CN115594744A - 一种芋螺抗皱素的制备方法 - Google Patents

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CN115594744A CN202110716658.2A CN202110716658A CN115594744A CN 115594744 A CN115594744 A CN 115594744A CN 202110716658 A CN202110716658 A CN 202110716658A CN 115594744 A CN115594744 A CN 115594744A
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张建松
支钦
吴昊
郑飞
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Abstract

本发明涉及多肽药物制备技术领域，公开了一种芋螺抗皱素的制备方法，该方法包括以下步骤：在固相载体上，按照芋螺抗皱素肽序采用固相合成方法得到芋螺抗皱素全保护肽树脂；芋螺抗皱素全保护肽树脂经裂解试剂裂解，得到芋螺抗皱素线性肽；芋螺抗皱素线性肽经环化液环化后，得到芋螺抗皱素粗品，其中，环化液体系的pH范围为5～7.9；芋螺抗皱素粗品经纳微PS40柱纯化、转盐、浓缩、冷冻干燥，得到醋酸芋螺抗皱素。本发明工艺通过选择合适的裂解体系、环化体系和纯化体系，可以有效解决Cys在裂解及环化过程中发生的Cys‑EDT加成副反应、氧化降解聚合副反应、纯化制备上样堵柱三方面问题，是一种具有广泛的实用价值和应用前景的芋螺抗皱素制备方法。

Description

一种芋螺抗皱素的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽药物制备技术领域，特别涉及一种芋螺抗皱素的制备方法。
背景技术
芋螺毒素(conotoxin)由海洋软体动物芋螺(Conus)的毒腺分泌，是12-20个氨基酸长度的小肽毒素分子，主要是一些对多种离子通道和神经受体具有高度专一性的活性多肽，能特异性地作用于乙酰胆碱受体及其他神经递质的各种受体亚型，及钙、钠、钾等多种离子通道。根据芋螺毒素基因及其前体蛋白信号肽的保守性，可将芋螺毒素分为A、O、T、M、P、I等多个超家族；根据毒素作用于生物体内的不同靶位可分为α、ω、μ、δ等多种亚型。
芋螺抗皱素(或μ-芋螺毒素Cn IIIC，来自超M家族)是一种经过排序、人工合成的高度折叠的胜肽，以高亲和力和特异性靶向多样的分子实体，模拟芋螺毒素，穿透力强，稳定性高，目标性的针对肌肉达到放松的作用。μ-芋螺毒素家族的特征是保守的半胱氨酸模式，导致受限的三级结构，并导致与钠通道的相互作用。大多数μ-芋螺毒素优先靶向肌肉型电压门控钠通道(VGSC)，对神经元VGSC的选择性较低。芋螺抗皱素的作用靶点为细胞表达重组钠通道-肌肉型钠离子阀门通道Nav1.4(骨骼肌)，与受体紧密结合，调控突触信号，产生传导阻滞作用，使电信号无法传递至肌肉及节细胞，导致神经肌肉系统功能丧失，阻止肌肉收缩，从而让肌肉放松下来。
芋螺抗皱素具有非常强效的肌肉松弛作用，从而达到即时的抗皱效果，更高效地抑制动态纹。在各种抗衰老的个人护理品中均可应用。在护肤品配方中，加入如精华液、乳液、面霜及面膜等，从而达到祛除深层皱纹的理想效果。加入眼部护理中可明显去除眼周皱纹和眼角鱼尾纹；面部护理中可明显去除由于肌肉收缩而产生的抬头纹、法令纹等。
芋螺抗皱素，英文名为Mu-conotoxin，具体肽序如下：Pyr1-Gly2-Cys3-Cys4-Asn5-Gly6-Pro7-Lys8-Gly9-Cys10-Ser11-Ser12-Lys13-Trp14-Cys15-Arg16-Asp17-His18-Ala19-Arg20-Cys21-Cys22-CONH2,Cyclic(3→15),(4→21),(10→22)tris(disulfide)
目前获取芋螺毒素的方法主要有3种：从野生芋螺毒管中直接分离获得；通过转基因生物法合成；采用固相多肽合成法合成。其中，天然产物提取产量受限，从芋螺体内直接分离提取芋螺毒素的工艺复杂，提取困难，成本高；生物法合成工艺并不成熟，两者均难以实现芋螺毒素的产业化，并不能满足市场的需求。因此，需要通过固相多肽合成法大量合成，降低成本，以此满足科研用途及日益增长的市场需求。
芋螺抗皱素主链有22个氨基酸，其中有6个Cys，3对二硫键，其结构导致制备过程中若未选择合适的条件，容易发生副反应，进而对产品的收率、分离纯化的难度、产品质量等产生较大的影响。专利CN110894225A公开了一种芋螺抗皱素的规模化制备方法，该方法按照芋螺抗皱素主链C端至N端的氨基酸顺序依次偶联肽树脂，裂解后采用空气氧化法合成三对二硫键，最后纯化制备得到产品。该专利在裂解时使用EDT，容易导致Cys-EDT的加成副反应的发生；环化体系中pH范围选择8.0-10.0，然而芋螺肽裂解后得到的线性肽等电点为8.14，所以当环化液pH大于8.0时非常容易析出固体，不利于二硫键成环，产率低下。
