CN115894630A - 一种利那洛肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利那洛肽的制备方法。本发明采用固相液相结合的方法，通过完全选择性氧化精准构建利那洛肽的三对二硫键，且操作过程中不需要过多的纯化步骤，不但提高了反应总产率，且极大降低了利那洛肽二硫键错配现象的发生，引入的光保护基团符合当下绿色化学的发展理念，原料价格低廉易得，能有效降低物料成本，有利于工业化大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种利那洛肽的制备方法。
背景技术
利那洛肽的氨基酸序列及其S-S连接方式如图1所示，其结构式如下：
利那洛肽于(linaclotide)2012年8月30日获美国FDA批准上市，商品名为Linzess，2019年于中国上市，成为中国第一个上市的口服肠上皮细胞鸟苷酸环化酶C(GC-C)激动剂，用于治疗成人便秘肠易激综合征(IBS-C)和慢性特发性便秘(CIC)。利那洛肽由十四个氨基酸组成，分子式为C59H79N15O21S6，相对分子质量为1526.8，含有三对二硫键(Cys1-Cys6、Cys2-Cys10、Cys5-Cys13)。
目前，利那洛肽的合成方法分为以下几种方法，一是自由氧化方法，如专利CN201310223243.7使用六个自由巯基半胱氨酸合成利那洛肽线性肽，通过一次性自由氧化形成三对二硫键。虽然合成步骤简单，只使用了一种Cys的保护基团，但是对于需要定位形成三对二硫键的肽来说，随机氧化会得到许多不同的二硫键错配异构体，尽管可以通过一些缓冲溶液体系来使得氧化过程中尽可能大的转变为目标分子，但是始终无法避免其他异构体的产生，进而导致产率低，纯化困难。二是半选择性定位氧化方法，如利用三苯甲基(Trt)、乙酰胺甲基(Acm)保护的半胱氨酸半选择性氧化形成三对二硫键，实验中Cys1-Cys6利用Acm保护，剩下两对巯基(Cys2-Cys10、Cys5-Cys13)用Trt保护；先使用氯化血红素催化形成两对二硫键(Cys2-Cys10、Cys5-Cys13)，再用二苯亚砜/三甲基氯硅烷体系脱除Acm保护基氧化形成最后一对二硫键；或是用Trt保护基保护Cys5-Cys13，其余二对巯基使用Acm保护基团(Cys1-Cys6，Cys2-Cys10)，利用相同条件的氧化方法得到利那洛肽。相对于自由氧化方法，该方法定位氧化了一对二硫键，降低二硫键错配的风险，但二硫键的错配不可避免。三是全选择性氧化的方法，如分别用Trt、Acm、和叔丁基(tBu)作为正交保护基团，依次用双氧水、碘、二苯亚砜-三氯硅烷等氧化试剂分步构建利那洛肽的三对二硫键，此法完全解决了利那洛肽合成过程中错配的问题，但合成过程中需要进行多次繁琐的纯化，致使产率较低，且不利于大规模生产。四是一锅分步选择氧化的方法，如分别以2-硝基苄基(NBn)、Trt、Acm为Cys保护基团，Trt保护Cys5-Cys13，二硫仑(DSF)作为氧化剂形成第一对二硫键，NBn保护Cys1-Cys6，在365nm紫外光照下脱除保护基并形成第二对二硫键，Acm保护Cys2-Cys10，在金属钯的作用下DSF氧化形成第三对二硫键。此方法操作简单不需要多次纯化，并能准确构建三对二硫键，但金属钯造价昂贵，在用于生产中时不仅成本过高而且重金属的使用不利于多肽药物的合成。
由此可见，亟需探索一种反应条件温和、操作简便、产率高、成本低、环境友好，适用于大规模生产利那洛肽的合成方法。
发明内容
本发明针对上述合成方法中存在的二硫键错配导致产率低纯化困难、操作繁琐、成本高等问题，提供了一种固相和液相结合的全选择性氧化形成三对二硫键合成利那洛肽的新方法，从而实现定向高效合成三对全交叉的二硫键。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是，提供一种利那洛肽的制备方法，包括以下步骤：
S1：以Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin树脂或Fmoc-Tyr(tBu)-CTC Resin树脂为固相载体，采用Fmoc固相合成法合成具有如式I或式II所示氨基酸序列的利那洛肽线性前体树脂：
