KR101940833B1 - 유전자 및 생물학적 분석을 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

유전자 및 생물학적 분석을 위한 시스템 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴리뉴클레오티드를 서열분석할 뿐만 아니라 다른 생물학적 분자를 포함하는 반응 및 결합 사건을 검출하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 상기 시스템 및 방법은 무-챔버 장치 및 나노센서를 사용하여 이러한 반응을 고처리량으로 검출하거나 특성화할 수 있다. 다수의 실시양태에서 시스템이 재사용가능하기 때문에, 상기 시스템은 단일 사용 장치에 비해 더 정교하고 개선된 조작을 적용시킬 수 있다.

Description

유전자 및 생물학적 분석을 위한 시스템 및 방법 {SYSTEMS AND METHODS FOR GENETIC AND BIOLOGICAL ANALYSIS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2011년 5월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 61/491,081, 2011년 12월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 61/565,651, 2012년 4월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 61/620,381, 및 2012년 2월 15일에 출원된 미국 출원 일련 번호 13/397,581의 우선권 및 이익을 주장하며, 이들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 5월 28일 월요일이 연방 공휴일이었기 때문에, 본 PCT 출원은 2012년 5월 29일에 미국 수리관청에 제출되었다.
본원은 PCT/US2011/054769와 추가로 관련되며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원 연구 및 개발에 관한 언급
본 발명의 측면은 보건복지부(Department of Health and Human Services)와 협력하여 IRS에 의해 수여된 적격 치료제 개발 승인(Qualifying Therapeutic Discovery Grant) 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 일정 부분의 권리를 가질 수 있다.
고처리량 DNA 서열분석을 비롯한 신속하고 비용 효율적인 유전자 및 생물학적 분석 방법은 개인맞춤형 의약 및 진단 시험을 진보시키는 중요한 측면으로 남아 있다. 현재의 고처리량 또는 소형화된 시스템은 한계를 갖는다. 예를 들어, 광학 검출을 이용하는 것을 비롯한 DNA 서열분석을 위한 현재의 시스템은 번거롭고 비싸며, 제한된 처리량을 갖는다. 일부 시스템이 이들 한계를 극복하기 위해 센서 및 서열분석 유동 셀을 사용하기는 하지만, 이들은 일반적으로 1회 사용하는 일회용품이고, 이는 실질적으로 사용자에게 비용을 증가시키고, 센서가 단일 사용을 위해 비용 효율적으로 제조되어야 하기 때문에 센서의 복잡성을 제한한다. 에멀젼 PCR은 약간의 이점을 제공하지만, 서열분석이 클론 집단 전체에 걸쳐 "동일 위상으로" 진행되지 않는 경우에 서열분석 클론 DNA 집단이 제한된 정확도를 나타낼 수 있고, 이는 결국 사실상 짧은 판독 길이로 이어질 수 있다.
유전자 및 생물학적 분석을 위한 시스템 및 방법, 및 특히 민감하고 동시에 비용 효율적인 고도 병렬 또는 클론 서열분석 반응을 위한 방법 및 시스템에 대한 필요성이 존재한다.
본원에 기재된 측면 및 실시양태는 폴리뉴클레오티드를 서열분석할 뿐만 아니라 다른 생물학적 분자를 포함하는 반응 및 결합 사건을 검출하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 시스템 및 방법은 이러한 반응을 고처리량으로 검출하고/거나 특성화하기 위해 무-챔버 장치 및/또는 나노센서를 사용할 수 있다. 다수의 실시양태에서 시스템이 재사용가능하기 때문에, 시스템은 단일 사용 장치와 비교하여 보다 정교하고 개선된 조작을 적용시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 개별 이중 또는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드일 수 있거나 또는 다른 실시양태에서 폴리뉴클레오티드의 클론 집단인 폴리뉴클레오티드를 서열분석하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 한 측면은 병렬 또는 클론 폴리뉴클레오티드 서열분석 방법을 제공하고, 방법은 표적 폴리뉴클레오티드 집단의 제1 부분을 서열분석하는 것, 위상 오차를 수정하는 것, 및 이어서 표적 폴리뉴클레오티드 집단의 제2 하류 부분을 서열분석하는 것을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열분석은 비드 어레이의 클론 서열분석, 뉴클레오티드 혼입의 전자적 검출, 및 반응 성분을 단리 또는 농축하기 위한 전자 웰 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
예를 들어, 위상 오차는 3종의 뉴클레오티드 염기의 조합물을 첨가하여, 배제된 염기의 첫 발생시에 폴리뉴클레오티드 집단을 정지시킴으로써 수정될 수 있다. 위상 오차는 또한 본원의 상세한 설명에 기재된 바와 같이 혼입 반응의 조합 및/또는 순서를 통해 수정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 위상 오차는 동일-위상 폴리뉴클레오티드 가닥 내로 쇄 종결 뉴클레오티드를 가역적으로 혼입시킴으로써 수정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 위상 오차는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 클램프를 첨가함으로써 수정될 수 있고, 클램프(들)는 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화되어 서열분석 반응을 정지시킨다. 일부 실시양태에서, 클램프는 서열분석 반응을 계속하기 위해 변성되거나, 탈안정화되거나 또는 분해된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 클램프는 연장될 수 없는 3' 종결 뉴클레오티드를 갖고, 따라서 3' 종결 뉴클레오티드의 제거 시, 클램프는 후속 하류 서열분석을 위한 프라이머가 된다.
