CN101636406A - 光可断裂的标记核苷酸和核苷与标记的核苷酸和核苷以及其在dna测序中的使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可用在DNA测序技术和其它类型的DNA分析中的本文所述的新的核苷酸、核苷及其衍生物。在一个实施方案中，具有未保护的3’－OH的核苷酸或核苷在核碱基上被衍生成包括通过连接物与不可断裂的终止基团连接的荧光染料。所述不可断裂的荧光基团被设计成终止DNA合成，使得可以平行模式对DNA寡聚体进行有效测序。在另一个实施方案中，具有未保护的3’－OH的核苷酸或核苷在核碱基上被衍生成包括通过连接物与光可断裂的终止基团连接的荧光染料。所述光可断裂的荧光基团被设计成终止DNA合成以及被断裂，使得可以平行模式对DNA寡聚体进行有效测序。

Description

光可断裂的标记核苷酸和核苷与标记的核苷酸和核苷以及其在DNA测序中的使用方法
技术领域
本发明一般涉及用于DNA测序和其它类型DNA分析的化合物和方法。更具体而言，本发明涉及利用光可断裂基团标记的核苷酸和核苷、利用不可断裂基团标记的核苷酸和核苷以及其在DNA测序和分析中的使用方法。
背景技术
快速DNA测序方法已经成为分析种群中疾病和突变以及开发治疗方法的需求。最常观察到的人序列变异形式是单核苷酸多态性(SNP)，其以大约1/300至1/1000个基因组序列碱基对而存在。基于人基因组全序列，正在努力通过绘制SNP谱或直接关联来确认成为常见疾病原因的基因关联。基于快速、高通量和低成本的DNA测序技术的开发将促进对遗传信息(例如SNP)在应用医学中的理解和应用。
一般而言，10％-15％的SNP将通过改变特定氨基酸残基来影响蛋白质功能、通过改变剪切机制来影响对基因的适当加工、或者通过改变调节机制来影响基因或蛋白质的正常表达水平。设想信息性SNP的鉴定将导致对遗传病的更准确诊断、对风险易感性的更好预测、或对组织中偶发性突变的识别。个体SNP特性的一个应用将是利用预防性药物治疗来显著延迟疾病的发生或进展。
此外，药物代谢基因的SNP特性可用于制定具体的给药方案以提供更安全和更有效的结果。为实现这些宏大的目标，基因组测序将进入具有对大多数种群进行部分测序可能性的重测序(resequencing)阶段，其将涉及对特定区域或分布在整个人类基因组中的单碱基对进行平行测序以获得特定复杂疾病的SNP特性。
成为大多数常见疾病原因的序列变异很可能与分散在全部相关基因中并以低频率存在的多个SNP有关。因此，与仅靶向已知SNP的技术相比，利用从头测序策略的DNA测序技术更可能检测和/或发现这些少见的、广泛分布的变异体。
传统上，通过“Sanger”法或“双脱氧”法实现DNA测序，其包括通过利用DNA聚合酶引入2’，3’-双脱氧核苷酸(ddNTP)的DNA合成的链终止(Sanger，F.，Nicklen，S.，and Coulson，A.R.(1977)DNAsequencing with chain-terminating inhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，5463-5467)。所述反应还包括天然2’-脱氧核苷酸(dNTP)，其通过DNA合成扩增DNA链。链扩增与链终止之间的大体平衡的竞争导致形成一系列套式DNA(nested DNA)片段，其均匀地分布在数以千计的碱基中并且在碱基对增长尺寸方面不同。利用电泳根据套式DNA片段的各自尺寸对其进行拆分。测序反应中的dNTP/ddNTP比决定链终止的频率，并因此决定终止链的长度分布。然后，当利用合适的激光源照射时，通过之前的4种不同荧光团与4种DNA碱基(即A、C、G和T)的结合发出其各自颜色的荧光来检测所述片段。目前，Sanger测序通过直接PCR测序(Gibbs，R.A.，Nguyen，P.-N.，McBride，L.J.，Koepf，S.M.，and Caskey，C.T.(1989)Identification of mutationsleading to the Lesch-Nyhan syndrome by automated direct DNAsequencing of in vitro amplified cDNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1919-1923)或基因组测序(Hunkapiller，T.，Kaiser，R.J.，Koop，B.F.，and Hood，L.(1991)Large-scale and automated DNA sequencingDetermination.Science 254，59-67；International Human GenomeSequencing Consortium.Initial sequencing and analysis of the humangenome.(2001)Nature 409，860-921)已经成为用于发现SNP的最广泛应用的方法。
另一种具有前景的测序方法是周期可逆终止(CRT)，其为一种测多模板的同步单个碱基加成的周期性方法。该方法本身与Sanger法(Metzker，M.L.(2005)Genome Rex 15，1767-1776)的不同之处在于其可不需要凝胶电泳(其为推进该领域的主要瓶颈)而进行。然而，与Sanger测序相似，读取长度较长意味着需要较少次测序试验来覆盖整个基因组。
仍然难于实现长CRT读取的目标，因为利用可商购的DNA聚合酶，可逆的终止子通常起到弱底物的作用。利用3’-O-阻滞基团和通过连接基团与荧光染料结合的核碱基构成可逆的终止子。在随后的碱基加成之前，阻滞基团和染色基团均需要除去。这些核苷酸修饰不能良好地耐受DNA聚合酶，这可通过多种策略进行突变来提高酶性能。脱保护时，将核碱基连接物置于一边，随着其后的CRT循环，在生长中的DNA双螺旋中进行依次累积。据信弱的酶动力学和随后修饰的DNA双螺旋限制了较长的读取长度。本发明部分地描述了需要终止部分和荧光染色部分的单一结合来提高酶动力学和脱保护效率的新的可逆核苷酸结构。这些可逆终止子通过多种可商购的DNA聚合酶而被有效地引入，所述生长中的DNA双螺旋通过脱保护步骤转变为其天然状态。
CRT技术的DNA测序读取长度由每个核苷酸加成循环的总效率所决定。例如，如果认为50％原始材料的终点具有可接受的信噪比，那么下述等式可用于评价循环效率对读取长度的作用：(RL)Ceff＝0.5，其中RL是碱基的读取长度，Ceff是总循环效率。换句话说，可以通过90％的总循环效率实现7个碱基的读取长度，通过99％的循环效率实现70个碱基的读取长度，可通过99.9％循环效率实现700个碱基的读取长度。为实现对大长度测序的目标，所述方法必须提供非常高的循环效率或者所述恢复可降至可接受的信噪比以下。表现出较高引入效率和脱保护效率的可逆终止子将实现较高的循环效率，因而实现较大的读取长度。
为使CRT终止子适当地起作用，必须在温和条件下有效地断裂掉所述保护基。保护基的除去通常涉及利用强酸或强碱、催化或化学还原的处理，或者这些方法的组合。这些条件对于所述DNA聚合酶、核苷酸、寡核苷酸引物模板、或固体载体而言可能是反应活性的，产生不希望的结果。使用光化学保护基是一种有吸引力的替代强烈化学处理的方法，并且可以非侵入方式进行使用。
已有多种光可除去的保护基(例如2-硝基苄基、苄氧基羰基、3-硝基苯基、苯甲酰甲基、3，5-二甲氧基苯偶姻基(3，5-dimethoxybenzoinyl)、2，4-二硝基苯硫基及其各自的衍生物)被用于合成肽、多糖和核苷酸(Pillai，V.N.R.(1980)Photoremovable Protecting Groups in OrganicSynthesis.Synthesis，1-26)。在这些保护基中，光敏感的2-硝基苄基保护基已成功用于以下的基团：用于二核糖核苷合成的核糖核苷的2’-OH(Ohtsuka，E.，Tanaka，S.和Ikehara，M.(1974)Studies on transferribonucleic acids and related compounds.IX(I)Ribooligonucleotidesynthesis using a photosensitive o-nitrobenzyl protection at the2′-hydroxyl group.Nucleic Acids Res.1，1351-1357)、自动化核酶合成中的核苷亚磷酰胺(ribophosphoramidite)的2’-OH(Chaulk，S.G.和MacMillan，A.M.(1998)Caged RNA：photo-control of a ribozyme.Nucleic Acids Res.26，3173-3178)、Affymetrix化学中用于寡核苷酸合成的亚磷酰胺的3’-OH(Pease，A.C，Solas，D.，Sullivan，E.J.，Cronin，M.T.，Holmes，C.P.和Fodor，S.P.A.(1994)Light-generatedoligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5022-5026)以及用于DNA测序应用的3’-OH(Metzker，M.L.，Raghavachari，R.，Richards，S.，Jacutin，S.E.，Civitello，A.，Burgess，K.和Gibbs，R.A.(1994)Termination of DNAsynthesis by novel 3′-modified deoxyribonucleoside triphosphates.Nucleic Acids Res.22，4259-4267)。在脱保护条件(紫外线＞300nm)下，可以在不影响嘧啶或嘌呤碱基的情形下有效地断裂2-硝基苄基(Pease，A.C，Solas，D.，Sullivan，E.J.，Cronin，M.T.，Holmes，C.P.和Fodor，S.P.A.(1994)Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNAsequence analysis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5022-5026)以及(Bartholomew，D.G.和Broom，A.D.(1975)One-step ChemicalSynthesis of Ribonucleosides bearing a Photolabile Ether ProtectingGroup.J.Chem.Soc.Chem.Commun.，38)。
在当今跨越不同研究部门(包括比较基因组学和进化学、法医学、流行病学、以及用于诊断和治疗的应用医学)的应用下，对于开发新的测序技术的需求从来没有这样强烈过。对于在人序列变异研究中的广泛应用而言，目前的测序技术太昂贵、费力且耗时。基因组中心的成本是基于每1,000个Q20碱基的美元数来计算的，并且通常可分成仪器、人员、试剂、材料以及管理花费等类别。目前，这些中心以不到1美元/1,000个Q20碱基进行运作，其中至少50％的成本单独由DNA测序仪器产生。对于新的检测方法、仪器小型化、微流体分离技术的开发以及每次运行的试验数的增加将最有可能对降低成本产生最大的影响。
因此，本发明的一个目的是提供可用于在高通量测序反应中对基因组信息进行有效测序的新化合物。
本发明的另一个目的是提供新的试剂和试剂组合，所述新的试剂和试剂组合可以有效并可买得起的方式提供基因组信息。
本发明的又一个目的是提供用于诊断方法和用于开发针对个体的靶向治疗剂的试剂的文库和阵列。
发明内容
光可断裂的标记核苷酸和核苷
本发明提供了可用在DNA测序技术中的核苷化合物及其磷酸酯和盐。所述化合物任选地是核糖核苷三磷酸(NTP)和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)化合物的形式。所述核苷酸和核苷化合物包含利用荧光染料标记的光可断裂基团。所述包含光可断裂保护基的核苷酸和核苷化合物被设计成终止DNA合成然后有效断裂，使得可以平行模式对所述核酸寡聚体进行快速测序。所述核苷酸和核苷化合物上这种利用荧光染料标记的可断裂基团的存在可提高对大的DNA寡聚体进行平行测序的速度和准确度，以使得可进行例如对整个基因组的快速测序以及对多态性和其它有价值遗传信息的鉴定。
提供了含有核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物的多种核苷酸和核苷化合物，其包含可断裂基团和/或可被衍生化而包含可检测的标记物(例如染料)。
在一个实施方案中，所述核苷的碱基与2-硝基苄基共价连接，所述2-硝基苄基的α碳位置任选地被本文中所述的一个烷基或芳基取代。所述2-硝基苄基可被官能化以提高终止性能和光催化的脱保护速率。即使在核糖上的3’-OH基未被封闭时，与所述核碱基相连的2-硝基苄基或α碳被取代的2-硝基苄基的终止性能仍然存在。这些3’-OH基未封闭的终止子可良好耐受多种可商购的DNA聚合酶，这代表了优于3’-O封闭的终止子的一个关键优点。所述α碳被取代的2-硝基苄基还可被衍生化而包含所选的荧光染料。
在一个实施方案中，所述核苷的碱基与2-硝基苄基共价连接，所述2-硝基苄基任选地被本文中所述的供电子和吸电子基团中的一种或多种所取代。所述2-硝基苄基可被官能化以提高光催化脱保护的速度。所述2-硝基苄基还可被衍生化而包含可检测的荧光染料。
具体而言，通过利用2-硝基苄基修饰的四种核苷三磷酸化合物和本文所述的利用不同荧光染料标记的衍生物的组合，提供了用于DNA测序的方法，其可用于鉴别所引入的碱基以揭示作为其基础的DNA序列。
标记的核苷酸和核苷
还提供了可用在DNA测序技术中的核苷化合物及其磷酸酯和盐。所述化合物任选地是核糖核苷三磷酸(NTP)和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)化合物的形式。所述核苷酸和核苷化合物包含利用荧光染料标记的不可断裂基团。所述核苷酸和核苷化合物被设计成终止DNA合成，使得可以平行模式对核酸寡聚体进行快速测序。提供了含有核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物的多种核苷酸和核苷化合物，其可被衍生化而包含可检测的标记物(例如染料)。
在一个实施方案中，所述核苷的碱基与苄基共价连接，所述苄基的α碳位置任选地被本文中所述的一种烷基或芳基所取代。所述苄基可被官能化以提高终止性能。即使在核糖上的3’-OH基未被封闭时，与核碱基相连接的任选地α碳被取代的苄基的终止性能仍然存在。这些3’-OH基未封闭的终止子可良好耐受多种可商购的DNA聚合酶，这代表了优于3’-O封闭的终止子的一个关键优点。所述连接基团还可被衍生化而包含所选的荧光染料。
具体而言，通过利用不可断裂的终止基团修饰的四种核苷三磷酸化合物和本文所述的利用不同荧光染料标记的衍生物的组合，提供了用于DNA测序的方法，其可用于鉴别所引入的碱基以揭示作为其基础的DNA序列。
具体实施方式
光可断裂标记的核苷酸和核苷
本发明提供了可用在快速DNA测序技术中的核苷酸和核苷化合物及其盐、酯和磷酸酯。所述化合物任选地是核糖核苷三磷酸(NTP)和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)化合物的形式。在一个实施方案中，所述核苷酸和核苷化合物包含利用荧光染料标记的光可断裂基团。所述核苷酸和核苷化合物包含被设计成终止DNA合成以及快速断裂的光可移除保护基，使得这些单体可用于以平行模式快速测序。所述核苷酸和核苷化合物上这种利用荧光染料标记的可快速断裂基团的存在可提高大的DNA寡聚体的平行测序的速度和准确度，以使得可以例如对整个基因组进行快速测序以及鉴定多态性和其它有价值的遗传信息。
提供了包含核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物的多种核苷酸和核苷化合物，其包含可断裂基团和/或可被衍生化而包含可检测的标记物(例如染料)。
在一个实施方案中，所述核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物可与光可除去的保护基如2-硝基苄基共价连接。所述2-硝基苄基可被衍生化以提高其对DNA合成的终止以及脱保护速度，因此增强了其在DNA测序中的用途。还可利用荧光染料通过与光可除去的保护基共价连接而对所述光可除去的保护基(例如2-硝基苄基)进行衍生化。
I.光可断裂的标记核苷酸和核苷化合物用于测序的优点
提供了可用于DNA测序技术的核苷酸和核苷化合物。循环可逆终止(CRT)是一种检测多个模板的同步、单个碱基加成的周期性方法。该方法本身与Sanger法的不同之处在于其可以在不需要凝胶电泳和高度平行的模式下(其为推进该领域的主要瓶颈)进行，。然而，与Sanger测序相似，较长读取长度意味着需要较少次测序试验来需要覆盖整个基因组。所述CRT循环包括三个步骤：引入、成像和脱保护。对于该过程而言，循环效率、循环时间和灵敏度是重要的因素。循环效率是脱保护和引入效率的结果，并且决定了CRT读取长度。CRT循环时间是引入、成像和脱保护时间的总和。对于针对整个基因组测序的快速CRT而言，可使用本文所公开的可表现出快速和有效的脱保护性能的核苷酸和核苷化合物。这些化合物可利用荧光染料进行标记，直接与2-硝基苄基相连，从而提供具有相似脱保护性能的荧光可逆终止子。CRT技术的读取长度由每个核苷酸加成循环、脱保护和引入效率的结果的总效率决定。例如，如果认为50％原始材料的终点具有可接受的信噪比，那么下述等式可用于评价循环效率对读取长度的作用：
(RL)Ceff＝0.5
其中RL是碱基的读取长度，Ceff是总循环效率。换句话说，可以通过90％的总循环效率实现7个碱基的读取长度，可通过99％的循环效率实现70个碱基的读取长度，可通过99.9％循环效率实现700个碱基的读取长度。本发明化合物的引入效率可以为引入类似的天然核苷的约70％至约100％。优选地，所述引入效率为约85％至约100％。光可断裂的效率优选为约85％至约100％。此外，当引入本发明化合物时，核酸延伸的终止为约90％至约100％。在一个实施方案中，核苷酸和核苷化合物的循环效率为至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。当用于基因组DNA时，可将所述化合物用在CRT中以直接由基因组DNA进行读取。片段基因组DNA可与含有横跨所选染色体的引发位点的高密度寡核苷酸芯片进行杂交。通过CRT法的所评估的读取长度来分离每个引发序列。在两次碱基加成之间，荧光成像仪可同时对整个高密度芯片成像，评价在速度和灵敏度方面的提高。通过紫外照射除去本文所述的与所述2-硝基苄基相连的荧光团或其衍生物，释放出2-硝基苄基用于下一轮的碱基加成。然后在大约500个CRT循环后，可将所述完全的且不间断的基因组序列信息与参比人基因组相比较，以确认单个样品中序列变异的程度和类型。
II.光可断裂的标记核苷酸和核苷化合物
本发明提供了多种核苷以及其单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯化合物。所述化合物可用于DNA测序技术。在一个实施方案中，所述核苷酸和核苷化合物包含利用荧光染料标记的光可断裂的终止基团，所述荧光染料可在CRT反应中被检测到并有效断裂。所述核苷酸和核苷化合物可转化成其各自的天然核苷单磷酸酯用于随后的DNA聚合酶反应。在一个具体实施方案中，提供了含有脱氧核糖或核糖和碱基的核苷酸和核苷化合物，其中所述碱基与光可断裂的终止基团2-硝基苄基共价连接。所述2-硝基苄基可被提高DNA合成终止和脱保护速度的基团所取代。此外，所述2-硝基苄基可通过与报告物基团(例如染料)相连而可被检测。所述染料可任选地通过双官能团连接物与2-硝基苄基相连。本发明的化合物可通过下式表示：
Figure G2007800494372D00091
其中R1是H、单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，R2是H或OH，碱基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤或其天然衍生物，可断裂的终止部分是赋予所述化合物聚合酶终止性能的基团，连接物是双官能团，染料是荧光团。本发明的化合物可被设计为可用于DNA合成测序中的荧光的、光不稳定的可逆终止子。所述化合物可被优化为可逆终止子，被修饰以具有在水溶液中的快速有效脱保护行为和良好的荧光性能。在一个实施方案中，提供了具有式I-VII结构的化合物或其可药用盐或酯或其对映体、外消旋混合物或立体异构体：
Figure G2007800494372D00101
式I                    式II
Figure G2007800494372D00102
式III                  式IV
Figure G2007800494372D00111
式V                        式VI
Figure G2007800494372D00112
式VII
其中R1＝H、单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，R2＝H或OH，R3和R4各自独立地选自H、C1-C12直链或支链烷基、C2-C12直链或支链烯基或多烯基(polyenyl)、C2-C12直链或支链炔基或多炔基(polyalkynyl)、以及芳香基(例如苯基、萘基或吡啶环)，前提是R3和R4中至少一个是H；R5、R6、R7和R8各自独立地选自H、OCH3、NO2、CN、卤化物、C1-C12直链或支链烷基、C2-C12直链或支链烯基或多烯基、C2-C12直链或支链炔基或多炔基、以及芳香基(例如苯基、萘基或吡啶环)，和/或下述一般结构的连接基团：
X＝CH2、CH＝CH、C≡C、O、S或NH，Y＝CH2、O或NH，n＝0-12的整数；m＝0-12的整数，染料＝荧光团。在一个具体实施方案中，在本发明提供的含有衍生的2-硝基苯环的化合物(例如式I-VII的化合物)中，可通过在2-硝基苯环的4-位引入供电子基团或者在5-位引入吸电子基团而提高DNA测序过程中2-硝基苯基的脱保护和去除速度。
在一个优选实施方案中，R3和R4选自但不限于-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、异丙基、叔丁基、苯基、2-硝基苯基以及2，6-二硝基苯基。或者，R3和R4选自但不限于烷基和芳香性基团，所述烷基和芳香性基团的烷基或芳香性基团中任选地含有至少一个杂原子，此外，其中所述芳香性基团可任选地是芳基(例如苯基)或多环基团(例如萘基)。在某些实施方案中，R5、R6、R7和R8是选自芳基和多环基团的芳香性基团。
或者，光可断裂的终止部分可具有下述一般结构：
Figure G2007800494372D00122
例如，含有这些光可断裂的终止部分的化合物可具有下述结构：
其中所述可断裂的终止部分通过选自以下的键与所述碱基相连接：苄胺、苄醚、氨基甲酸酯、碳酸酯、氨基甲酸2-(邻硝基苯基)乙酯以及碳酸2-(邻硝基苯基)乙酯。这些实施方案均包含在本发明的范围内。
对荧光染料没有特别限制。例如，所述荧光团可以选自但不限于BODIPY、荧光素、罗丹明、香豆素、呫吨、花青、芘、酞菁、藻胆蛋白、alexa、squarene染料、产生能量转移染料的组合、及其衍生物。
优选的实施方案包括但不限于下述化合物：
Figure G2007800494372D00141
Figure G2007800494372D00151
III.光可断裂的核苷酸和核苷化合物的合成
本文所公开的化合物通常可如本文中所公开并利用本领域中可利用的方法进行合成。例如，下述一般方案表示腺苷化合物的合成：
合成腺苷N6-修饰化合物的一般方案
Figure G2007800494372D00152
合成鸟苷O6-修饰化合物的一般方案
Figure G2007800494372D00161
合成鸟苷8-氧代-修饰化合物的一般方案
Figure G2007800494372D00171
合成尿苷5-HOMe-修饰化合物的一般方案
Figure G2007800494372D00172
合成胞苷5-HOMe-修饰化合物的一般方案
Figure G2007800494372D00181
合成胞苷N4-修饰化合物的一般方案
其它细节在实施例部分提供。
标记的核苷酸和核苷
本发明提供了可用在快速DNA测序技术中的核苷酸和核苷化合物及其盐、酯和磷酸酯。所述化合物任选地是核糖核苷三磷酸(NTP)和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的形式。在一个实施方案中，所述核苷酸和核苷化合物包含利用荧光染料标记的不可断裂基团。所述核苷酸和核苷化合物被设计成终止DNA合成，使得这些单体可用于平行模式的快速测序。所述核苷酸和核苷化合物上这些利用荧光染料标记的基团的存在可提高对大的DNA寡聚体进行平行测序的速度和准确度，以使得可以例如进行对整个基因组的快速测序和对多态性以及其它有价值遗传信息的鉴定。
提供了含有核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物的多种核苷酸和核苷化合物，其包含不可断裂的终止部分和/或其可被衍生化而包含可检测的标记物(例如染料)。
在一个实施方案中，所述核碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物可通过不可断裂的终止部分与染料共价相连，所述不可断裂的终止部分可被衍生化以提高其对DNA合成的终止并因此增强其在DNA测序中的有用性。
I.标记的核苷酸和核苷化合物用于测序的优点
提供了可用在DNA测序技术中的核苷酸和核苷化合物。本发明化合物的引入效率可以为类似的天然核苷的引入效率的约70％至约100％。优选地，所述引入效率为约85％至约100％。此外，当引入本发明化合物时，核酸延伸的终止为约90％至约100％。在一个实施方案中，核苷酸和核苷化合物的终止效率为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。
II.标记的核苷酸和核苷化合物
提供了多种核苷以及其单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯化合物。所述化合物可用于测序技术。在一个实施方案中，所述核苷化合物包含可被有效检测到的荧光基团。所述核苷化合物可转化成其各自的三磷酸酯用于DNA聚合酶反应。本发明的化合物可通过下式表示：
Figure G2007800494372D00201
其中R1是H、单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，R2是H或OH，碱基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或其天然衍生物，所述不可断裂的终止部分是赋予所述化合物聚合酶终止性能的基团，连接物是双官能团，所述染料是荧光团。本发明的化合物可被设计为可用在DNA合成测序中的荧光的、稳定的不可逆终止子。
在一个实施方案中，提供了具有式I-VII结构的化合物或其可药用盐或酯或其对映体、外消旋混合物或立体异构体：
Figure G2007800494372D00211
式I                     式II
Figure G2007800494372D00212
式III                   式IV
Figure G2007800494372D00221
式V                      式VI
Figure G2007800494372D00222
式VII
其中R1＝H、单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，R2是H或OH，R3和R4各自独立地选自H、C1-C12直链或支链烷基、C2-C12直链或支链烯基或多烯基、C2-C12直链或支链炔基或多炔基、以及芳香性基团(例如苯基、萘基或吡啶环)；R5、R6和R7各自独立地选自H、OCH3、NO2、CN、卤化物、C1-C12直链或支链烷基、C2-C12直链或支链烯基或多烯基、C2-C12直链或支链炔基或多炔基、以及芳香性基团(例如苯基、萘基或吡啶环)，和/或具有下述一般结构的连接基团：
Figure G2007800494372D00231
X＝CH2、CH＝CH、C≡C、O、S或NH，Y＝CH2、O或NH，n＝0-12的整数；m＝0-12的整数，染料＝荧光团；R8和R9如上述针对R5、R6和R7所定义，前提是R8和R9不是NO2。
在一个优选实施方案中，R3和R4选自但不限于-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、异丙基、叔丁基、苯基、2-硝基苯基以及2，6-二硝基苯基。或者，R3和R4选自但不限于烷基和芳香性基团，所述烷基和芳香性基团在烷基或芳香性基团中任选地含有至少一个杂原子，并且其中所述芳香性基团可任选地是芳基(例如苯基)或者是多环基团(例如萘基)。在某些实施方案中，R5、R6、R7和R8是选自芳基和多环基团的芳香性基团。
或者，连接物可具有下述一般结构：
例如，含有这些连接物的化合物可具有下述结构：
Figure G2007800494372D00241
其中所述不可断裂的终止部分通过选自以下的键与所述碱基相连接：苄胺、苄醚、氨基甲酸酯、碳酸酯、氨基甲酸2-(邻硝基苯基)乙酯和/或碳酸2-(邻硝基苯基)乙酯。
对荧光染料没有特别限制。例如，所述荧光团可以选自但不限于BODIPY、荧光素、罗丹明、香豆素、呫吨、花青、芘、酞菁、藻胆蛋白、alexa、squarene染料、产生能量转移染料的组合、及其衍生物。
优选的实施方案包括但不限于下述化合物：
Figure G2007800494372D00251
Figure G2007800494372D00261
III.标记的核苷酸和核苷化合物的合成
本文所公开的化合物通常可如本文所公开并利用本领域中可利用的方法进行合成。例如，下述一般方案表示腺苷化合物的合成：
合成腺苷N6-修饰化合物的一般方案
Figure G2007800494372D00262
合成鸟苷O6-修饰化合物的一般方案
Figure G2007800494372D00271
合成鸟苷8-氧代-修饰化合物的一般方案
Figure G2007800494372D00281
合成尿苷5-HOMe-修饰化合物的一般方案
合成胞苷5-HOMe-修饰化合物的一般方案
Figure G2007800494372D00291
合成胞苷N4-修饰化合物的一般方案
IV.本发明化合物的使用方法
本发明公开的核苷酸和核苷化合物可在DNA测序技术中用于多个目的。与本发明化合物联合使用的聚合酶可以是天然的聚合酶或修饰的聚合酶。聚合酶包括但不限于Taq DNA聚合酶、Klenow(exo-)DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、Pfu(exo-)DNA聚合酶以及DeepVent(exo-)DNA聚合酶。修饰的聚合酶包括但不限于TaqFSDNA聚合酶、ThermoSequenase DNA聚合酶、ThermoSequenase IIDNA聚合酶、Therminator DNA聚合酶、Therminator II DNA聚合酶以及Vent(exo-)A488L DNA聚合酶。优选地，以等于或接近天然核苷酸引入水平的水平引入本发明化合物，从而不导致对本发明化合物的偏差。甚至更优选地，本发明化合物与可商购的聚合酶相容。