S2：用1～5％TFA/DCM溶液脱除利那洛肽线性前体树脂第1和6位Cys上的Mmt保护基；然后将脱Mmt保护基后的树脂与NCS按100:5～15的质量比投入固相反应器中，室温反应1～2h，然后用甲醇收缩30min，构建第一对二硫键Cys(1-6)；
S3：用裂解液对经过S2处理后的树脂进行裂解，再纯化，得到Cys(2-10)侧链巯基裸露、Cys(5-13)侧链巯基受到NBn保护的利那洛肽前体1；所述裂解液为1～5％裂解剂/TFA溶液，裂解剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和TRIPS中的至少一种；
S4：将利那洛肽前体1分散于pH为7～8的溶液中，加入5～15eq的氧化剂，室温氧化1～3h，构建第二对二硫键Cys(2-10)，得到含有两对二硫键Cys(1-6)和Cys(2-10)的利那洛肽前体2；氧化剂为DSF、双氧水、50M碳酸氢铵和NCS中的至少一种；
S5：将利那洛肽前体2在波长为350～380nm的紫外光下照射5～120min，脱除第5和13位Cys上的NBn保护基；然后以DSF为氧化剂氧化1～3h，形成第三对二硫键Cys(5-13)；再经HPLC纯化得到利那洛肽。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，利那洛肽线性前体树脂的合成包括以下步骤：
SS1：将取代度为0.1～1mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin树脂或取代度为0.1～1mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-CTC Resin树脂分散于DCM溶液中，溶胀15～25min，然后用DCM和DMF各冲洗两次，得预处理后的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin树脂或Fmoc-Tyr(tBu)-CTCResin树脂；
SS2：将预处理后的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin树脂或Fmoc-Tyr(tBu)-CTC Resin树脂浸没于20％PIP/DMF(体积百分比)溶液中，室温下反应2min；然后更换新的20％PIP/DMF溶液，继续反应5min，得脱除Fmoc保护基的树脂；
SS3：将脱除Fmoc保护基的树脂、Fmoc-Cys(NBn)-OH和偶联缩合剂投入固相反应容器中，加入DMF，室温下反应15min，得中间体；偶联缩合剂为DIEA和HATU的混合物；
SS4：重复SS2和SS3中的操作，依次将Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Cys(NBn)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH和Fmoc-Cys(Mmt)-OH与中间体进行偶联，即得具有如式I或式II所示氨基酸序列的利那洛肽线性前体树脂。
进一步，脱除Fmoc保护基的树脂、Fmoc-Cys(NBn)-OH和偶联缩合剂的质量比为1:2～5:1.5～3。
进一步，偶联缩合剂由HATU和DIEA按1～1.5g:1mL的料液比混合而成。
进一步，S2中Cys上Mmt保护基的脱除包括以下步骤：将利那洛肽线性前体树脂浸没于1～5％TFA/DCM溶液中，反应2min，然后更换新的TFA/DCM溶液，继续反应2min；重复上述操作8～12次，直至树脂由红色变为无色；随后用DCM和DMF各清洗2次，得脱Mmt保护基后的树脂。
进一步，利那洛肽前体1经过以下步骤制得：
SS31：将经过S2处理后的树脂分散于裂解液中，室温下反应2h；然后抽滤收集滤液，再将滤液加入冰乙醚中，静置沉降；沉降物用冰乙醚离心洗涤5次，干燥后得利那洛肽线性前体粗肽；
SS32：将利那洛肽线性前体粗肽用0.1％TFA/水溶液溶解，配成10mg/mL的溶液，再依次用滤膜和HPLC纯化，然后冻干，得利那洛肽前体1。
进一步，裂解液由TFA、TRIPS和水按95:2.5:2.5的体积比混合而成。
