KR960005720B1 - 알키닐 아미노 누클레오티드의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

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Description

알키닐 아미노 누클레오티드의 제조 방법
본원 발명은 알키닐아미노-누클레오티드에 관한 것이며 특히 형광을 기초로 한 DNA 서열화 방법에 사슬-종결 기질로서 형광으로 표시된 누클레오티드를 제조할 때 그것을 사용함에 관한 것이다.
DNA 서열화는 현대 분자 생물학적의 분석적 기법에 있어서 하나의 초석이다. 서열화를 위한 신뢰할 수 있는 방법의 발전은 유전 정보 구조의 이해에 커다른 진보를 가져 왔으며 유전 물질을 조종하는 것을(유전 공학이라 일컬어 진다) 가능케 하였다.
현재 DNA 서열화에 두가지 일반적 방법이 있다 : 맥삼-길버트의 화학적 분해 방법[A.M. 맥삼 일동 Meth. in Enzym., Vol. 65, 499-599(1980)]과 생거의 이탈산소 사슬 종결(dideoxy chain termination) 방법[F. 생거 일동 Proc. Nat. Acat. Sci. USA, Vol. 74, 5463-5467(1977)]. 이 두가지 기법의 공통 특징은 전기 영동에 의하여 분석되는 DNA 단편의 조합을 생성하는 것이다. 이 기법들을 이러한 단편을 제조하는 방법에서 차이가 난다.
맥삼-길버트 기법에서는, DNA 단편을 서열화하려는 DNA 조각의 염기 특이적 화학적 절단에 의하여 제조한다. 서열화하려는 DNA 조각을 먼저 p32로 5'-말단에 표지하고나서 4부분으로 나눈다. 주어진 염기(들)의 인접한 위치에서 DNA을 절단하기 위해 여러가지 각 부분을 일련의 화학처리에 적용한다. 결과로서 모든 표지된 단편의 DNA원 조각과 동일한 5'-말단을 가지며 절단의 위치로 정의된 3'-말단을 가질 것이다. 이러한 처리는 겔 전기영동법에 의한 분리에 알맞은 길이를 갖는 DNA 단편을 제공하는 조건에서 수행된다.
생거의 기법에서 DNA 단편은 서열화하려는 DNA 조각을 부분적으로 효소적 복제(합성)하여 제조한다. 통상의 경우에 서열화하려는 DNA 조각은 표준기법을 사용하여 박테리아파지 M13와 같은 크고 원형인 한가닥의 DNA 조각에 삽입시킨다. 이것이 복제 과정의 주형이 된다. 삽입부의 바로 위인 주형 부위에 대하여 상보적 서열을 갖는 DNA의 짧은 조각이 합성의 프라이머로서 주형에 부가된다. 4개의 천연 데옥시리보 누클레오시드 트리포스페이트(dNTP)의 존재하여, DNA 폴리머라제는 프라이머를 3'-끝으로부터 확장시켜 삽입의 영역에서 주형의 상보적 복제를 초래할 것이다. 완전한 서열화 단편 조합을 얻기 위하여 4개의 반응을 병행하여 수행하는데, 각각은 각 염기에 하나씩 단일의 디데옥시리보누클레오시드 삼인산(ddNTP) 종결제 4개의 dNTP를 함유하고 있다(32P로 표시된 dNTP)가 표지 단편을 제공하기 위하여 첨가된다). dNTP가 폴리머라제에 의하여 통합된다면, 사슬 확장은 계속될 수 있을 것이다. 상응하는 ddNTP가 선택된다면, 사슬은 종료된다. ddNTP대 dNTP의 비율은 DNA 단편이 적당한 길이가 되도록 조정한다. 그리하여, 4개의 반응 혼합물 각각은 3'-말단과 프라이머에 의하여 정해진 5'-말단에서 동일한 디데옥시누클레오시드 잔기를 가지는 단편의 분포를 가질 것이다.
용어 종결제(terminator) 사슬 종결졔(chain terminator) 및 사슬 종결 기질(chain terminating substrate)은 주형-지시 방식으로 핵산을 복제하는 효소에 의하여 DNA 또는 RNA 사슬의 3'-말단에 통합될 수 있고 일단 통합되면, 부가의 사슬 확장을 막는 기질을 나타내기 위하여 구별없이 전체적으로 사용된다. 반대로 천연데옥시누클레오티드 기질은 "사슬 생장 기질"로 간주될 수 있다.
용어 "누클레오시드"는 일 분자의 피리미딘 또는 푸린(또는 그 유도체)과 일 분자의 리보스 당(또는 그 유도체 또는 동등한 관능기를 가지는 물질)로 구성되는 헤테로 고리 염기-당 단위를 표시하기 위하여 전체적으로 사용된다. 용어"누클레오티드"는 누클레오시드 또는 부인산화 유도체를 표시하기 위하여 전체적으로 사용된다.
생기 및 맥삼-길버트 방법 모두에 있어서, 염기 서열 정보는 일반적으로 물리적 방법에 의하여 직접 결정될 수 없으며 분리해석될 수 있는 사슬-길이 정보로 전환되었다. 이러한 분리해석은 전기 영동법에 의하여 성취될 수 있다. 변성 조건(고온, 우레아 퍼센트 등등)하에서, 짧은 DNA 단편은 딱딱한 막대기와 같이 이동한다. 전기 영동을 위해 겔 메트릭스를 사용한다면, DNA 단편은 크기에 따라 분류될 것이다. 서열화를 위하여 필요한 단일-염기 분석은 보통 수백 염기 이하를 함유하는 DNA 단편에 대해 가능하다.
완전한 서열을 얻기 위하여, 맥삼-길버트 또는 생거 방법론에 의하여 만들어진 4가지 단편 조합을 4개의 평행 레인에서 전기 영동 처리에 적용시킨다. 이리하여 단편은 겔의 길이를 따라 공간을 두고 분류된다. 표지 단편의 패턴을 보통 오토라디오그라피(즉 노출은 겔과 필림을 일정시간 동안 샌드위칭함으로써 이루어진다)에 의하여 감광성 필름에 옮긴다. 현상된 필름은 4개의 레인에 분산된 연속띠를 보여주는데, 이것은 통상 서열 사다리라 불리운다. 이 사다리는 시각적으로 이 필름을 스캐닝(짧고 빠르게 움직이는 단편부터 시작하여)하고 사다리의 각 계단에 대해 다음 띠가 나타나는 레인을 결정함으로써 해독된다. 각 레인은 주어진 염기(또는 맥삼-길버트의 경우에는 염기의 조합)와 연관되기 때문에 레인의 선형적 순열은 바로 염기 서열로 해석된다.
DNA 서열화를 위한 생거와 맥삼-길버트 방법은 개념적으로 우아하며 효율적이지만 수행하기 어렵고 많은 시간을 요한다. 이러한 기법의 분석은 단일 방사성 동위원소 리포터의 사용에 따른 많은 문제점을 보인다(리포터는 적합한 물리적 또는 화학적 탐지 장치 또는 방법에 의하여 용이하게 측정되고 탐지될 수 있는 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 화학기로서 정의 할 수 있다). 용이한 탐지는 색변화, 냉광, 형광 또는 방사선과 같은 특성에 의하여 제공될 수 있고; 또는 리간드 인지 부위로서 작용하여 종래의 탐지 방법(예를 들면 색도계, 분광기, 형광분석기 또는 방사선 계측기)에 의해 탐지될 수 있는 기를 함유하는 특이적 리간드-리간드 착물을 형성하는 리포터의 기능에 의해 제공될 수 있다. 리간드-리간드 착물은 단백질-리간드, 효소-기질, 항체-항원, 탄수화물-렉틴, 단백질-코팩터(cofactor), 단백질-이펙터(effector), 핵산-핵산 또는 핵산-리간드 착물의 형태일 수 있다.
높은 특이 활성의32P와 같은 단명의 방사성 동위 원소의 사용은 보관 및 건강과 안전의 관점에서 문제가 있다.32P는 짧은 반감기 때문에 몇일분의 시약을 미리 예기해야하며 즉시 사용해야 한다. 일단 32P-표지 DNA 서열화 단편이 만들어지면 자체 파괴가 될 수 있으므로 곧장 전기 영동 분석해야 한다. 단일 염기 분리를 달성하는데 요구되는 큰 전기 영동겔은 많은 부피의 오염된 버퍼(buffer)를 초래하므로 이것은 폐기물 처리의 문제를 야기시킨다. 뒤이어 겔내 표지 DNA 단편을 현시하기 위한 오토라디오그라피는 느린 공정(밤새 노출이 보통이다)이므로 총 수행 시간에 상당한 시간이 부가되어야 한다. 마지막으로, 이러한 잠재적 방사성 동위 원소와 관련된 건강상의 위험이 있을 수 있다.
4가지 염기의 위치를 분석하기 위해 단일 리포터만을 사용하는 것은 전체 공정에서 상당한 조작상의 번잡함을 초래한다. 화학적/효소적 단계는 별개의 용기에서 수행해야 하며 전기 영동 분리는 4개의 평행한 레인에서 수행해야 한다. 이동상의 열 유도 왜곡은 표지 DNA 단편의 비뚤어진 상(예를들면 스마일 효과)을 보이며 이것은 4개의 레인은 비교하는데 어려움을 준다. 이러한 왜곡은 자주 단일 겔 상에서 해독할 수 있는 염기 숫자를 제한한다.
4개의 평행 레인을 기본적으로 사용하는 것과 함께 오토라디오그래프상(象) 처리에 드는 장시간은 "스냅샷"의 포착 모드를 강요한다. 많은 띠의 동시 공간적 분리가 필요하므로 대단히 큰 겔이 사용되어야 한다. 이러한 것은 부가의 문제를 야기하는데; 큰 겔은 취급하기 힘들고 실행이 느리며 전체 공정에 많은 시간을 부가한다. 마지막으로, 매뉴얼 해석의 문제가 있다. 서열 사다리를 염기 순열로 전환하는 것은 고도로 숙련된 과학자의 완전한 주의를 요구하는 시간 집약적이고 실수하기 쉬운 공정이다. 해독을 자동화하기 위한 많은 시도가 이루어졌으나 약간의 기계적 보조 장치가 있을뿐 서열겔을 해석하는 공정은 여전히 느리고 수고가 많이 드는 작업이다.
이러한 문제점을 해결하기위하여 다른 비-방사성 동위 원소 리포터/탐지 시스템으로32P/오토라디오그라피를 대체하는 것이 고려되었다. 이러한 탐지 시스템은32P에 필적하는 감도를 얻을 정도로 매우 민감해야 한다; 서열화 겔 상의 각 띠는 10-16몰 정도의 DNA를 함유한다. 이러한 수준의 감도를 얻을 수 있는 탐지 방법은 형광이다. DNA 단편인 하나 이상의 형광 표지(형광 염료)로 표지될 수 있다. 적당한 광원에 의한 들뜸은 표지로부터의 특징적인 방사광을 초래하여 띠를 명시한다.
형광 표지의 사용은 방사성 동위 원소 표지와 달리, 탐지 시스템을 상기의 특정 용도에 맞추는 것을 쉽게한다. 예를 들면, 몇몇 방사 특성(예를 들면 분광분포, 수명, 편광)을 기초로 하여 분별가능한 4개의 다른 형광표지를 사용하면 주어진 표지를 주어진 염기와 연결된 서열화 단편과 독특하게 관련짓는 것이 가능하다. 이러한 관련성이 성립되면 단편을 조합하고 단일 레인에서 분리할 수 있고 염기 할당치는 선택된 방사 특성을 기초로 하여 직접적으로 만들 수 있다.
지금까지 형광에 기초를 둔 DNA 서열화 시스템을 개발하기 위한 두가지 시도를 기술했다. 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지에서 개발된 첫번째 시스템은 L.M. 스미드의 서독 특허 출원 #DE 3446635 AL(1984) : L.E. 후드 일동의 서독 특허 출원 #DE 3501306 Al 1985 : L.M. 스미드 일동의 뉴클레익애시드 리서치, Vol, 13 2399-2412 (1985) : 및 L.M. 스미드 일동의 네이처(Nature), Vol. 321, 674-679(1980)에 기재되어 있다. 이러한 체계는 개념적으로 앞서 서술한 문제를 개념적으로 언급하고 있지만 방법상의 특성으로 인해 스미스의 시도는 단지 부분적인 성공만을 가능케 한다. 예를 들면, 이 시스템에 사용되는 형광 표지된 DNA 서열화 단편의 최대 방상의 장파장 범위는 모든 4개의 염료를 단일 단색광원(monochromatic Source)으로 효과적으로 들뜨게 하는 것을 어렵게 한다. 더욱 중요한 것은, 다른 수전하를 가진 염료로부터 발생되는 전기 영동 이동에 있어서 중요한 미분적인 변동이 이 시스템에 사용되는 염료의 조합으로 단일 레인 서열화를 수행하는 것을 어렵거나 불가능하게 한다는 것이다. 이러한 단점은 스미스 일동이 명백하게 지적하고 있다.
일반적으로 형광 표지 서열화 단편을 만드는데 사용하는 방법론이 단점을 초래한다. 맥삼-길버트 서열화에 있어서, 5'-표지 올리고 누클레오티드는 제한 절단에 의하여 생성되는 끈끈한 말단을 가진 2중 가닥의 DNA 단편에 효소적으로 묶여있다. 이것은 이러한 양상으로 생성되는 서열화 단편에만 한정된다. 생거 서열화의 경우에는, 5'-표지 올리고 누클레오티드를 프라이머로 사용한다. 네개의 특별한 프라이머가 필요하다. 새로운 벡터 시스템을 사용하기 위해 실험자는 네개의 새로운 염료-표지된 프라이머를 합성하고 정제하는 복잡한 과정을 거쳐야만 한다. 특별한 프라이머가 적용될 때 마다 마찬가지일 것이다.
표지된 프라이머의 사용은 다른 관점에서도 역시 열등하다. 중합 반응을 여전히 분리된 용기에서 수행해야 한다. 맥삼-길버트와 생거 서열화 시스템에서와 같이, 실질적으로 표지된 프라이머로부터 유도된 모든 단편이 형광으로 표지될 것이다. 따라서, 결과얻어지는 서열화 패턴은 효소적 사슬 확장이 사슬 종결제와다른 공정에 의하여 방해 받을 때 발생하는 대부분의 공통된 가공물(예를들면 허위 또는 음영 띠, 집적)을 가질 것이다.
두번째 시도로, W. 안소르게 일동은(J. Biochem Biophys. Methods. Vol. 13,315-323(1986)] 단일 5'-테트라메틸로다민 형광 표지가 17-염기 올리고 누클레오티드 프라이머의 5'-말단에 공유 결합되어 있는 비-방사성 동위 원소 DNA 서열화 기법을 기술하고 있다. 상기 프라이머는 일련의 효소적으로 복제된 다양한 길이의 DNA 단편을 제공하기 위한 표준 디데옥시 누클레오티드 서열화 화학에 의하여 4개의 용기에서 효소적으로 확장된다. 4개의 용기 각각은 4개의 겔 레인에서 종래의 전기 영동식 분리에 의해 말단 염기 지정을 수행케 하는 4개의 DNA 염기의 하나에 상당하는 디데옥시누클레오티드 사슬 종결제를 함유한다. 5'-데트라메틸-로다민 형광 표지는 전체 겔의 폭을 통과하는 아르곤 이온레이저 광선에 의하여 여기된다. 상기 시스템은 형광리포터가 방사성 리포터 대신에 사용되는 잇점은 있지만 종래의 서열화와 표지 프라이머를 만드는 것과 연관된 모든 불이익은 여전히 남아있다.
최근까지, 아무도 형광 탐지의 잇점과 종결제 표지를 결합시킨 DNA 서열화 시스템을 만들지 못했다. 적절한 형과 표지된 사슬 종결제가 고안될 수 있다면, 표지된 서열화 단편은 표지된 사슬 종결제가 효소적으로 서열화 단편에 통합될 때 만 생성되어 다른 표지 방법과 관련된 많은 가공물을 제거할 것이다. DNA를 서열화하는데 필요한 4개의 사슬 종결제 각각이 별개의 구별 가능한 형광 리포터에 공유 결합되어 있다면, 원리적으로는, 단일프라이머 확장 반응 중에 4개의 모든 종결제를 통합시키고나서 단일의 겔 레인에서 결과의 서열화 단편을 해석하는 것이 가능해야 한다. 이러한 형광 표지된 사슬 종결제가 고안될 수 있다면, 이러한 화합물은 다른 형태의 핵산의 효소적 표지에도 유용할 것이다. 특히 형광 표지 사슬 종결제의 유사체는 다른 비형광성 리포터를 사용하기 위하여 또는 주형 지시 방식으로 핵산을 자기 복제하는 효소(예를들면, 역 전사 효소, RNA 폴리머라제 또는 DNA 폴리머라제)를 위한 사슬-전파 기질로서 사용하기 위하여 고안될 수 있다. 리포터를 서열화에 유용한 방식으로 DNA에 혼입하는 것은 가장 어려운 핵산 표지의 문제점 중 하나이다. DNA 서열화를 위해 개발된 화합물 및/또는 방법을 많은 다른 표지 문제점에도 적용할 수 있다.
형광을 기초로 한 DNA 서열화를 위한 사슬-종료 기질로서 유용하기 위하여, 기질은 형광 표지를 함유해야 하고 DNA 서열화에 유용한 효소에 의하여 받아들여져야 한다. 적당한 기질로는 자연 발생 누클레오티드의 유사체 또는 유도체가 예상된다. 형광 표지와 누클레오티드가 복제효소의 활성 부위에 동시에 들어맞지 않을 것이 예상되기 때문에, 잘 고안된 기질은 형광 표지를 효소의 활성 부위에서 먼곳으로 위치시키기 위하여 충분한 길이와 적당한 구조를 갖는 연결기에 의하여 누클레오티드로부터 분리된 형광 표지를 가져야 한다. 연결기의 성질은 사용되는 표지와 효소 모두에 따라 변할 수 있다. 그러나, 합성의 용이함과 표지 및/또는 효소 조건의 변동에 대한 적응성으로 인해, 연결기를 누클레오티드와 형광 표지에 부착된 링커로 구성된 것으로 간주하는 것이 가장 편리하다.
DNA 서열화를 위한 형광 표지된 사슬 종결제의 고안에 있어서 링커는 몇몇 조건을 만족시켜야 한다 : 1) DNA 내에서 발견되는 모든 4개의 염기에 대하여 동일한 또는 동등한 관능성을 가진 링커를 부착할 수 있어야 한다; 2) 링커는 표지 누클레오티드가 DNA 서열화에 유용한 효소의 사슬 종료 기질로서 유효하게 사용되는 것을 방해해서는 안된다; 3) 링커 (+ 임의의 스페이서 및 표지는) 링커가 붙은 염기와 무관한 방식으로 링커가 부착된 올리고누클레오티드의 전기 영동을 교란해야 한다; 4) 링커를 염기와 스페이서 또는 표지에 부착시키는 것은 단일의 잘 정의된 누클레오티드 기질을 얻기 위하여 입체선택적이고 레지오선택적이어야 한다; 5) 링커는 표지와 커플링하는 1차 또는 2차 아민을 함유하는 것이 바람직하다.
다섯개의 다른 유형의 아민 링커가 표지를 누클레오티드와 올리고누클레오티드(하기 참조)에 부착하기 위하여 공개되었으나, 상기 링커 중 어느것도 DNA 서열화에 유용한 사슬 종료 기질에 사용되기 위한 상기 열거한 다섯개의 모든 조건을 반복시키지 못했다. 베그르스트롬 일동[J. Am. Chem. Soc. Vol. 98, 1587(1976)]은 올레핀에 대한 5-머큐리오-우리딘의 Pd(II)-촉매 커플링에 의하여 알켄-아미노와 아크릴레이트 측쇄를 누클레오시드에 부착하는 방법을 공개하고 있다. 루쓰(PCT/US84/00279)는 리포터를 효소없이 합성된 클리고누클레오티드에 부착시키기 위한 링커로서 상기 측쇄의 사용을 공개하고 있다. 랑거 일행은 [Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Vol, 78, 6633(1981)] 리포터를 누클레오티드에 부착하기 위한 알릴아미노 링커의 사용을 공개하고 있다. 이러한 링커의 단점은 적당한 수은 누클레오티드 전구체를 레지오 선택적으로 제조하는 어려움과 약간의 상기 누클레오티드/올레핀 커플링 반응에 위해 야기되는 혼합 생성물을 분리하는 어려움과 비닐치환 누클레오시드의 잠재적 불안정을 포함한다. 클레반 일동(WO 86/02929)은 시티딘의 N4 위치와 아데노신 치환 누클레오시드의 잠재적 불안정을 포함한다. 클레반 일동(WO 86/02929)은 시티딘의 N4 위치와 아데노신의 N6 위치에 링커를 부착시키는 방법을 공개하고 있다. 상기 방법의 단점은 우리딘과 구아노신에 링커를 부착시킬 유사한 위치가 없다는 것이다.
상기 조건을 만족하는 다른 가능한 링커는 알키닐 아미노 링커인데, 이것은 3중 결합의 한 말단이 누클레오시드에 부착되어 있고 3중 결합의 다른 말단은 1차 또는 2차 아민을 포함하는 기에 부착되어 있다. 화학적 안정을 확실히 하기 위하여, 아민은 삼줄 결합에 직접 부착되어서는 안된다. 알킬기를 누클레오시드에 부착시키기 위한 몇몇 방법이 공개되어 있다(하기 참조).
바르 일동[J. Chem. Soc., Perkins Trans. 1, 1263-1267 (1978)]은 5-에티닐 우리딘, 2'-데옥시-5-에티닐우리딘, 5-에티닐시토신, 5-에티닐시티딘, 2'-데옥시-5-에티닐시티딘과 2'-데옥시리보누클레오시드의 α-아노머를 공개하고 있다. 2'-데옥시리보누클레오시드는 헤테로 고리를 만들고 관능기를 가진 2-데옥시 당과 커플링시키고 아미노 혼합물을 분리하고 당의 보호기를 제거함으로서 만들었다.
베르그스트롬 일동[J. Am. Chem. Soc, Vol, 100, 8106 (1978)]은 알켄을 우라실 누클레오시드의 5-머큐리 또는 5-요오드 유도체와 팔라듐 촉매로 커플링시키는 것을 공개하고 있다. 상기 방법은 알킨과 우라실 누클레오시드 유도체의 유사 반응에서 실패한 것으로 보고되었다.
빈센트 일동[Tetrhedron Letters, Vol. 22, 945-947 (1981)]은 팔라듐 또는 니켈 촉매[디클로로-비스(트리페닐포스핀)-팔라듐(II), 디클로로-비스)벤조 니트릴)팔라듐(II) 또는 디클로로(에틸렌-(비스(디페닐포스핀)-니켈(II) 존재하에 0-3',5'-비스(트리메틸실릴)데옥시우리딘과 알키닐 아연 시약관의 반응에 의한 5-알키닐-2'-데옥시우리딘의 합성을 공개하고 있다.
로빈 일동 J. Org. Chem., Vol. 48, 1854-1862(1983)은 따뜻한 트리에틸 아민내의 비스(트리페닐 포스핀)-팔라듐(II) 클로라이드와 요오드화 구리(I) 존재하에 말단 알킬, HC≡CR(R은 H, 알킬, 페닐, 트리알킬실릴, 히드록시 알킬 또는 보호된 히드록시알킬)을 5-요오드-1-메틸우라실과 5-요오드 우라실 누클레오시드(그의 p-톨루일 에스테르로 보호됨)에 커플링시키는 방법을 공개하고 있다. 3',5'-디-O-아세틸-5-요오드-2'-데옥시우리딘이 헥신, 4-(p-톨리일옥시)부틴, 4-(테트하리드로 피라닐옥시) 또는 4-(트리틸옥시)부틸과 반응할 때, 주요 생성물은 바라는 알키닐 우리딘 보다는 환화된 푸라노[2,2-d] 피리미딘-2-온이었다.
상기 참고 문헌의 어떤 것도 알킬아미노 링커를 누클레오시드에 부착하는 방법을 제공하지 않는다. 베르그스트롬의 방법론은 실패이고, 바르의 것은 바로 적용될 수가 없다. 로빈 일동과 빈센트 일동에 의하여 사용된 촉매는 알킨이 아미노기를 함유할 때 무수히 많은 불필요한 부반응(예를 들면 환화 또는 아민의 알킨에 대한 분자간 친핵 첨가)을 증가시킬 가능성이 있다. 커플링 반응은 전자 결핍 우라실 염기를 포함하는 요오드 누클레오시드에 대해서만 보고되었다. Pd-촉매 커플링 반응은 일반적으로 전자-결핍 요오드화 아릴과 잘 일어나므로 알킨을 다른 세개의 염기 어느 것(모두 우라실 보다 전자가 풍부하다)에나 커플링시키는데 문제점이 예측된다.
알키닐 아미노 누클레오티드의 필요성과 그들의 제법을 허용하는 방법에 대한 필요성이 있다.
본원 발명의 화합물은
Nuc-C≡C-R1-NR2R3(1)
의 구조를 갖는 알키닐 아미노-누클레오티드로서, 여기서 R1은 치환 또는 비치환의 1-20 원자를 갖는 디라디칼 부분이다. R1은 임의로 사슬내 2중 결합, 3중 결합, 아릴기 또는 N, O 또는 S와 같은 헤테로 원자를 갖는 C1-C20의 직쇄 알킬렌일 수 있다. 헤테로 원자는 에테르, 티오에테르, 에스테르, 아민 또는 아미드와 같은 관능기의 부분일 수 있다. 바람직하게, R1은 C1-C10의 직쇄 알킬렌이고; 가잘 바람직하게 R1은 CH2-이다. R1의 치환기는 C1-C6알킬, 아릴, 에스테르, 에테르, 아민, 아미드 또는 염소기를 포함하고 R2와 R3는 독립적으로, H, C1-C4알킬 또는 아실, 알콕시카르보닐 또는 설포닐과 같은 보호기이다. 바람직한 R2는 H이며, R3는 H 또는 트리플루오로아세틸이며; NUc(누클레오티드)는 R4-Het(헤테로 고리 염기)이다.
Z는 H 또는 NH2이고; 그리고 R4는 당 또는 당과 유사한 부분이고;
그리고 여기서 R5는 H, PO3H2, P2O6H3또는 그 염이며, R7=R8=H일때 R6=H, OH, F, N3또는 NH2이고; 또는 R7=H이고 R8=OH일 때 R6=H 또는 OH이고; 또는 R7=OH이고 R8=H 일때 R6=OH이다.
본 발명의 표지된 알키닐아미노-누클레오티드는 R3가 리포터인 구조I이다. 리포터를 염기-특이적 양식으로 DNA 서열화 단편에 통합하는데 사용되는 기법은 모든 DNA 서열화 체계의 중요한 특징이다. 본 발명의 알키닐아미노 누클레오티드의 사용은 리포터(표지)를 알키닐아미노-누클레오티드 사슬 종결제에 부착함으로서 생거의 방법을 가장 유리하게 변형시키는 것을 가능하게 한다. 리포터는 다양한 범위의 탐지 용이한 기(표지)에서 선택할 수 있지만, 편의상 바람직한 시도는 하기에 설명되는 형광 리포터를 사용하는 것이다. 이러한 시도는 많은 조작상 잇점을 제공한다. 가장 중요한 것은, 종결제 표지는 부착된 리포터를 염기-특이적 종결과 굳게 결속시키는다는 것이다. 진정한 종결과정에서 기인한 DNA 서열화 단편만이 리포터를 가질 것이다. 상기 종래의 서열화에서 관찰되었던 가공물(거짓띠)를 없앨 것이다. 상기 시도는 또한 특별한 프라이머를 포함하지 않기 때문에 서열화 벡터의 선택에 유연성을 줄 것이다. 리포터가 단일 반응으로 선택적으로 도입될 수 있는 4개의 저분자량 시약에 의하여 운반된다는 사실로부터 자동화가 용이하게 된다.