因此，需要设计合理的制备路线来减少上述副反应的发生，提高粗肽纯度、降低制备的难度，从而提高总收率、降低总成本。
发明内容
本发明针对现有技术在合成过程中存在副反应多，纯化难，收率低，纯度低的问题，提供了一种芋螺抗皱素的制备方法，该方法包括如下步骤：
步骤1：在固相载体上，按照芋螺抗皱素肽序采用固相合成方法在碱或者缩合剂存在下进行逐步缩合或片段偶联，得到芋螺抗皱素全保护肽树脂；
步骤2：将步骤1制得的芋螺抗皱素全保护肽树脂经裂解试剂裂解后，得到芋螺抗皱素线性肽；
步骤3：将步骤2制得的芋螺抗皱素线性肽经环化液环化后，得到芋螺抗皱素粗品；其中，环化液体系的pH范围为5～7.9；
步骤4：将步骤3制得的芋螺抗皱素粗品经纯化、转盐、浓缩、冷冻干燥，得到芋螺抗皱素精肽。
进一步地，所述步骤1具体为：在碱或者缩合剂存在下，将固相载体依次与Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、H-Pyr-OH进行缩合，得到芋螺抗皱素全保护肽树脂：Pyr-Gly-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Gly-Pro-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-树脂；
进一步地，步骤1所述的固相载体选自AM Resin、HMBA Resin、Rink Amide Resin、Rink Amide AM Resin、Rink Amide MBHA Resin、PAL Resin中的一种，其中所述固相载体的替代度为0.2mmol/g～0.7mmol/g。
优选地，步骤1中所述的缩合剂选自HOBt、HOAT、DIC、DCC、EDC.HCl、HATU、HBTU、HCTU、Py.BOP、Py.AOP、DPPA。
作为优选方案，步骤1中的缩合剂选自HOBt、HOAT、DPPA。His18用常规的缩合剂缩合容易发生消旋副反应，产生D-His18消旋杂质。缩合剂选择HOBt、HOAT或DPPA时，可以特异地抑制消旋反应的发生，从而很好的避免D-His18消旋杂质的产生。
进一步地，步骤2裂解试剂为TFA、DODT和X的混合溶液，X选自Tis、Mpr、H2O；其中，TFA占裂解液的体积百分比为85％-90％，且DODT体积百分比为1％-10％。若采用EDT作为裂解试剂，容易发生Cys-EDT的加成副反应，且EDT的气味太大，所以选择DODT不仅可以避免Cys-EDT加成副反应的发生，而且操作过程中无恶臭气味产生，在不改变粗肽纯度的前提下，更适合工业放大生产。
进一步地，步骤3芋螺抗皱素线性肽环化形成3对二硫键时采用的方法选自空气氧化法、DMSO氧化法或血晶素氧化法，三种方法均可实现3对二硫键一步成环；
进一步地，环化时环化液体系中的氧化剂选自空气、1％～10％的DMSO水溶液或10％～20％的血晶素中的一种；
进一步地，环化时环化液体系中盐体系为磷酸盐缓冲盐体系或Tris-HCl/DIEA体系；
作为优选的，磷酸盐缓冲盐体系为磷酸二氢钠与盐酸胍或磷酸二氢钾与盐酸胍，其中磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的含量为0.1～0.2mol/L，盐酸胍含量为0.001～0.002mol/L；
作为优选的，环化时环化液体系中pH范围选自6.0～6.5。
现有技术中芋螺抗皱素线性肽在环化时，pH一般大于8.0，由于其等电点为8.14，pH大于8.0时非常容易析出固体，发生聚合现象，不利于二硫键成环，因此，此pH条件下环化收率低。本申请人通过长期实验发现，pH在5-7.9时，芋螺抗皱素线性肽在环化过程中基本没有固体析出，收率大大提高，其中当pH范围在6.0-6.5时，收率提高的更明显。
进一步地，步骤4芋螺抗皱素粗品经纯化的方法为：环化液过滤后直接上样，用高效液相色谱法进行纯化，色谱柱为反相高效液相色谱柱，流动相：A为0.01％-0.1％醋酸水溶液；B为乙腈；梯度为：0-60min，B％为2％-12％。
进一步地，反相高效液相色谱柱中填料选自UniPS 40-300。芋螺抗皱素肽分子量较大，使用C18填料非常容易堵柱子；且环化液体积大，上样时间长，C18填料容易毁坏。而选择UniPS 40-300填料则不会出现以上问题。
