JPH04320699A - 核酸塩基配列の決定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な核酸の標識化方
法、それを利用した核酸塩基配列の決定方法及び塩基配
列決定用組成物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】サンガ−法のうちの、チェ−ンタ−ミネ
−タ−法は、指標として用いるため、１つのｄＮＴＰ（
２’−デオキシヌクレオシド三燐酸誘導体）に放射性同
位元素を含む化合物を使用する。従って、特定の管理施
設で有資格者が取り扱う必要があり、更に放射性標識試
薬の質が時間的経過に伴って変化することから、安定し
た測定系の維持が困難であるという欠点がある。

【０００３】一方、特開昭６３−１５２３６４号公報及
び特開平１−１８０４５５号公報には、放射性同位元素
を含む化合物の代わりに、蛍光標識された化合物を用い
る核酸塩基配列の決定方法が開示されている。

【０００４】この方法は、放射性同位元素を含む化合物
を使用せず、かつ、反応後そのまま塩基配列の解析に移
行できる点、簡便で迅速性に優れるが、上記標識された
化合物が、ヌクレオシド部分に比し、極めて嵩高い蛍光
標識部分を有するために、酵素によって取り込まれにく
いという欠点があり、このために、過剰の蛍光標識され
た化合物を用いる必要がある。

【０００５】更に、上記蛍光標識部分の嵩高さに起因し
て、塩基配列によって取り込まれ方に大きな相違が生じ
、又、得られる断片数が分子量等により大きく異なるこ
とになるので、蛍光で検出する際の蛍光強度のばらつき
の原因となり、塩基配列の解析が非常に困難という難点
がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の発明者らは、
核酸の標識化方法、及びそれを利用した核酸塩基配列の
決定方法について、永年に亘り鋭意研究を行なった結果
、既知の方法とは異なった、本発明の新規な方法が、蛍
光強度のばらつきを生ぜず、蛍光検出が容易であり、塩
基配列の解析が簡易かつ迅速・確実に行えることを見出
し、本発明を完成した。

【０００７】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明の新規な核
酸の標識化方法は、反応性官能基を有するヌクレオシド
三燐酸誘導体を用い、酵素による重合反応によって、核
酸鎖中に取り込ませ、次いで、前記反応性官能基を標識
化合物又は担体と結合させることを特徴とし、又、本発
明の新規な核酸塩基配列の決定方法は、サンガ−法のう
ちの、チェ−ンタ−ミネ−タ−法において、（１）ｄＮ
ＴＰとして、放射性同位元素を使用せず、（２）チェ−
ンタ−ミネ−タ−として、反応性官能基を有する３’−
デオキシヌクレオシド三燐酸誘導体を使用し、（３）相
補鎖ＤＮＡを合成した後、上記反応性官能基を標識化合
物と結合させることを特徴とし、更に、本発明の新規な
核酸の塩基配列決定用組成物は、少なくとも、（１）プ
ライマ− （２）酵素 （３）反応性官能基を有する３’−デオキシヌクレオシ
ド三燐酸誘導体 （４）標識化合物 （５）４種のｄＮＴＰ混液を含むことを特徴とするもの
である。

【０００８】以下に本発明を詳細に説明する。

【０００９】本発明において使用される、「反応性官能
基を有するヌクレオシド三燐酸誘導体」とは、標識化合
物と結合しうる「反応性官能基」を有する「ヌクレオシ
ド誘導体」のＯ５’−トリホスフェ−ト体を示し、次の
構造式で表される。

【化１】

【００１０】上記式中、Ｘ１で表される「反応性官能基
」とは、通常、共有結合、イオン結合のような結合に関
与しうる基であれば特に限定はないが、例えば、ニトロ
基、スルホン基、アミノ基、水酸基、メルカプト基、カ
ルボキシ基、アルデヒド基、カルボニル基、二重結合、
三重結合、アゾ基、アジド基、ニトロソ基を挙げること
ができ、更に好適には、スルホン基、アミノ基、水酸基
、メルカプト基、カルボキシ基、アルデヒド基、二重結
合、アジド基である。尚、Ｒ１は三燐酸を、Ｙ１及びＹ
２は水素原子又は水酸基をそれぞれ表している。

