CN114989235A - 用作dna合成测序的可逆终止物的基于新的二硫键接头的核苷酸的设计与合成 - Google Patents
用作dna合成测序的可逆终止物的基于新的二硫键接头的核苷酸的设计与合成 Download PDFInfo
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Abstract
本发明尤其公开了化合物、组合物以及它们在核酸测序中的使用方法。
Description
本申请是申请日为2016年9月28日、申请号为201680069556.3且发明名称为“用作DNA合成测序的可逆终止物的基于新的二硫键接头的核苷酸的设计与合成”的中国发明专利申请的分案申请。本申请要求享有US 62/233,950和US 62/257,102的优先权。
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年9月28日提交的第62/233,950号美国临时申请和2015年11月18日提交的第62/257,102号美国临时申请的权益，其通过整体引用并入本文并且用于全部目的。
引用“序列表”，即作为ASCII文件提交的表格或计算机程序清单附录。
特此通过引用将序列表并入，序列表记载在于2016年9月28日创建的文件160928_88050-A-PCT_Sequence_Listing_RBR中，3个字节，计算机版本IBM-PC，MS Windows操作系统。
背景技术
DNA测序是生物学和医学研究的基本工具，对个性化医学范式尤其重要。已经研究了各种新的DNA测序方法，目的是最终实现1000美元基因组测序的目标；主要方法是合成测序(SBS)，合成测序是一种在聚合酶反应期间确定DNA序列的方法。目前广泛使用的高通量SBS技术(Bentley DR，et al.Nature，2008，456，53-59)使用我们以前开发的可切割荧光核苷酸可逆终止物(NRT)测序化学过程((Ju J et al.2003，US Patent 6664079；Ju J etal.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103，19635-19640)。这些可切割的荧光NRT基于以下原理设计：通过将特有的可切割荧光团连接至特定位置的碱基并用小的可逆部分对3’-OH进行加帽(这使得它们仍然能够作为底物被DNA聚合酶识别)以对四种核苷酸(A、C、G、T)中的每一种进行改性。因此，可切割的荧光NRT涉及两个位点修饰(Ju J et al.2003，US Patent6664079；Ju J et al.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103，19635-19640)：在碱基上用作报道基团的荧光染料和用于加帽3′-OH基团以在用于序列测定的核苷酸掺入后暂时终止聚合酶反应的小的化学部分。在掺入和信号检测之后，切下荧光团并除去3′-OH加帽部分以在下一个循环中恢复聚合酶反应。已证明这些可切割的荧光NRT是再造工程化聚合酶的良好底物，并已广泛用于下一代DNA测序系统(Ju J et al.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103，19635-19640；Bentley DR，et al.Nature，2008，456，53-59)。此外，因为在每个循环中仅识别一个碱基，使得能够准确地测定均聚物序列。
为了在SBS策略中获得长的读段长度，以下要求是必要的：在测序反应过程中可切割的接头是稳定的，几乎没有操作并且在切割反应后没有在碱基上留下长尾巴。
发明内容
具有下式的化合物：
其中
B为碱基；
L1为共价接头；
L2为共价接头；
R3为-OH、单磷酸酯、多磷酸酯或核酸；
R4A为氢、-CH3、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-CN、-Ph，、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R4B为氢、-CH3、-CX2 3、-CHX2 2、-CH2X2、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R5为可检测标签或锚部分；
R6为氢或聚合酶相容的可切割部分；
R7为氢或-OR7A，其中R7A为氢或聚合酶相容的可切割部分；
X1和X2独立地为卤素。
附图说明
图1A-1B：使用3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(其中“DTM”是指二硫基甲基)的SBS。(步骤1)将DNA聚合酶添加至带有引物的模板部分(以上仅示出引物链)使得在引物的3′末端以较高的效率和特异性掺入互补的3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料。(步骤2)在洗去未掺入的标记的分子后，检测连接于引物延伸产物的特有标签以确定掺入的核苷酸的身份。(步骤3)添加TCEP或THP以切割二硫键，因此使得引物延伸产物上的标签被去除，并再次产生引物延伸产物上的3′-OH。重复步骤1到步骤3使得能够进行连续的DNA序列测定。图1B：使用3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-“锚”和相应的标记的结合分子的SBS。(步骤1)将DNA聚合酶添加至带有引物的模板部分(以上仅示出引物链)使得在引物的3′末端以较高的效率和特异性掺入互补的3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS(DTM)-“锚”。(步骤2)向相应的引物延伸产物添加标记的结合分子导致标记的结合分子与引物延伸产物碱基上的相应“锚”部分正交结合；在洗去未结合的标记的分子后，检测连接于引物延伸产物的特有标签以确定掺入的核苷酸的身份。(步骤3)添加TCEP或THP以切割二硫键，因此使得引物延伸产物上的标签被去除，并在此生成引物延伸产物上的3′-OH。重复步骤1到步骤3使得能够进行连续的DNA序列测定。“锚”部分和标记的结合分子包括可以形成共价键或稳定的非共价键的任何特异反应性的配对物。该标签可以是荧光分子、FRET盒或荧光树枝状大分子。
图2：3′-O-DTM-dNTP-SS-染料(3′-O-叔丁基二硫基甲基-dCTP-5-SS-Alexa488、3′-O-叔丁基二硫基甲基-dUTP-5-SS-R6G、3′-O-叔丁基二硫基甲基-dATP-7-SS-Rox)和3′-O-叔丁基二硫基甲基-dGTP-7-SS-Cy5(其中“DTM”是指二硫基甲基)的结构。
图3A-3E：3′-O-DTM-dNTP-SS-生物素(3′-O-叔丁基二硫基甲基-dATP-7-SS-生物素、3′-O-叔丁基二硫基甲基-dGTP-7-SS-生物素、3′-O-叔丁基二硫基甲基-dUTP-5-SS-生物素、3′-O-叔丁基二硫基甲基-dCTP-5-SS-生物素)和作为示例性标记部分的Cy5染料标记的链霉亲和素(可将多种Cy5染料连接到单个链霉亲和素分子以增加检测灵敏度)的结构。
图4A-4D：使用3′-O-DTM-dNTP-SS-生物素和Cy5标记的链霉亲和素的单色SBS。通过使用四种3′-O-DTM-dNTP-SS-生物素之一(图3A-3E)进行DNA聚合酶掺入反应，随后添加Cy5标记的链霉亲和素并成像以确定DNA序列，如步骤1至步骤4中所述(如图4A步骤1所示，并在图4A-4D步骤2-4中所重复的)。每个步骤由三部分组成：(a部分)加入聚合酶和四种3′-O-DTM-dNTP-SS-生物素中的一种，然后洗涤；如果添加的核苷酸与模板上紧邻引物3′末端的核苷酸互补，则添加的核苷酸将掺入引物中以产生具有生物素的DNA延伸产物。(b部分)加入Cy5标记的链霉亲和素，其将与DNA延伸产物上的生物素结合。(c部分)在洗去未结合的Cy5标记的链霉亲和素后，进行成像以检测Cy5信号从而鉴定掺入的核苷酸。在步骤4之后，向DNA延伸产物添加THP将切割二硫键并在DNA延伸产物的3′端重新生成游离的3′-OH基团。连续重复所述由步骤1至步骤4组成的过程，然后进行THP切割，这使得可以连续进行序列测定。
图5：3′-O-DTM-dNTP-SS-“锚”(3′-O-叔丁基二硫基甲基-dATP-7-SS-TCO、3′-O-叔丁基二硫基甲基-dCTP-5-SS-PBA、3′-O-叔丁基二硫基甲基-dGTP-7-SS-生物素、3’-O-叔丁基二硫基甲基-dUTP-5-SS-N3)的结构。在这组核苷酸类似物中，通过DTM连接分别将四种不同的“锚”部分TCO、PBA、生物素和叠氮基连接到dATP、dCTP、dGTP和dTTP的碱基上，如该图所示。
图6：与图4中所列的核苷酸类似物(3’-O-叔丁基二硫基甲基-dATP-7-SS-TCO、3’-O-叔丁基二硫基甲基-dCTP-5-SS-PBA、3’-O-叔丁基二硫基甲基-dGTP-7-SS-生物素、3’-O-叔丁基二硫基甲基-dTTP-5-SS-N3)中的四种“锚”部分特异性结合的四色标记的正交结合分子(Rox-标记的四嗪、Alexa488-标记的SHA、Cy5-标记的链霉亲和素和R6G-标记的二苯并环辛炔)的结构如下所示：Rox连接到四嗪(四嗪与TCO发生特异性反应)；Alexa488连接到SHA(SHA与PBA形成稳定的复合物)；Cy5连接到链霉亲和素(链霉亲和素与生物素形成稳定的复合物)；R6G连接到二苯并环辛炔(DBCO，其与N3基团快速形成的三唑部分)。因此，可使用特有的荧光染料对图5中列出的每种核苷酸类似物进行标记。
图7：DNA产物之间的缀合物或复合物，其中通过使用四种相应匹配的标记的结合分子(Rox-标记的四嗪、Alexa488-标记的SHA、Cy5标记的链霉亲和素和R6G标记的二苯并环辛炔)掺入锚标记的3′-O-DTM-核苷酸(3′-O-叔丁基二硫基甲基-dATP-7-SS-TCO、3′-O-叔丁基二硫基甲基-dCTP-5-SS-PBA、3’-O-叔丁基二硫基甲基-dGTP-7-SS-生物素、3′-O-叔丁基二硫基甲基-dUTP-5-SS-偶氮)产生所述DNA产物。在碱基上含有四个“锚”部分的DNA延伸产物(图5)与四种相应匹配的标记的结合分子(图6)的反应导致DNA延伸产物中每个掺入的核苷酸被特有的染料标记。因此，Rox将通过特异性的四嗪TCO连接与DNA延伸产物连接以形成产物1；Alexa488将通过稳定的PBA-SHA复合物与DNA延伸产物连接形成产物2；Cy5将通过生物素链霉亲和素复合物连接到DNA延伸产物以形成产物3；R6G将通过二苯并环辛炔和叠氮基之间发生链接反应形成三唑连接至DNA延伸产物以形成产物4。
图8：使用3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-“锚”(3′-O-叔丁基二硫基甲基-dATP-7-SS-TCO、3′-O-叔丁基二硫基甲基-dCTP-5-SS-PBA、3′-O-叔丁基二硫基甲基-dGTP-7-SS-生物素、3′-O-叔丁基二硫基甲基-dUTP-5-SS-N3)和四种相应匹配的染料标记的结合分子(Rox-标记的四嗪、Alexa488-标记的SHA、Cy5标记的链霉亲和素和R6G标记的二苯并环辛炔)的SBS。将DNA聚合酶和4种3′-O-SS(DTM)-DNTP-SS-“锚(3′-O-DTM-dATP-7-SS-TCO、3′-O-DTM-dCTP-5-SS-PBA、3′-O-DTM-dGTP-7-SS-生物素和3′-O-DTM-dUTP-5-SS-N3)(图5)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得互补的核苷酸类似物掺入生长中的DNA链来终止DNA合成。在洗去未掺入的核苷酸类似物后，加入染料标记的结合分子(图6)；这些分子将特异性地与DNA延伸产物上的四个特有“锚”部分中的每一个连接，以使得能够使用四种不同的荧光染料(图7)标记用四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的每一种终止的每种DNA产物。检测来自DNA产物上的每种荧光染料特有的荧光信号使得能够鉴定掺入的核苷酸。接下来，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应(如图中后续步骤所示)做好准备。
图9A-9C：荧光(Cy5)树状聚合物缀合的四嗪(图9A和图9C)和3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-TCO(图9B)的结构。在聚合酶反应中将四种3′-O-DTM-dNTP-SS-TCO中的每一种掺入生长的DNA链中以终止DNA合成，产生具有TCO基团的DNA产物。具有TCO基团的DNA产物通过TCO-四嗪连接与具有四嗪部分的分子A(图9A)或分子B(图9C)偶联使得DNA产物能够被多种荧光染料标记，由此促进检测信号放大从而在单分子水平或整体水平上进行SBS(按照类似于图4A-4D所示方案的方案进行)。
图10：基于肽的荧光(Cy5)树状聚合物缀合的四嗪(分子A)和聚合物缀合的四嗪(分子B)的实例。在聚合酶反应中将四种3′-O-DTM-dNTP-SS-TCO中的每一种掺入生长的DNA链中以终止DNA合成，产生具有TCO基团的DNA产物。具有TCO基团的DNA产物与具有四嗪部分的分子A或分子B(如上所示)通过TCO-四嗪连接结合使得DNA产物可以被多种荧光染料标记，从而促进检测信号放大从而在单分子水平或整体水平上进行SBS(按照类似于图4所示方案的方案进行)。
图11A-11D：FRET盒标记的结合分子的实例。FRET盒策略通过改变供体和受体荧光团之间的距离来提供许多不同的FRET信号特征。与这种具有四个特有的FRET信号特征的FRET盒缀合的结合分子使得这种FRET盒能够使用“锚”部分连接反应与DNA延伸产物结合；这使得能够通过FRET使用具有不同发射的两种不同荧光染料来进行无疤2-色SBS以鉴定四种DNA碱基。在上面显示的一组FRET盒标记的结合分子中，分别充当供体和受体的Rox和Cy5与7个或3个dSpacer单体连接以产生两个不同的FRET盒：FRET盒A(连接到SHA的Rox-7-Cy5)，其在Rox和Cy5之间具有7个dSpacer单体的长间隔距离，从供体(Rox)到受体(Cy5)的能量转移效率较低，由此产生弱的Cy5发射信号和强的Rox发射信号；FRET盒B(与反式环辛烯TCO连接的Rox-3-Cy5)在Rox和Cy5之间具有3个dSpacer单体的短间隔距离，从供体(Rox)到受体(Cy5)的能量转移效率将较高，从而产生强的Cy5信号和弱的Rox信号。在标记分子C中，其中单个Rox连接到四嗪，只有Rox信号是可检测的。在标记分子D(图11D)中，其中单个Cy5连接至链霉亲和素，仅Cy5信号是可检测的。根据与图8所示方案类似的方案，通过执行以下步骤进行SBS以对DNA进行测序：将DNA聚合酶和四种3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-“锚”(3′-O-DTM-dATP-7-SS-TCO、3′-O-DTM-dCTP-5-SS-PBA、3′-O-DTM-dGTP-7-SS-生物素和3′-O-DTM-dTTP-5-SS-N3)加入经固定化的带有引物的DNA模板使互补核苷酸类似物能够掺入生长的DNA链以终止DNA合成。在洗去未掺入的核苷酸类似物后，添加染料标记的结合分子(A、B、C、D)，这些分子将与每个DNA延伸产物上的四个特有的“锚”部分中的每一种特异性连接，使得由具有四种不同的荧光信号的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的每一种终止的DNA产物能够被标记。检测来自标记的DNA产物中的特有的荧光信号以鉴定掺入的核苷酸。接下来，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而除去荧光标签并在DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应做好准备。
图12：FRET盒标记的结合分子(例如SHA、四嗪、DBCO、链霉亲和素等)的一般方案。通过改变供体和受体荧光团之间的距离，FRET盒的使用提供了许多不同的FRET信号特征(A、B、C、D)。按照与图8所示的方案类似的方案，通过进行以下步骤执行SBS以对DNA进行测序：将DNA聚合酶和四个3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-“锚”(3′-O-DTM-dATP-7-SS-TCO、3′-O-DTM-dCTP-5-SS-PBA、3′-O-DTM-dGTP-7-SS-生物素和3′-O-DTM-dUTP-5-SS-N3)加入经固定化的带有引物的DNA模板，使得能够将互补核苷酸类似物掺入生长的DNA链以终止DNA合成。洗去未掺入的核苷酸类似物后，添加染料标记的结合分子(A、B、C、D)，该分子将与每种DNA延伸产物上的四个特有“锚”部分中的每一个特异性连接，使得每个DNA产物被具有四种不同的荧光信号的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种终止。检测来自标记的DNA产物的特有的荧光信号以鉴定掺入的核苷酸。接下来，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光标签并在DNA延伸产物上重新产生游离的3′-OH基团，这为进行下一个DNA测序循环反应做好准备。
图13A-13F：3′-O-DTM-dNTP-SS-染料(3′-O-DTM-dATP-7-SS-Rox、3′-O-DTM-dCTP-5-SS-Alexa488)；3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-“锚”(3′-O-DTM-dGTP-7-SS-TCO和3′-O-DTM-dUTP-5-SS-N3)以及它们相应的染料标记的结合分子(Rox标记的四嗪和Alexa488标记的二苯并环辛炔)的实例结构。
图14A-14B：使用3′-O-DTM-dNTP-SS-染料(3′-O-DTM-dATP-7-SS-Rox、3′-O-DTM-dCTP-5-SS-Alexa488)；3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-“锚”(3′-O-DTM-dGTP-7-SS-TCO和3′-O-DTM-dUTP-5-SS-N3)以及它们相应的染料标记的结合分子(Rox标记的四嗪和Alexa488标记的二苯并环辛炔)进行2-色DNA SBS。将DNA聚合酶和四个核苷酸类似物(3′-O-DTM-dATP-7-SS-TCO、3′-O-DTM-dCTP-5-SS-Alexa488、3′-O-DTM-dGTP-7-SS-TCO和3′-O-DTM-dUTP-5-SS-N3)加入经固定化的带有引物的DNA模板，使得能够将互补核苷酸类似物掺入生长的DNA链以终止DNA合成(步骤1)。洗去未掺入的核苷酸类似物后，检测来自Rox和BodipyFL的荧光信号以鉴定掺入的核苷酸为A(由Rox标记)和C(由BodipyFL标记)。接下来，用染料标记的结合分子(RoX-四嗪和BodipyFL-二苯并环辛炔)加入DNA延伸产物(步骤2)，这些分子将与每个DNA延伸产物上的两个特有的“锚”部分(TCO和N3)特异性连接，使得由两种核苷酸类似物(G和T)中的每一种终止的每个DNA产物能够被两种不同的荧光染料标记(以G终止的情况用Rox标记，以T终止的情况用BodipyFL标记)。检测来自DNA延伸产物上的RoX和BodipyFL的新产生的特有荧光信号(除来自步骤1的信号外)，这使得可以鉴定新掺入的核苷酸，分别为G和T。接下来，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光标签并在DNA延伸产物上重新产生游离的3′-OH基团(步骤3)，这为进行下一个DNA测序循环反应做好准备。
图15A-15B：通过不同的可切割接头(在本图括号中突出显示)与荧光染料缀合的标记的结合分子的结构。通过偶氮连接将四嗪连接至ATTO647N(四嗪-偶氮(接头)-ATTO647N)，偶氮连接可以被连二亚硫酸钠(Na2S2O4)切割；链霉亲和素经由二甲基缩酮连接至ATTO647N(链霉亲和素-二甲基缩酮(接头)-ATTO647N)，二甲基缩酮连接可以在弱酸性条件(如柠檬酸缓冲液(pH4))下被切割；通过可光切割的硝基苄基连接将SHA连接至ATTO647N(SHA-2-硝基苄基(接头-ATTO647N)，硝基苄基连接可通过光照射被切割；通过烯丙基连接将DBCO连接至ATTO647N(二苯并环辛炔-烯丙基(接头)-ATTO647N)，烯丙基连接可被Pd(0)切割；也可以通过Dde连接将DBCO连接到ATTO647N(二苯并环辛炔-Dde(接头)-ATTO647N)，Dde连接可以被肼切割。ATTO647N标记的链霉亲和素(链霉亲和素-ATTO647N)也可以与通过不同的可切割接头与荧光染料缀合的三种其他结合分子组合使用。
图16A-16B：用于在单分子水平或在整体水平执行单色SBS的3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-“锚”(3′-O-DTM-dATP-7-SS-N3、3′-O-DTM-dCTP-5-SS-生物素、3′-O-DTM-dUTP-5-SS-TCO)以及它们相应的、通过不同的可切割接头与荧光染料缀合的标记的结合分子[DBCO-偶氮(-N＝N-接头)-ATTO647N、四嗪-Dde(接头)-ATTO647N和链霉亲和素-ATTO647N]、以及3′-O-叔丁基-SS(DTM)-dGTP(3′-O-SS-dGTP)的实例结构。
图17A-17B：单色SBS反应方案方法1：(1)在DNA聚合酶存在下，将具有锚的三种核苷酸[3′-O-DTM-dATP-7-SS-N3、3′-O-DTM-dCTP-5-SS生物素、3′-O-DTM-dUTP-5-SS-TCO]和3’-叔丁基-SS(DTM)-dGTP(如图16所示)加入带有引物的DNA模板使得能够掺入引物；(2)通过将DBCO-偶氮-(-N＝N-接头)-ATTO647N、四嗪-Dde(接头)-ATTO647N和链霉亲和素-ATTO647N(如图16中所示)添加到含有掺入的具有锚的核苷酸类似物的DNA延伸产物来连接荧光标记(例如ATTO647N)，这使得所有掺入的核苷酸(除G外)由于特异性的锚-结合分子相互作用而被标记；(3)洗涤后，进行第一轮成像，由A、C和T终止的所有DNA产物均显示相同的颜色，而不发出信号的DNA产物是由核苷酸G终止的；(4)通过用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)处理来进行第一次切割(I)，连二亚硫酸钠仅切割偶氮键以从由A核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料。进行第二轮成像。如果荧光信号在切割I后消失，则确定DNA产物中掺入的A核苷酸；(5)通过用肼(N2H4)处理进行第二次切割(II)，肼(N2H4)将切割Dde连接以从由T核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料。进行第三轮成像。如果切割II后荧光信号消失，则确定DNA产物中掺入了T核苷酸。通过推断确定荧光信号未改变的DNA产物由C核苷酸终止；(6)用THP进行第三次切割(III)以切割二硫键并除去C上的染料，因此在THP处理后信号的变化证实了DNA产物由C核苷酸终止。同时，THP处理也将切割DTM(SS)键以在所有DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH，这为随后的单色DNA SBS循环做好准备。(7)重复步骤1-6以继续随后的单色DNA SBS循环。
图18A-18B：用于在单分子水平或整体水平上进行单色SBS的3′-O-DTM-dNTP-SS-染料(3′-O-DTM-dATP-7-SS-Rox)、3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-“锚”(3’-O-DTM-dUTP-5-SS-N3和3′-O-DTM-dCTP-5-SS-生物素)及其相应的、经由不同的可切割接头与一种荧光染料缀合的标记的结合分子[DBCO-偶氮(-N＝N-接头)-Rox和链霉亲和素-Rox]、以及3’-O-叔丁基-SS-(DTM)-dGTP(3′-O-SS-dGTP)的实例结构。
图19A-19B：单色SBS反应方案方法2：(1)在DNA聚合酶存在下，将两种锚标记的核苷酸(3′-O-DTM-dUTP-5-SS-N3和3′-O-DTM-dCTP-5-SS-生物素)、3′-O-DTM-dATP-7-SS-Rox和3’-O-叔丁基-SS(DTM)-dGTP，如图18所示，加入带有引物的DNA模板以使得能够掺入引物；(2)洗涤后，进行第一轮成像，由A核苷酸类似物终止的DNA产物显示Rox信号，因此确定已掺入A核苷酸，而其他由G、C、T终止的DNA产物不会显示任何荧光信号；(3)通过将DBCO-偶氮-(-N＝N-接头)-Rox和链霉亲和素-Rox(如图18所示)添加到含有掺入的锚标记的核苷酸类似物的DNA延伸产物来连接荧光标记(例如Rox)，这使得所有掺入的核苷酸(除G外)由于特异性的锚-结合分子相互作用而被标记；(4)洗涤后，进行第二轮成像，由A、C和T终止的DNA产物均显示相同的Rox信号，而不发出信号的DNA产物由核苷酸G终止；(5)通过用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)处理进行第一次切割(I)，连二亚硫酸钠(Na2S2O4)仅切割偶氮键以从由T核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第二轮成像。如果Rox荧光信号在切割I后消失，则确定DNA产物掺入了T核苷酸；(6)用THP进行第二次切割(II)以切割二硫键并从由核苷酸A和C终止的DNA延伸产物中除去染料，因此在THP处理后信号的变化将DNA产物确定为由核苷酸C终止，因为已经在上述第一轮成像中确定了由A核苷酸终止的DNA产物。同时，THP处理也将切割DTM(SS)键以在所有DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH，这为随后的单色DNA SBS循环做好准备。重复步骤1-6以继续后续的单色DNA SBS循环。
图20A-20B：用于在单分子水平或整体水平上进行单色SBS的3′-O-DTM-dNTP-SS-染料(3′-O-DTM-dATP-7-SS-Rox)、3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-“锚”(3′-O-DTM-dUTP-5-SS-TCO、3′-O-DTM-dCTP-5-SS-生物素和3′-O-DTM-dGTP-7-SS-N3)及其相应的、经由不同的可切割接头与一种荧光染料缀合的标记的结合分子[四嗪-Dde(接头)-Rox、链霉亲和素-Rox、DBCO-偶氮(-N＝N-接头)-Rox]的实例结构。
图21A-21F：单色SBS反应方案方法3：(1)在DNA聚合酶存在下，将三种锚标记的核苷酸(3′-O-DTM-dUTP-5-SS-TCO、3′-O-DTM-dCTP-5-SS-生物素和3′-O-DTM-dGTP-7-SS-N3)和3′-O-DTM-dATP-7-SS-Rox(如图20所示)添加到带有引物的DNA模板以使得能够掺入到引物中；(2)洗涤后，进行第一轮成像，由A核苷酸类似物终止的DNA产物显示Rox信号，因此确定已掺入A核苷酸，而其他由G、C、T终止的DNA产物不会显示任何荧光信号；(3)通过将DBCO-偶氮-(-N＝N-接头)-Rox、四嗪-Dde-Rox和链霉亲和素-Rox(如图20所示)添加到含有掺入的锚标记的核苷酸类似物的DNA延伸产物来将荧光标记(例如Rox)连接到DNA上，这使得所有掺入的核苷酸由于特异性的锚-结合分子相互作用而被标记；(4)洗涤后，进行第二轮成像，由A、G、T、C终止的DNA产物都显示相同的Rox信号。从在第一轮成像中被确定为由A核苷酸终止的DNA产物中减去Rox信号，结果显示由G、T、C终止的DNA产物；(5)通过用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)处理来进行第一次切割(I)，连二亚硫酸钠(Na2S2O4)仅切割偶氮键以从由G核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第二轮成像。如果Rox荧光信号在切割I后消失，则确定DNA产物掺入了G核苷酸；(6)用肼(N2H4)进行第二次切割(II)，其将切割Dde键以从由T核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第三轮成像。如果Rox荧光信号在切割II后消失，则确定DNA产物掺入了T核苷酸。如果Rox荧光信号在切割II后保留，则确定DNA产物掺入了C核苷酸；(7)用THP进行第三次切割(III)以切割二硫键并从由核苷酸A和C终止的DNA延伸产物中除去Rox染料，因此在THP处理后信号的变化证实DNA产物由C核苷酸终止，因为已经在上述第一轮成像中确定了由A核苷酸终止的DNA产物。同时，THP处理也将切割DTM(SS)键以在所有DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH，这为随后的单色DNA SBS循环做好准备。重复步骤1-7以继续随后的单色DNA SBS循环。
图22：3′-O-SS-dNTP-可切割的接头-染料(3′-O-DTM-dATP-7-SS-Rox、3′-O-DTM-dCTP-5-硝基苄基-Rox和3′-O-DTM-dUTP-5-烯丙基-Rox)和3′-O-SS(DTM)-dGTP的结构。
图23A-23D：单色SBS反应方案方法4：(1)在DNA聚合酶存在下，将三种3′-O-DTM-dNTP-可切割的接头-染料(3′-O-DTM-dATP-7-SS-Rox、3′-O-DTM-dCTP-5-硝基苄基-Rox和3′-O-DTM-dUTP-5-烯丙基-Rox)和3′-O-叔丁基-SS-dGTP(如图22所示)添加到带有引物的DNA模板以使得能够掺入到引物中；(2)洗涤后进行第一轮成像，由C、T和A终止的DNA产物均显示相同的Rox信号，而不发出信号的DNA产物由核苷酸G终止；(3)通过～350nm的光照射进行第一次切割(I)以从由C核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第二轮成像。如果Rox荧光信号在切割I后消失，则确定DNA产物掺入了C核苷酸；(4)用Pd(0)进行第二次切割(II)，Pd(0)将切割烯丙基连接以从由T核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第三轮成像。如果Rox荧光信号在切割II后消失，则确定DNA产物掺入了T核苷酸。如果Rox荧光信号在切割II后仍然存在，则确定DNA产物掺入A核苷酸；(5)用THP进行第三次切割(III)以切割二硫键并从由核苷酸A终止的DNA延伸产物中除去Rox染料，因此在THP处理后信号的变化证实DNA产物由A核苷酸终止。同时，THP处理也将切割DTM(SS)键以在所有DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH，这为随后的单色DNA SBS循环做好准备。重复步骤1-4以继续后续的循环。
图24A-24B：用于四色测序的四种3’-O-SS-dNTP-(SS)可切割的接头-染料和3’-O-SS-dNTP的结构(使用这些核苷酸的测序数据在图32中示出)。
图25A-25F：具有追加的四色SBS。使用3’-O-SS-(DTM)-dNTP-SS-染料(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP-SS-Rox、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP-SS-Alexa488、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP-SS-Cy5、3’-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dUTP-SS-R6G)(图24)和4种3’-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dNTP(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)(图24)的SBS。步骤1，标记：将DNA聚合酶和四种3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP-SS-Rox、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP-SS-Alexa488、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP-SS-Cy5、3’-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dUTP-SS-R6G)加入经固定化的带有引物的DNA模板使得能够将互补的染料标记的核苷酸类似物掺入到生长的DNA链中，生长的DNA链由具有四种不同荧光染料的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的每一种终止。步骤2：追加：将DNA聚合酶和4种3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dNTP(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板，使互补的3′-O-SS-核苷酸类似物能够结合到生长的DNA链上，该生长的DNA链未被步骤1中染料标记的3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dNTP之一延长。该生长的DNA链由具有四种不同的荧光染料的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)之一终止，或由不含染料的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的同一种终止。洗去未掺入的核苷酸类似物后(步骤3)，检测来自DNA产物上每种荧光染料特有的荧光信号以鉴定掺入的核苷酸从而进行序列测定(步骤4)。接下来，在步骤5中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH基团，这为进行下一个循环的DNA测序反应做好准备。
图26A-26F：无追加的四色SBS。使用3’-O-SS-(DTM)-dNTP-SS-染料(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP-SS-Rox、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP-SS-Alexa488、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP-SS-Cy5、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dUTP-SS-R6G)(图24)的SBS。步骤1，将DNA聚合酶和4种3’-O-SS-(DTM)-dNTP-SS-染料(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP-SS-Rox、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP-SS-Alexa488、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP-SS-Cy5、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dUTP-SS-R6G)加入经固定化的带有引物的DNA模板使互补的核苷酸类似物能够掺入生长的DNA链中。生长的DNA链是由具有四种不同的荧光染料的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的每一种终止。在洗涤(步骤2)以除去未掺入的染料标记的核苷酸类似物后，检测来自DNA产物上的每种荧光染料特有的荧光信号(步骤3)以鉴定掺入的核苷酸。接下来，在步骤4中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH基团，这为下一个循环的DNA测序反应做好准备。
图27A-27B：使用标记和未标记的可逆终止物的混合物的四色SBS。使用3’-O-SS-(DTM)-dNTP-SS-染料(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP-SS-Rox、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP-SS-Alexa488、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP-SS-Cy5、3’-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dUTP-SS-R6G)(图24)和4种3’-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dNTP(3’-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)(图24)的SBS。步骤1，将DNA聚合酶、4种3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3’-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP-SS-Rox、3’-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP-SS-Alexa488、3’-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP-SS-Cy5、3’-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dUTP-SS-R6G)和4种3’-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dNTP(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定化的带有引物的DNA模板使互补的核苷酸类似物能够掺入到生长的DNA链中。生长的DNA链由具有四种不同荧光染料或没有染料标记的四种不同核苷酸类似物(A、C、G、T)中的每一种终止。在洗去(步骤2)未掺入的核苷酸类似物后，检测来自DNA产物上的每种荧光染料特有的荧光信号(步骤3)以鉴定掺入的核苷酸。接下来，在步骤4中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH基团，这为下一个循环的DNA测序做好准备。
图28A-28B：具有追加(chasing)和步移(walking)的四色SBS。在该实例中，将具有3′-O-保护基的四种荧光核苷酸类似物以及四种未标记的保护核苷酸一起加入以进行如前述实例(图27)中所述的测序。接下来，将DNA变性以去除延伸的引物。将原始引物重新退火得到DNA模板。之后，将三种天然核苷酸和一种3′-O-保护的核苷酸(全部未标记)加入到原始带有引物的模板中以延伸至与下一次出现单个3′-O-保护的核苷酸互补的位置。重复该操作足够多的次数以快速步移到大约在先测序运行结束的位置(步移中的步数将由目标基因组中的预期碱基频率决定)。此时，添加四种标记的和四种未标记的3′-O-保护的核苷酸以产生新的序列读段，该序列读段从先前读取停止的位置开始延伸。可重复序列-变性-步移方案多次以获得比没有步移的情况下可获得的序列长得多的序列。
图29A-29H：MALDI-TOF MS光谱，其显示分别使用3′-SS-dATP-SS-Rox(分子量1344)、3′-SS-dCTP-SS-Alexa488(分子量1319)、3′-SS-dGTP-SS-Cy5(分子量1482)和3′-SS-dUTP-SS-R6G(分子量1233)(结构如图24所示)时单碱基延伸和切割产物。预期延伸产物的质量分别为7253道尔顿、6288道尔顿、7438道尔顿和6221道尔顿。预期切割产物的质量为6451道尔顿、5488道尔顿、6515道尔顿和5508道尔顿。y轴显示百分比强度，而x轴显示质量(m/z)。
图30A-30D：示例结构和使用四种3′-O-乙基-二硫基甲基-dNTP可逆终止物(3′-O-SS-乙基-dNTP或3′-O-DTM-dNTP)进行连续DNA合成测序的实验方案(左)以及从每步延伸和切割获得的MALDI-TOF MS谱(右)。THP＝(三(羟丙基)膦)。预期延伸产物的质量分别为4381Da、4670Da、4995Da和5295Da。预期切割产物的质量为4272Da、4561Da、4888Da和5186Da。图30B所示的测量质量在MALDI-TOF MS的分辨率内。使用4种3′-O-叔丁基-SS-dNTP可逆终止物(图30C)进行连续DNA合成测序的实验方案和从每步延伸和切割获得的MALDI-TOF MS光谱(图30D)。预期延伸产物的质量分别为4404道尔顿、4697道尔顿、5024道尔顿和5328道尔顿。预期切割产物的质量为4272道尔顿、4653道尔顿、4888道尔顿和5199道尔顿。
图31：步移策略展示。使用上面显示的DNA模板(SEQ ID NO：1)和引物(SEQ ID NO：2)(以绿色显示的模板部分为引物结合区)，并使用Therminator IX DNA聚合酶、dATP、dCTP、dTTP和3′-O-叔丁基-SS-dGTP进行温育。第一次步移之后，引物延伸至模板中下一个C的位置(在模板链中以红色突出显示最右边的C)。如左上角MALDI-TOF质谱图所示，延伸产物的大小为5330道尔顿(预计5328Da)。用THP切割后，观察到右上角显示的5198Da产物(预计5194Da)。用Therminator IX DNA聚合酶、dATP、dCTP、dTTP和3′-O-叔丁基-SS-dGTP进行第二次步移，以获得中间左侧曲线中显示的产物(观察到7771Da，预期以红色突出显示的中间C达到7775Da)。切割后，获得7643Da的产物(预期7641Da)。最后进行第三次步移和切割，得到9625Da(预期最左侧的以红色突出显示的C为9628Da)和9513Da(预期9493Da)的产物。这证明了能够使用3′-O-叔丁基-SS-核苷酸作为步移反应的终止物。这些可以被并入到组合测序/步移方案中，例如图27所示的测序/步移方案。
图32：固体表面上的四色SBS数据。通过使用共价连接到载玻片上的如上所示的自引发DNA模板，并在每个测序循环中使用3′-SS-dATP-SS-Rox、3′-SS-dCTP-SS-Alexa488、3′-SS-dGTP-SS-Cy5和3′-SS-dTTP-SS-R6G混合物获得的原始荧光发射强度的四色测序数据图。
图33：3′-O-SS-dNTP衍生物的一般结构。
图34：3′-O-SS-dNTP衍生物的一般结构。
图35A-35C：具有不同保护基修饰的碱基标记的可逆终止物。
图36：在3′-O位置具有不同保护基修饰的未标记的可逆终止物(用于测序、追加和步移)。
图37：3′-O-DTM-dCTP-5-硝基苄基-Rox的合成。
图38：3′-O-DTM-dUTP-5-烯丙基-Rox的合成。
图39：3′-O-DTM-dNTP-硝基苄基-R的合成；R是指染料或“锚”分子。
图40：3′-O-DTM-dNTP-烯丙基-R的合成；R是指染料或“锚”分子。
图41：3′-O-DTM-dNTP-偶氮(-N＝N-接头)-R的合成；R是指染料或“锚”分子。
图42：3′-O-DTM-dNTP-Dde接头-R的合成；R是指染料或“锚”分子。
图43：制备3′-O-DTM-dNTP-SS-染料的合成方案。
图44：四种5(7)-氨基丙炔基-3′-O-叔丁基-二硫基甲基-dNTP(PA-3′-O-DTM-dNTP)的结构。
图45：四种3′-O-烷基二硫基甲基-dNTP-SS-接头-染料(3′-O-DTM-dNTP-SS-染料)的结构。
图46：使用3′-O-叔丁基-SS-dCTP-SS-BodipyFL可逆终止物进行连续延伸的实验方案和第一延伸产物(产物1，左，预期分子量6334)、第一切割产物(产物2，中间，预期分子量5556)和第二延伸产物(产物3，右侧，预期分子量6746)的MALDI-TOF MS谱。
图47：合成3′-O-乙基二硫基甲基-dTTP(7a)的方案。
图48：合成3′-O-乙基二硫基甲基-dATP(8c)的方案。
图49：合成3′-O-乙基二硫基甲基-dCTP(3′-O-DTM-dCTP 7d)的方案。
图50：合成5-(3-氨基丙炔基)-3′-O-叔丁基二硫基甲基-dCTP(5-PA-3′-O-DTM-dCTP)的方案。
具体实施方式
I.定义
本文使用的缩写具有其在化学和生物学领域中的常规含义。本文所述的化学结构和化学式是根据化学领域已知的化学价的标准规则构建的。
在取代基由其常规化学式具体指明的情况下，从左至右书写的化学式同样地涵盖由从右向左书写结构而产生的化学上相同的取代基，例如-CH2O-相当于-OCH2-。
除非另有说明，术语“烷基”本身或作为另一个取代基的一部分是指直链(即非支链)或支链碳链(或碳)或其组合，其可以为完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，并且可以包括具有指定数目的碳原子(即，C1-C10表示1-10个碳)的单价、二价和多价基团。烷基是一个非环化链。饱和烃基的实例包括但不限于诸如以下基团的基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、(环己基)甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及更高级的同系物和异构体。烷氧基是通过氧接头(-O-)与分子其余部分连接的烷基。烷基部分可以是烯基部分。烷基部分可以是炔基部分。烷基部分可以完全饱和。烯基可以包括多于一个的双键和/或除一个或多个双键之外还包括一个或多个三键。炔基可以包括多于一个三键和/或除一个或多个三键之外还包括一个或多个双键。
除非另有说明，否则术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分意指衍生自烷基和不饱和烷基的二价基团，例如但不限于-CH2CH2CH2CH2-。通常，烷基(或亚烷基)基团将具有1-24个碳原子，其中具有10个或更少碳原子的那些基团在本文中是优选的。“低级烷基”或“低级亚烷基”通常为具有8个或更少碳原子的较短链烷基或亚烃基(alkelyene)(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)。除非另有说明，否则术语“亚烯基”本身或作为另一个取代基的一部分意指衍生自烯烃的二价基团。除非另有说明，否则术语“亚炔基”自身或作为另一取代基的一部分是指衍生自炔的二价基团。
除非另有说明，否则术语“杂烷基”本身或与其他术语组合意指包括至少一个碳原子和至少一个杂原子(例如O、N、P、Si和S)的稳定的直链或支链或其组合，并且其中氮和硫原子可以任选地被氧化，氮杂原子可以任选地被季铵化。杂原子(例如，O、N、S、Si或P)可以位于杂烷基的任何内部位置处或在烷基与分子的其余部分连接的位置。杂烷基是一个非环化链。实例包括但不限于：-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3、-CH＝CH-N(CH3)-CH3、-O-CH3、-O-CH2-CH3和-CN。多达两个或三个的杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。杂烷基部分可以包括一个杂原子(例如O、N、S、Si或P)。杂烷基部分可以包括两个任选的不同杂原子(例如O、N、S、Si或P)。杂烷基部分可以包括三个任选的不同杂原子(例如O、N、S、Si或P)。杂烷基部分可以包括四个任选的不同杂原子(例如O、N、S、Si或P)。杂烷基部分可以包括五个任选的不同杂原子(例如O、N、S、Si或P)。杂烷基部分可以包括多达8个任选的不同杂原子(例如O、N、S、Si或P)。除非另有说明，否则术语“杂烯基”本身或与另一术语组合意指包含至少一个双键的杂烷基。杂烯基可以任选地包含多于一个的双键和/或除一个或多个双键之外还包含一个或多个三键。除非另有说明，否则术语“杂炔基”自身或与另一术语组合意指包含至少一个三键的杂烷基。杂炔基可以任选地包含多于一个三键和/或除一个或多个三键之外还包含一个或多个双键。
类似地，除非另有说明，术语“亚杂烷基”本身或作为另一个取代基的一部分意指衍生自杂烷基的二价基团，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于亚杂烷基基团，杂原子也可占据链末端中的任一个或两个(例如亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。此外，对于亚烃基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)连接基团和亚杂烃基连接基团，连接基团的书写方向并不暗示连接基团的取向。例如，式-C(O)2R′-代表-C(O)2R′-和-R′C(O)2-如上所述，本文所用的杂烷基包括通过杂原子与分子的其余部分连接的那些基团，例如-C(O)R′、-C(O)NR′、-NR′R″、-OR′、-SR′和/或-SO2R′。当列举“杂烷基”，随后列举具体杂烷基(如-NR′R”等)时，应理解术语杂烷基和-NR′R″不是多余的或相互排斥的。而是，列举具体的杂烷基以使描述更加清楚。因此，在本文中术语“杂烷基”不应被解释为排除具体杂烷基，例如-NR′R″等。
除非另有说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其它术语组合意指分别为“烷基”和“杂烷基”的环状形式。环烷基和杂环烷基不是芳香族的。另外，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环与分子其余部分连接的位置。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。“亚环烷基”和“亚杂环烷基”，单独地或作为另一取代基的一部分，分别表示衍生自环烷基和杂环烷基的二价基团。
除非另有说明，术语“卤代”或“卤素”本身或作为另一取代基的一部分意指氟、氯、溴或碘原子。另外，术语如“卤代烷基”旨在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”包括但不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另有说明，术语“酰基”是指-C(O)R，其中R是取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。
除非另有说明，否则术语“芳基”是指多不饱和的芳族烃取代基，其可以是单环、或稠合在一起的或共价连接的多个环(优选1-3个环)(即稠环芳基)。稠环芳基是指稠合在一起的多个环，其中至少一个稠合的环是芳基环。术语“杂芳基”是指含有至少一个杂原子(如N、O或S)的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选被氧化，氮原子任选被季铵化。因此，术语“杂芳基”包括稠环杂芳基(即稠合在一起的多个环，其中至少一个稠合的环是杂芳环)。5，6-稠环亚杂芳基是指稠合在一起的两个环，其中一个环为5元环，另一个环为6元环，并且其中至少一个环是杂芳基环。同样地，6，6-稠环亚杂芳基是指两个稠合在一起的环，其中一个环为6元环，另一个环为6元环，并且其中至少一个环是杂芳基环。6，5-稠环亚杂芳基是指稠合在一起的两个环，其中一个环为6元环，另一个环为5元环，并且其中至少一个环是杂芳基环。杂芳基可以通过碳原子或杂原子连接到分子的其余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、萘基、吡咯基、吡唑基、哒嗪基、三嗪基、嘧啶基、咪唑基、吡嗪基、嘌呤基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、异喹啉基、喹喔啉基、喹啉基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。每个上述芳基和杂芳基环系统的取代基选自下面描述的可接受的取代基。单独或作为另一取代基的一部分的“亚芳基”和“亚杂芳基”分别表示衍生自芳基和杂芳基的二价基团。杂芳基取代基可以与环杂原子氮-O-键合。
螺环是两个或更多个环，其中相邻的环通过单个原子连接。螺环内的各个环可以相同或不同。螺环中的单个环可以是取代的或未取代的，并且在一组螺环内单个环可以具有与的其它单环不同的取代基。螺环内的各个环的可能取代基为当该环不是螺环的一部分时可能具有的取代基(例如环烷基或杂环烷基环的取代基)。螺环可以是取代或未取代的环烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的杂环烷基、或者取代或未取代的亚杂环烷基，螺环基团内的单环可以是前面所列的任何一个，包括所有环均为一种类型的情况(例如，所有环均为取代的亚杂环烷基，其中每个环可以是相同或不同的取代的亚杂环烷基)。当提到螺环体系时，杂环螺环是指下述的螺环，其中至少一个环是杂环，并且其中每个环可以是不同的环。当提到螺环体系时，取代的螺环意指至少一个环被取代，并且每个取代基可以任选地不同。
符号
表示化学部分与分子或化学式的其余部分的连接点。
本文所用的术语“氧基”是指与碳原子双键结合的氧。
术语“亚烷基芳基”为共价键合到亚烃基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)部分(在本文中也称为亚烃基)的亚芳基部分。在实施方案中，亚烷基芳基具有下式：
亚烷基芳基部分可以在亚烃基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)部分或亚芳基接头上(例如在2、3、4或6位碳上)被以下基团取代：卤素、氧基、-N3、-CF3、-CCl3、-CBR3、-CI3、-CN、-CHO、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO2CH3-SO3H、-OSO3H、-SO2NH2、NHNH2、ONH2、NHC(O)NHNH2、取代或未取代的C1-C5烷基、或者取代或未取代的2-5元杂烷基。在实施方案中，亚烷基芳基未被取代。
每个上述术语(例如“烷基”、“杂烷基”、“环烷基”、“杂环烷基”、“芳基”和“杂芳基”)包括所指基团的取代形式和未取代形式。下面提供了每种类型基团的优选取代基。
烷基和杂烷基(包括通常称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是但不限于选自以下各种基团的一种或多种：-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R″′)＝NR″′、-NR-C(NR′R″)＝NR″′、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、NR′NR″R″′、ONR′R″、NR′C(O)NR″NR″′R″″、-CN、-NO2、-NR′SO2R″、-NR′C(O)R″、-NR′C(O)-OR″、-NR′OR″，其数量范围从0到(2m′+1)，其中m′是这种基团中碳原子的总数。优选R、R′、R″、R″′和R″″各自独立地表示氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基(例如，由1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或芳基烷基。当本文描述的化合物包含多于一个R基团时，例如，当存在多于1个这些基团时，每个R基团独立地选为R′、R″、R″′和R″″。当R′和R″连接到相同的氮原子时，它们可以与氮原子结合形成4-元环、5-元环、6-元环或7-元环。例如，-NR′R”包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从以上关于取代基的讨论中，本领域技术人员将理解，术语“烷基”意指包括与除氢基以外的基团结合的碳原子的基团，例如卤代烷基(例如-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
与描述的烷基取代基类似，芳基和杂芳基的取代基是变化的并且选自例如：-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R″′)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR″′、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、NR′NR″R″′、ONR′R″、NR′C(O)NR″NR″′R″′、-CN、-NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基和氟代(C1-C4)烷基、-NR′SO2R″、-NR′C(O)R″、-NR′C(O)-OR″、-NR′OR″，其数量范围从0至芳环体系上的开放化合价的总数；并且其中优选R′、R″、R″′和R″″各自独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基。当本文所述的化合物包含多于一个R基团时，例如，当存在多于1个这些基团时，每个R基团独立地选为R′、R″、R″′和R″″。
环(例如环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基)的取代基可以描述为环上的取代基而不是环上的特定原子上的取代基(通常称为浮动取代基)。在这种情况下，取代基可以与任何环原子连接(遵守化学价的规则)并且在稠合环或螺环的情况下，被描述为与稠合环或螺环的一个成员相连的取代基(单环上的浮动取代基)可以是任何稠合环或螺环(多环上的浮动取代基)上的取代基。当取代基连接到环而不是特定原子(浮动取代基)，并且取代基的下标是大于1的整数时，多个取代基可以在相同的原子、相同的环、不同的原子、不同的稠环、不同的螺环上，并且每个取代基可以任选地不同。当环与分子其余部分的连接点不限于单个原子时(浮动取代基)，连接点可以是环的任何原子，并且在稠环或螺环的情况下，连接点可以是任何稠环或螺环的原子，与此同时遵守化学价的规则。当环、稠环或螺环含有一个或多个环杂原子时，显示环、稠合环或螺环有一个浮动取代基(包括但不限于与分子其余部分的连接点)，浮动取代基可以键合到杂原子上。当在具有浮动取代基的结构或结构式中显示环杂原子与的一个或多个氢结合时(例如，环上的氮与环原子形成两个键并与氢形成第三个键)，当杂原子与浮动取代基键合，取代基将被理解为取代氢，同时遵守化学价的规则。
两个或更多个取代基可以任选地连接形成芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基。这种所谓的成环取代基通常(但不一定是)与环状基本结构相连。在一个实施方案中，成环取代基连接至基本结构的相邻成员。例如，连接到环状基本结构的相邻成员上的两个成环取代基产生稠环结构。在另一个实施方案中，成环取代基连接至基本结构的单个成员。例如，连接到环状基本结构的单个成员上的两个成环取代基产生螺环结构。在又一个实施方案中，成环取代基连接于基本结构的非相邻成员。
芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选形成式-T-C(O)-(CRR′)q-U-的环，其中T和U独立地为-NR-、-O-、-CRR′-或单键，并且q是0-3的整数。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-A-(CH2)r-B-的取代基取代，其中A和B独立地为-CRR′-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR′-或单键，并且r是1-4的整数。如此形成的新环的单键之一可以任选地被双键取代。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-(CRR′)s-X′-(C″R″R″′)d-的取代基取代，其中s和d独立地为0-3的整数，并且X′为-O-、-NR′-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR′-。优选取代基R、R′、R″和R″′独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基，取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。
本文所用的术语“杂原子”或“环杂原子”意在包括硼(B)、氧(O)、氮(N)、硫(S)、磷(P)和硅(Si)。
本文所用的“取代基”或“取代基团”是指选自以下部分的基团：
(A)氧基、卤素、-CF3、-CHF2、-CH2F、-C(卤素)3、-CH(卤素)2、-CH2(卤素)、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、NHNH2、ONH2、NHC(O)NHNH2、NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OC(卤素)3、-OCH(卤素)2、-OCH2(卤素)、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基，以及
(B)被选自以下的至少一个取代基取代的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基：
(i)氧基、卤素、-CF3、-CHF2、-CH2F、-C(卤素)3、-CH(卤素)2、-CH2(卤素)、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、NHNH2、ONH2、NHC(O)NHNH2、NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OC(卤素)3、-OCH(卤素)2、-OCH2(卤素)、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基，以及
(ii)被选自以下的至少一个取代基取代的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基：
(a)卤素、-CF3、-CHF2、-CH2F、-C(卤素)3、-CH(卤素)2、-CH2(卤素)、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、NHNH2、ONH2、NHC(O)NHNH2、NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OC(卤素)3、-OCH(卤素)2、-OCH2(卤素)、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基，未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基，以及
(b)被选自以下的至少一个取代基取代的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基：氧基、卤素、-CF3、-CHF2、-CH2F、-C(卤素)3、-CH(卤素)2、-CH2(卤素)、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、NHNH2、ONH2、NHC(O)NHNH2、NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OC(卤素)3、-OCH(卤素)2、-OCH2(卤素)、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基。
本文所用的“尺寸受限的取代基”或“尺寸受限的取代基团”是指选自上文针对“取代基团”所述的所有取代基基团，其中每个取代的或未取代的烷基是取代的或未取代的C1-C20烷基，各取代或未取代的杂烷基为取代或未取代的2-20元杂烷基，各取代或未取代的环烷基为取代或未取代的C3-C8环烷基，各取代或未取代的杂环烷基为取代或未取代的3-8元杂环烷基，各取代或未取代的芳基为取代或未取代的C6-C10芳基，并且各取代或未取代的杂芳基为取代或未取代的5-10元杂芳基。
本文所用的“低级取代基”或“低级取代基团”是指选自上文针对“取代基团”所述的所有取代基基团，其中每个取代或未取代的烷基为取代或未取代的C1-C8烷基，各取代或未取代的杂烷基为取代或未取代的2-8元杂烷基，各取代或未取代的环烷基为取代或未取代的C3-C7环烷基，各取代或未取代的杂环烷基为取代或未取代的3-7元杂环烷基，未取代的芳基为取代或未取代的C6-C10芳基，且各取代或未取代的杂芳基为取代或未取代的5-9元杂芳基。
在一些实施方案中，本文化合物中描述的每个取代的基团被至少一个取代基取代。更具体地，在一些实施方案中，在本文化合物中描述的各取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基、取代的杂芳基、取代的亚烷基、取代的亚杂烷基、取代的亚环烷基、取代的亚杂环烷基、取代的亚芳基和/取代的亚杂芳基被至少一个取代基取代。在其他实施方案中，这些基团中的至少一个或全部被至少一个尺寸受限的取代基取代。在其它实施方案中，这些基团中的至少一个或全部被至少一个低级取代基取代。
在本文化合物的其他实施方案中，各取代或未取代的烷基可为取代或未取代的C1-C20烷基，各取代或未取代的杂烷基为取代或未取代的2-20元杂烷基，各取代或未取代的环烷基为取代或未取代的C3-C8环烷基，各取代或未取代的杂环烷基为取代或未取代的3-8元杂环烷基，各取代或未取代的芳基为取代或未取代的C6-C10芳基，和/或各取代或未取代的杂芳基为取代或未取代的或未经取代的5-10元杂芳基。在本文化合物的一些实施方案中，各取代或未取代的亚烃基(例如亚烷基，亚烯基或亚炔基)为取代或未取代的C1-C20亚烷基，各取代或未取代的亚杂烷基为取代或未取代的2-20元亚杂烷基，各取代或未取代的亚环烷基是取代或未取代的C3-C8亚环烷基，各取代或未取代的亚杂环烷基是取代或未取代的3-8元亚杂环烷基，各取代或未取代的亚芳基是取代或未取代的C6-C10亚芳基，和/或各取代或未取代的亚杂芳基是取代或未取代的5-10元亚杂芳基。
在一些实施方案中，各取代或未取代的烷基为取代或未取代的C1-C8烷基，各取代或未取代的杂烷基为取代或未取代的2-8元杂烷基，各取代或未取代的环烷基为取代或未取代的C3-C7环烷基，各取代或未取代的杂环烷基为取代或未取代的3-7元杂环烷基，各取代或未取代的芳基为取代或未取代的C6-C10芳基，和/或各取代或未取代的杂芳基为取代或未取代的5-9元杂芳基。在一些实施方案中，各取代或未取代的亚烃基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)为取代或未取代的C1-C8亚烷基，各取代或未取代的亚杂烷基为取代或未取代的2-8元亚杂烷基，各取代或未取代的亚环烷基是取代或未取代的C3-C7亚环烷基，各取代或未取代的亚杂环烷基是取代或未取代的3-7元亚杂环烷基，各取代或未取代的亚芳基是取代或未取代的C6-C10亚芳基，和/或各取代或未取代的亚杂芳基取代或未取代的5-9元亚杂芳基。在一些实施方案中，该化合物是下面的实施例部分、附图或表格中列出的化学物质。
本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学或手性中心)或双键；可以根据绝对立体化学将对映体、外消旋体、非对映体、互变异构体、几何异构体、立体异构体形式定义为(R)-或(S)-，或定义为(D)-或(L)-(针对氨基酸)，并且各个异构体包含在本发明的范围内。本发明的化合物不包括本领域已知的对于合成和/或分离而言太不稳定的化合物。本发明意在包括外消旋和光学纯形式的化合物。光学活性(R)-和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术进行分析。当本文所述的化合物含有烯键或其他几何不对称中心时，除非另有说明，所述化合物旨在包括E和Z几何异构体。
本文所用的术语“异构体”是指具有相同的原子数量和原子种类的化合物，因此具有相同的分子量，但在原子的结构排列或构型方面不同。
本文所用的术语“互变异构体”是指存在于平衡中且易于从一种异构体形式转化为另一种异构体形式的两种或更多种结构异构体中的一种。
本领域技术人员将会明白，本发明的某些化合物可以以互变异构形式存在，所有这些化合物的互变异构形式都在本发明的范围内。
除非另有说明，否则本文所述的结构还意味着包括该结构的所有立体化学形式；即每个不对称中心的R和S构型。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映体和非对映体混合物在本发明的范围内。
除非另有说明，否则本文所述的结构还意味着包括不同仅在于存在一个或多个同位素富集的原子的化合物。例如，除了用氘或氚代替氢或用13C或14C富集的碳代替碳之外具有本结构的化合物都在本发明的范围内。
本发明化合物还可以在构成这些化合物的一个或多个原子处含有非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素例如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)对化合物进行放射性标记。本发明化合物的所有同位素变体，不管是否是放射性的，都包括在本发明的范围内。
应该注意的是，在整个申请中，替代选择被写入马库什组中，例如，包括多于一种可能的氨基酸的每个氨基酸位置。特别考虑到马库什组的每个成员应该被分开考虑，由此构成另一个实施方案，并且马库什组不应被视为单个单元。
根据其在化学和生物学中的普通含义，使用“类似物”，并且类似物是指与另一种化合物(即所谓的“参比”化合物)在结构上相似但组成不同的化学化合物，不同组成例如一个原子被不同元素的原子置换，或存在的特定官能团不同，或一个官能团被另一个官能团替换或参比化合物的一个或多个手性中心的绝对立体化学不同。因此，类似物是在功能和外观上相似或相当的化合物，但其结构或来源与参比化合物不同。
本文使用的术语“一个/一种(a/an)”意味着一种或多种。另外，本文所用的短语“被......取代”意指指定的基团可以被一个或多个任何或所有指名的取代基取代。例如，当诸如烷基或杂芳基的基团“被未取代的C1-C20烷基或未取代的2-20元杂烷基取代”时，该基团可含有一个或多个未取代的C1-C20烷基和/或一个或多个未取代的2-20元杂烷基。
此外，当部分被R取代基取代时，该基团可以被称为“R-取代的”。当部分被R取代时，该部分被至少一个R取代基取代，并且每个R取代基可选地不同。在化学类(例如式(I))的描述中存在特定的R基的情况下，可以使用罗马字母符号来区分该特定R组的每次出现。例如，在存在多个R13取代基的情况下，每个R13取代基可以被区分为R13A、R13B、R13C、R13D等，其中R13A、R13B、R13C、R13D等各自被定义为在R13的范围内，并且任选地不同。