재위상화는 일정한 간격으로 발생할 수 있거나, 또는 대안적으로, 반응이 신호의 손실에 대해 모니터링되고, 서열분석 신호를 회복하기 위해 재위상화가 수행될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 병렬 또는 클론 폴리뉴클레오티드 서열분석에서 진상(leading phase) 오차를 감소시키는 방법을 제공한다. 이러한 측면에 따른 방법은 경쟁적 반응의 존재 하에 표적 폴리뉴클레오티드 집단을 서열분석하는 것을 포함하며, 여기서 경쟁적 반응은 모든 4종의 뉴클레오티드 염기에 대해 뉴클레오티드 염기 또는 뉴클레오티드 유도체를 포함한다. 일반적으로, 4종의 뉴클레오티드 염기 중 3종은 성장하는 폴리뉴클레오티드 가닥 내로 혼입가능하지 않을 것이며, 그로 인해 틀린 뉴클레오티드를 혼입시키는 폴리머라제의 경향을 감소시킨다. 이러한 측면에 따르면, 폴리뉴클레오티드 서열분석은 비드 어레이의 클론 서열분석, 뉴클레오티드 혼입의 전자적 검출, 및 반응 성분을 단리 또는 농축하기 위한 전자 웰 중 하나 이상을 임의로 포함할 수 있다. 폴리머라제에 의해 결합될 수 있지만 성장하는 폴리뉴클레오티드 가닥 내로 혼입될 수 없는 다양한 뉴클레오티드 유도체가 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 병렬 또는 클론 폴리뉴클레오티드 서열분석 반응에서 지상(lagging phase) 오차를 감소시키는 방법을 제공한다. 이러한 측면에 따르면, 서열분석 반응 동안 폴리머라제 효소를 표적 폴리뉴클레오티드 집단 상에 또는 근처에 비축시켜 폴리머라제가 각각의 활성 중합 부위에 대해 실질적으로 이용가능하도록 하는 것을 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 방법은 복구 단백질 또는 단일 가닥 DNA 결합 단백질을 표적 폴리뉴클레오티드 집단에 결합시키는 것을 포함한다. 임의로, 폴리뉴클레오티드 서열분석 반응은 비드 어레이의 클론 서열분석, 뉴클레오티드 혼입의 전자적 검출, 및 반응 성분을 단리 또는 농축하기 위한 전자 웰 중 하나 이상을 포함한다. 비축은 주형 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 비-연장가능한 프라이머를 비롯한 프라이머에 대한 폴리머라제의 자연 결합의 결과일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 반복되는 뉴클레오티드 서열분석 방법을 제공하여, 수회의 서열분석 실행이 서열 데이터에 대해 분석될 수 있도록 한다. 이러한 측면에 따르면, 방법은 원형화된 DNA 서열분석 주형을 제공하는 것, 및 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제에 의해 뉴클레오티드 혼입 서열을 결정함으로써 주형을 서열분석하는 것을 포함한다. 이러한 측면은 또한 비드 어레이의 클론 서열분석, 뉴클레오티드 혼입의 전자적 검출, 및 반응 성분을 단리 또는 농축하기 위한 전자 웰 중 하나 이상을 임의로 포함할 수 있다. 이러한 측면에 따른 DNA 폴리머라제는 고도 처리성일 수 있고, 감소된 엑소뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 고도 처리성인 폴리머라제는 뉴클레오티드의 혼입을 측정하도록 맞춰진 바이오센서 상에 또는 근처에 결합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 폴리머라제 효소를 바이오센서에 일정 부피로 부착하고, DNA 주형을 연관 프라이머와 함께 상기 부피 내에 진입시키고 혼성화시켜 폴리머라제에 의해 (또는 그에 근접하여) 유지시킴으로써 단일 DNA 분자를 서열분석한다. 후속적으로, 서열은 폴리머라제에 의한 프라이머의 연장 시 결정될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 전자기 센서 어레이, 전자기 센서에 또는 근처에 관심 분자를 전달하거나 유지시키기 위한 자기 담체, 및 액체 유동 및/또는 전자기 제거를 통해 자기 담체를 제거하기 위한 메카니즘을 포함하는 무-챔버 장치를 제공한다. 전자기 센서는 나노니들(nanoneedle) 또는 나노브릿지(nanobridge) 중 하나일 수 있고, 장치는 국부 증폭기를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전자기 센서는 협소한 구조를 갖고, 센서 표면의 양 측면이 pH에서의 변화 또는 전도성에서의 변화에 접근가능하도록 상기 구조 하에서 에칭된다. 본원에 기재된 장치 및 방법은 감소된 제타 전위를 갖는 물질을 혼입시키는 것, 폴리뉴클레오티드 혼입 및 민감한 pH 측정을 둘 다 허용하는 시약을 사용하는 것, 및 서열분석 반응을 위해 폴리뉴클레오티드 주형을 유지시키는 비드 또는 기판에 대한 최적 근접도 및 배치에 있어서의 나노센서의 설계 및 제작을 비롯한 하나 이상의 개선을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면 및 실시양태는 하기 상세한 설명에 기반하여 당업자에게 분명할 것이다.
도 1a는 몇몇의 서브시스템의 개략적인 세부사항과 함께 완전한 통합 시스템을 나타낸다. 도 1b는 샘플 및 라이브러리 정제용 서브시스템의 개략적인 세부사항을 나타낸다. 도 1c는 DNA 단편화 및 정제 서브시스템의 개략적인 세부사항을 나타낸다. 도 1d는 PDMS 라이브러리 제조 서브시스템을 나타낸다.
도 2는 자기 및 가상 구속 어레이를 나타낸다.
도 3은 가상 웰을 위한 전계를 콤솔(Comsol) 시뮬레이션하는 것을 나타낸다.
도 4a 내지 4d는 개략적인 도면 및 제조된 PDMS 밸브 서브시스템을 나타낸다.
도 5는 나노니들 센서 및 자기 어레이 요소를 겸비하기 위한 한 실시양태를 나타낸다.
도 6은 고정된 위치에 자기 비드를 위치시킬 수 있는 자기 어레이의 두 가지 버전을 나타낸다.
도 7은 고정된 위치에 비드를 둘 수 있는 자기 어레이의 한 실시양태를 나타낸다.
