CN116836255A - 一种μ-芋螺毒素肽的化学合成制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及属于多肽化学合成技术领域，具体涉及一种μ‑芋螺毒素肽的化学合成制备方法。本发明的制备方法首先采用固相合成技术合成μ‑芋螺毒素肽主链线性肽，脱除树脂和氨基酸侧链保护基后采用DMSO和碘溶液进行两步成环，有效降低了μ‑芋螺毒素肽的成环错配，提高粗肽纯度和收率；经两步纯化后产品总收率达到55%，纯品纯度＞98%，单杂<0.1%。且本发明的制备方法有机溶剂使用少，减少了环境污染和工艺成本。
Description
技术领域
本发明属于多肽化学合成技术领域，具体涉及一种μ-芋螺毒素肽的化学合成制备方法。
背景技术
芋螺毒素(Cnotoxin)，是海洋腹足纲软体动物芋螺(Conus)的毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌，是由许多单一多肽分子组成的混合毒素，主要成分是一些对不同离子通道及神经受体高专一性的活性多肽化合物。每种芋螺可分泌百种以上的毒素多肽分子，不同芋螺所分泌毒素也各不相同，组成了庞大的芋螺毒素多肽家族。μ-芋螺毒素肽是芋螺毒素蛋白家族中的一种，最初从海洋蜗牛毒液分离得到，靶向多种电压敏感性钠通道，主要阻断nav1.4通道。在美容行业，μ-芋螺毒素肽可添加到抗皱护肤品中作为即时松弛剂，产生快速祛皱效果，塑造光滑的皮肤外观，同时，μ-芋螺毒素肽提供有效的肌肉放松但不完全僵硬瘫痪，保留肌肉5％神经肌肉电流传导，所以获得了表现更为自然的抗皱效果。目前，用于化妆品芋螺毒素主要来自μ家族，其中最为知名的是μ-conotoxin CnIIIC，CAS NO.:936616-33-0，分子量：2375.7。例如，瑞士Activen公司开发的祛皱产品XEPTM-018，能靶向阻断NaV1.4通道(IC50＝1.3nM)和Nav1.2通道(所需剂量：1μM)。3％ XEPTM-018即可实现祛皱，且不产生细胞毒性、皮肤刺激性、过敏性等。
μ-芋螺毒素肽(μ-conotoxin)是一个由22个氨基酸构成的环状多肽，含有三对二硫键，形成三个分子内环，属于含分子内环较多的多肽，其碳末端成酰胺，一级结构序列为：H-Pyr-Gly-Cys-Cys-Asn-Gly-Pro-Lys-Gly-Cys-Ser-Ser-Lys-Trp-Cys-Arg-Asp-His-Ala-Arg-Cys-Cys-NH2(二硫键:Cys3-Cys15,Cys4-Cys21,Cys10-Cys22)。其中Cys氨基酸间准确成环，形成正确的分子构像方可确保μ-芋螺毒素肽发挥生物活性。二硫键错配导致错误的成环和分子折叠，会导致μ-芋螺毒素肽失去活性甚至产生毒性(吴勇,罗素兰,长孙东亭.芋螺毒素氧化折叠研究进展[J].生物技术通报,2006,2006(5):49-53.)。
目前μ-芋螺毒素肽可采用天然提取、微生物发酵、化学合成等方法制备。其中天然提取的来源受限，微生物发酵法虽可确保产品准确折叠和正确的分子构像，但技术尚不成熟，无法满足产业化需求。因此，工业生产中，化学合成法仍然是μ-芋螺毒素肽的主流制备方法，其中以固相合成技术方法为主。
固相合成技术中，μ-芋螺毒素肽相邻位置(3位和4位，21位和22位)的Cys残基最易产生错位成环。这类错误结构因性质较为接近，分离纯化难度较大。通常先合成μ-芋螺毒素肽的一级结构，然后进行Cys之间的成环反应。其中一种方法是游离Cys巯基成环，空气氧化、双氧水氧化、二甲基亚砜氧化、铁氰化钾氧化、碘氧化、血晶素氧化、固相埃尔曼试剂氧化等均属于此种成环策略。该方法虽然终产物受热力学控制，纯化步骤少。但对于三对二硫键的多肽而言，6个Cys残基在反应中可生成13种异构体，极大的影响产品纯度和收率(安婷婷,吴勇,长孙东亭,等.天然芋螺毒素肽的化学合成[J].中国海洋药物,2010(3):6.)。且μ-芋螺毒素肽的一级结构肽链较长，本身即增加了二硫键正确成环的难度。因此其报道的产品收率和纯度仍然较低。CN110894225A提供了一种μ-芋螺毒素肽的制备工艺，制备的μ-芋螺毒素肽最高纯度98％，总收率10％。