【００１１】上記のような「反応性官能基」Ｘ１は、中
間にＲ２を介在してヌクレオシド誘導体と結合しており
、このＲ２としては、例えば、メチレン、メチルメチレ
ン、エチレン、プロピレン、トリメチレン、テトラメチ
レン、１−メチルトリメチレン、２−メチルトリメチレ
ン、３−メチルトリメチレン、ペンタメチレン、ヘキサ
メチレンのような炭素数１乃至６個の直鎖又は分枝鎖ア
ルキレン基である低級アルキレン基（好適には、炭素数
１乃至４個の直鎖又は分枝鎖アルキレン基である。）；
例えば、２−プロペニレン、１−メチル−２−　プロペ
ニレン、２−エチル−２−　プロペニレン、２−ブテニ
レン、１−メチル−２−　ブテニレン、３−ブテニレン
、１−メチル　−３−　ブテニレン、２−ペンテニレン
、　１−メチル−２−　ペンテニレン、３−ペンテニレ
ン、１−メチル−３−　ペンテニレン、４−ペンテニレ
ン、１−メチル−４−　ペンテニレン、２−ヘキセニレ
ン、３−ヘキセニレン、４−ヘキセニレン、５−ヘキセ
ニレンのような炭素数２乃至６個の直鎖又は分枝鎖アル
ケニレン基である低級アルケニレン基（好適には、炭素
数２乃至４個の直鎖又は分枝鎖アルケニレン基である。 ）；例えば、２−プロピニレン、２−メチル−２−　プ
ロピニレン、２−エチル−２−　プロピニレン、２−ブ
チニレン、２−メチル−２−　ブチニレン、３−ブチニ
レン、１−メチル−３−　ブチニレン、２−ペンチニレ
ン、１−メチル−２−　ペンチニレン、３−ペンチニレ
ン、２−メチル−３−　ペンチニレン、４−ペンチニレ
ン、１−メチル−４−　ペンチニレン、２−ヘキシニレ
ン、３−ヘキシニレン、４−ヘキシニレン、５−ヘキシ
ニレンのような炭素数２乃至６個の直鎖又は分枝鎖アル
キニレン基である低級アルキニレン基（好適には、炭素
数２乃至４個の直鎖又は分枝鎖アルキニレン基である。 ）；イミノ基、酸素原子又は硫黄原子で中断された上記
低級アルキレン基；イミノ基、酸素原子又は硫黄原子で
中断された上記低級アルケニレン基；イミノ基、酸素原
子又は硫黄原子で中断された上記低級アルキニレン基等
を挙げることができる。

【００１２】「ヌクレオシド誘導体」とは、上記構造式
中、Ｂで示される「核酸塩基」が、「糖」と結合した化
合物をいい、このような「核酸塩基」とは、通常、核酸
塩基として、特異的にベ−スペアを形成するものであれ
ば特に限定はないが、例えば、アデニン、グアニン、ヒ
ポキサンチン、シトシン、ウラシル、チミン、７−デア
ザグアニン、７−デアザアデニンのような生体内核酸塩
基及びそれらの化学的に合成された類似体を挙げること
ができる。

【００１３】一方、上記のような「核酸塩基」と結合す
る「糖」としては、核酸に取り込まれうる糖であれば特
に限定はないが、例えば、リボ−ス、２’−デオキシリ
ボ−スのような３’α位に水酸基を有するリボ−ス誘導
体を挙げることができる。「ヌクレオシド誘導体」とし
て、具体的には、例えば、アデノシン、グアノシン、イ
ノシン、シチジン、ウリジン、チミジン、のような生体
内ヌクレオシド及びそれらの化学的に合成された類似体
を挙げることができる。

