TW202124406A - 核苷酸之可逆修飾 - Google Patents

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Abstract

本文尤其揭示用於修飾核苷酸之方法，該等方法例如包含使具有3'-O-肟部分之核苷酸與具有結構R2-ONH2 之試劑反應以產生具有3'-O-NH2 部分之核苷酸，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。

Description

核苷酸之可逆修飾
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2019年9月10日申請之美國臨時申請案第62/898,152號之權益，該臨時申請案以全文引用之方式且出於所有目的併入本文中。
本揭示案大體上關於用於抑制核苷酸及核酸之3'羥基部分之經酶催化修飾之核苷酸及核酸的可逆阻斷，且特定地適用於採用環狀可逆終止之核酸定序方法。
基因體已類比為含有個別生物體之發育及運作說明書之操作手冊。已顯示，基因體指導生長及發育，指導重要器官之功能、影響情緒及行為等。每一個體之獨特性很大一部分源自其基因體之獨特組成。可將個體之間的差異視為構成其基因體之DNA中之核苷酸序列的差異。僅舉幾例，已在識別彼等序列差異如何預測疾病風險、對某些治療藥物具有不良反應之可能性及具有某些能力及人格特質之可能性方面取得巨大進步。
最近，由於DNA定序平台商業化，基因體資訊之診斷潛力已得到提高，該DNA定序平台能夠以具有30億個核苷酸序列之典型人類基因體規模進行定序。儘管在過去幾十年中定序通量及成本已大大改善，但仍存在診斷序列標籤尚未加以識別之許多疾病且定序成本對於許多臨床應用而言仍遙不可及。
已開發的許多定序技術，包含若干種廣泛用於商業用途之定序技術，採用了環狀可逆終止子（CRT）方法。CRT方法沿所關注之DNA模板延伸引子以使得各循環引起對模板中之單一位置進行偵測。重複循環以有效地沿著DNA中之模板步移，同時讀取單一核苷酸步中之序列。執行100個CRT循環產生100個核苷酸之序列讀段。所得序列讀段之單一核苷酸步長及因此單一核苷酸解析度係藉由用具有3'可逆終止子部分之核苷酸增量引子來達成。在添加經可逆地終止之核苷酸之後，引子無法進一步延伸直至其經適當去阻斷試劑處理以移除可逆終止子部分為止。已知由於將可逆終止子併入引子中之步驟及用於對引子進行去阻斷之步驟的低效率，使得包含現今商業在用之CRT方法之大部分CRT方法之準確度及讀取長度受損。此外，許多CRT方法使用可能會正好損傷待定序之DNA之去阻斷試劑。因為定序為累積過程，因此引子延伸、引子去阻斷及DNA損傷抵抗即便稍微低效，亦可能歷經定序方法之許多循環而累加成明顯不利之影響。
因此，存在對用於可逆地終止核苷酸及核酸之經改良試劑及方法之需求。本發明滿足此需求且亦提供相關優點。
本揭示案提供包含含有具有諸如3'-O-肟部分之保護基之核苷酸及用以移除保護基且將阻斷基遞送至保護基位置之試劑，諸如具有結構R2-ONH2 之試劑之溶液的組合物。多個R2部分與本揭示案一致。在一些情況下，R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。可替代地或組合地，R2包括分子量為至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36或大於36 g/mol之部分。類似地，如本文所考慮之R2部分之分子量不超過1000、不超過500、不超過400、不超過300、不超過250、不超過200、不超過150或不超過100 g/mol。可替代地或組合地，各個R2實施例包括以下中之一或多者：單獨或與彼此組合之至少兩個碳核、氟核、一個磷核、一個氮核、一個矽核、一個氧核、一個羥基部分、雜環、一個苯基環或另一部分。
在特定組態中，用於本文中之方法或組合物之代表性核苷酸起始物質具有結構：
Figure 02_image001
。 B可為核鹼基。R1可獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，或可在2' R1位處攜有替代修飾，以使得核苷酸不同地為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸。Q可獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、核酸、氫或諸如表面或鍵結至表面之連接子之另一部分。R3及R4可獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。舉例而言，核苷酸之3'位處之保護基部分可為醛肟（以使得R3或R4中之一者為氫）或酮肟（其中R3及R4均不為氫）。本文考慮其他保護基部分且其與本揭示案一致。
本揭示案亦提供用於修飾核苷酸之方法。該等方法可藉由以下來進行：使具有諸如3'-O-肟部分之保護基之核苷酸與用以移除保護基且將阻斷基遞送至保護基位置之試劑，諸如具有結構R2-ONH2 之試劑反應以產生具有3'-O-NH2 部分之核苷酸，其中R2獨立地為R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2 (R6)、經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）、經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）或經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在一些情況下，R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。R2部分可包括單獨或組合之多個成分以傳達本文所揭示之效益。一些R2部分不同地包括至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個或超過6個碳核。類似地，一些R2包括以下中之至少一者：至少1個氮核、至少一個矽核、至少一個磷核、至少一個氟核或至少另一成分。在一些情況下，R2部分經部分或完全氟化或經部分或完全氫化。在一些情況下，R2部分包括至少一個組分以促進溶解度。本文亦考慮具有用以遞送諸如ONHCH3、O-CH2N3之替代阻斷基或可逆終止子部分或諸如與核酸延伸之可逆終止一致之部分之另一部分的結構的試劑。在一些組態中，具有3'-O-肟部分之核苷酸可具有結構：
Figure 02_image003
且具有3'-O-NH2 部分之核苷酸可具有結構：
Figure 02_image005
。
B可為核鹼基。R1可獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH。Q可獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、核酸或諸如表面或鍵結至表面之連接子之另一部分。R3及R4可獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。舉例而言，核苷酸之3'位處之部分可為醛肟（以使得R3或R4中之一者為氫）或酮肟（R3或R4均不為氫）。在特定組態中，用於本文中之方法或組合物之核苷酸起始物質具有結構：
Figure 02_image007
。 B可為核鹼基。R1可獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH。Q可獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、核酸或諸如表面或鍵結至表面之連接子之另一部分。R3及R4可獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。舉例而言，核苷酸之3'位處之保護基部分可為醛肟（以使得R3或R4中之一者為氫）或酮肟（其中R3及R4均不為氫）。本文考慮其他保護基部分且其與本揭示案一致。本揭示案亦提供用於修飾核苷酸之方法。該等方法可藉由以下來進行：使具有諸如3'-O-肟部分之保護基之核苷酸與用以遞送阻斷基之試劑，諸如具有結構R2-ONH2 之試劑反應以產生具有3'-O-NH2 部分之核苷酸，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。本文亦考慮具有用以遞送諸如ONHCH3 、O-CH2 N3 之替代阻斷基或與核酸延伸之可逆終止一致之另一部分的結構的試劑。
本揭示案進一步提供包含含有具有3'-O-肟部分之核苷酸之第一容器及含有具有結構R2-ONH2 之試劑之第二容器的套組，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。在一些組態中，核苷酸可具有結構：
Figure 02_image009
。
B可為核鹼基。R1可獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH。Q可獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、核酸或諸如表面或鍵結至表面之連接子之另一部分。R3及R4可獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。舉例而言，核苷酸之3'位處之部分可為醛肟（以使得R3或R4中之一者為氫）或酮肟（R3或R4均不為氫）。
本揭示案提供適用於合成在3'位處具有部分，諸如保護3'位免於諸如化學修飾及酶修飾（諸如如藉由經模板導入DNA聚合酶實現之核苷酸添加）之修飾之部分的核苷酸的組合物及方法。以此方式受保護之核苷酸可稱作受到阻斷或終止。舉例而言，當將具有受保護3'位之核苷酸併入延伸核酸股中作為核酸引子之3'核苷酸部分時，經延伸引子受到有效阻斷以免於經聚合酶或接合酶進一步延伸。換言之，引子延伸已受到終止。
在特定組態或實施例中，經阻斷或終止核苷酸可具有諸如3'-ONH2 部分之可逆終止子部分，與在去氧核糖核苷酸及核糖核苷酸之3'位處發現之天然羥基不同，該3'-ONH2 部分對藉由某些酶及化學試劑進行之修飾具有抗性。在某些條件下，例如當經阻斷核苷酸經諸如亞硝酸之酸處理時，3'-ONH2 部分可經化學上轉化成羥基。用-OH部分置換整體-O-NH2 部分或用-H置換-NH2 部分均有效地引起去阻斷，且3' O在去阻斷中之命運無關緊要，只要最終產物具有可供用於經聚合酶介導之核酸延伸之3' OH即可。因此，3'-ONH2 部分在與本揭示案之去阻斷試劑偶合時充當可逆終止子。易於移除以回收與酶股延伸相容之3'羥基部分之其他可逆終止子與本文揭示內容一致，以使得並非全部本文實施例皆限於具有3'-O-NH2 部分之核苷酸製備。例示性替代物包含包含3'-O-NHCH3 、-O-CH2 N3 及當附接在核酸股3'端之3'位處時阻斷股延伸之本領域中已知之其他替代物，同時不阻止藉由DNA或其他核酸聚合酶進行之結合以使得可將攜有該等可逆終止子之核苷酸在其5'端處添加至未經阻斷核苷酸或核苷酸聚合物之3'羥基中以產生3'終止核酸股。
核苷酸之可逆終止適用於各種應用。舉例而言，各種核酸定序平台利用環狀可逆終止子（CRT）方法，在該方法中讀取模板核酸序列，同時遞增地沿模板延伸引子核酸。遞增延伸可在CRT方法中藉由建構各循環以包含經由添加經可逆地終止之核苷酸（或在其3'端處經可逆地終止之寡核苷酸）延伸引子、接著對經延伸引子進行去阻斷之步驟來達成。在各循環中，亦進行偵測步驟以便識別存在於已相對於經延伸引子對準之特定位置處之核苷酸的類型。
本文所闡述之經可逆地終止之核苷酸及其合成方法提供以下優勢：極有效地置換諸如3'-O-肟之3'保護基或所添加之其他基團以促進核酸其他區域之化學操縱，諸如向核苷酸5'位添加三磷酸酯部分。在不受理論束縛之情況下，經預測因為CRT為總體上累積方法，故阻斷及去阻斷步驟中之任何差錯或低效率皆產生累積副作用。舉例而言，定相為在CRT方法過程期間例如由於阻斷基移除中之缺陷，導致未能在CRT方法之一或多個循環期間併有額外部分，故群體內之個別核酸分子彼此損失同步的現象。定相可顯現為『落後於』群體中之其他引子分子之一或多個引子分子之延伸，或替代地顯現為導致一或多個引子分子『超前於』群體中之其他引子分子之缺陷。舉例而言，每個循環僅0.5%之定相速率可能在120個循環之後造成約一半之用於定序或其他CRT反應之真實信號之累加損失。問題因由產生於異相群體成員之虛假信號所致之背景雜訊成比例增加而加劇。信號雜訊比中之累加損失造成讀取長度受限（繼而造成定序通量減少）及尤其雜訊淹沒信號時後續循環之差錯增加。本文所闡述之經可逆地終止之核苷酸可用於抑制延伸階段中之破壞，藉此改善諸如核酸定序方法中之準確度及讀取長度反應。經由實踐本文所揭示之方法及使用本文所揭示之組合物生成具有極高置換度之核苷酸組合物，該置換係在如圖1A中所描繪且如一般適用於本文所揭示之R2部分之低dC降解速率情況下用諸如-O-NH2之可逆基團置換諸如-O-肟之保護基。因此，在一些情況下，使用本文中之組合物或經由本文所揭示之方法生成之試劑適用於添加至核酸定序試劑中，諸如不經進一步淨化或純化即直接添加至核酸定序試劑中，以產生如下實例2中所描繪在相當大運作時長內具有高準確度之定序反應運作。此類試劑可進一步包括聚合酶界面活性劑、緩衝劑或適用於直接添加至定序裝置中之其他試劑。在不受理論束縛之情況下，諸如呈現於實例2中之運作之運作效能至少部分歸因於定相缺陷減少，該等定相缺陷減少可以其他方式由以下引起：用諸如-O-NH2之可逆終止子低效地置換諸如-O-肟基團之保護基，產生類似呈現於圖3中之基團、部分或鹼基之留存保護基、未經阻斷3' OH部分或經降解dC鹼基。
在不受理論束縛之情況下，用於阻斷核苷酸之3'位之本文所闡述之合成方法及組合物之一個可能性優點在於，該等方法對與核苷酸其他部分之不合需要之副反應相對具有惰性。因此，藉由本文所闡述之方法或涉及本文所闡述之組合物製成之經可逆地終止之核苷酸可不以在CRT方法或利用經可逆地終止之核苷酸之其他生物化學方法期間發生之阻斷及去阻斷步驟期間繼續產生副作用的方式受到實質破壞或修飾。在各種情況下，經由實踐本揭示案來對不超過6%、不超過5%、不超過4%、不超過3%、不超過2%、不超過1%或少於1%用於本文中之反應中或呈現於本文中之組合物中的諸如胞嘧啶核苷酸之核苷酸進行修飾或降解。因此，本文所闡述之方法及組合物藉由提供相對不含可能干擾定序反應之準確度、階段或讀取長度之諸如經降解或經修飾胞嘧啶之經降解或經修飾鹼基之定序起始物質來提供經改善的定序準確度。類似地，本文所闡述之方法及組合物藉由生成在一些情況下可不經進一步純化或分離即直接添加至定序試劑中之具有一定純度之經可逆地終止之核苷酸來促進核酸定序試劑產生。
因此，如本文所揭示或經由本文所揭示之方法產生之組合物藉由作為或藉由生成相對不含諸如經降解或修飾胞嘧啶鹼基之經降解或修飾鹼基、同時相對不含諸如-O-肟之留存3'保護基且具有相對低濃度之未經阻斷3' OH基團的經可逆地終止之核苷酸來促進準確定序。單獨或組合之此等特點促進定序反應之定序準確度、定相或讀取長度。另外，更高效率之方法及更高純度之由此等方法產生之組合物促進更具成本效益之定序，此係因為組合物在其用於定序反應中之前需要較少純化，且在一些情況下不經進一步分離或純化即直接添加至定序試劑或套組中。 定義
除非另外規定，否則本文所使用之術語應理解為取其在相關領域中之普通含義。本文所使用之若干術語及其含義闡述於下文中。
在取代基係由其自左至右書寫之習知化學式規定之情況下，其同樣涵蓋由自右向左書寫結構產生之化學上一致之取代基，例如-CH2 O-等效於-OCH2 -。在取代基或部分書寫有所描繪之內部鍵之情況下，應理解該取代基或部分亦可描繪為不具有經明確地繪製之內部鍵，且兩個表示均應理解為相同取代基或部分，例如-ONH2 及-O-NH2 為相同基團。
如本文所使用之「烯基」係指在直鏈或分支鏈烴鏈中含有一或多個雙鍵之烷基。烯基部分可未經取代或經取代。視情況，烯基部分可具有介於本文針對烷基部分所例示之範圍內之數目之碳原子。
如本文所使用之「烷氧基」係指式-OR，其中R為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基或環炔基。烷氧基之非限制性清單為甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(異丙氧基)、正丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基或第三丁氧基。烷氧基部分可經取代或未經取代。
如本文所使用之「烷氧基胺」係指式R'-ONR2 ，其中R'為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基或環炔基。烷氧基之非限制性清單為甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(異丙氧基)、正丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基或第三丁氧基，其中R'不為氫，且其中鍵結至氮之一個或兩個R基團獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基或環炔基。烷氧基之非限制性清單為甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(異丙氧基)、正丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基或第三丁氧基。烷氧基胺部分可經取代或未經取代。
如本文所使用之「烷基」係指包括完全飽和（無雙鍵或參鍵）烴部分之直鏈或分支鏈烴鏈。烷基為未經環化之鏈。在一些實施例中，烷基部分可具有1至20個碳原子（不論何時出現在本文中時，諸如「1至20個」之數值範圍係指介於給定範圍內之各整數（包含端點）；例如「1至20個碳原子」意味著烷基部分可由1個碳原子、2個碳原子、3個碳原子等、至多且包含20個碳原子組成，但本發明定義亦涵蓋在數值範圍未經指定之情況下術語「烷基」之存在）。烷基部分亦可為具有約7至約10個碳原子之中等尺寸烷基。烷基部分亦可為具有1至6個碳原子之低碳數烷基。化合物之烷基部分可命名為「C1 -C4 烷基」或類似名稱。僅舉例而言，「C1 -C4 烷基」指示烷基鏈中存在一至四個碳原子，亦即，烷基鏈係選自甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基及第三丁基。典型烷基部分包含但絕不限於甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第三丁基、戊基及己基。烷基部分可經取代或未經取代。具有至少兩個碳原子之烷基部分可為特別適用的，例如當甲基部分不如較長鏈烷基部分有效時如此。
如本文所使用之「炔基」係指在直鏈或分支鏈烴鏈中含有一或多個參鍵之烷基。炔基部分可未經取代或經取代。視情況，炔基部分可具有介於本文針對烷基部分所例示之範圍內之數目之碳原子。
除非另外說明，否則單獨或作為另一取代基之一部分之術語「伸烷基」意謂衍生自烷基之二價基，如例示為但不限於-CH2 CH2 CH2 CH2 -。通常，烷基（或伸烷基）具有1至24個碳原子，其中具有10個或更少個碳原子之彼等基團在本文中為較佳的。「低碳數烷基」或「低碳數伸烷基」為一般具有八個或更少個碳原子之較短鏈烷基或伸烷基。除非另外說明，否則單獨或作為另一取代基之一部分之術語「伸烯基」意謂衍生自烯烴之二價基。除非另外說明，否則單獨或作為另一取代基之一部分之術語「伸炔基」意謂衍生自炔烴之二價基。
除非另外說明，否則單獨或與另一術語組合之術語「雜烷基」意謂包含至少一個碳原子及至少一個雜原子（例如O、N、P、Si及S）之穩定直鏈或分支鏈或其組合，且其中氮原子及硫原子可視情況經氧化，且氮雜原子可視情況經四級銨化。一或多個雜原子（例如O、N、S、Si或P）可置於雜烷基之任何內部位置處或烷基與分子剩餘部分附接之位置處。雜烷基為未經環化之鏈。實例包含但不限於：-CH2 -CH2 -O-CH3 、-CH2 -CH2 -NH-CH3 、-CH2 -CH2 -N(CH3 )-CH3 、-CH2 -S-CH2 -CH3 、-CH2 -S-CH2 、-S(O)-CH3 、-CH2 -CH2 -S(O)2 -CH3 、-CH=CH-O-CH3 、-Si(CH3 )3 、-CH2 -CH=N-OCH3 、-CH=CH-N(CH3 )-CH3 、-O-CH3 、-O-CH2 -CH3 及-CN。至多兩個或三個雜原子可為連續的，諸如-CH2 -NH-OCH3 及-CH2 -O-Si(CH3 )3 。雜烷基部分可包含一個雜原子（例如O、N、S、Si或P）。雜烷基部分可包含兩個視情況不同之雜原子（例如O、N、S、Si或P）。雜烷基部分可包含三個視情況不同之雜原子（例如O、N、S、Si或P）。雜烷基部分可包含四個視情況不同之雜原子（例如O、N、S、Si或P）。雜烷基部分可包含五個視情況不同之雜原子（例如O、N、S、Si或P）。雜烷基部分可包含至多8個視情況不同之雜原子（例如O、N、S、Si或P）。除非另外說明，否則單獨或與另一術語組合之術語「雜烯基」意謂包含至少一個雙鍵之雜烷基。雜烯基可視情況包含超過一個雙鍵及/或除一或多個雙鍵之外之一或多個參鍵。除非另外說明，否則單獨或與另一術語組合之術語「雜炔基」意謂包含至少一個參鍵之雜烷基。雜炔基可視情況包含超過一個參鍵及/或除一或多個參鍵之外之一或多個雙鍵。在實施例中，雜烷基之碳-碳鍵可為完全飽和的（無雙碳-碳鍵或參碳-碳鍵）。
類似地，除非另外說明，否則單獨或作為另一取代基之一部分之術語「伸雜烷基」意謂衍生自雜烷基之二價基，如例示為但不限於-CH2 -CH2 -S-CH2 -CH2 -及-CH2 -S-CH2 -CH2 -NH-CH2 -。對於伸雜烷基而言，雜原子亦可佔據任一或兩個鏈末端（例如伸烷基氧基、伸烷基二氧基、伸烷基胺基、伸烷基二胺基及其類似基團）。再此外，對於伸烷基及伸雜烷基連接基團而言，連接基團化學式書寫方向不暗示連接基團定向。舉例而言，式-C(O)2 R'-表示-C(O)2 R'-及-R'C(O)2 -。如上文所描述，如本文所使用之雜烷基包含經由雜原子附接至分子剩餘部分之彼等基團，諸如-C(O)R'、-C(O)NR'、-NR'R''、-OR'、-SR'及/或-SO2 R'。在敍述「雜烷基」，接著敍述諸如-NR'R''或其類似基團之特定雜烷基之情況下，應理解術語雜烷基及-NR'R''不為冗餘的或相互排斥的。相反地，敍述特定雜烷基以增加明確性。因此，術語「雜烷基」不應在本文中解釋為排除諸如-NR'R''或其類似基團之特定雜烷基。除非另外說明，否則單獨或作為另一取代基之一部分之術語「伸雜烯基」意謂衍生自雜烯烴之二價基。除非另外說明，否則單獨或作為另一取代基之一部分之術語「伸雜炔基」意謂衍生自雜炔烴之二價基。
如本文所使用之「胺」係指-NR2 部分，其中一或多個R基團可獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基或(雜脂環基)烷基。在實施例中，各R基團獨立地經取代或未經取代。
如本文所使用之「胺氧基」係指-O-NR2 部分，其中一或多個R基團可獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基或(雜脂環基)烷基。在實施例中，各R基團獨立地經取代或未經取代。
如本文所使用之「陣列」係指附接至一或多個固體載體之分子群，以使得一個位點處之分子可區別於其他位點處之分子。陣列可包含各自位於固體載體上之不同可定址位點處之不同分子。可替代地，陣列可包含各自充當承載不同分子之位點之單獨固體載體，其中可根據固體載體在與固體載體附接之表面上之位置或根據固體載體在諸如流體流之液體中之位置來識別不同分子。舉例而言，陣列之分子可為核苷酸、核酸、核酸引子、核酸模板、經引發模板核酸或諸如聚合酶、接合酶、核酸外切酶之核酸酶或其組合。
如本文所使用之「芳基」係指遍及環中之至少一個具有完全非定域π電子系統之碳環（全碳）單環或多環芳環系統（包含例如稠合、橋接或螺環系統，其中兩個碳環，例如一或多個芳基環與一或多個芳基或非芳基環共用一個化學鍵）。芳基部分中之碳原子數目可變化。舉例而言，在一些實施例中，芳基部分可為C6 -C14 芳基部分、C6 -C10 芳基部分或C6 部分。芳基部分之實例包含但不限於苯、萘及薁。芳基部分可經取代或未經取代。在各個實施例中，芳基部分獨立地為苯基或萘基。在實施例中，稠環芳基係指稠合在一起之多個環，其中稠環中之至少一個為芳基環且其中多個環經由含於多個環之芳基環內之任何碳原子附接至母分子部分。單獨或作為另一取代基之一部分之「伸芳基」意謂衍生自芳基之二價基。
如本文所使用之「芳烷基」及「芳(烷基)」係指作為取代基經由低碳數伸烷基部分連接之芳基。芳烷基之低碳數伸烷基及芳基部分可經取代或未經取代。實例包含但不限於苄基、2-苯基烷基、3-苯基烷基及萘基烷基。
如本文所使用之「附接」係指兩個事物彼此接合、緊固、黏著、連接或結合之狀態。舉例而言，核酸可藉由共價或非共價鍵附接至固相載體。類似地，兩個核酸可藉由共價（例如磷酸二酯）鍵或藉由非共價鍵（例如兩個核酸之鹼基之間之氫鍵結）彼此附接。共價鍵之特徵在於原子之間之電子對共用。非共價鍵為不涉及電子對共用之化學鍵，且可包含例如氫鍵、離子鍵、凡得瓦爾力（van der Waals force）、親水相互作用及疏水相互作用。
如本文所使用之「阻斷部分」在關於核苷酸使用時意謂抑制或防止核苷酸之3'氧與另一核苷酸或與寡核苷酸形成共價鍵之核苷酸的一部分。舉例而言，阻斷部分可抑制或防止在核酸聚合反應期間核苷酸之3'位與下一恰當核苷酸之間之共價鍵的聚合酶催化形成。類似地，阻斷部分可抑制或防止在核酸接合反應期間核苷酸之3'位與寡核苷酸之間之共價鍵的接合酶催化形成。值得注意地，如本文所考慮之阻斷部分不干擾經阻斷鹼基併入延伸引子股中（例如藉由聚合酶催化）；相反地，一旦併入，則經阻斷核苷酸干擾後續伸長，此係因為核苷酸之3'端不可接近後一核苷酸之5'磷酸酯。「經可逆地終止之」核苷酸之阻斷部分可在對延伸引子股或其互補序列無實質性損害之情況下自核苷酸類似物中移除或以其他方式經修飾以使核苷酸之3'-氧可用於共價連接至另一核苷酸或寡核苷酸。此類阻斷部分可在本文中稱作「可逆終止子部分」，此係因為引子延伸之阻斷係經由移除阻斷部分或終止子部分來進行逆轉。具有諸如可逆終止子部分之阻斷部分之核苷酸可處於諸如引子之核酸之3'端處，或可為不共價附接至核酸之單體分子。例示性阻斷部分包含3' ONH2 以及3' ONHCH3 及3' O疊氮甲烷（3'-OCH2 N3 ）。在各個實施例中，保護部分亦可為阻斷部分（例如3'-O-肟部分可為阻斷部分）。如本文所使用之R2-嵌段為鍵結至諸如可逆終止子部分之阻斷部分之R2。在一些情況下，於溶液中之R2-部分用於穩定化阻斷部分以便防止不合需要地將其自核苷酸中移除以形成與經聚合酶介導之延伸相容之3' OH基團。
如本文所使用之「保護部分」為在諸如非酶方法或非特定化學方法之化學方法期間保護其所附接之分子免於交叉反應或誤定向反應的部分。與諸如可逆終止部分之阻斷部分不同，保護部分不一定易於在與受保護分子無交叉反應或降解風險之情況下移除。例示性部分包含在例如5'磷酸化反應期間保護核糖3'位免於交叉反應之諸如3'-O-烷肟或3' O-酮肟之3'-O-肟部分。在各個實施例中，保護部分為3'-O-肟（例如3'-O-烷肟或3'-O-酮肟）。在實施例中，保護部分防止在核苷酸或核苷之磷酸化反應期間，諸如可在向核苷酸5'位添加三磷酸酯部分期間發生之核苷酸或核苷之3'碳或3'氧之反應性。
術語「包括」在本文中意欲為開放式的，包含所敍述之元素，但亦開放包含額外之未經敍述元素之可能性。
如本文所使用之「環烷基」係指完全飽和（無雙鍵或參鍵）之單環或多環烴環系統。當由兩個或更多個環構成時，環可以稠合方式接合在一起。環烷基部分可在一或多個環中含有3至10個原子。在一些分子中，環烷基部分可在一或多個環中含有3至8個原子。環烷基部分可未經取代或經取代。典型環烷基部分包含但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基及環辛基。
如本文所使用之「環烯基」係指在至少一個環中含有一或多個雙鍵之單環或多環烴環系統；但若存在超過一個雙鍵，則雙鍵不遍及全部環形成完全非定域π-電子系統（否則部分為如本文所定義之「芳基」）。當由兩個或更多個環構成時，環可以稠合方式連接在一起。環烯基部分可未經取代或經取代。單獨或作為另一取代基之一部分之「伸環烷基」意謂衍生自環烷基之二價基。
如本文所使用之「環炔基」係指在至少一個環中含有一或多個參鍵之單環或多環烴環系統。若存在超過一個參鍵，則參鍵不遍及全部環形成完全非定域π-電子系統。當由兩個或更多個環構成時，環可以稠合方式接合在一起。環炔基部分可未經取代或經取代。
如本文所使用之「去阻斷」意謂諸如經由暴露3' OH生成來移除或修飾核苷酸之諸如可逆終止子部分之阻斷部分以使核苷酸可延伸。此類經去阻斷核苷酸或核酸股能夠與第二核苷酸一起形成磷酸二酯鍵，使得核苷酸能夠形成涉及核苷酸之3'碳及第二核苷酸之5'碳的磷酸二酯鍵。舉例而言，經可逆地終止之核苷酸可存在於引子之3'端處以使得去阻斷使引子可延伸。可替代地，核苷酸可在經去阻斷時呈單體形式。
如本文所使用之術語「各」在關於物品集合使用時意欲識別集合中之個別物品，但不一定指集合中之每一物品。若明確揭示內容或上下文另外清楚地指示，則可能存在例外狀況。
除非另外指定，否則如本文所使用之片語「至少一個選自A、B及C之清單之元素」意欲讀取包含來自該清單之一個元素、來自該清單之兩個元素或該清單之全部元素的組，且可但不一定意欲需要表示各元素A、B及C。
如本文所使用之「外源」在關於分子部分使用時意謂不存在於分子天然類似物中之化學部分。舉例而言，核苷酸之外源標記為不存在於天然存在之核苷酸上之標記。類似地，存在於核酸上之外源連接子未在處於核酸天然環境下之核酸上發現到。
如本文所使用之「延伸」在關於核酸使用時意謂向核酸之3'端添加至少一個核苷酸之過程。術語「聚合酶延伸」在關於核酸使用時係指向核酸之3'端添加一或多個個別核苷酸之聚合酶催化過程。術語「接合酶延伸」在關於核酸使用時係指向核酸之3'端添加至少一個寡核苷酸之接合酶催化過程。據稱藉由延伸添加至核酸中之核苷酸或寡核苷酸係併入核酸中。因此，術語「合併」可用於指藉由形成磷酸二酯鍵將核苷酸或寡核苷酸接合至核酸之3'端之過程。
如本文所使用之「可延伸」在關於核苷酸使用時意味著核苷酸在3'位處具有氧或羥基部分，且在併入核酸中之情況下及當併入核酸中時能夠與下一恰當核苷酸（或寡核苷酸）形成共價鍵。可延伸核苷酸可處於引子之3'位處或其可為單體核苷酸。可延伸核苷酸缺乏諸如可逆終止子部分之阻斷部分，且經去阻斷核苷酸或核酸股常常為可延伸的。
如本文所使用之「流槽」為包含一或多個將流體導引至偵測區之通道之容器。偵測區可耦合至偵測器以使得可觀測到發生在容器中之反應。舉例而言，流槽可含有繫栓至固相載體之經引發模板核酸分子，向該固相載體反覆地施用核苷酸及輔助試劑且將其洗掉。流槽可包含在發生期望反應之後准許樣品成像之透明材料。舉例而言，流槽可包含含有小流體通道之玻璃或塑膠載片，聚合酶、dNTP及緩衝劑可流動通過該等小流體通道。通道內部之玻璃或塑膠可經待偵測之一或多個經引發模板核酸分子裝飾。外部成像系統可經定位以在偵測區處偵測分子。例示性流槽、其製造方法及其使用方法描述於以下中：2010年5月6日公開之美國專利申請公開案第2010/0111768 A1號或2012年10月25日公開之美國專利申請公開案第2012/0270305 A1號；或2005年7月25日公開之美國專利申請公開案第WO 05/065814號，該等案中之各者特此以全文引用之方式併入本文中。
如本文所使用之「流體」係指能夠流動及改變其形狀以填充容器之液體或氣體。在許多條件下，流體在受到傾向於改變其形狀之力作用時以穩定速率改變形狀。例示性流體為作為含氣泡液體之流體發泡體。可例如用於流體發泡體中之例示性液體包含含有諸如結合反應、核酸定序反應或分析檢定中所用反應之反應試劑或產物的液體。水性液體可為特別適用的。例示性氣體包含諸如氮氣（N2 ）之惰性氣體或鈍氣。適用鈍氣包含例如氦氣（He）、氖氣（Ne）、氬氣（Ar）、氪氣（Kr）及氙氣（Xe）。另一適用氣體為地球大氣。流體發泡體及用於製造且使用流體發泡體之方法之另外實例闡述於美國專利申請案序列號62/883,276中，該案以引用之方式併入本文中。
如本文所使用之「鹵素原子」、「鹵素」或「鹵基」意謂諸如氟、氯、溴及碘之元素週期表第7欄之輻射穩定原子中之任一者。另外，諸如「鹵烷基」之術語意在包含單鹵烷基及聚鹵烷基。舉例而言，術語「鹵基(C1 -C4 )烷基」包含但不限於氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基及其類似基團。
如本文所使用之「雜環基」係指包含至少一個雜原子（例如O、N、S）之環系統。該等系統可為不飽和的，可包含某種不飽和，或可含有某一芳族部分，或為全部芳族的。雜環基部分可未經取代或經取代。
如本文所使用之「雜脂環」或「雜脂環基」係指三、四、五、六、七、八、九、十員或更多員至18員單環、雙環及三環環系統，其中碳原子與1至5個雜原子一起構成環系統。雜環可視情況含有一或多個不飽和鍵，然而該一或多個不飽和鍵以使得完全非定域π-電子系統不遍及全部環存在的方式定位。雜原子獨立地選自氧、硫及氮。雜環可進一步含有一或多個羰基或硫羰基官能基，且因此定義包含諸如內醯胺、內酯、環狀醯亞胺、環狀硫醯亞胺及環狀胺基甲酸酯之側氧基-系統及硫基-系統。當由兩個或更多個環構成時，環可以稠合方式接合在一起。另外，雜脂環部分中之任何氮可經四級銨化。雜脂環基或雜脂環部分可未經取代或經取代。該等「雜脂環」或「雜脂環基」部分之實例包含但不限於1,3-二氧雜環己烯、1,3-二
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烷、1,4-二
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烷、1,2-二氧雜環戊烷、1,3-二氧雜環戊烷、1,4-二氧雜環戊烷、1,3-氧硫
Figure 02_image013
、1,4-
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噻
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、1,3-氧硫雜環戊烷、1,3-二硫雜環戊烯、1,3-二硫雜環戊烷、1,4-氧硫
Figure 02_image013
、四氫-1,4-噻
Figure 02_image015
、2H-1,2-
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Figure 02_image015
、順丁烯二醯亞胺、丁二醯亞胺、巴比妥酸、硫基巴比妥酸、二側氧基哌
Figure 02_image015
、乙內醯脲、二氫尿嘧啶、三
Figure 02_image011
烷、六氫-1,3,5-三
Figure 02_image015
、咪唑啉、咪唑啶、異
Figure 02_image011
唑啉、異
Figure 02_image011
唑啶、
Figure 02_image011
唑啉、
Figure 02_image011
唑啶、
Figure 02_image011
唑啶酮、噻唑啉、噻唑啶、嗎啉、環氧乙烷、哌啶N-氧化物、哌啶、哌
Figure 02_image015
、吡咯啶、吡咯啶酮、吡咯啶二酮、4-哌啶酮、吡唑啉、吡唑啶、2-側氧基吡咯啶、四氫哌喃、4H-哌喃、四氫硫哌喃、噻嗎啉、噻嗎啉亞碸、噻嗎啉碸及其苯并稠合類似物（例如苯并咪唑啶酮、四氫喹啉、3,4-亞甲基二氧基苯基）。在實施例中，稠環雜脂環基係指稠合在一起之多個環，其中稠環中之至少一個為雜脂環基環且其中多個環經由含於多個環之雜脂環基環內之任何原子附接至母分子部分。單獨或作為另一取代基之一部分之「伸雜脂環基」意謂衍生自雜脂環基之二價基。
如本文所使用之「雜芳基」係指含有一或多個雜原子，亦即除碳以外之元素，包含但不限於氮、氧及硫及至少一個芳環之單環或多環芳環系統（具有具備完全非定域π-電子系統之至少一個環的環系統）。雜芳基部分之一或多個環中之原子數目可變化。舉例而言，在一些實施例中，雜芳基部分可在一或多個環中含有4至14個原子、在一或多個環中含有5至10個原子或在一或多個環中含有5至6個原子。此外，術語「雜芳基」包含稠環系統，其中諸如至少一個芳基環及至少一個雜芳基環或至少兩個雜芳基環之兩個環共用至少一個化學鍵。雜芳基環之實例包含但不限於呋喃、呋
Figure 02_image017
、噻吩、苯并噻吩、呔
Figure 02_image015
、吡咯、
Figure 02_image011
唑、苯并
Figure 02_image011
唑、1,2,3-
Figure 02_image011
二唑、1,2,4-
Figure 02_image011
二唑、噻唑、1,2,3-噻二唑、1,2,4-噻二唑、苯并噻唑、咪唑、苯并咪唑、吲哚、吲唑、吡唑、苯并吡唑、異
Figure 02_image011
唑、苯并異
Figure 02_image011
唑、異噻唑、三唑、苯并三唑、噻二唑、四唑、吡啶、噠
Figure 02_image015
、嘧啶、吡
Figure 02_image015
、嘌呤、喋啶、喹啉、異喹啉、喹唑啉、喹
Figure 02_image011
啉、
Figure 02_image020
啉及三
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。雜芳基部分可經取代或未經取代。在實施例中，術語「雜芳基」包含稠環雜芳基，其中多個環稠合在一起且其中稠環中之至少一個為雜芳環且其中多個環經由含於多個環之雜芳環內之任何原子附接至母分子部分。單獨或作為另一取代基之一部分之「伸雜芳基」意謂衍生自雜芳基之二價基。
如本文所使用之「(雜脂環基)烷基」為作為取代基經由低碳數伸烷基部分連接之雜環或雜脂環部分。(雜脂環基)烷基之低碳數伸烷基及雜環或雜環基可經取代或未經取代。實例包含但不限於四氫-2H-哌喃-4-基)甲基、(哌啶-4-基)乙基、(哌啶-4-基)丙基、(四氫-2H-硫哌喃-4-基)甲基及(1,3-硫雜環己烷-4-基)甲基。
如本文所使用之「雜芳烷基」及「雜芳(烷基)」係指作為取代基經由低碳數伸烷基部分連接之雜芳基。雜芳烷基之低碳數伸烷基及雜芳基部分可經取代或未經取代。實例包含但不限於2-噻吩基烷基、3-噻吩基烷基、呋喃基烷基、噻吩基烷基、吡咯基烷基、吡啶基烷基、異
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唑基烷基及咪唑基烷基以及其苯并稠合類似物。
如本文所使用之「羥基」係指-OH部分。類似地，「羥化」係指已添加有-OH部分例如以促進溶解度之分子。
如本文所使用之「標記」係指提供可偵測特徵之分子或其部分。舉例而言，可偵測特徵可為光信號，諸如輻射吸光度、螢光發射、發光發射、螢光壽命、螢光偏振或其類似者；瑞利（Rayleigh）及/或米氏（Mie）散射；針對諸如抗體或抗生蛋白鏈菌素之配位體或受體之結合親和力；磁特性；電特性；傳導性；電荷；質量；放射性或其類似者。例示性標記包含但不限於螢光團、發光團、發色團、奈米粒子（例如金、銀、碳奈米管）、重原子、放射性同位素、質量標記、電荷標記、自旋標記、受體、配位體或其類似者。
如本文所使用之「連接子」及「連接子部分」係指接合兩個不同實體之原子或部分。通常，連接子在兩個實體之間提供或包括共價鍵或一系列共價鍵。然而，連接子可包含諸如在受體與配位體之間形成之非共價鍵之非共價鍵。例示性可連接實體包含但不限於固體載體、部分（例如核酸之核苷酸單體或核苷酸之鹼基）或分子（例如核酸或標記）。
如本文所使用之「下一恰當核苷酸」係指在引子之3'端處結合及/或合併以補足當經恰當地鹼基配對時與引子雜交之模板股中之鹼基的核苷酸類型。模板股中之鹼基稱作「下一鹼基」且緊鄰與引子之3'端雜交之模板中之鹼基的5'。下一恰當核苷酸可稱作下一鹼基之「同源」物且反之亦然。在三元複合物中或在雙股核酸中彼此相互作用之同源核苷酸稱為彼此「配對」。根據華特生-克里克配對規則（Watson-Crick pairing rule），腺嘌呤（A）與胸腺嘧啶（T）或尿嘧啶（U）配對，且鳥嘌呤（G）與胞嘧啶（C）或尿嘧啶（U）配對。具有不與下一模板鹼基互補之鹼基之核苷酸稱作「不恰當」、「錯配」或「非同源」核苷酸。
如本文所使用之「核鹼基」（亦稱作「含氮鹼基」或「鹼基」）係指形成核苷酸之分化單元之嘌呤或嘌呤衍生物或嘧啶或嘧啶衍生物。五個一級或典型核鹼基為腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）及尿嘧啶（U）。腺嘌呤及鳥嘌呤為嘌呤鹼基。胞嘧啶、尿嘧啶及胸腺嘧啶為嘧啶鹼基。呈典型雙螺旋形式之鹼基對中之各者包含嘌呤及嘧啶：A與T配對，A與U配對，或G與C配對或G與U配對。此等嘌呤-嘧啶對稱作『鹼基互補序列』或稱為彼此「互補」。特定而言，依據用阻斷基置換一些保護基，胞嘧啶核鹼基經受修飾或降解。
如本文所使用之「核酸」係指共價連接在一起之至少兩個核苷酸。因此，例示性「核酸」為諸如DNA、RNA或其任何組合之多核苷酸。在核酸合成或偵測期間，典型核酸可受聚合酶作用。術語「核酸」包含單股、雙股或多股DNA、RNA及其類似物（衍生物）。
如本文所使用之「核苷酸」可用於指天然核苷酸或其類似物。一般而言，核苷酸具有三個部分：核鹼基（例如嘌呤或嘧啶）、五碳糖（例如核糖或去氧核糖）及至少一磷酸酯。實例包含但不限於三磷酸核苷酸（NTP），諸如三磷酸核糖核苷酸（rNTP）、三磷酸去氧核糖核苷酸（dNTP）或其非天然類似物，諸如三磷酸二去氧核糖核苷酸（ddNTP）或經可逆地終止之三磷酸核苷酸（rtNTP）。核苷酸可呈單體形式，例如呈三磷酸核苷酸、二磷酸核苷酸或單磷酸核苷酸形式。核苷酸亦可為例如根據其在核酸聚合物中之位置來識別之該聚合物之部分，諸如3'核苷酸（亦即，存在於該聚合物3'端處之核苷酸部分）或5'核苷酸（亦即，存在於該聚合物5'端處之核苷酸部分）。核苷含有核鹼基及5碳糖。因此，核苷酸為具有磷酸酯部分之核苷。
如本文所使用之「視情況經取代」在關於分子部分使用時意味著部分可未經取代或經所指示取代基中之一或多者取代。同樣，當部分描述為「經取代或未經取代」或「未經取代或經取代」時，取代基可選自一或多個所指示取代基。若未指示取代基，則意味著所指示「視情況經取代」或「經取代」之部分可單獨地且獨立地經一或多個單獨地且獨立地選自一組官能基之部分取代，該組官能基包含但不限於烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基、羥基、受保護羥基、烷氧基、芳氧基、醯基、巰基、烷硫基、芳硫基、氰基、鹵素、硫羰基、O-胺甲醯基、N-胺甲醯基、O-硫胺甲醯基、N-硫胺甲醯基、C-醯胺基、N-醯胺基、S-磺醯胺基、N-磺醯胺基、C-羧基、受保護C-羧基、O-羧基、異氰酸基、硫氰基、異硫氰基、硝基、矽基、次磺醯基、亞磺醯基、磺醯基、鹵烷基、鹵烷氧基、三鹵甲磺醯基、三鹵甲磺醯胺基、胺基、經單取代之胺基、經二取代之胺基及其受保護衍生基團。若未關於「未經取代」之部分指示取代基，則一或多個所省略之部分可單獨地且獨立地選自一組官能基，該組官能基包含但不限於前一句或本文其他地方所闡述之官能基組。
上文術語（例如「烷基」、「烯基」、「炔基」、「雜烷基」、「環烷基」、「環烯基」、「環炔基」、「雜脂環基」、「芳基」、「雜芳基」、「伸烷基」、「伸烯基」、「伸炔基」、「伸雜烷基」、「伸環烷基」、「伸環烯基」、「伸環炔基」、「伸雜脂環基」、「伸芳基」及「伸雜芳基」）中之各者包含所指示基團之經取代形式及未經取代形式。下文提供各類基團之較佳取代基。
烷基及雜烷基之取代基可為選自但不限於以下之各種基團中之一或多者：-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R''、-SR'、-鹵素、-SiR'R''R'''、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2 R'、-CONR'R''、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR'C(O)NR''R'''、-NR''C(O)2 R'、-NRC(NR'R''R''')=NR''''、-NRC(NR'R'')=NR'''、-S(O)R'、-S(O)2 R'、-S(O)2 NR'R''、-NRSO2 R'、-NR'NR''R'''、-ONR'R''、-NR'C(O)NR''NR'''R''''、-CN、-NO2 、-NR'SO2 R''、-NR'C(O)R''、-NR'C(O)OR''、-NR'OR''、-N3 ，數值範圍為零至（2m'+1），其中m'為該基團中之碳原子總數。R、R'、R''、R'''及R''''各自較佳獨立地指氫、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳基（例如經1-3個鹵素取代之芳基）、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之烷基、烷氧基或硫烷氧基、或芳烷基。當本文所描述之化合物包含超過一個R基團時，例如當此等基團中超過一者存在時，R基團中之各者各自獨立地選為R'、R''、R'''及R''''基團。當R'及R''附接至同一氮原子時，其可與氮原子組合以形成4員、5員、6員或7員環。舉例而言，-NR'R''包含但不限於1-吡咯啶基及4-嗎啉基。根據上文對取代基之論述，本領域中熟習此項技術者應理解術語「烷基」意在包含結合至除氫基團以外之基團之包含碳原子之基團，諸如鹵烷基（例如-CF3 及-CH2 CF3 ）及醯基（例如-C(O)CH3 、-C(O)CF3 、-C(O)CH2 OCH3 及其類似基團）。
