은 어떤 것이 그의 보통 방식으로 계속 존재하거나 작동할 수 없게 하는 것을 의미한다. 이성분 복합체의 "불안정화"는 이성분 복합체의 용해 또는 분해를 촉진하는 과정을 지칭한다. "불안정화"는 또한 이성분 복합체의 형성을 억제하거나 방지하는 과정을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "1가 양이온을 제공하는 염"은 수용액에서 해리되어 단일 양전하를 갖는 양이온을 생성하는 이온성 화합물이다. 예를 들어, 양이온은 산화 상태가 +1인 금속 양이온일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "글루타메이트 염"은 수용액에서 해리되어 글루타메이트 음이온을 생성하는 이온성 화합물이다.
본원에 사용된 바와 같이, 이성분 복합체 형성보다 삼성분 복합체 형성을 "향상시키는" 반응 조건을 제공하는 것은 1을 초과하는 삼성분 복합체 대 이성분 복합체 신호의 비율을 생성하는 조건을 제공하는 것을 의미한다. 2배의 향상은 삼성분 복합체 형성과 관련된 신호가 이성분 복합체 형성과 관련된 신호의 2배임을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 함께 공유 결합된 적어도 2개의 뉴클레오타이드, 또는 이의 유사체를 의미한다. 따라서, "핵산"은 핵산 합성 동안 중합 효소에 의해 작용할 수 있는 DNA, RNA, 또는 이의 임의의 조합을 포괄한다. 용어는 단일, 이중, 또는 다중 가닥의 DNA, RNA 및 이의 유사체를 포함한다. 이중 가닥의 핵산은 유리하게도 핵산 합성을 방해할 수 있는 2차 구조를 최소화할 수 있다. 이중 가닥의 핵산은 닉 또는 단일 가닥의 갭을 가질 수 있다. 핵산은 핵산 분자의 단일, 복수, 또는 클론적으로 증폭된 집단을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "주형 핵산"은 임의의 개시된 방법을 사용하여 검출, 시퀀싱, 평가 또는 분석될 핵산이다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이밍된 주형 핵산"은 프라이머로 프라이밍된(즉, 이에 혼성화된) 주형 핵산이며, 프라이머는 주형 핵산의 적어도 일부에 상보적인 서열을 갖는 3'-말단을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 프라이머는 선택적으로 자유 5'-말단을 가질 수 있거나(예컨대, 프라이머가 주형과 비공유적으로 결합됨) 또는 프라이머는 주형과 연속적일 수 있다(예컨대, 헤어핀 구조를 통해). 프라이밍된 주형 핵산은 주형 핵산에 결합된 상보적 프라이머를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "다음의 주형 뉴클레오타이드"(또는 "다음의 주형 염기")는 혼성화된 프라이머의 3'-말단의 바로 하류에 위치하는 주형 핵산 내의 다음의 뉴클레오타이드(또는 염기)를 지칭한다. 즉, 다음의 주형 뉴클레오타이드(또는 염기)는 프라이머의 3' 말단에 혼성화된 주형 가닥 내의 염기의 바로 5'에 있는 주형 가닥에 위치한다.
본원에 사용된 바와 같이, "다음의 정확한 뉴클레오타이드"(때때로 "동족" 뉴클레오타이드로도 지칭됨)는 혼성화된 프라이머의 3'-말단의 바로 하류에 위치한 다음의 주형 염기에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오타이드이다. 다음의 주형 염기에 상보적이지 않은 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 "부정확한"(또는 "비동족") 뉴클레오타이드로 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같이, "차단된 프라이밍된 주형 핵산"은 프라이머의 3'-말단에서의 포스포디에스테르 결합 형성을 배제하거나 방지하기 위해 변형된 프라이밍된 주형 핵산이다. 차단은, 예를 들어, 프라이머의 3' 말단에서 오탄당의 3' 또는 2' 위치에 있는 차단 기를 이용한 화학적 변형에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 포스포디에스테르 결합 형성을 배제하거나 방지하는 화학적 변형은 또한 뉴클레오타이드의 질소성 염기에 대해 이뤄질 수 있다. 이러한 유형의 차단 기 각각을 포함하는 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드 유사체는 당업계에서 통상의 수준의 기술을 가진 자에게 익숙할 것이다. 프라이머의 3' 말단에서 이들 유사체의 도입은 차단된 프라이밍된 주형 핵산을 초래한다.
본원에 사용된 바와 같이, "뉴클레오타이드"는 질소성 염기, 오탄당(리보스 또는 데옥시리보스), 및 적어도 하나의 포스페이트 기를 포함하는 분자이다. 용어는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 외인성 표지 또는 가역적 터미네이터를 포함하도록 변형된 뉴클레오타이드, 및 뉴클레오타이드 유사체를 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같이, "시험 뉴클레오타이드"는 프라이밍된 주형 핵산 및 중합효소를 추가로 포함하는 삼성분 복합체의 형성에 참여하는 능력이 조사되는 뉴클레오타이드이다.
본원에 사용된 바와 같이, "천연" 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 유사체를 특성화할 수 있는 것과 같은 외인성 표지(예컨대, 형광 염료, 또는 다른 표지)나 화학적 변형을 포함하지 않는 자연발생 뉴클레오타이드를 지칭한다. 본원에 기재된 결합에 의한 시퀀싱 절차를 수행하는데 유용한 천연 뉴클레오타이드의 예는 dATP(2'-데옥시아데노신-5'-트리포스페이트); dGTP(2'-데옥시구아노신-5'-트리포스페이트); dCTP(2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트); dTTP(2'-데옥시티미딘-5'-트리포스페이트); 및 dUTP(2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "뉴클레오타이드 유사체"는 천연 뉴클레오타이드의 임의의 성분(예컨대, 질소성 염기, 오탄당, 또는 포스페이트 기(들))을 대체하고/하거나 변형하는 화학적 모이어티와 같은 변형을 갖는다. 뉴클레오타이드 유사체는 핵산 중합 반응에서 중합효소에 의해 도입될 수 있거나 비도입될 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체의 3'-OH 기는 모이어티로 변형된다. 모이어티는 3' 가역적 또는 비가역적 터미네이터일 수 있다. 뉴클레오타이드의 염기는 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티민, 또는 우라실, 또는 이의 유사체 중 어느 것일 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드는 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 이소사이토신, 이소구아닌, 니트로피롤(3-니트로피롤 포함) 또는 니트로인돌(5-니트로인돌 포함) 염기를 갖는다. 뉴클레오타이드는, 비제한적으로, ATP, UTP, CTP, GTP, ADP, UDP, CDP, GDP, AMP, UMP, CMP, GMP, dATP, dTTP, dUTP, dCTP, dGTP, dADP, dTDP, dCDP, dGDP, dAMP, dTMP, dCMP, 및 dGMP를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 또한 DNA 중합효소의 종결 억제제, ddNTP(ddGTP, ddATP, ddTTP, ddUTP 및 ddCTP)로 약칭되는 디데옥시뉴클레오타이드 또는 2',3' 디데옥시뉴클레오타이드를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 뉴클레오타이드 유사체와 관련하여 사용될 때 "차단 모이어티"는 뉴클레오타이드의 3' 산소가 핵산 중합 반응의 도입 단계 동안 제2 뉴클레오타이드에 공유 결합을 형성하는 것(예컨대, 프라이머의 3' 말단에 존재할 때 뉴클레오타이드 유사체의 3'- 산소를 통해)을 억제하거나 방지하는 뉴클레오타이드의 부분이다. "가역적 터미네이터" 뉴클레오타이드의 차단 모이어티는 뉴클레오타이드 유사체로부터 제거되어 뉴클레오타이드 도입을 허용할 수 있다. 이러한 차단 모이어티는 본원에서 "가역적 터미네이터 모이어티"로 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같이, "중합효소"는 비제한적으로, DNA 중합효소, RNA 중합효소, 역전사효소, 프리마아제 및 전이효소를 포함하는, 핵산 합성 효소를 지칭할 수 있다. 전형적으로, 중합효소는 뉴클레오타이드 결합 및/또는 뉴클레오타이드 중합의 촉매 작용이 발생할 수 있는 하나 이상의 활성 부위를 포함한다. 중합효소는 그의 상보적 핵산 가닥에 결합된 프라이머의 3'-말단에 대한 뉴클레오타이드의 중합을 촉매할 수 있다. 예를 들어, 중합효소는 포스포디에스테르 결합을 통해 프라이머의 3'-OH 기에 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 부가하는 것을 촉진함으로써, 프라이머 내로 뉴클레오타이드를 화학적으로 도입한다. 선택적으로 중합효소는, 예를 들어, 돌연변이 또는 화학적 변형과 같은 변형으로 인해, 촉매성 뉴클레오타이드 중합 기능이 결여된다. 선택적으로, 제공된 방법에 사용된 중합효소는 진행성(processive) 중합효소이다. 선택적으로, 제공된 방법에 사용된 중합효소는 분배성(distributive) 중합효소이다.
본원에 사용된 바와 같이, 주형, 프라이머, 프라이밍된 주형 핵산, 또는 차단된 프라이밍된 주형 핵산을 "제공하는 것"은 하나 또는 많은 핵산 중합체를 제조하거나, 예를 들어 반응 혼합물 또는 반응 챔버에 전달하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "모니터링"(또는 때때로 "측정")은 2개의 분자 종 사이의 측정가능한 상호작용 또는 결합을 검출하는 과정을 지칭한다. 예를 들어, 모니터링은, 전형적으로 절차 동안 다양한 시점에, 중합효소 및 프라이밍된 주형 핵산 사이의 측정가능한 상호작용을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 모니터링은 간헐적(예컨대, 주기적) 또는 연속적(예컨대, 중단 없이)일 수 있고, 정량적 결과의 획득을 포함할 수 있다. 모니터링은 결합 사건 중 일정 시간 동안 다수의 신호를 검출함으로써, 또는 대안적으로, 결합 사건 동안 또는 이후에 단일 시점에 신호(들)를 검출함으로써 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "접촉"은 물리적 결합 반응 또는 화학적 반응이 발생할 수 있도록 시약을 함께 혼합하는 것(예컨대, 고정화된 주형 핵산 및 중합효소, 또는 중합효소 및 시험 뉴클레오타이드의 조합을 포함하는 완충 용액을 혼합하는 것)을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 프라이머 및 동족 뉴클레오타이드와 관련하여 사용될 때 "도입" 또는 "화학적 도입"은 포스포디에스테르 결합의 형성에 의해 동족 뉴클레오타이드를 프라이머에 연결하는 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "이성분 복합체"는 중합효소 및 프라이밍된 주형 핵산 사이의 복합체이며, 복합체는 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "삼성분 복합체"는 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산(예컨대, 자유 3'-OH 또는 차단된 3' 위치를 갖는 프라이머를 가짐), 및 프라이머의 바로 하류에 위치하고 프라이밍된 주형 핵산의 주형 가닥에 상보적인 다음의 정확한 뉴클레오타이드 사이의 복합체이다. 프라이밍된 주형 핵산은, 예를 들어, 자유 3'-OH를 갖는 프라이머 또는 차단된 프라이머(예컨대, 3' 말단 뉴클레오타이드의 염기 또는 당 모이어티 상에 화학적 변형을 갖는 프라이머로서, 변형은 효소적 포스포디에스테르 결합 형성을 배제하는 프라이머)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "촉매성 금속 이온"은 핵산(예컨대, 프라이머)의 3'-OH 및 유입되는 뉴클레오타이드의 인산 사이의 포스포디에스테르 결합 형성에 필요한 금속 이온을 지칭한다. "2가 촉매성 금속 양이온"은 2의 원자가를 갖는 촉매성 금속 이온이다. 촉매성 금속 이온은 금속 이온의 비촉매성 농도로 지칭되는, 중합효소, 뉴클레오타이드, 및 프라이밍된 주형 핵산 사이의 복합체의 형성을 안정화시키는데 필요한 농도로 제공될 수 있다. 금속 이온의 촉매성 농도는 핵산(예컨대, 프라이머)의 3'-OH 기 및 도입되는 뉴클레오타이드의 포스페이트 기 사이의 반응을 촉매하는 중합효소에 의해 필요한 금속 이온의 양을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "비촉매성 금속 이온"은 중합효소의 존재하에 있을 때, 프라이머 내로 뉴클레오타이드의 화학적 도입에 필요한 포스포디에스테르 결합 형성을 촉진하지 않는 금속 이온을 지칭한다. 전형적으로, 비촉매성 금속 이온은 양이온이다. 비촉매성 금속 이온은 중합효소에 의한 포스포디에스테르 결합 형성을 억제할 수 있으므로, 뉴클레오타이드 도입을 방지함으로써 삼성분 복합체를 안정화시킬 수 있다. 비촉매성 금속 이온은, 예를 들어, 촉매성 금속 이온과 비교하여 경쟁적 결합을 통해 중합효소와 상호작용할 수 있다. "2가 비촉매성 금속 이온"은 2의 원자가를 갖는 비촉매성 금속 이온이다. 2가 비촉매성 금속 이온의 예는, 비제한적으로, Ca2+, Zn2+, Co2+, Ni2+, 및 Sr2+를 포함한다. 3가 Eu3+ 이온은 3의 원자가를 갖는 비촉매성 금속 이온이다.
본원에 사용된 바와 같이 "외인성 표지"는 뉴클레오타이드 또는 중합효소(예컨대, DNA 중합효소)와 같은 시퀀싱 시약에 첨가된 검출 가능한 화학적 모이어티를 지칭한다. 천연 dNTP는 특징적인 제한된 형광 프로파일을 가질 수 있음에도 불구하고, 천연 dNTP는 임의의 부가된 비색 또는 형광 모이어티를 포함하지 않는다. 반대로, 화학적 링커 및 감마 인산에 부착된 형광 모이어티를 포함하도록 변형된 dATP(2'-데옥시아데노신-5'-트리포스페이트) 분자는 외인성 표지를 포함한다고 할 것인데, 부착된 화학적 성분은 일반적으로 뉴클레오타이드의 일부가 아니기 때문이다. 물론, 뉴클레오타이드 염기에 검출 가능한 표지를 부가하는 화학적 변형 또한 외인성 표지로 고려될 것이다. 마찬가지로, 형광 염료를 포함하도록 변형된 DNA 중합효소(예컨대, 효소의 일차 서열의 일부인 cys 잔기에의 부착에 의해) 또한 외인성 표지를 포함한다고 할 것인데, 표지는 일반적으로 중합효소의 일부가 아니기 때문이다.
본원에 사용된 바와 같이, "중합효소-뉴클레오타이드 조합"은 두 성분이 조합에 필요한 경우, 함께 사용되는(예컨대, 함께 혼합되고, 혼합물 또는 조합으로서 전달됨) 중합효소 및 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 중합효소 복합체에 관해 사용될 때 "구별 조건"은 이성분 복합체(중합효소 및 동족 뉴클레오타이드가 없는 프라이밍된 주형 핵산 분자 사이의 복합체)의 형성과 삼성분 복합체(중합효소, 프라이밍된 주형 핵산 분자 및 동족 뉴클레오타이드 사이의 복합체)의 형성을 구별하는 반응 조건이다. 구별 조건은 염(예컨대, 1가 양이온, 또는 글루타메이트 음이온을 제공하는 염)의 사용, 비동족 뉴클레오타이드의 존재하에 낮은 백그라운드 결합을 나타내도록 조작된 중합효소의 사용, 온도 조절, 및/또는 pH 조절 등을 포함하는, 많은 경로에 의해 제공될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "순차적으로" 또는 "순차적 방식"으로 발생하는 것은 연속적으로 교대로 발생하는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 두 단계는 개재 단계 또는 작용을 허용하여 연속으로 발생할 수 있다(즉, 반드시 중단이 없는 것은 아님). 따라서, 핵산 분자를 2개의 상이한 중합효소-뉴클레오타이드 조합과 "순차적으로" 또는 "순차적 방식으로" 접촉시키는 것은 제1 조합과 접촉시킨 다음, 제2 조합과 접촉시키는 것을 의미한다. 선택적으로, 프라이밍된 주형 핵산과 순차적으로 접촉하는 중합효소-뉴클레오타이드 조합은 서로 섞이지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "플로우 셀"은 원하는 반응을 수행하기 위해 미리 결정된 방식으로 유체를 안내하는 하나 이상의 채널을 포함하는 반응 챔버이다. 플로우 셀은 반응 챔버에서 발생하는 반응이 관찰될 수 있도록 검출기에 결합될 수 있다. 예를 들어, 플로우 셀은, 예를 들어, 고체 지지체에 포박된(tethered) 프라이밍된 주형 핵산 분자(또는 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자)를 함유할 수 있으며, 여기에 뉴클레오타이드 및 보조 시약이 반복적으로 적용되고 씻겨 내려간다. 플로우 셀은 원하는 반응이 발생한 후에 샘플을 이미지화할 수 있는 투명한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 플로우 셀은 중합효소, dNTP 및 완충액이 펌핑될 수 있는 작은 유체 채널을 함유하는 유리 슬라이드를 포함할 수 있다. 채널 내부의 유리는 시퀀싱될 하나 이상의 프라이밍된 주형 핵산 분자로 장식된다. 외부 이미징 시스템은 유리의 표면 상의 분자를 검출하도록 배치된다. 플로우 셀에서의 시약 교환은 플로우 셀을 통해 상이한 액체 시약을 펌핑하거나, 뽑아내거나, 또는 "유동"시킴으로써 달성된다. 예시적인 플로우 셀, 이들의 제조 방법 및 이들의 사용 방법은 각각 본원에 참조로 포함된 미국 특허출원 공개 제2010/0111768호 A1 또는 제2012-0270305호 A1; 또는 제WO 05/065814호에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "표지되지 않은"은 부가되거나 외인성인 표지(들) 또는 태그(들)가 없는 분자 종을 지칭한다. 천연 뉴클레오타이드는 표지되지 않은 분자 종의 예이다.
결합에 의한 시퀀싱
중합효소 기반의 핵산 결합에 의한 시퀀싱 반응이 본원에 기재되어 있으며, 중합효소는 반응의 별개의 단계 동안 개방 및 폐쇄된 형태 간에 형태 전이(conformational transition)를 겪는다. 일 단계에서, 중합효소가 프라이밍된 주형 핵산에 결합하여 본원에서 사전-삽입(pre-insertion) 형태로도 지칭되는 이성분 복합체를 형성한다. 후속 단계에서, 유입되는 뉴클레오타이드가 결합하고 중합효소 핑거가 닫혀, 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산 및 뉴클레오타이드를 포함하는 사전-화학(pre-chemistry) 형태를 형성하며; 결합된 뉴클레오타이드는 도입되지 않았다. 본원에서 검사 단계로도 지칭되는 이 단계 후에, 뉴클레오타이드로부터 수반되는 피로포스페이트 절단으로 포스포디에스테르 결합이 형성되는 화학적 도입 단계(뉴클레오타이드 도입)가 이어질 수 있다. 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산 및 새롭게 도입된 뉴클레오타이드는 사후-화학(post-chemistry), 사전-번역(pre-translation) 형태를 생성한다. 사전-화학 형태 및 사전-번역 형태 모두는 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산 및 뉴클레오타이드를 포함하며 중합효소가 폐쇄된 상태에 있기 때문에, 어느 하나의 형태는 본원에서 삼성분 복합체로 지칭될 수 있다. 그러나, 주목할만하게도, 포스포디에스테르 결합 형성은 본원에 기재된 접근법에 의해 배제될 수 있으므로, 언급된 삼성분 복합체는 반드시 사전-화학 형태이다. 폐쇄된 사전-삽입 상태에서, Mg2+와 같은 2가 촉매성 금속 이온은 프라이머 말단의 3'-하이드록실에 의한 피로포스페이트(PPi)의 친핵성 치환을 포함하는 신속한 화학적 단계를 매개한다. 중합효소는 PPi의 방출, 사후-전좌(post-translocation) 단계, 및 전좌가 반응의 다음 라운드를 개시할 때 개방 상태로 되돌아간다. 삼성분 복합체는 2가 촉매성 금속 이온(예컨대, Mg2+)의 부재하에 형성될 수 있지만, 그것은 2가 금속 이온의 존재하에 뉴클레오타이드의 화학적 부가에 능숙하다. Mg2+와 같은 촉매성 금속 이온의 낮은 또는 불충분한 수준은 단단한 삼성분 복합체에서 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 비공유(물리적) 격리를 야기하는 경향이 있다. 이 삼성분 복합체는 안정화된 또는 트랩된 삼성분 복합체로도 지칭될 수 있다. 상기 기재된 임의의 반응 단계에서, 중합효소 배열 및/또는 핵산과의 상호작용은 핵산 서열에서 다음의 정확한 염기를 확인하기 위해 검사 단계 동안 모니터링될 수 있다. 도입 전 또는 후에, 반응 조건은 프라이밍된 주형 핵산으로부터 중합효소를 분리시키도록 변화될 수 있고, 중합효소 결합을 억제하는 임의의 시약을 국소 환경으로부터 제거하도록 다시 변화될 수 있다.
일반적으로, SBB 절차는 다음의 주형 염기를 확인하는 "검사" 단계, 및 선택적으로 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 성분의 3'-말단에 하나 이상의 상보적 뉴클레오타이드를 부가하는 "도입" 단계를 포함한다. 부가될 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 실체는 공유 결합을 통해 프라이머의 3'-말단에 상기 뉴클레오타이드의 화학적 연결 없이 또는 화학적 연결 전에 결정된다. 검사 단계는 절차에 사용될 프라이밍된 주형 핵산을 제공하는 단계, 및 프라이밍된 주형 핵산을 중합효소(예컨대, DNA 중합효소) 및 가능한 다음의 정확한 뉴클레오타이드로서 조사되는 하나 이상의 시험 뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 시험 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소 및 프라이밍된 주형 핵산 사이의 상호작용을 모니터링하거나 측정하는 것을 포함하는 단계가 있다. 선택적으로, 상호작용은 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머가 프라이머 내로 유입되는 뉴클레오타이드의 효소적 도입을 배제하는 차단 기를 포함할 때 발생할 수 있다. 선택적으로, 상호작용은 안정화제의 존재하에 발생할 수 있고, 이로써 중합효소-핵산 상호작용은 다음의 정확한 뉴클레오타이드(즉, 삼성분 복합체를 안정화시키는 안정화제)의 존재하에 안정화된다. 다시, 검사 단계는 상기 뉴클레오타이드의 도입을 필요로 하지 않으면서 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 실체를 확인하거나 결정한다. 달리 말하면, 검사의 하나 이상의 사이클이 표지되거나 표지되지 않은 뉴클레오타이드를 사용하여 수행될 때 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 실체는 프라이머 내로 뉴클레오타이드의 화학적 도입 없이 확립될 수 있다. 마찬가지로, 절차에 사용된 중합효소는 표지되거나 표지되지 않을 수 있다.
단일 주형 핵산 분자를 포함하는 방법이 편의상 기재될 수 있지만, 이들 방법은 예시적이다. 본원에 제공된 시퀀싱 방법은 복수의 주형 핵산을 용이하게 포함하며, 복수의 핵산은 단일 핵산의 클론적으로 증폭된 복제물일 수 있거나, 또는 클론적으로 증폭된 이질적인 핵산의 집단과 같은 조합을 포함하는 이질적인 핵산일 수 있다.
검사 단계
검사 단계는 전형적으로 하기 하위단계를 포함한다: (1) 프라이밍된 주형 핵산(즉, 선택적으로 그의 3'-말단에서의 연장으로부터 차단될 수 있는 프라이머와 혼성화된 주형 핵산 분자)을 제공하는 단계; (2) 프라이밍된 주형 핵산을 중합효소 및 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물과 접촉시키는 단계; (3) 뉴클레오타이드(들)의 존재하에 그리고 프라이밍된 주형 핵산 내로 임의의 뉴클레오타이드의 화학적 도입 없이 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자의 상호작용을 모니터링하는 단계; 및 (4) 모니터링된 상호작용으로부터 주형 핵산에서 다음의 염기(즉, 다음의 정확한 뉴클레오타이드)의 실체를 결정하는 단계. 선택적으로, 프라이밍된 주형 핵산 분자는 임의의 뉴클레오타이드에 접촉하기 전에 뉴클레오타이드(들)의 부재하에 중합효소와 초기에 접촉될 수 있다. 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머는 연장 가능한 프라이머일 수 있다. 프라이밍된 주형 핵산, 중합효소 및 시험 뉴클레오타이드는 시험 뉴클레오타이드의 염기가 프라이밍된 주형 핵산 분자의 다음의 염기에 상보적일 때 삼성분 복합체를 형성할 수 있다. 프라이밍된 주형 핵산 및 중합효소는 시험 뉴클레오타이드의 염기가 프라이밍된 주형 핵산 분자의 다음의 염기에 상보적이지 않을 때 이성분 복합체를 형성할 수 있다. 선택적으로, 접촉은 이성분 복합체의 형성보다 삼성분 복합체의 형성에 유리한 조건하에서 발생한다. 선택적으로, 삼성분 복합체를 선호하거나 안정화시키는 조건은 (1) 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머의 3' 뉴클레오타이드 상의 가역적 터미네이터 모이어티의 존재; 또는 (2) 비촉매성 이온(예컨대, 2가 비촉매성 금속 이온)의 존재에 의해 제공된다. 선택적으로, 이성분 복합체를 선호하지 않거나 불안정화시키는 조건은 검사 단계 동안 반응 혼합물 내에 하나 이상의 1가 양이온 및/또는 글루타메이트 음이온의 존재에 의해 제공된다. 결정 또는 확인 단계는 프라이밍된 주형 핵산의 다음 염기에 상보적인 뉴클레오타이드의 염기를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 선택적으로, 이것은 삼성분 복합체를 삼성분 복합체를 선택적으로 유지시키거나 해리시키는 상이한 뉴클레오타이드 조성물을 갖는 하나 이상의 세척 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다.
검사 단계는 뉴클레오타이드 도입이 약화되거나 달성되도록 제어될 수 있다. 뉴클레오타이드 도입이 약화되면, 별도의 도입 단계가 수행될 수 있다. 검사 단계 동안 염기가 이미 확인되었기 때문에, 별도의 도입 단계는 모니터링할 필요 없이 달성될 수 있다. 검사 동안 뉴클레오타이드 도입이 진행되면, 이후의 뉴클레오타이드 도입은 도입 후에 핵산 상의 중합효소를 트랩(trap)하는 안정화제에 의해 약화될 수 있다. 단일 사이클 동안 하나를 초과하는 뉴클레오타이드의 부가를 방지하기 위해 가역적으로 종결된 뉴클레오타이드가 도입 단계에서 사용될 수 있다.
결합에 의한 시퀀싱 방법은 표지된 뉴클레오타이드의 필요 없이 주형 핵산 염기의 제어된 결정을 허용하는데, 중합효소 및 주형 핵산 사이의 상호작용이 뉴클레오타이드 상의 표지 없이 모니터링될 수 있기 때문이다. 제어된 뉴클레오타이드 도입은 또한 표지된 뉴클레오타이드의 사용을 필요로 하지 않으면서 반복적인 동종중합체성 영역의 정확한 서열 정보를 제공할 수 있다. 또한, 주형 핵산 분자는 주형 핵산 또는 중합효소를 고상 지지체에 부착할 필요가 없는 검사 조건하에 시퀀싱될 수 있다. 그러나, 특정 바람직한 구현예에서, 시퀀싱될 프라이밍된 주형 핵산은 플로우 셀의 내부 표면과 같은 고체 지지체에 부착된다. 본원에 기재된 조성물, 방법 및 시스템은 제어된 반응 조건, 서열의 분명한 결정, 긴 리드 길이, 시약의 낮은 전체 비용, 및 낮은 기구 비용과 같이 이전 시스템보다 많은 장점을 제공한다.
또한 프라이머로 프라이밍된 주형 핵산 분자(즉, 프라이밍된 주형 핵산 분자)를 제공하는 단계; 프라이밍된 주형 핵산 분자를 중합효소 및 제1 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 제1 반응 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 검사 단계를 포함하는, 주형 핵산 분자를 시퀀싱하는 방법이 본원에 제공되며, 프라이밍된 주형 핵산 분자, 중합효소 및 제1 뉴클레오타이드 분자는 제1 뉴클레오타이드 분자가 프라이밍된 주형 핵산 분자의 다음의 염기에 상보적일 때 삼성분 복합체를 형성할 수 있고, 프라이밍된 주형 핵산 분자 및 중합효소는 제1 뉴클레오타이드 분자가 프라이밍된 주형 핵산 분자의 다음의 염기에 상보적이지 않을 때 이성분 복합체를 형성할 수 있다. 방법은 제1 뉴클레오타이드 분자의 존재하에, 그리고 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로 제1 뉴클레오타이드 분자의 화학적 도입 없이, 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자의 상호작용을 모니터링하는 단계; 및 모니터링된 상호작용에 의해 프라이밍된 주형 핵산 분자의 다음의 염기에 상보적인 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 선택적으로, 접촉은 삼성분 복합체의 형성을 안정화시키고 이성분 복합체의 형성을 불안정화시키는 조건하에 발생한다. 선택적으로, 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건은 (1) 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머의 3' 뉴클레오타이드 상에 가역적 터미네이터 모이어티의 존재; 또는 (2) 비촉매성 이온(예컨대, 2가 비촉매성 금속 이온)의 존재에 의해 제공된다. 선택적으로, 이성분 복합체를 불안정화시키는 조건은 검사 단계 동안 반응 혼합물에 하나 이상의 1가 양이온 및/또는 글루타메이트 음이온의 존재에 의해 제공된다. 이러한 단계는 1회 이상 반복될 수 있다. 예를 들어, 접촉 및 모니터링 단계는 1회 이상 반복될 수 있다. 선택적으로, 접촉 및 모니터링 단계는 제1 반응 혼합물을 사용하여 반복된다. 선택적으로, 접촉 및 모니터링 단계는 중합효소 및 제2 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 제2 반응 혼합물을 사용하여 반복된다. 선택적으로, 접촉 및 모니터링 단계는 중합효소 및 제3 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 제3 반응 혼합물을 사용하여 반복된다. 선택적으로, 접촉 및 모니터링 단계는 중합효소 및 제4 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 제4 반응 혼합물을 사용하여 반복된다.
또한 주형 핵산 분자를 시퀀싱하는 방법이 제공된다. 방법은 프라이머로 프라이밍된 주형 핵산 분자(즉, 프라이밍된 주형 핵산 분자)를 제공하는 단계; 프라이밍된 주형 핵산 분자를 중합효소, 제1 뉴클레오타이드 분자 및 제2 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 반응 혼합물과 접촉시키는 단계로서, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 분자는 서로 상이하고 반응 혼합물에 선택적으로 상이한 농도로 동시에 존재하며, 프라이밍된 주형 핵산 분자, 중합효소 및 제1 및/또는 제2 뉴클레오타이드 분자는 제1 및/또는 제2 뉴클레오타이드 분자가 프라이밍된 주형 핵산 분자의 다음의 염기에 상보적일 때 삼성분 복합체를 형성할 수 있고, 프라이밍된 주형 핵산 분자 및 중합효소는 제1 및/또는 제2 뉴클레오타이드 분자가 프라이밍된 주형 핵산 분자의 다음의 염기에 상보적이지 않을 때 이성분 복합체를 형성할 수 있는 단계를 포함하는 검사 단계를 포함한다. 선택적으로, 접촉은 삼성분 복합체의 형성을 안정화시키고 이성분 복합체의 형성을 불안정화시키는 조건하에 발생한다. 선택적으로, 조건은 삼성분 복합체의 형성을 안정화시키고 이성분 복합체의 형성을 불안정화시킨다. 선택적으로, 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건은 (1) 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머의 3' 뉴클레오타이드 상에 가역적 터미네이터 모이어티의 존재; 또는 (2) 비촉매성 이온(예컨대, 2가 비촉매성 금속 이온)의 존재에 의해 제공된다. 선택적으로, 이성분 복합체를 불안정화시키는 조건은 검사 단계 동안 반응 혼합물에 하나 이상의 1가 양이온 및/또는 글루타메이트 음이온의 존재에 의해 제공된다. 방법은 또한 제1 및 제2 뉴클레오타이드 분자의 존재하에, 그리고 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로 제1 또는 제2 뉴클레오타이드 분자의 화학적 도입 없이 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자의 상호작용을 모니터링하는 단계; 및 모니터링된 상호작용에 의해 임의의 뉴클레오타이드가 프라이밍된 주형 핵산 분자의 다음 염기에 상보적인 염기를 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 반응 혼합물은 제3 뉴클레오타이드 분자를 추가로 포함하며, 제3 뉴클레오타이드 분자는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 분자와 상이하고 제1 및 제2 뉴클레오타이드 분자와 상이한 농도로 반응 혼합물 중에 존재한다. 선택적으로, 반응 혼합물은 제4 뉴클레오타이드 분자를 추가로 포함하며, 제4 뉴클레오타이드 분자는 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 분자와 상이하고 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 분자와 상이한 농도로 반응 혼합물 중에 존재한다. 선택적으로, 제1 반응 혼합물은 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로 도입될 수 있는 하나 이상의 제1 뉴클레오타이드 분자 및 도입될 수 없는 하나 이상의 제1 뉴클레오타이드 분자를 포함한다. 선택적으로, 제2 반응 혼합물은 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로 도입될 수 있는 하나 이상의 제2 뉴클레오타이드 분자 및 도입될 수 없는 하나 이상의 제2 뉴클레오타이드 분자를 포함한다. 선택적으로, 제3 반응 혼합물은 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로 도입될 수 있는 하나 이상의 제3 뉴클레오타이드 분자 및 도입될 수 없는 하나 이상의 제3 뉴클레오타이드 분자를 포함한다. 선택적으로, 제4 반응 혼합물은 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로 도입될 수 있는 하나 이상의 제4 뉴클레오타이드 분자 및 도입될 수 없는 하나 이상의 제4 뉴클레오타이드 분자를 포함한다.
선택적으로, 제공된 방법은 세척 단계를 추가로 포함한다. 세척 단계는 방법 내의 임의의 다른 단계 이전 또는 이후에 발생할 수 있다. 선택적으로, 세척 단계는 모니터링 단계 이전 및/또는 결정 또는 확인 단계 이전에 수행된다. 선택적으로, 세척 단계는 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건하에 발생한다. 선택적으로, 조건은 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머의 3' 뉴클레오타이드 상의 가역적 터미네이터 모이어티의 존재로부터 유래된다. 선택적으로, 조건은 안정화제를 포함한다. 선택적으로, 안정화제는 비촉매성 금속 이온(예컨대, 2가 비촉매성 금속 이온)이다. 비촉매성 금속 이온은, 비제한적으로, 칼슘, 스트론튬, 스칸듐, 티탄, 바나듐, 크롬, 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 갈륨, 게르마늄, 비소, 셀레늄, 로듐, 유로퓸, 및 테르븀 이온을 포함한다. 선택적으로, 비촉매성 금속 이온은 스트론튬, 주석, 또는 니켈 이온 중 어느 것이다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 반감기를 가지며, 세척 단계는 뉴클레오타이드 분자가 프라이밍된 주형 핵산 분자의 다음의 염기에 상보적인 염기를 제공할 때 형성된 삼성분 복합체의 반감기보다 더 짧은 지속시간 동안 수행된다.
선택적으로, 모니터링 단계 후에 재로딩 단계가 있다. 재로딩 단계는 삼성분 복합체를 안정화시키고 이성분 복합체 형성을 불안정화시키는 조건하에 프라이밍된 주형 핵산을 중합효소 및 제1 또는 선택적인 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 재로딩 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
검사 단계는 프라이밍된 주형 핵산 분자 상의 다음의 정확한 염기의 결정을 허용하면서 뉴클레오타이드의 화학적 도입을 방지하는 반응 조건을 제공함으로써, 부분적으로 제어될 수 있다. 이러한 반응 조건은 검사 반응 조건으로 지칭될 수 있다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 검사 조건하에 형성된다. 선택적으로, 안정화된 삼성분 복합체는 검사 조건하에 또는 사전-화학 형태로 형성된다. 선택적으로, 안정화된 삼성분 복합체는 봉입된 뉴클레오타이드가 도입되었지만, 삼성분 복합체는 후속 뉴클레오타이드의 도입을 허용하지 않는 사전-전좌 형태이다.
선택적으로, 검사 조건은, 예를 들어 이성분 복합체를 안정화시킴으로써, 상이한 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합효소의 친화성의 차이를 두드러지게 한다. 선택적으로, 검사 조건은 상이한 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합효소의 차별적 친화성을 유발한다. 예로서, 상이한 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합효소의 차별적 친화성을 유발하는 검사 조건은, 비제한적으로, 높은 염 및 글루타메이트 이온을 포함한다. 예를 들어, 염은 수용액에 용해되어 1가 양이온, 예컨대 1가 금속 양이온(예컨대, 나트륨 이온 또는 칼륨 이온)을 생성할 수 있다. 선택적으로, 1가 양이온(예컨대, 1가 금속 양이온)을 제공하는 염은 글루타메이트 음이온을 추가로 제공한다. 글루타메이트 이온의 공급원은 칼륨 글루타메이트일 수 있다. 일부 경우, 프라이밍된 주형 핵산의 중합효소 친화성을 변화시키는데 사용될 수 있는 칼륨 글루타메이트의 농도는 10 mM 내지 1.6 M의 칼륨 글루타메이트, 또는 10 mM 내지 1.6 M 사이의 임의의 양으로 확장된다. 선택적으로, 상기 표시된 바와 같이, 높은 염은 50 내지 1,500 mM 염의 염 농도를 지칭한다.
검사는 전형적으로 주형 핵산과의 중합효소 상호작용을 검출하는 것을 포함한다. 검출은 광학, 전기적, 열, 음향, 화학적 및 기계적 수단을 포함할 수 있다. 선택적으로, 검사는 세척 단계 후에 수행되며, 세척 단계는 관찰 영역으로부터 임의의 비결합된 시약(예컨대, 결합하지 않은 중합효소 및/또는 뉴클레오타이드)을 제거한다. 선택적으로, 검사는 세척 단계 동안 수행되어, 중합효소-핵산 또는 중합효소-핵산-뉴클레오타이드 복합체의 해리 동역학이 다음의 염기의 실체를 결정하는 데 사용될 수 있다. 선택적으로, 검사는 검사 반응 혼합물(또는 제1 반응 혼합물)의 첨가 과정 동안 수행되어, 핵산에 대한 중합효소의 결합 동역학이 핵산 상의 다음의 염기의 실체를 결정하는 데 사용될 수 있다. 선택적으로, 검사는 삼성분 복합체를 중합효소 및 핵산의 이성분 복합체와 구별하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 검사는 측정된 친화성이 평형 친화성인 평형 조건하에 수행된다. 상이한 또는 유사한 검사 시약을 포함하는 다수의 검사 단계가 다음의 주형 염기의 실체를 확인하기 위해 연속적으로 수행될 수 있다. 다수의 검사 단계는 다수의 주형 핵산이 하나의 시퀀싱 반응에서 동시에 시퀀싱되는 경우에 이용될 수 있고, 상이한 핵산은 상이한 검사 시약에 상이하게 반응한다. 선택적으로, 다수의 검사 단계는 다음의 염기 결정의 정확도를 개선할 수 있다.
일반적으로, 검사 단계는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물에서 프라이밍된 주형 핵산의 중합 개시 부위에 중합효소를 결합시키는 단계, 및 상호작용을 모니터링하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 중합효소에 의해 봉입된 뉴클레오타이드의 도입이 약화되거나 억제되는 조건하에, 뉴클레오타이드는 중합효소-프라이밍된 주형 핵산 복합체 내에서 격리되어 삼성분 복합체를 형성한다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 프라이머의 3' 말단 뉴클레오타이드 상의 차단 모이어티(예컨대, 가역적 터미네이터 모이어티)의 존재에 의해 안정화된다. 선택적으로 안정화제는 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 삼성분 복합체를 안정화시키기 위해 첨가된다. 이 삼성분 복합체는 안정화된 또는 중합효소 트랩된 사전-화학 형태이다. 봉입된 뉴클레오타이드의 도입을 허용하지만 후속 뉴클레오타이드의 도입을 허용하지 않는 삼성분 복합체는 안정화된 또는 트랩된 사전-전좌 형태이다. 선택적으로, 중합효소는 중합효소 도메인의 가교, 핵산에 대한 중합효소의 가교, 작은 분자에 의한 알로스테릭 억제, 경쟁력 없는 억제제, 경쟁적 억제제, 비경쟁적 억제제, 및 변성에 제한되지 않는, 하나의 수단 또는 수단들의 조합에 의해 그의 삼성분 복합체 내의 중합 부위에서 트랩되며; 트랩된 삼성분 복합체의 형성은 핵산 주형 상에서 다음의 염기의 실체에에 관한 정보를 제공한다.
일반적으로, 본원에 제공된 방법에 따르면, 중합효소는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 분자의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산 분자와 상호작용하여 복합체를 형성한다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 분자는 프라이밍된 주형 핵산 분자에서 프라이머의 3'-말단의 하류에 있는 주형 핵산 분자의 염기에 상보적인 염기를 포함하는 뉴클레오타이드이다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 분자는 다음의 정확한 뉴클레오타이드(즉, 프라이밍된 주형 핵산 분자에서 프라이머의 3'-말단의 하류에 있는 주형 핵산 분자의 염기에 상보적인 염기를 포함함)이며, 복합체는 프라이밍된 주형 핵산 분자, 중합효소, 및 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 삼성분 복합체이다. 선택적으로, 프라이밍된 주형 핵산 및 중합효소 사이의 이성분 복합체의 형성보다 삼성분 복합체의 형성이 유리하다. 선택적으로, 접촉은 삼성분 복합체의 형성을 안정화시키고 이성분 복합체의 형성을 불안정화시키는 조건하에 발생한다. 선택적으로, 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건은 (1) 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머의 3' 뉴클레오타이드 상에 가역적 터미네이터 모이어티의 존재; 또는 (2) 비촉매성 이온(예컨대, 2가 비촉매성 금속 이온)의 존재에 의해 제공된다. 선택적으로, 이성분 복합체를 불안정화시키는 조건은 검사 단계 동안 반응 혼합물 내에 하나 이상의 1가 양이온 및/또는 글루타메이트 음이온의 존재에 의해 제공된다. 바람직한 구현예에서, 제1 반응 혼합물이 고농도의 염을 포함할 때 이성분 복합체의 형성보다 삼성분 복합체의 형성이 유리할 수 있다. 선택적으로, 제1 반응 혼합물은 이성분 복합체 형성을 불안정화시키기 위해 50 mM 내지 1,500 mM의 염을 포함한다. 100 mM 내지 1,500 mM, 및 200 mM 내지 1,500 mM 범위의 염 농도가 매우 바람직하다. 특정 구현예에서, 이성분 복합체를 불안정화시키는데 사용된 염은 용해되어 1가 이온, 예컨대 1가 금속 양이온(예컨대, 나트륨 이온 또는 칼륨 이온)을 생성한다. 일부 경우, 염은 1가 금속 양이온 및 글루타메이트 음이온을 제공하는 글루타메이트 염이다. 대안적으로 제1 반응 혼합물이 높은 pH를 갖는 완충액을 포함할 때 이성분 복합체의 형성보다 삼성분 복합체의 형성이 유리할 수 있다. 선택적으로, pH는 7.4 내지 9.0이다. 극한성(extremophile) 환경으로부터 추출된 특정 중합효소의 경우, 제1 반응 혼합물이 낮은 pH를 갖는 완충액을 포함할 때 이성분 복합체의 형성보다 삼성분 복합체의 형성이 유리할 수 있다. 선택적으로, pH는 4.0-7.0이다. 반응 온도 및/또는 유기 및 무기 첨가제가 또한 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자 사이의 친화성을 조절하는 데 사용될 수 있다.
본원에 제공된 시퀀싱 방법에서, 검사 단계에서 사용된 반응 혼합물은 1, 2, 3, 또는 4개 유형의 뉴클레오타이드 분자를 포함할 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드는 dATP, dTTP(또는 dUTP), dCTP, 및 dGTP로부터 선택된다. 선택적으로, 반응 혼합물은 하나 이상의 삼인산 뉴클레오타이드 및 하나 이상의 이인산 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 프라이밍된 주형 핵산, 중합효소, 및 4개의 뉴클레오타이드 분자 중 어느 하나 사이에 형성되어 4개 유형의 삼성분 복합체가 형성될 수 있다.
접촉 단계
제공된 방법에서, 중합효소 및 하나 이상의 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 반응 혼합물과 프라이밍된 주형 핵산 분자와의 접촉은 바람직하게는 삼성분 복합체의 형성을 안정화시키고 이성분 복합체의 형성을 불안정화시키는 조건하에 발생한다. 이러한 조건은 최종 사용자에 의한 선택 문제인 대안적인 접근법에 의해 제공될 수 있다.
선택적으로, 조건은 프라이밍된 핵산 분자를 삼투압을 조절하는 완충액과 접촉시키는 것을 포함한다. 선택적으로, 검사 단계에서 사용된 반응 혼합물은 삼투압을 조절하는 완충액을 포함한다. 선택적으로, 완충액은 50 내지 1,500 mM의 농도로 1가 이온, 예컨대 1가 금속 이온(예컨대, 칼륨 이온 또는 나트륨 이온)을 포함하는 높은 염 완충액이다. 100 내지 1,500 mM, 및 200 내지 1,500 mM 범위의 염 농도가 또한 매우 바람직하다. 선택적으로, 완충액은 글루타메이트 이온(예컨대, 칼륨 글루타메이트)의 공급원을 추가로 포함한다. 선택적으로, 삼성분 복합체의 형성을 안정화시키는 조건은 프라이밍된 핵산 분자를 안정화제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 선택적으로, 검사 단계 동안 사용된 반응 혼합물은 안정화제를 포함한다. 선택적으로, 안정화제는 비촉매성 금속 이온(예컨대, 2가 비촉매성 금속 이온)이다. 이 문맥에서 유용한 비촉매성 금속 이온은, 비제한적으로, 칼슘, 스트론튬, 스칸듐, 티탄, 바나듐, 크롬, 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 갈륨, 게르마늄, 비소, 셀레늄, 로듐, 유로퓸, 및 테르븀을 포함한다. 선택적으로, 삼성분 복합체 형성을 촉진하기 위해 Ni2+가 검사 반응에 제공된다. 선택적으로, 삼성분 복합체 형성을 촉진하기 위해 Sr2+가 검사 반응에 제공된다. 선택적으로, 비촉매성 금속 이온은 스트론튬, 주석, 또는 니켈이다. 선택적으로, 제1 반응 혼합물은 0.01 mM 내지 30 mM 스트론튬 클로라이드 또는 니켈 클로라이드를 포함한다.
선택적으로, 접촉 단계는 플로우 셀 또는 챔버(이하, "플로우 셀")의 사용에 의해 촉진된다. 액체 시약을 내부 고체 지지체 표면(예컨대, 평면 표면)을 함유하는 플로우 셀을 통해 유동시키는 것은 편리하게 시약 교환을 가능하게 한다. 본원에 기재된 절차를 이용하여 시퀀싱되거나 조사될 하나 이상의 프라이밍된 주형 핵산은 플로우 셀의 내부 표면에 고정화된다. 전형적인 플로우 셀은 액체 시약(예컨대, 본원에 논의된 "반응 혼합물"의 성분)을 입구 포트로 전달하는 미세유체 밸브를 포함할 것이다. 액체 시약은 출구 포트를 통해 빠져나옴으로써 플로우 셀로부터 제거될 수 있다.
선택적으로, 접촉 단계는 센서를 하나의 시약 저장조(reservoir)에서 또 다른 시약 저장조로 물리적 전달 또는 이송함으로써 촉진된다. 플라스틱 멀티웰 플레이트가 시약 저장조로서의 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 그 위에 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 갖는 광학 센서 팁은 이송 단계 동안 연속적 또는 간헐적으로 모니터링하면서 멀티웰 플레이트의 하나의 웰에서 멀티웰 플레이트의 상이한 웰로 이송될 수 있다.
모니터링
단계
뉴클레오타이드 분자의 존재하에 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자의 상호작용을 모니터링하거나 측정하는 것은 많은 상이한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 모니터링은 프라이밍된 주형 핵산, 중합효소, 및 4개의 뉴클레오타이드 분자 중 어느 하나 사이의 상호작용에 대한 결합 동역학을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 분자의 존재하에 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자의 상호작용을 모니터링하는 것은 중합효소 및 프라이밍된 주형 핵산 분자 사이의 평형 결합 상수(즉, 4개의 뉴클레오타이드 중 어느 하나의 존재하에 주형 핵산에 대한 중합효소의 평형 결합 상수)를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 모니터링은 4개의 뉴클레오타이드 중 어느 하나의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합효소의 평형 결합 상수를 측정하는 단계를 포함한다. 뉴클레오타이드 분자의 존재하에 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자의 상호작용을 모니터링하는 것은 4개의 뉴클레오타이드 중 어느 하나의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산로부터 중합효소의 해리 동역학을 측정하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 분자의 존재하에 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자의 상호작용을 모니터링하는 것은 폐쇄된 복합체의 해리(즉, 프라이밍된 주형 핵산, 중합효소, 및 4개의 뉴클레오타이드 분자 중 어느 하나의 해리)의 해리 동역학을 측정하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 측정된 결합 동역학은 뉴클레오타이드 분자의 실체에에 따라 상이하다. 선택적으로, 중합효소는 4개 유형의 뉴클레오타이드 분자 각각에 대해 상이한 친화성을 갖는다. 선택적으로, 중합효소는 각각의 유형의 삼성분 복합체에서 4개 유형의 뉴클레오타이드 분자 각각에 대해 상이한 해리 상수를 갖는다. 결합, 평형 및 해리 동역학은 알려져 있으며, 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 그 전체가 참조로 본원에 포함된 문헌[Markiewicz et al., Nucleic Acids Research 40(16):7975-84 (2012); Xia et al., J. Am. Chem. Soc. 135(1):193-202 (2013); Brown et al., J. Nucleic Acids, Article ID 871939, 11 pages (2010); Washington, et al., Mol. Cell. Biol. 24(2):936-43 (2004); Walsh and Beuning, J. Nucleic Acids, Article ID 530963, 17 pages (2012); and Roettger, et al., Biochemistry 47(37):9718-9727 (2008)]을 참고한다.
모니터링 단계는 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로 제1 뉴클레오타이드 분자의 화학적 도입 없이, 제1 뉴클레오타이드 분자의 존재하에 정상 상태 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자의 상호작용을 모니터링하는 단계를 포함할 수 있다. 선택적으로, 모니터링은 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로 제1 뉴클레오타이드 분자의 화학적 도입 없이, 제1 뉴클레오타이드 분자의 존재하에 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자와의 해리를 모니터링하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 모니터링은 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로 제1 뉴클레오타이드 분자의 화학적 도입 없이, 제1 뉴클레오타이드 분자의 존재하에 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자와의 결합을 모니터링하는 단계를 포함한다. 다시, 이러한 절차에서 시험 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드(즉, 표지되지 않은), 표지된 뉴클레오타이드(예컨대, 형광 표지된 뉴클레오타이드), 또는 뉴클레오타이드 유사체(예컨대, 가역적 터미네이터 모이어티를 포함하도록 변형된 뉴클레오타이드)일 수 있다.