고유한 조작상의 단점은 없다; 이러한 시도의 문제점은 디자인 단계에서 부닥친다. 일반적으로, DNA를 서열화하는데 사용되는 효소는 기질 선택성이 강하여 서열화 효소를 위한 효과적인 사슬-종료 기질인 공유 결합된 리포터를 가진 누클레오시드 삼인산염을 만들 수 있는 것이란 선험적인 기대는 이유없다. 기질에 대한 리포터의 부착은 기질의 입체 구조 및 전자적 특성에 많은 변화를 초래하기 때문에 효소에 수용되는 것은 방해하고, 수용되었다 하더라도, DNA 사슬에 통합되지 않을 것이다. 그러나 본원 발명의 알킬아미노 링커의 작은 크기와 알킬아미노 링커를 피리미딘 누클레오티드의 5-위치에 그리고 퓨린 누클레오티드 7-위치에 부착시키는 능력이 기질 통합의 정도와 충실도를 과하게 방해하지 않는 표지된 사슬-종료기질을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
본원 발명의 알키닐아미노 누클레오티드는 형광표지된 알키닐아미노 누클레오티드 사슬 종결제의 서술을 통해 설명된다. 본원 발명의 형광 표지된 알키닐아미노 누클레오티드의 구조적 영역 및 원리를 설명하기 위하여, 표지된 구조(I)를 5개 부분으로 나누는 것이 유용하다:
(i) 삼인산 부분, R5(ii) "당", R4(iii) 헤테로 고리 염기(Het)(iv) 링커(-C≡CR1NR2-), 와 (v) 형광 표지, R3.
(i) 삼인산 부분(R5)
삼인산 부분 또는 유사체 (예를 들면, α-티오트리포스페이트)는 사슬 종료나 또는 그외에 과정에서, 어느 효소 기질에 있어서나 필수적인 관능기이다. 이 관능기는 기질에 많은 결합에너지를 제공하고 효소-기질 반응이 일어나는 실제 위치이다.
"당"부분은 자연 효소 기질내 2'-데옥시리보푸라노즈 구조 단편에 해당하다. 분자의 이 부분은 효소 인식에 기여하며 삼인산 부분과 헤테로 고리 염기간의 적절한 공간 관계를 유지하는데 필수가 결합 것이다. 당이 리보푸라노즈일때 DNA 서열화에 유용하기 위하여, 3'-α-위치는 연이어 효소에 의하여 사용되어질 수 있는 히드록실기를 가져하는 안된다. 히드록실기는 부재하던지, 다른 기로 대체되든지, 그렇지 않다면 사용할 수없게 되어야 한다. 이러한 당은 사슬-종료 당으로 불려질 것이다. 하기를 포함하는 많은 변형 푸라노즈 단편이 이러한 조건을 만족할 것이다: 2',3'-디데옥시-β-D-리보푸라노실[(a). F. 생거 일동., Proc. Nat.Acad. Sci. USA, Vol. 74, 5463-5467(1977). β-D-아라비노푸라노실, [(b). F. 생거 일동., Proc. Nat., Acad. Sci. USA, Vol. 74, 5463-5467(1977)]. 3'-데옥시-β-D-리보푸라노실[(c). Klement 일동. Gene Analysis Technology. Vol. 3. 59-66 (1986). 3'-아미노-2',3'-디데옥시-β-D-리보푸라노실[(d). Z. G. 치제바제 일동., Nuc. Aids Res., Vol. 12, 1671-1686(1984)]. 2',3'- 디데옥시-플루오로β-D-리보푸라노실[(e). Z. G. 치제바제 일동., FEBS Leet., Vol. 183, 275-278(1985)]와, 2',3'-디데옥시-2',3'-디데하이드로-β-D-리보푸라노실[(f). 아트킨손 일동., Biochem., Vol. 8, 4997 4904(196)].
소위 말하는 당이 비환족기(예를들면 2-옥시에톡시메틸(g))인 비환족 누클레오시드 삼이산염(AcyNTP)은 생거 방법론에 의한 DNA 서열화에 있어 사슬 종결제로서 역시 사용될 수 있다. 사슬 종료 기질로서 AcyNTP의 사용은 ddNTP 대신에 AcyNTP를 대체한 종래의 생거 서열화(32P 리포터)방법을 수행함으로서 입증되었다. AcyNTP로 얻어지는 서열화 사다리는 ddNTP로 얻어지는 것과 실질적으로 동일하지만 비슷한 분포의 DNA 단편을 얻기위해 높은 농도의 AcyNTP (약 10x)가 요구된다는 점이 다른다. AcyNTP는 DNA 폴리머라제 I(클레노우 단편)와 AMV 역전사효소 모두에 유효하다. 그러므로 AcyNTP의 알키닐아미노 유도체는 또는 사슬-종료 기질로서 기능할 것으로 기대할 수 있다.
AcyNTP는 ddNTP 보다 쉽게 합성되는 장점을 갖는다. ddNTP의 합성은 종래의 서열화에 있어서 주요 문제는 아니지만, 구조가 복잡한 형광 표지된 사슬 종결제가 만들어질 때는 중요하다. 2-옥시에톡시메틸기를 당으로 사용함은 상당한 성과를 얻으면서 시약합성을 아주 간단하게 한다.
의학적 연구는 DNA 서열화에 유용한 다른 당 변형을 입증해 왔다. 예를 들면 3'-아지도-2',3'-디데옥시 티미딘[AZT; 미추아 일동 Rroc. Nat, Acad, Sci USA Vol 82, 7096-7100(1985)]과 9-2'-히드록시-1'-(히드록시메틸)-에톡시메틸 구아닌[DHPG; 아스톤 일동, Biochem. Biophys. Res. Comm., Vol. 108, 1716-1721(1982)]은 DNA 자기복제의 사슬종료를 유발하는 삼인산으로 전환됨으로서 작용하는 것으로 예상되는 두개의 항바이러스 제제이다. 상기 당 단위를 갖는 누클레오시드 삼인산은 DNA 서열화에 있어서도 유용할 수 있다.
(iii) 헤테로 고리 염기(Het)
헤테로 고리 염기는 특정한 공간적 배치에서 수소 결합 수용체 또는 공예체로 작용하여 핵산내에서 중요한 인지 요소로서 작용한다. 헤테로 고리 염기 요소는 정확한 서열화에 필수적인 높은 신뢰성을 갖춘 통합에 중요하다. 이러한 구조 부분은 링커 부착의 장소이기도 하다.
바람직한 헤테로 고리 염기는 다음을 포함한다: 우라실(h), 시토신(i), 7-데아자아데닌(i) 7-데아자아아닌(k)과 7-데아자하이포크산틴(l), 인공의 7-데아자푸린을 사용하여 링커를 순전하를 부과함이 없이 염기부분에 부착시킬 수 있으며 이것은 글리코시드 연결을 불안정하게 한다. 게다가, 수소 결합 공여체 및 수용체와 기능적으로 동일한 다른 헤테로 고리 염기를 사용할 수 있으며 예를들면 8-아자-7-데아지푸린과 3,7-디데아자아데닌을 7-데아자푸린 대신에 사용할 수 있으며 6-아자피리미딘은 피라미인 대신에 사용할 수 있다(명명을 간략히 하기 위하여 헤테로 고리 염기는 전체적으로 7-데아자푸린으로 이름 붙여진다).
링커는 알키닐아미노 기이며 여기서 삼중결합의 한 말단은, 치환 또는 비치환 디라디칼 부분, 1-20개 원자를 갖는 R1을 통하여 아민과 결합하고 다른 말단은 헤테로 고리 염기의 피리미딘 5-위치 또는 7-데아자푸린의 7-위치(푸린의 넘버링으로서)에 공유 결합되어 있다. 알킬 아미노기의 아민 질소는 형광 표시 상 반응성 관능기(예, 카르보닐)에 부착되어 있다. 링커 DNA 폴리머라제에 대한 결합 또는 상기에 의한 병합을 크게 방해할 필요는 없다. 디라디칼 부위는 사슬내 이중 결합, 삼중 결합 아릴기 또는 N, O 또는 S와같은 헤테로 원자를 임의로 함유하는 C1-C20의 직쇄 알킬렌일 수 있다. 헤테로 원자는 에테르, 티오에테르, 에스테르, 아민 또는 아미드와 같은 관능기의 부분일 수 있다. 디라디칼 부위의 치환체로는 C1-C6알킬, 아릴, 에스테르, 에테르, 아민, 아미드 또는 염소기를 들 수 있다. 바람직하게, 2 라디칼 부위는 직쇄 C1-C10알킬렌이며; 가장 바람직하게는 디라디탈은 -CH2-이다.
(v) 형광 표지(R3)
형광 표지는 아르곤 이온 레이저와 같은 적합한 광원으로부터의 에너지 흡수에 의해 여기 후 방출되는 탐지 가능한 복사를 제공한다. 서염화 용융에서 당면하게 되는 각 DNA 염기들에 대해 독특하고 구별할 수 있는 형광 리포터를 가지는 것이 요망된다.
표지된 사슬-종결제에 기초를 둔 DNA 서열화 방법에 있어서 형광표지에 유용한 일군의 리포터는 공지된 염료 9-카르복시에틸-6-히드록시-3-옥소-3H-크산텐[S. 빅스일동 J. Chem. Soc., Vol. 123. 2934-2943 (1923)]으로 부터 얻어질 수 있다. 이 크산텐 군은 일반식 1을 가진다.
상기에서 R9과 R10는 H, 저급알킬, 저급 알콕시, 할로 및 시아노를 포함한다. DNA 서열화에 적합한 바람직한 일련의 염료는 구조 1이다.
a) R9=R10=H, abs. 487 ㎚, emis, 505㎚; b) R9=H, R10=CH, abs. 494 ㎚, emis, 512㎚; c) R9=CH3, R10=H, abs. 501 ㎚, emis, 519㎚; d) R=R=CH, abs. 508 ㎚, emis, 526㎚;
L.M. 스미드, L.E. 후드일동, L.M. 스미드 일동과 W 안소르게 일동이 설명하고 있는 장치가 DNA 서열화에 적합한 농도에서 상기 염료의 어느 것으로든지 표지된 서열화 단편을 탐지할 수 있지만 이러한 장치는 상기 4개의 염료를 구별할 수는 없다. DNA 서열화를 결정하기 위해 염료를 구별하고 상기 정보를 사용하는 방법이 동시 계류중인 출원(변호사 서류번호 IP-597-A)에 기술되어 있으며 여기에 참고 문헌으로 병합되어 있다.
본 출원인 밀접한 관련이 있으나 구별가능한, 개선된 생거 DNA 사슬신장 방법에 있어서 사슬 종료 누클레오티드로서, 작용하는 화합물에 공유적으로 부착된 리포터로부터 복사 에너지를 탐지하기 위한 수단을 포함하는 DNA 서열화를 위한 시스템을 공개한다. 하나의 뚜렷한 형광 리포터는 생거 DNA 서열화 반응에서 대표되는 4개의 디데옥시누클레오티드 염기 즉 아데닌, 구아닌, 시토신과 티민의 디데오시누클레오티드의 각각에 부착되어 있다. 이러한 표지된 리포터 사슬 종료 시약은 전통적 생거 방법에서 표지안된 사슬 종료제를 대신하여 대체되었고 반응에서 해당 데옥시누클레오티드, 적절한 프라이머, 주형과 폴리머라제와 결합한다. 결과 혼합물은 다른 길이의 DNA 단편을 함유하는데 이러한 것은 3'-말단을 가지며 DNA의 4개 염기 각각에 상응하는 독특한 표지 사슬 종결제를 갖고 그 길이가 염기 하나의 단위로 달라진다. 이렇게 표지하는 신규한 방법은 전통적 생거 방법의 데옥시누클레오티드에 있어서 포함되는 통례의 방사성 표지를 사용 안해도 된다.
이러한 리포터 표지의 탐지는 DNA 단편사에서 사슬 종결제에 부착된 레이저-자극 리포터로부터 인접한 형광 방사광을 흡수하는 두개의 정체 광증폭 튜브(PMT)로서 달성될 수 있다. 이러한 단편은 PMT의 감지 부위에 수직한 축으로 움직이게 하여 전기영동적으로 공간 및/또는 시간에 따라 분리할 수 있다. 형광방사는 투과 및 반사특성 모두를 갖는 이색성 필터를 최초에 통과하는데 이 필터는 하나의 특성(투과)은 하나의 PMT로 향하게 하고 다른 특성(반사)는 다른 PMT에 향하게 위치된다. 이러한 방식으로, 다른 디지탈 신호는 일련의 형광 리포터가 근접한 위치의 방사광을 갖더라도, 주어진 형광 리포터에 독특한 3차 신호를 만들기 위한 비율로 배분이 된 각 PMT에서 창출된다. 이러한 시스템은 488㎜같은 단일 레이저 광선 모두를 효율적으로 들뜨게 하여 최대치가 통상 인접한 것과 단지 5에서 7㎜만이 틀리는 근접하게 인접해 있는 리포터를 탐지할 수 있다. 그러므로 주목하는 DNA 띠에 있어서 일련의 염기 할당치는 DNA의 4개의 염기의 각각에 상응하는 4개의 리포터-표지가 붙은 체인 터미네이터 각각에 대하여 얻어지는 독특한 비율을 기준하여 만들어질 수 있다.
이러한 크산텐 염료는 반응성 관능기를 가지므로 상기 동시 계류중인 출원은 이러한 염료를 알키닐아미노 링커의 아미노기에 부착시키는데 유용한 시약이 디자인과 제법에 대하여도 공개하고 있다. N-히드록시숙신이미드 에스테르 2(R9과 R10은 구조 1과 같이 정의된다)다 그러한 시약의 바람직한 예이다. 2의 제조중에 사르코신기가 부반응을 최소화하기 위하여 기본 염료 구조에 부착된다. 상기 동시 계류중인 출원에서 이 임의적인 사르코신기는 "스페이서(spacer)"라 불리운다. 바람직한 시약만이 여기서 사용되므로 표지된 알키닐아미노 사슬 종결제 형광부위는 사르코신 스페이서를 포함하는 것으로 고려된다. n-히드록시숙신아미드 탈리기가 링커의 아미노기에 의하여 대체된 후에, 형광 염로(부분 구조 1)가 진한 수산화암모늄의 처리에 의하여 배출된다. N-히드록시숙신이미드에스테르는 상기의 알키닐아미노 링커에 존재하는 것과 같은 친핵성이 강한 아미노기와 선택적으로 반응하는 아실화 물질이다. 대조 실험은 2와 유사한 N-히드록시숙신이미드 에스테르가 링커아미노기 보다 헤테로고리 염기의 아미노기와 훨씬 더 늦게 반응함을 보였다. 반응이 헤테로 고리 아미노기와 적은 범위로 일어난다면, 결과의 아미드는 염료를 방출하는 수산화 암모늄 처리에 의하여 가수 분해됨이 발견되었다. 그러므로 2와 같은 에스테를 사용하여 형광염료와 같은 임의의 리포터를 누클레오티드를 원치않는 양상으로 변형하지 않고 링커의 아미노기에 선택적으로 부착할 수 있다.
본 발명의 형광 표지된 알키닐아미노-누클레오티드 사슬-종결제는 동시 게류중인 출원 IP-597-A에 공개된 알릴아미노 링커를 함유하는 상응 기질 뿐만아니라 AMV 역 전사효소와 DNA 서열화에 있어서 함께 작용한다. 그렇지만 본원 발명의 화합물은 알키닐아미노 링커가 DNA 서열화에 필요한 여러 염기상에 미리 선택된 위칭 더 쉽게 부착되기 때문에 알릴아미노 링커를 함유하는 해당 기질보다 합성하기 쉽다. 게다가, 알키닐아미노 링커는 누클레오티드에 높은 수율로 부착될 수 있다. 결론적으로 헤테로고리와 공액인 알킨을 함유하는 누클레오티드는 알켄을 함유하는 해당 누클레오티드 보다 더 안정한 것으로 예상된다. 알키닐아미노-누클레오티드로부터 얻어진 적절한 형광 표지된 사슬 종결제가 구조 3으로 나타내진다.
여기서 Nuc, R1-R4와 R6-R8은 상기 정의와 같은, R5=HO9P3 -3이며 다만 R8이 H 또는 OH 이면 R6는 OH가 아니다.
도표 1은 당이 2,3-디데옥시리보푸라노실기인 본원 발명의 알키닐아미노누클레오티드를 만드는 방법을 설명하고 있다. 이러한 방법은 본 발명의 모든 당과 상용할 수 있다. 누클레오티드 당을 변형하기 위한 공지된 방법과 결합될 때, 이러한 방법은 2,3-디데옥시리보푸라노실기가 본 발명의 다른 당으로 대치되는 알키닐아미노 누클레오티드를 제조하는데 사용될 수 있다.
최초 핵심 중간체, 요오도누클레오시드(4)를 만들기 위하여 많은 루트가 사용될 수 있다 (예를들면, 상응하는 브로모누클레오시드가 요오도누클레오시드에 대신하여 사용될 수 있다).
5-요오도-2',3'-디데옥시우리딘은 2',3'-디데옥시우리딘[화이저 일동 J. Org. Chem. Vol. 29, 1508 (1964)]을 Icl[로빈스 일동 Can. J. Chem,. Vol 60, 554-557 (1982)]로 처리하여 제조될 수 있다.
5-요오드-2',3'-디데옥시시리딘은 2',3'-디데옥시시리딘(레이코 CO.)를 해당 5-모쿠리오 누클레오시드[베르그스트롬 일동 J. Carbohydrates, Nucleosides and Nucleotides, Vol. 4, 257-269 (1977)]로 전환시키고 요오드로 처리함으로서 얻을 수 있다.
7-데아자구아노신과 2'-데옥시-7-데아자구아노신의 제조 방법은 알려져 있지만 7-데아자구아닌에 대한 친전자공격은 7- 과 8- 위치에서 모두 일어남이 알려졌다[실라 일동, Chem. Ber., Vol. 111, 2925-2930 (1978)]. 그러나, 원하는 7-요오드-데아자푸린이 6-메톡시-2-티오메틸-7-데아자푸린을 N-요오도숙신이미드로 처리하고 뒤이어 도표 2에 제시되고 실시예 3에서 설명된 2-티오메틸과 6-메톡시 전환기로 대치하여 얻을 수 있음이 밝혀졌다. 7-데아자푸린 고리 체계의 레지오선택성 요오드화를 위한 N-요오도숙신이미드의 사용은 전례가 없다.
7-요오도-2',3'-디데옥시-7-데아자아데노산은 투베르시딘의 탈산소화와 뒤이은 수은화/요오드화(도표 3)에 의하여 제조될 수 있다. 탈산소 반응은 도표 3에 도시되고 실시예 4에서 설명된 2',3'-디데옥시-7-데아자아데노신의 개선된 합성을 제공하기 위하여 모파트 일동[J. Am. chem. Soc., vol. 95, 4016-4030 (1972)]과 로빈스 일동[Tetrahedron Lett., vol. 25, 367-340(1984)]에 의하여 공개된 방법에서 채용한다.
7-요오드-7-데아자아데노신은 베르그스트롬 일동[J. Carbohydrates, Nucleosides and Nucleotides, Vol. 5, 185-296 (1987)]과 베르그스트롬 일동[J. Org. Chem. Vol. 46, 1424 (1981)]에 의하여 보고된 바와 같이 투베르시딘(7-데아자아데노신)의 레지오 선택적 수은화/요오드화에 의하여 제조될 수 있다.
값비싼 발효 산물인 투버시딘을 출발물질로 사용하지 않는, 7-요오드-2',3'-디데옥시-7-데아자아데노신을 향한 다른 대안 경로를 사용할 수 있다. 이들 경로가 도표 4와 5에 도시되어 있으며, 실시예 5와 6에 기재되어 있다. 이들 경로 중 한 경로에 있어서, 7-위치에 요오드를 레지오선택적(regioselective)으로 도입시키는 문제는 전례없던 또 다른 요오드화에 의해서 해결되었다. 이 경우, 6-클로로-7-데아자푸린 32을 일염화요오드로 처리하면 7-요오드 레지오 이성체 33만이 생성된다.
Pd(II)/Cu(I) 촉매를 사용하여 말단 알킨을 보호된 5-요오도우라실 누클레오시드와 커플링시키는 방법이 로빈 일행의 문헌[Tetrahedron Lett., Vol. 22. 421-424 (1981)]에 보고되어 있으나, 이 방법으로는 알키닐아민 (예 : 프로파르길아민)과 보호되지 않은 5-요오도-피리미딘 또는 7-요오도-푸린 누클레오시드 사이의 바람직한 커플링이 성취될 수 없다. 뒤이어서 형광 표지를 부착시키기 위한 아민기를 갖는 화합물을 직접 제공하기 위하여 알키닐아민을 직접 커플링에 사용하는 능력이 매우 요구된다. 마찬가지로, 불필요한 일련의 보호/탈보호 반응을 없앰으로써, 원하는 화합물로 향한 보다 더 직접적인 경로를 제공하기 위하여 보호되지 않은 누클레오시드를 사용하는 방법이 연구되었다.
아래에 기재된 조건하에, Pd(O)/Cu(I) 촉매를 사용하여 탁월한 수율로 알키닐아민을 각종 할로누클레오시드에다 성공적으로 커플링시켰다. 이러한 커플링 반응은 알키닐아민 질소나 아세틸 및 트리플루오로아세틸 같은 아실기, 9-플루오레닐 메틸옥시카르보닐기와 같은 알콕시카르보닐기, 및 P-톨루엔설포닐기와 같은 설포닐기에 의하여 보호되었을 때도 성공적이었다. 삼중 결합과 아미노기 사이에 있는 탄소 원자의 수는 아래에 기재된 과정에서 중요치 않다는 것이 에기치 않게 발견되었다 : 3-아미노-1-프리핀(프로파르길아민), 5-아미노-1-펜틴, N-(2-프로피닐)트리플루오로아세트아미드, N-(4-펜티닐)-트리플루오로아세트아미드 및 N-(11-도데니실)-트리플루오로아세트아미드를 모두 커플링 반응에 성공적으로 사용하였다.
이러한 Pd(O)/Cu(I) 촉매와 커플링 반응의 광범위한 성공인 이 분야의 기술에서 예기치 못했던 것이다. 예컨대, 베르그스트롬 일행은 [J. Am. Chem. Soc., Vol. 100, 8106(1978)]에서 Pd 촉매를 사용하여서는 알킨을 우라실 누클레오시드의 5-머큐리 또는 5-요오드 유도체에 커플링시킬 수 없다고 보고했다. 또한 로빈스 일행은[J. Org. Chem., Vol. 48, 1854-1862 (1983)]에서 3',5'-O-아세틸-5-요오도-2'-데옥시우리딘의 Pd(II)/Cu(I) 촉매화 반응이 자주 환화된 생성물을 생산해낸다고 발표했다. 아래에 기재되어 있는 공정을 사용하는 경우, 쉽게 환화될 가능성이 있는 알키닐아민(예 : 5-아미노-1-펜틴)과도 커플링이 잘 이루어진다.
전형적으로, 본 발명의 알키닐아미노-누클레오시드는, 할로누클레오시드와 Cu(I)을 플라스크 속에 넣고, Ar로 플러슁(flushing)하여 공기를 제거하고, 건조 디메틸포름아미드를 첨가한 후, 알키닐아민, 트리에틸아민 및 Pd(O)를 첨가함으로써 제조할 수 있다. 반응 혼합물을 몇 시간 동안, 혹은 박층 크로마토그래피(TLC)가 할로 누클레오시드의 소모를 나타낼 때까지 휘저어 섞을 수 있다. 보호되지 않은 알키닐 아민을 사용하는 경우엔, 반응 혼합물을 농축시키고, 커플링 반응에서 발생된 할로겐화 수소를 중화시키기 위한 수산화 암모늄을 함유하는 용축 용매를 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그래피시킴으로써 알키닐아미노-누클레오시드를 분리할 수 있다. 보호된 알키닐아민을 사용하는 경우엔 반응 혼합물에다 메탄올/염화 메틸렌을 첨가한 수 중탄산염 형태의 강염기성 음이온 교환 수지를 첨가할 수 있다. 그런 다음 슬러리를 약 45분간 휘저어 섞고, 여과하고, 수지를 추가량의 메탄올/염화 메틸렌으로 헹구어 줄 수 있다. 여액들을 합하여 농축시키고 메탄올-염화메틸렌 구배를 사용하여 실리카겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 신속하게 정제할 수 있다.
본 발명의 알키닐아미노-누클레오티드는 5-요오도피리미딘 또는 7-요오도-7-데아자푸린 누클레오시드로부터 제조되는 것이 바람직하지만, 유사한 브로모누클레오시드를 또한 사용할 수 있다. [Pd(O)/Cu(I) 촉매화 커플링 반응은 또한 방향족 또는 헤테로 방향족 고리 위의 다른 위치에 알키닐아민기를 도입시키는데 사용될 수도 있으나, 단, 적합한 할로누클레오티드가 이용가능하다는 전제하에서만 그러하다.]
Pd(O)/Cu(I) 촉매화 커플링 반응에 적합한 알키닐아민은 삼중 결합이 1-20개의 원자를 갖는 디라디칼 부분에 의하여 아민에 부착되어 있는 말단 알킨이다. 디라디칼 부분은 직쇄 알킬렌(C1-C20, 예 : -C3H6-)이거나 또는 이중 결합 (예 : -CH=CHCH2에서 처럼), 삼중 결합(예 : -C≡C-CH2-에서 처럼) 또는 아릴기 [예 : (피라)-C6H4- 또는 -CH2-C6H3-]를 함유할 수 있다. 디라디칼은 또한 N, O 또는 S와 같은 헤테로 원자를 에테르, 에스테르, 아민 또는 아미드기의 부분으로서 사슬 내에 함유할 수 있다. 디라디칼 부분 위의 적합한 치환체로 C1-C6알킬, 아릴, 에스테르, 에테르, 아민, 아미드 또는 클로로기를 들 수 있다. 바람직하게, 디라디칼은 직쇄 알킬렌(C1-C10)이고, 가장 바람직하게 디라디칼은 -CH2-이다. 아민 위의 적합한 치환체는 저급 알킬(C1-C4) 및 트리플루오로아세틸과 같은 보호기이다. 일반적으로 알키닐아민의 아민은 1차, 2차 또는 3차 아민일 수 있다. 그러나 링커로서 사용되기 위해서는, 알키닐아민이 1차 아민인 것이 바람직하다. 알키닐아민의 아민은 통상적으로 보호되는데, 그 이유는 단계에서 아민의 보호가 요구되기 때문이다. 이 아민이 보호된 형태로 도입될 때는 커플링된 생성물이 또한 보다 더 쉽게 정제된다. 트리플루오로아세틸 보호기는 커플링 생성물이 상응하는 5'-트리포스페이트로 전환된 후 쉽게 제거되기 때문에 바람직하다. 일반적으로, 요오도누클레오시드를 알키닐아미노-누클레오시드로 완전히 전환시키기 위하여 1.5-3.0 배 과량의 알키닐아민(요오도누클레오시드에 대하여)을 사용할 수 있다.
커플링 반응에 적합한 용매에는, 요오도-또는 브로보누클레오시드를 용해시키고 Pd(O)/Cu(I) 촉매 시스템을 분해시키기 않는 극성 용매들이 포함된다. N,N-디메틸포름아미드(DMF), 아세토니트릴, THF, 디메틸설폭시드(DMSO), 헥사메틸포스포르아미드(HMPA) 및 알코올을 모두 사용할 수 있으며, 소량의 물을 함유하는 용매도 허영된다. 바람직한 용매는 DMF이다. 할로누클레오시드의 바람직한 농도는 0.02-1.0M이고, 가장 바람직한 농도는 0.2-0.5M이다.
적합한 Pd 촉매는 Pd(O) 착물, 예컨대 테트라키스(트리아릴포스핀) Pd(O)이다. Pd(O) 촉매가 테트라키스(트리페닐포스핀) Pd(O)인 것이 바람직하다. Pd촉매의 사용량은 일반적으로 1-25몰%(요오도누클레오시드를 기준으로)이고, 바람직하게는 5-15몰%이다. 반응을 매우 작은 규모로 수행하기 위해서 또는 커플링에 필요한 반응 시간을 단축하기 위해서 다량의 촉매가 사용된다.
Cu(1) 조촉매는, 바람직하게 할로겐화 제일구리 또는 슈도할라이드(예 : 시안화제일구리)이고, 가장 바람직하게는 Cu I이다.
Pd(O)에 대한 Cu(I) 조촉매의 몰비는 1.0 이상, 20 미만이다. 보호된 알키닐아민을 사용할 때, 바람직한 Cu/Pd의 몰비는 2이다. 알키닐아민이 보호되지 않았을 때는 차폐되지 않은 염기성 질소 원자가 구리의 촉매활성을 떨어뜨린다. 이 경우, Cu/Pd 비율이 5인 것이 바람직하다. 이들 두 경우중 그 어느 경우에도, Cu/Pd=1일 때 실온에서 아무런 반응이 관찰되지 않는다. 반응 속도는 일반적으로 Cu/Pd 비율이 증가함에 따라 증가한다. 그러나 보호된 알키닐아민을 사용하고 Cu/Pd 비율이 2이상일 경우에는, TLC에 의해 지적되는 바와 같이, 이같은 증가가 부산물의 증가를 수반하게 된다.