與針對烷基所描述之取代基類似，芳基及雜芳基之取代基可變且選自例如：-OR'、-NR'R''、-SR'、-鹵素、-SiR'R''R'''、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2 R'、-CONR'R''、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR'C(O)NR''R'''、-NR''C(O)2 R'、-NRC(NR'R''R''')=NR''''、-NRC(NR'R'')=NR'''、-S(O)R'、-S(O)2 R'、-S(O)2 NR'R''、-NRSO2 R'、-NR'NR''R'''、-ONR'R''、-NR'C(O)NR''NR'''R''''、-CN、-NO2 、-R'、-N3 、-CH(Ph)2 、氟(C1 -C4 )烷氧基及氟(C1 -C4 )烷基、-NR'SO2 R''、-NR'C(O)R''、-NR'C(O)-OR''、-NR'OR''，數值範圍為零至芳環系統上開放化合價總數；且其中R'、R''、R'''及R''''較佳獨立地選自氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳基及經取代或未經取代之雜芳基。當本文所描述之化合物包含超過一個R基團時，例如當此等基團中超過一者存在時，R基團中之各者各自獨立地選為R'、R''、R'''及R''''基團。
環（例如環烷基、環烯基、環炔基、雜脂環基、芳基或雜芳基）之取代基可描繪為環而非環之特定原子上之取代基（通常稱作浮動取代基）。在此類情況下，取代基可附接至環原子中之任一者（遵從化學價規則），且在稠環或螺環之情況下，取代基描繪為與稠環或螺環之一個成員締合（單個環上之浮動取代基），可為稠環或螺環中任一者上之取代基（多個環上之浮動取代基）。當取代基附接至環而非特定原子（浮動取代基）且取代基下標為大於一之整數時，多個取代基可處於同一原子、同一環、不同原子、不同稠環、不同螺環上，且各取代基可視情況不同。在環與分子剩餘部分之附接點不限於單個原子（浮動取代基）之情況下，附接點可為環之任何原子，且在稠環或螺環之情況下，附接點可為稠環或螺環中任一者之任何原子，同時遵從化學價規則。在環、稠環或螺環含有一或多個環雜原子且環、稠環或螺環顯示為具有再一浮動取代基（包含但不限於與分子剩餘部分之附接點）之情況下，浮動取代基可鍵結至雜原子。在於具有浮動取代基之結構或化學式中環雜原子顯示為結合至一或多個氫（例如具有針對環原子之兩個鍵及針對氫之第三鍵之環氮）的情況下，當雜原子鍵結至浮動取代基時，取代基應理解為置換氫，同時遵從化學價規則。
兩個或更多個取代基可視情況接合以形成芳基、雜芳基、環烷基、環烯基、環炔基或雜脂環基。儘管不一定，但通常發現該等所謂之成環取代基附接至環狀基底結構。在一個實施例中，成環取代基附接至基底結構之鄰接成員。舉例而言，附接至環狀基底結構之鄰接成員之兩個成環取代基產生稠環結構。在另一實施例中，成環取代基附接至基底結構之單個成員。舉例而言，附接至環狀基底結構之單個成員之兩個成環取代基產生螺環結構。在又另一實施例中，成環取代基附接至基底結構之非鄰接成員。
如本文所使用之術語「雜原子」或「環雜原子」意在包含氧（O）、氮（N）、硫（S）、硒（Se）、磷（P）及矽（Si）。
如本文所使用之「取代基」意謂選自以下部分之基團： （A）側氧基、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-OSO3 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-N3 、未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）、未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）、未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）、未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）、未經取代之環烷基（例如C3 -C8 環烷基、C3 -C6 環烷基或C5 -C6 環烷基）、未經取代之環烯基（例如C3 -C8 環烯基、C3 -C6 環烯基或C5 -C6 環烯基）、未經取代之環炔基（例如C3 -C8 環炔基、C3 -C6 環炔基或C5 -C6 環炔基）、未經取代之雜脂環基（例如3至8員雜脂環基、3至6員雜脂環基或5至6員雜脂環基）、未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基），及 （B）烷基（例如C1 -C20 、C1 -C12 、C1 -C8 、C1 -C6 、C1 -C4 或C1 -C2 ）、烯基（例如C2 -C20 、C2 -C12 、C2 -C8 、C2 -C6 或C2 -C4 ）、炔基（例如C2 -C20 、C2 -C12 、C2 -C8 、C2 -C6 或C2 -C4 ）、雜烷基（例如2至20員、2至12員、2至8員、2至6員、4至6員、2至3員或4至5員）、環烷基（例如C3 -C10 、C3 -C8 、C3 -C6 、C4 -C6 或C5 -C6 ）、環烯基（例如C3 -C10 、C3 -C8 、C3 -C6 、C4 -C6 或C5 -C6 ）、環炔基（例如C3 -C10 、C3 -C8 、C3 -C6 、C4 -C6 或C5 -C6 ）、雜脂環基（例如3至10員、3至8員、3至6員、4至6員、4至5員或5至6員）、芳基（例如C6 -C12 、C6 -C10 或苯基）或雜芳基（例如5至12員、5至10員、5至9員或5至6員），以上經至少一個選自以下之取代基取代： （i）側氧基、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-OSO3 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-N3 、未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）、未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）、未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）、未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）、未經取代之環烷基（例如C3 -C8 環烷基、C3 -C6 環烷基或C5 -C6 環烷基）、未經取代之環烯基（例如C3 -C8 環烯基、C3 -C6 環烯基或C5 -C6 環烯基）、未經取代之環炔基（例如C3 -C8 環炔基、C3 -C6 環炔基或C5 -C6 環炔基）、未經取代之雜脂環基（例如3至8員雜脂環基、3至6員雜脂環基或5至6員雜脂環基）、未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基），及 （ii）烷基（例如C1 -C20 、C1 -C12 、C1 -C8 、C1 -C6 、C1 -C4 或C1 -C2 ）、烯基（例如C2 -C20 、C2 -C12 、C2 -C8 、C2 -C6 或C2 -C4 ）、炔基（例如C2 -C20 、C2 -C12 、C2 -C8 、C2 -C6 或C2 -C4 ）、雜烷基（例如2至20員、2至12員、2至8員、2至6員、4至6員、2至3員或4至5員）、環烷基（例如C3 -C10 、C3 -C8 、C3 -C6 、C4 -C6 或C5 -C6 ）、環烯基（例如C3 -C10 、C3 -C8 、C3 -C6 、C4 -C6 或C5 -C6 ）、環炔基（例如C3 -C10 、C3 -C8 、C3 -C6 、C4 -C6 或C5 -C6 ）、雜脂環基（例如3至10員、3至8員、3至6員、4至6員、4至5員或5至6員）、芳基（例如C6 -C12 、C6 -C10 或苯基）或雜芳基（例如5至12員、5至10員、5至9員或5至6員），以上經至少一個選自以下之取代基取代： （a）側氧基、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-OSO3 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-N3 、未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）、未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）、未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）、未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）、未經取代之環烷基（例如C3 -C8 環烷基、C3 -C6 環烷基或C5 -C6 環烷基）、未經取代之環烯基（例如C3 -C8 環烯基、C3 -C6 環烯基或C5 -C6 環烯基）、未經取代之環炔基（例如C3 -C8 環炔基、C3 -C6 環炔基或C5 -C6 環炔基）、未經取代之雜脂環基（例如3至8員雜脂環基、3至6員雜脂環基或5至6員雜脂環基）、未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基），及 （b）烷基（例如C1 -C20 、C1 -C12 、C1 -C8 、C1 -C6 、C1 -C4 或C1 -C2 ）、烯基（例如C2 -C20 、C2 -C12 、C2 -C8 、C2 -C6 或C2 -C4 ）、炔基（例如C2 -C20 、C2 -C12 、C2 -C8 、C2 -C6 或C2 -C4 ）、雜烷基（例如2至20員、2至12員、2至8員、2至6員、4至6員、2至3員或4至5員）、環烷基（例如C3 -C10 、C3 -C8 、C3 -C6 、C4 -C6 或C5 -C6 ）、環烯基（例如C3 -C10 、C3 -C8 、C3 -C6 、C4 -C6 或C5 -C6 ）、環炔基（例如C3 -C10 、C3 -C8 、C3 -C6 、C4 -C6 或C5 -C6 ）、雜脂環基（例如3至10員、3至8員、3至6員、4至6員、4至5員或5至6員）、芳基（例如C6 -C12 、C6 -C10 或苯基）或雜芳基（例如5至12員、5至10員、5至9員或5至6員），以上經至少一個選自以下之取代基取代：側氧基、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-OSO3 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-N3 、未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）、未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）、未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）、未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）、未經取代之環烷基（例如C3 -C8 環烷基、C3 -C6 環烷基或C5 -C6 環烷基）、未經取代之環烯基（例如C3 -C8 環烯基、C3 -C6 環烯基或C5 -C6 環烯基）、未經取代之環炔基（例如C3 -C8 環炔基、C3 -C6 環炔基或C5 -C6 環炔基）、未經取代之雜脂環基（例如3至8員雜脂環基、3至6員雜脂環基或5至6員雜脂環基）、未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。
如本文所使用之「尺寸受限之取代基（size-limited substituent/size-limited substituent group）」意謂選自上文針對「取代基（substituent group）」所描述之全部取代基之基團，其中各經取代或未經取代之烷基為經取代或未經取代之C1 -C20 烷基，各經取代或未經取代之烯基為經取代或未經取代之C2 -C20 烯基，各經取代或未經取代之炔基為經取代或未經取代之C2 -C20 炔基，各經取代或未經取代之雜烷基為經取代或未經取代之2至20員雜烷基，各經取代或未經取代之環烷基為經取代或未經取代之C3 -C8 環烷基，各經取代或未經取代之環烯基為經取代或未經取代之C3 -C8 環烯基，各經取代或未經取代之環炔基為經取代或未經取代之C3 -C8 環炔基，各經取代或未經取代之雜脂環基為經取代或未經取代之3至8員雜脂環基，各經取代或未經取代之芳基為經取代或未經取代之C6 -C10 芳基，且各經取代或未經取代之雜芳基為經取代或未經取代之5至10員雜芳基。
如本文所使用之「低碳數取代基（lower substituent/lower substituent group）」意謂選自上文針對「取代基（substituent group）」所描述之全部取代基之基團，其中各經取代或未經取代之烷基為經取代或未經取代之C1 -C8 烷基，各經取代或未經取代之烯基為經取代或未經取代之C2 -C8 烯基，各經取代或未經取代之炔基為經取代或未經取代之C2 -C8 炔基，各經取代或未經取代之雜烷基為經取代或未經取代之2至8員雜烷基，各經取代或未經取代之環烷基為經取代或未經取代之C3 -C7 環烷基，各經取代或未經取代之環烯基為經取代或未經取代之C3 -C7 環烯基，各經取代或未經取代之環炔基為經取代或未經取代之C3 -C7 環炔基，各經取代或未經取代之雜脂環基為經取代或未經取代之3至7員雜脂環基，各經取代或未經取代之芳基為經取代或未經取代之C6 -C10 芳基，且各經取代或未經取代之雜芳基為經取代或未經取代之5至9員雜芳基。
在一些實施例中，本文化合物中所描述之各經取代之基團係經至少一個取代基取代。更具體言之，在一些實施例中，本文化合物中所描述之各經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之雜烷基、經取代之環烷基、經取代之環烯基、經取代之環炔基、經取代之雜脂環基、經取代之芳基、經取代之雜芳基、經取代之伸烷基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳基及/或經取代之伸雜芳基係經至少一個取代基取代。在其他實施例中，此等基團中之至少一個或全部經至少一個尺寸受限之取代基取代。在其他實施例中，此等基團中之至少一個或全部經至少一個低碳數取代基取代。
在本文化合物之其他實施例中，各經取代或未經取代之烷基可為經取代或未經取代之C1 -C20 烷基，各經取代或未經取代之烯基可為經取代或未經取代之C2 -C20 烯基，各經取代或未經取代之炔基可為經取代或未經取代之C2 -C20 炔基，各經取代或未經取代之雜烷基為經取代或未經取代之2至20員雜烷基，各經取代或未經取代之環烷基為經取代或未經取代之C3 -C8 環烷基，各經取代或未經取代之環烯基為經取代或未經取代之C3 -C8 環烯基，各經取代或未經取代之環炔基為經取代或未經取代之C3 -C8 環炔基，各經取代或未經取代之雜脂環基為經取代或未經取代之3至8員雜脂環基，各經取代或未經取代之芳基為經取代或未經取代之C6 -C10 芳基，且/或各經取代或未經取代之雜芳基為經取代或未經取代之5至10員雜芳基。在本文化合物之一些實施例中，各經取代或未經取代之伸烷基為經取代或未經取代之C1 -C20 伸烷基，各經取代或未經取代之伸烯基為經取代或未經取代之C2 -C20 伸烯基，各經取代或未經取代之伸炔基為經取代或未經取代之C2 -C20 伸炔基，各經取代或未經取代之伸雜烷基為經取代或未經取代之2至20員伸雜烷基，各經取代或未經取代之伸環烷基為經取代或未經取代之C3 -C8 伸環烷基，各經取代或未經取代之伸環烯基為經取代或未經取代之C3 -C8 伸環烯基，各經取代或未經取代之伸環炔基為經取代或未經取代之C3 -C8 伸環炔基，各經取代或未經取代之伸雜脂環基為經取代或未經取代之3至8員伸雜脂環基，各經取代或未經取代之伸芳基為經取代或未經取代之C6 -C10 伸芳基，且/或各經取代或未經取代之伸雜芳基為經取代或未經取代之5至10員伸雜芳基。
在一些實施例中，各經取代或未經取代之烷基為經取代或未經取代之C1 -C8 烷基，各經取代或未經取代之烯基為經取代或未經取代之C2 -C8 烯基，各經取代或未經取代之炔基為經取代或未經取代之C2 -C8 炔基，各經取代或未經取代之雜烷基為經取代或未經取代之2至8員雜烷基，各經取代或未經取代之環烷基為經取代或未經取代之C3 -C7 環烷基，各經取代或未經取代之環烯基為經取代或未經取代之C3 -C7 環烯基，各經取代或未經取代之環炔基為經取代或未經取代之C3 -C7 環炔基，各經取代或未經取代之雜脂環基為經取代或未經取代之3至7員雜脂環基，各經取代或未經取代之芳基為經取代或未經取代之C6 -C10 芳基，且/或各經取代或未經取代之雜芳基為經取代或未經取代之5至9員雜芳基。在一些實施例中，各經取代或未經取代之伸烷基為經取代或未經取代之C1 -C8 伸烷基，各經取代或未經取代之伸烯基為經取代或未經取代之C2 -C8 伸烯基，各經取代或未經取代之伸炔基為經取代或未經取代之C2 -C8 伸炔基，各經取代或未經取代之伸雜烷基為經取代或未經取代之2至8員伸雜烷基，各經取代或未經取代之伸環烷基為經取代或未經取代之C3 -C7 伸環烷基，各經取代或未經取代之伸環烯基為經取代或未經取代之C3 -C7 伸環烯基，各經取代或未經取代之伸環炔基為經取代或未經取代之C3 -C7 伸環炔基，各經取代或未經取代之伸雜脂環基為經取代或未經取代之3至7員伸雜脂環基，各經取代或未經取代之伸芳基為經取代或未經取代之C6 -C10 伸芳基，且/或各經取代或未經取代之伸雜芳基為經取代或未經取代之5至9員伸雜芳基。在一些實施例中，化合物為應用（例如下文實例部分、圖式或表格）中所闡述之化學物種。
在實施例中，經取代或未經取代之部分（例如經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之伸烷基、經取代或未經取代之伸烯基、經取代或未經取代之伸炔基、經取代或未經取代之伸雜烷基、經取代或未經取代之伸環烷基、經取代或未經取代之伸環烯基、經取代或未經取代之伸環炔基、經取代或未經取代之伸雜脂環基、經取代或未經取代之伸芳基及/或經取代或未經取代之伸雜芳基）為未經取代的（例如分別為未經取代之烷基、未經取代之烯基、未經取代之炔基、未經取代之雜烷基、未經取代之環烷基、未經取代之環烯基、未經取代之環炔基、未經取代之雜脂環基、未經取代之芳基、未經取代之雜芳基、未經取代之伸烷基、未經取代之伸烯基、未經取代之伸炔基、未經取代之伸雜烷基、未經取代之伸環烷基、未經取代之伸環烯基、未經取代之伸環炔基、未經取代之伸雜脂環基、未經取代之伸芳基及/或未經取代之伸雜芳基）。在實施例中，經取代或未經取代之部分（例如經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之伸烷基、經取代或未經取代之伸烯基、經取代或未經取代之伸炔基、經取代或未經取代之伸雜烷基、經取代或未經取代之伸環烷基、經取代或未經取代之伸環烯基、經取代或未經取代之伸環炔基、經取代或未經取代之伸雜脂環基、經取代或未經取代之伸芳基及/或經取代或未經取代之伸雜芳基）為經取代的（例如分別為經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之雜烷基、經取代之環烷基、經取代之環烯基、經取代之環炔基、經取代之雜脂環基、經取代之芳基、經取代之雜芳基、經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳基及/或經取代之伸雜芳基）。
在實施例中，經取代之部分（例如經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之雜烷基、經取代之環烷基、經取代之環烯基、經取代之環炔基、經取代之雜脂環基、經取代之芳基、經取代之雜芳基、經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳基及/或經取代之伸雜芳基）經至少一個取代基取代，其中若經取代之部分經複數個取代基取代，則各取代基可視情況為不同的。在實施例中，若經取代之部分經複數個取代基取代，則各取代基為不同的。
在實施例中，經取代之部分（例如經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之雜烷基、經取代之環烷基、經取代之環烯基、經取代之環炔基、經取代之雜脂環基、經取代之芳基、經取代之雜芳基、經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳基及/或經取代之伸雜芳基）經至少一個尺寸受限之取代基取代，其中若經取代之部分經複數個尺寸受限之取代基取代，則各尺寸受限之取代基可視情況為不同的。在實施例中，若經取代之部分經複數個尺寸受限之取代基取代，則各尺寸受限之取代基為不同的。
在實施例中，經取代之部分（例如經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之雜烷基、經取代之環烷基、經取代之環烯基、經取代之環炔基、經取代之雜脂環基、經取代之芳基、經取代之雜芳基、經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳基及/或經取代之伸雜芳基）經至少一個低碳數取代基取代，其中若經取代之部分經複數個低碳數取代基取代，則各低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，若經取代之部分經複數個低碳數取代基取代，則各低碳數取代基為不同的。
在實施例中，經取代之部分（例如經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之雜烷基、經取代之環烷基、經取代之環烯基、經取代之環炔基、經取代之雜脂環基、經取代之芳基、經取代之雜芳基、經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳基及/或經取代之伸雜芳基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之部分經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，若經取代之部分經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基為不同的。
本揭示案之某些化合物具有不對稱碳原子（光學或手性中心）或雙鍵；就絕對立體化學而言可針對胺基酸定義為(R)-或(S)-或定義為(D)-或(L)-之對映異構體、外消旋物、非對映異構體、互變異構體、幾何異構體、立體異構形式以及個別異構體涵蓋於本揭示案之範疇內。本揭示案之化合物不包含本領域中已知太不穩定而難以合成及/或分離之化合物。本揭示案意在包含呈外消旋及光學純形式之化合物。光學活性(R)-及(S)-或(D)-及(L)-異構體可使用手性合成組元或手性試劑來製備或使用習知技術來解析。當本文所描述之化合物含有烯鍵或其他幾何不對稱中心時且除非另外規定，否則希望化合物包含E幾何異構體及Z幾何異構體。
如本文所使用之術語「異構體」係指具有相同數目及種類之原子且因此具有相同分子量、但不同原子結構佈置或組態之化合物。
如本文所使用之術語「互變異構體」係指平衡存在且易於自一種異構形式轉化成另一異構形式之兩種或更多種結構異構體中的一者。
本領域中熟習此項技術者將顯而易知，本揭示案之某些化合物可以互變異構形式存在，化合物之全部該等互變異構形式皆在本揭示案之範疇內。
除非另外說明，否則本文所描繪之結構亦意在包含結構之全部立體化學形式；亦即，關於各不對稱中心之R組態及S組態。因此，本發明化合物之單獨立體化學異構體以及對映異構及非對映異構體混合物係在本揭示案之範疇內。
除非另外說明，否則本文所描繪之結構亦意在包含僅在存在一或多個經同位素增濃之原子之情況下有所不同之化合物。舉例而言，除氫經氘或氚置換或碳經13 C或14 C增濃碳置換之外具有本發明結構之化合物在本揭示案之範疇內。
本揭示案之化合物亦可在構成該等化合物之原子中之一或多者處含有非天然比例之原子同位素。舉例而言，化合物可經諸如氚（3 H）、碘-125（125 I）或碳-14（14 C）之放射性同位素進行放射性標記。本揭示案之化合物之全部同位素變體無論是否具放射性均涵蓋於本揭示案之範疇內。
應注意，在本申請案通篇，將替代物寫入馬庫什群組（Markush group）中，例如各含有超過一個可能性胺基酸之胺基酸位置。經特定地考慮，馬庫什群組之各成員應分開予以考慮，藉此包括另一實施例，且馬庫什群組不作為單個單元來讀取。
「類似物（analog/analogue）」係根據其在《化學生物學（Chemistry and Biology）》內之普通一般含義來使用且係指與另一化合物（亦即所謂之「參考化合物」）結構上類似、但組成不同的化合物，該組成例如一個原子經不同元素之原子置換、或特定官能基之存在、或一個官能基經另一官能基置換、或參考化合物之一或多個手性中心之絕對立體化學。因此，類似物為與參考化合物在功能及外觀上類似或相當、但在結構或起源上不類似或相當之化合物。
如本文所使用之術語「一（a/an）」意謂一或多個/種。另外，如本文所使用之片語「經……取代」意謂規定基團可經任何或全部附名取代基中之一或多者取代。舉例而言，在諸如烷基或雜芳基之基團「經未經取代之C1 -C20 烷基或未經取代之2至20員雜烷基取代」之情況下，該基團可含有一或多個未經取代之C1 -C20 烷基及/或一或多個未經取代之2至20員雜烷基。
如本文所使用之術語「約」意謂包含規定值之值範圍，本領域中一般熟習此項技術者將該值範圍視為與規定值合理地類似。在實施例中，約意謂在使用本領域中一般可接受之量測結果之標準差內。在實施例中，約意謂延伸至規定值之+/- 10%之範圍。在實施例中，約包含規定值。
在本揭示案中，「包括（comprises/comprising）」、「含有」及「具有」及其類似者可具有在美國專利法中歸屬於其之含義且可意謂「包含（includes/including）」及其類似者。「基本上由……組成（Consisting essentially of/consists essentially）」同樣具有在美國專利法中所歸屬之含義且該術語為開放式的，允許存在所列舉內容以外之內容，只要所列舉內容之基礎或新穎特徵不因所列舉內容以外之內容的存在而變化即可，但排除先前技術實施例。
此外，在部分經R取代基取代之情況下，基團可稱作「經R取代的」。在部分為經R取代的情況下，部分經至少一個R取代基取代且各R取代基視情況為不同的。在特定R基團存在於化學屬（諸如式（I））描述中之情況下，可使用羅馬字母符號以區分彼特定R基團之各外觀。舉例而言，在多個R13 取代基存在之情況下，各R13 取代基可區分為R13A 、R13B 、R13C 、R13D 等，其中R13A 、R13B 、R13C 、R13D 等中之各者之定義係在R13 定義之範疇內且視情況不同。
「可偵測試劑」或「可偵測部分」為可藉由諸如光譜法、光化學、生物化學、免疫化學、化學、磁共振成像或其他物理手段之適當手段來偵測之物質、元素、化合物或組合物；或其部分。舉例而言，適用可偵測試劑包含18 F、32 P、33 P、45 Ti、47 Sc、52 Fe、59 Fe、62 Cu、64 Cu、67 Cu、67 Ga、68 Ga、77 As、86 Y、90 Y、89 Sr、89 Zr、94 Tc、94 Tc、99m Tc、99 Mo、105 Pd、105 Rh、111 Ag、111 In、123 I、124 I、125 I、131 I、142 Pr、143 Pr、149 Pm、153 Sm、154-1581 Gd、161 Tb、166 Dy、166 Ho、169 Er、175 Lu、177 Lu、186 Re、188 Re、189 Re、194 Ir、198 Au、199 Au、211 At、211 Pb、212 Bi、212 Pb、213 Bi、223 Ra、225 Ac、Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、32 P、螢光團（例如螢光染料）、電子緻密試劑、酶（例如如ELISA中所常用）、生物素、長葉毛地黃配質、順磁分子、順磁奈米粒子、超小超順磁氧化鐵（「USPIO」）奈米粒子、USPIO奈米粒子聚集體、超順磁氧化鐵（「SPIO」）奈米粒子、SPIO奈米粒子聚集體、單結晶氧化鐵奈米粒子、單結晶氧化鐵、奈米粒子對比劑、脂質體或含有釓螯合物（「Gd-螯合物」）分子之其他遞送媒劑、釓、放射性同位素、放射核種（例如碳-11、氮-13、氧-15、氟-18、銣-82）、氟去氧葡萄糖（例如經氟-18標記）、任何γ射線發射放射核種、正電子發射放射核種、放射性標記葡萄糖、放射性標記水、放射性標記氨、生物膠體、微泡（例如包含有包含白蛋白、半乳糖、脂質及/或聚合物之微泡殼體；包含空氣、重氣、全氟碳、氮、八氟丙烷、全氟己烷脂質微球、全氟丙烷等之微泡氣體核）、碘化對比劑（例如碘海醇、碘克沙醇、碘佛醇、碘帕醇、碘昔蘭、碘普羅胺、泛影酸鹽、甲泛影酸鹽、碘克沙酸鹽）、硫酸鋇、二氧化釷、金、金奈米粒子、金奈米粒子聚集體、螢光團、雙光子螢光團或半抗原及蛋白質或可例如藉由將放射性標記併入特定地對目標肽具反應性之肽中而可偵測之其他實體。可偵測部分為單價可偵測試劑或能夠與另一組合物形成鍵之可偵測試劑。
可根據本揭示案之實施例用作成像及/或標記試劑之放射性物質（例如放射性同位素）包含但不限於18 F、32 P、33 P、45 Ti、47 Sc、52 Fe、59 Fe、62 Cu、64 Cu、67 Cu、67 Ga、68 Ga、77 As、86 Y、90 Y、89 Sr、89 Zr、94 Tc、94 Tc、99m Tc、99 Mo、105 Pd、105 Rh、111 Ag、111 In、123 I、124 I、125 I、131 I、142 Pr、143 Pr、149 Pm、153 Sm、154-158 Gd、161 Tb、166 Dy、166 Ho、169 Er、175 Lu、177 Lu、186 Re、188 Re、189 Re、194 Ir、198 Au、199 Au、211 At、211 Pb、212 Bi、212 Pb、213 Bi、223 Ra及225 Ac。可根據本揭示案之實施例用作額外成像劑之順磁離子包含但不限於過渡及鑭系金屬（例如原子序數為21-29、42、43、44或57-71之金屬）之離子。此等金屬包含Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb及Lu之離子。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換地用於指胺基酸殘基之聚合物，其中聚合物可視情況與不由胺基酸組成之部分結合。該等術語適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基為對應天然存在之胺基酸之人工化學模擬物，以及適用於天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。
如本文所使用之「肟」係指具有以下結構之部分：
Figure 02_image022
。
肟部分可經由氧原子附接至另一部分，在該情況下，部分可稱作「O-肟」部分。醛肟部分在R或R'中之一者處具有氫。酮肟在R及R'處均不具有氫。在本文所揭示之一些實施例中，肟為例示性保護基。3'-O-肟為經由肟氧附接至核苷酸或核苷之3'碳之肟部分。
如本文所使用之「聚合酶」可用於指核酸合成酶，包含但不限於DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉錄酶、引子酶及轉移酶。通常，聚合酶具有一或多個活性位點，在該一或多個活性位點處可發生核苷酸結合及/或核苷酸聚合之催化。聚合酶可催化核苷酸聚合至雙股核酸分子之第一股之3'端。舉例而言，聚合酶可催化下一恰當核苷酸經由磷酸二酯鍵添加至雙股核酸分子之第一股之3'氧基團中，藉此將核苷酸共價併入雙股核酸分子之第一股中。視情況，聚合酶不需要能夠在本文所闡述之方法中所用之一或多個條件下進行核苷酸併入。舉例而言，突變聚合酶可能能夠形成三元複合物，但不能夠催化核苷酸併入。
如本文所使用之「經引發模板核酸」或「經引發模板」係指具有雙股區域以使得股中之一者為引子且另一股為模板的核酸。兩個股可為相連核酸分子之部分（例如髮夾式結構）或兩個股可為彼此不共價附接之可分離分子。
如本文所使用之「引子」係指具有在模板序列處或附近結合至核酸之序列之核酸。在特定組態中，引子以允許例如經由引子之聚合酶延伸或引子之接合酶延伸來進行模板複製之組態結合。引子可為結合至核酸分子之第二部分的核酸分子之第一部分，第一部分為引子序列且第二部分為引子結合序列（例如髮夾式引子）。可替代地，引子可為結合至具有模板序列之第二核酸分子之第一核酸分子。引子可由DNA、RNA或其類似物組成。引子可具有可延伸3'端或經阻斷，諸如經可逆地終止以便阻止引子延伸直至移除阻斷部分為止之3'端。
如本文所使用之「位點」在關於陣列使用時意謂其中存在特定分子之陣列中之位置。位點可僅含有單個分子或其可含有相同種類之若干分子群（例如分子系集）。可替代地，位點可包含不同種類之分子群（例如不同模板序列群）。陣列位點通常為離散的。離散位點可為相連的或其彼此之間可具有空間。本文適用之陣列可具有例如間隔小於100微米、50微米、10微米、5微米、1微米或0.5微米之位點。可替代地或另外，陣列可具有間隔大於0.5微米、1微米、5微米、10微米、50微米或100微米之位點。位點之面積可各自為小於1平方毫米、500平方微米、100平方微米、25平方微米、1平方微米或更小。陣列中之位點之位點之密度可為例如至少約10個位點/cm2 、100個位點/cm2 、1×103 個位點/cm2 、1×104 個位點/cm2 、1×105 個位點/cm2 、1×106 個位點/cm2 或更高。
如本文所使用之「固體載體」或「固相載體」係指不可溶於水性液體中之剛性基質。基質可為無孔或多孔的。基質可視情況能夠溶解液體（例如由於孔隙度），但將通常具有足夠剛性以使得基質在溶解液體時不實質上膨脹且在藉由乾燥移除液體時不實質上收縮。無孔固體載體一般對液體或氣體而言不可滲透。例示性固體載體包含但不限於玻璃及經改質或官能化玻璃、塑膠（包含丙烯酸聚合物、聚苯乙烯及苯乙烯與其他材料之共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚胺基甲酸酯、TeflonTM 、環狀烯烴、聚醯亞胺等）、耐綸、陶瓷、樹脂、環狀聚烯烴（Zeonor）、二氧化矽或包含矽及經改質矽之基於二氧化矽之材料、碳、金屬、無機玻璃、光纖束及聚合物。
如本文所使用之術語「表面」係指接觸流體之固體載體之一部分。流體可為氣體或液體。表面可為實質上扁平或平坦的。可替代地，表面可為圓的或波狀的。例示性可包含在表面上之輪廓為孔、凹陷部分、柱、脊、通道或其類似者。例示性可用作固體載體之材料包含但不限於上文所闡述之材料。
如本文所使用之「三元複合物」係指聚合酶、雙股核酸與核苷酸之間之分子間締合。通常，聚合酶促進下一恰當核苷酸與經引發核酸之模板股之間之相互作用。下一恰當核苷酸可經由華特生-克里克氫鍵結與模板股相互作用。術語「穩定三元複合物」意謂三元複合物具有經促進或延長之存在或對三元複合物之破壞已得到抑制。一般而言，三元複合物之穩定防止三元複合物之核苷酸組分共價併入三元複合物之經引發核酸組分中。
如本文所使用之「類型」係用於識別共用同一化學結構之分子。舉例而言，核苷酸混合物可包含若干dCTP分子。dCTP分子應理解為彼此類型相同之核苷酸，但與dATP、dGTP、dTTP等相比類型不同之核苷酸。類似地，具有相同核苷酸序列之個別DNA分子係相同類型，而具有不同序列之DNA分子係不同類型。術語「類型」亦可識別共用同一化學結構之部分。舉例而言，模板核酸中之胞嘧啶鹼基應獨立於其在模板序列中之位置而理解為彼此類型相同之鹼基。
如本文所使用之「容器」為用以將一個化學過程（例如結合事件；合併反應；向延伸鏈中添加核苷酸；自經阻斷核苷酸或延伸引子之3'端移除可逆終止子；或由阻斷部分置換保護部分；或諸如涉及核酸化學反應之反應的其他反應）與另一化學過程間隔開或用以提供其中可發生化學過程之空間的容器。可結合所揭示之技術使用之容器之非限制性實例包含：流槽；多孔盤之孔；顯微鏡載片；管（例如毛細管）；液滴；小泡；試管；塔盤；離心管；陣列中之零件；導管；基質中之通道或核酸化學反應中所用之其他容積。如本文所使用之「製造容器」為人類製造或人類改良且用以將一個化學過程（例如結合事件；合併反應；保護部分之添加或移除；諸如可逆終止子之阻斷部分之添加或移除）與另一化學過程間隔開或用以提供其中可發生化學過程之空間的容器。
如本文所使用之術語「降解（degrade/degradation）」在關於核苷酸或核苷酸之一部分時意謂核苷酸或核苷酸之一部分的化學修飾，產生相對於原始（亦即未經降解）核苷酸或核苷酸部分而言具有至少一種經調節功能或活性之不同分子。在一些實施例中，術語「降解（degrade/degradation）」在關於核鹼基時意謂核鹼基之化學修飾，引起核鹼基或包含核鹼基之核苷酸或核苷之活性或功能得到調節。在實施例中，核鹼基降解可稱作「核苷酸降解」。在實施例中，特定類型之核鹼基或核苷酸之降解可稱作特定核鹼基類型或核苷酸類型之降解，例如「dC降解」係指去氧胞苷降解（例如去氧胞苷中之胞嘧啶核鹼基降解、三磷酸去氧胞苷中之去氧胞苷降解、DNA核酸中之胞嘧啶核鹼基降解）。圖3描繪產生經降解dC之反應之實例。
下文所闡述及申請專利範圍中所敍述之實施例可鑒於上文定義進行理解。 組合物及方法
本揭示案提供包括含有具有諸如3'-O-肟部分之保護基之核苷酸及具有繫栓至諸如R2-ONH2 之可逆終止子之結構R2之試劑之溶液的組合物，其中R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2 (R6)、經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）、經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）或經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R2具有大於甲基之分子量。在實施例中，R2具有大於乙基之分子量。在實施例中，R2之分子量大於36 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於57 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於100 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於200 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於300 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於400 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於500 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於600 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於700 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於800 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於900 g/mol。在實施例中，R2之分子量小於或等於1000 g/mol。在實施例中，R2之分子量小於1000 g/mol。儘管不希望受機理限制，但咸信具有比氫及甲基更大之空間體積之R2部分產生與較小部分相比經改善之合成結果，且對核酸及核苷酸產生較少不合需要之修飾。參見下文實例1A之結果。在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。類似地，在一些情況下，R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。在特定組態中，核苷酸具有結構：
Figure 02_image024
。
B可為核鹼基。R1可獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH。Q可獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、氫或核酸。R3及R4可獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體或外源標記部分。在實施例中，R3及R4可獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。舉例而言，核苷酸之3'位處之部分可為醛肟（亦即，R3或R4中之一者為氫）或酮肟（R3或R4均不為氫）。
經取代之B部分及未經取代之B部分均與本文揭示內容一致。在實施例中，B經取代。在實施例中，B未經取代。在實施例中，經取代之B（例如經取代之核鹼基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之B經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當B經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當B經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當B經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。在實施例中，B為經取代之腺嘌呤部分。在實施例中，B為經取代之胞嘧啶部分。在實施例中，B為經取代之鳥嘌呤部分。在實施例中，B為經取代之胸腺嘧啶部分。在實施例中，B為經取代之尿嘧啶部分。在實施例中，B為未經取代之腺嘌呤部分。在實施例中，B為未經取代之胞嘧啶部分。在實施例中，B為未經取代之鳥嘌呤部分。在實施例中，B為未經取代之胸腺嘧啶部分。在實施例中，B為未經取代之尿嘧啶部分。
類似地，經取代之Q部分及未經取代之Q部分與本文揭示內容一致。在實施例中，Q經取代。在實施例中，Q未經取代。在實施例中，經取代之Q（例如經取代之單磷酸酯、經取代之二磷酸酯、經取代之三磷酸酯、氫原子及/或經取代之核酸）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之Q經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當Q經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當Q經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當Q經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，Q為去氧核糖核酸。在實施例中，Q為核糖核酸。在實施例中，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸。
在實施例中，R1為H。在實施例中，R1為OH。
在實施例中，經取代之R3（例如經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之環烷基、經取代之環烯基、經取代之環炔基、經取代之芳基、經取代之雜芳基、經取代之雜脂環基、經取代之芳烷基、經取代之雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之R3經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當R3經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當R3經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當R3經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，R3獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體或外源標記部分。在實施例中，R3獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。在實施例中，R3獨立地為外源標記部分。
在實施例中，經取代之R4（例如經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之環烷基、經取代之環烯基、經取代之環炔基、經取代之芳基、經取代之雜芳基、經取代之雜脂環基、經取代之芳烷基、經取代之雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之R4經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當R4經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當R4經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當R4經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體或外源標記部分。在實施例中，R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。在實施例中，R4獨立地為外源標記部分。