进一步，S4中溶液为6M盐酸胍、乙腈、水、DMF或50％乙腈/水。
进一步，紫外光的波长为365nm。
本发明的有益效果是：本发明采用固相液相结合的策略，将三对二硫键的形成过程划分为三个阶段。该方法不但能够使三对二硫键精准高效配对，降低错配率，而且所使用的氧化剂(NCS、DSF等)较为温和，能有效避免副反应的发生。此外，利用2-硝基苄基(NBn)保护的半胱氨酸作为反应底物，在紫外光照条件下即可快速脱除保护基团氧化形成二硫键，反应条件温和且无需添加其他化学试剂，减少了对环境的污染，并且提高了安全性。本发明的合成策略有助于提高产品纯度和收率，易于放大生产。经制备型高效液相色谱纯化所得利那洛肽纯度为99.8％，总产率为46％。与现有技术相比，在产率上有着显著提高。
附图说明
图1为利那洛肽的氨基酸序列及其S-S连接方式；
图2为利那洛肽合成路线示意图；
图3为利那洛肽质谱图；
图4为利那洛肽色谱图。
具体实施方式
本发明公开了利那洛肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明的内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
按照图2所示路线，先合成利那洛肽粗品，溶解过滤后进行HPLC纯化，即获得利那洛肽精肽。具体步骤如下：
(1)利那洛肽直链树脂合成：以Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin或Fmoc-Tyr(tBu)-CTCResin树脂(购买于吉尔生化)为固相载体，按照Fmoc固相合成策略逐个偶联，合成利那洛肽线性前体树脂，其结构如下：
H-Cys(Mmt)-Cys(Dpm)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(NBn)-Cys(Mmt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Dpm)-Thr(tBu)-Gly-Cys(NBn)-Tyr(tBu)-Wang Resin；
H-Cys(Mmt)-Cys(Dpm)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(NBn)-Cys(Mmt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Dpm)-Thr(tBu)-Gly-Cys(NBn)-Tyr(tBu)-CTC Resin。
(2)利那洛肽第一对二硫键Cys(1-6)的形成：用侧链脱保护试剂脱除第1位和第6位侧链保护基Mmt，再在氧化剂作用下氧化形成第一对二硫键Cys(1-6)。
(3)含一对二硫键的利那洛肽前体1的制备：采用裂解液将直链肽从树脂上裂解下来，得到Cys(1-6)成二硫键，Cys(2-10)侧链巯基裸露，Cys(5-13)侧链巯基受到NBn保护的利那洛肽前体1。
(4)利那洛肽第二对二硫键Cys(2-10)的形成：将上述步骤3得到的利那洛肽前体1溶解在溶液中，采用氧化剂氧化，构建第二对二硫键Cys(2-10)，得到含有两对二硫键Cys(1-6)和Cys(2-10)的利那洛肽前体2。
(5)利那洛肽第三对二硫键Cys(1-6)的形成：将上述步骤4的反应体系直接移至光反应器下，紫外光照射除去Cys(5-13)上保护基NBn，再以DSF为氧化剂氧化形成第三对二硫键，经HPLC纯化得到利那洛肽精肽。
上述步骤(1)中，Fmoc保护基的脱除是使用20％PIP/DMF溶液(体积百分比)，偶联缩合剂为DIEA和HATU的混合物。
上述步骤(2)中，第一对二硫键Cys(1-6)的形成过程中，使用的侧链脱保护试剂为1～5％TFA/DCM溶液(体积百分比)，脱除时间为1～5min，直到树脂颜色由红色变为无色；使用的氧化剂为NCS，氧化剂与树脂质量比为5～15:100，反应时间为1～2h。
上述步骤(4)中，第二对二硫键Cys(2-10)的形成过程中，使用的溶液为pH为7～8的6M盐酸胍、乙腈、水、DMF或50％乙腈/水(体积百分比)，利那洛肽前体1的溶解比例为1mg/mL～5mg/ml；所用氧化剂为DSF、双氧水、50M碳酸氢铵和NCS中的至少一种，氧化剂用量为5～15eq，室温下氧化1～3h。