트리에틸아민은 이러한 반응에 있어 아마도 산-스캐빈저로서 작용하며; 다른 강염기성 아민도 사용할 수 있다. 과량의 보호되지 않은 알키닐아민은 또한 산-스캔빈저로 작용할 수 있으나, 바람직하게 트리에틸아민을 같이 첨가한다.
보호된 알키닐아미노 누클레오시드는 옥시염화인으로 처리한 후 트리-n-부틸암모늄 피로포스페이트로 처리함으로써 상응하는 5'-트리포스페이트로 전환시킬 수 있다[ 루스일행 Mol Pharmacol., 415 (1981)]. 이렇게해서 만들어진 미정제 트리포스페이트는 트리에틸암모늄 중탄산염과 같은 휘발성 완충액으로 용출시킴으로써 이온 교환 크로마토그라피에 의하여 이 단계에서 정제시킬 수 있다. 원하던 누클레오시드 트리포스페이트는 부산물로부터 잘 분리되지만, 동결건조에 의하면, 보호기가 트리플루오로아세틸기인 경우 링커 질소상의 보호기가 제거될 수 있다. 탈호보는 14% 수성 암모니아로 처리함으로써 완결될 수 있으며, 생성물은 이온 교환 크로마토그라피에 의하여다시 정제할 수 있다. 링커와 그의 보호기의 성질은 트리포스페이트로의 전환을 막는 것이라고 생각되지 않으므로, 이러한 방법론은 보호되거나 보호되지 않은 알키닐아미노 링커를 갖는 각종 누클레오시드 모노-, 디- 및 트리포스페이트를 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 알키닐아미노-누클레오티드를 제조한 후에 이 단계는 본 발명에서 원하는 임의의 리포터-표지된 알키닐아미노 누클레오티드를 생산하기 위해 설정되다.
아래와 나와 있는 바람직한 네개 형광 표지된 알키닐아미노-누클레오티드 사슬-종결제(34-37) 셋트는 본 발명의 알키닐아미노-누클레오티드로부터 유도된다. 이러한 표지된 화합물 세트는 n-히드록시 숙신이미드 에스테르 2를 알키닐아미노 누클레오시드 트리포스페이트 6과 커필링시킨 후 암모니아 탈 보호함으로써 실시예 19에 기재된 바와 같이 제조된다.
자구르스키 일행의 문헌[유전자 분석 기술, Vol. 2, 89-94 (1985)]에 따라서 AMV 역전사 효소를 이용하여 2를 서열화할 때 이들 네개 형광-표지된 사슬 종결제를 표준 디데옥시누클레오티드 사슬 터미네이터 대신 사용하였다. 이렇게 하여 생성된 형광-표지된 서열화 사다리는 형광 분자가 겔 전기 영동 도중 이동할 때 이들을 탐지하도록 고안된 기구에 의하여, 바람직하게는 동시 계류중인 로버트슨 일행의 출원 S.W._ (IP-678)에 기재된 기구에 의하여 분석할 수 있다. 두 필터를 사용하는 이러한 유형이 시스템은 본 발명에 참고문헌으로 병합된 동시 계류중인 로보트슨 일행이 출원에 기재되어 있다. 로버트슨 일행에 의하여 기재된 바와 같이 광선을 자극하는 리포터가 전기 영동 겔 위의 레인을 스캐닝하는 평면의 위 아래에 한 쌍의 모듈이 위치한다. 각 채널은 리포터-표지된 DNA 단편을 함유한다. 각 검출 모듈은 넓은 입구 면적을 갖는 광전자중 배관과 겔 속이 형광 종과 PMT 사이에 위치한 별개 파장 선택성 필터로 구성된다. 이들 필터는 이색성 필터 작용을 가장하는 상보적 투과 밴드 특성을 갖는 간섭 필터이다. 이 필터는 PMT가 그 종의 성질의 기능으로서 다른 의미에서 진폭이 상이한 신호들을 발생하도록 해준다. 한 필터는 낮은 방사파장은 충분히 통과시키고 높은 방사 파장은 거부하는 한편, 다른 필터는 정확히 그와 반대로 작용한다. 투과 필터는 각 간섭 필터와 함께 예정된 각도 보다 큰 축이 각도로 벗어난 빛을 거부하기 위해 사용될 수 있다. 파장 필터들은 네 염료의 방사지역에서 대략 상보적인 투과대 파장 특성을 갖는데, 전이 파장은 그 종의 복사 에너지 스펙트럼 중앙 근처에서 생긴다.
스미스 일행, 후드 일행 및 안소르지 일행에 의해 서술된 방법에 따라서 단편들을 검출할 수도 있다. 그러나, 이같은 네 형광 염료의 특정 세트에 의해서 제공된 정보를 이용하여 단일 레인내 네개의 염기를 동시 분석하는 것은 상기 동시계류중인 특허 출원에 기재된 신호 프로세싱 시스템에 의해서만 성취될 수 있다.
형광 검출에 의해 얻은 결과를 표준 서열화 기술에 의해 얻은 결과와 비교해보기 위해서, 표지된 상기 네개 사슬 종결제의 세트를 사용하여32P 리포터도 함유할 수 있는 형광-표지된 서열화된 단편을 발생시켰다(32p 리포터는 키아제를 사용하여 프라이머를 5'-표지하거나 표지된 dNTP를 첨가함으로써 프라이머 연장도중 효소를 이용해 통합시킬 수 있다). 그 결과 생긴 이중 표지된 서열화 사다리는 오로래디오그라피에 의해, 그리고 형광 겔 해독기에 의하여 분석될 수 있다. 이들 형광 표지된 서열화 사다리들은 표준 디데옥시누클레오티드사슬 종결제에 의해 생산된 사디리와 매우 유사하고 기능적으로 동일한데, 단, 다른 점은 모든 밴드가 대략 두 염기만큼 늦게 진행된다는 것이다. 이들 서열화 사다리내의 여러 밴드의 상대적인 강도는 링커와 염료의 첨가에 의해 개조되지만 개조된 사슬 종결제가 어떠한 밴드라도 상실시키지 않는다고 생각된다. 적합한 겔 전기 영동 조건하에서 사슬 종결제 상의 링커와 염료는 어떠한 밴드도 변칙적으로 이동시키지 않는다; 더 빨리 움직이는 밴드는 더 느리게 이동하는 밴드보다 염기를 더 적게 함유한다. 각기 다른 염료를 갖는 인접 밴들간의 간격은 서로 그 염에 어떤 염료가 있는가에 따라서 좌우된다. 최적의 조건하에 형광 또는 방사상 활성 검출을 이용하는 경우, 상대적 밴드 강도 및 위치에 있어서의 이러한 가벼운 변화는 DNA를 서열화하는데 있어서의 이들 사슬 종결제의 사용을 방해하지 않는다.
DNA 서열화를 위한 표지된 사슬 종결 기질을 제조하기 위한 알키닐아미노 누클레오티드의 유용성은 상기 서술된 네개 화합물(34-37) 세트의 합성에만 제한되지 않는다. 당, 염기 및 염료의 다른 조합물들이 알키닐아미노 링커에 의해서 결합되었었으며, 이들 화합물도 역시 DNA 서열화에 유용하다.
형광 표지된 사슬 종결제를 제조하는데 있어서의 유용성 이외에, 본 발명의 알키닐아미노 누클레오티드는 일반적으로 각종 리포터를 누클레오티드 또는 올리고누클레오티드에 부착시키는 데에도 유용하다. 이들 분자내에서 가장 친핵성인 부위가 링커와 함께 도입된 아미노기이므로, 활성화 카르복실산(예 : N-히드록시숙신이미드 에스테르). 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 활성화 아릴할라이드(예 : 1-플루오로-2,4- 디니트로벤젠), 또는 적절한 반응성의 다른 친전자성 관응기를 함유하는 리포터를 이러한 질소 원자에다 선택적으로 부착시킬 수 있다. 그리고나서 이렇게 하여 만들어진 표지된 부가 생성물을 이후 기술되는 다른 용도로 사용할 수 있다.
누클레오티드의 헤테로시클릭 염기 하위 단위가 유전 암호에 사용되기 때문에, 많은 누클레오티드의 기능은 종종 당 하위 단위의 성질에 의해 결정된다. 마찬가지로, 알키닐아미노 누클레오티드의 유용성은 구체적으로 어떠한 유형의 당 하위 단위가 존재하는가에 따라서 좌우된다. 이러한 유용성은 알키닐아미노 링커 및/또는 리포터가 누클레오티드의 필요한 기능을 방해할 경우에 감소될 것이다.
본 발명의 알키닐아미노 링커-함유 누클레오티드는 다음과 같은 뚜렷한 장점들을 갖는다 : 알키닐아미노 링커의 작은 입체 용적은 누클레오티드의 혼란을 최소화한다; 링커를 피리미딘 누클레오티드의 5-위치와 7-데아자푸린 누클레오티드의 7-위치에다 놓으면, 궁극적으로는, 누클레오티드가 2본쇄 DNA내로 통합될 때 링커와 리포터를 주요구(groove) 속에 위치시킨다(이는 2본쇄 구조가 가능해야 하는 혼성 및 그외의 다른 과정에 대한 방해를 최소화하는 작용을 한다); 리포터가 부착된 알키닐아미노-누클레오티드는 AMV 역전사 효소를 위한 우수한 기질이다. 기능적으로 연관된 효소는 그의 기질과 유사한 방식으로 상호작용하는 경향이 있기 때문에, 이들 누클레오티드는 형판-지지 누클레오티드 중합을 수행하는 다른 유용한 효소(예: 다른 역전자효소, DNA 포리머라제 및 RNA 폴리머라제)에 대한 기질이 될 수도 있을 것이다.
본 발명은 알키닐아미노-누클레오티드는 표지된 2'-데옥시올리고누클레오티드의 화합적(효소적이 아님) 합성에 대한 매력적인 대체 방법을 제공해 준다. 루스의 국제 출원 번호 PCT/US 84/00279에는, 리포터기를 정의된 서열의 1본쇄 올리고누클레오티드에 병합시키는 방법이 공개되어 있다. 이 방법은 보호된 아미노기가 있는 링커를 갖고 있는 적절하게 보호 및 활성화된 단량체 누클레오티드를 제조하고, 올리고누클레오티드를 화학적으로 합성하기 위하여 이들 단량체 누클레오티드를 사용하고 리포터를 링커 아미노기에 선택적으로 부착시키는 것을 포함한다. 이들을 함유하는 올리고누클레오티드의 성능을 개선하기 위하여 알키닐아미노 링커의 크기가 작고, 그들이 피리미딘 누클레오티드의 5-위치 및 7-데아자푸린투의 7-위치에 있어야 한다. 루스에 의해 기재된 것과 유사한 적절하게 보호 및 활성화된 단량체(38)는 알키닐아미노 링커를 Pd(O)/Cu(I)의 촉매 작용에 의해 구입가능한 5-요오드-2'-데옥시우리딘에다 부착한 후 5'-알콜을 선택적으로 디메톡시트리틸화시키고, 끝으로 클로로(디이소프로필아미노)메톡시포스핀을 사용하여 3'-포스포르아미디트로 전환시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 단량체 및 유사한 알키닐아미노-함유 단량체들은 루스에 의해 기재된 방법에 따라 올리고누클레오티드를 합성하고 리포터를 부착시키는데 유용하리라고 기대된다(링커 질소에 대한 트리플루오로아세틸 보호기는 올리고누클레오티드의 화학 합성 중에 최종 탈보호를 위하여 통상 사용되는 염기성 및/또는 친핵성 시약에 의해서 제거된다). 디포터가 올리고누클레오티드의 합성시 사용된 반응에 의하여 영향을 받지 않는다면 초기 단계에 이것을 알키닐아미노 링커에 부착시킬 수도 있다.
현재, 올리고리보누클레오티드의 화학적인 합성이 2'-데옥시올리고누클레오티드의 합성만큼 효율적이거나 유용하지는 않으나, 적절한 단량체 [(39), -O-테트라히드로피라닐(OTHP)]를 제조하고, 표지된 RNA를 만드는데 사용할 수 있다.
또 다른 적용에 있어서, 알키닐아미노 링커를 사용함으로써 효소를 이용한 2본쇄 핵산의 표지 부착을 손쉽게 수행할 수 있다. 랭거 일행의 문헌[Proc. Nat. Acad, Sci. USA, 78, 6633 (1981)]에는 바이오틴 리포터고 2본쇄 DNA에 표지를 붙이는 니크(nick)-번역법이 나와 있다. 바이오틴을 우리딘 트리포스페이트와 2'-데옥시우리딘 프리포스페이트의 5-위치에다 부착시키기 위하여 아릴아미노 링커를 사용하였다. 이렇게 만든 바이오티닐화누클레오티드는 DNA 및 RNA 폴리머라제에 대한 기질이다. 다른 방법으로, 알키닐아미노링커를 사용하여 바이오틴을 부착시키거나, 보통은 형광 염료와 같은 다른 리포터를 부칙시킬 수 있었다. 알키닐아미노 링커를 갖는 아데노신 트리포스페이트 유사체(40) 및 (41)은 알릴아미노링커를 갖는 아데노신 유사체 보다 더 쉽게 제조될 수 있다. (40)과 (41)의 누클레오티드 트리포스페이트 유사체는 랭거 일행의 효소적인 과정에 의하여 DNA 또는 RNA에 표지되는 니크-번역에 사용될 수 있다.
하기 실시예들은 본 발명을 예증해 준다.
모든 온도는 섭씨이다(25˚는 주위 온도 또는 실온을 말한다). 모든 부와 퍼센트는 다른 언급이 없는 한 중량에 대한 것이지만, 액체 혼합물은 부피로 표시하였다. 다음과 같은 약어를 사용하였다 : DMF-디메틸포름아미드; DMSO-디메틸설폭시드: NHTFA-트리플루오로아세트아미도기: TEAB-트리에틸 암모늄 중탄산염: Tris-트리스(히드록시메틸) 아미노메탄; SF-숙시닐플루오르신; NMR-핵자기 공명 스펙트럼; IR-적외선 스펙트럼; UV-자외선 스펙트럼 또는 검출; TLC-실리카겔 위에서의 박층 크로마토그라피; HPLC-고압 액체 크로마토그라피; GC-기체 크로마토그라피: mp-융점; mp d-융점(분해) : bp-비등점. NMR 자료를 보고함에 있어서 화학적 이동은 ppm으로, 커플링 상수(J)는 헤르쯔로 나타내었다. 융점은 모두 다 보정하지 않은 것이다. 이온 교환 수지는 사용 전에 적합한 수성 및 유기 용매로 세척하였다. 여기에 기재된 모든 화합물의 정체는 적절한 분광 분석기술에 의해 입증되었다. 다른 언급이 없는 한, 실리카 겔 위에서의 크로마토그라피에 의한 정제는 스틸 일행의 문헌[J. Org. Chem., 43 2923-2926 (1978)]에서 기재된 바와 같이 실시하였다.
[실시예 1]
5-(3-아미노-1-프로피닐)-2',3'-디데옥시 시티딘 5'-트리포스페이트(42)(화합물 42는 Het가 시토신(i)이고 R1이 -CH2-인 경우에 있어서 구조 6의 실례이다. 그것은 표지가 붙여진 체인 터미네이트 35에 대한 직후 선구물질이다).
A. N-프로파르길트리플루오로아세트아미드(43)의 제조.
프로파르길아민(24.79g, 0.450몰; 알드리치, 99%)을 0˚의 메틸 트리플루오로아세테이트(69.19g, 0.540몰, 1.2 당량, 알드리치)에 1시간에 걸쳐 방울로 떨어뜨려 가하였다. 0˚에서 추가의 시간동안 휘저어 섞은 후, 15㎝ 비그류 관(Vigreux column)을 통한 중류 결과, 62.12g(91%)의 트리플루오로아세트아미드 43을 무색액체(11 torr 하에서 비등점 68.5-69.5˚)로서 얻었다. 이 물질은 NMR와 GC에 의해 균질하였으며, 프로파르길아민을 트리플루오로아세트산 무수물로 아실화시켜 제조되는 분광학적으로 동일한 물질과 호환하여 사용될 수 있다.
1H-NMR(CDCl3) : 6.85(넓은 s, 1H, NHTFA), 4.17 (dd, J=5.6 및 2.5, 2H, CH2), 2.35(t, J=2.5, 1H, CH).
IR (희석시키지 않음 ; ㎝-1) : 3300 (N-H), 3095 및 2935 (C-H), 2130 (아세틸렌), 1720 (C=O), 1550 (N-H), 1430, 1365, 1160, 1040, 998, 918, 857, 829, 772 및 725.
B. 5-요오드-2',3'-디데옥시시티딘(44)의 제조.
2',3'-디데옥시시티딘 (2.11g, 10밀리몰, 레일로)와 초산 제2수은(3.35g, 10.5밀리몰, 피셔)을 50㎖ 메탄올에 녹인 용액을 19시간 동안 환류시켰다. 이 결과의 백색 현탁액을 메탄올(50㎖)과 디클로로메탄(100㎖)에 희석시켰다. 요오드(3.05g, 12밀리몰)를 가하고, 자주색의 투명한 용액이 나올 때가지 상기 현탁액을 25˚에서 휘저어 섞었다. 4시간 후에, 유리염기 형태의 AG3 X4 수지(20㎖, 38meq, 바이오-레드; 약 염기성 폴리스티렌 수지)를 가하고, 황화 수소를 15분 동안 반응물 속으로 거품을 내며 가하였다. 수은(II)의 완전한 침전을 TLC로 입증하였다. 반응물을 여과 조제를 통해 여과시키고, 여과 조제를 1:1 메탄올-디클로로메탄으로 세척하였다. 여과물을 실리카 겔(10g) 위에서 증발시키고, 실리카 겔을 150g 실리카 겔 칼럼 위에 위치시켰다. 디클로로메탄 내의 5%, 10% 및 20% 메탄올로 실시한 용출로 2.79g(83%)의 요오드화물 44를 무색의 결정고체로서 얻었다. 50˚에서 진공-건조 후에, 끓는 물에서의 2번의 재결정화에 의해 커다란, 분석적으로-순수한 프리즘(용융점 : d 178˚)을 얻었다.
1H-NMR(DMSO-d6) : 8.5(s, 1H, H6), 7.73(넓은 s, 1H, NH2a), 6.53(넓은 s, 1H, -NH2b), 5.86(dd, J=6.5 및 2.1, 1H, H1'), 5.19(t, 1H, 5'OH), 4.04(m, 1H, H4') 3.75(ddd, J=12.1, 5.2 및 2.9, 1H, H5'a), 3.53(dt, J=12.1 및 3.8, 1H, H5'b), 및 2.3-1.7(m, 4H, H2' 및 H3').
C9H12N3O3I에 대한 계산치 : C 32.07%, H 3.59%, N 12.46%
측정치 : C 32.05%, H 3.80%, N 12.46%
C. 요오도누클레오시드에 아미노알킨을 결합시키는 일반적인 공정.
5-(3-트리플루오로아세트아미도-1-프로피닐)-2',3'-디데옥시시티딘(45)의 제조.
세개의 목을 가진 50㎖ 플라스크에 요오도시티딘 44 (770㎎, 2.00밀리몰) 및 요오드화 제1구리(76.2㎎, 0.400밀리몰, 0.20 당량; 알드리치, 금장 표지)을 충전시켰다. 아르곤으로 플라스크를 채운 후, 건성 디메틸 포름알데히드(10㎖, 알드리치)를 가하여 현탁된 요오드화 제1구리를 함유하는 요오도시티딘 0.2M 용액을 만들었다. N-프로파르길트리플루오로아세트아미드(0.70㎖, 6.00 밀리몰, 3.0 당량) 및 트리에틸아민(0.56㎖, 4.00 밀리몰, 2.0 당량, 몰레큘러시이브 위에 저장) 시린지를 통해 가하였다. 테트라키스(트리페닐포스핀) 팔라듐(0) (131㎎, 0.20 밀리몰, 0.10 당량)을 건조한 상자내의 유리병에 넣어 중량을 잰 뒤, 반응 혼합물에 가하였다. 요오드화 제1구리가 용해되고, 몇 시간에 걸쳐 점차 어두운 색으로 변하는 황색 용액이 나타났다. 출발 물질이 완전히 소비된 것을 TLC가 나타낼 때까지 반응을 진행시켰다. 4시간 후에, 1:1 메탄올-디클로로메탄 20㎖로 반응물을 희석시키고, 비카보네이트 형태의 AG1 X8 수지(바이오-래드, 2.9g, 대략 6 당량; 강염기성, 음이온 교환, 폴리스티렌 수지)를 가하였다. 대략 15분동안 휘저어 섞은 후에, 가스 방출이 그쳤다. 조합된 여과물을 회전식 증발기로 쉽게 농축시켰다(45˚ 및 2torr에 대략 10분동안에 디메틸 포름아미드의 제거가 요구됨). 100g의 실리카 겔 위에서, 디클로로메탄에녹인 10%, 15% 및 20% 메탄올을 사용한 크로마토그라피에 의해 잔류물을 즉시 정제시켰다. 적절한 유분(fractions)에서 용제를 제거함으로써, 651㎎ (90%)의 알키닐아민 누클레오시드 45가 TLC 및 NMR에 의해 규질인 엷은 황색 결정성 거품으로 나타났다. 유사한 제법으로 만든 생성물은 원소 분석에 의해 반-수확물(hemi-hydrate)임이 판명되었다.
1H-NMR(DMSO-d6) :9.96(넓은 s, 1H, NHTFA), 8.32(s, 1H, H6), 7.76(넓은 s, 1H, NH2a), 6.78(넓은 s, 1H, NH2b), 5.88(dd, J=6.5 및 2.5, 1H, H1'), 5.13(t, J=5.1, 1H, 5'OH), 4.28(d, J=5.0, 2H, -CH2-), 4.04(m, 1H, H4'), 3.73(ddd, J=12.0, 5.0 ALC 3.1, 1H, H5'a), 3.53(dt, J=12.1 및 4.0, 1H, H5'b), 2.3-1.7 (m, 4H, H2' 및 H3'),19F-NMR(DMSO-d6) : -74.0(s), UV(MeOH) ; 238.5(17,100) 및 295.5 (9,300)에서 최대.
C14H15N4O4F3·1/2H2O에 대한 계산치 : C 45.53, H 4.37, N 15.17
측정치 : C 45.56, H 4.52, N 15.26.
D. 트리스(트리- N-부틸암모늄)파이로포스페이트의 제조.
테트라소듐 파이프로스페이트 데카하이드레이트(4.46g, 10 밀리몰)를 최소량의 물(대략 50㎖)에 녹이고, 물에 부어 녹인 AG 50 W X8 수지(100-200 메쉬, 4×10㎝ 상(床); 강산, 양이온 교환, 폴리스티렌 수지)의 칼럼을 통해 통과시켰다. 칼럼을 물로 용출시키고, 용출액이 pH가 중성에 도달할때까지 용출액을 얼음-냉각 플라스크에 집적시켰다. 트리-n-부틸아민(알드리치 금장 표지, 7.1㎖, 30 밀리몰)을 용출액에 가하고, 모든 아민이 용해될 때까지 두개의 상을 격렬하게 휘저어 섞었다. 이 결과의 용액을 동결건조시켰다. 잔류물 건성 피리딘으로 두번, 건성 디메틸포름아미드로 한번 동시 증발시켰다. 잔류물을 건성 디메틸포름아미드(10㎖)로 용해시키고, 이 결과의 1.0M 용액을(한달-정도의 기간동안) 사용될 때까지 0˚의 아르곤 하에서 저장하였다.
E. 보호된 알키닐아미노 누클레오시드를, 해당하는 5'-트리포스페이트로 전환시키고, 트리플루오로아세탈 보호기를 제거하는 일반적인 방법, 5-(3-아미노-1-프로피닐)-2',3'-디데옥시시티딘 5'-트리포스페이트(42)의 제조.
알키닐아미노 누클레오시드 45(361㎎, 1.00 밀리몰)를 오븐-건조 플라스크 내에서 질소 하에 휘저어 섞으면서 트리 메틸 포스페이트(2.0㎖, 알드리치 금장 표지)내에 용해시켰다. 용액을 -10˚로 냉각시키고, 옥시염화 인(0.093㎖, 1.00밀리몰, 알드리치 금강 표지)를 시린지에 의해 가하였다. 반응 혼합물을 -10˚에서 30분 동안 휘저어 섞은 후에, 옥시염화인 이차 앨리쿼드(0.093㎖, 1.00밀리몰)를 가하고, 용액을 휘저어 섞으면서 25˚로 천천히 가열하였다. 반응 혼합물로부터의 앨리쿼트를 1N 수용성 수산화물로 칭시키고, HPLC로 분석하였다. 해당 뉴글레티드 모노포스페이트로의 전환이 최대일 때 (이경우 옥시염화 인의 이차 부가 후 100분간), 반응 혼합물을 트리스(트리-n-부틸암모늄) 피로포스페이트의 예비 냉각된(-10˚) 용액(건성 디메틸포름아미드에 녹인 상기 1.0M 용액 6.0㎖)에 가하였다. 용액을 아르곤 하에서 휘저어 섞으면서 25˚로 천천히 가열시켰다. 100분 후에, 물(20㎖)에 녹인 트리에틸아민(1.4㎖)의 예비냉각된(0˚) 용액에 반응 용액을 천천히 가하였다. 용액을 15분동안 얼음 냉각시키면서 휘저어 섞고 난 후, 밤새껏 대략 2˚에서 그대로 두었다.
휘발 성분들을 25˚ 및 0.5torr에서 진공 증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 물(75㎖)에 재용해시키고 나서, 다음의 물질로 평형에 도달된 DEAE-SEPHADEX 이온 교환기(A-25-120, 2.6×65㎝ 상(床)의 칼럼에 적용시켰다 : 1) pH 7.6, 10M 수용성 TEAB(300㎖), 2) 1.0M 수용성 칼륨비카보네이트(30㎖) 및 3) pH 7.6 1.0M 수용성 TEAB(300㎖). 칼럼을 0.1M(1ℓ)에서 1.0M(1ℓ)까지의 pH 7.6 수용성 TEAB의 선형 구배로 용출시켰다. 유분을 매 12분마다 수집하면서 칼럼을 100㎖/h로 드라이브시켰다. 270㎚(40 AUFS)에서의 흡수에 의해 용출을 통해 통제하였다. 바라는 물질은 구배의 말단부(유분 73-80) 근처에서, 주 밴드로서 잘 분리되어 용출하였다. 생성물을 함유하는 유분을 모아, 농축시키고 (30˚이하에서), 무수 에탄올로 두번 동시 증발시켰다. 잔류물을 물(20.4㎖)에 흡수시키고 동결건조시켰다.
중간 생성물을 물(12.5㎖)에 흡수시키고, 농축 수산화암모늄(12.5㎖)을 가하였다. 3.5시간동안 휘저어 섞은 후, 2시간 동안 아스피레이터 진공 하에서 휘저어 섞어 과량이 암모니아 기체를 제거하고 동결건조시켰다. 잔류물을 0.1M의 pH 7.6 수용성 TEAB(10㎖)내에 모으고 위에서 언급한 대로 제조된 DEAE-SEPHADEX 이온 교환 수지(A-25-120, 1.6×55㎝ 상(床)의 칼럼에 적용시켰다. 0.1M(280㎖) 내지 1.0M(280㎖) 사이에서 TEAB의 선형 구배로 6㎖ 유분을 수집하면서, 칼럼을 용출시켰다. 생성물은 단일 주 피크로 용출하였다. 순수한 생성물을 함유할 것으로 추측되는 유분(#39-45)를 모은 뒤, 농축시키고(30˚ 이하에서), 무수에탄올(2x)로 동시 증발시켜, 물(9.8㎖)에 흡수시켰다. 용액을 UV 흡수 및 HPLC에 의해 분석하고, 동결건조시켰다.
생성물의 희석 용액은 pH 8.2 50mM 수용성 트리스 완충액 내에서 240 및 293.5㎚에서 최대 흡수를 보여주었다. 생성물의 흡수 계수가 출발물질의 그것(9,300)과 동일하다고 가정하면, 293.5㎚에서의 흡수를 기초로 할 때, 생성물 수율은 0.32 밀리몰(32%)이다. 최종 생성물의 HPLC(Zorbax SAX, 0.2M pH 6.5 수용성 인산칼륨, 270㎚ 제어)는 필수적으로 단일 피크(>99%)를 보여준다.
1H-NMR(D2O) : 8.57 (s, 1H, H6), 6.03 (dd, J=6.4 및 1.6, 1H, H1'), 4.42 (m, 2H, H4' 및 H5'a), 4.18 (ddd, J=12, 5.5 및 3, 1H, H5'b), 4.036 (s, 2H, -CH2-), 2.5-1.9 (m, 4H, H2' 및 H3'), 더하기 반대 이온(트리에틸암모늄)피크.31P-NMR(D2O) : -9.02 (d, J=20, 1P), -9.74(d, J=20, 1P), -21.37(t, J=20, 1P), UV (pH 8.2 수용성 트리스) : 240 및 293.5㎚에서 최대.