光可断裂的标记核苷酸和核苷
在一个实施方案中，所述化合物可用在循环可逆终止(CRT)中，其是一种检测多个模板的同步、单个碱基加成的周期性方法。较长读取长度意味着需要较少次测序试验来覆盖整个基因组。合成核酸的方法包括下述步骤：
a)将引物的5’-末端与固体表面相连接；
b)将靶核酸与所述连接到固体表面上的引物进行杂交；
c)加入下式的一种或多种化合物：
Figure G2007800494372D00311
其中R1是H、单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，R2是H或OH，碱基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤或其天然衍生物。可断裂的终止部分是赋予所述化合物聚合酶终止性能的基团，连接物是双官能团，染料是荧光团；
d)将DNA聚合酶加入到所述杂交的引物/靶核酸复合物中以将前述步骤的化合物引入到生长中的引物链中，其中所引入的化合物以约90％至约100％的效率终止聚合酶反应；
e)任选地清洗所述固体表面以除去未引入的成分；
f)检测所引入的荧光团，其中所述检测器任选地是用于使荧光染料成像的脉冲多线激发检测器(pulsed multiline excitation detector)；
g)任选地加入一种或多种化合物以给未延伸的引物永久性加帽；
h)将所述固体载体暴露于光源以除去光可断裂的部分，得到含有天然成分的延伸的引物；以及
i)清洗所述固体表面以除去所述断裂的保护基；并以循环方式重复上述步骤。
在另一个实施方案中，本发明的化合物可用在测定核酸分子序列的方法中，所述方法包括以下步骤：将靶核酸分子加入到测序仪器中；将一种或多种本发明化合物加入到所述测序仪器中；将聚合酶和任选地天然核酸成分加入到所述测序仪器中，进行聚合酶反应以将前述步骤的至少一种化合物引入到生长中的核酸链中，以及分析引入本发明至少一种化合物的聚合酶反应的结果。所述步骤可以任意顺序和任意重复次数进行。优选地，在引入步骤之后，以约90％至约100％的比率终止链生长。在另一个实施方案中，本发明化合物的引入比率是引入相似碱基的天然底物的约70％至约100％，使得不出现显著的偏差。例如，所述引入比率可以是引入相应核苷酸碱基的正常比率的约85％至约100％。一个重要的实施方案包括以下步骤：将由引入修饰的核苷酸而得到的核酸分子暴露于紫外线或其它光源以除去核酸中光可断裂的终止部分。优选地，所述光断裂步骤的效率是暴露于紫外线或其它光源的约85％至约100％。
本发明的方法可以单独实施或组合实施。例如，可将核酸分子的测序方法部分地作为将非天然成分引入到核酸分子中的方法或者在引入本发明化合物后将核酸分子中的非天然成分转化为天然成分的单独方法来实施。
在一个实施方案中，本发明的方法包括在引入未保护的3’-OH核苷酸后终止核酸合成的方面。有利地，与天然核苷酸相比较而言，可通过聚合酶以更高的水平引入未保护的3’-OH核苷酸，导致聚合酶反应中存在更低水平的修饰核苷酸和更低的偏差。因此，一个优选的实施方案包括终止核酸合成的方法，所述方法包括以下步骤：将3’-OH未保护的核苷酸或核苷置于聚合酶环境中，使得可将3’-OH未保护的核苷酸或核苷引入核酸分子中，其中所述3’-OH未保护的核苷酸或核苷是具有下式的化合物：
Figure G2007800494372D00331
其中R1是H、单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，R2是H或OH，碱基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤或其天然衍生物，可断裂的终止部分是赋予所述化合物聚合酶终止性能的基团，连接物是双官能团，染料是荧光团。优选地，当引入所述3’-OH未保护的核苷酸或核苷时，所述方法的终止效率为约90％至约100％。或者，与具有相同碱基的天然核苷酸或核苷的引入效率相比较而言，所述方法引入3’-OH未保护的核苷酸或核苷的效率为约70％至约100％。
可将所述核苷酸和核苷化合物用于CRT以直接从基因组DNA中进行读取。片段基因组DNA可与含有横跨所选染色体的引发位点的高密度寡核苷酸芯片进行杂交。通过CRT法的所评估的读取长度来分离每个引发序列。在碱基加成之间，荧光成像仪(例如脉冲多线激发(PME)检测器)可同时对整个高密度芯片成像，评价在速度和灵敏度方面的提高。通过紫外线或其它光照射除去与所述碱基上可断裂的终止基团相连的荧光团，从而将所述修饰的核苷酸转为其天然形式用于下一轮的碱基加成。然后在大约500个CRT循环后，可将所述完全的且不间断的基因组序列信息与参比人基因组相比较以确认单个样品中序列变异的程度和类型。本领域中已经开发了用于循环可逆终止的方法并且可按例如WO2003/021212中所述进行使用，WO2003/021212的公开内容在此通过引用并入本文。
在一个实施方案中，使用了在聚合酶反应中于核苷酸类似物被引入到生长中的DNA链中之后通过检测核苷酸类似物的身份来进行核酸测序的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)将核酸的5’-末端与固体表面相连接；
(b)将引物与所述已连接到固体表面上的核酸相连接；
(c)将聚合酶和一种或多种不同的核苷三磷酸化合物加入到所述核酸中，其中引入所述核苷三磷酸化合物，然后终止聚合酶反应，其中各核苷三磷酸化合物包含选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶及其类似物的碱基和与所述碱基相连接的光可断裂的终止基团以及脱氧核糖或核糖，所述光可断裂基团含有可检测标记物；
(d)任选地清洗所述固体表面以除去未引入的核苷类似物；
(e)例如利用PME检测并从而确定与所述终止的核苷三磷酸相连的可检测标记物，例如荧光染料或报告物分子；
(f)任选地加入一种或多种化合物，以给与所述核酸相连的引物上任意未反应的-OH永久性加帽，或者给通过将一种或多种核苷酸添加到所述引物上而形成的引物延伸链上的任意未反应的-OH永久性加帽；
(g)将所述固体表面暴露于光源以除去含有独特标记物或报告物分子的光可断裂保护基，其中余下的所引入核苷单磷酸单元与天然、未加工的或未修饰的核酸分子相类似；
(h)清洗所述固体表面以除去所述断裂的保护基；以及
(g)重复步骤(c)至(h)用于检测确定被引入到生长中的引物链中的被鉴定核苷酸类似物的序列。
标记的核苷酸和核苷
在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括测定靶核酸序列的方法，所述方法包括(i)将靶核酸加入到Sanger或Sanger型测序仪器中，(ii)将一种或多种本发明化合物加入到所述测序仪器中，前提是在存在一种以上类型的碱基的情况下，各碱基与不同的荧光团相连接；(iii)加入互补引物和聚合酶；(iv)进行聚合酶反应以将步骤(ii)的至少一种化合物引入到生长中的核酸链中，以及(v)利用荧光测序仪器或通过脉冲多线激发荧光来分析Sanger测序反应的结果，其中步骤(i)-(iii)可以任意顺序进行。
在一个优选的实施方案中，在步骤(iv)的引入至少一种化合物之后，以约90％至约100％的效率终止链生长。或者，步骤(iv)的引入至少一种化合物的效率是聚合酶反应中引入含有相同碱基的天然底物的约70％至约100％，或更优选约85％至约100％。
本发明的方法还包括将非天然成分引入到核酸中的方法，所述方法包括：(i)将靶核酸加入到测序仪器中，(ii)将一种或多种本发明化合物加入到所述测序仪器中，前提是在存在一种以上类型碱基的情况下，各碱基与不同的荧光团相连接；(iii)加入聚合酶；以及(iv)进行聚合酶反应以将步骤(ii)的至少一种化合物引入到生长中的核酸链中，其中步骤(i)-(iii)可以任意顺序进行。所述方法还可包括(v)分析用于步骤(ii)的引入至少一种化合物的聚合酶链反应的结果。
本发明的一个替代性实施方案是终止核酸合成的方法，所述方法包括以下步骤：将本发明的3’-OH未保护的核苷酸或核苷置于聚合酶环境中，使得可将所述3’-OH未保护的核苷酸或核苷引入到核酸中。所述方法的优选实施方案是当引入所述3’-OH未保护的核苷酸或核苷时具有约90％至约100％的终止效率；其中所述3’-OH未保护的核苷酸或核苷的引入效率与具有相同碱基的天然核苷酸或核苷的引入效率相比而言为约70％至约100％。
本发明还包括进行Sanger或Sanger型测序的方法，所述方法包括将本发明化合物加入到Sanger或Sanger型测序方法中。一种包括将本发明化合物加入到微测序或微测序型测序方法中而进行微测序或微测序型测序的方法在本发明的范围内。
PME检测器
在一个使用任一种前述标记的和/或光可断裂的核苷和核苷酸的实施方案中，如2003年3月27日公开的US 2003/0058440或2003年3月13日公开的WO 2003/021212中所述，可以使用用于色盲荧光检测的脉冲多线激发(“PME”)。该技术提供了荧光检测用于信息性SNP的高通量鉴别，用于更准确地诊断遗传病、更好地预测风险易感性或识别组织中的偶发性突变。所述PME技术具有两个显著提高荧光灵敏度的主要优点：(1)基因组分析中所有荧光团的最佳激发和(2)“色盲”检测，其收集比标准波长分辨检测(standard wavelength resolved detection)显著更多的光。该技术与用于DNA序列鉴别的特征在于单一源激发和色散的DNA测序仪器显著不同。所述技术可用在临床诊断学、法医学和一般测序法中并且具有针对大部分种群的靶序列变异进行分析的能力、适应性和可移动性。
在一个实施方案中，使用用于高通量DNA序列鉴别的仪器和方法。使用用于分析含有一种或多种荧光物的样品的脉冲多线激发仪器，其包括：被配置而发射两条或更多条激发线的一个或多个激光器，每条激发线具有不同的波长；与一个或多个激光器相连的定时电路，所述定时电路被配置成根据定时程序依次形成两条或更多条激发线以从样品中产生与时间相关的荧光发射信号；所布置的非色散检测器(non-dispersivedetector)，以收集样品发射的与时间相关的荧光发射信号；以及分析仪，所述分析仪与检测器相连接并被配置成将与时间相关的荧光发射信号与定时程序相关联以鉴定样品成分。
所述检测器和所述分析仪可以是一体的。在一个实施方案中，所述两条或更多条激发线在样品中相互交叉，或所述两条或更多条激发线可被配置成使得它们不在样品中相互交叉。所述两条或更多条激发线可以是同轴的。在一个实施方案中，所述仪器还可包含与所述一个或多个激光器配合操作的一个或多个棱镜的装置，其被配置成使得发射基本上同线和/或同轴的两条或更多条激发线。所述仪器可具有多条激发线，例如分别具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多个激发波长的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多条激发线。所述样品可被包含在多种容器例如毛细管中，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、多达20、多达24、多达28、多达36、多达48、多达64、多达96、多达384或更多个毛细管中。可以使用鞘流池。
所述定时程序可包括每个激光器点火之间的约10飞秒至约5秒、约1毫秒至约100毫秒、或约50皮秒至约500皮秒的延迟。脉冲产生一条或多条激发线。所述脉冲激发线可通过TTL逻辑装置或机械装置或电子装置来控制。在一个实施方案中，所述仪器可产生一序列离散的激发线，所述激发线与来自样品的荧光发射信号是时间相关的。所述激光器可独立地包含二极管激光器、半导体激光器、气体激光器(例如氩离子、氪或氦-氖激光器)、二极管激光器、固态激光器(例如包含离子增益介质(例如YAG和钒酸钇(YV04)的钕激光器)，或者二极管泵浦固态激光器。还可使用其它在一个或多个离散的激发波长下发光的装置代替所述激光器。所述激光器还可包括与至少一个激光束配合操作的拉曼转换器。在本发明的一个实施方案中，各激光器提供的激发波长任选地与各荧光团的吸收波长相匹配。
所述检测器可包括电偶装置、光电倍增管、硅雪崩光电二极管或硅PIN检测器。装置的占地面积优选小(例如小于4英尺×4英尺×2英尺，小于1英尺×1英尺×2英尺)，并且可以制成1英寸×3英寸×6英寸一样小。另一方面包括鉴定样品成分的方法，所述方法包括：(a)制备含有样品成分、第一染料和第二染料的样品；(b)将所述样品置于第一激发线和第二激发线的光路中；(c)依次对所述第一激发线和所述第二激发线点火；(d)收集作为时间函数的样品荧光信号；以及(e)通过每条激发线的在线窗(其中样品成分被鉴定)将荧光分类。本发明的一个方面是从离散的时间段中收集荧光信号，在所述离散的时间段中没有与样品相关的激发线，并且所述时间段存在于两条激发线点火之间。该技术称为“黑暗中观察”。另一个方面是所述第一染料的最大吸收值基本上与所述第一激发线的激发波长相对应。所述第二染料的最大吸收值基本上与所述第二激发线的激发波长相对应。在又一个方面中，存在第三和第四染料以及第三和第四激发线，其中所述第三和第四染料的最大吸收值分别基本上与所述第三和第四激发线的激发波长相对应。类似地，可存在5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多种染料，其中所述染料的最大吸收值分别基本上与第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16或第更多条激发线的激发波长相对应。所述染料可以是呫吨(zanthene)、荧光素、罗丹明、BODIPY、花青、香豆素、芘、酞菁、藻胆蛋白、alexa、squarene染料或某些其它合适的染料。
在一个实施方案中，样品成分能进行SNP的测定。所述方法可用于信息性SNP的高通量鉴定。所述SNP可直接从基因组DNA物质、PCR扩增物质或克隆DNA物质中得到，并且可利用单核苷酸引物延伸法进行分析。所述单核苷酸引物延伸法可包括利用单一的未标记dNTP、单一的标记dNTP、单一的3’-修饰的dNTP、单一的碱基修饰的3’-dNTP、单一的α-硫代dNTP或单一标记的2’，3’-二脱氧核苷酸。微测序法可包括利用单一的未标记dNTP、单一的标记dNTP、单一的3’-修饰的dNTP、单一的碱基修饰的3’-dNTP、单一的α-硫代dNTP或单一标记的2’，3’-二脱氧核苷酸。所述SNP可直接从基因组DNA物质、PCR扩增物质或克隆DNA物质中得到。还预见到用于检测核酸的方法。可以原位或利用用于检测核酸的多种凝胶、印迹和相似方法(例如美国专利7,125,660中所公开的，在此通过引用并入本文)来检测核酸。
实施例
光可断裂的标记核苷酸和核苷
实施例1：dA化合物
3’-O-(2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷三磷酸(WW1p108)的合成
方案.3’-O-(2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、DMF，室温，过夜；Boc2O、DMAP、DMF，室温，过夜，83％；(ii)n-Bu4NF、THF、0℃，然后逐渐升至室温，96％；(iii)TBSCl、咪唑、DMF，83％；(iv)n-Bu4NOH、NaI、NaOH、CH2Cl2/H2O、2-硝基苄基溴，室温，91％；(v)SiO2、高真空，70-80℃，24小时，91％；(vi)n-Bu4NF、THF、0℃，然后逐渐升至室温，23％；(vii)POCl3、(MeO)3PO、零下20℃；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF；1M HNEt3HCO3，31％。
N6，N6-双-叔丁氧羰基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷(dA.01)
根据Furrer和Giese(Furrer，E.and Giese，B.(2003)On thedistance-independent hole transfer over long(A·T)n-sequences in DNA.Helvetica Chimica Acta，86，3623-3632)所述步骤合成化合物dA.01。室温下将2’-脱氧腺苷dA(2.5g，10mmol)、咪唑(4.5g，66mmol)和TBSCl(4.82g，32mmol)在无水DMF(25mL)中的溶液搅拌过夜。加入甲醇(20mL)，搅拌混合物20分钟，然后在真空下浓缩。将残留物溶解在无水DMF(15mL)中，然后加入DMAP(3.66g，30mmol)和Boc2O(6.55g，30mmol)。室温下搅拌反应过夜，然后在真空下浓缩。将残留物溶液在CH2Cl2(100mL)中，利用饱和NH4Cl溶液清洗两次(每次50mL)。利用CH2Cl2(50mL)萃取合并的水层。然后利用Na2SO4干燥合并的有机层，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫的N6，N6-双-叔丁氧羰基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷dA.01(5.66g，83％)。
N6，N6-双-叔丁氧羰基-2’-脱氧腺苷(dA.02)
0℃下将Bu4NF(7.85g，30mmol)在THF(30mL)中的溶液加入到化合物dA.01(6.78g，10mmol)在THF(30mL)中的溶液中。将反应混合物逐渐升至室温，搅拌2小时，然后在真空下浓缩。将残留物溶解在CH2Cl2(100mL)中，利用饱和NH4Cl溶液清洗两次(每次100mL)。利用Na2SO4干燥有机层，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫的N6，N6-双-叔丁氧羰基-2’-脱氧腺苷dA.02(4.34g，96％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.84(s，1H，H-8)，8.20(s，1H，H-2)，6.41(dd，1H，J＝5.6Hz和9.2Hz，H-1’)，4.77(d，1H，H-4’)，4.21(s，1H，H-3’)，3.98(dd，1H，H-5’a)，3.80(m，1H，H-5’b)，3.00(m，1H，H-2’a)，2.36(m，1H，H-2’b)，1.47(s，18H，(CH3)3CO).
N6，N6-双-叔丁氧羰基-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷(dA.03)
0℃下将TBSCl(1.88g，12.5mmol)在无水DMF(5mL)中的溶液加入到化合物dA.02(4.34g，9.6mmol)和咪唑(1.3g，19.2mmol)在无水DMF(20mL)中的溶液中。将反应混合物逐渐升至室温，搅拌2天。加水(50mL)，利用乙酸乙酯萃取混合物3次(每次40mL)，利用饱和NH4Cl溶液(50mL)清洗合并的有机层，利用Na2SO4干燥，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫的N6，N6-双-叔丁氧羰基-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷(dA.03)(4.68g，83％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.84(s，1H，H-8)，8.42(s，1H，H-2)，6.57(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，4.69(m，1H，H-4’)，4.10(m，1H，H-3’)，3.89(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.70(m，1H，H-2’a)，2.58(m，1H，H-2’b)，1.44(s，18H，(CH3)3CO)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.10(s，6H，(CH3)2Si).
N6，N6-双-叔丁氧羰基-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-(2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷(dA.04)
将化合物dA.03(1.13g，2mmol)在CH2Cl2(3mL)中的溶液与n-Bu4NOH(0.94mL，4mmol，55％水溶液)和NaI(20mg，催化量)在NaOH(1M；3mL)中的溶液相混合。逐滴将2-硝基苄基溴(1.3g，6mmol)在CH2Cl2(2mL)中的溶液加入到所述混合物中，室温下于黑暗中搅拌反应混合物2小时。分离有机层，利用CH2Cl2萃取水层2次(每次10mL)。利用Na2SO4干燥合并的有机层，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫的N6，N6-双-叔丁氧羰基-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-(2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷dA.04(1.28g，91％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.85(s，1H，H-8)，8.43(s，1H，H-2)，8.10(dd，1H，Ph-H)，7.81(d，1H，Ph-H)，7.70(t，1H，Ph-H)，7.51(t，1H，Ph-H)，6.57(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，4.98(dd，2H，PhCH2)，4.45(m，1H，H-4’)，4.33(m，1H，H-3’)，3.90(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.73(m，2H，H-2’a和H-2’b)，1.46(s，18H，(CH3)3CO)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(s，6H，(CH3)2Si)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C33H49N6O9Si[M+H]+而言，计算质量为701.3330，实测质量为701.3317。
5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-(2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷(dA.05)
将硅胶60(10g，100-200目，通过在减压下加热至70-80℃24小时活化)加入到化合物dA.04(1.28g，1.8mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液中，将混合物在真空下蒸干。将所得残留物在减压下加热至70-80℃2天，利用甲醇清洗3次(每次50mL)，利用布氏漏斗过滤。在真空下浓缩合并的滤液，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫的5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-(2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷dA.05(0.83g，91％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.34(s，1H，H-8)，8.15(s，1H，H-2)，8.09(d，1H，Ph-H)，7.81(d，1H，Ph-H)，7.67(t，1H，Ph-H)，7.47(t，1H，Ph-H)，6.50(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，6.03(bs，2H，6-NH2)，4.96(dd，2H，PhCH2)，4.43(m，1H，H-4’)，4.30(m，1H，H-3’)，3.88(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.71(m，2H，H-2’a和H-2’b)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.10(s，6H，(CH3)2Si)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C23H33N6O5Si[M+H]+而言，计算质量为501.2282，实测质量为501.1702。
3’-O-(2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷(dA.06)
0℃下将n-Bu4NF(314mg，1.2mmol)在THF(1.2mL)中的溶液加入到化合物dA.05(400mg，0.8mmol)在THF(3mL)中的溶液中。将反应混合物逐渐升至室温，搅拌4小时。加入甲醇(10mL)以溶解反应过程中形成的沉淀，然后加入硅胶60(1.5g)。将混合物在真空下蒸干，通过硅胶柱色谱纯化残留物，得到白色泡沫的3’-O-(2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷dA.06(72mg，23％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.35(s，1H，H-8)，8.13(s，1H，H-2)，8.06(d，1H，Ph-H)，7.79(m，2H，Ph-H)，7.60(m，1H，Ph-H)，7.34(bs，2H，6-NH2，与D2O可交换)，6.33(dd，1H，J＝4.8和6.8Hz，H-1’)，5.40(t，1H，与D2O可交换，5’-OH))，4.92(s，2H，PhCH2)，4.36(m，1H，H-4’)，4.12(m，1H，H-3’)，3.59(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.85(m，1H，H-2’a)，2.54(m，1H，H-2’b)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C17H19N6O5[M+H]+而言，计算质量为387.1417，实测质量为387.1350。
3’-O-(2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(WW1p108)
将POCl3(26μL，0.24mmol)加入到化合物dA.06(72mg，0.18mmol)在磷酸三甲酯(1mL)中的溶液中，并在零下20-30℃保持2.5小时。加入双-三-正丁胺焦磷酸盐(427mg，0.9mmol)和三正丁胺(0.2mL)在无水DMF(2mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后冷冻至干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在300分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分，冷冻干燥得到白色蓬松固体的3’-O-(2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸WW1p108(38mg，31％)。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.50(s，1H，H-8)，8.24(s，1H，H-2)，8.10(d，1H，Ph-H)，7.78(d，1H，Ph-H)，7.62(m，1H，Ph-H)，6.50(dd，1H，J＝6.8和8Hz，H-1’)，5.03(dd，2H，Ph-CH2)，4.65(m，1H，H-4’)，4.53(m，1H，H-3’)，4.22(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.80(m，2H，H-2’a和H-2’b)；
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.54(d，J＝19.4Hz)，-10.85(d，J＝19.4Hz)，-21.31(t，J＝19.4Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C17H21N6O14P3Na[M+Na]+而言，计算质量为649.0226，实测质量为649.0212。
利用不带紫外检测的制备HPLC进一步纯化所述三磷酸酯，得到不含天然核苷酸杂质(例如dATP)的样品。通过UV/VIS测量利用ε260＝20,800的消光系数进行所述三磷酸酯溶液浓度的测定。
N6-(2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(WW1p129)的合成
方案.N6-(2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸的合成。(i)Mg(ClO4)2、THF，50℃，68％；(ii)NaH、DMF、2-硝基苄基溴，0℃，然后逐渐升至室温，49％；(iii)SiO2，真空，70-80℃，87％；(iv)n-Bu4NF、THF，43％；(v)POCl3、(MeO)3PO，零下20-30℃；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF；1MHNEt3HCO3；60％。
N6-叔丁氧羰基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷(dA.07)
将Mg(ClO4)2(155mg，0.7mmol)加入到化合物dA.01(2.36g，3.5mmol)在无水THF(35mL)中的溶液中，在50℃搅拌过夜。在真空下除去溶剂，通过硅胶柱色谱纯化粗产物，得到黄色泡沫状的N6-叔丁氧羰基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷dA.07(1.39g，68％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.74(s，1H，H-8)，8.29(s，1H，H-2)，8.24(s，1H，6-NHBoc)，6.49(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，4.60(m，1H，H-4’)，4.02(m，1H，H-3’)，3.86(dd，1H，H-5’a)，3.77(dd，1H，H-5’b)，2.62(m，1H，H-2’a)，2.47(m，1H，H-2’b)，1.54(s，9H，(CH3)3CO)，0.90(s，18H，(CH3)3CSi)，0.08(2s，12H，(CH3)2Si).