“可检测剂”或“可检测化合物”或“可检测标签”或“可检测部分”是通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学、磁共振成像或其他物理手段可检测的成分。例如，可检测剂包括18F、32P、33P、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、77As、86Y、90Y、89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、99Mo、105pd、105Rh、111Ag、111In、123I、124I、125I、131I、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、154- 1581Gd、161Tb、166Dy、166Ho、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194Ir、198Au、199Au、211At、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra、225Ac、Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、32p，荧光团(例如荧光染料)、高电子密度试剂、酶(例如ELISA中通常使用的酶)、生物素、地高辛、顺磁性分子、顺磁性纳米颗粒、超小型超顺磁性氧化铁(“USPLO”)纳米颗粒、USPIO纳米颗粒聚集体、超顺磁性氧化铁(“SPIO”)纳米颗粒、SPIO纳米颗粒聚集体、单晶氧化铁纳米颗粒、单晶氧化铁、纳米颗粒造影剂、脂质体或含有钆螯合物(“Gd-螯合物”)分子的其他递送载体、钆、放射性同位素、放射性核素(例如碳-11、氮-13、氧-15、氟-18、铷-82)、氟脱氧葡萄糖(例如，发射γ射线的任何放射性核素、发射正电子的放射性核素、放射性标记的葡萄糖、放射性标记的水、放射性标记的氨、生物胶体、微泡(例如包括微泡壳，其包括白蛋白、半乳糖、脂质和/或聚合物；微泡气芯，其包括空气、重质气体、全氟化碳、氮气、八氟丙烷、全氟己烷(perflexane)脂质微球、全氟丙烷(perflutren)等)、碘化造影剂(例如碘海醇、碘克沙醇、碘佛醇、碘帕醇、碘普兰、碘普胺、泛影酸盐、甲泛影酸盐、碘克沙酸盐)、硫酸钡、二氧化钍、金、金纳米颗粒、金纳米颗粒聚集体、荧光团、双光子荧光团或半抗原和蛋白质或其他可以被检测到的实体，例如通过将放射性标签掺入到与靶肽进行特异性反应的肽或抗体中。
根据本文描述的实施方案，可用作可检测成像和/或标记试剂的放射性物质(例如放射性同位素)包括但不限于18F、32P、33P、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、77As、86y、90y.89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、99Mo、105Pd、105Rh、111Ag、111In、123I、124I、125I、131I、142pr、143Pr、149Pm、153Sm、154-1581Gd、161Tb、166Dy、166Ho、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194Ir、198Au、199Au、211At、211pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra和225Ac。根据本发明的实施方案可用作附加成像剂的顺磁性离子包括但不限于过渡金属离子和镧系金属的离子(例如原子序数为21-29、42、43、44或57-71)。这些金属包括Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu的离子。
可检测试剂的实例包括显像剂，包括荧光和发光物质，包括但不限于通常称为“染料”、“标签”或“指示剂”的各种有机或无机小分子。实例包括荧光素、罗丹明、吖啶染料、Alexa染料和花青染料。在实施方案中，可检测部分是荧光分子(例如吖啶染料、花青染料、氟染料、噁嗪染料、菲啶染料或罗丹明染料)。在实施方案中，可检测部分是荧光分子(例如吖啶染料、花青染料、氟染料、噁嗪染料、菲啶染料或罗丹明染料)。在实施方案中，可检测部分是荧光素异硫氰酸酯部分、四甲基罗丹明-5-(和6)-异硫氰酸酯部分、Cy2部分、Cy3部分、Cy5部分、Cy7部分、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚部分、Hoechst 33258部分、Hoechst 33342部分、Hoechst 34580部分、碘化丙锭部分或吖啶橙部分。在实施方案中，可检测部分是Indo-1、Ca饱和部分、Indo-1 Ca2+部分、级联蓝BSA pH 7.0部分、级联蓝部分、LysoTracker Blue部分、Alexa 405部分、LysoSensor Blue pH 5.0部分、LysoSensor Blue部分、DyLight 405部分、DyLight 350部分、BFP(蓝色荧光蛋白)部分、Alexa 350部分、7-氨基-4-甲基香豆素pH 7.0部分、氨基香豆素部分、AMCA缀合物部分、香豆素部分、7-羟基-4-甲基香豆素部分、7-羟基-4-甲基香豆素pH 9.0部分、6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素pH 9.0部分、Hoechst33342部分、太平洋蓝(Pacific Blue)部分、Hoechst 33258部分、Hoechst 33258-DNA部分、太平洋蓝抗体缀合物pH 8.0部分、PO-PRO-1部分、PO-PRO-1-DNA部分、POPO-1部分、POPO-1-DNA部分、DAPI-DNA部分、DAPI部分、Marina Blue部分、SYTOX Blue-DNA部分、CFP(青色荧光蛋白)部分、eCFP(增强型青色荧光蛋白)部分、1-苯胺基萘-8-磺酸(1，8-ANS)部分、Indo-1、无Ca部分、1，8-ANS(1-苯胺基萘-8-磺酸)部分、BO-PRO-1-DNA部分、BOPRO-1部分、BOBO-1-DNA部分、SYTO 45-DNA部分、evoglow-Pp1部分、evoglow-Bs1部分、evoglow-Bs2部分、Auramine O部分、DiO部分、LysoSensor Green pH 5.0部分、Cy2部分、LysoSensor Green部分、Fura-2、高Ca部分、Fura-2 Ca2+部分、SYTO 13-DNA部分、YO-PRO-1-DNA部分、YOYO-1-DNA部分、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)部分、LysoTracker Green部分、GFP(S65T)部分、BODIPYFL、MeOH蓝色部分、蓝宝石(Sapphire)部分、BODIPY FL缀合物部分、MitoTracker绿色部分、MitoTracker绿色FM、MeOH部分、荧光素0.1MNaOH部分、钙黄绿素pH9.0部分、荧光素pH9.0部分、钙黄绿素部分、Fura-2、无Ca部分、Fluo-4部分、FDA部分、DTAF部分、荧光素部分、CFDA部分、FITC部分、Alexa Fluor 488酰肼-水部分、DyLight 488部分、5-FAM pH 9.0部分、Alexa488部分、罗丹明110部分、罗丹明110pH 7.0部分、吖啶橙部分、BCECF pH5.5部分、PicoGreendsDNA定量试剂部分、SYBR Green I部分、罗丹明绿pH7.0部分、CyQUANT GR-DNA部分、NeuroTrace 500/525、绿色荧光Nissl染色-RNA部分、丹酰基尸胺部分、氟-祖母绿(Fluoro-Emerald部分)、Nissl部分、荧光素葡聚糖pH8.0部分、罗丹明绿部分、5-(和-6)-羧基-2′，7′-二氯荧光素pH9.0部分、丹酰基尸胺、MeOH部分、eYFP(增强型黄色荧光蛋白)部分、Oregon Green 488部分、Fluo-3部分、BCECF pH 9.0部分、SBFI-Na+部分、Fluo-3 Ca2+部分、罗丹明123MeOH部分、FlAsH部分、钙绿(Calcium Green)-1Ca2+部分、镁绿部分、DM-NERFpH4.0部分、钙绿部分、柠檬色(Citrine)部分、LysoSensor Yellow pH9.0部分、TO-PRO-1-DNA部分、镁绿Mg2+部分、钠绿Na+部分、TOTO-1-DNA部分、俄勒冈绿(Oregon Green)514部分、俄勒冈绿514抗体缀合物pH8.0部分、NBD-X部分、DM-NERF pH7.0部分、NBD-X、MeOH部分、CI-NERF pH 6.0部分、Alexa 430部分、CI-NERF pH 2.5部分、萤黄(Lucifer yellow)、CH部分、LysoSensor Yellow pH 3.0部分、6-TET、SE pH 9.0部分、曙红抗体缀合物pH 8.0部分、曙红部分、6-羧基罗丹明6G pH 7.0部分、6-羧基罗丹明6G、盐酸盐部分、Bodipy R6G SE部分、BODIPY R6GMeOH部分、6JOE部分、级联黄部分、mBanana部分、Alexa 532部分、赤藓红-5-异硫氰酸酯pH9.0部分、6-HEX、SE pH9.0部分、mOrange部分、mHoneydew部分、Cy 3部分、罗丹明B部分、DiI部分、5-TAMRA-MeOH部分、Alexa 555部分、DyLight 549部分、BODIPY TMR-X、SE部分、BODIPY TMR-X MeOH部分、PO-PRO-3-DNA部分、PO-PRO-3部分、罗丹明部分、POPO-3部分、Alexa546部分、钙橙Ca2+部分、TRITC部分、钙橙部分、罗丹明标记鬼笔环肽(Rhodaminephalloidin)pH 7.0部分、MitoTracker橙部分、MitoTracker橙MeOH部分、藻红蛋白部分、镁橙部分、R-藻红蛋白pH7.5部分、5-TAMRA pH7.0部分、5-TAMRA部分、Rhod-2部分、FM1-43部分、Rhod-2Ca2+部分、FM1-43脂质部分、LOLO-1-DNA部分、dTomato部分、DsRed部分、Dapoxyl(2-氨基乙基)磺酰胺部分、四甲基罗丹明葡聚糖pH7.0部分、Fluor-Ruby部分、试卤灵(Resorufin)pH 9.0部分、mTangerine部分、LysoTracker Red部分、丽丝胺罗丹明(Lissamine rhodamine)部分、Cy 3.5部分、罗丹明红-X抗体缀合物pH 8.0部分、苏尔罗丹胺101EtOH部分、JC-1pH 8.2部分、JC-1部分、mStrawberry部分、MitoTracker Red部分、MitoTracker Red、MeOH部分、X-Rhod-1Ca2+部分、Alexa 568部分、5-ROX pH 7.0部分、5-ROX(5-羧基-X-罗丹明、三乙基铵盐)部分、BO-PRO-3-DNA部分、BOPRO-3部分、BOBO-3-DNA部分、溴化乙锭部分、ReAsH部分、钙深红(calcium crimson)部分、深红钙Ca2+部分、mRFP部分、mCherry部分、HcRed部分、DyLight 594部分、乙锭均二聚物-1-DNA部分、乙锭均二聚物部分、碘化丙啶部分、SYPRO Ruby部分、碘化丙啶-DNA部分、Alexa 594部分、BODIPY TR-X、SE部分、BODIPY TR-X、MeOH部分、BODIPY TR-X类鬼笔环肽pH7.0部分、Alexa Fluor 610R-藻红蛋白链霉亲和素pH 7.2部分、YO-PRO-3-DNA部分、Di-8ANEPPS部分、Di-8-ANEPPS-脂质部分、YOYO-3-DNA部分、尼罗红-脂质部分、尼罗红部分、DyLight 633部分、mPlum部分、TO-PRO-3-DNA部分、DDAO pH 9.0部分、Fura红高Ca部分、别藻蓝蛋白pH 7.5部分、APC(别藻蓝蛋白)部分、尼罗蓝、EtOH部分、TOTO-3-DNA部分、Cy5部分、BODIPY 650/665-X、MeOH部分、Alexa Fluor647R-藻红蛋白链霉亲和素pH7.2部分、DyLight649部分、Alexa647部分、Fura红Ca2+部分、Atto647部分、Fura红、低Ca部分、羧基萘并荧光素pH10.0部分、Alexa660部分、Cy5.5部分、Alexa680部分、DyLight680部分、Alexa 700部分、FM 4-64、2％CHAPS部分或FM4-64部分。
在一些实施方案中，可检测部分是1，1-二乙基-4，4-羰花青碘化物、1，2-二苯基乙炔、1，4-二苯基丁二烯、1，4-二苯基丁二炔、1，6-二苯基己三烯、1，6-二苯基己三烯、1-苯胺基萘-8-磺酸、2，7-二氯荧光素、2，5-二苯基噁唑、2-二-1-ASP、2-十二烷基试卤灵、2-甲基苯并噁唑、3，3-二乙基硫代二羰花青碘化物、4-二甲基氨基-4-硝基二苯乙烯、5(6)-羧基荧光素、5(6)-羧基萘并荧光素、5(6)-羧基四甲基罗丹明B、5-(和-6)-羧基-2′，7′-二氯荧光素、5-(和-6)-羧基-2，7-二氯荧光素、5-(N-十六酰基)氨基曙红、5-(N-十六酰基)氨基曙红、5-氯甲基荧光素、5-FAM、5-ROX、5-TAMRA、5-TAMRA、6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素、6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素、6-羧基罗丹明6G、6-HEX、6-JOE、6-JOE、6-TET、7-氨基放线菌素D、7-苄氨基-4-硝基苯-2-氧-1，3-二唑、7-甲氧基香豆素-4-乙酸、8-苄氧基-5，7-二苯基喹啉、8-苄氧基-5，7-二苯基喹啉、9，10-双(苯基乙炔基)蒽、9，10-二苯基蒽、9-甲基咔唑、(CS)2Ir(μ-Cl)2Ir(CS)2、AAA、吖啶橙、吖啶橙、吖啶黄、Adams Apple Red(亚当苹果红)680、Adirondack Green 520、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor430、AlexaFluor430、Alexa Fluor480、Alexa Fluor488、Alexa Fluor488、Alexa Fluor488酰肼、Alexa Fluor500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor594、Alexa Fluor594、Alexa Fluor610、Alexa Fluor 610-R-PE、Alexa Fluor 633、AlexaFluor635、Alexa Fluor647、Alexa Fluor647、Alexa Fluor 647-R-PE、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680、Alexa Fluor680-APC、Alexa Fluor 680-R-PE、Alexa Fluor 700、AlexaFluor 750、Alexa Fluor 790、别藻蓝蛋白、AmCyan1、氨基甲基香豆素、Amplex Gold(产品)、Amplex Red 试剂、Amplex UltraRed、蒽、APC、APC-Seta-750、AsRed2、ATTO 390、ATTO425、ATTO 430LS、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 490LS、ATTO 495、ATTO 514、ATTO 520、ATTO532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO 590、ATTO 594、ATTO 610、ATTO 620、ATTO 633、ATTO 635、ATTO 647、ATTO 647N、ATTO 655、ATTO 665、ATTO 680、ATTO 700、ATTO 725、ATTO 740、ATTOOxal2、ATTO Rho3B、ATTO Rho6G、ATTO Rho11、ATTO Rho12、ATTO Rho13、ATTO Rho14、ATTORho101、ATTO Thio12、Auramine O、Azami Green、Azami Green单体、B-藻红蛋白、BCECF，BCECF、Bexl、联苯、桦木黄580、蓝绿藻、BO-PRO-1、BO-PRO-3、BOBO-1、BOBO-3、BODIPY630650-X、BODIPY 650/665-X、BODIPY FL、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR-X、BODIPYTR-X、BODIPY TR-X Ph 7.0、BODIPY TR-X类鬼笔环肽、BODIPY-DiMe、BODIPY-苯基、BODIPY-TMSCC、C3-靛青、C3-靛青、C3-氧化花青、C3-噻青染料(EtOH)、C3-噻青染料(PrOH)、C5-靛青、C5-氧化花青、C5-噻青、C7-靛青、C7-氧化花青、C545T、C-藻蓝蛋白、钙黄绿素、钙黄绿素红橙、钙深红、钙绿-1、钙橙、卡尔科弗卢尔荧光增白剂(Calcofluor White)2MR、羧基SNARF-1pH 6.0、羧基SNARF-1pH 9.0、羧基萘荧光素、级联蓝、级联黄、卡茨基尔绿(Catskill Green)540、CBQCA、CellMask橙、CellTrace BODIPY TR甲基酯、CellTrace钙黄绿素紫、CellTraceTM FarRed、CellTracker Blue、CellTracker Red CMTPX、CellTrackerViolet BMQC、CF405S、CF405S、CF488A、CF543、CF555、CFP、CFSE、CF TM 350、CFTM485、叶绿素A、叶绿素B、Chromeo 488、Chromeo 494、Chromeo 505、Chromeo 546、Chromeo 642、柠檬黄、柠檬黄、ClOH丁氧基氮杂-BODIPY、ClOH C12氮杂-BODIPY、CM-H2DCFDA、香豆素1、香豆素6、香豆素6、香豆素30、香豆素314、香豆素334、香豆素343、香豆素545T、甲酚紫高氯酸盐、CryptoLight CF1、CryptoLight CF2、CryptoLight CF3、CryptoLight CF4、CryptoLightCF5、CryptoLight CF6、结晶紫、Cumarin153、Cy2、Cy3、Cy3、Cy3.5、Cy3B、Cy3B、Cy3Cy5ET、Cy5、Cy5、Cy5.5、Cy7、花青3NHS酯、花青5羧酸、花青5NHS酯、Cyclotella meneghinianaKützing、CypHeR5、CypHeR5pH 9.15、CyQUANTGR、CyTrak Orange、Dabcyl SE、DAF-FM、DAMC(Weiss)、丹酰基尸胺、丹酰甘氨酸(二噁烷)、DAPI、DAPI、DAPI、DAPI、DAPI(DMSO)、DAPI(H2O)、Dapoxyl(2-氨基乙基)磺酰胺、DCI、DCM、DCM、DCM(乙腈)、DCM(MeOH)、DDAO、深紫、di-8-ANEPPS、DiA、二氯三(1，10-菲咯啉)钌(II)、DiClOH C12氮杂-BODIPY、DiClOH丁氧基氮杂-BODIPY、DiD、DiI、DiIC18(3)、DiO、DiR、Diversa Cyan-FP、Diversa Green-FP、DM-NERFpH 4.0、DOCI、多柔比星、DPP pH探针590-7.5、DPP pH探针590-9.0、DPP pH探针590-11.0、DPP pH探针590-11.0、Dragon Green、DRAQ5、DsRed、DsRed、DsRed、DsRed-Express、DsRed-Express2、DsRed-EXpress T1、dTomato、DY-350XL、DY-480、DY-480XL MegaStokes、DY-485、DY-485XL MegaStokes、DY-490、DY-490XL MegaStokes、DY-500、DY-500XL MegaStokes、DY-520、DY-520XL MegaStokes、DY-547、DY-549P1、DY-549P1、DY-554、DY-555、DY-557、DY-557、DY-590、DY-590、DY-615、DY-630、DY-631、DY-633、DY-635、DY-636、DY-647DY-649P1 DY-649P1 DY-650 DY-651、DY-656 DY-673、DY-675 DY-DY-676、DY-680、DY-681、DY-700、DY-701、DY-730、DY-731、DY-750、DY-751、DY-776、DY-782、Dye-28、Dye-33、Dye-45、Dye-304。Dye-1041、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 594、DyLight 633、DyLight 649、DyLight680、E2-深红(E2-Crimson)、E2-橙、E2-红/绿、EBFP、ECF、ECFP、ECL Plus、eGFP、ELF97、Emerald、Envy Green、曙红、曙红Y、epicocconone、EqFP611、赤藓红-5-异硫氰酸酯、溴化乙锭、乙锭二聚体-1、乙基曙红、乙基曙红、乙基尼罗蓝A、对二甲基氨基苯甲酸乙酯、对二甲基氨基苯甲酸乙酯、Eu2O3纳米颗粒、Eu(Soini)、Eu(tta)3DEADIT、EvaGreen、EVOblue-30、EYFP、FAD、FITC、FITC、FlAsH(Adams)、FLAsH Red EX、FLAsH-CCPGCC、FlAsH-CCXXCC、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-5F、荧光素、荧光素0.1NaOH、荧光素-Dibase、氟-祖母绿(fluoro-emerald)、氟5G(Fluorol 5G)、FluoSpheres蓝、FluoSpheres深红、FluoSpheres暗红、FluoSpheres橙、FluoSpheres红、FluoSpheres黄绿色、CTC中的FM4-64、SDS中的FM4-64、FM1-43、FM 4-64、Fort橙600、FuraRed、Fura Red无钙、fura-2、Fura-2无钙、钆双胺、Gd-Dtpa-Bma、钆双胺、Gd-Dtpa-Bma、GelGreenTM、GelRedTM、H9-40、HcRedl、Hemo Red 720、HiLyteFluor 488、HiLyte Fluor 555、HiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor750、HiLyte Plus 555、HiLyte Plus 647、HiLyte Plus 750、HmGFP、Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst-33258、Hoechst-33258、Hops Yellow 560、HPTS、HPTS、HPTS、HPTS、HPTS、indo-1、Indo-1无Ca、Ir(Cn)2(acac)、乙酰丙酮酸二铯铱(Ir(Cs)2(acac))、IR-775氯化物、IR-806、Ir-OEP-CO-Cl、
650炔烃、
650叠氮化物、
650羧酸酯、
650DBCO、
650马来酰亚胺、
650NHS酯、
680LT羧酸酯、
680LT马来酰亚胺、
680LT NHS酯、
680RD炔烃、
680RD叠氮化物、
680RD羧酸酯、
680RD DBCO、
680RD马来酰亚胺、
680RD NHS酯、
700亚磷酰胺、
700DX、
700DX、
700DX羧酸酯、
700DX NHS酯、
750羧酸酯、
750马来酰亚胺、
750NHS酯、
800亚磷酰胺、
800CW、
800CW炔、
800CW叠氮化物、
800CW羧酸酯、
800CW DBCO、
800CW马来酰亚胺、
800CW NHS酯、
800RS、
800RS羧酸酯、
800RSNHS酯、
QC-1羧酸酯、
QC-1NHS Ester、球等鞭金藻-Parke、JC-1、JC-1、JOJO-1、Jonamac Red Evitag T2、Kaede绿、Kaede红、kusabira橙、普莱西德湖490(LakePlacid 490)、LDS 751、丽丝胺罗丹明(Weiss)、LOLO-1、荧光黄CH、路西法黄CH、荧光黄CH、路西法黄CH二锂盐、Lumio Green、Lumio Red、Lumogen F Orange、Lumogen Red F300、Lumogen Red F300、LysoSensor Blue DND-192、LysoSensor Green DND-153、LysoSensorGreen DND-153、LysoSensor Yellow/Blue DND-160pH 3、LysoSensor YellowBlue DND-160、LysoTracker Blue DND-22、LysoTracker Blue DND-22、LysoTracker Green DND-26、LysoTracker Red DND-99、LysoTracker Yellow HCK-123、Macoun Red Evitag T2、Macrolex荧光红G、Macrolex荧光黄10GN、Macrolex荧光黄10GN、镁绿、八乙基卟啉镁、镁橙、酞菁镁、酞菁镁、四(均三甲苯基)卟啉镁、四苯基卟啉镁、孔雀石绿异硫氰酸酯、枫树红橙620、Marina blue、mBanana、mBBr、mCherry、部花青540、甲基绿、甲基绿、甲基绿、亚甲蓝、亚甲蓝、mHoneyDew、MitoTracker Deep Red 633、MitoTracker Green FM、MitoTrackerOrange CMTMRos、MitoTracker Red CMXRos、一溴bimane、一氯bimane、单针藻属(Monoraphidium)、mOrange、mOrange2、mPlum、mRaspberry、mRFP、mRFP1、mRFP1.2(Wang)、mStrawberry(Shaner)、mTangerine(Shaner)、N，N-双(2，4，6-三甲基苯基)-3，4：9，10-苝二(二甲酰亚胺)、NADH、萘、萘、萘并荧光素、萘并荧光素、NBD-X、NeuroTrace 500525、Nilblau高氯酸盐、尼罗蓝、尼罗蓝、尼罗蓝(EtOH)、尼罗红、尼罗红、尼罗红、尼罗红、尼罗蓝A、NIR1、NIR2、NIR3、NIR4、NIR820、八乙基卟啉、OH丁氧基氮杂-BODIPY、OHC12氮杂BODIPY、橙色荧光蛋白、俄勒冈绿488、俄勒冈绿488DHPE、俄勒冈绿514、Oxazin1、噁嗪750、噁嗪1、噁嗪170、P4-3、对四联苯、对三联苯、PA-GFP(活化后)、PA-GFP(预活化)、太平洋橙、钯(II)间四苯基四苯并卟啉、PdOEPK、PdTFPP、PerCP-Cy5.5、苝、苝、苝双酰亚胺pH-探针550-5.0、苝双酰亚胺pH-探针550-5.5、苝双酰亚胺pH-探针550-6.5、苝绿色pH-探针720-5.5、苝绿标签pH-探针720-6.0、苝橙pH-探针550-2.0、苝橙标签550、苝红pH-探针600-5.5、苝二酰亚胺、苝绿pH-探针740-5.5、苯酚、苯丙氨酸、pHrodo、琥珀酰亚胺酯、酞菁、PicoGreen双链DNA定量试剂、频哪氰醇碘化物、吡罗昔康、四苯基四苯并卟啉铂(II)、李子紫(Plum Purple)、PO-PRO-1、PO-PRO-3、POPO-1、POPO-3、POPOP、卟吩、PPO、原黄素、PromoFluor-350、PromoFluor-405、PromoFluor-415、PromoFluor-488、PromoFluor-488Premium、PromoFluor-488LSS、PromoFluor-500LSS、PromoFluor-505、PromoFluor-510LSS、PromoFluor-514LSS、PromoFluor-520LSS、PromoFluor-532、PromoFluor-546、PromoFluor-555、PromoFluor-610、PromoFluor-633、PromoFluor-647、PromoFluor-670、PromoFluor-680、PromoFluor-700、PromoFluor-750、PromoFluor-770、PromoFluor-780、PromoFluor-840、碘化丙啶、原卟啉IX、PTIR475/UF、PTIR545/UF、PtOEP、PtOEPK、PtTFPP、芘、QD525、QD565、QD585、QD605、QD655、QD705、QD800、QD903、QD PbS 950、QDot 525、QDot 545、QDot 565、Qdot 585、Qdot605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、QpyMe2、QSY 7、QSY 7、QSY 9、QSY 21、QSY35、奎宁、硫酸奎宁、硫酸奎宁、R-藻红蛋白、R-藻红蛋白、ReAsH-CCPGCC、ReAsH-CCXXCC、RedBeads(Weiss)、雷德蒙红(Redmond Red)、试卤灵、试卤灵、rhod-2、罗丹明700高氯酸盐、罗丹明、罗丹明6G、罗丹明6G、罗丹明101、罗丹明110、罗丹明123、罗丹明123、罗丹明B、罗丹明B、罗丹明绿、罗丹明pH-探针585-7.0、罗丹明pH-探针585-7.5、罗丹明鬼笔环肽、罗丹明红-X、罗丹明红-X、罗丹明标签pH-探针585-7.0、罗多尔绿、核黄素、玫瑰红、蓝宝石(Sapphire)、SBFI、SBFI零Na、栅列藻属、SensiLight PBXL-1、SensiLight PBXL-3、Seta633-NHS、Seta-633-NHS、SeTau-380-NHS、SeTau-647-NHS、蛇眼红900、SNIR1、SNIR2、SNIR3、SNIR4、钠绿、沙拉菲尼尔嫩黄(Solophenyl flavine)7GFE 500、Spectrum Aqua、SpectrumBlue、Spectrum FRed、Spectrum Gold、Spectrum Green、Spectrum Orange、Spectrum Red、方酸染料III、Stains All、茋(Stilben)衍生物、茋、Styryl8高氯酸盐、磺基-花青3羧酸、磺基-花青3羧酸、磺基-花青3NHS酯、磺基-花青5羧酸、磺基-罗丹明101、磺基-罗丹明101、磺基-罗丹明B、磺基-罗丹明G、Suncoast Yellow、SuperGlo BFP、SuperGlo GFP、Surf GreenEX、SYBR Gold核酸凝胶染料、SYBR Green I、SYPRO Ruby、SYTO9、SYTO 11、SYTO 13、SYTO16、SYTO 17、SYTO 45、SYTO 59、SYTO 60、SYTO 61、SYTO 62.SYTO 82、SYTO RNASelect、SYTO RNASelect、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、T-蓝宝石(T-Sapphire)、Tb(Soini)、tCO、tdTomato、Terrylen、Terrylendiimid、testdye、四叔丁基氮杂卟啉、四叔丁基萘酞菁、并四苯(Tetracen)、四(邻氨基苯基)卟啉、四(均三甲苯基)卟啉、四甲基罗丹明、四甲基罗丹明、四苯基卟啉、四苯基卟啉、TexasRed、Texas Red DHPE、TexasRed-X、ThiolTracker紫、乙酸硫堇酯、TMRE、TO-PRO-1、TO-PRO-3、甲苯、Topaz(Tsien1998)、TOTO-1、TOTO-3、三(2，2′-联吡啶基)氯化钌(II)、三(4，4-二苯基-2，2-联吡啶)氯化钌(II)、三(4，7-二苯基-1，10-菲咯啉)钌(II)TMS、TRITC(Weiss)、TRITC葡聚糖(Weiss)、色氨酸、酪氨酸、Vex1、Vybrant Dyecycle Green(绿)染料、Vybrant Dyecycle Orange(橙)染料、Vybrant Dyecycle Violet(紫)染料、WEGFP(活化后)、WellRED D2、WellRED D3、WellRED D4、WtGFP、WtGFP(Tsienl998)、X-rhod-1、Yakima Yellow(黄)、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YoYo-1、YoYo-1双链DNA、YoYo-1单链DNA、YOYO-3、八乙基卟啉锌、酞菁锌、四(均三甲苯基)卟啉锌、四苯基卟啉锌、ZsGreen1或ZsYellow1。
在实施方案中，可检测标记是荧光染料。在实施方案中，可检测标记是能够与另一种荧光染料交换能量的荧光染料(例如荧光共振能量转移(FRET)发色团)。
在一些实施方案中，可检测部分是上文刚刚描述过的可检测部分之一的衍生物的部分，其中所述衍生物与上文刚刚描述过的可检测部分中的一个的不同之处在于通过将可检测部分缀合至本文所述的化合物而进行修饰。
如本文所述的术语“花青”或“花青部分”是指含有被聚次甲基链分隔的两个氮基的化合物。在实施方案中，花青部分具有3个次甲基结构(即花青3或Cy3)。在实施方案中，花青部分具有5个次甲基结构(即花青5或Cy5)。在实施方案中，花青部分具有7个次甲基结构(即花青7或Cy7)。
本发明化合物的描述受到本领域技术人员已知的化学键合原理的限制。因此，在一个基团可以被一个或多个取代基取代的情况下，选择这种取代以符合化学键合的原理，并且给出的化合物在环境条件下(例如水性、中性和一些已知的生理条件)不是固有不稳定的和/或普通的本领域技术人员已知其可能不稳定。例如，杂环烷基或杂芳基与分子的其余部分根据本领域技术人员已知的化学键合原理经由环杂原子连接，从而避免固有不稳定的化合物。
术语“药学上可接受的盐”意指包括用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐，这取决于本文描述的化合物上存在的具体取代基。当本发明化合物含有相对较酸性的官能团时，可以通过使这些化合物的中性形式与足够量的所需碱(纯的或在合适的惰性溶剂中)接触而获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐或镁盐或类似的盐。当本发明化合物含有相对碱性的官能团时，可以通过使这些化合物的中性形式与足够量的所需酸(纯的或在合适的惰性溶剂中)接触而获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸(如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等)的那些盐，以及衍生自相对无毒的有机酸(如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、草酸、甲磺酸等)的那些盐。还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及有机酸(如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等)的盐(参见例如Berge et al.，“Pharmaceutical Salts”，Journal of Pharmaceutical Science，1977，66，1-19)。本发明的某些具体化合物同时含有碱性官能团和酸性官能团，使得化合物可以转化为碱加成盐或酸加成盐。
因此，本发明的化合物可以以盐的形式存在，例如与药学上可接受的酸形成的盐。本发明包括这样的盐。这些盐的非限制性实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、丙酸盐、酒石酸盐(例如(+)-酒石酸盐、(-)-酒石酸盐或其混合物，包括外消旋混合物在内)、琥珀酸盐、苯甲酸盐，以及与氨基酸(如谷氨酸)形成的盐和季铵盐(如甲基碘，乙基碘等)。这些盐可以通过本领域技术人员已知的方法制备。
优选通过使盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物而重新生成化合物的中性形式。化合物的母体形式可以与各种盐形式在某些物理性质上不同，例如在极性溶剂中的溶解度。
除了盐形式之外，本发明提供了呈前药形式的化合物。本文所述化合物的前药是在生理条件下易于发生化学变化以提供本发明化合物的那些化合物。本文所述化合物的前药可以在施用后在体内进行转化。另外，前药可以在离体环境中通过化学或生物化学方法转化为本发明化合物，例如当与合适的酶或化学试剂接触时。
本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式以及包括水合形式在内的溶剂化形式存在。通常，溶剂化形式等同于非溶剂化形式，并且包括在本发明的范围内。本发明的某些化合物可以以多晶或无定形形式存在。通常，所有物理形式对于本发明所考虑的用途而言是等同的，并且旨在落入本发明的范围内。
“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的载体”是指有助于向个体施用活性剂并有助于活性剂被个体吸收的物质，并且可以包含在本发明的组合物中而不会对病人引起显著的毒理学副作用。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、普通蔗糖、普通葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、调味剂、盐溶液(例如林格氏液)、油、明胶、碳水化合物(如乳糖、直链淀粉或淀粉)、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷和色素等。这样的制剂可以是经灭菌的，并且如果需要，将制剂与不会和本发明的化合物有害地发生反应的助剂(如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂和/或芳香物质等)混合。本领域技术人员会认识到其他药物赋形剂可用于本发明。
术语“制剂”旨在包括活性化合物剂与包封材料的制剂，该包封材料作为提供胶囊的载体，在胶囊中与或不与其他载体在一起的活性成分被载体包围，因此载体与活性成分结合在一起。同样，包括扁囊剂和锭剂。片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可以用作适于口服给药的固体剂型。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用以表示氨基酸残基的聚合物，其中该聚合物可任选地缀合至不是由氨基酸组成的部分。这些术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人造化学模拟物，并适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
当多肽或细胞是人造的或被工程化的，或衍生自人造或工程化蛋白或核酸或含有人造或工程化蛋白或核酸(例如非天然或非野生型)时，多肽或细胞是“重组的”。例如，下述的多核苷酸是重组多核苷酸的实例：所述多核苷酸被插入载体或任何其他异源位置(例如重组生物体的基因组中)使得其与天然存在的多核苷酸正常侧接的核苷酸序列不相关联。由重组多核苷酸体外或体内表达的蛋白质是重组多肽的一个例子。同样，天然不存在的多核苷酸序列(例如天然存在的基因的变体)是重组的。
“杂交”意指基于序列互补性的公知原理将一个单链核酸(例如引物)与另一种核酸退火。在一个实施方案中，另一种核酸是单链核酸。核酸之间杂交的倾向取决于它们的温度和离子强度、核酸的长度和互补程度。在例如Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.，Molecular cloning：a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork(1989)中描述了这些参数对杂交的影响。如本文所用，分别通过与可形成磷酸二酯键的可用核苷酸或核苷酸类似物形成磷酸二酯键，可扩展引物或DNA延伸产物的杂交。
本文所用的“引物”(引物序列)是短的、通常是化学合成的寡核苷酸，其具有足以与靶核酸(例如单链核酸)杂交的适当长度，例如约18-24个碱基，并能够在本领域熟知的合适条件下向其添加核苷酸残基或由其合成寡核苷酸或多核苷酸。在一个实施方案中，引物是DNA引物，即由脱氧核糖核苷酸残基组成或基本上由其组成的引物。引物被设计成具有与模板/靶DNA的引物杂交区域互补的序列。通过形成磷酸二酯键将核苷酸残基添加至引物的3′末端产生DNA延伸产物。通过形成磷酸二酯键将核苷酸残基添加至DNA延伸产物的3′末端产生进一步的DNA延伸产物。在另一个实施方案中，引物是RNA引物。
本文所用的“核苷”是指由核碱基和5元环糖(核糖或脱氧核糖)组成的糖基化合物。核苷可包含碱基如A、C、G、T、U或其类似物。可以在碱基和/或糖处对核苷酸进行修饰。在一个实施方案中，核苷是脱氧核糖核苷。在另一个实施方案中，核苷是核糖核苷。
本文所用的“核苷酸”是指核苷-5′-多磷酸化合物或其结构类似物，其可以通过核酸聚合酶掺入以延伸生长的核酸链(例如引物)。核苷酸可以包含碱基例如A、C、G、T、U或其类似物，并且可以在磷酸基团中包含2、3、4、5、6、7、8或更多个磷酸。可以在一个或多个碱基、糖或磷酸基团上对核苷酸进行修饰。核苷酸可以具有标记物或标签(“标记的核苷酸”或“加标记的核苷酸”)。在一个实施方案中，核苷酸是脱氧核糖核苷酸。在另一个实施方案中，核苷酸是核糖核苷酸。
本文所用的“聚合酶”是指能够催化聚合反应(例如核苷酸单体的聚合以形成核酸聚合物)的任何天然或非天然存在的酶或其他催化剂。可用于本发明的组合物和方法中的聚合酶的示例性类型包括核酸聚合酶，例如DNA聚合酶、DNA或RNA依赖性RNA聚合酶，以及逆转录酶。在一些情况下，DNA聚合酶是9°N聚合酶或其变体、大肠杆菌DNA聚合酶I、噬菌体T4DNA聚合酶、测序酶，Taq DNA聚合酶、来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的DNA聚合酶、Bst 2.0DNA聚合酶，9°N聚合酶、9°N聚合酶(exo-)A485L/Y409V、Phi29 DNA聚合酶(
DNA聚合酶)、T7 DNA聚合酶、DNA聚合酶II、DNA聚合酶III全酶、DNA聚合酶IV、DNA聚合酶V、VentR DNA聚合酶、TherminatorTM II DNA聚合酶、TherminatorTM III DNA聚合酶或TherminatorTM IX DNA聚合酶。
“固体基底”应意指核酸或试剂可以附着于其上的以固相存在的任何合适的介质。非限制性实例包括芯片、珠和柱。
所使用的“接触”与其普通含义一致，是指使至少两种不同物质(例如包括生物分子或细胞在内的化学化合物)变得足够近以进行反应、相互作用或物理接触的过程。然而，应理解的是，所得到的反应产物可以直接由加入的试剂之间的反应制备或由可以在反应混合物中产生的来自一种或多种加入的试剂的中间体来制备。
术语“接触”可以包括使两种物质反应。相互作用或物理接触，其中两种物质可以是如本文所述的化合物和蛋白质或酶。在一些实施方案中，接触包括使本文所述的化合物与参与信号传导途径的蛋白质或酶相互作用。
如本文所定义的，涉及蛋白质的术语“活化”、“激活”等是指蛋白质从初始无活性或失活状态转化为具有生物活性的衍生物。所述术语涉及激活、敏化或上调信号转导或酶活性或在疾病中减少的蛋白的量。
术语“激动剂”、“活化剂”、“上调剂”等是指能够可检测地增加给定基因或蛋白质的表达或活性的物质。与不存在激动剂时的对照相比，激动剂可以增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的表达或活性。在某些情况下，表达或活性是不存在激动剂时的表达或活性的1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更高。
如本文所定义的，关于蛋白质-抑制剂相互作用的术语“抑制”等意指相对于不存在抑制剂的情况下蛋白质的功能，对蛋白质的活性或功能有负面影响(例如降低)。在实施方案中，抑制意指相对于不存在抑制剂时蛋白质的浓度或水平，对蛋白质的浓度或水平产生负面影响(例如降低)。在实施方案中，抑制是指减少疾病或疾病症状。在实施方案中，抑制是指特定蛋白质靶标的活性降低。因此，抑制包括至少部分地、部分地或完全地阻断刺激、降低、预防或延迟活化、或失活、脱敏或下调信号转导或酶活性或蛋白质的量。在实施方案中，抑制是指由直接相互作用(例如抑制剂结合靶蛋白)导致的靶蛋白活性的降低。在实施方案中，抑制是指由间接相互作用(例如，抑制剂结合激活靶蛋白的蛋白质，从而阻止靶蛋白激活)导致的靶蛋白活性的降低。
术语“抑制剂”、“阻遏物”或“拮抗剂”或“下调剂”可互换地指能够可检测地降低给定基因或蛋白质的表达或活性的物质。与不存在拮抗剂时的对照相比，拮抗剂可以使表达或活性降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在某些情况下，表达或活性是不存在拮抗剂时的表达或活性的1/1.5、1/2、1/3、1/4、1/5、1/10或更低。
术语“链霉亲和素”和
是指能够结合生物素的四聚体蛋白(包括其同源物、同种型和功能片段)。该术语包括维持链霉亲和素活性(例如与野生型链霉亲和素相比，具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的活性)的任何重组或天然形式的链霉亲和素变体。
术语“表达”包括涉及产生多肽的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。可以使用用于检测蛋白质的常规技术(例如ELISA、蛋白质免疫印迹、流式细胞术、免疫荧光、免疫组织化学等)检测表达。
“有效量”是相对于不存在化合物时，足以使该化合物实现所述目的的量(例如达到施用其所要达到的效果，即治疗疾病、降低酶活性、增加酶活性、减少信号传导途径、或减少疾病或病症的一种或多种症状)。本文所用的“活性降低量”是指相对于不存在拮抗剂而言降低酶活性所需的拮抗剂的量。本文所用的“功能破坏量”是指相对于不存在拮抗剂而言破坏酶或蛋白质功能所需的拮抗剂的量。
本文所用的“细胞”是指执行代谢功能或其他功能的细胞，其足以保存或复制其基因组DNA。细胞可以通过本领域熟知的方法鉴定，包括例如完整膜的存在。由特定染料染色、产生后代的能力或者在配子的情况下能够与第二配子结合产生一个可存活的后代。细胞可以包括原核细胞和真核细胞。原核细胞包括但不限于细菌。真核细胞包括但不限于酵母细胞和来源于植物和动物的细胞，例如哺乳动物、昆虫(例如夜蛾(Spodoptera))和人类细胞。当细胞天然为非粘附性的或已被处理(例如通过胰蛋白酶消化)从而不粘附至表面时，它们可能是有用的。
使用的“对照”或“对照实验”与其平常的普通含义一致，是指这样的实验，其中将实验的个体或试剂如在平行实验中一样进行处理，不同之处在于省略了实验的步骤、试剂、或变量。在某些情况下，将对照用作评估实验效果的比较标准。在一些实施方案中，对照是在不存在本文所述的化合物(包括实施方案和实施例)的情况下测量蛋白质的活性。
所用术语“调节”与其普通含义一致，是指改变或变化一种或多种性质的行为。“调节”是指改变或变化一种或多种性质的过程。例如，当应用于调节剂对靶蛋白质的作用时，调节是指通过增强或减弱靶分子的性质或功能或靶分子的量进行改变的手段。
本文使用的术语“异常”是指与正常不同。当用于描述酶活性或蛋白质功能时，异常是指活性或功能大于或小于正常对照或正常非患病对照样品的平均值。
本文使用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”或语法上的对等词表示共价连接在一起的至少两个核苷酸。术语“核酸”包括其单链、双链或多链DNA、RNA及其类似物(衍生物)。寡核苷酸的长度通常为约5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50或更多个核苷酸的长度，至多约100个核苷酸的长度。核酸和多核苷酸是任何长度的聚合物，包括更长的长度，例如200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10000等。在某些实施方案中，本文的核酸含有磷酸二酯键。在其他实施方案中，包括具有可替代的骨架的核酸类似物，可替代的骨架包含例如氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键或O-甲基亚磷酰胺键(参见Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，Oxford University Press)；和肽核酸骨架和键。其他类似物核酸包括具有阳性骨架；非离子骨架和非核糖骨架的核酸，包括在第5,235,033号和第5,034,506号美国专利中以及ASC Symposium Series 580，Carbohydrate Modifications in Antisense Research，Sanghui＆Cook，eds，第6、7章中描述的那些。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的一个定义中。可以出于各种原因对核糖磷酸骨架进行修饰，例如为了增加这些分子在生理环境中的稳定性和半衰期，或作为生物芯片上的探针。可以制备天然存在的核酸和类似物的混合物；或者，可以制备不同核酸类似物的混合物，以及天然存在的核酸和类似物的混合物。本文所提及的核酸的残基是核酸的单体(例如，核苷酸)。
特定的核酸序列也包括“剪接变体”。类似地，由核酸编码的特定蛋白质包括由该核酸的剪接变体编码的任何蛋白质。顾名思义，“剪接变体”是基因选择性剪接的产物。转录后，可以剪接初始核酸转录物，使得不同的(替代的)核酸剪接产物编码不同的多肽。产生剪接变体的机制各不相同，但包括外显子的交替剪接。该定义也包括通过读取出转录从相同核酸衍生的可选多肽。剪接反应的任何产物，包括剪接产物的重组形式在内，都包括在该定义中。在Leicher，et al.，J.Biol.Chem.273(52)：35095-35101(1998)中描述了钾通道剪接变体的一个实例。
当将核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，核酸是“可操作地连接”的。例如，如果将前导序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，则其表达为参与多肽分泌的前蛋白；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果放置核糖体结合位置以便于翻译，则该核酸体结合位点与编码序列可操作地连接。一般而言，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列彼此靠近，并且在分泌前导序列的情况下，被连接的DNA序列是连续的并处于阅读框中。但是，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点进行连接来完成。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过人工比对和目测检查(参见例如NCBI网站等)进行测量时，两个或更多个序列或子序列相同，或者两个或更多个序列具有特定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，当在比较窗口或指定区域内比较和比对最大对应性时，在指定区域上具有约60％同一性，优选61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％，94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)。那么认为这样的序列是“基本相同的”。该定义还涉及或可以应用于测试序列的补体。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。如下所述，优选的算法可以解决缺口等问题。优选地，同一性存在于长度为至少约10个氨基酸或20个核苷酸的区域上，或更优选地在长度为10-50个氨基酸或20-50个核苷酸的区域上。本文所使用的氨基酸序列同一性百分比(％)被定义为在比对序列和引入缺口(如果需要)以实现最大序列同一性百分比后，候选序列中与参考序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分比。为了确定序列同一性百分比，可以以本领域技术范围内的各种方式实现比对，例如使用公众可获取的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。可以通过已知方法确定用于测量比对的适当参数，包括在比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
本文所用的“比较窗口”是指由选自10-600、通常约50至约200、更通常约100-150的任何一个数目的连续位置组成区段，在该比较窗口中，在序列与相同数目连续位置的参考序列以最佳方式对齐后，可以将两个序列进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith＆Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法进行，通过Needleman＆Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法进行，通过Pearson＆Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85：2444(1988)中的相似性搜索方法进行，通过这些算法的计算机化实现(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在威斯康星遗传软件包(Wisconsin Genetics SoftwarePackage)中，基因计算机组，575科学博士，麦迪逊，威斯康星州)进行，或通过人工比对和可视化检查(例如参见Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.1995supplement)进行。
本文所用的术语“生物缀合物”或“生物缀合物接头”是指生物缀合物反应性基团的原子之间或分子之间产生的结合。该结合可以是直接或间接的。例如，本文提供的第一生物缀合物反应性基团(例如-NH2、-COOH、-N-羟基琥珀酰亚胺或马来酰亚胺)与第二生物缀合物反应性基团(例如巯基、含硫氨基酸、胺、含胺侧链的氨基酸、或羧酸盐)之间的缀合可以是直接的，例如通过共价键或接头(例如第一接头或第二接头)，或是间接的，例如通过非共价键(例如静电相互作用(例如离子键、氢键、卤键)、范德华相互作用(例如偶极-偶极、偶极诱导偶极、伦敦分散)、环堆积(π效应)、疏水相互作用等)。在实施方案中，当生物缀合反应性基团的原子之间或分子之间的缔合是直接的(例如共价键、接头)情况时，生物缀合物是点击化学反应的反应物部分。
在实施方案中，使用生物缀合物化学反应(即两个生物缀合物反应性基团的结合)形成生物缀合物或生物缀合物接头，生物缀合物化学反应包括但不限于亲核取代(例如胺和醇与酰基卤、活性酯的反应)、亲电取代(例如烯胺反应)以及对碳-碳和碳-杂原子多重键的加成(例如迈克尔反应、狄尔斯-阿尔德加成)。这些反应和其他有用的反应在例如下述文献中进行了讨论：March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，3rd Ed.，John Wiley＆Sons，纽约，1985；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，AcademicPress，圣地亚哥，1996；以及Feeney et al.，MODIFICATION OF PROTEINS；Advances in Chemistry Series，198卷，American Chemical Society(美国化学会)，华盛顿特区，1982。在实施方案中，第一生物缀合反应性基团(例如马来酰亚胺部分)共价连接至第二生物缀合反应性基团(例如巯基)。在实施方案中，第一生物缀合物反应性基团(例如卤代乙酰基部分)共价连接至第二生物缀合物反应性基团(例如巯基)。在实施方案中，第一生物缀合反应性基团(例如吡啶基部分)共价连接至第二生物缀合反应性基团(例如巯基)。在实施方案中，第一生物缀合反应性基团(例如，N-羟基琥珀酰亚胺部分)共价连接至第二生物缀合反应性基团(例如胺)。在实施方案中，第一生物缀合反应性基团(例如马来酰亚胺部分)共价连接至第二生物缀合反应性基团(例如巯基)。在实施方案中，第一生物缀合反应性基团(例如-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺部分)共价连接至第二生物缀合反应性基团(例如胺)。
本文中用于生物缀合物化学反应的有用生物缀合物反应性基团包括例如：(a)羧基及其各种衍生物，包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰卤、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯酯、烷基、烯基、炔基和芳族酯；
(b)可以转化成酯、醚、醛等的羟基；
(c)卤代烷基，其中随后卤素可用亲核基团(例如胺、羧酸根阴离子、硫醇阴离子、碳负离子或醇盐离子)取代，从而使新基团共价连接于卤原子的位置；
(d)能够参与狄尔斯-阿尔德反应的亲二烯体基团，例如马来酰亚胺基或马来酰亚胺基团；
(e)醛或酮基，从而通过形成羰基衍生物(例如亚胺、腙、缩氨基脲或肟)或通过例如格氏加成或烷基锂加成的机制可进行随后的衍生化；
(f)磺酰卤基团，用于随后与胺反应，例如形成磺酰胺；
(g)硫醇基，其可以转化为二硫化物，与酰基卤反应，或与金等金属键合，或与马来酰亚胺反应；
(h)胺或巯基(例如存在于半胱氨酸中)，其可以例如酰化、烷基化或氧化；
(i)烯烃，其可以经历例如环加成反应、酰化反应、迈克尔加成等；
(j)环氧化物，其可与例如胺和羟基化合物反应；
(k)亚磷酰胺和用于核酸合成的其他标准官能团；
(l)金属硅氧化物结合；和
(m)与反应性磷基(例如膦)键合形成例如磷酸二酯键的金属；
(n)叠氮化物，其通过铜催化的环加成点击化学与炔烃偶联；
(o)生物素缀合物，其可以与抗生物素蛋白或链霉亲和素反应以形成抗生物素蛋白-生物素复合物或链霉亲和素-生物素复合物。
可选择生物缀合物反应性基团，使得它们不参与或干扰本文所述的缀合物的化学稳定性。或者，通过保护基团的存在可以保护反应性官能团免于参与交联反应。在实施方案中，生物缀合物包含衍生自不饱和键(例如马来酰亚胺)和巯基的反应的分子实体。
使用的术语“单磷酸酯”与其在本领域中的普通含义一致，指具有下式的部分：
术语“多磷酸酯”是指至少两个磷酸酯基团，具有下式：
其中np是1或更大的整数。在实施方案中，np是0-5的整数。在实施方案中，np是0-2的整数。在实施方案中，np是2。
本文所用的术语“碱基”是指可以作为核酸(即DNA或RNA或其衍生物)的组成部分的二价嘌呤或嘧啶化合物或其衍生物。在实施方案中，碱基是天然存在的DNA或RNA碱基的衍生物(例如碱基类似物)。在实施方案中，碱基是杂交碱基。在实施方案中，碱基与互补碱基杂交。在实施方案中，所述碱基能够与互补碱基形成至少一个氢键(例如腺嘌呤与胸腺嘧啶的氢键、腺嘌呤与尿嘧啶的氢键、与胞嘧啶配对的鸟嘌呤)。碱基的非限制性实例包括胞嘧啶或其衍生物(例如胞嘧啶类似物)、鸟嘌呤或其衍生物(例如鸟嘌呤类似物)、腺嘌呤或其衍生物(例如腺嘌呤类似物)、胸腺嘧啶或其衍生物(例如胸腺嘧啶类似物)、尿嘧啶或其衍生物(例如尿嘧啶类似物)、次黄嘌呤或其衍生物(例如次黄嘌呤类似物)、黄嘌呤或其衍生物(例如黄嘌呤类似物)、7-甲基鸟嘌呤或其衍生物(例如7-甲基鸟嘌呤类似物)、脱氮腺嘌呤或其衍生物(例如脱氮腺嘌呤类似物)、脱氮鸟嘌呤或其衍生物(例如脱氮鸟嘌呤类似物)、脱氮次黄嘌呤或其衍生物、5，6-二氢尿嘧啶或其衍生物(例如5，6-二氢尿嘧啶类似物)、5-甲基胞嘧啶或其衍生物(例如5-甲基胞嘧啶类似物)或5-羟甲基胞嘧啶或其衍生物(例如5-羟甲基胞嘧啶类似物)部分。在实施方案中、所述碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、可可碱、咖啡因、尿酸或异鸟嘌呤。在实施方案中，碱基为：
所用术语“非共价接头”与其普通含义一致，是指包含彼此不共价连接但通过非共价键相互作用(例如静电相互作用(例如离子键、氢键、卤键)或范德华相互作用(例如偶极-偶极、偶极-诱导偶极、伦敦分散)的至少两个分子的二价部分。
本文所用的术语“锚部分”是指能够与任选不同的第二化学部分(例如互补锚部分结合剂)相互作用(例如，共价或非共价)的化学部分。在实施方案中，锚部分是能够与互补的生物缀合物反应性基团(例如，互补的锚部分反应性基团)相互作用(例如，共价地)的生物缀合物反应性基团。在实施方案中，锚部分是点击化学反应的反应物部分。在实施方案中，锚部分(“亲和锚部分”)能够与第二化学部分(例如互补性的亲和锚部分结合剂)以非共价的方式相互作用。锚部分的非限制性实例包括生物素、叠氮化物、反式环辛烯(TCO)(Melissa L，et al.J.Am.Chem.Soc.，2008，130，13518-13519；Marjoke F，etal.Org.Biomol.Chem.，2013，11，6439-6455)和苯基硼酸(PBA)(Bergseid M，etal.BioTechniques，2000，29，1126-1133)。在实施方案中，亲和锚部分(例如生物素部分)与互补性的亲和锚部分结合剂(例如链霉亲和素部分)以非共价的方式相互作用。在实施方案中，锚部分(例如叠氮部分、反式环辛烯(TCO)部分、苯基硼酸(PBA)部分)共价结合互补性的锚部分结合剂(例如二苯并环辛炔(DBCO)部分(Jewett JC and BertozziCRJ.Am.Chem.Soc.，2010，132，3688-3690)、四嗪(TZ)部分、水杨基异羟肟酸(SHA)部分)。
本文所用的术语“可切割接头”或“可切割部分”分别指能够被分离(例如解离、分解、断开、水解、该部分内的稳定键被断裂)为不同实体的二价部分或一价部分。可切割接头是响应于外部刺激(例如，酶、亲核/碱性试剂、还原剂、光照射、亲电/酸性试剂、有机金属和金属试剂或氧化剂)而可切割的(例如，可特异性切割)。化学可切割的接头是指能够响应于化学物质(例如，酸、碱、氧化剂、还原剂、Pd(0)、三-(2-羧乙基)膦)、稀亚硝酸、氟化物、三(3-羟丙基)膦、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、肼(N2H4))而被分解的接头。化学可切割接头不是酶可切割的。在实施方案中，通过使可切割接头与切割剂接触来切割可切割接头。在实施方案中，切割剂是连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、弱酸、肼(N2H4)、Pd(0)或光照射(例如紫外线照射)。
光可切割接头(例如，包括邻硝基苄基或由邻硝基苄基组成)是指能够响应于光照射(例如紫外线照射)而被分解的接头。酸可切割接头是指能够响应于pH变化(例如酸度增加)而被分解的接头。碱可切割的接头是指能够响应于pH变化(例如酸度降低)而被分解的接头。氧化剂可切割的接头是指响应于氧化剂的存在而能够被分解的接头。还原剂可切割接头是指响应于还原剂(例如，三(3-羟丙基)膦)的存在而能够被分解的接头。在实施方案中，可切割接头是二烷基缩酮接头(Binaulda S，et al.Chem.Commun.，2013，49，2082-2102；Shenoi RA，et al.J.Am.Chem.Soc.，2012，134，14945-14957)、偶氮接头(Rathod，KM，et al.Chem.Sci.Tran.，2013，2，25-28；Leriche G，et al.Eur.J.Org.Chem.，2010，23，4360-64)、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头或硝基苄基接头。
本文所用的术语“正交可切割接头”指可被两种或更多种不同切割剂的混合物中的第一切割剂(例如酶、亲核/碱性试剂、还原剂、光照射、亲电/酸性试剂、有机金属和金属试剂、氧化剂)切割且不被该两种或更多种切割剂的混合物中的任何其他不同切割剂切割的可切割接头。例如，当两种不同的可切割接头的混合物与两种不同的切割剂反应时，每种可切割接头仅被一种切割剂切割而不被另一种切割剂切割，则这两种不同的可切割接头都是正交可切割接头。在实施方案中，在正交可切割接头被切割后，两个分离的实体(例如荧光染料、生物缀合物反应性基团)不进一步反应并也不会形成新的正交可切割接头。
本文所用的术语“正交结合基团”或“正交结合分子”是指能够结合两种或更多种不同的互补结合基团的混合物中的第一互补结合基团(例如，互补性锚部分结合剂或锚部分)且不能结合该两种或更多种互补结合基团的混合物中的任何其他不同的互补结合基团的结合基团(例如锚部分或互补锚部分结合剂)。例如，当两个不同结合基团的混合物与两个互补结合基团反应时，每个结合基团仅结合一个互补结合基团而不结合另一个互补结合基团，则两个不同的结合基团都是正交结合基团。一组四个正交结合基团和一组正交互补结合基团的实例是：结合基团生物素、叠氮化物、反式环辛烯(TCO)和苯基硼酸(PBA)，它们特异性且有效地结合互补结合基团链霉亲和素、二苯并环辛炔(DBCO)、四嗪(TZ)和水杨基异羟肟酸(SHA)或与它们反应。
本文所用的术语“正交可检测标签”或“正交可检测部分”是指在两种或更多种不同的可检测标签的混合物或实验组(不同样本的集合)中能够被检测和鉴定(例如，通过使用检测手段(例如发射波长、物理特性测量))的可检测标签(例如荧光染料或可检测染料)。例如，当两种不同荧光染料的实验组受到被一种荧光染料吸收而不被另一种荧光染料吸收的一定波长的光照射时，吸收所述光的荧光染料发射光，而其他荧光染料不发射光，则作为荧光染料的两种不同的可检测标签都是正交可检测标签。正交可检测标签可以通过相互比较正交可检测标签的不同吸光度或发射强度而分别鉴定，而不仅仅是通过信号绝对存在或不存在来鉴定。一组四个正交可检测标签的实例是Rox标记的四嗪、Alexa488标记的SHA、Cy5标记的链霉亲和素和R6G标记的二苯并环辛炔的组。
本文所用的术语“聚合酶相容的可切割部分”是指不干扰聚合酶(例如DNA聚合酶、修饰的DNA聚合酶)功能的可切割部分。用于确定本文考虑的聚合酶功能的方法描述于B.Rosenblum et al.(Nucleic Acids Res.1997Nov 15；25(22)：4500-4504)和Z.Zhu etal.(Nucleic Acids Res.1994Aug 25；22(16)：3418-3422)，通过引用将所述文献全文并入本文用于所有目的。在实施方案中，相对于不存在聚合酶-相容的可切割部分的情况，聚合酶-相容的可切割部分不降低聚合酶的功能。在实施方案中，聚合酶相容的可切割部分不会不利地影响DNA聚合酶识别。在实施方案中，聚合酶相容的可切割部分不会不利地影响(例如，限制)DNA聚合酶的读取长度。聚合酶相容的可切割部分的其他实例可以在下述文献中找到：第6,664,079号美国专利；Ju J.等人(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103(52)：19635-19640；Ruparel H.等人(2005)Proc Natl Acad Sci USA 102(17)：5932-5937；WuJ.等人(2007)Proc Natl Acad Sci USA 104(104)：16462-16467；Guo J.等人(2008)ProcNatl Acad Sci USA 105(27)：9145-9150；Bentley D.R.等人(2008)Nature 456(7218)：53-59；或Hutter D.等人(2010)Nucleosides Nucleotides＆Nucleic Acids29：879-895，通过引用将所述文献全文并入本文用于所有目的。在实施方案中，聚合酶相容的可切割部分包括叠氮基部分或二硫基连接部分。在实施方案中，聚合酶相容的可切割部分是-NH2、-CN、-CH3、C2-C6烯丙基(例如，-CH2-CH＝CH2)、甲氧基烷基(例如，-CH2-O-CH3)或-CH2N3。在实施方案中，聚合酶相容的可切割部分为：
如本文所述的术语“烯丙基”是指与乙烯基(即-CH＝CH2)连接的未取代的亚甲基，其具有式
“烯丙基接头”是指二价的与乙烯基连接的未取代亚甲基，具有式
在提供一定范围的值的情况下，应理解的是除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值(如果合适，至下限单位的十分之一)，以及所述范围内的任何其他所述值或中间值都包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包含在本发明内，受限于所述范围内的任何特别排除的界限。在所述范围包括一个或两个界限的情况下，不包括那些所包括的界限中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
某些实施方案
II化合物
一方面，本发明提供了具有下式的化合物：
B为碱基。L1为共价接头。L2为共价接头。R3为-OH、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、多磷酸酯或核酸。R4A为氢、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-OCX1 3、-OCH2X1、-OCHX1 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R4B为氢、-CX2 3、-CHX2 2、-CH2X2、-OCX2 3、-OCH2X2、-OCHX2 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R5为可检测标签或锚部分。R6为氢或聚合酶相容的可切割部分。R7为氢或-OR7A，其中R7A为氢或聚合酶相容的可切割部分。符号X1和X2独立地为卤素。
一方面，本发明提供了具有下式的化合物：
B为碱基。L3为可切割的接头。R3为-OH、单磷酸酯、多磷酸酯或核酸。R5为可检测标记或锚部分。R7为氢或-OR7A，其中R7A为氢或
R8A独立地为氢、CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R8B独立地为氢、CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R8C独立地为氢，CH3、-CX8C 3、-CHX8C 2、-CH2X8C、-OCX8C 3、-OCH2X8C、-OCHX8C 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。符号X3、X4和X8C独立地为卤素。在实施方案中，R8C独立地为未取代的苯基。
一方面，本发明提供了式(III)的化合物
B是碱基。L3是可切割的接头。R3是-OH、单磷酸酯、多磷酸酯或核酸。R5是可检测标签或锚部分。R7是氢或-OR7A，其中R7A是氢或
R8A是氢、CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R8B是氢、CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R9是氢、CH3、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R10是氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R11是氢、CH3、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。符号X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。
另一方面，本发明提供了下式的化合物：