[실시예 2]
5-(3-아미노-1-프로피닐)-2',3'-디데옥시우리딘 5'-트리포스페이트(46)의 제조.
(화합물 46은 Het가 우라실(h)이고, R1이 -CH2-인 경우에 있어서 구조 6의 실례이다. 그것인 표지가 붙여진 체인 터미네이트 (34에 대한 직후 선구물질이다)
A. 5-요오드-2',3'-디데옥시우리딘(47)의 제조:
디데옥시우리딘(2.122g, 10.0밀리몰)을 30㎖의 따뜻한 메탄올에 녹이고, 25˚로 냉각시킨 후에, 메탄올(20㎖)에 녹인 일염화 요오드(4.06g, 25밀리몰, 2.5 당량, Fisher)를 5분에 걸쳐 가하였다. 어두운 자주색 반응 혼합물을 질소하의 50˚ 욕내에 가열한 후, 즉시 얼음-물 욕내에서 냉각시킨다. 165분 동안 휘젓지 않고 놓아둔 후, 이 결과의 침전물을 여과에 의해 수집하고 차가운 메탄올(2×10㎖)로 세척한다. 밤새껏 진공-건조시켜, 2.232g(66%)의 요오드화물 47을 회색이 도는 흰색의 미세 결정으로서 얻었다. 이 물질은 다음 반응에서 더 이상의 정제없이 사용하였으나, 기타의 제조물은 크로마토그라피에 의해 또는 끓는 메탄올(30㎖/g)으로 재결정시켜 정제하여 백색의 바늘형 결정(mp d 160-164˚)을 얻었다. NMR 원 침전물이 균질하고, 또한 5'-히드록실 양성자가 미소 불순물에 의한 촉매 교환에 따라 매우 넓다는 사실을 가르쳐 준다. 크로마토그라피되거나 재결정된 물질은 이 양성자가, 보통대로, 예리한 3개 1벌인 스펙트럼을 나타낸다.
1H-NMR (DMSO-d6) : 11.60(넓은 s, 1H, H3), 8.57(s 1H, H6), 5.90 (dd, J=2.0 및 6.6, 1H, H1'), 5.2(넓은 s, 1H, 5'OH), 4.06(m, 1H, H4'), 3.75 및 3.53(m, 2H, H5'), 2.26 2.02 및 1.84 (m, 4H, H2' 및 H3')
B. 5-(3-트리플루오로아세트아미도-1-프로피닐)-2',3'-디데옥시우리딘(48)의 제조.
요오도우리딘 47을 실시예 1C에 주어진 일반적인 방법에 따라 3시간 동안 N-프로파르길트리플루오로아세트이미드에 결합시켰다. 디클로로메탄에 녹인 0-5% 메탄올로 크로마토그라피를 실시한 구배 결과, TLC에 의해 균질하기는 하나, 건조시키기에 어려운 물질을 얻었다. 크로마토그라피를 거친 생성물을 수차례 클로로포름으로 동시 증발시키고, 진공-건조시켜, 536.5㎎의 알키닐아미노 누클레오시드 48을 흰색 거품으로 얻었다. 이 물질은 TLC에 의해 균질하였으며, 소량의 (39몰%; 수정 수율 66%) 클로로포름을 제외하고는 NMR에 의해 순수하였다.
1H-NMR (DMSO-d6) : 11.61(s, 1H, H3), 10.07 (뒤틀린 t, 1H, NHTFA), 8.35(s, 1H, H6), 7.26 (s, 0.39H, CHCl3), 5.89(dd, J=6.6 및 3.2, 1H, H1'), 5.15(t, J-5.2, 1H, 5'OH), 4.22(넓은 d, 2H, -CH2N-), 4.04(겉보기 7, J=3.5, 1H, H4'), 3.73 및 3.53 (m, 2H, H5'), 2.26 2.03 및 1.84(m, 4H, H2' 및 H3')
TLC (95 : 5 디클로로메탄-메탄올, 2번의 용출, UV) : 출발 요오드화물 47 Rf=0.37 ; 생성물 48, 0.28; 촉매, 0.95 및 0.80 외에 경미한 줄무늬.
C. 5-(3-아미노-1-프로피닐)-2',3'-디데옥시우리딘 5'-트리포스페이트(46)의 제조.
알키닐아미노 누클레오티드 48(0.30 밀리몰)을 해당 트리포스페이트로 전환시키고, 이의 트리플루오로아세틸 기를 실시예 1E에 주어진 일반적인 공정에 따라서 제거하였다. 옥시염화 이의 이차 앨리쿼트의 부가 후에, 총 210분동안 포르포릴화를 진행시켰다. 생성물의 흡광 계수가 출발 물질의 그것과 동일하다(13,000)고 가정하면, 291.5㎚에서의 이의 UV 흡수를 기준으로 할때, 트리포스페이트 46의 수율은 18이었다.
[실시예 3]
7-(3-아미노-1-프로피닐)-2',3'-디데옥시구아노신 5'-트리포스페이트(49)의 제조.
(화합물 49는 Het가 7-데아자구아닌(k)이고, R1이 CH2인 경우에 있어서 구조 6의 실례이다. 그것은 표지가 붙은 체인 터미네이트 37에 대한 직후 선구물질이다).
A. 6-메톡시-2-메틸티오-9-(3.5-디-O-p-톨루오일-2-데옥시-β-D-리보퓨란오실)-7-디아자퓨린(9)의 제조.
6-메톡시-2-메틸티오-7-디아자퓨린(8, 9.2g, F. Seela 일행의 chem. Ber., Vol. 111, 2925(1978)의 방법에 따라 제조됨)을 건성 피리딘 150㎖에 녹이고, 30-35˚에서 건조 상태로 증발시킴으로써, 공비적으로 건조시켰다. 이 물질을 질소하의 상온에서 건조 아세토니트릴 450㎖에 현탁시키고, 수산화나트륨(오일에 녹인 60% 현탁액 2.16g)을 휘저어 섞으면서 가하였다. 45분 후에, 1-클로로-2데옥시-3,5-디-O-p-톨루오일-α-D-리보푸라노즈(18.6g, M. Hoffer의 Chem. Ber., Vol. 93, 2777(1960)의 방법에 따라 제조됨)를 20분에 걸쳐 똑같은 분량으로 가하였다. 상온에서 추가의 45동안 반응 혼합물을 휘저어 섞고 난 후, 초산(1㎖)과 디클로로메탄(300㎖)를 가하였다. 혼합물을 여과 조재 패드를 통해 흡인 여과시키고 여과물을 건조상태로 증발시켰다. 잔류물을 벤젠에 녹이고, 이 용액을 물(2x)로 그리고 소금물(1x)로 세척하였다. 황산나트륨 위에서 유기 층을 건조시키고, 증발시킨 후에, 잔류물을 메탄올(400㎖)에 녹이고 결정화하여, 19.24g(73.8%) 의 리보실화 생성물 9를 무색 결정(용융점 106-107˚)으로 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) : 2.42(s, 3H, 톨루오일 CH3), 2.44(s, 3H, 톨루오일 CH3), 2.64 (s, 3H, SCH3), 2.70 및 2.89(m, 2H, H2'), 4.08(s, 3H, OCH3), 4.56(m, 1H, H3'), 4.65(m, 2H, H5'), 5.74(m, 1H, H4'), 6.44(d, J=4, 1H, H7), 6.77 (dd, J=8 및 6, 1H, H1'), 7.05(d, J=4, 1H, H8) 및 7.25 및 7.95 (m, 8H, 톨루오일 H).
소량의 디클로로메탄을 함유하는 메탄올로부터 상기 물질의 샘플을 재결정하여 용융점 109-110˚의 결정을 얻었다.
B. 6-메톡시-2-메틸티오-9-(2-데옥시-β-D-리보퓨란오실)-7-데아자퓨린(10)의 제조.
메탄올 600mL에 녹인 수산화물 형태의 렉신 201 수신(38g; 강염기, 음이온 교환, 폴리스티렌 수지)와 에스테르 9(19g)의 현탁액을 질소 하에서 1.5시간동안 환류시켰다. 수지를 제거하여 위해 뜨거운 현탁액을 흡인 여과시키고, 여과물을 건조 상태로 증발시켰다. 고체 잔류물을 에테르(450mL)에 녹이고, 10분 후에, 용액을 여과 조제 패드를 통하여 여과시켜 소량의 색깔이 있는 불술물을 제거하였다. 먼저의 반응에서 얻어진 원하는 생성물의 결정을 용액에 뿌리고, 이를 25˚에서 밤새껏 놓여두었다. 결정성 디올 10을 여과로 모으로, 원 액체를 농축시켜 이차 수확물을 만들었다. 각 수확물을 에테르로 완전히 세척한 뒤, 건조시켜 총 8.43g(78.0%)의 디올 10을 무색 결정(용융점 129-130˚)으로 얻었다.
1H-NMR (DMSO-d6) : 2.21 및 2.25(m, 2H, H2'), 2.56(s, 3H, SCH3), 3.53(m, 2H, H5'), 3.82(m, 1H, H3'), 4.02(s, 3H, OCH3), 4.36(m, 1H, H4'), 4.90 (t, J=5.5, 1H, 5' OH), 5.30(d, J=5.5, 1H, 3' OH), 6.48(d, J=4, 1H, H7), 6.55(dd, J=8 및 6, 1H, H1'), 7.48(d, J=4, 1H, H8).
소량의 메탄올을 함유하는 디클로메탄에서 나온 이 물질의 샘플을 재결정화하여 용융점이 130-131˚인 결정을 얻었다.
C. 6-메톡시-2-메틸티오-9-(5-O-트리페닐메틸-2-데옥시-β-D-리보퓨란오실)-7-디아자퓨린 (11)의 제조.
디올 10(7.2g)을 건성 피리딘에 용해시키고, 이 용액을 35˚의 건조 상태로 증발시킴으로써 공비로 건조시켰다. 잔류물을 건성 피리딘(100mL)에 용해시키고, 염화 트리페닐메틸(8.0g), 트리에틸아민(4.0㎖) 및 4-(디메틸아미노)피리딘(300㎎)을 가하였다. 반응 혼합물을 질소 하의 65˚에서 30분동안 가열한 후에, 염화 트리페닐메틸 이차 분(1.0g)을 가하고, 16.5시간동안 가열을 계속하였다. 냉각 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 디클로로메탄과 물 사이에서 분배하였다. 수용성 층을 디클로로메탄으로 추출하고, 결합된 유기층을 0.3N 염산, 수용성 나트륨 비카보네이트, 및 소금물로 세척하였다. 황산 나트륨 위에서 건조시키고, 농축시킨뒤, 디클로로 메탄내의 0%, 1%, 1.5% 및 2% 메탄올로 실리카 겔 크로마토그라피에 의해 조 생성물을 정제한 결과 12.1g(94.5%)의 모노트리틸 에티르 11이 무색의 유리로서 나타났다.
1H-NMR (CDCl6) : 2.58(s, 3H, SCH3), 2.42 및 2.62(m, 2H, H2'), 3.37(m, 2H, H5'), 4.04(m, 1H, H3'), 4.08(s, 3H, OCH2), 4.60(m, 1H, H4'), 6.40(d, J=4, 1H, H7), 6.68(겉보기 t, J=7, 1H, H1'), 7.00(d, J=4, 1H, H8), 7.27 및 7.43(m, 15H, 트리틸 H).
이 데이타는 위에서 언급한 대로 제조된 11의 다른 배치에서 얻었다.
D. 6-메톡시-2-메틸티오-9-(5-O-트리페닐페닐-2,3-디데옥시-β-D-리보퓨란오실)-7-디아자퓨린(12)의 제조.
건성 디클로로메탄(220㎖)에 녹인 트리틸 에테르 11(12.1g), 4-디메틸아미노피리딘(9.2g), 및 페닐 클로로티오노카보네이트(7.5㎖, 알드리치)의 용액을 질소하의 25˚에서 2시간동안 휘저어 섞었다. TLC 분석은 반응이 불완전하다는 것은 나타낸 주었으므로, 페닐 클로로티오노카르보네이트(4.0㎖)를 가하고, 반응 조합물을 추가의 1시간동안 휘저어 섞었다. 용액을 디클로로메탄(280㎖)으로 희석시키고, 뒤이어 0.5N 염산(500㎖) 0.5N 수산화 나트륨(500㎖) 및 소금물로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨 위에서 건조시키고, 건조 상태로 증발시켰다.
이 결과의 조 티오노카보네이트를 건성 톨루엔(350㎖)에 녹이고, 아조이소비스부티로니트릴(350㎎)과 트리-n-부틸틴 하이드라이드(10㎖)를 가하였다. 이 결과의 용액을 100-105˚로 10분동안 가열하였다. 냉각 후에, 용액을 약간의 에테르로 희석시키고, 10% 수용성 불화 칼륨(350㎖)를 가하여 흔들었다. 두개의 층을(어두운 빛의 슬러지를 제거하기 위해) 여과 조제 패드를 통해 여과, 분리하였다. 유기칭을 0.75N 수산화 칼륨과 소금물로 세척하고, 황산 나트륨 위에서 건조시킨 후 농축시켰다. 실리카 겔 위에서 1:1 디클로로메탄-에테르로, 그후 디클로로메탄으로 실시한 상기 최종 오일에 대한 크로마토그라피에 의해 9.93g(84.5%)의 디데옥시누클레오시드 12를 무색 고체(용융점 122-124˚)로 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) : 2.10, 2.33 및 2.43 (m, 4H, H2' 및 H3'), 2.60 (s, 3H, SCH3), 3.30(m, 2H, H5'), 4.08(s, 3H, OCH3), 4.29 (m, 1H, H4'), 6.36 (d, J=3.7, 1H, H7), 6.53 (dd, J=7 및 4, 1H, H1'), 7.09 (d, 1H, J=3.7, H8), 7.25 및 7.45 (m, 15H, 트리틸 H).
E. 7-요오드-6-메톡시-미틸티오-9-(5-O-트리페닐메틸-2,3-디데옥시-β-D-리보퓨란오실)-7-디아자퓨린(13)의 제조.
N-요오드 숙신이미드(10.0g)을, 데아자퓨린 12 (9.9g)을 건성 디메틸포름아미드(550㎖)에 녹인 용액에 가하였다. 질소하의 어두운 곳에서 16시간동안 휘저어 섞고난 후, 10% 수용성 나트륨 비카보네이트(2.5㎖)를 가하고, 반응 혼합물을 50˚진공속에서 부피 100㎖로 농축시켰다. 이 용액을 물과 에틸 아세테이트 사이에서 분배시켰다. 유기층을 5% 수용성 나트륨 하이드로설파이트 및 소금물로 세척하고, 황산 나트륨 위에서 건조시켜 농축시켰다. 실리카 겔 위에서 디클로로메탄으로 경미하게 불순한 생성물을 크로마토그라피한 결과, 11.68g(95.6%)의 요오드화물 13을 무색의 유리형 고체로 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) : 2.06, 2.24 및 2.41 (m, 4H, H2' 및 H3'), 2.58 (s, 3H, SCH3), 3.30 (m, 2H, H5'), 4.10 (S, 3H, OCH3), 4.29 (m, 1H, H4'), 6.47 (dd, J=6 및 4, 1H, H1'), 7.19 (s, 1H, H8), 7.30 및 7.46 (m, 15H, 트리틸 H).
위에서 언급한 대로 제조된 13의 다른 배치로부터 이 데이타를 얻었다.
F. 7-요오드-2-메틸티오-9-(5-0-트리메틸메틸-2,3-디데옥시-β-D-리보퓨란오실)-7-데아자퓨린-4-온(14)의 제조.
메탄올에 티오클레졸을 녹여 만든 용액에 나트륨 메톡사이드(1 당량)을 가하고나서, 건조 상태로 증발시켜 나트륨 티오크레졸레이트를 만들었다. 건성 톨루엔(150㎖)에 메틸 에테르 13 (4.0g), 나트륨 티오크레졸레이트(4.0g), 및 헥사메틸포스포르아미드(10㎖)를 넣어 만든 혼합물을 4.5시간동안 질소 하에서 환류시켰다. 냉각 후에, 혼합물을 에틸아세테이트와 물 사이에 분배시켰다. 유기층을 물과 소금물로 세척하고, 황산 나트륨 위에서 말려, 건조 상태로 증발시켰다. 실리카 겔 위에서 디클로로메탄내의 0% 및 2% 메탄올로 최종의 조생성물을 크로마토그라피한 결과 3.80g (97.0%)의 데아자퓨린온 14를 무색의 유리형 고체로 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) : 2.05, 2.25 및 2.42 (m, 4H, H2' 및 H3'), 2.60 (s, 3H, SCH3), 3.30 (m, 2H, H5'), 4.28 (m, 1H, H4'), 6.40 (dd, J=7 및 4, 1H, H1'), 7.05 (s, 1H, H8), 7.30 및 7.46 (m, 15H, 트리틸 H), 10.00 (넓은 s, 1H, H1).
G. 7-요오드-5'-O-트리페닐메틸-2',3'-디데옥시-7'-데아자구아노신(15)의 제조.
메타-클로로퍼옥시벤조산(1.23g, 85%, 알드리치)을, 0˚의 질소하에서 건성 디클로로메탄(150㎖)에 메틸티오 에테르 14(3.6g)를 넣어 휘저어 섞어 만든 용액에 가하였다. 15분 후에, 냉각 욕을 제거하고 나서, 40분 동안 25˚에서 계속하여 휘저어 섞었다. 이 용액을 수용성 나트륨 비카보네이트 및 소금물로 세척하고 황산나트륨 위에서 건조시켰다. 메탄올 (부피로 2%)을 가하고, 이 결과의 용액을 극성 불순물을 제거하기 위해 실리카 겔의 짧은 플러그를 통해 통과시켰다. 이 결과의 조 설폭사이드(3.07g)을 디옥산(40 ㎖)에 녹이고, 유리-내장 봄브내에 놓아 두었다. 암모니아(10 0g)을 가하고, 혼합물을 100˚의 오오토클레이브 내에서 2시간 동안 가열하였다. 이 결과의 용액을 건조 상태로 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄(20 ㎖)에 용해시키고, 여과 조제 패드를 통해 여과시켰다. 메탄올(40 ㎖)을 용액에 가하고, 냉각시켜, 1.57g의 무색의 생성물을 결정화시켰다. 원액을 증발시키고, 디클로로메탄에 녹인 5% 메탄올로 실리카 겔 위에서 실시한 중압 액체 크로마토그라피에 의해 정제하여, 328㎎의 추가 생성물을 무색 결정으로 얻었다. 데아자구아노신 15의 총 수율은 1.90g(55.4%)이다.
1H-NMR (CDCl3) : 2.05, 2.23 및 2.35 (m, 4H, H2' 및 H3'), 3.29 (m, 2H, H5'), 4.26 (m, 1H, H4'), 5.90 (넓은 s, 2H, NH2), 6.24 (dd, J=7 및 4, 1H, H1'), 6.90 (s, 1H, H8), 7.30 및 7.46 (m, 15H, 트리틸 H), 10.90 (넓은 s, 1H, H1).
메탄올-디클로로메탄에서 나온 이 물질을 재결하여 용융점이 201-203˚인 결정을 얻었다.
H. 2',3'-디데옥시-7-요오드-7-데아자구아노신(16)의 제조.
개미 산(12㎖)의 트리틸 에테르 15(1.7g)을 녹여 만든 용액을 상온에서 10분동안 휘저어 섞었다. 이 결과의 황색 현탁액을 30˚의 진공에서 건조상태로 빨리 증발시켰다. 디클로로메탄에 녹인 5%, 7% 및 10% 메탄올로 실리카 겔 위에서 잔류물을 크로마토그라피한 결과, 무색고체 940㎎을 얻었다. 소량의 디클로로메탄을 포함하는 에테르와 상기 고체를 분쇄하여 838㎎(81.0%)의 누클레오시드 16을 무색 결정으로 얻었다.
1H-NMR (DMSO-d6) : 1.95, 2.09 및 2.26 (m, 4H, H2' 및 H3'), 3.48 및 3.54(m, 2H, H5'), 3.98 (m, 1H, H4'), 4.90 (넓은 t, J=5, 1H, 5'OH), 6.08 (m, 1H, J1'), 6.32 (넓은 s, 2H, NH2), 7.12 (s, 1H, H8), 10.46 (넓은 s, 1H, H1).
I·7-(3-트리플루오로아세트아미도-1-프로피닐)-2',3'-디데옥시-7-데아자구아노신(50)의 제조.
요오도화물 16 (376㎎, 1.00밀리몰)을 실시예 1C에 주어진 일반적인 방법으로 N-프로파르길트리플루오로 아세트아미드에서 2.25시간동안 결합시켰다. 생성물과 출발 물질을 TLC로 구분할 수 없었고, 따라서, 반응을 역상 HPLC(10㎝ ODS, 1㎖/분, 5분에 걸쳐 100% 물에서 100% 메탄올로 구배, 그후 100% 메탄올, 280㎚에서 UV 검출도 같이 함; 출발 요오드화물 16, 5.49분; 생성물 50, 5.75분; 중간체, 6.58분)로 통제하였다. 조 생성물은 디클로로메탄에 잘 녹지 않기 때문에, 크로마토그라피 칼럼에 재워지기전에 조 생성물은 실리카겔(5g) 위에서 디클로로메탄-메탄올 용액으로부터 농축된다. 디클로로메탄내의 2%, 5%, 7% 및 10% 메탄올로 용출을 실시한 결과, 300㎎(78%)의 노란색 고체인 알키닐아미노 누클레오시드 50을 얻었다.
1H-NMR (DMSO-d6) : 1.96, 2.08 및 2.28 (m, 4H, H2' 및 H3'), 3.47 및 3.55(m, 2H, H5'), 3.99 (m, 1H, H4'), 4.22(넓은 s, 2H, -CH2-), 4.90(t, J=5, 1H, 5'OH), 6.09(dd, J=6 및 4, 1H, H1'), 6.33 (넓은 s, 2H, NH2), 7.30 (s, 1H, H8), 10.05(넓은 s, 1H, NHTFA), 10.50 (넓은 s, 1H, H1),1H-커플링되지 않은13C-NMR (DMSO-d6) : 155.5 (9, J=36.5, 트리플루오로아세틸카보닐), 157.8, 153.1 및 149.9(C2, C4 및 C6), 122.6(C8), 115.9(q, J=288, CF3), 99.4 및 97.5 (C7 및 C5), 84.2 ALC 77.4 (아세틸렌형), 83.2 및 81.0(C1' 및 C4'), 62.9(C5'), 29.7(프로파르길형), 31.8 및 25.8(C2' 및 C3').
J. 7-(3-아미노-1-프로피닐)-2',3'-디데옥시-7-데아지구아노신 5'-트리포스페이트(49)의 제조.
알키닐아미노 누클레오시드 50(0.90 밀리몰)을 해당 5'-트리포스페이트로 바꾸고, 뒤이어 트리플루오로아세틸 보호기를 실시예 1E에 주어진 일반적인 공정에 따라 제거하였다. 옥시염화인의 이차 부가 후에, 반응물을 추가의 165분동안 휘저어 섞었다. 생성물의 흡광 계수가 출발물질의 그것과 동일하다(11.900)고 가정하면, 272.5㎚에서의 흡수를 기준으로 할때 5'-트리포스페이트 49의 수율은 18%였다.
[실시예 4]
7-3(아미노-1-프로피닐)-2',3'-디데옥시-7-데아자아데노신 5'-트리포스페이트(51)의 제조 (화합물 51은 Het 7-데아자아데닌(j)이고 R'이 -CH2-인 경우에 구조 6의 실례이다. 이는 표지가 붙여진 체인터미네이터 36에 대한 직후 선구물질이다)
A. 2'-아세톡시-3'-브로모-5'-(2-아세톡시이소부틸)아세노신(18)의 제조, 건성 아세토니트릴 (250㎖, 알드리지)에 투베르시딘(17,7-데아자아데노신, 6.66g, 25.0 밀리몰, 시그마)을 넣어 만든 현탁액에 15분간에 걸쳐 브롬화 2-아세트옥시이소부티릴(19.5㎖, 150 밀리몰, 5당량, Russell 일행, J. Am. Chem Soc., 95, 4016-4030 (1973)의 방법에 따라 제조됨)을 가하였다. 현탁된 고체를 대략 5분내로 녹이고, 반응물을 질소하의 25˚에서 22시간 동안 휘저어 섞었다. 물(400㎖)에 디포타슘 하이드로겐포스페이트(43.55g, 300밀리몰, 6당량)을 녹여 만든 용액에 상기 반응 혼합물을 가하였다. 30분동안 휘져서 섞고 난 후, 용액을 초산에틸(1×400㎖ 및 2×200㎖)로 추출하였다. 조합된 유기층을 황산 마그네슘 위에서 말리고 건조상태로 증발시켜, 14.73g(118%)의 흰색 거품을 얻었다. 이 물질은(UV 검출과 함께) TLC에 의해 95% 이상이 하나의 경미하게 넓혀진 점보다는 컸으나 NMR로 1개의 주 생성물과 1개 이상의 부 생성물이 존재한다는 것이 밝혀졌다. NMR 스펙트럼은 브로모아세테이트 18인 주 생성물과 양립할 수 있었다.
주 성분 18에 대한
1H-NMR (DMSO-d6) : 8.08(s, 1H, H2), 7.34(d, J=3.7, 1H, H8), 7.12(넓은 s, 2H, NH2), 6.70(d, J=3.7, 1H, H7), 6.32(d, J=3.8, 1H, H1'), 5.61(dd, J=2.4 및 3.8, 1H, H2'), 4.89(dd, J=2.4 및 4.5, 1H, H3'), 4.43(m, 1H, H4'), 4.35(dd, J=12 및 4, 1H, H5'a), 4.29(dd, J=12 및 7, 1H, H5'b), 2.08(s, 3H, OAc), 2.00(s, 3H, OAc), 및 1.49(s, 6H, 2HC3).
B. 2',3'-디데옥시-2',3'-디데히드로-7-데아자아데노신(19)의 제조 아연 더스크(20g 말린크로트)를 1N 염산(3×50㎖), 물(2×50㎖), 2%, 황산 제2구리(2×50㎖), 물(4×50㎖), 에탄올(3×50㎖) 및 에테르(2×50㎖)로 신속하게 (총 소요시간이 대략 10분 정도)세척함으로써 아연-구리 결합물을 불순물이 없도록 만들었다. 각 세척시마다, 아연 더스트를 현탁될 때까지 프리트 깔때기 내에서 휘저어 섞꼬, 공기에 대한 아연의 노출을 최소화 시키는 동안에 흡인(suction)으로 세척물을 제거하였다. 결합물을 30분동안 진공건조시켰다. 상기 조 브로모아세테이트(14.63g)를 건성 디메틸포름아미드(150㎖, 알드리치)내에 용해시키고, 대략 25㎖의 용제를 회전식 증발기(45˚, 2torr)로 제거하였다. 불순물이 없는 아연-구리 결합물(14.63g, 대략 9당량)을 가하고, 이 결과의 현탁액을 질소하의 25˚에서 휘저어 섞었다. 아연-구리 결합물의 질에 의존하여 이 반응물은 유도기(induction periodl) 및/또는 변화 속도를 보여줄 수 있으며, 따라서 출발 물질이 완전히 소비되었음을 TLC(90:9:1 디클로메탄-메탄올-농축수산화 암모늄:출발물질 Rf=0.45 및 생성물 Rf=0.39 및 0.36)가 나타낼 때까지 상기 반응을 진행시킨다. 이 경우에, 상기 반응은 15분 이내에 완료된다. 100분후에, 포화 수용성 나트륨 비카보네이트(75㎖)를 반응 혼합물에 10분에 걸쳐 주의 깊게 가하였다. 반응 혼합물을 여과 조제를 통해 통과시키고 여과 조제를 메탄올(2×50㎖)로 세척하였다. 조합된 여과물을 건조상태로 증발시키고, 잔류물을 물(150㎖)와 초산 에틸(150㎖) 사이에서 분배시켰다. 수용성 층을 초산 에틸(2×100㎖)로 추출하고, 조합된 유기 추출물을 황산 마그네슘 위에서 건조시킨 후, 농축하고, 1시간 동안 진공 건조시켰다.