N6-叔丁氧羰基-N6-(2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷(dA.08)
在0℃下将NaH(5.3mg，0.22mmol，干燥的)加入到化合物dA.07(116mg，0.2mmol)在无水DMF(2mL)中的溶液中，搅拌30分钟。逐滴加入2-硝基苄基溴(43mg.0.2mmol)在无水DMF(0.5mL)中的溶液。将混合物逐渐升至室温并搅拌2小时。在真空下除去DMF，将残留物溶解在乙酸乙酯(20mL)中，利用饱和NH4Cl溶液清洗2次(每次10mL)，用水清洗1次(10mL)。利用乙酸乙酯(10mL)萃取合并的水层，利用Na2SO4干燥合并的有机层，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到粘性油状的N6-叔丁氧羰基-N6-(2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷dA.08(70mg，49％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.69(s，1H，H-8)，8.38(s，1H，H-2)，8.05(dd，1H，Ph-H)，7.77(d，1H，Ph-H)，7.56(m，1H，Ph-H)，7.40(m，1H，Ph-H)，6.51(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.63(s，2H，Ph-CH2)，4.63(m，1H，H-4’)，4.03(m，1H，H-3’)，3.87(m，1H，H-5’a)，3.78(m，1H，H-5’b)，2.63(m，1H，H-2’a)，2.46(m，1H，H-2’b)，1.40(s，9H，(CH3)3CO)，0.92(s，18H，(CH3)3CSi)，0.10(2s，12H，(CH3)2Si-)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C34H55N6O7Si2[M+H]+而言，计算质量为715.3671，实测质量为715.3661。
N6-(2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷(dA.09)
将硅胶60(3.5g，100-200目，通过在减压下加热至70-80℃24小时活化)加入到化合物dA.08(325mg，0.45mmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液中，将混合物在真空下蒸干。将所得残留物减压下加热至70-80℃2天，利用甲醇清洗3次(每次20mL)，利用布氏漏斗过滤。在真空下浓缩合并的滤液，通过硅胶柱色谱纯化，得到黄色泡沫状的N6-(2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷dA.09(238mg，86％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.37(s，1H，H-8)，8.09(s，1H，H-2)，8.07(d，1H，Ph-H)，7.74(d，1H，Ph-H)，7.56(m，1H，Ph-H)，7.42(m，1H，Ph-H)，6.57(t，1H，6-NH)，6.44(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.19(bs，2H，Ph-CH2)，4.61(m，1H，H-4’)，4.00(m，1H，H-3’)，3.86(dd，1H，H-5’a)，3.76(dd，1H，H-5’b)，2.63(m，1H，H-2’a)，2.43(m，1H，H-2’b)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.09(2s，12H，(CH3)2Si-)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C29H47N6O5Si2[M+H]+而言，计算质量为615.3147，实测质量为615.2288。
N6-(2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷(dA.10)
在0℃下将n-Bu4NF(216mg，0.83mmol)在THF(1mL)中的溶液加入到化合物dA.09(202mg，0.33mmol)在THF(5mL)中的溶液中。将反应混合物逐渐升至室温并搅拌2小时。加入硅胶60(1.5g)。将混合物在真空下蒸干。将残留物通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫状的N6-(2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷dA.10(55mg，43％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.48(br s，1H，与D2O可交换，6-NH)，8.41(s，1H，H-8)，8.16(s，1H，H-2)，8.04(dd，1H，Ph-H)，7.66(d，1H，Ph-H)，7.51(m，2H，Ph-H)，6.35(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.32(d，1H，与D2O可交换，3’-OH)，5.17(t，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.97(bs，2H，Ph-CH2)，4.41(m，1H，H-4’)，3.87(m，1H，H-3’)，3.60(m，1H，H-5’a)，3.52(m，1H，H-5’b)，2.71(m，1H，H-2’a)，2.28(m，1H，H-2’b)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C17H19N6O5[M+H]+而言，计算质量为387.1417，实测质量为387.1186。
N6-(2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(WW1p129)
将POCl3(19μL，0.2mmol)加入到化合物dA.10(52mg，0.13mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，并保持在零下20-30℃2.5小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(308mg，0.65mmol)和三正丁胺(130μL)在无水DMF(1.3mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后冷干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在300分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的N6-(2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸WW1p129(53mg，60％)。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.42(s，1H，H-8)，8.13(s，1H，H-2)，8.09(d，1H，Ph-H)，7.55(m，2H，Ph-H)，7.45(m，1H，Ph-H)，6.46(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.05(bs，2H，Ph-CH2)，4.29(s，1H，H-3’)，4.21(m，2H，H-5’a and H-5’b)，2.78(m，1H，H-2’a)，2.59(m，1H，H-2’b)；
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.86(d，J＝16.2Hz)，-10.78(d，J＝16.2Hz)，-19.22(t，J＝16.2Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C17H22N6O14P3[M-H]-而言，计算质量为625.0250，实测质量为625.0231。
利用不带紫外检测的制备HPLC进一步纯化所述三磷酸酯，得到不含天然核苷酸杂质的样品。通过UV/VIS测量利用ε260＝20,800的消光系数进行三磷酸酯溶液浓度的测定。
N6-(4-甲氧基-2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷三磷酸(WW2p005)的合成
Figure G2007800494372D00471
方案.N6-(4-甲氧基-2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸的合成。(i)NaH、DMF、4-甲氧基-2-硝基苄基溴，0℃，然后逐渐升至室温，64％；(ii)SiO2，高真空，70-80℃，24小时，84％；(iii)n-Bu4NF、THF，99％；(iv)POCl3、(MeO)3PO，零下20-30℃；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N，DMF；1M HNEt3HCO3；40％。
N6-叔丁氧羰基-N6-(4-甲氧基-2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷(dA.11)
在0℃下将NaH(26mg，1.1mmol，干燥的)加入到化合物dA.07(580mg，1.0mmol)在无水DMF(5mL)中的溶液中，搅拌45分钟。逐滴加入4-甲氧基-2-硝基苄基溴(260mg.1.05mmol)在无水DMF(1.0mL)中的溶液。将混合物逐渐温热至室温，搅拌过夜。在真空下除去DMF，将残留物溶解在乙酸乙酯(50mL)中，利用饱和NH4Cl溶液清洗2次(每次30mL)。利用乙酸乙酯(20mL)萃取合并的水层，利用Na2SO4干燥合并的有机层，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到粘性油状的N6-叔丁氧羰基-N6-(4-甲氧基-2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷dA.11(480mg，64％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.68(s，1H，H-8)，8.37(s，1H，H-2)，7.66(d，1H，J＝8.7Hz，Ph-H)，7.55(d，1H，J＝2.7Hz，Ph-H)，7.10(dd，1H，J＝2.7和8.7Hz，Ph-H)，6.51(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.55(s，2H，Ph-CH2)，4.63(m，1H，H-4’)，4.03(m，1H，H-3’)，3.87(m，1H，H-5’a)，3.84(s，3H，OCH3)，3.78(m，1H，H-5’b)，2.63(m，1H，H-2’a)，2.44(m，1H，H-2’b)，1.41(s，9H，(CH3)3CO)，0.92(s，18H，(CH3)3CSi)，0.10(2s，12H，(CH3)2Si-)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C35H57N6O8Si2[M+H]+而言，计算质量为745.3776，实测质量为745.3782。
N6-(4-甲氧基-2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷(dA.12)
将硅胶60(5g，100-200目，通过在减压下加热至70-80℃24小时活化)加入到化合物dA.11(530mg，0.71mmol)在CH2Cl2(30mL)中的溶液中，将混合物在真空下蒸干。将所得残留物于减压下加热至70-80℃2天，利用甲醇清洗3次(每次20mL)，利用布氏漏斗过滤。在真空下浓缩合并的滤液，通过硅胶柱色谱纯化，得到黄色泡沫状的N6-(4-甲氧基-2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷dA.12(385mg，84％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.37(s，1H，H-8)，8.08(s，1H，H-2)，7.66(d，1H，J＝8.5Hz，Ph-H)，7.57(m，1H，J＝2.7Hz Ph-H)，7.09(dd，1H，J＝2.7和8.7Hz Ph-H)，6.52(t，1H，6-NH)，6.43(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.07(bs，2H，Ph-CH2)，4.60(m，1H，H-4’)，4.00(m，1H，H-3’)，3.87(m，1H，H-5’a)，3.85(s，3H，OCH3)，3.76(dd，1H，H-5’b)，2.62(m，1H，H-2’a)，2.43(m，1H，H-2’b)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.09(2s，12H，(CH3)2Si-)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C30H48N6O6Si2[M+H]+而言，计算质量为645.3252，实测质量为645.3248。
N6-(4-甲氧基-2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷(dA.13)
在0℃下将n-Bu4NF(353mg，1.35mmol)在THF(2mL)中的溶液加入到化合物dA.12(350mg，0.54mmol)在THF(5mL)中的溶液中。将反应混合物逐渐温热至室温，搅拌4小时。加入硅胶60(1.5g)。将混合物在真空下蒸干，通过硅胶柱色谱纯化残留物，得到黄色泡沫状的N6-(4-甲氧基-2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷dA.13(225mg，99％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.40(bs，1H，与D2O可交换，6-NH)，8.39(s，1H，H-8)，8.15(s，1H，H-2)，7.54(d，1H，J＝2.7Hz，Ph-H)，7.44(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.24(d，1H，J＝2.7和8.7Hz，Ph-H)，6.33(t，1H，J＝6.7Hz，H-1’)，5.32(d，1H，与D2O可交换，3’-OH)，5.17(t，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.88(bs，2H，Ph-CH2)，4.40(m，1H，H-4’)，3.87(m，1H，H-3’)，3.81(s，3H，OCH3)，3.60(m，1H，H-5’a)，
3.52(m，1H，H-5’b)，2.70(m，1H，H-2’a)，2.26(m，1H，H-2’b)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C18H21N6O6[M+H]+而言，计算质量为417.1523，实测质量为417.1458。
N6-(4-甲氧基-2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(WW2p005)
将POCl3(19μL，0.2mmol)加入到化合物dA.13(42mg，0.1mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，并保持在零下20-30℃3小时。加入双-三正丁铵焦磷酸盐(237mg，0.5mmol)和三正丁胺(100μL)在无水DMF(1mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在300分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的N6-(4-甲氧基-2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸WW2p005(28mg，40％)。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.41(s，1H，H-8)，8.17(s，1H，H-2)，7.64(d，1H，J＝2.7Hz，Ph-H)，7.47(d，1H，J＝8.7Hz，Ph-H)，7.15(d，1H，J＝2.7和8.7Hz，Ph-H)，6.46(t，1H，J＝6.7Hz，H-1’)，4.97(bs，2H，Ph-CH2)，4.29(s，1H，H-3’)，4.20(m，2H，H-5’a和H-5’b)，3.84(s，3H，OCH3)，2.80(m，1H，H-2’a)，2.60(m，1H，H-2’b)；
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.97(d，J＝19.9Hz)，-11.07(d，J＝19.3Hz)，-21.76(t，J＝19.3Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C18H21N6O15P3Na[M-2H+Na]-而言，计算质量为677.0175，实测质量为677.0197。
利用不带紫外检测的制备HPLC进一步纯化所述三磷酸酯，得到不含天然核苷酸杂质的样品。通过UV/VIS测量利用ε260＝20,800的消光系数进行三磷酸酯溶液浓度的测定。
6-FAM标记的N6-[(4-(3-氨基-1-丙基)-2-硝基苄基)]-2’-脱氧腺苷三磷酸(WW2p055)的合成
Figure G2007800494372D00511
方案.6-FAM标记的N6-(4-(3-氨基-1-丙基)-2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷三磷酸的合成。(i)NaH、DMF、4-碘-2-硝基苄基溴，0℃，然后逐渐温热至室温，61％；(ii)PdCl2(PPh3)2、CuI、Et3N、THF，回流，94％；(iii)SiO2，真空，70-80℃，82％；(iv)n-Bu4NF、THF、0℃，然后逐渐温热至室温，33％；(v)POCl3，质子海绵体(proton sponge)，(MeO)3PO，零下20-30℃，2小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N，DMF，2分钟；1M HNEt3HCO3，1小时；NH4OH，1小时；72％；(vi)6-FAM-SE，0.1M NaHCO3/Na2CO3，pH 9.2。
N6-叔丁氧羰基-N6-(4-碘-2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷(dA.14)
在0℃下将NaH(40mg，1.66mmol，干燥的)加入到化合物dA.07(875mg，1.51mmol)在无水DMF(10mL)中的溶液中，搅拌45分钟。逐滴加入4-碘-2-硝基苄基溴(516mg.1.51mmol)在无水DMF(2mL)中的溶液。将混合物逐渐温热至室温，搅拌4小时。在真空下除去DMF，将残留物溶解在乙酸乙酯(50mL)中，利用饱和NH4Cl溶液(30mL)清洗，利用水清洗2次(每次30mL)。利用乙酸乙酯(20mL)萃取合并的水层，利用Na2SO4干燥合并的有机层，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫状的N6-叔丁氧羰基-N6-(4-碘-2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷dA.14(777mg，61％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.66(s，1H，H-8)，8.38(s，1H，H-2)，8.34(d，1H，J＝1.1Hz，Ph-H)，7.85(dd，1H，J＝1.1和8.3Hz，Ph-H)，7.50(d，1H，J＝8.3Hz，Ph-H)，6.50(t，1H，J＝6.3Hz，H-1’)，5.54(s，2H，Ph-CH2)，4.63(m，1H，H-3’)，4.03(m，1H，H-4’)，3.87(m，1H，H-5’a)，3.78(m，1H，H-5’b)，2.62(m，1H，H-2’a)，2.46(m，1H，H-2’b)，1.41(s，9H，(CH3)3CO)，0.92(s，18H，(CH3)3CS)，0.10(2s，12H，(CH3)2Si).
N6-叔丁氧羰基-N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷(dA.15)
在N2气氛下，将化合物dA.14(730mg，0.87mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(183mg，1.2mmol)、CuI(33mg，0.17mmol)，双(三苯基膦)氯化钯(II)(61mg，0.087mmol)和Et3N(1.6mL，11.57mmol)在无水THF(7.5mL)中的混合物于黑暗中回流6小时。在真空下浓缩混合物，通过硅胶柱色谱纯化残留物，得到黄色泡沫状的N6-叔丁氧羰基-N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷dA.15(706mg，94％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.67(s，1H，H-8)，8.39(s，1H，H-2)，8.06(d，1H，J＝1.5Hz，Ph-H)，7.73(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.56(dd，1H，J＝1.5和8.2Hz，Ph-H)，7.28(br s，1H，NH)，6.51(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.59(s，2H，Ph-CH2)，4.63(m，1H，H-3’)，4.37(m，2H，CH2)，4.03(m，1H，H-4’)，3.87(m，1H，H-5’a)，3.78(m，1H，H-5’b)，2.63(m，1H，H-2’a)，2.48(m，1H，H-2’b)，1.40(s，9H，(CH3)3CO)，0.92(s，18H，(CH3)3CSi)，0.10(2s，12H，(CH3)2Si-).
N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷(dA.16)
将硅胶60(3.5g，100-200目，通过在减压下加热至70-80℃24小时活化)加入到化合物dA.15(507mg，0.59mmol)在CH2Cl2(30mL)中的溶液中，将混合物在真空下蒸干。将所得残留物于减压加热至70-80℃42小时，利用甲醇清洗3次(每次20mL)，利用布氏漏斗过滤。在真空下浓缩合并的滤液，通过硅胶柱色谱纯化，得到黄色泡沫状的N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷dA.16(366mg，82％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.35(s，1H，H-8)，8.12(s，1H，H-2)，8.05(d，1H，J＝1.3Hz，Ph-H)，7.66(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.48(dd，1H，J＝1.3和8.0Hz，Ph-H)，7.20(bs，1H，NH)，6.54(t，1H，NH)，6.44(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.16(bs，2H，Ph-CH2)，4.61(m，1H，H-4’)，4.39(d，2H，CH2)，4.00(m，1H，H-3’)，3.87(m，1H，H-5’a)，3.78(m，1H，H-5’b)，2.62(m，1H，H-2’a)，2.44(m，1H，H-2’b)，1.40(s，9H，(CH3)3CO)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.09(2s，12H，(CH3)2Si-).
N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-2’-脱氧腺苷(dA.17)
在0℃下将n-Bu4NF(282mg，1.08mmol)在THF(2mL)中的溶液加入到化合物dA.16(330mg，0.43mmol)在THF(5mL)中的溶液中。将反应混合物逐渐温热至室温，搅拌2小时。加入甲醇(5mL)和硅胶60(2g)，将混合物在真空下蒸干。通过硅胶柱色谱纯化残留物，得到白色泡沫状的N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-2’-脱氧腺苷dA.17(75mg，33％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.08(t，1H，与D2O可交换，NH)，8.50(brs，1H，与D2O可交换，NH)，8.42(s，1H，H-8)，8.16(s，1H，H-2)，8.06(d，1H，J＝1.6Hz，Ph-H)，7.71(dd，1H，J＝1.6和8.1Hz，Ph-H)，7.51(m，1H，Ph-H)，6.35(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.30(d，1H，与D2O可交换，3’-OH)，5.13(br s，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.96(br s，2H，Ph-CH2)，4.41(m，1H，H-4’)，4.29(d，2H，CH2)，3.87(m，1H，H-3’)，3.60(m，1H，H-5’a)，3.51(m，1H，H-5’b)，2.72(m，1H，H-2’a)，2.27(m，1H，H-2’b).
N6-[4-(3-氨基-1-丙基)-2-硝基苄基]-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(dA.18)
将POCl3(8.5μL，0.09mmol)加入到化合物dA.17(32mg，0.06mmol)和质子海绵体(19mg，0.09mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，并保持在零下20-30℃2小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(142mg，0.3mmol)和三正丁胺(60μL)在无水DMF(0.6mL)中的溶液。搅拌2分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；5mL)。室温下搅拌反应1小时，然后在0℃下逐滴加入浓氢氧化铵(10mL，27％)。室温下再搅拌混合物1小时，然后冻干。将所得残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在300分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的三磷酸酯dA.18(31mg，72％)。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.47(s，1H，H-8)，8.23(s，1H，Ph-H)，8.20(s，1H，H-2)，765(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.57(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.52(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，5.14(br s，2H，Ph-CH2)，4.31(s，1H，H-4’)，4.21(m，2H，H-5’a和H-5’b)，3.60(s，2H，CH2)，2.82(m，1H，H-2’a)，2.62(m，1H，H-2’b)
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.43(d，J＝15.4Hz)，-10.46(d，J＝15.6Hz)，-18.85(t，J＝15.6Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C20H23N7O14P3[M-H]-而言，计算质量为678.0516，实测质量为678.0857。
6-FAM标记的N6-(4-(3-氨基-1-丙基)-2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(WW2p055)
将6-FAM-SE(6.7mg，0.014mmol)在无水DMSO(70μL)中的溶液加入到三磷酸酯dA.18(4.4μmol)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH9.2；3mL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC将反应纯化，得到6-FAM标记的三磷酸酯WW2p055(2.6mg，49％)。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mMTEAA。利用5-20％B 20分钟，然后20-90％B 20分钟的线性梯度进行洗脱。利用6-FAM染料的消光系数(即在494nm下的68,000)通过吸收光谱评价WW2p055的浓度。
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.87(d，J＝19.8Hz)，-11.01(d，J＝19.1Hz)，-21.76(t，J＝19.8Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C41H35N7O20P3[M+H]+而言，计算质量为1038.1150，实测质量为1138.1281。
5(6)-SFX标记的N6-(4-(3-氨基-1-丙基)-2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷三磷酸(WW2p052)的合成
Figure G2007800494372D00561
方案.5(6)-SFX标记的N6-(4-(3-氨基-1-丙基)-2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷三磷酸的合成。(i)5(6)-SFX，0.1M NaHCO3/NaCO3，pH 9.2。
5(6)-SFX标记的N6-(4-(3-氨基-1-丙基)-2-硝基苄基)-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(WW2p052)
将5(6)-SFX(1.5mg，2.55μmol)在无水DMSO(30μL)中的溶液加入三磷酸酯dA.18(0.54μmol)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH 9.2；0.8mL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC将反应纯化得到5(6)-SFX标记的三磷酸酯WW2p052。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-20％B 20分钟，然后20-90％B 20分钟的线性梯度进行洗脱。利用6-FAM染料的消光系数(即在494nm下的68,000)通过吸收光谱估计WW2p052的浓度。
N6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脱氧腺苷三磷酸(WW3p006)的合成
Figure G2007800494372D00571
方案.N6-[(1-(2-硝基苯基)乙基)-2’-脱氧腺苷三磷酸的合成。(i)1-(2-硝基苯基)乙胺、BOP、DIPEA、DMF，室温，过夜，42％；(ii)POCl3、质子海绵体、(MeO)3PO、0℃，2小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N、DMF，5分钟；1M HNEt3HCO3，1小时。
N6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脱氧腺苷(dA.19)
向2’-脱氧肌苷(100mg，0.4mmol)和苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP，210mg，0.48mmol)在无水DMF(1mL)中的混悬液中加入N，N-二异丙基乙胺(100μL，0.6mmol)，然后加入1-(2-硝基苯基)乙胺(250mg，1.51mmol)在DMF(1mL)中的溶液。室温下搅拌反应64小时。加入硅胶60(1g，60-200目)，将混合物在真空下蒸干。通过硅胶柱色谱纯化残留物，得到白色泡沫状的N6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脱氧腺苷dA.19(67mg，42％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.68(br s，1H，与D2O可交换，NH)，8.42(br s，1H，H-8)，8.16和8.06(2s，1H，H-2)，7.88(m，2H，Ph-H)，7.69(m，1H，Ph-H)，7.46(m，1H，Ph-H)，6.34(m，1H，H-1’)，5.79(m，1H，Ph-CH)，5.32(br s，1H，与D2O可交换，3’-OH)，5.16(br s，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.42(m，1H，H-3’)，3.88(m，1H，H-4’)，3.61(m，1H，H-5’a)，3.53(m，1H，H-5’b)，2.71(m，2H，H-2’a)，2.25(m，1H，H-2’b)，1.68(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)
N6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(WW3p006)
将化合物dA.19(30mg，0.075mmol)和质子海绵体(32mg，0.15mmol)在无水吡啶(2mL)中蒸发3次，并溶解在磷酸三甲酯(0.5mL)中。加入POCl3(10.5μL，0.11mmol)，在0℃搅拌混合物2小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(178mg，0.38mmol)和三正丁胺(75μL)在无水DMF(0.75mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC纯化部分溶液得到N6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸WW3p006(非对映体的1∶1混合物)。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行洗脱。
非对映体的1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.47(s，1H，H-8)，8.12(2s，1H，H-2)，8.02(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.78(d，1H，J＝7.8Hz，Ph-H)，7.67(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.49(t，1H，J＝8.1Hz，Ph-H)，6.49(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.89(bs，1H，Ph-CH)，4.29(m，1H，H-4’)，4.23-4.15(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.81(m，1H，H-2’a)，2.58(m，1H，H-2’b)，1.74(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)；
非对映体的31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.65(m)，-10.52(d，J＝19.6Hz)，-21.32(m)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C18H21N6O14P3Na[M-2H+Na]-而言，计算质量为661.0226，实测质量为661.0492。
6-FAM标记的N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷三磷酸(WW3p015)的合成
方案.6-FAM标记的N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷三磷酸的合成。(i)1-(4-碘-2-硝基苯基)乙胺、BOP、DIPEA、DMF，室温，65％；(ii)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、无水DMF，4.5h，94％；(iii)POCl3、质子海绵体、(MeO)3PO、0℃，2小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N、DMF，5分钟；1M HNEt3HCO3，1小时；NH4OH，1小时；(iv)6-FAM-SE，0.1M NaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小时。
N6-[1-(4-碘-2-硝基苯基)乙基]-2’-脱氧腺苷(dA.20)
向2’-脱氧肌苷(150mg，0.6mmol)和苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP，379mg，0.86mmol)在无水DMF(1.5mL)中的混悬液中加入N，N-二异丙基乙胺(186μL，1.1mmol)，然后加入1-(4-碘-2-硝基苯基)乙胺(460mg，1.57mmol)在无水DMF(0.5mL)中的溶液。在氮气气氛下搅拌混合物48小时。真空下除去DMF，通过硅胶柱色谱纯化粗产物，得到白色泡沫状的N6-[1-(4-碘-2-硝基苯基)乙基]-2’-脱氧腺苷dA.20(204mg，65％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.72(br m，1H，与D2O可交换，NH)，8.42(br s，1H，H-8)，8.20(s，1H，H-2)，8.06(m，2H，Ph-H)，7.65(m，1H，Ph-H)，6.34(m，1H，H-1’)，5.70(br s，1H，PhCH)，5.32(br s，1H，与D2O可交换，3’-OH)，5.15(br m，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.42(m，1H，H-4’)，3.88(m，1H，H-3’)，3.61(m，1H，H-5’a)，3.53(m，1H，H-5’b)，2.71(m，1H，H-2’a)，2.25(m，1H，H-2’b)，1.65(d，3H，J＝6.9Hz，CH3)；
非对映体的13C NMR(100MHz，MeOH-d4)：δ153.39(CH)，151.94(C)，150.65(C)，143.44(CH)，141.82(C)，141.40(C)，133.77/133.69(CH)，130.55/130.52(CH)，121.37(C)，92.09(C)，91.87(C)，89.97(CH)，87.21(CH)，73.18/73.15(CH)，65.78/65.76(CH2)，47.12(CH)，41.62(CH2)，37.14/37.10(CH3)；
ES-MS(ESI)：m/e 525[M-H]-.
N6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷(dA.21)
室温下将化合物dA.20(108mg，0.21mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(127mg，0.84mmol)、CuI(11mg，0.06mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(33mg，0.03mmol)和Et3N(80μL，0.56mmol)在无水DMF(1.5mL)中的溶液搅拌4.5小时。在真空下浓缩混合物，通过硅胶柱色谱纯化，得到腊状固体的N6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷dA.21(106mg，94％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.10(br m，1H，与D2O可交换，NH)，8.71(br m，1H，与D2O可交换，NH)，8.43(br s，1H，H-8)，8.15和8.06(2s，1H，H-2)，7.93(s，1H，Ph-H)，7.86(m，1H，Ph-H)，7.75(m，1H，Ph-H)，6.35(br m，1H，H-1’)，5.73(br m，1H，Ph-CH)，5.31(br s，1H，与D2O可交换，3’-OH)，5.15(br m，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.40(m，1H，H-4’)，4.31(d，2H，J＝5.3Hz，CH2)，3.88(m，1H，H-3’)，3.62(m，1H，H-5’a)，3.51(m，1H，H-5’b)，2.71(m，1H，H-2’a)，2.25(m，1H，H-2’b)，1.67(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)；
非对映体的13C NMR(100MHz，MeOH-d4)：δ157.85/157.48(C)，152.26(CH)，149.50(C)，140.27(C)，136.04(CH)，128.02(CH)，127.07(CH)，122.56(C)，120.25(C)，117.81(C)，114.96(C)，88.85(CH)，86.08(CH)，85.81(C)，80.67(C)，72.07/72.04(CH)，62.66/62.63(CH2)，48.30(CH)，40.47(CH2)，29.46(CH2)，24.26(CH3)；
N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(dA.22)
将化合物dA.21(44mg，0.08mmol)和质子海绵体(34mg，0.16mmol)在无水吡啶(2mL)中蒸发3次，并溶解在磷酸三甲酯(0.5mL)中。加入POCl3(11μL，0.12mmol)，在0℃搅拌混合物2小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(190mg，0.4mmol)和三正丁胺(80μL)在无水DMF(0.8mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC纯化部分溶液，得到N6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行HPLC纯化。然后室温下利用浓氢氧化铵(1mL，27％)处理N6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸1小时，得到N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸dA.22(非对映体的1∶1混合物)。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.45(s，1H，H-8)，8.08(2s，1H，H-2)，7.95(s，1H，Ph-H)，7.65(m，1H，Ph-H)，7.53(m，1H，Ph-H)，6.45(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.80(brs，1H，Ph-CH)，4.28(s，1H，H-4’)，4.18(m，2H，H-5’a和H-5’b)，3.64(s，2H，CH2)，2.78(m，1H，H-2’a)，2.57(m，1H，H-2’b)，1.69(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)；
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.29(d，J＝20.1Hz)，-10.45(d，J＝19.1Hz)，-21.08(t，J＝19.6Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C21H25N7O14P3[M-H]-而言，计算质量为692.0672，实测质量为692.0757。
6-FAM标记的N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(WW3p015)
将6-FAM-SE(1.5mg，3.15μmol)在无水DMSO(30μL)中的溶液加入到三磷酸酯dA.22(0.34μmol)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH9.2；100μL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC将反应纯化得到6-FAM标记的三磷酸酯WW3p015。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN中的100mM TEAA(30∶70)。利用5-50％B 40分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行HPLC纯化。利用6-FAM染料的消光系数(即在494nm下的68,000)通过吸收光谱估计WW3p015的浓度。
非对映体N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(dA.22dS1和dA.22dS2)的分离
利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC进行dA.22的两种非对映体的分离，以得到N6-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷三磷酸dA.22dS1(单一非对映体，绝对构型未测定)和N6-{(S或R)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷三磷酸dA.22dS2(单一非对映体，绝对构型未测定)。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-25％B 50分钟，然后25-50％B 30分钟的线性梯度进行HPLC纯化。
Figure G2007800494372D00631
6-FAM标记的单一非对映体N6-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(WW3p021)的合成
方案.6-FAM标记的单一非对映体N6-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸的合成。(i)6-FAM-SE，0.1MNaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小时。
6-FAM标记的单一非对映体N6-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(WW3p021)
将6-FAM-SE(0.75mg，1.57μmol)在无水DMSO(15μL)中的溶液加入到三磷酸酯dA.22ds1(0.26μmol，单一非对映体，绝对构型未测定)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH 9.2；150μL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC将反应纯化，得到6-FAM标记的单一非对映体三磷酸酯WW3p021。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行HPLC纯化。利用6-FAM染料的消光系数(即在494nm下的68,000)通过吸收光谱估计WW3p021的浓度。
6-FAM标记的单一非对映体N6-{(R或S)-1-{4-[3-(6-氨基己酰基)氨基-1-丙炔基]-2-硝基苯基}乙基}-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(WW3p032)的合成
Figure G2007800494372D00651
方案.6-FAM标记的单一非对映体N6-{(R或S)-1-{4-[3-(6-氨基己酰基)氨基-1-丙炔基]2-硝基苯基}乙基}-2’-脱氧腺苷三磷酸的合成。(i)N-(三氟乙酰基)氨基己酸N-琥珀酰亚胺酯，0.1M NaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小时；NH4OH，1小时；(ii)6-FAM-SE，0.1M NaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小时。
N6-{(R或S)-1-{4-[3-(6-氨基己酰基)氨基-1-丙炔基]-2-硝基苯基}乙基}-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(单一非对映体dA.23ds1)
将6-N-(三氟乙酰基)氨基己酸N-琥珀酰亚胺酯(0.5mg，1.54μmol)在无水DMSO(10μL)中的溶液加入到三磷酸酯dA.22ds1(0.25μmol，单一非对映体，绝对构型未测定)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH9.2；200μL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。加入NH4OH(500μL，25％水溶液)，混合物在室温下再孵育1小时。利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC将反应纯化，得到三磷酸酯dA.23ds1(单一非对映体，绝对构型未测定)。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mMTEAA。利用5-50％B 20分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行HPLC纯化。
6-FAM标记的单一非对映体N6-{(R或S)-1-{4-[3-(6-氨基己酰基)氨基-1-丙炔基]-2-硝基苯基}乙基}-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(WW3p032)的合成
将6-FAM-SE(0.5mg，1.05μmol)在无水DMSO(10μL)中的溶液加入到三磷酸酯dA.23ds1(0.196μmol，单一非对映体，绝对构型未测定)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH 9.2；200μL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC将反应纯化，得到6-FAM标记的单一非对映体三磷酸酯WW3p032。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行HPLC纯化。利用6-FAM染料的消光系数(即在494nm下的68,000)通过吸收光谱估计WW3p032的浓度。
实施例2：dT化合物
N3-(2-硝基苄基)-胸苷-5’-三磷酸(WW1p050)的合成
Figure G2007800494372D00671
方案.N3-(2-硝基苄基)-胸苷-5’-三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、无水CH2Cl2，室温，过夜，58％；(ii)2-硝基苄基溴，n-Bu4NOH、NaI、NaOH(1M)、CHCl3，室温，过夜，37％；(iii)n-Bu4NF、THF、25℃，45分钟，80％；(iv)POCl3、质子海绵体、(MeO)3PO、0℃，6小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分钟；1M HNEt3HCO3，1小时，56％。
5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷(dT.01)
在N2气氛和室温下搅拌胸苷dT(2.85g，11.76mmol)、咪唑(2.44g，35.80mmol)和TBSCl(1.77g，11.76mmol)在无水CH2Cl2(20mL)中的溶液过夜。然后在真空下将反应混合物浓缩成粘性油，然后加入乙醚(60mL)和水(60mL)。分离有机层，用水清洗2次(每次20mL)，用乙醚(20mL)萃取合并的有机层。利用Na2SO4干燥合并的有机层，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色固体的5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷dT.01(3.44g，82％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ9.35(br s，1H，H-3)，7.53(d，1H，J＝1.2Hz，H-6)，6.39(dd，1H，J＝8.3，5.6Hz，H-1’)，4.45(m，1H，H-4’)，4.07(m，1H，H-3’)，3.87(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.99(br.s，1H，3’-OH)，2.38(m，1H，H-2’b)，2.09(m，1H，H-2’b)，1.91(d，3H，J＝1.2Hz，5-Me)，0.92(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(s，6H，(CH3)2Si).
N3-(2-硝基苄基)-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷(dT.02)
将2-硝基苄基溴(400mg，1.85mmol)在CHCl3(5mL)中的溶液逐滴加入到化合物dT.01(660mg，1.85mmol)、四丁基氢氧化铵(0.5mL)、碘化钠(55mg)在CHCl3(5mL)和NaOH(1M；5mL)中的强烈搅拌的混合物中，室温下搅拌过夜。分离有机层，用氯仿萃取水层2次(每次5mL)。用水(5mL)、盐水(5mL)清洗合并的有机层，用Na2SO4干燥。真空下蒸发溶剂，通过硅胶柱色谱纯化残留物，得到白色泡沫状的N3-(2-硝基苄基)-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷dT.02(562mg，58％)。
1H NMR(CDCl3)：δ7.98(dd，1H，J＝7.2，1.2Hz，Ph-H)，7.60(d，1H，J＝1.2Hz，H-6)，7.49(dt，1H，J＝7.6，1.2Hz，Ph-H)，7.36(dt，1H，J＝8.1，1.4Hz，Ph-H)，7.16(dd，1H，J＝7.8，1.1Hz，Ph-H)，6.31(dd，1H，J＝8.2，5.7Hz，H-1’)，5.50(d，1H，J＝16.2Hz，PhCH2)，5.44(d，1H，J＝16.2Hz，PhCH2)，4.40(m，1H，H-4’)，3.97(q，1H，J＝2.4Hz，H-3’)，3.82(dq，2H，J＝11.4，2.4Hz，H-5’a和H-5’b)，2.98(s，1H，3’-OH)，2.29(m，1H，H-2’a)，2.05(m，1H，H-2’b)，1.93(d，3H，J＝1.2Hz，5-Me)，0.90(s，9H，(CH3)3CSi)，0.09(s，3H，(CH3)Si)，0.08(s，3H，(CH3)Si).
N3-(2-硝基苄基)-胸苷(dT.03)
将n-Bu4NF溶液(1.0M，在THF中，1.125mL，1.125mmol)逐滴加入到化合物dT.02(369mg，0.75mmol)在THF(3.75mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌45分钟，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫状的N3-(2-硝基苄基)-胸苷dT.03(225mg，80％)。
1H NMR(CDCl3)：δ8.01(dd，1H，J＝8.2，1.3Hz，Ph-H)，7.51(m，2H，H-6和Ph-H)，7.40(m，1H，Ph-H)，7.21(dd，1H，J＝7.8，0.9Hz，Ph-H)，6.21(t，1H，J＝6.7Hz，H-1’)，5.49(dd，2H，PhCH2)，4.53(m，1H，H-4’)， 3.97(m，1H，H-3’)，3.78(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.30(m，2H，H-2’a和H-2’b)，1.94(s，3H，5-CH3).