【００１４】尚、本発明核酸の標識化方法で使用する具
体的な「反応性官能基を有するヌクレオシド三燐酸誘導
体」としては、例えば、下記のような化合物（１）

【化
２】 を挙げることができる。

【００１５】「酵素」とは、「ヌクレオシド三燐酸誘導
体」と用いて、核酸鎖を伸長できる酵素であれば特に限
定はないが、例えば、Ｋｌｅｎｏｗ酵素、逆転写酵素、
Ｔ７ファ−ジのＤＮＡポリメラ−ゼ、ＳＥＱＵＥＮＡＳ
Ｅ（ＵＳＢ社）、ＴａｑのＤＮＡポリメラ−ゼのような
ＤＮＡポリメラ−ゼ及びＲＮＡポリメラ−ゼＩ、ＲＮＡ
ポリメラ−ゼＩＩ、ＲＮＡポリメラ−ゼＩＩＩ、Ｔ７フ
ァ−ジのＲＮＡポリメラ−ゼ、ＳＰ６ファ−ジのＲＮＡ
ポリメラ−ゼのようなＲＮＡポリメラ−ゼを挙げること
ができる。

【００１６】「標識化合物」とは、前記「反応性官能基
を有するヌクレオシド三燐酸誘導体」の「反応性官能基
」と結合しうる「反応基」を有する「標識基」をいい、
このような「反応基」とは、「反応性官能基を有するヌ
クレオシド三燐酸誘導体」の「反応性官能基」と結合し
うるものであれば特に限定はないが、例えば、アミノ基
、カルボキシ基、スルホン基、イソシアナ−ト基、イソ
チオシアナ−ト基、２，５−オキソ−ピロリジノオキシ
カルボニル基、４，６−ジクロル−１，３，５−トリア
ジン−２−イルを挙げることができ、「標識化合物」と
反応性官能基を有するヌクレオシド三燐酸誘導体」の「
反応性官能基」との反応は、例えば、適当な溶媒（例え
ば、リン酸緩衝液）中、活性エステル化法、カルボジイ
ミド法、酸無水物法等により達成され、場合によっては
、シクロヘキシルカルボジイミド等を縮合剤として用い
る方法により達成される。

【００１７】一方、「標識基」とは、電気泳動の後、何
らかの手段で検出できるものであれば特に限定はないが
、例えば、２，４−ジニトロフェノ−ル、３，３’−ジ
メトキシ−２，２’−ジヒドロキシビフェニル−５，５
’−酢酸、２，２’−ジヒドロキシビフェニル−５，５
’−ジアラニン、２，２’−ジヒドロキシビフェニル−
５，５’−ジエチルアミンのような２，２’−ジヒドロ
キシビフェニル誘導体、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル
）プロピオン酸、チラミン、ホモバニリン酸、ウンベリ
フェロン、ロ−ダミンＢ、エオシン、エスクリン、キニ
ン塩類、フルオレセイン誘導体のような蛍光又は燐光標
識基；ルミノ−ル、イソルミノ−ルのようなルミノ−ル
誘導体、ルシゲニン、ビス（２，４，６−トリクロロフ
ェニル）オキザレ−ト（ＴＣＰＯ）の様なオキザレ−ト
誘導体、ピロガロ−ル、８−アニリノナフタレン−１−
スルフォン酸のような化学発光標識基；ビオチン（アビ
ジンで発色）、１，２−ジアミノベンゼン、２，２’−
アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スル
ホン酸）のような発色標識基を挙げることができる。