R7A是氢或聚合酶相容的可切割部分；R8A独立地为氢、CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R8B独立地为氢、CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R9独立地为氢、CH3、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R10独立地是氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R11独立地是氢、CH3、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。符号X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。符号m独立地是1-4的整数。
一方面，本发明提供了下式的化合物：
一方面，本发明提供了下式：
R8A是氢、CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R8B独立地是氢、CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R9独立地是氢、CH3、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R10独立地是氢、CH3、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R11独立地是氢、CH3、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。符号X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。符号m独立地是1-4的整数。
一方面，本发明提供下式的化合物：
R8A独立地是氢、CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R8B独立地是氢、CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R9独立地是氢、CH3、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R10独立地是氢、-CH3、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R11独立地是氢、CH3、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。符号X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。
另一方面，本发明提供了下式的组合物：
符号“---”是非共价键。B为碱基。L1是共价接头。L2是共价接头。L4是共价接头。R3是-OH、单磷酸酯、多磷酸酯或核酸。R4A为氢、CH3、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-OCX1 3、-OCH2X1、-OCHX1 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R4B为氢、CH3、-CX2 3、-CHX2 2、-CH2X2、-OCX2 3、-OCH2X2、-OCHX2 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R5为亲和锚部分。R6为氢或聚合酶相容的可切割部分。R7为氢或-OR7A，其中R7A为氢或聚合酶相容的可切割部分。R12是互补的亲和锚部分结合剂。R13是可检测标签。符号X1和X2独立地为卤素。
在实施方案中，b为二价胞嘧啶或其衍生物、二价鸟嘌呤或其衍生物、二价腺嘌呤或其衍生物、二价胸腺嘧啶或其衍生物、二价尿嘧啶或其衍生物、二价次黄嘌呤或其衍生物、二价黄嘌呤或其衍生物、脱氮腺嘌呤或其衍生物、脱氮鸟嘌呤或其衍生物、脱氮次黄嘌呤或其衍生物、二价7-甲基鸟嘌呤或其衍生物、二价5，6-二氢尿嘧啶或其衍生物、二价5-甲基胞嘧啶或其衍生物或二价5-羟甲基胞嘧啶或其衍生物。
在实施方案中，B为二价胞嘧啶、二价鸟嘌呤、二价腺嘌呤、二价胸腺嘧啶、二价尿嘧啶、二价次黄嘌呤、二价黄嘌呤、脱氮腺嘌呤、脱氮鸟嘌呤、脱氮次黄嘌呤或其衍生物、二价7-甲基鸟嘌呤、二价5，6-二氢尿嘧啶、二价5-甲基胞嘧啶或二价5-羟甲基胞嘧啶。在实施方案中，B是二价胞嘧啶。在实施方案中，B是二价鸟嘌呤。在实施方案中，B是二价腺嘌呤。在实施方案中，B是二价胸腺嘧啶。在实施方案中，B是二价尿嘧啶。在实施方案中，B是二价次黄嘌呤。在实施方案中，B是二价黄嘌呤。在实施方案中，B是脱氮腺嘌呤。在实施方案中，B是脱氮鸟嘌呤。在实施方案中，B是脱氮次黄嘌呤或其衍生物、二价7-甲基鸟嘌呤。在实施方案中，B是二价的5，6-二氢尿嘧啶。在实施方案中，B是二价5-甲基胞嘧啶。在实施方案中，B是二价5-羟甲基胞嘧啶。
在实施方案中，B是二价胞嘧啶或其衍生物。在实施方案中，B是二价鸟嘌呤或其衍生物。在实施方案中，B是二价腺嘌呤或其衍生物。在实施方案中，B是二价胸腺嘧啶或其衍生物。在实施方案中，B是二价尿嘧啶或其衍生物。在实施方案中，B是二价次黄嘌呤或其衍生物。在实施方案中，B是二价黄嘌呤或其衍生物。在实施方案中，B是脱氮腺嘌呤或其衍生物。在实施方案中，B是脱氮鸟嘌呤或其衍生物。在实施方案中，B是脱氮次黄嘌呤或其衍生物、二价7-甲基鸟嘌呤或其衍生物。在实施方案中，B是二价5，6-二氢尿嘧啶或其衍生物。在实施方案中，B是二价5-甲基胞嘧啶或其衍生物。在实施方案中，B是二价5-羟甲基胞嘧啶或其衍生物。
在实施方案中，B为
在实施方案中，B为
在实施方案中，B为
在实施方案中，B为
在实施方案中，B为
在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D和L1E独立地为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基、亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基、亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D和L1E独立地为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C8亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基、亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-8元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基、亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C8亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C10亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-10元亚杂芳基；其中，L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D和L1E独立地为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基、亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基、亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元亚杂芳基；其中，L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L1是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基、亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基、亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基。
在实施方案中，L1为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C8亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基、亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-8元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基、亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C8亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C10亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-10元亚杂芳基。
在实施方案中，L1为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基、亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基、亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元亚杂芳基。
在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D或L1E独立地为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烯基(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烯基；其中，L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D或L1E独立地为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C8亚烯基，或者取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-8元亚杂烯基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D或L1E独立地为键、取代的(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6亚烯基、或者取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元亚杂烯基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L1是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烯基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烯基。在实施方案中，L1是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C2-C8亚烯基，或者取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元亚杂烯基。在实施方案中，L1为键、取代的(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C2-C6亚烯基、或者取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元亚杂烯基。
在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D或L1E独立地为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚炔基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂炔基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D或L1E独立地为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C8亚炔基，或者取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-8元亚杂炔基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。在实施方案中，L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且L1A、L1B、L1C、L1D或L1E独立地为键、取代的(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6亚炔基、或者取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元亚杂炔基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L1是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚炔基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂炔基。在实施方案中，L1是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C2-C8亚炔基，或者取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元亚杂炔基。在实施方案中，L1为键、取代的(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C2-C6亚炔基、或者取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元亚杂炔基。
在实施方案中，L1为取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6亚烃基(例如亚烷基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)亚烯基或亚炔基)、或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元亚杂烷基(例如亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)。在实施方案中，L1是未取代的C1-C4亚烷基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)。在实施方案中，L1是-C≡C-CH2-。
在实施方案中，L1是聚合物。术语“聚合物”是指包含重复的子单元(例如聚合单体)的分子。例如，聚合物分子可以基于聚乙二醇(PEG)、四聚乙二醇(TEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚(二甲苯)或聚(对二甲苯)。使用的术语“可聚合单体”与其在聚合物化学领域中的含义一致，是指可以与其他单体分子(例如相同或不同的其他可聚合单体)化学共价结合以形成聚合物的化合物。
在实施方案中，L2是可切割的接头。在实施方案中，L2是化学可切割的接头。在实施方案中，L2是光可切割接头、酸可切割接头、碱可切割接头、氧化剂可切割接头、还原剂可切割接头或氟化物可切割接头。在实施方案中，L2是光可切割接头。在实施方案中，L2是酸可切割接头。在实施方案中，L2是碱可切割接头。在实施方案中，L2是氧化剂可切割接头。在实施方案中，L2是还原剂可切割的接头。在实施方案中，L2是氟化物可切割接头。
在实施方案中，L2包括可切割的接头。在实施方案中，L2包含化学可切割的接头。在实施方案中，L2包括光可切割接头、酸可切割接头、碱可切割接头、氧化剂可切割接头、还原剂可切割接头或氟化物可切割接头。在实施方案中，L2包含光可切割接头。在实施方案中，L2包含酸可切割的接头。在实施方案中，L2包含碱基可切割的接头。在实施方案中，L2包含氧化剂可切割的接头。在实施方案中，L2包含还原剂可切割的接头。在实施方案中，L2包含氟化物可切割的接头。
在实施方案中，L2是可切割接头，其包括二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头或硝基苄基接头。在实施方案中，L2是包括二烷基缩酮接头的可切割接头。在实施方案中，L2是包括偶氮接头的可切割接头。在实施方案中，L2是包括烯丙基接头的可切割接头。在实施方案中，L2是包括氰乙基接头的可切割接头。在实施方案中，L2是包括1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头的可切割接头。在实施方案中，L2是包括硝基苄基接头的可切割接头。
在实施方案中，L2是L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；并且L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L2是L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；并且L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C20亚烷基(例如亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-20元亚杂烷基(例如亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C20亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-20元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C20亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-20元亚杂芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L2是L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；并且L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C10亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-10元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C8亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C10亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-10元亚杂芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L2是L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；并且L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元亚杂芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L2是L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；L2A是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)。L2B是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；L2C是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；L2D是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)；L2E是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L2是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基。在实施方案中，L2是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C20亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-20元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C20亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-20元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C20亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-20元亚杂芳基。在实施方案中，L2是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C8亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-8元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C8亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C10亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-10元亚杂芳基。在实施方案中，L2是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元亚杂芳基。
在实施方案中，L2为取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的4-10元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)。在实施方案中，L2为取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的4-8元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)。在实施方案中，L2是取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的4-6元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)。
在实施方案中，L3是正交可切割的接头。在实施方案中，L3是可切割的接头。在实施方案中，L3是化学可切割的接头。在实施方案中，L3是光可切割接头、酸可切割接头、碱可切割接头、氧化剂可切割接头、还原剂可切割接头或氟化物可切割接头。在实施方案中，L3是光可切割的接头。在实施方案中，L3是酸可切割的接头。在实施方案中，L3是碱可切割的接头。在实施方案中，L3是氧化剂可切割的接头。在实施方案中，L3是还原剂可切割的接头。在实施方案中，L3是氟化物可切割的接头。在实施方案中，L3是可切割接头，其包括二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头或者硝基苄基接头。在实施方案中，L3是包括二烷基缩酮接头的可切割接头。在实施方案中，L3是偶氮接头。在实施方案中，L3是烯丙基接头。在实施方案中，L3是氰乙基接头。在实施方案中，L3是1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头或硝基苄基接头。
在实施方案中，L3包括正交可切割的接头。在实施方案中，L3包括可切割的接头。在实施方案中，L3包括化学可切割的接头。在实施方案中，L3包括光可切割的接头、酸可切割接头、碱可切割接头、氧化剂可切割接头、还原剂可切割接头或氟化物可切割接头。在实施方案中，L3包括光可切割接头。在实施方案中，L3包括酸可切割的接头。在实施方案中，L3包括碱可切割的接头。在实施方案中，L3包括氧化剂可切割的接头。在实施方案中，L3包括还原剂可切割的接头。在实施方案中，L3包括氟化物可切割的接头。在实施方案中，L3包括二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头或硝基苄基接头。在实施方案中，L3包括二烷基缩酮接头。在实施方案中，L3包括偶氮接头。在实施方案中，L3包括烯丙基接头。在实施方案中，L3包括氰乙基接头。在实施方案中，L3包括1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头。在实施方案中，L3包括硝基苄基接头。
在实施方案中，L3是L3A-L3B-L3C-L3D-L3E。L3A、L3B、L3C、L3D或L3E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；其中L3A、L3B、L3C、L3D和L3E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L3是L3A-L3B-L3C-L3D-L3E；L3A、L3B、L3C、L3D或L3E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C20亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-20元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C20亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-20元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C20亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-20元亚杂芳基；其中L3A、L3B、L3C、L3D和L3E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L3是L3A-L3B-L3C-L3D-L3E；L3A、L3B、L3C、L3D或L3E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C10亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-10元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C8亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C1o亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-10元亚杂芳基；其中L3A、L3B、L3C、L3D和L3E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L3是L3A-L3B-L3C-L3D-L3E；L3A、L3B、L3C、L3D或L3E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元亚杂芳基；其中L3A、L3B、L3C、L3D和L3E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L3是L3A-L3B-L3C-L3D-L3E；其中L3A是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)；L3B是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；L3C是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；L3D是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)；L3E是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；其中L3A、L3B、L3C、L3D和L3E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L3是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基。
在实施方案中，L3是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C20亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-20元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C20亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-20元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C20亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-20元亚杂芳基。
在实施方案中，L3是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C8亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-8元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C8亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C10亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-10元亚杂芳基。
在实施方案中，L3是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元亚杂芳基。
在实施方案中，L3是取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-10元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)。在实施方案中，L3是取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)。在实施方案中，L3是取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基).
在实施方案中，L3是
其中Z是0-20的整数、或
其中Z是0-20的整数。
在实施方案中，L2为-C(CH3)2CH2NHC(O)-。
在实施方案中，L2是正交可切割的接头或非共价接头。在实施方案中，L2包括正交可切割的接头或非共价接头。在实施方案中，L2是正交可切割的接头。在实施方案中，L2是非共价接头。
在实施方案中，-L2-R5为
z是0-10的整数。
在实施方案中，-L2-R5是
在实施方案中，-L2-R5是
在实施方案中，-L2-R5是
在实施方案中，-L2-R5是
在实施方案中，-L2-R5是
在实施方案中，-L2-R5是
在实施方案中，-L2-R5是
在实施方案中，-L2-R5是
其中z是0-10的整数。在实施方案中，-L2-R5是
在实施方案中，-L2-R5是
在实施方案中，-L2-R5是
在实施方案中，-L2-R5是
在实施方案中，-L2-R5是
在实施方案中，L3是
其中L1是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基、亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基、亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；L2为键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基、亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基、亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基、可切割的接头、正交可切割的接头、非共价接头或-L2A-L2B-L2C-L2D-，其中L2A是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基、亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基、亚杂炔基)；L2B是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；L2C是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；L2D是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基、亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基、亚杂炔基)；L2A、L2B、L2C、L2D中的至少一个不是键；R4A是氢、CH3、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-OCX1 3、-OCH2X1、-OCHX1 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基；R4B是氢、CH3、-CX2 3、-CHX2 2、-CH2X2、-OCX2 3、-OCH2X2、-OCHX2 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基；并且X1和X2独立地为卤素。
在实施方案中，L3是
其中L1是共价接头；L2是共价接头；R4A是氢、CH3、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-OCX1 3、-OCH2X1、-OCHX1 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基；R4B为氢、CH3、-CX2 3、-CHX2 2、-CH2X2、-OCX2 3、-OCH2X2、-OCHX2 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。符号X1和X2独立地为卤素。
在实施方案中，L4是正交可切割的接头。在实施方案中，L4是可切割的接头。在实施方案中，L4是化学可切割的接头。在实施方案中，L4是光可切割接头、酸可切割接头、碱可切割接头、氧化剂可切割接头、还原剂可切割接头或氟化物可切割接头。在实施方案中，L4是光可切割接头。在实施方案中，L4是酸可切割的接头。在实施方案中，L4是碱可切割的接头。在实施方案中，L4是氧化剂可切割的接头。在实施方案中，L4是还原剂可切割的接头。在实施方案中，L4是氟化物可切割的接头。在实施方案中，L4是可切割接头，其包括二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头或者硝基苄基接头。在实施方案中，L4是包括二烷基缩酮接头的可切割接头。在实施方案中，L4是偶氮接头。在实施方案中，L4是烯丙基接头。在实施方案中，L4是氰乙基接头。在实施方案中，L4是1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头或硝基苄基接头。
在实施方案中，L4包括正交可切割的接头。在实施方案中，L4包括可切割的接头。在实施方案中，L4包括化学可切割的接头。在实施方案中，L4包括光可切割接头、酸可切割接头、碱可切割接头、氧化剂可切割接头、还原剂可切割接头或氟化物可切割接头。在实施方案中，L4包括光可切割接头。在实施方案中，L4包括酸可切割的接头。在实施方案中，L4包括碱可切割的接头。在实施方案中，L4包括氧化剂可切割的接头。在实施方案中，L4包括还原剂可切割的接头。在实施方案中，L4包括氟化物可切割的接头。在实施方案中，L4包括二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头或硝基苄基接头。在实施方案中，L4包括二烷基缩酮接头。在实施方案中，L4包括偶氮接头。在实施方案中，L4包括烯丙基接头。在实施方案中，L4包括氰乙基接头。在实施方案中，L4包括1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头。在实施方案中，L4包括硝基苄基接头。
在实施方案中，L4是L4A-L4B-L4C-L4D-L4E。L4A、L4B、L4C、L4D或L4E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；其中L4A、L4B、L4C、L4D和L4E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4是L4A-L4B-L4C-L4D-L4E；并且L4A、L4B、L4C、L4D或L4E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C20亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-20元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C20亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-20元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C20亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-20元亚杂芳基；其中L4A、L4B、L4C、L4D和L4E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4是L4A-L4B-L4C-L4D-L4E；并且L4A、L4B、L4C、L4D或L4E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C10亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-10元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C8亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C10亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-10元亚杂芳基；其中L4A、L4B、L4C、L4D和L4E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4是L4A-L4B-L4C-L4D-L4E；并且L4A、L4B、L4C、L4D或L4E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元亚杂芳基；其中L4A、L4B、L4C、L4D和L4E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4是L4A-L4B-L4C-L4D-L4E；其中L4A是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)；L4B是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；L4C是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或者取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；L4D是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)；L4E是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；其中L4A、L4B、L4C、L4D和L4E中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基。
在实施方案中，L4是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C20亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-20元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C20亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-20元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C20亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-20元亚杂芳基。
在实施方案中，L4是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C8亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-8元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C8亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C10亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-10元亚杂芳基。
在实施方案中，L4是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元亚杂芳基。
在实施方案中，L4是取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-10元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)。在实施方案中，L4是取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)。在实施方案中，L4是取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)。
在实施方案中，L4z是正交可切割的接头。在实施方案中，L4z是可切割的接头。在实施方案中，L4z是化学可切割的接头。在实施方案中，L4z是光可切割接头、酸可切割接头、碱可切割接头、氧化剂可切割接头、还原剂可切割接头或氟化物可切割接头。在实施方案中，L4z是光可切割接头。在实施方案中，L4z是酸可切割的接头。在实施方案中，L4z是碱可切割的接头。在实施方案中，L4z是氧化剂可切割的接头。在实施方案中，L4z是还原剂可切割的接头。在实施方案中，L4z是可切割接头，其包括二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头或者硝基苄基接头。
在实施方案中，L4z包括正交可切割的接头。在实施方案中，L4z包括可切割的接头。在实施方案中，L4z包括化学可切割的接头。在实施方案中，L4z包括光可切割接头、酸可切割接头、碱可切割接头、氧化剂可切割接头、还原剂可切割接头或氟化物可切割接头。在实施方案中，L4z包括光可切割接头。在实施方案中，L4z包括酸可切割的接头。在实施方案中，L4z包括碱可切割的接头。在实施方案中，L4z包括氧化剂可切割的接头。在实施方案中，L4z包括还原剂可切割的接头。在实施方案中，L4z包括可切割接头，其包括二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4、4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头或硝基苄基接头。
在实施方案中，L4z是L4zA-L4zB-L4zC-L4zD-L4zE。L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；其中L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4z是L4zA-L4zB-L4zC-L4zD-L4zE；L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C20亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-20元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C20亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-20元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C20亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-20元亚杂芳基；其中L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4z是L4zA-L4zB-L4zC-L4zD-L4zE；和L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C10亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-10元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C8亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C10亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-10元亚杂芳基；其中L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4z是L4zA-L4zB-L4zC-L4zD-L4zE；L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元亚杂芳基；其中L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4z是L4zA-L4zB-L4zC-L4zD-L4zE；其中L4zA是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)；L4zB是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；L4zC是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；L4zD是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)；L4zE是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基；其中L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE中的至少一个不是键。
在实施方案中，L4z是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的亚杂芳基。
在实施方案中，L4z是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C20亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-20元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C20亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-20元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C20亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-20元亚杂芳基。
在实施方案中，L4z是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C8亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-8元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C8亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C6-C10亚芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-10元亚杂芳基。
在实施方案中，L4z是键、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6亚烷基(例如，亚烷基、亚烯基或亚炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6亚环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元亚杂芳基。
在实施方案中，L4z是取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-10元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)。在实施方案中，L4z是取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-8元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)。在实施方案中，L4z是取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元亚杂烷基(例如，亚杂烷基、亚杂烯基或亚杂炔基)。
在实施方案中，R3是-OH。在实施方案中，R3是单磷酸酯。在实施方案中，R3是二磷酸酯。在实施方案中，R3是三磷酸酯。在实施方案中，R3是多磷酸酯。在实施方案中，R3是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯或六磷酸酯。在实施方案中，R3是四磷酸酯、五磷酸酯或六磷酸酯。在实施方案中，R3是四磷酸。在实施方案中，R3是五磷酸。在实施方案中，R3是六磷酸酯。
在实施方案中，R3是核酸。在实施方案中，R3是核酸的残基。在实施方案中，R3是核酸的10-10,000个碱基。在实施方案中，R3是核酸的100-10,000个碱基。在实施方案中，R3是核酸的1000-10,000个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-8,000个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-9,000个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-7,000个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-6,000个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-5,000个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-4,000个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-3,000个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-2,000个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-1,000个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-900个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-800个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-700个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-600个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-500个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-400个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-300个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-200个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-90个碱基。在实施方案中，R3是核酸的10-75个碱基。
在实施方案中，R3是5-25个碱基的核酸。在实施方案中，R3是10-25个碱基的核酸。在实施方案中，R3是10-20个碱基的核酸。在实施方案中，R3是10-15个碱基的核酸。在实施方案中，R3是10-1000个碱基的核酸。在实施方案中，R3是100-600个碱基的核酸。在实施方案中，R3是10-500个碱基的核酸。在实施方案中，R3是10-250个碱基的核酸。在实施方案中，R3是10-100个碱基的核酸。在实施方案中，R3是10-50个碱基的核酸。
在实施方案中，R3是核酸的核碱基。在实施方案中，R3是核酸的核苷酸。在实施方案中，R3是核酸的核苷。在实施方案中，R3是长度为10-10,000个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为100-10,000个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为1000-10,000个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为10-8,000个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为10-9,000个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为10-7,000个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为10-6,000个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为10-5,000个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是核酸10-4000个碱基的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为10-3,000个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为10-2,000个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为10-1,000个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为10-900个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为10-800个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为10-700个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是核酸10-600碱基的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为10-500个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为10-400个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为10-300个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为10-200个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为10-90个核苷酸的核酸的碱基。在实施方案中，R3是长度为10-75个核苷酸的核酸的碱基。
在实施方案中，R4A是氢、CH3、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-OCX1 3、-OCH2X1、-OCHX1 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R4A是氢、CH3、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-OCX1 3、-OCH2X1、-OCHX1 2，-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基。在实施方案中，R4A是氢。
在实施方案中，R4A是氢、-CH3、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-CN、-Ph、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R4B是氢、CH3、-CX2 3、-CHX2 2、-CH2X2、-OCX2 3、-OCH2X2、-OCHX2 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R4B是氢、CH3、-CX2 3、-CHX2 2、-CH2X2、-OCX2 3、-OCH2X2、-OCHX2 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基。在实施方案中，R4B是氢。
在实施方案中，R4B是氢、-CH3、-CX2 3、-CHX2 2、-CH2X2、CN、-Ph、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R4A是氢、-CH3、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-CN、-Ph、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R4A是氢、-CH3、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-CN、-Ph、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基。
在实施方案中，R4B是氢、-CH3、-CX2 3、-CHX2 2、-CH2X2、CN、-Ph、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R4B是氢、-CH3、-CX2 3、-CHX2 2、-CH2X2、CN、-Ph、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基。
在实施方案中，R5是可检测标签。在实施方案中，R5是荧光染料。在实施方案中，R5是锚部分。在实施方案中，R5是点击化学反应的反应物部分。在实施方案中，R5是反式环辛烯部分或叠氮化物部分。在实施方案中，R5是亲和锚部分。在实施方案中，R5是生物素部分。在实施方案中，R5是用于生物偶联反应的反应物，该偶联反应在R5与第二生物偶联反应反应物之间形成共价键。
在实施方案中，R5是荧光染料。在实施方案中，R5是Alexa
350部分、Alexa
405部分、Alexa
430部分、Alexa
488部分、Alexa
532部分、Alexa
546部分、Alexa
555部分、Alexa
568部分、Alexa
594部分、Alexa
610部分、Alexa
633部分、Alexa
635部分、Alexa
647部分、Alexa
660部分、Alexa
680部分、Alexa
700部分、Alexa
750部分或Alexa
790部分。在实施方案中，可检测部分是Alexa
488部分、罗丹明6G(R6G)部分、ROX Reference Dye(ROX)部分或Cy5部分。
在实施方案中，R5是FAMTM部分、TETTM部分、JOETM部分、VICTM部分、HEXTM部分、NEDTM部分、
部分、ROXTM部分、TAMRATM部分、TETTM部分、Texas
488部分、Alexa
488部分、罗丹明6G(R6G)部分、ROX Reference Dye(ROX)部分、Sulfo-Cy5或Cy5部分。在实施方案中、R5是罗丹明6G(R6G)部分、ROX Reference Dye(ROX)部分、Sulfo-Cy5或Cy5部分。
在实施方案中，R5是FAMTM部分。在实施方案中，R5是TETTM部分。在实施方案中，R5是JOETM部分。在实施方案中，R5是
部分。在实施方案中，R5是HEXTM部分。在实施方案中，R5是NEDTM部分。在实施方案中，R5是
部分。在实施方案中，R5是ROXTM部分。在实施方案中，R5是TAMRATM部分。在实施方案中，R5是TETTM部分。在实施方案中，R5是Texas
部分。在实施方案中，R5是Alexa
488部分。在实施方案中，R5是罗丹明6G(R6G)部分。在实施方案中，R5是ROX Reference Dye(ROX)部分。在实施方案中，R5是Sulfo-Cy5。在实施方案中，R5是Cy5部分。
在实施方案中，R5是生物素部分。在实施方案中，R5是生物素部分，并且R12是链霉亲和素部分。
在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是
在实施方案中，R5是
在实施方案中，R6是氢。在实施方案中，R6是聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R6是包括叠氮基部分的聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R6是包括二硫基(dithiol)接头的聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R6是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是-CH2N3。在实施方案中，聚合酶相容的可切割部分是-NH2、-CN、-CH3、C2-C6烯丙基(例如-CH2-CH＝CH2)、甲氧基烷基(例如-CH2-O-CH3)或-CH2N3。在实施方案中，R6是-NH2。在实施方案中，R6是-CH2N3。在实施方案中，R6是
在实施方案中，R6是
在实施方案中，R6是
在实施方案中，R6是-CH2-O-CH3。在实施方案中，R6是-NH2、-CH2N3、
或-CH2-O-CH3。在实施方案中，L3包括二硫基接头且R6为-NH2、-CH2N3、
或-CH2-O-CH3。在实施方案中，L3为
且R6为-NH2、-CH2N3、
或-CH2-O-CH3。
在实施方案中，R6是聚合酶相容的可切割部分；聚合酶相容的可切割部分是
R8C氢、-CH3、-CX8C 3、-CHX8C 2、-CH2X8C、-OCX8C 3、-OCH2X8C、-OCHX8C 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基。符号X8C独立地为卤素。在实施方案中，R8C独立地为未取代的苯基。
在实施方案中，R6是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
R8A独立地为氢、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R8A独立地是氢、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基。R8B独立地为氢、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R8B独立地为氢、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基。R9独立地为氢、-CH3、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R9独立地为氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基。R10独立地为氢、-CH3、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R10独立地为氢、-CH3、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基。R11独立地为氢、-CH3、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R11独立地为氢、-CH3、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基。符号X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。
在实施方案中，R6是聚合酶相容的可切割部分；聚合酶相容的可切割部分是：
其中，R8A独立地是氢、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基；R8B独立地为氢、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基；R9独立地为氢、-CH3、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基；R10独立地为氢、-CH3、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基。R11独立地为氢、-CH3、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基。符号X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。
在实施方案中，R6是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
其中R8A和R8B独立地是氢或未取代的烷基；R9、R10和R11独立地为未取代的烷基或未取代的杂烷基。在实施方案中，R6是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
其中R8A和R8B独立地是氢或未取代的C1-C4烷基；并且R9、R10和R11独立地为未取代的C1-C6烷基或未取代的2-4元杂烷基。在实施方案中，R6是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
其中R8A和R8B独立地是氢；并且R9、R10和R11独立地为未取代的C1-C6烷基或未取代的2-4元杂烷基。在实施方案中，R6是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
其中R8A和R8B独立地为氢；R9、R10和R11独立地为未取代的甲基或未取代的甲氧基。在实施方案中，R6是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
在实施方案中，R7是氢。在实施方案中，R7是-OR7A；R7A是氢。在实施方案中，R7是-OR7A；并且R7A是聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R7是-OR7A；并且R7A是包括叠氮基部分的聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R7是-OR7A；并且R7A是包括二硫基接头的聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R7是-OR7A；R7A是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是-CH2N3。在实施方案中，R7是-OR7A；并且R7A是包括二硫基接头、烯丙基或2-硝基苄基的聚合酶相容的可切割部分。在实施方案中，R7是-NH2、-CHxN3、
或-CHx-O-CH3。
在实施方案中，R7是-OR7A；R7A是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
在实施方案中，R7A是
R8C是氢、CH3、-CX8C 3、-CHX8C 2、-CH2X8C、-OCX8C 3、-OCH2X8C、-OCHX8C 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代的或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。符号X8C独立地为卤素。在实施方案中，R8C独立地为未取代的苯基。
在实施方案中，R8A独立地是氢、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代的(例如，与取代基取代的，尺寸受限的取代基团，或取代的(例如被取代基，尺寸受限的取代基或低级取代基取代的)未取代的烷基，取代的(例如被取代基，尺寸受限的取代基，取代的(例如被取代基，尺寸限制的取代基或低级取代基取代的)或未取代的杂环烷基，取代的(例如被取代基，尺寸受限的取代基，或低取代基)或未取代的芳基，或取代的(例如，被取代基，尺寸受限的取代基或低取代基取代)或未取代的杂芳基基。在实施方案中，R8A独立地是氢、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基。在实施方案中，R8A独立地为氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN或-Ph。在实施方案中，R8B独立地为氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN或-Ph。