N3-(2-硝基苄基)-胸苷-5’-三磷酸(WW1p050)
在0℃下将POCl3(30μL，0.33mmol)加入到化合物dT.03(38mg，0.11mmol)和质子海绵体(32mg，0.15mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，搅拌6小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(237mg，0.5mmol)和三正丁胺(100μL)在无水DMF(1mL)中的溶液。搅拌5分钟后，将三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)加入到所述溶液中。室温下搅拌反应1小时，然后冻干。将所得残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在240分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的三磷酸酯N3-(2-硝基苄基)-胸苷-5’-三磷酸WW1p050(38mg，56％)。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.15(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.82(s，1H，H-6)，7.64(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.54(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.24(d，1H，J＝7.8Hz，Ph-H)，6.35(t，1H，J＝6.7Hz，H-1’)，5.47(s，2H，Ph-CH2)，4.64(m，1H，H-4’)，4.25(m，3H，H-3’，H-5’a和H-5’b)，2.40(m，2H，H-2’a和H-2’b)，1.98(s，3H，5-CH3)；
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-6.12(d，J＝15.6Hz)，-11.21(d，J＝15.4Hz)，-19.565(d，J＝15.6Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C17H20N3O16P3Na[M-2H+Na]-而言，计算质量为637.9954，实测质量为637.9802。
5-(2-硝基苄氧基甲基)-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(VL3p03085)的合成
Figure G2007800494372D00701
方案.5-(2-硝基苄氧基甲基)-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、无水DMF，室温，过夜，90％；(ii)NBS，过氧化苯甲酰，CCl4、回流，1小时，44％；(iii)2-硝基苄醇，110-115℃，10分钟，35％；(iv)POCl3、质子海绵体、(MeO)3PO、0℃，2小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF；1M HNEt3HCO3，1小时，22％。
3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷(dT.04)
将TBSCl(9.96g，66.05mmol)在DMF(11mL)中的溶液逐滴加入到胸苷(5.00g，20.64mmol)和咪唑(9.0g，132.1mmol)在无水DMF(11mL)中的溶液中，并将混合物在N2气氛和室温下搅拌过夜。用水(100mL)稀释混合物后，过滤所形成的沉淀并溶解在乙醚(125mL)中。所述醚溶液用水清洗2次(每次25mL)，用盐水清洗1次(25mL)，利用Na2SO4干燥，减压浓缩成腊状固体，以己烷/乙醚(10∶1)重结晶，得到3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷dT.04(10.64g，90％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.51(br s，1H，H-3)，7.48(d，1H，J＝1.2Hz，H-6)，6.34(dd，1H，J＝5.8和8.0Hz，H-1’)，4.41(m，1H，H-3’)，3.93(m，2H，H-4’)，3.87(dd，1H，J＝2.6和11.4Hz，H-5’a)，3.76(dd，1H，J＝2.6和11.4Hz，H-5’b)，2.17(m，1H，H-2’a)，2.01(m，1H，H-2’b)，1.92(d，3H，J＝1.2Hz，CH3)，0.93(s，9H，(CH3)3CSi)，0.88(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(s，6H，(CH3)2Si)，0.08(s，6H，(CH3)2Si).
5-溴甲基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧尿苷(dT.05)
将化合物dT.04(4.63g，9.83mmol)、N-溴代琥珀酰亚胺(3.68g，20.68mmol)和过氧化苯甲酰(0.10g，75％水溶液)在CCl4(100mL)中的溶液回流1小时。过滤混合物，在真空下浓缩滤液，通过硅胶柱色谱纯化，得到5-溴甲基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧尿苷dT.05(2.40g，44％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ9.16(br s，1H，H-3)，7.89(s，1H，H-6)，6.30(dd，1H，J＝5.8和7.7Hz，H-1’)，4.41(m，1H，H-3’)，4.29(d，1H，J＝10.6Hz，CH2Br)，4.23(d，1H，J＝10.6Hz，CH2Br)，3.98(m，2H，H-4’)，3.89(dd，1H，J＝2.6和11.4Hz，H-5’b)，3.78(dd，1H，J＝2.6和11.4，Hz，H-5’a)，2.30(m，1H，H-2’a)，2.01(m，1H，H-2’b)，0.95(s，9H，(CH3)3CSi)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.15(s，6H，(CH3)2Si)，0.09(s，6H，(CH3)2Si).
5-(2-硝基苄氧基甲基)-2’-脱氧尿苷(dT.06)
在N2气氛下，于110-115℃下加热化合物dT.05(238mg，0.43mmol)和2-硝基苄醇(331mg，2.17mmol)10分钟。将混合物冷却至室温，溶解在乙酸乙酯中，通过硅胶柱色谱纯化，得到5-(2-硝基苄氧基甲基)-2’-脱氧尿苷dT.06(60mg，35％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.41(br s，1H，与D2O可交换，NH)，8.05(d，J＝8.0Hz，1H，Ph-H)，7.96(s，1H，H-6)，7.78(m，2H，Ph-H)，7.56(m，1H，Ph-H)，6.17(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，5.25(d，1H，与D2O可交换，3’-OH)，5.00(t，1H，J＝5.0Hz，与D2O可交换，5’-OH)，4.48(s，2H，CH2)，4.24(m，1H，H-3’)，4.23(s，2H，CH2)，3.79(m，1H，H-4’)，3.57(m，2H，H-5’)，2.11(m，2H，H-2’)；
13C NMR(100MHz，MeOH-d4)：δ163.38(C)，147.18(C)，139.53(CH)，134.80(C)，133.81(C)，132.87(CH)，128.53(CH)，127.63(CH)，123.75(CH)，110.24(C)，87.16(CH)，82.83(CH)，70.41(CH)，68.26(CH2)，64.73(CH2)，61.05(CH2)，39.58(CH2)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C17H20N3O8[M+H]-而言，计算质量为394.1250，实测质量为394.1286。
5-(2-硝基苄氧基甲基)-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(VL3p03085)
在0℃下将POCl3(22μL，0.24mmol)加入到化合物dT.06(48mg，0.12mmol)和质子海绵体(39mg，0.18mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，搅拌2小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(285mg，0.6mmol)和三正丁胺(120μL)在无水DMF(1.2mL)中的溶液。搅拌2分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过离子交换色谱利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在300分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的5-(2-硝基苄氧基甲基)-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸VL3p03085(16mg，22％)。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.01(d，J＝8.0Hz，1H，Ph-H)，7.78(s，1H，H-6)，7.65(m，2H，Ph-H)，7.52(m，1H，Ph-H)，6.26(t，J＝6.8Hz，1H，H-1’)，4.93(m，2H，CH2)，4.57(m，1H，H-3’)，4.41(s，2H，CH2)，4.21(m，3H，H-4’和H-5’)，2.34(m，2H，H-2’)；
31P NMR(162Hz，D2O)：δ-5.58(d，J＝18.5Hz)，-10.91(d，J＝18.5Hz)，-20.80(br)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C17H21N3O17P3[M-H]-而言，计算质量为632.0084，实测质量为631.9779。
5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p043)的合成
Figure G2007800494372D00731
方案.5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸的合成。(i)1-(2-硝基苯基)乙醇(1.25g，7.50mmol)，110-115℃，10分钟，8％；(ii)POCl3，质子海绵体，(MeO)3PO，0℃，3小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N，DMF；1M HNEt3HCO3，1小时，55％。
5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷(dT.07)
在N2气氛下，于110-115℃下加热化合物dT.05(0.81g，1.5mmol)和1-(2-硝基苯基)乙醇(1.25g，7.50mmol)10分钟。将混合物冷却至室温，溶解在乙酸乙酯中，通过硅胶柱色谱纯化，得到5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷dT.07(48mg，8％，1∶1的非对映体混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.36和11.35(2br s，1H，与D2O可交换，NH)，7.95(m，1H，Ph-H)，7.87(m，1H，Ph-H)，7.76(m，2H，H-6和Ph-H)，7.54(m，1H，Ph-H)，6.14(m，1H，H-1’)，5.25(d，1H，与D2O可交换，3’-OH，5.00(m，2H，其中1H与D2O可交换，5’-OH和CH)，4.24(m，1H，H-3’)，3.96(m，2H，CH2)，3.78(m，1H，H-4’)，3.57(m，2H，H-5’)，2.08(m，2H，H-2’)，1.43(d，J＝6.3Hz，3H，CH3)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C18H22N3O8[M+H]+而言，计算质量为408.1407，实测质量为408.1446。
5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p043)
在0℃下将POCl3(15μL，0.17mmol)加入到化合物dT.07(34mg，0.08mmol)和质子海绵体(27mg，0.12mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，搅拌3小时。加入三-正丁胺焦磷酸盐(197mg，0.4mmol)和三正丁胺(100μL)在无水DMF(0.8mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在300分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸WW2p043(32mg，55％，1∶1的非映应体混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，D2O)：δ7.93(m，1H，Ph-H)，7.71-7.61(m，3H，H-6和Ph-H)，7.49(m，1H，Ph-H)，6.18和6.12(2t，J＝6.6Hz，1H，H-1’)，5.13(m，1H，CH)，4.53(m，1H，H-3’)，4.39(m，1H，H-4’)，4.20(m，4H，CH2和H-5’)，2.28(m，2H，H-2’)，1.54(d，3H，J＝6.3Hz，CH3)；
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-7.98(br)，-12.64(br)，-23.33(br)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C18H24N3O17P3Na[M+Na]+而言，计算质量为670.0216，实测质量为670.0176。
6-JOE标记的5-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苄氧基甲基]-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p075)的合成
Figure G2007800494372D00751
方案.6-JOE标记的5-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苄氧基甲基]-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸的合成。(i)4-碘-2-硝基苄醇，不含水，110-115℃，10分钟，10％；(ii)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、无水DMF，4小时，50％；(iii)POCl3、质子海绵体、(MeO)3PO，0℃，4小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分钟；1M HNEt3HCO3，1小时；NH4OH，1小时；31％；(iv)6-JOE-SE，0.1M Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH 9.2)，1小时。
5-(4-碘-2-硝基苄氧基甲基)-2’-脱氧尿苷(dT.08)
在N2气氛下，于110-115℃下加热化合物dT.05(0.59g，1.06mmol)和4-碘-2-硝基苄醇(1.09g，3.9mmol)10分钟。将混合物冷却至室温，溶解在乙酸乙酯中，通过硅胶柱色谱纯化，得到低熔点固体的5-(4-碘-2-硝基苄氧基甲基]-2’-脱氧尿苷dT.08(52mg，10％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.42(s，1H，与D2O可交换，N-H)，8.34(d，1H，J＝1.7Hz，Ph-H)，8.09(dd，1H，J＝1.7和8.2Hz，Ph-H)，7.96(s，1H，H-6)，7.56(d，1H，J＝8.2，Ph-H)，6.16(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，5.25(d，1H，与D2O可交换，3’-OH)，5.02(t，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.77(s，2H，CH2)，4.20(m，1H，H-3’)，4.22(s，2H，CH2)，3.79(m，1H，H-4’)，3.57(m，2H，H-5’)，2.11(m，2H，H-2’).
5-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苄氧基甲基]-2’-脱氧尿苷(dT.09)
室温下将化合物dT.08(51mg，0.1mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(45mg，0.3mmol)、四(三苯基膦)-钯(0)(12mg，0.01mmol)、CuI(4mg，0.02mmol)和Et3N(28μL，0.2mmol)在无水DMF(1.2mL)中的溶液搅拌4小时。在真空下浓缩混合物，通过硅胶柱色谱纯化，得到腊状固体的5-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苄氧基甲基]-2’-脱氧尿苷dT.09(27mg，50％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.44(s，1H，与D2O可交换，N3-H)，10.44(1H，与D2O可交换，N-H(COCF3))，8.06(s，1H，Ph-H)，7.97(s，1H，H-6)，7.79(s，2H，Ph-H)，6.16(t，J＝6.8Hz，1H，H-1’)，5.25(d，1H，与D2O可交换，3’-OH)，5.02(t，1H，与D2O可交换，5’OH)，4.83(s，2H，Ph-CH2)，4.30(s，2H，CH2)，4.23(m，3H，CH2和H-3’)，3.79(m，1H，H-4’a)，3.57(m，2H，H-5’)， 2.10(m，2H，H-2’a和H-2’b)；
ES+MS(ESI)：543[M+H]+；ES-MS(ESI)：541[M+H]+
5-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苄氧基甲基]-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(dT.10)
在0℃下将POCl3(8μL，88μmol)加入到化合物dT.09(24mg，44μmol)和质子海绵体(14mg，66μmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，搅拌2小时。再加入POCl3(8μL，88μmol)，再搅拌2小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(104mg，0.22mmol)和三正丁胺(50μL)在无水DMF(0.5mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后在0℃下逐滴加入浓氢氧化铵(5mL，27％)。室温下再搅拌混合物1小时，然后冻干。将所得残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用QSepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在300分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的三磷酸酯dT.10(10mg，31％)。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.10(d，J＝5.1Hz，1H，Ph-H)，7.75(m，2H，H-6和Ph-H)，7.65(m，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，6.27(t，J＝6.8Hz，1H，H-1’)，4.95(m，2H，CH2)，4.58(m，1H，H-3’)，4.43(s，2H，CH2)，4.22(m，3H，H-4’和H-5’)，3.64(s，2H，CH2)，2.33(m，2H，H-2’)；
31P NMR(162Hz，D2O)：δ-6.51(d，J＝15.0Hz)，-11.56(d，J＝15.6Hz)，-19.82(t，J＝15.0Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C20H23N4O17P3Na[M-2H+Na]-而言，计算质量为707.0169，实测质量为707.0321。
6-JOE标记的5-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苄氧基甲基]-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p075)
将6-JOE-SE(1.25mg，2μmol)在无水DMSO(50μL)中的溶液加入到三磷酸酯dT.10(1.4μmol)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH9.2；0.5mL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC纯化反应，得到6-JOE标记的三磷酸酯WW2p075。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵酯(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-38％B 40分钟，然后38-90％B 10分钟的线性梯度进行洗脱。利用6-JOE染料的消光系数(即在520nm下的75,000)通过吸收光谱估计WW2p075的浓度。
6-JOE标记的5-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p113)的合成
Figure G2007800494372D00791
方案.6-JOE标记的5-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸的合成。(i)Boc2O、DMAP、无水DMF，室温，16小时，78％；(ii)NBS、过氧化苯甲酰、CCl4，回流，1小时，43％；(iii)1-(4-碘-2-硝基苯基)乙醇，不含水，95℃，50分钟，13％；(iv)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、无水DMF，4小时，76％；(v)POCl3、质子海绵体、(MeO)3PO，0℃；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF；1M HNEt3HCO3，1小时；NH4OH，1小时；31％；(vi)6-JOE-SE，0.1MNa2CO3/NaHCO3缓冲液(pH 9.2)，1小时。
N3-叔丁氧羰基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷(dT.11)
将二碳酸二叔丁酯(2.47g，11.34mmol)在DMF(9mL)中的溶液逐滴加入到化合物dT.04(2.43g，5.15mmol)和DMAP(1.39g，11.34mmol)在无水DMF(45mL)中的溶液中。在N2气氛和室温下搅拌混合物16小时。在真空下浓缩混合物，将晶体残留物溶解在CH2Cl2(80mL)中，利用饱和NH4Cl溶液(10mL)清洗，用Na2SO4干燥，在真空下浓缩。通过硅胶柱色谱纯化残留物，得到白色固体的N3-叔丁氧羰基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷dT.11(2.30g，78％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.50(d，1H，J＝1.1Hz，H-6)，6.34(dd，1H，J＝5.8和7.9Hz，H-1’)，4.42(m，1H，H-3’)，3.95(m，2H，H-4’)，3.87(dd，1H，J＝2.5和11.4Hz，H-5’a)，3.76(dd，1H，J＝2.5和11.4Hz，H-5’b)，2.17(m，1H，H-2’a)，2.01(m，1H，H-2’b)，1.92(d，3H，J＝1.2Hz，CH3)，1.60(s，9H，(CH3)3COCON)，0.93(s，9H，(CH3)3CSi)，0.88(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(s，6H，(CH3)2Si)，0.08(s，6H，(CH3)2Si).
N3-叔丁氧羰基-5-溴甲基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧尿苷(dT.12)
将化合物dT.11(570mg，1.00mmol)、N-溴代琥珀酰亚胺(0.37g，2.10mmol)和过氧化苯甲酰(10mg，75％水溶液)在CCl4(10mL)中的溶液回流1小时。过滤混合物，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到腊状固体的N3-叔丁氧羰基-5-溴甲基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧尿苷dT.12(281mg，43％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.89(s，1H，H-6)，6.27(dd，1H，J＝5.7和7.7Hz，H-1’)，4.39(m，1H，H-3’)，4.27(d，1H，J＝10.6Hz，CH2Br)，4.20(d，1H，J＝10.6Hz，CH2Br)，3.98(m，2H，H-4’)，3.89(dd，1H，J＝2.5 and 11.4，Hz，H-5’b)，3.78(dd，1H，J＝2.6和11.4Hz，H-5’a)，2.30(m，1H，H-2’a)，2.04(m，1H，H-2’b)，1.61(s，9H，(CH3)3COCON)，0.95(s，9H，(CH3)3CSi)，0.89(s，9H，(CH3)3CSi)，0.14(s，6H，(CH3)2Si)，0.07(s，6H，(CH3)2Si)；
13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ159.21(C)，147.99(C)，147.32(C)，138.46(CH)，111.30(C)，88.34(CH)，87.22(C)，86.00(CH)，72.28(CH)，63.04(CH2)，41.93(CH2)，27.42(CH3)，25.99(CH3)，25.71(CH3)，25.65(CH3)，24.91(CH2)，18.47(C)，17.97(C)，-3.58(CH3)，-4.65(CH3)，-4.86(CH3)，-5.32(CH3).
5-[1-(4-碘-2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷(dT.13)
在N2气氛下，于95-97℃下加热化合物dT.12(323mg，0.50mmol)和1-(4-碘-2-硝基苯基)乙醇(293mg，2.23mmol)50分钟。将混合物冷却至室温，溶解在乙酸乙酯中，通过硅胶柱色谱纯化，得到腊状固体的5-[1-(4-碘-2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷dT.13(34mg，13％，1∶1的非映体混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，MeOH-d4)：δ8.26(t，1H，J＝1.7Hz，H-6)，8.05(dd，1H，J＝1.6，8.3Hz，Ph-H)，8.02(d，1H，J＝10.6Hz，Ph-H)，7.60(dd，1H，J＝1.1，8.3Hz，Ph-H)，6.26(m，1H，H-1’)，5.03(m，1H，PhCH)，4.41(m，1H，H-3’)，4.10(m，2H，CH2)，3.94(m，1H，H-4’)，3.80(m，1H，H-5’a)，3.74(m，1H，H-5’b)，2.30(m，1H，H-2’a)，2.20(m，1H，H-2’b)，1.50(m，3H，CH3).
5-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷(dT.14)
在室温下将化合物dT.13(52mg，0.1mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(44mg，0.29mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(12mg，0.01mmol)、CuI(4mg，0.02mmol)，和Et3N(27μL，0.2mmol)在无水DMF(1.5mL)中的溶液搅拌4小时。在真空下浓缩混合物，通过硅胶柱色谱纯化，得到腊状固体的5-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷dT.14(41mg，76％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.36，11.35(2s，1H，与D2O可交换，NH)，10.11(t，1H，J＝5.6Hz，与D2O可交换，NH)，7.98(s，1H，H-6)，7.88(d，1H，J＝8.1Hz，Ph-H)，7.78(m，2H，Ph-H)，6.14(t，J＝7.0Hz，1H，H-1’)，5.25(m，1H，与D2O可交换，3’-OH)，5.01(m，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.98(m，1H，PhCH)，4.33(m，2H，CH2)，4.24(m，1H，H-3’)，4.00(m，1H，H-5’a)，3.94(m，1H，H-5’b)，3.78(m，1H，H-4’)，3.57(m，2H，CH2)，2.08(m，2H，H-2’a H-2’b)，1.41(d，J＝8.1Hz，3H，CH3)；
ES+MS(ESI)：579[M+Na]+.
5-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(dT.15)
在0℃下将POCl3(10μL，0.11mmol)加入到化合物dT.14(30mg，0.054mmol)和质子海绵体(17mg，0.08mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，搅拌2小时。再加入POCl3(2.5μL，0.03mmol)，再搅拌1小时。加入双-三-正丁胺焦磷酸盐(128mg，0.27mmol)和三正丁胺(60μL)在无水DMF(0.54mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后在0℃下逐滴加入浓氢氧化铵(5mL，27％)。室温下再搅拌混合物1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用QSepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在300分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的三磷酸酯dT.15(16mg，40％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.01(m，1H，Ph-H)，7.74-7.55(m，3H，H-6和Ph-H)，6.18和6.12(2t，J＝6.4Hz，1H，H-1’)，5.11(m，1H，PhCH)，4.53(m，1H，H-3’)，4.37(m，1H，H-4’)，4.20(m，4H，CH2和H-5’)，3.65(s，2H，CH2)，2.35(m，1H，H-2’a)，2.25(m，1H，H-2’b)，1.54(d，3H，J＝6.4Hz，CH3)；
非对映体的31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.87(d，J＝19.8Hz)，-11.18和-11.30(2d，J＝19.4Hz)，-21.62(t，J＝19.6Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C21H27N4O17P3Na[M+Na]+而言，计算质量为723.0482，实测质量为723.0497。
6-JOE标记的5-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p113)
将6-JOE-SE(0.75mg，1.2μmol)在无水DMSO(30μL)中的溶液加入到三磷酸酯dT.15(0.56μmol)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH 9.2；200μL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC纯化反应得到6-JOE标记的三磷酸酯WW2p113。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行洗脱。利用6-JOE染料的消光系数(即在520nm下的75,000)通过吸收光谱估计WW2p113的浓度。
5-[1-(2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p148)的合成
Figure G2007800494372D00831
方案.5-[1-(2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸的合成。(i)1-(2-硝基苯基)-2-甲基丙醇，100-110℃，35分钟，14％；(ii)POCl3、质子海绵体、(MeO)3PO，0℃，3小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF；1M HNEt3HCO3，1小时。
5-[1-(2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷(dT.16)
在N2气氛下，于100-110℃下加热化合物dT.12(0.316g，0.486mmol)和1-(2-硝基苯基)-2-甲基丙醇(0.706g，3.62mmol)35分钟。将混合物冷却至室温，溶解在乙酸乙酯中，通过硅胶柱色谱纯化，得到5-[1-(2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷dT.16(30mg，14％，1∶1的非映体混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.33和11.34(2brs，1H，与D2O可交换，NH)，7.95(m，1H，Ph-H)，7.83(m，1H，Ph-H)，7.72(m，1H，Ph-H)，7.68(m，1H，H-6)，7.54(m，1H，Ph-H)，6.14(m，1H，H-1’)，5.26(d，1H，与D2O可交换，3’-OH)，4.97(m，1H，1H  与D2O可交换，5’-OH)，4.66(m，1H，CH)，4.22(m，1H，H-3’)，3.98(m，2H，CH2)，3.78(m，1H，H-4’)，3.55(m，2H，H-5’)，2.08(m，2H，H-2’)，1.72(m，1H，CH)，0.85(m，3H，CH3)，0.80(m，3H，CH3)；
非对映体的13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ165.04(C)，152.20/151.09(C)，141.19/141.04(CH)，139.28(C)，138.05(C)，134.08(CH)，130.57/130.51(CH)，129.60(CH)，125.25/125.19(CH)，112.62/112.43(C)，89.12(CH)/86.64(CH)，82.72/82.40(CH)，72.45(CH)，65.78/65.61(CH2)，63.01(CH2)，41.50/41.45(CH2)，36.21(CH)，26.68(CH)，19.85/19.80(CH3)，18.20/18.14(CH3)；
5-[1-(2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p148)
在0℃下将POCl3(13μL，0.17mmol)加入到化合物dT.16(30mg，0.07mmol)和质子海绵体(30mg，0.14mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，搅拌3小时。加入三-正丁胺焦磷酸盐(166mg，0.35mmol)和三正丁胺(70μL)在无水DMF(0.7mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在240分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速纯化部分溶液。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的5-[1-(2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸WW2p148(非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，D2O)：δ7.93(m，1H，Ph-H)，7.74-7.64(m，3H，H-6和Ph-H)，7.52(m，1H，Ph-H)，6.19和6.13(2t，J＝6.6Hz，1H，H-1’)，4.55(m，1H，H-3’)，4.40(m，1H，H-4’)，4.21(m，4H，CH2和H-5’)，2.38-2.22(m，2H，H-2’)，1.99(m，1H，CH)，1.01(m，3H，CH3)，0.78(m，3H，CH3).
非对映体的31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.26(d，J＝20.1Hz)，-10.66和-10.72(2d，J＝19.6Hz)，-21.17(t，J＝19.6Hz).
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C20H27N3O17P3[M-H]-而言，计算质量为674.0553，实测质量为674.0470。
6-JOE标记的5-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p150)
Figure G2007800494372D00861
方案.6-JOE标记的5-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸的合成。(i)1-(4-碘-2-硝基苯基)-2-甲基丙醇，不含水，108℃，45分钟，18％；(ii)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、无水DMF，4.5小时，99％；(iii)POCl3、质子海绵体、(MeO)3PO，0℃，3小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF；1MHNEt3HCO3，1小时；NH4OH，1小时；(iv)6-JOE-SE，0.1MNa2CO3/NaHCO3缓冲液(pH 9.2)，1小时。
5-[1-(4-碘-2-硝基苯基-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷(dT.17)
在N2气氛和108℃下加热化合物dT.12(400mg，0.615mmol)和1-(4-碘-2-硝基苯基)-2-甲基乙醇(800mg，2.49mmol)45分钟。将混合物冷却至室温，溶解在乙酸乙酯中，通过硅胶柱色谱纯化，得到腊状固体的5-[1-(4-碘-2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷dT.17(64mg，18％，1∶1的非映体混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，MeOH-d4)：δ8.22(m，1H，H-6)，8.02(m，2H，Ph-H)，7.49(m，1H，Ph-H)，6.22(m，1H，H-1’)，4.69(m，1H，CH)，4.41(m，1H，H-3’)，4.10(m，2H，CH2)，3.92(m，1H，H-4’)，3.75(m，2H，H-5’a)，2.17(m，1H，H-2’a)，2.15(m，1H，H-2’b)，1.90(m，1H，CH)，0.92(m，3H，CH3)，0.85(m，3H，CH3)；
非对映体的13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ165.11(C)，152.16/151.18(C)，143.12(CH)，141.44/141.32(CH)，137.91/137.88(C)，133.83/133.77(CH)，132.37/132.33(CH)，130.80/129.67(C)，112.40/112.24(C)，92.75(C)，89.12(CH)/86.90(CH)，82.43/82.18(CH)，72.39/72.37(CH)，65.83/65.70(CH2)，62.96(CH2)，41.56/41.49(CH2)，36.01(CH)，27.83/26.37(CH)，19.82/19.78(CH3)，17.91/17.88(CH3)；
5-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷(dT.18)
在室温下将化合物dT.17(60mg，0.107mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(48.5mg，0.321mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(12.4mg，0.01mmol)、CuI(4mg，0.02mmol)和Et3N(30μL，0.214mmol)在无水DMF(1.5mL)中的溶液搅拌4.5小时。在真空下浓缩混合物，通过硅胶柱色谱纯化，得到腊状固体的5-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷dT.18(62mg，99％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ11.36，11.35(2s，1H，与D2O可交换，N3-H)，10.11(t，1H，J＝5.3Hz，与D2O可交换，NHTFA)，7.99(m，1H，H-6)，7.86(m，1H，Ph-H)，7.75(m，1H，Ph-H)，7.65(m，1H，Ph-H)，6.12(m，1H，H-1’)，5.26(m，1H，与D2O可交换，3’-OH)，4.97(m，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.62(m，1H，CH)，4.31(m，2H，CH2)，4.30(m，1H，H-3’)，3.98(m，2H，CH2)，3.78(m，1H，H-4’)，3.55(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.08(m，2H，H-2’a和H-2’b)，1.77(m，1H，CH)，0.82(m，6H，2CH3)；
5-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(dT.19)
在0℃下将POCl3(8μL，0.09mmol)加入到化合物dT.18(34mg，0.06mmol)和质子海绵体(26mg，0.12mmol)在磷酸三甲酯(0.3mL)中的溶液中，搅拌2小时。再加入POCl3(4μL，0.045mmol)，再搅拌1小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(142mg，0.3mmol)和三正丁胺(60μL)在无水DMF(0.6mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后在0℃下逐滴加入浓氢氧化铵(5mL，27％)。室温下再搅拌混合物1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用QSepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在240分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速纯化部分溶液。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的三磷酸酯dT.19(非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.06和8.04(2s，1H，Ph-H)，7.78(m，1H，Ph-H)，7.69-7.59(m，2H，H-6和Ph-H)，6.13(m，1H，H-1’)，4.55(m，1H，H-3’)，4.46和4.34(2d，2H，CH2)，4.20(m，3H，H-4’和H-5’)，3.87和3.83(2s，2H，CH2)，2.40-2.20(m，2H，H-2’)，1.99(m，1H，CH)，1.02(m，3H，CH3)，0.79(m，3H，CH3)；
非对映体的31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.15(d，J＝19.8Hz)，-10.48和-10.54(2d，J＝19.6Hz)，-21.0(m)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C23H30N4O17P3[M-H]-而言，计算质量为727.0819，实测质量为727.0828。
6-JOE标记的5-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p150)
将6-JOE-SE(0.75mg，1.2μmol)在无水DMSO(30μL)中的溶液加入到三磷酸酯WW2p145(0.47μmol)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH 9.2；0.3mL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC纯化反应，得到6-JOE标记的三磷酸酯WW2p150。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行HPLC纯化。利用6-JOE染料的消光系数(即在520nm下的75,000)通过吸收光谱估计WW2p150的浓度。
6-JOE标记的5-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(WW3p024)的合成
Figure G2007800494372D00901
方案.6-JOE标记的5-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸的合成。(i)(S或R)-1-(4-碘-2-硝基苯基)-2-甲基丙醇，不含水，108℃，45分钟，20％；(ii)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、无水DMF，4.5小时，81％；(iii)POCl3、质子海绵体、(MeO)3PO，0℃，2小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF；1M HNEt3HCO3，1小时；NH4OH，2小时；(iv)6-JOE-SE，0.1M Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH 9.2)，1小时。
5-[(R或S)-1-(4-碘-2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷(dT.20)
在N2气氛和108℃下，加热化合物dT.12(143mg，0.22mmol)和对映体纯(S或R)-1-(4-碘-2-硝基苯基)-2-甲基乙醇(282mg，0.88mmol，绝对构型未测定)45分钟。将混合物冷却至室温，溶解在乙酸乙酯中，通过硅胶柱色谱纯化，得到腊状固体的5-[(R或S)-1-(4-碘-2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷dT.20(25mg，20％，绝对构型未测定)。
1H NMR(400MHz，MeOH-d4)δ8.22(d，1H，J＝1.8Hz，H-6)，8.01(m，2H，Ph-H)，7.50(d，1H，J＝8.3Hz，Ph-H)，6.25(t，1H，J＝7.2Hz，H-1’)，4.69(d，1H，J＝5.8Hz，PhCH)，4.41(m，1H，H-3’)，4.10(m，2H，CH2)，3.92(m，1H，H-4’)，3.75(m，2H，H-5’a)，2.17(m，1H，H-2’a)，2.15(m，1H，H-2’b)，1.90(m，1H，CH)，0.92(m，3H，CH3)，0.85(m，3H，CH3)；
5-{(R或S)-1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷(dT.21)
室温下将化合物dT.20(24mg，0.043mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(28mg，0.186mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(7.2mg，0.006mmol)、CuI(2.4mg，0.012mmol)和Et3N(17μL，0.124mmol)在无水DMF(1.5mL)中的溶液搅拌4.5小时。在真空下浓缩混合物，通过硅胶柱色谱纯化，得到腊状固体的5-{(R或S)-1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷dT.21(19.8mg，81％，绝对构型未测定)。
1H NMR(400MHz，MeOH-d4)：δ8.01(br s，1H，H-6)，7.95(d，1H，J＝1.2Hz，Ph-H)，7.72(m，2H，Ph-H)，6.25(t，1H，J＝6.7Hz，H-1’)，4.74(d，1H，J＝5.8Hz，PhCH)，4.38(m，1H，H-3’)，4.34(s，2H，CH2)，4.05(m，2H，CH2)，3.55，3.93(m，1H，H-4’)，3.77(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.15(m，2H，H-2’a和H-2’b)，1.90(m，1H，CH)，0.92(m，6H，2×CH3)；
5-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(dT.22)
在0℃下将POCl3(6μL，0.06mmol)加入到化合物dT.21(18mg，0.03mmol)和质子海绵体(13mg，0.06mmol)在磷酸三甲酯(0.3mL)中的溶液中，搅拌2小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(73mg，0.15mmol)和三正丁胺(30μL)在无水DMF(0.3mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；5mL)。室温下搅拌反应1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(5mL)中，过滤，通过Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC纯化反应纯化部分溶液，得到5-{(R或S)-1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行HPLC纯化。然后利用浓氢氧化铵(27％；0.5mL)在室温下处理所纯化的三磷酸酯2小时，得到5-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(dT.22，绝对构型未测定)。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.01(s，1H，Ph-H)，7.76(d，1H，J＝6.9Hz，Ph-H)，7.62(m，2H，H-6和Ph-H)，6.17(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，4.55(m，1H，H-3’)，4.39和4.29(2d，2H，J＝6.4Hz，CH2)，4.17(m，3H，H-4’和H-5’)，3.74(s，2H，CH2)，2.28(m，2H，H-2’)，2.00(m，1H，CH)，0.79(m，3H，CH3)；
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.40(d，J＝19.4Hz)，-10.75(d，J＝19.4Hz)，-21.23(t，J＝19.4Hz).