도 8은 비드를 국소 적용시키기 위해 "누수 밸브"를 사용하는 어레이의 요소를 개략적으로 도시한다.
도 9는 검출을 위한 산화환원 반응과 관련된 시뮬레이션된 전압 및 전류 플롯을 도시한다.
도 10은 DNA 결합 단백질의 전하 분포를 예시한다.
도 11은 평면 자기 입자를 위해 사용되는 자기 어레이의 개략적인 도시를 나타낸다.
도 12는 비드와 결합된 자기 가상 웰 및 나노니들 어레이를 개략적으로 예시한다.
도 13a 내지 13e는 다양한 풍부화 모듈 실시양태의 도면, 예시 및 현미경 사진을 나타낸다.
도 14는 기존 유동 셀에 대한 비드 로딩 밀도를 예시한다.
도 15는 밸브 시스템 및 다중 채널 유동 셀과 근접 밸브 대조물에 대한 계면을 개략적으로 예시한다.
도 16은 나노니들 및 비드 어레이 요소에서의 임피던스에 대한 단순한 모델을 개략적으로 예시한다.
도 17은 하부 에칭된 적층 나노니들을 개략적으로 도시한다.
도 18은 하부 에칭된 적층 나노니들의 어레이의 현미경사진이다.
도 19는 하부 에칭된 적층 나노니들의 2D 어레이를 개략적으로 도시한다.
도 20은 하부 에칭된 적층 나노니들의 2D 어레이의 현미경 사진이다.
도 21a 내지 c는 단면 접촉 나노니들의 어레이의 요소를 개략적으로 도시한다.
도 22a 내지 d는 양면 접촉 나노니들의 어레이의 요소를 개략적으로 도해하여 나타낸다.
도 23은 나노브릿지의 요소를 개략적으로 도시한다.
도 24a 내지 c는 고리 나노브릿지의 도를 개략적으로 도시한다.
도 25는 단일 분자 서열분석을 위해 사용된 나노니들의 어레이를 개략적으로 도시한다.
도 26은 나노니들 어레이 요소로부터의 서열분석 데이터 및 그의 선형성을 예시한다.
본 발명은 DNA 서열분석, 및 다른 유형의 생물학적 또는 유전자 분석을 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 본 발명은 전자 서열분석에 의한 것을 비롯한 클론 DNA 집단 또는 단일 분자 DNA의 어레이를 서열분석하기 위한 방법 및 시스템을 제공하며, 그로 인해 저비용 및 편리한 서열분석 플랫폼을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 DNA의 클론 집단을 서열분석하는 동안 위상 오차를 모니터링하고/거나 수정하여 그로 인해 정확도 및 판독 길이를 개선하는 방법을 제공한다. 대안적으로, 본 발명은 DNA의 단일 분자를 서열분석하여 그로 인해 이러한 위상 오차를 회피하기 위한 방법 및 센서를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 고도 병렬 반응을 위한 자기 어레이를 비롯한 어레이 및 가상 반응기를 제공한다. 일부 실시양태에서 이들 시스템은 DNA 서열분석 동안 뉴클레오티드의 혼입을 비롯한 생물학적 반응 또는 상호작용을 검출하기 위한 나노센서를 포함한다. 추가로, 본 발명은 DNA 샘플을 증폭시키고 서열분석하기 위한 통합 시스템을 제공한다.
서열분석 위상 오차에 대한 모니터링 및 수정
본원에 사용된 "위상 오차"는 클론 집단의 일부 주형 폴리뉴클레오티드가 컨센서스 상태보다 더 또는 덜 확장되는 경우에 발생하는 것으로서 정의된다. 염기가 컨센서스에 대해 부가되지 않아야 하는 곳에 부가된 단편에 대해, 이 위상 오차는 "선진(leading)"인 것으로 여겨진다. 염기가 컨센서스에 대해 부가되어야 하는 곳에 부가되지 않은 다른 주형 분자에 대해, 폴리뉴클레오티드는 "지체(lagging)"인 것으로 여겨진다. 폴리머라제가 불완전하기 때문에, 일부 위상 오차는 콜로니 기반의 서열분석 과정의 일부로서 장기 연장 반응을 갖는 콜로니 내에서 불가피하다. 위상 오차는 상업용 클론 서열분석 시스템의 판독 길이를 제한한다.
"선진 서열분석 혼입 오차"는 뉴클레오티드의 부정확한 부가를 통해 우성 서열의 앞에 있는 서열을 지칭한다. 부정확한 부가는, 특히 고농도의 dNTP가 비경쟁적 반응에 사용되는 경우에 폴리머라제 오차로부터 생성될 수 있다. 대안적으로, 선진 서열분석 혼입 오차는 부적절한 세척 및 dNTP의 비특이적 결합으로부터 생성될 수 있으며, 이는 후속적으로 방출되고 포함될 수 있다. "지체 서열분석 혼입 오차"는 정확한 뉴클레오티드의 손실된 부가를 통해 우성 서열 뒤에 있는 서열을 지칭하며; 이는 폴리머라제 억제의 최적이 아닌 반응 조건, 입체 장애, 2차 구조 또는 다른 공급원으로 인해 발생할 수 있다. 보다 긴 주기 시간은 폴리머라제에 잘못된 뉴클레오티드를 혼입하는 더 많은 기회를 허용할 수 있다. 유사하게, 덜 접근가능한 DNA는 정확한 뉴클레오티드를 혼입하는데 불충분한 기회를 발생시킬 수 있다. 온도, 단계 시간, 폴리머라제 선택, 뉴클레오티드 농도, 염 농도 및 완충제 선택이 혼입 오차를 최소화하기 위해 최적화될 수 있는 것으로 예측된다.