由于芋螺抗皱素肽链较长且序列结构特殊，其在制备过程中若未选择合适的反应条件容易发生副反应，进而对产品的收率、分离纯化的难度、产品质量等产生较大的影响。本发明通过将芋螺抗皱素线性肽在环化形成3对二硫键的过程中，环化液体系的pH控制在5.0～7.9之间，降低了Cys在环化液中发生氧化、降解、聚合等副反应发生的可能。此外，在裂解体系中使用DODT，可以避免裂解过程中容易发生Cys-EDT加成副反应的问题，同时，在不改变粗肽纯度的前提下，避免操作过程中恶臭气味的产生，更适合工业放大生产；在纯化时，选择填料UniPS 40-300，可以解决环化液上样压力过高、堵柱及毁坏填料等问题。本发明以较简便的工艺步骤同时实现了提高粗肽纯度、控制杂质含量和增加总收率的目标，与现有技术相比，反应操作简单、工期短、成本低、收率高，容易达到产业化的要求，具有广泛的市场应用前景。
附图说明
图1所示为实施例5芋螺抗皱素线性肽的HPLC峰图；
图2所示为实施例11芋螺抗皱素粗肽的HPLC峰图；
图3所示为实施例17芋螺抗皱素精肽的HPLC峰图；
图4所示为实施例17芋螺抗皱素精肽的质谱图；
图5所示为对比例3芋螺抗皱素粗肽的HPLC峰图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。在本发明具体实施方式中，所有偶联有保护基的氨基酸均可通过市售获得。本发明权利要求书及说明书中涉及的英文缩写对应的中文名称如下表：
Figure BDA0003135240140000041
Figure BDA0003135240140000051
实施例1：芋螺抗皱素全保护肽树脂制备1
1.1树脂的溶胀
称取Rink-Amide AM Resin树脂2072.8g(树脂初始替代度为0.42mmol/g)，将树脂加入到固相合成反应器中，加入DMF(13L)溶胀30min，溶胀结束后分别用DMF洗涤树脂2次,13L/次/min。
1.2脱Fmoc
加入去保护液(20％哌啶/DMF)去保护，去保护两次，去保护时间10min+10min，每次去保护液13L，用DMF洗涤6次，13L/次/min，茚三酮检测呈K+。
1.3投料反应
称取1335.50g Fmoc-Cys(Trt)-OH、338.90g HOBT，溶于DMF(13L)中，控制温度-5℃，加入316.6g DIC，活化3～5min，加入到上述树脂中偶联，偶联时间2h，茚三酮检测呈K-，偶联完全。
1.4反应完毕洗涤树脂
加入DMF 13L，开启搅拌，树脂和溶剂均匀混合后计时搅拌1～2min，抽干3min。反复用13L DMF洗涤树脂，抽干溶剂，直至抽滤出的溶剂澄清透明。
1.5依次偶联氨基酸
重复1.2～1.4的步骤，按照芋螺抗皱素肽序依次偶联Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、H-Pyr-OH，得到Pyr-Gly-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Gly-Pro-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-RinkAmide AM Resin。
1.6收缩晾干树脂
将1.5制得的树脂用甲醇(13L)洗涤一次，再用DCM(13L)洗涤2次，最后用甲醇(13L)洗涤两次，树脂干燥至恒重，得到芋螺抗皱素全保护肽树脂6800g。
实施例2：芋螺抗皱素全保护肽树脂制备2
2.1树脂的溶胀
称取HMBA Resin树脂4352.9g(树脂初始替代度为0.2mmol/g)，将树脂加入到固相合成反应器中，加入DMF(28L)溶胀30min，溶胀结束后分别用DMF洗涤树脂2次,28L/次/min。
2.2脱Fmoc
树脂溶胀后不需要脱Fmoc，偶联氨基酸时需要脱Fmoc：加入去保护液(20％哌啶/DMF)去保护，去保护两次，去保护时间10min+10min，每次去保护液13L，用DMF洗涤6次，13L/次/min，茚三酮检测呈K+。
2.3投料反应
称取1335.50g Fmoc-Cys(Trt)-OH、340.12g HOAT，溶于DMF(28L)中，控制温度-5℃，加入316.6g DIC，活化3～5min，加入到上述树脂中偶联，偶联时间2h，茚三酮检测呈K-，偶联完全。
2.4反应完毕洗涤树脂
加入DMF 28L，开启搅拌，树脂和溶剂均匀混合后计时搅拌1～2min，抽干3min。反复用28L DMF洗涤树脂，抽干溶剂，直至抽滤出的溶剂澄清透明。
2.5依次偶联氨基酸
重复2.2～2.4的步骤，按照芋螺抗皱素肽序依次偶联Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、H-Pyr-OH，得到Pyr-Gly-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Gly-Pro-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Rink Amide AM Resin。
2.6收缩晾干树脂
将2.5制得的树脂用甲醇(28L)洗涤一次，再用DCM(28L)洗涤2次，最后用甲醇(13L)洗涤两次，树脂干燥至恒重，得到芋螺抗皱素全保护肽树脂9200g。