6-JOE标记的5-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸(WW3p024)
将6-JOE-SE(0.625mg，1μmol)在无水DMSO(25μL)中的溶液加入到三磷酸酯dT.22(0.31μmol)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH9.2；180μL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC纯化反应，得到6-JOE标记的三磷酸酯WW3p024。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行HPLC纯化。利用6-JOE染料的消光系数(即在520nm下的75,000)通过吸收光谱估计WW3p024的浓度。
实施例3：dC化合物
N4-(2-硝基苄基)-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸(WW2p044)的合成
Figure G2007800494372D00931
方案.N4-(2-硝基苄基)-2’-脱氧胞苷三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、无水DMF，室温，过夜，84％；(ii)Boc2O、DMAP、Et3N、CH2Cl2，室温，过夜，56％；(iii)2-硝基苄基溴，NaH、无水DMF，0℃，然后逐渐温热至室温，过夜，37％；(iv)SiO2，真空，70-80℃，48小时，79％；(v)n-Bu4NF、THF，0℃，然后逐渐温热至室温，2小时，59％；(vi)POCl3、质子海绵体、(MeO)3PO，0℃，2小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分钟；1MHNEt3HCO3，1小时，52％。
3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧胞苷(dC.01)
在N2气氛和室温下将2’-脱氧胞苷dC(2.85g，12.54mmol)、咪唑(6.49g，95.31mmol)和TBSCl(7.18g，47.65mmol)加入到无水DMF(27mL)中并搅拌过夜。加入甲醇(20mL)，搅拌混合物30分钟，然后在真空下浓缩。然后加入乙酸乙酯(60mL)和水(60mL)。分离有机层，用水清洗2次(20mL)，用乙酸乙酯(20mL)萃取合并的水层。利用Na2SO4干燥合并的有机层，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫状的3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧胞苷dC.01(4.79g，84％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.95(d，1H，J＝7.4Hz，H-6)，6.26(t，1H，J＝5.6Hz，H-1’)，5.69(d，1H，J＝7.4Hz，H-5)，4.37(m，1H，H-3’)，3.90(m，2H，H-4’和H-5’a)，3.76(m，1H，H-5’b)，2.40(m，1H，H-2’a)，2.08(m，1H，H-2’b)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.87(s，9H，(CH3)3CSi)，0.10(s，6H，(CH3)2Si)，0.05(s，6H，(CH3)2Si).
N4-叔丁氧羰基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧胞苷(dC.02)
在氮气气氛下，将二碳酸二叔丁酯(0.34g，1.58mmol)在无水CH2Cl2(3mL)中的溶液缓慢加入到化合物dC.01(0.5g，1.10mmol)、Et3N(0.15mL，1.10mmol)和DMAP(0.13g，1.10mmol)在无水CH2Cl2(5mL)中的溶液中。室温下搅拌混合物过夜，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化残留物，得到白色泡沫状的N4-叔丁氧羰基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧胞苷dC.02(0.34g，56％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.30(d，1H，J＝7.4Hz H-6)，7.47(bs，1H，NH)，7.14(d，1H，J＝7.4Hz，H-5)，6.25(t，1H，J＝5.6Hz，H-1’)，4.38(m，1H，H-3’)，3.95(m，2H，H-4’和H-5’a)，3.78(m，1H，H-5’)，2.50(m，1H，H-2’a)，2.10(m，1H，H-2’b)，1.51(s，9H，(CH3)3CO)，0.93(s，9H，(CH3)3CSi)，0.88(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(s，6H，(CH3)2Si)，0.06(s，6H，(CH3)2Si).
N4-叔丁氧羰基-N4-(2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧胞苷(dC.03)
0℃下将NaH(32mg，1.26mmol，干燥的)加入到化合物dC.02(540mg，0.97mmol)在无水DMF(6mL)中的溶液中，并在氮气气氛下搅拌30分钟。逐滴加入2-硝基苄基溴(313mg，1.45mmol)在无水DMF(1.5mL)中的溶液。将反应混合物逐渐温热至室温并搅拌过夜。加入乙酸乙酯(60mL)后，利用饱和NH4Cl溶液(40mL)清洗混合物3次，用乙酸乙酯(40mL)萃取合并的水层。利用Na2SO4干燥合并的有机层，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫状的N4-叔丁氧羰基-N4-(2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧胞苷dC.03(250mg，37％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.29(d，1H，J＝7.6Hz，H-6)，8.05(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.53(t，1H，J＝7.5Hz，Ph-H)，7.38(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.28(m，2H，Ph-H和H-5)，6.26(t，1H，J＝5.6Hz，H-1’)，5.60(q，2H，Ph-CH2)，4.41(m，1H，H-3’)，3.96(m，2H，H-4’和H-5’a)，3.80(m，1H，H-5’b)，2.51(m，1H，H-2’a)，2.15(m，1H，H-2’b)，1.28(s，9H，(CH3)3CO)，0.95(s，9H，(CH3)3CSi)，0.88(s，9H，(CH3)3CSi)，0.14(s，6H，(CH3)2Si)，0.07(s，6H，(CH3)2Si).
N4-(2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧胞苷(dC.04)
将硅胶60(2.5g，100-200目，通过在减压下加热至50-60℃24小时活化)加入到化合物dC.03(250mg，0.36mmol)在CH2Cl2(5mL)中的溶液中，将混合物在真空下蒸干。减压下将残留物加热至60-70℃48小时，利用甲醇(30mL)清洗3次，利用布氏漏斗过滤。在真空下浓缩合并的滤液，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫状的N4-(2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧胞苷dC.04(0.185g，79％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.02(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.92(d，1H，J＝7.2Hz，H-6)，7.79(d，1H，J＝7.5Hz，Ph-H)，7.57(t，1H，J＝7.3Hz，Ph-H)，7.41(t，1H，J＝7.5Hz，Ph-H)，6.38(bs，1H，NH)，6.26(t，1H，J＝5.2Hz，H-1’)，5.68(d，1H，J＝7.2Hz，H-5)，4.92(m，2H，Ph-CH2)，4.36(m，1H，H-3’)，3.88(m，2H，H-4’和H-5’a)，3.75(m，1H，H-5’b)，2.39(m，1H，H-2’a)，2.07(m，1H，H-2’b)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.87(s，9H，(CH3)3CSi)，0.09(s，6H，(CH3)2Si)，0.05(s，6H，(CH3)2Si).
N4-(2-硝基苄基)-2’-脱氧胞苷(dC.05)
在氮气气氛下于0℃下将n-NBu4F(190mg，0.73mmol)在THF(1.4mL)中的溶液逐滴加入到化合物dC.04(170mg，0.29mmol)在THF(3.4mL)中的溶液中。搅拌反应混合物2小时，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫状的N4-(2-硝基苄基)-2’-脱氧胞苷dC.05(62mg，59％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.23(t，1H，与D2O可交换，NH)，8.07(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.83(d，1H，J＝7.4Hz，H-6)，7.74(t，1H，J＝7.5Hz，Ph-H)，7.54(m，2H，Ph-H)，6.13(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，5.91(d，1H，J＝7.4Hz，H-5)，5.19(d，1H，与D2O可交换，3’-OH)，4.97(t，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.78(m，2H，Ph-CH2)，4.19(m，1H，H-3’)，3.76(m，1H，H-4’)，3.55(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.09(m，1H，H-2’a)，1.93(m，1H，H-2’b)；
13C NMR(100MHz，CD3OD)：δ165.71，158.51，149.70，141.75，135.09，134.73，131.30，129.43，125.94，96.75，88.83，87.57，72.03，62.78，42.71，42.00.
N4-(2-硝基苄基)-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸(WW2p044)
在0℃下将POCl3(17μL，0.2mmol)加入到化合物dC.05(36mg，0.1mmol)和质子海绵体(32mg，0.15mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中并搅拌2小时。再加入POCl3(9μL，0.1mmol)，再搅拌1小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(237mg，0.5mmol)和三正丁胺(100μL)在无水DMF(1mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后在0℃下逐滴加入浓氢氧化铵(5mL，27％)。室温下再搅拌混合物1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用QSepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在300分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的三磷酸酯WW2p044(34mg，52％)。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.12(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.83(d，1H，J＝7.6Hz，H-6)，7.69(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.60(d，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.53(t，1H，J＝8.0和7.6Hz，Ph-H)，6.29(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，6.15(d，1H，J＝7.6Hz，H-5)，4.85(bs，2H，Ph-CH2)，4.58(m，1H，H-3’)，4.21(m，3H，H-4’，H-5’a和H-5’b)，2.38(m，1H，H-2’a)，2.28(m，1H，H-2’b)；
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.61(d，J＝15.9Hz)，-10.60(d，J＝15.4Hz)，-19.26(br)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C16H21N4O15P3Na[M+Na]+而言，计算质量为625.0114，实测质量为624.9993。
N4-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸和染料标记(WW2p080)的合成
Figure G2007800494372D00981
方案.6-TAMRA标记的N4-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸的合成。(i)4-碘-2-硝基苄基溴、n-Bu4NBr、CH2Cl2、1MNaOH，室温，4小时，45％；(ii)N-炔丙基三氟乙酰胺、PdCl2(PPh3)2、CuI、Et3N、THF，回流，3小时，82％；(iii)SiO2，真空，70-80℃，48小时，81％；(iv)n-Bu4NF、THF，0℃，2小时，然后室温过夜，39％；(v)POCl3、质子海绵体、(MeO)3PO，0℃，2小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分钟；1M HNEt3HCO3，1小时；NH4OH，1小时，39％；(vi)6-TAMRA-SE，0.1M Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH 9.2)，1小时。
N4-叔丁氧羰基-N4-(4-碘-2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧胞苷(dC.06)
将4-碘-2-硝基苄基溴(461mg，1.35mmol)在CH2Cl2(4mL)中的溶液逐滴加入到化合物dC.02(250mg，0.45mmol)和n-Bu4NBr(145mg，0.45mmol)在CH2Cl2(4mL)和NaOH(1M；4.5mL)中的混合物中。室温下强烈搅拌反应4小时。分离有机层，利用CH2Cl2萃取水层2次(每次4mL)。利用Na2SO4干燥合并的有机层，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫状的N4-叔丁氧羰基-N4-(4-碘-2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧胞苷dC.06(167mg，45％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.37(d，1H，J＝1.8Hz，Ph-H)，8.30(d，1H，J＝7.5Hz，H-6)，7.82(dd，1H，J＝1.8Hz和8.3Hz，Ph-H)，7.26(d，1H，J＝7.5Hz，H-5)，6.99(d，1H，J＝8.4Hz，Ph-H)，6.24(dd，1H，J＝63和5.0Hz，H-1’)，5.52(q，2H，Ph-CH2)，4.41(m，1H，H-3’)，3.96(m，2H，，H-4’和H-5’a)，3.80(m，1H，H-5’b)，2.51(m，1H，H-2’a)，2.14(m，1H，H-2’b)，1.34(s，9H，(CH3)3CO)，0.95(s，9H，(CH3)3CSi)，0.89(s，9H，(CH3)3CSi)，0.14(s，3H，(CH3)Si)，0.13(s，3H，(CH3)Si)，0.08(s，3H，(CH3)Si)，0.07(s，3H，(CH3)Si).
N4-叔丁氧羰基-N4-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧胞苷(dC.07)
在氮气气氛下，将双(三苯基膦)二氯化钯(II)(41mg，0.058mmol)在无水THF(3mL)中的溶液快速加入到化合物dC.06(315mg，0.39mmol)、CuI(15mg，0.078mmol)、Et3N(0.73mL，5.2mmol)和N-炔丙基三氟乙酰胺(82mg，0.54mmol)在无水THF(7mL)中的混合物中。将反应混合物回流2小时，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫状的N4-叔丁氧羰基-N4-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧胞苷dC.07(268mg，82％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.33(d，1H，J＝7.7Hz，H-6)，8.03(d，1H，J＝1.5Hz，Ph-H)，7.61(bs，1H，NH)，7.50(dd，1H，J＝1.5Hz和8.2Hz，Ph-H)，7.32(d，1H，J＝7.7Hz，H-5)，7.18(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.24(t，1H，J＝6.0Hz，H-1’)，5.56(q，2H，PhCH2)，4.42(m，1H，H-3’)，4.35(d，2H，CH2)，3.97(m，2H，H-5’a和H-4’)，3.80(m，1H，H-5’b)，2.50(m，1H，H-2’a)，2.05(m，1H，H-2’b)，1.31(s，9H，(CH3)3CO)，0.96(s，9H，(CH3)3CSi)，0.89(s，9H，(CH3)3CSi)，0.15(s，3H，(CH3)Si)，0.14(s，3H，(CH3)Si)，0.07(s，6H，(CH3)2Si).
N4-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧胞苷(dC.08)
将硅胶60(3.1g，100-200目，通过在减压下加热至50-60℃24小时活化)加入到化合物dC.07(305mg，0.36mmol)在CH2Cl2(4mL)的溶液中，将混合物在真空下蒸干。减压下将残留物加热至60-70℃24小时，利用甲醇(30mL)清洗3次，利用布氏漏斗过滤。在真空下浓缩合并的滤液，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫状的N4-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧胞苷dC.08(219mg，81％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.25(bs，1H，N-H)，7.94(d，1H，J＝7.4Hz，H-6)，7.84(s，1H，Ph-H)，7.62(d，1H，J＝7.7Hz，Ph-H)，7.41(d，1H，J＝7.8Hz，Ph-H)，6.25(m，2H，N-H和H-1’)，5.67(d，1H，J＝7.3Hz，H-5’)，4.83(m，2H，Ph-CH2)，4.38(m，2H，CH2和H-3’)，3.90(m，2H，H-4’和H-5’a)，3.75(m，1H，H-5’b)，2.36(m，1H，H-2’a)，2.05(m，1H，H-2’b)，0.90(s，9H，(CH3)3CSi)，0.87(s，9H，(CH3)3CSi)，0.08(s，6H，(CH3)2Si)，0.05(s，6H，(CH3)2Si).
N4-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-2’-脱氧胞苷(dC.09)
在氮气气氛和0℃下将n-Bu4NF(94mg，0.36mmol)在THF(2.5mL)中的溶液逐滴加入到化合物dC.08(200mg，0.27mmol)在THF(1mL)中的溶液中。将反应混合物在0℃下搅拌2小时，然后在室温下过夜，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫状的N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-2’-脱氧胞苷dC.09(54mg，39％)。
1H NMR(400MHz，(DMSO-d6)：δ10.12(t，1H，N-H)，8.26(t，1H，N-H)，8.08(s，1H，Ph-H)，7.84(d，1H，J＝7.5Hz，H-6)，7.78(d，1H，J＝8.1Hz，Ph-H)，7.50(d，1H，J＝8.1Hz，Ph-H)，6.13(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，5.91(d，1H，J＝7.4Hz，H-5)，5.20(d，1H，3’-OH)，5.10(t，1H，5’-OH)，4.77(d，2H，Ph-CH2)，4.35(m，1H，H-3’)，4.31(m，2H，CH2)，3.80(m，1H，H-4’)，3.55(m，2H，H-5’)，2.10(m，1H，H-2’a)，1.92(m，1H，H-2’b).
N4-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸(dC.10)
在0℃下将POCl3(18μL，0.2mmol)加入到化合物dC.09(49mg，0.1mmol)和质子海绵体(32mg，0.15mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中并搅拌2小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(237mg，0.5mmol)和三正丁胺(100μL)在无水DMF(1mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后在0℃下逐滴加入浓氢氧化铵(5mL，27％)。室温下再搅拌混合物1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在300分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的三磷酸酯dC.10(28mg，39％)。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.22(s，1H，Ph-H)，7.88(d，1H，J＝7.6Hz，H-6)，7.74(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.59(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，6.33(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，6.18(d，1H，J＝7.6Hz，H-5)，4.61(m，1H，H-3’)，4.24(m，3H，H-4’，H-5’)，3.63(s，2H，CH2)，2.42(m，1H，H-2’a)，2.29(m，1H，H-2’b)；
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.88(d，J＝15.6Hz)，-10.69(d，J＝15.6Hz)，-19.25(t，J＝15.6Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C19H22N5O15P3Na[M-2H+Na]-而言，计算质量为676.0223，实测质量为676.0563。
6-TAMRA标记的N4-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸(WW2p080)
将6-TAMRA-SE(0.75mg，1.4μmol)在无水DMSO(30μL)中的溶液加入到三磷酸酯dC.10(1.6μmol)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH9.2；0.3mL)中的溶液中，并在室温下孵育30分钟。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC纯化反应，得到6-TAMRA标记的三磷酸酯WW2p080。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行HPLC纯化。利用6-TAMRA染料的消光系数(即在555nm下的65,000)通过吸收光谱估计WW2p080的浓度。
N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸(WW2p115)的合成
Figure G2007800494372D01041
方案.N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、DMF，室温，3小时，92％；(ii)TPSCl、DMAP、CH2Cl2，室温，88％；(iii)1-(2-硝基苯基)乙胺dC.13c、DMF，90℃，1.5小时，39％；(iv)n-Bu4NF、THF，0℃，2小时，然后室温，1小时，90％；(v)POCl3，质子海绵体、(MeO)3PO，0℃，2小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分钟；1M HNEt3HCO3，1小时。
3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧尿苷(dC.11)
在氮气气氛下于0℃下将2’-脱氧尿苷dU(2.5g，10.95mmol)，TBSCl(7.26g，48.2mmol)和咪唑(6.56g，96.4mmol)在无水DMF(25mL)中的混合物搅拌2小时，然后在1小时内温热至室温。在真空下浓缩反应混合物，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫状的3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧尿苷dC.11(4.62g，92％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ9.48(s，1H，NH)，7.80(d，1H，J＝8.1Hz，H-6)，6.19(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.59(d，1H，J＝8.1Hz，H-5)，4.31(m，1H，H-3’)，3.81(m，2H，H-4’和H-5’a)，3.65(m，1H，H-5’b)，2.21(m，1H，H-2’a)，1.97(m，1H，H-2’b)，0.81(s，9H，(CH3)3CSi)，0.79(s，9H，(CH3)3CSi)，0.00(s，6H，(CH3)2Si)，-0.02(2s，各3H，(CH3)2Si).
O4-(2，4，6-三异丙基苯磺酰基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧尿苷(dC.12)
在氮气气氛下将2，4，6-三异丙基苯磺酰氯(660mg，2.19mmol)加入到化合物dC.11(500mg，1.09mmol)、DMAP(6.7mg，催化量)和Et3N(0.62mL，4.38mmol)在无水CH2Cl2(6mL)中的溶液中。室温下搅拌反应混合物过夜，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫状的O4-(2，4，6-三异丙基苯磺酰基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧尿苷dC.12(690mg，88％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.46(d，1H，J＝7.3Hz，H-6)，7.20(s，2H，Ph-H)，6.08(dd，1H，J＝4.3Hz，H-1’)，6.01(d，1H，J＝7.3Hz，H-5)，4.33(m，1H，H-3’)，4.25(m，2H，CH)，3.94(m，2H，H-4’和H-5’a)，3.76(m，1H，H-5’b)，2.91(m，1H，CH)，2.48(m，1H，H-2’a)，2.12(m，1H，H-2’b)，1.31(d，6H，CH3)，1.26(dd，12H，CH3)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.86(s，9H，(CH3)3CSi)，0.10和0.09(2s，6H，(CH3)2Si)，0.04(s，6H，(CH3)2Si).
N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧胞苷(dC.13)
将化合物dC.12(410mg，0.56mmol)和1-(2-硝基苯基)乙胺dC.13c(470mg，2.82mmol)在无水DMF(3mL)中的溶液加热至90℃1.5小时，然后在真空下浓缩。将残留物溶解在CH2Cl2(50mL)中，利用饱和NH4Cl溶液(30mL)、水(30mL)清洗，利用饱和NaHCO3溶液(30mL)清洗。利用Na2SO4干燥有机层，过滤，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫状的N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧尿苷dC.13(130mg，39％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.97(m，1H，Ph-H)，7.89(d，1H，J＝7.1Hz，H-6)，7.65(m，2H，Ph-H，7.41(m，1H，Ph-H)，6.19(m，1H，H-1’)，5.91(m，1H，H-5)，5.37(m，1H，Ph-CH)，4.34(m，1H，H-3’)，3.86(m，2H，H-4’和H-5’a)，3.72(m，1H，H-5’b)，2.05(m，1H，H-2’a)，1.83(m，1H，H-2’b)，1.59(bs，3H，CH3)，0.86(s，12H，(CH3)3CSi)，0.03(s，12H，(CH3)2Si).
N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脱氧胞苷(dC.14)
在0℃下将n-Bu4NF(142mg，0.54mmol)在THF(3mL)中的溶液加入到化合物dC.13(130mg，0.22mmol)在THF(2mL)中的溶液中。将反应混合物在0℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌1小时，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色粉末的N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脱氧胞苷dC.14(80mg，90％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.95(m，2H，Ph-H和H-5)，7.65(m，2H，Ph-H)，7.45(m，1H，Ph-H)，6.22(m，1H，H-1’)，5.97(m，1H，H-5)，5.74(m，1H，Ph-CH)，4.34(m，1H，H-3’)，3.93(m，1H，H-4’)，3.75(m，2H，H-5’)，2.32(m，1H，H-2’a)，2.09(m，1H，H-2’b)，1.59(m，3H，CH3).
N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸(WW2p115)
在0℃下将POCl3(14μL，0.15mmol)加入到化合物dC.14(28mg，0.08mmol)和质子海绵体(23mg，0.11mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中并搅拌2小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(180mg，0.38mmol)和三正丁胺(80μL)在无水DMF(0.8mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在300分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的三磷酸酯WW2p115(24mg，47％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，D2O)：δ7.98(m，1H，Ph-H)，7.80(m，1H，H-6)，7.66(m，2H，Ph-H)，7.49(m，1H，Ph-H)，6.24(m，1H，H-1’)，6.11(m，1H，H-5)，5.60(m，1H，Ph-CH)，4.55(m，1H，H-3’)，4.19(m，3H，H-4’和H-5’)，2.35(m，1H，H-2’a)，2.24(m，1H，H-2’b)，1.59(d，3H，J＝6.7Hz，CH3)；
非对映体的31P NMR(162MHz，D2O)：δ-6.00(d，J＝14.1Hz)，-10.82(d，J＝15.6Hz)，-19.36(t，J＝15.9Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C17H23N4O15P3Na[M+Na]+而言，计算质量为639.0271，实测质量为639.0332。
1-(2-硝基苯基)乙胺(dC.13c)的合成
Figure G2007800494372D01071
dC.13c的方案.1-(2-硝基苯基)乙胺的合成。(i)NaBH4、MeOH、二噁烷，室温，1小时，92％；(ii)邻苯二甲酰亚胺、DIAD、Ph3P、THF，0℃，3小时，99％；(iii)NH2NH2、CH3CH2OH，回流，1小时，80％。
1-(2-硝基苯基)乙醇(dC.13a)
将NaBH4(3.24g，85.60mmol)缓慢加入到2’-硝基苯乙酮NAP(3.74g，22.65mmol)在甲醇(34mL)和二噁烷(22mL)混合物中的溶液中。室温下搅拌反应混合物1小时，然后用乙酸乙酯(100mL)稀释，利用水(25mL)清洗。利用Na2SO4干燥有机层，过滤，在真空下浓缩，得到白色粉末的1-(2-硝基苯基)乙醇dC.13a(3.49g，92％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.89(d，1H，J＝8.1Hz，Ph-H)，7.83(d，1H，J＝7.4Hz，Ph-H)，7.65(t，1H，J＝7.4Hz，Ph-H)，7.42(t，1H，J＝8.1Hz，Ph-H)，5.41(q，1H，J＝6.0Hz，Ph-CH)，2.48(s，1H，OH)，1.57(d，3H，J＝6.4Hz，CH3).
N-[1-(2-硝基苯基)乙基]邻苯二甲酰亚胺(dC.13b)
将邻苯二甲酰亚胺(660mg，4.5mmol)加入到化合物dC.13a(750mg，4.5mmol)和Ph3P(1.41g，5.4mmol)在THF(12mL)中的溶液中。将混悬液冷却至0℃并搅拌10分钟，然后逐滴加入偶氮二甲酸二异丙酯(1.1mL，5.4mmol)。在0℃搅拌3小时后，在真空下浓缩反应混合物，通过硅胶柱色谱纯化，得到褐色油状的N-[1-(2-硝基苯基)乙基]邻苯二甲酰亚胺dC.13b(1.33g，99％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.93(d，1H.J＝7.9Hz，Ph-H)，7.81(m，3H，Ph-H)，7.71(m，2H，Ph-H)，7.61(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.44(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，6.08(q，1H，J＝7.2Hz，Ph-CH)，1.97(d，3H，J＝7.2Hz，CH3).
1-(2-硝基苯基)乙胺(dC.13c)
将化合物dC.13b(1.33g，4.5mmol)溶解在加热至50℃的乙醇(21mL)中，然后冷却至室温。加入肼(0.55mL，11.22mmol)，将反应混合物回流1小时，然后用冰进行冷却。加入乙醚(40mL)以沉淀所述化合物，通过过滤分离所述化合物，用乙醚清洗2次(每次40mL)。用水清洗合并的滤液2次(每次40mL)，然后用盐水(40mL)清洗。利用Na2SO4干燥有机层，在真空下浓缩，得到褐色油状的1-(4-碘-2-硝基苯基)乙胺dC.13c(600mg，80％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.78(m，2H.Ph-H)，7.61(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.37(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，4.59(q，1H，J＝6.4Hz，Ph-CH)，1.45(d，3H，J＝6.4Hz，CH3).