在實施例中，溶液為水溶液。在實施例中，核苷酸附接至固體載體，且其中固體載體與溶液接觸。在實施例中，包括結構R2-ONH2 之試劑附接至與水溶液接觸之固體載體。在實施例中，核鹼基包括外源標記部分。
本揭示案亦提供用於修飾核苷酸之方法。該等方法可藉由以下來進行：使具有諸如3'-O-肟部分之保護部分之核苷酸與具有結構R2-嵌段之試劑反應，其中嵌段為諸如可逆終止子部分-ONH2 之阻斷部分，以產生具有3'-O-NH2 部分或作為阻斷部分或可逆終止子之其他部分的核苷酸。在一些情況下，R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。R2可為除甲基以外之烷基。在實施例中，R2不為-CH3 。在實施例中，R2不為氫。在實施例中，R2不為氫或-CH3 。本揭示案亦提供用於修飾核苷酸之方法。該方法可藉由以下來進行：使具有3'-O-肟部分之核苷酸與具有結構R2-ONH2 之試劑反應以產生具有3'-O-NH2 部分之核苷酸，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
在實施例中，經取代之R2（例如經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之環烷基、經取代之環烯基、經取代之環炔基、經取代之芳基、經取代之雜芳基、經取代之雜脂環基、經取代之芳烷基、經取代之雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之R2經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當R2經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當R2經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當R2經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2 (R6)、經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）、經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）或經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。
在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)。在實施例中，R2為-C(O)(R6)。在實施例中，R2為-P(O)(R6)(R7)。在實施例中，R2為-C(R6)(=C(R7)(R8))。在實施例中，R2為-Si(R6)(R7)(R8)。在實施例中，R2為-SO2 (R6)。在實施例中，R2為經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R2為未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R2為未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R2為未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R2不為未經取代之甲基。在實施例中，R2不為未經取代之乙基。在實施例中，R2不為未經取代之丙基。
R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）、經取代或未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）、經取代或未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）、經取代或未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）、經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）、經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）、經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基、經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基或外源標記部分。在實施例中，R6、R7及R8不全為氫。在實施例中，R6不為氫。在實施例中，R7不為氫。在實施例中，R8不為氫。在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。
在實施例中，R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）、經取代或未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）、經取代或未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）、經取代或未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）、經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）、經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）、經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。在實施例中，R6、R7及R8不全為氫。在實施例中，R6不為氫。在實施例中，R7不為氫。在實施例中，R8不為氫。在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。
在實施例中，經取代之R6（例如經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之雜烷基、經取代之環烷基、經取代之環烯基、經取代之環炔基、經取代之芳基、經取代之雜芳基、經取代之雜脂環基、經取代之芳烷基、經取代之雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之R6經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當R6經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當R6經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當R6經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，R6獨立地為氫。在實施例中，R6獨立地為鹵素。在實施例中，R6獨立地為-CCl3 。在實施例中，R6獨立地為-CBr3 。在實施例中，R6獨立地為-CF3 。在實施例中，R6獨立地為-CI3 。在實施例中，R6獨立地為-CHCl2 。在實施例中，R6獨立地為-CHBr2 。在實施例中，R6獨立地為-CHF2 。在實施例中，R6獨立地為-CHI2 。在實施例中，R6獨立地為-CH2 Cl。在實施例中，R6獨立地為-CH2 Br。在實施例中，R6獨立地為-CH2 F。在實施例中，R6獨立地為-CH2 I。在實施例中，R6獨立地為-CN。在實施例中，R6獨立地為-OH。在實施例中，R6獨立地為-NH2 。在實施例中，R6獨立地為-COOH。在實施例中，R6獨立地為-CONH2 。在實施例中，R6獨立地為-NO2 。在實施例中，R6獨立地為-SH。在實施例中，R6獨立地為-SO3 H。在實施例中，R6獨立地為-SO4 H。在實施例中，R6獨立地為-SO2 NH2 。在實施例中，R6獨立地為-NHNH2 。在實施例中，R6獨立地為-ONH2 。在實施例中，R6獨立地為-NHC(O)NHNH2 。在實施例中，R6獨立地為-NHC(O)NH2 。在實施例中，R6獨立地為-NHSO2 H。在實施例中，R6獨立地為-NHC(O)H。在實施例中，R6獨立地為-NHC(O)OH。在實施例中，R6獨立地為-NHOH。在實施例中，R6獨立地為-OCCl3 。在實施例中，R6獨立地為-OCF3 。在實施例中，R6獨立地為-OCBr3 。在實施例中，R6獨立地為-OCI3 。在實施例中，R6獨立地為-OCHCl2 。在實施例中，R6獨立地為-OCHBr2 。在實施例中，R6獨立地為-OCHI2 。在實施例中，R6獨立地為-OCHF2 。在實施例中，R6獨立地為-OCH2 Cl。在實施例中，R6獨立地為-OCH2 Br。在實施例中，R6獨立地為-OCH2 I。在實施例中，R6獨立地為-OCH2 F。在實施例中，R6獨立地為-SF5 。在實施例中，R6獨立地為-N3 。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之芳烷基。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。在實施例中，R6獨立地為外源標記部分。
在實施例中，R6獨立地為未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之芳烷基。在實施例中，R6獨立地為未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R6獨立地為未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，經取代之R7（例如經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之雜烷基、經取代之環烷基、經取代之環烯基、經取代之環炔基、經取代之芳基、經取代之雜芳基、經取代之雜脂環基、經取代之芳烷基、經取代之雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之R7經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當R7經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當R7經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當R7經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，R7獨立地為氫。在實施例中，R7獨立地為鹵素。在實施例中，R7獨立地為-CCl3 。在實施例中，R7獨立地為-CBr3 。在實施例中，R7獨立地為-CF3 。在實施例中，R7獨立地為-CI3 。在實施例中，R7獨立地為-CHCl2 。在實施例中，R7獨立地為-CHBr2 。在實施例中，R7獨立地為-CHF2 。在實施例中，R7獨立地為-CHI2 。在實施例中，R7獨立地為-CH2 Cl。在實施例中，R7獨立地為-CH2 Br。在實施例中，R7獨立地為-CH2 F。在實施例中，R7獨立地為-CH2 I。在實施例中，R7獨立地為-CN。在實施例中，R7獨立地為-OH。在實施例中，R7獨立地為-NH2 。在實施例中，R7獨立地為-COOH。在實施例中，R7獨立地為-CONH2 。在實施例中，R7獨立地為-NO2 。在實施例中，R7獨立地為-SH。在實施例中，R7獨立地為-SO3 H。在實施例中，R7獨立地為-SO4 H。在實施例中，R7獨立地為-SO2 NH2 。在實施例中，R7獨立地為-NHNH2 。在實施例中，R7獨立地為-ONH2 。在實施例中，R7獨立地為-NHC(O)NHNH2 。在實施例中，R7獨立地為-NHC(O)NH2 。在實施例中，R7獨立地為-NHSO2 H。在實施例中，R7獨立地為-NHC(O)H。在實施例中，R7獨立地為-NHC(O)OH。在實施例中，R7獨立地為-NHOH。在實施例中，R7獨立地為-OCCl3 。在實施例中，R7獨立地為-OCF3 。在實施例中，R7獨立地為-OCBr3 。在實施例中，R7獨立地為-OCI3 。在實施例中，R7獨立地為-OCHCl2 。在實施例中，R7獨立地為-OCHBr2 。在實施例中，R7獨立地為-OCHI2 。在實施例中，R7獨立地為-OCHF2 。在實施例中，R7獨立地為-OCH2 Cl。在實施例中，R7獨立地為-OCH2 Br。在實施例中，R7獨立地為-OCH2 I。在實施例中，R7獨立地為-OCH2 F。在實施例中，R7獨立地為-SF5 。在實施例中，R7獨立地為-N3 。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之芳烷基。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。在實施例中，R7獨立地為外源標記部分。
在實施例中，R7獨立地為未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之芳烷基。在實施例中，R7獨立地為未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R7獨立地為未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，經取代之R8（例如經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之雜烷基、經取代之環烷基、經取代之環烯基、經取代之環炔基、經取代之芳基、經取代之雜芳基、經取代之雜脂環基、經取代之芳烷基、經取代之雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之R8經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當R8經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當R8經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當R8經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，R8獨立地為氫。在實施例中，R8獨立地為鹵素。在實施例中，R8獨立地為-CCl3 。在實施例中，R8獨立地為-CBr3 。在實施例中，R8獨立地為-CF3 。在實施例中，R8獨立地為-CI3 。在實施例中，R8獨立地為-CHCl2 。在實施例中，R8獨立地為-CHBr2 。在實施例中，R8獨立地為-CHF2 。在實施例中，R8獨立地為-CHI2 。在實施例中，R8獨立地為-CH2 Cl。在實施例中，R8獨立地為-CH2 Br。在實施例中，R8獨立地為-CH2 F。在實施例中，R8獨立地為-CH2 I。在實施例中，R8獨立地為-CN。在實施例中，R8獨立地為-OH。在實施例中，R8獨立地為-NH2 。在實施例中，R8獨立地為-COOH。在實施例中，R8獨立地為-CONH2 。在實施例中，R8獨立地為-NO2 。在實施例中，R8獨立地為-SH。在實施例中，R8獨立地為-SO3 H。在實施例中，R8獨立地為-SO4 H。在實施例中，R8獨立地為-SO2 NH2 。在實施例中，R8獨立地為-NHNH2 。在實施例中，R8獨立地為-ONH2 。在實施例中，R8獨立地為-NHC(O)NHNH2 。在實施例中，R8獨立地為-NHC(O)NH2 。在實施例中，R8獨立地為-NHSO2 H。在實施例中，R8獨立地為-NHC(O)H。在實施例中，R8獨立地為-NHC(O)OH。在實施例中，R8獨立地為-NHOH。在實施例中，R8獨立地為-OCCl3 。在實施例中，R8獨立地為-OCF3 。在實施例中，R8獨立地為-OCBr3 。在實施例中，R8獨立地為-OCI3 。在實施例中，R8獨立地為-OCHCl2 。在實施例中，R8獨立地為-OCHBr2 。在實施例中，R8獨立地為-OCHI2 。在實施例中，R8獨立地為-OCHF2 。在實施例中，R8獨立地為-OCH2 Cl。在實施例中，R8獨立地為-OCH2 Br。在實施例中，R8獨立地為-OCH2 I。在實施例中，R8獨立地為-OCH2 F。在實施例中，R8獨立地為-SF5 。在實施例中，R8獨立地為-N3 。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之芳烷基。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。在實施例中，R8獨立地為外源標記部分。
在實施例中，R8獨立地為未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之芳烷基。在實施例中，R8獨立地為未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R8獨立地為未經取代之(雜脂環基)烷基。
轉至圖1A，吾人看到在R2尺寸增大之情況下，如在60分鐘25℃反應之後所觀測，吾人觀測到最終反應產物中之dC降解百分比降低。吾人亦觀測到就起始物質消耗而言，具有至少兩個碳原子之R2部分比較小R2部分執行地更佳。
在一些組態中，具有3'-O-肟部分之核苷酸可具有結構：
Figure 02_image026
且具有3'-O-NH2 部分之核苷酸可具有結構：
Figure 02_image028
。
B可為核鹼基。R1可獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH。Q可獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸。R3及R4可獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。舉例而言，核苷酸之3'位處之部分可為醛肟（亦即，R3或R4中之一者為氫）或酮肟（R3或R4均不為氫）。
在實施例中，反應在水溶液中發生。在實施例中，核苷酸附接至與水溶液接觸之固體載體。
在實施例中，所產生之核苷酸包括去氧核苷酸。在實施例中，所產生之核苷酸包含：
Figure 02_image030
其中鹼基為核鹼基，且其中DNA獨立地為單股去氧核糖核酸或雙股去氧核糖核酸。在實施例中，鹼基之值為B。
在實施例中，試劑獨立地為以下中之一者：
Figure 02_image032
。試劑之額外個別實例包含圖1B中所列之分子及圖2中所列之分子。
本揭示案亦提供用於修飾核苷酸之方法。該方法可藉由以下來進行：使具有3'-O-肟部分之核苷酸與具有結構R2-ONH2 之試劑反應以產生具有3'-O-NH2 部分之核苷酸，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。在一些組態中，具有3'-O-肟部分之核苷酸可具有結構：
Figure 02_image034
且具有3'-O-NH2 部分之核苷酸可具有結構：
Figure 02_image036
。 B可為核鹼基。R1可獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH。Q可獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸。R3及R4可獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。舉例而言，核苷酸之3'位處之部分可為醛肟（亦即，R3或R4中之一者為氫）或酮肟（R3或R4均不為氫）。
本揭示案之方法或組合物可包含各種核苷酸中之任一者。核苷酸可根據期望為天然核苷酸、核苷酸類似物或經修飾核苷酸以適合本文所闡述之特定應用或組態。視情況，核苷酸具有含氮鹼基、五碳糖及磷酸基，其中與天然核苷酸相比，核苷酸之任何部分可經修飾、移除及/或置換。舉例而言，核苷酸之5'氧不需要具有磷酸酯部分且可替代地經諸如二甲氧基三苯甲基（DMT）部分之外源部分保護。若期望，核苷酸之鹼基部分中之反應性原子可經外源部分保護。本文所揭示之方法及組合物常常包括胞嘧啶鹼基，且如例如藉由圖1A中之點DRT 1所呈現，胞嘧啶鹼基以比先前技術中之相當方法或組合物更高之速率以未經降解或未經修飾之形式保存。
用於本文中之組合物、方法、設備或系統中之核苷酸可包含在將類似物併入引子中之後可逆地防止引子3'端處之後續核苷酸併入的終止子。舉例而言，U.S. 7,544,794（2009年6月9日公開）、U.S. 8,034,923（2011年10月11日公開）及US 10,472,383（2019年11月12日公開）（該等案中之各者之揭示內容分別以全文引用之方式併入本文中）描述其中3'-OH基團經3'-ONH2 部分置換之可逆終止子。此等可逆終止子對藉由諸如聚合酶及接合酶之核酸酶進行之修飾具有抗性以使得當將其併入時其防止3'阻斷位處之後續鹼基添加，藉此終止核酸股之延伸。胺基部分可藉由亞硝酸（HONO）自核苷酸（例如當核苷酸處於引子3'端處時）中移除，藉此對核苷酸進行去阻斷。經去阻斷核苷酸具有在稱為併入反應或延伸反應之反應中可受聚合酶作用以使得3'氧與另一核苷酸之5'磷酸酯形成共價鍵的3'OH。經由去阻斷步驟自核苷酸中移除胺基部分可類似地在併入或延伸反應中使核苷酸受接合酶作用以使得3'氧與寡核苷酸之5'磷酸酯形成共價鍵。
阻斷部分之數目與本文中之揭示內容一致。一些阻斷部分共用以下特徵：其不阻止將其所結合之核苷酸藉由核苷酸聚合酶在其5'端處併入至可用3' OH部分，以便併入阻斷進一步延伸之核苷酸。一般而言，諸如保護部分之較大部分常常太大而難以藉由核酸聚合酶併入。在實施例中，3'可逆終止子及3'阻斷部分包含-ONH2 、-ONHCH3 、-OCH2 N3 及-ONHCOCH3 。在實施例中，3'阻斷部分為-ONH2 。在實施例中，3'阻斷部分為-ONHCH3 。在實施例中，3'阻斷部分為-OCH2 N3 。在實施例中，3'阻斷部分為-ONHCOCH3 。在實施例中，3'阻斷部分為3'-O-肟部分。在實施例中，3'可逆終止子部分為3'-O-肟部分。
本揭示案提供用於合成諸如具有3'-ONH2 部分之經可逆地終止之核苷酸之經可逆地終止之核苷酸的新型且適用試劑及方法。該等經可逆地終止之核苷酸可藉由使具有3'-O-肟部分之前驅體核苷酸與具有結構R2-ONH2 之烷氧基胺試劑反應來合成。特別適用之試劑包含其中R2為除氫以外之部分之試劑。舉例而言，R2可為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。特別適用之R2部分包含例如-CH2 CH3 、-CH2 CHCH2 及-C(CH3 )3 。在實施例中，R2係如本文中，包含實施例、申請專利範圍及圖式中所描述。因此，適用烷氧基胺試劑可包含以下分子中之一或多者：
Figure 02_image038
，以及圖1A或圖2中所列之分子中之任一者。
可對上文R2部分作出各種取代中之任一者。舉例而言，-CH2 CH3 或-CH2 CHCH2 部分中之氫中之一或多者可經羰基（-CO2 ）、醇（-OH）、胺（-NH2 ）或鹵素（例如溴、氟、氯或碘）取代。類似地，-C(CH3 )3 部分之甲基中之一或多者中的氫中之一或多者可以此方式經取代。在特定應用中，由此等類型之取代提供之額外空間體積可有益地促進在修飾核苷酸之核鹼基部分之不合需要之副反應內核苷酸的3'-O-肟部分轉化成3'-O-NH2 部分。
在實施例中，R2獨立地為
Figure 02_image040
Figure 02_image042
Figure 02_image044
。
在實施例中，R2獨立地為
Figure 02_image046
。在實施例中，R2獨立地為
Figure 02_image048
。在實施例中，R2獨立地為
Figure 02_image050
。在實施例中，R2獨立地為
Figure 02_image052
。在實施例中，R2獨立地為
Figure 02_image054
。在實施例中，R2獨立地為
Figure 02_image056
。在實施例中，R2獨立地為
Figure 02_image058
。在實施例中，R2獨立地為
Figure 02_image060
。在實施例中，R2獨立地為
Figure 02_image062
。在實施例中，R2獨立地為
Figure 02_image064
。在實施例中，R2獨立地為
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。在實施例中，R2獨立地為
Figure 02_image068
。在實施例中，R2獨立地為
Figure 02_image070
。在實施例中，R2獨立地為
Figure 02_image072
。在實施例中，R2獨立地為
Figure 02_image074
。
在本文所闡述之方法及組合物之一些組態中，式R2-ONH2 中之R2可為CH3 。然而，R2不必為CH3 。更確切而言，R2可為比甲基更高階之烷基（亦即R2可具有超過一個碳）。因此，R2可為除甲基以外之烷基。在實施例中，R2不為-CH3 。在實施例中，R2不為氫。在實施例中，R2不為氫或-CH3 。在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2 (R6)、經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）、經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）或經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R2具有大於甲基之分子量。在實施例中，R2具有大於乙基之分子量。在實施例中，R2之分子量大於36 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於57 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於100 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於200 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於300 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於400 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於500 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於600 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於700 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於800 g/mol。在實施例中，R2之分子量大於900 g/mol。在實施例中，R2之分子量小於或等於1000 g/mol。在實施例中，R2之分子量小於1000 g/mol。儘管不希望受機理限制，但咸信具有比氫及甲基更大之空間體積之R2部分產生與較小部分相比經改善之合成結果，且對核酸及核苷酸產生較少不合需要之修飾。參見下文實例1之結果。在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。在實施例中，R2不為未經取代之甲基。在實施例中，R2不為未經取代之乙基。在實施例中，R2不為未經取代之丙基。
經由本文中之揭示內容，吾人觀測到以下內容。如本文所揭示之R2部分比驅動反應幾乎完成中之先前技術試劑執行地實質上更佳。舉例而言，在於25℃下執行之60分鐘反應中，吾人觀測到如本文所揭示之R2部分展現至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或大於99%核苷酸起始物質消耗之起始物質消耗，而先前技術方法達成小於92%。
類似地，吾人觀測到在R2尺寸增大之情況下，吾人看到諸如dC鹼基之核苷酸降解量降低，以使得在dC降解不超過6%、不超過5%、不超過4%、不超過3%、不超過2%、不超過1%或小於1%之情況下如本文所揭示之R2部分達到上文所提及之完成百分比。
類似地，在一些情況下，吾人看到R2尺寸與諸如dC降解之核苷酸還原之間之相關性。因此，本文揭示分子量為以下值中之至少任一者之R2部分：24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、39,50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或大於100。
在實施例中，R2部分在一些情況下受溶解度限制以使得在實施例中較大部分變得不可溶。因此，在實施例中，R2部分不同地限於以下分子量中之至多任一者：1000、900、800、700、650、600、550、500、450、400、350、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100或小於100 g/mol。
R2部分可包括單獨或組合之多個成分以傳達本文所揭示之效益。一些R2部分不同地包括至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個或超過6個碳核。類似地，一些R2包括以下中之至少一者：至少1個氮核、至少一個矽核、至少一個磷核、至少一個氟核或至少另一成分。在一些情況下，R2部分經部分或完全氟化或經部分或完全氫化。在一些情況下，R2部分包括至少一個組分以促進溶解度。
具有其中R2為-CH2 CH3 、-CH2 CHCH2 及-C(CH3 )3 之結構R2-ONH2 之烷氧基胺試劑可溶於水溶液中，使其特別適用於核苷酸合成及修飾。亦可使用提供水溶解度之其他R2部分。在一些組態中，合成可使用不可溶或僅微溶於水溶液中之烷氧基胺試劑來進行。舉例而言，合成可在非水溶液中或在藉由水性且有機溶劑混合物形成之液體中進行。例示性可用於非水性液體或部分水性液體中之烷氧基胺試劑包含具有苯基部分及/或鹵素部分之烷氧基胺試劑，諸如：
Figure 02_image076
。可替代地，提供水溶解度之一些部分可包含羥基、胺、羧基或其他親水性或極性部分。
上文烷氧基胺試劑在胺氧基部分中具有一級胺。烷氧基胺試劑可在胺氧基部分中具有二級胺。舉例而言，烷氧基胺試劑可具有結構
Figure 02_image078
。
在本文所闡述之方法或組合物之特定組態中，具有結構R2-ONH2 之烷氧基胺試劑可附接至固體載體。在實施例中，包括結構R2-ONH2 之試劑附接至與水溶液接觸之固體載體。舉例而言，試劑可藉由用鍵取代氫中之一者經由氮原子附接至固體載體。使用固體載體附接之試劑之效益在於反應產生固體載體附接之產物，可藉由將固體載體與發生反應之處之液體分離來自反應物及其他反應組分中純化該產物。將試劑附接至固體載體亦可經由與R2部分鍵結之鍵發生。
一般而言，用於使用本文所闡述之烷氧基胺試劑合成具有3'-ONH2 部分之核苷酸之溶液的pH可為4至8。當pH在此範圍內降低時，將核苷酸之3'-O-肟部分轉化成3'-O-NH2 部分之速率提昇。然而，當pH接近範圍下端值時，對核苷酸之其他部分造成不合需要之修飾之副反應風險亦增加。因此，本文所闡述之合成反應之pH可介於5至8、6至8或7至8範圍內。若期望，pH可介於4至7、4至6或4至5以及5至7、5至6或6至7或本文所揭示之具有下pH值及上pH值之範圍所涵蓋之任何上範圍值及下範圍值的範圍內。類似地，本文所闡述之合成反應之pH可為至少4、至少5、至少6、至少7或不超過8、不超過7、不超過6或不超過5。
具有除3'-O-肟或3'-ONH2 以外之可逆終止子之核苷酸可用於本文方法或組合物中。舉例而言，當期望阻斷引子群以使得可選擇性地對一或多個引子亞群進行去阻斷時，具有不同類型之可逆終止子之核苷酸可為適用的。更具體言之，可用3'-O-肟或3'-ONH2 部分阻斷第一引子亞群，且可用第二類型之阻斷部分阻斷第二群。第二類型之阻斷部分可有利地藉由與本文所闡述之去阻斷方法正交之用於3'-O-肟或3'-ONH2 部分之方法來去阻斷。正交方法為不實質上交叉反應之方法。因此，各別地，3'-O-肟或3'-ONH2 部分可藉由不實質上對第二阻斷部分進行去阻斷之方法來去阻斷，且第二阻斷部分可藉由不實質上對3'-O-肟或3'-ONH2 部分進行去阻斷之方法來去阻斷。
其他類型之可逆終止子部分及其去阻斷方法之實例包含但不限於以下內容。適用可逆終止子部分包含可經化學上去阻斷之可逆終止子部分，諸如可藉由膦移除之3'疊氮基甲基、可藉由鹼基水解或金屬催化劑去阻斷之酯及美國專利第7,427,673號、第7,414,116號、第7,057,026號、第7,544,794號或第8,034,923號；或PCT公開案WO 91/06678或WO 07/123744中所闡述之其他可逆終止子部分，該等案中之各者以引用之方式併入本文中。其他適用可逆終止子包含可藉由光移除之3'光反應性部分，諸如美國專利第7,964,352號、第9,399,798號及第10,041,115號（該等案中之各者以全文引用之方式併入本文中）中所描述之3'光反應性部分；或以酶方式可移除之部分，諸如可藉由磷酸酶移除之3'磷酸酯部分，諸如美國專利第10,378,051號（該案以全文引用之方式併入本文中）中所闡述之3'磷酸酯部分。
具有不可逆終止子之核苷酸可用於本文方法或組合物中。舉例而言，當期望阻斷引子群以使得第一引子亞群可經去阻斷且第二亞群對去阻斷具有抗性時，具有不可逆終止子之核苷酸可為適用的。更具體言之，可用3'-ONH2 部分阻斷第一引子亞群，且可用不可逆阻斷部分阻斷第二群。不可逆核苷酸包含2', 3'-雙去氧核苷酸（ddNTP，諸如ddGTP、ddATP、ddTTP、ddCTP）。雙去氧核苷酸缺乏dNTP之3'-OH基團，否則將參與聚合酶介導或接合酶介導之引子延伸。因此，3'位具有代替天然羥基部分之氫部分。
用於本文方法及組合物之特定組態以例如參與穩定三元複合物之核苷酸不必包含防止在將類似物併入引子中之後引子3'端處之後續核苷酸併入的阻斷基（例如可逆終止子）。此種情況可為是否使用具有諸如可逆終止子之阻斷基團之一或多個核苷酸進行延伸步驟的情況。
作為本文組合物或例如在合成程序期間或在定序方法期間經由本文方法產生之組合物之成分之核苷酸可視情況包含外源標記。經外源性標記之核苷酸可包含可逆或不可逆終止子部分，經外源性標記之核苷酸可為非可併入的，經外源性標記之核苷酸可缺乏終止子部分，經外源性標記之核苷酸可為可併入的，或經外源性標記之核苷酸可為可併入的及未經終止的。經外源性標記之核苷酸可為核酸中之部分，例如為引子之3'核苷酸。經外源性標記之核苷酸可在用於與未經標記之聚合酶一起形成穩定三元複合物時特別適用於Sequencing By BindingTM 方法中。經外源性標記之核苷酸可在藉由聚合酶併入引子中時適用於合成定序方法中。
適用外源標記之實例包含但不限於放射性標記部分、發光團部分、螢光團部分、量子點部分、發色團部分、酶部分、電磁自旋標記部分、奈米粒子光散射部分及本領域中已知之各種其他信號生成部分中之任一者。合適酶部分包含例如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶。例示性螢光團標記包含但不限於對甲胺基苯酚（rhodol）；試鹵靈（resorufin）；香豆素；二苯并哌喃；吖啶；螢光素；玫瑰紅；地衣紅質；矢車菊色素；苯二甲醛；萘胺；螢光胺；苯并
Figure 02_image011
二唑；芪；芘；吲哚；硼聚氮雜二環戊二烯并苯（borapolyazaindacene）；喹唑啉酮；曙紅；赤藻紅；孔雀綠；CY染料（GE Biosciences），包含Cy3（及其衍生物）、Cy5（及其衍生物）及Cy7（及其衍生物）；DYOMICS及DYLIGHT染料（Dyomics），包含DY-547、DY-630、DY-631、DY-632、DY-633、DY-634、DY-635、DY-647、DY-649、DY-652、DY-678、DY-680、DY-682、DY-701、DY-734、DY-752、DY-777及DY-782；螢光黃；CASCADE BLUE；TEXAS RED；BODIPY（硼-二吡咯亞甲基）（分子探針（Molecular Probes））染料，包含BODIPY 630/650及BODIPY 650/670；ATTO染料（Atto-Tec），包含ATTO 390、ATTO 425、ATTO 465、ATTO 610 611X、ATTO 610、ATTO 635；ALEXA FLUORS，包含ALEXA FLUOR 633、ALEXA FLUOR 647、ALEXA FLUOR 660、ALEXA FLUOR 700、ALEXA FLUOR 750及ALEXA FLUOR 680（分子探針）；DDAO（7-羥基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮或其任何衍生物）（分子探針）；QUASAR染料（Biosearch）；IRDYES染料（LiCor），包含IRDYE 700DX（NHS酯）、IRDYE 800RS（NHS酯）及IRDYE 800CW（NHS酯）；EVOBLUE染料（Evotech Biosystems）；JODA 4染料（應用生物系統（Applied Biosystems））；HILYTE染料（AnaSpec）；MR121及MR200染料（羅氏（Roche））；Hoechst染料33258及33242（英傑（Invitrogen））；FAIR OAKS RED（分子裝置（Molecular Devices））；SUNNYVALE RED（分子裝置）；LIGHT CYCLER RED（羅氏）；EPOCH（Glen Research）染料，包含EPOCH REDMOND RED、EPOCH YAKIMA YELLOW、EPOCH GIG HARBOR GREEN；Tokyo綠（M. Kamiya等人, 2005 《德國應用化學（Angew.Chem. Int. Ed. ）》44:5439-5441）；及CF染料，包含CF 647及CF555（Biotium）；以及本領域中已知之其他螢光團標記，諸如《螢光光譜原理（Principles of Fluorescence Spectroscopy）》, Joseph R. Lakowicz（編者）, 普萊南出版公司（Plenum Pub Corp）, 第2版（1999年7月）及Richard P. Hoagland之第6版《分子探針手冊（Molecular Probes Handbook）》中所描述之螢光團標記。在實施例中，外源標記為可偵測部分。在實施例中，外源標記為可偵測試劑。
外源標記可經由連接子附接至核苷酸或核酸。存在於核苷酸或核酸中之連接子能但不必可裂解。舉例而言，外源標記可經由連接子附接至核苷酸或核酸之核鹼基，且連接子可對具有式R2-ONH2 之烷氧基胺試劑具有惰性且/或連接子可對亞硝酸（HONO）具有惰性。連接子可對本文所闡述之方法中所用之條件穩定以使得連接子之共價結構在本文所闡述之方法之任何特定步驟期間或在整個全部步驟中不變。可替代地，將外源標記附接至核鹼基之連接子可對具有式R2-ONH2 之烷氧基胺試劑具反應性以使得反應使外源標記與核鹼基分離。舉例而言，連接子可包含具有以下結構之部分：
Figure 02_image080
其中R3、R4或R5中之至少一者直接或經由連接子之第二部分附接至外源標記，且其中R3、R4或R5中之至少一者直接或經由連接子之第三部分附接至核鹼基。另一適用連接子部分為腙。舉例而言，連接子可包含具有以下結構之部分：
Figure 02_image082
其中R3、R4或R5中之至少一者直接或經由連接子之第二部分附接至外源標記，且其中R3、R4或R5中之至少一者直接或經由連接子之第三部分附接至核鹼基。此等連接子部分可與R2-ONH2 分子反應以自核鹼基裂解外源標記。在實施例中，B、鹼基、R3、R4、R5、R6、R7或R8可獨立地包含外源標記。在實施例中，B、鹼基、R3、R4、R5、R6、R7或R8可獨立地包含標記。在實施例中，B、鹼、R3、R4、R5、R6、R7或R8可獨立地包含可偵測部分。在實施例中，B、鹼、R3、R4、R5、R6、R7或R8可獨立地包含螢光團部分。在實施例中，R3、R4、R5、R6、R7或R8獨立地為外源標記。在實施例中，R3、R4、R5、R6、R7或R8獨立地為標記。在實施例中，R3、R4、R5、R6、R7或R8獨立地為可偵測部分。在實施例中，R3、R4、R5、R6、R7或R8獨立地為螢光團部分。在實施例中，阻斷部分為外源標記部分。在實施例中，阻斷部分包含外源標記部分。在實施例中，保護部分為外源標記部分。在實施例中，保護部分包含外源標記部分。
R5獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體或外源標記部分。
在實施例中，經取代之R5（例如經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之環烷基、經取代之環烯基、經取代之環炔基、經取代之芳基、經取代之雜芳基、經取代之雜脂環基、經取代之芳烷基、經取代之雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之R5經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當R5經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當R5經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當R5經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，R5獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。在實施例中，R5獨立地為外源標記部分。
在替代實施例中，核苷酸、核酸、本文所闡述之方法之反應物或本文所闡述之方法之產物可缺乏外源標記。舉例而言，核酸、核苷酸、聚合酶及/或穩定三元複合物可缺乏一個、若干或全部本文或引用且併入本文中之參考文獻中所描述之外源標記。舉例而言，未經標記之三元複合物可基於諸如質量、電荷、本質光學特性或其類似特性之穩定三元複合物之本質特性來加以偵測。例示性用於偵測未經標記之三元複合物之方法闡述於共同擁有之美國專利申請公開案第2017/0191125 A1號或第2017/0022553 A1號或美國專利第10,246,744號中，該等案中之各者以引用之方式併入本文中。
在實施例中，核鹼基包含外源標記部分（例如經由連接子、螢光團部分、用於抗體辨識之抗原連接至核鹼基）。在實施例中，核鹼基經外源標記部分（例如經由連接子、螢光團部分、用於抗體辨識之抗原連接至核鹼基）取代。在實施例中，核鹼基經由連接子共價鍵結至外源標記部分。在實施例中，連接子包含
Figure 02_image084
。在實施例中，連接子包含
Figure 02_image086
。在實施例中，連接子為
Figure 02_image088
。在實施例中，連接子為
Figure 02_image090