이 결과의 어두운 오렌지 색 반고체를 메탄올(100㎖)에 녹이고, 물(25㎖)와 렉신 201 수지(29g, 4.3당량/g, 5당량, 수산화물ㅡ 형태)를 가하였다. 반응 혼합물을 총 210분 동안 환류시켰다. TLC로 통제함(85:13;2 디클로로메탄-메탄올-농축 수산화 암모늄; 중간체 Rf=0.49 최종 생성물 19. 0.24)으로써, 반응이 70% 전화(conversion)에서 급속하에 정지함이 밝혀졌고, 따라서 165분 후에, 추가의 수지(29g)을 가하였다. 냉각하지 않고, 상기 수지를 여과로 제거하고 1:1 디클로메탄-메탄올(2×75㎖)로 세척하였다. 조합된 여과물을 건조상태로 증발시키고, 이 결과의 자주색 고체를 끓는 이소프로판올(150㎖)로부터 재결정시켜 3.778g의 올레핀 19를 회색빛 도는 흰색의 바늘형(용융점 205-206˚)으로 얻었다. 0/631g의 생성물(엷은 자주빛 바늘형, 용융점 202-203˚)의 이차 수확물을, 원액을 25㎖로 농축시켜 얻었다. 수확물 둘다(총 4.409g, 76%)는 TLC에 의해 균질하였으며, 미량의 이소프로판올을 제외하고는 NMR에 의해 순수하였다.
1H-NMR (DMSO-d6) : 8.07(s, 1H, H2), 7.15(d, J=3.6, 1H, H8), 7.12(넓은 s, 1H, H1'), 7.01(넓은 s, 2H, NH2), 6.57(d, J=3.6, 1H, H7), 6.43 및 6.02(넓은 d, J=6.0, 각각 1H, H2' 및 H3'), 4.95(t, J=6.5, 1H, 5' OH), 4.79(m, 1H, H4'), 3.52(m, 2H, H5').
C. 2',3'-디데옥시-7-데아자아데노신(20)의 제조, 450㎖파르 병에 올리핀(19(3.80g), 에탄올(76㎖), 10% 카본위 파라듐(380㎖, 알드리치) 및 40psi의 수소를 충전하였다. 4.67시간동안 25℃에서 흔든 후에, 14.5psi의 수소가 흡수되고나서, 수소 흡수가 멈추었다. TLC(85:13:2 디클로로메탄-메탄올-농축 수산화 암모늄과 함께 2개의 분배물; 출발물질 19, 0.45; 생성물 20, 0.48)는 단일 UV-활성 신규 생성물로의 완전한 전환을 보여주었다. 촉매를 여과 조제를 통하여 여과로 제거하고, 에탄올로 세척하였다. 여과물로부터 용제를 제거하고, 밤새껏 질소 건조시켜, 3.98g(104%)의 디데옥시누클레오시드 20을 흰색 거품으로 얻었다. NMR은 8중량%의 에탄올(96%의 수정수율)의 존재를 제외하고는 생성물이 균질화다는 것을 나타내었다. 이 물질의 유사한 배치는 결정화에 저항하며, 무수 용제와의 공비 건조에 대하여 극도의 흡습성을 나타낸다. 그러므로 이 물질을 대략 1주일 동안 진공하에서 저장한 뒤에 의해 이물질이 5중량%의 에탄올을 함유한다는 것이 밝혀질 때 사용된다. 이 생성에서 관찰된 결정성의 결핍과 스펙트럼의 특성은 Robins 일행, Can. J. Chem., vol. 55, 1259(1977)에 의해 앞서 보고된 것과 같다.
1H-NMR (DMSO-d6) : 8.04(s, 1H, H2), 7.33(d, J=3.6, 1H, H8), 6.97 (넓은 s, 2H, NH2), 6.56 (d, J=3.6, 1H, H7), 6.34(dd, J=5.2 및 6.4, 1H, H1'), 4.06(t, J=5.6, 1H, 5' OH), 4.33(t, J=5.1, 0.43H, 에탄올 OH), 4.04(m, 1H, H4'), 3.4-3.6(m, 2.86H, H5' 및 에탄올 CH2), 2.33, 2.21 및 2.20(m, 4H, H2', H3') 및 1.06 (t, J=7.0, 1.3H, 에탄올 CH3).
D. 7-요오드-2',3'-디데옥시-7-데아자아데노시(21)의 제조.
물(190㎖)에 95% 순도 디데옥시누클레오시드 20(2.95g, 11.96 밀리몰), 무수초산 나트륨(4.13g, 50.3 밀리몰, 4당량) 및 초산 제2수은(3.81g, 11.95 밀리몰, 1.00 당량, 피셔, 99.9%)를 녹여 기계적으로 휘저어 섞은 용액을 질소하의 65℃에서 2시간동안 가열하였다. 이 결과의 메탄올 흰색 현탁액을 25˚로 냉각시킨 후에, 요오드(4.79g, 18.9 밀리몰, 1.6당량) 및 초산 에틸(190㎖)를 가하였다. 1시간 후, 현탁된 수은제가 소비되었으며, 투명한 자주빛 용액이 남았다. 2시간 후, 아황산 나트륨(6.35g)을 가하자, 자주색이 사라졌다. 30분동안 휘저어 섞은 후에, 황화 수소기체를 15분동안 반응물 속으로 완만하게 거품이 나도록 불어넣었다. 황화 제2수은(흑색 콜로이드)와 요오드화물 21(백색 분말)이 반응물로부터 침전하였다. TLC에 의해 두개의 주된 UV-활성 점중 하나가 사라짐을 통제함으로써 수은(II)의 완전한 침전을 추정하였다. 반응 혼합물을 여과 제조를 통해 여과시키고 2개의 층으로 분리시켰다. TLC가 더 이상의 생성물이 추출되지 않았음을 나타낼 때까지 끊는 초산 에틸(9×100㎖)를 여과 조제를 세척하였다. 각 초산에틸 추출물을 수용액 층으로 세척하였다. 조합된 초산에틸 층을 황산 마그네슘 위에서 말려, 건조 상태로 증발시켰다. 이 결과의 조 고체를 공기에 노출시키자 적색으로 변하였다. 이 물질을 3:1 디클로로메탄-메탄올(100㎖)에 녹이고 유리 염기 형태의 AG3 X4A음이온 교환 수지(5.0g, 바이오레드 2.9meq/g 건조)를 가하였다. 황화 수소를 10분동안 적색 용액 속으로 거품을 내며 불어넣자, 적색이 사라졌다. 경미한 흐름을 약간 가열함으로써 제거하고, 실리카 겔이 2㎝ 플러그(15g)를 통해 용액을 신속히 여과시켰다.
살리카 겔을 추가의 3:1 디클로로메탄-메탄올(100㎖)로 용출시켰다. 실리카겔(50g)을 여과물에 가하고 황화 수소를 10분 동안 거품을 내며 불어넣었다. 회전식 증발기로 용제를 이 혼합물로 부터 제거하고, 실리카겔을 클로로포름(200㎖)으로 동시 증발시킴으로써 건조시켰다. 질소 흐름을 탈가스화된 실리카겔 칼럼(500g)속에 이 실리카 겔을 신속히 충전하였다. 질소 하에서 디클로로메탄 내의 5%(6ℓ) 및 10%(4ℓ) 끓는 메탄올로 용출시킨 결과, 백색 분말의 2.92g(64%)의 요오드화물 21과 극성이 낮은 456㎎(7.5%)의 7.8-디요오드-2',3'-디데옥시-7-데아자아데노신을 얻었다. 끓는 초산에틸(200㎖)로 부터 주 생성물을 재결정화한 결과 2.626g의 백색 바늘형(용융점 158-160˚)을 얻었다. 원액을 10㎖로 농축하여 0.391g의 밝은 적색 바늘형(용융점 156-158˚)의 이차 수확물을 얻었다. 수확물 둘다는 NMR과 TLC에 따라서 균질하였으며, 올레핀 19에서의 요오드뉴클레오시드 21의 총 수율이 모두 64%로 나타났다.
1H-NMR (DMSO-d6) : 8.09(s, 1H, H2), 7.67(S, 1H, H8), 6.65(넓은 s, 2H, NH2), 6.34(dd, J=4.4, 및 6.8, 1H, H1'), 4.95(t, J=5.5 1H, 5' OH), 4.04(겉보기 7), J=3.5, 1H, H4'), 3.59 및 3.49(m, 2H, H5'), 2.30, 2.28 및 2.00(m, 4H, H2' 및 H3').
E. 7-(3-트리플루오로아세트아미드-1-프로피닐)-2',3'-디데옥시-7-데아자아데노신(52)의 제조.
요오드화물 21(720, 3㎎, 2.00 밀리몰)을 90분 동안 실시예 IC에 주어진 표준 공정에 따라서 N-프로파르길 트리플루오로아세트아미드와 결합시켰다. 디클로로메탄 내의 7% 메탄올로 크로마토그래피한 결과, 705,8㎎(92%)의 결합 생성물 52를, NMR과 TLC에 따라서 균질한, 회색이 도는 흰색의 분말로서 얻었다. 끓는 초산에틸(10㎖)로 부터 재결정화하여 372㎎의 백색의 미결정(용융점 169-171˚)을 얻었다.
1H-NMR (DMSO-d6) : 10.1(뒤틀린 t, 1H, NHTFA), 8.10(s, 1H, H2), 7.78(s, 1H, H8), 6.0-7.5 매우 넓은 s, 2H, NH2), 6.34(dd, J=4.5 및 7.0, 1H, H1'), 4.98 (t, J=5, 1H, 5' OH), 4.31(약간 넓은 s, 2H, -CH2-N-), 4.10(겉보기 7, J=3.5, 1H, H4'), 3.60 및 3.40 (m, 2H, H5'), 2.37, 2.18 및 2.00(m, 4H, H2' 및 H3'), TLC(90:9;1 디클로메탄-메탄올-농축 수산화 암모늄;UV) : 출발 요오드화물 21, Rf=0.36; 생성물 52, -0.26).
F. 7-(3-아미노-1-프로페닐)-2',3'-디데옥시-7-데아자아메노신 5'-트리포스페이트(51)의 제조.
알키닐아미노 뉴클레오시드(52)(1.00 밀리몰)을 해당 5'-트리포스페이트를 바꾸고, 트리플루오로아세틸기를 실시예 1E에서 설명한 일반적인 공정에 따라 제거하였다. 옥시염화 인의 이차 앨리퀴트를 부가한 후에, 용액을 120 분 동안 휘저어 섞었다. 생성물의 흡광 계수가 출발물질의 그것(12.700)과 동일하다고 가정하면, 279.5㎚에서의 흡수를 기준으로 할때, 트리포스페이트 51의 수율은 40%였다.
1H-NMR (D2O) : 7.97(s, 1H, H2), 7.80(s, 1H, H8), 6.33(m, 1H, H1'), 4.44(m, 1H, H4'), 4.27(m, 1H, H5'a), 4.14(m, 1H, H5'b), 4.11(넓은 s, 2H, -CH2-), 2.6-2.0(m, 4H, H2' 및 H3'), 플러스 카운터이온(트리에틸암모늄)피이크,31P-NMR(D2O) : -8.59(넓은 d, J=20, 1P), -9.56(d, J=20, 1P) 및 -21,38(m, 1P), UV(pH 8.2 수정 트리스);238 및 279.5㎚에서 초래.
[실시예 5]
7-요오드-2',3'-디데옥시-7-데아자데노신(21)의 이차 제조(화합물 21은 실시예 4에서 제조되어 사용된 중간체이다.)
A. 6-클로로-2-메틸티오-9-(2-데옥시-β-D-리보퓨란오실)-7-데아자퓨린(23)의 제조.
메탄올(210㎖) 및 농축 수산화 암모늄(210㎖)을, 디클로로메탄(210㎖)에 6-클로로-2-메틸티오-9-(3,5-디-O-p-톨우로일-2-데옥시-β-D-리보퓨란오실)-7-데아자퓨린(22, 26.8g, 카자미에러 일행의 J. Am. Chem. Soc., Vol 106, 6379(1984)에서 설명된 대로 제조됨)을 녹여 만든 용액에 가하였다. 결과의 혼합물을 상온에서 5일동안 섞어준 후 건조증발시켰다. 잔류물을 에탄올로 동시 증발시킴으로서 건조시켰다. 조 생성물을 디클로메탄에 녹익 놓아두자, 무색의 결정이 침전하였다. 침전물을 수집하고, 에테르로 충분히 세척하여 14.5g(79.1%)의 디올 23(용융점 d 190-192˚)을 얻었다.
1H-NMR (DMSO-d6) : 2.26 및 2.56(m, 2H, H2'), 2.57(s, 3H, SCH3), 3.54(m, 2H, H5'), 3.84(m, 1H, H3'), 4.37(m, 1H, H4'), 4.95(m, 1H, OH), 5.34(m, 1H, OH), 6.57(m, 1H, H1'), 6.63(m, 1H, H7), 7.80(m, 1H, H8). 이 데이타는 위에서 설명한 대로 제조된 디올 23의 다른 배치로 부터 얻었다.
B. 6-클로로-2-메틸티오-9-(5-O-트리페닐메틸-2-데옥시-β-D-리보퓨란오실)-7-데아지퓨린(24)의 제조.
디올23(14.5g)을 건성 피리딘으로 동시-증발시켜 말렸다. 염화 트리페닐메틸(16g), 4-(디메틸아미노) 피리딘(600㎎), 및 트리에틸아민 (8.0㎖)를, 건성 피리딘(200㎖)에 건성 디올을 녹여 만든 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 질소하의 65˚에서 6시간 동안 휘저어 섞은 후에, 추가의 염화 트리페닐메틸(2.0g) 및 트리에틸아민(1.0㎖)을 가하고 17시간 동안 가열을 계속하였다. 냉각 후에, 메탄올(3㎖)를 가하고, 반응 혼합물을 증발건조시켰다. 잔류물을 디클로메탄과 0.3N 염산사이에서 분배시켰다. 유기층을 수용성 나트륨 비카보네이트 및 소금물로 세척시킨 후, 황산 나트륨 위에서 말려 증발 건조시켰다. 디클로로메탄내의 1% 및 1.5% 메탄올로 실리카 겔위에서, 이 결과의 조생성물을 크로마토그래피한 결과, 22.7g(88.6%)의 모노트리틸에테르 24로 유리형 고체를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) : 2.48 및 2.60(m, 2H, H2'), 2.59(s, 3H, SCH3), 3.40(m, 2H, H5'), 4.08(m, 1H, H3'), 4.61(m, 1H, H4'), 6.43(m, 1H, H7), 6.68(m, 1H, H1'), 7.2-7.5(m, 16H, 트리틸 H 및 H8). 이 데이터는 위에서 설명한 대로 제조된 24의 다른 배치로 부터 얻었다.
C. 6-클로로-2-메틸티오-9-(5-O-트리페닐메틸-2,3-디데옥시-β-D-리보퓨란오실)-7-데아자퓨린(25), 4-(디메틸아미노)피리딘 (16.5g)과 페닐 클로로티오노카로네이트(13.5㎖)를, 건성 디클로로메탄(300㎖)에 트리틸에틸 24를 녹여 만든 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 질소하의 상온에서 2.25시간 동안 휘저여 섞은 후에, 디클로로메탄(200㎖)를 가하였다. 용액을 0.5N 염산(700㎖), 0.5N 수산화나트륨(700㎖) 및 소금물로 세척하였다. 유기 층을 황상 나트륨 위에서 말려, 증발 건조시켰다.
이 결과의 조 티아카보네이트를 건성 톨루엔(450㎖)에 녹이고 용액을 완만한 환류가 되게 가열하였다. 아조이소비스부티로니트릴(600㎎)과 수산화 트리-n-부틸틴(17.7㎖)을 가하였다. 15분 동안 질소 하의 환류에서 휘저어 섞은 후에, 추가의 수소화 트리-n-부틸틴(2.0㎖)를 가하고, 반응 혼합물을 이외의 15분 동안 환류시켰다. 냉각 후에, 반응 혼합물을 에테르 (200㎖)로 희석시키고나서, 10% 수용성 불화 칼륨(500㎖), 0.75N 수산화 칼륨(500㎖), 및 소금물로 세척하였다. 황산나트륨 위에서 건조시키고, 농축시킨 후, 2:1 디클로로메탄-에테르 및 디클로로메탄으로 실리카겔 위에서 이 결과의 조 생성물은 크로마토그래피한 결과, 10.1g의 디데옥시뉴클레오시드 25를 얻었다. 불순한 유분을 조합시켜, 재크로마토그래피한 결과, 추가의 3.76g의 순수한 생성물을 얻었다. 이들 생성물을 조합하여, 13.9g(63.0%)의 25를 무색 고체(용융점 140-142.5˚)를 얻었다.
1H-NMR (CDCl3) : 2.11, 2.36 및 2.46(m, 4H, H2' 및 H3'), 2.60(s, 3H, SCH3), 3.33(겉보기 d, J=4, 2H, H5'), 4.32(m, 1H, H4'), 6.39(d, J=3.7, 1H, H7), 6.52(dd, J=6.7 및 3.7, 1H, H1'), 7.25 및 7.45(m, 15H, 트리틸 H), 7.32(d, 1H, J=3.7, H8), 이 데이타는 앞에서 설명한 대로 제조된 25의 다른 배치로 부터 얻었다.
D. 6-클로로-2-메틸티오-9-(2',3'-디데옥시-β-D-리보퓨란오실)-7-데아자퓨린(26)의 제조.
트리플루오로아세트산(10㎖)을 1:1 메탄올-디클로로메탄(100㎖)에 트리틸 에테르 25(7.58g)을 녹여 만든 용액에 가하고, 상기 용액을 질소하의 25˚에서 17시간 동안 휘저어 섞었다. 반응 혼합물을 디클로로메탄 (500㎖)과 수용성 나트륨 비카보네이트 사이에 분배시키고, 수용성 층을 디클로로메탄으로 재추출시켰다. 조합된 유기 층을 황산 나트륨 위에 말리고, 증발 건조시켰다. 디클로로메탄 내의 0% 및 5% 메탄올로 실리카 겔 위에 잔류물을 크로마토그래피한 결과, 4.07g(97.1%)의 뉴클레오시드 26을 점성이 큰 무색 유리로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) : 2.16, 2.26 및 2.50(m, 4H, H2' 및 H3'), 2.63(s, 3H, SCH3), 2.76(넓은 s, 1H, OH), 3.67 및 3.93(m, 2H, H5'), 4.27(m, 1H, H4'), 6.38(dd, J=6.7 및 5.2 Hz, 1H, H1'), 6.51(d, J=3.7 Hz, 1H, H7), 7.26(d, 1H, J=3.7 Hz, H8). 이 데이타는 위에서 설명한 대로 제조된 26의 다른 배치로 부터 얻었다.
E. 2',3'-디데옥시-2-메틸티오-7-데아자아데노신(27)의 제조.
유리-내장 봄브 내의 메탄올(50㎖)에 염화물 26 (1.83g)을 녹여 만든 용액속에 암모니아(10g)을 증류시켰다. 용액을 100˚의 오오토클레이브내에서 15시간 동안 가열하였다. 냉각 후에, 반응 혼합물을 증발건조시켰다. 디클로로메탄 내의 0%, 3% 및 5% 메탄올로 실리카 겔 위에서 이 결과의 조 생성물을 정제한 결과, 1.27g(80.4%)의 데아자이데노신 27을 무색 고체(용융점 184-185˚)로서 얻었다.
1H-NMR (DMSO-D6) : 2.01, 2.21 및 2.39(m, 4H, H2' 및 H3'), 2.45(s, 3H, SCH3), 3.50(m, 2H, H5'), 4.02(m, 1H, H4'), 4.83(t, J=5.5, 1H, 5' OH), 6.32(dd, J=7 및 4.5, 1H, H1'), 6.50(d, J=3.7, 1H, H7), 7.07(넓은 s, 2H, NH2), 7.20(d, 1H, J=3.7, H8).
F. 2',3'-디데옥시-7-데아자아데노신(20)의 제조.
600㎎과 27과의 과량의 라니 니켈(Raney Nickel) (알드리치, 물 및 메탄올로 예비 세척됨)을, 출발 물질의 사라짐이 TLC로 나타날 때까지(6시간)질소 하에서 환류시켰다. 이 뜨거운 용액을 여과-조제를 통해 여과시키고, 수집돤 라니니켈을 메탄올로 잘 세척하였다. 조합된 여과물을 증발시켜 424g(84.9%)의 20을 실시예 4C에서 제조된 물질과 동일한 무색의 유리형 고체를 얻었다.
G. 7-요오드-2',3'-디데옥시-7-데아자아데노신(21)의 제조.
디데옥시-7-데아자데노신 20을 실시예(4D)에 주어진 방법에 따라 요오드화 시켰다.
[실시예 6]
7-요오드-2', 3'-디데옥시-7-데아자아데노신 (21)의 세번째 제조(화합물 21은 실시예 4에서 제조 및 사용된 중간체이다)
A. 6-클로로-9-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-7-데아자푸린(29)의 제조메탄올(175㎖) 내 진한 수산화 암모늄(100㎖)의 용액을 디클로로메탄(100㎖) 내 6-클로로-9-(3.5-디-O-p-플루오일-2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-7-데아자푸린(28, 10.0g; Z, 카지메어주크 일행이 J. Amer, Chem, Soc., Vol, 106, 6379(1984)에 기재된 바와 같이 제조)용액 속에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 25°에서 24시간 동안 휘저어 섞은 후, 추가로 진한 수산화암모늄 (50㎖)을 더 첨가했다. 총 5시간 동안 휘저어 섞은 후에 반응 혼합물을 증발 건조시키고 조 생성물을 에탄올과 함께 동시 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 속에 용해시키고 원하는 생성물을 결정화 시켰다. 여과 및 건조에 의하여 누클레오시드 29 4.90g(92%)을 무색의 결정(용융점 155.5-158.5°)형태로 얻었다.
1H-NMR(DMSO-d6) : 2.30 및 2.55 (m, 2H, H2'), 3.58(m, 2H, H5'), 3.85(m, 1H, H3'), 4.40(m, 1H, H4'), 4.97(m, 1H, OH'), 5.35(m, 1H, H1), 6.65(m, 1H, H1'), 6.75(d, 1H, H7), 8.00(m, 1H, H8), 8.65(s. 1H, H2). 이 데이타는 전술한 바와 같이 제조된 29의 다른 배치로 부터 얻었다.
B. 6-클로로-9-(5-O-트리페닐메틸-2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-7-데아자푸린(30)의 제조.
누클레오시드 29 (2.5g)를 건조 피디린으로 동시 증발시켜 건조시켰다. 잔류물을 건조 피리딘(40㎖)속에 용해시키고, 염화트리페닐메틸(2.5g), 4-(디메틸아미노)피리딘 1(120㎖) 및 트리에틸아민 (1.6㎖)을 첨가했다. 반응 혼합물을 질소하에 4시간 동안 65°에서 휘저어 섞었다. 추가로 염화트리페닐메틸(1.0g)과 트리에틸아민(0.6㎖)을 첨가하고, 반응물을 75°에서 18시간 동안 휘저어 섞었다. 냉각후에 메탄올(2㎖)을 첨가하고 반응 혼함물을 증발 건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄과 0.5N 염산 사이에 분배시켰다. 유기층을 수성 나트륨 비카보네이트와 염수로 세척하고, 황산나트륨상에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. 디클로로메탄내의 0%, 1.5% 및 3% 메탄올을 사용하여 실리카 겔상에서 크로마토그래피 시킴으로써 2.26g(48%)의 트리틸에테르 30을 유리질의 고체 형태로 얻었다.
1H-NMR(CDCL3) : 2.46 및 2.65 (m, 2H, H2'), 3.40(m, 2H, H5'), 4.10(m, 1H, H3'), 4.65(m, 1H, H4'), 6.55(m, 1H, H7), 6.72(m, 1H, H1'), 7.2-7.5(m, 16H, 트리틸 H 및 H8) 및 8.60(s. 1H, H2).
C. 6-클로로-9-(5-0-트리페닐메틸-2-데옥시-3-티오노카르보페녹시-β-D-리보푸라노질)-7-데아자푸린(30a)의 제조.
4-(디메틸아미노)피리딘(1.35g)과 패닐 클로로티오노카르보네이트(1.20㎖)를 건조 디클로로메탄 (30㎖)내의 트리틸에테르 30의 용액에다 첨가했다. 반응혼합물을 질소하에 25°에서 2시간 동안 휘저어 섞은 후에, 추가로 디클로로메탄(20㎖)을 첨가하고 용액을 0.5N 수산화나트륨 및 염수로 세척했다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄-에테르로 분쇄하여 1.53g(76%)의 티오카르보네이트 30a를 무색으로 결정(mp 186.5-188.5°)형태로 얻었다.
1H-NMR(CDCL3) : 2.85 및 3.00 (m, 2H, H2'), 3.55(m, 2H, H5'), 4.50(m, 1H, H4'), 6.00(m, 1H, H3'), 6.60(m, 1H, H7), 6.85(m, 1H, H1'), 7.1-7.5(m, 20H, 트리틸 및 패닐 H), 7.50(d, 1H, H8) 및 8.60(s. 1H, H2).
D. 6-클로로-9-(5-O-트리페닐메틸-2, 3-디데옥시-β-D-리보푸라노실)-7-데아자푸린(31)의 제조.
건조 톨루엔(50㎖)속에 용해된 키오카르보네이트 30a(1.2g), 아조이소비스부티로 니트릴(50㎖) 및 트리-n-부틸 주석 수소화물(0.60㎖)의 용액을 질소하에 110°에서 15분간 가열했다. 냉각 후 반응 혼합물을 에테르 50㎖로 희석하고 10% 수성 불화칼륨 (50㎖)과 염수로 세척했다. 유기층을 황산나트늄에서 건조시키고 증발시켜 건조상태를 만들었다. 이렇게 해서 만든 조 생성물을 실리카겔상에서 디클로로메탄 내의 0% 및 1.5% 메탄올로 크로마토그래피시켜, 0.84g(92%)의 디데옥시누클레오이스 31을 무색 고체(mp60-63.5°) 형태로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) : 2.11, 2.36 및 2.50 (m, 4H, H2' 및 H3'), 3.37(m, 2H, H5'), 4.35(m, 1H, H4'), 6.50(d, J=3.7, 1H, H7), 6.58(dd, 1H, H1'), 7.25 및 7.45(m, 15H, 트리틸 H), 7.55(d, 1H, J=3.7, H8), 및 8.60(s. 1H, H2).
E. 6-클로로-9-(2,3-디데옥시-β-D-리보푸라노실)-7-데아자푸린(31a)의 제조 트리플루오르아세트산(1.5㎖)을 1 : 1 메탄올-디클로로메탄(20㎖)내의 트리에틸에테르 31(700㎖)의 용액속에 첨가했다. 25°에서 질소하에 17시간 동안 휘저어 섞은 후에 중탄산나트륨(1.5g)을 첨가하고 혼합물을 30분간 휘저어 섞었다. 반응혼합을 여과하고 증발건조시켰다. 생성된 조 생성물을 디클로로메탄내의 0% 및 2% 메탄올로 실리카 겔 상에서 크로마토그래피시킴으로써, 300㎖(84%)의 알콜 31a을 무색 유리로 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) : 2.20, 2.40 및 2.65 (m, 4H, H2' 및 H8'), 3.65 및 (4,00(m, 2H, H5'), 3.95(넓은 s, 1H, OH), 4.35(m, 1H, H4'), 6.28(dd, 1H, H1'), 6.62(d, J=4, 1H< H7), 7.40(d, 1H, J=4, H8), 및 8.65(s, 1H, HJ2).
F. 6-클로로-9-(5-아세톡시-2,3-디데옥시-β-D-리보푸라노실)-7-데아자푸린(32)의 제조.
무수 초산(2,0 밀리몰)을 건조 피리딘(10㎖) 내 알콜 31a(284㎎) 용액에다 첨가했다. 25°에서 1.25식 동안 용액을 휘저어 섞은 후에 메탄올(10㎖)을 첨가했다. 30분간 더 휘저어 섞은 후에 반응 혼합물을 증발건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 속에 용해시키고, 이 용액을 1N 염산(2x) 및 염수(1x)로 세척했다. 유기층을 황산나트륨 위에서 건조시키고 증발 건조시켜서 295㎎ (98%)의 조 아세테이트 32를 무색 유리 형태로 얻었다.
1H-NMR(CDCL3) : 2.07(s, 3H, 아세틸), 2.20, 2.45 및 2.55(m, 4H, H2' 및 H3'), 4.25 및 4.35(m, 2H, H5'), 4.40(m, 1H, H4'), 6.55(dd, 1H, H1'), 6.65(d, 1H, H7), 7.50(d, 1H, H8), 및 8.60(s. 1H, H2).