固相合成技术中Cys间成环反应的常用方法是选择性成环法或定点成环法(对每对Cys进行独特的保护，逐步脱保护逐步成环，以减少错误成环)。即进行逐对环化，但该方法步骤繁琐，产品纯度较低。此外，也有研究者尝试游离Cys巯基成环与定点成环法相结合的制备技术。但本质上，该方法仍类似定点成环法，步骤繁琐。谷胱甘肽试剂最可提高芋螺毒素成环反应中氧化折叠的速率和产率，但试剂价格昂贵，导致产品成本上升。
发明内容
针对现有技术存在的以上技术问题，本发明的目的是提供一种μ-芋螺毒素肽的化学合成制备方法，以提高化学合成μ-芋螺毒素肽的纯度、收率，降低单一杂质含量，尤其是降低成环步骤的错配及导致的合成收率降低和粗肽纯度降低。
具体来说，本发明采用的技术路线如下：
第一步:用固相合成技术依次偶联侧链保护的氨基酸残基或侧链未保护的氨基酸残基制备μ-芋螺毒素肽树脂，然后脱除树脂和氨基酸残基侧链保护基，制备μ-芋螺毒素肽主链线性肽:
H-Pyr-Gly-Cys-Cys-Asn-Gly-Pro-Lys-Gly-Cys-Ser-Ser-Lys-Trp-Cys-Arg-Asp-His-Ala-Arg-C ys-Cys-NH2；
第二步:依次用二甲基亚砜氧化(Dimethyl sulfoxide，DMSO)和碘溶液(I2)氧化μ-芋螺毒素肽主链线性肽的半胱氨酸(Cysteine，Cys)残基，进行配对成环，得μ-芋螺毒素粗肽；
第三步:用高效液相色谱法，经两次纯化和一次转盐对μ-芋螺毒素粗肽进行纯化，得μ-芋螺毒素肽精制产物。
进一步地，前述第一步中，用固相合成技术制备μ-芋螺毒素肽树脂:
H-Pyr-Gly-Cys(X)-Cys(X)-Asn(trt)-Gly-Pro-Lys(Boc)-Gly-Cys(X)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(X)-Arg(pbf)-Asp(tBu)-His(trt)-Ala-Arg(pbf)-Cys-Cys-NH2，其中X选自trt、Acm、tBu、Mob中的一种；Y为树脂，选自Rink amide AM-Resin、王树脂中的一种；采用体积比为82.5:5:5:5:2.5的TFA、TIS、EDT、苯酚、水裂解试剂进行裂解，制备μ-芋螺毒素肽主链线性肽。
前述第二步中，所用溶剂为浓度100mmol/L的磷酸盐水溶液，溶剂中μ-芋螺毒素肽主链线性肽浓度为0.1mg/ml～1000mg/ml，反应pH为7.0～9.5，反应温度为0℃～50℃，氧化后加入维生素C至溶液无色得μ-芋螺毒素粗肽。
优选地，第二步所用溶剂为浓度100mmol/L的磷酸二氢钠水溶液或磷酸二氢钾水溶液；溶剂中μ-芋螺毒素肽主链线性肽浓度为10mg/ml，反应pH为8.5±0.5，反应温度为15℃～35℃。
进一步优选地，第二步中，DMSO与磷酸盐水溶液的体积比为5％，碘溶液中I2浓度为25g/L，碘溶液与磷酸盐水溶液的体积比为80％，分别于DMSO氧化后6h和18h分两次等体积加入碘溶液，末次加入碘溶液后反应8h再加入维生素C得μ-芋螺毒素粗肽。