。L3及L5各自獨立地為共價連接子。在實施例中，L5鍵結至核鹼基。在實施例中，L3鍵結至核鹼基。在實施例中，L5鍵結至外源標記部分。在實施例中，L3鍵結至外源標記部分。在實施例中，L5為-L5A-L5B-L5C-L5D-L5E-。在實施例中，L3為-L3A-L3B-L3C-L3D-L3E-。在實施例中，將核鹼基連接至外源標記部分之連接子為-L6-L7-L8-L9-L10-。L3A、L3B、L3C、L3D、L3E、L5A、L5B、L5C、L5D、L5E、L6、L7、L8、L9及L10獨立地為鍵、-NH-、-O-、-S-、-SO2 -、-C(O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、-C(O)O-、-OC(O)-、-SO2 NH-、-NHSO2 -、經取代或未經取代之伸烷基（例如C1 -C8 、C1 -C6 或C1 -C4 ）、經取代或未經取代之伸烯基（例如C2 -C8 、C2 -C6 或C2 -C4 ）、經取代或未經取代之伸炔基（例如C2 -C8 、C2 -C6 或C2 -C4 ）、經取代或未經取代之伸雜烷基（例如2至8員、2至6員或2至4員）、經取代或未經取代之伸環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之伸環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之伸環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之伸芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或伸苯基）、經取代或未經取代之伸雜芳基（例如5至10員、5至9員或5至6員）、經取代或未經取代之伸雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）、經取代或未經取代之伸芳烷基、經取代或未經取代之伸雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)伸烷基。 在實施例中，L3經取代。在實施例中，L3未經取代。在實施例中，經取代之L3（例如經取代之共價連接子）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之L3經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當L3經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當L3經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當L3經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，L5經取代。在實施例中，L5未經取代。在實施例中，經取代之L5（例如經取代之共價連接子）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之L5經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當L5經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當L5經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當L5經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，經取代之L3A（例如經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸芳基、經取代之伸雜芳基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳烷基、經取代之伸雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)伸烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之L3A經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當L3A經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當L3A經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當L3A經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，經取代之L3B（例如經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸芳基、經取代之伸雜芳基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳烷基、經取代之伸雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)伸烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之L3B經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當L3B經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當L3B經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當L3B經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，經取代之L3C（例如經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸芳基、經取代之伸雜芳基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳烷基、經取代之伸雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)伸烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之L3C經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當L3C經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當L3C經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當L3C經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，經取代之L3D（例如經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸芳基、經取代之伸雜芳基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳烷基、經取代之伸雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)伸烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之L3D經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當L3D經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當L3D經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當L3D經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，經取代之L3E（例如經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸芳基、經取代之伸雜芳基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳烷基、經取代之伸雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)伸烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之L3E經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當L3E經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當L3E經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當L3E經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，經取代之L5A（例如經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸芳基、經取代之伸雜芳基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳烷基、經取代之伸雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)伸烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之L5A經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當L5A經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當L5A經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當L5A經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，經取代之L5B（例如經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸芳基、經取代之伸雜芳基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳烷基、經取代之伸雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)伸烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之L5B經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當L5B經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當L5B經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當L5B經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，經取代之L5C（例如經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸芳基、經取代之伸雜芳基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳烷基、經取代之伸雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)伸烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之L5C經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當L5C經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當L5C經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當L5C經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，經取代之L5D（例如經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸芳基、經取代之伸雜芳基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳烷基、經取代之伸雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)伸烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之L5D經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當L5D經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當L5D經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當L5D經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，經取代之L5E（例如經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸芳基、經取代之伸雜芳基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳烷基、經取代之伸雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)伸烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之L5E經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當L5E經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當L5E經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當L5E經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，經取代之L6（例如經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸芳基、經取代之伸雜芳基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳烷基、經取代之伸雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)伸烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之L6經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當L6經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當L6經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當L6經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，經取代之L7（例如經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸芳基、經取代之伸雜芳基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳烷基、經取代之伸雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)伸烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之L7經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當L7經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當L7經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當L7經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，經取代之L8（例如經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸芳基、經取代之伸雜芳基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳烷基、經取代之伸雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)伸烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之L8經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當L8經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當L8經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當L8經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，經取代之L9（例如經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸芳基、經取代之伸雜芳基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳烷基、經取代之伸雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)伸烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之L9經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當L9經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當L9經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當L9經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
在實施例中，經取代之L10（例如經取代之伸烷基、經取代之伸烯基、經取代之伸炔基、經取代之伸雜烷基、經取代之伸環烷基、經取代之伸環烯基、經取代之伸環炔基、經取代之伸芳基、經取代之伸雜芳基、經取代之伸雜脂環基、經取代之伸芳烷基、經取代之伸雜芳烷基及/或經取代之(雜脂環基)伸烷基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之L10經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當L10經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當L10經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當L10經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
可替代地，在本文中例如用於延伸引子或用於參與三元複合物形成之核苷酸可缺乏外源標記（亦即，核苷酸可「未經標記」）。未經標記之核苷酸可包含諸如3'-ONH2 部分之可逆終止子或不可逆終止子部分。未經標記之核苷酸可為非可併入的，未經標記之核苷酸可缺乏終止子部分，未經標記之核苷酸可為可併入的，或未經標記之核苷酸可為可併入的及未經終止的。舉例而言，當使用聚合酶上之標記以偵測穩定三元複合物時或當使用無標記偵測時，未經標記之核苷酸可適用於Sequencing By BindingTM （SBBTM ）方法中。未經標記之核苷酸亦可適用於SBBTM 方法或本文所闡述之其他方法之延伸步驟。應理解，核苷酸之部分或功能不存在係指核苷酸不具有該功能或部分。然而，亦應理解可在本文所闡述之方法或組合物中特定地省略本文所闡述之核苷酸或其類似物之功能或部分或本領域中已知之核苷酸或其類似物之其他功能或部分中的一或多者。
核苷酸之核鹼基可為嘌呤或嘧啶。舉例而言，核鹼基可為諸如腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之典型或一級核鹼基。諸如與一級或典型核鹼基中之一或多者互補之核鹼基之其他核鹼基可為適用的。在實施例中，核鹼基與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互補。可使用經修飾之核苷酸，例如甲基化核鹼基，諸如5-甲基胞嘧啶或7-甲基鳥苷；或羥化及甲基化核鹼基，諸如5-羥甲基胞嘧啶。其他適用核鹼基包含例如次黃嘌呤、黃嘌呤假尿苷、二氫尿苷、肌苷、異鳥嘌呤或異胞嘧啶。異鳥嘌呤及異胞嘧啶可為特別適用的，此係因為其與彼此互補，且當與兩個天然鹼基對腺嘌呤:胸腺嘧啶及胞嘧啶:鳥嘌呤相比時對彼此具有特異性以便形成第三鹼基對。特別適用之核鹼基為7-去氮鳥嘌呤，該7-去氮鳥嘌呤可為將標記附接至核鹼基之合成程序提供適宜核鹼基，同時亦能夠在經標記核鹼基存在於核酸股中時與胞嘧啶配對。在實施例中，核鹼基獨立地為5-甲基胞嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤假尿苷、二氫尿苷、肌苷、異鳥嘌呤、異胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤或7-甲基鳥苷。在實施例中，核鹼基（例如B、鹼基）包含視情況直接鍵結至核鹼基或視情況經由連接子（例如L5）鍵結之外源標記（例如可偵測部分、螢光團部分、抗原）。
核苷酸之糖部分可為去氧核糖、核糖或其類似物。舉例而言，核苷酸可具有以下結構中之一個：
Figure 02_image092
其中R1為H，B為核鹼基且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。此去氧核糖核苷酸可呈單體形式，由此Q為氫、外源保護部分或至少一磷酸酯（例如單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或大於三磷酸酯，前述磷酸酯中之任一者可經取代或未經取代）。可替代地，核苷酸可為例如其中Q為去氧核糖核酸（DNA）之核酸部分。DNA可為單股或雙股的。在其中DNA為雙股之組態中，核苷酸可為例如引子3'端處之引子股之部分，或核苷酸部分可在模板股中。核苷酸可為作為由具有不同主鏈之股形成之混合雜交體之核酸部分，該混合雜交體諸如DNA:RNA雜交體、DNA:PNA雜交體、RNA:PNA雜交體或其類似雜交體（其中PNA為肽核酸）。
可替代地，核苷酸之糖部分可具有以下結構中之一個：
Figure 02_image094
其中R1為OH，B為核鹼基且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。此核糖核苷酸可呈單體形式，由此Q為至少一磷酸酯（例如單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或大於三磷酸酯，前述磷酸酯中之任一者可經取代或未經取代）。可替代地，核苷酸可為例如其中Q為核糖核酸（RNA）之核酸部分。RNA可為單股或雙股的。在其中RNA為雙股之組態中，核苷酸可為例如引子3'端處之引子股之部分，或核苷酸部分可在模板股中。核苷酸可為作為由具有不同主鏈之股形成之混合雜交體之核酸部分，該混合雜交體諸如DNA:RNA雜交體、DNA:PNA雜交體、RNA:PNA雜交體或其類似雜交體（其中PNA為肽核酸）。
用於本文方法或組合物中之核酸可為諸如基因體DNA、合成DNA、經擴增DNA、互補DNA（cDNA）或其類似DNA之DNA。亦可使用諸如mRNA、核糖體RNA、tRNA或其類似RNA之RNA。本文亦可使用諸如PNA或本領域中已知之其他核酸類似物之核酸類似物。核酸引子、探針或模板可為DNA、RNA或其類似物。
核酸可為單股或雙股的。雙股核酸可具有單股切口或間隙。在雙股之情況下，核酸分子可為鈍端的或具有突出端（例如5'突出端或3'突出端）。該等核酸分子可藉由本領域中已知之任何化學或酶方法產生。該等方法之實例包含活體內或活體外胺基磷酸酯合成或複製。本揭示案之核酸可為線性的（例如具有游離3'端及5'端）或其可為圓形的（例如缺乏5'端及3'端）。
去氧核糖核酸（DNA）為特別適用之核酸。DNA可為單股或雙股去氧核糖核酸。去氧核糖核苷酸通常藉由磷酸二酯鍵接合，儘管在一些情況下，可具有替代主鏈之核酸類似物包含在內，該等替代主鏈諸如磷醯胺（例如Beaucage,等人, 《四面體（Tetrahedron ）》, 49 (10):1925 (1993)及其中之參考文獻；Letsinger, 《有機化學期刊（J. Org.Chem .）》, 35:3800 (1970)；Sprinzl,等人, 《歐洲生物化學期刊（Eur.J. Biochem .）》, 81:579 (1977)；Letsinger,等人, 《核酸研究（Nucl.Acids Res .）》, 14:3487 (1986)；Sawai,等人, 《化學快報（Chem. Lett .）》, 805 (1984), Letsinger,等人, 《美國化學會志（J. Am. Chem. Soc .）》, 110:4470 (1988)；及Pauwels,等人, 《化學學報（Chemica Scripta ）》, 26:141 (1986)）、硫代磷酸酯（例如Mag,等人, 《核酸研究》, 19:1437 (1991)；及美國專利第5,644,048號）、二硫代磷酸酯（例如Briu,等人, 《美國化學會志》, 111:2321 (1989)）、O-甲基亞磷醯胺鍵（例如Eckstein, 《寡核苷酸及類似物：實用方法（Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach）》, 牛津大學出版社（Oxford University Press））以及肽核酸（PNA）主鏈及鍵（例如Egholm, 《美國化學會志》, 114:1895 (1992)；Meier,等人, 《化學國際英文版（Chem. Int. Ed. Engl .）》, 31:1008 (1992)；Nielsen, 《自然（Nature ）》, 365:566 (1993)；Carlsson,等人, 《自然》, 380:207 (1996)）。其他類似核酸包含具有以下之類似核酸：正主鏈（例如Denpcy,等人, 《美國國家科學院院刊（Proc, Natl. Acad. Sci. USA ）》, 92:6097 (1995)）；非離子主鏈（例如美國專利第5,386,023號；第5,637,684號；第5,602,240號；第5,216,141號；及第4,469,863號；Kiedrowshi,等人, 《應用化學國際英文版（Angew.Chem. Intl. Ed. English）》, 30:423 (1991)；Letsinger,等人, 《美國化學會志》, 110:4470 (1988)；Letsinger,等人, 《核苷及核苷酸（Nucleosides & Nucleotides ）》, 13:1597 (1994)；第2及3章, 《ASC研討會580系列（ASC Symposium Series 580）》, 《反義研究中之碳水化合物修飾（Carbohydrate Modifications in Antisense Research）》, 編者Y. S. Sanghui及P. Dan Cook；Mesmaeker,等人, 《生物有機與藥物化學快報（Bioorganic & Medicinal Chem. Lett .）》, 4:395 (1994)；Jeffs,等人, 《生物分子NMR期刊（J. Biomolecular NMR ）》, 34:17 (1994)；《四面體快報（Tetrahedron Lett .）》, 37:743 (1996)）；及非核糖主鏈，包含例如美國專利第5,235,033號及第5,034,506號以及第6及7章, 《ASC研討會580系列》, 《反義研究中之碳水化合物修飾》, 編者Y. S. Sanghui及P. Dan Cook中所描述之非核糖主鏈。含有一或多個碳環糖之核酸亦包含在核酸定義內（例如Jenkins,等人, 《化學學會評論（Chem. Soc. Rev .）》, (1995) 第169 176頁）。若干核酸類似物描述於Rawls, 《化學化工新聞（C & E News）》, 1997年6月2日, 第35頁中。此等參考文獻全部皆特此以引用之方式明確地併入。核糖-磷酸酯主鏈之此等修飾可存在以促進諸如標記之外源部分之添加，或以增加該等分子在生理環境中之穩定性及半衰期。另外，可製造天然存在之核酸及類似物之混合物。可替代地，可製造不同核酸類似物之混合物及天然存在之核酸類似物及非天然類似物之混合物。
可衍生核酸之例示性生物體包含例如來自以下之生物體：哺乳動物，諸如嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、有蹄類動物、馬、綿羊、豬、山羊、母牛、貓、狗、靈長類動物、人類或非人類靈長類動物；植物，諸如阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana ）、玉米、高粱、燕麥、小麥、稻米、芥花或大豆；海藻，諸如萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii ）；線蟲，諸如秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans ）；昆蟲，諸如黑腹果蠅（Drosophila melanogaster ）、蚊蟲、果蠅、蜜蜂或蜘蛛；魚，諸如斑馬魚；爬行動物；兩棲動物，諸如蛙或有爪蟾蜍（Xenopus laevis ）；盤基網柄菌（Dictyostelium discoideum ）；真菌，諸如肺炎肺囊蟲（Pneumocystis carinii ）、虎河魨（Takifugu rubripes ）、酵母、釀酒酵母（Saccharamoyces cerevisiae ）或粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）；頂複門囊泡蟲病原體（aplicomplexan alveolate pathogen），諸如惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum .）；環境樣品；或任何其他真核、真細菌或古細菌源。核酸亦可源自真細菌原核生物，諸如細菌、大腸桿菌（Escherichia coli ）、葡萄球菌（Staphylococci ）或肺炎黴漿菌（Mycoplasma pneumoniae ）；古細菌原核生物；病毒，諸如C型肝炎病毒、冠狀病毒或人類免疫缺乏病毒；或類病毒。核酸可源自上文生物體之均質培養物或群體或可替代地源自例如群落或生態系統中之若干不同生物體之集合。核酸可使用本領域中已知之方法來分離，該等方法包含例如Sambrook等人, 《分子選殖：實驗室手冊（第3版）（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition ）》, 紐約冷泉港實驗室（Cold Spring Harbor Laboratory, New York） (2001)或Ausubel等人, 《分子生物學現行規範（Current Protocols in Molecular Biology ）》, 馬里蘭州巴爾的摩之約翰威立（John Wiley and Sons, Baltimore, Md.）(1998)中所描述之方法，該等文獻中之各者以引用之方式併入本文中。細胞、組織、生物流體、蛋白質及其他樣品可自此等生物體獲得且用於本文所闡述之組合物、設備或方法中。
核酸可由諸如基因體分離、基因體斷裂、基因選殖及/或擴增之製備方法獲得。核酸可由諸如聚合酶鏈反應（PCR）、滾環擴增（RCA）、多重置換擴增（MDA）或其類似擴增技術之擴增技術獲得。擴增亦可使用Sambrook等人, 《分子選殖：實驗室手冊（第3版）》, 紐約冷泉港實驗室(2001)或Ausubel等人, 《分子生物學現行規範》, 馬里蘭州巴爾的摩之約翰威立(1998)中所闡述之方法來進行，該等文獻中之各者以引用之方式併入本文中。
在本文所闡述之方法及組合物之一些組態中，單核苷酸或單核酸分子可經操縱、修飾或偵測。單核苷酸或單核酸分子可在溶液相或固相中（例如附接至表面）。在一些組態中，單分子經受在其中將個別分子彼此分解之條件下之偵測（例如單分子定序）。可替代地，可製造或使用多個特定類型之核苷酸或多個核酸複本。所得系集可例如在核酸定序方案中經操縱、修飾或偵測。舉例而言，核酸可使用下文進一步詳細闡述之技術來在溶液中或在表面上（例如在流槽內壁上）進行擴增。
在多個實施例中，多個不同核酸分子（亦即，具有各種不同序列之群體）經操縱或偵測。分子可視情況附接至流槽或其他容器中之表面。核酸可附接在表面上之獨特位點處，且彼此空間上可區分之單核酸分子可經並行操縱、修飾或偵測。可替代地，核酸可在表面上經擴增以產生複數個表面附接之系集。系集可與彼此空間上區分且經並行操縱、修飾或偵測。
本文所闡述之方法可使用各種核酸擴增技術中之任一種。例示性可使用技術包含但不限於聚合酶鏈反應（PCR）、滾環擴增（RCA）、多重置換擴增（MDA）、橋式擴增或隨機引發擴增（RPA）。在特定組態中，一或多個用於擴增之引子可附接至流槽中之表面。在該等實施例中，表面附接之引子沿模板核酸之延伸引起模板之互補複本附接至表面。該等擴增方法可用於諸如即時PCR或定量PCR之分析性目的。可替代地，擴增可用於製備用於諸如核酸定序之下游應用之核酸。在固體載體上產生一或多個位點之製備型擴增方法可稱作「簇聚」方法，其中各位點附接至特定核酸模板之多個複本。用於DNA擴增技術之引子可包含待轉化成如本文所揭示之可逆終止子部分之3'-O-肟部分或3'-ONH2 或如本文所揭示之其他可逆終止子部分，以使得本文所闡述之去保護方法可用於生成適用於去阻斷之經可逆地終止之引子以便在擴增反應中在一或多個點處啟動延伸或控制延伸。
在PCR技術中，用於擴增之一或兩個引子可附接至表面。利用兩種所附接引子之格式常常稱作橋式擴增，此係因為雙股擴增子在側接已複製之模板序列之兩個所附接引子之間形成橋狀結構。例示性可用於橋式擴增之試劑及條件描述於例如美國專利第5,641,658號或第7,115,400號、美國專利公開案第2002/0055100 A1號、第2004/0096853 A1號、第2004/0002090 A1號、第2007/0128624 A1號或第2008/0009420 A1號中，該等案中之各者以引用之方式併入本文中。PCR擴增亦可用附接至表面之擴增引子中之一者及於溶液中之第二引子進行。使用一個固相附接之引子及溶液相引子之組合之例示性格式稱為引子步移且可如以引用之方式併入本文中之美國專利第9,476,080號中所描述來進行。另一實例為可如例如Dressman等人, 《美國國家科學院院刊》 100:8817-8822 (2003)、WO 05/010145或美國專利公開案第2005/0130173 A1號或第2005/0064460 A1號中所描述來進行之乳液PCR，該等文獻及案中之各者以引用之方式併入本文中。PCR技術中所用之引子中之一者或兩者可例如在啟動擴增之前或在擴增停止或暫停之處之點處包含3'-O-肟部分或3'-ONH2 部分。擴增可藉由使用本文所闡述之方法對3'位進行去阻斷來繼續進行。
RCA技術可用於本文所闡述之方法中。可用於使RCA可產生擴增子之RCA反應及方法中之例示性試劑描述於例如Lizardi等人, 《自然-遺傳學（Nat. Genet.）》19:225-232 (1998)或美國專利申請公開案第2007/0099208 A1號中，該等文獻及案中之各者以引用之方式併入本文中。用於RCA之引子可在溶液中或附接至流槽中之表面。引子可例如在啟動擴增之前或在擴增停止或暫停之處之點處視情況包含3'-O-肟部分或3'-ONH2 部分。擴增可藉由使用本文所闡述之方法對3'位進行去阻斷來繼續進行。
MDA技術亦可用於本揭示案之方法中。用於MDA之一些試劑及適用條件描述於例如Dean等人, 《美國國家科學院院刊》 99:5261-66 (2002)；Lage等人, 《基因體研究（Genome Research ）》 13:294-307 (2003)；Walker等人, 《用於病毒偵測之分子方法（Molecular Methods for Virus Detection ）》, 學術出版社（Academic Press, Inc.）, 1995；Walker等人, 《核酸研究》 20:1691-96 (1992)；或美國專利第5,455,166號；第5,130,238號；或第6,214,587號中，該等文獻及案中之各者以引用之方式併入本文中。用於MDA之引子可在溶液中或附接至流槽中之表面。引子可例如在啟動擴增之前或在擴增停止或暫停之處之點處視情況包含3'-O-肟部分或3'-ONH2 部分。擴增可藉由使用本文所闡述之方法對3'位進行去阻斷來繼續進行。
用於本文方法或組合物中之核酸模板可為諸如基因體DNA、合成DNA、經擴增DNA、互補DNA（cDNA）或其類似DNA之DNA。亦可使用諸如mRNA、核糖體RNA、tRNA或其類似RNA之RNA。核酸類似物亦可用作本文模板。本文所使用之引子可為DNA、RNA或其類似物。
用於本文方法或組合物中之核酸可為線性的，例如由3'端及5'端側接。可替代地，核酸可為圓形的，藉此缺乏3'端及5'端。無論線性、圓形或呈任何其他構形，本文所使用之核酸均可具有為特定用途所期望或為在核酸上進行之操縱結果的尺寸。舉例而言，核酸長度可為至少50個鹼基、100個鹼基、1 × 103 個鹼基、1 × 104 個鹼基、1 × 105 個鹼基、1 × 106 個鹼基或更多個鹼基。可替代地或另外，核酸長度可為至多1 × 106 個鹼基、1 × 105 個鹼基、1 × 104 個鹼基、1 × 103 個鹼基、100個鹼基、50個鹼基或更少個鹼基。當使用核酸群時，群體之平均長度可具有選自彼等範圍之下限值及/或上限值。
核苷酸可附接至固體載體。核苷酸可呈單體形式或其可為核酸部分。通常，核苷酸經由除3'位以外之部分附接至固體載體。因此，3'位可如本文所闡述經阻斷或去阻斷。因此，儘管核苷酸附接至固體載體，但可與溶液接觸。溶液可含有用於阻斷或去阻斷固相核苷酸之試劑。舉例而言，所附接核苷酸可具有以下結構中之一個：
Figure 02_image096
其中鹼基為核鹼基，且其中DNA獨立地為單股去氧核糖核酸或雙股去氧核糖核酸。視情況，核苷酸可經由DNA附接至固體載體。可替代地，糖可為核糖而非去氧核糖，且核苷酸可處於RNA而非DNA之3'端處。在此情況下，RNA可為單股或雙股的。視情況，核苷酸可經由RNA附接至固體載體。
在實施例中，經取代之鹼基（例如經取代之核鹼基）經至少一個取代基、尺寸受限之取代基或低碳數取代基取代；其中若經取代之鹼基經複數個選自取代基、尺寸受限之取代基及低碳數取代基之基團取代，則各取代基、尺寸受限之取代基及/或低碳數取代基可視情況為不同的。在實施例中，當鹼經取代時，其經至少一個取代基取代。在實施例中，當鹼經取代時，其經至少一個尺寸受限之取代基取代。在實施例中，當鹼經取代時，其經至少一個低碳數取代基取代。
特別適用之固體載體為陣列。陣列提供分析物多重處理之優點，由此多個不同類型之分析物經並行操縱或偵測。儘管使用本文所闡述之方法或組合物連續處理不同類型之分析物亦為有可能的，但並行處理可提供成本節省、時間節省及檢定條件均一性。陣列可包含至少2、10、100、1 × 103 、1 × 104 、1 × 105 、1 × 106 、1 × 109 個或更多個不同分析物位點。可替代地或另外，陣列可包含至多1 × 109 、1 × 106 、1 × 105 、1 × 104 、1 × 103 、100、10、2個或更少個不同分析物位點。
陣列可附接至容器內表面（例如流槽內壁）或附接至容器內部固體載體（例如流槽內部珠粒或其他固體載體）。容器或固體載體可由用於分析性生物化學之各種材料中之任一種製成。合適材料可包含玻璃、聚合物材料、矽、石英（熔融矽石）、硼矽酸鹽浮法玻璃、二氧化矽、基於二氧化矽之材料、碳、金屬、光纖或光纖束、藍寶石或塑膠材料。材料可基於特定用途所期望之特性來進行選擇。舉例而言，期望輻射波長可穿透之材料適用於利用彼波長下之輻射之分析技術。相反地，可能期望選擇不透過特定波長之輻射（例如不透明、具吸收性或反射性）之材料。可採用之材料之其他特性為對下游過程中所用之試劑，諸如本文所闡述之試劑具惰性或反應性或操縱容易性或低製造成本。
特別適用於流槽或其他容器中之固體載體為諸如珠粒或微球之粒子。珠粒群可用於附接諸如核苷酸、核酸、經可逆地終止之引子、經去阻斷引子、可延伸引子、聚合酶、穩定三元複合物或其類似物之分析物群。在一些組態中，各珠粒具有單個類型之穩定三元複合物、單個類型之能夠形成該複合物之組分或單個類型之本文或本文所引用之參考文獻中所闡述的一些其他分析物。舉例而言，個別珠粒可附接至單個類型之三元複合物、單個類型之模板對偶基因、單個類型之模板基因座、單個類型之引子、單個類型之經可逆地終止之引子、單個類型之經去阻斷引子、單個類型之可延伸引子或單個類型之核苷酸。可替代地，不同類型之組分不必在逐珠基礎上分離。因此，單個珠粒可攜帶多個不同類型之：三元複合物、模板核酸、引子（無論經阻斷或可延伸）、經引發模板核酸（無論引子為經阻斷或可延伸）及/或核苷酸（無論經阻斷或可延伸）。珠粒組合物可視例如待使用之附接格式、化學物質及/或方法而變化。例示性珠粒組合物包含用於蛋白質及核酸捕獲方法中之固體載體及其上之化學官能基。該等組合物包含例如塑膠、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、三聚氰胺、甲苯乙烯、丙烯酸聚合物、順磁材料、氧化釷溶膠、碳石墨、二氧化鈦、受控微孔玻璃（CPG）、諸如SepharoseTM 之乳膠或交聯聚葡萄糖、纖維素、耐綸、交聯微胞及TeflonTM 以及以引用之方式併入本文中之Bangs Laboratories, Fishers Ind.之《微球偵測指南（Microsphere Detection Guide）》中所闡述的其他材料。
珠粒可具有諸如球面、多面體、圓柱形或其類似形狀之對稱形狀。可替代地，珠粒可具有不規則或非對稱形狀。例示性本文所使用之珠粒尺寸之平均直徑可為至少約10 nm、100 nm、1 μm、5 μm、10 μm、100 μm、1 mm或更大。可替代地或另外，本文所使用之珠粒之平均直徑可為至多約1 mm、100 μm、10 μm、5 μm、1 μm、100 nm、10 nm、1 nm或更小。此等尺寸範圍內之珠粒可用作陣列零件或用作於流體中之粒子。
例示性可用於製造珠粒陣列之組合物及技術包含但不限於用於可獲自Illumina公司（San Diego, CA）之BeadChipTM 陣列之組合物及技術、美國專利第6,266,459號、第6,355,431號、第6,770,441號、第6,859,570號或第7,622,294號或PCT公開案第WO 00/63437號中所描述之組合物及技術，該等案中之各者以引用之方式併入本文中。珠粒可位於固體載體上之諸如孔之離散位置處，由此各位置容納單個珠粒。可替代地，珠粒駐存之離散位置可各自包含如例如美國專利申請公開案第2004/0263923 A1號、第2004/0233485 A1號、第2004/0132205 A1號或第2004/0125424 A1號中所描述之複數個珠粒，該等案中之各者以引用之方式併入本文中。
其他適用陣列包含用於核酸定序應用中之陣列。舉例而言，用於固定基因體片段擴增子之陣列（常常稱作簇）可為特別適用的。可用於本文中之核酸定序陣列之實例包含Bentley等人, 《自然》 456:53-59 (2008)、PCT公開案第WO 91/06678號、第WO 04/018497號或第WO 07/123744號、美國專利第7,057,026號、第7,211,414號、第7,315,019號、第7,329,492號或第7,405,281號、或美國專利申請公開案第2008/0108082號中所描述之核酸定序陣列，該等文獻及案中之各者以引用之方式併入本文中。用於商業定序平台之形成於流槽上之陣列，諸如Illumina（San Diego, CA）、生命科技（Life Technologies）（馬薩諸塞州沃爾瑟姆之賽默費舍爾（Thermo Fisher, Waltham MA）子公司）、加利福尼亞州門洛帕克之太平洋生物科學（Pacific Biosciences, Menlo Park, CA）、華大智造（MGI）（中國廣東深圳之華大基因（BGI, Shenzhen, Guangdong, China）子公司）所研發之陣列亦可為適用的。
核酸或其他分析物可以提供單分子位準或系集位準下之偵測之方式附接至載體。舉例而言，複數個不同核酸可以載體上之經阻斷或經去阻斷狀態之個別核酸分子可區別於載體上之全部鄰近核酸分子的方式附接至固體載體。因此，例如在本文所闡述之定序方法中，一或多個不同模板可以其中各單分子模板以單分子自固體載體上之全部其他分子分解之方式經物理上分離及偵測的格式附接至固體載體。
可替代地，本揭示案之組合物或方法可採用一或多個系集，系集為相同類型之分析物群，諸如具有共同模板序列之核酸群。簇聚方法可用於將一或多個核酸系集附接至固體載體。因此，陣列可具有複數個系集，系集中之各者稱作簇或彼格式中之陣列位點。簇可使用諸如橋式擴增、乳液PCR或本文所闡述之其他方法之本領域中已知之方法形成。簇中之核酸可包含經可逆地終止之核苷酸、經去阻斷核苷酸或可延伸核苷酸。
本揭示案之系統可經組配以使用流槽。流槽可包含其中可觀測到所關注之分析性反應之偵測通道。分析性反應可發生在流槽內之溶液相中。可替代地，分析性反應可發生在偵測通道內之固體載體上。舉例而言，試劑溶液可在附接至諸如核酸之所關注分析物之固體載體上流動，且可在固體載體上觀測到所得反應物。無論經表面附接或不經表面附接，存在於流槽中之核酸均可包含經可逆地終止、經去阻斷或可延伸之3'核苷酸。流槽允許藉由使溶液通過進入開口到達偵測通道中及通過外出開口到達內部外進行適宜流體操縱。舉例而言，偵測通道可具有諸如可經由其觀測到光信號之光學透明窗口、可經由其觀測到電子信號之電接點或其類似物之觀測面積或體積。特別適用之流槽具有用於發光偵測之激發輻射及發射輻射可穿透之窗口。例示性可用於本文中之流槽描述於例如美國專利申請公開案第2010/0111768 A1號、WO 05/065814或美國專利申請公開案第2012/0270305 A1號中，該等案中之各者以引用之方式併入本文中。