예를 들어, DNA 샘플은 프라이머에 상보적인 영역 이후의 제1 영역에 TGTTC의 서열을 가질 수 있다. 유체 주기는 첫번째로 dCTP, 이어서 두번째로 dTTP, 이어서 세번째로 dATP, 및 이어서 네번째로 dGTP를 도입할 수 있고, 세척 단계가 그 사이에 배치될 수 있다. 유체 주기의 제1 부분에서, 상기 제1 주기의 부분으로서 유동하는 dCTP 분자는 웰 구조를 적절하게 세척할 수 없다. 유체 주기의 제2 부분에서, 상기 제2 주기의 부분으로서 유동하는 dTTP 분자는 웰 구조를 적절하게 세척할 수 없다. 제1 유체 주기의 제1 및 제2 부분 동안, dNTP는 혼입되지 않을 것이다. 유체 주기의 제3 부분 동안, dATP가 샘플의 제1 염기인 T에 상보적이기 때문에, dATP는 도입될 수 있고 혼입될 수 있다. 비특이적으로 결합되는 것을 중단시키는 임의의 비특이적으로 결합된 dCTP 분자가 또한 유체 주기의 이러한 제3 부분 동안 혼입될 수 있다. 이들 미결합 dCTP 분자는 dATP 분자가 혼입된 후에 혼입될 수 있다. dCTP 분자가 혼입된 후에, 2개 추가의 dATP 분자가 후속적으로 혼입될 수 있고, 이는 선진 서열분석 위상 오차를 갖는 모노클로날 비드의 일부 분자를 생성할 수 있다. 따라서, 모노클로날 비드의 일부 분자는 "위상-외(out of phase)"가 될 수 있다.
폴리머라제가 단일 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체와 한번에 제공되는 경우에, 오차 비율은 전형적으로 모든 4개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 제공되는 경우보다 상당히 더 높다. 이는 미스매칭된 뉴클레오티드 대 매칭된 뉴클레오티드에 대해 4 로그 이상 더 낮을 수 있는 kpol/Kd , app로서 측정된 효소적 효율에 있어서의 상당한 차이에도 불구하고 발생할 수 있다. 이의 대부분은 Kd,app에서의 차이로 인한 것이다. 예를 들어, 클레나우 폴리머라제는 매 106 내지 108개의 염기마다 1개 염기의 오혼입을 갖는다. 비교해보면, 단일 천연 dNTP의 혼입을 활용하는 현재의 상업용 시스템에 의한 폴리머라제 연장 반응은 100 내지 1000개 염기에 제한될 수 있다. 이들 시스템에서의 폴리머라제는 염기 오편입을 시도하는데 거의 모든 시간을 소비하여, 유의한 "진상" 오차를 유도한다. 대안적으로 탈위상화는, 폴리머라제의 부재로 인해 혼입 유체 유동 주기에서 혼입 염기가 아닌 상기 폴리머라제, 이어서 후속적 혼입 유체 유동 주기에서의 폴리머라제의 존재로부터, 또는 염기가 혼입되지 않도록 하는 충분히 낮은 dNTP 농도의 조합 및 혼입 시간으로부터 생성될 수 있으며, 이로써 "지상" 오차를 생성한다. 시스템에 첨가된 뉴클레오티드가 부가된 다음의 뉴클레오티드인 경우에도, 반응 시간은 8개 이상의 뉴클레오티드일 수 있는 단독중합체에 대해 또는 입체 장애로부터 덜 접근가능할 수 있는 DNA 가닥에 대해 반응을 완료하기에 충분히 길어야만 한다.
한 측면에서, 본 발명은 병렬 또는 클론 폴리뉴클레오티드 서열분석을 위한 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 방법은, 주형 폴리뉴클레오티드 집단의 제1 부분을 서열분석하고, 위상 오차를 수정하는 것을 포함한다. 이어서, 표적 폴리뉴클레오티드 집단의 제2 하류 부분을 계속 서열분석한다. 다양한 실시양태에서, 서열분석은 폴리뉴클레오티드 집단의 어레이 (예를 들어, 비드 어레이) 중 하나 이상의 클론 서열분석, 뉴클레오티드 혼입의 전자적 검출, 및 서열분석 반응 성분을 단리 또는 농축하기 위한 전자 웰을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 본 발명은 진상 및 지상 둘 다에 대한 모니터링 및 수정 방법을 제공하고, 본원에 기재된 다양한 접근법이 개별적으로 또는 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "클론"은 비드 또는 입자의 실질적으로 모든 집단이 동일한 주형 핵산 서열일 수 있음을 의미한다. 일부 실시양태에서, "메이트 쌍," "쌍형성된 말단" 또는 다른 유사한 방법론에 바람직할 바와 같이, 단일 샘플 DNA 단편과 연관된 2개의 집단이 존재할 수 있고; 집단은 비드 또는 입자 상에 대략 유사한 수로 존재할 수 있고, 비드 또는 입자에 무작위로 분포될 수 있다.