【００１８】上記「標識化合物」としては、例えば、

【
化３】 で表されるものを挙げることができる。尚、式中、Ｘ２
は上記説明した標識基を、Ｙ３はカルボキシル基又はス
ルホン基をそれぞれ表している。

【００１９】更に、本発明核酸の標識化方法で使用する
具体的な「標識化合物」としては、例えば、下記のよう
な化合物（２）

【化４】 を挙げることができる。

【００２０】而して、「サンガ−法のうちの、チェ−ン
タ−ミネ−タ−法」とは、以下のとおりである。

【００２１】先ず、塩基配列の決定を目的とするＤＮＡ
断片を含む、一本鎖のベクタ−（塩基配列の決定を目的
とするＤＮＡ断片を、制限酵素で切りだし、常法に従っ
て、ベクタ−に組み込んだものである。このような制限
酵素は、通常、制限酵素として使用できるものであれば
特に限定はないが、好適には、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ，Ｋ
ｐｎＩ，ＳａｃＩ，ＳｍａＩ，ＸｍａＩ，ＢａｍＨＩ，
ＸｂａＩ，ＳａｌＩ，ＡｃｃＩ、ＨｉｎｃＩＩを挙げる
ことができる。又、使用されるベクタ−は、ベクタ−と
して一般に使用されているものであれば特に限定はない
が、例えば、Ｍ１３ｍｐシリ−ズを挙げることができ、
好適には、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９のような逆
向きのポリクロ−ニング部位を有するベクタ−である。 ）に、プライマ−ＤＮＡをアニ−リングさせ、上記説明
したＤＮＡポリメラ−ゼを用い、相補鎖ＤＮＡ合成反応
を行わせる。

【００２２】この際、４種類の反応系を作り、各反応系
には基質として４種類のｄＮＴＰと、チェ−ンタ−ミネ
−タ−として１種類のｄｄＮＴＰ（２’，３’−ジデオ
キシヌクレオシド三燐酸誘導体）を適当な濃度比で加え
ておく。例えば、ｄｄＧＴＰ（２’，３’−ジデオキシ
グアノシン三燐酸）を加えた場合には、ｄＮＴＰが順次
付加され、相補鎖ＤＮＡが５’末端から３’末端方向へ
伸長する際、ｄＧＴＰ（２’−デオキシグアノシン三燐
酸）分子の付加反応毎に、ある確率で一部の相補鎖ＤＮ
Ａ断片はｄｄＧＴＰを取り込むことになる。

【００２３】そして、この場合には、ｄｄＧＴＰは糖部
分の３’の位置に水酸基を欠損しているために伸長反応
はそこで停止する。従って、４種類の反応系に、各々ｄ
ｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ（２’，３’−ジデオキシシチジ
ン三燐酸）、ｄｄＡＴＰ（２’，３’−ジデオキシアデ
ノシン三燐酸）、ｄｄＴＴＰ（２’，３’−ジデオキシ
チミジン三燐酸）を加えることによって、塩基配列とし
てグアニン、シトシン、アデニン、チミンのところで伸
長反応を特異的に停止した様々な長さのＤＮＡ断片を容
易に得ることができる。

【００２４】この反応の際に、１つのｄＮＴＰのα位を
３２Ｐで標識しておけば、各ＤＮＡ断片は電気泳動後、
オ−トラジオグラフィ−により検出できるので、簡単に
塩基配列を決定できることになるが、本発明はこれを改
良した核酸塩基配列の決定方法を更に提供する。

【００２５】本発明の核酸塩基配列の決定方法で使用す
る「ｄＮＴＰ」とは、従来のサンガ−法においても使用
されている２’−デオキシヌクレオシド三燐酸誘導体の
総称であり、２’位に水酸基がなく、３’位に必ず水酸
基を有する前記「ヌクレオシド誘導体」のＯ５’−トリ
ホスフェ−ト体であり、又、２’位にアミノ基、アジド
基又はハロゲン原子を有していてもよく、具体的には、
例えば、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグ
アノシン、２’−デオキシイノシン、２’−デオキシシ
チジン、２’−デオキシウリジン、２’−デオキシチミ
ジンのような生体内ヌクレオシド及びそれらの化学的に
合成された類似体を挙げることができる。