本揭示案提供用於對核酸進行定序之方法。該方法可在經引發模板核酸上進行，在該經引發模板核酸中引子具有與具有亞硝酸（HONO）之去阻斷試劑反應之3' ONH2 可逆終止子部分，藉此將引子轉化成具有3'羥基部分之可延伸引子。在一些組態中，經可逆地終止之引子可具有以下結構：
Figure 02_image098
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH；且Q為核酸引子。
可替代地，定序方法可在經引發模板核酸上進行，在該經引發模板核酸中引子具有藉由用具有結構R2-ONH2 之試劑處理來移除之3'-O-肟保護部分或其他可逆終止子且藉此將引子轉化成經可逆地終止之引子，隨後可藉由例如與亞硝酸（HONO）反應將該經可逆地終止之引子轉化成具有3'羥基部分之可延伸引子。可替代地，定序方法可在經引發模板核酸上進行，在該經引發模板核酸中引子具有藉由用具有結構R2-ONH2 之試劑及用亞硝酸（HONO）處理來去阻斷之3'-O-肟可逆終止子部分，藉此將引子轉化成具有3'羥基部分之可延伸引子。R2可獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2(R6)、經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）、經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）或經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。
在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)。在實施例中，R2為-C(O)(R6)。在實施例中，R2為-P(O)(R6)(R7)。在實施例中，R2為-C(R6)(=C(R7)(R8))。在實施例中，R2為-Si(R6)(R7)(R8)。在實施例中，R2為-SO2(R6)。在實施例中，R2為經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R2為未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R2為未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R2為未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R2不為未經取代之甲基。在實施例中，R2不為未經取代之乙基。在實施例中，R2不為未經取代之丙基。
R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）、經取代或未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）、經取代或未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）、經取代或未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）、經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）、經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）、經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。在實施例中，R6、R7及R8不全為氫。在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。
在實施例中，R6獨立地為氫。在實施例中，R6獨立地為鹵素。在實施例中，R6獨立地為-CCl3 。在實施例中，R6獨立地為-CBr3 。在實施例中，R6獨立地為-CF3 。在實施例中，R6獨立地為-CI3 。在實施例中，R6獨立地為-CHCl2 。在實施例中，R6獨立地為-CHBr2 。在實施例中，R6獨立地為-CHF2 。在實施例中，R6獨立地為-CHI2 。在實施例中，R6獨立地為-CH2 Cl。在實施例中，R6獨立地為-CH2 Br。在實施例中，R6獨立地為-CH2 F。在實施例中，R6獨立地為-CH2 I。在實施例中，R6獨立地為-CN。在實施例中，R6獨立地為-OH。在實施例中，R6獨立地為-NH2 。在實施例中，R6獨立地為-COOH。在實施例中，R6獨立地為-CONH2 。在實施例中，R6獨立地為-NO2 。在實施例中，R6獨立地為-SH。在實施例中，R6獨立地為-SO3 H。在實施例中，R6獨立地為-SO4 H。在實施例中，R6獨立地為-SO2 NH2 。在實施例中，R6獨立地為-NHNH2 。在實施例中，R6獨立地為-ONH2 。在實施例中，R6獨立地為-NHC(O)NHNH2 。在實施例中，R6獨立地為-NHC(O)NH2 。在實施例中，R6獨立地為-NHSO2 H。在實施例中，R6獨立地為-NHC(O)H。在實施例中，R6獨立地為-NHC(O)OH。在實施例中，R6獨立地為-NHOH。在實施例中，R6獨立地為-OCCl3 。在實施例中，R6獨立地為-OCF3 。在實施例中，R6獨立地為-OCBr3 。在實施例中，R6獨立地為-OCI3 。在實施例中，R6獨立地為-OCHCl2 。在實施例中，R6獨立地為-OCHBr2 。在實施例中，R6獨立地為-OCHI2 。在實施例中，R6獨立地為-OCHF2 。在實施例中，R6獨立地為-OCH2 Cl。在實施例中，R6獨立地為-OCH2 Br。在實施例中，R6獨立地為-OCH2 I。在實施例中，R6獨立地為-OCH2 F。在實施例中，R6獨立地為-SF5 。在實施例中，R6獨立地為-N3 。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之芳烷基。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，R6獨立地為未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之芳烷基。在實施例中，R6獨立地為未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R6獨立地為未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，R7獨立地為氫。在實施例中，R7獨立地為鹵素。在實施例中，R7獨立地為-CCl3 。在實施例中，R7獨立地為-CBr3 。在實施例中，R7獨立地為-CF3 。在實施例中，R7獨立地為-CI3 。在實施例中，R7獨立地為-CHCl2 。在實施例中，R7獨立地為-CHBr2 。在實施例中，R7獨立地為-CHF2 。在實施例中，R7獨立地為-CHI2 。在實施例中，R7獨立地為-CH2 Cl。在實施例中，R7獨立地為-CH2 Br。在實施例中，R7獨立地為-CH2 F。在實施例中，R7獨立地為-CH2 I。在實施例中，R7獨立地為-CN。在實施例中，R7獨立地為-OH。在實施例中，R7獨立地為-NH2 。在實施例中，R7獨立地為-COOH。在實施例中，R7獨立地為-CONH2 。在實施例中，R7獨立地為-NO2 。在實施例中，R7獨立地為-SH。在實施例中，R7獨立地為-SO3 H。在實施例中，R7獨立地為-SO4 H。在實施例中，R7獨立地為-SO2 NH2 。在實施例中，R7獨立地為-NHNH2 。在實施例中，R7獨立地為-ONH2 。在實施例中，R7獨立地為-NHC(O)NHNH2 。在實施例中，R7獨立地為-NHC(O)NH2 。在實施例中，R7獨立地為-NHSO2 H。在實施例中，R7獨立地為-NHC(O)H。在實施例中，R7獨立地為-NHC(O)OH。在實施例中，R7獨立地為-NHOH。在實施例中，R7獨立地為-OCCl3 。在實施例中，R7獨立地為-OCF3 。在實施例中，R7獨立地為-OCBr3 。在實施例中，R7獨立地為-OCI3 。在實施例中，R7獨立地為-OCHCl2 。在實施例中，R7獨立地為-OCHBr2 。在實施例中，R7獨立地為-OCHI2 。在實施例中，R7獨立地為-OCHF2 。在實施例中，R7獨立地為-OCH2 Cl。在實施例中，R7獨立地為-OCH2 Br。在實施例中，R7獨立地為-OCH2 I。在實施例中，R7獨立地為-OCH2 F。在實施例中，R7獨立地為-SF5 。在實施例中，R7獨立地為-N3 。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之芳烷基。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，R7獨立地為未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之芳烷基。在實施例中，R7獨立地為未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R7獨立地為未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，R8獨立地為氫。在實施例中，R8獨立地為鹵素。在實施例中，R8獨立地為-CCl3 。在實施例中，R8獨立地為-CBr3 。在實施例中，R8獨立地為-CF3 。在實施例中，R8獨立地為-CI3 。在實施例中，R8獨立地為-CHCl2 。在實施例中，R8獨立地為-CHBr2 。在實施例中，R8獨立地為-CHF2 。在實施例中，R8獨立地為-CHI2 。在實施例中，R8獨立地為-CH2 Cl。在實施例中，R8獨立地為-CH2 Br。在實施例中，R8獨立地為-CH2 F。在實施例中，R8獨立地為-CH2 I。在實施例中，R8獨立地為-CN。在實施例中，R8獨立地為-OH。在實施例中，R8獨立地為-NH2 。在實施例中，R8獨立地為-COOH。在實施例中，R8獨立地為-CONH2 。在實施例中，R8獨立地為-NO2 。在實施例中，R8獨立地為-SH。在實施例中，R8獨立地為-SO3 H。在實施例中，R8獨立地為-SO4 H。在實施例中，R8獨立地為-SO2 NH2 。在實施例中，R8獨立地為-NHNH2 。在實施例中，R8獨立地為-ONH2 。在實施例中，R8獨立地為-NHC(O)NHNH2 。在實施例中，R8獨立地為-NHC(O)NH2 。在實施例中，R8獨立地為-NHSO2 H。在實施例中，R8獨立地為-NHC(O)H。在實施例中，R8獨立地為-NHC(O)OH。在實施例中，R8獨立地為-NHOH。在實施例中，R8獨立地為-OCCl3 。在實施例中，R8獨立地為-OCF3 。在實施例中，R8獨立地為-OCBr3 。在實施例中，R8獨立地為-OCI3 。在實施例中，R8獨立地為-OCHCl2 。在實施例中，R8獨立地為-OCHBr2 。在實施例中，R8獨立地為-OCHI2 。在實施例中，R8獨立地為-OCHF2 。在實施例中，R8獨立地為-OCH2 Cl。在實施例中，R8獨立地為-OCH2 Br。在實施例中，R8獨立地為-OCH2 I。在實施例中，R8獨立地為-OCH2 F。在實施例中，R8獨立地為-SF5 。在實施例中，R8獨立地為-N3 。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之芳烷基。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，R8獨立地為未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之芳烷基。在實施例中，R8獨立地為未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R8獨立地為未經取代之(雜脂環基)烷基。
去保護處理可藉由以下來進行：使3'-O-肟可逆終止子部分與R2-ONH2 反應以產生3'-ONH2 可逆終止子部分，且隨後用HONO處理3'-ONH2 部分以產生3'羥基部分。在一些組態中，受保護之引子可具有以下結構：
Figure 02_image100
。 其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH；且Q為核酸引子。R3及R4可獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。去阻斷處理可藉由以下來進行：使3'-O-肟可逆終止子部分與R2-ONH2 反應以產生3'-ONH2 部分，且隨後用HONO處理3'-ONH2 部分以產生3'羥基部分。在一些組態中，經可逆地終止之引子可具有以下結構：
Figure 02_image102
。 其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH；且Q為核酸引子。R3及R4可獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2(R6)、經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）、經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）或經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。
在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)。在實施例中，R2為-C(O)(R6)。在實施例中，R2為-P(O)(R6)(R7)。在實施例中，R2為-C(R6)(=C(R7)(R8))。在實施例中，R2為-Si(R6)(R7)(R8)。在實施例中，R2為-SO2(R6)。在實施例中，R2為經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R2為未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R2為未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R2為未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R6、R7及R8不全為氫。在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。在實施例中，R2不為未經取代之甲基。在實施例中，R2不為未經取代之乙基。在實施例中，R2不為未經取代之丙基。
R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）、經取代或未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）、經取代或未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）、經取代或未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）、經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）、經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）、經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，R6獨立地為氫。在實施例中，R6獨立地為鹵素。在實施例中，R6獨立地為-CCl3 。在實施例中，R6獨立地為-CBr3 。在實施例中，R6獨立地為-CF3 。在實施例中，R6獨立地為-CI3 。在實施例中，R6獨立地為-CHCl2 。在實施例中，R6獨立地為-CHBr2 。在實施例中，R6獨立地為-CHF2 。在實施例中，R6獨立地為-CHI2 。在實施例中，R6獨立地為-CH2 Cl。在實施例中，R6獨立地為-CH2 Br。在實施例中，R6獨立地為-CH2 F。在實施例中，R6獨立地為-CH2 I。在實施例中，R6獨立地為-CN。在實施例中，R6獨立地為-OH。在實施例中，R6獨立地為-NH2 。在實施例中，R6獨立地為-COOH。在實施例中，R6獨立地為-CONH2 。在實施例中，R6獨立地為-NO2 。在實施例中，R6獨立地為-SH。在實施例中，R6獨立地為-SO3 H。在實施例中，R6獨立地為-SO4 H。在實施例中，R6獨立地為-SO2 NH2 。在實施例中，R6獨立地為-NHNH2 。在實施例中，R6獨立地為-ONH2 。在實施例中，R6獨立地為-NHC(O)NHNH2 。在實施例中，R6獨立地為-NHC(O)NH2 。在實施例中，R6獨立地為-NHSO2 H。在實施例中，R6獨立地為-NHC(O)H。在實施例中，R6獨立地為-NHC(O)OH。在實施例中，R6獨立地為-NHOH。在實施例中，R6獨立地為-OCCl3 。在實施例中，R6獨立地為-OCF3 。在實施例中，R6獨立地為-OCBr3 。在實施例中，R6獨立地為-OCI3 。在實施例中，R6獨立地為-OCHCl2 。在實施例中，R6獨立地為-OCHBr2 。在實施例中，R6獨立地為-OCHI2 。在實施例中，R6獨立地為-OCHF2 。在實施例中，R6獨立地為-OCH2 Cl。在實施例中，R6獨立地為-OCH2 Br。在實施例中，R6獨立地為-OCH2 I。在實施例中，R6獨立地為-OCH2 F。在實施例中，R6獨立地為-SF5 。在實施例中，R6獨立地為-N3 。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之芳烷基。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，R6獨立地為未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之芳烷基。在實施例中，R6獨立地為未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R6獨立地為未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，R7獨立地為氫。在實施例中，R7獨立地為鹵素。在實施例中，R7獨立地為-CCl3 。在實施例中，R7獨立地為-CBr3 。在實施例中，R7獨立地為-CF3 。在實施例中，R7獨立地為-CI3 。在實施例中，R7獨立地為-CHCl2 。在實施例中，R7獨立地為-CHBr2 。在實施例中，R7獨立地為-CHF2 。在實施例中，R7獨立地為-CHI2 。在實施例中，R7獨立地為-CH2 Cl。在實施例中，R7獨立地為-CH2 Br。在實施例中，R7獨立地為-CH2 F。在實施例中，R7獨立地為-CH2 I。在實施例中，R7獨立地為-CN。在實施例中，R7獨立地為-OH。在實施例中，R7獨立地為-NH2 。在實施例中，R7獨立地為-COOH。在實施例中，R7獨立地為-CONH2 。在實施例中，R7獨立地為-NO2 。在實施例中，R7獨立地為-SH。在實施例中，R7獨立地為-SO3 H。在實施例中，R7獨立地為-SO4 H。在實施例中，R7獨立地為-SO2 NH2 。在實施例中，R7獨立地為-NHNH2 。在實施例中，R7獨立地為-ONH2 。在實施例中，R7獨立地為-NHC(O)NHNH2 。在實施例中，R7獨立地為-NHC(O)NH2 。在實施例中，R7獨立地為-NHSO2 H。在實施例中，R7獨立地為-NHC(O)H。在實施例中，R7獨立地為-NHC(O)OH。在實施例中，R7獨立地為-NHOH。在實施例中，R7獨立地為-OCCl3 。在實施例中，R7獨立地為-OCF3 。在實施例中，R7獨立地為-OCBr3 。在實施例中，R7獨立地為-OCI3 。在實施例中，R7獨立地為-OCHCl2 。在實施例中，R7獨立地為-OCHBr2 。在實施例中，R7獨立地為-OCHI2 。在實施例中，R7獨立地為-OCHF2 。在實施例中，R7獨立地為-OCH2 Cl。在實施例中，R7獨立地為-OCH2 Br。在實施例中，R7獨立地為-OCH2 I。在實施例中，R7獨立地為-OCH2 F。在實施例中，R7獨立地為-SF5 。在實施例中，R7獨立地為-N3 。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之芳烷基。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，R7獨立地為未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之芳烷基。在實施例中，R7獨立地為未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R7獨立地為未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，R8獨立地為氫。在實施例中，R8獨立地為鹵素。在實施例中，R8獨立地為-CCl3 。在實施例中，R8獨立地為-CBr3 。在實施例中，R8獨立地為-CF3 。在實施例中，R8獨立地為-CI3 。在實施例中，R8獨立地為-CHCl2 。在實施例中，R8獨立地為-CHBr2 。在實施例中，R8獨立地為-CHF2 。在實施例中，R8獨立地為-CHI2 。在實施例中，R8獨立地為-CH2 Cl。在實施例中，R8獨立地為-CH2 Br。在實施例中，R8獨立地為-CH2 F。在實施例中，R8獨立地為-CH2 I。在實施例中，R8獨立地為-CN。在實施例中，R8獨立地為-OH。在實施例中，R8獨立地為-NH2 。在實施例中，R8獨立地為-COOH。在實施例中，R8獨立地為-CONH2 。在實施例中，R8獨立地為-NO2 。在實施例中，R8獨立地為-SH。在實施例中，R8獨立地為-SO3 H。在實施例中，R8獨立地為-SO4 H。在實施例中，R8獨立地為-SO2 NH2 。在實施例中，R8獨立地為-NHNH2 。在實施例中，R8獨立地為-ONH2 。在實施例中，R8獨立地為-NHC(O)NHNH2 。在實施例中，R8獨立地為-NHC(O)NH2 。在實施例中，R8獨立地為-NHSO2 H。在實施例中，R8獨立地為-NHC(O)H。在實施例中，R8獨立地為-NHC(O)OH。在實施例中，R8獨立地為-NHOH。在實施例中，R8獨立地為-OCCl3 。在實施例中，R8獨立地為-OCF3 。在實施例中，R8獨立地為-OCBr3 。在實施例中，R8獨立地為-OCI3 。在實施例中，R8獨立地為-OCHCl2 。在實施例中，R8獨立地為-OCHBr2 。在實施例中，R8獨立地為-OCHI2 。在實施例中，R8獨立地為-OCHF2 。在實施例中，R8獨立地為-OCH2 Cl。在實施例中，R8獨立地為-OCH2 Br。在實施例中，R8獨立地為-OCH2 I。在實施例中，R8獨立地為-OCH2 F。在實施例中，R8獨立地為-SF5 。在實施例中，R8獨立地為-N3 。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之芳烷基。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，R8獨立地為未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之芳烷基。在實施例中，R8獨立地為未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R8獨立地為未經取代之(雜脂環基)烷基。
定序通常使用DNA模板及DNA引子來進行。因此，定序方法中所用之引子可具有以下結構：
Figure 02_image104
其中鹼基為核鹼基，且其中DNA為去氧核糖核酸引子。應理解，RNA可代替DNA用於定序方法。R3及R4可獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
本揭示案之定序方法可包含延伸步驟，由此將核苷酸添加至經去阻斷引子之3'端。核苷酸通常經由聚合酶催化來添加。核苷酸可包含可逆終止子部分以使得在延伸步驟中僅將單核苷酸添加至引子中。類似地，定序方法可包含延伸步驟，由此將寡核苷酸添加至經去阻斷引子之3'端。寡核苷酸通常經由接合酶催化來添加。寡核苷酸3'端處之核苷酸可包含可逆終止子部分以使得在延伸步驟中僅將單寡核苷酸添加至引子中。經可逆地終止之核苷酸或寡核苷酸可包含外源標記，或可替代地，經可逆地終止之核苷酸或寡核苷酸可缺乏外源標記。舉例而言，用於引子延伸之經可逆地終止之核苷酸可具有結構：
Figure 02_image106
，且可經由對諸如以下之核苷酸進行去阻斷而產生：
Figure 02_image108
其中鹼基為核鹼基。R3及R4可獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
在一些定序方法中，在延伸步驟中添加至引子中之核苷酸或寡核苷酸可具有外源標記部分以使得外源標記附接至經延伸引子。標記經延伸引子可用於合成定序方法或接合定序方法，諸如下文描述及所引用參考文獻中進一步詳細闡述之定序方法。在替代性定序方法中，在延伸步驟中添加之核苷酸或寡核苷酸缺乏外源標記部分以使得經延伸引子不具有外源標記。未經標記之經延伸引子可用於Sequencing By SynthesisTM 方法，諸如下文描述及所引用參考文獻中進一步詳細闡述之方法。
本文所闡述之經可逆地終止之核苷酸用途及去阻斷方法可有益地促進採用試劑遞送及產物偵測之重複循環之循環技術。各循環可包含一個步驟或多個步驟。舉例而言，各循環可包含偵測指示模板核酸中之單核苷酸位置之信號所需之全部步驟。該等定序方法可稱作循環可逆終止子（CRT）技術。CRT技術中之各循環可包含以下步驟：（i）添加單個經可逆地終止之核苷酸（或單個經可逆地終止之寡核苷酸）以將初生引子增量至待偵測之核苷酸位置；（ii）偵測單核苷酸位置處或鄰接位置處之核苷酸；及（iii）對初生引子進行去阻斷以允許返回至步驟（i）來開始後續循環。
適用CRT核酸定序方法之特定實例為例如如共同擁有之美國專利申請公開案第2017/0022553 A1號、第2018/0044727 A1號、第2018/0187245 A1號或第2018/0208983 A1號中所描述之Sequencing By BindingTM （SBBTM ）反應，該等案中之各者以引用之方式併入本文中。用於確定模板核酸分子之序列之SBBTM 方法可視情況基於在規定條件下三元複合物（在聚合酶、經引發核酸與下一恰當核苷酸之間）之形成。該方法可包含檢查階段、接著為核苷酸併入階段（亦稱作延伸階段）。
SBBTM 方法之檢查階段可針對至少一個與引子雜交之模板核酸分子進行。引子可經可逆地終止。經引發模板可與包含聚合酶及至少一個核苷酸類型之反應混合物接觸。聚合酶及核苷酸與一或多個經引發模板核酸分子之相互作用可在其中不將核苷酸共價添加至一或多個引子中之條件下進行觀測；且各模板核酸中之下一鹼基可使用所觀測到之聚合酶及核苷酸與一或多個經引發模板核酸分子之相互作用來加以識別。經引發模板、聚合酶與核苷酸之間之相互作用可在各個流程中加以偵測。舉例而言，核苷酸可含有可偵測標記。具有不同核鹼基類型之核苷酸可分別藉由不同標記來加以區分。相對於其他類型之核鹼基而言，各類型之核鹼基可具有可區分標記。可替代地，不同核鹼基類型中之一些或全部可具有相同標記，且不同核苷酸類型可基於各別核苷酸類型至流槽之單獨遞送來加以區分。在一些實施例中，聚合酶可經標記。與不同核鹼基類型締合之聚合酶可具有區分核苷酸類型與其相關核苷酸類型之獨特標記。可替代地，聚合酶可具有類似標記，且不同核鹼基類型可基於不同核苷酸類型至流槽之單獨遞送來加以區分。
在SBBTM 方法之檢查階段期間，恰當核苷酸與不恰當核苷酸之間之區分可藉由三元複合物穩定來促進。各種條件及試劑可為適用的。舉例而言，引子可含有諸如本文所闡述之可逆終止子部分之可逆終止子部分；且/或諸如二價金屬離子之延伸所需之聚合酶輔因子可不存在；且/或抑制基於聚合酶之引子延伸之抑制性二價陽離子可存在；且/或檢查階段中存在之聚合酶可具有抑制引子延伸之化學修飾及/或突變；且/或核苷酸可具有諸如移除或更改天然三磷酸酯部分之5'修飾之抑制併入之化學修飾。檢查階段可包含使用本文所闡述之設備及方法進行之偵測。一旦完成檢查，則SBBTM 方法可藉由移除用於檢查之聚合酶及核苷酸且使經引發模板核酸經受另外去阻斷、延伸及檢查循環而繼續進行至下一循環。
洗滌可在SBBTM 方法之各個遞送步驟之間進行。洗滌步驟可在本文所闡述之各個步驟中之任一個之間執行。舉例而言，在SBBTM 方法期間，洗滌步驟可用於在三元複合物穩定條件下將經引發模板核酸與接觸經引發模板核酸之其他試劑分離。此類洗滌可移除一或多種試劑以免干擾混合物檢查或以免污染待形成於先前已與第一混合物接觸之基質上（或容器中）之第二混合物。舉例而言，經引發模板核酸可在三元複合物穩定條件下與聚合酶及至少一個核苷酸類型接觸以形成第一混合物，且可對第一混合物進行檢查。視情況，洗滌可在檢查之前進行以移除不參與穩定三元複合物形成之試劑。可替代地或另外，洗滌可在檢查步驟之後進行以自經引發模板核酸移除第一混合物之一或多種組分。隨後，經引發模板核酸可在三元複合物穩定條件下與聚合酶及至少一個其他核苷酸接觸以形成第二混合物，且可針對三元複合物形成對第二混合物進行檢查。如前所述，視情況選用之洗滌可在第二檢查之前進行以移除不參與穩定三元複合物形成之試劑。
另一適用CRT定序方法為合成定序（SBS）。SBS一般涉及經由反覆添加針對與引子雜交之模板股之核苷酸來以酶方式延伸初生引子。簡言之，SBS可藉由使附接至流槽中之位點之目標核酸與一或多個經標記核苷酸、DNA聚合酶等接觸來引發。其中使用目標核酸作為模板來延伸引子之彼等位點併入可偵測之經標記核苷酸。視情況，經標記核苷酸可進一步包含諸如本文所闡述之可逆終止子中之任一者之可逆終止子。舉例而言，可將具有可逆終止子部分之核苷酸類似物添加至引子中以使得後續延伸無法發生直至遞送本揭示案之去阻斷試劑以移除該部分為止。因此，關於使用可逆終止之實施例，可將去阻斷試劑遞送至容器（在偵測發生之前或之後）。洗滌可在各個遞送步驟之間進行。循環可執行n 次以藉由n 個核苷酸延伸引子，藉此偵測長度為n 之序列。例示性可易於經修改及修飾以採用本揭示案之可逆終止子及去阻斷試劑之SBS程序、試劑及偵測組件描述於例如Bentley等人, 《自然》 456:53-59 (2008)、WO 04/018497、WO 91/06678、WO 07/123744、美國專利第7,057,026號、第7,329,492號、第7,211,414號、第7,315,019號或第7,405,281號及美國專利申請公開案第2008/0108082 A1號中，該等文獻及案中之各者以引用之方式併入本文中。可商購自Illumina公司（San Diego, CA）之SBS方法亦為適用的。
接合定序反應亦為適用的，包含例如Shendure等人《科學（Science ）》 309:1728-1732 (2005)、美國專利第5,599,675號或美國專利第5,750,341號中所描述之反應，該等文獻及案中之各者以引用之方式併入本文中。一些實施例可包含如例如以下中所描述之雜交定序程序：Bains等人, 《理論生物學期刊（Journal of Theoretical Biology ）》 135 (3), 303-7 (1988)；Drmanac等人, 《自然生物技術（Nature Biotechnology ）》 16, 54-58 (1998)；Fodor等人, 《科學》 251 (4995), 767-773 (1995)；或WO 1989/10977，該等文獻及案中之各者以引用之方式併入本文中。在接合定序程序及雜交定序程序中，與核酸模板雜交之引子經受藉由寡核苷酸接合進行之延伸之重複循環。通常，寡核苷酸經螢光標記且可經偵測以確定模板序列。該等方法中所用之引子及寡核苷酸可包含本文所闡述之可逆終止子且其可使用本文所闡述之試劑來進行去阻斷。
上文定序方法之步驟可循環進行。舉例而言，SBBTM 方法之檢查及延伸步驟可重複進行以使得在各循環中檢查單個下一恰當核苷酸（亦即，下一恰當核苷酸為恰當地結合至緊靠與經雜交引子3'端雜交之模板中之鹼基之5'定位的模板核酸中的核苷酸的核苷酸），且隨後將單個下一恰當核苷酸添加至引子中。可進行本文所闡述之定序方法之任何數目之循環，包含例如至少1、2、10、25、50、100、150、250、500個或更多個循環。可替代地或另外，進行不超過500、250、150、100、50、25、10、2或1個循環。
各種聚合酶中之任一種可用於本文所闡述之方法中。除非另外指示，否則提及諸如本揭示案通篇例示之聚合酶之特定聚合酶應理解為包含其功能變異體。特別適用之聚合酶功能包含形成三元複合物、延伸引子以引入核苷酸（諸如經可逆地終止之核苷酸）或使用現有核酸作為模板來催化核酸股聚合。
聚合酶可基於結構同源性進行分類，諸如將聚合酶分類至識別為A、B、C、D、X、Y及RT之家族中。家族A中之DNA聚合酶包含例如T7 DNA聚合酶、真核粒線體DNA聚合酶γ、大腸桿菌DNA Pol I、水生棲熱菌（Thermus aquaticus ）Pol I及脂肪嗜熱芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus ）Pol I。家族B中之DNA聚合酶包含例如真核DNA聚合酶α、δ及ε；DNA聚合酶ζ；T4 DNA聚合酶；Phi29 DNA聚合酶；及RB69噬菌體DNA聚合酶。家族C包含例如大腸桿菌DNA聚合酶III α亞單元。家族B太古菌DNA聚合酶包含例如Vent、Deep Vent、Pfu及9o N聚合酶（例如來自馬薩諸塞州伊普斯維奇之新英格蘭生物實驗室公司（New England BioLabs Inc.；Ipswich, MA）之TherminatorTM DNA聚合酶）。家族D包含例如來源於古細菌（Archaea ）之廣古菌門（Euryarchaeota ）亞域之聚合酶。家族X中之DNA聚合酶包含例如真核聚合酶Pol β、pol σ、Pol λ及Pol μ以及釀酒酵母（S. cerevisiae ）Pol4。家族Y中之DNA聚合酶包含例如Pol η、Pol ι、Pol κ、大腸桿菌Pol IV（DINB）及大腸桿菌Pol V（UmuD'2C）。RT（逆轉錄酶）家族之DNA聚合酶包含例如逆轉錄病毒逆轉錄酶及真核端粒酶。例示性RNA聚合酶包含但不限於病毒RNA聚合酶，諸如T7 RNA聚合酶；真核RNA聚合酶，諸如RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、RNA聚合酶IV及RNA聚合酶V；及古細菌RNA聚合酶。
適用DNA聚合酶之另外實例包含細菌DNA聚合酶、真核DNA聚合酶、古細菌DNA聚合酶、病毒DNA聚合酶及噬菌體DNA聚合酶。細菌DNA聚合酶包含大腸桿菌DNA聚合酶I、II及III、IV及V、大腸桿菌DNA聚合酶之克列諾片段（Klenow fragment）、糞堆梭菌（Clostridium stercorarium ，Cst）DNA聚合酶、熱纖梭菌（Clostridium thermocellum ，Cth）DNA聚合酶及硫磺礦硫化葉菌（Sulfolobus solfataricus ，Sso）DNA聚合酶。真核DNA聚合酶包含DNA聚合酶α、β、γ、δ、€、η、ζ、λ、σ、µ及ⱪ以及Revl聚合酶（末端去氧胞苷轉移酶）及末端去氧核苷酸轉移酶（TdT）。病毒DNA聚合酶包含T4 DNA聚合酶、phi-29 DNA聚合酶、GA-l、phi-29樣DNA聚合酶、PZA DNA聚合酶、phi-15 DNA聚合酶、Cpl DNA聚合酶、Cp7 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶及T4聚合酶。其他適用DNA聚合酶包含熱穩定及/或嗜熱性DNA聚合酶，諸如水生棲熱菌（Taq）DNA聚合酶、絲狀棲熱菌（Thermus filiformis ，Tfi）DNA聚合酶、速生熱球菌（Thermococcus zilligi ，Tzi）DNA聚合酶、嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus ，Tth）DNA聚合酶、黃色棲熱菌（Thermus flavusu ，Tfl）DNA聚合酶、烏茲火球菌（Pyrococcus woesei ，Pwo）DNA聚合酶、激烈火球菌（Pyrococcus furiosus ，Pfu）DNA聚合酶及Turbo Pfu DNA聚合酶、海濱嗜熱球菌（Thermococcus litoralis ，Tli）DNA聚合酶、火球菌屬（Pyrococcus sp. ）GB-D聚合酶、海棲熱孢菌（Thermotoga maritima ，Tma）DNA聚合酶、脂肪嗜熱芽孢桿菌（Bst）DNA聚合酶、鹿兒島火球菌（Pyrococcus Kodakaraensis ，KOD）DNA聚合酶、Pfx DNA聚合酶、熱球菌屬（Thermococcus sp. ）JDF-3（JDF-3）DNA聚合酶、蛇發女怪熱球菌（Thermococcus gorgonarius ，Tgo）DNA聚合酶、嗜酸熱球菌（Thermococcus acidophilium ）DNA聚合酶；嗜酸熱硫化葉菌（Sulfolobus acidocaldarius ）DNA聚合酶；熱球菌屬go N-7 DNA聚合酶；隱蔽熱網菌（Pyrodictium occultum ）DNA聚合酶；沃氏甲烷球菌（Methanococcus voltae ）DNA聚合酶；嗜熱自養甲烷球菌（Methanococcus thermoautotrophicum ）DNA聚合酶；詹氏甲烷球菌（Methanococcus jannaschii ）DNA聚合酶；除硫球菌（Desulfurococcus ）菌株TOK DNA聚合酶（D. Tok Pol）；深海火球菌（Pyrococcus abyssi ）DNA聚合酶；掘越氏火球菌（Pyrococcus horikoshii ）DNA聚合酶；島火球菌（Pyrococcus islandicum ）DNA聚合酶；煙生熱球菌（Thermococcus fumicolans ）DNA聚合酶；敏捷氣熱菌（Aeropyrum pernix ）DNA聚合酶；及雜二聚體DNA聚合酶DP1/DP2。結合所揭示之技術之經工程改造且經修飾聚合酶亦為適用的。舉例而言，可使用極端嗜熱性海洋古細菌熱球菌屬9°N 之經修飾型式（例如來自馬薩諸塞州伊普斯維奇之新英格蘭生物實驗室公司之TherminatorTM DNA聚合酶）。
適用RNA聚合酶包含但不限於病毒RNA聚合酶，諸如T7 RNA聚合酶、T3聚合酶、SP6聚合酶及Kll聚合酶；真核RNA聚合酶，諸如RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、RNA聚合酶IV及RNA聚合酶V；及古細菌RNA聚合酶。
另一適用類型之聚合酶為逆轉錄酶。例示性逆轉錄酶包含但不限於來自人類免疫缺乏病毒1型之HIV-1逆轉錄酶（PDB 1HMV）、來自人類免疫缺乏病毒2型之HIV-2逆轉錄酶、來自莫洛尼鼠類白血病病毒（Moloney murine leukemia virus）之M-MLV逆轉錄酶、來自禽骨髓胚細胞過多症病毒之AMV逆轉錄酶及維護真核染色體端粒之端粒酶逆轉錄酶。
具有本質3'-5'改正核酸外切酶活性之聚合酶可用於本文所闡述之方法及系統之一些應用。舉例而言，3'-5'核酸外切酶活性可用於自引子3'端移除經可逆地終止之核苷酸。實質上缺乏3'-5'改正核酸外切酶活性之聚合酶亦適用於例如大部分定序系統及方法中之一些組態。不存在核酸外切酶活性可為野生型特徵或由變異或經工程改造聚合酶結構賦予之特徵。舉例而言，核酸外切酶缺失（exo minus）克列諾片段為缺乏3'-5'改正核酸外切酶活性之克列諾片段之突變型式。克列諾片段及其核酸外切酶缺失變異體可適用於本文所闡述之方法或組合物。
可用於本文所闡述之方法或組合物中之聚合酶包含天然存在之聚合酶及包含但不限於突變體、重組體、融合體、基因修飾物、化學修飾物、合成物及類似物之其經修飾變體。適用於三元複合物形成及偵測之聚合酶不限於具有催化聚合反應之能力之聚合酶。視情況，適用聚合酶具有在穩定三元複合物形成或檢查期間不使用之至少一種條件下催化聚合反應之能力。例示性可用於形成穩定三元複合物之聚合酶包含例如美國專利申請公開案第2017/0314072 A1號或第2018/0155698 A1號或美國專利申請案序列號62/732,510中所闡述之野生型及突變聚合酶，該等案中之各者以引用之方式併入本文中。
含有可用於偵測聚合酶（例如在SBBTM 檢查步驟期間）之外源標記部分（例如外源發光團）之聚合酶可適用於一些實施例中。視情況，外源標記部分可例如使用聚合酶之游離硫氫基或游離胺部分以化學方式連接至聚合酶。外源標記部分亦可經由蛋白質融合附接至聚合酶。例示性可經由蛋白質融合來附接之標記部分包含例如綠螢光蛋白（GFP）、藻膽蛋白（例如藻藍素及藻紅素）或GFP或藻膽蛋白之波長移位變異體。
亦提供包含流體試劑遞送系統、偵測系統及流槽之核酸偵測設備，其中流體試劑遞送系統經組配以將流體試劑遞送至流槽，其中偵測系統經組配以偵測流槽中之信號，其中流槽附接至具有以下結構之第一分子：
Figure 02_image110
其中鹼基為核鹼基，其中DNA獨立地為單股去氧核糖核酸或雙股去氧核糖核酸，且其中流體試劑包括有包括結構：R2-ONH2 之第二分子，其中R2、R3及R4獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
本揭示案之設備可經組配以偵測發光或螢光。因此，設備可包含具有諸如雷射、LED或燈之光學激發設備及諸如攝影機（例如互補金屬氧化物半導體（CMOS）攝影機或電荷耦合裝置（CCD）攝影機）之發光偵測器的偵測系統。可用於本文系統或方法中之偵測設備及其組件之實例描述於例如美國專利申請公開案第2010/0111768 A1號或美國專利第7,329,860號、第8,951,781號或第9,193,996號中，該等案中之各者以引用之方式併入本文中。其他偵測設備包含經商業化以用於核酸定序之偵測設備，諸如由以下提供之偵測設備：IlluminaTM 公司（例如HiSeqTM 、MiSeqTM 、NextSeqTM 或NovaSeqTM 系統）、Life TechnologiesTM （例如ABI PRISMTM 或SOLiDTM 系統）、太平洋生物科學（例如使用SMRTTM 技術之系統，諸如SequelTM 或RS IITM 系統）或凱傑（Qiagen）（例如GenereaderTM 系統）。其他適用偵測器描述於美國專利第5,888,737號、第6,175,002號、第5,695,934號、第6,140,489號或第5,863,722號或美國專利公開案第2007/007991 A1號、第2009/0247414 A1號或第2010/0111768號或WO2007/123744中，該等案中之各者以全文引用之方式併入本文中。
儘管本揭示案之組合物及方法係在於本文若干例示性組態中之光學偵測之情形下說明，但應理解可另外或替代地使用其他偵測模態。舉例而言，偵測器可為用於偵測質子或焦磷酸酯之電子偵測器（參見例如美國專利申請公開案第2009/0026082 A1號、第2009/0127589 A1號、第2010/0137143 A1號或第2010/0282617 A1號，該等案中之各者以全文引用之方式併入本文中，或可商購自馬薩諸塞州沃爾瑟姆之賽默費舍爾之Ion TorrentTM 系統），或如用於偵測奈米孔之電子偵測器，諸如由英國牛津（Oxford UK）之Oxford NanoporeTM 商業化之電子偵測器（例如MinIONTM 或PromethIONTM 系統）或美國專利第7,001,792號、Soni及Meller, 《臨床化學（Clin.Chem. ）》 53, 1996-2001 (2007)；Healy, 《奈米醫學（Nanomed. ）》2, 459-481 (2007)；或Cockroft,等人 《美國化學會志》130, 818-820 (2008)中所闡述之電子偵測器，該等案及文獻中之各者以引用之方式併入本文中。可使用FET偵測器，諸如美國專利申請案序列號62/767,712、美國專利申請公開案第2017/0240962 A1號、第2018/0051316 A1號、第2018/0112265 A1號、第2018/0155773 A1號或第2018/0305727 A1號或美國專利第9,164,053號、第9,829,456號、第10,036,064號或第10,125,391號中所描述之FET偵測器中之一或多個，該等案中之各者以引用之方式併入本文中。
可用於本文所闡述之方法中之其他偵測技術包含例如可用於感知質量之質譜法；可用於感知與表面之結合之表面電漿子共振；可用於感知能量標記吸收波長之吸收；可用於感知因標記存在所致之溫度變化之熱量測定法；可用於感知標記電特性之電導或阻抗；或其他已知分析技術。
適用偵測設備可包含流體試劑遞送系統。流體遞送系統可包含經組配以進行本文所闡述之化學反應之反應容器（例如流槽）。反應容器亦可經組配以允許偵測反應或反應產物。流體遞送系統可包含用於儲存試劑之儲集器。來自試劑之流體可經由流體遞送系統遞送至反應容器（例如流槽）。來自反應之廢試劑及產物或廢料可自反應容器排至廢料儲集器中。
在特定組態中，流體試劑遞送系統經組配以將引子延伸試劑遞送至流槽，其中引子延伸試劑包括聚合酶及具有3' ONH2 部分之核苷酸。舉例而言，藉由流體試劑遞送系統儲存或遞送之核苷酸可具有以下結構：
Figure 02_image112