R8B独立地为氢、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R8B独立地为氢、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基。
在实施方案中，R8A独立地是氢、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN、-Ph、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R8B独立地为氢、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN、-Ph、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R8A和R8B独立地为氢或未取代的烷基。在实施方案中，R8A和R8B独立地为氢或未取代的C1-C4烷基。在实施方案中，R8A和R8B独立地是氢。
在实施方案中，R9独立地是氢、-CH3、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R9独立地为氢、-CH3、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基。
在实施方案中，R10独立地为氢、-CH3、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R10独立地为氢、-CH3、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基。
在实施方案中，R9独立地为氢、-CH3、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。R10独立地是氢、-CH3、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R11独立地为氢、-CH3、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R11独立地为氢、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基。符号X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。
在实施方案中，R11独立地为氢、CH3、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R9、R10和R11独立地为未取代的烷基或未取代的杂烷基。在实施方案中，R9、R10和R11独立地为未取代的C1-C6烷基或未取代的2-4元杂烷基。在实施方案中，R9、R10和R11独立地为未取代的C1-C6烷基或未取代的2-4元杂烷基。在实施方案中，R9、R10和R11独立地为未取代的甲基或未取代的甲氧基。在实施方案中，R8A、R8B、R9、R10和R11独立地为氢或未取代的甲基。在实施方案中，R8A和R8B是氢并且R9、R10和R11是未取代的甲基。
在实施方案中，R7是-OR7A；R7A是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
其中R8A是氢、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基；R8B独立地是氢、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基；R9独立地为氢、-CH3、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基；R10独立地为氢、-CH3、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基；R11独立地为氢、-CH3、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C1-C6烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的2-6元杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的C3-C6环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的3-6元杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的苯基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的5-6元杂芳基；X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。
在实施方案中，R7是-OR7A；R7A是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
其中R8、R8B、R9、R10和R11独立地是氢或未取代的甲基。在实施方案中，R7是-OR7A；R7A是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
在实施方案中，R7A是氢。在实施方案中，R7A是
在实施方案中，R7A是
在实施方案中，R7A是
在实施方案中，R8A独立地是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，R8A独立地是氢-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN、-Ph、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R8A独立地是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。
在实施方案中，R8B独立地为氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN、-Ph、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R8B独立地是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。
在实施方案中，-CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。
在实施方案中，R9独立地为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3，-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。在实施方案中，R9独立地为氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R10独立地为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。R10为氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R11独立地为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。在实施方案中，R11是氢、-CX73、-CHX7 2、-CH2X7、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的芳基或取代(例如被取代基、尺寸受限的取代基或低级取代基取代)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R13是荧光染料。在实施方案中，R13是Alexa
350部分、Alexa
405部分、Alexa
430部分、Alexa
488部分、Alexa
532部分、Alexa
546部分、Alexa
555部分、Alexa
568部分、Alexa
594部分、Alexa
610部分、Alexa
633部分、Alexa
635部分、Alexa
647部分、Alexa
660部分、Alexa
680部分、Alexa
700部分、Alexa
750部分或Alexa
790部分。在实施方案中，可检测部分为Alexa
488部分、罗丹明6G(R6G)部分、ROX Reference Dye(ROX)部分或Cy5部分.。
在实施方案中，R13是FAMTM部分、TETTM部分、JOETM部分、
部分、HEXTM部分、NEDTM部分、
部分、ROXTM部分、TAMRATM部分、TETTM部分、Texas
部分、Alexa
488部分、罗丹明6G(R6G)部分、ROX Reference Dye(ROX)部分、Sulfo-Cy5或Cy5部分。在实施方案中，R13是罗丹明6G(R6G)部分、ROX Reference Dye(ROX)部分、-Cy5、Sulfo-Cy5或Cy5部分。
在实施方案中，X1独立地为-F。在实施方案中，X1独立地为-Cl。在实施方案中，X1独立地为-Br。在实施方案中，X1独立地为-I。在实施方案中，X2独立地为-F。在实施方案中，X2独立地为-Cl。在实施方案中，X2独立地为-Br。在实施方案中，X2独立地为-I。在实施方案中，X3独立地为-F。在实施方案中，X3独立地为-Cl。在实施方案中，X3独立地为-Br。在实施方案中，X3独立地为-I。在实施方案中，X4独立地为-F。在实施方案中，X4独立地为-Cl。在实施方案中，X4独立地为-Br。在实施方案中，X4独立地为-I。在实施方案中，X5独立地为-F。在实施方案中，X5独立地为-Cl。在实施方案中，X5独立地为-Br。在实施方案中，X5独立地为-I。在实施方案中，X6独立地为-F。在实施方案中，X6独立地为-Cl。在实施方案中，X6独立地为-Br。在实施方案中，X6独立地为-I。在实施方案中，X7独立地为-F。在实施方案中，X7独立地为-Cl。在实施方案中，X7独立地为-Br。在实施方案中，X7独立地为-I。
在实施方案中，z为0-20的整数。在实施方案中，z为0-10的整数。在实施方案中，z为0-15的整数。在实施方案中，z为5-10的整数。在一些实施方案中，z是0。在实施方案中，z是1。在实施方案中，z是2。在实施方案中，z是3。在实施方案中，z是4。在实施方案中，z是5。在实施方案中，z是6。在实施方案中，z为7。在实施方案中，z为8。在实施方案中，z为9。在实施方案中，z为10。在实施方案中，z为11。在实施方案中，z为12。
在实施方案中，z为13。在一些实施方案中，z为14。在实施方案中，z为15。在实施方案中，z为16。在实施方案中，z为17。在实施方案中，z为18。在实施方案中，z为19。在实施方案中，z为20。
在实施方案中，m为1-4的整数。在实施方案中，m为1。在实施方案中，m为2。在实施方案中，m为3。在实施方案中，m为4。
在实施方案中，该化合物具有下式：
其中L2、R5、R7A、R8A、R8B、R9、R10和R11如本文所述，并且m是1-4的整数。
在实施方案中，该化合物具有下式：
其中L2、R5、R7A、R8A、R8B、R9、R10和R11如本文所述。
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
其中L2、R5、R8A、R8B、R9、R10和R11如本文所述，并且m是1-4的整数。在实施方案中，R8A是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，R8A是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3，-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，-CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。在实施方案中，R9是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3，-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。在实施方案中，R10是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。在实施方案中，R11是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、或-Ph。
在实施方案中，该化合物具有下式：
其中L2、R5、R8A、R8B、R9、R10和R11如本文所述。在实施方案中，R8A是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN、或-Ph。在实施方案中，R8A是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，-CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。在实施方案中，R9是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，R10是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、CN或-Ph。在实施方案中，R11是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。
在实施方案中，该化合物具有下式：
其中L2、R5、R7A、R8A、R8B、R9、R10和R11如本文所述。
在实施方案中，该化合物具有下式：
其中B、R7A、R8A、R8B、R9、R10和R11如本文所述，并且m是1-4的整数。在实施方案中，R8A是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8A是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3，、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN、或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3，、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN、或-Ph。在实施方案中，R8B是氢，-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3，、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，-CR9R10R11是未取代的甲基，未取代的乙基，未取代的丙基，未取代的异丙基，未取代的丁基或未取代的叔丁基。在实施方案中，R9是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3，-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，R10是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、CN或-Ph。在实施方案中，R11是氢-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、CN或-Ph。在实施方案中，R7A是氢。在实施方案中，R7A是
在实施方案中，R7A是
在实施方案中，R7A是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
其中R7A、R8A、R8B、R9、R10和R11如本文所述，m为1-4的整数。在实施方案中，R8A是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8A是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，-CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。在实施方案中，R9是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3，-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，R10是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，R11是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，该化合物具有下式：
其中R7A、R8A、R8B、R9、R10和R11如本文所述。在实施方案中，R8A是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3，-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8A是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3，-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3，-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2，-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，-CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。在实施方案中，R9是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3，-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。在实施方案中，R10是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，R11是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
其中R8A、R8B、R9、R10和R11如本文所述，m为1-4的整数。在实施方案中，R8A是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8A是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH-CN3或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3，-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，-CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。在实施方案中，R9是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3，-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。在实施方案中，R10是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，R11是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，B是
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中、该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
其中B、R5、R7A、R8A、R8B、R9、R10和R11如本文所述。在实施方案中，R8A是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8A是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，-CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。在实施方案中，R9是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，R10是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，R11是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，R5是
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
其中B、R5、R8A、R8B、R9、R10和R11如本文所述、m为1-4的整数。在实施方案中，R8A是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8A是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。在实施方案中，R9是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。在实施方案中，R10是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，R11是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，R5是
在实施方案中，该化合物具有下式：
其中B、R5、R8A、R8B、R9、R10和R11如本文所述。在实施方案中，R8A是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8A是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，R8B是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3-CN或-Ph。在实施方案中，-CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。在实施方案中，R9是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，R10是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，R11是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3、-CN或-Ph。在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，B是
在实施方案中，R5是
在实施方案中，该化合物具有下式：
其中B、R5、R9、R10和R11如本文所述。在实施方案中，R5是
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，可检测标签为Alexa
350部分、Alexa
405部分、Alexa
430部分、Alexa
488部分、Alexa
532部分、Alexa
546部分、Alexa
555部分、Alexa
568部分、Alexa
594部分、Alexa
610部分、Alexa
633部分、Alexa
635部分、Alexa
647部分、Alexa
660部分、Alexa
680部分、Alexa
700部分、Alexa
750部分或Alexa
790部分。在实施方案中、可检测部分为Alexa
488部分、罗丹明6G(R6G)部分、ROX Reference Dye(ROX)部分或Cy5部分。
在实施方案中，可检测部分为FAMTM部分、TETTM部分、JOETM部分、
部分、HEXTM部分、NEDTM部分、
部分、ROXTM部分、TAMRATM部分、TETTM部分、Texas
部分、Alexa
488部分、罗丹明6G(R6G)部分、ROX Reference Dye(ROX)部分、Sulfo-Cy5或Cy5部分。
在实施方案中，该化合物具有下式：
一方面，本发明提供了具有下式的化合物：R12z-L4z-R13。L4z为共价接头。R12z为互补性的锚部分反应性基团。R13为可检测标签。在实施方案中，该化合物具有下式：
其中R12z如本文所述，且z是0-20的整数。
在实施方案中，R12z为
链霉亲和素部分或
在实施方案中，R12z为
在实施方案中，R12z为
在实施方案中，R12z为
在实施方案中，R12z为
在实施方案中，R12z为
在实施方案中，R12z为
在实施方案中，R12z为
在实施方案中，R12z为链霉亲和素部分。在实施方案中，R12z为
在实施方案中，R13为荧光染料。在实施方案中，R13包括荧光共振能量转移受体荧光染料。在实施方案中，R13包括荧光共振能量转移供体荧光染料。在实施方案中，R13包括荧光共振能量转移受体荧光染料。在实施方案中，R13包括通过接头连接的荧光共振能量转移供体和受体荧光染料对。
在实施方案中，R13包括一个由接头连接并间隔0.1nm-10nm的荧光共振能量转移供体和受体荧光染料对。
在实施方案中，R13是
在实施方案中，该化合物具有下式：
一方面，本发明提供了下式的化合物R12z-R14。R12z为互补的锚部分反应性基团。R14是R15-取代的烷基、R15-取代的杂烷基、R15-取代的环烷基、R15-取代的杂环烷基、R15-取代的芳基或R15-取代的杂芳基。R15独立地是R16-取代的烷基、R16-取代的杂烷基、R16-取代的环烷基、R16-取代的杂环烷基、R16-取代的芳基、R16-取代的杂芳基或可检测的染料。R16独立地是R17-取代的烷基、R17-取代的杂烷基、R17-取代的环烷基、R17-取代的杂环烷基、R17-取代的芳基、R17-取代的杂芳基或可检测的染料。R17独立地是R18-取代的烷基、R18-取代的杂烷基、R18-取代的环烷基、R18-取代的杂环烷基、R18-取代的芳基、R18-取代的杂芳基或可检测的染料。R18为可检测的染料。R14被多个R15部分取代，R15被多个R16部分取代，R16是被多个R17部分取代。
在实施方案中，R12z是
链霉亲和素部分或
在实施方案中，R12z是
在实施方案中，R12z是
在实施方案中，R12z是
在实施方案中，R12z是
在实施方案中，R12z是
在实施方案中，R12z是
在实施方案中，R12z是
在实施方案中，R12z为链霉亲和素部分。在实施方案中，R12z是
在实施方案中，可检测染料为荧光染料。在实施方案中，可检测染料包括荧光共振能量转移供体荧光染料。在实施方案中，可检测染料包括荧光共振能量转移受体荧光染料。在实施方案中，可检测染料包括通过接头连接的荧光共振能量转移供体和受体荧光染料对。在实施方案中，可检测染料包括一个由接头连接并间隔0.1nm-10nm的荧光共振能量转移供体和受体荧光染料对。
在实施方案中，可检测染料是
在实施方案中，该化合物具有下式：
在实施方案中，该化合物具有下式：
其中R12z如本文所述。
III.使用方法
一方面，本发明提供了用于测序核酸的方法，所述方法包括：(i)在反应容器内使用核酸聚合酶将四种不同的标记的核苷酸类似物中的一种顺序地掺入引物中以形成延伸链，其中所述引物与核酸杂交，并且其中四种不同的标记的核苷酸类似物中的每一种包括特有的可检测标记；(ii)检测每个掺入的核苷酸类似物的特有的可检测标记，从而鉴定延伸链中每个掺入的核苷酸类似物，从而对核酸进行测序。四种不同的标记的核苷酸类似物中的每一种具有如本文(包括实施方案)所述的结构，其中在四种不同的标记的核苷酸类似物中的第一种中，B是胸苷或尿苷杂交碱基；在四种不同标记的核苷酸类似物中的第二种中，B是腺苷杂交碱基；在四种不同标记的核苷酸类似物中的第三种中，B是鸟苷杂交碱基；并且在四种不同标记的核苷酸类似物中的第四种中，B是胞嘧啶杂交碱基。
在实施方案中，所述方法进一步包括在每个掺入步骤后，向反应容器中添加四种不同的未标记的核苷酸类似物，其中四种不同的未标记的核苷酸类似物中的每一种具有如本文(包括实施方案)所述的结构，其中在四种不同的未标记核苷酸类似物中的第一种中，B是胸苷或尿苷杂交碱基；在四种不同的未标记核苷酸类似物中的第二种中，B是腺苷杂交碱基；在四种不同的未标记核苷酸类似物中的第三种中，B是鸟苷杂交碱基；并且在四种不同的未标记的核苷酸类似物中的第四种中，B是胞嘧啶杂交碱基。
在实施方案中，四种不同的标记的核苷酸类似物中的至少一种是包含可切割部分的正交可切割的、标记的核苷酸类似物，所述正交可切割的标记的核苷酸类似物具有如本文所述的结构，其中所述方法进一步包括在掺入步骤中，向反应容器添加能够切割可切割部分的切割剂。在实施方案中，切割剂是酸、碱、氧化剂、还原剂、Pd(0)、三(2-羧乙基)膦、稀亚硝酸、氟化物、三(3-羟丙基)膦)、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)或肼(N2H4)。在实施方案中、切割剂包括酸、碱、氧化剂、还原剂、Pd(0)、三(2-羧乙基)膦、稀亚硝酸、氟化物、三(3-羟丙基)膦)、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)或肼(N2H4)。
另一方面是用于对核酸进行测序的方法，所述方法包括：(i)在反应容器内使用核酸聚合酶将四种不同的核苷酸类似物中的一种顺序地掺入引物中以产生延伸链，其中引物与核酸杂交，其中四种不同核苷酸类似物中的三种是不同的标记核苷酸类似物，每种核苷酸类似物包括特有的可检测标记，并且四种不同核苷酸类似物中的一种是不同的未标记核苷酸类似物；(ii)检测每种掺入的核苷酸类似物的特有可检测标记的存在或不存在，从而鉴定延伸链中每个掺入的核苷酸类似物，由此对核酸进行测序；其中四种不同的标记的核苷酸类似物中的每一种具有如本文所述(包括实施方案)的结构，其中在四种不同的标记的核苷酸类似物中的第一种中，B是胸苷或尿苷杂交碱基；在四种不同标记的核苷酸类似物中的第二种中，B是腺苷杂交碱基；在四种不同标记的核苷酸类似物中的第三种中，B是鸟苷杂交碱基；并且在四种不同的标记的核苷酸类似物中的第四种中，B是胞嘧啶杂交碱基。
在实施方案中，所述方法进一步包括在每个掺入步骤后，向反应容器添加四种不同的未标记核苷酸类似物，其中四种不同的未标记核苷酸类似物中的每一种具有如本文(包括实施方案)所述结构，其中在四种不同的未标记的核苷酸类似物中的第一种中，B是胸苷或尿苷杂交碱基；在四种不同的未标记核苷酸类似物中的第二种中，B是腺苷杂交碱基；在四种不同的未标记核苷酸类似物中的第三种中，B是鸟苷杂交碱基；并且在四种不同的未标记的核苷酸类似物中的第四种中，B是胞嘧啶杂交碱基。
在实施方案中，三种不同的标记的核苷酸类似物中的至少一种是包括可切割部分的正交可切割的标记核苷酸类似物，具有如本文(包括实施方案)所述结构的正交可切割的标记核苷酸类似物，并且其中所述方法还包括在每个掺入步骤之后，向反应容器中添加能够切割可切割部分的切割剂。在实施方案中，切割剂是酸、碱、氧化剂、还原剂、Pd(0)、三(2-羧乙基)膦、稀亚硝酸、氟化物、三(3-羟丙基)膦)、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)或肼(N2H4)。在实施方案中，切割剂包括酸、碱、氧化剂、还原剂、Pd(0)、三(2-羧乙基)膦、稀亚硝酸、氟化物、三(3-羟丙基)膦)、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)或肼(N2H4)。
在一个方面，本发明提供了将核苷酸类似物掺入引物的方法，所述方法包括在反应容器内将聚合酶、与核酸模板杂交的引物和核苷酸类似物合并，使聚合酶将核苷酸类似物掺入引物从而形成延伸的引物，其中所述核苷酸类似物具有如本文(包括实施方案)所述的结构。
在一些实施方案中，L2是可切割的部分，并且R5是可检测的标签，所述方法还包括在掺入之后用切割剂切割可切割的部分。在实施方案中，切割剂是酸、碱、氧化剂、还原剂、Pd(0)、三(2-羧乙基)膦、稀亚硝酸、氟化物、三(3-羟丙基)膦)、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)或肼(N2H4)。在实施方案中，切割剂包括酸、碱、氧化剂、还原剂、Pd(0)、三(2-羧乙基)膦、稀亚硝酸、氟化物、三(3-羟丙基)膦)、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)或肼(N2H4)。
在实施方案中，R5是锚部分，所述方法进一步包括在掺入后，用可检测标签对核苷酸类似物进行标记。在实施方案中，R5是亲和锚部分。在实施方案中，所述标记包括向反应容器中加入具有式R12-L4-R13的化合物，其中R12是互补的亲和锚部分结合剂；R13是可检测标签；而L4是共价接头。
在实施方案中，R5是化学反应性锚部分。在实施方案中，R5是生物缀合物反应性基团。
在实施方案中，标记包括向反应容器中加入具有式R12z-L4z-R13的化合物，其中R12z是互补的锚部分反应性基团；R13是可检测标签；而L4z是共价接头。在实施方案中，R12z-L4z-R13具有如本文所述的结构。在实施方案中，L4z是可切割的接头。
在实施方案中，所述方法进一步包括在掺入后用切割剂切割可切割部分。在实施方案中，切割剂是酸、碱、氧化剂、还原剂、Pd(0)、三(2-羧乙基)膦、稀亚硝酸、氟化物、三(3-羟丙基)膦)、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)或肼(N2H4)。在实施方案中，切割剂包括酸、碱、氧化剂、还原剂、Pd(0)、三(2-羧乙基)膦、稀亚硝酸、氟化物、三(3-羟丙基)膦)、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)或肼(N2H4)。
在实施方案中，所述方法还包括在掺入后向反应容器中添加包含3′-聚合酶相容的可切割部分的、未标记的核苷酸类似物。
在实施例中，该方法形成合成测序方法的一部分。
在实施方案中，本文所述的荧光标记的化合物与未标记的化合物(例如核苷酸可逆终止物)的比例为约1∶9至约9∶1。(参见图27A-27B)
在一个实施方案中，对核酸进行测序的方法包括将DNA聚合酶和标记的核苷酸类似物加入带有引物的DNA模板以能够掺入互补的标记核苷酸类似物至生长的DNA链，并直接或通过间接标记鉴定标记的核苷酸，以便对核酸进行测序。
在一个实施方案中，测序核酸的方法包括：a)提供与引物杂交的核酸模板；b)用标记的核苷酸或核苷酸类似物延伸与所述核酸模板杂交的引物，其中所述标记的核苷酸或核苷酸类似物具有与碱基连接的标签并且在3′-羟基上具有聚合酶相容的可切割保护基团；以及c)鉴定标记的核苷酸，以便对核酸进行测序。
在一个实施方案中，一种同时测序多种不同核酸的方法，包括：a)通过掺入标记的核苷酸使多种双链DNA生长，所述双链DNA各自包含双链DNA链的一条链；以及b)鉴定每种标记的核苷酸，以便同时测序多种不同的核酸。
在另一个实施方案中，所述标记的核苷酸具有与碱基连接的标签和在3′-羟基上的聚合酶相容的可切割保护基团。
对于上述三个实施方案中的任何一个，其中：
1.聚合酶相容的可切割保护基团包含二硫基接头。
2.聚合酶相容的可切割保护基团包含叠氮基部分。
3.聚合酶相容的可切割保护基团包含-CH2SS-R、-CH2N3、烯丙基、2-硝基苄基、氰乙基或偶氮基。
4.聚合酶相容的可切割保护基团是具有以下结构的二硫基：
R8A为氢、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R8B为氢、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R9为氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
取R10为氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R11为氢、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；和
X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。
5.标签通过可切割的接头连接到碱基。
6.标记的核苷酸具有通过可切割接头连接至碱基的5位或7位的标签。
7.核苷酸类似物包含脱氮嘌呤碱基。
8.所述可切割接头由以下结构中的L3表示：
B是碱基；
其中
B是碱基；
L3是可切割的接头；
R3是-OH、单磷酸酯、三磷酸酯、多磷酸酯或核酸；
R5是可检测标签或锚部分；
R7是氢或-OR7A，其中R7A是氢；
R8A、R8B、R9、R10和R11如权利要求6中所述，
X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。
9.L3中的可切割部分包含二硫基、烯丙基、叠氮基、硝基苄基、氰基乙基、二甲基缩酮、Dde或偶氮基。
10.碱基上的标签和3′-OH上的保护基团被高效地化学切割。
11.碱基上的标签和3′-OH上的保护基团同时被切割。
12.碱基上的标签和3′-OH上的保护基团在单独的化学反应中被切割。
13.用还原剂处理基于二硫键的接头或基于二硫键的保护基，可以切割二硫键而不留下任何连接至添加至引物中的核苷酸的巯基残基。
14.还原剂是THP或TCEP。
15.聚合酶是9°N DNA聚合酶的变体或其他突变的家族B或家族A聚合酶或其突变体，并且反应缓冲液可含有Mn2+或可用于有效地将标记的核苷酸类似物掺入的其他二价阳离子。
本发明的一个实施方案包括用于测序核酸的4色方法，其包括：
a)提供
1)核酸
2)核酸聚合酶
3)能够与所述核酸杂交的引物，和
4)四种不同的核苷酸类似物，每种包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；(iii)与脱氧核糖或核糖的3′-氧结合的烷基二硫基甲基部分或其变体，包括但不限于本文所述的实施方案中的那些，以下称为SS-可切割的保护基团；和(iv)通过二硫基甲基接头或其变体结合至碱基的锚，包括但不限于本文所述实施方案中的那些，下文称为SS-可切割锚，并且其中每种核苷酸类似物包含特有的碱基和特有的锚(包括但不限于TCO、PBA、生物素和偶氮)；
b)用所述核酸聚合酶将所述核苷酸类似物中的一种掺入所述引物中以产生延伸链；
c)与用相应匹配的染料标记的结合分子(包括但不限于Rox标记的四嗪、Alexa-488标记的SHA、Cy5标记的链霉亲和素和R6G标记的二苯并环辛炔(DBCO))孵育以标记DNA产物，所述DNA产物携带在掺入的核苷酸的碱基上特有的锚；
d)检测每个掺入的核苷酸类似物的所述特有的可检测标签，从而鉴定所述延伸链中每个掺入的核苷酸类似物；
e)用TCEP或THP处理所述延伸的引物以去除SS保护基团并切割SS可切割的接头；以及
f)重复步骤a)至e)至多30次、至多100次或至多1000次以确定添加至延伸引物链的其他核苷酸类似物，
从而对核酸进行测序。
在一个实施方案中，在步骤a)中添加具有下列组成的四种不同的未标记的核苷酸类似物：(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；和(iii)3′-O-S-S可切割的保护基团，以下称为3′-SS-NRT。
在一个实施方案中，在步骤a)之后的追加步骤中将四种3′-SS-NRT与聚合酶一起加入。
单色、4种用相同颜色的标记的核苷酸(nucs)、逐步进行、无追加(图4A-4D)
实施方案A2.用于测序DNA的单色方法，包括：
a)提供
1)核酸
2)核酸聚合酶
3)能够与所述核酸杂交的引物，和
4)标记的核苷酸类似物，其包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；(iii)SS-可切割的保护基团；和(iv)通过SS-可切割的接头连接到碱基的可检测标签；
b)如果标记的核苷酸类似物已被掺入DNA引物中，则检测所述可检测标签，以鉴定所述延伸链中掺入的标记的核苷酸类似物；
c)使用除含有不同于a)中的碱基之外相同的标记核苷酸类似物重复步骤a)和b)；
d)使用除含有不同于a)和b)中的碱基之外相同的标记核苷酸类似物重复步骤a)和b)；
e)使用除含有不同于a)、b)和c)中的碱基之外相同的标记核苷酸类似物重复步骤a)和b)；
f)用TCEP或THP处理所述延伸的引物以去除SS保护基团并切割SS可切割的接头；以及
g)重复步骤a)至e)至多30次、至多100次或至多1000次以确定添加至延伸引物链的其他核苷酸类似物，从而鉴定所述延伸链中掺入的标记的核苷酸类似物；
从而对核酸进行测序。
单色、4种相同颜色标记的核苷酸(nucs)、逐步进行、在每次添加期间一起追加(co-chase)(图4A-4D)
在A2的一个实施方案中，实施方案JS4的方法，其中在步骤a)4)、b)4)、c)4)和d)4)添加具有与标记的核苷酸类似物相同碱基的3′-SS-NRT。
单色、4种相同颜色标记的核苷酸、逐步进行、每次添加后进行后追加(post-chase)(图4A-4D)
在A2的另一个实施方案中，实施方案JS4的方法，其中在步骤a)4)、b)4)、c)4)和d)4)之后立即在追加步骤中添加具有与标记的核苷酸类似物相同碱基的3′-SS-NRT。
2-色、2种标记的核苷酸、2种锚核苷酸、相同的两种标签、无追加(参见图14A-14B)
实施方案A3.用于测序核酸的2-色方法，其包括：
a)提供
1)核酸
2)核酸聚合酶
3)能够与所述核酸杂交的引物，
4)两种标记的核苷酸类似物，包括但不限于本文所述的实施方案中的那些，其包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；(iii)SS可切割的保护基团；和(iv)通过SS-可切割的接头结合到碱基的可检测标签，其中两个标记的核苷酸类似物具有特有的碱基和标签(例如，3′-O-SS-dATP-SS-Rox和3′-O-SS-dCTP-SS-dATP-SS-Alexa-488)，和
5)两种核苷酸类似物，包括但不限于本文所述的实施方案中的那些，其包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；(iii)SS可切割的保护基团；和(iv)通过SS可切割的接头结合至碱基的锚部分，其中两个标记的核苷酸具有与4)中的核苷酸不同的特有碱基和两个不同的锚(例如3′-O-SS-dUTP-SS-N3和3′-O-SS-dGTP-SS-TCO)；
b)如果标记的核苷酸类似物已经掺入DNA引物中，则检测所述可检测标签，从而鉴定所述延伸链中掺入的标记的核苷酸类似物，例如如果检测到Rox，则为A，如果检测到Alexa-488，则为C；
c)与用相应匹配染料标记的结合分子(包括但不限于本文描述的实施方案中的那些)(例如，Alexa-488标记的二苄基环辛炔和Rox标记的四嗪)孵育；
d)如果已将锚核苷酸类似物掺入DNA引物中，则检测所述可检测标签，以鉴定所述延伸链中掺入的锚核苷酸类似物，例如如果检测到Alexa-488，则为U，如果检测到Rox，则为G。
e)用TCEP或THP处理所述延伸的引物以去除SS保护基团并切割SS可切割的接头；以及
f)重复步骤a)至e)至多30次、至多100次或至多1000次以确定添加至延伸引物链的其他核苷酸类似物，
从而对核酸进行测序。
2-色、2种标记的核苷酸、2种锚核苷酸、相同的两种标签、共同追加(参见图14A-14B)
在A3的实施方案中，实施方案JS7的方法，其中在步骤a)中添加四种3′-SS-NRT。
2-色、2种标记的核苷酸、2种锚核苷酸、相同的两种标签、后追加(参见图14A-14B)
在A3的另一个实施方案中，实施方案JS4的方法，其中在步骤a)之后立即添加四种3′-SS-NRT。
单色、3种锚核苷酸、3种相同标签(3种正交可切割接头)、1种深色NRT(参见图17A-17B)
实施方案A4.用于测序核酸的单色方法，其包括：
a)提供
1)核酸
2)核酸聚合酶
3)能够与所述核酸杂交的引物，
4)三种锚核苷酸类似物，包括但不限于本文所述的实施方案中的那些，其包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；(iii)SS可切割的保护基团；和(iv)通过SS-可切割的接头结合到碱基的锚，其中三种标记的核苷酸类似物各自具有特有的碱基和标签(例如，3’-O-SS-dATP-SS-N3、3’-O-SS-dUTP-SS-TCO和3’-O-SS-dCTP-SS-生物素)，和
5)3′-SS-NRT，其具有与4)中不同的碱基(例如3′-SS-dGTP)；
b)与相应匹配染料标记的结合分子(包括但不限于本文描述的实施方案中的那些)(例如，DBCO-偶氮接头-ATTO647N、四嗪-Dde-ATTO647N和链霉亲和素-ATTO647N)孵育以标记在所掺入的核苷酸的碱基上携带特有锚的DNA产物；
c)如果锚核苷酸类似物已掺入到DNA引物中，则检测所述可检测标签，从而鉴定所述延伸链中掺入的锚核苷酸类似物(例如，如果检测到荧光，则掺入A、C或T；否则，掺入G)；
d)如果已经掺入了这种核苷酸，用连二亚硫酸钠处理所述延伸引物以切割偶氮连接；
e)检测所述可检测标签(例如，如果标签丢失，则表示掺入了A)；
f)如果已经掺入了这种核苷酸，用肼处理所述延伸的引物以切割Dde连接；
g)检测所述可检测标签(例如，如果标签现在丢失，则表示掺入了U)；
h)用TCEP或THP处理所述延伸的引物以切割S-S键，这将除去任何剩余染料并同时重新生成3′-OH；
i)检测所述可检测标签(例如，如果标签现在丢失，则表示掺入了C)；
j)可选地用三种尚未使用的3′-SS-dNTP进行追加；
k)重复步骤a)至j)至多30次、至多100次或至多1000次以确定添加至延伸引物链的其他核苷酸类似物；
从而对核酸进行测序。
单色、2种锚核苷酸、2种相同颜色的标签(可切割的)、1种相同颜色标记的核苷酸、1种深色NRT(参见图19A-19B)
实施方案A5.用于测序核酸的单色方法包括：
a)提供
1)核酸
2)核酸聚合酶
3)能够与所述核酸杂交的引物，
4)两种锚核苷酸类似物，包括但不限于本文所述的实施方案中的那些，其包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；(iii)SS可切割的保护基团；和(iv)通过SS-可切割的接头结合到碱基的锚，其中两种标记的核苷酸类似物具有特有的碱基和标签(例如，3’-O-SS-dUTP-SS-N3、3’-O-SS-dUTP-SS-生物素)；
5)一种标记的核苷酸类似物，包括但不限于本文所述实施方案中那些，其具有与4)中的核苷酸类似物不同的碱基(例如3′-O-SS-dATP-Rox)；
6)一种3′-SS-NRT，其具有与4)和5)中的碱基不同的碱基；
b)如果已将锚核苷酸类似物掺入DNA引物中，则检测所述可检测标签，以鉴定所述延伸链中掺入的锚核苷酸类似物(例如，如果检测到荧光则为A，否则为C、G或T)；
c)与两种相应匹配染料标记的结合分子(包括但不限于本文描述的实施方案中的那些)(例如Rox标记的DBCO-偶氮接头和Rox标记的链霉亲和素)一起孵育以标记在所掺入的核苷酸的碱基上携带特有锚的DNA产物；
d)如果已将锚核苷酸类似物掺入DNA引物中，则检测所述可检测标签，以鉴定所述延伸链中掺入的锚核苷酸类似物(例如，如果检测到荧光，则为A、C或T，否则为G)；
d)如果已经掺入了这种核苷酸，用连二亚硫酸钠处理所述延伸引物以切割偶氮连接；
e)检测所述可检测标签(例如，如果标签丢失，则表示掺入了T)；
f)用TCEP或THP处理所述延伸的引物以切割S-S键，着将除去任何剩余的染料并同时重新生成3′-OH；
g)检测所述可检测标签(例如，如果标签现在丢失，则表明掺入了C，因为如果是A，其在步骤b中已被确定)；
h)任选地，用使用过的4种3′-SS-dNTP进行追加；
i)重复步骤a)至h)至多30次、至多100次或至多1000次以确定添加到延伸引物链中的其他核苷酸类似物；
从而对核酸进行测序。
单色、3种锚核苷酸、3种相同染料标签(正交可切割接头)、1种标记的核苷酸(参见图21A-21F)
实施方案A6.用于测序核酸的单色方法包括：
a)提供
1)核酸
2)核酸聚合酶
3)能够与所述核酸杂交的引物，
4)三种锚核苷酸类似物，包括但不限于本文所述的实施方案中的那些，其包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；(iii)SS可切割的保护基团；和(iv)通过SS-可切割的接头结合到碱基的锚，其中两种标记的核苷酸类似物具有特有的碱基和锚(例如，3’-O-SS-dGTP-SS-N3、3’-O-SS-dCTP-生物素和3’-O-SS-dATP-TCO)和
5)一种标记的核苷酸类似物，包括但不限于本文所述实施方案中那些，其具有与4)中碱基不同碱基(例如3′-O-SS-dATP-SS-Rox)；
b)如果已将锚核苷酸类似物掺入DNA引物中，则检测所述可检测标签，以鉴定所述延伸链中掺入的锚核苷酸类似物(例如，如果检测到荧光，则为A，否则为C、G或T)；
c)与相应匹配染料标记的结合分子(包括但不限于本文所述的实施方案中的那些)(例如Rox-偶氮标记的DBCO，Rox标记的四嗪偶氮接头和Rox标记的链霉亲和素)孵育以标记在掺入的核苷酸碱基上携带特有锚的DNA产物；
d)如果已将锚核苷酸类似物掺入DNA引物，检测所述可检测标签，以鉴定所述延伸链中掺入的锚核苷酸类似物(例如，如果现在检测到荧光，则为C、G或T)；
d)如果已经掺入了这种核苷酸，用连二亚硫酸钠处理所述延伸引物以切割偶氮连接；
e)检测所述可检测标签(例如，如果标签丢失，则表示掺入了G)；
f)如果已经掺入了这种核苷酸，用肼处理所述延伸的引物以切割Dde连接；
g)检测所述可检测标签(例如，如果标签现在丢失，则表示掺入了U，否则为C)；
h)用TCEP或THP处理所述延伸的引物以切割S-S键，这将会除去任何剩余染料并同时重新生成3′-OH；
i)检测所述可检测标签(例如，如果标签现在丢失，确认掺入了C，因为如果是A，则在步骤b)中已经确定)；
j)可选地用四种3′-SS-dNTP进行追加；
k)重复步骤a)至h)至多30次、至多100次或至多1000次以确定添加至延伸引物链的其他核苷酸类似物；
从而对核酸进行测序。
单色，3种标记的核苷酸，2种相同颜色的标签(正交可切割接头)，1种深色NRT(参见图23A-23D)
实施方案A7.用于测序核酸的单色方法包括：
a)提供
1)核酸
2)核酸聚合酶
3)能够与所述核酸杂交的引物，
4)三种标记的核苷酸类似物，包括但不限于本文所述的实施方案中的那些，其包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；(iii)SS可切割的保护基团；和(iv)通过化学或光可切割的接头结合到碱基的标签，其中三种标记的核苷酸类似物各自具有特有的碱基、可切割接头和标签(例如，3’-O-SS-dATP-SS-Rox、3’-O-SS-dUTP-烯丙基-Rox和3’-O-SS-dCTP-硝基苄基-Rox)和
5)具有与4)中碱基不同的碱基的3′-SS-NRT(例如3′-O-叔丁基-SS-dGTP)；
b)如果标记的核苷酸类似物已被掺入到DNA引物中，则检测所述可检测标签，以鉴定所述延伸链中掺入的锚核苷酸类似物(例如，如果检测到荧光，则为A、U或C，否则为G)；
c)如果已经掺入了这种核苷酸，则在约350nm处进行光照射以切割含有硝基苄基的接头；
d)如果标记的核苷酸类似物已被掺入DNA引物中，则检测所述可检测标签，以鉴定所述延伸链中掺入的锚核苷酸类似物(例如，如果标签丢失，则掺入了C)；
e)如果已经掺入了这种核苷酸，则用Pd(0)切割以切割含烯丙基的接头；
f)如果标记的核苷酸类似物已经掺入DNA引物中，则检测所述可检测标签，以鉴定所述延伸链中掺入的锚核苷酸类似物(例如，如果标签丢失，则掺入了U)；
g)用TCEP或THP处理所述延伸的引物以切割S-S键，这将会除去任何剩余的染料并同时重新生成3′-OH；
h)检测所述可检测标签(例如，如果标签现在丢失，则确认掺入了A)；
j)可选地用三种尚未使用的3′-SS-dNTP进行追加；
k)重复步骤a)至h)至多30次、至多100次或至多1000次以确定添加至延伸引物链的其他核苷酸类似物；
从而对核酸进行测序。
4色、4种标记的核苷酸、无追加(参见图26A-26F)
实施方案A8.用于测序核酸的4色方法包括：
a)提供
1)核酸
2)核酸聚合酶
3)能够与所述核酸杂交的引物，
4)四种不同的核苷酸类似物，各自包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；(iii)与脱氧核糖或核糖的3′-氧结合的烷基二硫甲基部分或其变体，包括但不限于本文所述的实施方案中的那些，在下文中称为SS-可切割保护基团；以及(iv)经由二硫甲基接头或其变体结合至碱基的标签，包括但不限于本文所述的实施方案中的那些，在下文中称为SS-可切割锚，其中每种核苷酸类似物包括特有的碱基和特有的标签(包括但不限于Rox、Alexa-488、Cy5和R6G)(例如，3′-O-SS-dATP-SS-Rox、3′-O-SS-dCTP-SS-Alexa-488，3′-O-SS-dGTP-SS-Cy5和3′-O-SS-dUTP-R6G)；
b)用所述核酸聚合酶将所述核苷酸类似物中的一种掺入至所述引物中以产生延伸链；
c)检测每个掺入的核苷酸类似物的所述特有的可检测标签，从而鉴定所述延伸链中每个掺入的核苷酸类似物；
d)用TCEP或THP处理所述延伸的引物以去除SS保护基团并切割SS可切割的接头；以及
e)重复步骤a)至d)至多30次、至多100次或至多1000次以确定添加至延伸引物链的其他核苷酸类似物，
从而对核酸进行测序。
4色、4种标记的核苷酸、混合标签和非标签(参见图27A-27B)
在实施方案A8中，实施方案JS14的方法，其中在步骤a)中加入全部四种3′-SS-NRT。
4色、4种标记的核苷酸、追加(参见图25A-25F)
在A8的另一个实施方案中，实施方案JS14的方法，其中在紧跟步骤a)的追加步骤中添加所有四种3′-SS-NRT。一般测序加步移(walking)(参见图28)
实施方案A9.用于在核酸内进行测序和步移的4色方法，包括：
a)使用权利要求S1-S14中任一种方法或本领域已知的其它测序方法获得至多100个核苷酸的序列或至多200个核苷酸的序列；
b)使DNA变性以去除延伸的引物并对原始引物进行重新退火；
c)加入含有三种天然核苷酸(例如dATP、dCTP和dTTP)和一种3′-O-SS-dNTP(例如3′-O-SS-dGTP)的混合物(“步移步骤”)以在一步中将引物延伸至模板中的下一个C；
d)加入TCEP或THP以恢复最后掺入的核苷酸上的3′-OH基团；
e)重复步骤c)和d)足够的时间以达到大约原始测序运行结束的位置；
f)重复步骤a)至e)以对另一段核酸测序并步移至第二测序运行结束的位置；
g)根据需要重复步骤j)以获得长的组装读段(是任何单个读数的长度的3或4倍)，由此获得长段的核酸合成。
4色测序加步移(参见图28A-28B)
实施方案A10.用于在核酸内进行测序和步移的4色方法，包括：
a)提供
1)核酸
2)核酸聚合酶
3)能够与所述核酸杂交的引物，
4)四种不同的核苷酸类似物，各自包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；(iii)与脱氧核糖或核糖的3′-氧结合的烷基二硫甲基部分或其变体，包括但不限于本文所述的实施方案中的那些，在下文中称为SS-可切割的保护基团；以及(iv)经由二硫甲基接头或其变体结合至碱基的标签，包括但不限于本文所述的实施方案中的那些，在下文中称为SS-可切割锚，其中每种核苷酸类似物包括特有的碱基和特有的标签(包括但不限于Rox、Alexa-488、Cy5和R6G)(例如，3′-O-SS-dATP-SS-Rox、3′-O-SS-dCTP-SS-Alexa-488、3′-O-SS-dGTP-SS-Cy5和3′-O-SS-dUTP-R6G)；
b)用所述核酸聚合酶将所述核苷酸类似物中的一种掺入至所述引物中以产生延伸链；
c)检测每个掺入的核苷酸类似物的所述特有的可检测标签，从而鉴定所述延伸链中每个掺入的核苷酸类似物；
d)用TCEP或THP处理所述延伸的引物以去除SS保护基团并切割SS可切割的接头；
e)重复步骤a)至d)至多100次以确定添加至延伸引物链的其他核苷酸类似物；
f)使DNA变性以去除延伸的引物并对原始引物进行重新退火；
g)加入含有三种天然核苷酸(例如dATP、dCTP和dTTP)和一种3′-O-SS-dNTP(例如3′-O-SS-dGTP)(“步移步骤”)的混合物以在一步中将引物延伸至模板中的下一个C；
h)加入TCEP或THP以恢复最后掺入的核苷酸上的3′-OH基团；
i)重复步骤g)和h)足够的时间以达到大约原始测序运行结束的位置；
j)重复步骤a)至i)以对另一段核酸测序并步移至第二测序运行结束的位置；
k)根据需要重复步骤j)以获得长组装读段(是任何单个读段长度的3或4倍)，
从而获得长段的核酸合成。
应当理解，本文描述的示例和实施方案仅用于说明的目的，并且启发本领域技术人员对其进行各种修改或改变，该修改和改变将被包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用全文并入本文用于所有目的。
实施方案
当本文示出和描述了本发明的各种实施方案时，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到很多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文描述的本发明实施方案的各种替代方案。
如本文所用，除非另有说明，下列术语中的每一个应具有如下所述的定义：
A-腺嘌呤；
C-胞嘧啶；
DNA-脱氧核糖核酸；
G-鸟嘌呤；
RNA-核糖核酸；
T-胸腺嘧啶；和
U-尿嘧啶。
冠词“一个”、“一种”和“所述”是非限制性的。例如，“所述方法”包括对该短语含义的最宽泛的定义，其可以为多于一种的方法。
“核酸”意指任何核酸分子及其衍生物，包括但不限于DNA、RNA及其杂交体。形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U，及其衍生物。这些碱基的衍生物在本领域中是众所周知的，并且在下述文献中有例示：PCR Systems，Reagents and Consumables(PerkinElmer Catalogue 1996-1997，Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，New Jersey，USA)。
如本文所用，“核苷酸类似物”应意指A、G、C、T或U的类似物(即，包含碱基A、G、C、T或U的核苷酸的类似物)，其包含磷酸基团，DNA聚合酶或RNA聚合酶(无论哪一个都适用)识别磷酸基团，并且磷酸基团掺入DNA或RNA链(以适当的为准)。核苷酸类似物的实例包括但不限于7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、本文中显示的脱氧核苷酸类似物(其中标签通过可切割接头连接至胞嘧啶或胸腺嘧啶的5-位或脱氮腺嘌呤或脱氮鸟嘌呤的7-位)以及其中使用小的化学部分加帽脱氧核糖的3′-位上的-OH基团的类似物。美国第6,664,079号专利中也描述了基于核苷酸类似物和DNA聚合酶的DNA测序。
本文特别设想了关于核酸测序的第6,664,079号美国专利的所有实施方案(其内容通过引用并入本文)。
“烷基二硫基甲基”是指包含二硫基的化合物或其部分，其中一个硫直接连接至甲基，另一个硫直接连接至烷基。一个实例是结构
其中R是烷基，波浪线表示与化合物另一部分的连接点。在一些情况下，烷基二硫基甲基是甲基二硫基甲基、乙基二硫基甲基、丙基二硫基甲基、异丙基二硫基甲基、丁基二硫基甲基、叔丁基二硫基甲基或苯基二硫基甲基。
实施方案P1.核苷酸类似物，其包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；(iii)与脱氧核糖或核糖的3′-氧结合的烷基二硫基甲基部分；和(iv)通过二硫基甲基接头与碱基结合的可检测标签。
实施方案P2.实施方案P1的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物包含脱氧核糖。
实施方案P3.实施方案P1的核苷酸类似物，其中核苷酸类似物包含核糖。
实施方案P4.实施方案P1-3之一的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物是核苷三磷酸、核苷四磷酸、核苷五磷酸或核苷六磷酸。
实施方案P5.实施方案P1-4之一的核苷酸类似物，其中所述碱基选自腺嘌呤或腺嘌呤类似物、鸟嘌呤或鸟嘌呤类似物、胞嘧啶或胞嘧啶类似物、胸腺嘧啶或胸腺嘧啶类似物和尿嘧啶或尿嘧啶类似物。
实施方案P6.实施方案P1-5之一的核苷酸类似物，其中与3′-氧结合的烷基二硫基甲基部分选自甲基二硫基甲基、乙基二硫基甲基、丙基二硫基甲基、异丙基二硫基甲基、丁基二硫基甲基、叔丁基二硫基甲基和苯基二硫基甲基。
实施方案P7.实施方案P1-6之一的核苷酸类似物，其中所述烷基二硫基甲基部分具有结构
其中R为烷基二硫基甲基部分的烷基部分，并且波浪线代表与3′-氧连接的点。
实施方案P8.实施方案P1-7之一的核苷酸类似物，其中如果碱基为T、U或C或T、U或C的类似物，则通过二硫基甲基接头与碱基结合的可检测标签结合至碱基的5-位，如果碱基是A或G或A或G的类似物，则与碱基的7位结合。
实施方案P9.实施方案P1-8之一的核苷酸类似物，其中所述碱基是脱氮类似物。
实施方案P10.实施方案P9的核苷酸类似物，其中脱氮类似物是7-脱氮嘌呤。
实施方案P11.实施方案P1-10之一的核苷酸类似物，其中所述烷基二硫基甲基部分和二硫基甲基接头均可用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP)切割。
实施方案P12.实施方案P1-11之一的核苷酸类似物，其中二硫基甲基接头具有如下结构：
其中α表示通过其与碱基形成共价连接的一个或多个原子，并且β表示通过其建立与可检测标签的共价连接的一个或多个原子。
实施方案P13.实施方案P12的核苷酸类似物，其中二硫基甲基接头具有如下结构：
其中α′表示通过其与碱基形成共价连接的一个或多个原子，并且β表示通过其建立与可检测标签的共价连接的一个或多个原子。
实施方案P14.实施方案P13的核苷酸类似物，其中二硫基甲基接头包含在如下的结构内：
其中B表示与碱基的连接点；其中L表示与可检测标签的连接点；并且其中n是1-11。
实施方案P15.实施方案P1-14之一的核苷酸类似物，其中可检测标签选自染料、荧光团、组合荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签和电泳(electrophore)。
实施方案P16.实施方案P15的核苷酸类似物，其中可检测标签是荧光团。
实施方案P17.实施方案P16的核苷酸类似物，其中所述荧光团选自但不限于BodipyFL、R6G、ROX和Cy5。
实施方案P18.实施方案P1的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物选自由3′-O-叔丁基-二硫基甲基-dCTP-S-S-BodipyFL、3′-O-叔丁基-二硫基甲基-dUTP-S-S-R6G、3′-O-叔丁基-二硫基甲基-dATP-S-S-ROX和3′-O-叔丁基-二硫基甲基-dGTP-S-S-Cy5，其中S-S代表二硫基接头。
实施方案P19.实施方案P1的核苷酸类似物，其中核苷酸类似物的结构选自
其中R是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基或苯基；n是2-11，m是1-4。
实施方案P20.包含至少两种不同类型的实施方案P1-18之一所述的核苷酸类似物的组合物，其中每种类型的核苷酸类似物包含与每种其他类型的核苷酸类似物不同的碱基和不同的可检测标签。
实施方案P21.一种组合物，其包含第一类的权利要求1-18之一所述的核苷酸类似物和第二类的实施方案P1-18之一所述的核苷酸类似物，其中所述第二类核苷酸类似物包含与第一类核苷酸类似物不同的碱基和不同的可检测标签。
实施方案P22.实施方案P21的组合物，其进一步包含第三类的权利要求1-18之一所述的核苷酸类似物，其中所述第三类核苷酸类似物包含与其他两种核苷酸类似物中的每一种不同的碱基和不同的可检测标签。
实施方案P23.实施方案P22的组合物，其进一步包含第四类的权利要求1-18之一所述的核苷酸类似物，其中所述第四类核苷酸类似物包含与其他三种类型的核苷酸类似物中的每一种不同的碱基和不同的可检测标签。
实施方案P24.实施方案P23的组合物，其进一步包含第五类的权利要求1-18之一所述的核苷酸类似物，其中所述第五种核苷酸类似物包含与其他四种类型的核苷酸类似物中的每一种不同的碱基和不同的可检测标签。
实施方案P25.核苷酸类似物，其包含(i)碱基，其选自腺嘌呤或腺嘌呤类似物、鸟嘌呤或鸟嘌呤类似物、胞嘧啶或胞嘧啶类似物、胸腺嘧啶或胸腺嘧啶和尿嘧啶或尿嘧啶类似物；(ii)脱氧核糖或核糖；(iii)与脱氧核糖或核糖的3′-氧结合的烷基二硫基甲基部分；和(iv)3-氨基丙炔基，如果碱基为T、U或C或T、U或C的类似物，则3-氨基丙炔基与碱基的5位结合，如果碱基是A或G或A或G的类似物，则与碱基的7-位结合。
实施方案P26.一种测序核酸的方法，其包括：
a)提供
1.核酸；
2.核酸聚合酶；
3.能够与所述核酸杂交的引物；和
4.四种不同的标记核苷酸类似物，每种包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；(iii)与脱氧核糖或核糖的3′-氧结合的烷基二硫基甲基部分；和(iv)通过二硫基甲基接头与碱基结合的可检测标签，其中每种核苷酸类似物包含特有的碱基和特有的可检测标签；
b)用所述核酸聚合酶将一种或多种核苷酸类似物掺入所述引物中以产生延伸链；
c)检测每个掺入的核苷酸类似物的所述特有的可检测标签，从而鉴定所述延伸链中每个掺入的核苷酸类似物，
从而对核酸进行测序。
实施方案P27.一种测序核酸的方法，其包括：
a)提供
a)核酸；
b)核酸聚合酶；
c)能够与所述核酸杂交的引物；
d)三种不同类型的标记核苷酸类似物，每种包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；(iii)与脱氧核糖或核糖的3′-氧结合的烷基二硫基甲基部分；和(iv)通过二硫基甲基接头与碱基结合的可检测标签；其中每个核苷酸类似物包含特有的碱基和特有的可检测标签；和
e)未标记的核苷酸类似物，其包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；和(iii)与脱氧核糖或核糖的3′-氧结合的烷基二硫基甲基部分，其中所述碱基不同于标记核苷酸类似物的碱基；
b)用所述核酸聚合酶将一种或多种核苷酸类似物掺入所述引物中以产生延伸链；
c)检测每种掺入的核苷酸类似物特有的可检测标签(如果存在的话)，从而鉴定所述延伸链中每种掺入的核苷酸类似物，
从而对核酸进行测序。
实施方案P28.实施方案P26-27之一的方法，所述方法还包括通过切割S-S键去除与脱氧核糖或核糖的3′-氧结合的烷基二硫基甲基部分，从允许将另一种类似物掺入每种所述延伸链中。
实施方案P29.实施方案P26-28之一所述的方法，所述方法还包括通过切割所述二硫键从每个掺入的核苷酸类似物中去除特有的可检测标签(如果存在的话)。
实施方案P30.实施方案P28-29之一的方法，其中烷基二硫基甲基部分和二硫基甲基接头中的至少一个(如果存在)中的二硫键被三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP)切割。
实施方案P31.实施方案P26-30之一的方法，其中每种核苷类似物是核苷三磷酸、核苷四磷酸、核苷五磷酸或核苷六磷酸。
实施方案P32.实施方案P26-31之一的方法，其中每种碱基选自腺嘌呤或腺嘌呤类似物、鸟嘌呤或鸟嘌呤类似物、胞嘧啶或胞嘧啶类似物、胸腺嘧啶或胸腺嘧啶类似物和尿嘧啶或尿嘧啶类似物。
实施方案P33.实施方案P26-32之一的方法，其中所述核苷酸类似物包含脱氧核糖。
实施方案P34.实施方案P33的方法，其中所述聚合酶是DNA聚合酶并且所述核酸是DNA。
实施方案P35.实施方案P33的方法，其中所述聚合酶是逆转录酶并且所述核酸是RNA。
实施方案P36.实施方案P26-32之一的方法，其中所述核苷酸类似物包含核糖。
实施方案P37.实施方案P36的方法，其中所述聚合酶是基于DNA的RNA聚合酶并且所述核酸是DNA。
实施方案P38.实施方案P36的方法，其中所述聚合酶是基于RNA的RNA聚合酶并且所述核酸是RNA。
实施方案P39.实施方案P26-38之一的方法，其中与3′-氧结合的每种烷基二硫基甲基部分独立地选自甲基二硫基甲基、乙基二硫基甲基、丙基二硫基甲基、异丙基二硫基甲基、丁基二硫基甲基、叔丁基二硫基甲基和苯基二硫基甲基。
实施方案P40.实施方案P25-39之一的方法，其中每个烷基二硫基甲基部分具有结构
其中R是烷基二硫基甲基部分的烷基部分，并且波浪线表示与3′-氧的连接点。
实施方案P41.实施方案P26-40之一的方法，其中如果碱基为T、U或C或T、U或C的类似物，则经由二硫基甲基接头结合至碱基的每个可检测标签结合至碱基的5-位，如果碱基是A或G或A或G的类似物，则与碱基的7位相连。
实施方案P42.实施方案P26-41之一的方法，其中至少一种核苷酸类似物的碱基是脱氮类似物。
实施方案P43.实施方案P42的方法，其中所述脱氮类似物是7-脱氮嘌呤。
实施方案P44.实施方案P25-43之一的方法，其中每个二硫基甲基接头具有如下结构：
其中α表示通过其与碱基形成共价连接的一个或多个原子，并且β表示通过其建立与可检测标签的共价连接的一个或多个原子。
实施方案P45.实施方案P44的方法，其中每个二硫基甲基接头具有如下结构：
其中α′代表一个或多个原子，通过该原子与碱基建立共价连接，并且β′代表通过其建立与可检测标签的共价连接的一个或多个原子。
实施方案P46.实施方案P45的方法，其中每个二硫基甲基接头包括在如下的结构内：
其中B代表与碱基的连接点；其中L表示与可检测标签的连接点；并且其中n是1-11。
实施方案P47.实施方案P26-46之一的方法，其中每个可检测标签选自染料、荧光团、组合荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签和电泳。
实施方案P48.实施方案P47的方法，其中每个可检测标签是荧光团。
实施方案P49.实施方案P48的方法，其中荧光团选自BodipyFL、R6G、ROX和Cy5。
实施方案P50.实施方案P26-27之一的方法，其中每种标记的核苷酸类似物选自3′-O-叔丁基-二硫基甲基-dCTP-S-S-BodipyFL、3′-O-叔丁基-二硫基甲基-dUTP-S-S-R6G、3′-O-叔丁基-二硫基甲基-dATP-S-S-ROX和3′-O-叔丁基-二硫基甲基-dGTP-S-S-Cy5，其中S-S代表二硫基接头。
实施方案P51.实施方案P26-27之一的方法，其中每种标记的核苷酸类似物的结构选自：
其中R是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基或苯基；n是1-11，并且m是1-4。
实施方案P52.实施方案P26-51之一的方法，其中所述核酸固定在固体基质上。
实施方案P53.实施方案P52的方法，其中通过叠氮基和炔官能团之间的1，3-偶极环加成反应或生物素-链霉亲和素相互作用将核酸固定在固体基质上。
实施方案P54.根据实施方案P52-53之一所述的方法，其中所述固体基质为芯片、珠、孔、毛细管或载玻片的形式。
实施方案P55.实施方案P52-54之一的方法，其中所述固体基质是金、石英、二氧化硅或塑料。
实施方案P56.根据实施例P52-55之一所述的方法，其中所述固体基质是多孔的。
实施方案P57.实施方案P26-56之一的方法，同时应用于多种不同的核酸。
实施方案P58.一种产生3′-O-乙基二硫甲基核苷的方法，其包括：
a)在允许产生3′-O-甲硫基甲基核苷的条件下提供
a)核苷；
b)乙酸；
c)乙酸酐；和
d)DMSO；
b)在允许产生3′-O-氯甲基核苷的条件下使部分a)中产生的3′-O-甲硫基甲基核苷与三甲胺、分子筛和磺酰氯接触；
c)在允许产生3′-O-乙基二硫甲基核苷的条件下，使部分b)中产生的3′-O-氯甲基核苷与对甲苯硫代磺酸钾和乙硫醇接触。
实施方案P59.