实施例3：芋螺抗皱素全保护肽树脂制备3
3.1树脂的溶胀
称取PAL Resin树脂1243.7g(树脂初始替代度为0.70mmol/g)，将树脂加入到固相合成反应器中，加入DMF(8L)溶胀30min，溶胀结束后分别用DMF洗涤树脂2次,8L/次/min。
3.2脱Fmoc
树脂溶胀后不需要脱Fmoc，偶联氨基酸时需要脱Fmoc：加入去保护液(20％哌啶/DMF)去保护，去保护两次，去保护时间10min+10min，每次去保护液13L，用DMF洗涤6次，13L/次/min，茚三酮检测呈K+。
3.3投料反应
称取1335.50g Fmoc-Cys(Trt)-OH、974.1g PyBop，溶于DMF(8L)中，控制温度-5℃，加入996.7g DIEA，活化3～5min，加入到上述树脂中偶联，偶联时间2h，茚三酮检测呈K-，偶联完全。
3.4反应完毕洗涤树脂
加入DMF 8L，开启搅拌，树脂和溶剂均匀混合后计时搅拌1～2min，抽干3min。反复用8L DMF洗涤树脂，抽干溶剂，直至抽滤出的溶剂澄清透明。
3.5依次偶联氨基酸
重复3.2～3.4的步骤，按照芋螺抗皱素肽序依次偶联Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、H-Pyr-OH，其中偶联His时，缩合剂采用DPPA/DIEA体系偶联，得到Pyr-Gly-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Gly-Pro-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Rink AmideAM Resin。
3.5.1Fmoc-His(Trt)-OH的偶联
称取1335.50g Fmoc-Cys(Trt)-OH，溶于DMF(28L)中，控制温度-5℃，加入644.7gDPPA、439.4gDIEA，加入到上述树脂中偶联，偶联时间5h，茚三酮检测呈K-，偶联完全。
3.6收缩晾干树脂
将3.5制得的树脂用甲醇(8L)洗涤一次，再用DCM(8L)洗涤2次，最后用甲醇(8L)洗涤两次，树脂干燥至恒重，得到芋螺抗皱素全保护肽树脂5750g。
实施例4：芋螺抗皱素全保护肽树脂制备4
4.1树脂的溶胀
称取Rink Amide Resin树脂1667.0g(树脂初始替代度为0.51mmol/g)，将树脂加入到固相合成反应器中，加入DMF(11L)溶胀30min，溶胀结束后分别用DMF洗涤树脂2次,11L/次/min。
4.2脱Fmoc
加入去保护液(20％哌啶/DMF)去保护，去保护两次，去保护时间10min+10min，每次去保护液11L，用DMF洗涤6次，11L/次/min，茚三酮检测呈K+。
4.3投料反应
称取1335.50g Fmoc-Cys(Trt)-OH、338.90g HBTU，溶于DMF(11L)中，控制温度-5℃，加入996.7g吗啡啉，活化3～5min，加入到上述树脂中偶联，偶联时间2h，茚三酮检测呈K-，偶联完全。
4.4反应完毕洗涤树脂
加入DMF 11L，开启搅拌，树脂和溶剂均匀混合后计时搅拌1～2min，抽干3min。反复用11L DMF洗涤树脂，抽干溶剂，直至抽滤出的溶剂澄清透明。
4.5依次偶联氨基酸
重复4.2～4.4的步骤，按照芋螺抗皱素肽序依次偶联Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、H-Pyr-OH，得到Pyr-Gly-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Gly-Pro-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Rink Amide AM Resin。
4.6收缩晾干树脂
将4.5制得的树脂用甲醇(11L)洗涤一次，再用DCM(11L)洗涤2次，最后用甲醇(13L)洗涤两次，树脂干燥至恒重，得到芋螺抗皱素全保护肽树脂6320g。
实施例5：芋螺抗皱素全保护肽树脂裂解1
按照裂解体系(TFA:Tis:Mpr:H2O:EDT＝90:3:3:3:1)配置好裂解液60L，控制温度为-5℃，将实施例1制得的芋螺抗皱素全保护肽树脂加入到上述裂解液中，恢复室温(30min)，继续反应1.5h，过滤，肽树脂用TFA洗涤两次，3.2L/次，合并滤液，减压浓缩，加入冰的异丙醚(64L)沉降，离心，固体用异丙醚洗涤6次，0.8L/次，得到芋螺抗皱素线性肽，其HPLC峰图如图1所示。
实施例6：芋螺抗皱素全保护肽树脂裂解2
按照裂解体系(TFA:Tis:Mpr:H2O:DODT＝90:3:3:3:1)配置好裂解液60L，控制温度为-5℃，将实施例1制得的芋螺抗皱素全保护肽树脂加入到上述裂解液中，恢复室温(30min)，继续反应1.5h，过滤，肽树脂用TFA洗涤两次，3.2L/次，合并滤液，减压浓缩，加入冰的异丙醚(64L)沉降，离心，固体用异丙醚洗涤6次，0.8L/次，得到芋螺抗皱素线性肽，其HPLC峰图与图1相似。