본원에 제공된 시퀀싱 방법에서, 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머의 3' 뉴클레오타이드의 화학적 차단(예컨대, 뉴클레오타이드의 염기 또는 당 상에 가역적 터미네이터 모이어티), 또는 반응 혼합물에서 촉매성 금속 이온의 부재, 또는 중합효소의 활성 부위에 촉매성 금속 이온의 부재는 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 내로 뉴클레오타이드의 화학적 도입을 방지한다. 선택적으로, 접촉 단계의 반응 혼합물에서 촉매성 금속 이온의 킬레이트화는 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 내로 뉴클레오타이드의 화학적 도입을 방지한다. 선택적으로, 비촉매성 금속 이온은 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 삼성분 복합체에 대한 안정화제로서 작용한다. 선택적으로, 접촉 단계의 반응 혼합물에서의 촉매성 금속 이온을 비촉매성 금속 이온으로 치환하는 것은 프라이밍된 주형 핵산에 대한 뉴클레오타이드 분자의 화학적 도입을 방지한다. 선택적으로, 촉매성 금속 이온은 마그네슘이다. 중합효소의 금속 이온 기전은 저농도의 금속 이온이 중합효소-뉴클레오타이드-DNA 결합 상호작용을 안정화시키는데 필요할 수 있다고 가정한다. 예를 들어, 문헌[Section 27.2.2, Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L, Biochemistry 5th Edition, WH Freeman Press, 2002]을 참고한다.
선택적으로, 검사 단계 동안 사용된 반응 혼합물에서 저농도의 촉매 이온은 프라이밍된 주형 핵산으로의 뉴클레오타이드 분자의 화학적 도입을 방지한다. 선택적으로, 저농도는 약 1 μM 내지 약 100 μM이다. 선택적으로, 저농도는 약 0.5 μM 내지 약 5 μM이다. 선택적으로, 검사 단계 동안 사용된 반응 혼합물은 코발트 이온을 포함하며, 도입 단계는 제1 반응 혼합물에서의 코발트 이온의 농도와 비교하여 더 높은 농도의 코발트 이온을 포함하는 도입 반응 혼합물과의 접촉을 포함한다.
예시적인 시퀀싱 반응에서, 검사 단계는 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드를 포함하는 삼성분 복합체의 형성 및/또는 안정화를 포함한다. 삼성분 복합체의 형성 및/또는 방출의 특징은 뉴클레오타이드 및 따라서 주형 핵산 내의 다음의 염기를 확인하기 위해 모니터링된다. 삼성분 복합체 특징은 시퀀싱 반응 성분(예컨대, 중합효소, 프라이머, 주형 핵산, 뉴클레오타이드) 및/또는 반응 혼합물 성분 및/또는 조건에 의존적일 수 있다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 사전-화학 형태이다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 사전-전좌 형태이다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 사후-전좌 형태이다.
검사 단계는 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소와 주형 핵산과의 상호작용을 모니터링하는 단계를 포함한다. 삼성분 복합체의 형성이 모니터링될 수 있다. 선택적으로, 삼성분 복합체의 형성의 부재가 모니터링된다. 선택적으로, 삼성분 복합체의 해리가 모니터링된다. 선택적으로, 도입 단계는 뉴클레오타이드의 도입을 모니터링하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 도입 단계는 뉴클레오타이드 도입의 부재를 모니터링하는 단계를 포함한다.
검사 및/또는 도입 단계의 임의의 과정이 모니터링될 수 있다. 선택적으로, 중합효소는 검출 가능한 태그를 갖는다. 선택적으로, 시퀀싱 반응의 성분은 검출 가능하게 표지되지 않는다. 선택적으로, 중합효소 상의 검출 가능한 태그 또는 표지는 제거가능하다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 또는 중합효소는 검출 가능한 표지를 갖지만, 표지는 시퀀싱 동안 검출되지 않는다.
뉴클레오타이드의 도입을 허용하거나 허용하지 않을 수 있는 조건하에, 정확한 뉴클레오타이드 및 부정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 주형 핵산에 대한 중합효소의 친화성의 변화를 모니터링하는 것이 핵산의 서열을 결정하는 데 사용될 수 있다. 변형된 또는 표지된 뉴클레오타이드를 포함하는 상이한 뉴클레오타이드의 존재하에 주형 핵산에 대한 중합효소의 친화성은 다양한 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소-핵산 상호작용의 오프-레이트(off-rate)로서 모니터링될 수 있다. 다양한 매치된/정확한, 미스매치된/부정확한 및 변형된 뉴클레오타이드에 대한 많은 표준 중합효소의 친화성 및 오프-레이트는 당업계에 공지되어 있다. 클레나우 중합효소의 단일 분자 이미징은 뉴클레오타이드 유형이 도입되는 것이 방지되는 경우 상이한 뉴클레오타이드 유형에 대한 주형 핵산의 오프-레이트가 뚜렷하고 측정가능하게 상이하다는 것을 밝힌다.
선택적으로, 특정 유형의 뉴클레오타이드가 프라이밍된 주형 핵산의 존재하에 중합효소에 이용가능하게 된다. 반응이 모니터링되고, 뉴클레오타이드가 다음의 정확한 뉴클레오타이드이면, 중합효소는 안정화되어 삼성분 복합체를 형성할 수 있다. 뉴클레오타이드가 부정확한 뉴클레오타이드이면, 삼성분 복합체는 여전히 형성될 수 있지만, 안정화제 또는 반응 조건(예컨대, 촉매성 이온, 중합효소 억제제, 염의 부재)의 추가의 도움이 없으면, 삼성분 복합체는 해리될 수 있다. 해리 속도는 중합효소, 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드의 특정 조합의 친화성뿐만 아니라 반응 조건에 의존한다. 선택적으로, 친화성은 오프-레이트로서 측정된다. 선택적으로, 친화성은 삼성분 복합체에 대해 상이한 뉴클레오타이드 사이에서 상이하다. 예를 들어, 프라이머의 3'-말단의 하류에 있는 주형 핵산 내의 다음 염기가 G이면, 오프-레이트로서 측정된 중합효소-핵산 친화성은, dATP, dCTP, dGTP 또는 dTTP가 부가되는지 여부에 따라 상이할 것으로 예상된다. 이 경우, dCTP는 가장 느린 오프-레이트를 가질 것이며, 다른 뉴클레오타이드는 상호작용에 대해 상이한 오프-레이트를 제공할 것이다. 선택적으로, 오프-레이트는 반응 조건, 예를 들어, 안정화제의 존재(예컨대, 마그네슘 또는 억제 화합물의 부재) 또는 반응 조건(예컨대, 뉴클레오타이드 변형 또는 변형된 중합효소)에 따라 상이할 수 있다.
다음의 정확한 뉴클레오타이드의 실체에이 결정되면, 삼성분 복합체의 형성을 특이적으로 표적화하는 조건하에 1, 2, 3, 4개 이상의 뉴클레오타이드 유형이 반응 혼합물에 동시에 도입될 수 있다. 과량의 뉴클레오타이드는 선택적으로 반응 혼합물로부터 제거될 수 있고 반응 조건은 삼성분 복합체의 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 도입하도록 조절될 수 있다. 이 시퀀싱 반응은 시퀀싱 사이클당 오직 하나의 뉴클레오타이드가 도입되는 것을 보장한다. 바람직하게는, 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드가 도입 단계에서 사용되고, 선택적 세척 단계가 생략된다.
확인 단계
다음의 정확한 염기 또는 뉴클레오타이드의 실체는 삼성분 복합체의 존재, 형성, 및/또는 해리를 모니터링함으로써 결정될 수 있다. 다음의 염기의 실체는 프라이머의 3'-말단에 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 화학적으로 도입하지 않고 결정될 수 있다. 선택적으로, 다음의 염기의 실체는 부가된 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 핵산 주형에 대한 중합효소의 친화성을 모니터링함으로써 결정된다. 선택적으로, 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 핵산 주형에 대한 중합효소의 친화성은 주형 핵산 상의 다음의 정확한 염기를 결정하는 데 사용될 수 있다. 선택적으로, 부정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 핵산 주형에 대한 중합효소의 친화성은 주형 핵산 상의 다음의 정확한 염기를 결정하는 데 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 프라이밍된 주형 핵산(또는 차단된 프라이밍된 주형 핵산)을 포함하는 삼성분 복합체는 중합효소 및 복수의 뉴클레오타이드의 존재하에 형성된다. 삼성분 복합체에 참여하는 동족 뉴클레오타이드는 동족 뉴클레오타이드가 반응 혼합물에 부재할 때 발생하는 복합체의 불안정화를 관찰함으로써 선택적으로 확인된다. 이것은, 예를 들어, 하나의 반응 혼합물을 또 다른 반응 혼합물로 교환함으로써 편리하게 수행된다. 여기에서, 복합체의 소실은 동족 뉴클레오타이드 실체에의 지표이다. 결합 신호(예컨대, 고체 지지체 상의 특정 위치와 관련된 형광 결합 신호)의 소실은 프라이밍된 주형 핵산이 동족 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 반응 혼합물에 노출될 때 발생할 수 있다. 선택적으로, 반응 혼합물에서 단일 뉴클레오타이드의 존재하에 삼성분 복합체의 유지 역시 동족 뉴클레오타이드의 실체를 나타낼 수 있다.
도입 단계
본원에 기재된 시퀀싱 방법은 도입 단계를 선택적으로 포함한다. 도입 단계는 주형 핵산에 결합된 프라이머의 3'-말단에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 화학적으로 도입하는 것을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 뉴클레오타이드는 프라이머의 3'-말단에 도입된다. 바람직한 구현예에서, 단일 뉴클레오타이드만이 프라이머의 3'-말단에 도입된다. 선택적으로, 동일한 종류의 다수의 뉴클레오타이드가 프라이머의 3'-말단에 도입된다. 선택적으로, 상이한 종류의 다수의 뉴클레오타이드가 프라이머의 3'-말단에 도입된다. 도입된 뉴클레오타이드는 대안적으로 표지되지 않은 뉴클레오타이드, 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드, 또는 검출 가능하게 표지된 뉴클레오타이드 유사체일 수 있다. 중합효소는 뉴클레오타이드 도입 이후 중합 개시 부위로부터 해리될 수 있거나 또는 도입 이후 중합 개시 부위에 보유될 수 있다.
도입 반응은 도입 반응 혼합물에 의해 촉진될 수 있다. 선택적으로, 도입 반응 혼합물은 검사 반응과 상이한 뉴클레오타이드 조성을 갖는다. 예를 들어, 검사 반응은 하나의 유형의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 도입 반응은 또 다른 유형의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 검사 반응은 하나의 유형의 뉴클레오타이드를 포함하고, 도입 반응은 4개 유형의 뉴클레오타이드를 포함하거나, 그 반대이다. 선택적으로, 검사 반응 혼합물은 도입 반응 혼합물에 의해 변경되거나 대체된다. 선택적으로, 도입 반응 혼합물은 촉매성 금속 이온(예컨대, 2가 촉매성 금속 이온), 1가 금속 양이온(예컨대, 칼륨 이온 또는 나트륨 이온), 글루타메이트 이온, 또는 이의 조합을 포함한다.
도입 단계에서 사용되는 뉴클레오타이드의 특성은 유연성이 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 뉴클레오타이드는, 예를 들어, 자유 3'-하이드록실 기일 수 있는 3'-하이드록실 기를 포함할 수 있다. 선택적으로, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 분자의 3' 위치는 3' 터미네이터 모이어티를 포함하도록 변형된다. 3' 터미네이터 모이어티는 가역적 터미네이터일 수 있거나 또는 비가역적 터미네이터일 수 있다. 선택적으로, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 분자의 가역적 터미네이터는 검사 단계 이전 또는 이후에 대체되거나 제거된다.
반응 혼합물 중에 존재하나 삼성분 복합체에서 격리되지 않는 뉴클레오타이드는 다수의 뉴클레오타이드 삽입을 유발할 수 있다. 트랩된 삼성분 복합체 내에서 격리된 뉴클레오타이드만이 도입 단계 동안 도입에 이용가능한 것을 보장하기 위해 세척 단계가 화학적 도입 단계 이전에 사용될 수 있다. 선택적으로, 자유 뉴클레오타이드가 포스파타아제와 같은 효소에 의해 제거될 수 있다. 트랩된 중합효소 복합체는 삼성분 복합체, 안정화된 삼성분 복합체 또는 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산 및 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 삼성분 복합체일 수 있다.
선택적으로, 검사 단계의 삼성분 복합체 내에 봉입된 뉴클레오타이드는 도입 단계 동안 주형 핵산 프라이머의 3'-말단 내로 도입된다. 예를 들어, 검사 단계의 안정화된 삼성분 복합체는 도입된 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 검사 단계의 삼성분 복합체 내에 봉입된 뉴클레오타이드는 검사 단계 동안 도입되지만, 삼성분 복합체는 후속 뉴클레오타이드의 도입을 허용하지 않는다. 이 경우, 삼성분 복합체는 도입 단계 동안 방출됨으로써, 후속 뉴클레오타이드가 도입되게 한다.
선택적으로, 도입 단계는 검사 단계로부터의 뉴클레오타이드를 대체하고(예컨대, 뉴클레오타이드는 부정확한 뉴클레오타이드임), 주형 핵산 프라이머의 3'-말단 내로 또 다른 뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함한다. 도입 단계는 삼성분 복합체로부터 뉴클레오타이드를 방출시키고(예컨대, 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체임), 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머의 3'-말단 내로 상이한 종류의 뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 선택적으로, 방출된 뉴클레오타이드는 제거되고 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 함유하는 도입 반응 혼합물로 대체된다. 예를 들어, 도입된 뉴클레오타이드는 검출 가능한 형광단을 포함하지 않는 표지되지 않은 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드와 같은 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드일 수 있다.
도입을 위한 적합한 반응 조건은 검사 반응 혼합물을 도입 반응 혼합물로 대체하는 단계를 포함할 수 있다. 선택적으로, 검사 반응 혼합물 중에 존재하는 뉴클레오타이드는 도입 반응 혼합물 내의 하나 이상의 뉴클레오타이드로 대체된다. 선택적으로, 검사 단계 동안 존재하는 중합효소는 도입 단계 동안 대체된다. 이 접근법에 의해, 검사 및 도입 단계에서 상이한 유형의 중합효소를 사용할 수 있다. 선택적으로, 검사 단계 동안 존재하는 중합효소는 도입 단계 동안 변형된다. 선택적으로, 검사 단계 동안 존재하는 하나 이상의 뉴클레오타이드는 도입 단계 동안 변형된다. 검사 단계 동안 존재하는 반응 혼합물 및/또는 반응 조건은 도입 단계 동안 임의의 수단에 의해 변경될 수 있다. 이러한 수단은, 비제한적으로, 시약을 제거하는 것, 시약을 킬레이트화하는 것, 시약을 희석하는 것, 시약을 첨가하는 것, 전도성 또는 pH와 같은 반응 조건을 변경하는 것, 및 이의 임의의 조합을 포함한다. 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드의 임의의 조합을 포함하는 반응 혼합물 내의 시약은 검사 단계 및/또는 도입 단계 동안 변형될 수 있다.
선택적으로, 도입 단계에서 사용되는 반응 혼합물은 경쟁적 억제제를 포함하며, 경쟁적 억제제는 다수의 도입의 발생을 감소시킨다. 일 구현예에서, 경쟁적 억제제는 비도입가능한 뉴클레오타이드이다. 일 구현예에서, 경쟁적 억제제는 아미노글리코시드이다. 경쟁적 억제제는 활성 부위 내의 뉴클레오타이드 또는 촉매성 금속 이온을 대체할 수 있으므로, 첫 번째 도입 이후 경쟁적 억제제는 활성 부위를 점유하여 두 번째 도입을 방지한다. 일부 구현예에서, 도입가능한 뉴클레오타이드 및 경쟁적 억제제 모두가 도입 단계에 도입되어, 프라이머의 3'-말단에서 단일 뉴클레오타이드의 도입을 보장하도록 도입가능한 뉴클레오타이드 및 억제제의 비율이 조절될 수 있다.
선택적으로, 도입 반응 혼합물을 포함하는 제공된 반응 혼합물은 비도입가능한 뉴클레오타이드 또는 핵산 가닥 내로 도입될 수 없는 뉴클레오타이드인 적어도 하나의 뉴클레오타이드 분자를 포함한다. 즉, 제공된 반응 혼합물은 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로 도입될 수 없는 하나 이상의 뉴클레오타이드 분자를 포함할 수 있다. 도입될 수 없는 이러한 뉴클레오타이드는, 예를 들어, 이인산 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드를 비도입가능하게 만드는 트리포스페이트 기에 대한 변형을 함유할 수 있다. 비도입가능한 뉴클레오타이드의 예는 그 전체가 참조로 본원에 포함된 미국 특허 제7,482,120호에서 발견될 수 있다. 선택적으로, 프라이머는 그의 3'-말단에 유리 하이드록실 기를 함유하지 않을 수 있으며, 이에 의해 프라이머가 임의의 뉴클레오타이드를 도입할 수 없게 만들고, 따라서, 임의의 뉴클레오타이드를 비도입가능하게 만든다.
중합효소 억제제는 선택적으로 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 결합시 핵산 상에 중합효소를 트랩하기 위해 검사 단계에서 시험 뉴클레오타이드를 함유하는 반응 혼합물과 함께 포함될 수 있다. 선택적으로, 중합효소 억제제는 피로포스페이트 유사체이다. 선택적으로, 중합효소 억제제는 알로스테릭 억제제이다. 선택적으로, 중합효소 억제제는 DNA 또는 RNA 앱타머이다. 선택적으로, 중합효소 억제제는 중합효소 내의 촉매성 이온 결합 부위와 경쟁한다. 선택적으로, 중합효소 억제제는 역전사효소 억제제이다. 중합효소 억제제는 HIV-1 역전사효소 억제제 또는 HIV-2 역전사효소 억제제일 수 있다. HIV-1 역전사효소 억제제는 (4/6-할로겐/MeO/EtO-치환된 벤조[d]티아졸-2-일)티아졸리딘-4-온일 수 있다.
제공된 방법은 도입 단계 후 다음 검사 단계를 위해 프라이밍된 주형 핵산 분자를 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 선택적으로, 제조는 프라이밍된 주형 핵산 또는 핵산/중합효소 복합체를 하나 이상의 세척 단계; 온도 변화; 기계적 진동; pH 변화; 또는 광학 자극에 적용하는 것을 포함한다. 선택적으로, 세척 단계는 프라이밍된 주형 핵산 또는 프라이밍된 주형 핵산/중합효소 복합체를 하나 이상의 완충액, 세제, 단백질 변성제, 프로테아제, 산화제, 환원제, 또는 중합효소 내의 내부 가교 또는 중합효소 및 핵산 사이의 가교를 방출시킬 수 있는 다른 제제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
선택적으로, 방법은 주형 핵산 분자를 시퀀싱하기 위해 검사 단계 및 도입 단계를 반복하는 것을 추가로 포함한다. 검사 단계는 도입 단계를 수행하기 이전에 1회 이상 반복될 수 있다. 선택적으로, 2개의 연속적인 검사 단계는 상이한 뉴클레오타이드 분자를 갖는 반응 혼합물을 포함한다. 선택적으로, 검사 단계는 뉴클레오타이드의 쌍 조합과 같은 상이한 뉴클레오타이드의 조합을 포함하는 반응 혼합물의 사용을 포함한다. 선택적으로, 프라이밍된 주형 핵산 분자 내로 단일 뉴클레오타이드를 도입하기 이전에, 제1 반응 혼합물은 중합효소 및 1, 2, 3, 또는 4개 유형의 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 제2 반응 혼합물로 대체된다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 분자는 dATP, dTTP(또는 dUTP), dCTP, 및 dGTP로부터 선택된다.
제공된 시퀀싱 방법에서, 다음의 염기는 도입 단계 이전에 확인되어, 도입 단계가 표지된 시약 및/또는 모니터링을 필요로 하지 않게 한다. 따라서, 제공된 방법에서, 뉴클레오타이드는 선택적으로 부착된 검출 가능한 태그 또는 표지를 함유하지 않는다. 선택적으로, 뉴클레오타이드는 검출 가능한 표지를 함유하지만, 표지는 방법에서 검출되지 않는다. 선택적으로, 정확한 뉴클레오타이드는 검출 가능한 표지를 함유하지 않으나; 다음의 염기에 대해 부정확한 또는 비상보적인 뉴클레오타이드는 검출 가능한 표지를 함유한다.
시퀀싱 반응의 검사 단계는 도입 단계 이전에 1, 2, 3, 4회 이상 반복될 수 있다. 검사 및 도입 단계는 주형 핵산의 원하는 서열이 수득될 때까지 반복될 수 있다.
삼성분 복합체의 형성 또는 안정화된 삼성분 복합체의 형성은 시퀀싱의 사이클당 하나의 뉴클레오타이드만이 주형 핵산 프라이머에 부가되는 것을 보장하기 위해 사용될 수 있으며, 부가된 뉴클레오타이드는 삼성분 복합체 내에서 격리된다. 시퀀싱 사이클당 단일 뉴클레오타이드의 제어된 도입은 동종중합체 반복을 포함하는 핵산 영역에 대한 시퀀싱 정확도를 향상시킨다.
반응 혼합물
핵산 시퀀싱 반응 혼합물, 또는 간단히 "반응 혼합물"은 전형적으로 중합효소 기반 핵산 합성 반응에 일반적으로 존재하는 시약을 포함한다. 반응 혼합물 시약은, 비제한적으로, 효소(예컨대, 중합효소), dNTP, 주형 핵산, 프라이머 핵산, 염, 완충액, 작은 분자, 보조 인자, 금속, 및 이온을 포함한다. 이온은 촉매성 이온, 2가 촉매성 이온, 비촉매성 이온, 비공유 금속 이온, 또는 이의 조합일 수 있다. 반응 혼합물은 수용액에서 이온화하여 1가 양이온을 생성하는 NaCl, KCl, 칼륨 아세테이트, 암모늄 아세테이트, 칼륨 글루타메이트, NH4Cl, 또는 (NH4HSO4)와 같은 염을 포함할 수 있다. 반응 혼합물은 Mg2+ 또는 Mn2+, Co2+, Cd2+ 또는 Ba2+ 이온과 같은 이온의 공급원을 포함할 수 있다. 반응 혼합물은 프라이밍된 주형 핵산 분자 및 동족 뉴클레오타이드 사이의 포스포디에스테르 결합의 형성을 억제함으로써 삼성분 복합체를 안정화시키는 주석, Ca2+, Zn2+, Cu2+, Co2+, Fe(II)SO4, 또는 Ni2+, 또는 다른 2가 비촉매성 금속 양이온을 포함할 수 있다.
완충액은 트리스, 트리신, HEPES, MOPS, ACES, MES, 포스페이트계 완충액, 및 아세테이트계 완충액을 포함할 수 있다. 반응 혼합물은 EDTA, EGTA 등과 같은 킬레이트화제를 포함할 수 있다. 선택적으로, 반응 혼합물은 가교 시약을 포함한다. 선택적으로, 검사 단계 동안 사용되는 제1 반응 혼합물뿐만 아니라 전술한 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있는 뉴클레오타이드 도입 동안 사용되는 도입 반응 혼합물이 본원에 제공된다. 제1 반응 혼합물은 검사 동안 사용될 때 검사 반응 혼합물로서 본원에 지칭될 수 있다. 선택적으로, 제1 반응 혼합물은 고농도의 염; 높은 pH; 1, 2, 3, 4개 이상의 유형의 뉴클레오타이드; 칼륨 글루타메이트; 킬레이트화제; 중합효소 억제제; 촉매성 금속 이온; 비촉매성 금속 이온; 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 제1 반응 혼합물은 10 mM 내지 1.6 M의 칼륨 글루타메이트(10 mM 내지 1.6 M 사이의 임의의 양 포함)를 포함할 수 있다. 선택적으로, 도입 반응 혼합물은 촉매성 금속 이온; 1, 2, 3, 4개 이상의 유형의 뉴클레오타이드; 염화칼륨; 비촉매성 금속 이온; 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
제공된 방법은 검사 단계 동안 삼성분 복합체의 형성 및 안정화를 조절하는 반응 조건하에 수행된다. 검사 단계의 반응 조건은 뉴클레오타이드를 캡슐화하는 삼성분 복합체의 형성 및/또는 안정화에 유리하고 이성분 복합체의 형성 및/또는 안정화를 방해한다. 중합효소와 주형 핵산 사이의 이원 상호작용은 이온 강도, pH, 온도, 또는 이의 임의의 조합과 같은 시퀀싱 반응 매개변수를 조절함으로써, 또는 이성분 복합체 불안정화제를 반응에 첨가함으로써 조작될 수 있다. 선택적으로, 높은 염(예컨대, 50 내지 1,500 mM) 및/또는 pH 변화가 이성분 복합체를 불안정화시키는데 이용된다. 선택적으로, 이성분 복합체는 뉴클레오타이드의 존재에 관계없이 시퀀싱 반응의 검사 또는 도입 단계 동안 중합효소와 주형 핵산 사이에 형성될 수 있다. 선택적으로, 반응 조건은 삼성분 복합체의 안정화 및 이성분 복합체의 불안정화에 유리하다. 예로서, 검사 반응 혼합물의 pH는 삼성분 복합체의 안정화 및 이성분 복합체의 불안정화에 유리한 4.0 내지 10.0으로 조절될 수 있다. 선택적으로, 검사 반응 혼합물의 pH는 4.0 내지 6.0이다. 선택적으로, 검사 반응 혼합물의 pH는 6.0 내지 10.0이다.
본원에 개시된 제공된 시퀀싱 방법은 뉴클레오타이드의 화학적 부가를 제어하면서 다음의 염기의 실체를 밝히는 방식으로 뉴클레오타이드 및 주형 핵산과의 중합효소 상호작용을 촉진한다. 선택적으로, 방법은 검출 가능하게 표지된 뉴클레오타이드의 부재하에, 또는 표지가 검출되지 않는 표지된 뉴클레오타이드의 존재하에 수행된다.
검사 반응 조건하에, 프라이밍된 주형 핵산에 결합된 중합효소 및 중합효소-주형 핵산 복합체 내에 봉입된 뉴클레오타이드를 포함하는 삼성분 복합체의 형성 및/또는 안정화를 위한 방법이 본원에 제공된다. 검사 반응 조건은 뉴클레오타이드 도입을 억제하거나 약화시킬 수 있다. 선택적으로, 봉입된 뉴클레오타이드의 도입은 억제되고, 복합체는 사전-화학 형태 또는 삼성분 복합체로 안정화되거나 트랩된다. 선택적으로, 봉입된 뉴클레오타이드가 도입되고 후속 뉴클레오타이드 도입은 억제된다. 이 경우, 복합체는 사전-전좌 형태로 안정화되거나 트랩된다. 본원에 제공된 시퀀싱 반응의 경우, 삼성분 복합체는 검사 단계 동안 안정화되어, 제어된 뉴클레오타이드 도입을 허용한다. 선택적으로, 안정화된 삼성분 복합체는 검사 단계 동안 봉입된 뉴클레오타이드의 도입이 일시적으로(예컨대, 복합체를 검사한 다음 뉴클레오타이드를 도입시키기 위해) 또는 영구적으로(예컨대, 검사만을 위해) 약화되는 복합체이다. 선택적으로, 안정화된 삼성분 복합체는 봉입된 뉴클레오타이드를 도입을 허용하지만, 후속 뉴클레오타이드의 도입을 허용하지 않는다. 선택적으로, 폐쇄된 복합체는 주형 핵산 내의 다음의 염기의 확인을 위한 뉴클레오타이드의 존재하에 주형 핵산과의 임의의 중합효소 상호작용을 모니터링하기 위해 안정화된다.
선택적으로, 봉입된 뉴클레오타이드는 삼성분 복합체에서 주형 핵산에 대해 심하게 감소되거나 불가능한 결합을 갖는다. 선택적으로, 봉입된 뉴클레오타이드는 다음의 염기에서 주형 핵산과 염기쌍을 형성한다. 선택적으로, 중합효소, 뉴클레오타이드, 프라이머, 주형 핵산, 또는 이의 임의의 조합의 실체는 삼성분 복합체 내의 봉입된 뉴클레오타이드와 주형 핵산 사이의 상호작용에 영향을 미친다.
선택적으로, 봉입된 뉴클레오타이드는 폐쇄된 복합체의 중합효소에 결합한다. 선택적으로, 봉입된 뉴클레오타이드는 삼성분 복합체의 중합효소와 약하게 결합한다. 선택적으로, 중합효소, 뉴클레오타이드, 프라이머, 주형 핵산, 또는 이의 임의의 조합의 실체는 삼성분 복합체 내의 봉입된 뉴클레오타이드와 중합효소 사이의 상호작용에 영향을 미친다. 주어진 중합효소의 경우, 각각의 뉴클레오타이드는 중합효소에 대해 또 다른 뉴클레오타이드와 상이한 친화성을 갖는다. 선택적으로, 이 친화성은 부분적으로 주형 핵산 및/또는 프라이머에 의존적이다.
삼성분 복합체는 일시적으로 형성될 수 있다. 선택적으로, 봉입된 뉴클레오타이드는 다음의 정확한 뉴클레오타이드이다. 일부 방법에서, 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재는 삼성분 복합체의 안정화에 부분적으로 기여한다. 선택적으로, 봉입된 뉴클레오타이드는 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 아니다.
선택적으로, 검사 반응 조건은 복수의 프라이밍된 주형 핵산, 중합효소, 뉴클레오타이드, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 선택적으로, 복수의 뉴클레오타이드는 1, 2, 3, 4개 이상의 유형의 상이한 뉴클레오타이드, 예를 들어 dATP, dTTP(또는 dUTP), dGTP, 및 dCTP를 포함한다. 선택적으로, 복수의 주형 핵산은 주형 핵산의 클론 집단이다.
검사 반응 혼합물은, 비제한적으로, 효소를 포함하는 다른 분자를 포함할 수 있다. 선택적으로, 검사 반응 혼합물은 일반적으로 핵산 중합 반응에 존재하는 임의의 시약 또는 생물분자를 포함한다. 반응 성분은, 비제한적으로, 염, 완충액, 작은 분자, 세제, 크라우딩제(crowding agent), 금속, 및 이온을 포함할 수 있다. 선택적으로, 반응 혼합물의 특성은, 예를 들어, 전기적으로, 자기적으로, 및/또는 진동을 이용하여 조작될 수 있다.
뉴클레오타이드
및
뉴클레오타이드
유사체
선택적으로, 검사 단계의 삼성분 복합체는 삼성분 복합체의 안정화를 촉진하기 위해 천연 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 질소성 염기, 오탄당, 및 포스페이트 기를 포함하며; 뉴클레오타이드의 임의의 성분은 변형되고/되거나 대체된다. 뉴클레오타이드 유사체는 비도입가능한 뉴클레오타이드일 수 있다. 비도입가능한 뉴클레오타이드는 시퀀싱 방법 동안 임의의 시점에 도입가능하도록 변형될 수 있다.
뉴클레오타이드 유사체는, 비제한적으로, 알파-포스페이트 변형된 뉴클레오타이드, 알파-베타 뉴클레오타이드 유사체, 베타-포스페이트 변형된 뉴클레오타이드, 베타-감마 뉴클레오타이드 유사체, 감마-포스페이트 변형된 뉴클레오타이드, 갇힌 뉴클레오타이드, 또는 ddNTP를 포함한다. 뉴클레오타이드 유사체의 예는 그 전체가 참조로 본원에 포함된 미국 특허 제8,071,755호에 기재되어 있다.
뉴클레오타이드 유사체는 프라이머의 3'-말단에 뉴클레오타이드 도입을 가역적으로 방지하는 터미네이터를 포함할 수 있다. 가역적 터미네이터의 한 가지 유형은 3'-O-차단된 가역적 터미네이터이다. 여기서, 터미네이터 모이어티는 뉴클레오타이드 5-탄소 당의 3'-OH 말단의 산소 원자에 연결된다. 예를 들어, 미국 제7,544,794호 및 미국 제8,034,923호(이들 특허의 개시내용은 참고로 포함됨)는 3'-OH 기가 3'-ONH2 기로 대체된 가역적 터미네이터 dNTP를 기술한다. 가역적 터미네이터의 또 다른 유형은 3'-차단되지 않은 가역적 터미네이터이며, 터미네이터 모이어티는 뉴클레오타이드의 질소성 염기에 연결된다. 예를 들어, 미국 제8,808,989호(이의 개시내용은 참조로 포함됨)는 본원에 기재된 방법과 관련하여 사용될 수 있는 염기 변형된 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드의 특정 예를 개시한다. 본원에 기재된 방법과 관련하여 유사하게 사용될 수 있는 다른 가역적 터미네이터는 미국 제7,956,171호, 미국 제8,071,755호, 및 미국 제9,399,798호(이들 미국 특허의 개시내용은 참조로 포함됨)에 기재된 것을 포함한다. 터미네이터를 갖는 뉴클레오타이드 유사체의 검토를 위해, 예컨대, 문헌[Mu, R., et al., "The History and Advances of Reversible Terminators Used in New Generations of Sequencing Technology," Genomics, Proteomics & Bioinformatics 11(1):34-40 (2013)]을 참조한다. 선택적으로, 검사 단계 동안 사용된 하나 이상의 천연 뉴클레오타이드는 도입 단계 동안 도입된 제2 유형의 뉴클레오타이드에 의해 대체된다. 예를 들어, 검사 단계 동안 사용되는 반응 혼합물 중에 존재하는 뉴클레오타이드는 가역적 터미네이터 모이어티(예컨대, 뉴클레오타이드 분자의 염기 또는 당에 위치함)를 포함하는 뉴클레오타이드 유사체에 의해 대체될 수 있다.
선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 프라이머의 3'-말단에 뉴클레오타이드 도입을 비가역적으로 방지하는 터미네이터 모이어티를 갖는다. 비가역적 뉴클레오타이드 유사체는 2', 3'-디데옥시뉴클레오타이드, ddNTP(ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP)를 포함한다. 디데옥시뉴클레오타이드는 중합효소 매개된 합성에 필수적인 dNTP의 3'-OH 기가 결여되어 있다.
선택적으로, 비도입가능한 뉴클레오타이드는 핵산 중합 반응의 도입 단계 동안 뉴클레오타이드가 제2 뉴클레오타이드(프라이머의 3'-OH)에 공유 결합을 형성하는 것을 억제하거나 방지하는 차단 모이어티를 포함한다. 차단 모이어티는 뉴클레오타이드로부터 제거되어, 뉴클레오타이드 도입을 허용할 수 있다.
선택적으로, 삼성분 복합체에 존재하는 뉴클레오타이드 유사체는 삼성분 복합체를 안정하게 만든다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 비도입가능하다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체가 방출되고, 천연 뉴클레오타이드가 도입된다. 선택적으로, 삼성분 복합체가 방출되고, 뉴클레오타이드 유사체가 변형되며, 변형된 뉴클레오타이드 유사체가 도입된다. 선택적으로, 삼성분 복합체에서 뉴클레오타이드 유사체를 변형시키고/시키거나 불안정화시키는 반응 조건하에 삼성분 복합체가 방출된다.
선택적으로, 삼성분 복합체에 존재하는 뉴클레오타이드 유사체가 도입되고 삼성분 복합체가 안정화된다. 삼성분 복합체는 뉴클레오타이드 유사체에 의해, 또는 예를 들어, 본원에 개시된 임의의 안정화 방법에 의해 안정화될 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 후속 뉴클레오타이드의 도입을 허용하지 않는다. 삼성분 복합체는, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 방출될 수 있고, 뉴클레오타이드 유사체는 변형된다. 변형된 뉴클레오타이드 유사체는 그의 3'-말단에 뉴클레오타이드의 후속 도입을 허용할 수 있다.
선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 검사 단계 동안 반응 혼합물 중에 존재한다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4개 이상의 뉴클레오타이드 유사체가 검사 단계 동안 반응 혼합물 중에 존재한다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 도입 단계 동안 대체, 희석, 또는 격리된다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 천연 뉴클레오타이드로 대체된다. 천연 뉴클레오타이드는 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 도입 단계 동안 변형된다. 변형된 뉴클레오타이드 유사체는 천연 뉴클레오타이드와 유사하거나 동일할 수 있다.
선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 중합효소에 대해 천연 뉴클레오타이드와 상이한 결합 친화성을 갖는다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 천연 뉴클레오타이드와 상이한 다음 염기와의 상호작용을 갖는다. 뉴클레오타이드 유사체 및/또는 비도입가능한 뉴클레오타이드는 주형 핵산의 상보적 염기와 염기쌍을 형성할 수 있다.
선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 중합효소에 융합된 변형된 또는 천연 뉴클레오타이드이다. 선택적으로, 복수의 뉴클레오타이드 유사체는 복수의 중합효소에의 융합을 포함하며, 각각의 뉴클레오타이드 유사체는 상이한 중합효소를 포함한다.
뉴클레오타이드는 이성분 복합체의 형성보다 폐쇄된 복합체의 형성에 유리하도록 변형될 수 있다. 뉴클레오타이드 변형은 유전적으로 조작될 수 있다. 뉴클레오타이드는 중합효소에 대해 높은 친화성을 갖도록 선택되거나 변형될 수 있으며, 중합효소는 주형 핵산에 결합하기 전에 뉴클레오타이드에 결합한다.
삼성분 복합체 내의 중합효소를 트랩하는 임의의 뉴클레오타이드 변형이 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 뉴클레오타이드는 영구적으로 또는 일시적으로 트랩될 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체는 폐쇄된 중합체가 안정화되는 수단이 아니다. 임의의 삼성분 복합체 안정화 방법은 뉴클레오타이드 유사체를 이용하는 반응에서 조합될 수 있다.
선택적으로, 폐쇄된 복합체의 안정화를 허용하는 뉴클레오타이드 유사체는 일반적으로 삼성분 복합체를 방출하는 반응 조건과 조합된다. 조건은, 비제한적으로, 방출 시약(예컨대, 촉매성 금속 이온, 예컨대 마그네슘 또는 망간)의 존재를 포함한다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 촉매성 금속 이온의 존재하에서도 안정화된다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 뉴클레오타이드 유사체의 존재하에서도 방출된다. 선택적으로, 폐쇄된 복합체의 안정화는 안정화 시약 및/또는 방출 시약의 농도 및/또는 실체에, 및 이의 임의의 조합에 부분적으로 의존한다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 유사체를 사용하는 삼성분 복합체의 안정화는, 비제한적으로, 촉매성 금속 이온의 격리, 제거, 감소, 생략, 및/또는 킬레이트화; 중합효소 억제제, 가교제의 존재; 및 이의 임의의 조합을 포함하는, 삼성분 복합체를 안정화시키는 기능을 하는 추가의 반응 조건과 조합된다.
선택적으로, 하나 이상의 뉴클레오타이드는 구별하고/하거나 검출 가능한 태그 또는 표지로 표지될 수 있으나, 이러한 태그 또는 표지는 검사, 염기의 확인 또는 염기의 도입 동안 검출되지 않으며, 이러한 태그 또는 표지는 본원에 개시된 시퀀싱 방법 동안 검출되지 않는다. 태그는 형광, 라만 스펙트럼, 전하, 질량, 굴절률, 발광, 길이, 또는 임의의 다른 측정가능한 특성에서의 이들의 차이에 의해 구별될 수 있다. 중합효소-핵산 복합체에 대한 결합의 충실도가 주형 핵산 상의 상보적 염기를 정확하게 확인할 수 있도록 충분히 유지되는 한, 태그는 뉴클레오타이드 상의 하나 이상의 상이한 위치에 부착될 수 있다. 선택적으로, 태그는 뉴클레오타이드의 핵염기에 부착된다. 적합한 반응 조건하에, 태깅된 뉴클레오타이드는 중합효소 및 프라이밍된 주형 핵산을 갖는 삼성분 복합체에 봉입될 수 있다. 대안적으로, 태그는 뉴클레오타이드의 감마 포스페이트 위치에 부착된다.
다수의 검사 단계에서 복수의
뉴클레오타이드를
사용한
뉴클레오타이드
확인의 향상
개시된 결합에 의한 시퀀싱 기술은 검사 단계의 각각의 사이클 동안 하나를 초과하는 뉴클레오타이드를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 단일 검사 단계는 선택적으로 2개, 3개, 또는 심지어 4개의 상이한 뉴클레오타이드를 사용하여 수행될 수 있다. 선택적으로, 각각의 뉴클레오타이드는 표지되지 않은 뉴클레오타이드, 예컨대 천연 뉴클레오타이드(즉, dATP, dGTP, dCTP, dTTP 또는 dUTP)이다. 바람직하게는, 프라이밍된 주형 핵산 분자는 프라이밍된 주형 핵산 내로 임의의 뉴클레오타이드를 도입하지 않고, 순차적 방식으로 복수의 반응 혼합물과 접촉된다. 선택적으로, 각각의 상이한 반응 혼합물은 중합효소 및 2개 또는 3개의 상이한 뉴클레오타이드의 상이한 조합을 포함한다. 예를 들어, 합계하여, 각각의 상이한 뉴클레오타이드(예컨대, dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP)가 2회 존재하는 4개의 상이한 반응 혼합물이 있을 수 있다. 이것은, 예를 들어, 뉴클레오타이드의 하기 4개의 조합을 사용하여 달성될 수 있다: (dATP 및 dTTP), (dATP 및 dGTP), (dTTP 및 dCTP), 및(dGTP 및 dCTP). 대안은 하기 조합일 것이다: (dGTP 및 dCTP), (dGTP 및 dTTP), (dATP 및 dCTP), 및(dATP 및 dTTP). 또 다른 대안은 하기 조합일 것이다: (dATP 및 dGTP), (dATP 및 dCTP), (dGTP 및 dTTP), 및(dCTP 및 dTTP). 검사 단계는 2개의 상이한 뉴클레오타이드의 4개의 조합을 교대로 사용하여 수행될 수 있다(즉, 제1 조합이 제2 조합에 의해 대체되고, 제2 조합이 제3 조합에 의해 대체되며, 제3 조합이 제4 조합에 의해 대체되도록). 이 경우, 그리고 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산과의 상호작용의 모니터링이 결합 상호작용을 확인하는 신호를 생성할 때, 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 양성 결합 신호를 생성하는 2개의 상이한 뉴클레오타이드 조합에 공통인 뉴클레오타이드로서 확인될 수 있다. 뉴클레오타이드 조합의 집합 중에서 각각의 상이한 뉴클레오타이드를 3회 나타내기를 원하는 경우, 예시적인 조합은 (dATP 및 dTTP), (dATP 및 dGTP), (dATP 및 dCTP), (dTTP 및 dGTP), (dTTP 및 dCTP), 및(dGTP 및 dCTP)일 수 있다. 검사 단계는 2개의 상이한 뉴클레오타이드의 6개의 조합을 교대로 사용하여 수행될 수 있다(즉, 제1 조합이 제2 조합에 의해 대체되고, 제2 조합이 제3 조합에 의해 대체되며, 제3 조합이 제4 조합에 의해 대체되고, 제4 조합이 제5 조합에 의해 대체되며, 제5 조합이 제6 조합에 의해 대체되도록). 이 경우, 그리고 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산과의 상호작용의 모니터링이 결합 상호작용을 확인하는 신호를 생성할 때, 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 양성 결합 신호를 생성하는 3개의 상이한 뉴클레오타이드 조합에 공통인 뉴클레오타이드로서 확인될 수 있다.
검사 단계 동안 하나를 초과하는 뉴클레오타이드를 사용하는 하나의 이점은 결합에 의한 시퀀싱 절차에서 주형 절차를 확립하는 데 사용될 수 있는 확인 증거에 관한 것이다. 하나 또는 또 다른 이유로 인해, 단일의 특정 검사 단계가 결합 상호작용을 나타내는 중간의 신호만을 생성할 때, 뉴클레오타이드의 하나를 초과하는 조합에서 동일한 뉴클레오타이드를 사용하여 수행된 시험은 각각의 특정 뉴클레오타이드에 대해 2회 이상 결합 상호작용을 검출할 기회를 제공한다. 이것은 모니터링 단계에서 잘못되게 낮거나 위음성 결과의 발생 정도를 감소시킴으로써 정확한 염기 호출을 향상시킨다.
중합효소
개시된 기술을 수행하는 데 사용될 수 있는 중합효소는 자연발생 중합효소 및, 비제한적으로, 돌연변이체, 재조합체, 융합체, 유전적 변형체, 화학적 변형체, 합성체, 및 유사체를 포함하는 이의 임의의 변형된 변이체를 포함한다. 자연발생 중합효소 및 이의 변형된 변이체는 중합 반응을 촉매하는 능력을 보유하는 중합효소에 제한되지 않는다. 선택적으로, 자연발생 및/또는 이의 변형된 변이체는 중합 반응을 촉매하는 능력을 보유한다. 선택적으로, 자연발생 및/또는 변형된 변이체는 핵산에 대한 향상된 결합 친화성, 핵산에 대한 감소된 결합 친화성, 향상된 촉매 작용 속도, 감소된 촉매 작용 속도 등을 포함하는 DNA를 시퀀싱하는 이들의 능력을 향상시키는 특별한 특성을 갖는다. 돌연변이체 중합효소는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산(자연 또는 비자연발생)으로 대체된 중합효소, 및 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 결실을 포함한다.
변형된 중합효소는 외부 태그(예컨대, 외인성의 검출 가능한 표지)를 함유하는 중합효소를 포함하며, 이는 중합효소의 존재 및 상호작용을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 선택적으로, 중합효소로부터의 내재적 신호가 이들의 존재 및 상호작용을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 제공된 방법은 중합효소로부터의 내재적 신호의 검출을 통해 중합효소, 뉴클레오타이드 및 주형 핵산의 상호작용을 모니터링하는 단계를 포함할 수 있다. 선택적으로, 내재적 신호는 광 산란 신호이다. 예를 들어, 내재적 신호는 트립토판과 같은 특정 아미노산의 천연 형광을 포함하며, 중합효소로부터의 내재적 신호의 변화는 삼성분 복합체의 형성을 나타낼 수 있다.
선택적으로, 검사 단계 동안 사용된 중합효소는 표지되지 않은 중합효소이며, 모니터링은 중합효소와 관련된 외인성의 검출 가능한 표지의 부재하에 수행된다. 일부 변형된 중합효소 또는 자연발생 중합효소는 특정 반응 조건하에 단일 뉴클레오타이드만을 도입시킬 수 있고, 단일 뉴클레오타이드의 도입 후에 프라이머-주형에 결합된 상태를 유지할 수 있다. 선택적으로, 중합효소의 엄지(thumb) 및 핑거(finger) 도메인은 중합효소의 폐쇄된 형태에서 이들의 물리적 근접성으로 인해 일시적 또는 공유성 가교를 형성할 수 있다. 가교는, 예를 들어 엄지 및 핑거 도메인 상의 적합한 위치에서 천연 또는 조작된 시스테인에 의해 형성될 수 있다.
선택적으로, 검사 단계 동안 사용된 중합효소는 중합효소가 단백질 단리 기술을 사용하여 적어도 부분적으로 정제된 후에 공유 결합에 의해 중합효소의 구조에 화학적으로 연결된 외인성의 검출 가능한 표지(예컨대, 형광 표지)를 포함한다. 예를 들어, 외인성의 검출 가능한 표지는 중합효소의 자유 설프하이드릴 또는 자유 아민 모이어티를 사용하여 중합효소에 화학적으로 결합될 수 있다. 이것은 시스테인 잔기의 측쇄를 통해, 또는 N-말단의 유리 아미노 기를 통해 중합효소에 대한 화학적 결합을 포함할 수 있다. 특정 바람직한 구현예에서, 중합효소에 부착된 형광 표지는 중합효소의 위치를 결정하는데 유용한데, 그것은 고정화된 프라이밍된 주형 핵산에 상응하는 어레이 상의 스팟에 국소화되었는지 여부를 결정하는데 중요할 수 있기 때문이다. 형광 신호는 임의의 뉴클레오타이드에 결합한 결과로서 흡수 또는 방출 특성을 변화시킬 필요가 없고, 바람직하게는 변화시키지 않는다. 달리 말하면, 표지된 중합효소에 의해 방출된 신호는 가능한 다음의 정확한 뉴클레오타이드로서 조사되는 임의의 뉴클레오타이드의 존재 및 부재하에 균일하게 유지된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 중합효소 및 그의 변형은 또한 서로 연결된 적어도 2개의 부분을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 예를 들어, 여기서 핵산 가닥 내로의 뉴클레오타이드의 중합을 촉매할 수 있는 펩타이드를 포함하는 하나의 부분이 리포터 효소 또는 진행도 변형 도메인과 같은 제2 모이어티를 포함하는 또 다른 부분에 연결된다. 예를 들어, T7 DNA 중합효소는 핵산 중합 도메인 및 티오레독신 결합 도메인을 포함하며, 티오레독신 결합은 중합효소의 진행도를 향상시킨다. 티오레독신 결합이 없으면, T7 DNA 중합효소는 단지 하나 내지 몇 개의 염기의 진행도를 갖는 분배성 중합효소이다. DNA 중합효소는 세부적으로 다르지만, 이들은 핑거, 손바닥, 및 엄지로 불리는 특정 영역을 갖는 손의 유사한 전체적인 모양; 및 핵산의 합성 동안 엄지 및/또는 핑거 도메인의 이동을 포함하는 유사한 전체적인 구조 전이를 갖는다.
DNA 중합효소는, 비제한적으로, 박테리아 DNA 중합효소, 진핵 DNA 중합효소, 고세균 DNA 중합효소, 바이러스 DNA 중합효소 및 파아지 DNA 중합효소를 포함한다. 박테리아 DNA 중합효소는 E. coli DNA 중합효소 I, II 및 III, IV 및 V, E. coli DNA 중합효소의 클레나우 단편, 클로스트리듐 스테르코라리움(Cst) DNA 중합효소, 클로스트리듐 써모셀럼(Cth) DNA 중합효소 및 설폴로부스 솔파타리쿠스(Sso) DNA 중합효소를 포함한다. 진핵 DNA 중합효소는 DNA 중합효소 α, β, γ, δ, ε, η, ζ, λ, σ, μ, 및 κ뿐만 아니라 Revl 중합효소(말단 데옥시시티딜전이효소) 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT)를 포함한다. 바이러스 DNA 중합효소는 T4 DNA 중합효소, phi-29 DNA 중합효소, GA-l, phi-29-유사 DNA 중합효소, PZA DNA 중합효소, phi-15 DNA 중합효소, Cpl DNA 중합효소, Cp7 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, 및 T4 중합효소를 포함한다. 다른 DNA 중합효소는 내열성 및/또는 호열성 DNA 중합효소, 예컨대 써머스 아쿠아티쿠스(Taq) DNA 중합효소, 써머스 필리포르미스(Tfi) DNA 중합효소, 써모코커스 질리지(Tzi) DNA 중합효소, 써머스 써모필러스(Tth) DNA 중합효소, 써머스 플라부수(Tfl) DNA 중합효소, 피로코커스 외세이(Pwo) DNA 중합효소, 피로코커스 푸리오수스(Pfu) DNA 중합효소 및 터보 Pfu DNA 중합효소, 써모코커스 리토랄리스(Tli) DNA 중합효소, 피로코커스 종 GB-D 중합효소, 써모토가 마리티마(Tma) DNA 중합효소, 바실러스 스테아로써모필러스(Bst) DNA 중합효소, 피로코커스 코다카라엔시스(KOD) DNA 중합효소, Pfx DNA 중합효소, 써모코커스 종 JDF-3(JDF-3) DNA 중합효소, 써모코커스 고르고나리우스(Tgo) DNA 중합효소, 써모코커스 아시도필리움 DNA 중합효소; 설폴로부스 아시도칼다리우스 DNA 중합효소; 써모코커스 종 9°N-7 DNA 중합효소; 피로딕티움 오쿨툼 DNA 중합효소; 메타노코커스 볼타에 DNA 중합효소; 메타노코커스 써모아우토트로피쿰 DNA 중합효소; 메타노코커스 잔나쉬 DNA 중합효소; 데설푸로코커스 균주 TOK DNA 중합효소(D. Tok Pol); 피로코커스 아비시 DNA 중합효소; 피로코커스 호리코쉬 DNA 중합효소; 피로코커스 이슬란디쿰 DNA 중합효소; 써모코커스 푸미콜란스 DNA 중합효소; 애로피룸 페르닉스 DNA 중합효소; 및 이종이량체성 DNA 중합효소 DP1/DP2로부터 단리된 DNA 중합효소를 포함한다. 조작되고 변형된 중합효소는 또한 개시된 기술과 관련하여 유용하다. 예를 들어, 매우 호열성인 해양 고세균 써모코커스 종 9°N의 변형된 형태(예컨대, New England BioLabs Inc.; Ipswich, MA로부터의 Therminator DNA 중합효소)가 사용될 수 있다. 3PDX 중합효소를 포함하는 또 다른 유용한 DNA 중합효소가 미국 제8,703,461호에 개시되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전체가 참조로 포함되어 있다.