G. 6-클로로-7-요오드-9-(5-O-아세틸-2,3-디데옥시-β-D-리보푸라노실)-7-데아자푸린(33)의 제조.
디클로로메탄(약 1㎖) 내 일염화요오드(340㎎)의 용액을 건조 디클로로메탄(20㎖)내의 아세테이트 32(200㎖)의 용액속에 첨가했다. 25°에서 3시간 동안 휘저어 섞은 후 반응 혼합물을 디클로로메탄과 수성 아황산수소나트륨 사이에 분배시켰다. 유기층을 수성 중탄산나트륨 및 염수로 세척하고, 황산 나트륨에서 건조시키고, 증발건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄-에테르로 분쇄하여 무색의 결정(mp 132.5-134°)135㎎ (47%)을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) : 2.10, 2.40 및 2.55(m, 4H, H2' 및 H3'), 2.17(s, 3H, COCH3), 4.27 및 4.37(m, 2H, H5'), 4.40(m, 1H, H4'), 6.55(dd, 1H, H1'), 7.72(s, 1H, H8) 및 8.60(s. 1H, H2).
H. 7-요오드-2', 3'-디데옥시-7-데아자아데노신(21)의 제조.
암모니아(4g)를 유리 내장 봄브속에 들어있는 메탄올(20㎖)내 염화물 33(125㎎)의 용액에다 첨가했다. 이 봄브를 100°하에 3시간 동안 오토클레이브속에서 가열했다. 잔류물을 뜨거운 초산에틸속에 용해시키고, 뜨거운 용액을 여과 조제의 패드를 통해 여과하였다. 여과물을 증발 건조시킨 후에 잔류물을 에테르로 분쇄하여 85㎎의 약간 불순한 생선물 21을 무색의 결정형태로 얻었다. 디클로로메탄내의 5% 메탄올을 사용하여 이 물질을 실리카겔 상에서 준비용 TLC에 의해 더 정제함으로써 67㎎(63%)의 요오드화물 21을 무색 고체형태로 얻어다. 이 물질은 실시예 4D에서 제조된 것과 같았다.
[실시예 7]
7-요오드-2', 3'-디데옥시-7-데아자아데노신(53)의 제조(화합물 53은 Het가 7-데아자히포크산틴 (1)인 구조 4의 한가지 예이다)
질소하에 빙초산 (2.0㎖)내에 데아자아데노신 21 (720.3㎎ 2.00mmol)의 현탁액에다 물(18㎖)을 적가하여 투명한 용액을 얻었다. 고체 아질산나트륨(1,38g, 20.0mmol, 10당량)을 작은 배치에서 아르곤 스트림을 통하여 10분에 걸쳐 첨가하였다. 생성된 흐린 반응 혼합물을 아르곤하에 기계적으로 휘저어 섞어서 고물질의 침전물을 점차로 형성시켰다. 18시간 후에 반응물을 여과하고, 침전물을 초산에틸(100㎖)과 물(약 10㎖)로 완전히 세척하였다. 합쳐진 여과물들을 분배시키고 수성층을 초산에틸(2×50㎖)로 추출했다. 유기층들은 합하여 황산마그네슘 상에서 건조시키고 증발건조 시켰다. TLC에 의하여, 침전물과 초산 에틸 추출물은 생성물 53으로 구성되며 5%미만의 미반응된 21로 오염되어 있음을 알 수 있었다. 두 생성물 배치를 1 : 1 메탄올-디클로로메탄속에 용해시키고 합쳐서, 실리카겔(7g)상에서 증발시켰다. 실리카겔을 클로로포름(50㎖)과 동시 증발시키고 실리카겔 컬럼(50g)속에 집어넣었다. 디클로로메탄내의 8% 메탄올을 용출시켜, 558.3㎎(78%)의 데아자아데노신 53을 담황색 고체 형태로 얻었다. 이 물질을 끓는 이소프로판올로부터 재결정화 시킴으로써 백색 침상물질의 두 수확물을 얻었다. 이들 침상물질은 200°내지 210°인 용융점(분해)를 가졌다. 크로마토그래피 및 재결정화시킨 생성물들은 이소프로판올 (5몰%)의 존재를 제외하고는 TLC 및 NMR에 의해 균질되었다.
1H-NMR(DMSO-d6) : 12.04(넓은 s. 1H, H1), 7.93(s. 1H, H2), 7.56(s. 1H, H8), 6.2+9(dd, J=4.0 및 6.8, 1H, H1'), 4.94(t, J=5.0, 1H, 5' OH), 4.04(겉보기 7, J=3.5, 1H, H4'), 2.36, 2.18 및 1.99(m, 4H, H2' 및 H3)
[실시예 8]
5-(3-아미노-1-프로피닐)-2'-데옥시시티딘 5'-트리포스페이트(54)의 제조(화합물 54는 R1이 -CH2-이며, Het는 시토신(i), R2, R3, R7및 R8는 수소, R5는 OH 그리고 R5는 P3O9H3-인 알키닐아미노누클레오티드 (I)의 한 예이다.)
A. 5-요오드-2'-데옥시시티딘(55)의 제조.
2'-데옥시시티딘 일 수화물이 1.226g(5mmol, Aldrich)이고 제 2 수은 아세테이트가 1.753g(5.5mmol, 1당량, Fisher)이 있는 메탄올 용액(20㎖)를 14.5시간 동안 환류시켰다. 그 결과로 생긴 흰 현탁액을 30㎖의 메탄올과 50㎖의 디클로로메탄으로 희석시켰고, 이어, 1.522g의 요오드(6mmol, 1.2다량)을 첨가했다. 60분간 휘저어 섞은 후 보라색 용액은 탈색되고, 여전히 미반응 수은이 흰 현택액으로서 보였다. 100분 후 및 240분후 휘저어 섞은 후 보라색 용액은 탈색도고, 여전히 미반응 수은이 흰 현탁액으로서 보였다. 100분 후 및 240분후 0.381g(1.5mmol, 0.3당량), 0.122g(0.5mmol, 0.1당량)의 요오드를 각각 더 첨가했다. 5시간 후에, 반응물은 침전없이 보라색이 되었다. 5.17g(2.9meq/g, 3당량 Bio-Red)의 유리 염기 형태로 AG3×4A 수지 처리를 했고, 이어 황화수소를 5분 동안 반응시켜 기포를 일으켰다. 수은(Ⅱ)의 침전 정도를 박층 크로마토그래피로 측정했다. 이 반응물은 여과조제에 의해 여과시켰고, 이 여과조제는 1:1 비율의 메탄올과 디클로로메탄으로 세척시켰다. 5g의 실리카겔을 혼합 여과물에 첨가시키고, 반응 혼합물은 증발시켜 건조화했다. 실리카 겔은 50㎖의 클로로포름과 동시증발시키고 50g 실리카 겔 컬럼에 장치시켰다. 디클로로메탄내의 15%, 20% 및 30% 메탄올로 용출했더니 요오드시티딘 55 1.378(78%)을 흰 가루상태로 얻었다. 35㎖의 끓는 메탄올로 부터 재결정화시키고 밤새 진공건조시켜서 융점이 170-180℃인 흰 침상결정 0.953g을 얻었다. 모액을 10㎖로 농축시켰더니 융점이 172-174℃인 엷은 황색 침상결정의 0.140g이 두번째로 속출되었다. 미량의 메탄올을 제외하고서도 총 수율이 62%인 두가지 속출물이 박층 크로마토그래피 및 핵자기 공명(NMR)을 이용했을때 균질하다는 것을 알 수 있다.
1H-NMR(DMSO-d6) : 8.28(s. 1H, H6), 7.8 및 6.6(넓은 s. 2H, NH2), 6.08(t, J=6.3, 1H, H1'), 5.20(d, J=4, 1H, 3' OH), 4.90(t, J=5, 1H, 5' OH), 4.20(m, 1H, H4'), 3.77(비틀린 q, 1H, H3'), 3.60 및 3.54(m, 1H, H5'), 2,12 및 1.98(m, 1H, H2') 및 TLC(75 : 5 디클로로메탄-메탄올-농축 수화암모늄 하이드록사이드; UV): 출발 물질, Rf=0.15 : 생성물 55, 0.33 : 수은(Ⅱ), 0.54.
B. 5-(3-트리플루오로아세트아미드-1-프로피닐)-2'-데옥시시티딘(56) 353.1㎎의 요오드화물 55(1.00mmol)을 실시예 IC에 주어진 일반적 절차에 따라 4시간 동안 N-프로파르길트리플루오로아세트아미드와 커플링시켰다. 디클로로메탄 구배내의 0-20% 메탄올로 조성물을 크로마토그래피시키고 밤새 진공 건조시킨 후 3.84g(102%)의 흰색 가루를 얻었다. 이 물질은 박층 크로마토그래피에 의하면 균질하다는 것을 알수 있지만, 용매를 강하게 보유하였다. 이 가루를 10㎖의 끓는 이소프로파놀로 부터 재결정화시키고 -20℃로 냉각시켜서 299.6㎎(74%)백색 침상의 알키닐아미노 누클레오티드 56을 (융점 168-170℃)을 얻었다. NMR에서 보면 이 재결정화된 생성물을 순수하고 그 결정물이 생성물 56몰 당 0.5mole의 이소프로파놀을 포함한다는 것을 알 수 있다.
1H-NMR(DMSO-d6) : 9.96(넓은 s. 1H, NHTFA), 8.15(s. 1H, H6), 7.83 및 6.86(넓은 s, 2H, NH2), 6.10(t, J=6.5, 1H, H1'), 5.21(d, J=4.5, 1H, 3' OH), 5.06(t, J=5, 1H, 5' OH), 4.35(d, J=4.0, 0.5H, 이소프로파놀 OH), 4.28(넓은 s, 2H, -CH2N-), 4.20(명백한 hex, J=3.5, 1H, H4'), 3.79(m, 1.5H, H3' 및 이소프로파놀(CH), 3.56(m, 2H, H5'), 2.13 및 1.97(m, 1H, H2'), 그리고 1.04(d, J=6, 3H, 이소프로파놀 CH3), 박층 크로마토그래피 (85:13:2 디클로로메탄-메탄올-농축된 수산화 암모늄, 2가지 용출물; UV) : 출발 요오드화물 55, Rf=0.31; 생성물, 56, 0.27).
C. 5-(3-아미노-1-프로피닐)-2'-데옥시시티딘 5'-트리포스페이트(54)의 제조, 알키닐아미노 누클레오시드 56(0.275mmol)을 그에 상응하는 5'-트리포스페이트로 전환시키고 그것의 트리플루오로아세틸 기는 실시예 IE에 주어진 일반 적절차에 따라 제거하였다. 옥시염화인의 2차 부분 표본을 첨가한 후, 인산화를 3.5시간동안 진행되게 했다. 생성물에 대한 흡수 계수가 출발물질(8.780)의 것고 같다고 했을 때, 293nm이 UV 흡수시에 나타나는 트리포스페이트 54의 수율은 17%였다.
[실시예 9]
5-(3-트리플루오로아세트아미도-1-프로피닐)-2'-데옥시우리딘(57)의 제조.(화합물 57은 R1이-CH2-이고, R2가 COCF3, Het가 우라실(h), R3, R5, R7및 R8가 수소, R6가 OH인 알키닐 아미노 누클레오티드(I)에 의한 예이다) 5-요오드-2'-데옥시우리딘(7.08g, 20.0mmol, 알드리치)을 평상시보다 2.5배 더 농축된 반응물을 사용한다는 것 외에는 실시예 IC에 일반적 절차에서처럼 4시간 동안 N-트리플루오로아세틸-프로파르길아민에다 커플링시켰다. 디클로로메탄내의 10-20%의 메탄올로 실리카겔상 (500g)에서 조 생성물을 크로마토그래피 시켜보니 흑색 고형물인 3.5g(46%)의 알키닐아미노 누클레오시드 57이 얻어졌다. NMR과 TLC에 의하면, 이 물질은 진공건조시 제거되지 않은 메탄올(약 50몰%)이 있는 것을 제외하면 95% 이상의 순도를 지녔다.
1H-NMR(DMSO-d6) : 11.63(s, 1H, H3), 10.06(비틀린, t, 1H, NHTFA), 8.19(s, 1H, H6), 6.10(명백한 t, 1H, H1'), 5.23(d, J=4, 1H, 3' OH), 5.07(t, J=5, 1H, 5' OH), 4.23(m, 3H, -CH2-및 H4'), 3.8(명백한 q, J=4, 1H, H3'), 3.58(m, 2H, H5'), 그리고 2.12(m, 2H, H2').
[실시예 10]
5-(5-트리플루오로아세트아미도-1-펜티닐-2',3'-디데옥시우리딘(58)의 제조, (화합물 58은 Het가 우라실(h)이고 R1이-(CH2)3-인 구조 5의 한 예이다.
A. 5-트리플루오로아세트아미도-1-펜틴(59)의 제조.
수소화나트륨(오일내의 60% 분산액 Alfa)을 펜탄으로 신속 정확한 세척을 하여 탈지시키고, 이어 진공 건조를 시켰다. 탈지된 수소화 나트륨(4.40g, 0.110mole, 1.1당량)을 5-클로로펜틴(10.6㎖, 0.100mole, 1.0당량)을 트리플루오로아세트아미드(14.13g, 0.125mole, 1.25 당량), 및 요오드화 나트륨(14.99g, 0.100mole, 1당량)의 건조 디메틸포름아미드(250㎖, Aldrich)내 용액에다 251분에 걸쳐 약 20분으로 나눠 가했다. 반응 혼합물을 25℃에서 4, 5시간 및 60℃에서 21시간 동안 휘저어 섞었다. 냉각시킨 후 반응 혼합물을 물(500㎖)속에 용해된 나트륨 143.5g 0.25mol, 2.0당량)의 용액에다 가했다. 이 용액을 펜탄(2× 500㎖) 및 에테르(3×500㎖)로 추출시켰다. 이 혼합 유기물 층은 물(1×100㎖)로 세척시키고 황산 마그네슘상에서 건조시키고, 회전등발기로 농축시켰다. 이 혼합 유기물 층은 물(1×100㎖)로 세척시키고 황산 마그네슘상에서 건조시키고, 회전등발기로 농축시켰다. 20㎝ Vigreux 컬럼을 통해 2번 분별 증류하여 무색 유동액(비점 68-69℃ 압력이 13트로)으로써 8.09g(415%)의 5-트리플루오로아세트아미도-1-펜틴(58)을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) : 6.77(넓은 s, 1H, NHTFA), 3.53(q, J=6.7과 2.7, 2H, -CH2NHTFA), 2.31 (td, J=6.7과 2.7, 2H, HCCCH2-), 2.04(t, J=2.7, 1H, HCCH2-), 과 1.83 q, J=6.7, 2H, -CH2CH2CH2-),
B. 5-(5-트리플루오로아세트아미도-1-티닐-)-2',3'-디데옥시우리딘(58)의 제조 실시예 IC에 나온 바와 같이 5-트릴플루오로아세트아미도-1-펜틴(59)에 5-요오도-2',3'-디데옥시우리딘을 4시간 커플링 시켰다. (이때 47은 실시예 2A에 나온 절차를 딸 제조된 것이다. 디클로로메탄 성분 중의 0-5%의 메탄올로 100g의 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 시켜서 엷은 흑색거품인 647.7㎖의 알키닐아미노누클레오시드 48을 얻었다.
이 물질은 약 16몰% 디메틸포름아미드의 존재를 제외하면 TLC와 NMR에 순수하다는 것을 알았다. 디메틸포름아미드의 양을 보정하면, 원하던 생성물의 수율을 80% 였다.
1H-NMR(DMSO-d6) : 11.52(s. 1H, H3), 9.47(비틀림 t, 1H, NHTFA), 5.90(q, 1H, H1'), 5.12(t, 1H, 5' OH), 4.04(m, 1H, H4'), 3.71 및 3.52(m, 2H, 5'H), 3.30(m, 2H, -CH2CH2CH2NHTFA), 2.40(t, 2H, 및 -CH2CH2CH2NHTFA), 2.23, 2.00 및 1.85(m, 4H, H2', H3') 및 1.73(q, 2H, -CH2CH2CH2NHTFA).
[실시예 11]
5-(12-트리플루오로아세트아미도-1-도데시닐)-2', 3'-디데옥시우리딘(60)의 제조(화합물 60은 Het는 우라실(h), R1은 -(CH2)10-인 구조 5의 한 예이다).
A. 11-도데신-1-올(61)의 제조.
내부 온도를 5-10℃로 유지시키기 위해 건조 디에틸설폭사이드(100㎖)내의 미리 냉각시킨 리듐 아세틸리드 에틸렌디아민 착체(23.94g, 0.260mole, 1.3당량, Aldrich 90%)의 현탁액에 140분에 걸쳐 1-브로모-10-테트라하이드로피라닐옥시데칸(64.26g, 0.2mole, Lancaster" 97+%")을 적가하였다. 첨가를 다 끝내고 냉욕을 제거하고 반응 혼합물을 45시간 동안 휘저어 섞었다. 물(20㎖)을 반응 혼합물에 적가하였다. 10분 동안 휘저어 섞은 후, 반응 혼합물을 물(300㎖)에 부었다. 이 용액은 펜탄(2×300㎖) 및 에테르(2×300㎖) 및 에테르(2×300㎖)와 함께 연속적으로 추출된 것이다. 각 유기물층은 각각 약 20㎖의 물로 세척시켰고 세척물은 재추출을 위해 주요수층과 혼합시켰다. 이 혼합 유기층을 황산마그네슘상에서 건조시키고, 증발건조시켜서 51.38g(96%)의 순수한 12-(테트라 하이드로피라닐옥시)-1-도데신을 오일상태로 얻었다.
강산이온 교환수지(AG-50W-X8, 50g, 5.1meg/g, Bio Rad)를 클로로포름(260㎖)과 메탄올(260㎖)로된 혼합물내에 있는 상기의 조생성물 용액(49.96g)에 가했다. 현탁액을 4,5시간 동안 가열환류시켰고 이어 냉가시켰다. 반응 혼합물을 여과시키고 여과물은 농축시켰다. 핵산내에 있는 10%, 20% 및 30%의 초산 에틸로 500g의 실리카겔 상에서 잔사의 크로마토그래피를 시켜보았더니 포스포몰리브딕산에 의한 검출과 TLC의 반점에 의해 95% 이상의 오일을 31g 얻을 수 있었다. 이 물질은 20㎝ Vigreux 컬럼을 통해 증류시켜서 먼저 0.78g이 나온 후에 17.91g의 11-도데신-1-올(61)을 얻을 수 있는데 이는 방지 해둔 백색 고형물이 고형화되어 융점이 104-108℃(1.4토르)인 무색 오일의 두꺼운 층을 이룬 것이다.
이 물질은 GC에 나타난 한개의 피크중에 98%를 차지하였다.
1H-NMR(CDCl3) 증류된 크로마토그래프 처리한 생성물 : 3.64(t, 2H, -CH2OH, 3.37 및 3.33(m, 0.2H, 불순물), 2.17(td, 2H, HCCCH2-), 1.92(t, 1H, HCCCH2-), 및 1.2-1.6(m, 17H, (CH2)8, OH), 1R(얇은 용해층); 3392(O-H), 3311, 2930 및 2854 (C-H), 2160(아세틸렌), 1466, 1432, 1394, 1371, 1352, 1328, 1303, 1103, 및 1001.
B. 12-요오드-1- 도데신(62)의 제조
요오드(43.16g 170mmol, 2당량)를 건조 톨루엔(425㎖, 분자체 상에 저장)내의 증류 알콜 61(15.50g, 85mmol), 이미다졸(17.36g, 225mmol, 3.0당량), 그리고 트리페닐포스핀(66.90g, 255mmol, 3당량)의 현탁액에 가했다. 이 반응 혼합물을 25분간 힘껏 휘저어 섞어서 환류가열시켰고, 이때 오일성분의 검은 침전과 함께 황색 용액이 되었다. 25℃로 냉각한 후, 포화된 중탄산 나트륨액(200㎖) 및 요오드(23.73g, 93.5mmol, 1.1당량)를 가했고, 반응물을 1시간 동안 세게 휘저어 섞었다. 포화된 아황산나트륨 수용액(40㎖)을 첨가시키고, 보라색을 소광시켰다. 반응 혼합물을 2가지 층으로 분리시켰고 유기층은 소금물로 세척했다. 이 유기층은 황산마그네슘상에서 건조시켰고 농축시켰다. 잔사는 50㎖의 디클로로메탄에 녹였고 200㎖의 에테르를 첨가했다. 30분간 방치한 후에, 생겨난 침전물(트리페닐포스포린옥사이드)을 여과에 의해 제거하고 100㎖의 에테르로 세척했다. 좀더 방치시키면 혼합모액과 에테르 세척물은 전과같이 제거되었던 제2의 결정속축물로 침전되었다. 혼합모액과 에테르 세척물을 농축시키고 가온한 200㎖의 톨루엔에 용해시켰다. 이 용액을 500g의 실리카 겔상에 장치시키고 3L의 톨루엔으로 용출시켰더니 13.55g(55%)의 요오드화물 62가 엷은 황색 유동액으로써 얻어졌다. 이 물질은 GC한개의 peak에서 95%를 차지했다.
1H-NMR(CDCl3) ; 3.20(t, 2H, -CH2I), 2.17(td, 2H, HCCCH2-, 1.94(t, 1H, HCCCH2-), 1.82, 1.51 및 1.20-1.42(m, 16H, (CH2)8).
C. 12-플루오로아세트아미도-1-도데신(63)의 제조.
수화나트륨(오일상 60% 분산액, lfa)을 펜탄으로 신속정확하게 행한 세척과 진공건조에 의해 오일을 제거하였다. 트리플루오로아세트아미드(22.61g, 200mmol, 5당량)가 50분간 10회에 걸쳐 건조 디메틸포름아미드(90㎖, ldricch)내에 있는 오일을 제거한 수화나트륨(3.84g, 160mmol, 4당량)의 현탁액에 가해졌다. 이때 반응혼합물의 가온이 조기의 발견이 되면 냉수욕을 첨가하고 부가물의 전사는 약 10℃ 내부에서 실행되었다. 이 냉수욕을 제거하고 반응 혼합물을 수소의 용출이 멈출때 까지 히저어 주었다. 15분간 첨가하면서 히저어 섞은 후에 10㎖의 건조 디메틸포름아미드내의 요오드화물 63 용액(11.69g, 40.0mmol)을 10분에 걸쳐 반응 혼합물에 적가했다. 25℃에서 4시간 동안 휘저은 후에, 반응 혼합물이 포함된 염화암모늄 수용액(200㎖)과 물(200㎖) 그리고 펜탄(200㎖)등을 휘저은 혼합물에 재빨리 가해졌다. 반응 용기를 물(50㎖)과 포화된 염화암모늄 용액(50㎖) 및 펜탄(200㎖)으로된 혼합물로 세척시켰다. 혼합 용액은 두 층으로 분리되었고 수층은 펜탄(2×200㎖)으로 추출되었다. 혼합 유기층은 황산 마그네슘상에서 건조시키고, 증발건조시켰더니, 방치시엔 납 같은 고형물로 고형화되어 오일인 트리플루오로아세트아미드(10.42g, 94%)가 생겼다. 이 물질은 100㎖의 끓은 헥산으로 부터 천천히 냉각시켜 재결정화해서 융점이 46-47℃인 엷은 황색의 침상 결정을 트리플루오로아세트아미드 63(8.145g, 73%)을 얻었다.
1H-NMR(CDCl3) : 6.27(넓은 2, 1H, NHTFA), 3.34(명백한 q, 2H, -CH2NHTFA), 2.18(td, 2H, HCCCH2-), 1.94(t, 1H, HCCCH2-), 1.20-1.65(m, 16H, (CH2)8), IR 얇은 용해중 : 3312, 3298, 2932 및 2857 (C-H 및 N-H), 2117(아세틸렌), 1706(C=O), 1675, 1563, 1460, 1448, 1208, 1182, 1166, 722 및 634.
D. 5-(12-트리플루오로아세트아미도-1-도데시닐)-2', 3'-디데옥시우리딘(60)의 제조
보호된 알키닐아민 63을 실시예 IC에 기술한 일반적인 절차에 따라 24시간 동안 5-요오드-2', 3'-디데옥시우리딘과 함께 커플링시켰다. 이때 47(676㎎; 2,00mmol)은 실시예 2A에 기술된 바와 같이 준비했다.
디클로로메탄 구배내의 0-5% 메탄올로 용출하는 100g 시리카겔 상에서 크로마토그래피를 시켜서 암적색 거품을 일으켰다. 40% 물이 있는 메탄올을 사용한 역상컬럼(100g, 40 마이크로미터 실리카겔상의 옥타데실리란; Baker)의 크로마토그래피에 의해 이 적색 불순물을 제거되었다. 적당한 분별물을 혼합되고 농축된 다음 무수에탄올로 두번 동시 증발되었고 순수오일인 알키닐라미노 누클레오시드 60을 731㎎ 얻었다. 이 물질은 잔여에탄올(25mile, 보정치 73%)만 제외하면 TLC와 NMR에 의해 순수하다는 것을 알 수 있었다.
1H-NMR(DMSO-d6) : 11.49(넓은 s, 1H, H3), 9.38(비틀린 t, 1H, NHTFA), 8.15(s, 1H, H6), 5.90(dd, 1H, H1'), 5.12(비틀린 5t, 1H, 5' OH), 4.35(t, 0.25H, CH3CH2OH), 4.03(m, 1H, H4'), 3.72 및 3.52(m, 2H, H5'), 3.43(m, 05H, CH3CH2OH), 3.16(q, 2H, -CH2NHTFA), 2.34(t, 2H, 프로파길릭 H), 2.16, 2.01, 및 1.86(m, 4H, H2' 및 H3'), 1.65-1.15(m, 16H, (CH2)8), 및 1.06(t, 0.75, CH3CH2OH).
[실시예 12]
5-(5-아미노-1-펜티닐)-2', 3'-디데옥시우리린(64)의 제조 (화합물 64은 Het이 우라실(h)이고, R1은 (CH2)3이며 R2, R3, R5, R6, R7및 R8는 수소 인 알키닐아미노누클레오티드의 한 예이다)
A. 5- 아미노-1-펜틴(65)의 제조
암모니아(340g, 20mole)를 요오드화나트륨(7.49g, 49g, 0.05mole, 0.25당량)과 5-클로로펜틴(20.51g, 0.2mmole)을 포함하고 있는 용기속에서 증류시켰다. 이 용기는 완전 밀폐시키고 소독기내에서 12시간동안 100℃로 가열했다. 암모니아는 증발시키고 잔사는 물(100㎖), 에테르(100㎖), 수산화나트륨(40g, 1.0mole, 5당량)으로 구성된 두가지 상의 혼합물로 휘저어 섞었다. 그 결과로 생긴 혼합물은 여과시켰고 두 층으로 분리되게 하였다. 유기층은 황산마그네슘상에서 건조시켰고, 20㎖ Vigreux 컬럼을 통해 증류시켰다. 4가지 분별증류물(12.46g 비점 95-127℃, 대기압)은 GC에 의해 생성물의 대부분을 포함하고 있다고 측정되었다. 이 분별증류물을 혼합시켜 조심스럽게 회전 밴드 컬럼을 통하여 비점이 125.5-126℃이고 무색 유동액으로된 6.55g(39%)의 5-아미노-1-펜틴(65)를 얻었다. 이 물질은 GC에 나타난 한개의 피크에서 99%를 차지했다.
1H-NMR(CDCl3) : 2.81(t, J=7.5, 2H, -CH2-NH2), 2.27(td, J=7.5 및 2.5 2, HCCCH2-), 1.96(t, J=2.5, 1H, HCCCH2-), 1.66(q, J=7.5, 2H, -CH2CH2CH2-), 및 1.07(넓은 s, 2H, NH2).
B. 보호되지 않은 알키닐아민을 요오드누쿨레오시드와 커플링하는 일반적인 방법.
5-(5-아미노-1-펜틴)-2',3'-디데옥시우리딘 (64)의 제조 방법.