产生n-(3-氨基丙炔基)-3′-O-叔丁基二硫基甲基-dNTP的方法，其中如果碱基是C、T或U，则n是5，如果碱基是A或G，则n是7，这里使用实例合成5-(3-氨基丙炔基)-3′-O-叔丁基二硫基甲基-dCTP，所述方法包括：
a)在允许形成N4-DMF-5-碘-2′-脱氧核苷(C)的条件下，提供
a)5-碘-2′-脱氧核苷(C)；和N，N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛；
b)在允许形成N4-DMF-5-碘-5′-O-三苯甲基-2′-脱氧核苷(C)的条件下使步骤a)中产生的N4-DMF-5-碘-2′-脱氧核苷与三苯甲基-Cl接触；
c)在允许形成N4-DMF-5-[3-(三氟乙酰氨基)丙炔基]-5′-O-三苯甲基-2′-脱氧核苷(C)的条件下，将步骤b)中制得的N4-DMF-5-碘-5′-O-三苯甲基-2′-脱氧核苷(C)与三乙胺和N-炔丙基三氟乙酰胺；
d)在允许形成N4-DMF-5-[3-(三氟乙酰氨基)丙炔基]-5′-O-三苯甲基-3’-O-甲基硫甲基-2′-脱氧核苷(C)的条件下，使步骤c)中产生的N4-DMF-5-碘-5′-O-三苯甲基-2′-脱氧核苷(C)与DMSO、乙酸和乙酸酐接触；
e)在允许形成N4-DMF-5-[3-(三氟乙酰氨基)丙炔基]-5′-O-三苯甲基-3′-O-(叔丁基二硫甲基)-2′-脱氧核苷(C)的条件下，使步骤d)中制得的N4-DMF-5-[3-(三氟乙酰氨基)丙炔基]-5′-O-三苯甲基-3′-O-甲基硫甲基-2′-脱氧核苷(C)与三乙胺、分子筛、磺酰氯、对甲苯硫代磺酸钾和叔丁基硫醇接触；
f)在允许形成N4-DMF-5-[3-(三氟乙酰氨基)丙炔基]-3′-O-(叔丁基二硫甲基)-2′-脱氧核苷(C)的条件下，将步骤e)中产生的N4-DMF-5-[3-(三氟乙酰氨基)丙炔基]-5′-O-三苯甲基-3′-O-(叔丁基二硫甲基)-2′-脱氧核苷(C)与三氯乙酸反应；
g)在允许形成5-[3-氨基丙炔基]-3′-O-(叔丁基二硫基甲基)-dCTP的条件下，使步骤f)中产生的N4-DMF-5-[3-(三氟乙酰氨基)丙炔基]-3′-O-(叔丁基二硫甲基)-2′-脱氧核苷(C)与焦磷酸四丁基铵、三丁胺、I2、吡啶和NH4OH接触。
实施方案P60.生产3′-O-烷基二硫基甲基-dNTP-SS-染料的方法，其中SS是烷基二硫基接头，其包括：
在允许形成3′-O-烷基二硫基甲基-dNTP-SS-染料的条件下提供
a)包含该结构的化合物
其中α代表通过其与羧酸基团建立共价连接的一种或多种原子，并且β代表通过其与染料建立共价连接的一种或多种原子，和
b)3′-O-烷基二硫基甲基-dNTP-n-(3-氨基丙炔基)，其中如果碱基是C、T或U，则n是5，如果碱是A或G，则n是7。
实施方案P61.将多种不同的核酸固定在固体基质上并与引物杂交，所述引物的一部分包含掺入的核苷酸类似物，所述核苷酸类似物包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；(iii)与脱氧核糖或核糖的3′-氧结合的烷基二硫基甲基部分；和(iv)通过二硫基甲基接头与碱基结合的可检测标签。
实施方案P62.实施方案P61的多种不同核酸，其中每种碱基选自腺嘌呤或腺嘌呤类似物，鸟嘌呤或鸟嘌呤类似物，胞嘧啶或胞嘧啶类似物，胸腺嘧啶或胸腺嘧啶类似物和尿嘧啶或尿嘧啶类似物。
实施方案P63.其中所述与3′-氧结合的烷基二硫基甲基部分选自甲基二硫基甲基、乙基二硫基甲基、丙基二硫基甲基、异丙基二硫基甲基、丁基二硫基甲基、叔丁基二硫基甲基和苯基二硫基甲基。
实施方案P64.实施方案P61-63之一的多种不同核酸，其中每个烷基二硫基甲基部分具有结构
其中R是烷基二硫基甲基部分的烷基部分，并且波浪线表示与3′-氧的连接点。
实施方案P65.实施方案P61-64之一的多种不同核酸，其中至少一种所述核苷酸类似物是脱氮类似物。
实施方案P66.实施方案P65的多种不同核酸，其中脱氮类似物是7-脱氮嘌呤。
实施方案P67.实施方案P61-66之一的多种不同核酸，其中每个接头具有如下结构：
其中α代表一个或多个原子，通过该原子与碱基建立共价连接，并且β代表通过其与可检测标签建立共价连接的一个或多个原子。
实施方案P68.实施方案P67的多种不同核酸，其中每个二硫基甲基接头具有如下结构：
其中α′表示通过其与碱基形成共价连接的一个或多个原子，并且β′表示通过其与可检测标签建立共价连接的一个或多个原子。
实施方案P69.实施方案P68的多种不同核酸，其中每个接头包含在如下的结构内：
其中B代表与碱基的连接点；其中L表示与可检测标签的连接点；并且其中n是1-11。
实施方案P70.实施方案P61-69之一的多种不同核酸，其中所述可检测标签选自染料、荧光团、组合荧光能量转移标签、化学发光化合物、发色团、质量标签和电泳。
实施方案P71.实施方案P70的多种不同核酸，其中所述可检测标签是荧光团。
实施方案P72.一种用于核酸测序的试剂盒，其包含在分开的隔室中的：
a)多种核苷酸类似物，每种核苷酸类似物包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；(iii)与脱氧核糖或核糖的3′-氧结合的烷基二硫基甲基部分；和(iv)通过二硫基甲基接头结合到碱基上可检测标签；
b)适用于核酸聚合的试剂；和
c)使用说明。
实施方案P73.实施方案P72的试剂盒，其进一步包含
a)核苷酸类似物，其包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；和(iii)与脱氧核糖或核糖的3′-氧结合的烷基二硫甲基部分。
其他实施方案
实施方案1.具有下式的化合物：
其中
B为碱基；L1为共价接头；L2为共价接头；
R3为-OH、单磷酸酯、多磷酸酯或核酸；
R4A为氢、-CH3、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-OCX1 3、-OCH2X1、-OCHX1 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R4B为氢、-CH3、-CX2 3、-CHX2 2、-CH2X2、-OCX2 3、-OCH2X2、-OCHX2 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R5为可检测标签或锚部分；
R6为氢或聚合酶相容的可切割部分；
R7为氢或-OR7A，其中R7A为氢或聚合酶相容的可切割部分；X1和X2独立地为卤素。
实施方案2.实施方案1的化合物，其中B是二价胞嘧啶或其衍生物、二价鸟嘌呤或其衍生物、二价腺嘌呤或其衍生物、二价胸腺嘧啶或其衍生物、二价尿嘧啶或其衍生物、二价次黄嘌呤或其衍生物、二价黄嘌呤或其衍生物、脱氮腺嘌呤或其衍生物、脱氮鸟嘌呤或其衍生物、脱氮次黄嘌呤或其衍生物、二价7-甲基鸟嘌呤或其衍生物、二价5，6-二氢尿嘧啶或其衍生物、二价5-甲基胞嘧啶或其衍生物或二价5-羟甲基胞嘧啶或其衍生物。
实施方案3.实施方案1的化合物，其中B是
实施方案4.实施方案1-3之一的化合物，其中
L1为L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；并且
L1A、L1B、L1C、L1D和L1E独立的是键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
实施方案5.实施方案1-3之一的化合物，其中L1为L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；L1A、L1B、L1C、L1D和L1E独立的是键、取代或未取代的C1-C8亚烷基、取代或未取代的2-8元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或者取代或未取代的5-10元亚杂芳基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
实施方案6.实施方案1-3之一的化合物，其中L1为L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；L1A、L1B、L1C、L1D和L1E独立的是键、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的2-6元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C6亚环烷基、取代或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元亚杂芳基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
实施方案7.实施方案1-3之一的化合物，其中L1为键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基。
实施方案8.实施方案1-3之一的化合物，其中L1为键、取代或未取代的C1-C8亚烷基、取代或未取代的2-8元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或者取代或未取代的5-10元亚杂芳基。
实施方案9.实施方案1-3之一的化合物，其中L1为键、取代或未取代的C1-C8亚烷基、取代或未取代的2-8元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或者取代或未取代的5-10元亚杂芳基。
实施方案10.实施方案1-3之一的化合物，其中L1为键、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的2-6元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C6亚环烷基、取代或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元亚杂芳基。
实施方案11.实施方案1-3之一的化合物，其中L1为取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的2-6元亚杂烷基。
实施方案12.实施方案1-3之一的化合物，其中L1是未取代的C1-C4亚烷基。
实施方案13.实施方案1-3之一的化合物，其中L1是-C三C-CH2-。
实施方案14.实施方案1-12之一的化合物，其中L2是可切割的接头。
实施方案15.实施方案1-12之一的化合物，其中L2是化学可切割的接头。
实施方案16.实施方案1-12之一的化合物，其中L2是光可切割接头，酸可切割接头，碱可切割接头，氧化剂可切割接头，还原剂可切割接头或氟化物可切割接头。
实施方案17.实施方案1-12之一的化合物，其中L2是可切割的接头，其包含二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头或硝基苄基接头。
实施方案18.实施方案1-12之一的化合物，其中L2是L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立的是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
实施方案19.实施方案1-12之一的化合物，其中L2是L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立的是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的C1-C20亚烷基、取代或未取代的2-20元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C20亚环烷基、取代或未取代的3-20元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C20亚芳基或者取代或未取代的5-20元亚杂芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
实施方案20.实施方案1-12之一的化合物，其中L2是L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独地是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的C1-C10亚烷基、取代或未取代的2-10元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或者取代或未取代的5-10元亚杂芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
实施方案21.实施方案1-12之一的化合物，其中L2是L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；并且L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的2-6元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C6亚环烷基、取代或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元亚杂芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
实施方案22.实施方案1-12之一的化合物，其中L2是L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；L2A是键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基；L2B是键、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；L2C是键、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；L2D是键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基；L2E键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
实施方案23.实施方案1-12之一的化合物，其中L2为键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基。
实施方案24.实施方案1-12之一的化合物，其中L2为键、取代或未取代的C1-C20亚烷基、取代或未取代的2-20元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C20亚环烷基、取代或未取代的3-20元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C20亚芳基或者取代或未取代的5-20元亚杂芳基。
实施方案25.实施方案1-12之一的化合物，其中L2为键、取代或未取代的C1-C8亚烷基、取代或未取代的2-8元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或者取代或未取代的5-10元亚杂芳基。
实施方案26.实施方案1-12之一的化合物，其中L2是键、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的2-6元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C6亚环烷基、取代或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元亚杂芳基。
实施方案27.实施方案1-12之一的化合物，其中L2为取代或未取代的4-10元亚杂烷基。
实施方案28.实施方案1-12之一的化合物，其中L2为取代或未取代的4-8元亚杂烷基。
实施方案29.实施方案1-12之一的化合物，其中L2为-C(CH3)2CH2NHC(O)-。
实施方案30.实施方案1-28之一的化合物，其中R3是-OH。
实施方案31.实施方案1-28之一的化合物，其中R3是单磷酸酯。
实施方案32.实施方案1-28之一的化合物，其中R3是多磷酸酯。
实施方案33.实施方案1-28之一的化合物，其中R3是三磷酸酯。
实施方案34.实施方案1-28之一的化合物，其中R3为四磷酸酯、五磷酸酯或六磷酸酯。
实施方案35.实施方案1-28之一的化合物，其中R3是核酸的残基。
实施方案36.实施方案1-28之一的化合物，其中R3是核酸的10-25个碱基残基。
实施方案37.实施方案1-28之一的化合物，其中R3是核酸的10-10,000个碱基残基。
实施方案38.实施方案1-36之一的化合物，其中R4A为氢、-CH3、-CXl 3、-CHX1 2、-CH2X1、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基。
实施方案39.实施方案1-36之一的化合物，其中R4A为氢-CH3、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元杂芳基。
实施方案40.实施方案1-36之一的化合物，其中R4A是氢。
实施方案41.实施方案1-39之一的化合物，其中R4B为氢、-CH3、-CX2 3、-CHX2 2、-CH2X2、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基。
实施方案42.实施方案1-39之一的化合物，其中R4B为氢、-CH3、-CX2 3、-CHX2 2、-CH2X2、-CN、-Ph、H2、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元杂芳基。
实施方案43.实施方案1-39之一的化合物，其中R4B是氢。
实施方案44.实施方案1-42之一的化合物，其中R5是可检测标签。
实施方案45.实施方案1-42之一的化合物，其中R5是荧光染料。
实施方案46.实施方案1-42之一的化合物，其中R5是锚部分。
实施方案47.实施方案1-42之一的化合物，其中R5是点击化学反应反应物部分。
实施方案48.实施方案1-42之一的化合物，其中R5是反式环辛烯部分或叠氮化物部分。
实施方案49.实施方案1-42之一的化合物，其中R5是亲和锚部分。
实施方案50.实施方案1-42之一的化合物，其中R5是生物素部分。
实施方案51.实施方案1-49之一的化合物，其中R6是氢。
实施方案52.实施方案1-49之一的化合物，其中R6是聚合酶相容的可切割部分。
实施方案53.实施方案1-49之一的化合物，其中R6是包含叠氮基部分的聚合酶相容的可切割部分。
实施方案54.实施方案1-49之一的化合物，其中R6是包含二硫基接头的聚合酶相容的可切割部分。
实施方案55.实施方案1-49之一的化合物，其中R6是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是-CH2N3。
实施方案56.实施方案1-49之一的化合物，其中R6是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
R8A独立地为氢、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R8B独立地为氢、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R9独立地为氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R1O独立地为氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；和
X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。
实施方案57.实施方案1-49之一的化合物，其中R6是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
R8A为氢、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元杂芳基；
R8B为氢、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元杂芳基；
R9为氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元杂芳基；
R10为氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元杂芳基；
R11是氢、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元杂芳基；以及
X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。
实施方案58.实施方案1-49之一的化合物，其中R6是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
R8A和R8B独立地为氢或未取代的烷基；并且R9、R10和R11独立地为未取代的烷基或未取代的杂烷基。
实施方案59.实施方案1-49之一的化合物，其中R6是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
R8A和R8B独立地为氢或未取代的C1-C4烷基；
R9、R10和R11独立地为未取代的C1-C6烷基或未取代的2-4元杂烷基。
实施方案60.实施方案1-49之一的化合物，其中R6是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
R8A和R8B独立地为氢；并且R9、R10和R11独立地为未取代的C1-C6烷基或未取代的2-4元杂烷基。
实施方案61.实施方案1-49之一的化合物，其中R6是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
R8A和R8B独立地为氢；和R9、R10和R11独立地为未取代的甲基或未取代的甲氧基。
实施方案62.实施方案1-49之一的化合物，其中R6是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
实施方案63.实施方案1-49之一的化合物，其中R7是氢。
实施方案64.实施方案1-70之一的化合物，其中R7是-OR7A；R7A是氢。
实施方案65.实施方案1-49之一的化合物，其中R7是-OR7A；并且R7A是聚合酶相容的可切割部分。
实施方案66.实施方案1-49之一的化合物，其中R7是-OR7A；并且R7A是包含叠氮基部分的聚合酶相容的可切割部分。
实施方案67.实施方案1-49之一的化合物，其中R7是-OR7A；并且R7A是包含二硫基接头、烯丙基或2-硝基苄基的聚合酶相容的可切割部分。
实施方案68.实施方案1-49之一的化合物，其中R7是-OR7A；R7A是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是-CH2N3。
实施方案69.实施方案1-49之一的化合物，其中R7是-OR7A；R7A是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
R8A是氢、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R8B为氢、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基，取代或未取代的杂烷基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的杂环烷基，取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R9是氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基，取代或未取代的杂烷基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的杂环烷基，取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R10为氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基，取代或未取代的杂烷基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的杂环烷基，取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R11为氢、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基，取代或未取代的杂烷基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的杂环烷基，取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；以及
X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。
实施方案70.实施方案1-49之一的化合物，其中R7是-OR7A；R7A是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
R8A为氢、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元杂芳基；
R8B为氢、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元杂芳基；
R9为氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元杂芳基；
R1O为氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元杂芳基；
R11是氢、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元杂芳基；以及
X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。
实施方案71.实施方案1-70之一的化合物，其中R7是-OR7A；R7A是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
R8A、R8B、R9、R10和R11独立地为氢或未取代的甲基。
实施方案72.实施方案1-70之一的化合物，其中R7是-OR7A；R7A是聚合酶相容的可切割部分；并且聚合酶相容的可切割部分是：
实施方案73.实施方案1的化合物，其具有下式：
实施方案74.实施方案1的化合物，其具有下式：
实施方案75.实施方案73-74之一的化合物，其中CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。
实施方案76.实施方案73-74之一的化合物，其中R9为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3，-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案77.实施方案73-74之一的化合物，其中R10为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案78.实施方案73-74之一的化合物，其中R11为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案79.实施方案73-74之一的化合物，其中R8A独立地是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN或-Ph。
实施方案80.实施方案73-74之一的化合物，其中R8B独立地为氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN或-Ph。
实施方案81.实施方案73-80之一的化合物，其中-R7A是氢。
实施方案82.实施方案73-80之一的化合物，其中-R7A是
实施方案83.实施方案73-80之一的化合物，其中-R7A是
实施方案84.实施方案73-80之一的化合物，其中-R7A是
实施方案85.实施方案73-85之一的化合物，具有下式：
实施方案86.实施方案73-85之一的化合物，其具有下式：
实施方案87.实施方案1的化合物，其具有下式：
实施方案88.实施方案1的化合物，其具有下式：
实施方案89.实施方案87-88之一的化合物，其中-CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。
实施方案90.实施方案87-88之一的化合物，其中R9独立地为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案91.实施方案87-88之一的化合物，其中R10独立地为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案92.实施方案87-88之一的化合物，其中R11独立地是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案93.实施方案87-88之一的化合物，其中R8A独立地是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN或-Ph。
实施方案94.实施方案87-88之一的化合物，其中R8B独立地是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN或-Ph。
实施方案95.实施方案87-94之一的化合物，其具有下式：
实施方案96.实施方案87-95之一的化合物，具有下式：
实施方案97.实施方案77-96之一的化合物，其中-L2-R5是
并且z是0-10的整数。
实施方案98.实施方案1的化合物，其具有下式：
其中m是1-4的整数。
实施方案99.实施方案1的化合物，其具有下式
实施方案100.实施方案98-99之一的化合物，其中-CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。
实施方案101.实施方案98-99之一的化合物，其中R9为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案102.实施方案98-99之一的化合物，其中R10为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案103.实施方案98-99之一的化合物，其中R11为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案104.实施方案98-99之一的化合物，其中R8A独立地为氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN或-Ph。
实施方案105.实施方案98-99之一的化合物，其中R8B独立地为氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN或-Ph。
实施方案106.实施方案98-105之一的化合物，其中-R7A是氢。
实施方案107.实施方案98-105之一的化合物，其中-R7A是
实施方案108.实施方案98-105之一的化合物，其中-R7A是
实施方案109.实施方案98-105之一的化合物，其中-R7A是
实施方案110.实施方案98-105之一的化合物，其具有下式：
实施方案111.实施方案115-126之一的化合物，其具有下式：
实施方案112.实施方案1的化合物，其具有下式：
其中m是1-4的整数。
实施方案113.实施方案1的化合物，其具有下式：
实施方案114.实施方案129-130之一的化合物，其中-CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。
实施方案115.实施方案129-130之一的化合物，其中R9是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案116.实施方案129-130之一的化合物，其中-R10是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案117.实施方案129-130之一的化合物，其中-R11是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3，、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案118.实施方案129-130之一的化合物，其中R8A是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN或-Ph。
实施方案119.实施方案129-130之一的化合物，其中R8B是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN或-Ph。
实施方案120.实施方案129-136之一的化合物，具有下式：
实施方案121.实施方案115-122之一的化合物，具有下式：
实施方案122.实施方案115-138之一的化合物，其中B是
实施方案123.实施方案1的化合物，其具有下式：
实施方案124.实施方案1的化合物，其具有下式：
实施方案125.实施方案140-141之一的化合物，其中-CR9R10R11是未取代的甲基，未取代的乙基，未取代的丙基，未取代的异丙基，未取代的丁基或未取代的叔丁基。
实施方案126.实施方案140-141之一的化合物，其中R9是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案127.实施方案140-141之一的化合物，其中-R10是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案128.实施方案140-141之一的化合物，其中-R11是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案129.实施方案140-141之一的化合物，其中R8A独立地是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN或-Ph。
实施方案130.实施方案140-141之一的化合物，其中R8B独立地为氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN或-Ph。
实施方案131.实施方案140-147之一的化合物，其中-R7A是氢。
实施方案132.实施方案140-147之一的化合物，其中-R7A是
实施方案133.实施方案140-147之一的化合物，其中-R7A是
实施方案134.实施方案140-147之一的化合物，其中-R7A是
实施方案135.实施方案140-147之一的化合物，其具有下式：
实施方案136.实施方案140-147之一的化合物，其具有下式：
实施方案137.实施方案1的化合物，具有下式：
实施方案138.实施方案1的化合物，其具有下式：
实施方案139.实施方案154-155之一的化合物，其中CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。
实施方案140.实施方案154-155之一的化合物，其中R9为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案141.实施方案154-155之一的化合物，其中-R10是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案142.实施方案154-155之一的化合物，其中-R11是、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3，、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案143.实施方案154-155之一的化合物，其中R8A是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN或-Ph。
实施方案144.实施方案154-155之一的化合物，其中R8B是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX4 3、-cHX4 2、-CH2X4、-CN或-Ph。
实施方案145.实施方案154-161之一的化合物，其具有下式：
实施方案146.实施方案154-161之一的化合物，其具有下式：
实施方案147.下式的组合物：
其中---是非共价键；B是碱基；
L1是共价接头；
L2是共价接头；
L4是共价接头；
R3是-OH、单磷酸酯、多磷酸酯或核酸；
R4A是氢、-CH3、-CX1 3、-CHX12、-CH2X1、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R4B是氢、-CH3、-CX2 3、-CHX2 2、-CH2X2、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R5是亲和锚部分；
R6是氢或聚合酶相容的可切割部分；
R7是氢或-OR7A，其中R7A是氢或聚合酶相容的可切割部分；
R12是互补的亲和锚部分结合剂；
R13是可检测标签；并且X1和X2独立地为卤素。
实施方案148.实施方案147的组合物，其中R5是生物素部分并且R12是链霉亲和素部分。
实施方案149.实施方案147-148之一的组合物，其中L4是正交可切割的接头。
实施方案150.实施方案147-148之一的组合物，其中L4是可切割接头。
实施方案151.实施方案147-148之一的组合物，其中L4是化学可切割接头。
实施方案152.实施方案147-148之一所述的组合物，其中L4是光切割接头、酸可切割接头、碱可切割接头、氧化剂可切割接头、还原剂可切割接头或氟化物可切割的接头。
实施方案153.实施方案147-148之一的组合物，其中L4是包括二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头或硝基苄基接头的可切割接头。
实施方案154.实施方案147-148之一的组合物，其中，
L4是L4A-L4B-L4C-L4D-L4E；L4A、L4B、L4C、L4D和L4E独立地为键，-NN-，-NHC(O)-，-C(O)NH-，取代或未取代的亚烷基，取代或未取代的亚杂烷基，取代或未取代的亚环烷基，取代或未取代的亚杂环烷基，取代或未取代亚芳基或者取代或未取代亚杂芳基；其中L4A、L4B、L4C、L4D和L4E中的至少一个不是键。
实施方案155.实施方案147-148之一的组合物，其中L4是L4A-L4B-L4C-L4D-L4E；和L4A、L4B、L4C、L4D和L4E独立地为键，-NN-，-NHC(O)-，-C(O)NH-取代或未取代的C1-C20亚烷基，取代或未取代的2至20元亚杂烷基，取代或未取代的C3-C20亚环烷基、取代或未取代的3至20元亚杂环烷基，取代或未取代的C6-C20亚芳基或者取代或未取代的5至20元亚杂芳基；其中L4A，L4B，L4C，L4D和L4E中的至少一个不是键。
实施方案156.实施方案147-148之一的组合物，其中
L4是L4A-L4B-L4C-L4D-L4E；和
L4A、L4B、L4C、L4D和L4E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的C1-C10亚烷基、取代或未取代的2-10元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或者取代或未取代的5-10元亚杂芳基；其中L4A、L4B、L4C、L4D和L4E中的至少一个不是键。
实施方案157.实施方案147-148之一的组合物，其中
L4是L4A-L4B-L4C-L4D-L4E；和
L4A、L4B、L4C、L4D和L4E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的2-6元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C6亚环烷基、取代或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元亚杂芳基；其中L4A、L4B、L4C、L4D和L4E中的至少一个不是键。
实施方案158.实施方案147-148之一的组合物，其中
L4是L4A-L4B-L4C-L4D-L4E；
L4A是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基；
L4B是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；
L4C是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；
L4D是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基；以及
L4E是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；其中L4A、L4B、L4C、L4D和L4E中的至少一个不是键。
实施方案159.实施方案147-148之一的组合物，其中L4为键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基。
实施方案160.实施方案147-148之一的组合物，其中L4是键、取代或未取代的C1-C20亚烷基、取代或未取代的2-20元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C20亚环烷基、取代或未取代的3-20元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C20亚芳基或者取代或未取代的5-20元亚杂芳基。
实施方案161.实施方案147-148之一的组合物，其中L4是键、取代或未取代的C1-C8亚烷基、取代或未取代的2-8元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或者取代或未取代的5-10元亚杂芳基。
实施方案162.实施方案147-148之一的组合物，其中L4是键、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的2-6元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C6亚环烷基、取代或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元亚杂芳基。
实施方案163.实施方案147-148之一的组合物，其中L4为取代或未取代的3-10元亚杂烷基。
实施方案164.实施方案147-148之一的组合物，其中L4为取代或未取代的3-8元亚杂烷基。
实施方案165.实施方案147-164之一的化合物，其中R13是荧光染料。
实施方案166.下式的化合物：
其中
B是碱基；
L3是可切割的接头；
R3是-OH、单磷酸酯、多磷酸酯或核酸；
R5是可检测标签或锚部分；
R7是氢或-OR7A，其中R7A是氢或
R8A是氢、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R8B为氢、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R9是氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R10是氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R11是氢、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。
实施方案167.实施方案183的化合物，其中B为二价胞嘧啶或其衍生物、二价鸟嘌呤或其衍生物、二价腺嘌呤或其衍生物、二价胸腺嘧啶或其衍生物、二价尿嘧啶或其衍生物、二价次黄嘌呤或其衍生物、二价黄嘌呤或其衍生物、二价7-甲基鸟嘌呤或其衍生物、二价5，6-二氢尿嘧啶或其衍生物、二价5-甲基胞嘧啶或其衍生物或二价5-羟甲基胞嘧啶或其衍生物。
实施方案168.实施方案166的化合物，其中B是
实施方案169.实施方案166-168之一的化合物，其中L3是
其中，
L1为键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；
L2为键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基、正交可切割的接头、非共价接头或-L2A-L2B-L2C-L2D-，其中
L2A是键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基；
L2B是键、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；
L2C是键、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；以及
L2D是键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基，其中L2A、L2B、L2C、L2D中至少一个不是键；
R4A是氢、-CH3、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R4B是氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
并且X1和X2独立地为卤素。
实施方案170.实施方案166-169之一的化合物，其中L3是
L1是共价接头；
L2是共价接头；
R4A是氢、-CH3、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R4B是氢、-CH3、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；并且
X1和X2独立地为卤素。
实施方案171.实施方案170的化合物，其中L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；L1A、L1B、L1C、L1D和L1E独立地为键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；并且L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
实施方案172.实施方案170的化合物，其中L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；L1A、L1B、L1C、L1D和L1E独立地为键、取代或未取代的C1-C8亚烷基、取代或未取代的2-8元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或者取代或未取代的5-10元亚杂芳基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
实施方案173.实施方案170的化合物，其中L1是L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；L1A、L1B、L1C、L1D和L1E独立地为键、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的2-6元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C6亚环烷基、取代或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元亚杂芳基；其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
实施方案174.实施方案170的化合物，其中L1是键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基。
实施方案175.实施方案170的化合物，其中L1是键、取代或未取代的C1-C8亚烷基、取代或未取代的2-8元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或者取代或未取代的5-10元亚杂芳基。
实施方案176.实施方案170的化合物，其中L1是键、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的2-6元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C6亚环烷基、取代或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元亚杂芳基。
实施方案177.实施方案170的化合物，其中L1是取代或未取代的C1-C6亚烷基或者取代或未取代的2-6元亚杂烷基。
实施方案178.实施方案170的化合物，其中L1是未取代的C1-C4亚烷基。
实施方案179.实施方案170的化合物，其中L1是-C≡C-CH2-。
实施方案180.实施方案170-179之一的化合物，其中L2是正交可切割的接头或非共价接头。
实施方案181.实施方案170-179之一的化合物，其中L2是可切割接头。
实施方案182.实施方案170-179之一的化合物，其中L2是化学可切割的接头。
实施方案183.实施方案170-179之一的化合物，其中L2是光切割接头、酸可切割接头、碱可切割接头、氧化剂可切割接头、还原剂可切割接头或氟化物可切割的接头。
实施方案184.实施方案170-179之一的化合物，其中L2是可切割接头，其包含二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头或硝基苄基接头。
实施方案185.实施方案170-179之一的化合物，其中
L2是L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；
L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；
其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
实施方案186.实施方案170-179之一的化合物，其中
L2是L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；
L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的C1-C20亚烷基、取代或未取代的2-20元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C20亚环烷基、取代或未取代的3-20元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C20亚芳基或者取代或未取代的5-20元亚杂芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
实施方案187.实施方案170-179之一的化合物，其中
L2是L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；
L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为键、取代或未取代的C1-C10亚烷基、取代或未取代的2-10元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或者取代或未取代的5-10元亚杂芳基；
其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
实施方案188.实施方案170-179之一的化合物，其中
L2是L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；
L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的2-6元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C6亚环烷基、取代或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元亚杂芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
实施方案189.实施方案170-179之一的化合物，其中
L2是L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；
L2A是键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基；
L2B是键、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的亚杂芳基；
L2C是键、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的亚杂芳基；
L2D是键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基；和
L2E是键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
实施方案190.实施方案170-179之一的化合物，其中L2是键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基。
实施方案191.实施方案170-179之一的化合物，其中L2是键、取代或未取代的C1-C20亚烷基、取代或未取代的2-20元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C20亚环烷基、取代或未取代的3-20元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C20亚芳基或者取代或未取代的5-20元亚杂芳基。
实施方案192.实施方案170-179之一的化合物，其中L2是键、取代或未取代的C1-C8亚烷基、取代或未取代的2-8元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或者取代或未取代的5-10元亚杂芳基。
实施方案193.实施方案170-179之一的化合物，其中L2是键、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的2-6元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C6亚环烷基、取代或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元亚杂芳基。
实施方案194.实施方案170-179之一的化合物，其中L2为取代或未取代的4-10元亚杂烷基。
实施方案195.实施方案170-179之一的化合物，其中L2为取代或未取代的4-8元亚杂烷基。
实施方案196.实施方案170-179之一的化合物，其中L2是-C(CH3)2CH2NHC(O)-。
实施方案197.实施方案166-196之一的化合物，其中R3是-OH。
实施方案198.实施方案166-196之一的化合物，其中R3是单磷酸酯。
实施方案199.实施方案166-196之一的化合物，其中R3是多磷酸酯。
实施方案200.实施方案166-196之一的化合物，其中R3是三磷酸酯。
实施方案201.实施方案166-196之一的化合物，其中R3是四磷酸酯、五磷酸或六磷酸。
实施方案202.实施方案166-196之一的化合物，其中R3是核酸的残基。
实施方案203.实施方案166-196之一的化合物，其中R3是10-25个碱基核酸的残基。
实施方案204.实施方案166-196之一的化合物，其中R3是10-10,000个碱基核酸的残基。
实施方案205.实施方案170-204之一的化合物，其中R4A独立地为氢、-CH3、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基。
实施方案206.实施方案170-204之一的化合物，其中R4A独立地为氢、-CH3、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元杂芳基。
实施方案207.实施方案170-204之一的化合物，其中R4A是氢。
实施方案208.实施方案170-204之一的化合物，其中R4B独立地为氢、-CH3、-CX2 3、-CHX2 2、-CH2X2、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基。
实施方案209.实施方案170-204之一的化合物，其中R4B独立地为氢、-CH3、-CX2 3、-CHX2 2、-CH2X2、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元杂芳基。
实施方案210：实施方案170-204之一的化合物，其中R4B是氢。
实施方案211.实施方案166-210之一的化合物，其中R5是可检测标签。
实施方案212：实施方案166-210之一的化合物，其中R5是荧光染料。
实施方案213.实施方案166-210之一的化合物，其中R5是锚部分。
实施方案214.实施方案166-210之一的化合物，其中R5是点击化学反应反应物部分。
实施方案215.实施方案166-210之一的化合物，其中R5是反式环辛烯部分或叠氮化物部分。
实施方案216.实施方案166-210之一的化合物，其中R5是亲和锚部分。
实施方案217.实施方案166-210之一的化合物，其中R5是生物素部分。
实施方案218.实施方案166-217之一的化合物，其中
R8A是氢、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R8B为氢、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R9是氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R11是氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R11是氢、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；以及
X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。
实施方案219.实施方案166-217之一的化合物，其中
R8A和R8B独立地为氢或未取代的烷基；
R9、R10和R11独立地为未取代的烷基或未取代的杂烷基。
实施方案220.实施方案166-217之一的化合物，其中
R8A和R8B独立地为氢或未取代的C1-C4烷基；
R9、R10和R11独立地为未取代的C1-C6烷基或未取代的2-4元杂烷基。
实施方案221.实施方案166-217之一的化合物，其中
R8A和R8B独立地为氢；
R9、R10和R11独立地为未取代的C1-C6烷基或未取代的2-4元杂烷基。
实施方案222.实施方案166-217之一的化合物，其中
R8A和R8B独立地为氢；
R9、R10和R11独立地为未取代的甲基或未取代的甲氧基。
实施方案223.实施方案166-217之一的化合物，其中R8A、R8B、R9、R10和R11独立地为氢或未取代的甲基。
实施方案224.实施方案166-217之一的化合物，其中R8A和R8B是氢，并且R9、R10和R11是未取代的甲基。
实施方案225.实施方案166-217之一的化合物，其中R7是氢。
实施方案226.实施方案166-217之一的化合物，其中R7是-OR7A；R7A是氢。
实施方案227.实施方案166-217之一的化合物，其中R7是-OR7A并且R7A是：
实施方案228.实施方案166-227之一的化合物，其中R7是-OR7A并且R7A是：
实施方案229.实施方案166的化合物，其具有下式：
实施方案230.实施方案166的化合物，其具有下式：
实施方案231.实施方案229-230之一的化合物，其中-CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。
实施方案232.实施方案229-230之一的化合物，其中R9为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案233.实施方案229-230之一的化合物，其中R10为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案234.实施方案229-230之一的化合物，其中R11为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案235.实施方案229-230之一的化合物，其中R8A是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN、-Ph。
实施方案236.实施方案229-230之一的化合物，其中R8B为氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN、-Ph。
实施方案237.实施方案229-236之一的化合物，其中-R7A是氢。
实施方案238.实施方案229-236之一的化合物，其中-R7A是
实施方案239.实施方案229-236之一的化合物，其中-R7A是
实施方案240.实施方案229-236之一的化合物，其中-R7A是
实施方案241.实施方案229-236之一的化合物，其具有下式：
实施方案242.实施方案229-236之一的化合物，其具有下式：
实施方案243.实施方案229-242之一的化合物，其中B是
实施方案244.实施方案229-243之一的化合物，其中R5为
实施方案245.实施方案166的化合物，其具有下式：
实施方案246.实施方案166的化合物，其具有下式：
实施方案247.实施方案245-246之一的化合物，其中-CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。
实施方案248.实施方案245-246之一的化合物，其中R9为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案249.实施方案245-246之一的化合物，其中R10为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案250.实施方案245-246之一的化合物，其中R11为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案251.实施方案245-246之一的化合物，其中R8A为氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN、-Ph。
实施方案252.实施方案245-246之一的化合物，其中R8B为氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-CN、-Ph。
实施方案253.实施方案245-246之一的化合物，其具有下式：
实施方案254.实施方案242-246之一的化合物，其具有下式：
实施方案255.实施方案229-254之一的化合物，其中B为
实施方案256.实施方案229-255之一的化合物，其中R5为
实施方案257.具有下式的化合物：
R7A是氢或聚合酶相容的可切割部分；
R8A是氢、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R8B是氢、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R9是氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R10是氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R11是氢、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；和
X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素；并且m是1-4的整数。
实施方案258.具有下式的化合物：
R7A是氢或聚合酶相容的可切割部分；
R8A独立地为氢、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R8B独立地为氢、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R9独立地为氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R10独立地为氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R11独立地为氢、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；以及
X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。
实施方案259.实施方案257-258之一的化合物，其中CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。
实施方案260.实施方案257-258之一的化合物，其中R9是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案261.实施方案257-258之一的化合物，其中R10为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案262.实施方案257-258之一的化合物，其中R11为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案263.实施方案257-258之一的化合物，其中R8A是氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-CN、-Ph。
实施方案264.实施方案257-258之一的化合物，其中R8B为氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、-CX4 3、-cHX4 2、-CH2X4、-CN、-Ph。
实施方案265.实施方案257-258之一的化合物，其中-R7A是氢。
实施方案266.实施方案257-258之一的化合物，其中-R7A是
实施方案267.实施方案257-258之一的化合物，其中-R7A是
实施方案268.实施方案257-258之一的化合物，其中-R7A是
实施方案269.实施方案257-258之一的化合物，其具有下式：
实施方案270.具有下式的化合物
R8A独立地为氢、CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、-Ph、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R8B独立地为氢、-CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、-Ph、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R9独立地为氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R10独立地为氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R11独立地为氢、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；以及
X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素；并且m是1-4的整数。
实施方案271.具有下式的化合物：
R8A独立地为氢、CH3、-CX3 3、-CHX3 2、-CH2X3、-OCX3 3、-OCH2X3、-OCHX3 2、-CN、-Ph、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R8B独立地为氢、CH3、-CX4 3、-CHX4 2、-CH2X4、-OCX4 3、-OCH2X4、-OCHX4 2、-CN、-Ph、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R9独立地为氢、-CX5 3、-CHX5 2、-CH2X5、-OCX5 3、-OCH2X5、-OCHX5 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R10独立地为氢、-CX6 3、-CHX6 2、-CH2X6、-OCX6 3、-OCH2X6、-OCHX6 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；
R11独立地为氢、-CX7 3、-CHX7 2、-CH2X7、-OCX7 3、-OCH2X7、-OCHX7 2、-CN、-OH、-SH、-NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；X3、X4、X5、X6和X7独立地为卤素。
实施方案272.实施方案270-271之一的化合物，其中CR9R10R11是未取代的甲基、未取代的乙基、未取代的丙基、未取代的异丙基、未取代的丁基或未取代的叔丁基。
实施方式273.实施方式270-271之一的化合物，其中R9为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案274.实施方案270-271之一的化合物，其中-R10是氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案275.实施方案270-271之一的化合物，其中-R11为氢、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案276.实施方案270-271之一的化合物，其中R8A独立地为氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案277.实施方案270-271之一的化合物，其中R8B独立地为氢、氘、-C(CH3)3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3、-CH2CH3、-CH3、OC(CH3)3、-OCH(CH3)2、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH3、-OCH3、-SC(CH3)3、-SCH(CH3)2、-SCH2CH2CH3、-SCH2CH3、-SCH3、-NHC(CH3)3、-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2CH3、-NHCH2CH3、-NHCH3或-Ph。
实施方案278.实施方案271-277之一的化合物，其具有下式：
实施方案279.具有下式的化合物：
R12zL4zR13；其中
L4z是共价接头；
R12z是互补的锚部分反应性基团；以及
R13是可检测标签。
实施方案280.实施方案279的化合物，其中L4z是正交可切割的接头。
实施方案281.实施方案279的化合物，其中L4z是可切割接头。
实施方案282.实施方案279的化合物，其中L4z是化学可切割接头。
实施方案283.实施方案279的化合物，其中L4z是光切割接头，酸可切割接头，碱可切割接头，氧化剂可切割接头，还原剂可切割接头或氟化物可切割的接头。
实施方案284.实施方案279的化合物，其中L4z是包含二烷基缩酮接头、偶氮接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基接头或硝基苄基接头。
实施方案285.实施方案279的化合物，其中
L4z是L4zA-L4zB-L4zC-L4zD-L4zE；
L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；
其中L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE中的至少一个不是键。
实施方案286.实施方案279的化合物，其中
L4z是L4zA-L4zB-L4zC-L4zD-L4zE；
L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的C1-C20亚烷基、取代或未取代的2-20元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C20亚环烷基、取代或未取代的3-20元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C20亚芳基或者取代或未取代的5-20元亚杂芳基；
其中L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE中的至少一个不是键。
实施方案287.实施方案279的化合物，其中
L4z是L4zA-L4zB-L4zC-L4zD-L4zE；
L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的C1-C10亚烷基、取代或未取代的2-10元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或者取代或未取代的5-10元亚杂芳基；
其中L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE中的至少一个不是键。
实施方案288.实施方案279的化合物，其中
L4z是L4zA-L4zB-L4zC-L4zD-L4zE；
L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的2-6元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C6亚环烷基、取代或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元亚杂芳基；