实施例7：芋螺抗皱素全保护肽树脂裂解3
按照裂解体系(TFA:Tis:Mpr:H2O:DODT＝85:2:2:1:10)配置好裂解液60L，控制温度为-5℃，将实施例2制得的芋螺抗皱素全保护肽树脂加入到上述裂解液中，恢复室温(30min)，继续反应1.5h，过滤，肽树脂用TFA洗涤两次，3.2L/次，合并滤液，减压浓缩，加入冰的异丙醚(64L)沉降，离心，固体用异丙醚洗涤6次，0.8L/次，得到芋螺抗皱素线性肽，其HPLC峰图与图1相似。
实施例8：芋螺抗皱素全保护肽树脂裂解4
按照裂解体系(TFA:Tis:DODT＝85:5:10)配置好裂解液60L，控制温度为-5℃，将实施例3制得的芋螺抗皱素全保护肽树脂加入到上述裂解液中，恢复室温(30min)，继续反应1.5h，过滤，肽树脂用TFA洗涤两次，3.2L/次，合并滤液，减压浓缩，加入冰的异丙醚(64L)沉降，离心，固体用异丙醚洗涤6次，0.8L/次，得到芋螺抗皱素线性肽，其HPLC峰图与图1相似。
实施例9：芋螺抗皱素全保护肽树脂裂解5
按照裂解体系(TFA:Tis:H2O:DODT＝87:4:4:5)配置好裂解液60L，控制温度为-5℃，将实施例4制得的芋螺抗皱素全保护肽树脂加入到上述裂解液中，恢复室温(30min)，继续反应1.5h，过滤，肽树脂用TFA洗涤两次，3.2L/次，合并滤液，减压浓缩，加入冰的异丙醚(64L)沉降，离心，固体用异丙醚洗涤6次，0.8L/次，得到芋螺抗皱素线性肽，其HPLC峰图与图1相似。
实施例10：芋螺抗皱素全保护肽树脂裂解6
按照裂解体系(TFA:Mpr:DODT＝88:9:3)配置好裂解液60L，控制温度为-5℃，将实施例4制得的芋螺抗皱素全保护肽树脂加入到上述裂解液中，恢复室温(30min)，继续反应1.5h，过滤，肽树脂用TFA洗涤两次，3.2L/次，合并滤液，减压浓缩，加入冰的异丙醚(64L)沉降，离心，固体用异丙醚洗涤6次，0.8L/次，得到芋螺抗皱素线性肽，其HPLC峰图与图1相似。
实施例11：芋螺抗皱素线性肽环化1
向纯化水(1791.64L)中加入磷酸二氢钠二水合物(28.22kg，0.1mol/L)、盐酸胍(345.8g，0.002mol/L)搅拌溶解澄清，将实施例5制得的线性肽用1％的DMSO(18.1L)溶解，加入至上述溶液中搅拌溶解，用25％的氨水调节pH为6.0，氧化24h，得到芋螺抗皱素粗肽，没有固体析出，其HPLC峰图如图2所示。标定含量945g，合成收率为33％，粗肽纯度60.65％。
实施例12：芋螺抗皱素线性肽环化2
向纯化水(1791.64L)中加入磷酸二氢钠二水合物(28.22kg，0.1mol/L)、盐酸胍(345.8g，0.002mol/L)搅拌溶解澄清，将实施例6制得的线性肽用1％的DMSO(18.1L)溶解，加入至上述溶液中搅拌溶解，用25％的氨水调节pH为6.0，氧化24h，得到芋螺抗皱素粗肽，没有固体析出，其HPLC峰图与图2类似。标定含量945g，合成收率为35％，粗肽纯度61.25％。
实施例13：芋螺抗皱素线性肽环化3
向纯化水(1628.84L)中加入磷酸二氢钠二水合物(28.22kg，0.1mol/L)、盐酸胍(345.8g，0.002mol/L)搅拌溶解澄清，将实施例7制得的线性肽用10％的DMSO(180.9L)溶解，加入至上述溶液中搅拌溶解，用25％的氨水调节pH为6.5，氧化24h，得到芋螺抗皱素粗肽，没有固体析出，其HPLC峰图与图2类似。标定含量891g，合成收率为33％，粗肽纯度60.71％。
实施例14：芋螺抗皱素线性肽环化4
向纯化水(1809.74L)中加入磷酸二氢钾(24.61kg，0.1mol/L)、盐酸胍(345.8g，0.002mol/L)搅拌溶解澄清，将实施例8制得的线性肽加入至上述溶液中搅拌溶解，用25％的氨水调节pH为7.9，通入空气氧化24h，得到芋螺抗皱素粗肽，没有固体析出，其HPLC峰图与图2类似。标定含量804.6g，合成收率为29.8％，粗肽纯度58.93％。
实施例15：芋螺抗皱素线性肽环化5
向纯化水(1809.74L)中加入Tris(21.91kg，0.1mol/L)、DIEA(467.6g，0.002mol/L)搅拌溶解，将实施例9制得的线性肽加入至上述溶液中搅拌溶解，加入20％的血晶素(542.7g)，用6M的盐酸调节pH为5.0，氧化1h，得到芋螺抗皱素粗肽，没有固体析出，其HPLC峰图与图2类似。标定含量850.5g，合成收率为31.5％，粗肽纯度59.02％。
实施例16：芋螺抗皱素线性肽环化6
向纯化水(1809.74L)中加入Tris(21.91kg，0.1mol/L)、DIEA(467.6g，0.002mol/L)搅拌溶解，将实施例10制得的线性肽加入至上述溶液中搅拌溶解，加入10％的血晶素(271.35g)，用6M的盐酸调节pH为6.3，氧化2h，得到芋螺抗皱素粗肽，没有固体析出，其HPLC峰图与图2类似。标定含量918g，合成收率为34％，粗肽纯度61.08％。