上述步骤(5)中，第三对二硫键Cys(5-13)的形成过程中，使用的紫外光波长为350～380nm，光照时间为5～120min，氧化时间为1～3h。
本发明采用固相液相结合的方法，将利那洛肽三对二硫键的形成过程分为三步，且操作过程中不需要过多的纯化步骤，不但提高了反应总产率，且极大降低了利那洛肽二硫键错配现象的发生，引入的光保护基团符合当下绿色化学的发展理念，原料价格低廉易得，能有效降低物料成本，有利于工业化大规模生产。
缩写及英文含义：
本发明提供的利那洛肽的制备方法中所用的原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1：Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin的预处理
称取500mg替代度为0.1mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin于25ml固相反应器中，加入DCM溶胀20min后抽滤，依次用DCM、DMF各洗两次。
实施例2：Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin的预处理
称取500mg替代度为0.64mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin于25ml固相反应器中，加入DCM溶胀20min后抽滤，依次用DCM、DMF各洗两次。
实施例3：Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin的预处理
称取500mg替代度为1mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin于25ml固相反应器中，加入DCM溶胀20min后抽滤，依次用DCM、DMF各洗两次。
实施例4：Fmoc-Tyr(tBu)-CTC Resin的预处理
称取500mg替代度为0.64mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-CTC Resin(购买于吉尔生化)于25ml固相反应器中，加入DCM溶胀20min后抽滤，依次用DCM、DMF各洗两次
实施例5：利那洛肽线性Wang Resin合成(利那洛肽线性前体树脂)
实施例1～3预处理后的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin树脂性能基本相同，以实施例2预处理后的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin树脂为例，进行利那洛肽线性Wang Resin合成，具体包括以下步骤：
(1)将实施例2预处理后的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin树脂浸没于20％PIP/DMF(体积百分比)溶液中，室温下反应2min；然后更换新的20％PIP/DMF溶液，继续反应5min；反应完毕后抽滤，DMF洗涤树脂5次。Kasier试剂检测结果呈阳性，说明脱保护成功，得脱除Fmoc保护基的树脂。
(2)按如下流程合成Fmoc-Cys(NBn)-OH
(3)将脱除Fmoc保护基的树脂、Fmoc-Cys(NBn)-OH和偶联缩合剂按1:4:2的质量比投入固相反应容器中，加入5ml DMF，室温反应15min，反应结束后抽滤，DMF洗涤树脂5次，kasier试剂进行检测，树脂无色透明说明缩合成功，得中间体；所用偶联缩合剂由HATU和DIEA按1.3g:1mL的料液比混合而成。
(4)重复步骤(1)和(2)中的操作，依次将Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Cys(NBn)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH和Fmoc-Cys(Mmt)-OH与中间体进行偶联，得到如下序列的利那洛肽线性Wang Resin：