其中鹼基為核鹼基。R3及R4可獨立地為H、CH3、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。例如適用於CRT定序方法之試劑之本文所闡述之其他試劑可經由流體試劑遞送系統來儲存或遞送。舉例而言，流體試劑遞送系統可經組配以將三元複合物形成試劑遞送至反應容器，其中三元複合物形成試劑包含聚合酶及為用於經引發模板核酸之下一恰當核苷酸之核苷酸。
本揭示案之偵測設備可包含經組配以導引設備執行核酸定序方法之程式模組，其中核酸定序方法包括經由流體試劑遞送系統將流體試劑重複遞送至反應容器及藉由偵測系統重複偵測反應容器。設備組件控制可利用設計成執行本文所描述功能之通用處理器、數位信號處理器（DSP）、特殊應用積體電路（ASIC）、場可程式化閘陣列（FPGA）或其他可程式化邏輯裝置、離散閘或電晶體邏輯、離散硬體組件或其任何組合。通用處理器可為微處理器，但在替代方案中，處理器可為任何習知處理器、控制器、微控制器或狀態機。處理器亦可以例如DSP及微處理器、複數個微處理器、一或多個微處理器以及DSP芯或任何其他該組態之組合之計算裝置組合的形式實施。用於控制流體之相同或不同處理器可與用於獲取、儲存及處理信號（例如本文所闡述之方法中所偵測之信號）之系統相互作用。在特定實施例中，處理器可用於根據信號確定模板核酸中之特定位置處存在之核苷酸的標識。在一些情況下，處理器根據所偵測之信號識別用於模板之核苷酸序列。
適用處理器可包含以下中之一或多者：個人電腦系統、伺服器電腦系統、精簡型用戶端、複雜型用戶端、手持式或膝上型裝置、多處理器系統、基於微處理器之系統、機上盒、可程式化消費型電子產品、網路PC、小型電腦系統、大型電腦系統、智慧型手機及包含以上系統或裝置中之任一者之分佈雲端計算環境以及其類似處理器。處理器可包含一或多個處理器或處理單元、可包含RAM及非揮發性記憶體之記憶體架構。記憶體架構可進一步包含可移除/非可移除、揮發性/非揮發性電腦系統儲存介質。此外，記憶體架構可包含用於自非可移除、非揮發性磁性介質（諸如硬驅動機）讀取及書寫至非可移除、非揮發性磁性介質（諸如硬驅動機）之一或多個讀取器；用於自可移除、非揮發性磁碟讀取及書寫至可移除、非揮發性磁碟之磁碟驅動機；及/或用於自可移除、非揮發性光碟（諸如CD-ROM或DVD-ROM）讀取或書寫至可移除、非揮發性光碟（諸如CD-ROM或DVD-ROM）之光碟驅動機。處理器亦可包含各種電腦系統可讀介質。該介質可為諸如揮發性及非揮發性介質以及可移除及非可移除介質之雲端計算環境可訪問之任何可用介質。
記憶體架構可包含具有以可執行指令形式實施之至少一個程式模組之至少一個程式產品，該等可執行指令經組配以進行本文所闡述之方法之一或多個步驟。舉例而言，可執行指令可包含操作系統、一或多個應用程式、其他程式模組及程式資料。一般而言，程式模組可包含執行本文所闡述之特定任務之常式、程式、對象、組件、邏輯、資料結構等。
處理器或其他可程式化裝置之組件可藉由內部匯流排耦合，該內部匯流排可以若干類型之匯流排結構，包含記憶體匯流排或記憶體控制器、周邊匯流排、加速圖形埠及使用各種匯流排架構中之任一者之處理器或局部匯流排中任一者的一或多者形式實施。作為實例而非限制，該等架構包含工業標準架構（ISA）匯流排、微通道架構（MCA）匯流排、增強型ISA（EISA）匯流排、視訊電子標準協會（Video Electronics Standards Association，VESA）局部匯流排及周邊組件互連（PCI）匯流排。
處理器可視情況與諸如鍵盤、指向裝置（例如滑鼠）、顯示器（諸如圖形使用者界面（GUI））或促進使用者與本揭示案系統互動之其他裝置的一或多個外部裝置連通。類似地，處理器可與其他裝置連通（例如經由網路卡、調變解調器等）。該連通可經由I/O界面發生。然而，本文系統之處理器可經由合適網路配接器與諸如區域網路（LAN）、一般廣域網路（WAN）及/或公用網路（例如網際網路）之一或多個網路連通。
本揭示案進一步提供例如可用於表徵核酸之套組。套組可包含用於進行本文所闡述之方法中之一或多種或使用或生成本文所揭示之組合物的試劑。舉例而言，套組可包含用於對經可逆地終止之核苷酸或核酸進行去阻斷之本文所闡述之一或多種試劑。可替代地或另外，本揭示案之套組可包含用於進行引子延伸步驟之一或多種試劑，包含例如經可逆地終止之核苷酸或經可逆地終止之核酸及/或聚合酶。用於延伸步驟或用於檢查步驟之聚合酶亦可包含在套組中。本發明之套組可視情況包含用於進行定序方法之其他步驟，包含例如用於產生且偵測穩定三元複合物之檢查步驟、洗滌步驟、用於產生核酸簇之步驟或其類似步驟的試劑。
因此，本揭示案提供包含含有包括3'-O-肟部分之核苷酸之第一容器及含有包括結構R2-ONH2 之試劑之第二容器的套組，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2(R6)、經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）、經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）或經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。
在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)。在實施例中，R2為-C(O)(R6)。在實施例中，R2為-P(O)(R6)(R7)。在實施例中，R2為-C(R6)(=C(R7)(R8))。在實施例中，R2為-Si(R6)(R7)(R8)。在實施例中，R2為-SO2 (R6)。在實施例中，R2為經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R2為經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R2為未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R2為未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R2為未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R2為未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R2不為未經取代之甲基。在實施例中，R2不為未經取代之乙基。在實施例中，R2不為未經取代之丙基。
R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）、經取代或未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）、經取代或未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）、經取代或未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）、經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）、經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）、經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）、經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。在實施例中，R6、R7及R8不全為氫。在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。
在實施例中，R6獨立地為氫。在實施例中，R6獨立地為鹵素。在實施例中，R6獨立地為-CCl3 。在實施例中，R6獨立地為-CBr3 。在實施例中，R6獨立地為-CF3 。在實施例中，R6獨立地為-CI3 。在實施例中，R6獨立地為-CHCl2 。在實施例中，R6獨立地為-CHBr2 。在實施例中，R6獨立地為-CHF2 。在實施例中，R6獨立地為-CHI2 。在實施例中，R6獨立地為-CH2 Cl。在實施例中，R6獨立地為-CH2 Br。在實施例中，R6獨立地為-CH2 F。在實施例中，R6獨立地為-CH2 I。在實施例中，R6獨立地為-CN。在實施例中，R6獨立地為-OH。在實施例中，R6獨立地為-NH2 。在實施例中，R6獨立地為-COOH。在實施例中，R6獨立地為-CONH2 。在實施例中，R6獨立地為-NO2 。在實施例中，R6獨立地為-SH。在實施例中，R6獨立地為-SO3 H。在實施例中，R6獨立地為-SO4 H。在實施例中，R6獨立地為-SO2 NH2 。在實施例中，R6獨立地為-NHNH2 。在實施例中，R6獨立地為-ONH2 。在實施例中，R6獨立地為-NHC(O)NHNH2 。在實施例中，R6獨立地為-NHC(O)NH2 。在實施例中，R6獨立地為-NHSO2 H。在實施例中，R6獨立地為-NHC(O)H。在實施例中，R6獨立地為-NHC(O)OH。在實施例中，R6獨立地為-NHOH。在實施例中，R6獨立地為-OCCl3 。在實施例中，R6獨立地為-OCF3 。在實施例中，R6獨立地為-OCBr3 。在實施例中，R6獨立地為-OCI3 。在實施例中，R6獨立地為-OCHCl2 。在實施例中，R6獨立地為-OCHBr2 。在實施例中，R6獨立地為-OCHI2 。在實施例中，R6獨立地為-OCHF2 。在實施例中，R6獨立地為-OCH2 Cl。在實施例中，R6獨立地為-OCH2 Br。在實施例中，R6獨立地為-OCH2 I。在實施例中，R6獨立地為-OCH2 F。在實施例中，R6獨立地為-SF5 。在實施例中，R6獨立地為-N3 。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之芳烷基。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R6獨立地為經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，R6獨立地為未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之炔基（例如C2 -C8 烷基、C2 -C6 烷基或C2 -C4 烷基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R6獨立地為未經取代之芳烷基。在實施例中，R6獨立地為未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R6獨立地為未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，R7獨立地為氫。在實施例中，R7獨立地為鹵素。在實施例中，R7獨立地為-CCl3 。在實施例中，R7獨立地為-CBr3 。在實施例中，R7獨立地為-CF3 。在實施例中，R7獨立地為-CI3 。在實施例中，R7獨立地為-CHCl2 。在實施例中，R7獨立地為-CHBr2 。在實施例中，R7獨立地為-CHF2 。在實施例中，R7獨立地為-CHI2 。在實施例中，R7獨立地為-CH2 Cl。在實施例中，R7獨立地為-CH2 Br。在實施例中，R7獨立地為-CH2 F。在實施例中，R7獨立地為-CH2 I。在實施例中，R7獨立地為-CN。在實施例中，R7獨立地為-OH。在實施例中，R7獨立地為-NH2 。在實施例中，R7獨立地為-COOH。在實施例中，R7獨立地為-CONH2 。在實施例中，R7獨立地為-NO2 。在實施例中，R7獨立地為-SH。在實施例中，R7獨立地為-SO3 H。在實施例中，R7獨立地為-SO4 H。在實施例中，R7獨立地為-SO2 NH2 。在實施例中，R7獨立地為-NHNH2 。在實施例中，R7獨立地為-ONH2 。在實施例中，R7獨立地為-NHC(O)NHNH2 。在實施例中，R7獨立地為-NHC(O)NH2 。在實施例中，R7獨立地為-NHSO2 H。在實施例中，R7獨立地為-NHC(O)H。在實施例中，R7獨立地為-NHC(O)OH。在實施例中，R7獨立地為-NHOH。在實施例中，R7獨立地為-OCCl3 。在實施例中，R7獨立地為-OCF3 。在實施例中，R7獨立地為-OCBr3 。在實施例中，R7獨立地為-OCI3 。在實施例中，R7獨立地為-OCHCl2 。在實施例中，R7獨立地為-OCHBr2 。在實施例中，R7獨立地為-OCHI2 。在實施例中，R7獨立地為-OCHF2 。在實施例中，R7獨立地為-OCH2 Cl。在實施例中，R7獨立地為-OCH2 Br。在實施例中，R7獨立地為-OCH2 I。在實施例中，R7獨立地為-OCH2 F。在實施例中，R7獨立地為-SF5 。在實施例中，R7獨立地為-N3 。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之芳烷基。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R7獨立地為經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，R7獨立地為未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R7獨立地為未經取代之芳烷基。在實施例中，R7獨立地為未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R7獨立地為未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，R8獨立地為氫。在實施例中，R8獨立地為鹵素。在實施例中，R8獨立地為-CCl3 。在實施例中，R8獨立地為-CBr3 。在實施例中，R8獨立地為-CF3 。在實施例中，R8獨立地為-CI3 。在實施例中，R8獨立地為-CHCl2 。在實施例中，R8獨立地為-CHBr2 。在實施例中，R8獨立地為-CHF2 。在實施例中，R8獨立地為-CHI2 。在實施例中，R8獨立地為-CH2 Cl。在實施例中，R8獨立地為-CH2 Br。在實施例中，R8獨立地為-CH2 F。在實施例中，R8獨立地為-CH2 I。在實施例中，R8獨立地為-CN。在實施例中，R8獨立地為-OH。在實施例中，R8獨立地為-NH2 。在實施例中，R8獨立地為-COOH。在實施例中，R8獨立地為-CONH2 。在實施例中，R8獨立地為-NO2 。在實施例中，R8獨立地為-SH。在實施例中，R8獨立地為-SO3 H。在實施例中，R8獨立地為-SO4 H。在實施例中，R8獨立地為-SO2 NH2 。在實施例中，R8獨立地為-NHNH2 。在實施例中，R8獨立地為-ONH2 。在實施例中，R8獨立地為-NHC(O)NHNH2 。在實施例中，R8獨立地為-NHC(O)NH2 。在實施例中，R8獨立地為-NHSO2 H。在實施例中，R8獨立地為-NHC(O)H。在實施例中，R8獨立地為-NHC(O)OH。在實施例中，R8獨立地為-NHOH。在實施例中，R8獨立地為-OCCl3 。在實施例中，R8獨立地為-OCF3 。在實施例中，R8獨立地為-OCBr3 。在實施例中，R8獨立地為-OCI3 。在實施例中，R8獨立地為-OCHCl2 。在實施例中，R8獨立地為-OCHBr2 。在實施例中，R8獨立地為-OCHI2 。在實施例中，R8獨立地為-OCHF2 。在實施例中，R8獨立地為-OCH2 Cl。在實施例中，R8獨立地為-OCH2 Br。在實施例中，R8獨立地為-OCH2 I。在實施例中，R8獨立地為-OCH2 F。在實施例中，R8獨立地為-SF5 。在實施例中，R8獨立地為-N3 。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之芳烷基。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R8獨立地為經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，R8獨立地為未經取代之烷基（例如C1 -C8 烷基、C1 -C6 烷基或C1 -C4 烷基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之烯基（例如C2 -C8 烯基、C2 -C6 烯基或C2 -C4 烯基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之炔基（例如C2 -C8 炔基、C2 -C6 炔基或C2 -C4 炔基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之雜烷基（例如2至8員雜烷基、2至6員雜烷基或2至4員雜烷基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之環烷基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之環烯基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之環炔基（例如C3 -C8 、C3 -C6 或C5 -C6 ）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之芳基（例如C6 -C10 芳基、C10 芳基或苯基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之雜芳基（例如5至10員雜芳基、5至9員雜芳基或5至6員雜芳基）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之雜脂環基（例如3至8員、3至6員或5至6員）。在實施例中，R8獨立地為未經取代之芳烷基。在實施例中，R8獨立地為未經取代之雜芳烷基。在實施例中，R8獨立地為未經取代之(雜脂環基)烷基。
視情況，套組可包含亞硝酸（HONO）。舉例而言，在第三容器中。在特定組態中，核苷酸可具有結構：
Figure 02_image114
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4可獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
在實施例中，Q獨立地為單股去氧核糖核酸或雙股去氧核糖核酸。
執行本文所闡述之方法中所用之組分或製品中之任一個可有用地封裝至套組中。舉例而言，套組可經封裝以包含執行本文所闡述之方法中所用之組分或製品中之一些、許多或全部。例示性組分包含例如經標記核苷酸（例如可延伸經標記核苷酸）；聚合酶（經標記或未經標記）；具有諸如-ONH2 部分之終止子部分之核苷酸（例如未經標記之經可逆地終止之核苷酸）；諸如本文所闡述之N-烷氧基胺試劑之試劑；及如本文及本文所引用之參考文獻中所闡述之其類似物。該等試劑中之任一種可包含例如用於執行經引發模板核酸分析之後續步驟中之一或多個之流體、組分及/或製品中的一些、許多或全部。套組不必包含引子或模板核酸。相反地，套組使用者可提供待與套組組分組合之經引發模板核酸。類似地，套組可排除本文所闡述之組件中之一或多個（諸如流槽或其他容器），且視情況，該等經排除之組件可由最終使用者提供。
一或多種輔助試劑亦可包含在套組中。該等輔助試劑可包含上文所例示之試劑及/或其他類型之適用於執行本文所闡述之方法之試劑中的任一種。指令可進一步包含在套組中。指令可包含例如用於製造本文所闡述之方法中所用之任何組分、執行本文所闡述之方法之任何實施例之一或多個步驟的程序及/或用於執行採用經引發模板核酸之後續分析步驟中之任一個的指令。舉例而言，套組可包含用於用經可逆地終止之核苷酸或經可逆地終止之寡核苷酸延伸引子之指令或用於對經可逆地終止之核苷酸或引子進行去阻斷之指令。
視情況，套組可包含呈可由人類使用者讀取之標記形式之識別資訊。諸如條碼、微晶片或無線射頻識別（RFID）標籤之機器可讀取標記亦可為適用的。
在特定實施例中，套組包含具有用於含有試劑之儲集器且進一步具有用於將試劑自儲集器轉移至偵測儀器之流體組件的筒。舉例而言，流體組件可經組配以將試劑轉移至其中偵測穩定三元複合物之流槽。筒可經組配以非永久性地引入諸如核酸定序平台之核酸分析系統中。因此，筒可經組配以與偵測設備一起安裝及自偵測設備移除。例示性可包含在本揭示案之套組（或系統）中之流體筒描述於美國專利申請公開案第2018/0280975 A1號或第2019/0055596 A1號中，該等案中之各者以引用之方式併入本文中。
在一態樣中，提供將3'-O-NH2 部分添加至具有3'保護基之核苷酸之方法，其包含使具有3'保護基之核苷酸與包含結構R2-O-NH2 之試劑接觸，其中R2之分子量為至少24。在實施例中，具有3'保護基之核苷酸包含核糖或去氧核糖。在實施例中，具有3'保護基之核苷酸包含核糖。在實施例中，具有3'保護基之核苷酸包含2'去氧核糖。在實施例中，具有3'保護基之核苷酸包含磷酸酯。在實施例中，具有3'保護基之核苷酸包含三磷酸酯。在實施例中，具有3'保護基之核苷酸包含結構：
Figure 02_image116
其中包含3'-O-NH2 部分之核苷酸包含結構：
Figure 02_image118
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
在實施例中，3'阻斷基包含3'-O-肟。在實施例中，3'阻斷基包含3'-O-醛肟。在實施例中，3'阻斷基包含3'-O-酮肟。
在實施例中，具有3'保護基之核苷酸包含結構：
Figure 02_image120
；其中包含3'-O-NH2 部分之核苷酸包含結構：
Figure 02_image122
；其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
在實施例中，該方法在不超過3小時內將代替3'保護基之3' ONH2 添加至至少94%之具有3'保護基之核苷酸群。在實施例中，該方法在不超過3小時內將代替3'保護基之3' ONH2 添加至至少96%之具有3'保護基之核苷酸群。在實施例中，該方法在不超過3小時內將代替3'保護基之3' ONH2 添加至至少98%之具有3'保護基之核苷酸群。在實施例中，該方法在不超過1小時內將代替3'保護基之3' ONH2 添加至至少98%之具有3'保護基之核苷酸群。
在實施例中，具有3'保護基之核苷酸包含胞嘧啶，且其中方法降解來自包含複數個包含胞嘧啶之具有3'保護基之核苷酸之群體的不超過6%的胞嘧啶鹼基。在實施例中，具有3'保護基之核苷酸包含胞嘧啶，且其中方法降解來自包含複數個包含胞嘧啶之具有3'保護基之核苷酸之群體的不超過5%的胞嘧啶鹼基。在實施例中，具有3'保護基之核苷酸包含胞嘧啶，且其中方法降解來自包含複數個包含胞嘧啶之具有3'保護基之核苷酸之群體的不超過4%的胞嘧啶鹼基。在實施例中，具有3'保護基之核苷酸包含胞嘧啶，且其中方法降解來自包含複數個包含胞嘧啶之具有3'保護基之核苷酸之群體的不超過3%的胞嘧啶鹼基。在實施例中，具有3'保護基之核苷酸包含胞嘧啶，且其中方法降解來自包含複數個包含胞嘧啶之具有3'保護基之核苷酸之群體的不超過2%的胞嘧啶鹼基。在實施例中，具有3'保護基之核苷酸包含胞嘧啶，且其中方法降解來自包含複數個包含胞嘧啶之具有3'保護基之核苷酸之群體的不超過1%的胞嘧啶鹼基。
在一態樣中，提供製造3'阻斷核苷酸之方法，該方法包含使3'保護核苷酸與具有結構R2-O-NH2 、R2-O-NHCH3 、R2-O-NHCOCH3 或R2-O-CH2 N3 之試劑接觸，其中R2之分子量為至少24 g/mol，且藉此由3'保護核苷酸製造3'阻斷核苷酸。
在實施例中，R2之分子量為至少36。在實施例中，R2包含氟核。在實施例中，R2包含至少兩個碳核。在實施例中，R2包含碳-碳雙鍵。在實施例中，R2包含三級碳。在實施例中，R2包含第三丁基部分。在實施例中，R2包含環狀部分。在實施例中，R2包含矽核。在實施例中，R2包含苯基環。在實施例中，R2包含氮核。在實施例中，R2包含氧核。在實施例中，R2包含羥化部分。
在一態樣中，提供製造3'阻斷核苷酸之方法，該方法包含使3'保護核苷酸與具有結構R2-O-NH2 或R2-O-CH2 N3 之試劑接觸，其中R2之分子量為至少24 g/mol，且藉此由3'保護核苷酸製造3'阻斷核苷酸。
在實施例中，3'阻斷核苷酸包含直接鍵結至核苷酸之核糖3'碳之阻斷部分；且阻斷部分為-ONH2 、-ONHCOCH3 、-ONHCH3 、-OCH2 N3 。在實施例中，3'阻斷核苷酸包含直接鍵結至核苷酸之核糖3'碳之阻斷部分；且阻斷部分為-ONH2 或-OCH2 N3 。在實施例中，3'阻斷核苷酸包含直接鍵結至核苷酸之核糖3'碳之阻斷部分；且阻斷部分為-ONH2 。
在實施例中，3'保護核苷酸包括直接共價鍵結至核苷酸之核糖3'碳之保護部分；且保護部分為3'-O-肟部分。
在實施例中，-O-肟部分具有式：-O-N=C(R3)(R4)；且R3及R4獨立地為氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，-O-肟部分具有式：-O-N=C(R3)(R4)；R3為氫；且R4為經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，-O-肟部分具有式：-O-N=C(R3)(R4)；且R3及R4獨立地為經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包含腺嘌呤部分或其衍生物、鳥嘌呤部分或其衍生物、胞嘧啶部分或其衍生物、胸腺嘧啶部分或其衍生物或尿嘧啶部分或其衍生物。在實施例中，腺嘌呤衍生物部分、鳥嘌呤衍生物部分、胞嘧啶衍生物部分、胸腺嘧啶衍生物部分及尿嘧啶衍生物部分包含可偵測部分。
在實施例中，3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包含單磷酸酯部分或其衍生物、二磷酸酯部分或其衍生物、三磷酸酯部分或其衍生物或單價核酸部分或其衍生物。在實施例中，3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包含單磷酸酯部分、二磷酸酯部分、三磷酸酯部分或單價核酸部分。在實施例中，3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括三磷酸酯部分。在實施例中，3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括單價核酸部分。在實施例中，3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括核糖部分。在實施例中，3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括2'去氧核糖部分。
在實施例中，R2之分子量為1000 g/mol或更小。在實施例中，R2之分子量為至少36 g/mol。在實施例中，R2之分子量為至少57 g/mol。
在實施例中，R2包含至少兩個碳核、氟核、碳-碳雙鍵、三級碳、第三丁基部分、環狀部分、矽核、苯基環、氮核、氧核或羥化部分。
在實施例中，R2為經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。在實施例中，R2不為未經取代之甲基。在實施例中，R2不為未經取代之乙基。在實施例中，R2不為未經取代之丙基。
在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2 (R6)、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基；且R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。
在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2 (R6)、未經取代之6員雜脂環基、未經取代之苯基、經取代或未經取代之雜芳基；且R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。在實施例中，R6、R7及R8不全為氫。
在實施例中，試劑具有式：
Figure 02_image124
Figure 02_image126
。
在實施例中，試劑具有式：
Figure 02_image128
。
在實施例中，3'保護核苷酸具有結構：
Figure 02_image130
；3'阻斷核苷酸具有結構：
Figure 02_image132
；B為核鹼基；R1為氫、-OH、鹵素、-OCH3 ；Q獨立地為核酸部分、三磷酸酯部分、二磷酸酯部分或單磷酸酯部分；R3及R4獨立地為氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，該方法在不超過3小時內將代替3'保護基之3' ONH2 添加至至少94%之具有3'保護基之核苷酸群。在實施例中，該方法在不超過1小時內將代替3'保護基之3' ONH2 添加至至少98%之具有3'保護基之核苷酸群。
在實施例中，具有3'保護基之核苷酸包含胞嘧啶，且其中方法降解來自包含複數個包含胞嘧啶之該具有3'保護基之核苷酸之群體的不超過6%的胞嘧啶鹼基。在實施例中，具有3'保護基之核苷酸包含胞嘧啶，且其中方法降解來自包含複數個包含胞嘧啶之該具有3'保護基之核苷酸之群體的不超過1%的胞嘧啶鹼基。
在實施例中，該方法進一步包含製造第一複數個3'阻斷核苷酸，該方法包含使第二複數個3'保護核苷酸與第三複數個試劑接觸，且藉此由第二複數個3'保護核苷酸製造第一複數個3'阻斷核苷酸。在實施例中，製造第一複數個3'阻斷核苷酸3小時或更少時間。在實施例中，製造第一複數個3'阻斷核苷酸2小時或更少時間。在實施例中，製造第一複數個3'阻斷核苷酸1小時或更少時間。
在實施例中，將至少94%之第一複數個3'保護核苷酸製成第二複數個3'阻斷核苷酸。在實施例中，將至少96%之第一複數個3'保護核苷酸製成第二複數個3'阻斷核苷酸。在實施例中，將至少98%之第一複數個3'保護核苷酸製成第二複數個3'阻斷核苷酸。
在實施例中，第一複數個3'阻斷核苷酸包含第四複數個包含胞嘧啶之3'阻斷核苷酸；且6%或更少之胞嘧啶經第三複數個試劑化學修飾。在實施例中，第一複數個3'阻斷核苷酸包含第四複數個包含胞嘧啶之3'阻斷核苷酸；且5%或更少之胞嘧啶經第三複數個試劑化學修飾。在實施例中，第一複數個3'阻斷核苷酸包含第四複數個包含胞嘧啶之3'阻斷核苷酸；且4%或更少之胞嘧啶經第三複數個試劑化學修飾。在實施例中，第一複數個3'阻斷核苷酸包含第四複數個包含胞嘧啶之3'阻斷核苷酸；且3%或更少之胞嘧啶經第三複數個試劑化學修飾。在實施例中，第一複數個3'阻斷核苷酸包含第四複數個包含胞嘧啶之3'阻斷核苷酸；且2%或更少之胞嘧啶經第三複數個試劑化學修飾。在實施例中，第一複數個3'阻斷核苷酸包含第四複數個包含胞嘧啶之3'阻斷核苷酸；且1%或更少之胞嘧啶經第三複數個試劑化學修飾。
在一態樣中，提供包含胞嘧啶核苷酸群之組合物，其中至少94%之胞嘧啶核苷酸群包含3'-O-NH2 ，其中不超過8%之胞嘧啶核苷酸群包含除-O-NH2 以外之3'部分，且其中不超過6%之胞嘧啶核苷酸群包含經修飾胞嘧啶鹼基。
在實施例中，至少96%之胞嘧啶核苷酸群包含3'-O-NH2 。在實施例中，至少98%之胞嘧啶核苷酸群包含3'-O-NH2 。在實施例中，至少99%之胞嘧啶核苷酸群包含3'-O-NH2 。
在實施例中，不超過6%之胞嘧啶核苷酸群包含除-O-NH2 以外之3'部分。在實施例中，不超過4%之胞嘧啶核苷酸群包含除-O-NH2 以外之3'部分。在實施例中，不超過2%之胞嘧啶核苷酸群包含除-O-NH2 以外之3'部分。在實施例中，不超過1%之胞嘧啶核苷酸群包含除-O-NH2 以外之3'部分。
在實施例中，不超過4%之胞嘧啶核苷酸群包含經修飾胞嘧啶鹼基。在實施例中，不超過2%之胞嘧啶核苷酸群包含經修飾胞嘧啶鹼基。在實施例中，不超過1%之胞嘧啶核苷酸群包含經修飾胞嘧啶鹼基。
在實施例中，至少98%之胞嘧啶核苷酸群包含3'-O-NH2 ，其中不超過1%之胞嘧啶核苷酸群包含除-O-NH2 以外之3'部分，且其中不超過1%之胞嘧啶核苷酸群包含經修飾胞嘧啶鹼基。
在實施例中，組合物為水溶液。在實施例中，溶液之pH不小於4且不大於8。
在實施例中，組合物包含有包含結構R2-O-NH2 之試劑。在實施例中，R2包含至少24、26、57或100之分子量。在實施例中，R2包含至少24之分子量。在實施例中，R2包含至少36之分子量。在實施例中，R2包含至少兩個碳核、氟核、碳-碳雙鍵、三級碳、第三丁基部分、環狀部分、矽核、苯基環、氮核、氧核或羥化部分。在實施例中，R2包含至少兩個碳核。在實施例中，R2包含氟核。在實施例中，R2包含碳-碳雙鍵。在實施例中，R2包含三級碳。在實施例中，R2包含第三丁基部分。在實施例中，R2包含環狀部分。在實施例中，R2包含矽核。在實施例中，R2包含苯基環。在實施例中，R2包含氮核。在實施例中，R2包含苯基環。在實施例中，R2包含氧核。在實施例中，R2包含羥化部分。
在實施例中，包含結構R2-O-NH2 之試劑選自由以下組成之群組：
Figure 02_image134
Figure 02_image136
Figure 02_image138
。
在實施例中，包含結構R2-O-NH2 之試劑選自由以下組成之群組：
Figure 02_image140
。在實施例中，包含結構R2-O-NH2 之試劑為
Figure 02_image142
。在實施例中，包含結構R2-O-NH2 之試劑為
Figure 02_image144
。在實施例中，包含結構R2-O-NH2 之試劑為
Figure 02_image146
。
在實施例中，除-O-NH2 以外之3'部分包含3' O-肟。在實施例中，除-O-NH2 以外之3'部分包含3' O-醛肟。在實施例中，除-O-NH2 以外之3'部分包含3' O-酮肟。
在實施例中，組合物包含有包含結構R2-O-NHCH3 或R2-O-CH2 N3 之試劑。在實施例中，組合物包含有包含結構R2-O-NHCH3 之試劑。在實施例中，組合物包含有包含結構R2-O-CH2 N3 之試劑。
在實施例中，具有除-O-NH2 核苷酸以外之3'部分之胞嘧啶核苷酸中之至少一些包含結構：
Figure 02_image148
；其中B為胞嘧啶核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
在一態樣中，提供調配定序試劑之方法，其包含使包含3'保護核苷酸之組合物與包含可逆終止子部分之試劑接觸以產生包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物，且將包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物調配為定序試劑，其中調配包含可逆終止子部分之組合物不包含進一步純化包含可逆終止子部分之組合物。
在實施例中，該方法進一步包含將該定序試劑施用至定序試劑以產生品質評分為至少Q30之至少100個鹼基之定序運作。在實施例中，包含可逆終止子部分之試劑具有結構R2-O-NH2 。
在實施例中，R2選自由以下組成之群組：-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2(R6)、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基；且R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。在實施例中，R2為-C(CH3 )3 。在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。
在實施例中，R2包含至少兩個碳核、氟核、碳-碳雙鍵、三級碳、第三丁基部分、環狀部分、矽核、苯基環、氮核、氧核或羥化部分。在實施例中，R2包含至少兩個碳核、碳-碳雙鍵、三級碳、第三丁基部分、環狀部分或苯基環。在實施例中，R2包含至少兩個碳核。在實施例中，R2包含氟核、矽核、氮核、氧核或羥化部分。在實施例中，R2 為-CH2 CH3 、-CH2 CHCH2 或-C(CH3 )3 。在實施例中，R2為-C(CH3 )3 。在實施例中，R2不為未經取代之甲基。在實施例中，R2不為未經取代之乙基。在實施例中，R2不為未經取代之丙基。
在實施例中，R2之分子量大於24、36、57或100。在實施例中，R2之分子量為至少24、36、57、100、200、300、400、500、600、700、800或900。在實施例中，R2之分子量為至少24。在實施例中，R2之分子量為至少36。在實施例中，R2之分子量為至少57。在實施例中，R2之分子量為至少100。在實施例中，R2之分子量為至少200。在實施例中，R2之分子量為至少300。在實施例中，R2之分子量為至少400。在實施例中，R2之分子量為至少500。在實施例中，R2之分子量為至少600。在實施例中，R2之分子量為至少700。在實施例中，R2之分子量為至少800。在實施例中，R2之分子量為至少900。
在實施例中，3'保護核苷酸包含3'-O-肟部分。在實施例中，肟為醛肟或酮肟。在實施例中，肟為醛肟。在實施例中，肟為酮肟。
在實施例中，相對於最初存在之3'保護核苷酸而言，包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物包含不超過6%之3'保護核苷酸。在實施例中，相對於最初存在之3'保護核苷酸而言，包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物包含不超過5%、4%、3%、2%或1%之3'保護核苷酸。在實施例中，相對於最初存在之3'保護核苷酸而言，包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物包含不超過5%之3'保護核苷酸。在實施例中，相對於最初存在之3'保護核苷酸而言，包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物包含不超過4%之3'保護核苷酸。在實施例中，相對於最初存在之3'保護核苷酸而言，包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物包含不超過3%之3'保護核苷酸。在實施例中，相對於最初存在之3'保護核苷酸而言，包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物包含不超過2%之3'保護核苷酸。在實施例中，相對於最初存在之3'保護核苷酸而言，包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物包含不超過1%之3'保護核苷酸。
在實施例中，包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物包含濃度為包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物中總dC核鹼基之不超過6%的經降解或經修飾dC核鹼基。在實施例中，包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物包含濃度為包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物中總dC核鹼基之不超過5%、4%、3%、2%或1%的經降解或經修飾dC核鹼基。在實施例中，包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物包含濃度為包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物中總dC核鹼基之不超過5%的經降解或經修飾dC核鹼基。在實施例中，包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物包含濃度為包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物中總dC核鹼基之不超過4%的經降解或經修飾dC核鹼基。在實施例中，包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物包含濃度為包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物中總dC核鹼基之不超過3%的經降解或經修飾dC核鹼基。在實施例中，包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物包含濃度為包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物中總dC核鹼基之不超過2%的經降解或經修飾dC核鹼基。在實施例中，包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物包含濃度為包含有包含可逆終止子部分之核苷酸之組合物中總dC核鹼基之不超過1%的經降解或經修飾dC核鹼基。
在一態樣中，提供用於修飾核苷酸之方法，其包含使包含3'-O-肟部分之核苷酸與包含結構R2-O-NH2之試劑反應以產生包含3'-O-NH2 部分之核苷酸，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
在實施例中，包含3'-O-肟部分之核苷酸包含結構：
Figure 02_image150
；其中包含3'-O-NH2 部分之核苷酸包含結構：
Figure 02_image152
；其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
在實施例中，所產生之核苷酸包含去氧核苷酸。在實施例中，所產生之核苷酸包含：
Figure 02_image154
；其中鹼基為核鹼基，且其中DNA獨立地為單股去氧核糖核酸或雙股去氧核糖核酸。
在實施例中，核鹼基為嘌呤或嘧啶。在實施例中，核鹼基獨立地為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。在實施例中，核鹼基獨立地為5-甲基胞嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤假尿苷、二氫尿苷、肌苷、異鳥嘌呤、異胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤或7-甲基鳥苷。
在實施例中，試劑獨立地為以下中之一者：
Figure 02_image156
。
在實施例中，反應在水溶液中發生。在實施例中，核苷酸附接至與水溶液接觸之固體載體。在實施例中，包含結構R2-O-NH2 之試劑附接至與水溶液接觸之固體載體。在實施例中，溶液之pH不小於4且不大於8。
在一態樣中，提供包含有包含3'-O-肟部分之核苷酸及包含結構R2-O-NH2 之試劑的溶液，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。在實施例中，R2不為未經取代之甲基。在實施例中，R2不為未經取代之乙基。在實施例中，R2不為未經取代之丙基。
在實施例中，核苷酸包含結構：
Figure 02_image158
；其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
在實施例中，核鹼基為嘌呤或嘧啶。在實施例中，核鹼基獨立地為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。在實施例中，核鹼基與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互補。在實施例中，核鹼基獨立地為5-甲基胞嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤假尿苷、二氫尿苷、肌苷、異鳥嘌呤、異胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤或7-甲基鳥苷。在實施例中，核鹼基包含外源標記部分。
在實施例中，R1為H。在實施例中，Q為去氧核糖核酸。在實施例中，R1為OH。在實施例中，Q為核糖核酸。
在實施例中，R2-O-NH2 分子獨立地為以下中之一者：
Figure 02_image160
。
在實施例中，溶液為水溶液。在實施例中，核苷酸附接至固體載體，且其中固體載體與溶液接觸。在實施例中，包含結構R2-O-NH2 之試劑附接至與水溶液接觸之固體載體。在實施例中，溶液之pH不小於4且不大於8。
在一態樣中，提供對核酸進行定序之方法，其包含以下步驟： A.       使用本文所描述之方法製造3'阻斷核苷酸，包含在實施例中，其中製造方法不包含將3'阻斷核苷酸與包含3'保護核苷酸與試劑接觸之反應物及產物之組合物分離； B.        在反應容器中使包含步驟A之3'阻斷核苷酸之組合物與核酸模板、引子及聚合酶接觸； C.        識別同時接觸模板核酸、引子3'端及聚合酶之3'阻斷核苷酸；且視情況將3'阻斷核苷酸共價結合至引子3'端，製造經延伸引子；且藉此識別與3'阻斷核苷酸同源之模板核酸之核苷酸； D.       自步驟C之經延伸引子之3'阻斷核苷酸移除3'阻斷部分；及 E.        重複步驟B至D且藉此對模板核酸進行定序。
在實施例中，執行步驟E至少99次。在實施例中，組合物包含試劑R2-ONH2 。在實施例中，試劑R2為未經取代之第三丁基。在實施例中，試劑R2不為氫。在實施例中，試劑R2不為未經取代之甲基。在實施例中，試劑R2不為未經取代之乙基。在實施例中，試劑R2不為未經取代之丙基。在實施例中，組合物不包含HONH2 。在實施例中，組合物不包含CH3 ONH2 。