前述第三步，第一次纯化的固定相选用Poly RP聚合物填料，流动相的水相选用2‰TFA-水，流动相的有机相选用乙腈；第二次纯化的固定相选用C-18硅胶填料，流动相的水相选用pH7.5的磷酸-三乙胺混合液，流动相的有机相选用乙腈；转盐的固定相选用C-18硅胶填料，流动相的水相选用2％醋酸-水，流动相的有机相选用乙腈。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明改进了μ-芋螺毒素肽的成环方法并改进了纯化方法，有效控制了μ-芋螺毒素肽的配对成环，减少错配导致的杂质，μ-芋螺毒素粗肽纯度达到68.670％。经纯化后产品总收率达到55％，纯品纯度＞98％，单杂<0.1％。
(2)本发明的μ-芋螺毒素肽成环方法除DMSO外，未使用额外的有机溶剂，减少了环境污染和工艺成本。
(3)本发明的μ-芋螺毒素肽成环方法未使用较为昂贵的谷胱甘肽试剂，进一步降低了工艺成本。
附图说明
图1为实施例4所得μ-芋螺毒素粗肽的高效液相色谱图；
图2为实施例5所得μ-芋螺毒素肽精制产物的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种μ-芋螺毒素肽的化学合成制备方法，以下通过较佳的实施例对该制备方法进行详细描述。需要特别指出的是，本领域技术人员可以借鉴本发明主要技术路线和实施例的内容，在不脱离本发明总体思路的范围内，对所述制备方法适当改动和变更，来实现同等或类似的技术效果。所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，应被视为包括在本发明保护范围之内。
实施例1NH2-Cys(trt)-AM-Resin的制备
取500g替代度0.4mmol/g的Rink amide AM-Resin加入固相反应器，加入N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide，DMF)溶胀20min，抽干后加入20％哌啶-DMF溶液，搅拌反应5min后抽干，再次加入20％哌啶-DMF溶液，搅拌反应10min后抽干，加入DMF洗涤抽干，共洗涤6次，抽干备用。
取Fmoc-Cys(trt)-OH共600mmol(3eq)，用DMF溶解，加入600mmol 1-羟基苯并三唑(1-Hydroxybenzotriazole，HBOt)和720mmolN,N'-二异丙基碳二亚胺(N,N'-Diisopropylcarbodiimide，DIC)，静置5min后加入溶胀处理的Rink amide AM-Resin中，反应4h。反应结束后抽干溶剂，加入DMF洗涤2次，抽干后加入20％哌啶-DMF溶液，搅拌反应5min后抽干，再次加入20％哌啶-DMF溶液，搅拌反应10min后抽干，加入DMF洗涤，共洗涤6次，得到NH2-Cys(trt)-AM-Resin。
实施例2μ-芋螺毒素肽树脂的制备
取Fmoc-Cys(trt)-OH共600mmol(3eq)，参考实施例1步骤，进行缩合偶连，得到NH2-Cys(trt)-Cys(trt)-AM-Resin。按照表1顺序依次偶连后续氨基酸残基。
表1μ-芋螺毒素肽氨基酸残基的保护基及偶连次序
| 3 | Fmoc-Arg(Pbf)-OH | 13 | Fmoc-Cys(trt)-OH |
| 4 | Fmoc-Ala-OH | 14 | Fmoc-Gly-OH |
| 5 | Fmoc-His(Trt)-OH | 15 | Fmoc-Lys(Boc)-OH |
| 6 | Fmoc-Asp(tBu)-OH | 16 | Fmoc-Pro-OH |
| 7 | Fmoc-Arg(Pbf)-OH | 17 | Fmoc-Gly-OH |
| 8 | Fmoc-Cys(trt)-OH | 18 | Fmoc-Asn(trt)-OH |
| 9 | Fmoc-Trp(Boc)-OH | 19 | Fmoc-Cys(trt)-OH |