实施例17：芋螺抗皱素纯化、转盐1
将实施例11制得的芋螺抗皱素粗肽经0.45μm有机膜过滤，浓度为0.4g/L，滤液经纳微C18柱(填料为UniSil 10-100 C18的色谱柱)纯化，流动相：A为0.05％醋酸水溶液；B为乙腈；梯度为：0-60min，B％为2％-12％，流速1600mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为850.5g，纯化收率79％，纯度98％。
将样液浓缩后转盐，先用4g/L醋酸铵转盐，转完盐后再用C18柱纯化，流动相：A为0.05％醋酸水溶液；B为乙腈；梯度为：0-60min，B％为2％-12％，流速1600mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为709.2g，转盐收率为95％，合格样品峰合并浓缩冻干，得到688.20g白色絮状产品，纯度：99.03％；MS检测：594.89(1/4M+H)、793.06(1/3M+H)。其HPLC峰图如图3所示，质谱图如图4所示。
实施例18：芋螺抗皱素纯化、转盐2
将实施例12制得的芋螺抗皱素粗肽经0.45μm有机膜过滤，浓度为0.4g/L，滤液经纳微PS40柱(填料为UniPS 40-300的色谱柱)纯化，流动相：A为0.05％醋酸水溶液；B为乙腈；梯度为：0-60min，B％为2％-12％，流速1600mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为850.5g，纯化收率90％，纯度98.5％。
将样液浓缩后转盐，先用4g/L醋酸铵转盐，转完盐后再用C18柱纯化，流动相：A为0.05％醋酸水溶液；B为乙腈；梯度为：0-60min，B％为2％-12％，流速1600mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为807.8g，转盐收率为95％，合格样品峰合并浓缩冻干，得到777.98g白色絮状产品，纯度：99.01％；MS检测：594.89(1/4M+H)、793.06(1/3M+H)。其HPLC峰图如图3所示，质谱图如图4所示。
实施例19：芋螺抗皱素纯化、转盐3
将实施例13制得的芋螺抗皱素粗肽经0.45μm有机膜过滤，浓度为0.4g/L，滤液经纳微PS40柱纯化，流动相：A为0.01％醋酸水溶液；B为乙腈；梯度为：0-60min，B％为2％-12％，流速1600mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为784.08g，纯化收率88％，纯度98.3％。
将样液浓缩后转盐，先用4g/L醋酸铵转盐，转完盐后再用C18柱纯化，流动相：A为0.01％醋酸水溶液；B为乙腈；梯度为：0-60min，B％为2％-12％，流速1600mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为729.2g，转盐收率为93％，合格样品峰合并浓缩冻干，得到740.2g白色絮状产品，纯度：99.08％；MS检测：595.41(1/4M+H)、793.24(1/3M+H)。其HPLC峰图与图3相似，质谱图与图4类似。
实施例20：芋螺抗皱素纯化、转盐4
将实施例14制得的芋螺抗皱素粗肽经0.45μm有机膜过滤，浓度为0.4g/L，滤液经纳微PS40柱纯化，流动相：A为0.1％醋酸水溶液；B为乙腈；梯度为：0-60min，B％为2％-12％，流速1600mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为683.9g，纯化收率85％，纯度98.5％。
将样液浓缩后转盐，先用4g/L醋酸铵转盐，转完盐后再用C18柱纯化，流动相：A为0.1％醋酸水溶液；B为乙腈；梯度为：0-60min，B％为2％-12％，流速1600mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为601.8g，转盐收率为88％，合格样品峰合并浓缩冻干，得到610.5g白色絮状产品，纯度：99.21％；MS检测：594.88(1/4M+H)、792.46(1/3M+H)。其HPLC峰图与图3相似，质谱图与图4类似。
实施例21：芋螺抗皱素纯化、转盐5
将实施例15制得的芋螺抗皱素粗肽经0.45μm有机膜过滤，浓度为0.4g/L，滤液经纳微PS40柱纯化，流动相：A为0.05％醋酸水溶液；B为乙腈；梯度为：0-60min，B％为2％-12％，流速1600mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为731.4g，纯化收率86％，纯度98.2％。