RNA 중합효소는, 비제한적으로, 바이러스 RNA 중합효소, 예컨대 T7 RNA 중합효소, T3 중합효소, SP6 중합효소, 및 Kll 중합효소; 진핵 RNA 중합효소, 예컨대 RNA 중합효소 I, RNA 중합효소 II, RNA 중합효소 III, RNA 중합효소 IV, 및 RNA 중합효소 V; 및 고세균 RNA 중합효소를 포함한다.
역전사효소는, 비제한적으로, 인간 면역결핍 바이러스 유형 1로부터의 HIV-1 역전사효소(PDB 1HMV), 인간 면역결핍 바이러스 유형 2로부터의 HIV-2 역전사효소, 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스로부터의 M-MLV 역전사효소, 조류 골수아세포증 바이러스로부터의 AMV 역전사효소, 및 진핵 염색체의 텔로미어를 유지하는 텔로머라아제 역전사효소를 포함한다.
선택적으로, 중합효소는 화학발광 태그로 태깅되며, 폐쇄된 복합체 형성은 적절한 발광 촉발자의 존재하에 안정적인 발광 신호로서 모니터링된다. 부정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소와 주형 핵산과의 불안정적인 상호작용은 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 형성된 삼성분 복합체와 비교하여 측정가능하게 더 약한 신호를 초래한다. 또한, 발광을 촉발하기 전에 선택적인 세척 단계는 안정적인 삼성분 복합체에서 결합되지 않은 실질적으로 모든 중합효소 분자를 제거할 수 있다.
선택적으로, 중합효소는 광학 산란 태그로 태깅되며, 삼성분 복합체 형성은 안정적인 광학 산란 신호로서 모니터링된다. 부정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소와 핵산과의 불안정적인 상호작용은 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 형성된 삼성분 복합체와 비교하여 측정가능하게 더 약한 신호를 초래한다.
선택적으로, 중합효소는 플라즈몬 나노입자 태그로 태깅되며, 삼성분 복합체 형성은 삼성분 복합체의 부재 또는 부정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 삼성분 복합체의 존재하에 플라즈몬 공명과 상이한 플라즈몬 공명의 이동으로서 모니터링된다. 플라즈몬 공명의 변화는 삼성분 복합체에서 국소 유전체(dielectric) 환경의 변화 때문일 수 있거나, 또는 그것은 클론적으로 증폭된 핵산 분자의 클러스터 상의 플라즈몬 나노입자의 동시 응집 또는 폐쇄된 복합체 배열에서 플라즈몬에게 상이하게 영향을 미치는 또 다른 수단 때문일 수 있다.
선택적으로, 중합효소는 라만 산란 태그로 태깅되며, 삼성분 복합체 형성은 안정적인 라만 산란 신호로서 모니터링된다. 부정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소와 핵산과의 불안정적인 상호작용은 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 형성된 삼성분 복합체와 비교하여 측정가능하게 더 약한 신호를 초래한다.
선택적으로, 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드에 대해 높은 친화성을 갖도록 선택되거나 변형된 중합효소 상의 태그에 의해 확인되며, 중합효소는 주형 핵산에 결합하기 전에 뉴클레오타이드에 결합한다. 예를 들어, 아프리카 돼지 열병 바이러스로부터의 DNA 중합효소 X는 변경된 기질 결합 순서를 가지며, 중합효소는 먼저 뉴클레오타이드에 결합한 다음, 주형 핵산에 결합한다. 선택적으로, 중합효소는 별도의 구획에서 각각의 유형의 뉴클레오타이드와 인큐베이션되며, 각각의 구획은 상이한 유형의 뉴클레오타이드를 함유하고 중합효소는 그것이 인큐베이션되는 뉴클레오타이드에 따라 태그로 상이하게 표지된다. 이러한 조건에서, 표지되지 않은 뉴클레오타이드는 상이하게 표지된 중합효소에 결합한다. 중합효소는 각각의 뉴클레오타이드 유형에 결합된 동일한 종류의 중합효소 또는 각각의 뉴클레오타이드 유형에 결합된 상이한 중합효소일 수 있다. 차별적으로 태깅된 중합효소-뉴클레오타이드 복합체는 시퀀싱 반응의 임의의 단계에 동시에 첨가될 수 있다. 각각의 중합효소-뉴클레오타이드 복합체는 다음의 염기가 중합효소-뉴클레오타이드 복합체 내의 뉴클레오타이드에 상보적인 주형 핵산에 결합한다. 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드를 갖는 중합효소 상의 태그에 의해 확인된다. 표지된 중합효소-뉴클레오타이드 복합체에 의한 다음의 주형 염기의 조사는 비도입 및/또는 검사 조건하에 수행될 수 있고, 다음의 주형 염기의 실체에이 결정되면, 복합체는 불안정화되고 제거되고, 격리되고/되거나 희석되며, 하나의 뉴클레오타이드만이 도입되는 것을 보장하는 방식으로 별도의 도입 단계가 수행된다.
검출 가능한 태그를 중합효소 상에 도입하는 일반적인 방법은 중합효소의 비활성 영역에 존재하는 아민 또는 시스테인에 대한 화학적 접합을 포함한다. 이러한 접합 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 비제한적인 예로서, n-하이드록시석신이미드 에스테르(NHS 에스테르)는 효소 상에서 발견될 수 있는 아민 기를 표지하는데 일반적으로 사용된다. 시스테인은 티올 또는 말레이미드 기와 쉽게 반응하는 반면, 카르복실 기는 이들을 EDC(1-에틸-3-[3- 디메틸아미노프로필]카르보디이미드 하이드로클로라이드)를 이용하여 활성화시킴으로써 아민과 반응할 수 있다. 선택적으로, N-하이드록시석신이미드(NHS) 화학이 N-말단 아민만이 반응하는 pH 범위(예를 들어, pH 7)에서 사용되어, 중합효소당 단일 태그만이 부가된다.
선택적으로, 중합효소에 부착된 태그는 전하 태그이므로, 안정적인 삼성분 복합체의 형성은 주형 핵산 주위의 국소 전하 밀도의 변화를 측정함으로써 전기적 수단에 의해 검출될 수 있다. 전기적 전하를 검출하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 그 중에서도 전계 효과 트랜지스터, 유전체 분광법, 임피던스 측정, 및 pH 측정과 같은 방법을 포함한다. 전계 효과 트랜지스터는, 비제한적으로, 이온 감응형 전계 효과 트랜지스터(ISFET), 전하 변조 전계 효과 트랜지스터, 절연된 게이트 전계 효과 트랜지스터, 산화금속 반도체 전계 효과 트랜지스터 및 반도체 단일 벽 탄소 나노튜브를 사용하여 제작된 전계 효과 트랜지스터를 포함한다.
선택적으로, 전하 태그는 약 4 미만 또는 약 10 초과의 등전점을 갖는 펩타이드 태그이다. 선택적으로, 펩타이드 태그를 포함하는 중합효소는 약 5 미만 또는 약 9 초과의 총 등전점을 갖는다. 전하 태그는 양으로 또는 음으로 하전된 임의의 모이어티일 수 있다. 전하 태그는 질량 및/또는 염료와 같은 표지를 포함하는 추가의 모이어티를 포함할 수 있다. 선택적으로, 전하 태그는 pH의 변화와 같은 특정 반응 조건하에서만 양 또는 음 전하를 갖는다.
중합효소는 선택적으로 형광단 및/또는 ?처로 표지될 수 있다. 선택적으로, 핵산은 형광단 및/또는 ?처로 표지된다. 선택적으로, 하나 이상의 뉴클레오타이드는 형광단 및/또는 ?처로 표지된다. 예시적인 형광단은, 비제한적으로, 형광 나노결정; 양자 점; 디클로로[R110], 디클로로[R6G], 디클로로[TAMRA], 디클로로[ROX] 등을 포함하는 d-로다민 수용체 염료; 플루오레세인, 6-FAM, 등을 포함하는 플루오레세인 공여체 염료; Cy3B와 같은 시아닌 염료; 알렉사 염료, SETA 염료, 아토 염료, 예컨대 Cy3B 등과 FRET 쌍을 형성하는 atto 647N을 포함한다. 형광단은, 비제한적으로, MDCC(7-디에틸아미노-3-[([(2-말레이미딜)에틸]아미노)카르보닐]쿠마린), TET, HEX, Cy3, TMR, ROX, 텍사스 레드(Texas Red), Cy5, LC 레드 705 및 LC 레드 640을 포함한다. 형광단 및 중합효소 및 다른 분자에의 부착을 포함하는 이들의 사용 방법은 문헌[The Molecular Probes® Handbook(Life Technologies, Carlsbad Calif.) 및 and Fluorophores Guide(Promega, Madison, WI)]에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다. 예시적인 ?처는, 비제한적으로, ZEN, IBFQ, BHQ-1, BHQ-2, DDQ-I, DDQ-11, Dabcyl, Qxl ?처, Iowa Black RQ, 및 IRDye QC-1을 포함한다.
선택적으로, 형태적으로 민감한 염료는 중합효소의 중합능 또는 충실도에 영향을 미치지 않으면서 중합효소의 활성 부위에 근접하게 부착될 수 있고; 삼성분 복합체의 형성으로 인한 형태의 변화, 또는 극성 환경의 변화가 염료의 형광 또는 흡광도 특성의 변화로서 반영된다. cy3 및 플루오레세인과 같은 일반적인 형광단은 삼성분 복합체의 형성이 이원 중합효소-핵산 복합체와 명확히 구별될 수 있을 정도로, 중합효소 결합 및 삼성분 복합체 형성에 대해 강한 솔바토그로마틱(solvatochromatic) 반응을 갖는 것으로 알려져 있다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 형태적으로 민감한 염료로부터의 형광 또는 흡광도 신호의 차이에 기초하여 이성분 복합체와 구별될 수 있다. 선택적으로, 솔바토그로마틱 염료는 형태 전이를 모니터링하는 데 사용될 수 있고; 형태 변화에 의해 유도된 국소적인 극성 환경의 변화는 리포터 신호로서 사용될 수 있다. 솔바토그로마틱 염료는, 비제한적으로, 라이차트(Reichart) 염료, IR44, 메로시아닌 염료(예컨대, 메로시아닌 540), 4-[2-N-치환된-1,4-하이드로피리딘-4-일리딘)에틸리덴]사이클로헥사-2,5-디엔-1-온, 레드 피라졸론 염료, 아조메틴 염료, 인도아닐린 염료, 디아자메로시아닌 염료, 인디고에 의해 예시된 바와 같은 인디고이드 염료 등뿐만 아니라 이의 혼합물을 포함한다. 중합효소의 특정 부위에 염료 또는 형광단을 도입하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 비제한적인 예로서, T7 DNA 중합효소를 염료로 부위 특이적으로 표지화하는 절차는 문헌[in Yu-Chih Tsai, Zhinan Jin, and Kenneth A. Johnson, "Site-Specific Labeling of T7 DNA Polymerase with a Conformationally Sensitive Fluorophore and Its Use in Detecting Single-Nucleotide Polymorphisms," Analytical Biochemistry 384, no. 1 (January 1, 2009): 136-44]에 제공되며, 이는 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
선택적으로, 중합효소는 반응을 방해하지 않고 삼성분 복합체 형성을 감지할 수 있는 위치에서 형광단으로 태깅된다. 중합효소는 천연 또는 변형된 중합효소일 수 있다. 변형된 중합효소는 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 부가, 및/또는 결실을 갖는 것을 포함한다. 선택적으로, 전부가 아닌 하나 이상의 시스테인 아미노산은 알라닌과 같은 또 다른 아미노산으로 돌연변이된다. 이 경우, 나머지 하나 이상의 시스테인은 형광단에의 부위 특이적 접합에 사용된다. 대안적으로, 하나 이상의 아미노산은 시스테인 또는 일차 아민을 포함하는 아미노산과 같은 형광단 접합에 적합한 반응성 아미노산으로 돌연변이된다.
선택적으로, 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소 및 주형 핵산 사이의 결합은 형광의 감소를 유도할 수 있는 반면, 부정확한 뉴클레오타이드와의 결합은 형광의 증가를 유발한다. 정확한 뉴클레오타이드 존재하에 중합효소 및 주형 핵산 사이의 결합은 형광의 증가를 유도할 수 있는 반면, 부정확한 뉴클레오타이드와의 결합은 형광의 감소를 유발한다. 형광 신호는 뉴클레오타이드 유도 형태 변화의 동역학을 모니터링하고 주형 핵산 서열 내의 다음의 염기를 확인하는 데 사용될 수 있다.
선택적으로, 중합효소/핵산 상호작용은 중합효소 또는 중합효소에 부착된 태그, 예를 들어, 나노입자 태그로부터 비롯되는 산란 신호에 의해 모니터링될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 중합효소는 본원에 기재된 시퀀싱 방법의 검사 단계 동안 삼성분 복합체 형성 및/또는 안정화를 촉진하도록 변형될 수 있다. 따라서, 변형된 중합효소는 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 중합효소의 변형은 삼성분 복합체 내의 구성원을 가교제로 가교시키는 것 또는 중합효소 내에 디설파이드 결합을 형성시켜 삼성분 복합체를 유지하는 것을 포함할 수 있다 .
선택적으로, 시스테인 잔기는 삼성분 복합체가 형성될 때, 시스테인이 근접하여 적어도 하나의 디설파이드 결합을 형성하여 폐쇄된 형태에 중합효소를 트랩하도록 위치한다. 선택적으로, 중합효소의 핑거 및 엄지 도메인은 각각 하나 이상의 시스테인을 함유하도록 조작되어, 폐쇄된 복합체에서, 반대편 핑거 상의 시스테인이 상호작용하여 디설파이드 결합을 형성하고 중합효소를 그의 폐쇄된 형태에 트랩한다. 디설파이드 결합 형성을 유도하기 위해 중합효소 상의 적합한 위치에 시스테인을 도입하는 것은 단백질 공학 분야의 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 2-머캅토에탄올(BME), 시스테인-HCl, 디티오트레이톨(DTT), 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀(TCEP), 또는 이의 임의의 조합과 같은 환원제가 디설파이드 결합을 감소시키고 중합효소를 방출시키는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드는 시스테인 변형된 중합효소와 함께 별도의 검사 단계에서 한 번에 하나씩 연속으로 부가되며, 삼성분 복합체 형성 및/또는 안정화에 유리한 추가의 검사 반응 조건에 대한 필요는 선택적이다. 선택적으로, 1, 2, 3, 4개 이상의 뉴클레오타이드가 시스테인 변형된 중합효소와 함께 하나의 검사 단계에서 조합(예컨대, dATP, dTTP, dCTP, 및 dGTP)으로 부가되며, 삼성분 복합체 형성 및/또는 안정화에 유리한 추가의 검사 반응 조건에 대한 필요는 선택적이다.
선택적으로, 시스테인 변형된 중합효소는 삼성분 복합체를 형성하면서 정확한 뉴클레오타이드를 도입하지 않고 주형 핵산에 결합한다. 삼성분 복합체에 있는 동안, 중합효소의 시스테인은 적어도 하나의 디설파이드 결합을 형성하기 위해 공간에서 충분히 근접하여, 삼성분 복합체를 안정화시킨다. 이 예에서, 중합효소는 트랩되고 뉴클레오타이드 도입이 방지된다.
선택적으로, 검사 반응 혼합물 중에 존재하는 뉴클레오타이드는 다음의 정확한 뉴클레오타이드이며, 시스테인 변형된 중합효소는 주형 핵산에 결합하고 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 도입하여 삼성분 복합체를 형성하며; 폐쇄된 복합체에 있는 동안, 중합효소의 시스테인은 적어도 하나의 디설파이드 결합을 형성하기 위해 공간에 충분히 근접하여, 삼성분 복합체를 안정화시킨다. 삼성분 복합체 안정화 및 모니터링 후, 도입 단계가 수행될 수 있고, 환원제가 디설파이드 결합을 파괴하여, 삼성분 복합체로부터 중합효소를 방출한다. 이후, 환원제는 제거, 희석, 또는 격리되고, 또 다른 검사 단계가 수행될 수 있다.
선택적으로, 디설파이드 안정화된 삼성분 복합체의 뉴클레오타이드는 삼성분 복합체의 안정화 이전에 또는 안정화 동안에 도입된다. 도입 단계는 후속 뉴클레오타이드 도입 및/또는 추가의 검사 단계를 허용하기 위해 디설파이드 결합을 환원시킴으로써 수행될 수 있다.
선택적으로, 검사 단계 동안 하나의 뉴클레오타이드가 반응 혼합물에 부가된다. 선택적으로, 검사 단계 동안 1, 2, 3, 4개 이상의 뉴클레오타이드가 반응 혼합물에 부가된다. 선택적으로, 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 삼성분 복합체 내에 봉입된다. 선택적으로, 부정확한 뉴클레오타이드가 삼성분 복합체 내에 봉입된다.
선택적으로, 중합효소는 삼성분 복합체의 형성 후에 그 자신과 디설파이드 결합을 형성할 수 있다. 중합효소는 삼성분 복합체의 형성 이후 프라이밍된 주형 핵산에 대해 디설파이드 결합을 형성할 수 있다. 삼성분 복합체는 다음의 염기에 염기쌍을 형성되고/되거나 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머에 도입된 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 부정확한 뉴클레오타이드를 포함하며, 다음의 염기에의 결합 및/또는 도입은 약화된다.
선택적으로, 중합효소는 삼성분 복합체의 중합 효소를 포함하는 가교 방법을 통해 안정화된다. 가교 방법은 가역적일 필요가 없는데, 중합효소가 효소적 또는 화학적 절단, 변성 또는 이의 임의의 조합과 같은 다른 수단을 사용하여 핵산에 결합하지 않을 수 있기 때문이다. 변성제는, 비제한적으로, 산, 예컨대 아세트산, 또는 트리클로로아세트산; 용매, 예컨대 에탄올 또는 메탄올; 카오트로픽 제제, 예컨대 우레아, 구아니디늄 클로라이드, 과염소산리튬; 계면활성제, 예컨대 나트륨 도데실 설페이트; 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 화학적 절단은 천연, 변형된, 또는 상업적으로 이용가능한 프로테아제 중 하나 이상의 사용을 포함한다. 가교된 중합효소를 방출시키기 위한 추가의 방법은, 비제한적으로, pH, 온도, 이온 강도, 또는 이의 임의의 조합을 변경하는 것을 포함한다.
삼성분 복합체는 반응의 검사 단계 동안 봉입된 뉴클레오타이드의 도입 없이 형성된다. 선택적으로, 임의의 시점에 검사 반응 혼합물은 가교제를 포함하며, 삼성분 복합체는 가교된다. 이 예에서, 중합효소는 트랩되며 뉴클레오타이드 도입이 방지된다. 선택적으로, 검사 반응 혼합물 중에 존재하는 뉴클레오타이드는 다음의 정확한 뉴클레오타이드이며, 중합효소는 주형 핵산에 결합하고 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 도입하여 삼성분 복합체를 형성하며; 삼성분 복합체에 있는 동안, 가교제가 삼성분 복합체를 트랩하는 데 이용가능하다. 삼성분 복합체 안정화 및 모니터링 이후, 도입 단계가 수행될 수 있고, 삼성분 복합체가 그의 폐쇄된 형태로부터 방출된다. 선택적으로, 삼성분 복합체가 형성되고, 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 주형 핵산 프라이머 내로 도입된다. 가교는 중합효소가 다음의 염기 위치로 전좌하는 것을 억제하고, 다음의 뉴클레오타이드는 중합효소가 더 이상 가교되지 않을 때까지 부가될 수 없다. 선택적으로, 가교된 안정화된 삼성분 복합체의 뉴클레오타이드는 삼성분 복합체의 안정화 이전 또는 안정화 동안에 도입된다. 도입 단계는 후속 뉴클레오타이드 도입 및/또는 추가의 검사 단계를 허용하기 위해 결합을 절단하고/하거나 중합효소를 변성시킴으로써 수행될 수 있다.
선택적으로, 중합효소는 삼성분 복합체의 형성 이후에 그 자신에 가교될 수 있다. 따라서, 중합효소는 삼성분 복합체의 형성 이후 프라이밍된 주형 핵산에 가교될 수 있다. 삼성분 복합체는 다음 염기에 염기쌍을 형성하고/하거나 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머에 도입된 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 부정확한 뉴클레오타이드를 포함하고, 다음의 염기에의 결합 및/또는 도입은 약화된다.
선택적으로, 중합효소는 이성분 복합체의 형성보다 폐쇄된 복합체의 형성에 유리하도록 변형된다. 중합효소 변형은 유전적으로 조작될 수 있다. 중합효소는 주형 핵산에 대한 이들의 선택적인 결합 친화성에 기초하여 선택될 수 있다. 중합효소는 뉴클레오타이드에 대해 높은 친화성을 갖도록 선택되거나 변형될 수 있으며, 중합효소는 주형 핵산에 결합하기 전에 뉴클레오타이드에 결합한다. 예를 들어, 아프리카 돼지 열병 바이러스로부터의 DNA 중합효소 X는 변경된 기질 결합 순서를 가지며, 중합효소가 먼저 뉴클레오타이드에 결합한 다음, 주형 핵산에 결합한다. 뉴클레오타이드에 먼저 결합하는 중합효소가 새로운 시퀀싱 체계를 개발하는 데 이용될 수 있다. 중합효소 변형은 본원에 개시된 방법에서 삼성분 복합체 내의 중합효소를 트랩하도록 설계될 수 있다. 중합효소는 영구적으로 또는 일시적으로 트랩될 수 있다.
선택적으로, 삼성분 복합체의 안정화시키는 변형된 중합효소는, 비제한적으로, 방출 시약(예컨대, 촉매성 금속 이온, 예컨대 마그네슘 또는 망간)의 존재를 포함하는, 일반적으로 삼성분 복합체를 방출시키는 반응 조건과 조합된다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 촉매성 금속 이온의 존재하에서도 안정화된다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 가교제의 존재하에서도 방출된다. 선택적으로, 폐쇄된 복합체의 안정화는 안정화 시약 및/또는 방출 시약의 농도 및/또는 실체에, 및 이의 임의의 조합에 부분적으로 의존한다. 선택적으로, 하나 이상의 변형된 중합효소를 사용한 삼성분 복합체의 안정화는, 비제한적으로, 촉매성 금속 이온을 격리, 제거, 감소, 생략, 및/또는 킬레이트화시키는 것; 중합효소 억제제, 또는 비도입가능한 뉴클레오타이드의 존재; 및 이의 임의의 조합을 포함하는, 삼성분 복합체를 안정화시키는 추가의 반응 조건과 조합된다.
중합효소 전달 시약
일 양태에서, 개시된 기술은 중합효소 및 뉴클레오타이드를 고정화된 핵산 피처(feature)의 집단에 전달하는 방법에 관한 것이며, 각각의 특징은 하나 이상의 프라이밍된 주형 핵산 분자를 포함한다. 방법은 고정화된 핵산 피처의 집단을 중합효소, 제1 뉴클레오타이드, 및 용액 중에 유리인 적어도 하나의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 포함하는 제1 시약과 접촉시키는 단계를 포함한다. 제1 시약의 제1 뉴클레오타이드는 제1 시약의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자 중 어느 것에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 아니다. 또한, 접촉 단계는 삼성분 복합체를 안정화시키고, 중합효소에 의한 포스포디에스테르 결합 형성의 촉매 작용을 억제하거나 배제하는 조건하에서 발생한다. 이 절차에 의해, 제1 시약의 상기 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자의 부재하에 중합효소 및 제1 뉴클레오타이드를 함유하는 시약의 사용과 비교하여, 이성분 복합체를 형성하기 위한 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 뉴클레오타이드 비의존적 중합효소 결합이 감소된다. 기술의 일 구현예에서, 제1 시약을 제1 시약의 동일한 유형의 중합효소, 제2 뉴클레오타이드, 및 용액 중에 유리인 적어도 하나의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 포함하는 제2 시약으로 대체하는 추가의 단계가 있다. 여기에서, 제1 및 제2 뉴클레오타이드는 서로 상이하다. 제2 뉴클레오타이드는 제2 시약의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자 중 어느 것에 대한 동족 뉴클레오타이드가 아니다. 또한, 대체 단계는 삼성분 복합체를 안정화시키고 중합효소에 의한 포스포디에스테르 결합 형성의 촉매 작용을 억제하거나 배제하는 조건하에서 발생한다. 이 경우, 제2 시약의 상기 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자의 부재하에 중합효소 및 제2 뉴클레오타이드를 포함하는 시약의 사용과 비교하여, 이성분 복합체를 형성하기 위한 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 뉴클레오타이드 비의존적 중합효소 결합이 감소된다. 선택적으로, 제1 및 제2 시약의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자는 서로 상이하다.
또 다른 양태에서, 반응 혼합물이 개시된다. 반응 혼합물은 복수의 고정화된 핵산 피처를 포함하며, 각각의 특징은 고정화된 프라이밍된 주형 핵산; 중합효소; 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자(즉, 용액 중에 자유) 및 뉴클레오타이드를 포함한다. 뉴클레오타이드는 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 동족 뉴클레오타이드가 아니다. 또한, 이성분 복합체를 형성하기 위한 고정화된 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합효소의 뉴클레오타이드 비의존적 결합은 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자의 존재에 의해 감소된다. 일 바람직한 구현예에서, 중합효소, 고정화된 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드는 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 내로의 뉴클레오타이드의 도입이 억제되거나 배제된 안정화된 삼성분 복합체를 형성한다.
또 다른 양태에서, 중합효소; 적어도 하나의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자; 및 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 포함하는 중합효소 전달 시약이 개시된다. 여기에서, 뉴클레오타이드 중 어느 것도 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자 중 어느 것에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 아니다. 선택적으로, 중합효소 전달 시약은 용액상 중합효소에 의한 포스포디에스테르 결합 형성을 억제하는 삼성분 복합체 안정화제를 추가로 포함한다. 선택적으로, 적어도 하나의 뉴클레오타이드는 적어도 하나의 천연 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 용액상 프라이밍된 주형 핵산 분자는 각각 상이한 3' 말단 뉴클레오타이드를 갖는 3종 이하의 상이한 유형의 프라이밍된 주형 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 중합효소는 선택적으로 Mg2+ 이온의 존재하에 촉매성 포스포디에스테르 결합 형성 활성이 없는 돌연변이체 중합효소이다.
삼성분 복합체를 안정화시키는 중합효소 억제제의 사용
삼성분 복합체는 검사 반응 혼합물에 중합효소 억제제를 첨가함으로써 형성되고/되거나 안정화될 수 있다. 억제제 분자 포스포노아세테이트(포스포노아세트산) 및 포스포노포르메이트(포스포노포름산, 일반명 포스카르네트(Foscarnet)), 수라민(Suramin), 아미노글리코시드, INDOPY-1 및 타게티톡신(Tagetitoxin)이 중합효소 활성의 경쟁력 없는 또는 비경쟁적 억제제의 비제한적인 예이다. 효소의 활성 부위 근처에서 억제제 분자의 결합은, 뉴클레오타이드 도입 사이클의 사전-전좌 또는 사후-전좌 단계에서 중합효소를 트랩하여, 뉴클레오타이드의 도입 이전 또는 이후에 그의 삼성분 복합체 형태에서 중합효소를 안정화시키고, 억제제 분자가 제거, 희석 또는 킬레이트화에 의해 반응 혼합물에서 이용가능하지 않을 때까지 중합효소를 주형 핵산에 결합시킨다.
따라서, 프라이머로 프라이밍된 주형 핵산 분자를 제공하는 단계; 프라이밍된 주형 핵산 분자를 중합효소, 중합효소 억제제 및 적어도 하나의 표지되지 않은 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 제1 반응 혼합물과 접촉시키는 단계; 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로 뉴클레오타이드의 도입 없이 표지되지 않은 뉴클레오타이드 분자의 존재하에 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자의 상호작용을 모니터링하는 단계; 및 모니터링된 상호작용에 의해 프라이밍된 주형 핵산 분자의 다음의 염기에 상보적인 뉴클레오타이드를 확인하는 단계를 포함하는 검사 단계를 포함하는, 주형 핵산 분자를 시퀀싱하는 방법이 제공된다. 중합효소 억제제는 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머 내로 표지되지 않은 뉴클레오타이드 분자의 도입을 방지한다. 선택적으로, 억제제는 비경쟁적 억제제, 알로스테릭 억제제, 또는 경쟁력 없는 알로스테릭 억제제이다. 선택적으로, 중합효소 억제제는 중합효소 내의 촉매성 이온 결합 부위와 경쟁한다.
아미노글리코시드는 클레나우 중합효소 내의 마그네슘 결합 부위를 대체함으로써 중합효소 활성을 비경쟁적으로 억제한다. 뉴클레오타이드 결합에 관한 상호작용의 비경쟁적 성질은 중합효소가 주형 핵산 및 뉴클레오타이드와 상호작용하게 하여, 뉴클레오타이드 도입의 촉매 단계에만 영향을 미친다.
하나의 억제제 분자는 HIV-1 역전사효소에 대한 비경쟁적 억제제로서 작용하는 에파비렌즈(Efavirenz) 약물이다. 상기 약물은 중합효소의 폐쇄된 복합체 배열에 대해 높은 친화성 및 낮은 오프-레이트를 가지므로, 중합효소가 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 도입하면, 약물이 중합효소에 결합하여, 중합효소가 후속 뉴클레오타이드의 결합 및/또는 도입을 허용하기 위해 그의 핑거를 개방하는 것을 방지한다. 이성분 복합체의 형성보다 삼성분 복합체 형성에 유리한 조건하에 반응이 발생하면, 비특이적 중합효소-주형 핵산 상호작용이 제거될 수 있고, 중합효소의 결합은 부가된 뉴클레오타이드가 주형 상의 다음의 염기에 상보적이라는 것을 의미한다. 검사 반응 조건하에 반응이 발생하면, 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 함유하는 주형 핵산에 대한 중합효소의 고친화성 결합이 중합효소와 주형 핵산과의 무작위적 비특이적 상호작용으로부터 삼성분 복합체를 구별하는 데 사용될 수 있다. 선택적으로, 고친화성 중합효소 결합은 뉴클레오타이드 도입을 나타내며, 별도의 도입 단계가 필요하지 않다. 중합효소가 결합하고 결합이 검출되면, 과량의 뉴클레오타이드 및 중합효소는 반응 혼합물로부터 제거되거나 격리될 수 있다. 다음의 뉴클레오타이드는 검사 반응 조건하에 부가될 수 있고, 원하는 리드 길이의 시퀀싱이 완료될 때까지, 모든 뉴클레오타이드 유형에 대해 또는 무작위 또는 미리 결정된 순서로, 과정이 주기적으로 반복된다.
임의의 중합효소가 선택될 수 있고, 적합한 비경쟁적 억제제가 고처리량 스크리닝(HTS) 과정을 사용하여 밝혀질 수 있다. 중합효소 억제제에 대한 HTS 과정의 많은 예가 문헌에서 발견되며, 특정 스크리닝 기준은 비경쟁적 중합효소 억제제에 대한 것이다. 일반적인 개념으로서, 이들 억제제는 중합효소가 그의 폐쇄된 형태일 때에만 노출되는 결합 부위를 갖도록 스크리닝될 수 있고, 이들은 높은 친화성 및 매우 낮은 오프-레이트로 결합하므로, 억제제의 결합은 폐쇄된 형태에서 중합효소를 안정화시킨다. 이러한 억제제는 단일 염기의 도입을 허용하고, 이후, 억제제의 결합은 중합효소가 또 다른 뉴클레오타이드를 수용하기 위해 개방되는 것을 방지한다. 전체 시스템은 시퀀싱 반응에서 다음 단계(검사 또는 도입)를 개시하기 전에, 중합 효소를 포함하여 씻겨 내려갈 수 있다.
선택적으로, HIV-1 역전사효소 중합효소를 억제하는데 효과적인 것으로 밝혀진 중합효소 억제제가 삼성분 복합체를 안정화시키는데 사용된다. 선택적으로, 억제제는 HIV-2 역전사효소의 억제제이다. HIV-1 역전사효소 억제제는 뉴클레오사이드/뉴클레오타이드 역전사효소 억제제(NRTI) 및 비뉴클레오사이드 역전사효소 억제제(NNRTI)를 포함한다. NRTI는, 비제한적으로, COMBIVIR(라미부딘 및 지도부딘; GlaxoSmithKline, Middlesex, UK), EMTRIVA(엠트리시타빈; Gilead Sciences, Foster City, CA), EPIVIR(라미부딘; GlaxoSmithKline, Middlesex, UK), EPZICOM(아바카비르 설페이트 및 라미부딘; GlaxoSmithKline, Middlesex, UK), HIVID(잘시타빈; Hoffmann-La Roche, Nutley, N.J.), RETROVIR(지도부딘; GlaxoSmithKline, Middlesex, UK), TRIZIVIR(아바카비르 설페이트, 지도부딘, 라미부딘; GlaxoSmithKline, Middlesex, UK), TRUVADA(엠트리시타빈/테노포비르 디소프록실 푸마레이트; Gilead Sciences, Foster City, CA), VIDEX EC(장용 코팅된 디다노신; Bristol Myers-Squibb, New York, N.Y.), VIDEX(디다노신; Bristol Myers-Squibb, New York, N.Y.), VIREAD(테노포비르 디소프록실 푸마레이트; Gilead Sciences, Foster City, CA), ZERIT(스타부딘; Bristol Myers-Squibb, New York, N.Y.), 및 ZIAGEN(아바카비르 설페이트; GlaxoSmithKline, Middlesex, UK)을 포함한다. NNRTI의 예는, 비제한적으로, VIRAMUNE(네비라핀; Boehringer Ingelheim, Rhein, Germany), SUSTIVA(에파비렌즈, Bristol Myers-Squibb, New York, N.Y.), DELAVIRDINE(레스크립토르; Pfizer, New York, N.Y.), 및 INTELENCE(에트라비린; Tibotec Therapeutics, Eastgate Village, Ireland)를 포함한다. 선택적으로, NNRTI는 서브단위 p66 상의 RNA 중합효소 활성 부위 근처에 위치한 알로스테릭 중심에 결합하는 비경쟁적 중합효소 억제제이다.
선택적으로, HIV-1 역전사효소 중합효소 억제제는 (4/6-할로겐/MeO/EtO-치환된 벤조[d]티아졸-2-일)티아졸리딘-4-온이다. 표 1은 19개의 (4/6-할로겐/MeO/EtO-치환된 벤조[d]티아졸-2-일)티아졸리딘-4-온 억제제의 목록을 포함한다(E. Pitta et. al., Synthesis and HIV-1 RT inhibitory action of novel (4/6-substituted benzo[d]thiazol-2-yl)thiazolidin-4-ones. Divergence from the non-competitive inhibition mechanism, Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, February 2013, Vol. 28, No.1, Pages 113-122로부터 개조됨). (4/6-할로겐/MeO/EtO-치환된 벤조[d]티아졸-2-일)티아졸리딘-4-온 억제제는 하기 식을 갖는다:
중합효소 억제제 및 중합효소 돌연변이체의 임의의 적합한 조합은, 이들이 삼성분 복합체를 트랩/안정화시키고, 선택적으로, 사이클당 다수의 뉴클레오타이드 도입을 방지하는 한 사용될 수 있다.
제공된 반응 혼합물은 100 nM 내지 1 mM의 중합효소 억제제, 또는 100 nM 내지 1 mM 사이의 임의의 양의 억제제를 포함할 수 있다. 선택적으로, 제공된 반응 혼합물은 1 내지 200 μM의 중합효소 억제제 또는 그 사이의 임의의 양을 포함할 수 있다. 선택적으로, 반응 혼합물은 30 내지 150 μM의 중합효소 억제제를 포함한다. 선택적으로, 반응 혼합물은 30 내지 70 μM의 중합효소 억제제를 포함한다. 선택적으로, 반응 혼합물은 60 내지 140 μM의 중합효소 억제제를 포함한다.
선택적으로, 삼성분 복합체의 중합효소는 그의 핑거 도메인을 개방하고 피로포스페이트 유사체 또는 다른 관련된 분자를 사용하여 다음의 주형 핵산 위치로 전좌하는 것이 방지된다. 피로포스페이트 유사체는 중합효소의 활성 포켓 내의 트리포스페이트 결합 부위에 가까운 부위를 점유함으로써 삼성분 복합체 내의 중합효소를 배열한다. 피로포스페이트(PPi)의 방출은 중합효소가 개방된 형태를 취하고, 다음의 주형 핵산 위치로 전좌되고, 다음의 뉴클레오타이드를 수용하는데 중요하다. 비경쟁적 억제제, 예컨대 포스카르네트(포스포노포르메이트), 포스포노아세테이트 또는 다른 피로포스페이트 유사체는 그의 핑거 폐쇄된 형태에 중합효소를 트랩한다. 선택적으로, PPi 유사체의 결합은 가역적이며, 중합효소 활성은 반응 혼합물에서 억제제를 세척, 희석, 또는 격리함으로써 완전히 회복된다. 대체로, 중합효소 활성의 임의의 비경쟁적 억제제가 시퀀싱 반응 동안 사용될 수 있다.
선택적으로, 삼성분 복합체를 안정화시키는 중합효소 억제제는, 비제한적으로, 마그네슘 또는 망간과 같은 촉매성 금속 이온의 존재를 포함하는, 일반적으로 삼성분 복합체를 방출시키는 반응 조건과 조합된다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 촉매성 금속 이온의 존재하에서도 안정화된다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 중합효소 억제제의 존재하에서도 방출된다. 선택적으로, 삼성분 복합체의 농도, 안정화 시약의 실체에, 방출 시약의 실체에, 및 이의 임의의 조합에 부분적으로 의존한다. 선택적으로, 중합효소 억제제를 사용한 삼성분 복합체의 안정화는 비제한적으로, 촉매성 금속 이온을 격리, 제거, 감소, 생략, 및/또는 킬레이트화하는 것; 삼성분 복합체 내의 변형된 중합효소의 존재; 삼성분 복합체 내의 비도입가능한 뉴클레오타이드; 및 이의 임의의 조합을 포함하는, 삼성분 복합체를 또한 안정화시키는 기능을 하는 추가의 반응 조건과 조합된다.
삼성분 복합체를 형성하고 조작하기 위한 조건
본원에 사용된 바와 같이, 삼성분 복합체는 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드를 포함한다. 삼성분 복합체는 사전-화학 형태일 수 있고, 뉴클레오타이드는 격리되지만 도입되지 않는다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머의 3' 뉴클레오타이드 상의 화학적 차단(예컨대, 뉴클레오타이드의 염기 또는 당 상의 가역적 터미네이터 모이어티)의 존재에 의해 안정화될 수 있다. 삼성분 복합체는 사전-전좌 형태일 수 있고, 뉴클레오타이드는 프라이밍된 주형 핵산에서 프라이머의 3'-말단과의 포스포디에스테르 결합의 형성에 의해 도입된다. 삼성분 복합체는 촉매성 금속 이온의 부재하에, 또는 부족한 수준의 촉매성 금속 이온하에 형성되어, 화학적 도입 없이 중합효소 활성 부위 내에서 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 물리적으로 격리시킬 수 있다. 선택적으로, 격리된 뉴클레오타이드는 비도입가능한 뉴클레오타이드일 수 있다. 삼성분 복합체는 촉매성 금속 이온의 존재하에 형성될 수 있으며, 삼성분 복합체는 도입된 뉴클레오타이드 유사체를 포함하나 PPi는 방출될 수 없다. 이 경우, 삼성분 복합체는 사전-전좌 형태로 안정화된다. 선택적으로, 사전-전좌 형태는 가교 중합효소를 화학적으로 가교시킴으로써 안정화된다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 외부 수단에 의해 안정화될 수 있다. 일부 경우, 삼성분 복합체는 작은 분자의 알로스테릭 결합에 의해 안정화될 수 있다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 높은 친화성으로 활성 부위 근처에 결합하여 중합효소의 전좌를 방지하는, 비제한적으로, 포스포노포르메이트를 포함하는 피로포스페이트 유사체에 의해 안정화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 안정화된 삼성분 복합체는 비제한적으로, 폐쇄된 형태에서 엄지 및 핑거 도메인을 가교시키는 것, 중합효소가 개방된 형태로 되돌아가는 것을 방지하는 알로스테릭 억제제의 결합, 사전-전좌 단계에서 중합 효소를 트랩하는 피로포스페이트 유사체의 결합, 중합효소의 활성 부위에서 촉매성 금속 이온의 부재, 및 촉매성 금속 이온에 대한 대체물로서 니켈, 바륨, 주석 및 스트론튬과 같은 비촉매성 금속 이온의 첨가를 포함하는, 하나의 수단 또는 수단들의 조합에 의해 프라이밍된 주형 핵산의 중합 개시 부위(프라이머의 3'-말단)에서 트랩된 중합효소를 지칭한다. 이와 같이, 중합효소는 뉴클레오타이드의 도입 이후에도 중합 개시 부위에서 트랩될 수 있다. 따라서, 중합효소는 사전-화학 형태, 사전-ㅈ전좌 단계, 사후-전좌 단계, 또는 이의 임의의 중간 단계에서 트랩되어, 다음의 정확한 뉴클레오타이드 또는 염기의 충분한 검사 및 확인을 가능하게 할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 중합효소 기반의 결합에 의한 시퀀싱 반응은 일반적으로 프라이밍된 주형 핵산을 제공하는 단계, 중합효소 및 하나 이상의 유형의 뉴클레오타이드와 함께 프라이밍된 주형 핵산을 제공하는 단계로서, 뉴클레오타이드는 프라이밍된 주형 핵산의 다음의 염기에 상보적이거나 상보적이지 않을 수 있는 단계, 및 프라이밍된 주형 핵산으로의 뉴클레오타이드의 화학적 도입이 사전-화학 형태에서 불가능하게 되거나 심각하게 억제되거나 또는 하나 이상의 상보적 뉴클레오타이드 도입이 프라이머의 3'-말단에서 발생하는 조건하에 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산와의 상호작용을 검사하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 사전-화학 형태가 바람직하게는 안정화제 또는 3' 가역적으로 종결된 프라이머를 사용하여 뉴클레오타이드 도입 이전에 안정화되는 경우, 별도의 도입 단계가 프라이머의 3'-말단에 단일 뉴클레오타이드를 도입하는 검사 단계에 이어질 수 있다. 선택적으로, 단일 뉴클레오타이드 도입이 발생하는 경우, 검사를 촉진하고/하거나 후속 뉴클레오타이드 도입을 방지하기 위해 사전-전좌 형태가 안정화될 수 있다.
설명의 편의를 위해 단일 주형 핵산 분자가 기술될 수 있지만, 본원에 제공된 시퀀싱 방법은 복수의 주형 핵산을 포괄하며, 복수의 핵산은 단일 핵산의 클론적으로 증폭된 복제물이거나, 또는 클론적으로 증폭된 이질적인 핵산의 집단과 같은 조합을 포함하는, 이질적인 핵산일 수 있다.
선택적으로, 삼성분 복합체는 본원에 제공된 시퀀싱 방법의 검사 단계 동안 일시적으로 형성된다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 검사 단계 동안 안정화된다. 안정화된 삼성분 복합체는 검사 단계 동안 중합 반응에서 뉴클레오타이드의 도입을 허용하지 않을 수 있으며, 이것은 봉입된 뉴클레오타이드의 도입 및/또는 봉입된 뉴클레오타이드 이후 후속 뉴클레오타이드의 도입을 포함한다. 삼성분 복합체의 안정성을 조절하는 반응 조건은, 비제한적으로, 촉매성 금속 이온, 최적 이하 또는 억제성 금속 이온, 이온 강도, pH, 온도, 중합효소 억제제, 가교 시약, 및 이의 임의의 조합의 이용가능성을 포함한다. 삼성분 복합체의 안정성을 조절하는 반응 시약은, 비제한적으로, 비도입가능한 뉴클레오타이드, 부정확한 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 변형된 중합효소, 비연장 가능한 중합 개시 부위를 갖는 주형 핵산, 및 이의 임의의 조합을 포함한다.
선택적으로, 삼성분 복합체는 그의 트랩된 또는 안정화된 형태로부터 방출되며, 이는 프라이머-주형 핵산 이합체에서 프라이머의 3'-말단에 뉴클레오타이드 도입을 허용할 수 있다. 삼성분 복합체는 반응 조건을 조절함으로써 불안정화되고/되거나 방출될 수 있다. 또한, 삼성분 복합체는 전기적, 자기적, 및/또는 기계적 수단에 의해 불안정화될 수 있다. 기계적 수단은, 예를 들어, 초음파 교반을 사용하는 것에 의한 기계적 교반을 포함한다. 기계적 진동은 폐쇄된 복합체를 불안정화시키고 DNA에 대한 중합효소의 결합을 억제한다. 따라서, 검사 반응 혼합물이 도입 혼합물로 대체되는 세척 단계보다는 기계적 교반이 주형 핵산으로부터 중합효소를 제거하는 데 사용될 수 있으며, 이는 단계당 단일 뉴클레오타이드 부가를 갖는 연속적인 도입 단계를 통한 사이클링을 가능하게 한다.
삼성분 복합체 안정화 또는 삼성분 복합체 방출 반응 조건 및/또는 방법의 임의의 조합이 조합될 수 있다. 예를 들어, 삼성분 복합체를 안정화시키는 중합효소 억제제는 삼성분 복합체를 방출하는 기능을 하는 촉매성 이온과 함께 검사 반응에 존재할 수 있다. 전술한 예에서, 폐쇄된 복합체는 중합효소 억제제 특성 및 농도, 촉매성 금속 이온의 농도, 다른 시약 및/또는 반응 혼합물의 조건, 및 이의 임의의 조합에 따라 안정화되거나 방출될 수 있다.
삼성분 복합체는 프라이밍된 주형 핵산 내의 프라이머의 3'-말단에 대한 뉴클레오타이드의 공유 부착이 약화되는 반응 조건하에서 안정화될 수 있다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 사전-화학 형태이다. 선택적으로, 삼성분 복합체는 사전-전좌 형태이다. 이러한 삼성분 복합체의 형성은 삼성분 복합체 방출 및/또는 반응 혼합물에서 프라이머로의 뉴클레오타이드의 화학적 도입을 허용하는 촉매성 금속 이온의 이용가능성을 조절함으로써 개시되고/되거나 안정화될 수 있다. 예시적인 금속 이온은, 비제한적으로, 마그네슘, 망간, 코발트, 및 바륨을 포함한다. 촉매성 이온(예컨대, 2가 촉매성 금속 이온)은 임의의 제제, 예를 들어, MgCl2, Mg(C2H3O2)2, 및 MnCl2와 같은 염으로부터 비롯될 수 있다.
촉매성 금속 이온의 선택 및/또는 농도는 시퀀싱 반응에서 중합효소 및/또는 뉴클레오타이드에 기초할 수 있다. 예를 들어, HIV 역전사효소는 뉴클레오타이드 도입을 위해 마그네슘을 이용한다(그 전체가 참조로 본원에 포함된, N Kaushik 1996 Biochemistry 35:11536-11546, and H P Patel 1995 Biochemistry 34:5351-5363). 망간 대비 마그네슘을 사용한 삼성분 복합체 형성 속도는 중합효소 및 뉴클레오타이드의 실체에에 따라 상이할 수 있다. 따라서, 폐쇄된 복합체의 안정성은 촉매성 금속 이온, 중합효소, 및/또는 뉴클레오타이드 실체에에 따라 상이할 수 있다. 또한, 삼성분 복합체 안정화에 필요한 촉매성 이온의 농도는 촉매성 금속 이온, 중합효소, 및/또는 뉴클레오타이드 실체에에 따라 달라질 수 있으며, 이는 본원에 제공된 지침을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 도입은 하나의 금속 이온의 높은 촉매성 이온 농도에서 발생하지만 동일한 금속 이온의 낮은 농도에서는 발생하지 않거나, 그 반대도 마찬가지이다. 따라서, 금속 이온 실체에, 금속 이온 농도, 중합효소 실체에, 및/또는 뉴클레오타이드 실체를 변형하는 것은 제어된 검사 반응 조건을 허용한다.
삼성분 복합체는 삼성분 복합체 방출 및/또는 화학적 도입이 발생하지 않도록 시퀀싱 반응의 검사 단계 동안 촉매성 금속 이온을 격리, 제거, 감소, 생략, 및/또는 킬레이트화함으로써 형성되고/되거나 안정화될 수 있다. 킬레이트화는 EDTA 및/또는 EGTA를 사용하는 것을 포함하여, 촉매성 금속 이온을 뉴클레오타이드 도입에 이용할 수 없게 만드는 임의의 절차를 포함한다. 감소는 반응 혼합물 내의 촉매성 금속 이온의 농도를 희석하는 것을 포함한다.
검사 단계에 사용되는 반응 혼합물은 비촉매성 이온을 포함하는 용액으로 희석되거나 대체될 수 있으며, 이는 삼성분 복합체 형성을 허용하나 뉴클레오타이드 도입을 억제한다. 선택적으로, 비촉매성 금속 이온 및 촉매성 금속 이온 모두는 반응 혼합물 중에 존재하며, 하나의 이온은 다른 이온보다 더 높은 유효 농도로 존재한다. 제공된 방법에서, 코발트와 같은 비촉매성 이온은 촉매성이 될 수 있으며, 즉, 고농도에서 뉴클레오타이드 도입을 촉진할 수 있다.
비촉매성 이온이 검사 조건하에 사용되는 반응 혼합물에 첨가되거나, 포함될 수 있다. 반응은 이미 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 선택적으로, 비촉매성 이온은 하나 이상의 뉴클레오타이드와 복합체화되고, 복합체화된 뉴클레오타이드는 반응 혼합물에 첨가된다. 비촉매성 이온은 상승된 온도(약 80℃)에서 뉴클레오타이드를 비촉매성 이온와 혼합함으로써 뉴클레오타이드에 복합체화할 수 있다. 예를 들어, 크롬 뉴클레오타이드 복합체가 삼성분 복합체 형성 및 안정화를 촉진하기 위해 혼합물에 첨가될 수 있다. 선택적으로, 크롬 뉴클레오타이드 복합체는 크롬 모노덴테이트, 바이덴테이트, 또는 트리덴테이트 복합체이다. 선택적으로, 크롬 뉴클레오타이드 복합체는 α-모노덴테이트, 또는 β-γ-바이덴테이트 뉴클레오타이드이다.