N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷-5’-三磷酸(WW2p152和WW3p026)的合成
Figure G2007800494372D01101
方案.N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷-5’-三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、DMF，室温，60小时，95％；(ii)TPSCl、Et3N、DMAP、CH2Cl2，室温，过夜，80％；(iii)1-(2-硝基苯基)乙胺、DMF，90℃，45分钟；n-Bu4NF、THF、0℃，然后逐渐温热至室温，2小时，对于非对映体而言为60％；(iv)POCl3、质子海绵体、(MeO)3PO、0℃，2小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分钟；1M HNEt3HCO3，1小时。
2’，3’，5’-O-三-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷(C.1)
在氮气气氛和0℃下将TBSCl(995mg，6.6mmol)加入到尿苷(244mg，1mmol)和咪唑(898mg，13.2mmol)在无水DMF(5mL)中的溶液中。将混合物温热至室温，搅拌60小时。加入乙酸乙酯(30mL)，用饱和NH4Cl溶液清洗混合物2次(每次20mL)，用水(20mL)清洗，利用Na2SO4干燥，浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫状的2’，3’，5’-O-三-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷C.1(558mg，95％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.79(s，1H，NH)，8.03(d，1H，J＝8.2Hz，H-6)，5.87(d，1H，J＝3.5Hz，H-1’)，5.68(d，1H，J＝8.2Hz，H-5)，4.08(m，3H，H-2’，H-3’和H-4’)，3.99(d，1H，J＝11.6Hz，H-5’a)，3.77(d，1H，J＝11.6Hz，H-5’b)，0.95(s，9H，(CH3)3CSi)，0.91和0.90(2s，18H，(CH3)3CSi)，0.09(5s，18H，(CH3)2Si).
O4-(2，4，6-三异丙基苯磺酰基)-2’，3’，5’-O-三-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷(C.2)
在氮气气氛下将2，4，6-三异丙基苯磺酰氯(557mg，1.84mmol)加入到化合物C.1(540mg，0.92mmol)、DMAP(12mg，催化量)和Et3N(0.5mL，3.68mmol)在无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中。室温下搅拌混合物过夜，加入CH2Cl2(20mL)，利用饱和NH4Cl溶液(15mL)清洗，利用Na2SO4干燥，浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色泡沫状的O4-(2，4，6-三异丙基苯磺酰基)-2’，3’，5’-O-三-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷C.2(629mg，80％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.62(d，1H，J＝7.3Hz，H-6)，7.20(s，2H，Ph-H)，5.99(d，1H，J＝7.3Hz，H-5)，5.68(d，1H，J＝1.0Hz，H-1’)，4.23(m，2H，CH)，4.09(m，3H，H-2’，H-3’和H-4’)，4.00(m，1H，H-5’a)，3.78(1H，d，J＝11.8Hz，H-5’b)，2.90(m，1H，CH)，1.31(d，6H，CH3)，1.26(dd，12H，CH3)，0.94(s，9H，(CH3)3CSi)，0.88(2s，18H，(CH3)3CSi)，0.17-0.05(6s，18H，(CH3)2Si).
N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷(单一非对映体C.3ds1和C.3ds2)
将化合物C.2(476mg，0.56mmol)和1-(2-硝基苯基)乙胺dC.13c(498mg，3mmol)在无水DMF(4mL)中的溶液在90℃下加热45分钟。加入乙酸乙酯(40mL)，将混合物用饱和NH4Cl溶液(20mL)和水(20mL)清洗，利用Na2SO4干燥，浓缩。通过硅胶柱色谱分离两种非对映体，得到N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’，3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-胞苷单一非对映体ds1(快速洗脱，290mg)和ds2(缓慢洗脱，203mg)。两种非对映体均不需进一步纯化而直接用在下一步中。
N4-[(R或S)-1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷(单一非对映体C.3ds1)
在0℃下将n-Bu4NF(235mg，0.9mmol)在THF(3mL)中的溶液加入到N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’，3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-胞苷单一非对映体ds1(264mg)在THF(4mL)中的溶液中。将反应混合物逐渐温热至室温并搅拌2小时。加入硅胶60(1g)，将混合物在真空下蒸干。通过硅胶柱色谱纯化残留物，得到白色泡沫状的N4-[(R或S)-1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷单一非对映体C.3ds1(65mg，两步大约为30％，绝对构型未测定)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.39(d，1H，与D2O可交换，NH)，7.92(dd，1H，J＝1.1和8.1Hz，Ph-H)，7.82(d，1H，J＝7.5Hz，H-6)，7.70(dt，1H，J＝1.1和7.5Hz，Ph-H)，7.64(dd，1H，J＝1.2和7.5Hz，Ph-H)，7.49(dt，1H，J＝1.3和7.5Hz，Ph-H)，1H，Ph-H)，5.80(d，1H，J＝7.5Hz，H-5)，5.65(d，1H，J＝3.4Hz，H-1’)，5.50(m，1H，Ph-CH)，5.30(d，1H，与D2O可交换，3’-OH)，5.02(t，1H，D2O与D2O可交换，5’-OH)，4.96(d，1H，与D2O可交换，2’-OH)，3.90(m，2H，H-2’和H-3’)，3.78(m，1H，H-4’)，3.59(m，1H，H-5’a)，3.50(m，1H，H-5’b)，1.48(d，3H，J＝6.9Hz，CH3).
N4-[(S或R)-1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷(单一非对映体C.3ds2)
在0℃下将n-Bu4NF(167mg，0.64mmol)在THF(2mL)中的溶液加入到N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’，3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-胞苷单一非对映体ds2(188mg)在THF(3mL)中的溶液中。将反应混合物逐渐温热至室温并搅拌1小时。加入硅胶60(1g)，将混合物在真空下蒸干。通过硅胶柱色谱纯化残留物，得到白色泡沫状的N4-[(S或R)-1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷单一非对映体C.3ds2(67mg，两步大约为30％，绝对构型未测定)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.38(d，1H，与D2O可交换，NH)，7.92(dd，1H，J＝1.1和8.1Hz，Ph-H)，7.80(d，1H，J＝7.5Hz，H-6)，7.72(dt，1H，J＝1.0和7.5Hz，Ph-H)，7.63(dd，1H，J＝1.1和7.5Hz，Ph-H)，7.49(dt，1H，J＝1.3和7.5Hz，Ph-H)，5.79(d，1H，J＝7.5Hz，H-5)，5.68(d，1H，J＝4.0Hz，H-1’)，5.51(m，1H，Ph-CH)，5.20(d，1H，与D2O可交换，3’-OH)，5.01(t，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.93(d，1H，与D2O可交换，2’-OH)，3.87(m，2H，H-2’和H-3’)，3.78(m，1H，H-4’)，3.59(m，1H，H-5’a)，3.50(m，1H，H-5’a)，1.49(d，3H，J＝6.9Hz，CH3).
N4-[(R或S)-1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷-5’-三磷酸单一非对映体(WW3p026)
将POCl3(14μL，0.15mmol)加入到化合物C.3ds1(29mg，0.074mmol)和质子海绵体(32mg，0.15mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中并搅拌2小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(175mg，0.37mmol)和三正丁胺(74μL)在无水DMF(0.74mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC纯化部分溶液，得到N4-[(R或S)-1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷-5’-三磷酸单一非对映体WW3p026(绝对构型未测定)。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行HPLC纯化。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.0(d，1H，J＝8.1Hz，Ph-H)，7.92(d，1H，J＝7.6Hz，H-6)，7.70(m，2H，Ph-H)，7.50(t，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，6.14(d，1H，J＝7.6Hz，H-5)，5.92(d，1H，J＝4.1Hz，H-1’)，5.61(q，1H，J＝6.8Hz，Ph-CH)，4.33-4.21(m，3H，H-2’，H-3’和H-4’)，4.01(m，2H，H-5’)，1.60(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)；
N4-[(S或R)-1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷-5’-三磷酸单一非对映体(WW2p152)
在0℃下将POCl3(11μL，0.12mmol)加入到化合物C.3ds2(31mg，0.08mmol)和质子海绵体(26mg，0.12mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中并搅拌2小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(190mg，0.4mmol)和三正丁胺(80μL)在无水DMF(0.8mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在240分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的N4-[(S或R)-1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷-5’-三磷酸单一非对映体WW2p152(26mg，47％，绝对构型未测定)。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ7.99(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.82(d，1H，J＝7.6Hz，H-6)，7.68(m，2H，Ph-H)，7.50(t，1H，J＝7.8Hz，Ph-H)，6.12(d，1H，J＝7.5Hz，H-5)，5.91(d，1H，J＝4.4Hz，H-1’)，5.60(q，1H，J＝6.8Hz，Ph-CH)，4.26(m，5H，H-2’，H-3’，H-4’和H-5’)，1.60(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)；
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.18(d，J＝19.8Hz)，-10.46(d，J＝19.1Hz)，-20.98(t，J＝19.6Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C17H21N4O16P3Na[M-2H+Na]-而言，计算质量为653.0063，实测质量为652.9975。
5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸(WW3p###)的合成
Figure G2007800494372D01161
方案.5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、DMF，室温，24小时，42％；(ii)TPSCl、DMAP、Et3N、CH2Cl2，室温，48小时，56％；(iii)NH3、1，4-二噁烷，80℃，2小时，56％；(iv)n-Bu4NF、THF、室温；(v)POCl3、质子海绵体、(MeO)3PO、0℃；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分钟；1M HNEt3HCO3，1小时。
3’，5’-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷(dC.15)
将TBSCl(114mg，0.76mmol)在无水DMF(0.5mL)中的溶液加入到化合物dT.07(97mg，0.24mmol)和咪唑(103mg，1.52mmol)在无水DMF(1mL)中的溶液中。在氮气气氛和室温下搅拌混合物24小时，然后在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化得到3’，5’-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷dC.15(64mg，42％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ9.39和9.33(2br s，1H，NH)，7.92(m，2H，Ph-H)，7.70(m，2H，H-6和Ph-H)，7.42(m，1H，Ph-H)，6.29(m，1H，H-1’)，5.11(m，1H，Ph-CH)，4.41(m，1H，H-3’)，4.04(m，2H，CH2)，3.96(m，1H，H-4’)，3.80(m，2H，H-5’)，2.38(m，1H，H-2’a)，2.04(m，1H，H-2’b)，1.55(m，3H，CH3)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.10(s，12H，(CH3)2Si)；
非对映体的13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ162.89/162.76(C)，150.15(C)，148.40(C)，139.21/139.17(C)，138.94/138.68(CH)，133.86/133.76(CH)，128.22/128.19(CH)，128.17/128.07(CH)，124.23(CH)，111.30/111.22(C)，87.97/87.94(CH)，85.43/85.37(CH)，73.46/73.43(CH)，72.34/72.28(CH)，63.92/63.77(CH2)，63.07(CH2)，41.27/41.17(CH2)，25.97/25.93(CH3)，23.69/23.57(CH3)，18.43/18.41(C)，-4.64/-4.82(CH3)，-5.37/-5.40(CH3).
ES+MS(ESI)：658[M+Na]+；
O4-(2，4，6-三异丙基苯磺酰基)-3’，5’-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷(dC.16)
将2，4，6-三异丙基苯磺酰氯(61mg，0.20mmol)的溶液加入到化合物dC.15(64mg，0.10mmol)和DMAP(6mg，0.05mmol)在无水CH2Cl2(3mL)中的溶液中，然后加入Et3N(63μL，0.45mmol)。在氮气气氛和室温下搅拌混合物48小时，然后在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化得到O4-(2，4，6-三异丙基苯磺酰基)-3’，5’-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷dC.16(50mg，56％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.33和8.28(2s，1H，Ph-H)，7.90(m，3H，Ph-H)，7.67(m，2H，H-6和Ph-H)，7.44(m，1H，Ph-H)，6.27(m，1H，H-1’)，5.11(m，1H，Ph-CH)，4.40(m，1H，H-3’)，4.06(m，2H，CH2)，3.97(m，1H，H-4’)，3.79(m，2H，H-5’)，2.38(m，1H，H-2’a)，2.04(m，1H，H-2’b)，1.54(m，3H，CH3)，1.60(m，3H，CH)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.80(m，18H，CH3)，0.09(s，12H，(CH3)2Si)；
3’，5’-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷(dC.17)
将NH3(1mL，0.5M，在二噁烷中)的溶液加入到化合物dC.16(48mg，0.05mmol)在无水1，4-二噁烷(1mL)中的溶液中。在80℃下搅拌混合物2小时，然后在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化得到3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脱氧尿苷dC.18(25mg，58％，非对映体的1∶1混合物)。
实施例4：dG化合物
N2-(2-硝基苄基)-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(WW2p067)的合成
Figure G2007800494372D01191
方案.N2-(2-硝基苄基)-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、无水DMF，0℃，然后逐渐温热至室温，过夜，96％；(ii)AC2O，无水吡啶，室温，100℃，72％；(iii)Boc2O、Et3N、DMAP、CH2Cl2，回流，2小时，54％；(iv)K2CO3、MeOH，95％；(v)2-硝基苄基溴、NaH、DMF，0℃，然后逐渐温热至室温，1小时，91％；(vi)SiO2，真空，70-80℃，48小时，97％；(vii)n-Bu4NF、THF，0℃，1小时，然后室温，2小时，83％；(viii)POCl3、(MeO)3PO，零下20-30℃，2小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N，DMF，5分钟；1M HNEt3HCO3，1小时，62％。
3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧鸟苷(dG.01)
在0℃和氮气气氛下将2’-脱氧鸟苷dG(0.89g，3.30mmol)、咪唑(2.0g，29.32mmol)和TBSCl(2.34g，15.55mmol)加入到无水DMF(8mL)中。将反应混合物逐渐温热至室温，搅拌过夜。然后在真空下浓缩混合物，利用CHCl3(8mL)和MeOH(8mL)的混合物处理，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化得到白色粉末状的3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧鸟苷dG.01(1.57g，96％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.60(br s，1H，H-1)，7.88(s，1H，H-8)，6.47(br s，2H，NH2)，6.10(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，4.48(m，1H，H-3’)，3.80(m，1H，H-4’)，3.70(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.64(m，1H，H-2’a)，2.18(m，1H，H-2’b)，0.89(s，9H，(CH3)3CSi)，0.86(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(s，6H，(CH3)2Si)，0.03(s，6H，(CH3)2Si).
N2-乙酰基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧鸟苷(dG.02)
室温下将乙酸酐(1.22mL，12.92mmol)缓慢加入到化合物dG.01(0.51g，1.03mmol)在无水吡啶(10mL)中的溶液中并在100℃下搅拌3小时。在真空下浓缩反应，利用无水乙醇(15mL)共蒸发3次，通过硅胶柱色谱纯化得到白色泡沫状的N2-乙酰基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧鸟苷dG.02(0.34g，56％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.03(s，1H，NH)，11.70(s.1H，NH)，8.20(s，1H，H-8)，6.19(t，1H，J＝6.2Hz，H-1’)，4.51(m，1H，H-3’)，3.84(m，1H，H-4’)，3.68(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.71(m，1H，H-2’a)，2.17(m，1H，H-2’b)，0.89(s，9H，(CH3)3CSi)，0.86(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(s，6H，(CH3)2Si)，0.04(s，6H，(CH3)2Si).
N1，N2-双-叔丁氧羰基-N2-乙酰基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧鸟苷(dG.03)
在氮气气氛下将二碳酸二叔丁酯(8.75g，40mmol)在无水CH2Cl2(27mL)中的溶液加入到化合物dG.02(1.85g，3.44mmol)、Et3N(12.17mL，15.48mmol)和DMAP(1.72g，14.10mmol)在无水CH2Cl2(20mL)中的溶液中。将反应混合物回流2小时，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化得到白色泡沫状的N1，N2-双-叔丁氧羰基-N2-乙酰基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧鸟苷dG.03(1.37g，54％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.25(s，1H，H-8)，6.43(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，4.59(m，1H，H-3’)，3.99(m，1H，H-4’)，3.87(m，1H，H-5’a)，3.87(m，1H，H-5’b)，2.60(a，3H，CH3CO)，2.52(m，1H，H-2’a)，2.41(m，1H，H-2’b)，1.71(s，9H，(CH3)3CO)，1.36(s，9H，(CH3)3CO)，0.92(s，9H，(CH3)3CSi)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.10(s，6H，(CH3)2Si)，0.09(s，6H，(CH3)2Si).
N1，N2-双-叔丁氧羰基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧鸟苷(dG.04)
室温下利用K2CO3(1.23g.8.90mmol)在MeOH(20.5mL)中处理化合物dG.03(1.31g，1.78mmol)30分钟。将反应在真空下浓缩，溶解在乙酸乙酯(50mL)中，用水清洗两次(10mL)。利用Na2SO4干燥有机层，在真空下浓缩，得到白色泡沫状的N1，N2-双-叔丁氧羰基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧鸟苷dG.04(1.18g，95％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ9.82(bs，1H，N-H)，8.24(s，1H，H-8)，6.27(t，1H，J＝6.6Hz，H-1’)，4.71(m，1H，H-3’)，3.82(m，1H，H-4’)，3.79(m，1H，H-5’a)，3.73(m，1H，H-5’b)，2.95(m，1H，H-2’a)，2.30(m，1H，H-2’b)，1.66(s，9H，(CH3)3CO)，1.48(s，9H，(CH3)3CO)，0.89(s，9H，(CH3)3CSi)，0.83(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(2s，6H，(CH3)2Si)，-0.01(2s，6H，(CH3)2Si).
N1，N2-双-叔丁氧羰基-N2-(2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧鸟苷(dG.05)
在0℃下将NaH(22mg，0.93mmol，干燥的)加入到化合物dG.04(500mg，0.72mmol)在无水DMF(6mL)中的溶液中，在氮气气氛下搅拌30分钟。逐滴加入2-硝基苄基溴(202mg.0.94mmol)在无水DMF(3mL)中的溶液。在0℃下搅拌反应1小时，然后在真空下浓缩。加入乙酸乙酯(50mL)，将混合物用饱和NH4Cl溶液清洗2次(20mL)。利用乙酸乙酯(20mL)萃取合并的水层，利用Na2SO4干燥合并的有机层，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到白色粉末状的N1，N2-双-叔丁氧羰基-N2-(2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧鸟苷dG.05(543mg，91％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.12(s，1H，H-8)，8.06(m，1H，Ph-H)，7.68(m，1H，Ph-H)，7.56(m，1H，Ph-H)，7.38(m，1H，Ph-H)，6.41(6，J＝6.2Hz，1H，H-2’)，5.49(s，2H，Ph-CH2)，4.56(m，1H，H-3’)，4.00(m，1H，H-4’)，3.80(m，2H，H-5’)，2.52(m，1H，H-2’a)，2.39(m，1H，H-2’b)，1.54(s，9H，(CH3)3CO)，1.45(s，9H，(CH3)3CO)，0.92(s，18H，(CH3)3CSi)，0.10(s，12H，(CH3)2Si).
N2-(2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧鸟苷(dG.06)
将硅胶60(4.5g，100-200目，通过在减压下加热至50-60℃24小时活化)加入到化合物dG.05(450mg，0.54mmol)在CH2Cl2(5mL)的溶液中，将混合物在真空下蒸干。减压下将残留物加热至60-70℃48小时，利用甲醇清洗3次(50mL)，利用布氏漏斗过滤。在真空下浓缩合并的滤液，通过硅胶柱色谱纯化得到白色泡沫状的N2-(2-硝基苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧鸟苷dG.06(333mg，97％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.85(s，1H，N-H)，8.05(m，1H，Ph-H)，7.85(s，1H，H-8)，7.69(m，1H，Ph-H)，7.62(m，1H，Ph-H)，7.54(m，1H，Ph-H)，7.10(t，1H，N-H)，6.07(t，1H，J＝，H-1’)，4.78(m，2H，Ph-CH2)，4.40(m，1H，H-3’)，3.79(m，1H，H-4’)，3.62(m，2H，H-5’)，2.60(m，1H，H-2’a)，2.15(m，1H，H-2’b)，0.86(s，9H，(CH3)3CSi)，0.85(s，9H，(CH3)3CSi)，0.06(s，6H，(CH3)2Si)，0.01(s，6H，(CH3)2Si).
N2-(2-硝基苄基)-2’-脱氧鸟苷(dG.07)
在0℃下将n-Bu4NF(393mg，1.5mmol)在THF(6mL)中的溶液逐滴加入到化合物dG.06(313mg，0.5mmol)在THF(12mL)中的溶液中。在0℃下搅拌反应混合物1小时，然后在室温下搅拌2小时。在真空下浓缩反应，通过硅胶柱色谱纯化得到黄色泡沫状的N2-(2-硝基苄基)-2’-脱氧鸟苷dG.07(165mg，83％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.82(s，1H，与D2O可交换，N-H)，8.06(m，1H，Ph-H)，7.90(s，1H，H-8)，7.72(m，1H，Ph-H)，7.64(m，1H，Ph-H)，7.55(m，1H，Ph-H)，7.06(t，1H，与D2O可交换，N-H)，6.08(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.23(d，1H，与D2O可交换，3’-OH)，4.80(t，3H，其中1H与D2O可交换，5’-OH and Ph-CH2)，4.25(m，1H，H-3’)，3.77(m，1H，H-4’)，3.42(m，2H，H-5’)，2.45(m，1H，H-2’a)，2.12(m，1H，H-2’b).
N2-(2-硝基苄基)-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(WW2p067)
将POCl3(17μL，0.18mmol)逐滴加入到化合物dG.07(50mg，0.12mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，并保持在零下20-30℃2小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(205mg，0.6mmol)和三正丁胺(120μL)在无水DMF(1.2mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌混合物1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在300分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的N2-(2-硝基苄基)-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸WW2p067(52mg，62％)。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.08(d，1H，Ph-H)，8.04(s，1H，H-8)，7.68(m，2H，Ph-H)，7.51(t，1H，Ph-H)，6.27(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，4.63(m，1H，H-3’)，4.21(m，1H，H-4’)，4.10(m，2H，H-5’)，2.66(m，1H，H-2’a)，2.41(m，1H，H-2’b)；
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-6.48(d，J＝15.7Hz)，-11.40(d，J＝15.2Hz)，-19.94(br)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C17H19N6O15P3Na[M-2H+Na]-而言，计算质量为663.0019，实测质量为663.0143。
O6-(2-硝基苄基)-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(WW2p077)的合成
方案.O6-(2-硝基苄基)-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸的合成。(i)2-均三甲苯-磺酰氯、Et3N、DMAP、无水CH2Cl2、HMPA，室温，过夜，98％；(ii)2-硝基苄醇、DABCO、DBU，分子筛，无水1，2-DME，0℃，然后逐渐温热至室温，24小时，77％；(iii)n-Bu4NF、THF，室温，1.5小时，94％；(iv)POCl3、(MeO)3PO，零下20-30℃，2小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N，DMF，5分钟；1M HNEt3HCO3，1小时，35％。
O6-(2-均三甲苯磺酰基)-3’，5’-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2-脱氧鸟苷(dG.08)
将2-均三甲苯磺酰氯(510mg，2.34mmol)、Et3N(0.56mL，4.0mmol)和DMAP(27mg，0.197mmol)加入到化合物dG.01(500mg，1.0mmol)在六甲基磷酰三胺(1.5mL)和无水CH2Cl2(7mL)混合物中的溶液中。在室温下搅拌反应过夜，然后用乙醚(25mL)稀释。将所述乙醚溶液用饱和NaHCO3清洗2次(每次10mL)，然后用盐水(10mL)清洗。利用Na2SO4干燥有机层，在真空下浓缩得到半固体，将所述半固体溶解在乙醚(2mL)中，用己烷(40mL)逐渐稀释。通过过滤收集沉淀，得到
O6-(2-均三甲苯磺酰基)-3’，5’-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧鸟苷dG.08(737mg，98％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.98(s，1H，H-8)，6.98(s，2H，Ph-H)，6.28(t，1H，J＝6.5Hz，H-1’)，4.84(br s，2H，NH2)，4.57(m，1H，H-3’)，3.97(m，1H，H-4’)，3.78(dd，1H，J＝2.9和11.0Hz，H-5’a)，3.75(dd，1H，J＝2.9和11.0Hz，H-5’b)，2.75(s，6H，CH3)，2.53(m，1H，H-2’a)，2.34(m，1H，H-2’b)，2.31(s，3H，CH3)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.90(s，9H，(CH3)3CSi)，0.09(s，6H，(CH3)2Si)，0.06(s，6H，(CH3)2Si).
O6-(2-硝基苄基)-3’，5’-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧鸟苷(dG.09)
在0℃下将DABCO(139mg，1.24mmol)和2-硝基苄醇(474mg，3.10mmol)加入到化合物dG.08(420mg，0.62mmol)和分子筛(200mg)在无水1，2-DME(6.2mL)中的溶液中。将混合物温热至室温，搅拌30分钟。加入DBU(139μL，0.93mmol)，在室温下搅拌反应24小时。加入乙酸乙酯(100mL)，用水(20mL)和盐水(20mL)清洗有机层，利用Na2SO4干燥，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化得到O6-(2-硝基苄基)-3’，5’-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧鸟苷dG.09(300mg，77％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.09(dd，1H，J＝1.1和8.2Hz，Ph-H)，7.94(s，1H，H-8)，7.86(d，1H，J＝7.7Hz，Ph-H)，7.60(dt，1H，J＝1.1和7.7Hz，Ph-H)，7.45(dt，1H，J＝1.0和8.2Hz，Ph-H)，6.32(t，1H，J＝6.5Hz，H-1’)，5.94(s，2H，NH2)，4.89(s，2H，PhCH2)，4.59(m，1H，H-3’)，3.98(m，1H，H-4’)，3.81(dd，1H，J＝2.9和11.0Hz，H-5’a)，3.75(dd，1H，J＝2.9和11.0Hz，H-5’b)，2.58(m，1H，H-2’a)，2.37(m，1H，H-2’b)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.10(s，6H，(CH3)2Si)，0.08(s，6H，(CH3)2Si).
O6-(2-硝基苄基)-2’-脱氧鸟苷(dG.10)
在室温下将n-Bu4NF(252mg，0.80mmol)在THF(4mL)中的溶液加入到化合物dG.09(200mg，0.32mmol)在THF(4mL)中的溶液中。搅拌混合物1.5小时，在真空下浓缩，通过硅胶色谱纯化得到O6-(2-硝基苄基)-2’-脱氧鸟苷dG.10(119mg，94％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.16(dd，1H，J＝1.0和8.2，Hz，Ph-H)，8.13(s，1H，H-8)，7.79(m，2H，Ph-H)，7.63(m，1H，Ph-H)，6.49(br s，2H，与D2O可交换，NH2)，6.22(dd，1H，J＝6.1和7.7Hz，H-1’)，5.87(s，2H，PhCH2)，5.28(br，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.99(br，1H，与D2O可交换，3’-OH)，4.35(m，1H，H-3’)，3.82(m，1H，H-4’)，3.55(m，1H，H-5’b)，3.52(m，1H，H-5’a)，2.58(m，1H，H-2’a)，2.23(m，1H，H-2’b).
O6-(2-硝基苄基)-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(WW2p077)
将POCl3(14μL，0.18mmol)逐滴加入到化合物dG.10(43mg，0.1mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中并保持在零下20-30℃2小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(237mg，0.5mmol)和三正丁胺(100μL)在无水DMF(1.0mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌混合物1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在300分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的O6-(2-硝基苄基)-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸WW2p077(24mg，35％)。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.21(s，1H，H-8)，8.13(d，J＝8.2Hz，1H，Ph-H)，7.83(d，1H，J＝7.8Hz，Ph-H)，7.74(t，1H，J＝7.8Hz，Ph-H)，7.51(t，J＝7.8Hz，1H，Ph-H)，6.35(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，5.86(s，2H，Ph-CH2)，4.28(m，1H，H-4’)，4.23(m，2H，H-5’)，2.82(m，1H，H-2’a)，2.57(m，1H，H-2’b)；
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-6.48(br)，-10.96(br)，-21.83(br)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C17H19N6O15P3Na[M-2H+Na]-而言，计算质量为663.0019，实测质量为663.0228。
6-ROX标记的O6-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(WW2p121)的合成
Figure G2007800494372D01281
方案.6-ROX标记的O6-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸的合成。(i)4-碘-2-硝基苄醇、DABCO、DBU、
Figure G2007800494372D01282
分子筛，无水1，2-DME，0℃，然后逐渐温热至室温，24小时，77％；(ii)n-Bu4NF、THF，室温，1.5小时，62％；(iii)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4(O)、CuI、Et3N、无水DMF，4小时，42％；(iv)POCl3、质子海绵体、(MeO)3PO、0℃，1小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N、DMF，5分钟；1M HNEt3HCO3，1小时；NH4OH，1小时；(v)6-ROX-SE，0.1M Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH 9.2)，1小时。
O6-(4-碘-2-硝基苄基)-3’，5’-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2-脱氧鸟苷(dG.11)
在0℃下将DABCO(90mg，0.80mmol)和4-碘-2-硝基苄醇(555mg，2.00mmol)加入到化合物dG.08(270mg，0.40mmol)和
Figure G2007800494372D01291
分子筛(129mg)在无水1，2-DME(4mL)中的溶液中。将混合物升至室温并搅拌30分钟。加入DBU(91μL，0.60mmol)，室温下搅拌反应24小时。加入乙酸乙酯(70mL)，用水(10mL)和盐水(10mL)清洗有机溶液，利用Na2SO4干燥，在真空下浓缩，通过硅胶色谱纯化得到O6-(4-碘-2-硝基苄基)-3’，5’-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2-脱氧鸟苷dG.11(233mg，77％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.40(d，1H，J＝1.7Hz，Ph-H)，7.94(s，1H，H-8)，7.86(dd，1H，J＝1.7和8.3Hz，Ph-H)，7.60(d，1H，J＝8.3Hz，Ph-H)，6.31(t，1H，J＝6.5Hz，H-1’)，5.86(s，2H，NH2)，4.87(s，2H，PhCH2)，4.59(m，1H，H-3’)，3.98(m，2H，H-4’)，3.82(dd，AB，1H，J＝4.2和11.2Hz，H-5’a)，3.75(dd，1H，J＝4.2和11.2Hz，H-5’b)，2.57(m，1H，H-2’a)，2.37(m，1H，H-2’b)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.10(s，6H，(CH3)2Si)，0.08(s，6H，(CH3)2Si).