H-Cys(Mmt)-Cys(Dpm)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(NBn)-Cys(Mmt)-Asn(Trt)-Pro-Al a-Cys(Dpm)-Thr(tBu)-Gly-Cys(NBn)-Tyr(tBu)-Wang Resin。
实施例6：利那洛肽线性CTC Resin合成
利那洛肽线性CTC Resin的合成包括以下步骤：
(1)将实施例4预处理后的Fmoc-Tyr(tBu)-CTC Resin树脂浸没于20％PIP/DMF(体积百分比)溶液中，室温下反应2min；然后更换新的20％PIP/DMF溶液，继续反应5min；反应完毕后抽滤，DMF洗涤树脂5次。Kasier试剂检测结果呈阳性，说明脱保护成功，得脱除Fmoc保护基的树脂。
(2)将脱除Fmoc保护基的树脂、Fmoc-Cys(NBn)-OH和偶联缩合剂按1:5:3的质量比投入固相反应容器中，加入5ml DMF，室温反应15min，反应结束后抽滤，DMF洗涤树脂5次，kasier试剂进行检测，树脂无色透明说明缩合成功，得中间体；所用偶联缩合剂由HATU和DIEA按1.5g:1mL的料液比混合而成。
(3)重复步骤(1)和(2)中的操作，依次将Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Cys(NBn)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH和Fmoc-Cys(Mmt)-OH与中间体进行偶联，得到如下序列的利那洛肽线性Wang Resin：
H-Cys(Mmt)-Cys(Dpm)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(NBn)-Cys(Mmt)-Asn(Trt)-Pro-Al a-Cys(Dpm)-Thr(tBu)-Gly-Cys(NBn)-Tyr(tBu)-CTC Resin。
实施例7：利那洛肽第一对二硫键Cys(1-6)的形成(利那洛肽前体1)
配制1％TFA/DCM溶液，将实施例5所合成的树脂浸没于所配制的溶液中，反应2min，然后更换新的TFA/DCM溶液，继续反应2min；重复上述操作10次；到树脂颜色由红色变为无色，脱除序列中第1和6位两个Cys上的Mmt保护基，脱除完毕后用DCM清洗树脂2次，DMF清洗树脂2次，得脱Mmt保护基后的树脂。
将脱Mmt保护基后的树脂与NCS按100:5的质量比投入固相反应器中，室温反应1h，用DMF清洗树脂3次，甲醇收缩树脂30min，抽滤干燥，形成第一对二硫键Cys(1-6)。
将上述树脂转移至圆底烧瓶中，配制裂解液TFA/水/TRIPS＝95:2.5:2.5，并将裂解液加入圆底烧瓶中，室温反应2h；反应结束后抽滤，收集滤液，将滤液缓慢加入冰乙醚中，静置沉降，沉降物在高速离心机中冰乙醚洗涤离心5次，干燥，得利那洛肽线性肽粗肽。
然后将利那洛肽线性肽粗肽用0.1％TFA/水溶液(体积百分比)溶解，得到10mg/ml浓度溶液，溶液用滤膜初步纯化，再经HPLC纯化，然后冻干后得到含有一对二硫键的利那洛肽前体1。
实施例8：利那洛肽第一对二硫键Cys(1-6)的形成(利那洛肽前体1)
配制2％TFA/DCM溶液，将实施例5所合成的树脂浸没于所配制的溶液中，反应2min，然后更换新的TFA/DCM溶液，继续反应2min；重复上述操作8次；到树脂颜色由红色变为无色，脱除序列中第1和6位两个Cys上的Mmt保护基，脱除完毕后用DCM清洗树脂2次，DMF清洗树脂2次，得脱Mmt保护基后的树脂。
将脱Mmt保护基后的树脂与NCS按100:10的质量比投入固相反应器中，室温反应1.5h，用DMF清洗树脂3次，甲醇收缩树脂30min，抽滤干燥，形成第一对二硫键Cys(1-6)。
将上述树脂转移至圆底烧瓶中，配制裂解液TFA/水/TRIPS＝95:2.5:2.5，并将裂解液加入圆底烧瓶中，室温反应2h；反应结束后抽滤，收集滤液，将滤液缓慢加入冰乙醚中，静置沉降，沉降物在高速离心机中冰乙醚洗涤离心5次，干燥，得利那洛肽线性肽粗肽。