선택적으로, 삼성분 복합체는 Sr2+를 포함하는 반응 조건에서 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드 사이에 형성되며, Sr2+는 삼성분 복합체의 형성을 유도한다. Sr2+의 존재는 부정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 복합체의 형성보다 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 삼성분 복합체의 유리한 형성을 허용할 수 있다. Sr2+는 약 0.01 mM 내지 약 30 mM의 농도로 존재할 수 있다. 선택적으로, Sr2+는 10 mM SrCl2로서 존재한다. 삼성분 복합체의 형성은 삼성분 복합체의 주형 핵산에서 다음의 염기를 확인하는 검사 조건하에 모니터링된다. Sr2+의 존재하에 각각의 dNTP(예컨대, dATP, dTTP, dCTP, dGTP)에 대한 중합효소(예컨대, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, Bst)의 친화성은 상이할 수 있다. 따라서, 검사는 dNTP에 대한 중합효소-주형 핵산의 결합 친화성을 측정하는 단계를 포함할 수 있고; 결합 친화성은 주형 핵산에서 다음의 염기를 나타낸다. 선택적으로, 결합 상호작용은 중합효소 및 프라이밍된 주형 핵산 사이의 이원 상호작용을 불안정화시키는 조건하에 수행될 수 있다. 선택적으로, 결합 상호작용은 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 다음의 정확한 뉴클레오타이드 사이의 삼성분 상호작용을 안정화시키는 조건하에 수행될 수 있다. 선택적으로, 검사 후, 세척 단계는 결합하지 않은 뉴클레오타이드를 제거하며, Mg2+는 뉴클레오타이드 도입 및 피로포스페이트(PPi) 방출을 유도하기 위해 반응에 첨가된다. 선택적으로, 세척 단계는 삼성분 복합체의 안정성을 유지시켜 삼성분 복합체의 해리를 방지하기 위해 Sr2+를 포함한다. 반응은 원하는 서열 리드 길이가 얻어질 때까지 반복될 수 있다.
선택적으로, 삼성분 복합체는 Ni2+를 포함하는 반응 조건에서 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드 사이에 형성되며, Ni2+는 삼성분 복합체의 형성을 유도한다. Ni2+의 존재는 부정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 복합체의 형성보다 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 삼성분 복합체의 유리한 형성을 허용할 수 있다. Ni2+는 약 0.01 mM 내지 약 30 mM의 농도로 존재할 수 있다. 선택적으로, Ni2+는 10 mM NiCl2로서 존재한다. 삼성분 복합체의 형성은 삼성분 복합체의 주형 핵산에서 다음의 염기를 확인하는 검사 조건하에 모니터링된다. Sr2+의 존재하에 각각의 dNTP(예컨대, dATP, dTTP, dCTP, dGTP)에 대한 중합효소(예컨대, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, Bst)의 친화성은 상이할 수 있다. 따라서, 검사는 dNTP에 대한 중합효소-주형 핵산의 결합 친화성을 측정하는 단계를 포함할 수 있고; 결합 친화성은 주형 핵산에서 다음의 염기를 나타낸다. 선택적으로, 결합 상호작용은 중합효소 및 프라이밍된 주형 핵산 사이의 이원 상호작용을 불안정화시키는 조건하에 수행될 수 있다. 선택적으로, 결합 상호작용은 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 다음의 정확한 뉴클레오타이드 사이의 삼성분 상호작용을 안정화시키는 조건하에 수행될 수 있다. 선택적으로, 검사 후, 세척은 결합하지 않은 뉴클레오타이드 및 중합효소를 제거하며, Mg2+는 뉴클레오타이드 도입 및 피로포스페이트 방출을 유도하기 위해 반응에 첨가된다. 선택적으로, 세척 완충액은 삼성분 복합체의 안정성을 유지시켜 삼성분 복합체의 해리를 방지하기 위해 Ni2+를 포함한다. 반응은 원하는 서열 판독길이가 수득될 때까지 반복될 수 있다.
선택적으로, 삼성분 복합체는 비촉매성 농도의 Co2+를 포함하는 반응 조건에서 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드 사이에 형성되며, Co2+는 삼성분 복합체의 형성을 유도한다. 비촉매성 농도의 Co2+의 존재는 부정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 복합체의 형성보다 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 삼성분 복합체의 유리한 형성을 허용할 수 있다. Co2+는 약 0.01 mM 내지 약 0.5 mM의 농도로 존재할 수 있다. 선택적으로, Co2+는 0.5 mM CoCl2로서 존재한다. 삼성분 복합체의 형성은 삼성분 복합체의 주형 핵산에서 다음의 염기를 확인하는 검사 조건하에 모니터링된다. Co2+의 존재하에 각각의 dNTP(예컨대, dATP, dTTP, dCTP, dGTP)에 대한 중합효소(예컨대, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, Bst)의 친화성은 상이할 수 있다. 따라서, 검사는 dNTP에 대한 중합효소-주형 핵산의 결합 친화성을 측정하는 단계를 포함할 수 있고; 결합 친화성은 주형 핵산에서 다음의 염기를 나타낸다. 선택적으로, 결합 상호작용은 중합효소 및 프라이밍된 주형 핵산 사이의 이원 상호작용을 불안정화시키는 조건하에 수행될 수 있다. 선택적으로, 결합 상호작용은 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 다음의 정확한 뉴클레오타이드 사이의 삼성분 상호작용을 안정화시키는 조건하에 수행될 수 있다. 검사 후, 세척은 결합하지 않은 뉴클레오타이드 및 중합효소를 제거하며, 촉매성 농도의 Co2+는 뉴클레오타이드 도입 및 피로포스페이트 방출을 유도하기 위해 반응에 첨가된다. 선택적으로, 세척 완충액은 삼성분 복합체의 안정성을 유지시켜 삼성분 복합체의 해리를 방지하기 위해 비촉매성 양의 Co2+를 포함한다. 반응은 원하는 서열 리드 길이가 얻어질 때까지 반복될 수 있다.
선택적으로, 촉매성 금속 이온(예컨대, 2가 촉매성 금속 이온)은 후속 뉴클레오타이드 도입 및 삼성분 복합체 방출 없이 폐쇄된 복합체의 형성을 촉진할 수 있다. 선택적으로, 반응 혼합물에서 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 μM Mg2+의 농도는 중합효소의 형태적 변화를 유도하여 후속 뉴클레오타이드 도입, PPi 및 삼성분 복합체 방출 없이 삼성분 복합체를 형성할 수 있다. 선택적으로, Mg2+의 농도는 약 0.5 μM 내지 약 10 μM, 약 0.5 μM 내지 약 5 μM, 약 0.5 μM 내지 약 4 μM, 약 0.5 μM 내지 약 3 μM, 약 μM 내지 약 5 μM, 약 1 μM 내지 약 4 μM, 및 약 1 μM 내지 약 3 μM이다.
선택적으로, 뉴클레오타이드 도입을 허용하는 데 필요한 시퀀싱 반응에서의 촉매성 금속 이온(예컨대, 2가 촉매성 금속 이온)의 농도는 약 0.001 mM 내지 약 10 mM, 약 0.01 mM 내지 약 5 mM, 약 0.01 mM 내지 약 3 mM, 약 0.01 내지 약 2 mM, 약 0.01 mM 내지 약 1 mM, 약 0.05 내지 약 10 mM, 약 0.05 mM 내지 약 5 mM, 약 0.05 mM 내지 약 3 mM, 약 0.05 내지 약 2 mM, 또는 약 0.05 mM 내지 약 1 mM이다. 선택적으로, 촉매성 금속 이온의 농도는 5 내지 50 mM이다. 선택적으로, 촉매성 금속 이온의 농도는 5 내지 15 mM, 또는 약 10 mM이다.
비촉매성 이온(예컨대, 2가 비촉매성 금속 이온)은 하기 임의의 반응 단계 이전, 동안, 또는 이후를 포함하는 임의의 단계에서 반응 혼합물에 첨가될 수 있다: 프라이밍된 주형 핵산의 제공, 중합효소의 제공, 이성분 복합체의 형성, 뉴클레오타이드의 제공, 사전-화학 삼성분 복합체의 형성, 뉴클레오타이드 도입, 사전-전좌 삼성분 복합체의 형성, 및 사후-전좌 형태의 형성. 비촉매성 이온은 세척 단계 동안 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 비촉매성 이온은 반응 혼합물에서의 반응을 통해 존재할 수 있다. 예를 들어, 촉매성 이온은 비촉매성 금속 이온을 희석시키는 농도로 반응 혼합물에 첨가되어, 뉴클레오타이드 도입을 허용한다.
뉴클레오타이드 도입을 조절하는 촉매성 및 비촉매성 이온의 능력은, 비제한적으로, pH, 이온 강도, 킬레이트화제, 화학적 가교, 변형된 중합효소, 비도입가능한 뉴클레오타이드, 기계적 또는 진동 에너지, 및 전계를 포함하는 반응 혼합물에서의 조건에 좌우될 수 있다.
선택적으로, 뉴클레오타이드 도입 없이 삼성분 복합체 형성의 형성을 가능하게 하는 데 필요한 시퀀싱 반응에서의 비촉매성 금속 이온(예컨대, 2가 비촉매성 금속 이온)의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 50 mM, 약 0.1 mM 내지 약 40 mM, 약 0.1 mM 내지 약 30 mM, 약 0.1 mM 내지 약 20 mM, 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 약 0.1 mM 내지 약 5 mM, 약 0.1 내지 약 1 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 내지 약 40 mM, 약 1 mM 내지 약 30 mM, 약 1 mM 내지 약 20 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 5 mM, 약 2 mM 내지 약 30 mM, 약 2 mM 내지 약 20 mM, 약 2 mM 내지 약 10 mM, 또는 이들 범위 내의 임의의 농도이다. 이와 관련하여 유용한 비촉매성 이온은, 비제한적으로 칼슘, 스트론튬, 스칸듐, 티탄, 바나듐, 크롬, 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 갈륨, 게르마늄, 비소, 셀레늄, 로듐, 유로퓸, 및 테르븀 이온을 포함한다. 선택적으로, Ni2+는 삼성분 복합체 형성을 촉진하기 위해 검사 반응에서 제공된다. 선택적으로, Sr2+는 삼성분 복합체 형성을 촉진하기 위해 검사 반응에서 제공된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 비촉매성 이온은 상기 표시된 농도로 포함될 수 있는 반면, 다른 비촉매성 이온은 검사 단계 동안 반응 혼합물로부터 배제된다. 예를 들어, 니켈 또는 스트론튬이 포함될 수 있는 반면, 칼슘은 제외된다.
검출 플랫폼: 삼성분 복합체를 검출하기 위한 기기
뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소와 주형 핵산의 상호작용은 태깅된 표지를 사용하거나 사용하지 않고 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 시퀀싱 반응은 굴절률 변화 검출, 전하 검출, 라만 산란 검출, 타원편광 반사법(ellipsometry) 검출, pH 검출, 크기 검출, 질량 검출, 표면 플라즈몬 공명, 유도 방식 공명, 나노공극 광학 간섭계, 위스퍼링 갤러리(whispering gallery) 방식 공명, 나노입자 산란, 광 결정(photonic crystal), 석영 결정 마이크로밸런스(microbalance), 생물층 간섭계, 진동 검출, 압력 검출 및 주형 핵산과 삼성분 복합체 내의 중합효소 결합으로 인한 부가된 질량 또는 굴절률을 검출하는 다른 표지가 없는 검출 체계에 의해 모니터링될 수 있다.
선택적으로, 중합효소의 라만 특징이 본원에 개시된 시퀀싱 방법의 하나 이상의 단계 동안 발생하는 중합효소 형태적 변화, 예를 들어 삼성분 복합체 형성 또는 방출을 검출하기 위해 이용된다. 선택적으로, 본원에 기재된 핵산 시퀀싱 방법의 하나 이상의 단계 동안, 빛은 가시광선, 근적외선, 또는 근자외선 범위로 시퀀싱 반응 혼합물로 유도된다. 빛은 반응에서 분자 진동 또는 다른 여기와 상호작용하여, 빛 에너지를 이동시킨다. 에너지 이동은 반응의 진동 방식에 관한 정보를 제공하며, 따라서 반응 성분(예컨대, 중합효소)의 배열에 관한 정보를 제공한다. 본 발명의 시퀀싱 방법은 표면 향상 라만, 공명 라만, 팁 향상 라만, 편광 라만, 자극 라만, 투과 라만, 공간 오프셋 라만, 및 하이퍼 라만 분광법으로 검출될 수 있다.
선택적으로, 굴절률 변화를 검출하는 것은, 비제한적으로, 표면 플라즈몬 공명 감지, 국소화된 플라즈몬 공명 감지, 플라즈몬-광자 결합 감지, 서브-파장 나노홀을 통한 투과 감지(향상된 광학 투과), 광 결정 감지, 간섭계 감지, 굴절 감지, 유도 방식 공명 감지, 링 공진기 감지, 또는 타원편광 반사법 감지를 포함하는 하나의 수단 또는 수단들의 조합에서 달성된다. 선택적으로, 핵산 분자는 표면에 국소화되며, 다양한 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소와 핵산과의 상호작용은 국소 굴절률의 변화로서 측정될 수 있다.
선택적으로, 주형 핵산은 표면에 또는 표면 근처에 적절하게 포박되거나 국소화되어, 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소 및 주형 핵산의 상호작용이 표면을 가로질러 투과되거나 표면으로부터 반사되는 빛을 변화시킨다. 표면은 나노구조를 함유할 수 있다. 선택적으로, 표면은 플라즈몬 또는 플라즈몬 공명을 지속시킬 수 있다. 선택적으로, 표면은 공명 공동, 공명 링 또는 광 결정 슬라브에 제한되지 않는 광 기질이다. 선택적으로, 표면은 유도 방식 공명 센서이다. 선택적으로, 핵산은 나노홀 어레이, 나노입자 또는 마이크로입자 상에 또는 근처에 적절하게 포박되거나 국소화되어, 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소 및 주형 핵산의 상호작용은 마이크로입자 또는 나노입자와 상호작용하는 빛의 흡광도, 산란, 반사 또는 공명을 변화시킨다.
선택적으로, 금 표면 상의 나노홀 어레이가 굴절률 센서로서 사용된다. 주형 핵산은 표준 티올 화학에 의해 금속 표면에 부착되어, DNA를 증폭시키는 PCR 반응에 사용되는 하나의 프라이머 상에 티올 기를 도입시킬 수 있다. 나노홀 어레이의 크기가 입사관에 적절하게 조정되면, 뉴클레오타이드의 존재하에 주형 핵산에 대한 중합효소의 결합은 나노홀을 투과한 빛의 변화로서 모니터링될 수 있다. 표지된 체계 및 표지가 없는 체계 모두에 대해, 평형 신호 강도의 간단하고 직관적인 측정은 안정적인 폐쇄된 복합체의 형성을 밝힐 수 있다.
선택적으로, 핵산 분자는 표면 플라즈몬을 지속시킬 수 있는 표면에 국소화되며, 국소화된 핵산과의 중합효소 상호작용에 의해 유발된 굴절률 변화는 표면 플라즈몬의 특성 변화를 통해 모니터링될 수 있고, 또한, 표면 플라즈몬의 상기 특성은 표면 플라즈몬 공명을 포함할 수 있다. 표면 플라즈몬, 국소 표면 플라즈몬(LSP), 또는 표면 플라즈몬 분극(SPP)은 표면 전하의 플라즈마 진동에 대한 전자기파의 결합으로부터 비롯된다. LSP는 나노입자 표면에 국한되는 반면, SPP는 고 전자 이동도 표면 및 유전체 매질 사이의 계면에서 높은 전자 밀도 표면에 국한된다. 표면 플라즈몬은 계면의 방향을 따라 전파할 수 있는 반면, 이들은 감쇠하는 방식으로만 유전체 매질에 침투한다. 표면 플라즈몬 공명 조건은 입사하는 전자기 복사의 주파수가 표면 전자의 진동의 고유 주파수와 일치할 때 확립된다. 예를 들어 결합 또는 분자 크라우딩(crowding)으로 인한 계면에서의 유전체 특성의 변화는 표면 전자의 진동에 영향을 미쳐 표면 플라즈몬 공명 파장을 변경시킨다. 표면 플라즈몬 공명이 가능한 표면은 비제한적인 방식으로, 나노입자, 나노입자의 클러스터 및 응집체, 연속적인 평면 표면, 나노구조화된 표면, 및 미세구조화된 표면을 포함한다. 금, 은, 알루미늄, 높은 전도성 산화금속(예컨대, 인듐 산화주석, 산화아연, 산화텅스텐)과 같은 물질은 이들의 표면에서 표면 플라즈몬 공명을 지원할 수 있다.
선택적으로, 단일 핵산 분자, 또는 핵산의 다수의 클론 복제물은 나노입자에 부착되어, 핵산에 대한 중합효소의 결합이 국소 표면 플라즈몬 공명(LSPR)의 이동을 유발할 수 있다. 나노입자에 입사하는 빛은 이들 내의 전도 전자가 나노입자의 크기, 모양 및 조성에 좌우되는 공명 주파수로 집합적으로 진동하도록 유도한다. 관심있는 나노입자는 구형 나노입자, 나노로드, 나노피라미드, 나노다이아몬드, 및 나노디스크를 포함하는 상이한 모양을 취할 수 있다. 이러한 LSPR 방식의 결과로서, 나노입자는 강하게 빛을 흡수하고 산란시켜 단일 나노입자가 암시야(광학 산란) 현미경검사를 사용하여 눈에 의해 쉽게 관찰된다. 예를 들어, 단일 80-nm 은 나노구체는 플루오레세인 분자의 형광 단면적보다 백만 배 더 크며, 자가 ?칭 한계까지 플루오레세인으로 채워진 유사한 크기의 나노구체의 단면적보다 수천 배 더 큰 (3 X 10-2) m2의 산란 단면적을 갖는 445-nm 청색 광을 산란시킨다. 선택적으로, 나노입자는 가시 스펙트럼 내의 어느 곳에서 산란 피크를 갖는 매우 밝은 나노크기의 광학 산란자로서 구성된 플라즈몬-공명 입자이다. 플라즈몬-공명 입자는 이들이 표백되지 않기 때문에 유리하다. 선택적으로, 플라즈몬-공명 입자가 제조되고, 주형 핵산으로 코팅되며, 중합효소 및 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물에서 제공되고, 중합효소-주형 핵산-입자 상호작용이 검출된다. 전술한 단계 중 하나 이상은 그 전체가 참조로 본원에 포함된 문헌[Sheldon Schultz et al., "Single-Target Molecule Detection with Nonbleaching Multicolor Optical Immunolabels," Proceedings of the National Academy of Sciences 97, no. 3 (February 1, 2000): 996-1001]에 개시된 하나 이상의 방법에 기초하거나 이로부터 유래될 수 있다.
공명 파장에서 매우 큰 소거(extinction) 계수는 귀금속 나노입자가 표면근처 상호작용을 위한 매우 강렬한 표지로서 작용할 수 있게 한다. 선택적으로, 나노입자 국소화된 DNA와의 중합효소 상호작용은 공명 파장의 이동을 초래한다. 결합 또는 결합 상호작용으로 인한 공명 파장의 변화는 많은 방법 중 하나에서 측정될 수 있다. 선택적으로, 이미징 장치에서 최대 산란이 관찰되는 파장을 확인하기 위해 조명이 다양한 범위의 파장을 통해 스캐닝된다. 선택적으로, 공명 피크가 분광학적으로 확인될 수 있도록, 광대역 조명이 이미징 장치 근처의 분산 소자와 함께 이용된다. 선택적으로, 나노입자 시스템이 그의 공명 파장에서, 또는 그의 공명 파장 근처에서 조명될 수 있고, 임의의 결합 상호작용은 새로운 공명 파장이 조명 파장으로부터 멀어짐에 따라 산란된 빛의 강도의 강하로서 관찰될 수 있다. 조명 파장의 위치에 따라, 상호작용은 공명 피크가 조명 파장 쪽으로 이동함에 따라 나노입자 산란의 증가로 나타날 수도 있다. 선택적으로, DNA 부착된 나노입자는 표면에 국소화될 수 있거나, 또는, 대안적으로, DNA 부착된 나노입자는 용액 중에 현탁될 수 있다. 나노입자를 이용한 바이오센싱의 포괄적인 검토는 그 전체가 참조로 본원에 포함된 문헌[Jeffrey N. Anker et al., "Biosensing with Plasmonic Nanosensors," Nature Materials 7, no. 6 (June 2008): 442-53]에 기재되어 있다.
선택적으로, LSPR이 가능한 나노특징은 평면 기질 상에 리소그래피적으로 패터닝된다. 나노특징의 2차원 패터닝은 다수의 상이한 핵산 분자의 멀티플렉싱 및 고처리량 분석에서 이점을 갖는다. 선택적으로, 금 나노포스트는 중합효소-주형 핵산 상호작용의 표면 플라즈몬 공명 이미징 검출을 위한 기질이며, 핵산은 나노포스트(nanopost)에 부착된다. 나노구조 크기 및 주기는 표면 플라즈몬 공명 신호 향상에 영향을 미쳐, 선택적으로, 대조군 필름과 비교하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8배 이상의 신호 증폭을 제공한다.
선택적으로, 표면 플라즈몬 공명은 평면 표면에서 지속될 수 있다. 크레취만(Kretschmann) 배열(예컨대, Biacore, Uppsala, Sweden) 및 표면 플라즈몬 공명 이미징(예컨대, GWC 기술, Madison, WI, 또는 Horiba, Kyoto, Japan)에 기반한 많은 상업적인 기구가 시장에서 쉽게 이용가능하며, 단일 스팟 및 멀티플렉스 어레이 패턴 모두에서, 이들의 표면에 DNA를 부착시키는 프로토콜을 잘 확립하였다. 크레취만 배열에서, 금속 필름, 전형적으로 금은 프리즘의 측면에서 증발되고, 입사 방사선이 표면 플라즈몬을 여기시키는 각도로 가해진다. 에바네센트파(evanescent wave)는 다른 측면 상의 플라즈몬을 여기시키는 금속 필름을 관통하며, 그것은 금 필름 근처의 표면근처 및 표면 상호작용을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 공명 각도에서, 프리즘-금 계면으로부터 반사된 빛은 심하게 약화된다. 고정된 파장 조명을 가정하면, 결합 상호작용은 공명 각도에 가까운 고정된 각도에서 반사된 빛의 강도를 모니터링할 뿐만 아니라 표면 플라즈몬 공명 조건(최소 반사율)을 확립하는 데 필요한 입사각의 변화를 모니터링함으로써 검사될 수 있다. CCD 또는 CMOS 카메라와 같은 2D 이미징 장치가 반사된 빛을 모니터링하는 데 사용될 때, 전체 조명 영역은 고해상도로 이미지화될 수 있다. 이 방법은 표면 플라즈몬 공명 이미징(SPRi)으로 불린다. 그것은 동시에 표면 상의 독립적 영역의 고처리량 분석을 허용한다. 광대역 조명이 또한 고정된 각도 배열로 사용될 수 있으며, 표면 플라즈몬 공명에 결합된 파장은 반사된 스펙트럼에서의 딥(dip)을 찾음으로써 분광학적으로 확인된다. 표면 상호작용은 공명 파장의 이동을 통해 모니터링된다.
표면 플라즈몬 공명은 단백질-핵산 상호작용을 모니터링하기 위해 잘 확립되어 있으며, 핵산 부착뿐만 아니라 데이터 분석 모두를 위한 많은 표준 프로토콜이 존재한다. 문헌으로부터의 예시적인 참조는 문헌[Bongsup Cho et al., "Binding Kinetics of DNA-Protein Interaction Using Surface Plasmon Resonance," Protocol Exchange, May 22,2013, and, Jennifer M. Brockman, Anthony G. Frutos, and Robert M. Corn, "A Multistep Chemical Modification Procedure To Create DNA Arrays on Gold Surfaces for the Study of Protein-DNA Interactions with Surface Plasmon Resonance Imaging," Journal of the American Chemical Society 121, no. 35 (September 1, 1999): 8044-51]을 포함하며, 이들은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
중합효소/핵산 상호작용은 국소 표면 플라즈몬을 지속시킬 수 있는 나노구조화된 표면 상에서 모니터링될 수 있다. 선택적으로, 중합효소/핵산 상호작용은 표면 플라즈몬 분극을 지속시킬 수 있는 나노구조화된 표면 상에서 모니터링될 수 있다.
선택적으로, 중합효소/핵산 상호작용은 국소 표면 플라즈몬을 지속시킬 수 있는 나노구조화된 표면 상에서 모니터링될 수 있다. 선택적으로, 중합효소/핵산 상호작용은 표면 플라즈몬 분극을 지속시킬 수 있는 나노구조화된 표면 상에서 모니터링될 수 있다.
선택적으로, 나노홀 어레이를 통한 특이 광 투과(extraordinary optical transmission, EOT)가 핵산/중합효소 상호작용을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 플라즈몬 금속 필름 내의 파장 이하의 나노홀을 통해 전달되는 빛은 고전적인 전자기 이론으로부터 예상된 것보다 더 높다. 이 향상된 광전송은 입사 방사선에 결합하는 플라즈몬 공명을 고려함으로써 설명될 수 있는데, 이에 의해 공명 파장에서, 예상보다 더 큰 빛의 일부가 금속 나노홀을 통해 전달된다. 향상된 광전송은 나노홀의 크기 및 피치(pitch), 금속의 특성뿐만 아니라 나노홀을 갖는 금속 필름의 어느 한쪽 면에 있는 매질의 유전체 특성에 의존한다. 바이오센서의 문맥에서, 금속 나노홀 어레이의 투과율은 금속 필름과 접촉하는 매질의 굴절률에 의존하며, 이에 의해, 예를 들어, 중합효소와 금속 표면에 부착된 핵산과의 상호작용은 나노홀 어레이를 통해 전송되는 빛의 강도의 변화로서 모니터링될 수 있다. EOT/플라즈몬 나노홀 어레이 접근법의 정밀함은 표면 플라즈몬 공명의 계측 및 정렬 요구사항이 매우 소형인 광학 및 이미징 소자에 의해 대체될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 저전력 LED 조명 및 저렴한 CMOS 또는 CCD 카메라만으로도 강력한 EOT 플라즈몬 센서를 구현하기에 충분할 수 있다. 예시적인 나노홀 어레이 기반의 표면 플라즈몬 공명 감지 장치는 문헌[C. Escobedo et al., "Integrated Nanohole Array Surface Plasmon Resonance Sensing Device Using a DualWavelength Source," Journal of Micromechanics and Microengineering 21, no. 11 (November 1, 2011): 115001]에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
플라즈몬 나노홀 어레이는 유리 표면 상에 증착된 금의 광학적으로 불투명한 층(50 nm 초과 두께) 상에 패터닝될 수 있다. 선택적으로, 플라즈몬 나노홀 어레이는 유리 상에 증착된 알루미늄 또는 은의 광학적으로 두꺼운 필름 상에 패터닝될 수 있다. 선택적으로, 나노홀 어레이는 저굴절률 플라스틱 상에 증착된 광학적으로 두꺼운 금속 층 상에 패터닝될 수 있다. 저굴절률 플라스틱 상에서 플라즈몬 나노홀 어레이를 패터닝하는 것은 금속 층의 2개의 측면 상의 굴절률을 더 잘 일치시켜 굴절률 변화에 대한 장치의 민감성을 향상시킨다. 선택적으로, 나노홀 어레이의 굴절률 민감성은 홀 사이의 거리를 증가시킴으로써 증가된다. 선택적으로, 나노홀 어레이는 복제에 의해, 예를 들어, 엠보싱, 캐스팅, 임프린트 리소그래피, 또는 주형-스트리핑에 의해 제조된다. 선택적으로, 나노홀 어레이는 콜로이드를 사용한 자체 조립에 의해 제조된다. 선택적으로, 나노홀 어레이는 레이저 간섭 리소그래피와 같은 투사 직접 패터닝(projection direct patterning)에 의해 제조된다.
나노-버킷(nano-bucket) 배열은 나노홀 배열보다 바람직할 수 있다. 나노홀 배열에서, 나노특징의 바닥은 유리 또는 플라스틱 또는 다른 적절한 유전체인 반면, 나노-버킷 배열에서, 나노특징의 바닥은 플라즈몬 금속을 포함한다. 나노버킷 어레이 배열은 국소 국절률에 대한 투과 감도를 유지하면서 대량 생산 방식으로 제조하기 더 쉬울 수 있다.
선택적으로, 나노홀 어레이 플라즈몬 감지는 저렴한 방식으로 큰 영역 이미징을 위한 렌즈가 없는 홀로그래픽 이미징과 조합된다. 선택적으로, 플라즈몬 바이오센싱 플랫폼은 나노홀 어레이를 포함하는 플라즈몬 칩, 칩을 조명하도록 구성된 발광 다이오드 공급원, 및 표면 상의 분자 결합 사건에 의해 조절되는 나노홀의 회절 패턴을 기록하는 CMOS 이미저(imager) 칩을 포함한다. 결합 사건은 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소와 주형 핵산 사이의 삼성분 복합체의 형성일 수 있다.
표면 플라즈몬 공명 감지를 위해 표면을 기능화하는 방법(핵산 부착을 위해)이 EOT 나노홀 어레이에 직접 적용될 수 있는데, 두 감지 체계는 핵산이 부착될 필요가 있는 유사한 금속 표면을 사용하기 때문이다.
선택적으로, 중합효소/핵산 상호작용과 관련된 굴절률 변화는 플라즈몬을 지지하지 않는 나노구조의 표면 상에서 모니터링될 수 있다. 선택적으로, 유도 방식 공명이 중합효소/핵산 상호작용을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 유도 방식 공명 또는 도파관 방식 공명은 광학 도파관의 유도 방식이 회절 격자 또는 프리즘과 같은 위상-매칭 소자의 도입에 의해 여기되고 동시에 추출될 수 있는 현상이다. 이러한 유도 방식은 "누설(leaky) 방식"으로도 불리는데, 이들이 유도 상태를 유지하지 않고 1차원 및 2차원 광 결정 슬래브에서 관찰되었기 때문이다. 유도 방식 공명은 인접하여 배치되거나 서로의 상부에 배치된 2개의 광학 구조의 도파관 방식에 대한 회절 방식의 결합으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 광학 도파관의 상부에 배치된 회절 격자의 경우, 회절 방식 중 하나가 광학 도파관의 유도 방식 내로 정확히 결합하여, 도파관을 따라 상기 방식을 전파할 수 있다. 오프-공명(off-resonance) 조건의 경우, 도파관 내로 빛이 결합하지 않으므로, 구조가 완전히 투명하게 보일 수 있다(유전체 도파관이 사용되는 경우). 공명에서, 공명 파장은 도파관 내로 강하게 결합되며, 격자-도파관 계면으로부터의 하류 소자에 따라 구조 밖으로 결합될 수 있다. 격자 커플러(coupler)가 도파관의 전체 표면으로 연장되는 경우, 빛은 유도될 수 없는데, 결합된 임의의 빛이 다음 격자 소자에서 결합되기 때문이다. 따라서, 격자 도파관 구조에서, 공명은 강한 반사 피크로서 관찰되는 반면, 구조는 오프-공명 조건에 대해 투명하다. 공명 조건은 입사광의 각도, 격자 특성, 편광 및 파장에 의존한다. 예를 들어 도파관의 전체 표면에 결합된 격자로 인해 유도 방식 전파가 존재하지 않는 경우, 강한 광학 감금 및 도파관 층으로부터 횡 방향으로 복사의 에바네센트 전파에 비추어 공명 박식은 누설-방식 공명으로도 불릴 수 있다. 예를 들어 생물분자의 결합으로 인한, 격자 근처의 유전체 특성의 변화는 도파관 내로의 결합에 영향을 미쳐, 공명 조건을 변경시킨다. 선택적으로, 핵산 분자가 격자 도파관 구조의 표면에 부착되는 경우, 중합효소/핵산 상호작용은 누설 방식 공명의 파장의 변화로서 모니터링될 수 있다.
회절 소자는 도파관 소자의 명백한 필요없이 투명한 기질 상에 직접 사용될 수 있다. 격자 나노구조 근처의 상호작용으로 인한 공명 조건의 변화는 반사되거나 투과된 복사에서 공명 파장 이동으로서 모니터링될 수 있다.
핵산 부착된 유도 방식 공명 센서로부터 반사된 빛이 중합효소/핵산 상호작용을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 광대역 조명 공급원이 조명에 사용될 수 있고, 반사된 빛의 분광 검사는 중합효소 결합으로 인한 국소 굴절률의 변화를 밝힐 수 있다.
선택적으로, 광대역 조명이 사용될 수 있고 투과광이 중합효소 상호작용으로 인한 공명 이동을 확인하기 위해 검사될 수 있다. 선형 편광된 협대역 조명이 사용될 수 있고, 투과광은 교차-편광자를 통해 필터링될 수 있으며; 편광이 변형된 누설 방식 응답을 제외하고 교차된 편광자로 인해 투과광은 완전히 약화된다. 이 구현은 굴절률 모니터링을 저렴한 이미징 시스템 상에서 모니터링될 수 있는 간단한 투과 분석으로 전환한다. 공개된 자료는 광학 성분의 조립을 기술한다. 문헌[Yousef Nazirizadeh et al., "Low-Cost Label-Free Biosensors Using Photonic Crystals Embedded between Crossed Polarizers," Optics Express 18, no. 18 (August 30, 2010): 19120-28]을 참고하며, 이는 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
나노구조의 표면 이외에도, 평면의 비구조화된 표면이 또한 유리하게도 굴절률 조절을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 선택적으로, 간섭계가 비구조화된 광학적으로 투명한 기질에 결합된 핵산과 중합효소와의 상호작용을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 핵산 분자는 유리 슬라이드의 상부 표면에 부착될 수 있고(당업계에 공지된 임의의 수단에 의해), 시스템은 유리 슬라이드의 하부 표면으로부터 조명된다. 이 배열에는 2개의 반사 표면이 있는데, 하나는 유리 슬라이드의 하부 표면으로부터의 반사이고, 다른 하나는 핵산 분자가 부착된 상부 표면으로부터의 반사이다. 2개의 반사파는 서로 간섭하여, 결합된 핵산 분자로 인한(그리고 이후에 결합된 핵산 분자와 중합효소와의 상호작용에 의한) 유전체 상수의 변화에 의해 조절된 상부 표면으로부터 반사된 파장과 함께, 경로 길이 차이에 기초하여 보강 또는 상쇄 간섭을 유발할 수 있다. 하부 표면으로부터의 반사가 변화하지 않으면, 핵산 분자에 대한 임의의 결합은 상부 및 하부 표면으로부터 반사된 빔 사이의 위상차에 반영될 수 있으며, 이는 결국 관찰되는 간섭 패턴에 영향을 미친다. 선택적으로, 생물층 간섭계가 핵산/중합효소 상호작용을 모니터링하는 데 사용된다. 생물층 간섭계는 팔 포르테 바이오 회사(Pall Forte Bio corporation, Menlo Park, CA)가 판매하는 것과 같은 상업적인 장치 상에서 수행될 수 있다.
선택적으로, 상부 표면으로부터의 반사된 빛은 선택적으로 포커싱 광학(focusing optics)을 사용하여 선택된다. 하부 표면으로부터의 반사된 빛은 초점 면에 있지 않기 때문에 무시된다. 핵산 부착된 상부 표면에만 초점을 맞추면, 포커싱 렌즈에 의해 수집된 빛은 부분적으로 반사된 입사 복사에 해당하는 평면파, 및 초점면 내의 분자에 의해 수집 방향으로 산란된 복사에 해당하는 산란파를 포함한다. 이러한 두 성분은 입사 복사가 간섭성(coherent)인 경우 간섭하게 될 수 있다. 이 산란 기반의 간섭계 검출은 매우 민감하며, 단일 단백질 분자까지 검출하는 데 사용될 수 있다.
선택적으로, 전계 효과 트랜지스터(FET)는 삼성분 복합체의 검출을 위한 바이오센서로서 구성된다. FET의 게이트 단자는 주형 핵산의 부가에 의해 변형된다. 하전된 태그를 포함하는 중합효소의 결합은 전기화학적 신호의 변화를 초래한다. 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 갖는 중합효소가 주형 핵산에 결합하는 것은 다른 부정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 주형 핵산에 대한 중합효소 결합과 상이한 신호를 제공하며, 각각의 부정확한 뉴클레오타이드가 또한 상이한 신호를 제공할 수 있다. 선택적으로, 주형 핵산과의 중합효소 상호작용은 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산, 또는 뉴클레오타이드 상의 표지된 태그를 사용하지 않고 FET를 사용하여 모니터링된다. 선택적으로, 도입 반응 동안 H+ 이온의 방출로 인해 발생하는 pH 변화는 FET를 사용하여 검출된다. 선택적으로, 중합효소는 FET에 의해 검출되는 연속적인 H+ 이온을 생성하는 태그를 포함한다. 선택적으로, 연속적인 H+ 이온을 생성하는 태그는 ATP 합성효소이다. 선택적으로, 연속적인 H+ 이온을 생성하는 태그는 팔라듐, 구리 또는 또 다른 촉매이다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 도입 후 PPi의 방출은 FET를 사용하여 검출된다. 예를 들어, 하나의 유형의 뉴클레오타이드가 한 번에 반응에 제공될 수 있다. 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 부가되고 조건이 도입을 허용하면, PPi는 절단되고, 방출되어, FET를 사용하여 검출되므로, 다음의 정확한 뉴클레오타이드 및 다음의 염기를 확인한다. 선택적으로, 주형 핵산은 나노튜브의 벽에 결합된다. 선택적으로, 중합효소는 나노튜브의 벽에 결합된다. FET는 그의 작은 크기 및 낮은 중량으로 인해 시퀀싱 센서로 사용하기에 유리하여, 휴대용 시퀀싱 모니터링 성분으로 사용하기에 적절하다. 분자 상호작용의 FET 검출의 세부사항은 그 전체가 참조로 본원에 포함된 문헌Dong-Sun Kim et al., "An FET-Type Charge Sensor for Highly Sensitive Detection of DNA Sequence," Biosensors and Bioelectronics, Microsensors and Microsystems 2003, 20, no. 1 (July 30, 2004): 69-74, doi:10.1016/j.bios.2004.01.025 and Alexander Star et al., "Electronic Detection of Specific Protein Binding Using Nanotube FET Devices," Nano Letters 3, no. 4 (April 1, 2003): 459-63, doi:10.1021/nl0340172]에 기재되어 있다.
예로서, 중합효소는 형광 태그를 포함한다. 높은 신호-대-노이즈로 중합효소-핵산 상호작용을 모니터링하기 위해, 에바네센트 조명 또는 공초점 이미징이 사용될 수 있다. 국소화된 주형 핵산 상에서 삼성분 복합체의 형성은 예를 들어 백그라운드와 비교하여 증가된 형광으로서 관찰될 수 있는 반면, 일부 경우 그것은 국소 극성 환경에서의 ?칭 또는 변화로 인해 감소된 형광으로서 관찰될 수도 있다. 선택적으로, 중합효소 분자의 분획은 형광단으로 태깅될 수 있는 반면, 또 다른 분획은 동일한 반응 혼합물에서 ?처로 태깅될 수 있고; 핵산의 국소화된 클론 집단 상에서 삼성분 복합체의 형성은 백그라운드와 비교하여 형광의 감소로서 나타난다. 핵산의 클론 집단은 평면 기질, 마이크로입자, 또는 나노입자와 같은 지지체 표면에 부착될 수 있다. 선택적으로, 중합효소는 형광단, 발광단, 화학발광단, 발색단, 또는 생물발광단으로 태깅된다.
선택적으로, 복수의 주형 핵산은 표면에 포박되고, 하나(또는 초과)의 dNTP가 연속적으로 유동된다. 친화성의 스펙트럼은 주형 핵산에서 다음의 정확한 뉴클레오타이드 및 따라서 다음의 염기의 실체를 밝힌다. 선택적으로, 친화성은 반응 혼합물 조건을 제거하고 대체할 필요 없이, 즉, 세척 단계 없이 측정된다. 예를 들어, 결합 상호작용의 측정된 강도의 자동상관관계는 상호작용의 역학을 쉽게 밝혀, 오프-레이트를 측정하기 위해 세척 단계의 필요 없이 친화성을 밝힐 수 있다.
중합효소와 핵산 사이의 역학 상호작용을 측정할 수 있는 임의의 기술이 친화성을 측정하고 본원에 개시된 시퀀싱 반응 방법을 가능하게 하는 데 사용될 수 있다.
뉴클레오타이드
특이적 삼성분 복합체 형성을 검출하기 위한 시스템
제공된 방법은 핵산 중합 반응의 임의의 성분이 표면에 국소화된 플랫폼 상에서 수행될 수 있다. 선택적으로, 주형 핵산은 평면 기질, 나노홀 어레이, 마이크로입자, 또는 나노입자에 부착된다. 선택적으로, 모든 반응 성분은 반응 혼합물에 자유롭게 현탁된다.
선택적으로, 주형 핵산은 표면에 고정화된다. 표면은 평면 기질, 하이드로겔, 나노홀 어레이, 마이크로입자, 또는 나노입자일 수 있다. 선택적으로, 제1 반응 혼합물은 복수의 클론적으로 증폭된 주형 핵산 분자를 포함한다. 선택적으로, 제1 반응 혼합물은 복수의 구별가능한 주형 핵산을 포함한다.
주형 핵산 서열 내의 다음의 염기를 확인하거나 또는 시퀀싱 동안 만나는 동종중합체 영역을 채우는데 필요한 뉴클레오타이드의 수를 확인하기 위해 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 사이의 상호작용을 검사하는 단계를 포함하는 시퀀싱 반응을 수행하기 위한 시스템이 특히 본원에 제공된다. 선택적으로, 검사는 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합효소의 친화성을 모니터링하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 중합효소는 핵산에 일시적으로 결합하고, 결합 동역학 및 친화성은 주형 핵산 상의 다음 염기의 실체에에 관한 정보를 제공한다. 선택적으로, 폐쇄된 복합체가 형성되며, 폐쇄된 복합체의 형성에 관련된 반응 조건은 핵산 상의 다음 염기에 관한 정보를 제공한다. 선택적으로, 중합효소는 중합효소 도메인의 가교, 핵산에 대한 중합효소의 가교, 작은 분자에 의한 알로스테릭 억제, 경쟁력 없는 억제제, 경쟁적 억제제, 비경쟁적 억제제, 및 변성에 제한되지 않는 하나의 수단 또는 수단들의 조합에 의해 그의 삼성분 복합체 내의 중합 부위에서 트랩되며; 트랩된 중합효소 복합체의 형성은 핵산 주형 상의 다음의 염기의 실체에에 관한 정보를 제공한다.
또한 본원에 개시된 임의의 시퀀싱 방법의 하나 이상의 단계를 수행하기 위한 시스템이 제공된다. 선택적으로, 시스템은 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소 및 주형 핵산 결합 분석을 수행하는 데 필요한 성분 및 시약을 포함하며, 주형 핵산은 나노구조 상에 제공된다. 선택적으로, 시스템은 나노구조 상으로 주형 DNA 분자를 결합시키는데 필요한 하나 이상의 시약 및 설명서를 포함한다. 예를 들어, 시스템은 결합 동역학을 결정하기 위해 표면 플라즈몬 공명과 함께 사용하도록 구성된, 칩과 같은 나노구조를 제공한다. 이러한 칩의 예는 CM5 센서 S 칩(GE Healthcare, Piscatawany, N.J)이다. 상기 시스템은 SPR 기구(예컨대, Biacore)와 같은 기기를 제공할 수 있다. 시스템은 스트렙타비딘 및/또는 바이오틴을 제공할 수 있다. 선택적으로, 시스템은 바이오티닐화된 주형 DNA의 제조를 위해 바이오틴-DNA, DNA 리가아제, 완충액, 및/또는 DNA 중합효소를 제공한다. 선택적으로, 시스템은 바이오티닐화된 DNA 정제를 위한 젤 또는 시약(예컨대, 페놀:클로로포름)을 제공한다. 대안적으로, 시스템은 바이오티닐화된 주형 DNA 특성규명, 예를 들어, 질량 분석법 또는 HPLC를 위한 시약을 제공한다. 선택적으로, 시스템은 칩 상에 스트렙타비딘을 고정화시키기 위해 스트렙타비딘, 칩, 시약, 기기, 및/또는 설명서를 포함한다. 선택적으로, 칩은 주형 DNA 코팅을 위해 이미 구성된 시스템에 제공되며, 칩은 주형 핵산 또는 변형된 주형 핵산(예컨대, 바이오티닐화된 주형 DNA)에 결합할 수 있는 시약으로 고정화된다. 선택적으로, 시스템은 칩 재생을 위한 시약을 제공한다.
또한 본원에 개시된 임의의 시퀀싱 방법의 하나 이상의 단계를 수행하기 위한 시스템이 제공된다. 선택적으로, 시스템은 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소 및 주형 핵산 결합 분석을 수행하는 데 필요한 성분 및 시약을 포함하며, 주형 핵산은 나노입자 상에 제공된다. 선택적으로, 시스템은 나노입자 상에 주형 DNA 분자를 결합시키는데 필요한 하나 이상의 시약 및 설명서를 포함한다. 나노입자는 예를 들어, 금 나노입자을 사용하여, 핵산-중합효소 상호작용의 전기화학적 검출을 위해 구성될 수 있다. 선택적으로, DNA-나노입자 접합체는 수성 금 콜로이드 용액 및 이들의 말단에 유리 티올 또는 디설파이드 기를 포함하는 주형 DNA 분자 사이에 형성된다. 접합체는 동일한 핵산 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 DNA 분자의 클론적으로 증폭된 집단을 포함할 수 있다. 선택적으로, 나노입자 접합체는 고온(예컨대,> 60℃) 및 높은 이온 강도(예컨대, 1M Na+)에서 응집 및 침전에 대해 안정화된다. 선택적으로, 시스템은 디설파이드 또는 티올을 갖는 주형 DNA 분자를 생성하는 것을 포함하여, 나노입자 부착을 위한 주형 DNA 분자를 제조하기 위한 시약을 제공한다. 디설파이드 함유 주형 핵산은, 예를 들어, 3'-티올 변형제 제어된-공극 유리(CPG)를 사용하여 또는 보편적인 지지체 CPG로 시작하고 서열 내의 제1 단량체로서 디설파이드 변형제 포스포라미다이트를 첨가함으로써 합성될 수 있다. 시스템은 디설파이드 변형된 주형 핵산을 수득하기 위한 핵산 합성 시약 및/또는 설명서를 제공할 수 있다. 티올 함유 주형 핵산은 또한 5'-트리틸티올 변형제 포스포라미다이트를 이용한 핵산 합성 동안 생성될 수 있다. 시스템은 예를 들어, 전기영동 또는 원심분리를 사용한 나노입자 접합체 정제를 위한 시약 및/또는 설명서를 제공할 수 있다. 선택적으로, 나노입자 접합체는 중합효소-주형 핵산 상호작용을 비색으로 모니터링하는 데 사용된다. 이 경우, 나노입자 접합체의 멜팅 온도는 강한 중합효소 결합의 존재하에 증가한다. 따라서, DNA 결합의 강도는 이 멜팅 전이의 변화에 의해 결정될 수 있고, 이는 색상 변화에 의해 관찰가능하다.
또한 본원에 개시된 임의의 시퀀싱 방법 중 하나 이상의 단계를 수행하기 위한 시스템이 제공된다. 선택적으로, 시스템은 검출 가능한 중합효소를 사용하여, 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소 및 주형 핵산 결합 분석을 수행하는 데 필요한 성분 및 시약을 포함한다. 선택적으로, 중합효소는 검출 가능하게 표지된다. 선택적으로, 중합효소는 중합효소의 내재적 특성, 예를 들어, 방향족 아미노산을 사용하여 검출된다. 선택적으로, 중합효소 및 주형 핵산은 지지체에 접합되지 않고 용액에서 사용하도록 구성된다. 중합효소 상의 검출 가능한 표지는 형광단일 수 있으며, 형광은 중합효소-주형 핵산 결합 사건을 모니터링하는 데 사용된다. 선택적으로, 검출 가능한 중합효소는 용액 중의 주형 핵산, 또는 지지체 구조에 접합된 주형 핵산과 조합하여 사용될 수 있다. 선택적으로, 중합효소의 하나 이상의 시스테인 잔기는 Cy3-말레이미드 또는 Cy3-아이오도아세트아미드로 표지된다. 선택적으로, 시스템은 형광 표지된 중합효소 분자를 제조하는 데 필요한 시약 및/또는 설명서를 포함한다. 시스템은 형광 표지된 중합효소의 정제를 위한 시약 및/또는 설명서를 포함할 수 있다.
방법의 절차상의 특징
삼성분 복합체의 형성을 통해 다음의 염기의 실체에이 확인된 검사 단계 후에, 반응 조건은 선택적인 도입 단계 또는 추가의 검사 단계의 준비로, 적절한 경우 재설정, 재충전, 또는 변형될 수 있다. 선택적으로, 다음의 염기의 실체는 뉴클레오타이드를 화학적으로 도입하지 않고 확인되었다. 선택적으로, 다음의 염기의 실체는 뉴클레오타이드의 화학적 도입으로 확인되며, 후속 뉴클레오타이드 도입이 억제되었다. 선택적으로, 시퀀싱되는 주형 핵산을 제외한 검사 단계의 모든 성분이 제거되고 씻겨 내려가 시스템을 검사전 조건으로 되돌린다. 선택적으로, 검사 단계의 부분적 성분이 제거된다. 선택적으로, 추가의 성분이 검사 단계에 추가된다.
선택적으로, 사이클당 하나, 및 오직 하나의 뉴클레오타이드(즉, 오직 단일 뉴클레오타이드)가 도입되는 것을 보장하기 위해 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드가 도입 단계에서 사용된다. 염기 실체에이 검사 단계에서 알려지기 때문에 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드 상에 표지가 필요하지 않다. 비형광 표지된 가역적 터미네이터는 상업적인 공급업체로부터 쉽게 이용가능하다. 비표지된 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드는 이들의 더 작은 입체적 풋프린트(footprint), 및 자연 뉴클레오타이드와 유사한 크기로 인해 표지된 가역적 터미네이터와 비교하여 훨씬 더 빠른 도입 동역학을 가질 것으로 예상된다.
시퀀싱 시약이 검사 및/또는 도입의 매 사이클 동안 차례로 도입되는 시약 사이클링 시퀀싱 방법이 본원에 부분적으로 개시된다. 선택적으로, 시퀀싱 반응 혼합물은 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 적어도 하나의 유형의 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 및/또는 중합효소는 시퀀싱 반응 혼합물에 주기적으로 도입된다. 선택적으로, 시퀀싱 반응 혼합물은 복수의 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 복수의 뉴클레오타이드 및/또는 복수의 중합효소는 시퀀싱 반응 혼합물에 주기적으로 도입된다. 선택적으로, 시퀀싱 반응의 검사 단계는 시퀀싱 반응의 도입 단계와 상이한 조성물을 갖는다.