将样液浓缩后转盐，先用4g/L醋酸铵转盐，转完盐后再用C18柱纯化，流动相：A为0.05％醋酸水溶液；B为乙腈；梯度为：0-60min，B％为2％-12％，流速1600mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为672.8g，转盐收率为92％，合格样品峰合并浓缩冻干，得到680.4g白色絮状产品，纯度：98.99％；MS检测：595.41(1/4M+H)、793.26(1/3M+H)。其HPLC峰图与图3相似，质谱图与图4类似。
实施例22：芋螺抗皱素纯化、转盐6
将实施例16制得的芋螺抗皱素粗肽经0.45μm有机膜过滤，浓度为0.4g/L，滤液经纳微PS40柱纯化，流动相：A为0.05％醋酸水溶液；B为乙腈；梯度为：0-60min，B％为2％-12％，流速1600mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为700.0g，纯化收率87％，纯度97.8％。
将样液浓缩后转盐，先用4g/L醋酸铵转盐，转完盐后再用C18柱纯化，流动相：A为0.05％醋酸水溶液；B为乙腈；梯度为：0-60min，B％为2％-12％，流速1600mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，标定含量为651.0g，转盐收率为93％，合格样品峰合并浓缩冻干，得到669.8g白色絮状产品，纯度：98.91％；MS检测：594.89(1/4M+H)、793.08(1/3M+H)。其HPLC峰图与图3相似，质谱图与图4类似。
对比例1：芋螺抗皱素全保护肽树脂制备
按照实施例1的方法制备Pyr-Gly-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Gly-Pro-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Rink Amide AM Resin，收缩晾干树脂后得到芋螺抗皱素全保护肽树脂6800g。
对比例2：芋螺抗皱素全保护肽树脂裂解
按照裂解体系(TFA:Tis:Mpr:H2O:EDT＝90:3:3:3:1)配置好裂解液60L，控制温度为-5℃，将对比例1制得的芋螺抗皱素全保护肽树脂加入到上述裂解液中，恢复室温(30min)，继续反应1.5h，过滤，肽树脂用TFA洗涤两次，3.2L/次，合并滤液，减压浓缩，加入冰的异丙醚(64L)沉降，离心，固体用异丙醚洗涤6次，0.8L/次，得到芋螺抗皱素线性肽。
对比例3：芋螺抗皱素线性肽环化
向纯化水(1719.24L)中加入磷酸二氢钠二水合物(28.22kg，0.1mol/L)、盐酸胍(345.8g，0.002mol/L)搅拌溶解澄清，将对比例2制得的线性肽用5％的DMSO(90.5L)溶解，加入至上述溶液中搅拌溶解，用25％的氨水调节pH为8.8，氧化24h，得到芋螺抗皱素粗肽，有大量固体析出，其HPLC峰图如图5所示。测得合成收率为28.32％，粗肽纯度46％。
对比例4：螺抗皱素纯化、转盐
将对比例3得的芋螺抗皱素粗肽经0.45μm有机膜过滤，浓度为0.4g/L，滤液经纳微C18柱纯化，流动相：A为0.05％醋酸水溶液；B为乙腈；梯度为：0-60min，B％为2％-12％，流速1600mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，测得纯化收率40.35％，纯度95％。
将样液浓缩后转盐，先用4g/L醋酸铵转盐，转完盐后再用C18柱纯化，流动相：A为0.05％醋酸水溶液；B为乙腈；梯度为：0-60min，B％为2％-12％，流速1600mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰，测得转盐收率为75％，合格样品峰合并浓缩冻干，得到白色絮状产品，纯度为：97.01％。
实施例11与对比例3的方法相比，仅环化液的pH不同，相应的，实施例11制得的芋螺抗皱素粗肽合成收率为33％，纯度为60.65％，与对比例3的结果相比，芋螺抗皱素粗肽的收率和纯度分别提高了16.53％、31.85％。实施例17制得的芋螺抗皱素纯化收率达79％，纯度为98％，转盐收率为95％，纯度为99.03％，与对比例4相比，其纯化收率提高了95.79％，转盐收率提高了26.67％。由此可知，本发明提供的一种芋螺抗皱素的制备方法可以在环化液体系pH为5.0～7.9时，降低Cys在环化液中发生氧化、降解、聚合等副反应发生的可能提高了粗肽的纯度和收率，同时也大大提高了纯化和转盐的收率。

Claims (15)

1.一种芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