然后将利那洛肽线性肽粗肽用0.1％TFA/水溶液(体积百分比)溶解，得到10mg/ml浓度溶液，溶液用滤膜初步纯化，再经HPLC纯化，然后冻干后得到含有一对二硫键的利那洛肽前体1。
实施例9：利那洛肽第一对二硫键Cys(1-6)的形成(利那洛肽前体1)
配制5％TFA/DCM溶液，将实施例5所合成的树脂浸没于所配制的溶液中，反应2min，然后更换新的TFA/DCM溶液，继续反应2min；重复上述操作12次；到树脂颜色由红色变为无色，脱除序列中第1和6位两个Cys上的Mmt保护基，脱除完毕后用DCM清洗树脂2次，DMF清洗树脂2次，得脱Mmt保护基后的树脂。
将脱Mmt保护基后的树脂与NCS按100:15的质量比投入固相反应器中，室温反应1.5h，用DMF清洗树脂3次，甲醇收缩树脂30min，抽滤干燥，形成第一对二硫键Cys(1-6)。
将上述树脂转移至圆底烧瓶中，配制裂解液TFA/水/TRIPS＝95:2.5:2.5，并将裂解液加入圆底烧瓶中，室温反应2h；反应结束后抽滤，收集滤液，将滤液缓慢加入冰乙醚中，静置沉降，沉降物在高速离心机中冰乙醚洗涤离心5次，干燥，得利那洛肽线性肽粗肽。
然后将利那洛肽线性肽粗肽用0.1％TFA/水溶液(体积百分比)溶解，得到10mg/ml浓度溶液，溶液用滤膜初步纯化，再经HPLC纯化，然后冻干后得到含有一对二硫键的利那洛肽前体1。
实施例10：利那洛肽第一对二硫键Cys(1-6)的形成(利那洛肽前体1)
配制2％TFA/DCM溶液，将实施例6所合成的树脂浸没于所配制的溶液中，反应2min，然后更换新的TFA/DCM溶液，继续反应2min；重复上述操作8次；到树脂颜色由红色变为无色，脱除序列中第1和6位两个Cys上的Mmt保护基，脱除完毕后用DCM清洗树脂2次，DMF清洗树脂2次，得脱Mmt保护基后的树脂。
将脱Mmt保护基后的树脂与NCS按100:10的质量比投入固相反应器中，室温反应1.5h，用DMF清洗树脂3次，甲醇收缩树脂30min，抽滤干燥，形成第一对二硫键Cys(1-6)。
将上述树脂转移至圆底烧瓶中，配制裂解液TFA/水/TRIPS＝95:2.5:2.5，并将裂解液加入圆底烧瓶中，室温反应2h；反应结束后抽滤，收集滤液，将滤液缓慢加入冰乙醚中，静置沉降，沉降物在高速离心机中冰乙醚洗涤离心5次，干燥，得利那洛肽线性肽粗肽。
然后将利那洛肽线性肽粗肽用0.1％TFA/水溶液(体积百分比)溶解，得到10mg/ml浓度溶液，溶液用滤膜初步纯化，再经HPLC纯化，然后冻干后得到含有一对二硫键的利那洛肽前体1。
实施例11：利那洛肽第二对二硫键Cys(2-10)的形成(利那洛肽前体2)
将实施例7所制得的利那洛肽前体1用50％乙腈/水溶液溶解，得到浓度为1mg/ml反应液，加入5eq的氧化试剂DSF，室温反应1h，得到含有第二对二硫键Cys(2-10)的利那洛肽前体2。
实施例12：利那洛肽第二对二硫键Cys(2-10)的形成(利那洛肽前体2)
将实施例8所制得的利那洛肽前体1用50％乙腈/水溶液溶解，得到浓度为2mg/ml反应液，加入10eq的氧化试剂DSF，室温反应2h，得到含有第二对二硫键Cys(2-10)的利那洛肽前体2。
实施例13：利那洛肽第二对二硫键Cys(2-10)的形成(利那洛肽前体2)
将实施例9所制得的利那洛肽前体1用50％乙腈/水溶液溶解，得到浓度为5mg/ml反应液，加入15eq的氧化试剂DSF，室温反应3h，得到含有第二对二硫键Cys(2-10)的利那洛肽前体2。
实施例14：利那洛肽第二对二硫键Cys(2-10)的形成(利那洛肽前体2)
将实施例10所制得的利那洛肽前体1用50％乙腈/水溶液溶解，得到浓度为2mg/ml反应液，加入10eq的氧化试剂DSF，室温反应2h，得到含有第二对二硫键Cys(2-10)的利那洛肽前体2。
实施例15：利那洛肽第三对二硫键Cys(5-13)的形成(利那洛肽成品)
实施例11～14所制得的利那洛肽前体2性能基本相同，以实施例12制得的利那洛肽前体2为例，进行利那洛肽第三对二硫键Cys(5-13)的形成实验。
将实施例12所制得的利那洛肽前体2放置在光反应器下，瓶口距离光源5cm，365nm波长紫外可见光照射5min，脱除第5和13位Cys上的NBn保护基，然后加入10eq的氧化试剂DSF，室温反应1h，得利那洛肽成品。利那洛肽成品的质谱和色谱图分别如图3和4所示。经HPLC分析，所得利那洛肽收率为8.2％。