본원에 제공된 바와 같이, 중합효소는 단일 중합효소 또는 복수의 중합효소를 지칭한다. 본원에 제공된 바와 같이, 프라이밍된 주형 핵산 또는 주형 핵산은 단일 프라이밍된 주형 핵산 또는 단일 주형 핵산, 또는 복수의 프라이밍된 주형 핵산 또는 복수의 주형 핵산을 지칭한다. 본원에 제공된 바와 같이, 뉴클레오타이드는 하나의 뉴클레오타이드 또는 복수의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 본원에 제공된 바와 같이, 단일 뉴클레오타이드는 하나의 뉴클레오타이드이다. 선택적으로, 시퀀싱 반응 뉴클레오타이드는, 비제한적으로, 하기 뉴클레오타이드 dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP(또는 dUTP) 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함한다. 선택적으로, 시약 사이클링은 주형 핵산을 플랫폼에 고정화시키는 단계, 현재의 반응 혼합물을 씻어내는 단계, 및 새로운 반응 혼합물을 주형 핵산에 첨가하는 단계를 포함한다.
선택적으로, 하나 이상의 뉴클레오타이드는 시퀀싱 반응에 연속적으로 첨가되고 시퀀싱 반응으로부터 제거된다. 선택적으로, 1, 2, 3, 4개 이상의 유형의 뉴클레오타이드가 반응 혼합물에 첨가되고 반응 혼합물로부터 제거된다. 예를 들어, 하나의 유형의 뉴클레오타이드가 시퀀싱 반응에 첨가되고, 제거되고, 또 다른 유형의 뉴클레오타이드에 의해 대체된다. 선택적으로, 검사 단계 동안 존재하는 뉴클레오타이드 유형은 도입 단계 동안 존재하는 뉴클레오타이드 유형과 상이하다. 선택적으로, 하나의 검사 단계 동안 존재하는 뉴클레오타이드 유형은 연속적 검사 단계 동안 존재하는 뉴클레오타이드 유형과 상이하다(즉, 연속적 검사 단계는 도입 단계 전에 수행됨). 선택적으로, 1, 2, 3, 4개 이상의 유형의 뉴클레오타이드가 검사 반응 혼합물 중에 존재하며, 1, 2, 3, 4개 이상의 유형의 뉴클레오타이드가 도입 반응 혼합물 중에 존재한다.
선택적으로, 중합효소는 시퀀싱 반응에 주기적으로 첨가되고 시퀀싱 반응으로부터 제거된다. 하나 이상의 상이한 유형의 중합효소가 시퀀싱 반응에 주기적으로 첨가되고 시퀀싱 반응으로부터 제거된다. 선택적으로, 검사 단계 동안 존재하는 중합효소 유형은 도입 단계 동안 존재하는 중합효소 유형과 상이하다. 하나의 검사 단계 동안 존재하는 중합효소 유형은 연속적 검사 단계 동안 존재하는 중합효소 유형과 상이하다(즉, 연속적 검사 단계는 도입 단계 전에 수행됨).
선택적으로, 시약, pH, 온도, 및 이온 강도의 존재와 같은 시약 조건은 시퀀싱 반응 동안 달라진다. 선택적으로, 금속은 시퀀싱 반응에 주기적으로 첨가되고 시퀀싱 반응으로부터 제거된다. 예를 들어, 촉매성 금속 이온은 검사 단계 동안 부재할 수 있고, 도입 단계 동안 존재할 수 있다. 대안적으로, 중합효소 억제제는 검사 단계 동안 존재하고 도입 단계 동안 부재할 수 있다. 선택적으로, 시퀀싱 반응 동안 소비된 반응 성분은 시퀀싱 반응 동안 임의의 시점에 새로운 성분의 첨가로 보충된다.
뉴클레오타이드는 삼성분 복합체 형성에 유리하고 이성분 복합체의 형성을 불안정화시키는 반응 조건에 중합효소와 함께 한 번에 하나의 유형으로 첨가될 수 있다. 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 존재하는 경우, 중합효소는 주형 핵산에만 결합한다. 모든 뉴클레오타이드 첨가 후 세척 단계는 삼성분 복합체에 관여하지 않은 모든 과량의 중합효소 및 뉴클레오타이드가 반응 혼합물로부터 제거되는 것을 보장한다. 뉴클레오타이드가 공지된 순서로 한 번에 하나씩 첨가되면, 주형 핵산 상의 다음의 염기는 부가된 뉴클레오타이드가 다음의 정확한 뉴클레오타이드일 때 삼성분 복합체의 형성에 의해 결정된다. 삼성분 복합체는 형태적 변화 및 중합효소-주형 핵산-뉴클레오타이드 상호작용의 안정성 증가 모두에 의해 확인될 수 있다. 선택적으로, 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 형성된 삼성분 복합체의 안정성은 부정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 주형 핵산과 중합효소의 불안정적인 상호작용보다 적어도 더 큰 크기이다. 세척 단계의 사용은 결합하지 않은 뉴클레오타이드 및 중합효소가 없다는 것과 반응에 존재하는 뉴클레오타이드만이 중합효소 및 주형 핵산을 갖는 삼성분 복합체에서 격리된다는 것을 보장한다. 주형 핵산 상의 다음의 염기가 결정되면, 폐쇄된 복합체에서 격리된 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 삼성분 복합체의 해리 또는 불안정화에 유리하고 주형 핵산 프라이머 가닥을 하나의 염기에 의해 연장(도입)시키는 반응 조건을 제공하는 시약 교환(예컨대, 플로우 셀을 통한 유동)에 의해 도입될 수 있다. 따라서, 세척 단계는 도입된 뉴클레오타이드만이 삼성분 복합체로부터의 다음의 정확한 뉴클레오타이드라는 것을 보장한다. 이 시약 사이클링 방법은 반복될 수 있고 핵산 서열이 결정될 수 있다. 이 시약 사이클링 방법은 단일 주형 핵산 분자, 또는 PCR 생성물 또는 롤링-서클 증폭된 DNA와 같은 클론 집단의 집합에 적용될 수 있다. 많은 상이한 주형은, 이들이 예를 들어 고체 지지체 상에 어레이되면, 동시에 시퀀싱될 수 있다. 선택적으로, 세척 단계는 이성분 복합체 형성을 불안정화시킨다. 선택적으로, 세척은 이성분 복합체가 제거되는 것을 보장하는 시간 동안 수행되어, 반응 혼합물에 안정화된 폐쇄된 복합체를 남긴다. 선택적으로, 세척 단계는 높은 이온 강도 또는 높은 pH 용액으로 반응을 세척하는 것을 포함한다.
선택적으로, 도입 단계는 3단계 과정이다. 1단계에서, 4개의 모든 뉴클레오타이드 유형은 삼성분 복합체의 형성에 유리한 반응 조건에서 높은 충실도 중합효소를 갖는 프라이밍된 주형 핵산을 포함하는 반응 내로 도입되고, 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 주형 핵산을 갖는 안정적인 삼성분 복합체를 형성하도록 허용된다. 2단계에서, 과량의 뉴클레오타이드 및 결합하지 않은 중합효소는 선택적으로 씻겨 내려간다. 3단계에서, 반응 조건은 삼성분 복합체가 불안정화되고 삼성분 복합체 내의 격리된 뉴클레오타이드가 프라이밍된 주형 핵산의 프라이머의 3'-말단 내로 도입되도록 변형된다. 도입 단계에서 단단한 중합효소-핵산 복합체의 형성은 비특이적 DNA 결합 도메인을 중합효소(예컨대, Phusion 중합효소)에 융합시키고, 고농도의 뉴클레오타이드를 이용하여 정확한 뉴클레오타이드가 폐쇄된 복합체에 항상 존재하는 것을 보장하는 것과 같은 표준 기술에 의해 가능해질 수 있다.
중합효소 분자는 전형적으로 중합효소 합성 반응이 필요한 2가 금속 이온의 부재하에서도 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 핑거 폐쇄된 형태로 프라이밍된 핵산 분자에 결합한다. 형태적 변화는 중합효소의 활성 부위 내에 다음의 주형 염기에 상보적인 뉴클레오타이드를 트랩한다. 선택적으로, 삼성분 복합체의 형성이 주형 핵산 상의 다음의 염기의 실체를 결정하는 데 사용될 수 있다. 선택적으로, 프라이밍된 주형 핵산은 중합효소의 존재하에, 촉매성 2가 금속 이온의 부재하에 상이한 뉴클레오타이드에 의해 순차적으로 접촉될 수 있고; 폐쇄된 복합체의 형성은 주형 핵산과 현재 접촉된 뉴클레오타이드가 핵산 상의 다음의 염기에 대한 상보적 뉴클레오타이드임을 나타낸다. 주형 핵산과 접촉한 뉴클레오타이드의 공지된 순서(중합효소의 존재, 촉매성 금속 이온의 부재하에)는 삼성분 복합체 형성을 유도하는 순서로 특정 위치에 기초하여 상보적 뉴클레오타이드의 용이한 확인을 보장한다. 선택적으로, 모든 과량의 효소 및 뉴클레오타이드의 제거를 보장하기 위해 모든 뉴클레오타이드 첨가 후에 적절한 세척 단계가 수행되며, 이는 활성 부위에 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 갖는 삼성분 복합체 내의 핵산에 결합된 중합효소만을 남긴다. 삼성분 복합체는 폐쇄된 형태의 중합효소의 형태적 변화를 밝히는 수단에 의해 또는 이원 중합효소-핵산 복합체와 비교하여 또는 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산 및 부정확한 뉴클레오타이드 사이의 불안정적인 상호작용과 비교하여 중합효소/핵산/다음의 정확한 뉴클레오타이드 복합체의 안정성 증가를 밝히는 수단에 의해 확인될 수 있다.
선택적으로, 다음의 상보적 뉴클레오타이드를 확인하는 과정(검사 단계)은 뉴클레오타이드의 화학적 도입을 억제하는 조건하에 고정화된 프라이밍된 주형 핵산을 중합효소 및 하나의 종류의 뉴클레오타이드를 포함하는 검사 혼합물과 접촉시키는 단계, 선택적으로 세척 단계에 의해 결합하지 않은 시약을 제거하는 단계, 고정화된 핵산 상의 중합효소 삼성분 복합체의 존재를 검출하는 단계, 및 삼성분 복합체가 형성되고 검출될 때까지 상이한 종류의 뉴클레오타이드를 이용하여 이들 단계를 순차적으로 반복하는 단계를 포함한다. 삼성분 복합체는 형태적 변화 및 중합효소/핵산/다음의 정확한 뉴클레오타이드 복합체의 안정성 증가 모두에 의해 확인될 수 있다. 연속적인 뉴클레오타이드 부가 사이의 세척 단계는 높은 충실도로 폐쇄된 복합체의 형성을 검출할 수 있는 검출 기전, 예를 들어, 에바네센트파 감지 방법 또는 삼성분 복합체로부터의 신호를 선택적으로 모니터링하는 방법을 사용하여 제거될 수 있다. 상기 언급된 검사 단계 후에 삼성분 복합체를 촉매성 금속 이온과 접촉시켜 삼성분 복합체에 격리된 뉴클레오타이드를 프라이머의 3'-말단에 공유적으로 부가하는 단계를 포함하는 도입 단계가 뒤따를 수 있다. 선택적으로, 도입 단계는 뉴클레오타이드의 화학적 도입을 억제하는 조건하에 고정화된 핵산을 다수의 유형의 뉴클레오타이드 및 중합효소의 조합을 포함하는 사전-도입 혼합물과 접촉시키는 것을 포함할 수 있으며; 사전-도입 혼합물은 고효율의 삼성분 복합체 형성을 보장하기 위한 첨가제 및 용액 조건(예컨대, 저염 조건)을 함유할 수 있다. 방법은 또한 결합하지 않은 시약을 제거하는 세척 단계를 수행하는 단계 및 고정화된 복합체를 촉매성 금속 이온을 포함하는 도입 혼합물과 함께 제공하여, 중합효소의 활성 부위 내에 격리된 뉴클레오타이드를 화학적으로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 사전-도입 혼합물은 고효율의 삼성분 복합체 형성을 보장하는 반면, 세척 단계 및 도입 혼합물은 프라이머의 3'-말단에 단일 뉴클레오타이드의 부가를 보장한다. 선택적으로, 도입 단계는 하나의 유형의 뉴클레오타이드의 부가의 검사 단계 직후에 발생할 수 있다. 예를 들어, 시퀀싱에 사용된 반복 패턴은 하기 유동 패턴 (i) dATP+/중합효소, (ii) 세척, (iii) Mg2+, (iv) 세척, (v) dTTP+/중합효소, (vi) 세척, (vii) Mg2+, (viii) 세척, (ix) dCTP+/중합효소, (x) 세척 (xi) Mg2+, (xii) 세척, (xiii) dGTP+/중합효소, (xiv) 세척, (xv) Mg2+, (xvi) 세척을 포함할 수 있다. 선택적으로, 시퀀싱을 위한 반복 패턴은 (i) dATP+/중합효소, (ii) 세척, (iii) dTTP+/중합효소, (iv) 세척, (v) dGTP+/중합효소, (vi) 세척, (vii) dCTP+/중합효소, (viii) 세척, (ix) 사전-도입 혼합물, (x) 세척, (xi) Mg2+, (xii) 세척을 포함할 수 있다. 세척 단계는 전형적으로 검사 단계 동안 우연한 도입을 방지하기 위해 금속 이온 킬레이터 및 다른 작은 분자를 함유한다. 도입 단계 후, 프라이머 가닥은 전형적으로 하나의 염기에 의해 연장된다. 이 과정을 반복하면, 핵산의 연속적인 핵염기가 확인되어, 핵산 서열을 효과적으로 결정할 수 있다. 선택적으로, 검사 단계는 고염 조건, 예를 들어, 50 mM 내지 1,500 mM 염(즉, 1가 금속 양이온과 같은 1가 양이온을 제공하는 염)의 조건하에 수행된다.
시퀀싱 적용을 위해, 유체 및 시약 교환을 최소화하거나 제거하는 것이 유리할 수 있다. 펌프, 밸브 및 시약 용기를 제거하는 것은 더 작고 덜 복잡한 장치를 허용할 수 있다. 검사 및/또는 도입의 매 사이클 동안 시약을 차례로 도입할 필요성이 제거된 "올인(all-in)" 시퀀싱 방법이 본원에 부분적으로 개시된다. 시약은 1번만 반응에 첨가되며, 합성에 의한 시퀀싱은 시퀀싱 반응 내에 이미 봉입된 시약을 조작함으로써 수행된다. 이와 같은 체계는 상이한 뉴클레오타이드를 구별하는 방법, 핵산의 클론 집단 및/또는 상이한 핵산 분자에 대해 뉴클레오타이드의 도입을 동시에 발생시키는 방법, 및 사이클당 하나의 뉴클레오타이드만이 부가되는 것을 보장하는 방법을 필요로 한다. 선택적으로, 시퀀싱 반응 혼합물은 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 적어도 하나의 유형의 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 시퀀싱 반응 혼합물은 복수의 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 바와 같이, 중합효소는 단일 중합효소 또는 복수의 중합효소를 지칭한다. 본원에 제공된 바와 같이, 프라이밍된 주형 핵산 또는 주형 핵산은 단일 프라이밍된 주형 핵산 또는 단일 주형 핵산, 또는 복수의 프라이밍된 주형 핵산 또는 복수의 주형 핵산을 지칭한다. 본원에 제공된 바와 같이, 뉴클레오타이드는 1개의 뉴클레오타이드 또는 복수의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 본원에 제공된 바와 같이, 단일 뉴클레오타이드는 하나의 뉴클레오타이드이다. 선택적으로, 시퀀싱 반응 뉴클레오타이드는, 비제한적으로, 하기 뉴클레오타이드 dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP(또는 dUTP) 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함한다.
선택적으로, 검사 단계 및 도입 단계는 단일 시퀀싱 반응 혼합물에서 발생한다.
선택적으로, 1, 2, 3, 4개 이상의 유형의 뉴클레오타이드(예컨대 dATP, dGTP, dCTP, dTTP)는 동시에 함께 반응 혼합물 중에 존재하며, 하나의 유형의 뉴클레오타이드는 다음의 정확한 뉴클레오타이드이다. 반응 혼합물은 적어도 하나의 중합효소 및 적어도 하나의 프라이밍된 주형 핵산을 추가로 포함한다. 선택적으로, 주형 핵산은 주형 핵산의 클론 집단이다. 선택적으로, 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드는 검사 반응 조건하에 삼성분 복합체를 형성한다.
제공된 방법에서, 4개 유형의 뉴클레오타이드는 구별되고 상이한 농도로 존재할 수 있고, 4개의 뉴클레오타이드의 상이한 농도로 인해, 이들이 다음의 정확한 뉴클레오타이드이면, 주형 핵산에 대한 중합효소의 확산 및 결합은 4개의 뉴클레오타이드 각각에 대해 상이하다. 예를 들어, 가장 높은 농도의 뉴클레오타이드는 더 빠른 시간으로 주형 핵산 상의 그의 상보적 염기에 결합할 것이고, 가장 낮은 농도의 뉴클레오타이드는 느린 시간으로 주형 핵산 상의 그의 상보적 염기에 결합할 것이며; 주형 핵산 상의 상보적 염기에의 결합은 삼성분 복합체 내의 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 갖는 주형 핵산에 대한 중합효소 결합을 지칭한다. 따라서, 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 실체는 삼성분 복합체에서 주형 핵산에 대한 중합효소의 결합 속도 또는 시간을 모니터링함으로써 결정된다. 선택적으로, 4개 유형의 뉴클레오타이드는 이들의 농도에 의해 구별될 수 있고, 뉴클레오타이드의 상이한 농도는 핵산에 결합하는 중합효소에 대해 측정가능하게 상이한 온-레이트를 초래한다. 선택적으로, 4개 유형의 뉴클레오타이드는 이들의 농도에 의해 구별될 수 있고, 뉴클레오타이드의 상이한 농도는 안정화된 삼성분 복합체의 형성에 대해 측정가능하게 상이한 온-레이트를 초래한다.
선택적으로, 중합효소는 표지된다. 일부 경우, 중합효소는 표지되지 않고 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 임의의 표지가 없는 검출 방법이 사용된다. 선택적으로, 핵산에 대한 중합효소의 결합은 중합효소의 검출 가능한 특징을 통해 모니터링된다. 선택적으로, 안정화된 삼성분 복합체의 형성은 중합효소의 검출 가능한 특징을 통해 모니터링된다. 중합효소의 검출 가능한 특징은, 비제한적으로, 광학, 전기적, 열, 비색, 질량, 및 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
선택적으로, 1, 2, 3, 4개 이상의 뉴클레오타이드 유형(예컨대, dATP, dTTP, dCTP, dGTP)은 1, 2, 3, 4개 이상의 상이한 중합효소에 포박되고; 각각의 뉴클레오타이드 유형은 상이한 중합효소에 포박되며, 각각의 중합효소는 그의 확인을 가능하게 하기 위해 다른 중합효소와 상이한 태그 또는 특징을 갖는다. 모든 포박된 뉴클레오타이드 유형은 시퀀싱 반응 혼합물에 함께 첨가되어 포박된 뉴클레오타이드-중합효소를 포함하는 삼성분 복합체를 형성할 수 있으며; 삼성분 복합체는 중합효소를 확인하기 위해 모니터링되어, 중합효소가 포박된 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 확인한다. 포박은 다중 포스페이트 기 및 링커 분자를 통해 뉴클레오타이드의 감마 포스페이트에서 발생할 수 있다. 이러한 감마-포스페이트 연결 방법은 형광단이 감마 포스페이트 링커에 부착되는 당업계의 표준이다. 태그는, 비제한적으로, 광학, 전기적, 열, 비색, 질량, 또는 임의의 다른 검출 가능한 특징을 포함한다. 선택적으로, 상이한 뉴클레오타이드 유형은 구별가능한 태그에 의해 확인된다. 선택적으로, 구별가능한 태그는 각각의 뉴클레오타이드의 감마 포스페이트 위치에 부착된다.
선택적으로, 시퀀싱 반응 혼합물은 촉매성 금속 이온을 포함한다. 선택적으로, 촉매성 금속 이온은 일시적인 방식으로 시퀀싱 반응에서 임의의 시점에 중합효소와 반응하는 데 이용가능하다. 강력한 시퀀싱을 보장하기 위해, 촉매성 금속 이온은 짧은 기간 동안 이용가능하여, 이는 도입 단계 동안 프라이머의 3'-말단 내로 도입될 주형 핵산 내의 다음의 염기에 상보적인 단일 뉴클레오타이드를 허용한다. 이 경우, 다른 뉴클레오타이드, 예를 들어, 주형 핵산 내의 다음의 염기의 하류에 있는 염기에 상보적인 뉴클레오타이드는 도입되지 않는다. 선택적으로, 촉매성 금속 이온 마그네슘은 시퀀싱 반응 혼합물에서 광포착된(photocaged) 복합체(예컨대, DM-Nitrophen)로서 존재하여 국소화된 UV 조명이 마그네슘을 방출시키며, 이는 이것이 뉴클레오타이드 도입을 위한 중합효소에 이용가능하게 만든다. 또한, 시퀀싱 반응 혼합물은 EDTA를 함유할 수 있고, 마그네슘은 촉매성 뉴클레오타이드 도입 후 중합효소 활성 부위로부터 방출되고 시퀀싱 반응 혼합물 내의 EDTA에 의해 포획되어, 마그네슘이 후속 뉴클레오타이드 도입을 촉매할 수 없게 만든다.
따라서, 제공된 방법에서, 촉매성 금속 이온은 촉발자에 의해 방출될 수 있는 킬레이트화된 또는 포착된(caged) 형태로 시퀀싱 반응에 존재할 수 있다. 예를 들어, 촉매성 금속 이온은 삼성분 복합체 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 도입을 촉매하고, 촉매성 금속 이온이 활성 부위로부터 방출됨에 따라, 제2 킬레이트제 또는 케이징제(caging agent)에 의해 격리되어, 금속 이온이 후속 도입을 촉매하는 것을 불가능하게 한다. 그의 킬레이팅 또는 포착된 복합체로부터 촉매성 금속 이온의 국소화된 방출은 에바네센트파 조명 또는 구조화된 조명과 같은 국소화된 비포착 또는 비킬레이팅 방식을 사용하여 보장된다. 촉매성 금속 이온의 제어된 방출은 예를 들어, 열적 수단에 의해 발생할 수 있다. 이들의 광포착된 복합체로부터의 촉매성 금속 이온의 제어된 방출은 제한된 광학 장에 의해, 예를 들어 도파관 또는 총 내부 반사 형미경검사와 같은 에바네센트 조명에 의해, 주형 핵산의 근처에서 국소적으로 방출될 수 있다. 촉매성 금속 이온의 제어된 방출은 예를 들어, 주형 핵산의 부근 근처의 용액의 pH를 변경함으로써 발생할 수 있다. EDTA 및 EGTA와 같은 킬레이트화제는 pH 의존적이다. 5 미만의 pH에서, 2가 양이온 Mg2+ 및 Mn2+는 EDTA에 의해 효과적으로 킬레이트화되지 않는다. 주형 핵산 근처의 pH를 제어적으로 조절하는 방법은 킬레이트화제로부터 촉매성 금속 이온의 제어된 방출을 허용한다. 선택적으로, 국소적 pH 변화는 핵산이 부착되는 표면에 전압을 인가함으로써 유도된다. pH 방법은 pH가 킬레이트화 범위로 되돌아갈 때 금속이 그의 킬레이트화된 형태로 되돌아간다는 점에서 이점을 제공한다.
선택적으로, 촉매성 금속 이온은 중합효소의 활성 부위에 강하게 결합되어, 단일 뉴클레오타이드 도입 후 주형 핵산으로부터 중합효소를 제거할 필요가 있다. 중합효소의 제거는 모든 뉴클레오타이드의 첨가 이후 합성되는 가닥(프라이머)의 3'-말단에서 떨어져 나가는, 고도의 분배성 중합효소의 사용에 의해 달성될 수 있다. 결합하지 않은 중합효소는 핵산 분자의 부근으로부터 그것을 제거하기 위해 전기장 또는 자기장에 추가로 적용될 수 있다. 중합효소에 결합된 임의의 금속 이온은 시퀀싱 반응 혼합물 중에 존재하는 킬레이트화제에 의해, 또는 폐쇄된 복합체의 형성을 방해하지 않고 중합효소의 활성 부위에의 결합에 대해 금속 이온과 경쟁하는 분자에 의해 격리될 수 있다. 주형 핵산으로부터 중합효소를 제거하거나 이동시키는 힘(예컨대, 전계, 자기장, 및/또는 킬레이트화제)은 종료되어, 중합효소가 또 다른 시퀀싱 라운드(즉, 검사 및 도입)를 위해 주형 핵산에 접근하게 할 수 있다. 비제한적인 예에서, 다음 시퀀싱 라운드는 삼성분 복합체의 형성, 주형 핵산 및/또는 삼성분 복합체의 부근으로부터 결합하지 않은 중합효소의 제거, 삼성분 복합체 내에 격리된 단일 뉴클레오타이드를 도입하는 촉매성 금속 이온의 방출의 제어, 주형 핵산의 부근으로부터 단일 도입 후 주형 핵산으로부터 해리되는 중합효소의 제거, 킬레이트화제 또는 경쟁적 결합제의 사용을 통한 임의의 자유 촉매성 금속 이온의 격리, 및 시퀀싱의 다음 사이클을 수행하기 위해 중합효소가 주형 핵산에 접근하게 하는 것을 포함한다.
핵산 서열의 확인을 위한 중합효소-핵산 결합 반응이 상기에 기재되어 있다. 핵산 서열 확인은 핵산 변형과 관련된 정보를 포함할 수 있다. 핵산 변형은 메틸화 및 하이드록시메틸화를 포함한다. 메틸화는 주형 핵산의 사이토신 염기에서 발생할 수 있다. DNA 메틸화는 유전자의 발현을 안정적으로 변경할 수 있다. DNA 메틸화는 또한 다양한 유형의 암, 아테롬성 동맥경화증, 및 노화의 발달에서 나타난다. 따라서, DNA 메틸화는 인간 질환에 대한 후생 바이오마커로서 작용할 수 있다.
선택적으로, 주형 핵산 상의 하나 이상의 사이토신 메틸화는 본원에 제공된 결합에 의한 시퀀싱 방법 동안 확인된다. 주형 핵산은 시퀀싱 전에 클론적으로 증폭될 수 있으며, 앰플리콘은 이들의 주형 핵산과 동일한 메틸화를 포함한다. 주형 핵산의 증폭은 앰플리콘 메틸화를 달성하는 DNA 메틸전이효소의 사용을 포함할 수 있다. 주형 핵산 또는 증폭된 주형 핵산은 중합효소 및 하나 이상의 뉴클레오타이드 유형을 포함하는 반응 혼합물에 제공되며, 중합효소와 핵산 사이의 상호작용이 모니터링된다. 선택적으로, 메틸화된 사이토신의 존재하에 중합효소 및 핵산 사이의 상호작용은 변형되지 않은 사이토신의 존재하에서의 상호작용과 상이하다. 따라서, 중합효소-핵산 상호작용의 검사에 기초하여, 변형된 뉴클레오타이드의 실체에이 결정된다.
뉴클레오타이드 및 다음의 염기의 다양한 가능한 조합에 대한 중합효소-핵산 친화성의 표를 생성하는 방법이 본원에 제공된다. 이러한 친화성은 주로 핵산 주형 상의 뉴클레오타이드 및 다음 염기만이 참여하는 중합효소 활성 부위에서의 상호작용에 영향을 받기 때문에, 문맥 특이적 효과는 무시될 수 있다. 문맥 특이적 효과는 핵산의 2차 구조 및 주형 핵산 상의 다음의 염기로부터 서열 더 아래의 염기의 기여를 포함할 수 있다. 친화성의 표는 자연 또는 변형된 뉴클레오타이드의 결정을 허용하며, 이는 상이한 주형 염기에 대한 친화성에서 가장 넓고 가장 쉽게 측정된 분산을 유도한다. 선택적으로, 주형 염기는 염기 dATP, dTTP, dCTP, 및 dGTP 중 1, 2, 3, 또는 4개이다. 가장 강한 친화성은 뉴클레오타이드에 상보적인 염기에 대해 존재할 것으로 이해된다. 본원에 사용된 바와 같이, 분산은 특히 다른 3개의 부정확한 비상보적 염기에 대한 친화성의 편차를 지칭한다. 선택적으로, 뉴클레오타이드 도입을 억제하고 이성분 복합체 형성을 불안정화시키는 검사 조건하에 각각의 친화성이 측정된다. 선택적으로, 중합효소는 친화성의 광범위한 분산을 제공하도록 변형되거나 선택된다. 조작된 또는 자연 중합효소는 시퀀싱 효소로서 불리한 오류 프로파일 또는 다른 불리한 특성을 가질 수 있는데, 이 중합효소는 비도입 조건하에서만 사용될 것이기 때문에 중요하지 않다. 중합효소는 상이한 주형 염기에 대해 쉽게 측정가능하고 구별되는 친화성을 제공하는 그의 능력에 대해 명시적으로 선택될 수 있다. 원하는 특성을 갖는 중합효소의 진화 또는 스크리닝은 당업계의 표준 절차(예컨대, 변형된 뉴클레오타이드에 대해 높은 친화성을 갖는 중합효소를 스크리닝하는 것)이다. 선택적으로, 중합효소는 도입 단계를 위해 고충실도 중합효소로 대체된다. 선택적으로, 중합효소 및 뉴클레오타이드의 조합은 주형 염기에 대해 가장 편리한 친화성을 제공함으로써, 선택된 뉴클레오타이드의 존재하에 주형 핵산에 대한 선택된 중합효소의 친화성을 측정하는 시퀀싱 방법의 실행을 허용하도록 선택된다. 핵산 상의 다음 염기는 측정된 친화성으로부터 결정되는데, 주형 염기에 대한 친화성의 스펙트럼이 제작된 친화성 표에서 제공되기 때문이다. 친화성은 중합효소 핵산 상호작용의 온-레이트, 오프-레이트, 또는 온-레이트 및 오프-레이트의 조합일 수 있다.
뉴클레오타이드의 존재하에 주형 핵산에 대한 중합효소의 친화성은 당업자에게 공지된 복수의 방법으로 측정될 수 있다. 선택적으로, 친화성은 오프-레이트로서 측정되며, 오프-레이트는 반응이 세척 완충액에 의해 세척됨에 따라 주형 핵산으로부터 중합효소의 방출을 모니터링함으로써 측정된다. 선택적으로, 친화성은 오프-레이트로서 측정되며, 오프-레이트는 평형 결합 조건, 특히 중합효소 결합 속도가 낮거나 확산이 제한되는 평형 결합 조건하에, 주형 핵산으로부터 중합효소의 방출을 모니터링함으로써 측정된다. 중합효소 결합 속도는 중합효소의 충분히 낮은 농도에서 확산 제한될 수 있는데, 중합효소가 DNA-중합효소 복합체로부터 떨어지면, 그것은 즉시 다시 로딩되지 않아, 중합효소가 복합체로부터 방출되었는지를 검출하기 위한 충분한 시간을 허용한다. 더 높은 친화성 상호작용을 위해, 중합효소는 핵산으로부터 느리게 방출되는 반면, 낮은 친화성 상호작용은 중합효소가 더 빨리 방출되게 한다. 이 경우, 친화성의 스펙트럼은 상이한 오프-레이트로 변환되며, 오프-레이트는 동적 세척 조건하에 또는 평형에서 측정된다. 가장 작은 오프-레이트는 첨가된 뉴클레오타이드에 상보적인 염기에 해당하는 반면, 다른 오프-레이트는 선택된 중합효소 및 뉴클레오타이드의 조합에 따라 공지된 방식으로 달라진다.
선택적으로, 오프-레이트는 중합효소 및 뉴클레오타이드가 반응 혼합물에 제공된 후 평형 신호 강도로서 측정되며, 가장 낮은 오프-레이트(가장 높은 친화성) 뉴클레오타이드와의 상호작용은 가장 강한 신호를 생성하는 반면, 다른 다양한 오프-레이트 뉴클레오타이드와의 상호작용은 측정가능하게 상이한 강도의 신호를 생성한다. 비제한적인 예로서, 바람직하게는, 총 내부 반사(TIRF) 조건하에 측정된 형광 표지된 중합효소는 적합하게 선택된 시간 윈도우에서 표면 고정화된 핵산 분자에 결합된 중합효소 분자의 수에 따라 상이한 측정된 형광 강도를 생성한다. 중합효소의 내재적 형광, 예를 들어, 트립토판 형광이 또한 이용될 수 있다. 선택된 시간 윈도우에서 결합된 중합효소 분자의 수가 매우 작기 때문에, 높은 오프-레이트 상호작용은 낮은 측정된 강도를 생성하며, 높은 오프-레이트는 대부분의 중합효소가 핵산으로부터 결합되지 않음을 나타낸다. 비제한적으로, 표지된 또는 형광 체계를 포함하는 임의의 표면 국소화된 측정 체계가 사용될 수 있다. 평형 조건하에 친화성을 측정하는 적합한 측정 체계는 비제한적으로, 결합된 질량, 굴절률, 표면 전하, 유전체 상수, 및 당업계에 공지된 체계를 포함한다. 선택적으로, 온-레이트 및 오프-레이트 조작의 조합은 제안된 방식에서 더 높은 충실도 검출을 생성한다. 비제한적인 예로서, 균일하게 낮은 온-레이트, 염기 의존적, 가변적 오프-레이트는 연장된 기간 동안 결합하지 않은 상태로 남아있는 결합하지 않은 중합효소를 초래하여, 오프-레이트 및 측정된 강도의 변화의 향상된 구별을 가능하게 한다. 온-레이트는 첨가된 중합효소, 뉴클레오타이드, 또는 중합효소 및 뉴클레오타이드 모두의 농도를 낮춤으로써 조작될 수 있다.
선택적으로, 중합효소와 핵산 사이의 상호작용은 중합효소에 부착된 검출 가능한 태그를 통해 모니터링된다. 태그는 비제한적으로, 광학, 전기적, 열, 질량, 크기, 전하, 진동, 및 압력을 포함하는 검출 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 표지는 자기, 형광 또는 하전될 수 있다. 외부 및 내부 표지 체계의 경우, 형광 이방성(anisotropy)이 삼성분 복합체에서 핵산에 대한 중합효소의 안정적인 결합을 결정하는 데 사용될 수 있다.
예로서, 중합효소는 형광단으로 태깅되며, 폐쇄된 복합체 형성은 안정적인 형광 신호로서 모니터링된다. 부정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 주형 핵산과 중합효소의 불안정적인 상호작용은 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 존재하에 형성된 삼성분 복합체와 비교하여 측정가능하게 더 약한 신호를 초래한다.
선택적으로, 뉴클레오타이드의 존재하에 중합효소와 주형 핵산 사이의 상호작용은, 비제한적으로, 라만 시그너처, 트립토판, 2-아미노퓨린 또는 다른 내재적 형광을 포함하는, 중합효소로부터의 내재적 신호를 이용하여 모니터링된다. 중합효소 아미노산의 내재적 형광은 본원에 개시된 시퀀싱 방법의 하나 이상의 단계 동안 발생하는 중합효소 형태적 변화, 예를 들어 삼성분 복합체 형성 또는 방출을 검출하는 데 이용될 수 있다. 내재적 형광을 갖는 아미노산은 트립토판, 티로신, 및 페닐알라닌을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 중합효소 아미노산은 트립토판, 티로신, 또는 페닐알라닌 잔기를 포함하도록 돌연변이된다. 중합효소는 내재적 형광을 갖는 추가의 아미노산을 포함하도록 유전적 또는 화학적 변형을 포함하는 임의의 수단에 의해 변형될 수 있다. 선택적으로, 내재적 형광은 형광의 ?칭을 유발할 수 있는 다른 아미노산, 예컨대 양성자화된 기를 갖는 아미노산(예컨대, 아스파트산, 글루탐산)의 근접에 의해 영향을 받는다. 선택적으로, 중합효소의 트립토판 잔기는 중합효소가 삼성분 복합체로 구성될 때 소수성 코어에 묻혀 있고, 중합효소가 방출되거나 폐쇄된 복합체 형태에 결합되지 않을 때 수성 환경에 노출된다. 트립토판의 방출 스펙트럼은 환경(친수성 또는 소수성)에 따라 상이하며, 이는 삼성분 복합체의 검출을 가능하게 한다. 선택적으로, 중합효소의 내재적 형광이 시퀀싱 반응 동안 형태적 변화를 확인하는 데 사용된다. 일 예에서, 중합효소의 트립토판 잔기로부터의 내재적 형광 방출은 그 전체가 참조로 본원에 포함된 문헌[Yu-Chih Tsai, Zhinan Jin, and Kenneth A. Johnson, "Site-Specific Labeling of T7 DNA Polymerase with a Conformationally Sensitive Fluorophore and Its Use in Detecting Single Nucleotide Polymorphisms," Analytical Biochemistry 384, no. 1 (January 1, 2009): 136-44]에 언급된 것과 유사한 기술을 사용하여 모니터링된다.
선택적으로, 제공된 방법에서, 하나 이상의 검사 및/또는 도입 단계 후, 위상조정(phasing)을 감소시키거나 재설정하기 위해 뉴클레오타이드의 서브세트가 첨가된다. 따라서, 방법은 핵산 분자의 주형 가닥의 반대편 가닥 내로 뉴클레오타이드를 도입하기 위해, 시퀀싱되는 주형 핵산 분자를 뉴클레오타이드 및 효소의 서브세트를 포함하는 조성물과 접촉시키는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 접촉은 핵산 분자에서 위상조정을 감소시키는 조건하에 발생할 수 있다. 선택적으로, 주형 핵산 분자를 접촉시키는 단계는 도입 단계 후 및/또는 검사 단계 후에 발생한다. 선택적으로, 접촉은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 라운드 이상의 시퀀싱, 즉, 수회의 검사 및 도입 후에 발생한다. 선택적으로, 접촉은 30 내지 60회의 시퀀싱 후에 발생한다. 선택적으로, 접촉은 매 시퀀싱 라운드 후에, 즉, 하나의 검사 및 도입 단계 후에 발생한다. 선택적으로, 다수의 접촉 단계는 매 시퀀싱 라운드 후에 발생하며, 각각의 접촉 단계는 뉴클레오타이드의 상이한 서브세트를 포함할 수 있다. 선택적으로, 방법은 접촉 후 하나 이상의 세척 단계를 추가로 포함한다. 선택적으로, 서브세트는 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 서브세트는 3개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 뉴클레오타이드의 서브세트는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP(또는 dUTP) 또는 이의 유도체 중 3개로부터 선택된다. 선택적으로, 3개의 뉴클레오타이드는 아데노신, 사이토신, 및 구아닌을 포함한다. 선택적으로, 3개의 뉴클레오타이드는 아데노신, 사이토신, 및 티민을 포함한다. 선택적으로, 3개의 뉴클레오타이드는 사이토신, 구아닌 및 티민을 포함한다. 선택적으로, 3개의 뉴클레오타이드는 아데노신, 구아닌 및 티민을 포함한다. 선택적으로, 접촉의 각각의 라운드는 뉴클레오타이드의 동일한 서브세트 또는 상이한 서브세트를 포함한다. 선택적으로, 핵산 주형의 시퀀싱은 모니터링되고, 뉴클레오타이드의 서브세트와의 접촉은 위상조정의 검출시 발생한다. 또한 예를 들어, 그 전체가 참조로 본원에 포함된 미국 특허 제8,236,532호를 참고한다.
선택적으로, 시퀀싱 반응은 복수의 주형 핵산, 중합효소 및/또는 뉴클레오타이드를 포함하며, 복수의 삼성분 복합체는 모니터링된다. 클론적으로 증폭된 주형 핵산은 함께 시퀀싱될 수 있으며, 시퀀싱 동안 향상된 모니터링을 허용하기 위해 클론은 근접하여 국소화된다. 선택적으로, 삼성분 복합체의 형성은 복수의 클론적으로 증폭된 주형 핵산에 대해 염기 연장의 동시성을 보장한다. 염기 연장의 동시성은 시퀀싱 사이클당 하나의 염기만의 추가를 허용한다.
실시예
실시예 1은 검사 단계 동안 2가 촉매성 양이온을 포함하거나 생략하는 결과를 조사한 절차를 기술한다. 절차는 표지가 없는 시스템 및 클레나우 중합효소를 사용하여 수행되었다.
실시예
1
결합 단계에서 마그네슘을 갖거나 없는 염기 서열의 결정
절차에 사용된 물질 및 방법은 다음과 같았다. 중합효소 완충액: 20 mM 트리스, pH 8.0, 300 mM NaCl, 5mM DTT, 100 μM dNTP, 150 nM 클레나우, 0.01% BSA, 0.02% 트윈-20, 10 mM MgCl2. 검사 완충액: 20 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 300 mM NaCl, 5 mM DTT, 100 μM dNTP, 150 nM 클레나우, 0.01% BSA, 0.02% 트윈-20. 도입 완충액: 20 mM 트리스 완충액(pH 8), 300 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.01% BSA, 0.02% 트윈-20, 10 mM MgCl2. 세척 완충액: 20 mM 트리스 완충액(pH 8), 300 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.01% BSA, 0.02% 트윈-20.
도 1은 검사 단계 동안 마그네슘이 존재하거나 부재하는 비표지된 광학 검출 방법을 사용한 실험의 결과를 나타낸다. 제1 유동은 dCTP(C:T 미스매치)를 포함하였고, 제2 유동은 dATP(A:T 매치)를 포함하였다. 도 1의 실선은 중합효소 완충액을 사용하여 수득된 결과를 나타낸다. 사전-정상 상태 속도 상수는 매치 A 및 미스매치 C 단계에 대해 각각 0.0106 및 0.0084였다. 차이가 너무 작아 동족 염기를 정확히 구별할 수 없었다. 도 1의 점선은 검사 완충액에서 마그네슘이 없는 검사 단계 후 도입 완충액에서의 침지를 나타낸다. 1.1 nm의 신호 역치는 정확한 염기를 정확하게 결정하였다. 이러한 결과는 감지 플랫폼이 매치와 미스매치 염기를 구별할 수 있는 일시적인 동역학을 포착할 수 없었고, 마그네슘이 검사 동안 완충액 중에 포함되었을 때(중합효소 완충액, 실선, 도 1) 서열 결정이 불가능할 것임을 나타내었다. 대조적으로, 마그네슘의 부재하에서의 결합은 정확한 염기와 부정확한 염기 사이의 매우 큰 구별을 제공하였다(검사 완충액, 점선, 도 1). 이 절차에서 정확한 염기 서열은 결합 속도보다 신호 역치에 의해 결정되었다.
실시예 2는 어떻게 결합 동역학이 검사 단계 동안(즉, 중합효소, DNA 주형 및 뉴클레오타이드 사이의 삼성분 복합체의 형성 동안) 정확한 염기 또는 뉴클레오타이드를 결정하는 데 사용될 수 있는지 입증한 절차를 기술한다. Bst 효소는 정확한 염기가 제공되었을 때 이정(bimodal) 결합 곡선을 나타내었고 부정확한 염기가 제공되었을 때 기본적인 지수 결합 거동을 나타내어, 절차 동안 정확한 염기 또는 뉴클레오타이드의 구별 및 검출을 가능하게 하였다.
실시예
2
Bst
효소 결합 동역학을 이용한 시퀀싱
절차에 사용된 물질 및 방법은 다음과 같았다. FORTEBIO®(Menlo Park, CA) 옥텟 기구(Red384 또는 QK)는 광섬유 팁의 표면에서 결합 반응을 측정하는 생물층 간섭계를 사용한다. 팁은 주형의 3'-말단 근처의 서열에 상보적인 프라이머와 혼성화된 5' 바이오틴 표지된 DNA 주형에 결합할 수 있도록 스트렙타비딘(SA)으로 기능화되었다. PhiX_matchC 및 phiX_matchA를 개별 팁에 로딩하였다. 프라이머-주형을 0.01-0.02% BSA 및 0.01-0.02% 트윈-20(로딩 완충액)을 함유하는 1-2x PBS 중에 100 내지 500 nM로 팁에 로딩하였다. FP2 프라이머는 주형보다 1.25-2배 과량이었다. 로딩을 신호의 변화에 의해 모니터링하였고, 보통 30℃에서 5분 내에 정체기에 도달하였다. 팁을 1-5분 동안 로딩 완충액에 침지하여 결합하지 않은 DNA 물질을 제거하였다. 염기 호출을 위해, 팁을 0.01-0.02% BSA 및 0.01-0.02% 트윈-20(LS 완충액), 100 nM 중합효소, 100 μM 뉴클레오타이드, 및 50 내지 300 mM의 다양한 농도의 추가의 NaCl이 보충된 1X Taq 완충액(10 mM 트리스-HCl(pH 8.3), 50 mM KCl, 25℃, 마그네슘 없음)을 함유하는 용액에 전형적으로 침지하였다. 이 실험에서, 정확한 염기를 결정하기 위해, 30 nM Bst2.0 효소, 100 μM dNTP, 및 150 mM NaCl을 함유하는 LS 완충액을 사용하였다. phiX_matchC 이합체는 삼성분 복합체를 형성하고 결합 신호의 증가를 나타낼 것인데, 정확한 다음 뉴클레오타이드(동족)가 제시되기 때문이다. phiX_matchA는 그렇지 않아야 하는데, 그것이 부정확한 뉴클레오타이드(비동족)이기 때문이다. 검사 단계 후, 센서를 5 mM Mg2 +를 함유하는 LS 완충액에 침지하여 중합효소가 뉴클레오타이드를 도입하게 하고, 이후 150 mM NaCl을 함유하는 LS 완충액으로 세척하였다.
절차의 결과가 도 2에 나타나 있다. 반복 사이클링은 이 방법이 서열 결정에 사용될 수 있음을 보여주었다. 표 2는 처음 3개의 염기가 이 검사 방법에 의해 정확히 확인되었음을 보여준다. 4번째 염기는 검사 방법에 의해 "호출 없음(no call)"이었고, 다수의 부가를 반영할 수 있다. 이것과 일치하게도, 후속 염기가 정확히 확인되었다. 전체적으로, 6개의 염기 중 5개가 정확하게 확인되었다. 또한, 부정확한 염기의 잘못된 도입은 관찰되지 않았다.
실시예 3은 높은 염 조건을 사용한 검사 단계 후에 도입 단계가 뒤따르는 시퀀싱 반응을 기술한다.
실시예
3
결합에 의한 시퀀싱
절차에 사용된 물질 및 방법은 다음과 같았다. 이 경우에 사용된 결합/검사 완충액은 250 mM NaCl, 100 μM dGTP, dCTP, dATP, 또는 dTTP, 1.5 mM Sr2 +, 100 nM 클레나우 엑소(-) 중합효소를 갖는 LS 완충액이었다. 도입 완충액은 50 mM NaCl, 50 mM MgCl2를 갖는 LS 완충액이었고, 세척 완충액은 250 mM NaCl을 갖는 LS 완충액이었다. FORTEBIO® 옥텟 Red384 시스템(Menlo Park, CA)을 사용하여, 시퀀싱 사이클을 SA 센서 팁에 부착된 바이오틴 phiX_matchC 주형 및 FP2 프라이머 서열을 사용하여 수행하였다. 시퀀싱 단계는 하기로 구성되었다: (a) dATP를 이용한 검사, (b) 도입, (c) 세척; (d) dGTP를 이용한 검사, (e) 도입, (f) 세척; (g) dCTP를 이용한 검사, (h) 도입, (i) 세척; (j) dTTP를 이용한 검사, (k) 도입, (l) 세척, 이후 (a)부터 이들 단계의 반복. 염기 호출의 경우, 검사 단계는 이전 세척 단계로부터의 기저선을 초과하여 및/또는 대조군 서열에 비해 검출 가능한 신호를 생성하였다.
이 절차로부터의 결과는 12개의 염기가 정확히 확인되었음을 나타내었다. 2개의 염기는 확인되지 않았는데, 결합 신호가 너무 낮았기 때문이다. 이 실험은 표 3에서 하기에 나타낸 바와 같이 12/14 염기를 정확하게 확인하였다.
실시예 4는 중합효소 매치/미스매치 구별에 대한 1가 양이온을 함유하는 염의 효과를 확립하기 위해 초기에 사용된 절차를 기술한다. 절차에 사용된 FORTEBIO® 옥텟 기구(Red384 또는 QK)(Menlo Park, CA)는 광섬유 팁의 표면에서 결합 반응을 측정하는 생물층 간섭계를 사용하였다. 팁은 주형의 3'-말단 근처의 서열에 상보적인 프라이머와 혼성화된 5' 바이오틴 표지된 DNA 주형에 결합할 수 있도록 스트렙타비딘(SA)으로 기능화되었다.
실시예
4
매치/
미스매치
염기 구별에서의 염 농도
절차에 사용된 물질 및 방법은 다음과 같았다. PhiX_matchC 및 phiX_matchA를 개별 팁에 로딩하였다. 프라이머-주형을 0.01-0.02% BSA 및 0.01-0.02% 트윈-20(로딩 완충액)을 함유하는 1-2xPBS 중에 100 내지 500 nM로 팁에 로딩하였다. FP2 프라이머는 주형보다 1.25-2배였다. 로딩을 신호의 변화에 의해 모니터링하였고, 보통 30℃에서 5분 내에 정체기에 도달하였다. 팁을 1-5분 동안 로딩 완충액에 침지하여 결합하지 않은 DNA 물질을 제거하였다. 염기 호출을 위해, 팁을 전형적으로 0.01-0.02% BSA 및 0.01-0.02% 트윈-20(LS 완충액), 100 nM 중합효소, 100 μM dNTP, 및 50 내지 300 mM의 다양한 농도의 추가의 NaCl이 보충된 1X Taq 완충액(10 mM 트리스-HCl, 50 mM KCl, 25℃에서 pH 8.3, 마그네슘 없음)을 함유하는 용액에 침지하였다. phiX_matchC 이합체는 삼성분 복합체를 형성하고 결합 신호의 증가를 나타낼 것인데, 정확한 다음의 뉴클레오타이드(동족)가 제시되기 때문이다. phiX_matchA는 결합 신호 증가를 유발하지 않아야 하는데, 그것이 부정확한(비동족) 뉴클레오타이드이기 때문이다.
결과는 두 주형이 표준 반응 조건하에 중합효소에 결합하였다는 것을 나타내었다. 그러나, 염 농도가 증가함에 따라, 비동족 복합체의 결합 친화성은 감소한 반면, 동족 복합체의 결합 친화성은 높게 유지되었다. 따라서, 염기 구별의 신호 대 노이즈 비율(SNR)은 증가하여 다음의 정확한 염기가 이 검사 단계 동안 쉽게 확인될 수 있다(도 3 참고). 본 실시예에서 NaCl이 1가 양이온을 함유하는 모델 염으로서 사용되었지만, KCl, NH2(SO4), 칼륨 글루타메이트, 및 당업계에 공지된 다른 것과 같은 다른 염이 또한 사용될 수 있다. 정확한 뉴클레오타이드와 부정확한 뉴클레오타이드 간의 결합 친화성의 차이를 나타내는 중합효소는 클레나우 중합효소, Bst2.0, Bsu, 및 Taq을 포함하였다.
실시예 5는 어떻게 결합 반응의 결합 및 해리 단계 동안의 검사가 서열 충실도를 개선하는 데 사용될 수 있는지 입증한 절차를 기술한다. 이 경우, 동족 뉴클레오타이드는 삼성분 복합체의 해리(즉, 손실)에 의해 확인될 수 있었다.