일부 실시양태에서, 콜로니는 달리 정상적으로 수행될 수 있는 것과는 상이한 순서로의 뉴클레오티드 혼입에 의해 서열분석을 제공함으로써 재-위상화된다. 예를 들어, 시스템이 우세하게 지상 오차를 갖는 경우에 (진상 오차와 대조적으로), 예를 들어 단순히 염기당 1% 지체 오차 (및 모든 4개의 상이한 염기가 유사한 지체 오차 비율을 가짐)를 가지면, 20개 염기가 혼입된 후에, 콜로니 구성원 중 정확히 75% 초과는 동일-위상에 존재할 수 있지만, 20% 초과는 단일 염기에 의해 지체될 수 있다. 70개 염기를 서열분석하는 때까지, 절반 미만의 콜로니 구성원이 동일-위상에 존재할 것이고, 35%가 단일 염기에 의해 지체될 것이고, 13%가 2개 염기에 의해 지체될 것이고, 3%가 3개 염기에 의해 지체될 것이다. 따라서, 이상적인 위치를 진하게 나타낸 다음의 예시적인 혼입 서열 예 (...CGATCGATCGA)에 대해, 콜로니 중 50%는 제4 염기 (T)에서 동일-위상에 있을 것이고, 35%는 1개 염기를 지체할 것이고 (A), 13%는 2개 염기를 지체할 것이고 (G), 3%는 3개 염기를 지체할 것이다 (C). 염기 혼입을 위한 이전 순서가 CGAT이고, C가 제공되는 경우에, 지체 오차는 계속될 것이고, 약간 증가할 것이다. 제공된 다음의 염기가 C 대신 G인 것을 제외하면, 선진 염기는 확장되지 않을 것인 한편, 나타낸 제1 G에서 2개 염기를 지체하는 콜로니의 부분이 확장될 것이고; A가 그 다음에 제공되는 경우에, 대부분의 콜로니가 현재 동일-위상에 존재할 것이다. C가 없는 3개 염기 조합, 예를 들어 GAT가 하나 이상 제공되는 경우에, 임의의 위상 오차는 C 염기에 집중될 것이다. 통계상 일부 서열은 결과적으로 보다 위상-외가 될 수 있지만, 대부분의 서열은 보다 상 내에 존재할 수 있게 된다. 2개 염기 조합은 또한 콜로니를 재-위상화하기 위해 대체로 동일한 방식으로 사용될 수 있고, 2개 염기 및 3개 염기 세트의 혼합물이 사용될 수 있다. 재-위상화 후에, 시스템은 4개 염기 조합으로 되돌아갈 수 있고, 재위상화는 필요한 만큼 빈번하게 반복될 수 있다.
다른 실시양태에서, 4개 염기 조합은 전혀 사용되지 않을 수 있지만, 교대 3개 및 2개 염기 세트는 독점적으로 사용된다. 추가 실시양태에서, 4개 염기는 뉴클레오티드의 3 및 2개 염기 세트의 임의의 조합으로 첨가되며, 2 및 3개 염기 세트의 조성물이 일부 실시양태에서 교대로 첨가된다. 일부 실시양태에서, 기재되어 있는 상기 염기 세트는 또한 혼입 불가능한 뉴클레오티드의 사용을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 2, 3 또는 4개 염기 조합에서 활용되는 뉴클레오티드 및 또는 혼입 불가능한 뉴클레오티드의 농도는 주기에서 주기에 따라, 또는 세트에서 세트에 따라 달라질 수 있다.
특정 실시양태에서, 위상 오차는 서열분석 반응으로부터 적어도 1개의 뉴클레오티드 염기를 제외함으로써 수정된다. 예를 들어, 위상 오차는, 3개의 뉴클레오티드 염기의 조합을 첨가하고 이에 따라 제외된 뉴클레오티드 염기의 제1 발생에서 클론 집단에서 각 신생 폴리뉴클레오티드를 휴지시킴으로써 수정될 수 있다.
특정의 다른 실시양태에서, 위상 오차는 동일-위상 폴리뉴클레오티드 가닥에 쇄 종결 뉴클레오티드를 가역적으로 혼입함으로써 수정된다. 지상 가닥이 동일-위상 가닥까지 따라잡으면, 종결 뉴클레오티드가 제거된다. 이러한 접근법은 서열분석된 서열이 단독중합체 영역을 포함하는 경우에 가장 유리할 수 있다. 예를 들어 콜로니의 동일-위상 부분에 T 염기를 혼입한 하기 서열 단편 ....AGCTCCC에서, 대부분의 지체 서열은 콜로니 구성원의 최종 염기로서 C, G 및 A 염기를 혼입하고, C' 종결 뉴클레오티드가 염기 조합 AGT에 이어서 제공되는 경우에, AGT는, 이어서 서열 ....AGC' 및 ....AGCTC'가 우세한 대게의 이중모드 집단으로 존재할 수 있다. 이어서, 상기 종결인자는 C' 뉴클레오티드로부터 제거될 수 있고, 또 다른 C' 종결 뉴클레오티드가 제공될 수 있으며, 2개의 우세한 서열: ....AGC 및 AGCTCC'를 생성한다. 이어서, C' 종결된 뉴클레오티드는 염기 조합 AGT에 이어질 수 있고, AGT는 2개 집단: ....AGCT 및 ....AGCTCC'를 생성한다. 이어서, 종결인자는 제거될 수 있고, 이어서 비-종결된 C 뉴클레오티드가 제공될 수 있으며, 단일 서열: ....AGCTCCC를 우세하게 생성한다.
일부 실시양태에서, 위상 오차는 참조 서열을 기준으로 하여 특정 위치 (예를 들어, 단독중합체 영역)에서 예측되며, 따라서 위상 수정이 서열분석시 적절한 장소에서 효과적으로 수행되도록 한다.
이들 접근법은, 예를 들어, 지체 오차와 같은 오차의 우세한 공급원을 갖는 그러한 시스템에 대해 가장 효과적일 수 있다. 재-위상화에 사용될 수 있는 염기 조합은 혼입의 완전한 서열이 결정될 수 있도록 개별적으로 첨가될 수 있거나, 또는 재-위상화가 손실 데이터의 작은 절편과 함께 달성될 수 있도록 함께 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가역적 종결인자는 서열분석 과정 또는 방법 동안 반복적으로 사용될 수 있고, 혼입 가능한 또는 혼입 불가능한 뉴클레오티드과 조합될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하여 서열분석 반응을 중단시키는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 클램프를 첨가하고, 이에 따라 위상 오차를 제거함으로써 위상 오차가 수정된다. 이러한 클램프는 PNA 단편, DNA 단편, 또는 DNA 서열에 특이적으로 결합하는 천연 또는 비-천연의 다른 분자일 수 있다. 표적화된 재서열분석을 위해 활용되는 시스템에서, 특이적인 올리고는 "클램프"로서 사용될 수 있다. "클램프"는 프라이머 서열이 제공될 수 있는 동일한 시간에, 프라이머 서열이 제공될 수 있는 시간 전에, 프라이머 서열이 제공될 수 있는 시간 후에, 임의의 서열분석 반응이 완결되기 전에, 또는 일부 서열분석 반응이 완결된 후에 제공될 수 있다. 다수의 상이한 표적화 또는 비표적화 클램프가 각 주형에 대해 제공될 수 있다.