将实施例12所制得的利那洛肽前体2放置在光反应器下，瓶口距离光源5cm，365nm波长紫外可见光照射10min，脱除第5和13位Cys上的NBn保护基，然后加入10eq的氧化试剂DSF，室温反应2h，得利那洛肽成品。利那洛肽成品的质谱和色谱图分别如图3和4所示。经HPLC分析，所得利那洛肽收率为17.5％。
将实施例12所制得的利那洛肽前体2放置在光反应器下，瓶口距离光源5cm，365nm波长紫外可见光照射15min，脱除第5和13位Cys上的NBn保护基，然后加入10eq的氧化试剂DSF，室温反应3h，得利那洛肽成品。利那洛肽成品的质谱和色谱图分别如图3和4所示。经HPLC分析，所得利那洛肽收率为24％。
将实施例12所制得的利那洛肽前体2放置在光反应器下，瓶口距离光源5cm，365nm波长紫外可见光照射20min，脱除第5和13位Cys上的NBn保护基，然后加入10eq的氧化试剂DSF，室温反应2h，得利那洛肽成品。得利那洛肽成品。利那洛肽成品的质谱和色谱图分别如图3和4所示。经HPLC分析，所得利那洛肽收率为37％。
将实施例12所制得的利那洛肽前体2放置在光反应器下，瓶口距离光源5cm，365nm波长紫外可见光照射25min，脱除第5和13位Cys上的NBn保护基，然后加入10eq的氧化试剂DSF，室温反应2h，得利那洛肽成品。得利那洛肽成品。利那洛肽成品的质谱和色谱图分别如图3和4所示。经HPLC分析，所得利那洛肽收率为46％。
将实施例12所制得的利那洛肽前体2放置在光反应器下，瓶口距离光源5cm，365nm波长紫外可见光照射30min，脱除第5和13位Cys上的NBn保护基，然后加入10eq的氧化试剂DSF，室温反应2h，得利那洛肽成品。利那洛肽成品的质谱和色谱图分别如图3和4所示。经HPLC分析，所得利那洛肽收率为39％。
将实施例12所制得的利那洛肽前体2放置在光反应器下，瓶口距离光源5cm，365nm波长紫外可见光照射60min，脱除第5和13位Cys上的NBn保护基，然后加入10eq的氧化试剂DSF，室温反应2h。经HPLC分析，所得利那洛肽收率为0％。
将实施例12所制得的利那洛肽前体2放置在光反应器下，瓶口距离光源5cm，365nm波长紫外可见光照射120min，脱除第5和13位Cys上的NBn保护基，然后加入10eq的氧化试剂DSF，室温反应2h。经HPLC分析，所得利那洛肽收率为0％。
虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
Claims (9)
1.一种利那洛肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：以Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin树脂或Fmoc-Tyr(tBu)-CTC Resin树脂为固相载体，采用Fmoc固相合成法合成具有如式I或式II所示氨基酸序列的利那洛肽线性前体树脂：
S2：用1～5％TFA/DCM溶液脱除利那洛肽线性前体树脂第1和6位Cys上的Mmt保护基；然后将脱Mmt保护基后的树脂与NCS按100:5～15的质量比投入反应器中，室温反应1～2h，然后用甲醇收缩30min，构建第一对二硫键Cys(1-6)；
S3：用裂解液对经过S2处理后的树脂进行裂解，再纯化，得到Cys(2-10)侧链巯基裸露、Cys(5-13)侧链巯基受到NBn保护的利那洛肽前体1；所述裂解液为1～5％裂解剂/TFA溶液，所述裂解剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和TRIPS中的至少一种；
S4：将利那洛肽前体1分散于pH为7～8的溶液中，加入5～15eq的氧化剂，室温氧化1～3h，构建第二对二硫键Cys(2-10)，得到含有两对二硫键Cys(1-6)和Cys(2-10)的利那洛肽前体2；所述氧化剂为DSF、双氧水、50M碳酸氢铵和NCS中的至少一种；