其中L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE中的至少一个不是键。
实施方案289.实施方案279的化合物，其中
L4z是L4zA-L4zB-L4zC-L4zD-L4zE；
L4zA是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基；
L4zB是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；
L4zC是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；
L4zD是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基；和
L4zE是键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基；
其中L4zA、L4zB、L4zC、L4zD和L4zE中的至少一个不是键。
实施方案290.实施方案279的化合物，其中L4z是键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或者取代或未取代的亚杂芳基。
实施方案291.实施方案279的化合物，其中L4z是键、取代或未取代的C1-C20亚烷基、取代或未取代的2-20元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C20亚环烷基、取代或未取代的3-20元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C20亚芳基或者取代或未取代的5-20元亚杂芳基。
实施方案292.实施方案279的化合物，其中L4z是键、取代或未取代的C1-C8亚烷基、取代或未取代的2-8元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基或者取代或未取代的5-10元亚杂芳基。
实施方案293.实施方案279的化合物，其中L4z是键、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的2-6元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C6亚环烷基、取代或未取代的3-6元亚杂环烷基、取代或未取代的苯基或者取代或未取代的5-6元亚杂芳基。
实施方案294.实施方案279的化合物，其中L4z是取代或未取代的3-10元亚杂烷基。
实施方案295.实施方案279的化合物，其中L4z是取代或未取代的3-8元亚杂烷基。
实施方案296.实施方案279的化合物，具有下式：
z是0-20的整数。
实施方案297.实施方案279-296之一的化合物，其中R12z为
链霉亲和素部分或
实施方案298.实施方案279-296之一的化合物，其中R13是荧光染料。
实施方案299.实施方案279-296之一的化合物，其中R13包含荧光共振能量转移供体荧光染料。
实施方案300.实施方案279-296之一的化合物，其中R13包含荧光共振能量转移受体荧光染料。
实施方案301.实施方案279-296之一的化合物，其中R13包含通过接头连接的荧光共振能量转移供体和受体荧光染料对。
实施方案302.实施方案279-296之一的化合物，其中R13包含通过接头连接并且相隔0.1nm-10nm的荧光共振能量转移供体和受体荧光染料对。
实施方案303.实施方案279-296之一的化合物，其中R13是
实施方案304.实施方案296的化合物，其具有下式：
实施方案305.具有下式的化合物：
R12z-R14；
其中
R12z是互补的锚部分反应性基团；
R14是R15取代的烷基、R15取代的杂烷基、R15取代的环烷基、R15取代的杂环烷基、R15取代的芳基或R15取代的杂芳基；
R15独立地为R16取代的烷基、R16取代的杂烷基、R16取代的环烷基、R16取代的杂环烷基、R16取代的芳基、R16取代的杂芳基或可检测的染料；
R16独立地为R17取代的烷基、R17取代的杂烷基、R17取代的环烷基、R17取代的杂环烷基、R17取代的芳基、R17取代的杂芳基或可检测的染料；
R17独立地为R18取代的烷基、R18取代的杂烷基、R18取代的环烷基、R18取代的杂环烷基、R18取代的芳基、R18取代的杂芳基或可检测的染料；
R18是一种可检测的染料；
其中R14被多个R15部分取代，R15被多个R16部分取代，并且R16被多个R17部分取代。
实施方案305.实施方案304的化合物，其中R12z是
实施方案306.实施方案304-305之一的化合物，其中可检测染料是荧光染料。
实施方案307.实施方案304-305之一的化合物，其中所述可检测染料包含荧光共振能量转移供体荧光染料。
实施方案308.实施方案304-305之一的化合物，其中可检测染料包含荧光共振能量转移受体荧光染料。
实施方案309.实施方案304-305之一的化合物，其中所述可检测染料包含通过接头连接的荧光共振能量转移供体和受体荧光染料对。
实施方案310.实施方案304-305之一的化合物，其中所述可检测染料包含通过接头连接并且相隔0.1nm-10nm的荧光共振能量转移供体和受体荧光染料对。
实施方案311.如实施方案304-305之一所述的化合物，其中所述可检测染料是
实施方案312.实施方案304-311之一的化合物，其具有下式
313.一种用于对核酸进行测序的方法，其包括：
(i)在反应容器内用核酸聚合酶将四种不同的标记核苷酸类似物中的一种顺序地掺入引物以产生延伸链，其中所述引物与所述核酸杂交，并且其中四种不同的标记核苷酸类似物包含特有的可检测标签；
(ii)检测每个掺入的核苷酸类似物特有的可检测标签，从而鉴定所述延伸链中每个掺入的核苷酸类似物，从而对核酸进行测序；
其中所述四种不同的标记核苷酸类似物中的每一种具有实施方案1-28、31-33、37-44、50-163、183-213、216-218和222-273之一的结构，其中
在所述四种不同的标记核苷酸类似物中的第一种中，B是胸苷或尿苷杂交碱基；
在所述四种不同的标记核苷酸类似物中的第二种中，B是腺苷杂交碱基；
在所述四种不同的标记核苷酸类似物中的第三种中，B是鸟苷杂交碱基；和
在所述四种不同的标记核苷酸类似物中的第四种中，B是胞嘧啶杂交碱基。
实施方案314.实施方案313的方法，其还包括在每个所述掺入步骤后，向所述反应容器中添加四种不同的未标记核苷酸类似物，其中所述四种不同的未标记核苷酸类似物中的每一种具有实施方案257-279之一的结构，其中
在所述四种不同的未标记核苷酸类似物中的第一种中，B是胸苷或尿苷杂交碱基；
在所述四种不同的未标记核苷酸类似物中的第二种中，B是腺苷杂交碱基；
在所述四种不同的未标记核苷酸类似物中的第三种中，B是鸟苷杂交碱基；和
在所述四种不同的未标记核苷酸类似物中的第四种中，B是胞嘧啶杂交碱基。
实施方案315.实施方案313或314之一所述的方法，其中所述四种不同的标记核苷酸类似物中的至少一种是包含可切割部分的正交可切割的标记核苷酸类似物，所述正交可切割的标记核苷酸类似物具有实施方案1-27、31-33、37-44、50-114、183-212、216-218和222-246之一的结构，并且其中所述方法进一步包括在每个所述掺入步骤后，向所述反应容器中加入能够切割可切割部分的切割剂。
实施方案316.一种用于对核酸进行测序的方法，其包括：
在反应容器内，使用核酸聚合酶将四种不同的核苷酸类似物中的一种顺序地掺入引物以产生延伸链，其中所述引物与所述核酸杂交，并且其中所述四种不同的核苷酸类似物中的三种是各自包含特有的可检测标签的不同的标记核苷酸类似物，所述四种不同的核苷酸类似物中的一种是不同的未标记核苷酸类似物；
检测每种掺入的核苷酸类似物特有的可检测标签的存在或不存在，从而鉴定所述延伸链中每个掺入的核苷酸类似物，由此对核酸进行测序；
其中所述四种不同的标记核苷酸类似物中的每一种具有实施方案1-28、31-33、37-44、50-163、183-213、216-218和222-273之一的结构，其中
在所述四种不同的标记核苷酸类似物中的第一种中，B是胸苷或尿苷杂交碱基；
在所述四种不同的标记核苷酸类似物中的第二种中，B是腺苷杂交碱基；
在所述四种不同的标记核苷酸类似物中的第三种中，B是鸟苷杂交碱基；以及
在所述四种不同的标记核苷酸类似物中的第四种中，B是胞嘧啶杂交碱基。
实施方案317.实施方案316的方法，其还包括在每个所述掺入步骤之后向所述反应容器添加四种不同的未标记核苷酸类似物，其中所述四种不同的未标记核苷酸类似物中的每一种具有实施方案274-295之一的结构，其中
在所述四种不同的未标记核苷酸类似物中的第一种中，B是胸苷或尿苷杂交碱基；
在所述四种不同的未标记核苷酸类似物中的第二种中，B是腺苷杂交碱基；
在所述四种不同的未标记核苷酸类似物中的第三种中，B是鸟苷杂交碱基；和
在所述四种不同的未标记核苷酸类似物中的第四种中，B是胞嘧啶杂交碱基。
实施方案318.实施方案316或317之一所述的方法，其中所述三种不同的标记核苷酸类似物中的至少一种是包含可切割部分的、正交可切割的标记核苷酸类似物，所述可正交切割的标记核苷酸类似物具有实施方案1-27、31-33、37-44、50-114、183-212、216-218和222-246之一的结构，其中所述方法进一步包括在每个所述掺入步骤后，向所述反应容器中添加能够切割可切割部分的切割剂。
实施方案319.一种将核苷酸类似物掺入引物的方法，所述方法包括将聚合酶、与核酸模板杂交的引物和核苷酸类似物在反应容器内合并，使所述聚合酶将所述核苷酸类似物掺入所述引物从而形成延伸引物，其中所述核苷酸类似物具有实施方案1-163和183-273之一的结构。
实施方案320.如实施方案319所述的方法，其中L2是可切割部分且R5是可检测标签，所述方法还包括在所述掺入后用切割剂切割所述可切割部分。
实施方案321.实施方案319所述的方法，其中R5是锚部分，所述方法还包括在所述掺入之后用可检测标签对所述核苷酸类似物进行标记。
实施方案322.实施方案321的方法，其中R5是亲和锚部分。
实施方案323.实施方案322的方法，其中所述标记包括向反应容器中加入具有式R12-L4-R13的化合物，其中
R12是互补的亲和锚部分结合剂；
R13是可检测标签；
L4是共价接头。
实施方案324.实施方案321的方法，其中R5是化学反应性锚部分。
实施方案325.实施方案324的方法，其中所述标记包括向反应容器添加具有式R12z-L4z-R13的化合物，其中
R12z是互补的锚部分反应性基团；
R13是可检测标签；
L4z是共价接头。
实施方案326.实施方案325的方法，其中R12z-L4z-R13具有实施方案296-321之一的结构。
实施方案327.实施方案325的方法，其中L4z是可切割的接头。
实施方案328.如实施方案327所述的方法，其进一步包括在所述掺入之后，用切割剂切割所述可切割部分。
实施方案329.实施方案319-328之一的方法，其还包括在所述掺入后向所述反应容器添加包含3′-聚合酶相容的可切割部分的未标记核苷酸类似物。
实施方案330.实施方案319-329之一的方法，其中所述方法形成合成测序方法的一部分。
实施方案331.一种用于对核酸进行测序的方法，其包括：
使具有与其一部分杂交的引物的核酸与聚合酶和第一类核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果所述核苷酸类似物与所述核酸的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻核酸中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将所述核苷酸类似物掺入引物中，从而形成核酸延伸产物，其中所述核苷酸类似物具有以下结构：
其中
B为核碱基；L3为具有以下结构的可切割接头：
其中L2为接头；
R6为聚合酶相容的可切割二硫基部分，当与核苷酸类似物的3′-O结合时，所述可切割二硫基部分防止聚合酶催化与核苷酸类似物的3′-O的聚合酶反应，其中R6具有以下结构：
其中R8A和R8B独立地为氢、-CH3、-CX3、-CHX2、-CH2X、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基、或者取代或未取代的5-6元杂芳基，其中X为卤素；
其中R9、R10和R11各自独立地为氢、-CX3、-CHX2、-CH2X、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基、或者取代或未取代的5-6元杂芳基，其中X为卤素；
R5为锚部分，其中锚部分的身份是预定的并且与核碱基的身份相关；
去除步骤a)中未掺入引物的任何核苷酸类似物；
使步骤a)中的核酸与具有式R12-L4-R13的至少一种化合物接触，其中R12为互补的锚部分结合剂，其与锚部分快速反应，从而与锚部分形成缀合物，L4为共价接头或非共价接头，并且R13为可检测标签；
检测可检测标签的存在以便由此确定步骤a)的核苷酸类似物是否被掺入以由此确定模板DNA中互补核苷酸残基的身份，
其中如果核苷酸类似物a)的碱基不与核酸的下述的核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻单链DNA中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则反复地用第二类的核苷酸类似物、第三类的核苷酸类似物和第四类的核苷酸类似物重复步骤a)至c)直至所述核苷酸类似物具有互补的碱基，其中每种不同类型的核苷酸类似物具有与每种其他类型的核苷酸类似物不同的碱基。
使核酸与切割剂接触，以便(i)切割连接至核碱基的可切割接头，和(ii)切割可切割的二硫基部分，从而在生长的DNA链上产生3′-OH；以及
针对待测序的核酸的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至e)，从而确定核酸的序列。
实施方案332：实施方案331，其中第一、第二、第三和第四类的核苷酸类似物具有不同的锚部分，并且其中每个不同的锚部分与不同的含有可检测标签的锚部分结合剂互补。
实施方案333：实施方案331-332之一的方法，其中不同的结合分子各自具有不同的可检测标签。
实施方案334.权利要求332-333之一的方法，其中在步骤a)期间或之后，使所述核酸与具有以下结构的核苷酸类似物接触：
B是核碱基，其与步骤a)的核苷酸类似物互补于相同的核碱基；
R8A和R8B独立地为氢、-CH3、-CX3、-CHX2、-CH2X、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基基或者取代或未取代的5-6元杂芳基，其中X是卤素；
R9、R10和R11各自独立地为氢、-CX3、-CHX2、-CH2X、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基基或者取代或未取代的5-6元杂芳基，其中X为卤素。
实施方案335.测定核酸的方法，包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的核酸与聚合酶以及第一类、第二类、第三类和第四类的核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果核苷酸类似物与核酸的下述的核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻核酸中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将该核苷酸类似物掺入引物中，以形成核酸延伸产物，其中每种类型的核苷酸类似物具有以下结构：
其中L3为具有以下结构的可切割接头：
其中L2为接头；
其中B是核碱基，其中每种类型的核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种类型的核苷酸类似物的碱基，其中一种碱基是胸苷或尿苷杂交碱基，一种碱基是腺苷杂交碱基，一种碱基是鸟苷杂交碱基，一种碱基是胞嘧啶杂交碱基；
R6为聚合酶相容的可切割二硫基部分，当与核苷酸类似物的3′-O结合时，所述可切割二硫基部分防止聚合酶催化与核苷酸类似物的3′-O的聚合酶反应，其中R6具有以下结构：
其中R8A和R8B独立地为氢、-CH3、-CX3、-CHX2、-CH2X、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基、或者取代或未取代的5-6元杂芳基，其中X为卤素；
其中R9、R10和R11各自独立地为氢、-CX3、-CHX2、-CH2X、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基、或者取代或未取代的5-6元杂芳基；
R5为锚部分，其中锚部分的身份是预定的并且与核碱基的身份相关，并且其中每种类型的核苷酸类似物的锚部分与每种其他核苷酸类似物互补于不同的锚结合部分；
b)使步骤a)中的核酸与至少第一种、第二种、第三种和第四种具有式R12-L4-R13的化合物接触，其中R12是互补的锚部分结合剂，其与锚部分快速反应从而与锚部分形成缀合物，其中每种类型化合物的锚部分结合剂与步骤a)的一种类型的核苷酸类似物的锚部分互补，其中L4是共价接头，R13是可检测的标签，其中每种类型的化合物具有与锚部分结合剂的身份相关的不同的可检测标签；
c)确定与步骤a)中掺入的核苷酸类似物结合的可检测标签的身份，从而确定掺入的核苷酸类似物的身份，
d)使核酸与切割剂接触，以便(i)切割连接至核碱基的可切割接头，和(ii)切割可切割的二硫基部分，从而在生长的DNA链上产生3′-OH；以及
e)针对待测序的核酸的每个核苷酸残基反复地执行步骤a)至d)，从而确定核酸的序列。
实施方案336.一种用于对核酸进行测序的方法，其包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的核酸与聚合酶和第一类、第二类、第三类和第四类的核苷酸类似物在如下的条件下接触：
如果核苷酸类似物与核酸的下述的核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻核酸中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物的条件下，以形成核酸延伸产物，其中所述核苷酸类似物具有以下结构：
其中L3为具有以下结构的可切割接头：
其中L2为接头；
其中B是核碱基，其中每种类型的核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种核苷酸类似物的碱基，其中一种碱基是胸苷或尿苷杂交碱基，一个碱基是腺苷杂交碱基，一种碱基是鸟苷杂交碱基，一种碱基是胞嘧啶杂交碱基；
R6为聚合酶相容的可切割二硫基部分，当与核苷酸类似物的3′-O结合时，所述可切割二硫基部分防止聚合酶催化与核苷酸类似物的3′-O的聚合酶反应，其中R6具有以下结构：
其中R8A和R8B独立地为氢、-CH3、-CX3、-CHX2、-CH2X、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基、或者取代或未取代的5-6元杂芳基，其中X为卤素；
其中R9、R10和R11各自独立地为氢、CX3、-CHX2、-CH2X、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基、或者取代或未取代的5-6元杂芳基；
其中对于第一种类型和第二种类型的核苷酸类似物，R5是锚部分，其中锚部分的身份是预定的并且与核碱基的身份相关，并且其中每种类型的核苷酸类似物的锚部分与每种其他核苷酸类似物互补于不同的锚结合部分；
其中对于第三种类型和第四种类型的核苷酸类似物，R5是可检测标签，其中第三种类型的核苷酸类似物的可检测标签不同于第四种类型；
b)去除未掺入的任何核苷酸类似物；
c)检测步骤a)中掺入的第三种类型或第四种类型的核苷酸类似物的任一种可检测标签的存在，以由此确定所并入的核苷酸的身份和核酸中互补残基的身份；
其中如果第三种类型和第四种类型核苷酸类似物的碱基不互补，则将步骤a)中的核酸与至少第一种和第二种具有式R12-L4-R13的化合物接触，其中R12是互补的锚部分结合剂，其与锚部分快速反应，从而与锚部分形成缀合物，其中第一类型化合物的锚部分结合剂与第一类核苷酸类似物的锚部分互补，第二类型化合物的锚部分结合剂与第二类核苷酸类似物的锚部分互补，其中L4是共价接头，且R13是可检测标签，其中第一类化合物和第二类化合物上的标签不同；
d)确定与步骤a)中掺入的核苷酸类似物结合的可检测标签的身份，从而确定掺入的核苷酸类似物的身份，
e)使核酸与切割剂接触，以便(i)切割连接至核碱基的可切割接头，和(ii)切割可切割的二硫基部分，从而在生长的DNA链上产生3′-OH；以及
f)针对待测序的核酸的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至e)，从而确定核酸的序列。
实施方案337.一种用于对核酸进行测序的方法，其包括：
a)使具有与其一部分杂交的引物的核酸与聚合酶和第一类、第二类、第三类和第四类的核苷酸类似物在如下条件下接触：
如果核苷酸类似物与核酸的下述的核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5’方向上紧邻核酸中与引物的3’末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则允许核苷酸聚合酶催化将核苷酸类似物掺入引物中，以形成核酸延伸产物，其中每种核苷酸类似物具有以下结构：
其中B是核碱基，其中L3为具有以下结构的可切割接头：
其中L2为接头；
R5是锚部分，其中锚部分的身份是预定的并且与核碱基的身份相关，并且其中每种类型的核苷酸类似物的锚部分与其余核苷酸类似物互补于不同的锚结合部分；
其中每种核苷酸类似物具有以下结构：
其中B是核碱基；
其中每种类型的核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种核苷酸类似物的碱基，其中一种碱基是胸苷或尿苷杂交碱基，一个碱基是腺苷杂交碱基，一种碱基是鸟苷杂交碱基，一种碱基是胞嘧啶杂交碱基；
第一、第二、第三和第四类型的核苷酸类似物各自的R6为聚合酶相容的可切割二硫基部分，当与核苷酸类似物的3′-O结合时，所述可切割二硫基部分防止聚合酶催化与核苷酸类似物的3′-O的聚合酶反应，其中R6具有以下结构：
其中R8A和R8B独立地为氢、-CH3、-CX3、-CHX2、-CH2X、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基、或者取代或未取代的5-6元杂芳基，其中X为卤素；
其中R9、R10和R11各自独立地为氢、CX3、-CHX2、-CH2X、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基、或者取代或未取代的5-6元杂芳基；
b)去除未掺入的任何核苷酸类似物；
c)将该核酸与具有式R12-L4-R13的第一种、第二种和第三种类型的化合物接触，
其中R12是互补的锚部分结合剂，其与锚部分快速反应，从而与锚部分形成缀合物，
其中第一类型化合物的锚部分结合剂与第一类型核苷酸类似物的锚部分互补，第二类型化合物的锚部分结合剂与第二类型核苷酸类似物的锚部分互补，第三类型化合物的锚部分结合剂与第三类型核苷酸类似物的锚部分互补，其中L4是可切割的接头，
每种类型化合物的L4不同；
d)除去任何未掺入的核苷酸或未缀合的锚部分结合剂，并检测是否缺少与步骤a)的掺入的核苷酸类似物结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸是否是第四类型的核苷酸类似物；
e)如果在步骤d)中检测到可检测标签，则使核酸与切割第一类型化合物的L4的物质(means)接触，其中所述物质不切割任何类型的核苷酸类似物的L3或R6，并且所述物质不切割第二种和第三种类型化合物的L4；
f)去除任何未结合的锚部分结合剂并检测是否缺乏与步骤a)的掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定结合的核苷酸的身份是第一类型的核苷酸类似物；
g)如果在步骤f)中检测到可检测标签，使所述核酸与切割第二类型化合物的L4的物质接触，其中所述物质不切割任何类型核苷酸类似物的L3或R6，并且所述手段不切割第三种类型化合物的L4；
h)去除任何未结合的锚部分结合剂并检测是否缺少与步骤a)的掺入的核苷酸结合的可检测标签，由此确定掺入的核苷酸的身份是第二种类型的核苷酸类似物；
i)使核酸与切割剂接触，以便(i)切割连接至核碱基的可切割接头，和(ii)切割可切割的二硫基部分，从而在生长的DNA链上产生3′-OH；以及
j)针对待测序的核酸的每个核苷酸残基重复地进行步骤a)至e)，从而确定核酸的序列。
实施方案338.实施方案333-337之一的方法，其中在步骤a)期间或之后，使核酸与四种不同类型的核苷酸类似物接触，每种核苷酸类似物具有以下结构：
其中B是核碱基；其中每种类型的核苷酸类似物的碱基独立地不同于其余三种核苷酸类似物的碱基，其中一种碱基是胸苷或尿苷杂交碱基，一个碱基是腺苷杂交碱基，一种碱基是鸟苷杂交碱基，一种碱基是胞嘧啶杂交碱基；
其中R8A和R8B独立地为氢、-CH3、-CX3、-CHX2、-CH2X、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基、或者取代或未取代的5-6元杂芳基，其中X为卤素；
其中R9、R10和R11各自独立地为氢、CX3、-CHX2、-CH2X、-OCH3、-SCH3、-NHCH3、-CN、-Ph、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2-6元杂烷基、取代或未取代的Cx-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基、取代或未取代的苯基、或者取代或未取代的5-6元杂芳基，其中X为卤素；
实施方案339.实施方案332-338之一的方法，其中锚部分和标记部分选自：
实施方案340.实施方案332-339之一的方法，其中所述互补的锚结合部分选自：
实施方案341.实施方案332-340之一的方法，其中L3具有以下结构：
实施方案342.一种合成具有以下结构的碱基连接的可切割接头的方法：
a)使3-三甲硅基-丙-2-炔-1-醇与DMSO、乙酸和乙酸酐反应以提供三甲基(3-((甲硫基)甲氧基)丙-1-炔-1-基)硅烷；
b)使三甲基(3-((甲硫基)甲氧基)丙-1-炔-1-基)硅烷与硫酰氯/环己烯接触，然后与硫代甲苯磺酸钾反应，生成S-(((3-(三甲基甲硅烷基)丙-2-炔-1-基)氧基)甲基)4-甲基硫代苯磺酸酯(methylbenzenesulfonothioate)；
c)随后使S-(((3-(三甲基甲硅烷基)丙-2-炔-1-基)氧基)甲基)4-甲基硫代苯磺酸酯与2，2，2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺在三乙胺存在下反应；
d)与四丁基氟化铵接触以形成2，2，2-三氟-N-(2-甲基-2-(((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)二硫基)丙基)乙酰胺。
e)使5′-O-tBDMS-3′-O-聚合酶相容的可切割保护基团-5(7)-碘-核苷与2，2，2-三氟-N-(2-甲基-2-(((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)二硫基)丙基)乙酰胺在Pd(0)、CuI、三乙胺的存在下反应，形成5′-O-tBDMS-3′-O-聚合酶相容的可切割保护基团-2′-脱氧核苷-5(7)-2，2，2-三氟-5-基)乙炔基)氧基)甲基)二硫基)-2-甲基丙基)乙酰胺。
f)将步骤e)的上述产物与四丁基氟化铵反应以除去5′-O-tBDMS基团，从而形成3′-O-聚合酶相容的可切割保护基团-2′-脱氧核苷-5(7)-2，2，2-三氟-5-基)乙炔基)氧基)甲基)二硫基)-2-甲基丙基)乙酰胺；
g)在允许形成3′-O-聚合酶相容的可切割保护基团-5(7-)-(3-(((1-氨基-2-甲基丙-2-基)二硫基)甲氧基)丙-1-炔-1-基)-2′-脱氧核苷-5′三磷酸的条件下，使步骤f)中产生的3′-O-聚合酶相容的可切割保护基团-2′-脱氧核苷-5(7)-2，2，2-三氟-5-基)乙炔基)氧基)甲基)二硫基)-2-甲基丙基)乙酰胺与2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、焦磷酸四丁铵、三丁胺、I2、吡啶和NH4OH接触。
实施例
实施例1.作为可逆终止物用于DNA合成测序的新的基于二硫键接头的核苷酸的设计与合成
我们首先证明四个3′-O-烷基二硫基甲基-dNTP(3′-O-DTM NRT)(图30A-30D)可以在单碱基延伸反应中延伸引物并终止其进一步延伸。使用这4种核苷酸类似物作为底物，我们进行了完整的4步SBS反应。我们使用MALDI-TOF MS分析来评价使单一3′-O-DTM-dNTP进入生长的DNA链的聚合酶延伸的结果(图30B和30D)。由于DTM标签的尺寸小，3′-O-DTM-dNTP是DNA聚合酶的有效底物。在SBS循环中，天然核苷酸在每次掺入和切割后恢复，产生没有修饰并且不会阻止进一步的聚合酶反应的生长DNA链。
我们还使用化学可切割的荧光核苷酸可逆终止物3′-O-DTM-dCTP-SS-BodipyFL进行类似的单碱基延伸和终止反应。在进行单碱基延伸以及从3′-O以及碱基和荧光团之间切割DTM部分后，可以用相同的核苷酸3′-O-DTM-dCTP-SS-BodipyFL进一步延伸得到的经延伸引物(图46)。这些结果清楚地表明可以同时掺入和切割多个NRT、3′-O-DTM-dNTP-SS-染料，从而进行长读段测序。
使用3′-O-乙基-SS-dNTP(3′-O-DTM-dNTP)的连续聚合酶延伸和通过MALDI-TOF质谱法进行的表征。为了验证在聚合酶反应中3′-O-DTM-dNTP以碱基特异性的方式准确掺入，在3′-O-DTM-dNTP作为底物的溶液中进行四次连续的DNA延伸和切割反应。这使得能够在每个步骤中分离DNA产物以进行详细的分子结构表征，如图30B所示。
我们进行了一个完整的连续4步SBS反应，涉及每个互补的3′-O-DTM-dNTP的掺入，然后进行MALDI-TOF MS分析用于序列测定，并从DNA延伸产物切割3′-O-DTM保护基团以产生游离的3′-OH基团用于掺入下一个核苷酸类似物。设计了模板-引物组合，其中接下来要添加的四种核苷酸是A、C、G和T。如图30B所示，用与DNA模板退火的13聚体引物引发SBS反应。当在聚合酶反应中使用第一互补核苷酸3′-O-乙基-SS-dATP(3′-O-DTM-dATP)时，将其掺入引物中以形成DNA延伸产物，通过MALDI-TOF MS证实出现单峰，DNA延伸产物的分子量为4387道尔顿(图30B(a)左上)。这些结果表明3′-O-DTM-dATP被定量掺入到13聚体DNA引物中。在进行THP处理以从DNA产物中除去DTM基团并进行HPLC纯化后，在4268Da处存在的单个MS峰证实了切割的进行，该单峰对应于去除3′-O-DTM基团的DNA产物(图30B(b)右上)。然后将新形成的具有游离3′-OH基团的DNA延伸产物用于第二聚合酶反应以掺入3′-O-Et-SS-dCTP(3′-O-DTM-dCTP)，在4675Da处产生单个MS峰(图30B(c))，表明在该循环中3′-O-DTM-dCTP被掺入生长的DNA链中。THP处理后，切割DNA产物的单个MS峰出现在4551Da处(图30B(d))，其证明从DNA延伸产物中完全去除DTM基团。图30B(左)显示3′-O-乙基-SS-dGTP(3′-O-DTM-dGTP)向生长的DNA链的第三次掺入。通过MALDI-TOF MS获得相应DNA产物的精确质量，第三核苷酸掺入的DNA产物为5002Da(图30B(e))，切割反应的DNA产物为4887Da(图30B(f))。最后，证实了在第四个循环中掺入了3′-O-乙基-SS-dTTP(3′-O-DTM-dTTP)并通过THP最终除去DTM基团，因为通过MALDI-TOF MS获得了相应的DNA产物的合适的分子量，第四核苷酸掺入的DNA产物的分子量为5301Da(图30B，(g))，切割反应的DNA产物的分子量为5194Da(图30B(h))，这些结果表明，在连续聚合酶反应中，所有4种3′-O-DTM-dNTP均以碱基特异性方式作为可逆终止物有效地掺入生长的DNA链，并且DNA延伸产物上的3′-OH加帽基团被THP定量切割。
使用3′-O-叔丁基-SS-dCTP-SS-BodipyFL(3′-O-DTM-dCTPSS-BodipyFL)的聚合酶延伸反应和通过MALDI-TOF质谱法进行的表征(图46)。聚合酶延伸反应由以下物质构成：20pmol合成DNA模板、60pmol引物(5′-TCTCTGGCCGCGTGTCT-3′)(SEQ ID NO：3)、100pmol单核苷酸可逆终止物(3′-O-叔丁基-SS-dCTP-SS-Bodipy)、1XThermoPol II反应缓冲液(纽英伦生物技术有限公司(New England Biolabs)，马萨诸塞州)、2单位的Therminator II DNA聚合酶、2nmol MnCl2和去离子水，总体积为20μL。在ABI GeneAmp PCR系统9700中进行反应，最初在94℃温育20秒，然后在80℃持续20秒、45℃持续30秒和65℃持续90秒的条件下进行38个循环。延伸反应后，延伸产物用乙醇沉淀，沉淀溶于10μL去离子水中。使用C18ZipTip柱(密理博公司(Millipore)，马萨诸塞州)将一部分延伸反应物脱盐，并通过MALDI-TOF MS(ABI Voyager，德拉维尔州)进行分析。用终浓度为5mM的THP(三(羟丙基)膦)处理剩余的大部分，并在65℃温育3分钟以重新生成3′-OH基团，以准备下一次延伸反应。如前所述将一小部分延伸产物进行脱盐并通过MALDI-TOF MS进行分析。剩余部分的延伸引物用于第二轮延伸反应(图46)。
使用3′-O-DTM-dNTP的合成测序反应：聚合酶延伸反应由以下物质构成：20pmol合成的51聚体DNA模板(5’GAGGCCAAGTACGGCGGGTACGTCCTTGACAATGTGTACATCAACATCACC-3’)(SEQ ID NO：9)、60pmol引物5’-CACATTGTCAAGG-3’)(SEQ ID NO：2)或先前经延伸和THP切割的DNA产物、100pmol单一3′-O-DTM核苷酸可逆终止物(3’-O-DTM-dATP、3’O-DTM-dCTP、3’-O-DTM-dGTP或3’-O-DTM-dTTP)、1×ThermoPol反应缓冲液(纽英伦生物技术有限公司，马萨诸塞州)、2单位的Therminator TM III DNA聚合酶和去离子水，总体积为20μL。在热循环仪(MJ Research，马萨诸塞州)中进行反应。在94℃初始温育20秒后，在80℃持续20秒、45℃持续40秒、65℃持续90秒的条件下进行36个循环的反应。
在延伸反应之后，使用C18 ZipTip柱(密理博公司，马萨诸塞州)将小的等份反应产物脱盐并通过MALDI-TOF MS(ABI Voyager，德拉维尔州)进行分析。将剩余的产物在真空下浓缩并通过反相HPLC在XTerra MSC18、2.5μm 4.6mm×50mm柱(沃特世公司，马萨诸塞州)上纯化以获得纯的延伸产物。流动相：A，8.6mM三乙胺/100mM 1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇的水溶液(pH8.1；B，甲醇。在40℃以0.5mL/min的流速进行洗脱，并且从88％A/12％B至65.5％A/34.5％B线性梯度进行90分钟。纯化产物用于随后的聚合酶延伸反应。
使用THP从DNA延伸产物中除去3′-O-DTM基团以重新3′-OH基团的切割反应通过以下步骤进行：将100pmol延伸产物溶解于10μL 5mM三(2-羟丙基)膦(THP)溶液(pH9.0)，并在65℃孵育3分钟。在1mL去离子水中稀释并在具有Ultracel-3膜(密理博公司)的AmiconUltra-0.5离心过滤器装置中脱盐，之后使用2μL所得溶液来获得MALDI-TOF质谱。在如上进一步反相HPLC之后，在随后的聚合酶延伸反应中将每种切割产物用作引物。图30A-30D显示了四步连续的核苷酸加成。
3’-O-乙基二硫基甲基-2’-脱氧核苷-5’-三磷酸(3’-O-DTMdNTP)的合成：3’-O-乙基二硫基甲基-dTTP(7a)的合成(图47)：
3’-O-甲硫基甲基-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(2a)：向搅拌的5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(1a，1.07g，3mmol)的DMSO溶液(10mL)中加入乙酸(2.6mL，45mmol)和乙酸酐(8.6mL，90mmol)。在室温下搅拌反应混合物直至反应完成(48h)，通过TLC对反应进行监测。然后在剧烈搅拌下将混合物缓慢加入到饱和碳酸氢钠溶液中并用乙酸乙酯萃取(3×30mL)。将合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干燥，并将化合物通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷：1∶2)纯化得到纯的产物2a(0.97g，74％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.16(s，1H)，7.48(s，1H)，6.28(m，1H)，4.62(m，2H)，4.46(m，1H)，4.10(m，1H)，3.78-3.90(m，2H)，2.39(m，1H)，2.14(s，3H)，1.97(m，1H)，1.92(s，3H)，0.93(s，9H)，0.13(s，3H)；HRMS(FAB+)C18H33N2O5SSi[(M+H)+]：计算值417.1879，实验值：417.1890。
3’-O-乙基二硫基甲基-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(5a)：将3’-O-甲硫基甲基-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(2a，453mg，1.09mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)中，然后加入三乙胺(0.18mL，1.31mmol，1.2当量)和分子筛(
2g)。将混合物在室温下搅拌30分钟后，在冰浴中冷却，然后在2分钟内逐滴加入硫酰氯(重蒸馏，0.1mL，1.31mmol，1.2当量)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。除去冰浴并将反应混合物再搅拌30分钟。然后将对甲苯硫代磺酸钾(375mg，1.65mmol，1.5当量)的无水DMF溶液(2mL)加入混合物中。在室温下再继续搅拌1小时，然后加入乙硫醇(0.17mL，2.2mmol，2当量)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟并快速过滤通过硅藻土。用二氯甲烷洗涤过滤器并浓缩有机部分。通过快速柱层析(乙酸乙酯/己烷：2∶1)纯化残余物得到纯的产物5a(261mg，52％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.66(br.s，1H)，7.49(s，1H)，6.30(dd，J＝7.2，11.2Hz，1H)，4.83(dd，J＝15.2，37.2Hz，2H)，4.49(d，J＝8.0Hz，1H)，4.14(d，J＝3.2Hz，1H)，3.80(m，2H)，2.77(dd，J＝10.0，19.6Hz，2H)，2.47(m，1H)，2.03(m，1H)，1.93(s，3H)，1.35(t，J＝8.8Hz，2H)，0.95(s，9H)，0.14(s，6H).13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ164.00，150.59，135.61，111.35，85.33，79.76，77.98，77.81，63.89，38.10，33.64，26.33，18.74，14.84，12.89，-4.85，-5.03。
3’-O-乙基二硫基甲基胸苷(3’-O-DTM-T，6a)：将3′-O-乙基二硫基甲基-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(5a，240mg，0.52mmol)溶于无水THF(10mL)，加入四丁基氟化铵的THF溶液(1.0M，1.04mL，1.04mmol，1.5当量)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应物真空浓缩将反应物真空浓缩，加入饱和NaHCO3溶液(50mL)，并用二氯甲烷提取混合物(3x20mL)。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，用快速柱层析(二氯甲烷/甲醇：20/1)纯化所得粗产物得到3′-O-乙基二硫基甲基胸苷6a(119mg，66％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.44(s，1H)，6.15(t，J＝8.8Hz，1H)，4.83(dd，J＝11.4，23.4Hz，2H)，4.46(m，1H)，4.12(m，2H)，3.80(m，2H)，2.77(dd，J＝7.5，14.7Hz，2H)，2.34(m，2H)，2.04(s，1H)，1.90(s，3H)，1.34(t，J＝7.5Hz，3H).13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ164.37，150.88，137.26，111.53，87.20，85.29，78.52，62.82，37.49，33.59，14.85，12.89.HRMS(ESI+)C13H20N2O5S2Na[(M+Na)+]：计算值：371.0711，实验值：371.0716。
3’-O-乙基二硫基甲基-dTTP(3’-O-DTM-TTP 7a)：将3’-O-乙基二硫基甲基胸苷(6a，50mg，0.14mmol)、四丁基焦磷酸铵(197mg，0.36mmol，2.5当量)和2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(44mg，0.22mmol，1.5eq)在室温下在高真空下分别干燥过夜。在氩气中将四丁基焦磷酸铵溶于二甲基甲酰胺(DMF，1mL)，然后加入三丁胺(1mL)。在氩气中将该混合物注入2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF溶液中(DMF，2mL)。在搅拌1h后，将反应混合物加入3’-O-乙基二硫基甲基胸苷的溶液中，在室温下再搅拌1h。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物中直至观察到永久的棕色。10分钟后，加入水(30mL)，将反应混合物在室温下再搅拌2小时。所得溶液用乙酸乙酯提取(2x30mL)。将水层在真空下浓缩至约20mL，转移至离心管(50mL)。将盐水(1.5mL)和无水乙醇(35mL)加入到每个管中，然后剧烈摇动。在-80℃下放置2小时后，将管离心(以4200rpm的速度离心10分钟)，得到粗产物，为白色沉淀。倒出上清液，用5ml水稀释白色沉淀，并于4℃在DEAE-SephadexA-25上通过离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)进行纯化。通过反相HPLC进一步纯化粗产物，得到7a。HRMS(ESI-)C13H22N2O14S2P3[(M-H)-]：计算值：586.9725，实验值：586.9727。31P-NMR(121.4MHz，D2O)：δ-10.83(s，1P)，-10.98(s，1P)，-20.53(t，J＝21Hz，1P)。
方案2. 3’-O-乙基二硫基甲基-dGTP(9b)的合成：
N2-二甲基亚胺甲基氨基-2′-脱氧鸟苷(2b)：向2′-脱氧鸟苷(1b，1.33g，5mmol)的无水DMF(20mL)悬浮液中加入N，N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛mL，11mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。除去溶剂并将残余物与甲醇一起研磨并过滤。用甲醇洗涤固体，得到白色固体2b(90％，1.44g)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.28(s，1H)，8.57(s，1H)，8.04(s，1H)，6.26(dd，J＝7.9，6.1Hz，1H)，5.30(d，J＝3.8Hz，1H)，4.93(t，J＝5.5Hz，1H)，4.40(dt，J＝5.8，2.8Hz，1H)，3.85(td，J＝4.5，2.5Hz，1H)，3.56(m，2H)，3.17(s，3H)，3.04(s，3H)，2.60(m，1H)，2.25(m，1H)。
二甲基亚胺甲基氨基-5′-O-DMT-2′-脱氧鸟苷(3b)：将N2-DMF-2′-脱氧鸟苷(2b，1.38g，4.3mmol，1当量)溶于无水吡啶(30mL)，加入4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(1.74g，5.2mmol，1.2当量)。在室温下搅拌4小时后，将反应混合物倒入饱和碳酸氢钠溶液(200mL)中，抽滤收集沉淀物，用水和己烷洗涤。将得到的粗产物通过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇：30/1)纯化，得到N2-DMF-5′-O-DMT-2′脱氧鸟苷3b(1.84g，69％)，为白色固体。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.13(s，1H)，8.57(s，1H)，7.71(s，1H)，7.3(m，2H)，7.34-7.20(m，6H)，7.18(t，J＝2.8Hz，1H)，6.90-6.72(m，4H)，6.40(t，J＝6.6Hz，1H)，4.64(m，1H)，4.15(m，1H)，3.81(m，1H)，3.78(m，6H)，3.43(dd，J＝10.1，4.8Hz，1H)，3.32(dd，J＝10.1，5.0Hz，1H)，3.11(s，3H)，3.06(s，3H)，2.65-2.48(m，2H)。
N2-二甲基亚胺甲基氨基-3’-O-甲基硫基甲基-5′-O-DMT-2′-脱氧鸟苷(4b)：向搅拌的N2-DMF-5′-O-DMT-2′-脱氧鸟苷(1.33g，2.1mmol)的DMSO溶液(10mL)中加入乙酸(2.1mL，36mmol)和乙酸酐(5.4mL，56mmol)，在室温下搅拌反应混合物直至反应完成(24h)，通过TLC对反应进行监测。然后在剧烈搅拌下将混合物缓慢加入到碳酸氢钠溶液中并用乙酸乙酯(3×30mL)萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干，并将所需化合物通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷：1/2)纯化得到纯的产物4b(1.27g，88％)，为白色固体。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.73(s，1H)，8.58(s，1H)，7.73(s，1H)，7.47-7.38(m，2H)，7.37-7.17(m，7H)，6.87-6.77(m，4H)，6.33(dd，J＝7.7，6.1Hz，1H)，4.72-4.63(m，3H)，4.25-4.18(m，1H)，3.80(s，6H)，3.34(m，2H)，3.14(s，3H)，3.09(s，3H)，2.64-2.48(m，2H)，2.13(s，3H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ158.96，158.69，158.50，150.61，144.88，136.19，136.02，130.41，128.49，128.33，127.35，120.85，113.61，86.96，84.19，83.64，74.01，64.05，55.65，41.74，38.31，35.61，14.26。
N2-二甲基亚胺甲基氨基-3’-O-乙基二硫基甲基-5′-O-DMT-2′-脱氧鸟苷(7b)：将N2-DMF-3’-O-甲基硫基甲基-5′-O-DMT-2′-脱氧鸟苷(684mg，1.0mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)，随后加入三乙胺(0.17mL，1.2mmol，1.2当量)和分子筛(
2g)。将混合物在室温下搅拌30分钟后，在冰浴中冷却，然后在2分钟内滴加硫酰氯(0.095mL，1.2mmol，1.2当量)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。除去冰浴并将反应混合物再搅拌30分钟。然后将4-甲苯硫代磺酸钾(341mg，1.5mmol，1.5当量)的无水DMF(2mL)溶液中加入到混合物中。继续在室温下继续搅拌1小时，然后加入乙硫醇(0.16mL，2.0mmol，2当量)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，并迅速过滤通过硅藻土。用二氯甲烷洗涤过滤器并浓缩有机部分。将残余物通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷：2/1)纯化得到纯的产物7b(255mg，35％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.55(s，1H)，8.58(s，1H)，7.73(s，1H)，7.47-7.38(m，2H)，7.37-7.27(m，6H)，7.27-7.18(m，1H)，6.88-6.79(m，4H)，6.34(t，J＝7.0Hz，1H)，4.86(s，2H)，4.65(m，1H)，4.25(m，1H)，3.80(d，J＝0.9Hz，6H)，3.44-3.28(m，2H)，3.16-3.07(s，3H)，3.10(s，3H)，2.75(qd，J＝7.4，0.7Hz，2H)，2.62-2.54(m，2H)，1.29(t，J＝13.5，4H).13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ158.99，158.50，157.30，150.57，144.84，136.06，135.95，130.41，128.47，128.36，127.38，120.88，113.65，87.04，84.12，83.61，79.68，78.48，64.02，55.65，41.74，38.34，35.60，33.60，14.87，14.59。
3’-O-乙基二硫基甲基-2′-脱氧鸟苷(8b)：将N2-DMF-3’-乙基二硫基甲基-5I-O-DMT-2′-脱氧鸟苷(280mg，0.38mmol)、氢氧化铵(10mL)和甲醇(10mL)的混合物在室温下搅拌直至反应完全(4h)。通过TLC对反应进行监测。在减压下蒸发溶剂后，粗品固体用含3％三氯乙酸的二氯甲烷溶液处理10分钟。然后在剧烈搅拌下将混合物缓慢加入到碳酸氢钠溶液中并用乙酸乙酯(3×30mL)萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干，并通过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇：20/1)纯化所需化合物，得到3′-乙基二硫基甲基-2′脱氧鸟苷8b(72mg，51％)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ10.61(s，1H)，7.93(s，1H)，6.45(bs，2H)，6.07(dd，J＝8.5，5.7Hz，1H)，5.06(bs，1H)，4.95(s，2H)，4.51(d，J＝5.3Hz，1H)，3.99(m，1H)，3.55(d，J＝4.3Hz，2H)，2.80(q，J＝7.3Hz，2H)，2.72-2.56(m，1H)，2.43-2.39(m，1H)，1.28(t，J＝7.3Hz，3H).HRMS(ESI+)C13H19N5O4S2Na[(M+Na)+]：计算值：396.0776，实验值：396.0770。
3’-O-乙基二硫基甲基-dGTP(9b)：合成步骤类似于7a的合成。在三个圆底烧瓶中在高真空、室温条件下将3’-乙基二硫基甲基-2′脱氧鸟苷(8b，64mg，0.17mmol)、四丁基焦磷酸铵(238mg，0.44mmol，2.5当量)和2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(53mg，0.27mmol，1.5当量)分别干燥过夜。在氩气中将四丁基焦磷酸铵溶于二甲基甲酰胺(DMF，1mL)，然后加入三丁胺(1mL)。在氩气中将混合物注入2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF溶液(2mL)。在搅拌1h后，将反应混合物加入3’-O-乙基二硫基甲基胸苷的溶液中，并在室温下再搅拌1h。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物中直至观察到永久的棕色。10分钟后，加入水(30mL)，将反应混合物在室温下再搅拌小时。所得溶液用乙酸乙酯提取(2x30mL)。水层在真空下浓缩至约20mL，转移至离心管(50mL)。将盐水(1.5mL)和无水乙醇(35mL)加入到每个管中，然后剧烈摇动。在-80℃放置2小时后，离心(以4200rpm的速度离心10分钟)得到粗产物，为白色沉淀。倒出上清液，用5ml水稀释白色沉淀，并在4℃通过DEAE-SephadexA-25阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)进行纯化。通过反相HPLC进一步纯化粗产物，得到9b。
3)3’-O-乙基二硫基甲基-dATP(8c)的合成(图48)：N6-苯甲酰-5′-O-三苯甲基-2′-脱氧腺苷(2c)：将N6-苯甲酰-2′-脱氧腺苷(1c，1.07g，3.0mmol，1当量)溶于无水吡啶(30mL)，加入三苯甲基氯(1.00g，3.6mmol，1.2当量)。在室温下搅拌1天后，将反应混合物倒入饱和碳酸氢钠溶液(200mL)，抽滤收集沉淀，并用水和己烷洗涤。通过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇：30/1)纯化获得的粗产物，得到N6-苯甲酰-5′-O-三苯甲基-2′-脱氧腺苷2c(1.45g，81％)，为白色固体。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.12(s，1H)，8.74(s，1H)，8.15(s，1H)，8.08-8.00(m，2H)，7.62(m，1H)，7.52(m，2H)，7.46-7.38(m，6H)，7.34-7.20(m，9H)，6.50(t，J＝6.5Hz，1H)，4.74(d，J＝4.7Hz，1H)，4.19(td，J＝4.8，3.5Hz，1H)，3.49-3.42(m，2H)，2.90(m，1H)，2.58(m，1H)。
N6-苯甲酰-3’-O-甲基硫基甲基-5′-O-三苯甲基-2′-脱氧腺苷(3c)：向搅拌的N6-苯甲酰-5′-O-三苯甲基-2′-脱氧腺苷(1.72g，2.93mmol)的DMSO溶液(10mL)中加入乙酸(2.8mL，48mmol)和乙酸酐(72mL，75mmol)。在室温下搅拌反应混合物直至反应完成(24h)，通过TLC对反应进行监测。然后将混合物在剧烈搅拌下缓慢加入到碳酸氢钠溶液中并用乙酸乙酯萃取(3×30mL)。合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干，并通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷：1/2)纯化所需化合物得到纯的产物3c(1.35g，71％)，为白色固体。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.07(s，1H)，8.74(s，1H)，8.19(s，1H)，8.05(dt，J＝7.2，1.4Hz，2H)，7.67-7.49(m，3H)，7.49-7.39(m，6H)，7.36-7.22(m，9H)，6.48(dd，J＝7.6，6.0Hz，1H)，4.79(m，1H)，4.66(m，2H)，4.31(td，J＝4.8，2.7Hz，1H)，3.51-3.38(m，2H)，2.89(m，1H)，2.64(m，1H)，2.15(s，3H).13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ165.03，153.03，151.82，149.88，143.87，141.78，134.05，133.19，129.27，129.02，128.35，128.28，127.67，123.83，87.52，85.43，85.59，76.85，74.05，63.98，37.94，30.13，14.27。
N6-苯甲酰-3’-O-乙基二硫基甲基-5′-O-三苯甲基-2′-脱氧腺苷(6c)∶将3’-O-甲基硫基甲基-5′-O-三苯甲基-2′-脱氧腺苷(3c，861mg，1.31mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)，随后加入三乙胺(0.19mL，1.5mmol，1.2当量)和分子筛(
2g)。将混合物在室温下搅拌0.5小时后，在冰浴中冷却，然后在2分钟内逐滴加入硫酰氯(0.11mL，1.5mmol，1.2当量)的无水二氯甲烷溶液(3mL)。除去冰浴，将反应混合物再搅拌30分钟。然后将对甲苯硫代磺酸钾(595mg，2.62mmol，1.5当量)的无水DMF溶液(3mL)加入混合物。继续在室温下再搅拌1小时，随后加入乙硫醇(0.47mL，6.55mmol，2当量)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，并快速过滤通过硅藻土。用二氯甲烷洗涤过滤器并对有机部分进行浓缩。通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷：2/1)纯化残余物得到纯的产物6c(615mg，67％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.04(s，1H)，8.74(s，1H)，8.18(s，1H)，8.05(d，J＝7.2Hz，2H)，7.67-7.59(m，1H)，7.59-7.50(m，2H)，7.50-7.38(m，6H)，7.36-7.21(m，9H)，6.47(dd，J＝7.8，5.9Hz，1H)，4.90(s，2H)，4.75(dt，J＝5.4，2.5Hz，1H)，4.35(td，J＝4.9，2.5Hz，1H)，3.45(m，2H)，3.00-2.86(m，1H)，2.85-2.71(m，2H)，2.68(m，1H)，1.33(t，J＝7.4，3H)。
N6-苯甲酰-3’-O-乙基二硫基甲基-2′-脱氧腺苷(7c)：在室温下用3％三氯乙酸的二氯甲烷溶处理N6-苯甲酰-3’-乙基二硫基甲基-5′-O-三苯甲基-2′-脱氧腺苷(6c，381mg，0.54mmol)10分钟。然后将混合物在剧烈搅拌下缓慢加入到碳酸氢钠溶液中并用乙酸乙酯萃取(3×30mL)。合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干，并对所需化合物的残余物通过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇：20/1)进行纯化得到7c(169mg，68％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.18(s，1H)，8.77(s，1H)，8.71(s，1H)，8.10-8.02(m，2H)，7.66(t，J＝7.6Hz，1H)，7.56(t，J＝7.6Hz 2H)，6.47(dd，J＝8.0，6.0Hz，1H)，5.15(t，J＝5.5Hz，1H)，5.00(s，2H)，4.65(dt，J＝5.4，2.4Hz，1H)，4.12(td，J＝4.7，2.2Hz，1H)，3.72-3.55(m，2H)，3.02-2.88(m，1H)，2.84(q，J＝7.3Hz，2H)，2.61(m，1H)，1.40-1.15(m，3H).13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ166.47，152.83，152.47，151.27，143.87，134.22，133.30，129.33，126.78，86.18，84.79，79.35，78.80，62.37，36.93，33.04，15.21。
3’-O-乙基二硫基甲基-dATP(8c)：将化合物7c(100mg，0.22mmol)和质子海绵(60mg，0.28mmol)在真空干燥器中用P2O5干燥过夜并溶于磷酸三甲酯(2ml)中。将新鲜蒸馏的POCl3(30μL，0.32mmol)逐滴加入，并将混合物在0℃下搅拌2小时。将三丁基焦磷酸三钠(452mg，0.82mmol)和三丁胺(450uL，1.90mmol)在无水DMF(1.9mL)中的溶液在室温下加入一部分，并将溶液再搅拌30分钟。加入三乙基碳酸氢铵溶液(TEAB，0.1M；pH8.0；10mL)并将混合物在室温下搅拌1小时。然后加入浓NH4OH(10mL)并在室温下继续搅拌3小时。将混合物真空浓缩，将粗产物在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)在4℃下进行纯化，随后通过反相HPLC进一步纯化得到8c。
3’-O-乙基二硫基甲基-dCTP(3’-O-DTM-dCTP，7d)的合成(图49)：N4-苯甲酰-3′-O-甲基硫基甲基-′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧胞苷(2d)：向搅拌的N4-苯甲酰-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧胞苷(1.5g，3.37mmol)的无水DMSO溶液中(6.5ml)加入乙酸(2.9ml)和乙酸酐(9.3ml)。将混合物在室温下搅拌2天，然后通过加入饱和NaHCO3溶液(50ml)猝灭反应。反应混合物用乙酸乙酯提取(50mL×3)，合并的有机层用无水Na2SO4干燥。通过快速柱层析(乙酸乙酯：己烷为8：2)纯化浓缩后的粗产物得到白色粉末(1.26g，74％)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ8.50(d，J＝7.5Hz，1H)，8.05-7.97(m，2H)，7.72-7.61(m，2H)，7.61-7.52(m，2H)，6.23(t，J＝6.3Hz，1H)，4.81-4.71(m，2H)，4.58(dt，J＝6.4，3.3Hz，1H)，4.24(q，J＝3.1Hz，1H)，4.02(dd，J＝11.5，3.3Hz，1H)，3.91(dd，J＝11.5，2.8Hz，1H)，2.75-2.59(m，1H)，2.24(dt，J＝13.9，6.3Hz，1H)，2.18(s，3H)，0.98(s，9H)，0.19(d，J＝3.3Hz，6H).HRMS(APCI+)C24H35N3O5SSi[(M+H)+]：计算值：506.2145，实验值：506.2124。
N4-苯甲酰-3′-O-乙基二硫基甲基-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧胞苷(5d)：向搅拌的2d(612mg，1.21mmol)的无水二氯甲烷溶液(10ml)中加入三乙胺(168μL，1.21mmol)和4A分子筛(1g)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后在冰浴中冷却。将溶于无水二氯甲烷(5ml)的SO2Cl2(98μL，1.21mmol)逐滴加入混合物。然后去除冰浴，将反应混合物在室温下搅拌30分钟。将溶于无水DMF(625μL)的对甲苯硫代磺酸钾(425mg，1.9mmol)加入反应混合物，再搅拌30分钟后，加入乙硫醇(174μL，2.4mmol)并在室温下继续再搅拌30分钟。将反应混合物过滤，浓缩，然后用饱和碳酸氢钠和二氯甲烷提取(3×50mL)。用Na2SO4干燥有机相，浓缩并通过快速柱层析使用乙酸乙酯-己烷从5∶5(v/v)至8∶2(v/v)的梯度进行纯化，得到563.2mg(84％)白色泡沫。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ8.55-8.42(m，1H)，8.00(dt，J＝8.4，1.1Hz，2H)，7.70-7.45(m，4H)，6.23(q，J＝6.9，6.4Hz，1H)，5.01-4.88(m，2H)，4.56(tt，J＝6.5，3.1Hz，1H)，4.30-4.19(m，1H)，4.00(m，J＝11.4，3.2，0.8Hz，1H)，3.94-3.76(m，1H)，2.81(qd，J＝7.3，0.9Hz，2H)，2.76-2.68(m，1H)，2.31-2.17(m，1H)，1.40-1.25(m，3H)，1.00-0.85(m，9H)，0.21-0.03(m，6H).HRMS(APCI+)C25H37N3O5S28i[(M+Na)+]：计算值：574.1841，实验值：574.1826。
N4-苯甲酰-3′-O-乙基二硫基甲基-2′-脱氧胞苷(6d)：向搅拌的5d(526mg，0.95mmol)在四氢呋喃(3ml)和甲醇(9ml)混合物中的溶液中加入少量NH4F(1.8g)粉末并在室温下搅拌3天。将粗产物浓缩并通过快速柱层析使用乙酸乙酯-己烷从2∶8(v/v)至7∶3(v/v)的梯度进行纯化，得到白色固体粉末(233mg，56％)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ8.54(d，J＝7.5Hz，1H)，8.04-7.97(m，2H)，7.71-7.43(m，4H)，6.25(t，1H)，5.01-4.89(m，2H)，4.56(dt，J＝6.0，3.0Hz，1H)，4.23(q，J＝3.4Hz，1H)，3.92-3.76(m，2H)，2.84(q，J＝7.3Hz，2H)，2.71(m，J＝13.9，5.9，2.9Hz，1H)，2.31-2.19(m，1H)，1.36(t，J＝7.3Hz，3H).HRMS(APCI+)C19H23N3O5S2[(M+H)+]：计算值：438.1157，实验值：438.1136。
3′-O-乙基二硫基甲基)-dCTP(7d)：将化合物6d(60mg，0.14mmol)和质子海绵(40mg，0.19mmol)在真空干燥器中用P2O5干燥过夜，溶于磷酸三甲酯(1ml)并在冰浴中冷却。逐滴加入新鲜蒸馏的POCl3(19μL，0.2mmol)，并在0℃下搅拌2小时。将三丁基焦磷酸铵(255mg，0.47mmol)和三丁胺(27.6uL，0.12mmol)在无水DMF(1.5mL)中的混合物在室温加入一部分，然后再搅拌30分钟。加入三乙基碳酸氢铵溶液(TEAB)(0.1M；pH8.0；7.5mL)并将混合物在室温下搅拌1小时。然后加入浓NH4OH(7.5mL)并在室温下继续搅拌过夜。将混合物真空浓缩，通过阴离子交换层析在DEAE-Sephadex A-25上在4℃下使用TEAB(pH 8.0；0.1-1.OM)梯度对粗产物进行纯化，随后通过反相HPLC进一步纯化以提供7d。
氨基丙炔基-3’-O-叔丁基二硫基甲基-2’-脱氧核苷-5’三磷酸的合成(PA-3’-O-DTM-dNTP，图50)：5-(3-氨基丙炔基)-3’-O-叔丁基二硫基甲基-dCTP(5-PA-3’-O-DTM-dCTP)。
N4-DMF-5-碘-2′-脱氧胞苷(2)：在室温下搅拌5-碘-2′-脱氧胞苷(1，1.25g，3.5mmol)和N，N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(1.25mL，9.1mmol)在无水DMF(20mL)中的混合物过夜。在这段时间后，除去溶剂，将残余物用甲醇研磨并过滤。用甲醇洗涤固体，得到白色固体2(88％，1.25g)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.57(s，1H)，8.46(s，1H)，6.10(t，J＝6.4Hz，1H)，5.21(d，J＝4.3Hz，1H)，5.11(t，J＝5.0Hz，1H)，4.24(p，J＝4.8，4.1Hz，1H)，3.83(q，J＝3.4Hz，1H)，3.71-3.53(m，2H)，3.21(s，3H)，3.13(s，3H)，2.21(dt，J＝13.7，5.0Hz，1H)，2.04(dt，J＝12.9，6.3Hz，1H)。
N4-DMF-5-碘-5′-O-三苯甲基-2′-脱氧胞苷(3)：将N4-DMF-5-碘-2′-脱氧胞苷(2，0.93g，2.3mmol，1当量)溶于无水吡啶(30mL)，加入三苯甲基氯(0.78g，2.8mmol，1.2当量)。在室温下搅拌1天后，反应混合物倒入饱和碳酸氢钠溶液(200mL)，过滤收集沉淀物，并用水和己烷洗涤。通过柱层析(二氯甲烷/甲醇：30/1)纯化获得的粗产物，得到N4-DMF-5-碘-5′-O-三苯甲基-2′-脱氧胞苷3(1.12g，75％)，为白色固体。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.59(s，1H)，8.13(s，1H)，7.45(m，6H)，7.30(m，6H)，7.26(m，3H)，6.13(t，J＝6.0Hz，1H)，5.29(d，J＝4.5Hz，1H)，4.23(td，J＝6.8，5.5，3.2Hz，1H)，3.94(m，1H)，3.28-3.18(m，5H)，3.14(d，J＝0.8Hz，3H)，2.28(ddd，J＝13.3，6.0，3.3Hz，1H)，2.18-2.06(m，1H)。
N4-DMF-5-[3-(三氟乙酰氨基)丙炔基]-5′-O-三苯甲基-2′-脱氧胞苷(4)：在氮气下将N4-DMF-5-碘-5′-O-三苯甲基-2′-脱氧胞苷(244mg，0.375mmol，1.2当量)、CuI(20mg，0.11mmol)和三乙胺(0.15mL)在无水DMF(5mL)中的混合物在室温下搅拌5分钟，然后加入N-炔丙基三氟乙酰胺(0.2g，1.36mmol)和Pd(PPh3)4(50mg，0.04mmol)。在室温下避光搅拌过夜后，在剧烈搅拌下将反应混合物逐滴加入盐水(200mL)中，抽滤收集沉淀，并用水和己烷洗涤。所得粗产物通过柱层析(100％乙酸乙酯，然后二氯甲烷/甲醇：30/1)纯化得到N4-DMF-5-[3-(三氟乙酰氨基)丙炔基]-5′-O-三苯甲基-2′-脱氧胞苷4(199mg，79％)，为淡黄棕色固体。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.97(t，J＝5.5Hz，1H)，8.62(s，1H)，8.03(s，1H)，.45(m，6H)，7.30(m，6H)，7.26(m，3H)，6.14(t，J＝6.6Hz，1H)，5.32(d，J＝4.5Hz，1H)，4.26(dq，J＝7.8，3.8Hz，1H)，4.06(d，J＝5.5Hz，2H)，4.04-3.94(m，1H)，3.29(m，1H)，3.20(s，3H)，3.16(m，1H)，3.09(s，3H)，2.29(m，1H)，2.14(m，1H)。
N4-DMF-5-[3-(三氟乙酰氨基)丙炔基]-5′-O-三苯甲基-3’-O-甲基硫基甲基-2′脱氧胞苷(5)：在搅拌下向N4-DMF-5-[3-(三氟乙酰氨基)丙炔基]-5′-O-三苯甲基-2′-脱氧胞苷(4，1.47g，2.19mmol)的DMSO(10mL)溶液中加入乙酸(2.3mL，39mmol)和乙酸酐(6.1mL，64mmol)。在室温下搅拌反应混合物直至反应完成(24h)，通过TLC对反应进行监测。然后在剧烈搅拌下将混合物加入到碳酸氢钠溶液中，抽滤收集沉淀物，并用水和己烷洗涤。所得粗产物通过柱层析二氯甲烷/甲醇：30/1)纯化得到纯的产物5(1.22g，77％)，为白色固体。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.81(s，1H)，8.47(s，1H)，7.48(m，6H)，7.34(m，6H)，7.25(m，3H)，6.31(t，J＝6.3Hz，1H)，6.24(s，1H)，4.66(m，1H)，4.61(m，2H)，4.16(m，1H)，3.90(m，2H)，3.54(dd，J＝10.8，2.9Hz，1H)，3.29(dd，J＝10.8，3.4Hz，1H)，3.18(d，J＝4.5Hz，6H)，2.70(m，J＝13.9，6.2，3.9Hz，1H)，2.25(dt，J＝13.8，6.4Hz，1H)，2.05(s，3H)。
N4-DMF-5-[3-(三氟乙酰氨基)丙炔基]-5′-O-三苯甲基-3’-O-(叔丁基二硫甲基)-2′脱氧胞苷(7)：将N4-DMF-5-[3-(三氟乙酰氨基)丙炔基]-5′-O-三苯甲基-3’-O-甲基硫基甲基-2′脱氧胞苷(5，1.05g，1.74mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)，随后加入三乙胺(0.3mL)和分子筛(3A，2g)。将混合物在室温下搅拌0.5小时后，在冰浴中冷却，然后在2分钟内逐滴加入硫酰氯(0.16mL)的无水二氯甲烷溶液(3mL)。除去冰浴，将反应混合物再搅拌30分钟。然后将对甲苯硫代磺酸钾(620mg)的无水DMF溶液(3mL)加入该混合物。在室温下继续搅拌1小时，随后加入叔丁基硫醇(0.38mL，)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时，并快速过滤通过硅藻土。用二氯甲烷洗涤过滤器并对有机部分进行浓缩。通过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇：30/1)对残余物进行纯化得到粗产物7。