步骤1：在固相载体上，按照芋螺抗皱素肽序采用固相合成方法在碱或者缩合剂存在下进行逐步缩合或片段偶联，得到芋螺抗皱素全保护肽树脂；
步骤2：将步骤1制得的芋螺抗皱素全保护肽树脂经裂解试剂裂解后，得到芋螺抗皱素线性肽；
步骤3：将步骤2制得的芋螺抗皱素线性肽经环化液环化后，得到芋螺抗皱素粗品；其中，环化液体系的pH范围为5～7.9；
步骤4：将步骤3制得的芋螺抗皱素粗品经纯化、转盐、浓缩、冷冻干燥，得到芋螺抗皱素精肽。
2.根据权利要求1所述的一种芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体为：在碱或者缩合剂存在下，将固相载体依次与Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、H-Pyr-OH进行缩合，得到芋螺抗皱素全保护肽树脂：Pyr-Gly-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Gly-Pro-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-树脂；
3.根据权利要求1或2所述的一种芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，所述固相载体选自AM Resin、HMBA Resin、Rink Amide Resin、Rink Amide AM Resin、Rink Amide MBHAResin、PAL Resin中的一种。
4.根据权利要求3所述的一种芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，所述固相载体的替代度为0.2mmol/g～0.7mmol/g。
5.根据权利要求1或2所述的一种芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，所述缩合剂选自HOBt、HOAT、DIC、DCC、EDC.HCl、HATU、HBTU、HCTU、Py.BOP、Py.AOP、DPPA。
6.根据权利要求5所述的一种芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，所述缩合剂选自HOBt、HOAT、DPPA。
7.根据权利要求1或2所述的一种芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，所述碱选自DIEA、吡啶、碳酸氢钠、碳酸钠、吗啡啉、氢氧化钠中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，所述步骤2裂解试剂为TFA、DODT和X的混合溶液，X选自Tis、Mpr、H2O；其中，TFA占裂解液的体积百分比为85％-90％，且DODT体积百分比为1％-10％。
9.根据权利要求1所述的一种芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，所述步骤3芋螺抗皱素线性肽环化时采用的方法选自空气氧化法、DMSO氧化法、血晶素氧化法。
10.根据权利要求1或9所述的一种芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，所述环化时环化液体系中的氧化剂选自空气、1％～10％的DMSO水溶液、10％～20％的血晶素中的一种。
11.根据权利要求1或9所述的一种芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，所述环化时环化液体系中盐体系为磷酸盐缓冲盐体系或Tris-HCl/DIEA体系。
12.根据权利要求11所述的一种芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲盐体系选自磷酸二氢钠与盐酸胍或磷酸二氢钾与盐酸胍。
13.根据权利要求1或9所述的一种芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，所述环化时环化液体系中pH范围为6.0～6.5。
14.根据权利要求1所述的一种芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，所述步骤4芋螺抗皱素粗品经纯化的方法为：环化液过滤后直接上样，用高效液相色谱法进行纯化，色谱柱为反相高效液相色谱柱，流动相：A为0.01％-0.1％醋酸水溶液；B为乙腈；梯度为：0-60min，B％为2％-12％。
15.根据权利要求14所述的一种制备芋螺抗皱素的方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱柱中填料选自UniPS 40-300。
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