상기 클램프(들)는 DNA 주형의 특정한 영역에 대해 랜덤하거나 표적화될 있다. DNA 단편 또는 다른 클램프는 히스톤, 양이온성 프로타민, 레콤비나제, 및 듀플렉스 DNA를 안정화시키는 것으로 공지된 다른 분자를 사용하여 추가로 안정화될 수 있다. 이어서, 서열 반응은 클램프(들)의 지점까지 진행될 수 있다. 추가의 혼입 반응은 단일 염기, 2개 염기 조합, 3개 염기 조합 또는 4개 염기를 동시에 사용하여 수행될 수 있다. 상기 클램프는, 프라이머의 3' 말단과 상기 클램프(들) 사이에 (평균) 10 내지 50개 염기가 존재하도록 상기 클램프가 이격될 수 있게 배치될 수 있거나, 또는 프라이머의 3' 말단과 상기 클램프(들) 사이에 (평균) 10 내지 100개 염기가 존재하도록 배치될 수 있거나, 또는 프라이머의 3' 말단과 상기 클램프(들) 사이에 (평균) 100 내지 500개 염기가 존재할 수 있도록 배치될 수 있거나, 또는 프라이머의 3' 말단과 상기 클램프(들) 사이에 (평균) 300 내지 500개 염기가 존재할 수 있도록 배치될 수 있거나, 또는 프라이머의 3' 말단과 상기 클램프(들) 사이에 (평균) 1000 내지 5000개 이상의 염기가 존재할 수 있도록 배치될 수 있거나, 또는 프라이머의 3' 말단과 상기 클램프(들) 사이에 (평균) 2000 내지 5000개 염기가 존재할 수 있도록 배치될 수 있다.
일부 실시양태에서, 클램프는 특이적으로 혼성화될 수 있는 특정한 수의 염기를 가질 수 있고, 상기 클램프를 안정화시키는 역할을 할 수 있는 추가의 염기를 가질 수 있다. 상기 클램프의 서열이 특정한 영역(들)에 대해 표적화되는 것이 아니라 대신에 비-표적화 클램프라면, 클램프의 서열은 관심 게놈 또는 유사한 성질의 게놈 또는 관심 염색체 또는 관심 트랜스크립톰에서의 선택된 클램프 서열의 빈도, 클램프의 안정성을 포함하는 여러 기준을 사용하여 선택될 수 있다. 임의의 비-특이적 염기, 예컨대 데옥시이노신, 5-니트로인돌 또는 무염기성 뉴클레오티드, 또는 US 7,575,902 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 임의의 범용 염기를 포함하는 완전한 클램프의 혼성화 안정성은 클램프에 대한 특정한 염기로서 선택된 염기의 안정성을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 클램프는 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 특정한 염기를 포함할 수 있다. 상기 클램프는 수많은 DNA 콜로니에 사용될 수 있으며, 여기서 실질적으로 모든 콜로니는 다른 DNA 콜로니와 상이한 DNA 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 특이적 혼성화 dNTP의 단일 세트를 포함하는 단일 클램프 유형이 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 특이적 혼성화 염기의 개수 또는 순서 또는 간격이 상이할 수 있는 다중 클램프 유형이 사용될 수 있다. 예를 들어, 2개의 상이한 헥사머 클램프가 사용되어, DNA 염기에서 측정된 바와 같이 프라이머로부터 클램프로의 또는 하나의 클램프와 다음의 클램프 사이의 평균 간격을 감소시킬 수 있으며, 이는 2개의 헥사머 클램프 중 단지 1개가 이용되었을 경우에 일어날 것이지만, 단일 펜타머 클램프가 사용되었을 경우에 일어날 수 있는 것보다 클 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 염기에서 측정된 바와 같이 프라이머로부터 클램프로의 또는 클램프로부터 클램프로의 간격은 클램프 서열의 선택 결과에 따라 변할 수 있으며, 트랜스크립톰에서의 상이한 헥사머의 표현에 있어서 상당한 변이 (20X 초과)가 존재한다 (문헌 [Anderson et al RNA V14(5)]).
일부 실시양태에서, 클램프(들)는 온도를 상승시키거나 pH 또는 이온 농도를 변화시킴으로써 (위상화 후) 후속적으로 제거되어 클램프의 변성을 일으키지만, 보다 긴 연장된 프라이머를 남기며 이는 클램프(들)의 제거 후 후속적으로 추가 연장될 수 있다. 다른 실시양태에서, 클램프(들)는 적절한 닉카제(nickase) 또는 엔도뉴클레아제에 의해 후속적으로 닉이 만들어질(nicked) 수 있는 닉(nick) 부위(들)를 포함할 수 있으며, 이는 클램프를 충분히 불안정화시켜 그를 변성시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 클램프는 절단가능한 링커 부위를 포함할 수 있으며, 상기 절단가능한 링커 부위(들)는 화학적으로 절단가능하거나 광절단가능할 수 있다. 일부 실시양태에서, 3' 위치에서 종결된 염기는 클램프(들)의 부분으로서 제공될 수 있다. 상기 종결인자는 재위상화를 수행하도록 뉴클레오티드가 첨가된 후에 후속적으로 제거될 수 있다. 상기 종결인자는 화학적 또는 광화학적 방법을 사용하여 제거될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 유형의 절단가능한 링커 부위 (예, 고유한 절단가능한 링커 부위)의 조합이 상이한 클램프에 대해 사용되어, 상이한 링커 유형을 갖는 클램프가 임의의 서열분석 시작 전 또는 서열분석 시작 후에 제공될 수 있고, 상이한 절단가능한 메카니즘이 사용되어, 주형 DNA의 다중 재위상화를 허용하는 순서로 클램프를 변성시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 서열분석 및 재위상화 과정이 일어난 후 클램프를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 추가 실시양태에서, 추가의 클램프를 첨가하는 과정은 여러번, 예컨대 2 내지 5회, 4 내지 10회, 또는 10회 초과로 반복될 수 있다.