실시예
5
해리/세척 단계 동안 염기 구별
절차에 사용된 물질 및 방법은 다음과 같았다. 이 실험에서, phiX_matchC 및 FP2 프라이머를 상기에 기재된 바와 같이 SA-센서 팁에 로딩하였다. 중합효소 복합체를 100 μM의 dGTP, dCTP, dATP, 또는 dTTP 중 어느 하나, 및 100 nM 클레나우 또는 Bst2.0 효소, 및 1 mM SrCl2를 갖는 LS 완충액에서 형성하였다.
결과는, 낮은 염에서 중합효소가 동족 뉴클레오타이드가 존재하는지 여부에 관계없이 프라이밍된 주형 핵산의 DNA에 효과적으로 결합하였음을 나타내었다. 세척 완충액(LS 완충액 + 50 mM 또는 100 mM 첨가된 NaCl)에서, 모든 복합체가 해리되었다. 추가의 NaCl이 존재하였을 때 SrCl2조차 복합체를 안정화시키지 못했다. 그러나, 결합 완충액에 있었던 50 μM의 동일한 dNTP가 세척 완충액에 포함된 경우, 해리된 부정확한 뉴클레오타이드를 갖는 복합체와 정확한 삼성분 복합체만이 안정화되었다(도 4 참고). 또한, dNTP는 결합 단계에서 불필요하였고 세척 동안 포함될 수 있음이 밝혀졌다. 결합된 이성분 복합체는 정확한 dNTP가 이후에 도입되었을 때 여전히 정확한 염기가 들어가 삼성분 복합체를 형성하게 할 수 있었다. 또한, 충실도는 부정확한 뉴클레오타이드의 존재에 의해 영향을 받지 않았다. 따라서, 중합효소의 해리 속도는 또한 dNTP의 혼합물에서 정확한 염기를 결정하는 데 사용될 수 있다(예컨대, 상이한 속도로 해리될 상이한 농도에서).
실시예
6
세척 완충액에서
핵산:중합효소
복합체의 안정화
동종중합체 영역에서 다수의 도입의 가능성을 최소화하기 위해, 세척 단계가 도입 전에 수행될 수 있다. 칼슘 및 스트론튬과 같은 금속 양이온은 중합효소 복합체를 안정화시킬 수 있지만(마그네슘과 같이), 뉴클레오타이드의 도입을 초래하는 포스포디에스테르 결합의 촉매 작용을 지원할 수 없다. 이 실험에서, 다양한 농도의 SrCl2(0 mM-14 mM)를 세척 완충액(LS 완충액)에 첨가하였다. 중합효소 복합체는 세척 완충액 중에 3.5 mM 정도의 적은 Sr2 + 이온(가장 낮은 농도)의 존재하에 훨씬 더 안정적이었다. 또한, 복합체의 안정성은 결합 단계 동안 정확한 또는 부정확한 뉴클레오타이드가 존재하였을 때 현저히 영향을 받지 않았고, 이는 중합효소의 Sr2 + 관련 안정성이 삼성분 복합체에 제한되지 않았음을 나타낸다. 결과가 도 5에 나타나 있다.
실시예 7은 DNA Pol I의 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성의 효과를 조사한 절차를 기술한다. 엑소뉴클레아제 활성은 충실도를 증가시키는데, 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 제공된 교정 기능에 의해 부정확한 염기 또는 플랩이 제거되기 때문이다. 그러나, 이 활성은 정확한 염기를 잠재적으로 절단하고 부정확한 서열 판독을 야기할 수 있다.
실시예
7
3'
-
5'
엑소뉴클레아제
활성이 없는 DNA
pol I의
사용
절차에 사용된 물질 및 방법은 다음과 같았다. 3' 말단 미스매치를 갖는 프라이머를 주형에 혼성화하여, 마모된(frayed) 말단 또는 플랩 구조물을 생성하였다. 클레나우 엑소(-) 중합효소는 이 말단을 연장할 수 없을 것이다. 그러나, DNA pol I 큰 단편은 엑소뉴클레아제 활성을 가지며, 미스매치 염기를 제거할 수 있었다. 제거되면, 프라이머는 클레나우 엑소(-) 중합효소 또는 DNA 중합효소에 의해 정상적으로 연장될 수 있다. 고정화된 플랩 구조를 갖는 2개의 센서를 시퀀싱을 위해 DNA 중합효소 또는 클레나우 엑소(-)에 노출시켰다. 그리고 나서, 센서를 정확한 순서로 주형 서열에 노출시켰다. DNA 중합효소 센서는 염기를 부가할 수 있는 반면, 클레나우 단편 센서는 플랩 구조 때문에 임의의 염기를 부가할 수 없었다. DNA 중합효소의 임의의 3'-5' 엑소 활성은 염기 부가가 서열과 일치하지 않게 할 것이다.
절차로부터의 결과가 도 6에 제시되어 있다. DNA 중합효소에 의한 미스매치 염기의 절단은 후속 염기 부가를 허용하였다. 염기는 4개의 사이클까지 정확하였다. 엑소뉴클레아제 활성이 없으면, 클레나우 엑소(-)는 주형을 연장시킬 수 없었다. 거짓(spurious) 엑소뉴클레아제 활성이 해로운 경우, 엑소뉴클레아제는 경쟁적, 경쟁력 없는 또는 비경쟁적 화합물 또는 유사체에 의해 억제될 수 있다. 예를 들어, NaF는 DNA 중합효소 엑소뉴클레아제 기능의 경쟁적 억제제이다(Potapova et al., FEBS Letters, 277(1-2):109-111(1990)).
실시예 8은 효소 억제제와 조합된 HIV-1 역전사효소를 사용하는 절차를 기술한다. 본 실시예에 사용된 표적 서열에 대한 백그라운드로서, EML4-ALK 융합은 비소세포 폐암을 가진 환자의 4-5%에서 발견된다(Soda et al., Nature 448:561-6 (2007); Mano, Cancer Sci. 99:2349-55 (2008); and Horn and Pao, J. Clin. Oncol. 27:4232-5 (2009)). ALK C4493A 돌연변이는 임상 폐 종양에서 확인되었고, 이는 ALK 단백질에서 L1196M "게이트키퍼" 돌연변이를 초래하고 화학요법 약물 크리조티닙에 대한 내성을 부여한다(Choi et al., N. Engl . J. Med . 18:1734-9(2010)). 4496-4509AS 프라이머는 게이트키퍼 돌연변이를 갖는 영역 내로의 시퀀싱을 가능하게 한다. 주형 올리고뉴클레오타이드 서열은 야생형 인간 ALK 유전자로부터 유래되었다(뉴클레오타이드 번호 4460-4509). 프라이머 서열은 인간 ALK 유전자의 부분에 상보적이었다(뉴클레오타이드 번호 4496-4509).
실시예
8
HIV
역전사효소
(RT) 및
비뉴클레오사이드
역전사효소
억제제(
NNRTI
) 화합물 7 및 18을 사용한 시퀀싱
절차에 사용된 물질 및 방법은 다음과 같았다. 3' 역위된 dT를 갖는 주형 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S의 DNA 서열은 바이오틴-5'-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGCTGGAGCTCATGGCGGG-3'-(3'-dT-5')(서열번호:9)이었다. 프라이머 올리고뉴클레오타이드 4496-4509AS의 DNA 서열은 5'-CCCGCCATGAGCTC-3'(서열번호:10)이었다. 주형 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S 및 프라이머 올리고뉴클레오타이드 4496-4509AS를 합성하였고 통합 DNA 기술(Coralville, IA)에 의해 분석(액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 및 전기분무 이온화(ESI))하였다. 올리고뉴클레오타이드를 100 μM로 TE 완충액(10 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 0.1 mM EDTA)에서 제조하였다. 프라이머 및 주형 올리고뉴클레오타이드를 어닐링 완충액(10 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 0.1 mM EDTA, 80 mM KCl)을 함유하는 튜브에서 조합하였다(10 μM 각각의 가닥). 프라이머-주형 용액을 함유하는 튜브를 건조 열 블록(5분 동안 95℃) 상에 로딩하였고, 블록을 벤치 탑으로 옮겨 주위 온도로 점진적으로 냉각하여 가닥을 어닐링하였다. 경쟁력 없는 NNRTI 화합물(그 전체가 참조로 본원에 포함된 Pitta et al., J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 28(10):113-22 (2013))을 에피젠 바이오사이언스사(Epigen Biosciences, Inc., San Diego, CA)로부터 얻었다. NNRTI 화합물 7(3-4-클로로-벤조[d]티아졸-2일)-2-(2-클로로-6-플루오로페닐)티아졸리딘-4-온) 및 18(3-(6-에톡시-벤조[d]티아졸-2-일)-2-(2-클로로-6-플루오로페닐)티아졸리딘-4-온)을 각각 25.0 mM 및 15.0 mM의 농도로 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시켰다. 재조합 정제된 HIV 역전사효소(HIV RT)를 워싱턴 생화학 회사(Worthington Biochemical Corp, Lakewood, NJ)로부터 얻었다. 초순수 소혈청 알부민(BSA)을 앰비온(Ambion, Foster City, CA)으로부터 얻었다. 모든 시약 및 용액은 분자 생물학 등급이었다. 프라이머-주형 이합체를 어닐링 완충액 내로 희석(100 μM)하였다. 사용 직후, HIV 역전사효소를 Enzyme Diluent(50 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 8 mM MgCl2) 내로 미리 희석하였다. 결합 완충액(50 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 160 mM KCl, 0.5 mM EDTA, 11 mM MgCl2, 0.3%(v/v) 트리톤 X-100, 5.3 mM 디티오트레이톨(DTT), 100 μg/mL 소혈청 알부민(BSA), 100 μM dNTP(dATP, dTTP, dGTP 또는 dCTP), 100 nM HIV RT). NNRTI 화합물을 결합 완충액에 첨가하기 직전에 DMSO로 미리 희석하였다. 반응 완충액은 NNRTI, dNTP 또는 HIV RT 효소가 없는 결합 완충액이었다. 프라이머-주형(PT)을 함유하는 완충액, PT 세척 완충액, 하나의 dNTP를 함유하는 결합 완충액, 및 반응 완충액을 Greiner 96-웰 블랙 마이크로플레이트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 카달로그 번호 M9685) 내로 로딩(200 μL/웰)하였다. 스트렙타비딘(SA) 바이오센서(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA; 카달로그 번호 18-5019)를 사용 전에 대략 10분 동안 어닐링 완충액에 재수화하였다. 옥텟 QK 바이오센서 시스템(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA)을 30℃ 작동으로 설정하고, 바이오센서를 프라이머-주형으로 코팅하고 결합하지 않은 프라이머-주형을 PT 세척 완충액으로 세척하도록 프로그램하였다. 바이오센서를 HIV RT 및 dCTP ± NNRTI를 함유하는 결합 완충액으로 옮긴 다음(결합 단계), 반응 완충액으로 옮겼다(dCTP 도입 및 해리 단계). 유사하게, 바이오센서를 표시된 바와 같이 주기적인 방식으로 개별 데옥시리보뉴클레오사이드 삼인산(dATP, dGTP, dCTP 또는 dTTP)을 함유하는 용액으로 옮겼다. 결합 및 도입의 사이클을 여러 번 반복하였다. 옥텟 간섭계 기구에 의해 생성된 모니터링 데이터를 디스플레이를 위해 마이크로소프트 엑셀 및 프리즘 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어, San Diego, CA) 내로 가져왔다. 결합 및 해리 반응의 진행을 19.4초 윈도우 이내에 또는 프리즘 소프트웨어(19.4초 윈도우 및 6차 평활 다항식)에 의해 평균함으로써 평활하였다.
절차로부터의 결과가 도 7A-7B, 및 도 8에 나타나 있다. 보고에 따르면 경쟁력 없는 억제 방식을 갖는 비뉴클레오사이드 역전사효소 억제제(NNRTI)를 HIV 역전사효소의 DNA-의존적 DNA 중합효소 활성을 통한 DNA 시퀀싱에 사용하였다. 프라이머-주형으로 코딩된 바이오센서에 대한 결합의 분석에서, HIV 역전사효소, 정확한 dNTP 및 NNRTI 화합물 7(40 μM)의 조합은 결합 단계에서 결합에 대한 분명한 피크를 나타낸 다음, 해리 단계 동안 세척 완충액에서 감소된 결합을 나타낸다(도 7A, 원). NNRTI-안정화된 HIV RT-dNTP 혼합물과 달리, HIV RT 및 정확한 dNTP를 함유하는 반응은 주목할만한 결합 피크를 생성하지 않았고(도 7A, 삼각형), 대조군도 그러지 않았다(40 μM NNRTI 화합물 7을 갖거나 갖지 않는 HIV RT; 도 7A, 실선 및 점선). 결합 및 해리에 대한 시간 경과는 도 7A에서 처음 6개 사이클(뉴클레오타이드 서열 CAGCAG)에 대한 시퀀싱을 나타낸다. 부정확한 뉴클레오타이드 dCTP 및 dATP를 갖는 7번째 사이클 및 8번째 사이클은 각각 결합 피크를 생성하지 않았다. 9번째 사이클은 정확한 뉴클레오타이드 dGTP를 가지고 있었다(도 7A). 결합(0-5분) 및 해리(5-10분)에 대한 시간 경과는 도 7B에서 각각의 사이클에 대해 나타나 있다. 유사하게, HIV RT 및 NNRTI 화합물 18을 사용한 시퀀싱은 또한 시퀀싱 결과를 생성하였다. 프라이머-주형으로 코팅된 바이오센서에 대한 결합 분석에서, HIV 역전사효소, 정확한 dNTP 및 NNRTI 화합물 18(80 μM)의 조합은 결합 단계에서 결합에 대한 뚜렷한 피크를 나타낸 다음, 해리 단계 동안 세척 완충액에서 감소된 결합을 나타낸다(도 8, 다이아몬드). NNRTI-안정화된 HIV RT-dNTP 혼합물과 달리, HIV RT 및 정확한 dNTP를 함유하는 반응은 주목할만한 결합 피크를 생성하지 않았고(도 8, 삼각형), 대조군도 그러지 않았다(80 μM NNRTI 화합물 18을 갖는 HIV RT; 도 8, 점선). 사이클 1-3에서, 결합 피크는 서열 CAG에 대해 정확한 뉴클레오타이드 및 화합물 18과의 HIV RT의 결합을 나타내었다(도 8). HIV RT, 부정확한 뉴클레오타이드 dTTP 및 화합물 18을 갖는 사이클 4는 결합 피크를 나타내지 않았다(도 8). 후속 사이클은 시퀀싱 분석을 위한 추가 피크를 나타내지 않았다.
실시예 9는 또 다른 표지가 없는 시퀀싱 시스템의 유용성을 입증한 절차를 기술한다. 보다 구체적으로, 결과는 SPRi 바이오센서 상에서 클레나우/dNTP 결합 분석을 사용하여 DNA를 정확히 시퀀싱하는 능력을 입증하였다. SPRi 바이오센서는 다수의 검사/도입 라운드 동안 DNA 시퀀싱을 수행하는 데 필요한 상이한 단계를 검출하는 충분한 감도 및 내구성을 갖는다. 아래에는 60 bp 가닥 내에서 3개의 염기쌍의 시퀀싱이 나타나 있다. 이 기술은 임의의 수의 시퀀싱 사이클까지 확장될 수 있다.
실시예
9
표면
플라즈몬
공명(
SPR
)
이미징
바이오센서 상에서의 DNA 시퀀싱
절차에 사용된 물질 및 방법은 다음과 같았다. SPR 센서 칩: 20 mm x 20 mm x 1 mm 높은 굴절률(1.61) 슬라이드(NanoSPR, Chicago, IL). 알칸티올, PEG6: 모노티오알칸(C11)PEG6-OH(11-머캅토운데실 헥사에틸렌글리콜(카달로그 번호, SPT-0011P6); 및 BAT: 바이오티닐화된 알칸 PEG 티올(카달로그 번호, SPT-0012D)을 센소패쓰 기술(Sensopath technologies, Bozeman, MT)로부터 수득하였다. 염기 완충액(세척): 300 mM KCl, 20 mM 트리스 HCl(pH 8.0), 0.01% 트윈-20, 1 mM SrCl2. 검사 완충액: 염기 완충액 및 50 nM 클레나우 단편 및 100 nM dNTP. 도입 완충액: 염기 완충액 및 10 mM MgCl2. 실험 전에, 금 코팅된 SPR 슬라이드를 1 x 10-4 M의 최종 조합된 농도로 100% EtOH에 희석된 18% BAT와 82% PEG6의 혼합된 SAM으로 코팅하였다. SPR 슬라이드를 실온에서 밤새 알칸티올 용액에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, SPR 슬라이드를 새로운 100% EtOH에서 세정한 다음, 탈이온수 중의 50% EtOH, 및 탈이온수에서 세정하였다. 그리고 나서, 슬라이드를 공기 중에서 건조시켰다. 슬라이드를 유체 제어, 이미지 획득, 및 데이터 정량화를 제공한 주문 제작된 SPR 이미징 시스템에 장착하였다. 염기 완충액 중의 10 μg/ml의 스트렙타비딘을 함유하는 용액을 플로우 셀 내로 주입하였다. 생성된 스트렙타비딘 층의 결합을 대략 180초 동안 SPR 칩으로부터 반사된 빛의 변화를 측정함으로써 모니터링하였다. 이후, 과량의 염기 완충액으로 세척하였다. 그리고 나서, 미리혼성화된 프라이머 FP2/PhiX_matchA 주형 DNA를 플로우 셀 내로 주입하고 대략 180초 동안 스트렙타비딘 층에 결합시킨 다음, 과량의 염기 완충액으로 세척하였다. 시퀀싱을 위해, 50 nM 클레나우 단편을 함유하는 용액을 100 nM의 dATP, dCTP, dTTP, 또는 dGTP 중 어느 하나를 갖는 염기 완충액에서 제조하였다. dNTP 용액을 개별적으로 플로우 셀 내로 주입하고(G, A, A, T, C, G의 순서로), SPRi 응답을 검사하기 위해 대략 180초 동안 인큐베이션하였다. 신호 변화가 없거나 낮으면, 플로우 셀을 과량의 염기 완충액으로 세척하였다. SPR 신호가 염기 매치를 나타내면, 플로우 셀을 30초 동안 도입 완충액(10 mM Mg2+ 함유)으로 세척하여 정확한 dNTP를 도입한 다음, 염기 완충액으로 세척하였다. 검사, 도입, 및 세척 단계를 반복하였다.
도 9는 3개의 미스매치된 염기 및 3개의 정확한 염기의 확인을 위해 기록된 센서그램을 나타낸다. 어닐링된 프라이머 서열 후 phiX_matchA 주형의 처음 3개의 정확한 접합체 염기는 A, T, 및 G였다. 센서 위로 유동한 제1 용액은 중합효소 및 염기쌍 미스매치에 해당하는 dGTP를 함유하였다. 생성된 센서 흔적은 기저선 반사율에서 거의 변화를 나타내지 않았고, 이는 중합효소 분자가 프라이밍된 주형 가닥에 결합하지 않았음을 나타낸다. 센서 위로 유동한 다음 용액은 중합효소 및 정확한 접합체 염기에 해당하는 dATP를 함유하였다. 생성된 흔적(회색 박스로 강조됨)은 반사된 빛의 강한 증가를 나타내었고, 이는 중합효소가 프라이밍된 주형 가닥에 결합하여, SPR의 위치를 이동시켰다는 것을 나타낸다. 중합효소 용액을 대략 180초 동안 인큐베이션한 후(이용가능한 결합 부위의 포화를 보장하기 위해), 10 mM Mg2+를 함유하는 도입 용액을 플로우 셀 내로 도입하였다. Mg2+의 도입은 중합효소가 주형에 결합된 프라이머 가닥 내로 결합된 dATP를 도입시키게 하였다. dATP의 성공적인 도입을 보장하기 위해, 중합효소-dATP 용액을 다시 센서 칩 상에 유동시켰다. 그러나, 이번에는 반사된 빛의 양은 이전처럼 강하게 증가하지 않았는데, 이는 정확한 동족 염기가 더 이상 A가 아니기 때문에 중합효소가 주형 가닥에 결합하지 않았다는 것을 나타낸다. 다음의 정확한 염기를 검사하기 위해, 중합효소 및 dTTP의 용액을 센서 위에 유동시켰다. 다시 한번, 반사된 빛의 강도는 역치 값을 초과하여 증가하였고, 이는 dATP의 도입이 성공적이었고, 다음의 정확한 염기가 예상된 대로 T임을 나타낸다. 도입 완충액을 센서 칩 위로 유동시켜 염기를 도입시켰다. 과정을 미스매치(중합효소-dCTP)를 사용하여 2회 반복한 다음, 매치(중합효소-dGTP)를 사용하여 반복하였다. 두 경우, 예상된 응답이 관찰되었고, 이는 다음의 정확한 접합체 염기가 실제로 G였음을 나타낸다.
실시예 10은 이중 가닥의 DNA 주형의 시퀀싱을 입증한 절차를 기술한다.
실시예
10
닉 번역에 의한 이중 가닥의 DNA의 시퀀싱
절차에 사용된 물질 및 방법은 다음과 같았다. 3' 역위된 dT를 갖는 주형 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S의 DNA 서열은 바이오틴-5'-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGCTGGAGCTCATGGCGGG-3'-(3'-dT-5')(서열번호:9)이었다. 프라이머 올리고뉴클레오타이드 4496-4509AS의 DNA 서열은 5'-CCCGCCATGAGCTC-3'(서열번호:10)이었다. 올리고뉴클레오타이드 4460-4494AS의 DNA 서열은 5'-AGCAGGATGAACCGGG/i5NitInd/CAGGGATTGCAGGCTCAC-3'(서열번호:11)이었으며, "/i5NitInd/"는 5-니트로인돌-2'-데옥시리보스 잔기이다. 5-니트로인돌은 이 문맥에서 구아닌 사분자(tetrad)의 형성을 방지하고 보편적인 염기로서 역할을 하는 것으로 의도된다. 올리고뉴클레오타이드를 100 μM로 TE 완충액(10 mM 트리스 pH 8.0, 0.1 mM EDTA)에서 제조하였다. ssDNA 프라이머/주형을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S 및 4496-4509AS를 어닐링 완충액(10 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 0.1 mM EDTA, 80 mM KCl)을 함유하는 튜브에서 조합하였다(10 μM 각각의 가닥). 1-염기쌍 갭을 갖는 dsDNA 프라이머/주형을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S, 4496-4509AS 및 4460-4494AS를 어닐링 완충액을 함유하는 튜브에서 조합하였다(10 μM 각각의 가닥). 올리고뉴클레오타이드 용액을 함유하는 튜브를 건조 열 블록(5분 동안 95℃)에 로딩하고, 블록을 벤치 탑으로 옮겨 주위 온도로 점진적으로 냉각시켜 가닥을 어닐링하였다. 바실러스 스테아로써모필러스에 의해 코딩된 전장 DNA 중합효소("Bst DNA 중합효소", 에세리키아 콜리로부터 정제된 재조합 효소)를 New England Biolabs(Ipswich, MA; 카달로그 번호 M0328L)로부터 구입하였다. 초순수 소혈청 알부민(BSA)을 Ambion(Foster City, CA)으로부터 구입하였다. 모든 시약 및 용액은 분자 생물학 등급이었다. 프라이머-주형 이합체를 어닐링 완충액 내로 희석(100 μM)하였다. 결합 완충액은 50 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 300 mM KCl, 0.1%(v/v) 트리톤-X100, 100 μg/mL 소혈청 알부민이었다. 반응 완충액은 10 mM MgCl2를 함유하는 결합 완충액이었다. 프라이머-주형(PT)을 함유하는 완충액, 하나의 dNTP를 함유하는 결합 완충액, 및 반응 완충액을 Greiner 96-웰 블랙 마이크로플레이트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 카달로그 번호 M9685) 내에 로딩(200 μL/웰)하였고, PCR-등급 미네랄 오일(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 카달로그 번호 M8662)을 적용하였다(75 μL/웰). 스트렙타비딘(SA) 바이오센서(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA; 카달로그 번호 18-5019)를 사용 전에 대략 10분 동안 어닐링 완충액에서 재수화시켰다. 옥텟 QK 바이오센서 시스템(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA)을 30℃ 작동을 위해 설정하고, 바이오센서를 프라이머-주형으로 코팅하고 결합하지 않은 프라이머-주형을 결합 완충액으로 세척하도록 프로그램하였다. 바이오센서를 지시된 바와 같이 136 단위/mL Bst DNA 중합효소 및 200 μM dNTP(dATP, dTTP, dGTP 또는 dCTP)을 함유하는 결합 완충액으로 옮긴 다음(결합 단계), dNTP 도입을 위한 반응 완충액으로 옮겼다. 바이오센서를 dNTP가 없는 Bst DNA 중합효소(136 단위/mL)을 함유하는 반응 완충액으로 옮겨 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 통한 닉 번역을 촉진시켰다. 바이오센서를 효소 또는 마그네슘 없는 반응 완충액으로 옮겼다(해리 단계). 유사하게, 바이오센서를 지시된 바와 같이 주기적 방식으로 개별 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트(dATP, dGTP, dCTP 또는 dTTP)를 함유하는 용액로 옮겼다. 결합 및 도입의 사이클 및 5'-3' 엑소핵산분해 절단을 여러 번 반복하여 시퀀싱을 평가하였다. 옥텟 간섭계 기구에 의해 생성된 모니터링 데이터를 디스플레이를 위해 마이크로소프트 엑셀 및 프리즘 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어, San Diego, CA) 내로 가져왔다.
절차로부터의 결과가 도 10A-10C에 나타나 있다. 프라이머-주형으로 코팅된 바이오센서에 대한 결합 분석에서, Bst DNA 중합효소 및 정확한 2'-데옥시리보뉴클레오사이드 삼인산(dCTP)의 조합은 결합 단계에서 결합에 대한 분명한 피크를 나타낸다(도 10A, 10B, 및 10C, dCTP "C"). 사이클 1은 dsDNA 주형에서 하나의 염기쌍 갭에 대한 결합 및 도입(도 10A 및 10B) 및 대조군 ssDNA 주형에서 프라이머의 하류에 정확한 뉴클레오타이드의 도입(도 10C)을 입증한다. dNTP가 결여된 대조군은 최소 결합을 나타낸다(도 10A, 10B, 및 10C, 사이클 1-7). 사이클 2는 다음의 정확한 뉴클레오타이드인 dATP와 조합된 dsDNA 주형에 대한 중합효소의 결합을 나타내며(도 10A 및 10B, dATP "A"), 이는 방해되지 않은 ssDNA 주형의 것보다 적으며(도 10C, dATP "A"), 이는 상보적 가닥의 엑소핵산분해 절단가 완료되지 않았음을 나타낸다. 결합 및 해리에 대한 시간 경과는 dsDNA(도 10A 및 10B) 및 ssDNA(도 10C)의 처음 3개의 사이클(뉴클레오타이드 서열 CAG)에 대한 시퀀싱을 입증한다. 예상된 대로, 부정확한 뉴클레오타이드 dTTP를 갖는 4번째 사이클은 결합 피크를 생성하지 않았다(도 10A, 10B, 및 10C). 이러한 결과는 DNA 중합효소 및 Bst DNA 중합효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 사용한 닉 번역에 의해 이중 가닥의 DNA을 시퀀싱하는 능력을 입증한다.
실시예 11은 이중 가닥의 DNA 주형 상에서의 시퀀싱을 입증하는 데 사용된 추가의 절차를 기술한다.
실시예
11
가닥 치환에 의한 이중 가닥의 DNA의 시퀀싱
절차에 사용된 물질 및 방법은 다음과 같았다. 3' 역위된 dT를 갖는 주형 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S의 DNA 서열은 바이오틴-5'-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGCTGGAGCTCATGGCGGG-3'-(3'-dT-5')(서열번호:9)이었다. 프라이머 올리고뉴클레오타이드 4496-4509AS의 DNA 서열은 5'-CCCGCCATGAGCTC-3'(서열번호:10)이었다. 올리고뉴클레오타이드 4460-4494AS의 DNA 서열은 5'-AGCAGGATGAACCGGG/i5NitInd/CAGGGATTGCAGGCTCAC-3'(서열번호:11)이었고, "/i5NitInd/"는 5-니트로인돌-2'-데옥시리보스 잔기이다. 5-니트로인돌은 이 문맥에서 구아닌 사분자(tetrad)의 형성을 방지하고 보편적인 염기로서 역할을 하는 것으로 의도된다. 올리고뉴클레오타이드 4460-4494AS-T8의 DNA 서열은 5'-TTTTTTTTAGCAGGATGAACCGGG/i5NitInd/CAGGGATTGCAGGCTCAC-3'(서열번호:12)이었고, "/i5NitInd/"는 5-니트로인돌-2'-데옥시리보스 잔기이다. 5-니트로인돌은 이 문맥에서 구아닌 사분자(tetrad)의 형성을 방지하고 보편적인 염기로서 역할을 하는 것으로 의도된다. 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S, 4460-4494AS, 4496-4509AS 및 4460-4494AS-T8을 합성하고 통합된 DNA 기술(Coralville, IA)에 의해 분석(액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 및 전기분무 이온화(ESI))하였다. 올리고뉴클레오타이드를 100 μM으로 TE 완충액(10 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 0.1 mM EDTA)에서 제조하였다. ssDNA 프라이머/주형을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S 및 4496-4509AS를 어닐링 완충액(10 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 0.1 mM EDTA, 80 mM KCl)을 함유하는 튜브에서 조합(10 μM 각각의 가닥)하였다. 1-염기 갭을 갖는 dsDNA 프라이머/주형을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S, 4496-4509AS 및 4460-4494AS를 어닐링 완충액을 함유하는 튜브에서 조합(10 μM 각각의 가닥)하였다. 5'-올리고-dT 플랩 및 1-염기 갭을 갖는 dsDNA 프라이머/주형을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S, 4496-4509AS 및 4460-4494-AS-T8을 어닐링 완충액을 함유하는 튜브에서 조합(10 μM 각각의 가닥)하였다. 올리고뉴클레오타이드 용액을 함유하는 튜브를 건조 열 블록(5분 동안 95℃)에 로딩하고, 블록을 벤치 탑으로 옮겨 주위 온도로 점진적으로 냉각시켜 가닥을 어닐링하였다. E. coli DNA 중합효소의 클레나우(3'→5' 엑소(-)) 단편을 엔자이매틱스(Enzymatics, Beverly, MA; 카달로그 번호 P7010-LC-L)로부터 구입하였다. 초순수 소혈청 알부민(BSA)을 앰비온(Ambion, Foster City, CA)으로부터 구입하였다. 모든 시약 및 용액은 분자 생물학 등급이었다. 프라이머-주형 이합체를 어닐링 완충액 내로 희석(50 nM)하였다. 결합 완충액은 20 mM 트리스, pH 8.0, 300 mM KCl, 0.01%(v/v) 트윈-20, 100 μg/mL 소혈청 알부민, 1.0 mM 디티오트레이톨이었다. 반응 완충액은 50 mM KCl 및 10 mM MgCl2를 함유하는 결합 완충액이었다. 프라이머-주형(PT)을 함유하는 완충액, 하나의 dNTP를 함유하는 결합 완충액, 및 반응 완충액을 Greiner 96-웰 블랙 마이크로플레이트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 카달로그 번호 M9685) 내로 로딩(200 μL/웰)하였고, PCR-등급 미네랄 오일(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 카달로그 번호 M8662)을 적용(75 μL/웰)하였다. 스트렙타비딘(SA) 바이오센서(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA; 카달로그 번호 18-5019)를 사용 전에 대략 10분 동안 어닐링 완충액에 재수화시켰다. 옥텟 QK 바이오센서 시스템(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA)을 30℃ 동작을 위해 설정하고, 바이오센서를 프라이머-주형으로 코팅하고 결합하지 않은 프라이머-주형을 결합 완충액으로 세척하도록 프로그램하였다. 바이오센서를 표시된 대로 클레나우 엑소(-)(68 단위/mL) 및 100 μM dNTP(dATP, dTTP, dGTP 또는 dCTP)를 함유하는 결합 완충액으로 옮긴 다음(결합 단계), dNTP 도입을 위해 반응 완충액으로 옮겼다. 바이오센서를 효소 또는 마그네슘이 없는 반응 완충액으로 옮겼다(해리 단계). 유사하게, 바이오센서를 표시된 대로 개별 데옥시리보뉴클레오사이드 삼인산(dATP, dGTP, dCTP 또는 dTTP)을 함유하는 용액으로 주기적으로 옮겼다. 결합 및 도입의 사이클을 여러 번 반복하여 시퀀싱을 평가하였다. 옥텟 간섭계 기구에 의해 생성된 모니터링 데이터를 디스플레이를 위해 마이크로소프트 엑셀 및 프리즘 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어, San Diego, CA) 내로 가져왔다.
절차로부터의 결과가 도 11A-11C에 나타나 있다. ssDNA 프라이머-주형으로 코팅된 바이오센서에 대한 결합 분석에서, 클레나우 엑소(-)는 정확한 개별 dNTP의 존재하에 결합 피크를 생성하였지만, 부정확한 dTTP 뉴클레오타이드는 그렇지 않았다(도 11A, 어두운 흔적). 대조적으로, 음성 대조군(dNTP가 없는 효소)는 일관되게 편평한 결합 응답에 의해 나타난 바와 같이 결합하지 못하였다(도 11A, 회색 흔적). 따라서, 클레나우 엑소(-)는 예상된 서열(CAGCAGGA(서열번호:1))과 88% 동일한 CAGCAG(C?)A(서열번호:13)의 서열을 생성하였다. 안티센스 프라이머 및 하류 안티센스 가닥 사이에 1-염기 갭을 갖는 dsDNA 프라이머-주형으로 코팅된 바이오센서에 대한 결합 분석에서, 클레나우 엑소(-)는 첫 번째 정확한 개별 dCTP 뉴클레오타이드의 존재하에서만 결합 피크를 생성하였다(도 11B, 어두운 흔적). 음성 대조군(dNTP가 없는 효소)은 일관되게 편평한 결합 응답에 의해 나타난 바와 같이 결합하지 못하였다(도 11B, 회색 흔적). 따라서, 클레나우 엑소(-)는 갭의 첫 번째 염기가 정확한 뉴클레오타이드로 채워진 "C"의 서열을 생성하였다. 그러나, 후속 사이클에서 이중 가닥의 DNA 영역 내로의 추가 결합 또는 중합은 차단된다. 추가 시퀀싱의 차단은 클레나우 엑소(-)의 5'-3' 엑소뉴클레아제 도메인의 내재적인 결여(닉 번역을 위해) 때문이거나 또는 DNA의 하류 이중 가닥의 나선을 파괴하지 못하는 능력(가닥 치환) 때문일 가능성이 있다. 따라서, 5'-올리고-dT 플랩을 도입하여 가닥 치환을 위한 클레나우 엑소(-)에 우수한 기질을 제공하였다. 바이오센서를 안티센스 프라이머 및 하류 안티센스 가닥 사이에 1-염기 갭을 갖는 5'-올리고-dT 플랩을 갖는 dsDNA 프라이머-주형으로 코팅하였다. 클레나우 엑소(-)는 사이클 #1의 1-염기 갭(C)에서 결합 피크를 생성하였고, 사이클 #2, 3 및 5에 대해 서열 AGC를 제공하는 dsDNA 영역 내로 추가의 결합 피크가 관찰되었다(도 11C, 어두운 흔적). 부정확한 dNTP를 갖는 사이클 #4, 6, 7 및 8은 고정화된 DNA에 대한 효소의 결합을 허용하지 않았다(도 11C). 음성 대조군(dNTP가 없는 효소)은 편평한 결합 응답에 의해 나타난 바와 같이 결합하지 못하였다(도 11C, 회색 흔적). 따라서, 클레나우 엑소(-)는 갭의 첫 번째 염기가 정확한 뉴클레오타이드로 채워진 "CAGC"의 100% 정확한 서열을 생성하였고, 추가의 결합 또는 중합이 이중 가닥의 DNA 영역 내로 3개의 추가의 염기에 대해 관찰되었다. 이중 가닥의 DNA 영역에 인접한 5'-플랩은 클레나우 엑소(-)가 가닥 치환에 의해 시퀀싱할 수 있게 한 반면(도 11C), 5'-플랩의 결여는 dsDNA 영역 내로의 시퀀싱을 차단하였다(도 11B). 이러한 결과는 가닥 치환 기전에 의해 DNA 중합효소의 클레나우 엑소(-) 단편을 사용하여 이중 가닥의 DNA를 시퀀싱하는 능력을 입증한다.
실시예 12는 시퀀싱 반응에 대한 글루타메이트 음이온의 효과를 조사한 절차를 기술한다.
실시예
12
단일 가닥의 DNA 시퀀싱에 대한 음이온의 효과
ssDNA 프라이머/주형을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S(서열번호:9) 및 4496-4509AS(서열번호:10)를 어닐링 완충액(10 mM 트리스 pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 80 mM KCl)을 함유하는 튜브에서 조합(10 μM 각각의 가닥)하였다. 올리고뉴클레오타이드 용액을 함유하는 튜브를 건조 열 블록(5분 동안 95℃) 상에 로딩하고, 블록을 벤치 탑으로 옮겨 주위 온도로 점진적으로 냉각하여 가닥을 어닐링하였다. E. coli DNA 중합효소의 클레나우(3'→5' 엑소(-)) 단편을 엔자이매틱스(Enzymatics, Beverly, MA; 카달로그 번호 P7010-LC-L)로부터 구입하였다. 칼륨 글루타메이트를 테크노바(Teknova, Hollister, CA; 카달로그 번호 P2000)로부터 구입하였다. 초순수 소혈청 알부민(BSA)을 앰비온(Ambion, Foster City, CA)으로부터 구입하였다. 모든 시약 및 용액은 분자 생물학 등급이었다. 결합 완충액은 20 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 300 mM KCl, 0.01%(v/v) 트윈-20, 100 μg/mL 소혈청 알부민, 1.0 mM 디티오트레이톨이었다. 반응 완충액은 50 mM KCl 및 10 mM MgCl2를 함유하는 결합 완충액이었다. 시험된 칼륨 글루타메이트의 각 수준에 대해, 결합 완충액을 0, 50, 100 또는 200 mM 칼륨 글루타메이트를 함유하도록 제조하였다. 반응 완충액은 칼륨 글루타메이트를 함유하지 않았다. 옥텟 QK 바이오센서 시스템을 실시예 11에 기재된 바와 같이 설정하였다. 바이오센서를 표시된 대로 클레나우 엑소(-)(68 단위/mL) 및 100 μM dNTP(dATP, dTTP, dGTP 또는 dCTP)를 함유하는 결합 완충액으로 옮긴 다음(결합 단계), dNTP 도입을 위한 반응 완충액으로 옮겼다. 바이오센서를 효소가 없는 마그네슘을 함유하는 반응 완충액으로 옮겼다(해리 단계). 바이오센서를 효소 또는 dNTP가 없지만 각각의 농도의 칼륨 글루타메이트를 함유하는 결합 완충액으로 옮겨 재평형화하였다. 유사하게, 바이오센서를 표시된 대로 주기적 방식으로 개별 데옥시리보뉴클레오사이드 삼인산(dATP, dGTP, dCTP 또는 dTTP)을 함유하는 용액으로 옮겼다. 결합 및 도입의 사이클을 여러 번 반복하여 시퀀싱을 평가하였다. 옥텟 간섭계 기구에 의해 생성된 모니터링 데이터를 디스플레이를 위해 마이크로소프트 엑셀 및 프리즘 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어, San Diego, CA) 내로 가져왔다.
절차의 결과가 도 12A-12C에 나타나 있다. ssDNA 프라이머-주형으로 코팅된 바이오센서에 대한 결합 분석에서, 클레나우 엑소(-)(글루타메이트가 없는 KCl)는 200 mM 글루타메이트를 함유하는 KCl에서의 효소처럼 정확한 뉴클레오타이드를 사용하여 시퀀싱을 위한 결합 피크를 생성하였다(도 12A, 각각 점선 및 실선). 그러나, 글루타메이트가 없는 완충액은 200 mM 글루타메이트를 갖는 제제와 비교하여 증가하는 백그라운드와 조합된 결합 피크의 진폭 감소를 나타내었다(도 12A). 8.25시간 경과 동안 효소 및 정확한 dNTP를 함유하는(부정확한 dNTP는 함유하지 않음) 혼합물에 대해 상대적 피크 높이에 따라 KCl 및 200 mM 글루타메이트 제제에서 정확한 서열이 관찰되었다(도 12A). 동종중합체 진행은 이러한 조건하에 단일 피크로서 검출되는 것처럼 보인다(도 12A, 12B, 및 12C). KCl 및 100 mM 글루타메이트를 함유하는 완충액에서, 정확한 서열이 7시간 동안 효소 및 정확한 dNTP에 대해 강한 피크 신호로 관찰된 반면, 대조군(dNTP가 없는 효소)은 피크 및 백그라운드의 점진적인 증가를 생성하지 않았다(도 12B). KCl 및 50 mM 글루타메이트를 함유하는 완충액은 7시간 동안 정확한 서열을 나타낸 반면, dNTP가 없는 대조군 효소는 결합 피크 및 편평한 안정적인 백그라운드를 생성하지 않았다(도 12C). 이러한 결과는 칼륨 글루타메이트에 의한 향상 및 미네랄 오일 오버레이에 의한 증발의 방지를 갖는 DNA 중합효소의 클레나우 엑소(-) 단편을 사용하여 단일 가닥 DNA를 시퀀싱하는 능력을 입증한다.
실시예 13은 ssDNA 또는 dsDNA 주형을 사용하여 유사한 서열의 존재하에 소량의 돌연변이체 서열의 검출을 입증하는 데 사용된 절차를 기술한다.
실시예
13
단일 가닥의 DNA 및 이중 가닥의 5'-
플랩
DNA의 시퀀싱에 의한 야생형 백그라운드에서 점 돌연변이의 검출
절차에 사용된 물질 및 방법은 다음과 같았다. 3' 역위된 dT를 갖는 주형 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S의 DNA 서열은 바이오틴-5'-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGCTGGAGCTCATGGCGGG-3'-(3'-dT-5')(서열번호:9)이었다. 3' 역위된 dT를 갖는 주형 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S C4493A의 DNA 서열은 바이오틴-5'-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGATGGAGCTCATGGCGGG-3'-(3'-dT-5')(서열번호:21)이었다. 프라이머 올리고뉴클레오타이드 4496-4509AS의 DNA 서열은 5'-CCCGCCATGAGCTC-3'(서열번호:10)이었다. 올리고뉴클레오타이드 4460-4494AS-T8의 DNA 서열은 5'-TTTTTTTTAGCAGGATGAACCGGG/i5NitInd/CAGGGATTGCAGGCTCAC-3'(서열번호:12)이었고, "/i5NitInd/"는 5-니트로인돌-2'-데옥시리보스 잔기이다. 5-니트로인돌은 이 문맥에서 구아닌 사분자(tetrad)의 형성을 방지하고 보편적 염기로서 작용하는 것으로 의도된다. 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S, Btn-4460-4509S C4493A, 4496-4509AS 및 4460-4494AS-T8을 합성하고 통합된 DNA 기술(Coralville, IA)에 의해 분석(액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 및 전기분무 이온화(ESI))하였다. 올리고뉴클레오타이드를 100 μM로 TE 완충액(10 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 0.1 mM EDTA)에서 제조하였다. ssDNA 프라이머/주형을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S(또는 C4493A) 및 4496-4509AS를 어닐링 완충액(10 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 0.1 mM EDTA, 80 mM KCl)을 함유하는 튜브에서 조합(10 μM 각각의 가닥)하였다. 5'-올리고-dT 플랩 및 1-염기 갭을 갖는 dsDNA 프라이머/주형을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S(또는 C4493A), 4496-4509AS 및 4460-4494-AS-T8을 어닐링 완충액을 함유하는 튜브에서 조합(10 μM 각각의 가닥)하였다. 올리고뉴클레오타이드 용액을 함유하는 튜브를 건조 열 블록(5분 동안 95℃) 상에 로딩하고, 블록을 벤치 탑으로 옮겨 주위 온도로 점진적으로 냉각하여 가닥을 어닐링하였다. E. coli DNA 중합효소의 클레나우(3'→5' 엑소(-)) 단편을 엔자이매틱스(Enzymatics, Beverly, MA; 카달로그 번호 P7010-LC-L)로부터 구입하였다. 초순수 소혈청 알부민(BSA) 및 초순수 연어 정자 DNA 용액을 라이프 테크놀로지스(Life Technologies, Foster City, CA)로부터 구입하였다. 니켈(II) 설페이트 6수화물(카달로그 번호 467901), dCDP, dGDP 및 dTDP를 시그마(Sigma, St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 모든 시약 및 용액은 분자 생물학 등급이었다. 프라이머-주형 이합체를 어닐링 완충액 내로 희석(50 nM)하였다. 세척 완충액은 20 mM 트리스, pH 8.0, 200 mM KCl, 200 mM 칼륨 글루타메이트, 0.01%(v/v), 트윈-20, 100 μg/mL 소혈청 알부민, 1.0 mM 디티오트레이톨이었다. 결합 완충액은 2.0 mM Ni(II)SO4를 함유하는 세척 완충액이었다. 반응 완충액은 20 mM 트리스, pH 8.0, 50 mM KCl, MgCl2(10 mM), 0.01%(v/v) 트윈-20, 100 μg/mL 소혈청 알부민, 1.0 mM 디티오트레이톨이었다. EDTA 세척 완충액은 100 μM EDTA를 함유하는 결합 완충액이었다. 프라이머-주형(PT)을 함유하는 완충액, 하나의 dNTP를 함유하는 결합 완충액 및 반응 완충액을 Greiner 96-웰 블랙 마이크로플레이트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 카달로그 번호 M9685)에 로딩(200 μL/웰)하고, PCR-등급 미네랄 오일(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 카달로그 번호 M8662)을 적용(75 μL/웰)하였다. 고정밀 스트렙타비딘 바이오센서(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA; 카달로그 번호 18-5117)를 사용 전에 대략 10분 동안 어닐링 완충액에서 재수화시켰다. 옥텟 QK 바이오센서 시스템(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA)을 30℃ 작동을 위해 설정하고 바이오센서를 프라이머-주형으로 코팅하고 결합하지 않은 프라이머-주형을 세척 완충액으로 세척하도록 프로그램하였다. 바이오센서를 표시된 대로 클레나우 엑소(-)(68 단위/mL), Ni(II)SO4(1.5 mM) 및 100 μM dNTP(dATP, dTTP, dGTP 또는 dCTP)를 함유하는 결합 완충액으로 옮긴 다음(결합 단계), MgCl2(10 mM)를 함유하는 반응 완충액에서 dNTP 도입(해리 단계)하였다. 바이오센서를 EDTA 세척 완충액으로 옮긴 다음, 효소, 뉴클레오타이드 또는 2가 양이온이 없는 반응 완충액에서 재평형화하였다. 유사하게, 바이오센서를 표시된 대로 주기적 방식으로 개별 데옥시리보뉴클레오사이드 삼인산(dATP, dGTP, dCTP 또는 dTTP)을 함유하는 용액으로 옮겼다. 결합 및 도입의 사이클을 각각의 dNTP에 대해 반복하여 시퀀싱을 평가하였다. 옥텟 간섭계 기구에 의해 생성된 모니터링 데이터를 디스플레이를 위해 마이크로소프트 엑셀 및 프리즘 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어, San Diego, CA) 내로 가져왔다.
절차의 결과가 도 13A-13C에 나타나 있다. ssDNA 프라이머-주형으로 코팅된 바이오센서에 대한 결합 분석에서, 클레나우 엑소(-) 효소는 사이클 1-2에서 정확한 dNTP의 존재하에 바이오센서에 강하게 결합하였다(도 13A). 사이클 3에서 "G" 피크는 증가하는 농도의 ALK 야생형 주형을 함유하는 혼합물에서 증가하는 피크 높이를 나타낸다(도 13A). 사이클 4에서 "T" 피크는 증가하는 농도의 ALK C4493A 돌연변이를 함유하는 혼합물에서 증가하는 피크 높이를 나타낸다. 사이클 4에서의 "T" 판독은 C4493A 돌연변이체의 안티센스 뉴클레오타이드에 해당한다. ALK 야생형 및 C4493A 주형 모두는 사이클 5 및 6에서 "C" 및 "A"의 전체 높이 피크를 생성한다. 피크는 도 13A에서 ALK 야생형(CAGCA) 및 ALK C4493A(CATCA)에 대한 정확한 서열을 나타낸다. 시퀀싱 동안의 피크 강도는 야생형 서열과의 혼합물에서 돌연변이체 대립유전자의 정량화를 허용한다. 사이클 4 피크(T)의 강도는 ssDNA(도 13B) 및 dsDNA-플랩에 대해 ALK 야생형 백그라운드에서 ALK C4493A 돌연변이체 서열의 양에 비례하였다(도 13C). 유사하게, 사이클 3 피크(G)는 ssDNA 주형에서 돌연변이체 농도가 증가함에 따라 선형적으로 감소하였고(도 13B), 피크 3 강도는 dsDNA-플랩 주형에 대한 돌연변이체 농도에 따라 감소하였다(도 13C). 야생형 백그라운드에서, 돌연변이체 서열의 5% 정도만이 ssDNA 또는 dsDNA-플랩 주형에서 검출될 수 있었다.
실시예 14는 상이한 2가 양이온에 의한 삼성분 복합체의 안정화를 입증하는 데 사용된 절차를 기술한다.