O6-(4-碘-2-硝基苄基)-2-脱氧鸟苷(dG.12)
室温下将n-Bu4NF(291mg，0.924mmol)在THF(2mL)中的溶液加入到化合物dG.11(233mg，0.31mmol)在THF(4mL)中的溶液中。搅拌混合物1.5小时，在真空下浓缩，通过硅胶色谱纯化得到O6-(4-碘-2-硝基苄基)-2-脱氧鸟苷dG.12(101mg，62％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.43(d，1H，J＝1.8Hz，Ph-H)，8.16(dd，1H，J＝1.8和8.2Hz，Ph-H)，8.13(s，1H，H-8)，7.52(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.48(br s，2H，与D2O可交换，NH2)，6.22(dd，1H，J＝6.2和7.7Hz，H-1’)，5.79(s，2H，PhCH2)，5.27(d，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.97(t，1H，与D2O可交换，3’-OH)，4.35(m，1H，H-3’)，3.82(m，1H，H-4’)，3.52(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.58(m，1H，H-2’a)，2.22(m，1H，H-2’b).
O6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-2’-脱氧鸟苷(dG.13)
室温下将化合物dG.12(95mg，0.18mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(82mg，0.53mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(21mg，0.018mmol)、CuI(7mg，0.036mmol)和Et3N(51μL，0.36mmol)在无水DMF(1.4mL)中的溶液搅拌4小时。加入CH2Cl2(1mL)、甲醇(1mL)和NaHCO3(84mg，1mmol)，搅拌混合物20分钟，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱和制备HPLC纯化，得到O6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-2’-脱氧鸟苷dG.13(42mg，42％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.11(br 1H，NH)，8.16(d，1H，J＝1.7Hz，Ph-H)，8.13(s，1H，H-8)，7.86(dd，1H，J＝1.7和8.2Hz，Ph-H)，7.75(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.50(br s，2H，与D2O可交换，NH2)，6.22(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.87(s，2H，PhCH2)，5.27(d，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.97(t，1H，与D2O可交换，3’-OH)，4.35(m，1H，H-3’)，4.33(s，2H，CH2)，3.82(m，2H，H-4’)，3.55(m，1H，H-5’b)，3.51(m，1H，H-5’a)，2.58(m，1H，H-2’a)，2.23(m，1H，H-2’b).
O6-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(dG.14)
将化合物dG.13(33mg，0.06mmol)和质子海绵体(26mg，0.12mmol)在无水吡啶(3mL)中蒸发3次，并溶解在磷酸三甲酯(0.3mL)中。加入POCl3(8μL，0.09mmol)，在0℃搅拌混合物1小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(142mg，0.3mmol)和三正丁胺(60μL)在无水DMF(0.6mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后在0℃下逐滴加入浓氢氧化铵(5mL，27％)。在室温下再搅拌混合物1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC纯化得到O6-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸dG.14。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行HPLC纯化。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.28(s，H-8)，8.26(s，1H，Ph-H)，7.80(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.63(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，6.38(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.88(br s，2H，Ph-CH2)，4.29(m，3H，H-4’，H-5’)，3.67(s，2H，CH2)，2.80(m，1H，H-2’a)，2.56(m，1H，H-2’b)；
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.85(d，J＝19.4Hz)，-10.98(d，J＝19.4Hz)，-21.78(t，J＝19.4Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C20H24N7O15P3Na[M+Na]+而言，计算质量为718.0441，实测质量为718.0600。
6-ROX标记的O6-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苄基]-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(WW2p121)
将6-ROX-SE(0.3mg，0.47μmol)在无水DMSO(12μL)中的溶液加入到三磷酸酯dG.14(0.36μmol)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH 9.2；0.6mL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC纯化反应，得到6-ROX标记的三磷酸酯WW2p121。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行HPLC纯化。利用6-ROX染料的消光系数(即在575nm下的82,000)通过吸收光谱估计WW2p121的浓度。
O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(WW2p143)的合成
Figure G2007800494372D01321
方案.O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸的合成。(i)1-(2-硝基苯基)乙醇、PPh3、DIAD、无水THF，室温，6小时，74％；(ii)n-Bu4NF、THF，0℃，然后逐渐温热至室温，4小时，64％；(iii)POCl3、质子海绵体、(MeO)3PO、0℃，2小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分钟；1M HNEt3HCO3，1小时；NH4OH，60℃，3小时。
O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-N2-乙酰基-3’，5’-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧鸟苷(dG.15)
将化合物dG.02(108mg，0.2mmol)、1-(2-硝基苯基)乙醇(33mg，0.23mmol)和PPh3(79mg，0.3mmol)在无水THF(2mL)中的溶液利用偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，59μL，0.3mmol)处理，并在室温下搅拌6小时。将混合物用CH2Cl2(20mL)进行稀释，利用饱和NH4Cl溶液(10mL)清洗1次，利用Na2SO4干燥，浓缩，通过硅胶色谱纯化得到黄色泡沫状的O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-N2-乙酰基-3’，5’-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧鸟苷dG.15(102mg，74％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.13和8.12(2s，1H，H-8).7.89(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.83(m，1H，Ph-H)，7.74(br s.，1H，NH)，7.57(t，1H，J＝7.2Hz，Ph-H)，7.40(t，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，6.69(m，1H，PhCH)，6.36(t，1H，J＝6.3Hz，H-1’)，4.56(m，1H，H-3’)，3.98(m，1H，H-4’)，3.82(m，1H，H-5’a)，3.76(m，1H，H-5’b)，2.50(m，1H，H-2’a)，2.41(m，4H，H-2’b和CH3CO)，1.88(2d，J＝6.5Hz，CH3)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.10(s，6H，(CH3)2Si)，0.09(s，6H，(CH3)2Si).
O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-N2-乙酰基-2’-脱氧鸟苷(dG.16)
在0℃下将n-Bu4NF(95mg，0.36mmol)在THF(2mL)中的溶液加入到化合物dG.15(100mg，0.15mmol)在THF(5mL)中的溶液中。将混合物逐渐温热至室温，搅拌4小时。加入硅胶(500mg，60-200目)，真空蒸发混合物。通过硅胶色谱纯化残留物，得到O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-N2-乙酰基-2’-脱氧鸟苷dG.16(43mg，64％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.19和10.18(2s，1H，与D2O可交换，NH)，8.43(2s，1H，H-8)，8.04(d，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.79-7.74(m，2H，Ph-H)，7.56(t，1H，J＝8.1Hz，Ph-H)，6.84(m，1H，PhCH)，6.26(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，5.29(2d，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.88(m，1H，与D2O可交换，3’-OH)，4.39(m，1H，H-3’)，3.82(m，1H，H-4’)，3.56(m，1H，H-5’b)，3.51(m，1H，H-5’a)，2.56(m，1H，H-2’a)，2.23(m，1H，H-2’b)，2.12(s，3H，CH3CO)，1.79(2d，J＝6.4Hz，CH3)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C20H21N6O7[M-H]-而言，计算质量为457.1472，实测质量为457.1392。
O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(WW2p143)
将化合物dG.16(25mg，0.055mmol)和质子海绵体(23mg，0.11mmol)在无水吡啶(2mL)中蒸发3次，并溶解在磷酸三甲酯(0.3mL)中。加入POCl3(8μL，0.08mmol)，在0℃搅拌混合物2小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(130mg，0.28mmol)和三正丁胺(55μL)在无水DMF(0.55mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC纯化部分溶液，得到O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-N2-乙酰基-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行HPLC纯化。然后在60℃下利用浓氢氧化铵(2mL，27％)处理所纯化的三磷酸酯3小时。如上所述利用反相HPLC进行纯化，得到O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸WW2p143(非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，D2O)：8.26和8.25(2s，1H，H-8)，8.02(d，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.88(d，1H，J＝7.8Hz，Ph-H)，7.72(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.53(t，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.71(m，1H，PhCH)，6.34(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，4.25-4.16(m，3H，H-4’和H-5’)，2.80(m，1H，H-2’a)，2.51(m，1H，H-2’b)，1.86(d，1H，J＝6.4Hz，CH3)；
非对映体的31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.18(d，J＝20.4Hz)，-10.25(d，J＝19.3Hz)，-21.07(t，J＝19.8Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C18H22N6O15P3[M-H]-而言，计算质量为655.0356，实测质量为655.0430。
6-ROX标记的O6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(WW3p008)的合成
Figure G2007800494372D01351
方案.6-ROX标记的O6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸的合成。(i)1-(4-碘-2-硝基苯基)乙醇、PPh3、DIAD、无水THF，室温，过夜，76％；(ii)n-Bu4NF、THF，0℃，然后逐渐温热至室温，2小时，52％；(iii)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4、CuI、Et3N、无水DMF，4小时，96％；(iv)POCl3、质子海绵体、(MeO)3PO、0℃，2小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N、DMF，5分钟；1M HNEt3HCO3，1小时；NH4OH，60℃，6小时；(v)6-ROX-SE，0.1M Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH 9.2)，1小时。
O6-[1-(4-碘-2-硝基苯基)乙基]-N2-乙酰基-3’，5’-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧鸟苷(dG.17)
利用偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，79μL，0.4mmol)处理化合物dG.02(146mg，0.27mmol)、1-(4-碘-2-硝基苯基)乙醇(79mg，0.27mmol)和PPh3(106mg，0.4mmol)在无水THF(2mL)中的溶液，在室温下搅拌过夜。将混合物用CH2Cl2(20mL)进行稀释，利用饱和NH4Cl溶液(10mL)清洗1次，利用Na2SO4干燥，浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到黄色泡沫状的
O6-[1-(4-碘-2-硝基苯基)乙基]-N2-乙酰基-3’，5’-双-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脱氧鸟苷dG.17(168mg，76％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.20(s，1H，Ph-H)，8.13和8.12(2s，1H，H-8)，7.87(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.73(br s，1H，NH)，7.55(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，6.62(m，1H，PhCH)，6.35(t，1H，J＝6.5Hz，H-1’)，4.56(m，1H，H-3’)，3.98(m，1H，H-4’)，3.82(m，1H，H-5’a)，3.77(m，1H，H-5’b)，2.50(m，1H，H-2’a)，2.41(m，4H，H-2’b和CH3CO)，1.85(d，J＝6.4Hz，CH3)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.09(2s，12H，(CH3)2Si).
O6-[1-(4-碘-2-硝基苯基)乙基]-N2-乙酰基-2’-脱氧鸟苷(dG.18)
在0℃下将n-Bu4NF(125mg，0.48mmol)在THF(1.5mL)中的溶液加入到化合物dG.17(155mg，0.19mmol)在THF(2mL)中的溶液中。将反应混合物逐渐温热至室温，搅拌2小时。加入硅胶60(1g，60-200目)，真空蒸发混合物至干。通过硅胶柱色谱纯化残留物，得到白色泡沫状的O6-[1-(4-碘-2-硝基苯基)乙基]-N2-乙酰基-2’-脱氧鸟苷dG.18(58mg，52％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.21和10.20(2s，1H，与D2O可交换，NH)，8.43(2s，1H，H-8)，8.34(2s，Ph-H)，8.08(2d，1H，J＝8.3Hz，Ph-H)，7.54(2d，1H，J＝8.3Hz，Ph-H)，6.75(m，1H，PhCH)，6.27(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.30(m，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.89(m，1H，与D2O可交换，3’-OH)，4.39(m，1H，H-3’)，3.82(m，1H，H-4’)，3.56(m，1H，H-5’b)，3.50(m，1H，H-5’a)，2.60(m ，1H，H-2’a)，2.22(m，1H，H-2’b)，2.12(s，3H，CH3CO)，1.75(2d，J＝6.4Hz，CH3).
O6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-N2-乙酰基-2’-脱氧鸟苷(dG.19)
室温下将化合物dG.18(58mg，0.1mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(45mg，0.3mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(11.5mg，0.01mmol)、碘化铜(I)(3.8mg，0.02mmol)和三乙胺(27μL，0.19mmol)的溶液搅拌4小时。加入甲醇(1mL)、CH2Cl2(1mL)和碳酸氢钠(80mg，0.95mmol)，再搅拌混合物半小时，然后在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化得到O6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-N2-乙酰基-2’-脱氧鸟苷dG.19(58mg，96％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.21和10.20(2s.1H，与D2O可交换，NH)，10.08(br，1H，NHCOCF3)，8.43(2s，1H，H-8)，8.06(s，1H，Ph-H)，7.77(m，2H，Ph-H)，6.78(m，1H，PhCH)，6.28(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.29(2d，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.89(t，1H，与D2O可交换，3’-OH)，4.39(m，1H，H-3’)，4.29(d，2H，CH2)，3.82(m，2H，H-4’)，3.50(m，1H，H-5’a)，3.44(m，1H，H-5’b)，2.67(m，1H，H-2’a)，2.23(m，1H，H-2’b)，2.11(s，3H，CH3)，1.78(d，3H，J＝6.4Hz，CH3)；
O6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(dG.20)
将化合物dG.19(44mg，0.07mmol)和质子海绵体(30mg，0.14mmol)在无水吡啶(3mL)中蒸发3次，并溶解在磷酸三甲酯(0.5mL)中。加入POCl3(10μL，0.11mmol)，在0℃搅拌混合物3小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(166mg，0.35mmol)和三正丁胺(70μL)在无水DMF(0.7mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH7.5；10mL)。将反应在室温下搅拌1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC纯化部分溶液，得到O6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-N2-乙酰基-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行HPLC纯化。然后在60℃下利用浓氢氧化铵(2mL，27％)处理所纯化的三磷酸酯6小时，得到O6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸dG.20(非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，D2O)：8.21和8.20(2s，1H，H-8)，7.85和7.75(2s，1H，Ph-H)，7.64(m，1H，Ph-H)，7.45(m，1H，Ph-H)，6.53(m，1H，PhCH)，6.28(m，1H，H-1’)，4.23-4.12(m，3H，H-4’和H-5’)，3.97(s，2H，CH2)，2.70(m，1H，H-2’a)，2.50(m，1H，H-2’b)，1.74(m，1H，CH3)；
非对映体的31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.53(d，J＝20.1Hz)，-10.50(d，J＝19.3Hz)，-21.29(t，J＝19.8Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C21H25N7O15P3[M-H]-而言，计算质量为708.0622，实测质量为708.0609。
6-ROX标记的O6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(WW3p008)
将6-ROX-SE(3mg，4.7μmol)在无水DMSO(120μL)中的溶液加入到三磷酸酯dG.20(1.45μmol)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH9.2；0.3mL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC将反应纯化，得到6-ROX标记的三磷酸酯WW3p008。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行HPLC纯化。利用6-ROX染料的消光系数(即在575nm下的82,000)通过吸收光谱估计WW3p008的浓度。
O6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸的两种非对映体(dG.20dS1和dG.20dS2)的分离
利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC进行dG.20的两种非对映体的分离，以得到O6-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧鸟苷三磷酸dG.20ds1(单一非对映体，绝对构型未测定)和O6-{(S或R)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧鸟苷三磷酸dG.20ds2(单一非对映体，绝对构型未测定)。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-25％B 70分钟，然后25-50％B 30分钟的线性梯度进行HPLC纯化。
Figure G2007800494372D01401
6-ROX标记的单一非对映体O6-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(WW3p037)的合成
Figure G2007800494372D01411
方案.6-ROX标记的单一非对映体O6-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸的合成。(i)6-ROX-SE，0.1MNaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小时。
6-ROX标记的单一非对映体O6-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(WW3p037)
将6-ROX-SE(1.5mg，2.38μmol)在无水DMSO(120μL)中的溶液加入到三磷酸酯dG.20ds1(0.67μmol，单一非对映体，绝对构型未测定)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH 9.2；150μL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC将反应纯化，得到6-ROX标记的单一非对映体三磷酸酯WW3p037。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分钟，然后50-90％B 20分钟的线性梯度进行HPLC纯化。利用6-ROX染料的消光系数(即在575nm下的82,000)通过吸收光谱估计WW3p037的浓度。
6-ROX标记的单一非对映体O6-{(S或R)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(WW3p039)的合成
Figure G2007800494372D01421
方案.6-ROX标记的单一非对映体O6-{(S或R)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸的合成。(i)6-ROX-SE，0.1MNaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小时。
6-ROX标记的单一非对映体O6-{(S或R)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(WW3p039)的合成
将6-ROX-SE(2.5mg，3.96μmol)在无水DMSO(200μL)中的溶液加入到三磷酸酯dG.20ds2(0.97μmol，单一非对映体，绝对构型未测定)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH 9.2；150μL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC将反应纯化，得到6-ROX标记的单一非对映体三磷酸酯WW3p039。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分钟，然后50-90％B 20分钟的线性梯度进行HPLC纯化。利用6-ROX染料的消光系数(即在575nm下的82,000)通过吸收光谱估计WW3p039的浓度。
6-ROX标记的单一非对映体O6-{(R或S)-1-{4-[3-(6-氨基-己酰基)氨基-1-丙炔基]-2-硝基苯基}乙基}-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(WW3p041)的合成
方案.6-ROX标记的单一非对映体O6-{(R或S)-1-{4-[3-(6-氨基己酰基)氨基-1-丙炔基]-2-硝基苯基}乙基}-2’-脱氧鸟苷三磷酸的合成。(i)6-N-(三氟乙酰基)氨基己酸N-琥珀酰亚胺酯，0.1M NaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小时；NH4OH，1小时；(ii)6-ROX-SE，0.1M NaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小时。
O6-{(R或S)-1-{4-[3-(6-氨基己酰基)氨基-1-丙炔基]-2-硝基苯基}乙基}-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(单一非对映体dG.21ds1)
将6-N-(三氟乙酰基)氨基己酸N-琥珀酰亚胺酯(1.0mg，3.08μmol)在无水DMSO(20μL)中的溶液加入到三磷酸酯dG.20ds1(0.89μmol，单一非对映体，绝对构型未测定)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH 9.2；200μL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。加入浓氢氧化铵(25％水溶液，0.5mL)，将混合物在室温下再孵育1小时。利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC将反应纯化，得到三磷酸酯dG.21ds1(单一非对映体，绝对构型未测定)。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分钟，然后50-90％B 10分钟的线性梯度进行HPLC纯化。
6-ROX标记的单一非对映体O6-{(R或S)-1-{4-[3-(6-氨基己酰基)氨基-1-丙炔基]-2-硝基苯基}乙基}-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸(WW3p041)的合成
将6-ROX-SE(1.5mg，2.34μmol)在无水DMSO(120μL)中的溶液加入到三磷酸酯dG.21ds1(0.59μmol，单一非对映体，绝对构型未测定)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH 9.2；200μL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC将反应纯化，得到6-ROX标记的单一非对映体三磷酸酯WW3p041。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分钟，然后50-90％B 20分钟的线性梯度进行HPLC纯化。利用6-ROX染料的消光系数(即在575nm下的82,000)通过吸收光谱估计WW3p041的浓度。
实施例5-聚合酶终点(PEP)检测：
已有多个小组使用了定性的基于Sanger的检测来评价相对于天然核苷酸类似物而言的终止核苷酸类似物的相对引入效率。尽管有用，但是在不存在天然核苷酸的情形下利用这些检测来测试修饰的核苷酸类似物是不可行的。这两个局限性导致了定量聚合酶终点(PEP)检测，其以高通量方式用于筛选对抗多种充分表征的可商购聚合酶的多种修饰核苷酸。然后可将利用特定DNA聚合酶对先导化合物的鉴别优选用于进一步的动力学研究中。所述PEP检测是按聚合酶浓度相对引物/模板复合物过量而设计的(即在滴定开始时该复合物完全与聚合酶相结合)，从而限制与核苷酸结合和核苷酸基(nucleotyl)偶联的反应步骤。然后在合适的浓度范围内(通常3个数量级)滴定所预期核苷酸的限量以通过凝胶电泳观察染料标记的引物的延伸。由半对数图测定终点浓度，在所述半对数图中，底物和产物的摩尔数相同，称为IC50(即50％时的引入浓度)值。
对于本研究中评价的所有聚合酶而言，将40nM的寡聚模板(5’-TACGGAGCA-G
Figure G2007800494372D01451
ACTGGCCGTCGTTTTACA，探询碱基(interrogation base)被加粗和下划线)与5nM BODIPY-FL标记的引物(5′-TTGTAAAACGACGGCCAGT)在1×ThermoPol缓冲液(20mMTris-HCl，pH 8.8；10mM(NH4)2SO4；10mM KCl；2mM MgSO4；0.1％Triton X-100，New England BioLabs)中于80℃下退火30秒，于57℃退火30秒，然后冷却至4℃。然后通过加入DNA聚合酶、核苷酸类似物和ThermoPol缓冲液将所述引物/模板复合物稀释一倍(即其最终浓度为2.5nM/10μL体积)。这清楚地表明核苷酸滴定的IC50值下限为1.25nM(即[引物]＝[引物+1])。将聚合酶反应在其合适的温度下孵育10分钟，然后冷却至4℃，利用10μL终止溶液(98％去离子甲酰胺；10mMNa2EDTA，pH 8.0；25mg/mL蓝色葡聚糖，MW 2,000,000)淬灭。将终止的反应加热至90℃30秒，然后置于冰上。利用AB型377DNA测序仪在10％Long Ranger(Cambrex)聚丙烯酰胺凝胶上分析延伸产物，以产物形成与化合物浓度的线性对数图显示定量数据。针对每种DNA聚合酶/核苷酸类似物组合一式三份进行PEP测试以计算其IC50值±1个标准偏差。
首先通过利用2’-脱氧腺苷三磷酸(dATP，浓度范围从0.1nM至100nM)进行滴定来测定8种可商购的3’-外切核酸酶缺陷(3’-exo-)DNA聚合酶的活性单位数，目的是达到1.25nM的PEP IC50限度(数据未显示)。一般而言，就该限度而言，除了Taq、Therminator和Therminator II以外，增加单位数将降低dATP的IC50值。对于这些酶而言，dATP的IC50值随着酶浓度的增加而增加，未对其进行进一步研究，推测是由于增加酶浓度与磷酸解的直接关系而引起的。就这些情形而言，用于随后的PEP试验的单位数是给出dATP的最低IC50值的那些活性单位。
修饰核苷酸的滴定
然后使用8种DNA聚合酶(单位活性前面定义过)在0.1nM至100nM、1nM至1μM、10nM至10μM或100nM至100μM的浓度范围内利用PEP试验滴定WW1p129和ddATP(见表1)。始终在低光照条件下处理对紫外线敏感的化合物，以将向dATP的转化降到最低。这些数据表明，除了TaqFS以外，在所有情形下WW1p129的引入效率比ddATP更高(即较小的IC50值)。
表1：对利用8种不同DNA聚合酶进行的针对WW1p129的PEP试验结果的总结
Figure G2007800494372D01471
还利用Bst聚合酶和Therminator DNA聚合酶并利用多种光可断裂的终止核苷酸进行了PEP试验(表2)，表明所述化合物被有效地引入。表2中的数据表明本发明化合物是非常好的底物。
表2：Bst和Therminator聚合酶的IC50值的比较
  化合物   Bst   Therminator
  WW1p129   39±9nm   2.5±0.4nm
  VL3p03085   138±38nm   1.1±0.1nm
  WW2p044   57±11nm   1.8±0.2nm
  WW2p077   3.8±0.2微摩尔/升   6.9±0.5mm
  WW2p050   未得到   4.4±0.6mm
  WW2p075   未得到   3.8±1.1mm
  WW2p080   未得到   3.0±0.6mm
  WW2p121   未得到   6.3±0.4mm
标记的核苷酸和核苷
实施例1：dA化合物
N6-苄基-2’-脱氧腺苷三磷酸(WW2p062)的合成
Figure G2007800494372D01481
方案.N6-苄基-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸的合成。(i)NaH、DMF、溴苄，0℃，然后逐渐温热至室温，86％；(ii)SiO2，真空，70-80℃，95％；(iii)n-Bu4NF、THF，99％；(iv)POCl3、(MeO)3PO、零下20-30℃；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF；1M HNEt3HC O3，32％。
N6-叔丁氧羰基-N6-苄基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷(dA.n1)
在0℃下将NaH(18mg，0.75mmol，干燥)加入到化合物dA.07(400mg，0.58mmol)在无水DMF(5mL)中的溶液中，搅拌30分钟。逐滴加入溴苄(149mg.0.87mmol)在无水DMF(2.5mL)中的溶液。将混合物逐渐温热至室温，搅拌2小时。在真空下除去DMF，将残留物溶解在乙酸乙酯(60mL)中，利用饱和NH4Cl溶液清洗2次(每次40mL)，用水(40mL)清洗1次。利用乙酸乙酯(10mL)萃取合并的水层，利用Na2SO4干燥合并的有机层，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到粘性油状的
N6-叔丁氧羰基-N6-苄基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷dA.n1(398mg，86％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.72(s，1H，H-8)，8.32(s，1H，H-2)，7.39(m，2H，Ph-H)，7.25(m，2H，Ph-H)，7.18(m，1H，Ph-H)，6.49(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.28(s，2H，Ph-CH2)，4.62(m，1H，H-3’)，4.01(m，1H，H-4’)，3.85(dd，1H，J＝4.4和11.2Hz，H-5’a)，3.77(dd，1H，J＝3.4和11.2Hz，H-5’b)，2.61(m，1H，H-2’a)，2.43(m，1H，H-2’b)，1.65(s，9H，(CH3)3CO)，0.96(s，18H，(CH3)3CSi)，0.08(2s，12H，(CH3)2Si).
N6-苄基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷(dA.n2)
将硅胶60(3.76g，100-200目，通过在减压下加热至70-80℃24小时而活化)加入到化合物dA.n1(376mg，0.56mmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液中，将混合物在真空下蒸干。减压下将残留物加热至70-80℃2天，利用甲醇清洗3次(每次30mL)，利用布氏漏斗过滤。在真空下浓缩合并的滤液，通过硅胶柱色谱纯化，得到黄色泡沫状的N6-苄基-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷dA.n2(305mg，95％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.41(s，1H，H-8)，8.07(s，1H，H-2)，7.38(m，2H，Ph-H)，7.33(m，2H，Ph-H)，7.28(m，1H，Ph-H)，6.45(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，6.12(br s，1H，6-NH)，4.87(br s，2H，Ph-CH2)，4.62(m，1H，H-3’)，4.01(m，1H，H-4’)，3.87(dd，1H，J＝4.2和11.2Hz，H-5’a)，3.77(dd，1H，J＝3.2和11.2Hz，H-5’b)，2.64(m，1H，H-2’a)，2.44(m，1H，H-2’b)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.09(2s，12H，(CH3)2Si-).
N6-苄基-2’-脱氧腺苷(dA.n3)
0℃下将n-Bu4NF(335mg，1.28mmol)在THF(2.5mL)中的溶液加入到化合物dA.n2(292mg，0.51mmol)在THF(6mL)中的溶液中。将反应混合物逐渐温热至室温，搅拌2小时。加入硅胶60(1g)。将混合物在真空下蒸干。通过硅胶柱色谱纯化残留物，得到白色泡沫状的N6-苄基-2’-脱氧腺苷dA.n3(173mg，99％)。
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ8.30(s，1H，H-8)，8.25(s，1H，H-2)，7.36(m，2H，Ph-H)，7.31(m，2H，Ph-H)，7.24(m，1H，Ph-H)，6.42(dd，1H，J＝6.0和7.9Hz，H-1’)，4.81(br s，2H，Ph-CH2)，4.57(m，1H，H-3’)，4.06(m，1H，H-4’)，3.83(m，1H，J＝2.9和12.3Hz，H-5’a)，3.73(dd，1H，J＝3.3和12.3Hz，H-5’b)，2.79(m，1H，H-2’a)，2.40(m，1H，H-2’b).