일부 실시양태에서, 데이터는 상기 클램프에 인접한 위치 이전의 모든 염기에 대해 혼입이 수행될 수 있을 때 수집될 수 있고; 다른 실시양태에서, 데이터는 상기 클램프에 인접한 위치 이전의 모든 염기에 대해 수행될 수 없다.
일부 실시양태에서, 상기 클램프는 비-가닥 치환 폴리머라제와 조합되어 이용될 수 있어서, 상기 폴리머라제가 중합 과정을 통해 상기 클램프에 도달할 때 상기 폴리머라제가 상기 클램프를 치환할 수 없도록 할 수 있다. 추가 실시양태에서, 상기 클램프의 5' 염기는 상기 폴리머라제가 가질 수 있는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 절단될 수 없는 비-천연 링커를 이용하여 연결될 수 있다. 대안적 실시양태에서, 상기 폴리머라제는 비-가닥 치환 폴리머라제일 수 있고, 또한 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되어 있을 수 있다.
추가 실시양태에서, 가닥 치환 폴리머라제는 상기 가닥 치환 폴리머라제에 의한 가닥 치환에 대해 저항성이 있는 클램프와 조합되어 사용될 수 있다. 상기 클램프는, 특히 클램프의 5' 말단에서, 가닥 치환 폴리머라제의 가닥 치환 활성에 대해 저항성이 있는 비-천연 염기로 이루어질 수 있다. 그러한 염기는 무염기성 염기, 예컨대 탈퓨린화된 염기, 또는 합성 염기, 예컨대 PNA, 핵염기의 아라비노실 유도체, 리보뉴클레오티드, 2'-O-알킬리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸리보뉴클레오티드, 또는 메틸포스포네이트 연결을 갖는 염기를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 클램프는 재위상화 후 프라이머로서 사용된다. 상기 클램프는 그의 3' 종결부에 가역적 종결인자를 포함할 수 있으며, 여기서 프라이머 연장 반응은 클램프가 추가의 연장을 실질적으로 방지할 때까지 진행된다. 추가의 연장에 이어서, 클램프의 3' 종결부로부터 종결인자가 제거되어, 폴리머라제가 상기 클램프/프라이머로부터의 프라이머 연장 반응을 개시하도록 허용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단일 클램프/프라이머는, 탈위상화가 정상적으로 일어나기 전에, 예를 들어 DNA 구조를 결정할 목적, 예를 들어 스캐폴드를 생성하고 각각의 서열로 인한 서열 모호성을 제거할 목적으로 상기 클램프(들)를 사용하는 것이 바람직할 경우에, 상기 프라이머와 상기 클램프 사이의 거리가 평균 서열분석 길이보다 유의하게 클 수 있는 콜로니 또는 콜로니 세트에 대해 사용된다. 일부 실시양태에서, 프라이머와 클램프/프라이머 사이의 거리는 탈위상화 전 평균 서열 "판독 길이"의 2배 길이일 수 있거나, 또는 탈위상화 전 평균 서열 "판독 길이"의 2배 길이 내지 5배 길이일 수 있거나, 또는 탈위상화 전 평균 서열 "판독 길이"의 5배 길이 내지 20배 길이일 수 있거나, 또는 탈위상화 전 평균 서열 "판독 길이"의 20배 길이 내지 50배 길이일 수 있다. 추가의 클램프/프라이머(들)는 이러한 실시양태에서 임의로 이용되어 판독 길이를 연장하고/거나 DNA 콜로니(들)의 구조를 추가로 설명할 수 있다. 일부 실시양태에서, 평균 판독 길이는 약 50개 뉴클레오티드, 또는 약 100개 뉴클레오티드, 또는 약 200개 뉴클레오티드, 또는 약 300개 뉴클레오티드, 또는 약 400개 뉴클레오티드, 또는 약 500개 뉴클레오티드이다. 다른 실시양태에서, 클램프/프라이머는, 탈위상화가 정상적으로 일어나기 전에, 예를 들어 평균 서열분석 길이의 판독 길이를 연장하는 것이 바람직할 경우에, 상기 프라이머와 상기 클램프/프라이머 사이의 거리 또는 클램프/프라이머로부터 다음의 클램프/프라이머로의 거리가 평균 서열분석 길이와 유사할 수 있는 콜로니 또는 콜로니 세트에 대해 사용된다.
임의의 안정화 모이어티를 포함하는 클램프와 폴리머라제 (또는 리가제) 사이의 상호작용의 결과로서 혼입의 정지점에 임의의 변이가 존재한다면, 클램프 재-위상화 방법은 상기 기재된 방법 중 하나 (클램프 서열이 이미 공지된 것이 유리할 수 있음)와 조합되어, 클램프 서열의 제1 염기 이외에 다른 염기의 첨가, 잠재적으로는 이어서 클램프 서열의 제2 염기 이외에 다른 염기의 첨가를 허용하거나, 클램프 서열의 임의의 다른 공지된 부분에서 임의의 정지를 허용할 수 있다.