| 10 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 20 | Fmoc-Cys(trt)-OH |
| 11 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 21 | Fmoc-Gly-OH |
| 12 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 22 | Pyr-OH |
得到μ-芋螺毒素肽树脂：
H-Pyr-Gly-Cys(trt)-Cys(trt)-Asn(trt)-Gly-Pro-Lys(Boc)-Gly-Cys(trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(trt)-Arg(pbf)-Asp(tBu)-His(trt)-Ala-Arg(pbf)-Cys(trt)-Cys(trt)-AM-Resin
实施例3μ-芋螺毒素肽主链线性肽的制备
实施例2所得μ-芋螺毒素肽树脂，充分干燥后加入反应釜，加入提前预冷至0℃的三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)裂解试剂反应2h，反应结束过滤，将所得溶液加入甲基叔丁基醚中，析出固体后过滤，真空干燥得到μ-芋螺毒素肽主链线性肽：
H-Pyr-Gly-Cys-Cys-Asn-Gly-Pro-Lys-Gly-Cys-Ser-Ser-Lys-Trp-Cys-Arg-Asp-His-Ala-Arg-C ys-Cys-NH2
所述TFA裂解试剂配比为：
TFA:TIS(三异丙基硅烷):EDT(乙二胺四乙酸):苯酚:水＝82.5:5:5:5:2.5。
实施例4μ-芋螺毒素肽的成环
取120g磷酸二氢钠加入10L水中，配制成100mmol/L浓度的磷酸二氢钠溶液；按浓度10mg/ml取实施例3所得μ-芋螺毒素肽主链线性肽，加入磷酸二氢钠溶液中搅拌分散，调节pH9.5继续搅拌溶解，至溶液澄清后调节pH 7.5，按体积比5％加入DMSO 500ml后，搅拌反应6h，后再加入4L碘溶液(含碘单质I2100g)，继续搅拌反应12h，再次加入4L碘溶液(含碘单质I2100g)反应8h，加入维生素C至溶液无色，即得到了二硫键正确配对的μ-芋螺毒素粗肽。μ-芋螺毒素粗肽纯度达到68.670％。图1为实施例4得μ-芋螺毒素粗肽的高效液相色谱图，其中μ-芋螺毒素粗肽(保留时间30.726min)峰面积(4175.3243)占比为68.670％。
图1的色谱检测条件如下：
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(YMC-Pack ODS-AQ 150×3.0mm 3μm色谱柱)；以含0.02mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 2.3)(取磷酸二氢钾2.72g，加水800ml溶解，用磷酸调pH值至2.3，用水稀释至1000ml)，为流动相A，乙腈为流动相B；按表2进行梯度洗脱；检测波长为210nm；柱温为50℃；流速为0.6ml/min；进样体积10μl。
表2色谱检测梯度洗脱程序
实施例5μ-芋螺毒素肽的纯化
实施例4所得的反应溶液，过滤除去不溶物，按照6L/次的上样量，进入150mm直径高效液相色谱系统，采用如下表3、4洗脱体系进行纯化，根据UV波长210nm吸收峰为判断标准，按照纯度标准收集主峰流份，合并后冻干，得到μ-芋螺毒素肽精制产物。
表3高效液相色谱系统洗脱体系
表4高效液相色谱系统洗脱梯度设置