S5：将利那洛肽前体2在波长为350～380nm的紫外光下照射5～120min，脱除第5和13位Cys上的NBn保护基；然后以DSF为氧化剂氧化1～3h，形成第三对二硫键Cys(5-13)；再经HPLC纯化得到利那洛肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述利那洛肽线性前体树脂的合成包括以下步骤：
SS1：将取代度为0.1～1mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin树脂或取代度为0.1～1mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-CTC Resin树脂分散于DCM溶液中，溶胀15～25min，然后用DCM和DMF各冲洗两次，得预处理后的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin树脂或Fmoc-Tyr(tBu)-CTCResin树脂；
SS2：将预处理后的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin树脂或Fmoc-Tyr(tBu)-CTC Resin树脂浸没于20％PIP/DMF(体积百分比)溶液中，室温下反应2min；然后更换新的20％PIP/DMF溶液，继续反应5min，得脱除Fmoc保护基的树脂；
SS3：将脱除Fmoc保护基的树脂、Fmoc-Cys(NBn)-OH和偶联缩合剂投入固相反应容器中，加入DMF，室温下反应15min，得中间体；所述偶联缩合剂为DIEA和HATU的混合物；
SS4：重复SS2和SS3中的操作，依次将Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Cys(NBn)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH和Fmoc-Cys(Mmt)-OH与中间体进行偶联，即得具有如式I或式II所示氨基酸序列的利那洛肽线性前体树脂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述脱除Fmoc保护基的树脂、Fmoc-Cys(NBn)-OH和偶联缩合剂的质量比为1:2～5:1.5～3。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述偶联缩合剂由HATU和DIEA按1～1.5g:1mL的料液比混合而成。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中Cys上Mmt保护基的脱除包括以下步骤：将利那洛肽线性前体树脂浸没于1～5％TFA/DCM溶液中，反应2min，然后更换新的TFA/DCM溶液，继续反应2min；重复上述操作8～12次，直至树脂由红色变为无色；随后用DCM和DMF各清洗2次，得脱Mmt保护基后的树脂。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述利那洛肽前体1经过以下步骤制得：
SS31：将经过S2处理后的树脂分散于裂解液中，室温下反应2h；然后抽滤收集滤液，再将滤液加入冰乙醚中，静置沉降；沉降物用冰乙醚离心洗涤5次，干燥后得利那洛肽线性前体粗肽；
SS32：将利那洛肽线性前体粗肽用0.1％TFA/水溶液溶解，配成10mg/mL的溶液，再依次用滤膜和HPLC纯化，然后冻干，得利那洛肽前体1。
7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于：所述裂解液由TFA、TRIPS和水按95:2.5:2.5的体积比混合而成。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：S4中所述溶液为6M盐酸胍、乙腈、水、DMF或50％乙腈/水。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述紫外光的波长为365nm。
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