【００２６】本発明の核酸塩基配列の決定方法において
は、上記チェ−ンタ−ミネ−タ−としての３’−デオキ
シヌクレオシド三燐酸誘導体に代えて、「反応性官能基
を有する３’−デオキシヌクレオシド三燐酸誘導体」を
使用する。この反応性官能基を有する３’−デオキシヌ
クレオシド三燐酸誘導体」とは、３’位に水酸基がない
前記「反応性官能基を有するヌクレオシド三燐酸誘導体
」のＯ５’−トリホスフェ−ト体をいう。

【００２７】そして、本発明方法では、従来のサンガ−
法と同様にして、相補鎖ＤＮＡを合成した後、上記反応
性官能基を標識化合物と結合させ、電気泳動等を利用す
ることにより、核酸の塩基配列を決定するのである。

【００２８】

【発明の効果】本発明により、主として、次のような効
果を得た。

【００２９】本発明では、反応性官能基を有するヌクレ
オシド三燐酸誘導体を先に核酸鎖中に取り込ませ、後か
ら標識化合物又は担体と結合させるので、従来法と異な
り、ヌクレオシド三燐酸誘導体が平均的に取り込まれ、
後述する実施例及び比較例に明らかな通り、本発明の方
法は、蛍光強度のばらつきを生ぜず、蛍光検出が容易で
あり、塩基配列の解析が簡易かつ迅速・確実に行える。

【００３０】又、従来法に比べ、使用する標識化合物の
量が少なくて済み、各工程に、熟練を必要とする工程が
含まれておらず、容易であり自動化が可能である。

【００３１】塩基配列は、ＡＴＣＧ４種について決定す
る必要があり、電気泳動を、常法通り、４レ−ンで行う
場合には、標識化合物は１種類でよい。

【００３２】更に、本発明の方法によって、４つの標識
化合物（例えば、波長の異なる４つの蛍光物質）、及び
それと各々特異的に結合する「反応性官能基を有するヌ
クレオシド三燐酸誘導体」を使用することにより、１つ
の容器で反応させ、しかも１レ−ンで塩基配列を解析す
ることが可能となった。例えば、「反応性官能基を有す
るヌクレオシド三燐酸誘導体」の反応性官能基が、アミ
ノ基の場合に、イソチオシアナ−ト基を有する蛍光物質
、「反応性官能基を有するヌクレオシド三燐酸誘導体」
の反応性官能基が、メルカプト基の場合に、無水マレイ
ン酸イミドを有する蛍光物質、「反応性官能基を有する
ヌクレオシド三燐酸誘導体」の反応性官能基が、カルボ
キシ基の場合に、アジド基を有する蛍光物質、「反応性
官能基を有するヌクレオシド三燐酸誘導体」の反応性官
能基が、アルデヒド基の場合に、アミノ基を有する蛍光
物質のような組み合わせを用いることによって、１つの
容器で反応させ、しかも１レ−ンで塩基配列を解析でき
るのである。

【００３３】又、ラベル化合物を使用しないので、特定
の管理施設で有資格者が取扱う必要がなく、標識試薬も
長期に亘り安定である。

【００３４】以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明
を更に具体的に説明する。

【００３５】

【実施例】（１）テンプレ−トＤＮＡの調製プラスミド
ＰＢＲ３２２を制限酵素であるＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩ
で切断し、約２００ｂｐの断片を、Ｍ１３ｍｐ１８に、
常法に従って組み込んだ。