실시예
14
삼성분 복합체 및 중합효소 촉매 작용의 안정화에 대한 2가 양이온의 효과
절차에 사용된 물질 및 방법은 다음과 같았다. 3' 역위된 dT를 갖는 주형 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S C4493A의 DNA 서열은 바이오틴-5'-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGATGGAGCTCATGGCGGG-3'-(3'-dT-5')(서열번호:21)이었다. 프라이머 올리고뉴클레오타이드 4496-4509AS의 DNA 서열은 5'-CCCGCCATGAGCTC-3'(서열번호:10)이었다. 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S C4493A 및 4496-4509AS를 합성하고 통합된 DNA 기술(Coralville, IA)에 의해 분석(액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 및 전기분무 이온화(ESI))하였다. 올리고뉴클레오타이드를 100 μM로 TE 완충액(10 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 0.1 mM EDTA)에서 제조하였다. ssDNA 프라이머/주형을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S C4493A 및 4496-4509AS를 어닐링 완충액(10 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 0.1 mM EDTA, 80 mM KCl)을 함유하는 튜브에서 조합(10 μM 각각의 가닥)하였다. 올리고뉴클레오타이드 용액을 함유하는 튜브를 건조 열 블록(5분 동안 95℃) 상에 로딩하고, 블록을 벤치 탑으로 옮겨 주위 온도로 점진적으로 냉각하여 가닥을 어닐링하였다. E. coli DNA 중합효소의 클레나우(3'→5' 엑소(-)) 단편을 엔자이매틱스(Enzymatics, Beverly, MA; 카달로그 번호 P7010-LC-L)로부터 구입하였다. 초순수 소혈청 알부민(BSA) 및 초순수 연어 정자 DNA 용액을 라이프 테크놀로지스(Life Technologies, Foster City, CA)로부터 구입하였다. 스트론튬 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 망간 클로라이드, 바륨 클로라이드, 코발트 클로라이드, 아연 클로라이드, 구리(II) 클로라이드, 철 암모늄 설페이트, 암모늄 설페이트, 니켈(II) 설페이트 6수화물, dCDP, dGDP 및 dTDP를 시그마(Sigma, St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 모든 시약 및 용액은 분자 생물학 등급이었다. 프라이머-주형 이합체를 어닐링 완충액 내로 희석(100 nM)하였다. 세척 완충액은 20 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 50 mM KCl, 0.01%(v/v) 트윈-20, 100 μg/mL 소혈청 알부민, 1.0 mM 디티오트레이톨이었다. 결합 완충액은 20 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 200 mM KCl, 200 mM 칼륨 글루타메이트, 0.01%(v/v) 트윈-20, 100 μg/mL 소혈청 알부민, 1.0 mM 디티오트레이톨이었다. 반응 완충액은 20 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 50 mM KCl, 0.01%(v/v) 트윈-20, 100 μg/mL 소혈청 알부민, 1.0 mM 디티오트레이톨 및 표시된 2가 양이온이었다. EDTA 세척 완충액은 100 μM EDTA을 함유하는 결합 완충액이었다. 프라이머-주형(PT)를 함유하는 완충액, 하나의 dNTP를 함유하는 결합 완충액 및 반응 완충액을 Greiner 96-웰 블랙 마이크로플레이트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 카달로그 번호 M9685) 내로 로딩(200 μL/웰)하고, PCR-등급 미네랄 오일(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 카달로그 번호 M8662)을 적용(75 μL/웰)하였다. 고정밀 스트렙타비딘 바이오센서(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA; 카달로그 번호 18-5117)를 사용 전에 대략 10분 동안 어닐링 완충액에서 재수화시켰다. 옥텟 QK 바이오센서 시스템(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA)을 30℃ 작동을 위해 설정하고 바이오센서를 프라이머-주형으로 코팅하고 결합하지 않은 프라이머-주형을 세척 완충액으로 세척하도록 프로그램하였다. 비도입된 프라이머/주형의 초기 수준을 측정하기 위해, 바이오센서를 클레나우 엑소(-)(68 단위/mL), SrCl2(2.0 mM) 및 100 μM dCTP(결합 단계)를 함유하는 결합 완충액으로 옮긴 다음, MgCl2가 없는 SrCl2(2.0 mM) 및 연어 정자 DNA 트랩(500 μg/mL)을 함유하는 세척 완충액으로 옮겼다. 센서를 MgCl2이 없는 연어 정자 DNA 트랩(500 μg/mL)을 함유하는 세척 완충액으로 옮긴 다음, EDTA 세척 완충액으로 옮기고 결합 완충액에서 재평형화하였다. 비도입된 프라이머/주형에 대한 결합을 측정하고, 2가 양이온-자유 결합 완충액에서 삼성분 복합체의 안정성을 모니터링하였다. 바이오센서를 클레나우 엑소(-)(68 단위/mL), CoCl2(1.0 mM) 또는 표시된 2가 양이온(2.0 mM) 중 어느 하나, 및 100 μM dCTP를 함유하는 결합 완충액으로 옮긴 다음(결합 단계), MgCl2이 없이 동일한 농도의 동일한 2가 양이온 및 연어 정자 DNA 트랩(500 μg/mL)을 함유하는 세척 완충액으로 옮겼다. 센서를 MgCl2이 없는 연어 정자 DNA 트랩(500 μg/mL)을 함유하는 세척 완충액으로 옮긴 다음, EDTA 세척 완충액으로 옮기고 결합 완충액에서 재평형화하였다. dNTP가 없는 다양한 2가 양이온을 함유하는 결합 완충액에서 삼성분 복합체의 안정화를 측정하였다. 바이오센서를 클레나우 엑소(-)(68 단위/mL), CoCl2(1.0 mM) 또는 표시된 2가 양이온(2.0 mM) 중 하나, 및 100 μM dCTP(결합 단계)를 함유하는 결합 완충액으로 옮긴 다음, MgCl2이 없이 동일한 2가 양이온 및 연어 정자 DNA 트랩(500 μg/mL)을 함유하는 세척 완충액으로 옮겼다. 센서를 10 mM MgCl2를 갖는 연어 정자 DNA 트랩(500 μg/mL)을 함유하는 세척 완충액으로 옮긴 다음, EDTA 세척 완충액으로 옮기고, 결합 완충액에서 재평형화하였다. 마지막으로, 뉴클레오타이드 도입을 나머지 비도입된 프라이머/주형을 측정함으로써 결정하였다. 바이오센서를 클레나우 엑소(-)(68 단위/mL), SrCl2(2.0 mM) 및 100 μM dCTP를 함유하는 결합 완충액으로 옮긴 다음(결합 단계), MgCl2가 없이 SrCl2(2.0 mM) 및 연어 정자 DNA 트랩(500 μg/mL)을 함유하는 세척 완충액으로 옮겼다. 센서를 MgCl2가 없이 연어 정자 DNA 트랩(500 μg/mL)을 함유하는 세척 완충액으로 옮긴 다음, EDTA 세척 완충액으로 옮기고 결합 완충액에서 재평형화하였다. 옥텟 간섭계 기구에 의해 생성된 모니터링 데이터를 디스플레이를 위해 마이크로소프트 엑셀 및 프리즘 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어, San Diego, CA) 내로 가져왔다.
절차의 결과가 도 14A-14B에 나타나 있다. 분석을 ssDNA 프라이머-주형으로 코팅된 바이오센서에 대한 중합효소 및 dCTP의 결합에 대해 수행하였다. 첫 번째 비촉매성 사이클에서, 클레나우 엑소(-) 효소는 정확한 뉴클레오타이드(dCTP) 및 SrCl2의 존재하에 바이오센서에 강하게 결합하였고, 이후 세척으로 기저선으로 되돌아갔다(도 14A, 피크#1). 두 번째(비촉매성) 사이클에서, 센서는 Ni(II)SO4, BaCl2 및 SrCl2는 존재하지만 EDTA가 부재할 때 효소 및 dCTP에 의해 강하게 결합되었다(도 14A, 피크#2-3). Ni(II)SO4를 함유하는 세척 완충액은 10분 동안 삼성분 복합체를 안정화시킨다(도 14A, 피크#2-3). 신호는 Mg2+의 존재하에 감소하며(도 14A, 피크#3 해리), 이는 클레나우 엑소(-) 및 dCTP에 의한 낮은 수준의 Sr2+ 매개된 결합에 의해 입증된 바와 같은 도입에 해당한다(도 14A, 피크 #4). 이러한 결과는 dNTP가 결여된 완충액에서 클레나우 엑소(-), dNTP 및 ssDNA 프라이머/주형의 삼성분 복합체를 안정화시키는 Ni2+의 능력을 입증하며, 이 안정화는 DNA 중합효소에 의한 뉴클레오타이드의 효소적 도입과 양립가능하다. 클레나우 엑소(-)는 마그네슘 이온 이외의 대안적인 2가 양이온의 존재하에 중합효소 활성을 나타낸다. 분석을 ssDNA 프라이머-주형으로 코팅된 바이오센서에 대한 중합효소 및 dCTP의 결합에 대해 수행하였다. 첫 번째 비촉매성 사이클에서, 클레나우 엑소(-) 효소는 정확한 뉴클레오타이드(dCTP) 및 SrCl2의 존재하에 바이오센서에 강하게 결합하였고, 이후 세척으로 기저선으로 되돌아갔다(도 14B, 피크#1). 2번째 결합 사이클에서, 센서는 SrCl2 또는 황산 암모늄의 존재하에 효소 및 dCTP에 의해 강하게 결합된다(도 14B, 피크#2-3). 그러나, 몇 개의 2가 양이온(Cu2+, Ca2+, Co2+, Fe2+, Zn2+)은 결합 완충액에서 클레나우 엑소(-) 및 dCTP에 의해 고정화된 프라이머/주형의 결합에 대한 일시적인 피크를 나타내었다(도 14B, 피크 2). 일시적인 피크(Ca2+, Co2+, Fe2+, Zn2+) 또는 편평한 피크(Mn2+)가 사라진 후, 동일한 2가 양이온 및 연어 정자 DNA 트랩 또는 트랩 단독을 함유하는 세척 완충액은 도 14A에서 결합 신호를 더 감소시키지 않았다(기저선으로 간 Ca2+ 제외)(피크#2). 사이클 3에서, 효소, dCTP 및 2가 양이온 Ca2+, Co2+, Fe2+, Zn2+에 대한 바이오센서의 두 번째 노출은 상당한 결합을 나타내지 않았고(도 14B, 피크 3), 표준 Sr2+ 매개된 결합 대조군도 그러하였다(도 14B, 피크 4). 더 적은 정도로, Cu2+는 또한 클레나우 엑소(-)에 의한 중합효소 활성을 향상시키는 것으로 보이는데, Cu2+에 대한 두 번째 노출(도 14B, 피크 3)이 첫 번째 Cu2+ 결합보다 적었기 때문이다(도 14B, 피크 2). 효소 및 dNTP에 첫 번째 노출 후 2가 양이온(Ca2+, Co2+, Fe2+, Zn2+, Mn2+)에 대한 결합 신호의 이러한 결여 및 결합을 지원하는 Sr2+ 매개된 제어 조건의 실패는 완전한 뉴클레오타이드 도입이 Mg2+의 부재하에 특정 2가 양이온(Ca2+, Co2+, Fe2+, Zn2+, Mn2+)을 사용하여 달성되었고, 이러한 일시적인 피크가 DNA 시퀀싱에 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예 15는 Co2+ 2가 양이온을 사용하는 절차를 기술한다.
실시예
15
CoCl
2
매개된
결합 및 촉매 작용을 이용한 단일 가닥의 DNA의 시퀀싱에 의한 긴 리드 길이
절차에 사용된 물질 및 방법은 다음과 같았다. 주형 올리고뉴클레오타이드 phiX_100 미스매치의 DNA 서열은 바이오틴-5'- GGCAAATCACCAGAAGGCGGTTCCTGAATGAATGGGAAGCCTTCAAGAA-GGTGATAAGCAGGAGAAACATACGAAGCATCATAACGATACCACTGACCC -3'(서열번호:22)이었다. 프라이머 올리고뉴클레오타이드 FP2의 DNA 서열은 5'-GAGGGTCAGTGGTATCGTTATG-3'(서열번호:5)이었다. 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 통합된 DNA 기술(Coralville, IA)에 의해 분석(액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 및 전기분무 이온화(ESI))하였다. 올리고뉴클레오타이드를 100 μM로 TE 완충액(10 mM 트리스 pH 8.0, 0.1 mM EDTA)에서 제조하였다. ssDNA 프라이머/주형을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 "phiX_100mismatch" 및 "FP2"를 어닐링 완충액(10 mM 트리스 pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 80 mM KCl)을 함유하는 튜브에서 조합(10 μM 각각의 가닥)하였다. 올리고뉴클레오타이드 용액을 함유하는 튜브를 건조 열 블록(5분 동안 95℃) 상에 로딩하고, 블록을 벤치 탑으로 옮겨 주위 온도로 점진적으로 냉각하여 가닥을 어닐링하였다. E. coli DNA 중합효소의 클레나우(3'→5' 엑소(-)) 단편을 엔자이매틱스(Enzymatics, Beverly, MA; 카달로그 번호 P7010-LC-L)로부터 구입하였다. 초순수 소혈청 알부민(BSA) 및 초순수 연어 정자 DNA 용액을 라이프 테크놀로지스(Life Technologies, Foster City, CA)로부터 구입하였다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 뉴클레오사이드 이인산 키나아제(NDPK) 효소(카달로그 번호 N0379), 아데노신 이인산(ADP) 및 코발트(II) 클로라이드 6수화물(카달로그 번호 255599)을 시그마(Sigma, St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 모든 시약 및 용액은 분자 생물학 등급이었다. 프라이머-주형 이합체를 어닐링 완충액 내로 희석(100 nM)하였다. 세척 완충액은 20 mM 트리스, pH 8.0, 200 mM KCl, 200 mM 칼륨 글루타메이트, 0.01%(v/v) 트윈-20, 100 μg/mL 소혈청 알부민, 1.0 mM 디티오트레이톨이었다. 결합 완충액은 낮은 CoCl2(0.050 mM)를 함유하는 세척 완충액이었다. 반응 완충액은 높은 CoCl2(15 mM)를 함유하는 결합 완충액이었다. EDTA 세척 완충액은 1.0 mM EDTA를 함유하는 결합 완충액이었다. 프라이머-주형(PT)을 함유하는 완충액, 하나의 dNTP를 함유하는 결합 완충액, 및 반응 완충액을 Greiner 96-웰 블랙 마이크로플레이트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 카달로그 번호 M9685)에 로딩(200 μL/웰)하고, PCR-등급 미네랄 오일(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 카달로그 번호 M8662)을 적용(75 μL/웰)하였다. 고정밀 스트렙타비딘 바이오센서(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA; 카달로그 번호 18-5117)를 사용 전에 대략 10분 동안 어닐링 완충액에서 재수화시켰다. 옥텟 QK 바이오센서 시스템(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA)을 30℃ 작동을 위해 설정하고, 바이오센서를 프라이머-주형으로 코팅하고 결합하지 않은 프라이머-주형을 세척 완충액으로 세척하도록 프로그램하였다. 바이오센서를 표시된 대로 클레나우 엑소(-)(68 단위/mL), CoCl2(100 μM) 및 100 μM dNTP(dATP, dTTP, dGTP 또는 dCTP)를 함유하는 결합 완충액으로 옮긴 다음(결합 단계), CoCl2(15 mM), NDPK, ADP(1 mM) 및 연어 정자 DNA(500 μg/mL)를 함유하는 반응 완충액에서 dNTP 도입(해리 단계)하였다. 바이오센서를 EDTA 세척 완충액으로 옮긴 다음, 효소, 뉴클레오타이드 또는 2가 양이온이 없는 반응 완충액에서 재평형화하였다. 유사하게, 바이오센서를 표시된 대로 개별 데옥시리보뉴클레오사이드 삼인산(dATP, dGTP, dCTP 또는 dTTP)을 함유하는 용액으로 주기적으로 옮겼다. 결합 및 도입의 이중 사이클을 각각의 dNTP에 대해 반복하여 시퀀싱을 평가하였다. 옥텟 간섭계 기구에 의해 생성된 모니터링 데이터를 디스플레이를 위해 마이크로소프트 엑셀 및 프리즘 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어, San Diego, CA) 내로 가져왔다.
절차의 결과가 도 15에 제시되어 있다. ssDNA 프라이머-주형으로 코팅된 바이오센서에 대한 결합 분석에서, 클레나우(엑소(-)) 효소는 dNTP의 부재하에 바이오센서에 불량하게 결합하였다(도 15, 해치 막대). 정확한 개별 dNTP의 존재하에, 처음 30개 뉴클레오타이드에 대해 100% 정확한 DNA 서열에 해당하는 처음 40 사이클에 대해 강한 피크가 관찰되었고(도 15, 검은색 막대), 이는 각각의 동종중합체가 단일 피크로 압축되었다고 가정한다. 그후, 식별가능한 서열에 해당하지 않는 사이클 41 이후에 작은 피크 높이가 관찰되었다. 이러한 결과는 낮은 Co2+ 농도에 의해 매개된 검사 단계에서 효소-dNTP-프라이머/주형 삼성분 복합체의 결합 후 높은 Co2+ 농도의 존재하에 dNTP 도입과 함께 DNA 중합효소의 클레나우 엑소(-) 단편을 사용하여 이중 가닥의 DNA를 시퀀싱하는 능력을 입증한다.
실시예 16은 연장된 서열 결정을 입증하는 데 사용된 절차를 기술한다. 하기에 나타낸 바와 같이, 결과는 DNA 중합효소(클레나우 엑소(-) 단편)를 사용하여 단일 가닥의 DNA를 시퀀싱하는 능력을 확인하였는데, 검사 단계에서 효소-dNTP-프라이머/주형 삼성분 복합체의 결합은 2가 비촉매성 양이온(즉, Ni2+)에 의해 안정화되었다. 이후, 동족 dNTP는 2가 촉매성 양이온(즉, MgCl2)과의 교환을 통해 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로 도입되었다.
실시예
16
중합효소 트랩 및
dNTP
-제거 효소의 존재하에 니켈 향상된 결합, 마그네슘 교환 및 촉매 작용을 이용한 단일 가닥의 DNA의 시퀀싱에 의한 긴 리드 길이
절차에 사용된 물질 및 방법은 다음과 같았다. 3' 역위된 dT를 갖는 주형 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S C4493A의 DNA 서열은 바이오틴-5'-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGATGGAGCTCATGGCGGG-3'-(3'-dT-5')(서열번호:21)이었다. 프라이머 올리고뉴클레오타이드 4496-4509AS의 DNA 서열은 5'-CCCGCCATGAGCTC-3'(서열번호:10)이었다. 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 통합된 DNA 기술(Coralville, IA)에 의해 분석(액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 및 전기분무 이온화(ESI))하였다. 올리고뉴클레오타이드를 100 μM로 TE 완충액(10 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 0.1 mM EDTA)에서 제조하였다. ssDNA 프라이머/주형을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 "Btn-4460-4509S C4493A" 및 "4496-4509AS"를 어닐링 완충액(10 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 0.1 mM EDTA, 80 mM KCl)을 함유하는 튜브에서 조합(10 μM 각각의 가닥)하였다. 올리고뉴클레오타이드 용액을 함유하는 튜브를 건조 열 블록(5분 동안 95℃) 상에 로딩하고, 블록을 벤치 탑으로 옮겨 주위 온도로 점진적으로 냉각하여 가닥을 어닐링하였다. E. coli DNA 중합효소의 클레나우(3'→5' 엑소(-)) 단편을 엔자이매틱스(Enzymatics, Beverly, MA; 카달로그 번호 P7010-LC-L)로부터 구입하였다. 초순수 소혈청 알부민(BSA) 및 초순수 연어 정자 DNA 용액을 라이프 테크놀로지스(Life Technologies, Foster City, CA)로부터 구입하였다. 사카로마이세스 세레비지애 뉴클레오사이드 이인산 키나아제(NDPK) 효소(카달로그 번호 N0379), 아데노신 이인산(ADP) 및 니켈(II) 설페이트 6수화물(카달로그 번호 467901)을 시그마(Sigma, St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 모든 시약 및 용액은 분자 생물학 등급이었다. 프라이머-주형 이합체를 어닐링 완충액 내로 희석(100 nM)하였다. 세척 완충액은 20 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 200 mM KCl, 200 mM 칼륨 글루타메이트, 0.01%(v/v), 트윈-20, 100 μg/mL 소혈청 알부민, 1.0 mM 디티오트레이톨이었다. 결합 완충액은 2.0 mM Ni(II)SO4를 함유하는 세척 완충액이었다. 반응 완충액은 MgCl2(10 mM)를 함유하는 결합 완충액이었다. EDTA 세척 완충액은 1.0 mM EDTA를 함유하는 결합 완충액이었다. 프라이머-주형(PT)을 함유하는 완충액, 하나의 dNTP를 함유하는 결합 완충액 및 반응 완충액을 Greiner 96-웰 블랙 마이크로플레이트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 카달로그 번호 M9685) 내로 로딩(200 μL/웰)하고, PCR-등급 미네랄 오일(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 카달로그 번호 M8662)을 적용(75 μL/웰)하였다. 고정밀 스트렙타비딘 바이오센서(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA; 카달로그 번호 18-5117)를 사용 전에 대략 10분 동안 어닐링 완충액에서 재수화시켰다. 옥텟® QK 바이오센서 시스템(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA)을 30℃ 작동을 위해 설정하고, 바이오센서를 프라이머-주형으로 코팅하고 결합하지 않은 프라이머-주형을 세척 완충액으로 세척하도록 프로그램하였다. 바이오센서를 표시된 대로 클레나우 엑소(-)(68 단위/mL), Ni(II)SO4(2.0 mM) 및 100 μM dNTP(dATP, dTTP, dGTP 또는 dCTP)를 함유하는 결합 완충액으로 옮긴 다음(결합 단계), MgCl2(10 mM), NDPK, ADP(1 mM) 및 연어 정자 DNA(500 μg/mL)를 함유하는 반응 완충액에서 dNTP 도입(해리 단계)하였다. 바이오센서를 EDTA 세척 완충액으로 옮긴 다음, 효소, 뉴클레오타이드 또는 2가 양이온이 없는 반응 완충액에서 재평형화하였다. 유사하게, 바이오센서를 표시된 대로 개별 데옥시리보뉴클레오사이드 삼인산(dATP, dGTP, dCTP 또는 dTTP)을 함유하는 용액으로 주기적으로 옮겼다. 결합 및 도입의 이중 사이클을 각각의 dNTP에 대해 반복하여 시퀀싱을 평가하였다. 옥텟 간섭계 기구에 의해 생성된 모니터링 데이터를 디스플레이를 위해 마이크로소프트 엑셀 및 프리즘 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어, San Diego, CA) 내로 가져왔다.
절차의 결과가 도 16에 나타나 있다. ssDNA 프라이머-주형으로 코팅된 바이오센서에 대한 결합 분석에서, 클레나우(엑소(-)) 효소는 dNTP의 부재하에 바이오센서에 불량하게 결합하였다(도 16, "클레나우"). 정확한 개별 dNTP의 존재하에, 처음 32개 뉴클레오타이드(CATCAGGATGAACCGGGGCAGGGATTGCAGGC(서열번호:23))에 대한 100% 정확한 DNA 서열에 해당하는 강한 피크가 관찰되었고(도 16, "클레나우+dNTP"), 이는 각각의 동종중합체가 단일 피크로 압축된다고 가정한다. 750분 후, 신호는 최소였고, 마지막 4개의 뉴클레오타이드(TCAC)에 대해 식별가능한 서열을 생성하지 않았다. 동종중합체 압축은 반응 완충액에서 하나를 초과하는 dNTP를 도입하는 중합효소로부터 비롯될 수 있었다. 단일-턴오버(turnover) 도입을 지원하도록 의도된 조건에 의해 동종중합체 압축을 방지하기 위해 두 가지 방법을 사용하였다. 첫째, 자유 클레나우가 프라이머/주형에 재결합하고 제2 dNTP를 도입하는 것을 차단하기 위해, 일부 반응 완충액은 중합효소 트랩으로서 과량의 연어 정자 DNA를 함유하였다. 둘째, 반응 완충액 내의 자유 dNTP가 클레나우-프라이머/주형 복합체를 재결합시키고 초기(nascent) 사슬 내로 효소적으로 도입되는 것을 방지하기 위해, NDPK 및 ADP를 함유하는 반응 완충액은 자유 dNTP를 dNDP 및 ATP로 전환시켜 dNDP가 중합효소에 의해 도입될 수 없도록 의도되었다. 삼성분 복합체는 결합 단계에서 형성되었고, 이후 반응 완충액에서 해리되었다. 중합효소 트랩을 함유하는 반응 완충액은 해리 진폭을 초과하는 결합 진폭에 의해 입증된 바와 같이 바이오센서 팁 상에 축적을 입증하였다(도 16, "클레나우+dNTP"). 대조적으로, NDPK 및 ADP를 함유하는 반응 완충액은 해리 후 기저선 분해능을 생성하였는데, 이는 해리 단계가 완료되었음을 시사한다(도 16, "NDPK+ADP+클레나우+dNTP"). 이러한 결과는 시퀀싱의 캡핑된(capped) 비생산적인 종료를 초래할 수 있는 중합효소-프라이머/주형 복합체에의 재결합에서 dNTP에 대한 역할을 시사한다. NDPK 및 ADP를 함유하는 반응 완충액은 촉매 작용 동안 자유 dNTP의 풀(pool)을 고갈시킴으로써 이러한 비생산적인 캡핑된 생성물을 방지하는 것으로 보인다. 연어 정자 DNA, NDPK 및 ADP의 존재하에도 동종중합체 압축이 관찰되었으므로 단일-턴오버 도입은 달성되지 않았으며; 예상된 서열(CATCAGGATGAACCGGGGCAGGGATTGCAGGCTCAC(서열번호:24))은 도 16에 나타난 바와 같이 연속적인 디뉴클레오타이드(GG, AA, CC 또는 TT), 트리뉴클레오타이드(GGG) 또는 테트라뉴클레오타이드(GGGG)가 없는 CATCAGATGACGCAGATGCAGC(서열번호:25)로서 검출되었다.
실시예 17은 이전 실시예에서 사용된 것과 상이한 중합효소를 사용한 연장된 서열 결정을 입증하는 데 사용된 절차를 기술한다. 하기에 나타낸 바와 같이, 결과는 Bsu Pol I(큰 단편)을 사용하여 단일 가닥의 DNA를 시퀀싱하는 능력을 확인하였고, 검사 단계에서 효소-dNTP-프라이머/주형 삼성분 복합체의 결합은 2가 비촉매성 양이온(즉, Ni2+)에 의해 안정화되었다. 동족 dNTP는 이후에 2가 촉매성 양이온(즉, MgCl2)과의 교환을 통해 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로 도입되었다. 동종중합체 분해능은 반응 완충액에서 경쟁하는 dNDP를 사용하여 개선되었다.
실시예
17
중합효소 트랩 및 2'-
데옥시리보뉴클레오사이드
디포스페이트
의
존재하에 니켈(II) 향상된 결합, 마그네슘 교환 및 촉매 작용을 이용한 단일 가닥의 DNA의 시퀀싱에 의한 동종중합체 분해능
절차에 사용된 물질 및 방법은 다음과 같았다. 3' 역위된 dT를 갖는 주형 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S C4493A의 DNA 서열은 바이오틴-5'-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGATGGAGCTCATGGCGGG-3'-(3'-dT-5')(서열번호:21)이었다. 프라이머 올리고뉴클레오타이드 4496-4509AS의 DNA 서열은 5'-CCCGCCATGAGCTC-3'(서열번호:10)이었다. 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 통합된 DNA 기술(Coralville, IA)에 의해 분석(액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 및 전기분무 이온화(ESI))하였다. 올리고뉴클레오타이드를 100 μM로 TE 완충액(10 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 0.1 mM EDTA)에서 제조하였다. ssDNA 프라이머/주형을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 "Btn-4460-4509S C4493A" 및 "4496-4509AS"를 어닐링 완충액(10 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 0.1 mM EDTA, 80 mM KCl)을 함유하는 튜브에서 조합(10 μM 각각의 가닥)하였다. 올리고뉴클레오타이드 용액을 함유하는 튜브를 건조 열 블록(5분 동안 95℃) 상에 로딩하고, 블록을 벤치 탑으로 옮겨 주위 온도로 점진적으로 냉각하여 가닥을 어닐링하였다. 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 바실러스 서브틸리스로부터의 Bsu DNA 중합효소 I(큰 단편)을 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs, Ipswich, MA; 카달로그 번호 M0330L)로부터 구입하였다. 초순수 소혈청 알부민(BSA) 및 초순수 연어 정자 DNA 용액을 라이프 테크놀로지스(Life Technologies, Foster City, CA)로부터 구입하였다. 니켈(II) 설페이트 6수화물(카달로그 번호 467901), dCDP, dGDP 및 dTDP를 시그마(Sigma, St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 모든 시약 및 용액은 분자 생물학 등급이었다. 프라이머-주형 이합체를 어닐링 완충액 내로 희석(100 nM)하였다. 세척 완충액은 20 mM 트리스, pH 8.0, 200 mM KCl, 200 mM 칼륨 글루타메이트, 0.01%(v/v), 트윈-20, 100 μg/mL 소혈청 알부민, 1.0 mM 디티오트레이톨이었다. 결합 완충액은 2.0 mM Ni(II)SO4를 함유하는 세척 완충액이었다. 반응 완충액은 20 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 50 mM KCl, MgCl2(10 mM), 0.01%(v/v) 트윈-20, 100 μg/mL 소혈청 알부민, 1.0 mM 디티오트레이톨이었다. EDTA 세척 완충액은 1.0 mM EDTA를 함유하는 결합 완충액이었다. 프라이머-주형(PT)을 함유하는 완충액, 하나의 dNTP를 함유하는 결합 완충액 및 반응 완충액을 Greiner 96-웰 블랙 마이크로플레이트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 카달로그 번호 M9685) 내로 로딩(200 μL/웰)하고, PCR-등급 미네랄 오일(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 카달로그 번호 M8662)을 적용(75 μL/웰)하였다. 고정밀 스트렙타비딘 바이오센서(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA; 카달로그 번호 18-5117)를 사용 전에 대략 10분 동안 어닐링 완충액에서 재수화시켰다. 옥텟 QK 바이오센서 시스템(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA)을 30℃ 작동을 위해 설정하고 바이오센서를 프라이머-주형으로 코팅하고 결합하지 않은 프라이머-주형을 세척 완충액으로 세척하도록 프로그램하였다. 바이오센서를 표시된 대로 Bsu Pol I(68 단위/mL), Ni(II)SO4(1.0 mM) 및 100 μM dNTP(dATP, dTTP, dGTP 또는 dCTP)를 함유하는 결합 완충액으로 옮긴 다음(결합 단계), MgCl2(10 mM), 연어 정자 DNA(500 μg/mL) 및 상응하는 dNDP(사용되지 않은 dADP 제외)를 함유하는 반응 완충액에서 dNTP 도입(해리 단계)하였다. 바이오센서를 EDTA 세척 완충액으로 옮긴 다음, 효소, 뉴클레오타이드 또는 2가 양이온이 없는 반응 완충액에서 재평형화하였다. 유사하게, 바이오센서를 표시된 대로 개별 데옥시리보뉴클레오사이드 삼인산(dATP, dGTP, dCTP 또는 dTTP)을 함유하는 용액으로 주기적으로 옮겼다. 결합 및 도입의 사이클을 각각의 dNTP에 대해 반복하여 시퀀싱을 평가하였다. 옥텟 간섭계 기구에 의해 생성된 모니터링 데이터를 디스플레이를 위해 마이크로소프트 엑셀 및 프리즘 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어, San Diego, CA) 내로 가져왔다.
절차의 결과가 도 17A-17B에 제시되어 있다. ssDNA 프라이머-주형으로 코팅된 바이오센서에 대한 결합 분석에서, Bsu Pol I 효소는 정확한 dNTP의 존재하에 바이오센서에 강하게 결합하였다(도 17A). 반응 완충액이 과량의 dNDP(3.0 mM)를 함유하는 신호 피크는 CATCAGG의 정확한 DNA 서열에 해당하며, 동종중합체의 2개의 GG는 2개의 뚜렷한 피크의 검출로 분해된다(도 17A, 화살표). 대조적으로, 동종중합체를 분해하지 못하는 것은 반응 완충액에서 dNDP가 결여된 대조군에 대한 신호 피크에서 관찰되었고, 이는 GG 동종중합체가 단일 G 피크로 압축된 것으로 가정하여 CATCAGGAT의 정확한 DNA 서열에 해당한다(도 17A, "대조군"). 동종중합체 분해능에 대한 dNDP의 효과는 2개의 수단에 의해 검증된다: (1) GG 디뉴클레오타이드의 두 번째 G 피크의 높이가 반응 완충액에서의 dNDP의 농도에 의존적이고(도 17A, 두 번째 화살표); 및 (2) GG 동종중합체 이후의 다음의 뉴클레오타이드(A 및 T)가 반응 완충액에서의 dNDP 농도와 반비례한다. 동종중합체 압축은 반응 완충액에서 하나를 초과하는 dNTP를 도입하는 중합효소로부터 유래될 수 있었다. 단일-턴오버 도입을 지원하도록 의도된 조건에 의해 동종중합체 압축을 방지하기 위해 두 가지 방법을 사용하였다. 첫째, Bsu Pol I이 프라이머/주형에 재결합하고 제2 dNTP를 도입하는 것을 차단하기 위해, 반응 완충액은 중합효소 트랩으로서 과량의 연어 정자 DNA를 함유하였다. 둘째, 반응 완충액 내의 자유 dNTP가 Bsu Pol-프라이머/주형 복합체를 재결합시키고 초기(nascent) 사슬 내로 효소적으로 도입되는 것을 방지하기 위해, 자유 dNTP에 의한 중합효소 결합에 대해 경쟁하는 dNDP를 함유하는 반응 완충액은 Bsu Pol-프라이머/주형 복합체에 결합하고 추가 도입을 차단하여, 동종중합체 압축을 차단할 것으로 예상된다. 단일-턴오버 도입의 목표는 거의 달성되는데, GG 동종중합체의 두 번째 피크가 첫 번째 G 피크의 크기의 60.1%였고(도 17B), 동종중합체 압축에 의한 다음의 2개의 뉴클레오타이드(A 및 T)에 대한 결합이 각각 73.4% 및 92.0% 감소하였기 때문이다(도 17B).
실시예 18은 동종중합체 서열의 동역학적 분해능을 입증하는 데 사용된 절차를 기술한다. 하기에 나타낸 바와 같이, 결과는 2단계 방법을 사용하여 동종중합체 주형 내로의 단일 및 다수의 도입을 정량적으로 검출하는 능력을 확인하였다. 첫째, 삼성분 복합체의 결합에 대한 동역학적 매개변수는 다수의 도입(ALK-G2, ALK-G3, ALK-G4)과 비교하여 단일 도입(ALK-G1)에 대해 상이하였다. 둘째, 삼성분 복합체-코팅된 바이오센서 팁을 반응 완충액으로 옮긴 후, 해리의 초기 속도(0-8초)는 동종중합체 주형(ALK-G2, ALK-G3, ALK-G4) 내의 2, 3 또는 4개의 뉴클레오타이드의 도입이 정량적으로 식별되는 것을 허용하였다.
실시예
18
2'-
데옥시리보뉴클레오사이드
디포스페이트 및 경쟁 기질의 존재하에 니켈(II) 향상된 결합, 마그네슘 교환 및 촉매 작용을 이용한 단일 가닥의 DNA의
시퀀싱에 의
한 동종중합체 분해능을 위한 동역학적 방법
절차에 사용된 물질 및 방법은 다음과 같았다. 3' 역위된 dT를 갖는 야생형 ALK 주형 올리고뉴클레오타이드 Btn-4460-4509S의 DNA 서열은 바이오틴-5'-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGCTGGAGCTCATGGCGGG-3'-(3'-dT-5')(서열번호: 7)이었다. ALK-G1 프라이머 올리고뉴클레오타이드 4494-4509AS의 DNA 서열은 5'-CCCGCCATGAGCTCCA-3'(서열번호: 26)이었다. ALK-G2 프라이머 올리고뉴클레오타이드 4491-4509AS의 DNA 서열은 5'-CCCGCCATGAGCTCCAGCA-3'(서열번호: 27)이었다. ALK-G3 프라이머 올리고뉴클레오타이드 4476-4509AS의 DNA 서열은 5'-CCCGCCATGAGCTCCAGCAGGATGAACC/ideoxyI/GGGCA-3'(서열번호: 28)이었고, "/ideoxyI/"는 2'-데옥시이노신 잔기이다. ALK-G4 프라이머 올리고뉴클레오타이드 4482-4509AS의 DNA 서열은 5'-CCCGCCATGAGCTCCAGCAGGATGAACC-3'(서열번호: 29)이었다. 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 통합된 DNA 기술(Coralville, IA)에 의해 분석(액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 및 전기분무 이온화(ESI))하였다. 올리고뉴클레오타이드를 100 μM로 TE 완충액(10 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 0.1 mM EDTA)에서 제조하였다. ssDNA 프라이머/주형을 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 "Btn-4460-4509S" 및 "4494-4509AS," "4491-4509AS," "4476-4509AS," 또는 "4482-4509AS"(각각 ALK-G1, ALK-G2, ALK-G3 또는 ALK-G4 이합체)를 어닐링 완충액(10 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 0.1 mM EDTA, 80 mM KCl)을 함유하는 튜브에서 조합(10 μM 각각의 가닥)하였다. 올리고뉴클레오타이드 용액을 함유하는 튜브를 건조 열 블록(5분 동안 95℃) 상에 로딩하고, 블록을 벤치 탑으로 옮겨 주위 온도로 점진적으로 냉각하여 가닥을 어닐링하였다. 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 바실러스 서브틸리스로부터의 Bsu DNA 중합효소 I(큰 단편)을 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs, Ipswich, MA; 카달로그 번호 M0330L)로부터 구입하였다. 초순수 소혈청 알부민(BSA) 및 초순수 연어 정자 DNA 용액을 라이프 테크놀로지스(Life Technologies, Foster City, CA)로부터 구입하였다. 기질 유사체 2'-데옥시아데노신-5'-O-(1-티오트리포스페이트)("α-S-dATP"), 2'-데옥시시티딘-5'-O-(1-티오트리포스페이트)("α-S-dCTP"), 2'-데옥시구아노신-5'-O-(1-티오트리포스페이트)("α-S-dGTP") 및 2'-데옥시티미딘-5'-O-(1-티오트리포스페이트)("α-S-dTTP")를 트리링크 바이오테크놀로지스사(TriLink Biotechnologies, Inc.(San Diego, CA)로부터 구입하였다. 니켈(II) 설페이트 6수화물(카달로그 번호 467901)을 시그마(Sigma, St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 모든 시약 및 용액은 분자 생물학 등급이었다. 프라이머-주형 이합체를 어닐링 완충액 내로 희석(100 nM)하였다. 세척 완충액은 30 mM 트리스, pH 8.0, 160 mM KCl, 160 mM 칼륨 글루타메이트, 0.01%(v/v), 트윈-20, 100 μg/mL 소혈청 알부민, 1.0 mM 디티오트레이톨이었다. 결합 완충액은 Bsu Pol I(68 단위/mL) 100 μM dGTP + 1.0 mM Ni(II)SO4를 함유하는 세척 완충액이었다. 반응 완충액은 Bsu(1 U/mL), MgCl2(80 μM), dGTP(28.1 μM), α-S-dGTP(162 μM)를 함유하는 세척 완충액이었다. EDTA 세척 완충액은 1.0 mM EDTA를 함유하나 Ni(II)SO4가 없는 세척 완충액이었다. 프라이머-주형(PT)을 함유하는 완충액, 결합 완충액 및 반응 완충액을 Greiner 96-웰 블랙 마이크로플레이트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 카달로그 번호 M9685) 내로 로딩(200 μL/웰)하고, PCR-등급 미네랄 오일(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 카달로그 번호 M8662)을 적용(75 μL/웰)하였다. 고정밀 스트렙타비딘 바이오센서(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA; 카달로그 번호 18-5117)를 사용 전에 대략 10분 동안 어닐링 완충액에서 재수화시켰다. 옥텟 QK 바이오센서 시스템(Pall ForteBio Corp., Menlo Park, CA)을 30℃ 작동을 위해 설정하고, 바이오센서를 프라이머-주형으로 코팅하고 결합하지 않은 프라이머-주형을 세척 완충액으로 세척하도록 프로그램하였다. 바이오센서를 결합 완충액으로 옮긴 다음(결합 단계), 반응 완충액에서 dNTP 도입(해리 단계)하였다. 바이오센서를 EDTA 세척 완충액으로 옮긴 다음, 효소, 뉴클레오타이드 또는 MgCl2가 없는 반응 완충액에서 재평형화하였다. 옥텟 간섭계 기구에 의해 생성된 모니터링 데이터를 디스플레이를 위해 마이크로소프트 엑셀 및 프리즘 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어, San Diego, CA) 내로 가져왔다. 결합 단계 시계열을 프리즘 소프트웨어를 사용하여 단일 지수 결합 방정식에 적합화하였다. 결합 단계 동역학적 매개변수(kobs 및 진폭)를 대조군 조건으로서 G의 단일 도입을 갖는 던네트 검정을 사용하여 InStat 통계 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어, San Diego, CA)에 의해 분석하였다. 해리 단계 시계열을 프리즘 소프트웨어를 사용하여 이중 지수 해리 방정식에 적합화하였다.
절차의 결과가 도 18A-18E에 나타나 있다. SsDNA 프라이머-주형으로 코팅된 바이오센서에 대한 결합 분석에서, Bsu Pol I 효소는 정확한 dGTP의 존재하에 프라이머/주형-코팅된 바이오센서에 강하게 결합하였다(도 18A 및 18B). ALK-G1에의 결합에 대한 신호(도 18A)는 ALK-G2, ALK-G3 및 ALK-G4에의 결합보다 높았다(도 18A 및 18B). 삼성분 복합체로 코팅된 바이오센서를 중합효소, dGTP 및 α-S-dGTP, Ni2+ 및 Mg2+를 함유하는 도입 완충액으로 옮긴 후, 뚜렷한 해리 시간 경과가 ALK 주형에 의존적으로 관찰되었다(도 18C). 삼성분 복합체의 형성을 위한 결합 단계를 결합 동역학적 매개변수가 프라이머/주형의 동종중합체 내로의 도입을 위한 뉴클레오타이드의 수에 의해 영향을 받을 수 있는지 분석하였다. 동종중합체 내로의 도입을 위한 다수(2-4)의 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머/주형은 대조군 단일 도입보다 더 낮은 진폭을 가지고 있었고(도 18D), 이는 던네트 검정에 의해 통계학적으로 유의하였다(p<0.01). 유사하게, 동종중합체 내로의 도입을 위한 다수(2-4)의 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머/주형은 대조군 단일 도입보다 더 높은 겉보기 동역학적 상수를 가지고 있었고(도 18D), 이는 던네트 검정에 의해 통계학적으로 유의하였다(p<0.01). 이 발견은 단일 도입이 동종중합체 주형에서의 다수의 도입과 동역학적으로 구별가능하다는 것을 나타낸다. 마지막으로, 관찰된 해리 속도(반응 완충액 내로의 전달 후 0-8초)는 ALK-G2 < ALK-G3 < ALK-G4 ~ ALK-G1의 순위로 도입을 위한 뉴클레오타이드의 수가 증가함에 따라 증가하며, 여기서 Bsu 중합효소 농도는 0.13 - 1 U/mL이다(도 18E).
실시예 19는 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 화학적 도입의 부재하에 중합효소에 의한 정확한 뉴클레오타이드와 부정확한 뉴클레오타이드 사이의 구별을 최적화하는 데 사용된 절차를 기술한다. 절차는 1가 양이온을 제공하기 위해 수용액에 용해된 염을 적정하는데 초점을 맞추었다. 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 중합효소의 결합을 동족 또는 비동족 뉴클레오타이드의 존재하에 모니터링하였다. 절차는 이성분 복합체 형성을 우선적으로 불안정화시킨 조건하에 뉴클레오타이드 구별의 향상에 초점을 맞추었다.
실시예
19
이성분 복합체 형성을 우선적으로 불안정화시키는 것에 의한 동족 및
비동족
뉴클레오타이드 사이의 중합효소 구별의 향상
절차에 사용된 물질 및 방법은 다음과 같았다. 광섬유 팁의 표면에서 결합 반응을 측정하기 위해 생물층 간섭계를 사용하는 FORTEBIO®(Menlo Park, CA) 옥텟® 기구를 멀티웰 플레이트 포맷으로 사용하여 이원 및 삼성분 복합체의 차별적 안정성을 조사하였다. 이들의 5'-말단에서 바이오티닐화된 주형 가닥을 사용하여 프라이밍된 주형 핵산을 표준 절차에 따라 스트렙타비딘(SA)으로 기능화된 광섬유 팁 상에 고정화시켰다. 바이오티닐화된 주형 DNA로부터의 예상된 서열 판독은 86 뉴클레오타이드의 잠재적 리드 길이를 가지고 있었고, 프라이머에 부가될 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 dCTP였다. 팁을 먼저 30 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 및 0.1 mM EDTA를 함유하는 트리스 완충액에서 평형화시킨 다음, 사이클링 프로토콜을 개시하였다. 2개의 시험 뉴클레오타이드(즉, 동족 및 비동족 뉴클레오타이드)에 대한 비의존적 결합 반응을 50 mM 내지 500 mM의 다양한 농도의 NaCl, KCl, 또는 칼륨 글루타메이트의 존재하에 수행하였다. 4번째 시험을 고정된 160 mM 농도의 칼륨 글루타메이트를 사용하여 수행한 반면, KCl의 농도는 50 mM 내지 500 mM로 다양하였다. 모든 경우, 검사 단계 동안 사용된 반응 혼합물은 트리스-HCl(pH 8.0), 0.01% 트윈-20, 100 μg/ml BSA, 2 mM NiSO4, 350 U/ml Bsu DNA 중합효소 큰 단편; 및 100 μM의 농도의 뉴클레오타이드 중 하나를 함유하였다(dCTP는 동족 뉴클레오타이드로서 사용되었고, dGTP는 비동족 뉴클레오타이드로서 사용되었음). 각각의 검사 단계 후, 팁을 30 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 500 mM KCl, 2 mM EDTA 및 0.05% 트윈-20을 함유하는 완충액에 20초 동안 노출시켜 프라이밍된 주형 핵산으로부터 효소 복합체를 제거하였다. 제거 단계 후 효소, dNTP 또는 2가 양이온이 없는 검사 완충액에 15초 노출시켜 검사의 다음 사이클을 위해 팁을 재생시켰다. 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합효소 및 뉴클레오타이드의 결합을 수행하기 위한 단일 접촉 단계를 사용할 때, 결합 단계는 45초 길이이고, 결합 상호작용은 연속적으로 모니터링된다. 이것은 프라이밍된 주형 핵산을 중합효소 및 시험 뉴클레오타이드를 함유한 단일 용액과 접촉시킴으로써 달성되었다. 간섭계 모니터링으로부터의 결과를 분석하여 삼성분 복합체(즉, 동족 뉴클레오타이드를 확인하는 것) 또는 이성분 복합체(즉, 비동족 뉴클레오타이드를 확인하는 것)의 형성을 확인하였다. 간섭계 시험으로부터의 수치 결과가 표 5-8에 재시되어 있다. 반올림된 이성분 복합체 측정값 일부는 너무 낮아서 표에 0.00으로 표시되었지만 배수 향상의 계산을 허용하였다.
표 5-8에 제시된 결과는 어떻게 1가 양이온을 제공하는 염이 뉴클레오타이드 도입을 배제한 조건하에 이성분 복합체 형성을 우선적으로 불안정화시키고 중합효소 차별 잠재력을 향상시켰는지 보여주었다. 결합 반응 혼합물에서 실질적으로 모든 1가 양이온 및 글루타메이트 이온은 첨가된 염에 의해 제공되었으므로, 완충액 및 다른 공급원으로부터의 1가 양이온의 기여는 이 분석에 유의하지 않은 것으로 간주되었다. 결합 신호를 측정하고 동족 또는 비동족 뉴클레오타이드의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산과의 중합효소 상호작용에 대해 비교하였다. 다시, 이러한 결과는 판독으로서 뉴클레오타이드 도입에 의존하지 않고 정확한 뉴클레오타이드 및 부정확한 뉴클레오타이드 사이를 구별하는 결합 반응에 적용된다. 물론, 절차에 사용된 뉴클레오타이드는 표지되거나 표지되지 않을 수 있다. 그러나, 바람직하게는 뉴클레오타이드는 표지되지 않은 천연 뉴클레오타이드이다.
이성분 복합체 형성은 검사 단계에 사용된 조건하에 불안정화되었다. 1가 양이온을 제공하는 모델 염(예컨대, NaCl, KCl, 및 칼륨 글루타메이트)을 이용한 용량-반응 적정은 유사하게 이원 및 삼성분 복합체가 첨가된 염에 차별적으로 민감하였음을 나타내었다. 염 농도가 증가됨에 따라, 이성분 복합체는 상응하는 삼성분 복합체에 비해 계속해서 덜 안정적이게 되었다. 삼성분 복합체(동족 뉴클레오타이드의 존재를 나타냄) 및 이성분 복합체(비동족 뉴클레오타이드의 존재를 나타냄) 사이의 구별을 향상시키는 예시적인 농도 범위는 200 mM 내지 500 mM의 1가 양이온을 제공하는 염이었다. 이러한 값은 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 중합효소 결합이 뉴클레오타이드 실체에(즉, 동족 대 비동족)의 지표로서의 역할을 한 절차에서 유용하였다. 칼륨 글루타메이트의 용량-반응 적정은 유사하게 이원 및 삼성분 복합체의 차별적 안정성을 나타내었다. 여기에서 다시, 첨가된 글루타메이트 염의 농도가 증가함에 따라, 이성분 복합체는 상응하는 삼성분 복합체에 비해 계속해서 덜 안정적이게 되었다. 칼륨 글루타메이트는 각각의 글루타메이트 이온에 대해 2개의 칼륨 이온을 포함하므로, 반응 혼합물에서 칼륨 이온 농도에 대한 기여는 첨가된 글루타메이트 염의 농도의 2배였다.
기재된 절차의 비도입 조건하에, 그리고 글루타메이트의 공급원의 부재하에, 200 mM 미만인 1가 양이온을 함유하는 염의 농도는 동족 및 비동족 뉴클레오타이드 결합 사이에 보통의 구별을 제공하였다. 그러나, 이러한 조건하에 중합효소는 높은 결합능을 유지하였다. KCl 또는 NaCl 단독의 적정은 이성분 복합체 형성의 불안정화를 나타내었고, 상기 배수 구별은 250 mM를 초과하는 농도에서 달성되었지만, 중합효소 결합 활성의 약간의 손실이 있었다. 칼륨 글루타메이트는 또한 시험된 전체 농도에서 실질적으로 이성분 복합체 형성을 불안정화시켰고 차별 잠재력을 향상시켰다. 결합에 의한 시퀀싱 절차를 이용하여 긴 리드 길이를 얻기 위해, 정확한 염기 호출과 부정확한 염기 호출을 구별하는 높은 신호가 표적화된 주형의 많은 염기에 대해 유지되어야 한다. 개선된 배수 구별로 높은 결합능을 유지하기 위해, 50 mM 내지 500 mM의 KCl로 적정하면서 일정한 수준의 글루타메이트(예컨대, 0 mM, 80 mM, 160 mM, 및 320 mM)를 사용하였다.
중합효소의 차별 잠재력의 향상은 중합이 배제된 조건하에 1가 양이온을 제공한 염을 글루타메이트 염과 조합하는 것으로부터 비롯되었다. 예를 들어, 150 mM의 KCl 또는 150 mM의 칼륨 글루타메이트에서, 삼성분 및 이성분 복합체의 형성 사이에 보통의 구별이 있었다. 그러나, 2개의 제제를 조합하는 것은 차별 잠재력을 향상시켰다. 효과는 증가된 1가 양이온 농도 또는 글루타메이트 이온 농도 단독으로 인한 것일 수 없다. 검사 단계 동안 이성분 복합체 형성을 불안정화시키기 위한 바람직한 조건은 1가 양이온을 제공하는 염을 포함하였고, 염의 농도는 50 mM 내지 1,500 mM, 보다 바람직하게는 50 mM 내지 500 mM의 범위로 떨어졌다.