5-[3-(三氟乙酰氨基)丙炔基]-3’-O-(叔丁基二硫甲基)-2′-脱氧胞苷(8)：将粗产物N4-DMF-5-[3-(三氟乙酰氨基)丙炔基]-5′-O-三苯甲基-3’-O-(叔丁基二硫甲基)-2′脱氧胞苷7溶于二氯甲烷，并在室温下用3％三氯乙酸溶液处理10分钟。在搅拌下将混合物缓慢加入碳酸氢钠的饱和溶液并用乙酸乙酯提取(3×30mL)。合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干并通过柱层析(二氯甲烷/甲醇：30/1)纯化所需化合物的残余物得到8(206mg，由5进行制备的产率为23％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.88(bs，1H)，8.77(s，1H)，8.17(bs，1H)，8.03(s，1H)，6.20(bs，1H)，6.12(t，J＝6.4Hz，1H)，4.80(m，2H)，4.52(m，1H)，4.32(m，2H)，4.17(d，J＝2.4Hz，1H)，3.97-3.83(m，2H)，2.52(m，1H)，2.25(m，1H)，1.30(s，9H).HRMS(Fab+)C19H26F3N4O5S2(M+H)+]：计算值：511.1297，实验值：511.1288。
5-(3-三氟乙酰氨基丙炔基)-3’-O-叔丁基二硫基甲基-dCTP(9)：在高真空下将5-[3-(三氟乙酰氨基)丙炔基]-3’-O-(叔丁基二硫基甲基)-2′-脱氧胞苷(8，70mg，0.14mmol)、2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(44mg，0.22mmol)和四丁基焦磷酸铵(197mg，0.36mmol)分别干燥过夜。在氩气下，将四丁基焦磷酸铵溶于DMF(1mL)中，随后加入三丁胺(1mL)。将混合物注入2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF(2mL)溶液。在搅拌1h后，将反应混合物加入3’-O-叔丁基二硫甲基胸苷的溶液，于室温下再搅拌1h。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)加入反应混合物直至观察到永久的棕色。10分钟后，加入水(30mL)，将反应混合物在室温下再搅拌2小时。所得溶液用乙酸乙酯提取(2x30mL)。水层在真空下浓缩至约20mL，转移至离心管(50mL)。将盐水(1.5mL)和无水乙醇(35mL)加入到每个管中，然后剧烈摇动。在-80℃下放置2小时后，将管离心(以4200rpm的速度离心10分钟)，得到粗产物，为白色沉淀，用5mL水和5mL氢氧化铵稀释白色沉淀。将反应混合物在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂后，将该混合物在DEAE-SephadexA-25上通过阴离子交换层析使用TEAB梯度(pH8.0；0.1-1.0M)在4℃下进行纯化。粗产物通过反相HPLC进一步纯化得到9。
其他三种核苷酸5-(3-氨基丙炔基)-3’-O-叔丁基二硫基甲基-dTTP、7-(3-氨基丙炔基)-3’-O-叔丁基二硫基甲基-7-脱氮-2’-dATP和7-(3-氨基丙炔基)3’-O-叔丁基二硫甲基-7-脱氮-2’-dGTP的合成按照上述相同的步骤进行。
接头的合成、染料与接头的连接以及与PA-3’-O-DTM-dNTP进行的偶联反应以得到3’-O和碱基被保护的3′-O-DTM-dNTP-SS-染料终止物(图43和图45)。
3-(甲硫基)甲氧基)丙腈(2)。向搅拌的3-羟基丙腈(1，3g，42.3mmol)的干燥DMSO(78ml)溶液中，加入乙酸(36ml)和乙酸酐(120ml)。将混合物在室温下搅拌2天，然后通过加入饱和NaHCO3溶液(150ml)猝灭反应。用乙酸乙酯提取(150mL x 3)水溶液，用无水Na2SO4干燥合并的有机相。对粗产物2进行浓缩，并通过快速柱层析(乙酸乙酯∶己烷8∶2)进行纯化。得到浅黄色油状物(2.41g，44％)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ4.69(s，2H)，3.77(t，J＝6.2Hz，2H)，2.65(t，J＝6.3Hz，2H)，2.19(s，3H)。
Fmoc-NH-PEG4-SH(5).将Fmoc-NH-PEG4-NHS酯(200mg，0.34mmole)溶于4ml DCM，然后加入2-氨基乙硫醇盐酸盐(38.8mg，0.37mmole)和DIPEA(0.24ml，1.36mmol)。在室温下将反应混合物搅拌4h。然后减压蒸发溶剂。使用硅胶柱(DCM/甲醇，10/1)纯化产物。除去溶剂后得到无色浆状的化合物5。MALDI---TOF MS实验值：548；计算值：546.6。
S-(2-氰基乙氧基)甲基)4-甲基硫代苯磺酸酯(3)和化合物6：向搅拌的2(50mg，0.38mmol)的无水二氯甲烷(3.75ml)溶液中加入环己烷(195μL，1.92mmol)。将反应混合物在冰浴中冷却。向混合物中逐滴加入SO2Cl2(34.5μL，0.42mmol)。然后去除冰浴，将反应混合物在室温下搅拌30分钟。将溶于无水DMF(3mL)的对甲苯硫代磺酸钾(87mg，0.38mmol)加入反应混合物得到3，再搅拌1小时后，加入Fmoc-NH-PEG4-SH(5，197mg，2.4mmol)的无水二氯甲烷(0.5ml)溶液，接着在室温下再搅拌1h。对反应混合物进行浓缩，向残余物中加入DCM(2ml)以溶解该将状物，在0℃加入15倍(体积)的乙酸乙酯以形成沉淀。使用离心法收集沉淀得到粗产物6。使用HPLC(C18柱，洗脱梯度：在40分钟内B从A溶液中的10％变化到80％，A：0.1％TFA的水溶液，B：乙腈)纯化产物，除去溶剂得到纯的产物6，为无色浆状物。MALDI---TOF MS实验值：663；计算值：661.6。
水解6得到化合物7：将化合物6(20mg)溶于600μl乙腈中，加入200μlTEA，将反应混合物在室温下振摇16h。然后使溶剂和TEA蒸发至干，加入100μl二氯甲烷(DCM)以溶解残余物。将乙醚(1.2ml)加入该DCM溶液使得能够形成沉淀。使用离心将沉淀旋至下部，弃去上清液。该DCM溶解-乙醚沉淀过程重复3次。彻底除去溶剂得到产物7，为白色固体。MALDI--TOFMS实验值：442，计算值：439。
Bodipy加成(8)：将化合物7(8mg)溶于DMF(0.2ml)，加入Bodipy NHS酯(5mg，溶于300μl甲醇)。在加入1μl TEA后，振摇反应混合物4h。蒸发出去溶剂，并通过HPLC纯化产物(C-18反相柱，洗脱梯度：在40分钟内B从A中的10％变至80％，A：0.1％TFA的水溶液，B：乙腈)。收集含有产物的级分，合并并干燥，得到产物8。MALDI-TOF MS实验值：714，计算值：714.2。
将CN水解生成COOH(9)：将化合物8(4mg)溶于PBS缓冲液(100mM，pH 7.5)和甲醇(400μl/100μl)的混合溶液，然后加入0.5mg腈水解酶(溶于10μl PBS)。将反应混合物在37℃孵育器中振摇24h，再加入0.5mg腈水解酶。将反应混合物在孵育器中保持3天。使用HPLC纯化最终产物9(C-18反相柱，洗脱梯度：在40分钟内B从A中的0％变至50％，A：HFIP-TEA缓冲液，B：甲醇)。TOF---MALDI MS实验值(M+1)：735；计算值：733.2。
3’-O-叔丁基-二硫基甲基-dCTP-SS-BodipyFL(3’-O-DTM-dCTP-SS-BodipyFL)(10)：将化合物9(1mg)溶于DMF(200μl)，加入DSC(0.4mg)和DIPEA(0.6μl)。将反应混合物振摇1小时后，将其加入3’-O-SS-dCTP-PA-NH2(先前方案中的化合物9)在0.1MNa2CO3/NaHCO3缓冲液(pH8.8)中的300μl溶液。振摇混合物6h，加入0.4ml0.1M TEAC缓冲液(pH8)。将所得溶液进行DEAE离子交换纯化。使用0.1M至0.8M的TEAC缓冲液(pH8)梯度对柱子进行洗脱。收集含产物的级分并浓缩。使用HPLC来纯化最终产物(C-18反相柱，洗脱梯度：在40分钟内B从A中的0％变至50％A：HFIP-TEA缓冲液，B：甲醇)。TOF-MALDI MS实验值(M+1)：1370；计算值：1365。
其他三种可逆终止物，即3’-O-SS-叔丁基-dUTP-S-S-R6G(3’-O-DTM-dUTP-SS-R6G)、3’-O-SS-叔丁基-dATP-S-S-ROX(3’-O-DTM-dATP-SS-ROX)和3’-O-SS-叔丁基-dGTP-S-S-Cy5(3’-O-DTM-dGTP-SS-Cy5)的合成按照与在3’-O-SS-叔丁基-dCTP-S-S-BodipyFL(3’-O-DTM-dCTP-SS-BodipyFL)所述的方法基本相同的方法进行。
实施例2.作为可逆终止物用于DNA合成测序的可切割基团修饰的核苷酸类似物
我们设计并合成了新的染料标记的3′-O-DTM dNTP，其中染料-DTM部分通过更短的接头更紧密地连接到碱基上(图1A-1B、图2)，从而使得在掺入和切割后碱基上留下一个小得多的尾巴，这大大促进了即将发生的酶促反应。此外，我们已经设计并描述了通过DTM接头将小的“锚”部分连接至核碱基的核苷酸类似物(图3B)。由于将较小的基团连接到核碱基上将显著降低对识别作为底物的这些分子的干扰，所以在SBS中这些NRT被更有效地掺入生长的DNA链中。核苷酸掺入后，与荧光染料连接的相应的标记结合分子将与DNA延伸产物上的锚正交反应。在该DNA延伸产物上荧光染料的成像将鉴定掺入的核苷酸从而进行序列测定。图1B和图4A-4D显示了将这些分子用于SBS的一般方案。
锚部分包括各种正交反应性或亲和性官能团，例如生物素、叠氮化物、反式环辛烯(TCO)和苯基硼酸(PBA)(图5)，它们将分别特异性且有效地与以下物质结合或与其反应：链霉亲和素、二苯并环辛炔(DBCO)29，30、四嗪(TZ)31，32和水杨基异羟肟酸(SHA)33(图6、图7)。DNA聚合酶将容易地把这些3′-O-锚修饰的核苷酸掺入到生长的DNA链以终止DNA合成。将标记的结合分子(例如不同荧光团标记的链霉亲和素、DBCO、TZ和SHA)添加至相应的引物延伸产物导致标记的结合分子与引物延伸产物上的相应“锚”部分正交结合；在洗去未结合的标记分子后，检测连接到引物延伸产物的3′末端的特有标签以确定掺入的核苷酸的身份。标记部分可以包含使得能够在SBS中进行高灵敏度检测的多个荧光团，可能用于单分子SBS。
除了使用上述核苷酸类似物进行四色SBS外，这些分子还允许在单分子水平或整体水平上进行的一系列的新的DNA测序方法，包括单色或2-色SBS。除了将单一染料连接到标记的结合分子上，也可以通过与携带多种染料的标记的结合分子(或用多种染料标记的树枝状聚合物)缀合，将多种染料连接到掺入的核苷酸上(图9A-9C、图10)，从而可以实现荧光信号的放大以促进通过SBS对DNA延伸产物进行的单分子检测。锚标记的NRT在这方面特别有优势。小的锚连接的NRT可通过聚合酶被更加有效地掺入，并且后续使用大取代基(例如染料标记的树枝状大分子和FRET盒)的标记反应(图11A-11D、图12)将实现高灵敏度检测或甚至单分子检测。可通过将结合分子连接至由具有不同发射的两种不同的荧光染料形成的荧光共振能量转移(FRET)盒实现2-色SBS，其产生四种不同的FRET信号特征以鉴定四种DNA碱基(A、C、G、T)34，35。如果每个标记的结合分子如下构建：使用用于标记DNA延伸产物的特有的可切割接头与染料报道基团缀合，则可以使用不同的切割方法从DNA延伸产物中选择性去除染料；因此检测到的信号变化将在单分子水平或整体水平上确定掺入的核苷酸以进行SBS。已知的可切割接头工具箱[偶氮36-38、二甲基缩酮39，40、Dde((4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基)41，42、烯丙基和硝基苄基3，4，8，9]可用于形成标记的结合分子与报道分子染料之间的连接。通过分别使用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、弱酸、肼(N2H4)、Pd(0)和光照的温和处理，可以在特定条件下容易地切割这些接头。
为了使用上述染料或锚标记的NRT完善测序技术，我们设计并合成了3′-O-DTM-dNTP及其衍生物(参见图33、图34)。这些3′-O-DTM-dNTP与染料或锚标记的3′-O-DTM-dNTP组合使用以实现DNA测序反应8，10和步移策略43的同步化，从而大大增加了测序读段长度和准确度。
使用MALDI-TOF MS分析在聚合酶反应中使用上述核苷酸类似物所产生的DNA延伸产物(图29A-29H、图30B和图31)。我们确定这些3′-O-DTM核苷酸类似物及其衍生物是DNA聚合酶终止DNA合成的有效底物。这些结果还证实在水溶液中可将荧光团(或锚部分)和3′-O-DTM基团在一步中高效除去。此外，使用表面固定的DNA上的3′-O-SS-dNTP-(SS)可切割接头-染料和3′-O-SS-dNTP(图24A-24B)获得准确的4色测序数据(图32)。
本文描述了各种新的DNA测序方法，其基于3′-O-DTM-dNTP、3′-O-dNTP-SS-染料、3′-O-dNTP-SS-锚及其正交报道分子染料标记的结合分子对应物或可切割的报道分子染料标记的结合对应物的组合使用。
对使用3′-O-DTM-dNTP-SS-标签(锚)的DNA合成测序方法的描述。3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料、3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-锚和3′-O-SS(DTM)-dNTP以及与荧光染料缀合(或使用不同的可切割连接与荧光染料缀合)的正交结合分子的组合使用使得能够构建用于单分子水平或整体水平上的四色、2-色和单色DNA SBS的多种新方法。
单色DNA SBS(图4A-4D).图4A-4D显示使用3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-生物素和Cy5标记的链霉亲和素的单色SBS方案。通过使用四种3′-O-SS-dNTP-SS-生物素(图3)之一进行DNA聚合酶掺入反应，然后加入Cy5标记的链霉亲和素并成像以确定DNA序列，如步骤1至步骤4中所述(如图4.1所示，并在图4.2、4.3和4.4中重复(见图4A-4D))。每一步使用不同的被添加的核苷酸类似物并且每一步由三部分组成：(部分a)加入聚合酶和四种3′-O-SS-dNTP-SS-生物素中的一种，然后洗涤；如果添加的核苷酸与模板上紧邻引物3′末端的核苷酸互补，则添加的核苷酸将被掺入引物中以产生在3′末端具有生物素的DNA延伸产物。(部分b)加入Cy5标记的链霉亲和素，其将在DNA延伸产物的3′末端与生物素结合。(部分c)洗去未结合的Cy5标记的链霉亲和素后，进行成像以检测Cy5信号从而鉴定掺入的核苷酸。请注意，在这种单染料SBS方法中，每次添加一种核苷酸。四种3′-O-SS-dNTP-SS-生物素中只有一种将被掺入且随后被Cy5-链霉亲和素标记。在步骤4之后，向DNA延伸产物添加THP将切割二硫键并在DNA延伸产物的3′端重新生成游离的3′-OH基团。同时，连接在核苷酸碱基上的染料或锚将被移除。按顺序重复由步骤1至步骤4组成的该过程，然后进行THP切割，以连续进行序列测定。多种Cy5染料可以连接到链霉亲和素上，实现高灵敏度检测，如单分子SBS。
四色DNA SBS(图8).使用3’-O-SS(DTM)-dNTP-SS-“锚”(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP-SS-TCO、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP-SS-PBA、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP-SS-生物素、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dUTP-SS-N3)(图5)和四种相应匹配的染料标记的结合分子(Rox标记的四嗪、Alexa488标记的SHA、Cy5标记的链霉亲和素和R6G标记的二苯并环辛炔)(图6)进行SBS。向经固定的带有引物的DNA模板中加入DNA聚合酶以及4种3’-O-SS(DTM)-dNTP-SS-“锚”(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP-SS-TCO、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP-SS-PBA、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP-SS-生物素、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dUTP-SS-N3)使得互补的核苷酸类似物能够掺入生长的DNA链中以终止DNA合成。洗去未掺入的核苷酸类似物后，加入染料标记的结合分子；这些分子将与每个DNA延伸产物3′末端处的四种特有的“锚”部分中的每一种特异性地连接，使得能够用四种不同的荧光染料标记由四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的每一种终止的每个DNA产物。检测来自DNA产物上的每种荧光染料特有的荧光信号以鉴定掺入的核苷酸。接下来，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH基团，为进行下一个DNA测序循环反应做好准备(如图8的后续步骤所示)。
图7显示DNA产物之间的缀合物或复合物的形成，该DNA产物通过使用四种相应匹配的标记结合分子(Rox-标记的四嗪、Alexa488-标记的SHA、Cy5-标记的链霉亲和素和R6G-标记二苯并环辛炔)将“锚”标记的核苷酸(3′-O-叔丁基二硫基-dATP-SS-TCO、3′-O-叔丁基二硫基甲基-dCTP-SS-PBA、3′-O-叔丁基二硫基甲基-dGTP-SS-生物素、3′-O-叔丁基二硫甲基-dUTP SS-N3)掺入而产生。
由多种染料(例如荧光树状聚合物)组成的标记分子(图9A-9C和图10)和荧光能量转移盒(图11A-11D和12)可用于大大地提高这些SBS方法的灵敏度以及简化光学设置。
2-色DNA SBS(图14A-14B)：图14显示使用3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3′-O-SS-dATP-SS-Rox和3′-O-SS-dCTP-SS-Alexa488)、3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-锚(3′-O-SS-dUTP-SS-N3和3′-O-SS-dGTP-SS-TCO)及其相应的染料标记的结合分子(Rox-四嗪和BodipyFL-二苯并环辛炔)(图13)进行2-色DNA SBS的方案。将DNA聚合酶和4种核苷酸类似物(3′-O-SS-dATP-SS-Rox、3′-O-SS-dCTP-SS-Alexa488、3′-O-SS-dUTP-SS-N3和3′-O-SS-dGTP-SS-TCO)加入到经固定的带有引物的DNA模板中能够使互补的核苷酸类似物掺入生长的DNA链以终止DNA合成(步骤1)。在洗去未掺入的核苷酸类似物后，检测来自Rox和Alexa488的荧光信号，以将掺入的核苷酸鉴定为A(用Rox标记)或C(用Alexa488标记)。然后将染料标记的结合分子(Rox-四嗪和Alexa488-二苯并环辛炔)加入到DNA延伸产物中(步骤2)，其将与每个DNA延伸产物的3′末端的碱基上的两种特有的“锚”部分(TCO和N3)特异性连接，以使用两种不同的荧光染料标记由两种核苷酸类似物(G和T)中的每一种终止的每个DNA产物(用Rox标记G并用Alexa488标记T)。检测来自Rox或Alexa488的DNA延伸产物上新产生的特有荧光信号(除了来自步骤1的信号外)，以将新掺入的核苷酸分别鉴定为G或T。接下来，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH基团(步骤3)，这为下一个循环的DNA测序反应(如图14A-14B的后续步骤所示)做好准备。
使用3′-O-可切割基团-dNTP-可切割接头-标签、3′-O-可切割基团-dNTP-可切割接头-锚和3′-O-可切割基团-dNTP(图16A-16B)与经由不同的可切割接头与荧光染料缀合的标记结合分子(图15A-15B)的组合使得能够构建单分子或整体分子水平上的单色SBS。在掺入3′-O-DTM-dNTP-SS-“锚”和3′-O-DTM-dNTP后，使用与荧光染料(ATTO647N、Cy5、Rox等)通过不同的可切割连接(偶氮、Dde、硝基苄基、二甲基缩酮等)(图15A-15B)缀合的正交标记的结合分子进行处理使得在DNA延伸产物的3′末端的碱基上具有锚的所有掺入的核苷酸由于特异性锚-结合分子反应而被标记。进行连续的特异性切割，然后进行成像，以从DNA延伸产物的3′端去除染料，从而能够准确检测信号变化。每种切割方法仅切割与标记的结合分子之一特异性连接的一种类型的接头，因此可使用每种切割方法来编码针对该特定核苷酸类似物的其相应锚部分上的DNA碱基之一。通常，四种DNA碱基(A、C、G、T)中只有三种需要具有标签以进行选择性检测。一旦这些碱基中的前三种碱基被标记，第四种碱基不需要标签来与其他三种进行区分以进行序列测定，如以下方案中所举例说明的。
碱基连接的二硫基甲基连接物的合成方法：
连接到碱基部分的可切割二硫基甲基接头的结构如下：
所述合成包括：
使3-三甲基硅基-丙-2-炔-1-醇与DMSO、乙酸和乙酸酐反应以提供三甲基(3-((甲硫基)甲氧基)丙-1-炔-1-基)硅烷；
使三甲基(3-((甲硫基)甲氧基)丙-1-炔-1-基)硅烷与磺酰氯/环己烯接触，然后与硫代甲苯磺酸钾反应生成S-(((3-(三甲基甲硅烷基)丙-2-炔-1-基)氧基)甲基)4-甲基硫代苯磺酸酯；
在三乙胺存在的条件下使S-(((3-(三甲基甲硅烷基)丙-2-炔-1-基)氧基)甲基)4-甲基硫代苯磺酸酯与2，2，2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺接触，然后
与四丁基氟化铵接触以形成2，2，2-三氟-N-(2-甲基-2-(((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)二硫基)丙基)乙酰胺。
该方法还提供：
使5′-O-tBDMS-3′-O-聚合酶相容的可切割保护基团-5(7)-碘-核苷与2，2，2-三氟-N-(2-甲基-2-(((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)二硫基)丙基)乙酰胺在Pd(0)、CuI、三乙胺存在下反应，形成5′-O-tBDMS-3′-O-聚合酶相容的可切割保护基团-2′-脱氧核苷-5(7)-2，2，2-三氟-5-基)乙炔基)氧基)甲基)二硫基)-2-甲基丙基)乙酰胺。
将步骤e)的上述产物与四丁基氟化铵反应以除去5′-O-tBDMS基团，从而形成3′-O-聚合酶相容的可切割保护基团-2′-脱氧核苷-5(7)-2，2，2-三氟-5-基)乙炔基)氧基)甲基)二硫基)-2-甲基丙基)乙酰胺；
在允许形成3′-O-聚合酶相容的可切割保护基团-5(7-)-(3-(((1-氨基-2-甲基丙-2-基)二硫基)甲氧基)丙-1-炔-1-基)-2′-脱氧核苷-5′三磷酸的条件下，使步骤f)中产生的3′-O-聚合酶相容的可切割保护基团-2′-脱氧核苷-5(7)-2，2，2-三氟-5-基)乙炔基)氧基)甲基)二硫基)-2-甲基丙基)乙酰胺与2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、焦磷酸四丁铵、三丁胺、I2、吡啶和NH4OH接触。
使用选择性接头切割去除染料的单色DNA SBS(图17A-17B).1.在DNA聚合酶存在下，将三种锚修饰核苷酸[3′-SS(DTM)-dATP-SS-N3、3′-SS(DTM)-dUTP-SS-TCO、3′-SS(DTM)dCTP-SS-生物素]和3′-叔丁基-SS(DTM)-dGTP，如图16所示]添加到带有引物的DNA模板以使得能够掺入到引物中。2.通过添加DBCO-偶氮-(-N＝N-接头)-ATTO647N、四嗪-Dde(接头)-ATTO647N和链霉亲和素-ATTO647N(图16A-16B所示)至含有掺入的锚修饰的核苷酸类似物的DNA延伸产物中来连接荧光标签(例如ATTO647N)，这使得所有掺入的核苷酸(除G外)因特异性锚-结合分子相互作用而在其碱基处被标记。3.洗涤后，进行第一轮成像，有A、C和T终止的DNA产物显示相同的颜色，而不发出信号的DNA产物由G终止。4.通过用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)处理来进行第一次切割(I)，其仅切割偶氮连接以从由A核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料。进行第二轮成像。如果荧光信号在切割I后消失，则确定DNA产物掺入了A核苷酸。5.通过用肼(N2H4)处理来进行第二次切割(II)，肼(N2H4)将切割Dde连接以从由T核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料。进行第三轮成像。如果切割II后荧光信号消失，则确定DNA产物掺入了T核苷酸。通过推断确定具有未改变的荧光信号的DNA产物由C核苷酸终止。6.用THP进行第三次切割(III)以切割二硫键并除去C上的染料，因此THP处理后信号的变化证实DNA产物由C核苷酸终止。同时，THP处理也将切割DTM(SS)键以在所有DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH，这为随后的单色DNA SBS循环做好准备。7.重复步骤1-6以继续随后的单色DNA SBS循环。
使用减少数量的用于去除染料的选择性切割反应的单色DNASBS(图19)
在DNA聚合酶的存在下，将碱基上具有锚的两种核苷酸[(3′-O-SS(DTM)-dUTP-SS-N3、3′-O-SS(DTM)-dCTP-SS-生物素)]、3′-O-SS(DTM)-dATP-SS-Rox和3′-O-叔丁基-SS(DTM)-dGTP[如图18所示]添加到带有引物的DNA模板中以使得能够掺入引物。
洗涤后，进行第一轮成像，由A核苷酸类似物终止的DNA产物显示Rox信号，因此确定已掺入A核苷酸，而由G、C、T终止的其他DNA产物不会显示任何荧光信号。
通过将DBCO-偶氮-(-N＝N-接头)-Rox和链霉亲和素-ROX(如图18所示)添加到含有掺入的锚修饰的核苷酸类似物的DNA延伸产物中来连接荧光标记(例如Rox)，这使得所有掺入的核苷酸(除G外)因特异性锚-结合分子相互作用而在其3′末端的碱基上被标记。
洗涤后，进行第二轮成像，以A、C和T中止的DNA产物全部显示相同的Rox信号，而不发出信号的DNA产物是由G核苷酸终止的。
通过用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)处理来进行第一次切割(I)，其仅切割偶氮连接以从由T核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第二轮成像。如果Rox荧光信号在切割I后消失，则确定DNA产物掺入了T核苷酸。
用THP进行第二次切割(II)以切割二硫键并从由核苷酸A和C终止的DNA延伸产物中去除染料，因此根据THP处理后信号的变化确定DNA产物由C核苷酸终止，因为由A终止的DNA产物已经在上述第一轮成像中被确定。同时，THP处理也将切割DTM(SS)键以在所有DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH，这位随后的单色DNA SBS循环做好准备。重复步骤1-6以继续后续的单色DNA SBS循环。
使用全部标记的核苷酸的单色DNA SBS，其中使用选择性连接体切割以除去染料(图21A-21F)。1.在DNA聚合酶存在下，将三种锚修饰的核苷酸[3′-O-SS(DTM)-dGTP-SS-N3、3′-O-SS(DTM)-dCTP-SS-生物素、3′-O-SS(DTM)-dUTP-SS-TCO)]和3′-O-SS(DTM)-dATP-SS-Rox[如图20A-20B所示]添加到带有引物的DNA模板以使得能够掺入到引物中。2.洗涤后，进行第一轮成像，由A核苷酸类似物终止的DNA产物显示Rox信号，因此确定已经掺入了A，而其他由G、C、T终止的DNA产物将会不显示任何荧光信号。3.通过将DBCO-偶氮-(-N＝N-接头)-Rox、四嗪-Dde-Rox和链霉亲和素-ROX(如图20A-20B所示)添加到含有掺入的锚核苷酸类似物的DNA延伸产物中来连接荧光标记物(例如Rox)，这使得所有掺入的核苷酸都因特异性锚-结合分子相互作用而在其碱基处被标记。4.洗涤后，进行第二轮成像，由A、G、T、C终止的DNA产物都显示相同的Rox信号。从在第一轮成像中确定的由A核苷酸终止的DNA产物中减去Rox信号揭示了由G、T、C终止的DNA产物。5.通过用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)处理来进行第一次切割(I)，其仅切割偶氮连接以从由G核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第二轮成像。如果Rox荧光信号在切割I后消失，则确定DNA产物掺入了G核苷酸。6.用肼(N2H4)进行第二次切割(II)，其将切割Dde键以从由T核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第三轮成像。如果Rox荧光信号在切割II后消失，则确定DNA产物掺入了T核苷酸。如果Rox荧光信号在切割II后保留，则确定DNA产物已经掺入C核苷酸。7.用THP进行第三次切割(III)以切割二硫键并从由核苷酸A和C终止的DNA延伸产物中去除Rox染料，因此在THP处理后信号的变化证实DNA产物由C核苷酸终止，因为已经在上述第一轮成像中确定了由A核苷酸终止的DNA产物。同时，THP处理也将切割DTM(SS)键以在所有DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH，这为随后的单色DNA SBS循环做好准备。重复步骤1-7以继续随后的单色DNASBS循环。
使用特有的可切割染料标记的dNTP的单色DNA SBS(图23A-23D)。1.在DNA聚合酶存在下，将三种3′-O-可切割基团-dNTP-可切割的接头-标签[3′-O-SS(DTM)-dATP-SS-Rox、3′-O-SS(DTM)-dUTP-烯丙基-ROX、3′-O-SS(DTM)-dCTP-硝基苄基-ROX]和3′-O-叔丁基-SS-dGTP[如图22所示]添加到带有引物的DNA模板以使得能够掺入到引物中。2.洗涤后，进行第一轮成像，由C、T和A终止的DNA产物全部显示相同的Rox信号，而不发出信号的DNA产物是由G终止的。3.通过在
处的光照射进行第一次切割(I)以从由C核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第二轮成像。如果Rox荧光信号在切割I后消失，则确定DNA产物掺入了C核苷酸。4.使用Pd(0)进行第二次切割(II)，其将切割烯丙基连接以从由T核苷酸终止的DNA产物中除去荧光染料Rox。进行第三轮成像。如果Rox荧光信号在切割II后消失，则确定DNA产物掺入了T核苷酸。如果Rox荧光信号在切割II后保留，则确定DNA产物已经掺入了A核苷酸。5.用THP进行第三次切割(III)以切割二硫键并从由核苷酸A终止的DNA延伸产物中除去Rox染料，因此在THP处理后信号的变化证实DNA产物终由A终止。同时，THP处理也将切割DTM(SS)键以在所有DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH，这为随后的单色DNA SBS循环做好准备。重复步骤1-4以继续随后的单色DNASBS循环。
所有上述示例性测序方法都可通过包括使用未标记的核苷酸可逆终止物(例如通过使用本文所述的3′-O-叔丁基-SS-dNTP)的追加步骤8，10来修饰。在该步骤中，在使用3′-O-可切割基团-dNTPs-可切割的接头-标签和3′-O-可切割的基团-dNTPs-可切割的接头-锚的每步聚合酶延伸反应后，使用3′-O-叔丁基-SS-dNTPs来进行聚合酶延伸以确保在3′-末端的完全引物延伸以进行整体SBS。
具有追加的四色DNA SBS(图25A-25F)：使用3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP-SS-Rox、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP-SS-Alexa488、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP-SS-Cy5、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dUTP-SS-R6G)和4种3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dNTP(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)(图24A-图24B)的方案显示在图25A-25F中。步骤1，将DNA聚合酶和四种3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP-SS-Rox、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP-SS-Alexa488、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP-SS-Cy5、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dUTP-SS-R6G)加入经固定的带引物的DNA模板以使得能够将互补的染料标记的核苷酸类似物掺入生长的DNA链。生长的DNA链是由具有四种不同的荧光染料的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的每一种终止的。步骤2，将DNA聚合酶和四种3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dNTP(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定的带引物的DNA模板以使得能够将互补的3′-O-SS-核苷酸类似物掺入生长的DNA链中，所述生长的DAN链在步骤1中未被染料标记的3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dNTP中的一种延伸，该过程被定义为追加。生长的DNA链是由具有四种不同荧光染料的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种或四种追加核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种终止的。洗去未掺入的核苷酸类似物(步骤3)后，检测DNA产物上每种荧光染料特有的荧光信号可鉴定掺入的核苷酸以进行序列测定(步骤4)。接下来，在步骤5中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH基团，这为下一个循环的DNA测序反应做好准备。与碱基标记的NRT相比，没有碱基修饰的追加NRT可以更有效地掺入DNA中，并且在去除3′-保护基团后，DNA延伸产物上没有疤痕，这两者都可产生更高的准确性和长的读段。
没有追加的四色DNA SBS(图26A-26F)。使用3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP-SS-Rox、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP-SS-Alexa488、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP-SS-Cy5、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dUTP-SS-R6G)(图24A-24B)且没有追加的方案显示在图26A-26F中。步骤1，将DNA聚合酶和四种3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP-SS-Rox、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP-SS-Alexa488、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP-SS-Cy5、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dUTP-SS-R6G)加入经固定的带引物的DNA模板以使得能够将互补的染料标记的核苷酸类似物掺入生长的DNA链。生长的DNA链是由被四种不同的荧光染料标记的四种核苷酸类似物(A、C、G、T)中的每一种终止的。在洗涤以除去未掺入的染料标记的核苷酸类似物(步骤2)后，检测来自DNA产物上的每种荧光染料特有的荧光信号(步骤3)以鉴定掺入的核苷酸从而进行序列测定。接下来，在步骤4中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而出去荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成游离的3′-OH基团，这为下一个循环的DNA测序反应做好准备。
使用混合的标记的和未标记的可逆终止物的四色DNA SBS(图27A-27B)。使用3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP-SS-Rox、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP-SS-Alexa488、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP-SS-Cy5、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dUTP-SS-R6G)和4种3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dNTP(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)(图24A-图24B)的SBS。步骤1，将DNA聚合酶和四种3′-O-SS(DTM)-dNTP-SS-染料(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP-SS-Rox、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP-SS-Alexa488、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP-SS-Cy5、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dUTP-SS-R6G)和4种3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dNTP(3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dATP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dCTP、3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dTTP和3′-O-叔丁基二硫基甲基(SS)-dGTP)加入经固定的带引物的DNA模板以使得能够将互补的核苷酸类似物掺入生长的DNA链。标记的NRT和未标记的NRT的比例可以从低于1：9到高于9：1。该生长的DNA链由四种不同的荧光染料标记的或未被染料标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)中的每一种终止，在洗去(步骤2)未掺入的核苷酸类似物后，检测来自DNA产物上的每种荧光染料特有的荧光信号(步骤4)以鉴定所掺入的核苷酸。接下来，在步骤4中，用THP处理DNA产物以切割SS接头，从而去除荧光染料并在DNA延伸产物上重新生成的游离的3′-OH基团，这为下一个循环的DNA测序反应做好准备。
步移和测序组合的方法，其使用标记的NRT和未标记的NRT的组合来获得更长的总读取长度(图28A-28B)。步移方法旨在获得比单独使用SBS更长的序列运行。在可能妨碍长的读段的问题中，包括掺入的核苷酸的碱基上存在化学“疤痕”，这将最终阻止进一步的延伸，在整体SBS中不可避免地损失同步化，即使在采用追加式“填充”反应的情况下也是如此。简而言之，如图28A-28B所示，通过例如使用任何上述策略(单色、2-色或4-色)和核苷酸类似物或任何其他SBS测序方法，将通过合成反应的测序进行至所需长度(30-100个或更多的核苷酸)。随后，将延伸的引物从模板链中剥离，并将原始引物重新退火至模板链上。接下来，使用全部没有任何荧光标记的三种天然核苷酸和一个可逆终止物(dATP、dCTP、dTTP和3′-O-叔丁基-SS-dGTP作为实例)将引物延伸至模板中与可逆终止物互补的下一个碱基(本例中为C)的位置。在对保护基团进行切割(在该实例中使用THP)以重新生成3′OH基团后，进行相同的延伸反应以达到模板中随后的C，并再次除去所得到的3′保护基团。重复几轮步移和切割以靠近第一轮测序结束的位置(这是根据测序基因组中的G的百分比估算的)。然后进行使用荧光NRT的第二轮SBS以获得进一步的序列延伸。如果需要，然后重复变性步骤以剥离延伸的引物并用原始引物再次替换它。进行新一轮步移以达到第二个序列段的末端。这个过程可以重复多次，所得到的序列是一轮测序中获得的序列的两倍、三倍或更高倍数。用于步移步骤的保护核苷酸可以用另一种替代物(例如3′-O-叔丁基-SS-dATP与dCTP、dGTP和dTTP等)代替。可选择的变型可包括使用两种、三种或四种3′-保护的核苷酸与两种、一种或零种天然核苷酸。重要的是，步移步骤将导致仅使用天然核苷酸的引物延伸，所以进行非常长的步移以到达第三或第四轮测序的适当位置应该是没有问题的。图31中显示了使用一个3′-O-DTM被保护的核苷酸和三个天然核苷酸的现行的一系列步移步骤。
使用可逆终止物3′-SS-dATP-SS-Rox、3′-SS-dCTP-SS-Alexa488、3′-SS-dGTP-SS-Cy5和3′-SS-dUTP-SS-R6G的聚合酶延伸以及通过MALDI-TOF质谱进行的表征(图29A-29H)。使用200pmol可逆终止物、2单位Therminator IX DNA聚合酶(NEB)、20pmol DNA引物(分子量6084)、20μl在含有20mM Tris-HCl的缓冲液中的100pmol DNA模板、10mM(NH4)2SO4、10mMKCl、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100、在25℃下pH 8.8和2mM MnCl2进行延伸反应反应。在ABI GeneAmp PCR系统9700中进行反应，最初在65℃温育30秒，然后进行38个循环的65℃/30秒、45℃/30秒、65℃/30秒。使用Oligo Clean＆ConcentratorTM(ZYMO Research)将反应混合物脱盐并通过MALDI-TOF MS(ABI Voyager DE)分析。使用终浓度为5mM的THP进行切割反应，在65℃温育10分钟，然后使用Oligo Clean＆ConcentratorTM(ZYMO Research)将反应混合物脱盐并通过MALDI-TOF MS进行分析。每个单独的延伸和切割的结果显示在图29A-29H中，表明所有这些核苷酸类似物都是聚合酶的有效底物，具有完整的延伸和切割。
以下指出的四种不同引物中的每一种都被设计为允许使用不同的核苷酸(从上倒下A、C、T或G)进行延伸。Exon8_模板(SEQ ID NO：4)用于A、C和T延伸；Exon7_模板(SEQ IDNO：5)用于G延伸。在模板的延伸点上存在两个连续的相同互补碱基是一种内置控制手段以解决任何不完全终止。
Exon8_模板：
Exon7_模板：
以下3种引物用于Exon_8模板的延伸：i)5’-TAGATGACCCTGCCTTGTCG-3’(SEQ IDNO：6)；ii)5’-TCTCTGGCCGCGTGTCT-3’(SEQ ID NO：3)；iii)5’-GATAGGACTCATCACCA-3’(SEQID NO：7)。以下引物用于用Exon_7模板进行延伸：5’-GTTGATGTACACATTGTCAA-3’(SEQ IDNO：8)。
使用3′-O-叔丁基-SS-dNTP(3′-O-DTM-dNTP)的连续聚合酶延伸和通过MALDI-TOF质谱法进行的表征(图30A-30B)。为了验证在聚合酶反应中以碱基特异性方式准确掺入3′-O-DTM-dNTP，在溶液中以3′-O-DTM-dNTP作为底物进行四次连续的DNA延伸和切割反应。这使得在每个步骤中能够分离DNA产物用于详细的分子结构表征。
我们进行了完整的连续4步SBS反应，其包括每种互补的3′-O-DTM-dNTP的掺入，接着是进行用于序列测定的MALDI-TOF MS分析，并从DNA延伸产物中切割3′-O-DTM保护基团产生游离的3′-OH基团用于下一个核苷酸类似物的掺入。设计了模板-引物组合，其中接下来的四种待加入的核苷酸是A、C、G和T。如图30所示，使用与DNA模板退火的13聚体引物启动SBS反应。当在聚合酶反应中使用第一种互补核苷酸3′-O-叔丁基-SS-dATP(3′-O-DTM-dATP)时，其被掺入引物中以形成分子量为4404道尔顿(Da)的DNA延伸产物，这通过MALDI-TOF MS得到证实，有单峰出现(图30B(a)左上)。这些结果表明3′-O-DTM-dATP定量掺入到13-聚体DNA引物中。在THP处理以从DNA产物中除去DTM基团并进行HPLC纯化后，在4272Da处存在的单个MS峰证实了切割，该峰对应于去除了3′-O-DTM基团的DNA产物(图30B(b)右上)。然后将新形成的具有游离3′-OH基团的DNA延伸产物用于第二聚合酶反应以掺入3′-O-叔丁基-SS-dCTP(3′-O-DTM-dCTP)，这在4697Da处产生了单一的MS峰(图30B(c))，表明在该循环3′-O-DTM-dCTP被掺入生长的DNA链中。THP处理后，切割的DNA产物的单个MS峰出现在4563Da处(图30B(d))，这证明从DNA延伸产物完全除去DTM基团。
第三个掺入是使用3′-O-叔丁基-SS-dGTP(3′-O-DTM-dGTP)；通过MALDI-TOF MS获得第三种核苷酸掺入(5024Da，图30B(e))和切割反应(4888Da，图30B(f))的相应DNA产物的准确质量。最终，证实了在第四个循环中掺入3’-O-叔丁基-SS-dTTP(3′-O-DTM-dTTP)并通过THP最终除去DTM基团，因为通过MALDI-TOF MS获得了第四种核苷酸掺入(5328Da，图30B(g))和切割反应(5199Da，图30B(h))的相应DNA产物的合适的质量，这些结果表明在连续聚合酶反应中，所有四种3′-O-DTM-dNTP作为可逆终止物均被有效地、碱基-特异性地掺入生长的DNA链，并且DNA延伸产物上的3′-OH加帽基团被THP定量切割。
证明在溶液中使用三种天然dNTP(dATP、dCTP和dTTP)和一种3′-O-叔丁基-SS-dNTP(3′-O-DTM-dGTP)进行步移的实验(图31)。我们使用dATP、dCTP、dTTP和3′-O-叔丁基-SS-dGTP进行了一系列3步步骤。结果显示在图31中。将WT49G(5’-CAGCTTAAGCAATGGTACATGCCTTGACAATGTGTACATCAACATCACC-3’)(SEQ ID NO：10)设计为模板，用于引物(13聚体，5′-CACATTGTCAAGG-3′)(SEQ ID NO：2)上4碱基的第一步延伸、第2步步移的8碱基延伸、第3步步移的6碱基延伸；在每种情况下，反应将停止在模板上的第一个相应的C处(在模板中从右到左以红色显示)。设计WT49G模板和13聚体引物用于通过MALDI-TOF质谱进行步移的有效表征。
使用1μmol可逆终止物、1μmol dATP、dCTP和dTTP、500pmol引物(MW3939)、5单位的Therminator IX DNA聚合酶(NEB)、5μl在含有20mM Tris-HCl的缓冲液中的300pmol DNA模板、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100、在25℃下pH 8.8和2mMMnCl2进行延伸反应。在ABI GeneAmp PCR系统9700中进行反应，最初在65℃温育30秒，然后进行38个循环的65℃/30秒、45℃/30秒、65℃/30秒。使用Oligo Clean＆ConcentratorTM(ZYMO Research)将反应混合物脱盐并通过MALDI-TOF MS(ABI Voyager DE)分析。使用终浓度为5mM的THP进行切割反应，在65℃温育5分钟，然后使用Oligo Clean＆ConcentratorTM(ZYMO Research)将反应混合物脱盐并通过MALDI-TOFMS进行分析。每个单独的延伸和切割的结果显示在图31中。
第一次步移之后，引物延伸至模板中下一个C的位置(在模板链中以红色突出显示的最右边的C)。如左上角MALDI-TOF MS图所示，延伸产物的大小为5330道尔顿(预期为5328Da)。用THP切割后，观察到右上角显示的5198Da产物(预期为5194Da)。使用该延伸和切割的引物再次使用Therminator IX DNA聚合酶、dATP、dCTP、dTTP和3′-O-叔丁基-dGTP进行第二次步移，以获得中间左侧曲线中显示的产物(观察到7771Da，预期到达中部C时为7775Da)。切割后，获得7643Da的产物(预计7641Da)。最后，使用先前延伸和切割的引物进行第三次步移和切割，产生9625Da(预期延伸至最左侧红色突出显示的C时为9628Da)和9513Da(预期9493Da)的产物。根据延伸长度在每次步移中调整核苷酸的量(在第2步中为2μmol，在第3步中为1.5μmol)。这证明了能够使用3′-O-叔丁基核苷酸作为步移反应的终止物。可以将这些结合到测序和步移的组合方案中，例如结合到图28A-28B中所述的方案中。
展示在表面固定的DNA上进行的四色SBS的实验(图32)。将5′-氨基修饰的自引发模板DNA(5’-CACTCACATATGTTTTTTAGCTTTTTTAATTTCTTAATGATGTTGTTGCATGCTGACCTCAGCTGCACGTAAGTGCAGCTGAGGTCAG-3’)(SEQ ID NO：1)以30μM的浓度溶于50mM磷酸钠缓冲液(pH9.0)中，使用SpotArray 72微阵列打印机器人(PerkinElmer，马萨诸塞州)在NHS酯活化的CodeLink载玻片(Surmodics Inc.公司，明尼苏达州)上点样。点样后，将载玻片在含有饱和氯化钠溶液的潮湿室中于37℃温育过夜以固定DNA。在固定化之后，通过将载玻片在50mM3-氨基-1-丙醇的溶液(在100mM Tris-HCl缓冲液，pH9.0中)在环境温度下孵育2小时来猝灭未反应的NHS酯基团。最后，将载玻片在水中简单地漂洗，在压缩空气下风干并在黑暗容器中干燥储存直至进一步使用。
然后将载玻片用硅氧烷隔离器覆盖，并将8μl含有四种可逆终止物(3′-SS-dARP-SS-Rox、3′-SS-dCTP-SS-Alexa488、3′-SS-dNTP-SS-Cy5和3′-SS-dUTP-SS-R6G)(图24A-24B)、5单位的Therminator IX DNA聚合酶(NEB)、1×Thermo Pol反应缓冲液(NEB)、2mMMnCl2的延伸混合物添加到涂有自引发DNA模板的区域。将载玻片在65℃孵育15分钟，然后在室温下用1×Thermo Pol反应缓冲液(NEB)、2mM MnCl2洗涤两次。然后将含有1μM各种3′-SS-dNTP(图24A-24B)、5单位的Therminator IXDNA聚合酶(NEB)、1×Thermo Pol反应缓冲液(NEB)、2mM MnCl2的8微升追加混合物加入，并在65℃下孵育15分钟。然后移除硅氧烷隔离器，并将载玻片用含有2％吐温20的SPSS缓冲液在37℃洗涤30分钟，然后用蒸馏水冲洗。使用扫描阵列快速微阵列扫描仪ScanArray Express(ScanArray Express MicroarrayScanner，Perkin Elmer)进行成像。使用488nm、543nm、594nm和633nm的激发进行四通道扫描，并记录荧光强度。
将载玻片再次用硅氧烷隔离器覆盖，加入8μl在1×PBS中5mM的THP并在65℃温育15分钟以除去荧光染料并在3′末端重新生成羟基。再次除去硅氧烷隔离器，用含有2％吐温20的SPSS缓冲液洗涤载玻片并重新扫描以确认成功除去碱基上的染料以及3′保护基团。对于每个随后的测序循环重复上述过程。
图8中示出了表面上的四色测序数据。在下列四个波长(488nm、543nm。594nm和633nm)处发射光的强度由条的高度表示(第一：Alexa488＝C；第二：R6G＝T；第三：Rox＝A；第四：Cy5＝G)。从左至右，四个条的组分别为第一延伸反应、第一切割反应、第二延伸反应、第二切割反应、第三延伸反应、第三切割反应、第四延伸反应、第4切割反应。基于模板中该位置的核苷酸，获得了每个核苷酸添加循环的预期荧光发射波长，用标记的保护的核苷酸(3′-SS-dARP-SS-Rox、3′-SS-dCTP-SS-Alexa488、3′-SS-dGTP-SS-Cy5和3′-SS-dUTP-SS-R6G)的组合以及Therminator IX聚合酶证明了精确性。此外，用THP处理后，发射降至背景处，表明染料被从碱基上完全切割。
方案3. 3′-O-叔丁基二硫代甲基-dTTP的合成
3'-O-甲基硫基甲基-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(2a)：向搅拌下的溶于DMSO(10mL)中的5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(1a，1.07g，3mmol)溶液中加入乙酸(2.6mL，45mmol)和乙酸酐(8.6mL，90毫摩尔)。反应混合物在室温下搅拌过夜。然后在剧烈搅拌下将混合物缓慢加入到饱和碳酸氢钠溶液中并用乙酸乙酯(3×30mL)萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干，并通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷：1：2)纯化化合物得到纯的产物2a(0.97g，74％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.16(s，1H)，7.48(s，1H)，6.28(m，1H)，4.62(m，2H)，4.46(m，1H)，4.10(m，1H)，3.78-3.90(m，2H)，2.39(m，1H)，2.14(s，3H)，1.97(m，1H)，1.92(s，3H)，0.93(s，9H)，0.13(s，3H)；HRMS(FAB+)C18H33N2O5SSi[(M+H)+]：计算值：417.1879，实验值：417.1890。
3’-O-叔丁基二硫基甲基-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(3a)：将3’-O-甲基硫基甲基-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基胸苷(2a，420mg，1mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)，随后加入三乙胺(0.18mL，1.31mmol，1.2当量)和分子筛(3g，2g)，混合物在室温下搅拌30分钟后，在冰浴中冷却，然后在2分钟内滴加硫酰氯(重蒸馏，0.1mL，1.31mmol，1.2当量)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。去除冰浴，并将反应混合物再搅拌30分钟。然后将对甲苯硫代磺酸钾(375mg，1.65mmol)的无水DMF(2mL)溶液加入混合物中。在室温下继续搅拌1小时，随后加入叔丁基硫醇(1mL)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，并快速过滤通过硅藻土。将过滤器用二氯甲烷洗涤，将有机层浓缩得到粗产物3a。
3’-O-叔丁基二硫基甲基-胸苷(4a)：不经分离，将粗制化合物3a溶于THF(10mL)，加入四丁基氟化铵(1.0M，1.04mL，1.04mmol)的THF溶液。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应物真空浓缩，加入饱和NaHCO3溶液(50mL)并用二氯甲烷提取混合物(3×20mL)，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，将所得粗制混合物通过快速柱层析(二氯甲烷/甲醇：20：1)进行纯化得到3′-O-叔丁基二硫基甲基-胸苷4a(132mg，由2a进行制备的产率为35％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.41(q，J＝1.2Hz，1H)，6.15(dd，J＝7.4，6.5Hz，1H)，4.89-4.82(m，2H)，4.62-4.54(m，1H)，4.15(q，J＝3.0Hz，1H)，3.97-3.86(m，2H)，2.42(ddd，J＝7.5，4.8，2.5Hz，2H)，1.95(d，J＝1.2Hz，3H)，1.36(s，8H)。
3’-O-叔丁基二硫基甲基-dTTP(5a)：在室温和高真空下将3’-O-叔丁基二硫基甲基-胸苷(4a，50mg，0.13mmol)、四丁基焦磷酸铵(197mg，0.36mmol)和2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(44mg，0.22mmol)分别干燥过夜。在氩气下将四丁基焦磷酸铵溶于二甲基甲酰胺(DMF，1mL)，随后加入三丁胺(1mL)。在氩气下将该混合物注入2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF(2mL)溶液。搅拌1h后，将反应混合物加入3’-O-叔丁基二硫基甲基-胸苷的溶液，在室温下再搅拌1小时。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物直至观察到永久的棕色。10分钟后，加入水(30mL)，并将反应混合物在室温下再搅拌2小时。所得溶液用乙酸乙酯提取(2x30mL)。将水层在真空下浓缩，所得残余物用5ml水稀释。然后在DEAE-SephadexA-25上通过阴离子交换层析在4℃下使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)对粗制混合物进行纯化。通过反相HPLC进一步纯化粗产物得到5a，该产物通过MALDI-TOF MS进行表征：C15H27N2O14P3S2：计算值：616.4，实验值：615.4。
方案4. 3’-O-叔丁基二硫基甲基-dGTP的合成
N2-异丁酰-3’-O-甲基硫基甲基-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧鸟苷(G2)：向搅拌的N2-异丁酰-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧鸟苷(G1，1.31g，3mmol)的DMSO(10mL)溶液中加入乙酸(2.6mL，45mmol)和乙酸酐(8.6mL，90mmol)。将反应混合物在室温下搅拌至反应完成，通过TLC对反应进行监测。然后在剧烈搅拌下将混合物缓慢加入到饱和碳酸氢钠溶液中并用乙酸乙酯(3×30mL)萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干，通过硅胶柱层析(DCM/甲醇：20∶1)纯化化合物得到纯的产物G2(75％，1.15g)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ12.10(d，J＝2.9Hz，1H)，9.17(d，J＝3.0Hz，1H)，8.03(m，1H)，6.18(td，J＝6.9，2.9Hz，1H)，4.74-4.60(m，3H)，4.13(dq，J＝6.8，3.3Hz，1H)，3.84-3.75(m，2H)，2.78(m，1H)，2.54(m，2H)，2.16(s，3H)，1.33-1.22(m，6H)，0.96-0.87(m，9H)，0.09(dd，J＝6.7，3.8Hz，6H)。
N2-异丁酰-3’-O-叔丁基二硫基甲基-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧鸟苷(G3)：N2-异丁酰-3’-O-甲基二硫基甲基-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧鸟苷(G2，511mg，1.0mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)，随后加入三乙胺(0.17mL，1.2mmol)和分子筛(
2g)将混合物在室温下搅拌30分钟后在冰浴中冷却，然后在2分钟内滴加硫酰氯(0.095mL，1.2mmol)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。去除冰浴，将反应混合物再搅拌30分钟。然后将4-甲苯硫代磺酸钾(341mg，1.5mmol)的DMF(2mL)溶液加入混合物。在室温下继续搅拌1小时，随后加入叔丁基硫醇(1mL)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，并快速过滤通过硅藻土。用二氯甲烷洗涤过滤器，将有机级分浓缩得到粗产物G3。
N2-异丁酰-3’-O-叔丁基二硫基甲基-2′-脱氧鸟苷(G4)：在未经分离的情况下，将粗制化合物G3溶于THF(10mL)，加入四丁基氟化铵的THF溶液(1.0M，1.04mL，1.04mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应物真空浓缩，加入饱和NaHCO3溶液(50mL)并用二氯甲烷提取混合物(3×20mL)。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，通过快速柱层析(二氯甲烷/甲醇：20∶1)纯化获得的粗制混合物以得到N2-异丁酰-3’-O-叔丁基二硫基甲基-2′-脱氧鸟苷G4(155mg，由化合物G2进行制备的产率为33％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ12.19(s，1H)，9.44(s，1H)，7.97(s，1H)，6.17(dd，J＝8.4，5.9Hz，1H)，5.04(s，1H)，4.92-4.80(m，2H)，4.76-4.64(m，1H)，4.26(q，J＝2.6Hz，1H)，3.98(dd，J＝12.2，2.8Hz，1H)，3.80(d，J＝12.3Hz，1H)，2.91-2.73(m，2H)，2.49(m，1H)，1.35(s，9H)，1.36-1.22(m，6H).13C NMR(75MHz，CDCl3)δ179.60，155.80，148.10，147.96，139.11，122.30，86.29，81.22，78.96，63.21，48.07，38.18，36.64，30.29，19.39，19.34。
3’-O-叔丁基二硫基甲基-dGTP(G5)：N2-异丁酰基-3′-O-叔丁基二硫基甲基-2′-脱氧鸟苷(G4，50mg，0.11mmol)，四丁基焦磷酸铵(180mg，0.33mmol)和2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(44mg，0.22mmol)在环境温度下在高真空下分别干燥过夜。将四丁基焦磷酸钠溶于二甲基甲酰胺(DMF，1mL)中，随后加入三丁胺(1mL)。将该混合物在氩气下注入到2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮在DMF(2mL)中的溶液中。在搅拌1小时后将反应混合物加入到N2-异丁酰基-3′-O-叔丁基二硫基甲基-2′-脱氧鸟苷溶液中，并在室温下再搅拌1小时。碘溶液(0.02M的碘/吡啶/水)中的溶液，然后注入到反应混合物直至观察到永久的棕色。10分钟后，水(30ml)中加入和将反应混合物在室温下搅拌另外的2小时。所得溶液用乙酸乙酯萃取。将水层在真空下浓缩至约20mL，然后加入浓NH4OH(20ml)并将混合物在室温下搅拌过夜。将所得混合物真空浓缩并将残余物用5ml水稀释。然后使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)，在4℃用DEAE-SephadexA-25上的阴离子交换层析纯化粗制混合物。粗产物通过反相HPLC进一步纯化，得到G5。HRMS(ESI-)C15H25N5O13P3S2[(M-H)-]：计算值：640.0103，实验值：640.0148。
方案5. 3’-O-叔丁基二硫基甲基-dATP的合成
N6-苯甲酰-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-甲基硫基甲基-2′-脱氧腺苷(A2)：向搅拌的N6-苯甲酰-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧腺苷(A1，1.41g，3mmol)的DMSO(10mL)溶液中加入乙酸(3mL)和乙酸酐(9mL)。将反应混合物在室温下搅拌直至反应完全，通过TLC对反应进行监测。然后将混合物在剧烈搅拌下缓慢加入到碳酸氢钠溶液中并用乙酸乙酯萃取(3×30mL)。合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干，并通过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇：30∶1)纯化所需化合物的残余物得到纯的产物A2(1.39g，88％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.12(s，1H)，8.81(s，1H)，8.35(s，1H)，8.10-8.01(m，2H)，7.68(m，1H)，7.49(m，2H)，6.53(dd，J＝7.5，6.0Hz，1H)，4.78-4.65(m，3H)，4.24(dt，J＝4.3，3.1Hz，1H)，3.98-3.81(m，2H)，2.80-2.60(m，2H)，2.21(s，3H)，0.94(s，10H)，0.13(s，6H)；MS(APCI+)C26H36N4O4SSi：计算值：528.74，实验值：529.4[M+H]+。
N6-苯甲酰-′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-叔丁基二硫基甲基-2′-脱氧腺苷(A3)：将N6-苯甲酰-′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-甲基硫基甲基-2′-脱氧腺苷(A2，529mg，1.0mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)，随后加入三乙胺(0.17mL，1.2mmol)和分子筛(
2g)。将混合物在室温下搅拌30分钟后在冰浴中冷却，然后在2分钟内滴加硫酰氯(0.095mL，1.2mmol)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。去除冰浴，将反应混合物再搅拌30分钟。然后将4-甲硫基磺酸钾(341mg，1.5mmol)的无水DMF(2mL)溶液加入到混合物中。在室温下继续搅拌1小时，随后加入叔丁基硫醇(1mL)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，并快速过滤通过硅藻土。用二氯甲烷洗涤过滤器，浓缩有机部分得到粗产物A3。
N6-苯甲酰-3’-O-叔丁基二硫基甲基-2′-脱氧腺苷(A4)：在不经分离的情况下，将粗制化合物A3溶于THF(10mL)，加入四丁基氟化铵的THF溶液(1.0M，1.04mL，1.04mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应物真空浓缩，加入饱和NaHCO3溶液(50mL)并用二氯甲烷提取混合物(3×20mL)，有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，通过快速柱层析(二氯甲烷/甲醇：20∶1)对获得的粗制混合物进行纯化以得到N6-苯甲酰-3’-O-叔丁基二硫基甲基-2′-脱氧腺苷A4(128mg，由化合物A2进行制备的产率为26％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.18(s，1H)，8.77(s，1H)，8.71(s，1H)，8.10-8.02(m，2H)，7.66(t，J＝7.6Hz，1H)，7.56(t，J＝7.6Hz 2H)，6.47(dd，J＝8.0，6.0Hz，1H)，5.15(t，J＝5.5Hz，1H)，5.00(s，2H)，4.65(dt，J＝5.4，2.4Hz，1H)，4.12(td，J＝4.7，2.2Hz，1H)，3.02-2.88(m，1H)，2.84(q，J＝7.3Hz，2H)，2.61(m，1H)，1.35(s，9H)。
3’-O-叔丁基二硫基甲基-dATP(A5)：在室温和高真空下将N6-苯甲酰-3’-O-叔丁基二硫基甲基-2′-脱氧腺苷(A4，50mg，0.10mmol)、四丁基焦磷酸铵(180mg，0.33mmol)和2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(44mg，0.22mmol)分别干燥过夜。在氩气下将四丁基焦磷酸铵溶于二甲基甲酰胺(DMF，1mL)，随后加入三丁胺(1mL)。将该混合物在氩气下注入到2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF(2mL)液中。搅拌1h后，将反应混合物加入N6-苯甲酰-3’-O-叔丁基二硫基甲基-2′-脱氧腺苷的溶液中，在室温下再搅拌1小时。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物直至观察到永久的棕色。10分钟后，加入水(30mL)并将反应混合物在室温下再搅拌2小时。所得溶液用乙酸乙酯提取。水层在真空下浓缩至约20mL，然后加入浓NH4OH(20ml)，并继续在室温下搅拌过夜。所得混合物在真空下浓缩，用5ml水稀释残余物。然后在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析在4℃下使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)对粗制混合物进行纯化。通过反相HPLC对粗产物进行进一步纯化得到A5，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C15H26N5O12P3S2：计算值：625.4，实验值：625.0。
方案6. 3’-O-叔丁基二硫基甲基-dCTP的合成
N4-苯甲酰-3’-O-甲基硫基甲基-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧胞苷(C2)：向搅拌的N4-苯甲酰-′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧胞苷(C1，1.5g，3.4mmol)的DMSO(6.5mL)溶液中加入乙酸(2.91mL)和乙酸酐(9.29mL)。将反应混合物在室温下搅拌2天。然后将反应混合物逐滴加入碳酸氢钠溶液并用乙酸乙酯提取(50ml x3)。通过柱层析对所得粗产物进行纯化(乙酸乙酯/己烷：8：2)得到纯的产物C2(1.26g，74％)，为白色固体。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.43(d，J＝7.4Hz，1H)，7.92(d，J＝7.6Hz，2H)，7.69-7.50(m，4H)，6.31(t，J＝6.1Hz，1H)，4.75-4.59(m，2H)，4.51(dt，J＝6.2，3.9Hz，1H)，4.20(dt，J＝3.7，2.6Hz，1H)，4.01(dd，J＝11.4，2.9Hz，1H)，3.86(dd，J＝11.4，2.4Hz，1H)，2.72(ddd，J＝13.8，6.2，4.1Hz，1H)，2.18(s，4H)，0.97(s，9H)，0.17(d，J＝3.9Hz，6H).HRMS(ESI+)C24H35N3O5SSi[(M+H)+]：计算值：506.2145，实验值∶506.2146。
N4-苯甲酰-3’-O-叔丁基二硫基甲基-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧胞苷(C3)：将N4-苯甲酰-3’-O-甲基硫基甲基-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧胞苷(C2，1.01g，2mmol)溶于无水二氯甲烷(8mL)，随后加入三乙胺(278μL，2mmol)和分子筛(
1g)。在室温下搅拌0.5h后，将混合物在冰浴中冷却，然后滴加硫酰氯(161μL，2.2mmol)的无水二氯甲烷(8mL)溶液。去除冰浴，将反应混合物再搅拌0.5小时。然后向混合物中加入对甲苯硫代磺酸钾(678mg，3mmol)的无水DMF(1mL)溶液。在室温下继续搅拌1小时，随后加入叔丁基硫醇(1mL)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时并快速过滤。在减压下除去溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯并用盐水洗涤(3x50mL)。合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干，通过硅胶柱层析使用乙酸乙酯-己烷梯度(从3∶7(v/v)至5∶5(v/v))对所需化合物的残余物进行纯化，产生959mg(83％)C3，为白色泡沫。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.43(d，J＝7.4Hz，1H)，7.92(d，J＝7.6Hz，2H)，7.69-7.50(m，4H)，6.31(t，J＝6.1Hz，1H)，4.75-4.59(m，2H)，4.51(dt，J＝6.2，3.9Hz，1H)，4.20(dt，J＝3.7，2.6Hz，1H)，4.01(dd，J＝11.4，2.9Hz，1H)，3.86(dd，J＝11.4，2.4Hz，1H)，2.72(ddd，J＝13.8，6.2，4.1Hz，1H)，2.18(s，4H)，0.97(s，9H)，0.17(d，J＝3.9Hz，6H)，0.10(s，2H).HRMS(ESI+)C27H41N3O5S2Si[(M+Na)+]：计算值：602.2155，实验值：602.2147。