在實施例中，定序之品質評分為至少Q20。在實施例中，定序之品質評分為至少Q30。在實施例中，定序之品質評分為至少Q50。
在一態樣中，提供包含含有3'阻斷核苷酸之第一容器及含有具有式R2-O-NH2 、R2-O-NHCH3 或R2-O-CH2 N3 之試劑之第二容器的套組，其中R2之分子量為至少24 g/mol。
在實施例中，3'阻斷核苷酸包含直接鍵結至核苷酸之核糖3'碳之阻斷部分；且阻斷部分為-ONH2 、-ONHCH3 或-OCH2 CH3 。在實施例中，3'阻斷核苷酸包含直接鍵結至核苷酸之核糖3'碳之阻斷部分；且阻斷部分為-ONH2 。
在實施例中，3'保護核苷酸包含直接共價鍵結至核苷酸之核糖3'碳之保護部分；且保護部分為3'肟部分。
在實施例中，-O-肟部分具有式：-O-N=C(R3)(R4)；且R3及R4獨立地為氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，-O-肟部分具有式：-O-N=C(R3)(R4)；R3為氫；且R4為經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，-O-肟部分具有式：-O-N=C(R3)(R4)；且R3及R4獨立地為經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在實施例中，3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包含腺嘌呤部分或其衍生物、鳥嘌呤部分或其衍生物、胞嘧啶部分或其衍生物、胸腺嘧啶部分或其衍生物或尿嘧啶部分或其衍生物。在實施例中，腺嘌呤衍生物部分、鳥嘌呤衍生物部分、胞嘧啶衍生物部分、胸腺嘧啶衍生物部分及尿嘧啶衍生物部分包含可偵測部分。在實施例中，3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包含單磷酸酯部分或其衍生物、二磷酸酯部分或其衍生物、三磷酸酯部分或其衍生物或單價核酸部分或其衍生物。在實施例中，3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包含單磷酸酯部分、二磷酸酯部分、三磷酸酯部分或單價核酸部分。在實施例中，3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包含三磷酸酯部分。在實施例中，3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包含單價核酸部分。在實施例中，3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包含核糖部分。在實施例中，3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包含2'去氧核糖部分。
在實施例中，R2之分子量為1000 g/mol或更小。在實施例中，R2之分子量為至少36 g/mol。在實施例中，R2之分子量為至少57 g/mol。
在實施例中，R2為經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。在實施例中，R2不為未經取代之甲基。在實施例中，R2不為未經取代之乙基。在實施例中，R2不為未經取代之丙基。
在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2 (R6)、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基；且R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。
在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2 (R6)、未經取代之6員雜脂環基、未經取代之苯基、經取代或未經取代之雜芳基；且R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。
在實施例中，試劑具有式：
Figure 02_image162
Figure 02_image164
Figure 02_image166
。
在實施例中，試劑具有式：
Figure 02_image168
。
在實施例中，3'保護核苷酸具有結構：
Figure 02_image170
；3'阻斷核苷酸具有結構：
Figure 02_image172
；B為核鹼基；R1為氫、-OH、鹵素、-OCH3 ；Q獨立地為核酸部分、三磷酸酯部分、二磷酸酯部分或單磷酸酯部分；且R3及R4獨立地為氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
在一態樣中，提供包含含有包含3'-O-肟部分之核苷酸之第一容器及含有包含結構R2-O-NH2 之試劑之第二容器的套組，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
在實施例中，核苷酸包含結構：
Figure 02_image174
；其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
在實施例中，核鹼基為嘌呤或嘧啶。在實施例中，核鹼基獨立地為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。在實施例中，核鹼基與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互補。在實施例中，核鹼基獨立地為5-甲基胞嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤假尿苷、二氫尿苷、肌苷、異鳥嘌呤、異胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤或7-甲基鳥苷。在實施例中，核鹼基包含外源標記部分。
在實施例中，Q獨立地為單股去氧核糖核酸或雙股去氧核糖核酸。
在實施例中，R2-O-NH2 分子獨立地為以下中之一者：
Figure 02_image176
。
在實施例中，套組包含RFID標籤或條碼。
在實施例中，核苷酸附接至固體載體。在實施例中，包含結構R2-O-NH2 之試劑附接至固體載體。
在一態樣中，提供在核苷酸之3'位處由阻斷基置換保護基之方法，其包含使核苷酸與包含結構R2-嵌段之試劑接觸，其中R2之分子量為至少24，其中R2-嵌段可溶於水，且其中嵌段包含阻斷基部分。在實施例中，嵌段包括可逆終止子部分。在實施例中，可逆終止子部分不阻止藉此可逆地終止之核苷酸裝配成三元複合物。
在實施例中，R2-嵌段選自由以下組成之群組：R2-O-NH2 、R2-O-NHCH3 、R2-O-NHCOCH3 或R2-O-CH2 N3 。在實施例中，R2-嵌段為R2-O-NH2 。在實施例中，R2-嵌段為R2-O-NHCH3 。在實施例中，R2-嵌段為R2-O-NHCOCH3 。在實施例中，R2-嵌段為R2-O-CH2 N3 。
在實施例中，包含3'保護基之核苷酸為：
Figure 02_image178
；其中包含3'阻斷基之核苷酸為：
Figure 02_image180
；其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
在實施例中，保護基包含O-肟。在實施例中，肟部分具有式：-O-N=C(R3)(R4)；且R3及R4獨立地為氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。在實施例中，R3為氫。在實施例中，R4為氫。在實施例中，核苷酸包括三磷酸酯部分。
在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2 (R6)、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基；且R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。在實施例中，R2為-C(R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。
在實施例中，R2-嵌段具有選自由以下組成之群組之式：
Figure 02_image182
Figure 02_image184
。在實施例中，R2-嵌段具有選自由以下組成之群組之式：
Figure 02_image186
Figure 02_image188
。
在實施例中，R2-嵌段具有式
Figure 02_image190
。在實施例中，R2-嵌段具有式
Figure 02_image192
。在實施例中，R2-嵌段具有式
Figure 02_image194
。在實施例中，R2-嵌段具有式
Figure 02_image196
。在實施例中，R2-嵌段具有式
Figure 02_image198
。在實施例中，R2-嵌段具有式
Figure 02_image200
。在實施例中，R2-嵌段具有式
Figure 02_image202
。在實施例中，R2-嵌段具有式
Figure 02_image204
。在實施例中，R2-嵌段具有式
Figure 02_image206
。在實施例中，R2-嵌段具有式
Figure 02_image208
。在實施例中，R2-嵌段具有式
Figure 02_image210
。在實施例中，R2-嵌段具有式
Figure 02_image212
。在實施例中，R2-嵌段具有式
Figure 02_image214
。在實施例中，R2-嵌段具有式
Figure 02_image216
。在實施例中，R2-嵌段具有式
Figure 02_image218
。
在實施例中，R2包括羥化部分。在實施例中，R2包括至少兩個碳核、氟核、碳-碳雙鍵、三級碳、第三丁基部分、環狀部分、矽核、苯基環、氮核、氧核或羥化部分。
在實施例中，R2之分子量不超過280 g/mol。在實施例中，R2之分子量不超過100 g/mol。
在實施例中，該方法在25℃下在不超過3小時內將代替3'保護基之阻斷基添加至至少94%之具有3'保護基之核苷酸群中。在實施例中，該方法在25℃下在不超過3小時內將代替3'保護基之阻斷基添加至至少98%之具有3'保護基之核苷酸群中。
在實施例中，該方法降解各自包括胞嘧啶核鹼基之核苷酸群中不超過6%之胞嘧啶核鹼基。在實施例中，該方法降解來自具有胞嘧啶核鹼基之核苷酸群之不超過1%之胞嘧啶鹼基。
在實施例中，組合物包含(CH3 )3 C-ONH2 。在實施例中，溶液包含(CH3 )3 C-ONH2 。在實施例中，水溶液包含(CH3 )3 C-ONH2 。在實施例中，容器包含(CH3 )3 C-ONH2 。在實施例中，套組包含(CH3 )3 C-ONH2 。在實施例中，組合物不包含CH3 -ONH2 。在實施例中，溶液不包含CH3 -ONH2 。在實施例中，水溶液不包含CH3 -ONH2 。在實施例中，容器不包含CH3 -ONH2 。在實施例中，套組不包含CH3 -ONH2 。在實施例中，組合物不包含H-ONH2 。在實施例中，溶液不包含H-ONH2 。在實施例中，水溶液不包含H-ONH2 。在實施例中，容器不包含H-ONH2 。在實施例中，套組不包含H-ONH2 。 實施例
實施例P1.    一種用於修飾核苷酸之方法，其包括使包括3'-O-肟部分之核苷酸與包括結構R2-ONH2 之試劑反應以產生包括3'-O-NH2 部分之核苷酸，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例P2.    如實施例P1之方法，其中包括3'-O-肟部分之核苷酸包括結構：
Figure 02_image220
其中包括3'-O-NH2 部分之核苷酸包括結構：
Figure 02_image222
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例P3.    如實施例P1之方法，其中反應在水溶液中發生。
實施例P4.    如實施例P3之方法，其中核苷酸附接至與水溶液接觸之固體載體。
實施例P5.    如實施例P3之方法，其中將包括結構R2-ONH2 之試劑附接至與水溶液接觸之固體載體。
實施例P6.    如實施例P1至P5中任一項之方法，其中核鹼基為嘌呤或嘧啶。
實施例P7.    如實施例P6之方法，其中核鹼基獨立地為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
實施例P8.    如實施例P6之方法，其中核鹼基與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互補。
實施例P9.    如實施例P6之方法，其中核鹼基獨立地為5-甲基胞嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤假尿苷、二氫尿苷、肌苷、異鳥嘌呤、異胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤或7-甲基鳥苷。
實施例P10.  如實施例P1至P9中任一項之方法，其中溶液之pH在4與8之間。
實施例P11.  如實施例P1至P10中任一項之方法，其中所產生之核苷酸包括去氧核苷酸。
實施例P12.  如實施例P11之方法，其中所產生之核苷酸包括：
Figure 02_image224
其中鹼基為核鹼基，且其中DNA獨立地為單股去氧核糖核酸或雙股去氧核糖核酸。
實施例P13.  如實施例P1至P12中任一項之方法，其中試劑獨立地為以下中之一者：
Figure 02_image226
。
實施例P14.  一種包括有包括3'-O-肟部分之核苷酸及包括結構R2-ONH2 之試劑的溶液，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例P15.  如實施例P14之溶液，其中核苷酸包括結構：
Figure 02_image228
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例P16.  如實施例P15之溶液，其中R1為H。
實施例P17.  如實施例P16之溶液，其中Q為去氧核糖核酸。
實施例P18.  如實施例P15之溶液，其中R1為OH。
實施例P19.  如實施例P18之溶液，其中Q為核糖核酸。
實施例P20.  如實施例P14之溶液，其中溶液為水溶液。
實施例P21.  如實施例P20之溶液，其中核苷酸附接至固體載體，且其中固體載體與溶液接觸。
實施例P22.  如實施例P20之溶液，其中將包括結構R2-ONH2 之試劑附接至與水溶液接觸之固體載體。
實施例P23.  如實施例P14至P2A3中任一項之溶液，其中核鹼基為嘌呤或嘧啶。
實施例P24.  如實施例P23之溶液，其中核鹼基獨立地為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
實施例P25.  如實施例P23之溶液，其中核鹼基與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互補。
實施例P26.  如實施例P23之溶液，其中核鹼基獨立地為5-甲基胞嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤假尿苷、二氫尿苷、肌苷、異鳥嘌呤、異胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤或7-甲基鳥苷。
實施例P27.  如實施例P14至P26中任一項之溶液，其中核鹼基包括外源標記部分。
實施例P28.  如實施例P14至P27中任一項之溶液，其中溶液之pH在4與8之間。
實施例P29.  如實施例P14至P28中任一項之溶液，其中R2-ONH2 分子獨立地為以下中之一者：
Figure 02_image230
。
實施例P30.  一種包括含有包括3'-O-肟部分之核苷酸之第一容器及含有包括結構R2-ONH2 之試劑之第二容器的套組，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例P31.  如實施例P30之套組，其中核苷酸包括結構：
Figure 02_image232
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例P32.  如實施例P30之套組，其中套組包括RFID標籤或條碼。
實施例P33.  如實施例P31或P32之套組，其中Q獨立地為單股去氧核糖核酸或雙股去氧核糖核酸。
實施例P34.  如實施例P33之套組，其中核苷酸附接至固體載體。
實施例P35.  如實施例P30之套組，其中將包括結構R2-ONH2 之試劑附接至固體載體。
實施例P36.  如實施例P30至P35中任一項之套組，其中核鹼基為嘌呤或嘧啶。
實施例P38.  如實施例P36之套組，其中核鹼基獨立地為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
實施例P39.  如實施例P36之套組，其中核鹼基與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互補。
實施例P40.  如實施例P36之套組，其中核鹼基獨立地為5-甲基胞嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤假尿苷、二氫尿苷、肌苷、異鳥嘌呤、異胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤或7-甲基鳥苷。
實施例P41.  如實施例P30至P40中任一項之套組，其中核鹼基包括外源標記部分。
實施例P42.  如實施例P30至P41中任一項之套組，其中R2-ONH2 分子獨立地為以下中之一者：
Figure 02_image234
。
實施例PP1.  一種用於修飾核苷酸之方法，其包括使包括3'-O-肟部分之核苷酸與包括結構R2-ONH2 之試劑反應以產生包括3'-O-NH2 部分之核苷酸、其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例PP2.  如實施例PP1之方法，其中包括3'-O-肟部分之核苷酸包括結構：
Figure 02_image236
其中包括3'-O-NH2 部分之核苷酸包括結構：
Figure 02_image238
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例PP3.  如實施例PP1之方法，其中反應在水溶液中發生。
實施例PP4.  如實施例PP3之方法，其中核苷酸附接至與水溶液接觸之固體載體。
實施例PP5.  如實施例PP3之方法，其中將包括結構R2-ONH2 之試劑附接至與水溶液接觸之固體載體。
實施例PP6.  如實施例PP1至PP5中任一項之方法，其中核鹼基為嘌呤或嘧啶。
實施例PP7.  如實施例PP6之方法，其中核鹼基獨立地為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
實施例PP8.  如實施例PP6之方法，其中核鹼基與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互補。
實施例PP9.  如實施例PP6之方法，其中核鹼基獨立地為5-甲基胞嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤假尿苷、二氫尿苷、肌苷、異鳥嘌呤、異胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤或7-甲基鳥苷。
實施例PP10.      如實施例PP1至PP9中任一項之方法，其中溶液之pH在4與8之間。
實施例PP11.       如實施例PP1至PP10中任一項之方法，其中所產生之核苷酸包括去氧核苷酸。
實施例PP12.      如實施例PP11之方法，其中所產生之核苷酸包括：
Figure 02_image240
其中鹼基為核鹼基，且其中DNA獨立地為單股去氧核糖核酸或雙股去氧核糖核酸。
實施例PP13.      如實施例PP1至PP12中任一項之方法，其中試劑獨立地為以下中之一者：
Figure 02_image242
Figure 02_image244
。
實施例PP14.      一種包括有包括3'-O-肟部分之核苷酸及包括結構R2-ONH2 之試劑的溶液，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例PP15.      如實施例PP14之溶液，其中核苷酸包括結構：
Figure 02_image246
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例PP16.      如實施例PP15之溶液，其中R1為H。
實施例PP17.      如實施例PP16之溶液，其中Q為去氧核糖核酸。
實施例PP18.      如實施例PP15之溶液，其中R1為OH。
實施例PP19.      如實施例PP18之溶液，其中Q為核糖核酸。
實施例PP20.      如實施例PP14之溶液，其中溶液為水溶液。
實施例PP21.      如實施例PP20之溶液，其中核苷酸附接至固體載體，且其中固體載體與溶液接觸。
實施例PP22.      如實施例PP20之溶液，其中將包括結構R2-ONH2 之試劑附接至與水溶液接觸之固體載體。
實施例PP23.      如實施例PP14至PP22中任一項之溶液，其中核鹼基為嘌呤或嘧啶。
實施例PP24.      如實施例PP23之溶液，其中核鹼基獨立地為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
實施例PP25.      如實施例PP23之溶液，其中核鹼基與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互補。
實施例PP26.      如實施例PP23之溶液，其中核鹼基獨立地為5-甲基胞嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤假尿苷、二氫尿苷、肌苷、異鳥嘌呤、異胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤或7-甲基鳥苷。
實施例PP27.      如實施例PP14至PP26中任一項之溶液，其中核鹼基包括外源標記部分。
實施例PP28.      如實施例PP14至PP27中任一項之溶液，其中溶液之pH在4與8之間。
實施例PP29.      如實施例PP14至PP28中任一項之溶液，其中R2-ONH2 分子獨立地為以下中之一者：
Figure 02_image248
Figure 02_image250
。
實施例PP30.      一種包括含有包括3'-O-肟部分之核苷酸之第一容器及含有包括結構R2-ONH2 之試劑之第二容器的套組，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例PP31.      如實施例PP30之套組，其中核苷酸包括結構：
Figure 02_image252
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例PP32.      如實施例PP30之套組，其中套組包括RFID標籤或條碼。
實施例PP33.      如實施例PP31或PP32之套組，其中Q獨立地為單股去氧核糖核酸或雙股去氧核糖核酸。
實施例PP34.      如實施例PP33之套組，其中核苷酸附接至固體載體。
實施例PP35.      如實施例PP30之套組，其中將包括結構R2-ONH2 之試劑附接至固體載體。
實施例PP36.      如實施例PP30至PP35中任一項之套組，其中核鹼基為嘌呤或嘧啶。
實施例PP38.      如實施例PP36之套組，其中核鹼基獨立地為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
實施例PP39.      如實施例PP36之套組，其中核鹼基與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互補。
實施例PP40.      如實施例PP36之套組，其中核鹼基獨立地為5-甲基胞嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤假尿苷、二氫尿苷、肌苷、異鳥嘌呤、異胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤或7-甲基鳥苷。
實施例PP41.      如實施例PP30至PP40中任一項之套組，其中核鹼基包括外源標記部分。
實施例PP42.      如實施例PP30至PP41中任一項之套組，其中R2-ONH2 分子獨立地為以下中之一者：
Figure 02_image254
。 另外實施例
實施例S1.    一種將3'-O-NH2 部分添加至具有3'保護基之核苷酸之方法，其包括使具有3'保護基之核苷酸與包括結構R2-O-NH2 之試劑接觸，其中R2之分子量為至少24。
實施例S2.    如實施例S1之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括核糖或去氧核糖。
實施例S3.    如實施例S2之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括三磷酸酯。
實施例S4.    如實施例S1之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括結構：
Figure 02_image256
其中包括3'-O-NH2 部分之核苷酸包括結構：
Figure 02_image258
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例S5.    一種製造3'阻斷核苷酸之方法，該方法包括使3'保護核苷酸與具有結構R2-O-NH2 、R2-O-NHCH3 、R2-O-NHCOCH3 或R2-O-CH2 N3 之試劑接觸，其中R2之分子量為至少24 g/mol，且藉此由3'保護核苷酸製造3'阻斷核苷酸。
實施例S6.    一種製造3'阻斷核苷酸之方法，該方法包括使3'保護核苷酸與具有結構R2-O-NH2 或R2-O-CH2 N3 之試劑接觸，其中R2之分子量為至少24 g/mol，且藉此由3'保護核苷酸製造3'阻斷核苷酸。
實施例S7.    如實施例S5之方法，其中3'阻斷核苷酸包括直接鍵結至核苷酸之核糖3'碳之阻斷部分；且阻斷部分為-ONH2 、-ONHCOCH3 、-ONHCH3 、-OCH2 N3 。
實施例S8.    如實施例S5至S6中一項之方法，其中3'阻斷核苷酸包括直接鍵結至核苷酸之核糖3'碳之阻斷部分；且阻斷部分為-ONH2 或-OCH2 N3 。
實施例S9.    如實施例S5至S6中一項之方法，其中3'阻斷核苷酸包括直接鍵結至核苷酸之核糖3'碳之阻斷部分；且阻斷部分為-ONH2 。
實施例S10.  如實施例S5至S9中一項之方法，其中3'保護核苷酸包括直接共價鍵結至核苷酸之核糖3'碳之保護部分；且保護部分為3'-O-肟部分。
實施例S11.  如實施例S10之方法，其中-O-肟部分具有式： -O-N=C(R3)(R4)；且 R3及R4獨立地為氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
實施例S12.  如實施例S10之方法，其中-O-肟部分具有式： -O-N=C(R3)(R4)； R3為氫；且 R4為經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
實施例S13.  如實施例S10之方法，其中-O-肟部分具有式： -O-N=C(R3)(R4)；且 R3及R4獨立地為經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
實施例S14.  如實施例S5至S13中一項之方法，其中3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括腺嘌呤部分或其衍生物、鳥嘌呤部分或其衍生物、胞嘧啶部分或其衍生物、胸腺嘧啶部分或其衍生物或尿嘧啶部分或其衍生物。
實施例S15.  如實施例S14之方法，其中腺嘌呤衍生物部分、鳥嘌呤衍生物部分、胞嘧啶衍生物部分、胸腺嘧啶衍生物部分及尿嘧啶衍生物部分包括可偵測部分。
實施例S16.  如實施例S5至S15中一項之方法，其中3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括單磷酸酯部分或其衍生物、二磷酸酯部分或其衍生物、三磷酸酯部分或其衍生物或單價核酸部分或其衍生物。
實施例S17.  如實施例S16之方法，其中3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括單磷酸酯部分、二磷酸酯部分、三磷酸酯部分或單價核酸部分。
實施例S18.  如實施例S16之方法，其中3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括三磷酸酯部分。
實施例S19.  如實施例S16之方法，其中3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括單價核酸部分。
實施例S20.  如實施例S5至S19中一項之方法，其中3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括核糖部分。
實施例S21.  如實施例S5至S19中一項之方法，其中3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括2'去氧核糖部分。
實施例S22.  如實施例S1至S21中一項之方法，其中R2之分子量為1000 g/mol或更小。
實施例S23.  如實施例S1至S22中一項之方法，其中R2之分子量為至少36 g/mol。
實施例S24.  如實施例S1至S22中一項之方法，其中R2之分子量為至少57 g/mol。
實施例S25.  如實施例S1至S22中一項之方法，其中R2包括至少兩個碳核、氟核、碳-碳雙鍵、三級碳、第三丁基部分、環狀部分、矽核、苯基環、氮核、氧核或羥化部分。
實施例S26.  如實施例S1至S22中一項之方法，其中R2為經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
實施例S27.  如實施例S1至S22中一項之方法，其中R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2 (R6)、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基；且 R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
實施例S28.  如實施例S27之方法，其中R2為 -C(R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。
實施例S29.  如實施例S27之方法，其中R2不為未經取代之甲基。
實施例S30.  如實施例S27之方法，其中R2不為未經取代之乙基。
實施例S31.  如實施例S27之方法，其中R2不為未經取代之丙基。
實施例S32.  如實施例S1至S22中一項之方法，其中R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2 (R6)、未經取代之6員雜脂環基、未經取代之苯基、經取代或未經取代之雜芳基；且 R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
實施例S33.  如實施例S32之方法，其中R2為 -C((R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。
實施例S34.  如實施例S32之方法，其中R2不為未經取代之甲基。
實施例S35.  如實施例S32之方法，其中R2不為未經取代之乙基。
實施例S36.  如實施例S32之方法，其中R2不為未經取代之丙基。
實施例S37.  如實施例S1至S22中一項之方法，其中試劑具有式：
Figure 02_image260
Figure 02_image262
Figure 02_image264
。
實施例S38.  如實施例S1至S22中一項之方法，其中試劑具有式：
Figure 02_image266
。
實施例S39.  如實施例S5至S11中一項之方法，其中3'保護核苷酸具有結構：
Figure 02_image268
； 3'阻斷核苷酸具有結構：
Figure 02_image270
； B為核鹼基； R1為氫、-OH、鹵素、-OCH3 ； Q獨立地為核酸部分、三磷酸酯部分、二磷酸酯部分或單磷酸酯部分； R3及R4獨立地為氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
實施例S40.  如實施例S1至S4中一項之方法，其中方法在不超過3小時內將代替3'保護基之3'ONH2 添加至至少94%之具有3'保護基之核苷酸群。
實施例S41.  如實施例S1至S4中一項之方法，其中方法在不超過1小時內將代替3'保護基之3'ONH2 添加至至少98%之具有3'保護基之核苷酸群。
實施例S42.  如實施例S1至S4中一項之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括胞嘧啶，且其中方法降解來自包括複數個包括胞嘧啶之該具有3'保護基之核苷酸之群體的不超過6%的胞嘧啶鹼基。
實施例S43.  如實施例S1至S4中一項之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括胞嘧啶，且其中方法降解來自包括複數個包括胞嘧啶之該具有3'保護基之核苷酸之群體的不超過1%的胞嘧啶鹼基。
實施例S44.  如實施例S5至S39中一項之方法，其進一步包括製造第一複數個3'阻斷核苷酸，該方法包括使第二複數個3'保護核苷酸與第三複數個試劑接觸，且藉此由第二複數個3'保護核苷酸製造第一複數個3'阻斷核苷酸。
實施例S45.  如實施例S44之方法，其中製造第一複數個3'阻斷核苷酸3小時或更少時間。
實施例S46.  如實施例S44之方法，其中製造第一複數個3'阻斷核苷酸2小時或更少時間。
實施例S47.  如實施例S44之方法，其中製造第一複數個3'阻斷核苷酸1小時或更少時間。
實施例S48.  如實施例S44至S47中一項之方法，其中將至少94%之第一複數個3'保護核苷酸製成第二複數個3'阻斷核苷酸。
實施例S49.  如實施例S44至S47中一項之方法，其中將至少96%之第一複數個3'保護核苷酸製成第二複數個3'阻斷核苷酸。
實施例S50.  如實施例S44至S47中一項之方法，其中將至少98%之第一複數個3'保護核苷酸製成第二複數個3'阻斷核苷酸。
實施例S51.  如實施例S44至S50中一項之方法，其中第一複數個3'阻斷核苷酸包括第四複數個包括胞嘧啶之3'阻斷核苷酸；且6%或更少之胞嘧啶經第三複數個試劑化學修飾。
實施例S52.  如實施例S44至S50中一項之方法，其中第一複數個3'阻斷核苷酸包括第四複數個包括胞嘧啶之3'阻斷核苷酸；且5%或更少之胞嘧啶經第三複數個試劑化學修飾。
實施例S53.  如實施例S44至S50中一項之方法，其中第一複數個3'阻斷核苷酸包括第四複數個包括胞嘧啶之3'阻斷核苷酸；且4%或更少之胞嘧啶經第三複數個試劑化學修飾。
實施例S54.  如實施例S44至S50中一項之方法，其中第一複數個3'阻斷核苷酸包括第四複數個包括胞嘧啶之3'阻斷核苷酸；且3%或更少之胞嘧啶經第三複數個試劑化學修飾。
實施例S55.  如實施例S44至S50中一項之方法，其中第一複數個3'阻斷核苷酸包括第四複數個包括胞嘧啶之3'阻斷核苷酸；且2%或更少之胞嘧啶經第三複數個試劑化學修飾。
實施例S56.  如實施例S44至S50中一項之方法，其中第一複數個3'阻斷核苷酸包括第四複數個包括胞嘧啶之3'阻斷核苷酸；且1%或更少之胞嘧啶經第三複數個試劑化學修飾。
實施例S57.  一種包括胞嘧啶核苷酸群之組合物，其中至少94%之胞嘧啶核苷酸群包括3'-O-NH2 ，其中不超過8%之胞嘧啶核苷酸群包括除-O-NH2 以外之3'部分，且其中不超過6%之胞嘧啶核苷酸群包括經修飾胞嘧啶鹼基。
實施例S58.  如實施例S57之組合物，其中至少98%之胞嘧啶核苷酸群包括3'-O-NH2 ，其中不超過1%之胞嘧啶核苷酸群包括除-O-NH2 以外之3'部分，且其中不超過1%之胞嘧啶核苷酸群包括經修飾胞嘧啶鹼基。
實施例S59.  如實施例S57之組合物，其中組合物為水溶液。
實施例S60.  如實施例S57之組合物，其中溶液之pH不小於4且不大於8。
實施例S61.  如實施例S57之組合物，其中組合物包括有包括結構R2-O-NH2 之試劑。
實施例S62.  如實施例S61之組合物，其中R2包括至少24、26、57或100之分子量。
實施例S63.  如實施例S61之組合物，其中R2包括至少兩個碳核、氟核、碳-碳雙鍵、三級碳、第三丁基部分、環狀部分、矽核、苯基環、氮核、氧核或羥化部分。
實施例S64.  如實施例S61之組合物，其中包括結構R2-O-NH2 之試劑選自由以下組成之群組：
Figure 02_image272
Figure 02_image274
Figure 02_image276
。
實施例S65.  如實施例S57至S64中一項之組合物，其中除-O-NH2 以外之3'部分包括3' O-肟。
實施例S66.  如實施例S57之組合物，其中組合物包括有包括結構R2-O-NHCH3 或R2-O-CH2 N3 之試劑。
實施例S67.  如實施例S57至S66中一項之組合物，其中具有除-O-NH2 核苷酸以外之3'部分之胞嘧啶核苷酸中之至少一些包括結構：
Figure 02_image278
其中B為胞嘧啶核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例S68.  一種調配定序試劑之方法，其包括使包括3'保護核苷酸之組合物與包括可逆終止子部分之試劑接觸以產生包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物，且將包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物調配為定序試劑，其中調配包括可逆終止子部分之組合物不包括進一步純化包括可逆終止子部分之組合物。
實施例S69.  如實施例S68之方法，其進一步包括將該定序試劑施用至定序試劑以產生品質評分為至少Q30之至少100個鹼基之定序運作。
實施例S70.  如實施例S68之方法，其中包括可逆終止子部分之試劑具有結構R2-O-NH2 。
實施例S71.  如實施例S70之方法，其中R2選自由以下組成之群組：-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2 (R6)、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基；且 R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
實施例S72.  如實施例S71之方法，其中R2為 -C(R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。
實施例S73.  如實施例S71之方法，其中R2不為未經取代之甲基。
實施例S74.  如實施例S71之方法，其中R2不為未經取代之乙基。
實施例S75.  如實施例S71之方法，其中R2不為未經取代之丙基。
實施例S76.  如實施例S70之方法，其中R2為-C(CH3 )3 。
實施例S77.  如實施例S70之方法，其中R2之分子量大於24、36、57或100。
實施例S78.  如實施例S70之方法，其中R2包括至少兩個碳核、氟核、碳-碳雙鍵、三級碳、第三丁基部分、環狀部分、矽核、苯基環、氮核、氧核或羥化部分。
實施例S79.  如實施例S68之方法，其中3'保護核苷酸包括3'-O-肟部分。
實施例S80.  如實施例S68之方法，其中相對於最初存在之3'保護核苷酸而言，包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物包括不超過6%之3'保護核苷酸。
實施例S81.  如實施例S68之方法，其中包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物包括濃度為包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物中總dC核鹼基之不超過6%的經降解或經修飾dC核鹼基。
實施例S82.  一種修飾核苷酸之方法，其包括使包括3'-O-肟部分之核苷酸與包括結構R2-O-NH2 之試劑反應以產生包括3'-O-NH2 部分之核苷酸、其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例S83.  如實施例S82之方法，其中包括3'-O-肟部分之核苷酸包括結構：
Figure 02_image280
其中包括3'-O-NH2 部分之核苷酸包括結構：
Figure 02_image282
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例S84.  如實施例S82至S83中一項之方法，其中所產生之核苷酸包括去氧核苷酸。
實施例S85.  如實施例S82之方法，其中所產生之核苷酸包括：
Figure 02_image284
其中鹼基為核鹼基，且其中DNA獨立地為單股去氧核糖核酸或雙股去氧核糖核酸。
實施例S86.  如實施例S82至S85中任一項之方法，其中試劑獨立地為以下中之一者：
Figure 02_image286
。
實施例S87.  一種包括有包括3'-O-肟部分之核苷酸及包括結構R2-O-NH2 之試劑的溶液，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例S88.  如實施例S87之溶液，其中核苷酸包括結構：
Figure 02_image288
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例S89.  如實施例S87至S88中一項之溶液，其中核鹼基包括外源標記部分。
實施例S90.  如實施例S87至S89中一項之溶液，其中R2-O-NH2 分子獨立地為以下中之一者：
Figure 02_image290
。
實施例S91.  一種對核酸進行定序之方法，其包括以下步驟： A.  使用如實施例S5至S56中一項之方法製造3'阻斷核苷酸，其中製造方法不包括將3'阻斷核苷酸與包括3'保護核苷酸與試劑接觸之反應物及產物之組合物分離； B.   在反應容器中使包括步驟A之3'阻斷核苷酸之組合物與核酸模板、引子及聚合酶接觸； C.   識別同時接觸模板核酸、引子3'端及聚合酶之3'阻斷核苷酸；且視情況將3'阻斷核苷酸共價結合至引子3'端，製造經延伸引子；且藉此識別與3'阻斷核苷酸同源之模板核酸之核苷酸； D.  自步驟C之經延伸引子之3'阻斷核苷酸移除3'阻斷部分；及 E.   重複步驟B至D且藉此對模板核酸進行定序。
實施例S92.  如實施例S91之方法，其中執行步驟E至少99次。
實施例S93.  如實施例S91至S92中一項之方法，其中定序之品質評分為至少Q20。
實施例S94.  如實施例S91至S92中一項之方法，其中定序之品質評分為至少Q30。
實施例S95.  如實施例S91至S92中一項之方法，其中定序之品質評分為至少Q50。
實施例S96.  一種包括含有3'阻斷核苷酸之第一容器及含有具有式R2-O-NH2 、R2-O-NHCH3 或R2-O-CH2 N3 之試劑之第二容器的套組，其中R2之分子量為至少24 g/mol。
實施例S97.  如實施例S96之套組，其中3'阻斷核苷酸包括直接鍵結至核苷酸之核糖3'碳之阻斷部分；且阻斷部分為-ONH2 、-ONHCH3 或-OCH2 CH3 。
實施例S98.  如實施例S96之套組，其中3'阻斷核苷酸包括直接鍵結至核苷酸之核糖3'碳之阻斷部分；且阻斷部分為-ONH2 。
實施例S99.  如實施例S96至S98中一項之套組，其中3'保護核苷酸包括直接共價鍵結至核苷酸之核糖3'碳之保護部分；且保護部分為3'肟部分。
實施例S100.       如實施例S99之套組，其中-O-肟部分具有式： -O-N=C(R3)(R4)；且 R3及R4獨立地為氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
實施例S101.       如實施例S99之套組，其中-O-肟部分具有式： -O-N=C(R3)(R4)； R3為氫；且 R4為經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