N6-苄基-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(WW2p062)
将POCl3(22μL，0.24mmol)加入到化合物dA.10a(42mg，0.12mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，并保持在零下20-30℃2小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(285mg，0.6mmol)和三正丁胺(120μL)在无水DMF(1.2mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后冻干。将残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用QSepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在300分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的N6-苄基-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸WW2p062(24mg，32％)。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.43(s，1H，H-8)，8.20(s，1H，H-2)，7.39-7.30(m，5H，Ph-H)，6.50(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，4.85(s，2H，Ph-CH2)，4.31(s，1H，H-4’)，4.22(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.82(m，1H，H-2’a)，2.62(m，1H，H-2’b)；
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.72(d，J＝15.9Hz)，-10.78(d，J＝15.4Hz)，-19.16(t，J＝14.9Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C17H20N5O12P3Na[M-2H+Na]-而言，计算质量为602.0219，实测质量为602.0363。
6-FAM标记的N6-(4-(3-氨基-1-丙基)苄基)-2’-脱氧腺苷三磷酸(WW2p085)的合成
Figure G2007800494372D01511
方案.6-FAM标记的N6-(4-(3-氨基-1-丙基)苄基)-2’-脱氧腺苷三磷酸的合成。(i)NaH、DMF、4-碘苄基溴，0℃，然后逐渐温热至室温，99％；(ii)SiO2，真空，70-80℃，99％；(iii)n-Bu4NF、THF、98％；(iv)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、无水DMF，4.5h，94％；(v)POCl3、质子海绵体、(MeO)3PO，零下20-30℃，2小时；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分钟；1M HNEt3HCO3，1小时；NH4OH，1小时；84％；(vi)6-FAM-SE、0.1M NaHCO3/Na2CO3，pH 9.2。
N6-叔丁氧羰基-N6-(4-碘苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷(dA.n4)
0℃下将NaH(23mg，0.94mmol，干燥)加入到化合物dA.07(500mg，0.72mmol)在无水DMF(6.5mL)中的溶液中，搅拌30分钟。逐滴加入4-碘苄基溴(322mg.1.08mmol)在无水DMF(2.5mL)中的溶液。将混合物逐渐温热至室温，搅拌2小时。在真空下除去DMF，将残留物溶解在乙酸乙酯(60mL)中，利用饱和NH4Cl溶液清洗2次(每次40mL)，利用水(40mL)清洗1次。利用乙酸乙酯(10mL)萃取合并的水层，利用Na2SO4干燥合并的有机层，在真空下浓缩，通过硅胶柱色谱纯化，得到粘性油状的N6-叔丁氧羰基-N6-(4-碘苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷dA.n4(565mg，99％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.71(s，1H，H-8)，8.33(s，1H，H-2)，7.58(d，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.17(d，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.49(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.20(s，2H，Ph-CH2)，4.62(m，1H，H-3’)，4.02(m，1H，H-3’)，3.86(dd，1H，J＝4.2和11.2Hz，H-5’a)，3.78(dd，1H，J＝3.2和11.2Hz，H-5’b)，2.63(m，1H，H-2’a)，2.45(m，1H，H-2’b)，1.42(s，9H，(CH3)3CO)，0.92(s，18H，(CH3)3CSi)，0.08(2s，12H，(CH3)2Si-).
N6-(4-碘苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷(dA.n5)
将硅胶60(6.00g，100-200目，通过在减压下加热至70-80℃24小时而活化)加入到化合物dA.n4(565mg，0.71mmol)在CH2Cl2(20mL)的溶液中，将混合物在真空下蒸干。减压下将残留物加热至70-80℃2天，利用甲醇清洗3次(每次30mL)，利用布氏漏斗过滤。在真空下浓缩合并的滤液，通过硅胶柱色谱纯化，得到黄色泡沫状的N6-(4-碘苄基)-3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷dA.n5(489mg，99％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.38(s，1H，H-8)，8.06(s，1H，H-2)，7.63(d，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.11(d，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.45(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，6.34(t，1H，6-NH)，4.81(br s，2H，Ph-CH2)，4.61(m，1H，H-3’)，4.00(m，1H，H-4’)，3.85(dd，1H，J＝4.2和11.2Hz，H-5’a)，3.76(dd，1H，J＝3.2和11.2Hz，H-5’b)，2.64(m，1H，H-2’a)，2.44(m，1H，H-2’b)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.09(2s，12H，(CH3)2Si-).
N6-(4-碘苄基)-2’-脱氧腺苷(dA.n 6)
0℃下将n-Bu4NF(282mg，1.08mmol)在THF(1.0mL)中的溶液加入到化合物dA.n5(300mg，0.43mmol)在THF(1.2mL)中的溶液中。将反应混合物逐渐温热至室温，搅拌2小时。加入硅胶60(1g)，将混合物在真空下蒸干。通过硅胶柱色谱纯化残留物，得到白色泡沫状的N6-(4-碘苄基)-2’-脱氧腺苷dA.n6(266mg，98％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.48(br s，1H，与D2O可交换，6-NH)，8.40(s，1H，H-8)，8.27(s，1H，H-2)，7.68(d，2H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.17(d，2H，J＝8.0Hz，Ph-H)，6.39(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.34(d，1H，与D2O可交换，3’-OH)，5.22(t，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.68(br s，2H，Ph-CH2)，4.44(m，1H，H-4’)，3.91(m，1H，H-3’)，3.64(m，1H，H-5’a)，3.55(m，1H，H-5’b)，2.76(m，1H，H-2’a)，2.31(m，1H，H-2’b).
N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)苄基]-2’-脱氧腺苷(dA.n 7)
室温下搅拌化合物dA.n6(266mg，0.57mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(260mg，1.72mmol)、CuI(22mg，0.11mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(65mg，0.06mmol)和Et3N(160μL，1.14mmol)在无水DMF(2.1mL)中的溶液4.5小时。在真空下浓缩混合物，通过硅胶柱色谱纯化，得到腊状固体的
N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)苄基]-2’-脱氧腺苷dA.n7(268mg，94％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.05(br m，1H，与D2O可交换，NH)，8.46(brm，1H，与D2O可交换，NH)，8.37(s，1H，H-8)，8.19(s，1H，H-2)，7.37(d，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.32(d，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.35(dd，1H，J＝6.4和7.5Hz，H-1’)，5.31(d，1H，与D2O可交换，3’-OH)，5.19(t，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.70(br s，2H，Ph-CH2)，4.41(m，1H，H-3’)，4.26(d，2H，J＝4.3Hz，CH2)3.88(m，1H，H-4’)，3.61(m，1H，H-5’a)，3.53(m，1H，H-5’b)，2.73(m，1H，H-2’a)，2.25(m，1H，H-2’b).
N6-[4-(3-氨基-1-丙基)苄基]-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(dA.n8)
将POCl3(16μL，0.17mmol)加入到化合物dA.n7(56mg，0.11mmol)和质子海绵体(37mg，0.17mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，并保持在零下20-30℃2小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(261mg，0.55mmol)和三正丁胺(110μL)在无水DMF(1.1mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后在0℃下逐滴加入浓氢氧化铵(10mL，27％)。室温下再搅拌混合物1小时，然后冻干。将所得残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在300分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的三磷酸酯dA.n8(63mg，84％)。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.41(s，1H，H-8)，8.19(s，1H，H-2)，7.38-7.26(m，4H，Ph-H)，6.47(dd，1H，J＝5.5和6.6Hz，H-1’)，4.30(s，1H，H-4’)，4.21(m，2H，H-5’a和H-5’b)，3.63(s，2H，CH2)，2.79(m，1H，H-2’a)，2.60(m，1H，H-2’b).
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-5.80(d，J＝20.1Hz)，-10.94(d，J＝19.3Hz)，-21.59(t，J＝19.3Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C20H23N6O12P3Na[M-2H+Na]-而言，计算质量为655.0485，实测质量为655.0758。
6-FAM  标记的N6-(4-(3-氨基-1-丙基)苄基)-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(WW2p085)
将6-FAM-SE(3.5mg，7.35μmol)在无水DMSO(70μL)中的溶液加入到三磷酸酯dA.18a(3.5μmol)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH 9.2；600μL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC将反应纯化，得到6-FAM标记的三磷酸酯WW2p085。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-20％B 20分钟，然后20-90％B 20分钟的线性梯度进行洗脱。利用6-FAM染料的消光系数(即在494nm下的68,000)通过吸收光谱估计WW2p085的浓度。
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C41H36N6O18P3[M+H]+而言，计算质量为993.1299，实测质量为993.1520。
6-FAM标记的N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷三磷酸(WW2p093)的合成
方案.6-FAM标记的N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、无水DMF，0℃，然后逐渐温热至室温，12小时，83％；(ii)2-均三甲苯磺酰氯、Et3N、DMAP、无水CH2Cl2，室温，1.5小时，20％；(iii)1-(4-碘苯基)乙胺、分子筛、无水1，4-二噁烷，50℃，18小时，88％；(iv)n-Bu4NF、THF，0℃，然后逐渐温热至室温，93％；(v)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、无水DMF，4.5小时，86％；(vi)POCl3、(MeO)3PO，零下20-30℃；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N，DMF；1M  HNEt3HCO3，86％；(vii)6-FAM-SE、0.1M NaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小时。
3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧肌苷(dA.n9)1
在氮气气氛和0℃下将TBSCl(1.91g，12.67mmol)的溶液加入到2’-脱氧肌苷(1.00g，3.96mmol)和咪唑(1.73g，25.34mmol)在无水DMF(3mL)中的溶液中。将反应混合物逐渐温热至室温，搅拌12小时。然后将混合物在真空下浓缩，溶解在CH2Cl2(100mL)中，用水(50mL)清洗2次，利用Na2SO4干燥，在真空下浓缩，通过硅胶色谱纯化，得到白色粉末的3’，5’-O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧肌苷dA.n9(1.58g，83％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ12.37(br s，1H，与D2O可交换，NH)，8.25(s，1H，H-8)，8.04(d，1H，J＝3.6Hz，H-2)，6.29(t，1H，J＝6.6Hz，H-1’)，4.59(m，1H，H-3’)，3.84(m，1H，H-4’)，3.74(m，1H，H-5’a)，3.66(m，1H，H-5’b)，2.76(m，1H，H-2’a)，2.30(m，1H，H-2’b)，0.89(s，9H，(CH3)3CSi)，0.85(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(s，6H，(CH3)2Si)，0.02(2s，6H，(CH3)2Si).
1：确切步骤可见于：Kiselyov，A.S.；Steinbrecher，T.；Harvey，R.G.(1995)″Synthesis of the Fjord-region cis-and trans-Amino TriolDerivatives of the carcinogenic Hydrocarbon Benzo[g]chrysene andUtilization for the Synthesis of a Deoxyadenosine Adduct Linked to theN6-Amino Group″J.Org.Chem.，60：6129-6134。
O6-(2-均三甲苯磺酰基)-3’，5’-双-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧鸟苷(dA.n10)1
将2-均三甲苯磺酰氯(0.70g，2.12mmol)、Et3N(0.42mL，3.07mmol)和DMAP(16mg，0.13mmol)加入到化合物dA.n9(1.02g，2.12mmol)在无水CH2Cl2(15mL)中的溶液中。在室温下搅拌反应混合物1.5小时，然后用乙醚(50mL)稀释。将所述醚溶液用饱和NaHCO3清洗2次(每次25mL)，然后用盐水(25mL)清洗，利用Na2SO4干燥有机层，在真空下浓缩，通过硅胶色谱纯化，得到O6-(2-均三甲苯磺酰基)-3’，5’-双-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧鸟苷dA.n10(279mg，20％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.55(s，1H，H-8)，8.38(s，1H，H-2)，6.99(s，2H，Ph-H)，6.48(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，4.61(m，1H，H-3’)，4.03(m，1H，H-4’)，3.85(m，1H，H-5’a)，3.76(m，1H，H-5’b)，2.77(s，6H，CH3)，2.61(m，1H，H-2’a)，2.43(m，1H，H-2’b)，2.32(s，3H，CH3)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.89(s，9H，(CH3)3CSi)，0.09(s，6H，(CH3)2Si)，0.08(2s，6H，(CH3)2Si).
N6-[1-(4-碘苯基)乙基]-3’，5’-双-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷(dA.n11)
在氮气气氛和室温下将1-(4-碘苯基)乙胺(312mg，1.26mmol)在无水1，4-二噁烷(1mL)中的溶液加入到化合物dA.n10(279mg，0.42mmol)在含有分子筛(
Figure G2007800494372D01581
8-12目，0.75g)的无水1，4-二噁烷(2mL)中的溶液中。然后在50℃搅拌混合物18小时。真空下除去溶剂，通过硅胶柱色谱纯化粗产物，得到白色泡沫状的N6-[1-(4-碘苯基)乙基]-3’，5’-双-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脱氧腺苷dA.n11(263mg，88％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.32(s，1H，H-8)，8.08(s，1H，H-2)，7.61(m，2H，Ph-H)，7.15(m，2H，Ph-H)，6.42(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，6.20(br m，1H，NH)，5.50(br s，1H，Ph-CH)，4.59(m，1H，H-3’)，3.99(m，1H，H-4’)，3.85(m，1H，H-5’a)，3.77(m，1H，H-5’b)，2.60(m，1H，H-2’a)，2.42(m，1H，H-2’b)，1.59(d，3H，J＝7.0Hz，CH3)，0.90(s，18H，(CH3)3CSi)，0.08(s，12H，(CH3)2Si)；
非对映体的13C NMR(100MHz，MeOH-d4)：δ153.78(C)，151.94(CH)，143.78/143.71(C)，138.36(CH)，137.57(CH)，128.17/128.16(CH)，119.99(C)，92.41(C)，87.81/87.79(CH)，84.28(CH)，71.78/71.74(CH)，62.72/62.68(CH2)，49.40(br，CH)，41.31(CH2)，25.96(CH3)，25.75(CH3)，22.64(CH3)，18.41(C)，17.99(C)，-4.66(CH3)，-4.82(CH3)，-5.39(CH3)，-5.48(CH3).
N6-[1-(4-碘苯基)乙基]-2’-脱氧腺苷(dA.n12)
在0℃下将n-Bu4NF(409mg，1.30mmol)在THF(3mL)中的溶液加入到化合物dA.n11(263mg，0.37mmol)在THF(5mL)中的溶液中。将反应混合物逐渐温热至室温，搅拌30分钟，然后在真空下浓缩至干。通过硅胶柱色谱纯化残留物，得到N6-[1-(4-碘苯基)乙基]-2’-脱氧腺苷dA.n12(164mg，93％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.35(s，1H，H-8)，8.32(br s，1H，与D2O可交换，NH)，8.13(s，1H，H-2)，7.62(d，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.22(d，2H，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.32(m，1H，H-1’)，5.41(br，1H，Ph-CH)，5.31(d，1H，与D2O可交换，3’-OH)，5.19(m，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.35(m，1H，H-4’)，3.85(m，1H，H-4’)，3.58(m，1H，H-5’a)，3.48(m，1H，H-5’b)，2.68(m，1H，H-2’a)，2.22(m，1H，H-2’b)，1.49(d，3H，J＝7.0Hz，CH3).
N6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷(dA.n13)
在室温下将化合物dA.n12(70mg，0.145mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(66mg，0.44mmol)、CuI(5.5mg，0.03mmol)、四(三苯基膦)钯(0)17mg，0.015mmol)和Et3N(41μL，0.29mmol)在无水DMF(2.2mL)中的溶液搅拌5.5小时。在真空下浓缩混合物，通过硅胶柱色谱纯化，得到腊状固体的N6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷dA.n13(63mg，86％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.05(t，1H，J＝5.4Hz，与D2O可交换，NH)，8.36(s，1H，H-8)，8.34(br s，1H，与D2O可交换，NH)，8.15(s，1H，H-2)，7.43(d，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.36(d，2H，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.33(dd，1H，J＝6.4和7.5，Hz，H-1’)，5.49(br，1H，Ph-CH)，5.30(d，1H，与D2O可交换，3’-OH)，5.10(m，1H，与D2O可交换，5’-OH)，4.39(m，1H，H-3’)，4.25(d，2H，J＝5.4Hz，CH2)，3.87(m，1H，H-3’)，3.59(m，1H，H-5’a)，3.51(m，1H，H-5’b)，2.72(m，1H，H-2’a)，2.24(m，1H，H-2’b)，1.52(d，3H，J＝7.0Hz，CH3)；
N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(dA.n14)
将POCl3(14μL，0.15mmol)加入到化合物dA.n14(51mg，0.1mmol)和质子海绵体(32mg，0.15mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，并保持在零下20-30℃2小时。加入双-三正丁胺焦磷酸盐(237mg，0.5mmol)和三正丁胺(100μL)在无水DMF(1.0mL)中的溶液。搅拌5分钟后，加入三乙胺碳酸氢盐缓冲液(1M，pH 7.5；10mL)。室温下搅拌反应1小时，然后在0℃下逐滴加入浓氢氧化铵(10mL，27％)。室温下再搅拌混合物1小时，然后冻干。将所得残留物溶解在水(10mL)中，过滤，通过阴离子交换色谱利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3线性梯度(在300分钟内从50mM至500mM)和4.5mL/分钟的流速进行纯化。合并含有三磷酸酯的级分并冷冻干燥，得到白色蓬松固体的三磷酸酯dA.n14(60mg，86％，非对映体的1∶1混合物)。
非对映体的1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.41(s，1H，H-8)，8.14(2s，1H，H-2)，7.38(m，4H，Ph-H)，6.46(m，1H，H-1’)，5.32(br，1H，Ph-CH)，4.30(s，1H，H-3’)，4.20(m，2H，H-5’a和H-5’b)，3.61(s，2H，CH2)，2.78(m，1H，H-2’a)，2.59(m，1H，H-2’b)，1.60(d，3H，J＝6.9Hz，CH3)；
31P NMR(162MHz，D2O)：δ-6.02(d，J＝19.4Hz)，-11.19(d，J＝19.4Hz)，-21.77(t，J＝19.4Hz)；
ToF-MS(ESI)：对于分子离子C21H25N6O12P3Na[M-2H+Na]-而言，计算质量为669.0641，实测质量为669.0960。
6-FAM标记的N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)苯基]乙基}-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸(WW2p093)
将6-FAM-SE(3.5mg，7.4μmol)在无水DMSO(70μL)中的溶液加入到三磷酸酯dA.n14(4.1μmol)在Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH9.2；600μL)中的溶液中，并在室温下孵育1小时。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通过反相HPLC将反应纯化，得到6-FAM标记的三磷酸酯WW2p093。流动相：A，在水中的100mM乙酸三乙铵(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-20％B 20分钟，然后20-90％B 20分钟的线性梯度进行洗脱。利用6-FAM染料的消光系数(即在494nm下的68,000)通过吸收光谱估计WW2p093的浓度。
本文所参考的所有专利和专利出版物在此通过引用并入本文。本领域技术人员可以在理解前述说明书的基础上作出某些改动和改进。应当理解，为了简明和可读性的目的已删除了所有这些改动和改进，但是所有这些改动和改进仍完全落在下述权利要求的范围内。

Claims (46)

1.下式的化合物：
Figure A2007800494370002C1
其中R1是H、单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，
R2是H或OH，
所述碱基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤或其天然衍生物，
所述可断裂的终止部分是赋予所述化合物以聚合酶终止性能的基团，
所述连接物是双官能团，以及
所述染料是荧光团。
2.权利要求1的化合物，其中所述可断裂的终止部分通过选自以下的键与所述碱基相连接：苄胺、苄醚、氨基甲酸酯、碳酸酯、氨基甲酸2-(邻硝基苯基)乙酯以及碳酸2-(邻硝基苯基)乙酯。
3.权利要求1或2的化合物，其中所述化合物选自式I-VII所代表的化合物、式I-VII所代表化合物的可药用盐或酯，以及式I-VII所代表化合物和其可药用盐或酯的对映体、外消旋混合物或立体异构体：
或
Figure A2007800494370004C1
其中R1＝H、单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，
R2＝H或OH，
R3和R4各自独立地选自H、C1-C12直链或支链烷基、C2-C12直链或支链烯基或多烯基、C2-C12直链或支链炔基或多炔基、以及芳香性基团例如苯基、萘基或吡啶环，
前提是R3和R4中至少一个是H，
R5、R6、R7和R8各自独立地选自H、OCH3、NO2、CN、卤化物、C1-C12直链或支链烷基、C2-C12直链或支链烯基或多烯基、C2-C12直链或支链炔基或多炔基、以及芳香性基团例如苯基、萘基或吡啶环，和/或下述一般结构的连接基团：
Figure A2007800494370004C2
其中X＝CH2、CH＝CH、C≡C、O、S或NH，
Y＝CH2、O或NH，
n＝0-12的整数，
m＝0-12的整数，以及
染料＝荧光团。
4.权利要求3的化合物，其中R3和R4独立地选自-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、异丙基、叔丁基、苯基、2-硝基苯基和2，6-二硝基苯基。
5.权利要求3的化合物，其中R3和R4中至少一个选自烷基和芳香基，所述烷基或芳香性基团中任选地含有至少一个杂原子，并且其中所述芳香性基团可任选地是芳基或者是多环基团。
6.权利要求3至5中任一项的化合物，其中R5、R6、R7和R8中至少一个选自芳基和多环基团的芳香基。
7.权利要求1至6中任一项的化合物，其中所述荧光团选自BODIPY、荧光素、罗丹明、香豆素、呫吨、花青、芘、酞菁、藻胆蛋白、alexa、squarene染料、产生能量转移染料的组合以及其衍生物。
8.权利要求3的化合物，其中所述化合物选自：
Figure A2007800494370005C1
Figure A2007800494370006C1
9.一种靶核酸的测序方法，所述方法包括下述步骤：
(i)将引物连接到固体表面上；
(ii)将靶核酸与所述连接到固体表面上的引物进行杂交；
(iii)加入权利要求1至8中任一项的一种或多种化合物，其中如果存在一种以上类型的碱基，则每种碱基任选地与不同荧光团相连接；
(iv)将聚合酶添加入到所述杂交的引物/靶核酸复合物中以通过聚合酶催化反应将步骤(iii)的化合物引入到生长中的引物核酸链中，其中所引入的步骤(iii)的化合物以约70％至约100％的效率终止所述聚合酶反应；
(v)任选地清洗所述固体表面以除去未引入的成分；
(vi)检测所引入的荧光团以鉴定所引入的步骤(iii)的化合物，其中所述检测任选地利用用于荧光染料成像的脉冲多线激发检测器进行；
(vii)任选地加入一种或多种化合物以给未延伸引物永久性加帽；
(viii)将所述固体表面暴露于光源以除去光可断裂的终止部分，得到含有天然成分的延伸的引物核酸；
(ix)任选地清洗所述固体表面以除去所述断裂的光可断裂终止部分；
(x)重复步骤(iii)至(ix)1次或多次以鉴定所述靶核酸中的多个碱基。
10.权利要求9的方法，其中步骤(iv)的至少一种化合物的引入效率为所述聚合酶反应中含相同碱基的天然底物的引入效率的约70％至约100％。
11.权利要求10的方法，其中所述引入效率为约85％至约100％。
12.权利要求9至11中任一项的方法，其中所述聚合酶选自逆转录酶、末端转移酶和DNA聚合酶。
13.权利要求12的方法，其中所述聚合酶选自Taq DNA聚合酶、Klenow(-exo-)DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Vent(-exo-)DNA聚合酶、Pfu(-exo-)DNA聚合酶以及DeepVent(exo-)DNA聚合酶。
14.权利要求12的方法，其中所述聚合酶是选自以下的修饰的聚合酶：Taq FS DNA聚合酶、ThermoSequenase DNA聚合酶、ThermoSequenase II DNA聚合酶、Therminator DNA聚合酶、Therminator II DNA聚合酶以及Vent(-exo-)A488L DNA聚合酶。
15.权利要求9至14中任一项的方法，其中在步骤(viii)中通过暴露于光源除去约85％至约100％的光可断裂的终止部分。
16.权利要求9至15中任一项的方法，其中在根据步骤(iv)引入至少一种化合物之后以约90％至约100％的效率终止所述引物核酸链的生长。
17.一种将核酸分子中的非天然成分转化成天然成分的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)将权利要求1至8中任一项的化合物引入核酸中；以及
(ii)将所得核酸暴露于光源以除去所述核酸中光可断裂的终止部分。
18.一种终止核酸合成的方法，所述方法包括将权利要求1至8中任一项的3’-OH未保护的核苷酸或核苷置于聚合酶的环境中以及将所述3’-OH未保护的核苷酸或核苷引入到核酸分子中的步骤。
19.权利要求18的方法，其中引入所述3’-OH未保护的核苷酸或核苷时DNA合成的终止效率为约90％至约100％。
20.权利要求18或19的方法，其中所述3’-OH未保护的核苷酸或核苷的引入效率为含有与所述3’-OH未保护的核苷酸或核苷相同的碱基的天然核苷酸或核苷的引入效率的约70％至约100％。
21.一种进行Sanger或Sanger型测序的方法，所述方法包括将权利要求1至8中任一项的化合物加入到Sanger或Sanger型测序反应中。
22.一种进行焦磷酸测序或焦磷酸测序型测序的方法，所述方法包括将权利要求1至8中任一项的化合物加入到焦磷酸测序或焦磷酸测序型测序反应中。
23.下式的化合物：
Figure A2007800494370008C1
其中R1是H、单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，
R2是H或OH，
所述碱基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或其天然衍生物，
所述不可断裂的终止部分是赋予所述化合物以聚合酶终止性能的基团，
所述连接物是双官能团，以及
所述染料是荧光团。
24.权利要求23的化合物，其中所述不可断裂的终止部分通过选自以下的键与所述碱基相连接：苄胺、苄醚、氨基甲酸酯、碳酸酯、氨基甲酸2-(邻硝基苯基)乙酯以及碳酸2-(邻硝基苯基)乙酯。
25.权利要求1的化合物，其中所述化合物选自式I-VII所代表的化合物、式I-VII所代表化合物的可药用盐或酯，以及式I-VII所代表化合物和其可药用盐或酯的对映体、外消旋混合物或立体异构体：
Figure A2007800494370009C1
其中R1＝H、单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，
R2是H或OH，
R3和R4各自独立地选自H、C1-C12直链或支链烷基、C2-C12直链或支链烯基或多烯基、C2-C12直链或支链炔基或多炔基、以及芳香性基团例如苯基、萘基或吡啶环，
R5、R6和R7各自独立地选自H、OCH3、NO2、CN、卤化物、C1-C12直链或支链烷基、C2-C12直链或支链烯基或多烯基、C2-C12直链或支链炔基或多炔基、以及芳香性基团例如苯基、萘基或吡啶环，和/或下述一般结构的连接基团：
Figure A2007800494370011C1
其中X＝CH2、CH＝CH、C≡C、O、S或NH，
Y＝CH2、O或NH，
n＝0-12的整数，
m＝0-12的整数，并且染料＝荧光团，以及
R8和R9如上述针对R5、R6和R7的定义，前提是R8和R9不是NO2。
26.权利要求25的化合物，其中R3和R4中的至少一个选自-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、异丙基、叔丁基和苯基。
27.权利要求25的化合物，其中R3和R4中的至少一个选自烷基和芳香性基团，所述烷基或芳香性基团中任选地含有至少一个杂原子，并且其中所述芳香性基团可任选地是芳基或者是多环基团。
28.权利要求25至27中任一项的化合物，其中R5、R6、R7和R8中至少一个选自芳基和多环基团的芳香性基团。
29.权利要求23至28中任一项的化合物，其中所述荧光团选自BODIPY、荧光素、罗丹明、香豆素、呫吨、花青、芘、酞菁、藻胆蛋白、alexa、squarene染料、产生能量转移染料的组合以及其衍生物。
30.权利要求25的化合物，其中所述化合物选自：
Figure A2007800494370012C1
31.一种测定靶核酸序列的方法，所述方法包括下述步骤：
(i)将靶核酸加入到Sanger或Sanger型测序反应中；
(ii)向所述测序反应中加入权利要求23至30中任一项的一种或多种化合物，其中如果存在一种以上类型的碱基，则每种碱基任选地与不同荧光团相连接；
(iii)加入互补引物和聚合酶；
(iv)进行聚合酶催化反应以将步骤(ii)的至少一种化合物引入到生长中的核酸链中，以及
(v)分析测序反应的结果，其中步骤(i)-(iii)可以任意顺序进行。
32.权利要求31的方法，其中在根据步骤(iv)引入至少一种化合物后以约90％至约100％的效率终止核酸链的生长。
33.权利要求31的方法，其中步骤(iv)的至少一种化合物的引入效率为聚合酶反应中含相同碱基的天然底物的引入效率的约70％至约100％。
34.权利要求33的方法，其中所述引入效率为约85％至约100％。
35.权利要求31至34中任一项的方法，其中所述聚合酶选自逆转录酶、末端转移酶和DNA聚合酶。
36.权利要求35的方法，其中所述聚合酶选自Taq DNA聚合酶、Klenow(exo-)DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Vent(-exo-)DNA聚合酶、Pfu(exo-)DNA聚合酶以及DeepVent(exo-)DNA聚合酶。
37.权利要求35的方法，其中所述聚合酶是选自以下的修饰的聚合酶：TaqFS DNA聚合酶、ThermoSequenase DNA聚合酶、ThermoSequenase II DNA聚合酶、Therminator DNA聚合酶、Therminator II DNA聚合酶以及Vent(exo-)A488L DNA聚合酶。
38.一种将非天然成分引入到核酸中的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)将靶核酸加入到反应中；
(ii)将权利要求23至30中任一项的一种或多种化合物加入到所述反应中，其中如果存在一种以上类型的碱基，则每种碱基任选地与不同荧光团相连接；
(iii)将聚合酶加入到所述反应中；以及
(iv)进行聚合酶催化反应以将步骤(ii)的至少一种化合物引入到生长中的核酸链中，其中步骤(i)-(iii)可以任意顺序进行。
39.权利要求38的方法，其还包括分析用于引入步骤(ii)的至少一种化合物的聚合酶反应的结果的步骤。
40.权利要求38至39中任一项的方法，其中在根据步骤(iv)引入至少一种化合物后以约90％至约100％的效率终止链的生长。
41.权利要求38至40中任一项的方法，其中根据步骤(iv)引入至少一种化合物的效率为聚合酶反应中含相同碱基的天然底物的引入效率的约70％至约100％。
42.一种终止核酸合成的方法，所述方法包括将权利要求23至30中任一项的3’-OH未保护的核苷酸或核苷置于聚合酶环境中并将所述3’-OH未保护的核苷酸或核苷引入到核酸中的步骤。
43.权利要求42的方法，其中引入所述3’-OH未保护的核苷酸或核苷时的终止效率为约90％至约100％。
44.权利要求42或43的方法，其中所述3’-OH未保护的核苷酸或核苷的引入效率为含相同碱基的天然核苷酸或核苷的引入效率的约70％至约100％。
45.一种进行Sanger或Sanger型测序的方法，所述方法包括将权利要求23至30中任一项的化合物加入到Sanger或Sanger型测序反应中。
46.一种进行微测序或微测序型测序的方法，所述方法包括将权利要求23至30中任一项的化合物加入到微测序或微测序型测序反应中。
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