N4-苯甲酰-3’-O-叔丁基二硫基甲基-2′-脱氧胞苷(C4)：向搅拌的N4-苯甲酰-3’-O-叔丁基二硫基甲基-′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧胞苷(C3，958mg，1.66mmol)的四氢呋喃(24ml)溶液中以小份加入四丁基氟化铵(1.0M，2.48mL)，在室温下搅拌3小时。将反应混合物倒入饱和的碳酸氢钠溶液(50mL)，并用乙酸乙酯提取(3x50mL)。合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干，通过硅胶柱层析使用乙酸乙酯-己烷梯度(从5：5(v/v)开始)对所需化合物的残余物进行纯化得到435mg(56％)C4，为固体白色粉末。1HNMR(400MHz，甲醇-d4)δ8.52(d，J＝7.5Hz，1H)，8.04-7.96(m，2H)，7.71-7.60(m，2H)，7.61-7.51(m，2H)，6.28-6.19(m，1H)，4.95-4.86(m，2H)，4.54(dt，J＝6.0，3.0Hz，1H)，4.23(q，J＝3.4Hz，1H)，3.92-3.76(m，2H)，2.70(ddd，J＝13.9，6.0，2.9Hz，1H)，2.25(ddd，J＝13.6，7.2，6.2Hz，1H)，1.37(s，9H).HRMS(ESI+)C21H27N3O5S2[(M+Na)+]：计算值：488.1290，实验值：488.1297。
3’-O-叔丁基二硫基甲基-dCTP(C5)：在室温和高真空下将N4-苯甲酰-3’-O-叔丁基二硫基甲基-2′-脱氧胞苷(C4，50mg，0.11mmol)、四丁基焦磷酸铵(180mg，0.33mmol)和2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(44mg，0.22mmol)分别干燥过夜。在氩气下将四丁基焦磷酸铵溶于二甲基甲酰胺(DMF，1mL)，随后加入三丁胺(1mL)。在氩气下将该混合物注入2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF(2mL)溶液。在搅拌1h后，将反应混合物加入N4-苯甲酰-3’-O-叔丁基二硫基甲基-2′-脱氧胞苷的溶液，在室温下再搅拌1小时。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物直至观察到永久的棕色。10分钟后，加入水(30mL)并将反应混合物在室温下再搅拌2小时。所得溶液用乙酸乙酯提取。水层在真空下浓缩至约20mL，然后加入浓NH4OH(20ml)，将混合物在室温下搅拌过夜。所得混合物在真空下浓缩，用5ml水稀释残余物。然后在DEAE-SephadexA-25上通过阴离子交换层析在4℃下使用TEAB梯度(pH8.0；0.1-1.0M)对粗制混合物进行纯化。过反相HPLC对粗产物进行进一步纯化通得到C5。HRMS(ESI-)C14H25N3O13P3S2[(M-H)-]：计算值：600.0042，实验值：600.0033。
方案7.DTM接头的合成
三甲基(3-((甲硫基)甲氧基)丙-1-炔-1-基)硅烷(2)：在搅拌下向3-三甲基甲硅烷-丙-2-炔-1-醇(1，1.28g，10mmol)的DMSO(10mL)溶液中加入乙酸(2.6mL，45mmol)和乙酸酐(8.6mL，90mmol)。在室温下搅拌反应混合物直至反应完成(24h)，通过TLC对反应进行监测。然后将混合物在剧烈搅拌下缓慢加入到碳酸氢钠溶液中并用乙酸乙酯萃取(3×30mL)。合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干，并通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷：1∶10)纯化所需化合物得到纯的产物2(0.97g，67％)：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：4.75(s，2H)，4.28(s，2H)，2.16(s，3H)，0.20(s，9H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：101.12，92.07，74.04，55.48，14.42，0.18。
2，2，2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺(4)：将1-氨基-2-甲基丙烷-2-硫醇盐酸盐(3)(1.0g，7mmol)与吡啶(2mL)在无水苯(15mL)中混合。在0℃下，将三氟乙酸酐(1.30mL，9.2mmol)加缓慢入到搅拌的混合物中，并在环境温度下继续搅拌过夜。小心加入0.5M Na2CO3/H2O，接着萃取(EtOAc)水层，并在真空下从合并的有机层中除去挥发物。对残余物进行快速层析(30％乙酸乙酯/己烷)得到4(4.0g，88％)：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：6.85(br，1H)，3.45(m，2H)，1.69(s，1H)，1.41(s，6H)。
S-(((3-(三甲基甲硅烷基)丙-2-炔-1-基)氧基)甲基)4-甲基硫代苯磺酸酯(5)：将三甲基(3-((甲硫基)甲氧基)丙-1-炔-1-基)硅烷(2，1.0g，5.32mmol)溶于无水二氯甲烷(10mL)，随后加入环己烷(3.4mL)。将混合物在冰浴中冷却，然后在2分钟内逐滴加入无水二氯甲烷(3mL)中的硫酰氯(0.47mL，5.85mmol)溶液。去除冰浴，并将反应混合物再搅拌1小时。然后将硫代甲苯磺酸钾(1.44g，6.38mmol)的无水DMF(5mL)溶液加入混合物中。在室温下继续搅拌1小时。浓缩溶液后，将残余物通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/己烷：10∶1)纯化得到纯的产物5。(1.29g，74％)：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.86(d，J＝8.4Hz，2H)，7.32(d，J＝8.4Hz，2H)，5.40(s，2H)，4.03(s，2H)，2.46(s，3H)，0.19(s，9H)。
2，2，2-三氟-N-(2-甲基-2-(((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)二硫基)丙基)乙酰胺(7)：在室温下将Et3N(0.3mL)加入搅拌的2，2，2-三氟-N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺(4，0.87g，4.32mmol)和S-(((3-(三甲基甲硅烷基)丙-2-炔-1-基)氧基)甲基)4-甲基硫代苯磺酸酯(5，1.29g，3.93mmol)在无水二氯甲烷(20mL)中的混合物，并继续搅拌0.5小时。然后，加入四丁基氟化铵THF溶液(1.0M，5.89mL，5.89mmol)加入。将反应混合物在室温下搅拌约10分钟，真空蒸发挥发物。对残余物进行快速柱层析得到2，2，2-三氟-N-(2-甲基-2-(((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)二硫基)丙基)乙酰胺(7，0.83g，70％)：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.22(br，1H)，4.87(s，2H)，4.30(d，J＝2.4Hz，2H)，3.45(d，J＝6.4Hz，2H)，2.50(s，J＝2.4Hz，1H)，1.27(s，6H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：158.16，118.26，79.81，77.93，76.27，56.50，50.93，47.32，25.30。
方案8. 3’-O-DTM-5-SS-R6G-dUTP的合成
5-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷(T2)：将5-碘-2′-脱氧胸苷(T1，1g，2.8mmol)、叔丁基二甲基氯硅烷(453mg，3.0mmol)和咪唑(199mg，3.0mmol)的混合物溶于干燥的DMF(15m)并在室温下搅拌过夜。在搅拌下将反应混合物倒入冰水(200mL)，抽滤收集沉淀，然后并用水和己烷洗涤。将所得粗产物用柱层析(二氯甲烷/甲醇：20∶1)纯化得到5-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷(T2，1.152g，88％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.19(s，1H)，8.12(s，1H)，6.36-6.27(m，1H)，4.51(dd，J＝5.7，2.9Hz，1H)，4.11(q，J＝2.5Hz，1H)，4.04-3.83(m，2H)，2.45(ddd，J＝13.5，5.7，2.3Hz，1H)，2.14(ddd，J＝13.6，8.0，5.8Hz，1H)，1.86(d，J＝3.5Hz，1H)，0.97(s，9H)，0.19(d，J＝6.7Hz，6H)。
5-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-甲基硫基甲基-胸苷(T3)：向搅拌的5-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷(T2，1009mg，2.35mmol)的DMSO(10mL)溶液中加入乙酸(3.0mL)和乙酸酐(8mL)。反应混合物在室温下搅拌过夜，然后在剧烈搅拌下滴加到饱和碳酸氢钠溶液中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干得到粗制化合物，将粗制化合物通过柱层析(二氯甲烷/甲醇：30∶1)纯化得到纯的产物5-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-甲基硫基甲基-胸苷(T3，789mg，64％)，为白色固体。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.53(s，1H)，8.13(s，1H)，6.26(dd，J＝8.5，5.5Hz，1H)，4.75-4.60(m，2H)，4.50(dt，J＝5.9，1.8Hz，1H)，4.18(q，J＝2.3Hz，1H)，3.89(ddd，J＝43.8，11.4，2.5Hz，2H)，2.51(ddd，J＝13.5，5.5，1.7Hz，1H)，2.18(s，3H)，2.08-1.97(m，1H)，0.98(s，9H)，0.20(d，J＝5.3Hz，6H)。
5-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-(叔丁基二硫基甲基)-2′-胸苷(T4)：将5-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-甲基硫基甲基-胸苷(T3，754mg，1.42mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)，随后加入三乙胺(0.3mL)和分子筛(
2g)。将混合物在冰浴中冷却，在室温下搅拌0.5小时后，在2分钟内滴加硫酰氯(0.12mL，1.50mmol)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。去除冰浴，将反应混合物再搅拌0.5小时。然后将对甲苯硫代磺酸钾(0.61g，2.25mmol)的无水DMF(3mL)溶液加入混合物中。在室温下继续搅拌1小时，随后加入叔丁基硫醇(1mL)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时，并快速过滤通过硅藻土。将过滤器用二氯甲烷洗涤并对有机部分进行浓缩。将残余物通过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇：30：1)进行纯化得到化合物T4。(561mg，66％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.11(s，1H)，8.12(s，1H)，6.25(dd，J＝8.5，5.4Hz，1H)，4.91(d，J＝11.2Hz，1H)，4.80(d，J＝11.2Hz，1H)，4.53(dt，J＝6.0，1.7Hz，1H)，4.22(q，J＝2.2Hz，1H)，4.00-3.80(m，2H)，2.59-2.45(m，1H)，2.02(ddd，J＝13.6，8.5，5.9Hz，1H)，1.36(s，9H)，0.98(s，9H)，0.19(d，J＝4.9Hz，6H)。
化合物T5：在氮气下，将T4(501mg，0.83mmol)、CuI(20mg，0.11mmol)和三乙胺(0.30mL)的混合物在干DMF(5mL)中的溶液在室温下搅拌5分钟，然后加入DTM接头7(277mg，0.91mmol)和Pd(0)(150mg，0.13mmol)。在室温下避光搅拌过夜后，在剧烈搅拌下将反应混合物滴加至盐水(200mL)，用乙酸乙酯提取。合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干得到粗制化合物T5。MS(APCI-)C30H48F3N3O7S4Si：计算值：776.0，实验值：774.5。
化合物T6：在不经分离的情况下，将粗制化合物T5溶于THF(10mL)，随后加入TBAFTHF溶液(1.0M，1.0mL，1.0mmol)。在室温下将混合物搅拌过夜。然后，在真空下浓缩混合物，加入饱和NaHCO3溶液(50mL)，并用二氯甲烷提取混合物。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，所得粗制化合物通过快速柱层析(二氯甲烷/甲醇：20∶1)纯化得到化合物T6(161mg，由化合物T4进行制备的产率为29％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.50(s，1H)，8.11(s，1H)，7.45(s，1H)，6.22(dd，J＝7.6，5.9Hz，1H)，4.93-4.85(m，3H)，4.81(d，J＝11.2Hz，1H)，4.58(dt，J＝6.0，2.9Hz，1H)，4.52(s，2H)，4.20(q，J＝2.7Hz，1H)，4.02(ddd，J＝11.9，4.4，2.6Hz，1H)，3.89(ddd，J＝11.8，5.0，2.7Hz，1H)，3.54-3.47(m，2H)，2.76(t，J＝4.7Hz，1H)，2.54(ddd，J＝13.8，6.0，2.8Hz，1H)，2.25(ddd，J＝13.8，7.6，6.4Hz，1H)，1.37(s，9H)，1.34(s，6H).13C NMR(75MHz，CDCl3)δ162.00，158.47，157.99，149.59，144.64，118.29，114.47，99.27，87.93，86.84，85.66，81.24，80.62，78.95，77.86，77.70，77.43，77.01，62.54，57.67，53.82，50.82，48.03，47.41，38.52，35.04，31.95，30.28，29.43，25.97，25.66，23.01，21.08，14.48，11.79.MS(APCI+)C24H34F3N3O7S4：计算值：661.8，实验值：661.4。
3’-O-DTM-dUTP-5-SS-NH2(化合物T7)：在室温高真空下将化合物T6(50mg，76μmol)、四丁基焦磷酸铵(100mg，0.18mmol)和2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(22mg，0.11mmol)分别干燥过夜。在氩气下将四丁基焦磷酸铵溶于二甲基甲酰胺(DMF，1mL)，随后加入三丁胺(1mL)。在氩气下将混合物注入2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF(2mL)溶液。在搅拌1h后，将反应混合物加入T6的DMF溶液，在室温下再搅拌1小时。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物直至观察到永久的棕色。10分钟后，加入水(30mL)，并将反应混合物在室温下再搅拌2小时。所得溶液用乙酸乙酯提取。水层在真空下浓缩至约20mL，然后加入浓NH4OH(20ml)，并在室温下继续搅拌过夜。所得混合物在真空下浓缩，残余物用5ml水稀释。然后在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析在4℃下使用TEAB梯度(pH8.0；0.1-1.0M)对粗制混合物进行纯化。通过反相HPLC进一步纯化粗产物得到T7，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C22H38N3O15P3S4：计算值：805.0，实验值：809.1。
3’-O-DTM-dUTP-5-SS-R6G(化合物T8)：向搅拌的罗丹明6G-NHS酯(2mg，3.6μmol)的DMF(0.2ml)溶液中加入溶于NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH8.9，0.1M，0.3ml)的3’-O-DTM-dUTP-5-SS-NH2(化合物T7，1.5μmol)。将反应混合物在室温下在避光条件下搅拌3h。在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析在4℃下使用TEAB梯度(pH8.0；0.1-1.0M)对反应混合物进行纯化。通过反相HPLC进一步纯化粗产物得到化合物T8，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C49H65N5O19P3S4 +：计算值：1249.2，实验值：1248.9。
方案9. 3’-O-DTM-dCTP-5-SS-Alexa488的合成
N4-DMF-5-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧胞苷(C2)：将5-碘-2′-脱氧胞苷(C1，1g，2.8mmol)、叔丁基二甲基氯硅烷(450mg，3.0mmol)和咪唑(200mg，3.0mmol)溶于干燥DMF(15mL)，并在室温下搅拌过夜。这段时间后，除去溶剂，将残余物加入N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛(1.5mL)的干燥DMF(10mL)溶液。在室温下再继续搅拌10小时，然后在搅拌下将反应混合物倒入冰水(200mL)。通过过滤收集沉淀，并用水和己烷洗涤。将所得粗产物通过柱层析(二氯甲烷/甲醇：20∶1)进行纯化得到N4-DMF-5-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧胞苷(C2，1.02g，70％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.74-8.69(m，1H)，8.27(s，1H)，6.37(dd，J＝7.8，5.6Hz，1H)，4.46(dt，J＝5.9，2.3Hz，1H)，4.16(q，J＝2.6Hz，1H)，3.94(dd，J＝11.3，2.8Hz，1H)，3.84(dd，J＝11.3，2.7Hz，1H)，3.22(d，J＝0.8Hz，3H)，3.19(d，J＝0.5Hz，3H)，2.69(ddd，J＝13.5，5.7，2.4Hz，1H)，2.05(ddd，J＝13.5，7.8，5.7Hz，1H)，0.93(s，9H)，0.15(d，J＝8.9Hz，6H).MS(APCI+)C18H31IN4O4Si：计算值：522.5，实验值：522.5。
N4-DMF-5-碘-′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-甲基硫基甲基-2′-脱氧胞苷(C3)：向搅拌的N4-DMF-5-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧胞苷(C2，1.02g，2.29mmol)的DMSO(10mL)溶液中加入乙酸(2.3mL)和乙酸酐(6.1mL)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后在剧烈搅拌下将反应混合物滴加到饱和碳酸氢钠溶液中，抽滤收集沉淀，并用水和己烷洗涤。将所得粗产物通过柱层析(二氯甲烷/甲醇：30：1)纯化得到纯的产物N4-DMF-5-碘-′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3'-O-甲基硫基甲基-2′-脱氧胞苷，为白色固体(C3，1.05mg，79％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.4(s，1H)，8.22(s，1H)，6.28(dd，J＝7.9，5.6Hz，1H)，4.70(d，J＝11.6Hz，1H)，4.61(d，J＝11.6Hz，1H)，4.48(dt，J＝6.1，2.3Hz，1H)，4.17(q，J＝2.7Hz，1H)，3.97-3.88(m，1H)，3.82(dd，J＝11.2，2.8Hz，1H)，3.21(ddd，J＝17.7，2.0，0.6Hz，7H)，2.68(ddd，J＝13.6，5.7，2.1Hz，1H)，2.16(s，3H)，1.97(ddd，J＝13.8，7.9，6.1Hz，1H)，0.96(s，9H)，0.17(d，J＝6.1Hz，6H).MS(APCI+)C20H35IN4O4SSi：计算值：582.5，实验值：582.4。
N4-DMF-5-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-(叔丁基二硫甲基)-2′-脱氧胞苷(C4)：将N4-DMF-5-碘-′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-甲基硫基甲基-2′-脱氧胞苷(C3，1.05g，1.81mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)，随后加入三乙胺(0.3mL)和分子筛(
2g)。将混合物在冰浴中冷却，室温搅拌0.5小时，然后在2分钟内滴加硫酰氯(0.16mL，1.99mmol)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。去除冰浴，将反应混合物再搅拌0.5小时。然后将对甲苯硫代磺酸钾(614mg，2.71mmol)的无水DMF(3mL)加入混合物。在室温下继续搅拌1小时，随后加入叔丁基硫醇(1mL)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时，并快速过滤通过硅藻土。二氯甲烷洗涤过滤器，并对有机部分进行浓缩。通过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇：30：1)纯化残余物得到化合物C4(648mg，53％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.77-8.71(m，1H)，8.23(s，1H)，6.28(dd，J＝8.0，5.6Hz，1H)，4.92(d，J＝11.2Hz，1H)，4.77(d，J＝11.2Hz，1H)，4.52(dt，J＝5.9，1.9Hz，1H)，4.21(q，J＝2.5Hz，1H)，3.95(dd，J＝11.3，2.7Hz，1H)，3.84(dd，J＝11.3，2.6Hz，1H)，3.23(d，J＝0.7Hz，3H)，3.19(d，J＝0.5Hz，3H)，2.72(ddd，J＝13.7，5.6，1.9Hz，1H)，1.96(ddd，J＝13.9，8.1，6.0Hz，1H)，1.35(s，9H)，0.96(s，9H)，0.18(d，J＝5.9Hz，6H)；MS(APCI+)：C23H41IN4O4S2Si：计算值：656.7，实验值：656.5。
化合物C5：在氮气下，将N4-DMF-5-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-(叔丁基二硫甲基)-2′-脱氧胞苷(C4，420mg，0.64mmol 0.375mmol)、CuI(20mg，0.11mmol)和三乙胺(0.30mL)的混合物在干燥DMF(5mL)中的溶液室温搅拌5分钟，然后加入DTM接头7(213mg，0.70mmol)和Pd(0)(150mg，0.13mmol)。在室温避光下搅拌过夜后，在剧烈搅拌下将反应混合物滴加至盐水(200mL)中，并用乙酸乙酯提取。合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干得到粗制化合物C5。MS(APCI+)C33H54F3N5O6S4Si：计算值：830.1，实验值：829.2。
化合物C6：在不分离的情况下，将粗制化合物C5溶于THF(10mL)中，然后加入TBAF氟化物THF溶液(1.0M，1.0mL，1.0mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。然后，将混合物在真空下浓缩，加入饱和碳酸氢钠溶液(50mL)，混合物用二氯甲烷萃取。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得粗制混合物经快速柱层(二氯甲烷/甲醇：20∶1)纯化得到化合物C6(146mg，由化合物C4进行制备的产率为32％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.77(s，1H)，8.09(s，1H)，7.44(d，J＝7.3Hz，1H)，6.11(t，J＝6.6Hz，1H)，4.95(s，2H)，4.87(d，J＝11.1Hz，1H)，4.76(d，J＝11.1Hz，1H)，4.60-4.48(m，3H)，4.18(q，J＝3.0Hz，1H)，3.98(dd，J＝12.1，2.7Hz，1H)，3.84(dd，J＝12.0，3.2Hz，1H)，3.47(d，J＝6.4Hz，2H)，3.20-3.15(m，6H)，2.96(s，1H)，2.88(d，J＝0.6Hz，1H)，2.59(ddd，J＝13.8，6.1，3.2Hz，1H)，2.35(dt，J＝13.7，6.8Hz，1H)，1.33(s，9H)，1.31(s，6H).13C NMR(75MHz，CDCl3)δ170.96，162.94，159.08，154.94，148.67，146.84，98.35，89.16，86.47，85.90，82.09，81.22，79.85，77.65，62.66，57.65，50.94，47.92，47.31，41.87，41.81，38.42，38.03，36.86，35.76，31.82，30.29，26.01.MS(APCI+)：C27H40F3N5O6S4：计算值：715.9，实验值：715.9。
3’-O-DTM-dCTP-5-SS-NH2(化合物C7)：在室温高真空下将化合物C6(50mg，0.07mmol)、四丁基焦磷酸铵(99mg，0.18mmol)和2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(22mg，0.11mmol)分别干燥过夜。在氩气下将四丁基焦磷酸铵溶于二甲基甲酰胺(DMF，1mL)，随后加入三丁胺(1mL)。在氩气下将混合物注入2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF(2mL)溶液。在搅拌1h后，将反应混合物加入C6的DMF溶液。在室温下再搅拌1小时。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物直至观察到永久的棕色。10分钟后，加入水(30mL)，并将反应混合物在室温下再搅拌2小时。所得溶液用乙酸乙酯提取。水层在真空下浓缩至约20mL，然后加入浓NH4OH(20ml)，将混合物在室温下搅拌过夜。所得混合物在真空下浓缩，用5ml水稀释残余物。然后在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析在4℃下使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)对粗制混合物进行纯化。通过反相HPLC对粗产物进行进一步纯化得到C7，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C22H39N4O14P3S4：计算值：804.0，实验值：807.5。
3’-O-DTM-5-SS-Alexa488-dCTP(化合物C8).向搅拌的Alexa488-NHS酯(2mg，3.1μmol)的DMF(0.2ml)溶液中，加入溶于NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH 8.9，0.1M，0.3ml)的3’-O-DTM-dCTP-5-SS-NH2(化合物C7，3.0μmol)。将反应混合物在室温避光下搅拌3h。在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析在4℃下使用TEAB梯度(pH8.0；0.1-1.0M)对反应混合物进行纯化。将粗产物通过反相HPLC进一步纯化获得化合物C8，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C43H49N6O24P3S6 2-：计算值：1319.2，实验值：1325.1。
方案10. 3’-O-DTM-dATP-7-SS-ROX的合成
N4-DMF-7-脱氮-7-碘-′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧腺苷(A2)：将7-脱氮-7-碘-2′-脱氧腺苷(A1，1g，2.66mmol)、叔丁基二甲基氯硅烷(440mg，2.9mmol)和咪唑(200mg，3.0mmol)的混合物溶于干燥DMF(15mL)，并在室温下搅拌过夜。这段时间后，除去溶剂并将残余物加入N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛(1.5mL)的干燥DMF(10mL)溶液。在室温下再继续搅拌10小时，然后在搅拌下将反应混合物倒入冰水(200mL)。通过抽滤收集沉淀，然后用水和己烷洗涤。将所得粗产物通过柱层析(二氯甲烷/甲醇：20：1)进行纯化得到N4-DMF-7-脱氮-7-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧腺苷(A2，1145mg，79％)。MS(APCI+)C20H32IN5O3Si：计算值：545.5，实验值：545.7。
N4-DMF-7-脱氮-7-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-甲基硫基甲基-2′-脱氧腺苷(A3)：向搅拌的N4-DMF-7-脱氮-7-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧腺苷(A2，1324mg，2.43mmol)的DMSO(10mL)溶液中加入乙酸(3mL)和乙酸酐(8mL)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后在剧烈搅拌下将反应混合物滴加到碳酸氢钠饱和溶液中，抽滤收集沉淀，并用水和己烷洗涤。将所得粗产物通过柱层析(二氯甲烷/甲醇：30∶1)纯化得到纯的产物N4-DMF-7-脱氮-7-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-甲基硫基甲基-2′-脱氧腺苷，为白色固体(A3，956mg，65％).1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.82-8.77(m，1H)，8.45(s，1H)，7.48(s，1H)，6.70(dd，J＝7.7，6.2Hz，1H)，4.76-4.64(m，2H)，4.64-4.55(m，1H)，4.14(td，J＝3.7，2.4Hz，1H)，3.86-3.80(m，2H)，3.32(d，J＝0.6Hz，3H)，3.22-3.17(m，3H)，2.54-2.42(m，2H)，2.19(s，3H)，0.97(s，9H)，0.15(d，J＝6.3Hz，6H).MS(APCI+)C22H36IN5O3SSi：计算值：605.6，实验值：605.1。
N4-DMF-7-脱氮-7-碘-′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-(叔丁基二硫甲基)-2′-脱氧腺苷(A4)：将N4-DMF-7-脱氮-7-碘-′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-甲基硫基甲基-2′-脱氧腺苷(A3，900mg，1.48mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)，随后加入三乙胺(0.3mL)和分子筛(
2g)。将混合物在冰浴中冷却，在室温下搅拌0.5小时，然后在2分钟内滴加硫酰氯(0.13mL，1.63mmol)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。去除冰浴，将反应混合物再搅拌0.5小时。然后将对甲苯硫代磺酸钾(509mg，2.22mmol)的无水DMF(3mL)溶液加入到混合物中。在室温下继续搅拌1小时，随后加入叔丁基硫醇(1mL)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时，并快速过滤通过硅藻土。二氯甲烷洗涤过滤器，并对有机部分进行浓缩。通过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇：30∶1)对残余物进行纯化得到N4-DMF-7-脱氮-7-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-(叔丁基二硫甲基)-2′-脱氧腺苷(A4，733mg，73％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.82-8.77(m，1H)，8.45(s，1H)，7.50(s，1H)，6.69(dd，J＝8.0，6.0Hz，1H)，4.95-4.80(m，2H)，4.63(dt，J＝5.3，2.5Hz，1H)，4.17(td，J＝3.5，2.3Hz，1H)，3.85(dd，J＝3.5，1.2Hz，2H)，3.32(d，J＝0.6Hz，3H)，3.19(s，3H)，2.58-2.41(m，2H)，1.36(s，9H)，0.98(s，9H)，0.16(d，J＝6.0Hz，6H).MS(APCI+)C25H42IN5O3S2Si：计算值：679.7，实验值：679.4。
化合物A5：在氮气下，将N4-DMF-7-脱氮-7-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-(叔丁基二硫甲基)-2′-脱氧腺苷(A4，444mg，0.65mmol)、CuI(20mg，0.11mmol)和三乙胺(0.30mL)的混合物在干燥DMF(5mL)中的溶液在室温下搅拌5分钟，随后加入DTM接头7(310mg，1.02mmol)和Pd(0)(150mg，0.13mmol)。在室温避光下搅拌过夜后，在剧烈搅拌下将反应混合物滴加至盐水中(200mL)，并用乙酸乙酯提取。合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干得到粗制化合物A5。MS(APCI+)C35H55F3N6O5S4Si：计算值：853.2，实验值：853.1。
化合物A6：在不经分离的情况加，将粗制化合物A5溶于THF(10mL)，然后加入TBAF氯化物THF溶液(1.0M，1.0mL，1.0mmol)。将混合物在室温下搅拌2h。然后在真空下浓缩该混合物，加入饱和NaHCO3溶液(50mL)，并用二氯甲烷提取混合物。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，将所得粗制混合物通过快速柱层析(二氯甲烷/甲醇：20：1)进行纯化得到化合物A6(105mg，由化合物A4进行制备的收率为22％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.81(d，J＝6.7Hz，1H)，8.41(d，J＝9.7Hz，1H)，7.28(s，1H)，6.12(dt，J＝12.8，6.5Hz，1H)，4.98(s，2H)，4.88(d，J＝3.3Hz，2H)，4.73(d，J＝5.4Hz，1H)，4.58(s，2H)，4.33(d，J＝4.9Hz，1H)，4.01(dt，J＝12.9，3.1Hz，1H)，3.83(d，J＝8.2Hz，1H)，3.48(d，J＝6.4Hz，2H)，3.23(d，J＝17.2Hz，6H)，3.13-3.00(m，1H)，2.40(dt，J＝13.3，6.6Hz，1H)，1.36(s，9H)，1.34(s，6H).13C NMR(75MHz，CDCl3)δ162.23，158.17，157.08，152.13，151.48，150.16，131.12，113.22，96.29，90.20，86.94，84.09，82.11，81.09，80.16，79.55，64.07，57.57，51.02，47.91，47.28，41.36，37.94，35.91，35.34，30.33，26.01。MS(APCI-)：C29H41F3N6O5S4：计算值：738.9，实验值：737.2。
3’-O-DTM-7-脱氮-dATP-7-SS-NH2(化合物A7)：在室温高真空下将化合物A6(40mg，54μmol)、四丁基焦磷酸铵(60mg，108μmol)和2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(22mg，110μmol)分别干燥过夜。在氩气下将四丁基焦磷酸铵溶于二甲基甲酰胺(DMF，1mL)，然后加入三丁胺(1mL)。在氩气下将混合物注入2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF(2mL)溶液。在搅拌1h后，将反应混合物加入A6的DMF溶液，并于室温下再搅拌1小时。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物直至观察到永久的棕色。10分钟后，加入水(30mL)并将反应混合物在室温下再搅拌2小时。所得溶液用乙酸乙酯提取。水层在真空下浓缩至约20mL，然后加入浓NH4OH(20ml)，并在室温下继续搅拌过夜。所得混合物在真空下浓缩，残余物用5ml水稀释。然后在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析在4℃下使用TEAB梯度(pH8.0；0.1-1.0M)对粗制混合物进行纯化。通过反相HPLC进一步纯化粗产物得到A7，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C24H40N5O13P3S4：计算值：827.0，实验值：830.1。
3’-O-DTM-7-脱氮-dATP-7-SS-ROX(化合物A8)：向搅拌的ROX-NHS酯(2mg，3.2μmol)的DMF(0.2ml)溶液中加入溶于NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH 8.9，0.1M，0.3ml)的3’-O-DTM-7-脱氮-dATP-7-SS-NH2(化合物A7，3.0μmol)。将反应混合物在室温避光下搅拌3h。在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析在4℃使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)对反应混合物进行纯化。通过反相HPLC对粗产物进行进一步纯化得到化合物A8，通过MALDI-TOFMS对其进行表征：C57H69N7O17P3S4 +：计算值：1344.3，实验值：1345.5。
方案11. 3’-O-DTM-dGTP-7-SS-Cy5的合成
N4-DMF-7-脱氮-7-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧鸟苷(G2)：将7-脱氮-7-碘-2′-脱氧鸟苷(G1，1g，2.55mmol)、叔丁基二甲基氯硅烷(420mg，2.8mmol)和咪唑(202mg，3.0mmol)的混合物溶于干燥DMF(15mL)溶液，并在室温下搅拌过夜。这段时间后，除去溶剂，并将残余物加入N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛(1.5mL)的干燥DMF(10mL)溶液。于室温下再继续搅拌10小时，然后在搅拌下将反应混合物倒入冰水(200mL)，抽滤收集沉淀，并用水和己烷洗涤。所得粗产物通过柱层析(二氯甲烷/甲醇：20∶1)进行纯化得到N4-DMF-7-脱氮-7-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧鸟苷(G2，1.07g，77％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.63(s，1H)，8.60(s，1H)，7.11(s，1H)，6.63(dd，J＝7.5，6.2Hz，1H)，4.62(s，1H)，4.03(dt，J＝4.7，3.1Hz，1H)，3.88(dd，J＝10.8，3.2Hz，1H)，3.79(dd，J＝10.8，4.7Hz，1H)，3.52(s，1H)，3.19(s，3H)，3.09(d，J＝0.6Hz，3H)，2.53-2.34(m，2H)，0.97(s，9H)，0.21-0.10(m，6H)。
N4-DMF-7-脱氮-7-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-甲基硫基甲基-2′-脱氧鸟苷(G3)：向搅拌的N4-DMF-7-脱氮-7-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2′-脱氧鸟苷(G2，950mg，1.74mmol)的DMSO(10mL)溶液中加入乙酸(3mL)和乙酸酐(8mL)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。在剧烈搅拌下将反应混合物滴加到饱和碳酸氢钠溶液中，抽滤收集沉淀，并用水和己烷洗涤。所得粗产物通过柱层析(二氯甲烷/甲醇：30：1)进行纯化得到纯的产物N4-DMF-7-脱氮-7-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-甲基硫基甲基-2′-脱氧鸟苷，为白色固体(G3，756mg，70％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.66(s，1H)，8.62(d，J＝0.9Hz，1H)，7.11(s，1H)，6.56(dd，J＝8.1，6.2Hz，1H)，4.76-4.64(m，2H)，4.59(dt，J＝5.2，2.7Hz，1H)，4.11(ddd，J＝4.4，3.1，2.2Hz，1H)，3.88-3.70(m，2H)，3.18(s，3H)，3.16-3.08(m，3H)，2.48-2.32(m，2H)，2.19(s，3H)，0.97(s，9H)，0.15(d，J＝5.9Hz，6H)。
N4-DMF-7-脱氮-7-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-(叔丁基二硫甲基)-2′-脱氧鸟苷(G4)：将N4-DMF-7-脱氮-7-碘-5′-O-叔丁基二甲基硅烷基-3'-O-甲基硫基甲基-2′-脱氧鸟苷(G3，731mg，1.18mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)，随后加入三乙胺(0.2mL)和分子筛(
2g)。在室温下搅拌0.5小时后在冰域中冷却，在2分钟内滴加硫酰氯(0.11mL，1.33mmol)的无水二氯甲烷(3mL)溶液。去除冰浴，并将反应混合物再搅拌0.5小时。然后将对甲苯硫代磺酸钾(417mg，1.82mmol)的无水DMF(2mL)溶液加入混合物。在室温下继续搅拌1小时，然后加入叔丁基硫醇(1mL)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时，并快速过滤通过硅藻土。用二氯甲烷洗涤过滤器，并对有机部分进行浓缩。通硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇：30∶1)对残余物进行纯化得到N4-DMF-7-脱氮-7-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-(叔丁基二硫甲基)-2′-脱氧鸟苷(G4，508mg，62％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.11(s，1H)，8.64(t，J＝0.6Hz，1H)，7.12(s，1H)，6.56(dd，J＝8.4，5.9Hz，1H)，4.94-4.83(m，2H)，4.59(dt，J＝5.8，2.2Hz，1H)，4.19-4.12(m，1H)，3.88-3.75(m，2H)，3.20(s，3H)，3.11(d，J＝0.7Hz，3H)，2.52-2.34(m，2H)，1.42-1.30(m，9H)，0.98(s，9H)，0.16(d，J＝6.0Hz，6H)。
化合物G5：在氮气下，将N4-DMF-7-脱氮-7-碘-5′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-(叔丁基二硫甲基)-2′-脱氧鸟苷(G4，471mg，0.68mmol)、CuI(20mg，0.11mmol)和三乙胺(0.30mL)的混合物在干燥DMF(5mL)中的溶液在室温下搅拌5分钟，随后加入DTM接头7(300mg，0.99mmol)和Pd(0)(150mg，0.13mmol)。在室温避光下搅拌过夜后，在剧烈搅拌下将反应混合物滴加到盐水(200mL)中，并用乙酸乙酯提取。合并的有机层用Na2SO4干燥并过滤。将滤液减压浓缩至干得到粗制化合物G5。
化合物G6：在不分离的情况下，将粗制化合物G5溶于THF(10mL)，随后加入TBAF氯化物的THF溶液(1.0M，1.0mL，1.0mmol)。将混合物在室温下搅拌2h。然后将混合物在真空下浓缩，加入饱和NaHCO3溶液(50mL)并用二氯甲烷提取混合物。有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，将所得粗制混合物通过快速柱层析(二氯甲烷/甲醇：20：1)进行过滤得到化合物G6(121mg，由化合物G4进行制备的收率为24％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.92(s，1H)，8.52(s，1H)，7.66(s，1H)，7.01(s，1H)，6.19(t，J＝7.2Hz，1H)，4.99(s，2H)，4.87(q，J＝11.1Hz，3H)，4.67(s，1H)，4.56(s，2H)，4.22(s，1H)，4.06-3.99(m，1H)，3.91(d，J＝12.1Hz，1H)，3.76(t，J＝10.2Hz，1H)，3.51(d，J＝6.3Hz，2H)，3.20(s，3H)，3.07(s，3H)，2.85(dq，J＝15.3，7.1Hz，1H)，2.41(dd，J＝13.9，6.3Hz，1H)，1.34(d，J＝16.5Hz，15H).13C NMR(75MHz，CDCl3)δ159.36，158.34，157.89，156.59，149.39，125.80，105.45，98.98，87.28，85.52，84.62，81.21，80.16，78.97，77.63，63.33，57.83，50.97，48.01，47.51，41.63，37.96，35.37，31.95，30.30，26.07，25.99，25.66，23.02，14.48。
3’-O-DTM-7-脱氮-dGTP-7-SS-NH2(化合物G7)：在室温高真空下将化合物G6(40mg，53μmol)、四丁基焦磷酸铵(89mg，160μmol)和2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(22mg，110μmol)分别干燥过夜。在氩气下将四丁基焦磷酸铵溶于二甲基甲酰胺(DMF，1mL)，随后加入三丁胺(1mL)。在氩气下将混合物注入2-氯-4-H-1，3，2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的DMF(2mL)溶液。在搅拌1h后，反应混合物加入G6的DMF溶液，并在室温下再搅拌1小时。然后将碘溶液(0.02M碘/吡啶/水)注入反应混合物直至观察到永久的棕色。10分钟后，加入水(30mL)并将反应混合物在室温下再搅拌2小时。所得溶液用乙酸乙酯提取。水层在真空下浓缩至约20mL，加入浓NH4OH(20ml)并在室温下继续搅拌过夜。所得混合物在真空下浓缩，残余物用5ml水稀释。然后在DEAE-SephadexA-25上通过阴离子交换层析在4℃下使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)对粗制混合物进行纯化。通过反相HPLC对粗产物进行进一步纯化得到G7，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C24H40N5O14P3S4：计算值：843.7，实验值：848.0。
3’-O-DTM-7-脱氮-dGTP-7-SS-Cy5(化合物G8)：向搅拌的Cy5-NHS酯(2mg，3.2μmol)的DMF(0.2ml)溶液中加入溶于NaHCO3/Na2CO3缓冲液(pH 8.9，0.1M，0.3ml)的7-脱氮-3’-O-DTM-dGTP-7-SS-NH2(化合物G7，3.0μmol)。将反应混合物在室温避光下搅拌3h。在DEAE-Sephadex A-25上通过阴离子交换层析在4℃下使用TEAB梯度(pH 8.0；0.1-1.0M)对反应混合物进行纯化。通过反相HPLC进一步纯化粗产物得到化合物G8，通过MALDI-TOF MS对其进行表征：C57H77N7O21P3S6-：计算值：1481.6，实验值：1485.2。
3’-O-DTM(SS)-dNTP-SS-“锚”分子的合成：按照与3’-O-DTM(SS)-dNTP-SS-染料的合成步骤相似的步骤合成3’-O-DTM(SS)-dNTP-SS-“锚”的实施例示于图42-45。使用各种“锚”NHS酯而不是各种染料-NHS酯与3’-O-DTM(SS)-dNTP-SS-NH2前体结合生成3’-O-DTM(SS)-dNTP-SS-N3(图42)、3’-O-DTM(SS)-dNTP-SS-PBA(图43)、3’-O-DTM(SS)-dNTP-SS-生物素(图44)和3’-O-DTM(SS)-dNTP-SS-TCO(图45)。
3’-O-DTM(SS)-dNTP-SS-“锚”分子的合成：按照与3’-O-DTM(SS)-dNTP-SS-染料的合成步骤相似的步骤合成3’-O-DTM(SS)-dNTP-SS-“锚”的实施例示于图42-45。使用各种“锚”NHS酯而不是各种染料-NHS酯与3’-O-DTM(SS)-dNTP-SS-NH2前体结合生成以下方案中所述的3’-O-DTM(SS)-dNTP-SS-“锚”分子。
方案12. 3’-O-DTM(SS)-dNTP-SS-N3的合成
方案13. 3’-O-DTM(SS)-dNTP-SS-PBA的合成
方案14. 3’-O-DTM(SS)-dNTP-SS-生物素的合成
方案15. 3’-O-DTM(SS)-dNTP-SS-TCO的合成
3’-DTM-保护基dNTP类似物的合成：这些衍生物的一般结构示于图36。
方案16显示了以5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)核苷酸为原料进行的3’-DTM-保护基团dNTP类似物的合成。
1，1’-硫代二烷基(R1-CH-R2)用于在Bz2O2和2，6-二甲基吡啶存在下制备R1，R2取代的3’-O-烷基(具有R1R2)硫代甲基-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)核苷酸。将所得化合物用硫酰氯、对甲苯硫代磺酸钾以及对应的具有R3、R4和R5基团的硫醇化合物生成R1，R2取代的3’-O-烷基(具有R3、R4和R5)二硫基甲基-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)核苷酸。用1.0M的TBAF的THF溶液除去5’-O-叔丁基二苯基甲硅烷基保护基团后，通过使用已建立的三磷酸化方法将具有游离的5’-OH的所得化合物转化为三磷酸酯得到R1，R2取代的3’-O-烷基(具有R3、R4和R5)二硫基甲基-dNTP。
方案17显示了具有或不具有氘取代的3’-DTM-保护基团dNTP类似物的合成。
DMSO或DMSO-d6用于处理5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)核苷酸产生3’-O-(甲基硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)核苷酸或氘取代的3’-O-甲基硫基甲基-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)核苷酸。使用硫酰氯、对甲苯硫代磺酸钾和相应的烷基硫醇(具有R3、R4和R5基团)处理所得化合物将产生3’-O-(R3，R4，R5-烷基二硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)核苷酸或氘取代的3’-O-(R3，R4，R5-烷基二硫基甲基(D2)-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)核苷酸。除去5’-O保护基团，随后进行三磷酸化以及碱基的去保护(如果适用)将产生最终的产物3’-O-(烷基(具有R3、R4和R5基团)二硫基甲基)-dNTP或氘取代的3’-O-(烷基(具有R3、R4和R5基团)硫代甲基(d2))-dNTP。
方案18显示了以5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)核苷酸为原料进行的3’-DTM-dNTP类似物的合成。
1，1’-硫代二烷基(R1-CH-R2)用于在Bz2O2和2，6-二甲基吡啶的存在下产生R1，R2取代的3’-O-(烷基(具有R1，R2)硫甲基)-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)核苷酸。所得化合物用硫酰氯、对甲苯硫代磺酸钾和相应的具有X-R3、R4和R5(X＝O、S或NH)基团的硫醇化合物以产生R1，R2取代的3’-O-(烷基(具有X-R3、R4和R5)二硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)核苷酸类似物。在用1.0M的TBAF的THF溶液除去5’-O-叔丁基二苯基甲硅烷基保护基团后，通过使用已建立的三磷酸化方法将具有游离的5’-OH的所得化合物转化为三磷酸酯得到R1，R2取代的3’-O-(烷基(具有X-R3、R4和R5)二硫基甲基)-dNTP类似物。
方案19显示了通过用DMSO或DMSO-d6进行处理将5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)核苷酸转化为3’-O-(甲基硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)核苷酸或氘取代的3’-O-(甲基硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)核苷酸。
然后使用硫酰氯、对甲苯硫代磺酸钾以及含有X-R3、R4和R5基团(X＝O、S或NH)的对应硫醇化合物中的一个处理所得化合物产生3’-O-(烷基(具有X-R3、R4和R5基团)二硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)核苷酸或氘取代的3’-O-(烷基(具有X-R3、R4和R5基团)二硫基甲基)-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)核苷酸。在用1.0M的TBAF的THF溶液去除5’-O保护基团后，将5’羟基转化为三磷酸酯，并将所得化合物用氢氧化铵进行处理以去除碱基上的保护基团(如果适用)从而产生最终产物3’-O-(烷基(具有X-R3、R4和R5基团)二硫基甲基)-dNTP或氘取代的3’-O-(烷基(具有X-R3、R4和R5基团)二硫基甲基)-dNTP。
方案20显示了通过在Bz2O2和2，6-二甲基吡啶存在下使用1，1’-硫代双乙烷进行处理制备甲基取代的3’-O-甲基硫基甲基-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷。
将所得化合物用硫酰氯、对甲苯硫代磺酸钾和1，1-二甲基乙硫醇进行处理产生甲基取代的3’-O-叔丁基二硫基甲基-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷。然后用1.0M的TBAF的THF溶液去除叔丁基二苯基甲硅烷基保护基团，通过使用已建立的三磷酸化方法将化合物进一步转化为甲基取代的3’-O-(叔丁基二硫基甲基)-dTTP。
方案21显示了使用DMSO-d6处理产生氘取代的3’-O-甲基硫基甲基-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷。
将所得化合物用硫酰氯、对甲苯硫代磺酸钾和1，1-二甲基乙硫醇进行处理产生氘取代的3’-O-叔丁基二硫基甲基-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷。在用1.0M的TBAF的THF溶液去除叔丁基二苯基甲硅烷基保护基团后，通过使用已建立的三磷酸化方法将所得化合物转化为氘取代的3’-O-叔丁基二硫基甲基)-dTTP。
方案22显示了使用DMSO处理产生3’-O-甲基硫基甲基-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷。
然后将所得化合物用硫酰氯、对甲苯硫代磺酸钾和甲氧基甲基硫醇进行处理产生3’-O-甲氧基甲基二硫基甲基-5’-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)胸苷。在用1.0M的TBAF的THF溶液去除叔丁基二苯基甲硅烷基保护基团后，通过使用已建立的三磷酸化方法将所得化合物转化为3’-O-甲氧基甲基二硫基甲基-dTTP。
染料标记的结合分子的合成。通过将可商购的结合分子原料与各种活化的染料结合来进行与荧光染料缀合的标记结合分子的合成。以下方案显示了Rox标记的四嗪、Alexa488标记的SHA和R6G标记的二苯并环辛炔(DBCO)合成的实施例。
方案23.
多染料缀合的结合分子(以Cy5-四嗪为例)的合成示于以下方案中。
方案24.由可商购原料合成荧光(Cy5)树状聚合物缀合的四嗪(图9A中的A)。Trebler亚磷酰胺和Cy5亚磷酰胺购自GlenResearch公司。首先，使用trebler亚磷酰胺与四嗪结合以产生四嗪-Trebler。在DMT去保护后，将Cy5亚磷酰胺与四嗪-Trebler结合得到Cy5标记的树状聚合物A。对于图9C所示的Cy5标记的树状聚合物B的合成，将第二个trebler亚磷酰胺结合到四嗪-Trebler，接着进行DMT去保护以及与Cy5亚磷酰胺的结合，将产生期望的产物。
方案25.与四嗪缀合的基于肽的荧光(Cy5)树状聚合物(图10中的分子A)的合成。
方案26.与四嗪缀合的基于肽的多荧光染料(Cy5)(图10中的分子B)的合成。
Rox-7-Cy5标记的SHA(示于图11A)的合成。Cy5标记的CPG(GlenResearch)用于在DNA合成仪上启动固相寡核苷酸合成。将dSpacer亚磷酰胺用作连续七个结合循环的构建模块，然后在下一个结合循环中使用Rox标记的dT亚磷酰胺。在最后的结合循环中使用C5氨基修饰剂亚磷酰胺。在GlenResearch方案后于温和条件下进行切割，之后产生氨基修饰的Rox-7-Cy5产物并通过HPLC对其进行纯化。在DMSO/NaCO3、NaHCO3缓冲液(pH8.9)中将SHANHS酯与氨基修饰的Rox-7-Cy5结合得到Rox-7-Cy5标记的SHA。
Rox-3-Cy5标记的DBCO(示于图11B)的合成。Cy5标记的CPG(GlenResearch)用于在DNA合成仪上启动固相寡核苷酸合成。将dSpacer亚磷酰胺用作三个连续结合循环的构建模块，然后在下一个结合循环中使用Rox标记的dT亚磷酰胺。在最后的结合循环中使用C5氨基修饰剂亚磷酰胺。在GlenResearch方案之后于温和条件下进行切割，之后产生氨基修饰的Rox-3-Cy5产物并通过HPLC对其进行纯化。将DBCO NHS酯与氨基修饰的Rox-3-Cy5在DMSO/NaCO3、NaHCO3缓冲液(pH8.9)中结合得到Rox-3-Cy5标记的DBCO。
通过不同的可切割接头与荧光染料缀合的标记结合分子的合成(图15中显示了这些分子的结构)显示在方案27至方案30中。这些化合物是通过将可商购的活化的染料与含有可切割连接部分的结合分子结合来实现的，所述可切割连接部分使用可商购的材料合成。
方案27显示了SHA-2-硝基苄基(接头)-ATTO647N的合成。
方案28.四嗪-偶氮(接头)-ATTO647N的合成。使用文献方法完成N3-偶氮-NHS酯、Rox-偶氮-NHS酯合成和偶氮接头部分的构建。
显示了链霉亲和素-二甲基缩酮(接头)-ATTO647N的示例性合成，并使用文献方法完成二甲基缩酮连接体部分的构建。链霉亲和素显示为深色半圆(即，
)。
方案29.显示了二苯并环辛炔(DBCO)-烯丙基(接头)-ATTO647N的示例性合成。
方案30.显示了二苯并环辛炔(DBCO)-Dde(接头)-ATTO647N的示例性合成，并且使用文献方法42完成了Dde接头部分的构建。
方案31.显示了四嗪-Dde(接头)-ATTO647N和四嗪-Dde(接头)-ROX的示例性合成。
方案32.显示了DBCO-偶氮(-N＝N-接头)-ATTO647N和DBCO-偶氮(-N＝N-接头)-ROX的示例性合成。
方案33.以四嗪-偶氮(接头)-ATTO647N、链霉亲和素-二甲基缩酮(接头)-ATTO647N和二苯并环辛炔-Dde(接头)-ATTO647N为例显示在温和条件下(分别使用N2S2O4、柠檬酸和N2H4)的详细切割反应和使用由偶氮、二甲基缩酮和Dde构建的接头的切割产物。
3′-O-DTM(SS)-dNTP-接头-染料-或-“锚”的示例性合成(图42至图45)显示在下面的方案中。使用各种(TFA)NH-接头-炔代替(TFA)NH-DTM(AA)-炔接头与3′-O-DTM(SS)-5(7)-碘核苷酸结合产生5(7)-接头修饰的核苷酸，然后可以通过5′-OH处的三磷酸化将其转化为5(7)-接头-NH2修饰的dNTP。最后，染料NHS酯或“锚”-NHS酯可用于与3′-O-DTM(SS)-5(7)-接头-NH2修饰的dNTP结合，从而生成各种3′-O-DTM(SS)-dNTP-接头-染料或-“锚”。
方案34. 3′-O-DTM-dCTP-5-硝基苄基-Rox的合成示于图37。
方案35. 3′-O-DTM-dUTP-5-烯丙基-Rox的合成示于图38。
方案36.更一般地说，3′-O-DTM-dNTP-硝基苄基-R(其中R为染料或锚)示于图39。
方案37. 3′-O-DTM-dNTP-烯丙基-R的合成示于图40。
方案38和39.分别通过偶氮和Dde接头进行的染料或锚标记的3’-O-DTM(SS)-dNTP的合成示于图41和图42。
实施例4.使用3’-O-烷基-二硫基甲基-dNTP的长DNA合成
方案40.使用3’-O-烷基-二硫基甲基-dNTP和末端脱氧核苷酸基转移酶合成长DNA的方案。
使用核苷亚磷酰胺化学过程的DNA合成是标准过程，并且用于大多数定制DNA合成需求。然而，合成受限于短的长度(＜120个核苷酸)，并且合成长度＞200个核苷酸的DNA是不切实际的。合成也涉及使用和产生有毒的副产物，对这种有毒废物的处置增加了DNA合成的成本(LeProust et al.，Nucleic Acids Res.(2010)38(8)，2522-2540)。
本发明提供了如下所述的和在上述方案中系统性描述的、使用本发明的3′-O-DTM-dNTP核苷酸进行DNA合成的改进方法。这些核苷酸可以通过使用末端脱氧核苷酸转移酶在模板依赖性(使用DNA聚合酶)和非模板依赖性合成多核苷酸(DNA)中使用。这些核苷酸在3′-O-位上携带可化学切割的二硫键，这会暂停单核苷酸添加后的合成。用THP或TCEP温和处理后，3′-保护基团被切割并且产生游离的3′-OH基团，这会引起下一种核苷酸的加入。
已知末端脱氧核苷酸转移酶以非模板依赖性的方式在多核苷酸的3′-末端掺入天然和修饰的核苷酸。已经进行了各种尝试以将TdT用于受控的单链DNA从头合成(Ud-DeanS.M.M.Syst.Synth Biol.(2009)2，67-73；美国专利5,763,594和US8,808,989)。可逆三磷酸核苷酸对于防止dNTP向不断生长的DNA链的3′末端不受控制地添加是必需的。然而，TdT掺入3′-O-修饰的核苷酸的效率非常有限(WO2016/128731A1)。突变型TdT酶也可用于掺入本发明的3′-O-可逆终止的核苷酸。
因此，本发明提供了制备长DNA的方法，其包括以下步骤：
a)与固体支持物结合的引发序列；
b)在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)存在下，将3′-O-烷基-二硫基甲基dNTP(3′-O-DTM-dNTP)加入到所述引发剂序列中；
c)从引发物序列中除去试剂；
d)在切割剂例如THP或TCEP存在下，从延伸的序列中切割3′-O-保护基团；
e)去除切割剂；
f)重复序列b-e。
本发明方法还提供了用于核酸合成的试剂盒，其包含突变型TdT、引发序列和一组四种或更多种3′-O-可逆保护的dNTP、缓冲液、切割剂和用于DNA合成的试剂盒的使用说明。
也可以使用本发明的模板/引物、DNA聚合酶和四种3′-O-可逆保护的dNTP来进行DNA合成。这会形成确定长度的双链DNA，其可以被变性并分离为单链DNA。
实施例5.合成方法
显示了3′-O-可切割基团-dNTP-SS-标记类似物的一般合成方法。从5(7)碘取代的核苷开始，对碱基上的5′-OH和氨基进行保护。然后使用各种已建立的合成方法将3′-OH转化为3′-O-R6。通过Sonogashira偶联将所得化合物与(TFA)NH-DTM(SS)-炔结构单元偶联，产生5(7)-(TFA)NH-SS-核苷。在除去5′-O保护基后，使用已建立的三磷酸化方法将3′-O-R6-5(7)-SS-核苷转化成3′-O-R6-5(7)-SS-dNTP。进一步将氨基脱保护得到3′-O-R6-5(7)-NH2-SS-dNTP。然后将所得3′-O-R6-5(7)-NH2-SS-dNTP前体与标签(锚或染料)-NHS酯反应以产生3′-O-可切割基团(R6)-dNTP-SS-标签(R)，其中R是指染料或锚分子。
方案41：3′-O-R-dUTP-DTM(SS)-标签(R)的合成，其中R＝染料或锚分子。
方案42：3′-O-R6-dCTP-DTM(SS)-标签(R)的合成，其中R6＝染料或锚分子。
方案43：3′-O-R6-dATP-DTM(SS)-标签(R)的合成，其中R6＝染料或锚分子。
方案44：3′-O-R6-dGTP-DTM(SS)-标签(R)的合成，R6＝染料或锚分子。
方案45：3’-O-烯丙基-dUTP-SS-R6G的合成
方案46. 3’-O-烯丙基-dCTP-SS-Alexa488的合成
方案47. 3’-O-烯丙基-dATP-SS-Rox的合成
方案48. 3’-O-烯丙基-dGTP-SS-Cy5的合成
方案49. 3’-O-N3-dUTP-SS-R6G的合成
方案50. 3’-O-N3-dCTP-SS-Alexa488的合成
方案51. 3’-O-N3-dATP-SS-Rox的合成
方案52. 3’-O-N3-dGTP-SS-Cy5的合成
方案53. 3’-O-硝基苄基-dUTP-SS-R6G的合成
方案54. 3’-O-硝基苄基-dCTP-SS-Alexa488的合成
方案55. 3’-O-硝基苄基-dATP-SS-Rox的合成
方案56. 3’-O-硝基苄基-dGTP-SS-Cy5的合成
方案57. 3’-O-Mom-dUTP-SS-R6G的合成
方案58. 3’-O-Mom-dCTP-SS-Alexa488的合成
方案59. 3’-O-Mom-dATP-SS-Rox的合成
方案60. 3’-O-Mom-dGTP-SS-Cy5的合成
方案61. 3’-O-氨基-dUTP-SS-R6G的合成
方案62. 3’-O-氨基-dCTP-SS-Alexa488的合成
方案63. 3’-O-氨基-dATP-SS-Rox的合成
方案64. 3’-O-氨基-dGTP-SS-Cy5的合成
方案65. 3’-O-偶氮甲基-dATP-SS-标签的合成
方案65. 3’-O-偶氮甲基-dATP-SS-标签的合成
方案66. 3’-O-偶氮甲基-dATP的合成
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<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
Claims (10)
1.一种核苷酸类似物，其包含(i)碱基，(ii)脱氧核糖或核糖，(iii)与所述脱氧核糖或核糖的3'-氧结合的烷基二硫甲基部分，和(iv)与通过二硫甲基接头结合至所述碱基的可检测标签。
2.根据权利要求1所述的核苷酸，其中所述二硫甲基接头具有如下结构：
其中α'表示通过其与所述碱基形成共价连接的一个或多个原子，β'表示通过其与所述可检测标签形成共价连接的一个或多个原子。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的核苷酸类似物，其中所述烷基二硫甲基部分具有以下结构：
其中R为烷基二硫甲基部分的烷基部分，波浪线表示与所述3'-氧连接的点；
其中所述烷基二硫甲基选自甲基二硫基甲基、乙基二硫基甲基、丙基二硫基甲基、异丙基二硫基甲基、丁基二硫基甲基、叔丁基二硫基甲基和苯基二硫基甲基。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物的结构选自由以下组成的组：
其中R为甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基或苯基；n为2-11，m为1-4。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的核苷酸类似物，其中，所述烷基二硫甲基部分和所述二硫甲基接头均可被三-(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(羟丙基)膦(THP)切割。
6.具有下式的化合物：
其中
B为碱基；
L1为共价接头；
L2为共价接头；
R3为-OH、单磷酸酯、多磷酸酯或核酸；
R4A为氢、-CH3、-CX1 3、-CHX1 2、-CH2X1、-CN、-Ph,、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R4B为氢、-CH3、-CX2 3、-CHX2 2、-CH2X2、-CN、-Ph、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基；
R5为锚部分；
R6为氢或聚合酶相容的可切割部分；
R7为氢或-OR7A，其中R7A为氢或聚合酶相容的可切割部分；以及
X1和X2独立地为卤素。
7.根据权利要求6所述的化合物，其中
L1为L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；
L1A、L1B、L1C、L1D和L1E独立地为键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的亚杂芳基；
其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键；
或者
L1为L1A-L1B-L1C-L1D-L1E；
L1A、L1B、L1C、L1D和L1E独立地为键、取代或未取代的C1-C8亚烷基、取代或未取代的2-8元亚杂烷基、取代或未取代的C3-C8亚环烷基、取代或未取代的3-8元亚杂环烷基、取代或未取代的C6-C10亚芳基、或者取代或未取代的5-10元亚杂芳基；
其中L1A、L1B、L1C、L1D和L1E中的至少一个不是键。
8.根据权利要求6-7中任一项所述的化合物，其中L2为L2A-L2B-L2C-L2D-L2E；并且L2A、L2B、L2C、L2D和L2E独立地为键、-NN-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基、或取代或未取代的亚杂芳基；其中L2A、L2B、L2C、L2D和L2E中的至少一个不是键。
9.一种组合物，其包括至少两种不同类型的根据权利要求1-8中任一项所述的核苷酸类似物，其中每种类型的核苷酸类似物包含与每种其他类型的核苷酸类似物不同的碱基和不同的可检测标签。
10.一种对核酸进行测序的方法，其包括：
a)提供
1)核酸，
2)核酸聚合酶，
3)能够与所述核酸杂交的引物，和
4)根据权利要求1-5的四种不同的经标记的核苷酸类似物，每种核苷酸类似物包含(i)碱基；(ii)脱氧核糖或核糖；(iii)与所述脱氧核糖或核糖的3'-氧结合的烷基二硫基甲基部分；和(iv)通过二硫基甲基接头结合至所述碱基的可检测标签，并且其中每种核苷酸类似物包含特有的碱基和特有的可检测标签；
b)用所述核酸聚合酶将一种或多种所述核苷酸类似物掺入所述引物中以产生延伸链；
c)检测每个掺入的核苷酸类似物的所述特有的可检测标签，从而鉴定所述延伸链中每个掺入的核苷酸类似物，由此对所述核酸进行测序。
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