图2为两步纯化后产物的液相色谱图，由图可见精制产物的杂质显著减少，仅在保留时间18.994min、19.470min、20.187min、20.917min出现4个色谱峰，峰面分别为6.88916、61.49263、1.40645x104、62.52759，其中保留时间20.187min的色谱峰为目标物色谱峰，峰面积占比为98.7618％。纯化后产品总收率达到55％，纯品纯度＞98％，单杂<0.1％。
Claims (8)
1.一种μ-芋螺毒素肽的化学合成制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步:用固相合成技术依次偶联侧链保护的氨基酸残基或侧链未保护的氨基酸残基制备μ-芋螺毒素肽树脂，然后脱除树脂和氨基酸残基侧链保护基，制备μ-芋螺毒素肽主链线性肽:H-Pyr-Gly-Cys-Cys-Asn-Gly-Pro-Lys-Gly-Cys-Ser-Ser-Lys-Trp-Cys-Arg-Asp-His-Ala-Arg-Cys-Cys-NH2；
第二步:依次用DMSO和碘溶液氧化μ-芋螺毒素肽主链线性肽的Cys残基，进行配对成环，得μ-芋螺毒素粗肽。
2.根据权利要求1所述的化学合成制备方法，其特征在于，所述第一步中，用固相合成技术制备μ-芋螺毒素肽树脂:H-Pyr-Gly-Cys(X)-Cys(X)-Asn(trt)-Gly-Pro-Lys(Boc)-Gly-Cys(X)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(X)-Arg(pbf)-Asp(tBu)-His(trt)-Ala-Arg(pbf)-Cys-Cys-NH2，其中X选自trt、Acm、tBu、Mob中的一种；Y为树脂，选自Rink amide AM-Resin、王树脂中的一种；采用体积比为82.5:5:5:5:2.5的TFA、TIS、EDT、苯酚、水配制的裂解试剂进行裂解，制备μ-芋螺毒素肽主链线性肽。
3.根据权利要求2所述的化学合成制备方法，其特征在于，所述第一步中X选自trt；Y为Rink amide AM-Resin。
4.根据权利要求1所述的化学合成制备方法，其特征在于，所述第二步中，所用溶剂为浓度100mmol/L的磷酸盐水溶液，溶剂中μ-芋螺毒素肽主链线性肽浓度为0.1mg/ml～1000mg/ml，反应pH为7.0～9.5，反应温度为0℃～50℃，氧化后加入维生素C至溶液无色得μ-芋螺毒素粗肽。
5.根据权利要求4所述的化学合成制备方法，其特征在于，所述第二步中，所用溶剂为浓度100mmol/L的磷酸二氢钠水溶液或磷酸二氢钾水溶液；溶剂中μ-芋螺毒素肽主链线性肽浓度为10mg/ml，反应pH为8.5±0.5，反应温度为15℃～35℃。
6.根据权利要求4所述的化学合成制备方法，其特征在于，所述第二步中，DMSO与磷酸盐水溶液的体积比为5％，碘溶液中I2浓度为25g/L，碘溶液与磷酸盐水溶液的体积比为80％，分别于DMSO氧化后6h和18h分两次等体积加入碘溶液，末次加入碘溶液后反应8h再加入维生素C得μ-芋螺毒素粗肽。
7.根据权利要求1至6任一项所述的化学合成制备方法，其特征在于，所述化学合成制备方法还包括如下步骤：
第三步:用高效液相色谱法，经两次纯化和一次转盐对μ-芋螺毒素粗肽进行纯化，得μ-芋螺毒素肽精制产物。
8.根据权利要求7所述的化学合成制备方法，其特征在于，所述第三步中，第一次纯化的固定相选用Poly RP聚合物填料，流动相的水相选用2‰TFA-水，流动相的有机相选用乙腈；
第二次纯化的固定相选用C-18硅胶填料，流动相的水相选用pH7.5的磷酸-三乙胺混合液，流动相的有机相选用乙腈；转盐的固定相选用C-18硅胶填料，流动相的水相选用2％醋酸-水，流动相的有机相选用乙腈。
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