검사 단계에서 이성분 복합체를 불안정화시키는데 유용한 조건을 더 잘 확립하기 위해 표 5-8로부터의 결과의 추가 분석과 함께, 전술한 설명과 일치하는 추가의 절차를 수행하였다. 1가 금속 양이온을 제공한 염(예컨대, KCl)을 이용한 적정은 삼성분 및 이성분 복합체에 대한 신호 사이의 최대 차이(결합에 의한 시퀀싱 절차와 관련된 매개변수)가 염이 약 300 mM - 350 mM의 농도 범위에 있을 때 발생하였음을 보여주는 플롯을 생성하였다(표 5 참고). 그러나, 더 낮은 농도로의 이동은 글루타메이트 염(예컨대, 칼륨 글루타메이트)이 또한 포함되었을 때 달성되었다. 여기에서 신호 사이의 차이는 글루타메이트 염이 80 mM - 320 mM의 농도로 포함되었을 때 1가 양이온(예컨대, 1가 금속 양이온)을 제공하는 염의 약 100 mM - 300 mM의 범위에서 가장 두드러졌다. 실제로, 신호 사이의 차이는 320 mM의 글루타메이트 염에서 100 mM - 200 mM; 160 mM의 글루타메이트 염에서 150 mM - 250 mM(표 8 참고); 및 80 mM의 글루타메이트 염에서 175 mM - 300 mM의 범위에서 가장 두드러졌다. 이성분 복합체(차별 효과를 측정하는 상이한 매개변수) 대비 삼성분 복합체에 대한 최대 신호 비율은 적정이 글루타메이트 염의 부재하에 수행되었을 때 1가 금속 양이온을 제공하는 염에 대해 약 450 mM에서 중심이었다. 조합된 적정에서의 비율은 1가 금속 양이온을 제공하는 염이 320 mM의 글루타메이트 염에서 200 mM - 250 mM; 160 mM의 글루타메이트 염에서 350 mM - 450 mM; 및 80 mM의 글루타메이트 염에서 275 mM - 350 mM의 범위로 떨어졌을 때 가장 두드러졌다. 모든 경우에, 최대 차별 비율을 생성한 1가 양이온을 제공하는 염의 농도는 삼성분 및 이성분 복합체를 나타내는 신호 사이에 최대 차이를 달성하는 데 필요한 농도보다 실질적으로 더 높았다. 주목할만하게도, 실질적으로 상기 언급된 농도(즉, 75 mM, 150 mM, 및 325 mM)로 글루타메이트 염 단독(즉, 첨가된 KCl 없음)을 사용하여 수행된 시험은 실질적으로 차별 잠재력의 향상을 나타내지 않았거나, 단지 매우 보통의 향상을 나타내었다(표 7 참고). 첨가된 염의 부재하에, 검사 단계에서 유용한 조건을 생성하는 데 필요한 글루타메이트 염의 농도는 바람직하게는 325 mM보다 더 높았다.
Bst 및 클레나우 중합효소를 사용하여 수행된 추가 시험은 이성분 복합체 형성이 글루타메이트 염 및/또는 1가 양이온(예컨대, 1가 금속 양이온)을 제공한 염을 포함한 검사 조건에 의해 우선적으로 불안정화되었음을 확인시켜 주었다. 일반적으로 말해서, 칼륨 글루타메이트의 농도가 증가함에 따라, 이성분 복합체를 불안정화시키는 KCl의 농도는 여전히 양호한 차별결과를 생성하면서 감소될 수 있었다. 칼륨 글루타메이트 농도가 500 mM만큼 높았을 때, 첨가된 KCl은 정확한 뉴클레오타이드와 부정확한 뉴클레오타이드 사이의 우수한 구별을 여전히 제공하면서 완전히 생략될 수 있었다(즉, 첨가된 KCl의 농도는 0 mM이었음). 마찬가지로, 칼륨 글루타메이트 농도가 320 mM이었을 때, 25 mM의 KCl 농도는 클레나우 중합효소를 사용하여 현저한 결과를 생성하였다. Bst 효소를 사용할 때, 최상의 결과를 달성하기 위해 약간 더 높은 농도의 KCl이 필요하였다.
따라서, 최적 차별 조건은 상이한 중합효소 사이에 다소 상이하였지만, 단독으로 또는 또 다른 글루타메이트 염과 조합하여 1가 양이온(예컨대, 1가 금속 양이온)을 제공하는 염이 이성분 복합체를 우선적으로 불안정화시켜 정확한 뉴클레오타이드와 부정확한 뉴클레오타이드 결합 사이의 구별을 향상시켰다는 것은 일반적으로 사실이었다. 글루타메이트 염이 1가 금속 양이온을 제공하는 염으로서 작용할 수 있음이 입증되었다.
전술한 것에 기초하여, 그리고 또한 실시예에 기재된 절차에 따른 추가의 시험에 비추어, 이성분 복합체 형성을 불안정화시키기 위한 바람직한 조건은 다음과 같았다. 검사 단계에서 사용된 반응 혼합물은 1가 양이온, 바람직하게는 1가 금속 양이온(예컨대, +1의 산화 상태를 갖는 금속 양이온)의 공급원을 함유해야 한다. 이것은 반응 혼합물에 1가 양이온을 제공하는 염을 포함시킴으로써 간편하게 달성될 수 있으며, 염은 약 50 mM - 1,500 mM의 농도로 포함된다. 바람직하게는, 염은 약 50 mM - 500 mM의 농도로 포함된다. 보다 바람직하게는, 염은 약 100 mM - 300 mM의 농도로 포함된다. 선택적으로, 1가 양이온을 제공하는 염은 또한 글루타메이트 음이온을 제공한다(즉, 염은 글루타메이트 염임). 이러한 농도 범위로 사용된 염이 는 글루타메이트 염 이외의 염인 경우, 염을 함유하는 반응 혼합물은 선택적으로 약 10 mM - 1,600 mM의 농도, 보다 바람직하게는 10 mM - 500 mM의 범위, 또는 보다 바람직하게는 80 mM - 320 mM의 범위로 글루타메이트 염을 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로 말해서, 검사 단계에서 프라이밍된 주형 핵산 분자를 반응 혼합물과 접촉시키는데 사용된 반응 조건은 바람직하게는 이성분 복합체 형성보다 삼성분 복합체 형성이 적어도 2배, 적어도 5배 이상 유리하다. 주목할 만하게도, 감소된 삼성분 복합체 형성은 결합에 의한 시퀀싱 절차의 검사 단계에서 조정될 수 있는데, 도입 반응이 중합효소 및 프라이밍된 주형 핵산 분자 사이의 상호작용(예컨대, 이성분 복합체의 형성을 허용하거나 유리한 상호작용 포함)을 촉진하는 상이한 반응 조건하에 고효율로 수행될 수 있기 때문이다.
이성분 복합체 형성으로부터 비롯되는 신호로 인한 기여를 감소시키거나 최소화하는 또 다른 접근법은 중합효소를 프라이밍된 주형 핵산 분자에 전달하는 데 사용된 시약 및 접근법을 포함한다. 여기에서, 전문화된 "중합효소 전달 시약"(PDR)이 검사를 받는 뉴클레오타이드에 대한 특정 제한을 받는 결합에 의한 시퀀싱 절차에 사용될 수 있다. PDR은 유리하게도 삼성분 복합체의 효율적인 형성을 여전히 허용하면서 원치않는 이성분 복합체 형성을 최소화하는 것을 돕는다, 개시된 PDR은 개선된 결과를 수득하기 위하여 다양한 플랫폼(예컨대, 표지가 없는 SPR; 플로우 셀에서의 형광 폴(fluorescent pols) 등)에서 사용될 수 있다. 일반적으로 말해서, 신호-대-노이즈 비율은 PDR을 사용하고 동족 및 비동족 뉴클레오타이드 실체에의 지표로서 중합효소 결합을 모니터링하는 절차에서 개선되며, 이것은 정확한 염기 호출 및 연장된 판독을 돕는다.
PDR의 개발 전에, 중합효소 시약은 자유 핵산 분자의 부재하에 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자에 전달되었다. 적어도 일부 수준의 백그라운드 신호는 동족 뉴클레오타이드의 부재하에 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 중합효소의 결합으로 인해 항상 검출되었다. 실제로, 백그라운드 결합이 너무 광범위하여 정확한 염기가 부가되었을 때 관찰가능한 차이가 검출되지 않은 경우 조건이 확인될 수 있었다. 이 백그라운드 신호는 이성분 복합체 형성에 기인하였고, 중합효소는 동족 뉴클레오타이드의 부재하에 프라이밍된 주형 핵산 분자에 결합하였다.
본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 이성분 복합체 형성으로부터 발생하는 신호를 감소시키는데 사용된 대안적인 접근법은 염의 농도 및 조합에 초점을 맞추었다. 예를 들어, KCl 및 칼륨 글루타메이트의 농도 범위는 이성분 복합체 형성을 억제하는데 유용하고 적절한 것으로 나타났다. 그러나, PDR의 대안적인 사용은 유리하게도 이성분 복합체 형성의 감소를 최소화하는 데 사용된 염 조건을 여전히 현저한 결과를 가지고 변화시킬 수 있다. 이것은 다수의 상이한 접근법이 이성분 복합체 형성을 억제하거나 "불안정화"시키는데 사용될 수 있음을 보여주었다.
실시예 20은 어떻게 PDR의 사용이 유리하게도 정확한 삼성분 복합체 형성을 허용하면서 이성분 복합체로부터 발생하는 신호를 감소시켰는지 입증한 절차를 기술한다. 중합효소 전달 시약은 (a) DNA 중합효소; 및 (b) 프라이밍된 주형 핵산을 포함하였다. 포함된 프라이밍된 주형 핵산은 용액에서 자유 상태이며, 중합효소와 상호작용하여 복합체(예컨대, 이성분 복합체)를 형성할 수 있다.
실시예
20
결합에 의한 시퀀싱 절차에서 이성분 복합체 형성을 감소시키기 위한 중합효소 전달 시약(
PDR
)
4개의 스트렙타비딘 코팅된 옥텟 팁을 프라이머에 혼성화된 바이오티닐화된 주형 DNA 가닥을 함유하는 결합 완충액과 접촉시켜 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 제조하였다. 이 절차에서, 결합 완충액은 KCl, 칼륨 글루타메이트, TbCl3, 트윈-80 및 BSA를 포함한 ACES-완충(pH 7.5) 용액이었다. 이후, 바이오센서 팁을 핵산을 포함하지 않은 결합 완충액을 사용하여 세척하였다. 바이오센서 팁을 바이오티닐화되지 않은 0 nM, 10 nM, 100 nM 또는 1,000 nM의 가용성 또는 용액상(즉, 용액에서 자유) 프라이밍된 주형 핵산과 함께 부가된 시스테인 잔기를 함유하도록 조작된 1 μM의 Bst DNA 중합효소를 함유하는 결합 완충액과 접촉시켜 이성분 복합체 형성을 달성하였다. 백그라운드 신호를 나타내는 이성분 복합체를 형성하는 데 사용된 용액은 동족 뉴클레오타이드를 포함하지 않았다. 주목할만하게도, 용액상 프라이밍된 주형 핵산은 바이오센서 팁에 고정화된 프라이밍된 주형 핵산의 서열과 상이한 서열을 가지고 있었다. 마지막으로, 바이오센서 팁을 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드인 100 μM의 뉴클레오타이드와 함께 0 nM, 10 nM, 100 nM 또는 1,000 nM의 가용성 또는 용액상(즉, 용액에서 자유) 프라이밍된 주형 핵산을 포함한 결합 완충액 용액과 접촉시켜 삼성분 복합체를 형성하였다. 결합 완충액에 포함된 용액상 뉴클레오타이드는 용액상 프라이밍된 주형 핵산에 대한 동족 뉴클레오타이드가 아니었다. 고정화된 핵산 피처(예컨대, 플로우 셀 내의 표면에 직접 또는 간접적으로 고정화된 프라이밍된 주형 핵산)에 대한 동족 뉴클레오타이드로서 시험될 용액상 뉴클레오타이드를 함유하는 상이한 시약을 사용할 때, 용액상 뉴클레오타이드는 용액상 프라이밍된 주형 핵산에 대한 동족 뉴클레오타이드가 아니어야 한다. 이 방식으로, 삼성분 복합체가 아닌 이성분 복합체만이 용액상 뉴클레오타이드 및 용액상 프라이밍된 주형 핵산 분자 사이에서 형성될 수 있다. 선택적으로, 용액상 뉴클레오타이드를 함유하는 시약 용액에 하나를 초과하는 용액상 프라이밍된 주형 핵산 분자가 있을 수 있다. 보다 특히, 용액상 뉴클레오타이드를 함유하는 단일 시약 용액에 최대 3개의 상이한 용액상 프라이밍된 주형 핵산이 있을 수 있으며, 용액상 뉴클레오타이드는 용액상 프라이밍된 주형 핵산 중 어느 것에 대한 동족 뉴클레오타이드가 아니다.
도 19에 나타난 이들 절차로부터의 결과는, 용액상 프라이밍된 주형 핵산에 대한 동족 뉴클레오타이드가 아닌 용액상 뉴클레오타이드 및 용액상 프라이밍된 주형 핵산과 조합된 중합효소의 전달이 유리하게도 삼성분 복합체 형성을 여전히 허용하면서 이성분 복합체 형성을 억제하거나 불안정화시켰다는 것을 확인시켜 주었다. 보다 특히, 용액상 프라이밍된 주형 핵산의 농도가 증가함에 따라, 뉴클레오타이드의 부재하에 중합효소 결합 신호의 크기의 상응하는 감소가 있었다. 여기에서, 이성분 복합체 형성만이 가능하였다. 이후, 바이오센서 팁에 고정화된 프라이밍된 주형 핵산에 대한 동족 뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드의 포함은 증가된 결합 신호를 생성하였다. 이 절차로부터의 결과의 비교는 신호 크기의 최적 차이가 용액상 프라이밍된 주형 핵산이 100 nM 농도로 존재하였을 때 발생하였음을 나타내었다(도 20 참고). 따라서, 양호한 결과를 생성하는 데 필요한 용액상 프라이밍된 주형 핵산의 농도를 최적화하기 위해 통상적인 절차를 따를 수 있다.
종합하면, 이들 결과는 어떻게 PDR 시약의 사용이 이전에 가능하지 않았던 방식으로 이원 및 삼성분 복합체 형성 사이의 구별을 개선하였는지 보여준다. 유사하게 양호한 결과가 2개의 비의존적 DNA 중합효소를 사용하여 수득되었다. 이것은 접근법의 일반적인 유용성을 확인시켜 주었다.
일부 구현예에서, 복수의 비의존적 검사 반응은 임의의 도입 반응의 수행 전에 완료된다. 상이한 바람직한 접근법에 따르면, 이것은 검출 가능하게 표지된 중합효소를 사용하여, 또는 하나 이상의 검출 가능하게 표지된 뉴클레오타이드를 사용하여 검사를 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
일 접근법에서, 검사 반응은 구별가능하게 표지된 중합효소의 집합보다는 단지 단일 표지된 중합효소를 사용하여 수행될 수 있다. 프라이밍된 주형 핵산(예컨대, 프라이밍된 주형 핵산을 나타내는 고정화된 RCA 생성물 또는 비드와 같은 간격을 두고 떨어져 있는 특징의 집합)은 표지된 중합효소 및 하나 이상의 뉴클레오타이드의 조합과 접촉될 수 있다. 결합을 허용하는 기간, 및 선택적으로 결합 반응 혼합물로부터 임의의 비복합체화된 물질(예컨대, 표지된 중합효소)을 제거하는 세척 단계 후, 프라이밍된 주형 핵산 분자와 표지된 중합효소의 상호작용이 평가된다. 제1 검사 반응의 완료, 및 프라이밍된 주형 핵산 분자로부터 중합효소-뉴클레오타이드(들) 조합의 제거 후, 제2 검사 반응은 프라이밍된 주형 핵산 분자를 제2 중합효소-뉴클레오타이드(들) 조합과 접촉시킴으로써 수행된다. 이후, 검출 및 제거 절차는 반복된다. 이 절차에 사용된 뉴클레오타이드는 임의의 검출 가능한 표지를 가질 필요가 없는데, 동족 뉴클레오타이드 실체에의 지표로서 이 절차에서 검출되거나 모니터링되는 것은 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 중합효소의 국소화이기 때문이다. 다시, 검출 가능하게 표지된 중합효소는 임의의 뉴클레오타이드와의 상호작용의 결과로서 실질적으로 변화하지 않는 신호를 우선적으로 생성한다. 보다 특히, 신호는 실질적으로 균일하다. 이 접근법에 의해, 신호의 생성과 대조적으로, 신호의 국소화가 모니터링되어 삼성분 복합체 형성을 평가할 수 있다. 절차는 삼성분 복합체를 안정화시키기 위해 프라이밍된 주형 핵산 분자에서 비촉매성 금속 이온 또는 가역적으로 차단된 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상이한 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 조합을 삼성분 복합체 형성을 촉진하는 능력에 대해 반복적으로 시험하는 절차에서 단지 단일 유형의 검출 가능하게 표지된 중합효소를 사용하여 연속적인 검사 반응을 수행할 수 있다.
대안적인 접근법에서, 검출 가능하게 표지된 뉴클레오타이드가 검출 가능하게 표지된 중합효소(들) 대신에 사용될 수 있다. 선택적으로, 표지된 뉴클레오타이드는 형광 모이어티, 라만-활성 모이어티 등을 갖는다. 선택적으로, 절차에 사용된 복수의 표지된 뉴클레오타이드 중에서 각각의 상이한 표지된 뉴클레오타이드는 동일한 유형의 형광 모이어티를 포함한다. 대안적으로, 절차에 사용된 복수의 표지된 뉴클레오타이드 중에서 각각의 상이한 표지된 뉴클레오타이드는 절차 동안 이들의 광학 특성에 의해 서로 구별되지 않는 상이한 형광 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 공통의 검출 채널 또는 파장 범위가 삼성분 복합체에서 상이한 표지된 뉴클레오타이드를 검출하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 표지된 뉴클레오타이드의 형광 모이어티의 광학 특성(예컨대, 여기 또는 방출 스펙트럼)은 표지된 뉴클레오타이드가 용액에서 자유이거나(즉, 삼성분 복합체에 포함되지 않음) 또는 삼성분 복합체에 참여하고 있을 때 실질적으로 변화하지 않은 상태를 유지한다. 따라서, 표지된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드가 삼성분 복합체에 참여할 때 구별되는 광학 신호를 방출하는 임의의 형태적으로 민감한 표지, 또는 인터컬레이팅 염료로 표지될 필요가 없다. 또한, 기술의 성공은 검출 가능한 표지가 임의의 다른 형광 염료 또는 ?처 모이어티(예컨대, 검출 가능한 모이어티는 바람직하게는 FRET 파트너일 필요는 없음)와의 에너지 전달 관계에 참여하는 것을 요구하지 않는다. 일부 구현예에서, 중합효소-뉴클레오타이드 조합은 한 번에 하나씩 순차 방식으로 프라이밍된 주형 핵산 분자(예컨대, 플로우 셀 내에 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자)에 전달될 수 있다. 동족 뉴클레오타이드 확인은 뉴클레오타이드에 부착된 표지 모이어티를 검출함으로써 삼성분 복합체를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이것은 동족 뉴클레오타이드 실체를 중합효소와 조합된 프라이밍된 주형 핵산 분자에 접촉된 뉴클레오타이드의 실체에과 연관시키는 것을 포함할 수 있고, 삼성분 복합체는 결과로서 형성되었다. 중합효소-뉴클레오타이드 조합이 공지된 순서로(예컨대, 순차 방식으로) 프라이밍된 주형 핵산에 전달된 삼성분 복합체를 단순히 검출하는 것은 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 확인하는데 충분할 수 있다.
일부 바람직한 접근법에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드와 조합된 중합효소를 프라이밍된 주형 핵산 분자(예컨대, 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자)와 접촉시키는 것을 포함하는 단계는 촉매성 금속 이온(예컨대, 마그네슘 이온 또는 망간 이온)의 존재하에 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 사용하여 수행될 수 있다. 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자는 본원에 기재된 바와 같이, 가역적 터미네이터 모이어티를 갖는 3' 말단 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머를 포함할 수 있다. 실제로, 상이한 중합효소-뉴클레오타이드 조합을 함유하는 시약 또는 용액은 또한 촉매성 금속 이온을 포함할 수 있다. 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자와 접촉될 때, 동족 뉴클레오타이드의 도입은 프라이밍된 주형 핵산 분자의 주형 가닥에 혼성화된 프라이머 가닥의 3' 말단 뉴클레오타이드 상에 가역적 터미네이터 모이어티의 존재에 의해 배제된다. 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 포함하는 삼성분 복합체는 중합효소의 촉매 능력에 관계없이 도입 없이 효율적으로 형성될 수 있다. 임의의 특정 작동 이론에 제한되기를 바라지 않지만, 한 가지 가능성은 촉매성 금속 이온의 존재가 중합효소의 완전성 및 동족 및 비동족 뉴클레오타이드 사이를 인식하고 구별하는 능력을 유지하도록 돕는다는 것이다. 대안적으로, 촉매성 금속 이온의 포함은 유리하게도 삼성분 복합체 자체의 구조에 영향을 미칠 수 있다. 근본적인 기전에도 불구하고, 개시된 기술을 수행하기 위한 일부 바람직한 접근법은 촉매성 금속 이온(예컨대, 마그네슘 이온 및 망간 이온 중 어느 하나 또는 둘 모두)의 존재하에 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자(예컨대, 3' 말단 뉴클레오타이드에 부착된 가역적 터미네이터 모이어티를 갖는 프라이머를 가짐)를 중합효소-뉴클레오타이드 조합과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 접촉 단계는 촉매성 금속 이온의 존재하에, 그리고 뉴클레오타이드 도입을 억제하는 비촉매성 금속 이온의 부재하에 수행된다.
도 21은 단일 유형의 검출 가능하게 표지된 중합효소를 사용한 반복적인 시퀀싱 절차에 대한 간단한 작업 흐름을 예시하며; 도 22는 본원에 기재된 절차 및 프로토콜을 필수적으로 사용하여 수득된 결과를 예시한다. 여기에서, 표지된 중합효소 및 한 번에 하나의 뉴클레오타이드가 Alk-C2 표적 서열에 대한 가역적으로 차단된 프라이밍된 주형 핵산을 갖는 비드와 접촉되었고, 뉴클레오타이드의 예상된 서열은 CGGG였다. 모든 결합 반응은 Mg2+ 이온의 존재하에 수행되었지만, 이 촉매성 금속 이온의 포함은 선택적이었다. 4개의 상이한 뉴클레오타이드를 순차적 방식으로 검사하는 각각의 사이클에서, 정확한 뉴클레오타이드는 가장 높은 결합 신호와 관련되었다. 이것은 검출 가능하게 표지된 중합효소가 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자와 결합하여 예상된 방식으로 삼성분 복합체를 형성하였다는 것을 나타내었다.
하기 실시예는 단일 유형의 검출 가능하게 표지된 중합효소를 사용하여 천연 뉴클레오타이드의 결합을 평가한 결합에 의한 시퀀싱 기술의 일 구현예를 예시한다.
실시예
21
표지된 중합효소 시퀀싱
플로우 셀을 공지된 서열의 합성 프라이밍된 주형 핵산을 나타내는 자성 1 μM 마이크로비드를 사용하여 제조하였다. 간략하게, 스트렙타비딘 코팅된 MyOne C1 자성 비드(ThermoFisher Scientific; Waltham, MA)를 스트렙타비딘 상의 자유 아민 모이어티와 반응하는 TCO-PEG4-NHS(트랜스사이클로옥텐-폴리에틸렌 글리콜-N-하이드록시석신이미드) 모이어티로 기능화하였다. 이후, TCO-변형된 비드를 100 nM의 농도의 원하는 프라이밍된 주형 핵산 분자를 함유하는 용액에서 배양하였다. 다음으로, TCO 변형된 비드에 공유결합하기 위해 NHS-테트라진 에스테르 시약으로 변형된 아미노실란 코팅된 커버슬립으로 제작된 플로우 셀에 비드를 도입하였다. 비드를 표면에 침착시키고, 약 15분 동안 결합시키고, 비드 밀도를 광학 현미경 검사에 의해 확인하였다. 더 높은 비드 밀도가 필요한 경우, 더 많은 비드가 유동되어 결합되었다. 플로우 셀의 내용물을 SuperBlock(ThermoFisher Scientific)으로 "차단"하여 시약이 비드 또는 백그라운드 표면에 비특이적으로 결합하는 것을 최소화하였다.
시퀀싱 진행을 개시하기 전, 시약을 15 mL 코니컬 튜브에 로딩하고, 플로우 셀로 이어지는 시약 라인으로 유동 매니폴드(manifold)에 연결하였다. 비드 어레이를 함유하는 플루오 셀을 20X 대물렌즈가 장착된 현미경에 올린 다음, 유동 매니폴드에 연결하였다. 플로우 셀을 세척 시약으로 퍼징하여 비드 및 프라이밍된 주형 핵산을 출발 반응 조건과 평형화하였다. 시약 전달의 순서 및 시기를 제어하는 자동화 프로토콜을 사용하여 시퀀싱을 시작하였다. 도 21은 예시적인 작업 흐름을 개괄하는 플로우 다이어그램을 나타낸다. 이 절차에서 표지된 중합효소 및 한 번에 단일 뉴클레오타이드를 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자에 접촉시켰다. 절차에 사용된 중합효소는 형광 Cy5 표지에 화학적으로 부착된 시스테인을 함유도하도록 조작된 BSU 중합효소이었다.
도 22는 형광 표지된 중합효소의 평형 결합에 대한 생성된 최대 결합 강도를 나타내며, 중합효소는 한 번에 하나의 천연 뉴클레오타이드와 조합된 프라이밍된 주형 핵산 분자에 결합하였다. 다시, 검출하기 위한 형광 모이어티 및 뉴클레오타이드 사이에 에너지 전달이 없었다. 또한, 중합효소 상의 표지는 중합효소의 위치를 추적하는 방식을 제공하는 역할만을 하는데, 중합효소의 형광은 반응 혼합물 중에 존재하는 상이한 뉴클레오타이드의 결과로서 실질적으로 변화되지 않은 상태를 유지하였다. 각각의 사이클에 대한 최대 결합 신호는 정확한 염기 호출로 간주되었다. 도에 나타낸 특징의 각각의 사이클에 대한 염기 호출은 주형 패널에 포함된 하나의 Alk 유전자 단편의 처음 4개의 염기에 해당하였다. 각각의 경우, 시퀀싱되는 특징은 각각의 검사 단계에 대해 독특한 응답을 나타내었다. 이것은 형광 표지된 중합효소를 사용하여 한 번에 단지 하나의 뉴클레오타이드를 검사하는 반복적인 사이클이 어떻게 주형 핵산을 시퀀싱하는 데 사용될 수 있는지 입증하였다.
개시된 방법 및 조성물을 위해 사용될 수 있거나, 개시된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있거나, 개시된 방법 및 조성물의 제조에 사용될 수 있거나, 또는 개시된 방법 및 조성물의 생성물인 물질, 조성물, 및 성분이 상기에 개시되어 있다.
이러한 물질의 조합, 서브세트, 상호작용, 그룹 등이 개시되어 있을 때, 그리고 이들 화합물의 각각의 다양한 개별적이고 집합적인 조합 및 순열은 명시적으로 개시되지 않을 수 있지만, 각각은 구체적으로 고려되고 본원에 기재된 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 방법이 개시되고 논의되며 방법을 포함하는 많은 분자에게 이뤄질 수 있는 많은 변형이 논의되는 경우, 방법의 각각 및 모든 조합 및 순열, 및 가능한 변형이 달리 명확히 나타나 있지 않는 한 구체적으로 포함된다. 마찬가지로, 이들의 임의의 서브세트 또는 조합 또한 구체적으로 고려되고 개시된다. 이 개념은 개시된 조성물을 사용하는 방법에서의 단계를 포함하여, 본 개시의 모든 양태에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가 단계가 있는 경우, 이러한 추가 단계 각각은 개시된 방법의 임의의 특정 방법 단계 또는 방법 단계의 조합으로 수행될 수 있으며, 이러한 상기 조합 또는 조합의 서브세트가 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주되어야 하는 것으로 이해된다.
본원에 인용된 간행물, 및 이들이 인용된 자료는 그 전체가 참조로 본원에 구체적으로 포함된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 참조로 포함된 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 포함된다.
본원에 사용된 제목은 단지 조직적인 목적을 위한 것이며 명세서 또는 청구범위를 제한하고자 하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
많은 구현예가 기재되었다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형이 이뤄질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 다른 구현예는 청구범위의 범주 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING
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Claims (98)
- (a) 프라이머로 프라이밍된 주형 핵산 분자를 제공하는 단계;
(b) 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서, 프라이밍된 주형 핵산 분자, 중합효소 및 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건하에, 프라이밍된 주형 핵산 분자를 중합효소 및 2종 또는 3종의 상이한 시험 뉴클레오타이드의 상이한 조합을 각각 포함하는 복수의 반응 혼합물과 순차적으로 접촉시키는 단계;
(c) 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 화학적 도입 없이, 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자와의 상호작용을 검출하여, 삼성분 복합체가 형성되는지 여부를 결정하는 단계; 및
(d) 검출된 상호작용을 이용하여 반응 혼합물 중 적어도 2개에 공통인 시험 뉴클레오타이드가 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드인지 여부를 결정하는 단계
를 포함하는, 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 방법. - 제1항에 있어서, 단계 (d)가, 검출된 상호작용을 이용하여 반응 혼합물 중 2개에 공통인 시험 뉴클레오타이드가 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드인지 여부를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 단계 (b)에서 4개의 상이한 반응 혼합물이 프라이밍된 주형 핵산 분자와 순차적으로 접촉되고, 전체적으로 각각의 상이한 뉴클레오타이드가 2개의 반응 혼합물 중에 존재하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (d)가, 검출된 상호작용을 이용하여 반응 혼합물 중 3개에 공통인 시험 뉴클레오타이드가 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드인지 여부를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 단계 (b)에서 6개의 상이한 반응 혼합물이 프라이밍된 주형 핵산 분자와 순차적으로 접촉되고, 전체적으로 각각의 상이한 뉴클레오타이드가 3개의 반응 혼합물 중에 존재하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 조건은 또한 프라이밍된 주형 핵산 분자 및 중합효소를 포함하지만, 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 이성분 복합체를 불안정화시키는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 삼성분 복합체가 프라이머의 3' 말단 뉴클레오타이드 상에 가역적 터미네이터 모이어티의 존재에 의해 안정화되는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 단계 (c) 후, 프라이머의 3' 말단 뉴클레오타이드 상의 가역적 터미네이터 모이어티를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 시험 뉴클레오타이드 각각은 표지되지 않은 뉴클레오타이드인 방법.
- 제9항에 있어서, 중합효소는 단계 (c)에서 검출되는 외인성 표지를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 다음의 정확한 뉴클레오타이드는 단계 (c)에서 검출되는 외인성 표지를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (c) 후 프라이머의 3' 말단에 뉴클레오타이드를 도입하는 단계 (e)를 추가로 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 도입되는 뉴클레오타이드는 표지되지 않은 뉴클레오타이드인 방법.
- 제12항에 있어서, 도입되는 뉴클레오타이드는 표지되지 않은 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드인 방법.
- 제12항에 있어서, 단계 (b) 내지 (e)를 반복하여 프라이밍된 주형 핵산 분자를 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- (a) 중합효소, 프라이밍된 주형 핵산 및 프라이밍된 주형 핵산의 다음의 염기에 상보적인 시험 뉴클레오타이드 사이의 안정화된 삼성분 복합체를 형성하는 조건하에 프라이밍된 주형 핵산을 중합효소 및 2개 또는 3개 유형의 시험 뉴클레오타이드의 제1 조합과 접촉시키는 단계;
(b) 프라이머 내로의 시험 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서 삼성분 복합체를 검출하는 단계;
(c) 프라이밍된 주형 핵산, 중합효소 및 2개 또는 3개 유형의 시험 뉴클레오타이드의 제2 조합을 사용하여 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계로서, 제2 조합은 제1 조합과 상이한 것인 단계;
(d) 단계 (c) 후, 프라이머 내로 다음의 염기에 상보적인 뉴클레오타이드를 도입하는 단계; 및
(e) 단계 (a) 내지 (d)를 반복하여 프라이밍된 주형 핵산의 서열을 확인하는 단계
를 포함하는, 프라이밍된 주형 핵산을 시퀀싱하는 방법. - 제16항에 있어서, 제1 조합은 2개 유형의 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 제2 조합은 2개 유형의 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)는 2개 유형의 시험 뉴클레오타이드의 4개의 상이한 조합에 대해 순차적으로 수행되며, 각각의 상이한 뉴클레오타이드 유형은 프라이밍된 주형 핵산과 합계하여 2회 접촉되는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)는 2개 유형의 시험 뉴클레오타이드의 6개의 상이한 조합에 대해 순차적으로 수행되며, 각각의 상이한 뉴클레오타이드 유형은 합계하여 3회 존재하는 것인 방법.
- (a) 프라이머로 프라이밍된 주형 핵산 분자를 제공하는 단계로서, 상기 프라이머는 이의 3' 말단 뉴클레오타이드에 부착된 가역적 터미네이터 모이어티를 포함하는 단계;
(b) 도입 없이, 촉매성 금속 이온의 존재하에 프라이밍된 주형 핵산 분자를 복수의 중합효소-뉴클레오타이드 조합과 순차적으로 접촉시키는 단계로서,
각각의 상기 조합은 중합효소 및 상이한 뉴클레오타이드를 포함하며,
이로써 상기 상이한 뉴클레오타이드 중 하나가 다음의 정확한 뉴클레오타이드일 때, 중합효소, 중합효소와 조합하여 전달된 상이한 뉴클레오타이드 중 하나, 및 프라이밍된 주형 핵산 분자를 포함하는 삼성분 복합체가 형성되는 단계; 및
(c) 삼성분 복합체를 검출함으로써, 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드를, 삼성분 복합체를 형성하기 위해 중합효소와 조합된 프라이밍된 주형 핵산 분자와 접촉된 상기 상이한 뉴클레오타이드 중 하나로서 확인하는 단계
를 포함하는, 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 확인하는 방법. - 제21항에 있어서, 단계 (b)는 촉매성 금속 이온의 존재하에 그리고 도입을 억제하는 임의의 비촉매성 이온의 부재하에 프라이밍된 주형 핵산 분자를 복수의 중합효소-뉴클레오타이드 조합과 순차적으로 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 촉매성 금속 이온이 마그네슘 이온인 방법.
- 제22항에 있어서, 중합효소는 신호를 생성하는 외인성의 검출 가능한 표지를 포함하는 표지된 중합효소이며, 표지된 중합효소의 외인성의 검출 가능한 표지에 의해 생성된 신호는 임의의 뉴클레오타이드의 존재 또는 부재하에 실질적으로 변화하지 않고, 단계 (c)는 표지된 중합효소의 외인성의 검출 가능한 표지를 검출함으로써 삼성분 복합체를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 단계 (b)에서 상기 조합의 상이한 뉴클레오타이드 각각은 상이한 천연(native) 뉴클레오타이드인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 조합의 각각의 상이한 뉴클레오타이드는 신호를 생성하는 외인성의 검출 가능한 표지를 포함하는 상이한 표지된 뉴클레오타이드이며, 상이한 표지된 뉴클레오타이드에 의해 생성된 신호는 삼성분 복합체의 형성 전과 후에 실질적으로 동일한 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 프라이밍된 주형 핵산 분자는 플로우 셀 내에 함유되며, 단계 (b)는 복수의 중합효소-뉴클레오타이드 조합 중 하나를 각각 포함하는 복수의 시약 용액을 한 번에 하나씩 플로우 셀을 통해 유동시킴으로써 프라이밍된 주형 핵산 분자를 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제27항에 있어서, 프라이밍된 주형 핵산 분자는 플로우 셀 내에 함유된 비드 상에 배치되는 것인 방법.
- 제27항에 있어서, 삼성분 복합체를 형성하기 위해 프라이밍된 주형 핵산 분자와 조합되지 않은 임의의 중합효소 및 상이한 뉴클레오타이드를 제거하는 세척 완충액을 복수의 시약 용액 각각의 유동 사이에 플로우 셀을 통해 유동시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제27항에 있어서, 단계 (c) 후에, (d) 삼성분 복합체를 해리시키는 스트리핑(stripping) 완충액을 플로우 셀을 통해 유동시켜 프라이밍된 주형 핵산 분자로부터 중합효소 및 상이한 뉴클레오타이드 중 하나를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제30항에 있어서, 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머의 3' 말단 뉴클레오타이드에 부착된 가역적 터미네이터 모이어티를 제거하여 연장 가능한 프라이머를 포함하는 프라이밍된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제31항에 있어서, (e) 연장 가능한 프라이머 내로 뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제32항에 있어서, 단계 (e)는 단계 (a)의 중합효소와 상이한 중합효소를 사용하여 도입하는 단계를 포함하는 방법.
- 제32항에 있어서, 연장 가능한 프라이머 내로 도입된 뉴클레오타이드는 가역적 터미네이터 모이어티를 포함하며, 도입은 차단된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 생성하는 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 중합효소는 외인성의 검출 가능한 표지를 포함하는 표지된 중합효소인 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 조합의 상이한 뉴클레오타이드 각각은 상이한 천연 뉴클레오타이드, 또는 임의의 외인성 형광 모이어티가 없는 상이한 표지되지 않은 뉴클레오타이드 유사체인 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 조합의 각각의 상이한 뉴클레오타이드는 신호를 생성하는 외인성의 검출 가능한 표지를 포함하는 상이한 표지된 뉴클레오타이드이며, 상이한 표지된 뉴클레오타이드 각각에 의해 생성된 신호는 삼성분 복합체의 형성 전과 후에 실질적으로 동일한 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 복수의 중합효소-뉴클레오타이드 조합은 4개의 중합효소-뉴클레오타이드 조합으로 구성되는 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 프라이밍된 주형 핵산 분자는 플로우 셀 내에 함유되며, 단계 (b)는 각각 복수의 중합효소-뉴클레오타이드 조합 중 하나를 포함하는 복수의 시약 용액을 한 번에 하나씩 플로우 셀을 통해 유동시킴으로써 프라이밍된 주형 핵산 분자를 순차적으로 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머의 3' 뉴클레오타이드로부터 가역적 터미네이터 모이어티를 제거하여 연장 가능한 프라이머를 포함하는 프라이밍된 주형 핵산 분자를 생성하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제21항에 있어서, (d) 삼성분 복합체를 해리시키는 스트리핑 완충액을 플로우 셀을 통해 유동시켜 프라이밍된 주형 핵산 분자로부터 중합효소 및 상이한 뉴클레오타이드 중 하나를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제41항에 있어서, (e) 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머의 3' 말단 뉴클레오타이드에 부착된 가역적 터미네이터 모이어티를 제거하여 연장 가능한 프라이머를 포함하는 프라이밍된 주형 핵산 분자를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제42항에 있어서, (f) 연장 가능한 프라이머 내로 뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제43항에 있어서, 연장 가능한 프라이머 내로 도입된 뉴클레오타이드는 가역적 터미네이터 모이어티를 포함하는 것인 방법.
- 제44항에 있어서, 주형 핵산 분자에 대한 서열 정보를 얻기 위해 단계 (a)∼(f)를 적어도 1회 반복하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- (a) 프라이머로 프라이밍된 주형 핵산 분자를 제공하는 단계;
(b) (i) 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서, 프라이밍된 주형 핵산 분자, 중합효소 및 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하는 삼성분 복합체를 안정화시키고,
(ii) 프라이밍된 주형 핵산 분자 및 중합효소를 포함하나 다음의 정확한 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 이성분 복합체를 불안정화시키는 조건하에,
단계 (a)로부터의 프라이밍된 주형 핵산 분자를 중합효소 및 적어도 하나의 시험 뉴클레오타이드를 포함하는 제1 반응 혼합물과 접촉시키는 단계;
(c) 프라이밍된 주형 핵산 분자의 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 화학적 도입 없이 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자와의 상호작용을 검출하여, 단계 (b)에서 삼성분 복합체가 형성되었는지 여부를 결정하는 단계; 및
(d) 단계 (c)의 검출된 상호작용을 이용하여 임의의 시험 뉴클레오타이드가 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드인지 여부를 결정하는 단계
를 포함하는, 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 방법. - 제46항에 있어서, 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건은, 중합을 억제하는 비촉매성 금속 이온을 제1 반응 혼합물에 포함시킴으로써 제공되는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건은 알로스테릭 중합효소 억제제, 경쟁력 없는(uncompetitive) 중합효소 억제제, 경쟁적 중합효소 억제제, 및 비경쟁적(non-competitive) 중합효소 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 중합효소 억제제를 제1 반응 혼합물에 포함시킴으로써 제공되는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건은 단계 (b)를 수행하기 전에 프라이머를 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드로 종결시킴으로써 제공되는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 단계 (b)에서 이성분 복합체를 불안정화시키는 조건은 50 mM 내지 1,500 mM의 농도의 1가 양이온을 제공하는 염을 포함하며, 상기 염은 제1 반응 혼합물에 포함되는 것인 방법.
- 제50항에 있어서, 단계 (b)에서 삼성분 복합체를 안정화시키고 이성분 복합체를 불안정화시키는 반응 조건은 이성분 복합체 형성보다 삼성분 복합체 형성을 적어도 2배 향상시키는 것인 방법.
- 제51항에 있어서, 단계 (b)에서 삼성분 복합체를 안정화시키고 이성분 복합체를 불안정화시키는 반응 조건은 이성분 복합체 형성보다 삼성분 복합체 형성을 적어도 5배 향상시키는 것인 방법.
- 제50항에 있어서, 1가 양이온을 제공하는 염은 글루타메이트 음이온을 추가로 제공하는 것인 방법.
- 제50항에 있어서, 1가 양이온을 제공하는 염의 농도는 50 mM 내지 500 mM인 방법.
- 제54항에 있어서, 1가 양이온을 제공하는 염의 농도는 100 mM 내지 300 mM인 방법.
- 제54항에 있어서, 제1 반응 혼합물은 10 mM 내지 1.6 M의 농도로 글루타메이트 염을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제56항에 있어서, 글루타메이트 염의 농도가 80 mM 내지 320 mM인 방법.
- 제54항에 있어서, 염이 글루타메이트 염인 방법.
- 제54항에 있어서, 염이 NaCl, KCl, NH2(SO4), 및 칼륨 글루타메이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제50항에 있어서, 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건은 중합을 억제하는 비촉매성 금속 이온에 의해 제공되는 것인 방법.
- 제50항에 있어서, 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건은 단계 (b)를 수행하기 전에 프라이머를 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드로 종결시킴으로써 제공되는 것인 방법.
- 제54항에 있어서, 단계 (b)에서 이성분 복합체를 불안정화시키는 조건은 200 mM의 1가 양이온을 제공하는 염을 포함하는 것인 방법.
- 제62항에 있어서, 염이 NaCl, KCl, NH2(SO4), 및 칼륨 글루타메이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제62항에 있어서, 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건은 중합을 억제하는 비촉매성 금속 이온에 의해 제공되는 것인 방법.
- 제64항에 있어서, 제1 반응 혼합물은 10 mM 내지 1.6 M의 농도로 칼륨 글루타메이트를 포함하는 것인 방법.
- 제62항에 있어서, 프라이머 내로의 임의의 뉴클레오타이드의 도입을 배제하면서 삼성분 복합체를 안정화시키는 조건은 단계 (b)를 수행하기 전에 프라이머를 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드로 종결시킴으로써 제공되는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 제1 반응 혼합물의 시험 뉴클레오타이드 각각은 상이한 표지되지 않은 뉴클레오타이드인 방법.
- 제67항에 있어서, 상이한 표지되지 않은 뉴클레오타이드 각각은 상이한 천연 뉴클레오타이드인 방법.
- 제67항에 있어서, 중합효소가 외인성의 검출 가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
- 제69항에 있어서, 외인성의 검출 가능한 표지가 형광 표지를 포함하는 것인 방법.
- 제67항에 있어서,
중합효소가 신호를 방출하는 검출 가능한 표지를 포함하고,
검출 가능한 표지에 의한 신호의 방출은, 중합효소가 임의의 뉴클레오타이드의 존재 또는 부재하에 프라이밍된 주형 핵산 분자와 복합체화될 때 실질적으로 균일한 것인 방법. - 제46항에 있어서, 단계 (a)의 프라이밍된 주형 핵산 분자는 고체 지지체 상의 위치(locus)에 고정화되고,
중합효소는 신호를 방출하는 검출 가능한 표지를 포함하며,
검출 가능한 표지에 의한 신호의 방출은 중합효소가 임의의 뉴클레오타이드의 존재 또는 부재하에 프라이밍된 주형 핵산 분자와 복합체화될 때 실질적으로 균일하고,
단계 (c)는 고체 지지체 상의 위치에서 신호의 강도를 측정하는 것을 포함하며,
단계 (b)에서 삼성분 복합체의 형성의 증가는 상기 위치에서의 신호의 강도 증가에 의해 나타나는 것인 방법. - 제72항에 있어서, 상기 고체 지지체가 플로우 셀 내에 함유되며, 검출 가능한 표지는 검출 가능한 형광 표지인 방법.
- 제72항에 있어서, (e) 제1 반응 혼합물을 중합효소, 하나 이상의 뉴클레오타이드, 및 촉매성 양이온을 포함하는 제2 반응 혼합물로 대체하여, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 프라이머 내로 도입되도록 하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제74항에 있어서, 제2 반응 혼합물의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 적어도 하나의 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
- 제75항에 있어서, 상기 고체 지지체가 플로우 셀 내에 함유되고, 단계 (e)는 플로우 셀을 통한 유체 유동에 의해 반응 혼합물을 대체하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제74항에 있어서, 제2 반응 혼합물이 100 mM 미만의 각각의 NaCl 및 KCl을 포함하는 것인 방법.
- 제74항에 있어서, 제2 반응 혼합물의 중합효소가 제1 반응 혼합물의 중합효소와 상이한 중합효소인 방법.
- 제75항에 있어서, 상기 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드가 형광 표지를 포함하지 않는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 단계 (a)의 프라이밍된 주형 핵산 분자는 플로우 셀 내에 함유된 고체 지지체 상의 위치에 고정화되고,
상기 방법은 (e) 플로우 셀을 통한 유체 유동에 의해, 제1 반응 혼합물을 중합효소, 하나 이상의 뉴클레오타이드, 및 촉매성 양이온을 포함하는 제2 반응 혼합물로 대체하여, 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 프라이머 내로 도입되도록 하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. - 제80항에 있어서, 제2 반응 혼합물의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 적어도 하나의 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
- 제80항에 있어서, 제2 반응 혼합물이 100 mM 미만의 각각의 NaCl 및 KCl을 포함하는 것인 방법.
- 제80항에 있어서, 단계 (c)와 단계 (e) 사이에 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 세척하여 제1 반응 혼합물의 성분 중 적어도 하나를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제80항에 있어서, 제2 반응 혼합물의 중합효소가 제1 반응 혼합물의 중합효소와 상이한 중합효소인 방법.
- 제81항에 있어서, 가역적 터미네이터 뉴클레오타이드가 형광 표지를 포함하지 않는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 단계 (a)의 프라이밍된 주형 핵산 분자는 고체 지지체 상의 위치에 고정화되고,
단계 (c)는 고체 지지체 상의 위치에서 중합효소와 프라이밍된 주형 핵산 분자의 상호작용을 나타내는 신호의 강도를 측정하는 것을 포함하며,
단계 (d)는, 신호의 측정된 강도가 소정의 역치를 초과할 경우, 제1 반응 혼합물의 시험 뉴클레오타이드 중 하나가 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드임을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법. - 제86항에 있어서, 단계 (c) 후 및 단계 (e) 전에 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 세척하여 제1 반응 혼합물의 성분 중 적어도 하나를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제46항에 있어서, 단계 (a)의 프라이밍된 주형 핵산 분자는 플로우 셀 내에 함유된 고체 지지체 상의 위치에 고정화되고, 상기 방법은
단계 (c) 후에 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 세척하여 제1 반응 혼합물의 상기 적어도 하나의 시험 뉴클레오타이드 중 하나 이상을 제거하는 단계; 및
세척 단계 후 중합효소와 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자와의 상호작용을 검출하여 단계 (b)에서 형성되었을 수 있는 임의의 삼성분 복합체가 남아있는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. - (a) 고정화된 핵산 피처의 집단을 중합효소, 제1 뉴클레오타이드, 및 적어도 하나의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 포함하는 제1 시약과 접촉시키는 단계로서,
제1 뉴클레오타이드는 제1 시약의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자 중 어느 것에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 아니고,
접촉은 삼성분 복합체를 안정화시키고 중합효소에 의한 포스포디에스테르 결합 형성의 촉매 작용을 억제하거나 배제하는 조건하에서 발생하며,
이로써, 제1 시약의 상기 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자의 부재하에 중합효소 및 제1 뉴클레오타이드를 포함하는 시약의 사용과 비교하여, 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 뉴클레오타이드 비의존적 중합효소 결합이 감소되는 것인 단계
를 포함하는, 각각 프라이밍된 주형 핵산 분자를 포함하는, 고정화된 핵산 피처의 집단에 중합효소 및 뉴클레오타이드를 전달하는 방법. - 제89항에 있어서, 단계 (a) 후 (b) 제1 시약을 제1 시약의 중합효소, 제2 뉴클레오타이드, 및 적어도 하나의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자를 포함하는 제2 시약으로 대체하는 추가의 단계가 있으며,
제1 뉴클레오타이드와 제2 뉴클레오타이드는 서로 상이하고,
제2 뉴클레오타이드는 제2 시약의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자 중 어느 것에 대한 동족 뉴클레오타이드가 아니며,
대체는 삼성분 복합체를 안정화시키고 중합효소에 의한 포스포디에스테르 결합 형성의 촉매 작용을 억제하거나 배제하는 조건하에서 발생하며,
이로써, 제2 시약의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자의 부재하에 중합효소 및 제2 뉴클레오타이드를 포함하는 시약의 사용과 비교하여, 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 뉴클레오타이드 비의존적 중합효소 결합이 감소되는 것인 방법. - 제90항에 있어서, 제1 및 제2 시약의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자는 서로 상이한 것인 방법.
- (a) 고정화된 프라이밍된 주형 핵산을 각각 포함하는 복수의 고정화된 핵산 피처;
(b) 중합효소;
(c) 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자; 및
(d) 뉴클레오타이드
를 포함하는 반응 혼합물로서,
뉴클레오타이드는 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자에 대한 동족 뉴클레오타이드가 아니고,
고정화된 프라이밍된 주형 핵산에 대한 중합효소의 뉴클레오타이드 비의존적 결합은 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자의 존재에 의해 감소되는 것인 반응 혼합물. - 제92항에 있어서, 중합효소, 고정화된 프라이밍된 주형 핵산, 및 뉴클레오타이드는, 고정화된 프라이밍된 주형 핵산 내로 뉴클레오타이드를 도입하는 것이 억제되거나 배제된 안정화된 삼성분 복합체를 형성하는 것인 방법.
- (a) 중합효소;
(b) 적어도 하나의 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자; 및
(c) 적어도 하나의 뉴클레오타이드
를 포함하는 중합효소 전달 시약으로서,
상기 뉴클레오타이드 중 어느 것도 상기 비고정화된 프라이밍된 주형 핵산 분자 중 어느 것에 대한 다음의 정확한 뉴클레오타이드가 아닌 것인 중합효소 전달 시약. - 제94항에 있어서, (d) 용액상 중합효소에 의한 포스포디에스테르 결합 형성을 억제하는 삼성분 복합체 안정화제를 추가로 포함하는 중합효소 전달 시약.
- 제94항에 있어서, 상기 적어도 하나의 뉴클레오타이드는 적어도 하나의 천연 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 중합효소 전달 시약.
- 제94항에 있어서, 용액상 프라이밍된 주형 핵산 분자는 각각 상이한 3' 말단 뉴클레오타이드를 갖는 3종 이하의 상이한 유형의 프라이밍된 주형 핵산 분자를 포함하는 것인 중합효소 전달 시약.
- 제97항에 있어서, 중합효소는 Mg2 + 이온의 존재하에 촉매성 포스포디에스테르 결합 형성 활성이 없는 돌연변이체 중합효소인 중합효소 전달 시약.
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