實施例S102.       如實施例S99之套組，其中-O-肟部分具有式： -O-N=C(R3)(R4)；且 R3及R4獨立地為經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
實施例S103.       如實施例S96至S102中一項之套組，其中3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括腺嘌呤部分或其衍生物、鳥嘌呤部分或其衍生物、胞嘧啶部分或其衍生物、胸腺嘧啶部分或其衍生物或尿嘧啶部分或其衍生物。
實施例S104.       如實施例S103之套組，其中腺嘌呤衍生物部分、鳥嘌呤衍生物部分、胞嘧啶衍生物部分、胸腺嘧啶衍生物部分及尿嘧啶衍生物部分包括可偵測部分。
實施例S105.       如實施例S96至S104中一項之套組，其中3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括單磷酸酯部分或其衍生物、二磷酸酯部分或其衍生物、三磷酸酯部分或其衍生物或單價核酸部分或其衍生物。
實施例S106.       如實施例S105之套組，其中3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括單磷酸酯部分、二磷酸酯部分、三磷酸酯部分或單價核酸部分。
實施例S107.       如實施例S105之套組，其中3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括三磷酸酯部分。
實施例S108.       如實施例S105之套組，其中3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括單價核酸部分。
實施例S109.       如實施例S96至S108中一項之套組，其中3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括核糖部分。
實施例S110.       如實施例S96至S108中一項之套組，其中3'阻斷核苷酸及3'保護核苷酸包括2'去氧核糖部分。
實施例S111.       如實施例S96至S110中一項之套組，其中R2之分子量為1000 g/mol或更小。
實施例S112.       如實施例S96至S111中一項之套組，其中R2之分子量為至少36 g/mol。
實施例S113.       如實施例S96至S111中一項之套組，其中R2之分子量為至少57 g/mol。
實施例S114.       如實施例S96至S111中一項之套組，其中R2為經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
實施例S115.       如實施例S96至S111中一項之套組，其中R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2 (R6)、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基；且 R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
實施例S116.       如實施例S115之套組，其中R2為 -C(R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。
實施例S117.       如實施例S115之套組，其中R2不為未經取代之甲基。
實施例S118.       如實施例S115之套組，其中R2不為未經取代之乙基。
實施例S119.       如實施例S115之套組，其中R2不為未經取代之丙基。
實施例S120.       如實施例S96至S111中一項之套組，其中R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2(R6)、未經取代之6員雜脂環基、未經取代之苯基、經取代或未經取代之雜芳基；且 R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
實施例S121.       如實施例S120之套組，其中R2為 -C(R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。
實施例S122.       如實施例S120之套組，其中R2不為未經取代之甲基。
實施例S123.       如實施例S120之套組，其中R2不為未經取代之乙基。
實施例S124.       如實施例S120之套組，其中R2不為未經取代之丙基。
實施例S125.       如實施例S96至S111中一項之套組，其中試劑具有式：
Figure 02_image292
Figure 02_image294
Figure 02_image296
。
實施例S126.       如實施例S96至S111中一項之套組，其中試劑具有式：
Figure 02_image298
。
實施例S127.       如實施例S96至S100中一項之套組，其中3'保護核苷酸具有結構：
Figure 02_image300
； 3'阻斷核苷酸具有結構：
Figure 02_image302
； B為核鹼基； R1為氫、-OH、鹵素、-OCH3 ； Q獨立地為核酸部分、三磷酸酯部分、二磷酸酯部分或單磷酸酯部分；且 R3及R4獨立地為氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
實施例S128.       一種包括含有包括3'-O-肟部分之核苷酸之第一容器及含有包括結構R2-O-NH2 之試劑之第二容器的套組，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例S129.       如實施例S128之套組，其中核苷酸包括結構：
Figure 02_image304
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例S130.       如實施例S128至S129中一項之套組，其中核鹼基包括外源標記部分。
實施例S131.       如實施例S128至S130中一項之套組，其中R2-O-NH2 分子獨立地為以下中之一者：
Figure 02_image306
。
實施例T1.    一種將3'-O-NH2 部分添加至具有3'保護基之核苷酸之方法，其包括使具有3'保護基之核苷酸與包括結構R2-O-NH2 之試劑接觸，其中R2之分子量為至少24。
實施例T2.    如實施例T1之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括核糖。
實施例T3.    如實施例T1之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括2'去氧核糖。
實施例T4.    如實施例T2之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括磷酸酯。
實施例T5.    如實施例T4之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括三磷酸酯。
實施例T6.    如實施例T3之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括磷酸酯。
實施例T7.    如實施例T6之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括三磷酸酯。
實施例T8.    如實施例T1之方法，其中R2之分子量為至少36。
實施例T9.    如實施例T1之方法，其中R2包括氟核。
實施例T10.  如實施例T1之方法，其中R2包括至少兩個碳核。
實施例T11.  如實施例T1之方法，其中R2包括碳-碳雙鍵。
實施例T12.  如實施例T1之方法，其中R2包括三級碳。
實施例T13.  如實施例T12之方法，其中R2包括第三丁基部分。
實施例T14.  如實施例T1之方法，其中R2包括環狀部分。
實施例T15.  如實施例T1之方法，其中R2包括矽核。
實施例T16.  如實施例T1之方法，其中R2包括苯基環。
實施例T17.  如實施例T1之方法，其中R2包括氮核。
實施例T18.  如實施例T1之方法，其中R2包括氧核。
實施例T19.  如實施例T1之方法，其中R2包括羥化部分。
實施例T20.  如實施例T1之方法，其中包括結構R2-O-NH2 之試劑選自由以下組成之群組：
Figure 02_image308
。
實施例T21.  如實施例T20之方法，其中包括結構R2-O-NH2 之試劑為
Figure 02_image310
。
實施例T22.  如實施例T20之方法，其中包括結構R2-O-NH2 之試劑為
Figure 02_image312
。
實施例T23.  如實施例T1之方法，其中包括結構R2-O-NH2 之試劑選自由以下組成之群組：
Figure 02_image314
Figure 02_image316
Figure 02_image318
。
實施例T24.  如實施例T8至T23中任一項之方法，其中3'阻斷基包括3'-O-肟。
實施例T25.  如實施例T8至T23中任一項之方法，其中3'阻斷基包括3'-O-醛肟。
實施例T26.  如實施例T8至T23中任一項之方法，其中3'阻斷基包括3'-O-酮肟。
實施例T27.  如實施例T8至T23中任一項之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括結構：
Figure 02_image320
其中包括3'-O-NH2 部分之核苷酸包括結構：
Figure 02_image322
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例T28.  如實施例T1至T27中任一項之方法，其中方法在不超過3小時內將代替3'保護基之3'ONH2 添加至至少94%之具有3'保護基之核苷酸群。
實施例T29.  如實施例T1至T27中任一項之方法，其中方法在不超過3小時內將代替3'保護基之3'ONH2 添加至至少96%之具有3'保護基之核苷酸群。
實施例T30.  如實施例T1至T27中任一項之方法，其中方法在不超過3小時內將代替3'保護基之3'ONH2 添加至至少98%之具有3'保護基之核苷酸群。
實施例T31.  如實施例T1至T27中任一項之方法，其中方法在不超過2小時內將代替3'保護基之3'ONH2 添加至至少98%之具有3'保護基之核苷酸群。
實施例T32.  如實施例T1至T27中任一項之方法，其中方法在不超過1小時內將代替3'保護基之3'ONH2 添加至至少98%之具有3'保護基之核苷酸群。
實施例T33.  如實施例T1至T32中任一項之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括胞嘧啶，且其中方法降解來自包括複數個包括胞嘧啶之該具有3'保護基之核苷酸之群體的不超過6%的胞嘧啶鹼基。
實施例T34.  如實施例T1至T32中任一項之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括胞嘧啶，且其中方法降解來自包括複數個包括胞嘧啶之該具有3'保護基之核苷酸之群體的不超過5%的胞嘧啶鹼基。
實施例T35.  如實施例T1至T32中任一項之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括胞嘧啶，且其中方法降解來自包括複數個包括胞嘧啶之該具有3'保護基之核苷酸之群體的不超過4%的胞嘧啶鹼基。
實施例T36.  如實施例T1至T32中任一項之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括胞嘧啶，且其中方法降解來自包括複數個包括胞嘧啶之該具有3'保護基之核苷酸之群體的不超過3%的胞嘧啶鹼基。
實施例T37.  如實施例T1至T32中任一項之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括胞嘧啶，且其中方法降解來自包括複數個包括胞嘧啶之該具有3'保護基之核苷酸之群體的不超過2%的胞嘧啶鹼基。
實施例T38.  如實施例T1至T32中任一項之方法，其中具有3'保護基之核苷酸包括胞嘧啶，且其中方法降解來自包括複數個包括胞嘧啶之該具有3'保護基之核苷酸之群體的不超過1%的胞嘧啶鹼基。
實施例T39.  一種包括胞嘧啶核苷酸群之組合物，其中至少94%之胞嘧啶核苷酸群包括3'-O-NH2 ，其中不超過8%之胞嘧啶核苷酸群包括除-O-NH2 以外之3'部分，且其中不超過6%之胞嘧啶核苷酸群包括經修飾胞嘧啶鹼基。
實施例T40.  如實施例T39之組合物，其中至少96%之胞嘧啶核苷酸群包括3'-O-NH2 。
實施例T41.  如實施例T39之組合物，其中至少98%之胞嘧啶核苷酸群包括3'-O-NH2 。
實施例T42.  如實施例T39之組合物，其中至少99%之胞嘧啶核苷酸群包括3'-O-NH2 。
實施例T43.  如實施例T39之組合物，其中不超過6%之胞嘧啶核苷酸群包括除 -O-NH2 以外之3'部分。
實施例T44.  如實施例T39之組合物，其中不超過4%之胞嘧啶核苷酸群包括除 -O-NH2 以外之3'部分。
實施例T45.  如實施例T39之組合物，其中不超過2%之胞嘧啶核苷酸群包括除 -O-NH2 以外之3'部分。
實施例T46.  如實施例T39之組合物，其中不超過1%之胞嘧啶核苷酸群包括除 -O-NH2 以外之3'部分。
實施例T47.  如實施例T39之組合物，其中不超過4%之胞嘧啶核苷酸群包括經修飾胞嘧啶鹼基。
實施例T48.  如實施例T39之組合物，其中不超過2%之胞嘧啶核苷酸群包括經修飾胞嘧啶鹼基。
實施例T49.  如實施例T39之組合物，其中不超過1%之胞嘧啶核苷酸群包括經修飾胞嘧啶鹼基。
實施例T50.  如實施例T39之組合物，其中至少98%之胞嘧啶核苷酸群包括3'-O-NH2 ，其中不超過1%之胞嘧啶核苷酸群包括除-O-NH2 以外之3'部分，且其中不超過1%之胞嘧啶核苷酸群包括經修飾胞嘧啶鹼基。
實施例T51.  如實施例T39之組合物，其中組合物為水溶液。
實施例T52.  如實施例T51之組合物，其中溶液之pH不小於4且不大於8。
實施例T53.  如實施例T39之組合物，其中組合物包括有包括結構R2-O-NH2 之試劑。
實施例T54.  如實施例T53之組合物，其中R2包括至少24之分子量。
實施例T55.  如實施例T53之組合物，其中R2包括至少36之分子量。
實施例T56.  如實施例T53之組合物，其中R2包括氟核。
實施例T57.  如實施例T53之組合物，其中R2包括至少兩個碳核。
實施例T58.  如實施例T53之組合物，其中R2包括碳-碳雙鍵。
實施例T59.  如實施例T53之組合物，其中R2包括三級碳。
實施例T60.  如實施例T59之組合物，其中R2包括第三丁基部分。
實施例T61.  如實施例T53之組合物，其中R2包括環狀部分。
實施例T62.  如實施例T53之組合物，其中R2包括矽核。
實施例T63.  如實施例T53之組合物，其中R2包括苯基環。
實施例T64.  如實施例T53之組合物，其中R2包括氮核。
實施例T65.  如實施例T53之組合物，其中R2包括氧核。
實施例T66.  如實施例T53之組合物，其中R2包括羥化部分。
實施例T67.  如實施例T53之組合物，其中包括結構R2-O-NH2 之試劑選自由以下組成之群組：
Figure 02_image324
。
實施例T68.  如實施例T53之組合物，其中包括結構R2-O-NH2 之試劑為
Figure 02_image326
。
實施例T69.  如實施例T53之組合物，其中包括結構R2-O-NH2 之試劑為
Figure 02_image328
。
實施例T70.  如實施例T53之組合物，其中包括結構R2-O-NH2 之試劑選自由以下組成之群組：
Figure 02_image330
Figure 02_image332
。
實施例T71.  如實施例T39至T70中任一項之組合物，其中除-O-NH2 以外之3'部分包括3' O-肟。
實施例T72.  如實施例T39至T70中任一項之組合物，其中除-O-NH2 以外之3'部分包括3' O-醛肟。
實施例T73.  如實施例T39至T70中任一項之組合物，其中除-O-NH2 以外之3'部分包括3' O-酮肟。
實施例T74.  如實施例T39之組合物，其中組合物包括有包括結構R2-O-NHCH3 之試劑。
實施例T75.  如實施例T39之組合物，其中組合物包括有包括結構R2-O-CH2 N3 之試劑。
實施例T76.  如實施例T39至T70中任一項之組合物，其中具有除-O-NH2 核苷酸以外之3'部分之胞嘧啶核苷酸中之至少一些包括結構：
Figure 02_image334
其中B為胞嘧啶核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例T77.  一種調配定序試劑之方法，其包括使包括3'保護核苷酸之組合物與包括可逆終止子部分之試劑接觸以產生包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物，且將包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物調配為定序試劑，其中調配包括可逆終止子部分之組合物不包括進一步純化包括可逆終止子部分之組合物。
實施例T78.  如實施例T77之方法，其進一步包括將該定序試劑施用至定序試劑以產生品質評分為至少Q30之至少100個鹼基之定序運作。
實施例T79.  如實施例T77之方法，其中包括可逆終止子部分之試劑具有結構R2-O-NH2 。
實施例T80.  如實施例T79之方法，其中R2包括至少兩個碳核、氟核、碳-碳雙鍵、三級碳、第三丁基部分、環狀部分、矽核、苯基環、氮核、氧核或羥化部分。
實施例T81.  如實施例T80之方法，其中R2包括至少兩個碳核、碳-碳雙鍵、三級碳、第三丁基部分、環狀部分或苯基環。
實施例T82.  如實施例T81之方法，其中R2為 -CH2 CH3 、-CH2 CHCH2 或-C(CH3 )3 。
實施例T83.  如實施例T82之方法，其中R2為 -C(CH3 )3 。
實施例T84.  如實施例T79之方法，其中R2之分子量為至少24。
實施例T85.  如實施例T84之方法，其中R2之分子量為至少36。
實施例T86.  如實施例T84之方法，其中R2之分子量為至少57。
實施例T87.  如實施例T84之方法，其中R2之分子量為至少100。
實施例T88.  如實施例T84之方法，其中R2之分子量為至少200。
實施例T89.  如實施例T84之方法，其中R2之分子量為至少300。
實施例T90.  如實施例T84之方法，其中R2之分子量為至少400。
實施例T91.  如實施例T84之方法，其中R2之分子量為至少500。
實施例T92.  如實施例T84之方法，其中R2之分子量為至少600。
實施例T93.  如實施例T84之方法，其中R2之分子量為至少700。
實施例T94.  如實施例T84之方法，其中R2之分子量為至少800。
實施例T95.  如實施例T84之方法，其中R2之分子量為至少900。
實施例T96.  如實施例T79之方法，其中R2包括至少兩個碳核。
實施例T97.  如實施例T79之方法，其中R2包括氟核、矽核、氮核、氧核或羥化部分。
實施例T98.  如實施例T79之方法，其中3'保護核苷酸包括3'-O-肟部分。
實施例T99.  如實施例T98之方法，其中肟為醛肟。
實施例T100.      如實施例T98之方法，其中肟為酮肟。
實施例T101.      如實施例T79之方法，其中相對於最初存在之3'保護核苷酸而言，包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物包括不超過6%之3'保護核苷酸。
實施例T102.      如實施例T101之方法，其中相對於最初存在之3'保護核苷酸而言，包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物包括不超過5%之3'保護核苷酸。
實施例T103.      如實施例T101之方法，其中相對於最初存在之3'保護核苷酸而言，包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物包括不超過4%之3'保護核苷酸。
實施例T104.      如實施例T101之方法，其中相對於最初存在之3'保護核苷酸而言，包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物包括不超過3%之3'保護核苷酸。
實施例T105.      如實施例T101之方法，其中相對於最初存在之3'保護核苷酸而言，包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物包括不超過2%之3'保護核苷酸。
實施例T106.      如實施例T101之方法，其中相對於最初存在之3'保護核苷酸而言，包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物包括不超過1%之3'保護核苷酸。
實施例T107.      如實施例T79之方法，其中包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物包括濃度為包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物中總dC核鹼基之不超過6%的經降解或經修飾dC核鹼基。
實施例T108.      如實施例T79之方法，其中包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物包括濃度為包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物中總dC核鹼基之不超過5%的經降解或經修飾dC核鹼基。
實施例T109.      如實施例T79之方法，其中包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物包括濃度為包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物中總dC核鹼基之不超過4%的經降解或經修飾dC核鹼基。
實施例T110.       如實施例T79之方法，其中包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物包括濃度為包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物中總dC核鹼基之不超過3%的經降解或經修飾dC核鹼基。
實施例T111.       如實施例T79之方法，其中包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物包括濃度為包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物中總dC核鹼基之不超過2%的經降解或經修飾dC核鹼基。
實施例T112.       如實施例T79之方法，其中包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物包括濃度為包括有包括可逆終止子部分之核苷酸之組合物中總dC核鹼基之不超過1%的經降解或經修飾dC核鹼基。
實施例T113.       一種修飾核苷酸之方法，其包括使包括3'-O-肟部分之核苷酸與包括結構R2-O-NH2 之試劑反應以產生包括3'-O-NH2 部分之核苷酸，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例T114.       如實施例T113之方法，其中包括3'-O-肟部分之核苷酸包括結構：
Figure 02_image336
其中包括3'-O-NH2 部分之核苷酸包括結構：
Figure 02_image338
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例T115.       如實施例T113之方法，其中反應在水溶液中發生。
實施例T116.       如實施例T115之方法，其中核苷酸附接至與水溶液接觸之固體載體。
實施例T117.       如實施例T115之方法，其中包括結構R2-O-NH2 之試劑附接至與水溶液接觸之固體載體。
實施例T118.       如實施例T113至T117中任一項之方法，其中核鹼基為嘌呤或嘧啶。
實施例T119.       如實施例T118之方法，其中核鹼基獨立地為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
實施例T120.      如實施例T118之方法，其中核鹼基與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互補。
實施例T121.      如實施例T118之方法，其中核鹼基獨立地為5-甲基胞嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤假尿苷、二氫尿苷、肌苷、異鳥嘌呤、異胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤或7-甲基鳥苷。
實施例T122.      如實施例T113至T121中任一項之方法，其中溶液之pH不小於4且不大於8。
實施例T123.      如實施例T113至T122中任一項之方法，其中所產生之核苷酸包括去氧核苷酸。
實施例T124.      如實施例T123之方法，其中所產生之核苷酸包括：
Figure 02_image340
其中鹼基為核鹼基，且其中DNA獨立地為單股去氧核糖核酸或雙股去氧核糖核酸。
實施例T125.      如實施例T113至T124中任一項之方法，其中試劑獨立地為以下中之一者：
Figure 02_image342
。
實施例T126.      一種包括有包括3'-O-肟部分之核苷酸及包括結構R2-O-NH2 之試劑的溶液，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例T127.      如實施例T126之溶液，其中核苷酸包括結構：
Figure 02_image344
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例T128.      如實施例T127之溶液，其中R1為H。
實施例T129.      如實施例T128之溶液，其中Q為去氧核糖核酸。
實施例T130.      如實施例T127之溶液，其中R1為OH。
實施例T131.      如實施例T130之溶液，其中Q為核糖核酸。
實施例T132.      如實施例T126之溶液，其中溶液為水溶液。
實施例T133.      如實施例T132之溶液，其中核苷酸附接至固體載體，且其中固體載體與溶液接觸。
實施例T134 如實施例T132之溶液，其中包括結構R2-O-NH2 之試劑附接至與水溶液接觸之固體載體。
實施例T135.      如實施例T126至T134中任一項之溶液，其中核鹼基為嘌呤或嘧啶。
實施例T136.      如實施例T135之溶液，其中核鹼基獨立地為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
實施例T137.      如實施例T135之溶液，其中核鹼基與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互補。
實施例T138.      如實施例T135之溶液，其中核鹼基獨立地為5-甲基胞嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤假尿苷、二氫尿苷、肌苷、異鳥嘌呤、異胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤或7-甲基鳥苷。
實施例T139.      如實施例T126至T138中任一項之溶液，其中核鹼基包括外源標記部分。
實施例T140.      如實施例T126至T139中任一項之溶液，其中溶液之pH不小於4且不大於8。
實施例T141.      如實施例T126至T140中任一項之溶液，其中R2-O-NH2 分子獨立地為以下中之一者：
Figure 02_image346
。
實施例T142.      一種包括含有包括3'-O-肟部分之核苷酸之第一容器及含有包括結構R2-O-NH2之試劑之第二容器的套組，其中R2獨立地為烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例T143.      如實施例T142之套組，其中核苷酸包括結構：
Figure 02_image348
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例T144.      如實施例T142之套組，其中套組包括RFID標籤或條碼。
實施例T145.      如實施例T143或T144之套組，其中Q獨立地為單股去氧核糖核酸或雙股去氧核糖核酸。
實施例T146.      如實施例T145之套組，其中核苷酸附接至固體載體。
實施例T147.      如實施例T142之套組，其中包括結構R2-O-NH2 之試劑附接至固體載體。
實施例T148.      如實施例T142至T147中任一項之套組，其中核鹼基為嘌呤或嘧啶。
實施例T149.      如實施例T148之套組，其中核鹼基獨立地為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
實施例T150.      如實施例T148之套組，其中核鹼基與腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶互補。
實施例T151.      如實施例T148之套組，其中核鹼基獨立地為5-甲基胞嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤假尿苷、二氫尿苷、肌苷、異鳥嘌呤、異胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤或7-甲基鳥苷。
實施例T152.      如實施例T142至T151中任一項之套組，其中核鹼基包括外源標記部分。
實施例T153.      如實施例T142至T152中任一項之套組，其中R2-O-NH2 分子獨立地為以下中之一者：
Figure 02_image350
。 額外實施例
實施例1.      一種在核苷酸之3'位處由阻斷基置換保護基之方法，其包括使核苷酸與包括結構R2-嵌段之試劑接觸，其中R2之分子量為至少24，其中R2-嵌段可溶於水，且其中嵌段包括阻斷基部分。
實施例2.      如實施例1之方法，其中嵌段包括可逆終止子部分。
實施例3.      如實施例2之方法，其中可逆終止子部分不阻止藉此可逆地終止之核苷酸裝配成三元複合物。
實施例4.      如實施例1至3中任一項之方法，其中R2-嵌段選自由以下組成之群組：R2-O-NH2 、R2 -O-NHCH3 、R2-O-NHCOCH3 或R2-O-CH2 N3 。
實施例5.      如實施例1至4中任一項之方法，其中R2-嵌段為R2-O-CH2 N3 。
實施例6.      如實施例1至4中任一項之方法，其中R2-嵌段為R2-O-NH2 。
實施例7.      如實施例1至4中任一項之方法，其中包括3'保護基之核苷酸為：
Figure 02_image352
其中包括3'阻斷基之核苷酸為：
Figure 02_image354
其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
實施例8.      如實施例1至7中任一項之方法，其中保護基包括-O-肟。
實施例9.      如實施例8之方法，其中-O-肟部分具有式：-O-N=C(R3)(R4)；且R3及R4獨立地為氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
實施例10.    如實施例9之方法，其中R3為氫。
實施例11.    如實施例9至10中任一項之方法，其中R4為氫。
實施例12.    如實施例1至11中任一項之方法，其中核苷酸包括三磷酸酯部分。
實施例13.    如實施例1至4中任一項之方法，其中R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2 (R6)、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基；且 R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
實施例14.    如實施例13之方法，其中R2為 -C(R6)(R7)(R8)，且R6、R7及R8不全為氫。
實施例15.    如實施例13之方法，其中R2不為未經取代之甲基。
實施例16.    如實施例13之方法，其中R2不為未經取代之乙基。
實施例17.    如實施例13之方法，其中R2不為未經取代之丙基。
實施例18.    如實施例13之方法，其中R2-嵌段具有選自由以下組成之群組之式：
Figure 02_image356
Figure 02_image358
。
實施例19.    如實施例18之方法，其中R2-嵌段具有選自由以下組成之群組之式：
Figure 02_image360
Figure 02_image362
。
實施例20.    如實施例19之方法，其中R2-嵌段具有式
Figure 02_image364
。
實施例21.    如實施例19之方法，其中R2-嵌段具有式
Figure 02_image366
。
實施例22.    如實施例19之方法，其中R2-嵌段具有式
Figure 02_image368
。
實施例23.    如實施例13之方法，其中R2包括羥化部分。
實施例24.    如實施例13之方法，其中R2包括至少兩個碳核、氟核、碳-碳雙鍵、三級碳、第三丁基部分、環狀部分、矽核、苯基環、氮核、氧核或羥化部分。
實施例25.    如實施例13之方法，其中R2之分子量不超過280 g/mol。
實施例26.    如實施例13之方法，其中R2之分子量不超過100 g/mol。
實施例27     如實施例1至4中任一項之方法，其中方法在25℃下在不超過3小時內將代替3'保護基之阻斷基添加至至少94%之具有3'保護基之核苷酸群中。
實施例28.    如實施例27之方法，其中方法在25℃下在不超過3小時內將代替3'保護基之阻斷基添加至至少98%之具有3'保護基之核苷酸群中。
實施例29.    如實施例28之方法，其中方法降解各自包括胞嘧啶核鹼基之核苷酸群中不超過6%之胞嘧啶核鹼基。
實施例30.    如實施例29之方法，其中方法降解來自具有胞嘧啶核鹼基之核苷酸群之不超過1%之胞嘧啶鹼基。
實施例31.    如實施例1至19中任一項之方法，其中方法在25℃下在不超過3小時內將代替3'保護基之阻斷基添加至至少94%之具有3'保護基之核苷酸群中。
實施例32.    如實施例31之方法，其中方法在25℃下在不超過3小時內將代替3'保護基之阻斷基添加至至少98%之具有3'保護基之核苷酸群中。
實施例33.    如實施例32之方法，其中方法降解各自包括胞嘧啶核鹼基之核苷酸群中不超過6%之胞嘧啶核鹼基。
實施例34.    如實施例33之方法，其中方法降解來自具有胞嘧啶核鹼基之核苷酸群之不超過1%之胞嘧啶核鹼基。 1.    實例
實例 1. 此實例展現使用各種烷氧基胺試劑進行之核苷酸去阻斷效率及去阻斷試劑對不合需要之核苷酸結構修飾及降解的惰性。將各胺氧基去阻斷試劑調配為3.2 M水溶液，且用10 M氫氧化鈉將pH調節至5.25。隨後，將此等胺氧基溶液中之各者與100 mM dCTP三磷酸肟溶液1:1混合且在25℃下培育1小時。此時，將反應物用含10%異丙基甲基酮之50%異丙醇/水稀釋50倍。藉由HPLC使用Phenomenex Gemini C18管柱（5 µm NX-X18 110 Å，LC管柱250 × 4.6 mm）分析消耗及降解百分比。
圖1A顯示當經各種候選試劑處理時核苷酸降解百分比對用於dCTP之3'肟消耗百分比的曲線圖。結果指示當使dCTP-3'-肟與具有結構R2-ONH2 之試劑反應時，相較於與羥胺反應而言，具有-CH3 、-CH2 CH3 、-CH2 CHCH2 或-C(CH3 )3 之R2部分之物種產生更高產率之3'-ONH2 核苷酸。具有-C(CH3 )3 之R2部分之候選試劑產生最高產率之3'-ONH2 核苷酸。
圖1A結果顯示相較於用羥胺進行之處理而言，具有-CH3 、-CH2 CHCH2 或-C(CH3 )3 之R2部分之物種產生實質上較少不合需要之核苷酸降解。具有-CH2 CH3 之R2部分之物種展現與用羥胺進行之處理大致相當之降解位準。在圖1A中所測試之試劑當中，具有-C(CH3 )3 之R2部分之試劑展現最低位準之不合需要之核苷酸降解。
實例 2. 在不經進一步純化之情況下使用經由使用第三丁基-O-NH2 產生之圖1組合物以調配定序試劑。在定序運作中使用進一步包括聚合酶之定序試劑，且對於至少100個鹼基讀取，觀測到至少Q30之讀取品質。
此實例展現本文方法之實踐產生適合於在不經進一步純化之情況下調配成定序試劑之核苷酸組合物，該等定序試劑諸如包括聚合酶、界面活性劑或適用於定序反應之其他試劑之定序試劑。
在本申請案通篇，已引用各種公開案、專利及/或專利申請案。此等文獻之揭示內容特此以全文引用之方式併入本申請案中。
已描述多個實施例。儘管如此，應理解可作出各種修改。因此，其他實施例係在以下申請專利範圍之範疇內。
無
圖1A顯示當經共用繫栓至各個R2基團之-O-NH2 可逆終止子部分之各種候選DRT（『去阻斷可逆終止子』）胺氧基試劑處理時3'-O-(N-丙酮肟)-dCTP之核苷酸降解百分比對3'-O-(N-丙酮肟)部分消耗百分比的曲線圖。如實例1中所描述執行反應且在1小時25℃反應之後對其加以檢定。圖1A說明當R2分子量增加時，吾人看到dC降解減少。類似地，當R2分子量增加時，吾人看到起始物質消耗增加。圖1B列舉圖1A中所檢定之DRT試劑之化學標識，指示其各個R2部分。
圖2呈現去阻斷試劑之實例。此圖中之全部實例皆共用繫栓至在分子量及化學結構範圍內之各個R2基團（在如所呈現之各分子中於左側處）的共同-O-NH2 可逆終止子部分（在如所呈現之各分子中於右側處）。本文亦考慮具有繫栓至諸如-O-NHCH3、-O-CH2N3之替代可逆終止子部分或諸如與核酸延伸之可逆終止一致之部分之另一部分的如本文所揭示之R2基團的類似去阻斷試劑以及此處所呈現或本文以其他方式揭示之R2部分。
圖3.與胞苷進行之去阻斷副反應之實例。此副反應解釋圖1A中所定量之dC降解中之至少一些。如圖1A中所指示，在R2尺寸增大之情況下，吾人看到本文所描繪之副反應減少。

Claims (30)

  1. 一種在核苷酸之3'位處由阻斷基置換保護基之方法，其包括使該核苷酸與包括結構R2-嵌段之試劑接觸，其中R2之分子量為至少24，其中R2-嵌段可溶於水，且其中嵌段包括阻斷基部分。
  2. 如請求項1之方法，其中嵌段包括可逆終止子部分。
  3. 如請求項2之方法，其中該可逆終止子部分不阻止藉此可逆地終止之核苷酸裝配成三元複合物。
  4. 如請求項1之方法，其中R2-嵌段選自由以下組成之群組：R2-O-NH2 、R2-O-NHCH3 、R2-O-NHCOCH3 或R2-O-CH2 N3 。
  5. 如請求項4之方法，其中R2-嵌段為R2-O-CH2 N3 。
  6. 如請求項4之方法，其中R2-嵌段為R2-O-NH2 。
  7. 如請求項4之方法，其中包括3'保護基之該核苷酸為：
    Figure 03_image370
    其中包括3'阻斷基之該核苷酸為：
    Figure 03_image372
    其中B為核鹼基；R1獨立地為鹵素、OCH3 、H或OH，Q獨立地為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或核酸，且R3及R4獨立地為H、CH3 、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環基)烷基或其視情況經取代之變異體。
  8. 如請求項4之方法，其中該保護基包括-O-肟。
  9. 如請求項8之方法，其中該-O-肟部分具有式：-O-N=C(R3)(R4)；且R3及R4獨立地為氫、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
  10. 如請求項9之方法，其中R3為氫。
  11. 如請求項10之方法，其中R4為氫。
  12. 如請求項4之方法，其中該核苷酸包括三磷酸酯部分。
  13. 如請求項4之方法，其中R2為-C(R6)(R7)(R8)、-C(O)(R6)、-P(O)(R6)(R7)、-C(R6)(=C(R7)(R8))、-Si(R6)(R7)(R8)、-SO2 (R6)、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基；且 R6、R7及R8獨立地為氫、鹵素、-CCl3 、-CBr3 、-CF3 、-CI3 、-CHCl2 、-CHBr2 、-CHF2 、-CHI2 、-CH2 Cl、-CH2 Br、-CH2 F、-CH2 I、-CN、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-NO2 、-SH、-SO3 H、-SO4 H、-SO2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHSO2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3 、-OCF3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、-OCHF2 、-OCH2 Cl、-OCH2 Br、-OCH2 I、-OCH2 F、-SF5 、-N3 、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之環烯基、經取代或未經取代之環炔基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜脂環基、經取代或未經取代之芳烷基、經取代或未經取代之雜芳烷基或經取代或未經取代之(雜脂環基)烷基。
  14. 如請求項13之方法，其中R2-嵌段具有選自由以下組成之群組之式：
    Figure 03_image374
    Figure 03_image376
    Figure 03_image378
    。
  15. 如請求項14之方法，其中R2-嵌段具有選自由以下組成之群組之式：
    Figure 03_image380
    Figure 03_image382
    。
  16. 如請求項15之方法，其中R2-嵌段具有式
    Figure 03_image384
    。
  17. 如請求項15之方法，其中R2-嵌段具有式
    Figure 03_image386
    。
  18. 如請求項15之方法，其中R2-嵌段具有式
    Figure 03_image388
    。
  19. 如請求項13之方法，其中R2包括羥化部分。
  20. 如請求項13之方法，其中R2包括至少兩個碳核、一氟核、碳-碳雙鍵、三級碳、第三丁基部分、環狀部分、矽核、苯基環、氮核、氧核或羥化部分。
  21. 如請求項13之方法，其中R2之分子量不超過280 g/mol。
  22. 如請求項13之方法，其中R2之分子量不超過100 g/mol。
  23. 如請求項4之方法，其中該方法在25℃下在不超過3小時內將代替3'保護基之阻斷基添加至至少94%之具有3'保護基之核苷酸群中。
  24. 如請求項23之方法，其中該方法在25℃下在不超過3小時內將代替3'保護基之阻斷基添加至至少98%之具有3'保護基之核苷酸群中。
  25. 如請求項24之方法，其中該方法降解各自包括胞嘧啶核鹼基之核苷酸群中不超過6%之胞嘧啶核鹼基。
  26. 如請求項25之方法，其中該方法降解來自具有胞嘧啶核鹼基之核苷酸群之不超過1%之胞嘧啶鹼基。
  27. 如請求項15之方法，其中該方法在25℃下在不超過3小時內將代替3'保護基之阻斷基添加至至少94%之具有3'保護基之核苷酸群中。
  28. 如請求項27之方法，其中該方法在25℃下在不超過3小時內將代替3'保護基之阻斷基添加至至少98%之具有3'保護基之核苷酸群中。
  29. 如請求項28之方法，其中該方法降解各自包括胞嘧啶核鹼基之核苷酸群中不超過6%之胞嘧啶核鹼基。
  30. 如請求項29之方法，其中該方法降解來自具有胞嘧啶核鹼基之核苷酸群之不超過1%之胞嘧啶核鹼基。
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