수분을 뺀 35㎖의 둥근 플라스크에 5-요오드-2',3'-디데옥시우리우딘을 채우고 이어 아르곤으로 분출시켰다. (이때 47(676.2㎎, 2mmol)은 실시예 2A에 나타난 바와 같이 준비했다) 건조 디메틸포름아미드(10㎖, Aldrich), 건조 트리에틸아민(0.56㎖, 4.0mmol, 2.0당량, 선별하여 저장함), 5- 아미노-1-펜틴(0.59㎖, 6.03mmol, 3.0 당량)그리고 테트라키스(트리페닐포스핀)-팔라듐(O)(231㎎, 0.200mmol, 0.1량, 건조용기내의 유리병속에 넣어 검량) 첨가되었다. 이렇게해서 생긴 현탁액을 45분간 히저어 섞었으나 팔라듐 촉매재는 최소한 부분적으로 용해되지 않고 남아 있었다. 요오드화 구리(190.4㎖, 1mmol, 0.5당량, Aldrich Gold Label)를 첨가했다. 15분간 휘저어 섞은 후에는, 균일한 청색 용액이 형성되었고 약 150분 후에는 용액이 탁해졌다. 200분 후에는 출발물질인 요오드화물 47의 전부가 소비되었다는 것을 TLC에 의해서 알 수 있었다. 4시간 후에, 반응 혼합물을 회전증발기로 45℃(2토르)에서 약 10분간 농축되었다. 잔사는 곧장 100g의 실리카겔컬럼으로 흡수되었고 디클로로메탄, 메탄올 및 농축시킨 수산화암모늄으로 된 혼합물(400㎖, 각각의 비율이 90 : 9 : 1, 85 : 13: 2, 75 : 20 : 5, 65 : 30 : 5 및 50 : 45 : 5)로 용출시켰다.
TLC에 따라 주로 극성 생성물을 포함하는 분별증류물을 혼합시키고 에탄올로 두번 동시증발시킨다음 밤새 진공건조하여 황색 고형물인 알키닐 아미노 누클레오시드 64(395.9g, 67%)를 얻었다.
이 물질은 진공 건조에 의해 제거되지 않은 에탄올(33몰%)만 제외하면 TLC 및 NMR에 의해 순수한 것임을 알 수 있었다. 상기 물질(64)의 수율은, 에탄올의 양을 보정했을 때, 64%였다.
1H-NMR(DMSO-d8) : 8.33(s, 1H, H6), 5.90(dd, J=6.6 및 3.0, 1H, H1'), 4.05(m, 1H, H4'), 3.73(dd, J=12.1 및 2.8, 1H, H5'a) 3.53(dd, J=12.1 및 3.1, 1H, H5'b), 2.80(넓은 s, 2H, -CH2H2), 2.45(t, J=7.0, 2H, 프로파르길릭 H), 2.28, 2.02 및 1.86(m, 4H, H2', H3'), 그리고 1.70(q, J=7.0Hz, 2H, -CH2CH2CH2-).
이 NMR 측정치는 상기에 서술한 것과 똑같은 방법으로 준비된 64의 또다른 자료정리로부터 알 수 있었다. 두 물질의 NMR 샘플에 있는 교환가능한 수소들(H3, 5' OH 및 -NH2)에 관한 표시는 기본치에서 겨우 용해된 넓고 단일한 표시 (넓이 2ppm이상)와 겹쳐졌다.
[실시예 13]
5-(3-아미노-1-프로피닐)-2', 3'-디데옥시우리딘(66)의 제조
(화합물 66은 Het가 우라실(h), R1이 CH2거리고 R2,R3,R5,R6,R7및 R8가 수소인 알키닐아미노누클레오티드(I)이 한 예이다.
5-요오드2', 3'-디데옥시우리딘(47g, 2,000mmol)올5- 아미노-1-펜틴 대신 프로파르길아민을 사용했다는 것을 제외하고, 실시예 12B에 나타난 절차에 따라 프로파르길아민(6mmol, Aldrich)과 3시간 동안 커플링 했다. 상기에 기술했던대로 크로마토그래피는 TLC에 의해 분석했을 때 단일 반점을 나타내는 황색 고형물로 불순물이 섞인 794.5㎎의 알키닐아미노 뉴졸레오시드 66g을 반송하였다. NMR과 반응물의 질량 평형은 이물질이 에탄올과 무기성 불수눌질에 의해 오염되었다는 가능성을 알려주었다.
1H-NMR(DMSO-d6) : 11.70(넓은 s, 1H, H3), 8.40(s, 1H, H66), 8.25(넓은 s, 2H, NH2), 5.89(dd, J=6.6 및 3.0 1H, H1'), 5.13(t, J=5.0, 1H, 5' OH), 4.07(m, 1H, H4'), 3.96(s. 2H, -CH2NH2), 3.71 및 3.56(m, 2H, H5'), 2.30, 2.04 및 1.85(m, 4H, H2' 및 H3')그리고, 미지의 불순물과 에탄올에 대한 표시, 상기의 NMR 자료는 0.2 당량의 요오드화물 구리가 사용되었고 그 반응이 완결되지 않은 것을 제외하고는 상기와 같이 실행된 다른 66의 침전으로부터 얻은 것이다.
[실시예 14]
1-(2-하이드로시에톡시메틸)-5-(3-아미노-1-프로피닐)시토신 트리포스페이트(67)의 제조
(화합물 67은 R1이 -CH2-이고 R2및 R3가 수소, Het가 시토신 (i)R4는 (g) 그리고 R5는 P3O9H3-인 알키닐 아미노 뉴클레오티드(I)의 한 예이다).
A. 1-(2-하이드록시에톡시메틸)-5-요오드시토신(68)의 제조.
1-(2-하이드록시에톡시메틸)시토신(1.85g, 10.0mmol)과 초산 제이수든(3.35g, 10.5mmol)의 혼합물을 메탄올 50㎖과 디클로로메탄 100㎖내에서 환류시켰다. 요오드(3.05g, 12.0mmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 1시간동안 휘저었다. AG3-X4 수지(38meq)의 자유염기 형태가 첨가되고, 용액은 황화수소로 15분간 기포를 내게했다. 고형물은 여과에 의해 제거되고 여과물은 실리카겔 컬럼(10g)위에서 스트립핑했고, 실리카는 실리카겔 컬럼(4×25㎝)에 하중되어 디클로로메탄내의 5%, 10% 및 2% 메탄올로 용출되었다. 다음에 진공건조 후에 증발을 실행했으며 1.73g(56%)의 무색 고형물을 얻었다. 95% 에탄올로부터 재결화시켰더니 용접이 172℃이고 분석적으로도 순수한 물질이 얻어졌다. CHNOI의 계산치 : C 27.03%, H 3.24%, N 13.51% 측정치 : C 27.08%, H 3.41%, N 13.51%, UV(메탄올) : 292.5(5,300)에서 최대.
1H-NMR(DMSO-d6) : 3.481(M, 4H), 4.659(t, J=5, 1H), 5.070(s, 2H, 6.665 (넓은 s, 1H), 7.869(넓은 s, 1H), 그리고 8.107(s, 1H).
B. 1-(2-하이드록시에톡시메틸)-5-(3-트리플루오로아세트아미드-1-프로피닐)시토신(69)의 제법.
요오드화물 68(311㎎, 1.00mmol)을 실시예 IC에 기술된 일반적 방법에 따라 N-프로파르길 트리플루오로아세트아미드(43)와 커플링했다. 디클로로메탄내에 있는 5%, 10% 및 20% 메탄올로 실리카겔 상 (3×20m)에서, 섬광 크로마토그래피를 시켰더니 엷은 황색 거품(77.4mg, 23%)인 알키닐아미노 뉴클레오티드 69를 얻었다.
1H-NMR(DMSO-d6) : 3.472 (넓은 s, 4.276(d, J=5.0, 2H), 4.653(넓은 t, J=4.5, 1H), 5.091(s, 2H), 6.925(넓은 s. 1H), 8.037(s, 1H) 및 9.964(넓은 s, 1H).
C. 1-(2-하이드록시에톡시메틸)-5-(13-아미노-1-프로피닐)시토신(67).
알키닐아미노 뉴클레오시드 69(0.167mmol)의 당부위에 있는 수산기가 트리포스페이트로 전환되었고 트리플루오로아세틸기는 실시예 1E에 주어진 일반적 방법에 따라 제거되었다. 옥시염하인의 2차 부분 표본을 첨가한 후에 75분간 인산화를 진행시켰다. 생성의 흡수 계수와 출발물질의 그것이 동일하다면 트리포스페이트 67의 수율은 UV 흡수(291nm)을 기준으로 했을 때 21%였다.
[실시예 15]
N-하이드록시 석신아미드 에스테르 2a의 제조
(R9및 R10가 수소인 알키닐아미노-뉴클레오티드에 505nm의 형광염료를 부가할 때 넣은 바람직한 시약)
A. 0-카르복시에틸리덴-3,6-디하디르곳기-9-크산텐(SF-505) 레조르시놀(33.0g 0.3mol)과 무수 석신산(30.0g, 0.3mol)을 둥근 플라스크에 넣고 질소로 세척했다. 황산메틸(150㎖)을 첨가하고 그 용액을 질소압하에서 2시간 동안 65℃에서 휘저어 섞었다. 반응 혼합물을 냉각수(1L)에 동시에 pH 2.5+0.5를 유지시키기 위해 50%의 수산화나트륨을 빠르게 휘저어 적가했다. 입자상의 침전을 나타난 생성을 여과해 의해 수거되고 물(3×100㎖)로 세척한 다음 초산(3×100㎖)으로도 세척했다. 생성물을 공기 건조시키고 이어 110℃에서 18시간 동안 진공건조(진공오븐)을 하여 암적색 가루(37.7g, 88%)를 얻었다. 분석 샘플은 뜨거운 0.3NHCl(25㎖)에서 1.0g의 생성물을 용해시켜서 준비했다. 냉각중에 형성된 침전물은 여과에 의해 제거시키고 폐기되었다. 희석 수산화 나트륨액을 첨가시켜서 pH를 1.25로 증가시켰다. 그 결과로 생성된 침전물을 여과에 의해 수거시키고, 물로 세척하고 공기건조에 이어 36시간 동안 140℃에서 P2O5를 통해 진공건조시켰다.
분석치 : 계산치 [C(16) H(12) O(5)] C 67.60, H 4.26, 측정치 : C 67.37, H 4.34, 0.52%(K-F), NMR(DMSO-d6) : (대부분이 스피로락톤형) 2.690(t, J=8, hz, 2H); 3.070(t, J=8.6 hz, 2H), 6.530(d, J=1.8 hz, 2H) ; 6.676(dd, J=8.7, 1.8 hz, 2H), 7.432(d, J=8.7, 1.8hz, 2H), 7.432(d, J=8.7hz, 2H), 그리고 9.964(s, 2H) 가시광선 흡수(pH 8.2 ; 50mM aq Tris/Hcl) : 최대가 486nm(72,600).
B. 9-(2-카르복시에틸)-3,6-디아세톡시-9-에톡시-9H-크산텐(Ac2EtSF-505) SF-505(29.3g 103mmol)을 무수 빙초산(500㎖)에 가하고 이어 100㎖의 피리딘을 가했다. 혼합물을 20분 동안 얼음 내에서 휘젓고 이어 20분간 걸쳐 빠르게 휘저어 섞이는 냉각수(7L)를 가했다. 30분 정도 더 휘저어 섞은 후에, 중간 생성물을 여과시키고 물(4L)속에서 재현탁시켰으며 또다시 30분 동안 휘저었다. 고형물은 여과에 의해 수거되었고 무수 에탄올(1L)내에 용해시켰고, 45분 동안 환류시켰다. 용액을 회전 증발기에서 결정화시킬 수 있게 200㎖로 농축시켰다. 생성물은 여과에 의해 수거되고, 공기 건조에 이어 진공 건조를 해서 옅은 오렌지색 미결정(21.9g, 55%)을 얻었다. 염화 메틸렌/사이클헥산으로부터 재결정화해서 무색의 미결정을 얻었다. 융점 : 142-143℃, 분석치 : 계산치[C(22) H(22) O(8)] C 66.76 H 5.35, 측정치 : C 63.58 H 5.39, NMR(DMSO-d6) : δ 1.035(t, J=6.9 hz, 3H), 1.667(m, 2H), 2.232(m, 2H), 2,294(s, 6H), s.888(q, J=6 hz, 2H).
C. 9-(2-(N-석신이미딜옥시카르보닐)-에틸)-3,6-아세톡시-9-에톡시-9H-크산텐(Ac2EtSF-505)의 제조
Ac2EtSF-505(10.4g, 25.1mmol)을 염화메틸렌(300㎖)과 섞고 1-(3-디메틸 아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염화염(9.70g, 50.6mmol) 및 4.32g의 N-하이드록시석신아미드(37.5mmol)를 첨가하였다. 혼합물 1시간 동안 휘젓고 이어 5×50㎖의 물로 세척했다. 혼합 수성층은 염화메틸렌(50㎖)으로 역추출시켰고 혼합 유기성층은 황산나트륨상에서 건조시켜 스트립핑했다. 75㎖의 에탄올로 연화시키고 이어 여과와 공기건조를 시켰더니 연한 황색 고형물(c.10g)의 조 생성물을 얻었다. 이 물질은 염화메틸렌에 용해되었고 사이클로헥산(50㎖)에 첨가되었다. 목탄 1ts을 첨가하고, 혼합물을 여과시켰으며, 생성물은 사이클로헥산(100㎖)를 분할첨가하여 만들었다. 여과에 의해 수거하고, 공기건조 및 진공 건조하여 무색 결정(6.94g, 54%)을 얻었다. 에탄올로부터의 2차 결정화는 분석적 샘플에서 얻었다. 융점 : 162-3℃, 분석치 : 계산치 [C(26) H(25) N(1) O(10)] C61.05, H 4.93, N 2.74, 측정치 : C 60.78, H 5.01, N 2.65, NMR(DMSO-d6) : δ1.056(t, J=7.0hz, 3H), 2.4-2.1(m, 4H), 2.293(s. 6H), 2.757(s, 4H), 2.922(q, J=7.0hz, 2H), 7.069(m, 4H), 그리고 7.617 (p d, J=9.1hz, 2H).
D. 9-(2-(N-메틸-N-(벤질옥시카르보닐메틸)카르복사미도)에틸)-3.6-디아세톡시-9-에톡시-9H-크산텐(Ac2EtSF-505-Sar-ORn) 염화메틸렌(50㎖) 내의 사르코신 벤질 에스테르(1.13g, 6.31mmol)용액에 Ac2EtsF-505-NHS(2.58g, 5.05mmol)과 5% 중탄산나트륨 수용액(30㎖)을 가했다. 이 두상의 혼합물을 20시간 동안 재빠르게 휘저었다. 층이 분리되고 유기성층을 물(3×15㎖)로 세척시키고 황산나트륨 상에서 건조시킨 후 25㎖로 농축시켰다.
용액을 사이클로헥산으로 150㎖가지 희석시켰고 목탄처리 후 질소기류하에 75㎖로 감소시켜서 생성물 침전을 얻었다. 상동액은 제거시키고 잔사는 염화메틸렌과 동시에 증발시켜 무색 기포(1.70g, 58%)를 얻었다. 강력 진공 건조를 분석적인 샘플을 얻었다. 분석치 : 계산치 [ C(32) H(33) N(1) O(9)] C 66.77, H 5.78, K 2.43, 측정치 C 66.66, H 5.89, N 2.2 NMR(DMSO-d6) : (아미드 결합 회전이성체의 5 : 2 혼합비를 보여줌)δ (최대와 최소치) 1.040 및 1.018 (t, J=6.7 hz, 3H), 1.789 및 1.670(m, 2H), 2.211(m, 2H), 2.290 및 2.276(s, 6H), 2.713 및 2.695 (s, 3H), 2.893(q, J=6.7 hz, 2H), 3.963(s, 2H), 5.075 및 5.039(s, 2H), 7.044(m, 4H), 7.324 및 7.573 및 7.516(pd. J=9.2 hz, 2H).
*사르코신 벤질 에스테르= p=토실레이트염(Adanis Chemical Co.)은 염화메틸렌 속에 집어넣고 5%의 중탄산나륨액을 번복 세척했으며, 이어 물세척후 황산나트륨상에서 건조시키고 스프립핑했다.
E. 9-(2-(N-메틸-N-(N'-석신이미딜옥시카로보닐메틸)카로복사이드)에틸)-3, 6-디아세톡시-9-에톡시-9H-크산텐(AcZEtSF-505-Sar-NHS, 구조 2a)의 제조
무수에탄올(㎖)내의 AcZEtSF-505-Sar-OBn (1.55g, 2.69mmol)에 10%탄소상 팔라듐(0.15g)을 가하였다. 혼합물을 플라스크내 수소 기구압하에서 30분 동안 휘저어 섞었다. 촉매제는 여과에 비해 제거되었고 에탄올은 스트립핑하여 시럽형의 잔사를 얻었다. 이 잔사는 염화메틸렌(85㎖)에 용해시키고 N-히드록시석신이미드(0.495g, 30mmol)와 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸 카르보디이미드 히드로클로라이드(1.12g, 5.84mmol를 첨가했다. (4×25㎖) 이용액을 25㎖로 농축시켰고, 시클로헥산으로 175㎖까지 희석시켰으며, 목탄처리를 하고 질소 기류하에서 부피를 75㎖로 감소시켰다. 고형생성물은 여과에 의해 수거되었고, 공기건조와 진공건조를 해서 무색분말(0.92g, 62%)을 얻었다. 40℃에서 강력진공 건조 후에 염화메틸렌으로 동시증발시켜서 미량의 시클로헥산이 제거되고, 무정형 고형물로 분석 샘플을 얻을 수 있었다.
분석치 : 계산치 [C(29)H(30)N(2)O(11)] C 59.79, H 5.19, N 4.81, 측정치 C 59.37, H 4.62, N 4.62, 0.93% 물(K-F). NMR(DMSO-d6) : (아미드 결합 회전이성체의 4 : 1 혼합비를 보여줌) δ(최대 및 최소) 1.034(t, J=6.9 hz, 3H), 1.827 및 1.935(m, 2H), 2.223(m, 2H), 2.289(s, 6H), 2.758(s, 4H), 2.779 및 2.824(s, 3H), 2.888(q, J=6.8 hz, 2H), 4.333 및 4.473(s, 2H), 7.043(m, 4H), 및 7.578(per d, J=9.1 hz, 2H).
[실시예 16]
N-하드록시석신이미드 에스테르 2b(512nm)의 형광 염료를 R9가 H이고 R10이 CH3인 알키닐아미노-누클레오티드에다 부착시키기 위한 바람직한 시약의 제조.
A. 4-메틸 레조르시놀의 제조
가스 입구와 기포관이 장치된 둥근바닥 플라스크속에서 2,4-디히드록시벤즈알데히드(33.97gm, 0.246 몰)(톨루엔으로 부터 재결정화)를 분광석분석용 2-프로판올(3ℓ)속에 용해시켰다. 10% 탄소 상(上) 팔라늄 (1.35gm)를 첨가한 후 인산(3㎖)을 첨가하고 이 혼합물에 질소를 끼얹어 주었다. 질소흐름을 수소로 바꾸고, 얼음 냉각과 아울러 혼합물을 휘저어 섞었다. 3시간후에 수소의 흡수가 완료되었고 촉매는 여과에 의해 제거하였다. 여과물을 200㎖로 스트리핑시키고, 초산에틸 2000㎖을 첨가했다. 이 용액을 4×200㎖의 물로 세척하고 수추출물들을 합하여 초산에틸로 역추출하였다. 이들 유기 추출물을 물로 세척하고, 유기층들을 합하여 황산나트륨상에서 건조시키고 스트리핑시켜, 생성물을 무색의 결정성 고체 (29.29gm, 98%)로 얻었다. M.P : 106℃(Lit 106-107℃ [J. C. Bell, W. Bridge, 및 A. Robertson, J. Chem. Soc., 1542-45(1937)]. NMR(DMSO-d6) : 1.961(s, Me), 6.076(dd, H-6, J[5,6]=8hz, J[2.6]=2hz, 6.231(d, H-2), 6.760(d, H-5). 8.867(s, OH) 및 9.008(s, OH).
B. 9-카르복시에틸리덴-3,6-디히드록시-2,7-디메틸-9H-크산텐(SF-512)의 제조
4-메틸레조르시놀(25.8g, 0.208몰)과 무수석신산(20.8g, 0.208g)을 둥근바닥 플라스크속에 집어넣고, 플라스크에다 질소를 끼얹었다. 메타설폰산(150㎖)을 첨가하고, 용액을 질소하에 2시간동안 65℃로 가열했다. 이 용액을 신속하게 휘저어 섞은 얼음처럼 차가운 물 1ℓ속에 적가하면서 pH를 2.25 +/-0.25로 유지시키기 위해 50% 수성 수산화나트륨을 동시에 첨가했다. 생성물을 여과에 의해 수거하고 물(3X)과 아세톤(2X)으로 세척했다. 고체를 공기 건조시킨 후 110℃에 진공 건조를 시켜 붉은 벽돌색 분말(24.1g, 74%)을 얻었다.
초산에틸이 디메틸 설폭시드내의 생성물 용액속으로 서서히 확산되도록 함으로써 정제하였다. 침전물을 여과에 의해 수거하고 공기건조시킨 후 진공건조시켰다. NMR(DMSO-d6) : (각각 1몰씩의 물과 디메틸 설폭시드와 더불어 순수한 델타 형식를 나타냄), δ 2.124(s. 6H), 3.421(d, J=7.2hz, 2H), 5.769(t, J=7.2 hz, 1H),; 6.512(s. 1H), 6.573(s. 1H); 7.295(s. 2H), 9.681(s, 1H), 9.825(s, 1H), 및 12.346(bs, 1H), Vis. abs. (pH 8.2 aq Tris) ; mex 493. 5nm.
C. 9-카르복시에틸-3,6-디아세톡시-2,7-디메틸-9-에톡시-9H-크산텐 (Ac2EtSF-512)의 제조
SF-512 (20.0g, 64.0mmol)의 샘플을 무수초산(350㎖)속에 첨가한 후 피리딘(80㎖)을 첨가했다. 이것을 1시간 동안 휘저어 섞은 후 여과하여 미반응 염료의 흔적을 제거했다. 여과물을 신속하게 휘저어 섞은 물 3.5ℓ 속에 쏟아부었다. 고체중간체를 여과에 의해 수거하고 2ℓ의 차가운 물속에 재현탁시키고 15분간 휘저어 섞은 후 다시 수거하고 공기 건조시켜서 스피락톤 중간체(20.8g)을 얻었다. 이것을 무수 에탄올(600㎖)속에 용해시키고 45분간 환류시켰다. 용액을 목탄처리하고 300㎖로 농축시켰다. 생성물을 여과에 의해 수거하고 차가운 에탄올(2×50㎖)로 헹구고 공기 건조시킨 후 진공 건조시켜서 무색의 미소 결정(14.9g, 53%)을 얻었다. M. p. : 143℃, 분석 : 계산치 [C(24)H(26)O(8)] C 65.15, H 5.92, 실측치 : C 65.31, H 5.97, NMR(DMSO-d6) : δ1.027(t, J=6.9 hz, 3H), 1.628(m, 2H), 2.136(s, 6H), 2.207(m, 2H), 2,303(s, 6H), 2.884(q, 6.9 hz, 2H), 6.939(s, 2H), 및 7.417(s, 2H).
D. 9-(2-(N-석신이디딜옥시카르보닐)에틸)-3,6-디아세톡시-2,7-디메틸-9-에톡시-9H-크산텐(Ac2EtSF-512-NHS)의 제조
염화메틸렌(175㎎)내의 Ac2EtSF-512 (9.42g, 21.3mmol)용액속에다 N-히드록시석신아미드(3.62g, 31.5mmol)을 첨가후 즉시 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(8.05g, 42.0mmol)를 첨가했다. 이 용액을 실온에서 2시간 동안 휘저어 섞었다. 이 혼합물을 물(4×100㎖)로 세척하고 수성 세척액들을 염화메틸렌(2×50㎖)으로 역추출하였다. 유기층들을 합하여 황산나트륨상에서 건조시키고 스트리핑시켜 오일로 만들었다. 무수에탄올을 첨가하고 스트래칭에 의해 결정화를 유도했다. 생성물을 여과에 의해 수거하고, 공기건조시킨 후 엷은 오렌지색의 미소결정(9.80g, 85%)을 얻었다.
1g을 염화메틸렌(10㎖)속에 용해시키고 시클로헥산(40㎖)을 첨가함으로써 분석 샘플을 제조했다. 목탄처리에 뒤이어 냉각 및 스크래칭을 하다 결정화를 유도함으로써 무색의 결정성 고체를 얻었다.
M.P. : 159℃, 분석 : 계산치, [C(28)H(29) N(1)O(10)] C 62.63, H 5.42, N 2.60, 실측치 : C 62.06, H 5.71, N 2.39, NMR(DMSO-d6) : δ1.053(t, J=6.9 hz, 3H), 2.149(s, 6H), 2.304(s, 6H), 2.1-2.4(m, 4H), 2.747(s, 4H), 2.920(q, J=6.9 hz, 2H), 6.975(s, 2H), 및 7.464(s. 2H).
E. 9-(2-N-메틸-N-(벤질옥시카르보닐메틸)카르복스아미도)에틸)-3,6-디아세톡시-3,7-디메틸-9-에톡시-9H-크산텐 (Ac2EtSF-512-Sar-OBn)의 제조
염화메틸렌(25㎎)내 사르코신벤질에스테르(0.72g, 4.02mmol)의 용액에다 Ac2EtSF-512-NHS(1.73g, 3.21mmol)와 5% 중탄산나트륨 수용액(20㎖)을 첨가했다. 2상 혼합물을 20시간 동안 신속하게 휘저어 섞었다. 층들을 분리하고, 유기층을 3×15㎖의 물로 세척하고 황산나트륨상에서 건조시키고 10㎖로 농축시켰다. 시클로헥산을 사용하여 용액을 60㎖로 희석하고, 목탄 처리를 하고, 질소 스트림하에 부피를 25㎖로 감소시킴으로써 생성물이 침전되었다. 상동액을 경사분리하고 무색의 고체를 진공건조시켰다. (1.44g 74%).
염화메틸렌/시클로헥산으로부터 재결정화시킴과 아울러 목탄처리를 하여 분석샘플을 얻었다.
NMR(DMSO-d6) ; (아미드 결합 회전이성체의 5 : 2 혼합물을 보여줌)δ(1류 및 2류) 1.049 및 1.008(t, J=6.8 hz, 3H), 1.747 및 1.66(m, 2H), 2.144 및 2.115(s, 6H), 2.18(m, 2H), 2.314 및 2.303 (s, 6H)), 2.694(s, 3H), 2,907 및 2.844 (q, J=6.8 hz, 2H), 3.961(s, 2H), 6.075및 5.016(s, 2H), 6.960 및 6.917(s, 2H), 7.430 및 7.396(s, 2H), 및 7.30(m, 5H).
F. 9-(2-(N-메틸-N-(N'-석신이미딜시카르보닐메틸)카르복스아미도)에틸)-3,6-디아세톡시-9-에톡시-2,4,5,7-테트라메틸-9H-크산텐 (Ac2EtSF-512-Sar-NHS, 구조 2b)의 제조
무수 에탄올 (20ℓ)내의 Ac2EtSF-512-Sar-OBn(0.45g, 0.745 몰)속에 10 탄소상(上) 팔라듐(0.05g)을 첨가했다. 혼합물을 기구 수소압하에 30분간 휘저어 섞었다. 여과에 의해 촉매를 제거하고 에탄올을 스트리핑시켜 시럽형 잔사를 얻었다.
잔사를 염화메틸렌(25㎖)속에 용해시키고 N-히드록시석신아미드 (0.129g, 1.12mmol)와 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(0.92g, 1.52mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 30분간 휘저어 섞은 후 물(3×15㎖)로 세척하였다. 용액을 황산나트륨상에서 건조시키고, 10㎖ 로 농축시키고, 시클로헥산을 사용하여 40㎖로 희석하고, 목탄처리를 한 후, 질소스트림하에 20㎖까지 부피를 감소시킨다. 상등액을 경사분리시키고 잔사를 염화메틸렌에서 이차 침전시켜 무색의 분말(0.27g, 59%)을 얻었다.