【００３６】（２）相補ＤＮＡの合成 （１）で製造したテンプレ−トＤＮＡ　　３μｇ（１２
μｌ）、５×ＳＥＱＵＥＮＡＳＥの２００ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ・ＨＣｌ、２５０ｍＭ　　ＮａＣｌ及び１００ｍＭ
　　ＭｇＣｌ２の緩衝溶液（ｐＨ　　７．５）６μｌ、
プライマ−（Ｍ４、宝酒造製）１５ｎｇ（３μｌ）を加
え、混合した後、９５℃で２分間加温し、３０分かけて
３７℃まで冷却した。０．１μＭのジチオスレイト−ル
２．５μｌ、各々７５μＭのｄＮＴＰ混合物３．０μｌ
及び上記化合物（１）１０ｎｇ（１μｌ）を混合し、更
に、酵素ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳＢ社）を１μｌ加え
た。

【００３７】この溶液を、上記ＤＮＡ溶液に加え、３７
℃で５分間加温した。　　この系に、３０μｌの５Ｍ酢
酸アンモニウムを添加し、更に、１５０μｌのエタノ−
ルを加え、次いで、遠心（１２０００ｒｐｍ、１５分間
）し、エタノ−ルを除去した。これを、水３μｌに溶解
した後、９５℃で２分間加温した後、氷冷した。

【００３８】（３）色素による標識化 ｐＨ９の炭酸水素ナトリウム（１Ｍ）２μｌ、上記式（
２）で表される色素（１００μｇ／ｍｌ）を２μｌ加え
、室温で２時間放置した。次いで、エタノ−ル２０μｌ
を加え、混合した後、遠心（１２０００ｒｐｍ、１５分
間）し、エタノ−ルを除去した。

【００３９】（４）塩基配列の解析 ３μｌのホルムアミドに溶解後、自動シ−ケンサ−（Ｇ
ｅｎｅｓｉｓ２０００、デュポン社製）にて、５１５ｎ
ｍと５３６ｎｍの２種類の波長を用いて、常法に従い、
解析した。結果を、図１に示す。

【００４０】

【比較例】上記化合物（１）を使用せず、以下に構造式
で示す化合物を１０ｎｇ（１μｌ）使用した以外は、上
記実施例と同様にして、自動シ−ケンサ−（Ｇｅｎｅｓ
ｉｓ２０００、デュポン社製）にて、５１５ｎｍと５３
６ｎｍの２種類の波長を用いて、常法に従い、解析した
。結果を、図２に示す。

【化５】

【図面の簡単な説明】

【図１】　　図１は、実施例の結果を示す。

【符合の説明】　　縦軸は蛍光強度を示し、横軸は時間
を示し、実線は５３６ｎｍの蛍光強度変化を示し、破線
は、５１５ｎｍの蛍光強度変化を示す。

【図２】図２は、比較例の結果を示す。

【符合の説明】　　縦軸は蛍光強度を示し、横軸は時間
を示し、実線は５３６ｎｍの蛍光強度変化を示し、破線
は、５１５ｎｍの蛍光強度変化を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　反応性官能基を有するヌクレオシド三
   燐酸誘導体を用い、酵素による重合反応によって、核酸
   鎖中に取り込ませ、次いで、前記反応性官能基を標識化
   合物と結合させることを特徴とする核酸の標識化方法。
2. 【請求項２】　　サンガ−法のうちの、チェ−ンタ−ミ
   ネ−タ−法において、（１）ｄＮＴＰとして、放射性同
   位元素を使用せず、（２）チェ−ンタ−ミネ−タ−とし
   て、反応性官能基を有する３’−デオキシヌクレオシド
   三燐酸誘導体を使用し、（３）相補鎖ＤＮＡを合成した
   後、上記反応性官能基を標識化合物と結合させることを
   特徴とする核酸塩基配列の決定方法。
3. 【請求項３】　　少なくとも、 （１）プライマ− （２）酵素 （３）反応性官能基を有する３’−デオキシヌクレオシ
   ド三燐酸誘導体 （４）標識化合物 （５）４種のｄＮＴＰ混液を含む核酸の塩基配列決定用
   組成物。