분석 : 계산치.[C(31)H(34)N(2)O(11)]C 60.68, H 5.61, N 4.59. 실측치 : C 60.28, H 5.71, N 4.40, 1.08% 물(K-F), NMR(DMSO-d6) : (대략 이미드 결합에서 5 : 1의 회전이성체 혼합물을 나타낸다 (다량 및 소량) 1.043(t, J=7.0 hz, 3H), 1.793 및 1.933(m, 2H), 2.145 및 2.133(s, 6H), 2.198(m, 2H), 2.314(s, 6H), 2.740(s, 4H), 2.778 및 2.821(s, 3H), 2.900(q, J=7.0 hz, 2H), 4.334 및 4.469(s, 2H), 6.960 및 6.925(s, 2HO 및 7.441(s, 2H)
[실시예 17]
N-히드록시석신아미드 에스테르 2C의 제조 (519nm 형광 염료를 R9이 CH3이고 R10이 H인 알키닐 아미노-누클레오티드에 부착시키기 위한 바람직한 시약)
A. 9-(2-카르복시에틸렌)-3,6-디히드록시-4,5-디메틸-9H-크산텐 (SF-519)의 제조
2-메틸레스르시놀(37.2g, 0.300mol)과 무수 석신산(30.0g, 0.300mol)을 둥근바닥 플라스크속에 넣고 질소를 불어넣었다. 메탄설폰산(150㎖)을 가하고 용액을 질소 분위기하에서 54시간동안 65℃에서 휘저어 섞었다. 반응 혼합물을 재빨리 휘저어 섞은 얼음-냉수에 적가하면서 동시에 50% 수성 수산화나트륨을 가해 pH를 6.0+/-0.5로 유지시켰다. 미분고체를 원심분리로 모으고 헹굴때마다 재현탁시키고, 스피닝한 후 상등액을 쏟아 버림으로써 물로 헹궜다. (4×250㎖)조 생성물을 물(1ℓ)에 현탁시키고, 충분한 수성 수산화나트륨(50%)를 첨가해 pH를 10.2로 올렸다. 용액을 여과한 후 농 HCl을 첨가해 여액의 pH를 1.2로 만들었다. 생성물을 원심분리로 모으고, 상기와 같이 물(3×350㎖)과 아세톤(3×250㎖)로 헹궜다. 생성고체를 톨루엔으로 공비시키고, 여과로 모으고 110℃에서 진공건조시켜 불은-벽돌색 분말(24.66g, 53%)을 얻었다. 분석 : 계산치 C(18)H(16)O(5) C 69.22 H 5.16 0.80% 물(K-F). NMR(DMSO-d6) : (대부분이 델타형) : 2.164(s, 3H), 2.177(s, 3H), 3.376(d, J=7.1 hz, 2H), 5.749(t, J=7.2 hz, 1H), 6.642(d, J=8.8 hz, 1H), 6.672(d, J=8.8 hz, 1H), 7.216(d, J=8.5 hz, 1H), 7.227(d, J=8.5 hz, 1H), 9.602(bs, 1H) 및 9.758(bs, 1H), Vis. abs. (pH 8.2; 50mM aq Tris/HCl)max 500nm (69,800).
B. 9-(2-카르복시에틸)-3,6-디아세톡시-4,5-디메틸-9-에톡시-9H-크산텐(Ac2EtSF-512)의 제조
SF-519 (15.0g, 48.0mM)을 무수 아세트산(250㎖)에 첨가하고 고체를 분쇄시켰다. (음파 파쇄는 매우 불용성 SF-519를 분산시키는데 유용하다) 현탁액을 얼음 냉각시키고, 피리딘(50㎖)을 첨가하고, 혼합무를 20분동안 휘저어 섞었다. 용액을 여과시켜 천천히 정류 흐름으로 빠르게 휘저어 섞은 얼음으로 냉각된 물(4ℓ)에 첨가했다. 20분 동안 더 휘저어 섞은 후에, 중간 생성물을 여과시키고 물(3ℓ)안에 재현탁시키고 25분 동안 더 휘저어 섞었다. 고체를 여과에 의해 수집하고 공기 건조시켰다. 건조된 중간 산물을 무수 에탄올(600㎖)내에 용해시키고 1시간동안 환류시켰다. 용액을 회전식 증발기상에서 200㎎로 농축시켜 결정화시킨다. 생성물을 여과에 의해 수집하고 공기 건조시킨 다음, 진공 건조시켜 무색의 미소 결정(12.13g, 57%)을 얻었다.
분석적 샘플을 시클로헥산으로 메틸렌 클로라이드 용액으로 부터의 침전에 의해 제조된다. NMR(DMSO-d6) : 1.033(t, J=6.9 hz, 3H), 1.674(m, 2H), 2.13(m, 6H), 2.19(m, 2H), 2.348(s, 6H), 2.878(q, J=6.9 hz 2H), 7.006(d, J=8.6 hz, 2H), 및 7.399(d, J=8.6 hz, 2H).
C. 9-(2-N-석신이미딜옥시카르보닐)에틸-3,6-디아세톡시-4,5-디메틸-9-에톡시-9H-크산텐 (Ac2EtSF-512-NHS)의 제조
Ac2EtSF-512-1 (7.80g, 17.4mmol)을 염화메틸렌(175㎖)과 혼합하고, N-히드록시석신아미드(2.75g, 23.9mmol)와 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이이미드 히드로클로라이드(7.00g, 63.5mmol)를 첨가했다. 이 혼합물은 90분간 휘어저 섞은 후, 물(5×100㎖)로 세척하였다. 수성 층들은 합하여 염화메틸렌(2×50㎖)역추출시키고, 유기층들을 모아서 황산마그네슘상에서 건조시키고 스트리핑시켰다. 에탄올(100㎖)로 분쇄한 후 여과하고 공기 건조시켜서 생성물을 엷은 황색 고체(7.45g, 78%)형태로 얻었다. 시클로헥산/염화메틸렌으로부터 두번 결정화시킴과 아울러 목탄 처리를 함으로써 분석 샘플을 얻었다. 시클로헥산/염화메틸렌으로 부터 두번 결정화시킴과 아울러 목탄 처리를 함으로써 분석 샘플을 얻었다. M.P. ; 164-5℃, 분석 : 계산치 [C(28)H(29)N(1)O(10)] C 62.33, H 5.42, N 2.60. 실측치 : C 62.17, H 5.47, N 2.48, NMR(DMSO-d6) : δ1.051(t, J=7.0 hz, 3H), 2.4-2.1(m, 4H), 2.191Is, 6H), 2.337(s, 6H), 2.715(s, 4H), 2.912(q, J=7.0 hz, 2H), 7.015(d, J=8.6 hz, 2H), 및 7.429(d, J=8.6 hz, 2H).
D. 9-(2-N-메틸-N-(벤젠옥시카르보닐메틸)카르복스아미도)에틸)-3,6-디아세톡시-4,5-디메틸-9-에톡시-9H-크산텐 (Ac2EtSF-512-Sar-OBn) 제조
염화메틸렌(19㎖)내의 사르코신벤질에스테르 (0.557g, 3.11mmol)의 용액에다 Ac2EtSF-519-NHS(1.30g, 2.41mmole)와 5% 중탄산나트륨 수용액(15㎖)을 첨가하였다. 이같은 2-상(相) 혼합물을 18시간동안 신속하게 휘저어 섞었다. 층들을 분리하고 유기츠을 3×10㎖의 물로 세척하고, 황산나트륨사에서 건조시키고 10㎖로 농축시켰다. 용액을 시클로헥산 40㎖로 희석하고, 목탄 처리를 한 후 질소 스트림하에 20㎖로 감소시켜서 생성물을 끈끈한 고체 형태로 침전시킨다.
상등액을 경사분리시켜 버리고, 잔사를 염화메틸렌으로 동시증발시켜서 무색의 거품(0.97g, 67%)을 얻었다.
광범위한 진공 건조에 의해 분석 샘플을 어었다 : 분석 : 계산치 C(34) H(37) N(1) O(9) C 67.65, H 6.18, N 2.32, 실측치 : C 67.43, H 6.37, N 2.32 NMR(DMSO-d6) : (아미드 결합 회전이성체들의 5 : 2 혼합물을 보여줌) : δ(1류 및 2류) 1.044 및 1.020(t, J=7.0 hz, 3H), 1.824 및 1.714(m, 2H), 2.17(m, 2H), 2.195 및 2.169(s, 6H), 2.346 및 2.337(s, 6H), 2.720 및 2.691(s, 3H), 2.889(q, J=7.0 hz, 2H), 3.950 및 3.988(s, 2H), 5.073 및 5.048(s, 2H), 7.000 및 6.954(d, J=8.6 hz, 2H), 7.45-7.25(m, 7H).
E. 9-(2-(N-메틸-N-(N'-석신이미딜옥시카르보닐메틸)카르복스아미도)에틸)-3,6-디아세톡시-4,5-디메틸-9-에톡시-9-크산텐 (Ac2EtSF=519-Sar-NHS, 구조 2C)의 제조
무수 에탄올(50㎖)내의 Ac2EtSF-519-Sar-OBn(1.35g, 2.24mmol)의 용액에다 10% 탄소상(上) 팔라듐(0.13g)을 첨가하였다. 이 혼합물을 기구(氣球) 수소압하에 20분간 휘저어 섞었다. 여과에 의해 촉매를 제거하고 에탄올을 스트리핑시켜 시럽형의 잔사를 얻었다.
이 잔사를 염화메틸렌(50㎖)속에 용해시키고, N-히드록시석신아미드(0.39g, 3.36mmol)와 1-(3-디메틸암모노프로필)-3-에틸-카르보디이미드히드로클로라이드(1.57g, 8.19mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 75분간 휘저어 섞은 후 물(4×15㎖)로 세척하였다. 용액을 황산나트륨상에서 건조시키고, 25㎖로 농축시키고, 시클로헥산 125㎖을 사용하여 125㎖로 희석하고, 목탄처리를 한 후 질소 스트림하에서 부피를 50㎖로 감소시켰다. 상등액을 경사분리시켜버리고, 잔류 오일을 염화메틸렌(5㎖)속에 집어넣고, 신속하게 휘저어 섞여진 시클로헥산(75㎖)에다 적가하여 무색의 분말(0.587g, 43%)을 얻었다.
분석 샘플을 얻기 위하여, 생성물의 일부분을 염화메틸렌 속에 집어넣고, 분자체 위에서 건조시키고, 질소스트림하에 증발시킨 다음, 끝으로 485℃하에 오산화인 위에서 20시간동안 건조 피스툴 속에서 건조시켰다.
분석:계산치[C(31)H(34)N(2)O(11)]; C 60.98, H 5.61, N 4.59, 실측치; C 60.15, H 5.71, N 4.51, 물(K-F) 1.51%, NMR(DMS-d6)(아미드 결합 회전이성체의 4:1 혼합물을 보여줌):δ(1류 및 2류) 1.039(t, J=6.9hz, 3H), 1.841 및 1.945(m, 2H), 2.19(m, 2H), 2.194(s, 6H), 2.345(s, 6H), 2.767 및 2.744(s, 4H), 2.778 및 2.825(s, 3H), 3.888(q, J=6.9hz, 2H), 4.328 및 4.461(s, 2H), 7.000(d, J=8.6hz, 2H), 및 7.410(d, J=8.6hz, 2H).
[실시예 18]
N-히드록시석신이미드 에스테르 2d의 제조(526nm 염료를 R9와 R10이 CH3인 알키닐아미노-누클레오티드에 부착시키기 위한 바람직한 시약)
A. 2,4-디히드록시-3-메틸벤조알데히드의 제조
옥시염화인(80ml, 0.86몰)을 에테르(250ml)내 N-메틸포름아닐리드(102ml, 0.82몰)의 휘저어 섞은 혼합물 속에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 1시간동안 휘어저 섞은 후 얼음속에서 냉각시켰다. 2-메틸레조르시놀(알드리치, 100g, 0.81몰)을 첨가하고, 이 혼합물을 하룻밤 휘저어 섞으면서 실온으로까지 가온시켰다. 침지된 중간 생성물을 여과에 의해 수거하고 에테르(3x)로 헹구었다. 중간체를 아세톤(25mg)과 물(250ml)의 혼합물속에 용해시키고 30분간 휘저어 섞음으로써 가수분해시켰다. 물(2ℓ)을 첨가하고, 혼합을 끊인 후 냉각시켜셔, 결정성 생성물을 침전시켰다. 이것을 물(4ℓ)로 2회 재결정화시켜서 순수한 생성물(70g, 57%)을 얻었다. M.P. 150℃(Lit. 152-3℃[W. Baker et al. J. Chem. So., 2834-5(1949).] NMR(DMSO-d6):δ1.973(s, 3H), 6.551(d, J=8.5hz, 1H), 7.428(d, J=8.5hz, 1H), 9.703(s, 1H),10.745(s, 1H) 및 11.592(s, 1H).
B. 2,4-디메틸페조르시놀의 제조
2,4-디히드록시-3-메질벤즈알데히드(30.0g, 197mmol)와 이소프로판올(3ℓ)과의 용액을 자석 젓개가 장치된 가지 세개 달린 5ℓ짜리 플라스크속에서 얼음냉각시켰다. 인산(4ml)과 10% 탄소상(上) 팔라듐을 첨가하고 이용액에다 질소를 끼얹은 후 수소를 끼얹었다. 흡수가 완결되었다고 판단될 때(C. 1.5시간) 용액에다 다시 질소를 끼얹은 후(elite를 통해 여과하였다. 용매를 스트리핑하고, 전사를 초산에틸 속에 집어넣고, 이렇게 하여 생긴 용액을 물(4×100ml)로 세척하였다. 수세액을 초산에틸로 역추출하고, 유기층들을 합하여 황산나트륨상에서 건조시키고 스트리핑시켰다. 승화(95°, 0.05토르)에 의하여 무색 고체(19.6g, 72%)가 얻어졌다. M.P. 107-8℃(Lit. 108-109℃[W. Baker et al., J. Chem. Soc. 2834-5(1949).] NMR(DMSO-d6):δ1.969(s, 3H), 2.037(s, 3H), 6.220(d, J=8.1hz, 1H), 6.637(d, J=8.1hz, 1H), 7.929(s, 1H), 및 8.785(s, 1H).
C. 9-(2-카르복시에틸리덴)-3,6-디히드록시-2,4,5,7-테트라메틸-9-크산텐(SF-526)의 제조
2,4-디메틸레조르시놀(28.4g, 0.205몰)과 무수숙신산(20.0g, 0.200몰) 둥근바닥 플라스크에 집어넣고 질소로 파이징(purging)하였다. 메탄설폰산(231ml)을 첨가하고, 용액을 질소 분위기하에 70℃에서 20시간동안 휘저어 섞는다. 반응 혼합물을 수정 수산화나트륨(물 150ml 내에서 95g)과 얼음(3ℓ)의 신속하게 휘저어 섞은 혼합물 속에 적가하였다. 충분한 메탄설폰산을 첨가하여 최종 pH를 4.7-1.5로 만들었다. 생성된 고체를 원심분리에 의해 수거하고, 현탁, 회전, 및 물(5×1.2L)에서의 경사분리에 의하여 세척하였다. 최종 현탁액을 여과에 의해 수거하고, 공기 건조시킨 후 110℃에서 6시간동안 오븐건조를 시켜 붉은 벽돌빛의 고체(36.6g, 44%)를 얻었다.
알칼리 용액으로부터 두번째로 침전시킨 후 원심분리 및 물 세척을 하여 분석 샘플을 얻었다. 분석;계산치. [C(16)H(12)O(5)]C 70.57, H 5.92, 실측치:C 70.39 H 6.00, 0.21% 몰(K-F), NMR(DMSO-d6)(대부분 온 스피로락톤 형태); δ 2.172(s, 12H), 2,508(m, 2H), 3.342(m, 2H) 및 7.604(s, 2H), Vis.abs(pH 8.2; 50mM aq Tris/HCl):509nm(71,300).
D. 9-(2-카르복시에틸)-3,6-디아세톡시-9-에톡시-2,4,5,7-테트라메틸-9H-크산텐(AC 2EtSF-526)제조
SF-526(26.2g, 74mmol)을 얼음처럼 차가운 무수 초산(450ml)에다 첨가한 후 피리딘(100ml)을 첨가하고, 이 혼합물을 150분간 열음 냉각하면서 휘저어 섞었다. 반응 혼합물을 여과한 후, 신속하게 휘저어 섞은 얼음처럼 차가운 물(7ℓ)속에다 느리고 안정된 스트림으로 첨가하였다. 30분간 더 휘저어 섞은 후에, 중간 생성물을 여과하고, 물로 세척하고, 물(4ℓ)속에 재현탁시키고, 30분간 더 휘저어 섞었다. 여과에 의해 고체를 수거하고, 공기 건조시켜서 스피록탁톤 중간체(28.9g)를 얻었다. 이러한 중간체(18.6g)를 무수 에탄올(1ℓ)속에 용해시키고 90분간 환류시켰다. 이 용액을 회전 증발기에서 300ml로 농축시킴으로써 결정화가 일어났다. 여과에 의해 생성물을 수거하고, 에탄올로 헹구고, 공기 건조시킨 후 건조시킨 무색의 미소결정(11.6g, 사용된 중간체의 양을 기준으로 52%)을 얻었다.
염화메틸렌/시클로헥산으로부터 재결정화시킴과 아울러 목탄 처리를 하여 무색의 미소결정을 얻었다. M.P.;154-155℃ 염화메틸렌으로 2회 증발시킴으로써 분석을 위해 시클로헥산의 자취를 없앴다. 분석:계산치. [C(20)H(20)O(5)] C 70.57, H 5.92, 실측치:C 70.39, H 6.00. 0.21% 물(K-F). NMR(DMSO-d6)(대부분은 스피로락톤 형태):δ 2.172(s, 12H), 2.508(m, 2H), 3.342(m, 2H), 및 7.604(s, 2H), Vis.abs(Ph 8.2;50mM aq Tris/HCl):509nm(71,300).
E. 9-(2-(N-석신이미딜옥시카르보닐)에틸)-3,5-디아세톡시-9-에톡시-2,4,5,7-테트라메틸-9H-크산텐(Ac2EtSF-526-NHS)의 제조
Ac2EtSF-526(4.70g, 9.99mmol)을 염화메틸렌(75ml)과 혼합하고 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(3.10g, 16.2mmol)와 N-히드록시석신이미드(1.50g, 130mmol)를 첨가했다. 이 혼합물을 90분간 휘저어 섞은 후 물(4×50ml)로 세척하였다. 수성층은 합하여 염화메틸렌(50ml)으로 역추출하고, 유기 층들을 다모아서 황산 나트륨상에서 건조시킨 후 스트리핑시켰다. 에탄올(75ml)로 분쇄한후 여과하고 공기 건조시켜서 조 생성물을 밝은 황색 고체(C. 4.7g)형태로 얻었다. 이 물질을 염화메틸렌(50ml)속에 용해시키고, 시클로헥산(50ml)을 첨가하였다. 1티스푼의 목탄을 첨가하고, 혼합물을 여과한후, 추가량의 시클로헥산(25ml)을 사용하여 생성물을 만들어냈다. 여과에 의해 수거하고, 공기 건조시키고, 진공 건조시켜서 무색의 결정(3.14g, 55%)을 얻었다.
시클로헥산과 염화메틸렌으로부터 두번째 침전을 시켜 분석 샘플을 얻었다.
분석;계산치[C(30)H(33)N(1)O(10)]:C 63.48, H 5.86, N 2.47. 실측치:C 63.08, H 6.00, N 2.37, NMR(DMSO-d6):1.058(t, J=6.9hz, 3H), 2.136(s, 6H), 2.155(s, 6H), 2.228(m, 4H), 2.371(s, 6H), 2.748(s, 5H), 2.918(q, J=6.9hz, 2H), 및 7.300(s, 2H).
F. 9-(2-(N-메틸-N-(벤질옥시칼보닐메틸)카르복스아미도)에틸)-3,6-디아세톡시-9-에톡시-9-크산텐)(Ac2EtSF-505-Sar-OBn)의 제조
사르코신벤질에스테르(0.72g, 4.02mmol)의 염화메틸렌(40ml)내 용액에다 Ac2EtSF-526-NHS(1.82g, 3.21mmol)과 5% 중탄산나트륨 수용액(30ml)을 첨가하였다. 2-상(相) 혼합물을 20분간 신속하게 휘저어 섞었다. 충돌을 분리하고, 유기층을 4×15ml의 물로 세척하고, 황산나트륨상에서 건조시키고 15ml로 농축시켰다. 이 용액을 시클로헥산을 사용하여 100ml로 농축하고, 목탄 처리를 한 후, 질소 스트림하에 50ml로 부피를 감소시킴으로써 생성물이 침전되었다. 여과한 후 공기 건조시켜서 무색의 고체(0.96g, 47%)를 얻었다.
염화메틸렌과의 동시 증발에 이어, 광범위한 진공 건조를 시킴으로써 분석 샘플을 얻었다.
분석:계산치.[C(36)H(41)N(1)O(9)] C 63.45, H 6.54, N 2.22 실측치:C68.29, H 6.70, N 2.07, NMR(DMSO-d6):(아미드 결합 회전 이성체의 5:2 혼합물을 보여준다):(1류 및 2류) 1.049 및 1.027(t, J=68hz, 3H), 1.783 및 1.700(m, 2H), 2.129 및 2.099(s, 6H), 2.159 및 2.129(s, 6H), 2.14(m, 2H), 2.379 및 2.371(s, 6H), 2.699 및 2.690(s, 3H), 2.873(q, J=6.8hz, 2H), 3.985 및 3.976(s, 2H), 5.075 및 5.019(s, 2H), 7.266 및 7.233(s, 2H), 및 7.25-7.40(m, 5H).
G. 9-(2-(N-메틸-N-CN'-숙신이미딜옥시 카르보닐메틸)카르복스아미도)에틸)-3,6-디아세톡시-9-에톡시-2,4,5,7-테트라메틸-9H-크산텐)(Ac2EtSF-526-Sar-NHS, 구조 2d)의 제조
무수 에탄올(40ml)의 Ac2EtSF-526-Sar-OBn(0.96g, 1.52mmol)용액 속에다 10% 탄소상(上) 팔라듐(0.10g)을 첨가했다. 이 혼합물을 기구 수소압 하에 30분간 휘저어 섞었다. 여가에 의해 촉매를 제거하고 에탄올을 스트리핑시켜서 시럽형 잔사를 얻었다.
잔사를 염화메틸렌(40ml)속에 용해시키고 N-히드록시숙시이미드(0.26g, 2.26gml)과 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸-카르보디이미드 히드로클로라이드(0.59g, 3.08mmol)를 첨가하였다.이 혼합물은 30분간 휘저어 섞은 후 물(4×15ml)로 세척하였다. 용액을 황산나트륨 상에 건조시키고 15ml로 농축시키고, 시클로헥산을 사용하여 100ml로 희석하고, 목탄처리를 한후, 질소 스트림하에 50ml로 까지 부피를 감소시킨다. 생성물을 여과에 의해 수거하고, 공기 건조시키고 진공 건조시켜서 무색의 미소결정(0.573g, 59%)을 얻었다.
염화메틸렌과의 동시 증발에 뒤이어 40℃하에 광범위한 진공 건조를 시켜서 시클로헥산의 자취를 없애고 무정형 고체 형태의 분석 샘플을 얻었다.
NMR(DMSO-d8):δ1.043(t, J=6.7hz, 3H), 1.82(m, 2H), 2.130(s, 6H), 2.157(s, 6H), 2.15(m, 2H), 2.378(5, 6H), 2.748(s, 4H), 2.778(s, 3H), 2.891(q, J=6.7hz, 2H), 4.327(s, 2H), 및 7.275(s, 2H).
[실시예 19]
알키닐아미노누클로이티드를 N-히드록시석신이미드 에스테르 2와 커플링시키는 일반적인 방법, 형광 표지체인 터미네이팅 알키닐아미노-누클레오티드 34-37의 제조. 알키닐아미노-누클레오티드 트리포스페이트 49(10마이크로 몰, 실시예 3J에서 나온 것)를 물(0.050ml) 속에 집어넣고, 디메틸포름아미드(0.100ml)로 희석하였다. 디메틸포름아미드(0.100ml)내의 N-히드록시숙신이미드 에스테르 2a의 용액(12.3mg), 21마이크로몰, 2.1당량. 실시예 15E에 나온 것)을 첨가하고 그 혼합물을 50°에서 4시간동안 휘저어 섞었다. 농축된 수산화 암모늄(0.25ml)을 첨가하고 반응 용기를 단단하게 막고, 50°에서 25분간 계속 가열하였다. 생성된 적색용액을 물을 사용하여 10mg로 희석하고, 10M1 pH 7.6의 수성 TEAB(50ml) 및, 뒤이어 .2M pH 7.6의 수성 TEAB(50ml)로 평형화시킨 DEAE-세파텍스 A-25-120(1×19cm 베드)의 컬럼에 적용시켰다. 이 컬럼을 0.4M(150ml)에서 0.7M(150ml)에 이르는 pH 7.6인 수성 TEAB의 선형 구배로 용출시켰다. 이 컬럼을 매 3분마다 100ml/h(수집유분)로 가동시켰다 .용출액을 498nm에서의 흡수율에 의하여 조절하였다(40AUFS). 더 작은 두 부산물 밴드를 먼저 용출시킨 후에 기본선 레졸루션의 더 강력한 생성물 밴드를 용출시켰다. 유분 순수한 생성물이라 생각되는 유분들을 모아서 스트리핑시키고(T 30°)무수 에탄올과 3회 동시 증발시킨 후 물(0.74ml)속에 집어 넣었다. 가시 흡수(ph 8.2의 50mM 수성 Tris 완충액)에 의해 용액을 분석하고 동결건조시켰다. 생성물의 희석 용액은 487.5nm에서 최소 흡수율을 나타내었다. 생성물에 대한 흡수계수가 유리 염료(72,600)의 흡수 계수와 같다고 가정했을때 표지가 붙은 알키닐아미노-누클레오티드 37의 수율은 4.2마이크로몰(42%)이었다.
상기 과정에 의해서 Het가 7-데아자구아닌(k)인 형광 표지 체인 종결제로 37이 생산되었다. 표지가 붙은 체인 종결제 34(Het는 우라실(h)), 35(시토신(i)), 및 36(7-데아자아데노신(j)은 알키닐아미노 누클레오티드 트리포스페이트 46, 42 및 51을 각각 N-히드록시석신이미드 2d, 2c 및 2b와 커플링시킴으로써 유사한 과정에 따라 제조하였다. 다른 형광 표지 누클레오티드 트리포스페이트도 같은 방법에 따라 제조하였다.

Claims (5)

  1. 요오드를 7-위치에다 레지오 선택적으로 도입시키기 위해서 2-티오알콕시-6-알콕시-7-데아자푸린을 N-요오도석신이미드로 처리하는 단계를 포함하는, 2-티오알콕시-6-알콕시-7-요오도-7-데아자푸린의 제조방법.
  2. 하기 단계(A)-(I)를 포함하는, 7-(3-아미노-1-프로피닐)-2',3'-디데옥시구아노신 5'-트리포스페이트의 제조방법: (A) 수소나트륨의 존재하에서 6-메톡시-2-메틸티오-7-데아자푸린을 1-클로로-2-데옥시-3,5-디-O-P-톨루오일-α-D-리보푸라노스와 접촉시키고; (B) 단계(A)의 에스테르 생성물 9를 염기성 조건하에서 디올 10으로 가수분해시키고; (C) 디올 10의 5-OH 위치를 트리틸기로 보호하고; (D) 중간체 티오카르보네이트를 수소화 주석 환원제로 환시킴으로써 3-OH기를 제거하고; (E) 단계(D)에서 생성된 디데옥시데아자푸린 12를 N-요오드 석신이미드로 처리하여 7-요오드 유도체를 13을 생성시키고; (F) 헥사메틸포스포르아미드 내에서 화합물 13을 나트륨티오크레졸레이트와 접촉시켜 7-데아자푸린-6-온 14를 생성시키고; (G) 화합물 14를 메타클로로퍼옥시벤조산과 암모니아로 연속 처리하여 7-데아자구아노신 15를 얻고; (H) N-프로파르릴트리플루오로아세트아미드를 탈보호된 7-요오드 화합물 16과 커플링시켜 7-(3-트리플루오로아세트아미도-1-프로피닐)-2',3',-디데옥시-7-데아자구아노신을 얻고; (I) 단계(H)의 생성물을 5'-트리포스페이트로 전환시킨 후 탈보호한다.
  3. 요오드를 7-위치에다 레지오 선택적으로 도입시키기 위하여 6-클로로-7-데아자푸린을 일염화요오드로 처리하는 단계를 포함하는 6-클로로-7-요오드-7-데아자푸린을 제조하는 방법.
  4. 비스(트리페닐포스핀)팔라듐 이염화물/요오드화 제1구리 촉매를 사용하여 헤테로 고리 염기내의 탄소 원자에 요오드 원자가 부착되어 있는 요오드-누클레오티드와 말단 알키닐아민을 커플링시켜 알키닐아미노-누클로레오티드를 제조하는 방법으로서, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(O)/요오드화 제1구리 촉매를 사용함을 특징으로 하는 방법.
  5. 하기 구조를 갖는 7-요오드-누클레오티드:
    상기 식에서, Z는 H 또는 NH2이고; R4는
    이며; R5는 H, PO3H2,P2O6H3또는 그의 염이고; (ⅰ) R7=R6H일 경우엔 R6=H, OH, F, N3또는 NH2이고; 또는 (ⅱ) R7=H이고 R8=OH일 경우엔 R6=H 또는 OH이며; 또는 (ⅲ) R7=OH이고 R8=H일 경우엔 R6=OH이다.
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