재위상화 시약으로서 짧은 혼성화 프로브를 허용하기 위해서, 안정화 화합물, 예컨대 히드랄라진 또는 항종양 항생제 cc-1065를 이용할 수 있다. 유사하게, 프로브는 PNA 또는 LNA 프로브일 수 있으며, 이는 보다 단단한 결합을 제공하고, 예를 들어 프로브의 3' 말단에서 종결인자를 사용하여 프로브가 폴리머라제에 의해 연장되는 것을 방지할 필요를 제거하는 이중 기능을 제공할 수 있다. 추가로, 프로브는 단일 플렉스, 표적 DNA에 혼성화되어 보다 안정한 트리플렉스를 생성할 수 있는 듀플렉스, 또는 표적 DNA에 혼성화되어 쿼드라플렉스를 형성할 수 있는 트리플렉스일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로브는 2개 이상의 조각으로 제공될 수 있으며, 여기서 한 부분은 혼성화 단일 플렉스이고 두번째 부분은 혼성화되어 트리플렉스를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로브 착물에 대한 추가의 부분이 제공되어 쿼드라플렉스를 형성하거나 원래 주형에 더하여 2개 초과의 조각을 갖는 듀플렉스를 형성할 수 있다.
다른 실시양태에서, 지연된 탈위상화는 연장 및 서열분석될 DNA 상 또는 근처에서 "비축" 폴리머라제 효소에 의해 감소되어, 수많은 폴리머라제가 각각의 활성 중합 부위에 대해 이용가능해질 수 있도록 할 수 있다. 상기 비축은 DNA에 대한 폴리머라제의 천연 결합으로부터 일어날 수 있다. 그러한 결합은, 예를 들어 클레나우 폴리머라제가 사용될 때 클레나우 폴리머라제가 고유의 ssDNA 및 dsDNA 결합을 가지는 경우, 정상적으로 일어날 수 있다.
대안적으로, 일부 실시양태에서, DNA에는 범용 또는 표적화 프라이머에 더하여 3' 종결된 랜덤 프라이머가 제공될 수 있으며, 여기서 상기 범용 또는 표적화 프라이머는 종결될 수 없고, 상기 폴리머라제는 상기 랜덤 프라이머의 3' 종결된 말단에서뿐만 아니라 상기 범용 또는 표적화 프라이머의 3' 말단에 결합할 수 있다. 상기 랜덤 프라이머가 종결될 수 있다면, 상기 랜덤 프라이머는 연장될 수 없고, 따라서 상기 범용 또는 표적화 프라이머로부터 가닥을 연장하는 것에 수반되는 신호에 기여할 수 없다. 이러한 실시양태에서, 폴리머라제는 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되어, 상기 랜덤 프라이머가 분해되지 않아 비축 용량의 손실을 초래할 수 있도록 할 수 있다.
대안적 실시양태에서, 적어도 3' 종결부에서 뉴클레오티드 유사체를 사용하는 랜덤 프라이머가 3' 종결된 랜덤 프라이머 대신에 사용될 수 있고, 여기서 폴리머라제는 랜덤 프라이머에 결합할 것이나, 이들을 연장시키지는 않을 것이다. 상기 실시양태에서, 폴리머라제는 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성이 뉴클레오티드 유사체를 제거하는데 있어서 효과적으로 불활성인 경우에 상기 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 3' 종결 랜덤 프라이머, 또는 적어도 3' 종결 위치에 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 갖는 랜덤 프라이머에 결합하는 폴리머라제에 대해 Kd가 보다 작은 것이 바람직할 수 있다. 랜덤 프라이머를 함유하는 상기 뉴클레오티드 유사체는 키메라일 수 있고, 여기서 상기 키메라는 천연 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체, 다양한 유형의 뉴클레오티드 유사체, 또는 천연 뉴클레오티드 및 다양한 유형의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
추가 실시양태에서, 랜덤 프라이머는 3' 종결 랜덤 프라이머일 수 있고, 여기서 랜덤 프라이머의 3' 종결부는 3' (종결) 위치에 티오포스페이트 뉴클레오티드를 추가로 포함함으로써 랜덤 프라이머가 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성에 추가로 저항성이 되도록 한다. 3' 티오포스페이트 프라이머는, 예를 들어 IDT (인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies))로부터 상업적으로 입수가능할 수 있다. 상기 실시양태에서, phi29와 같은 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 천연 폴리머라제는, 상기 랜덤 프라이머의 분해를 방지하기 위해 엑소뉴클레아제 활성을 불활성화시키기 위해 폴리머라제를 돌연변이시킬 필요 없이 사용될 수 있다. 이러한 티오포스페이트는 알파-S 또는 알파-R 입체이성질체일 수 있다. 랜덤 프라이머는 또한 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 억제될 수 있도록 5' 티오포스페이트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 랜덤 프라이머는 랜덤 프라이머의 3' 위치에 관하여 중합 및 엑소뉴클레아제 활성을 둘 다 방지하는 작용을 할 수 있는 3' 역전된 dT를 포함한다. 디데옥시뉴클레오티드는 종결인자로서 사용될 수 있다. 상기 종결인자는 가역적 종결인자, 가상 종결인자, 뉴클레오티드의 염기에 또는 뉴클레오티드의 당의 임의의 위치에 부착된 종결인자일 수 있다. 랜덤 프라이머에서의 뉴클레오티드는 천연 염기일 수 있거나, 또는 합성 염기일 수 있다. 상기 랜덤 프라이머는 dNTP를 포함할 수 있거나, 또는 키메라를 PNA, RNA, LNA, 5-니트롤인돌, 데옥시이노신 또는 다른 비-천연 dNTP와 조합하여 포함할 수 있다.
비축된 폴리머라제는 또한 비드의 표면에, 센서의 표면에, 센서 사이의 간극 영역에, 상기 비드, 센서 또는 간극 영역에 부착된 기, 링커 또는 중합체에 결합될 수 있다. 이러한 결합은 비 연장가능 엑소뉴클레아제 저항성 DNA, 합성 DNA 또는 다른 선형 중합체의 추가적 가닥에 대한 것일 수 있거나, 또는 결합 기가 상기 중합체에 직접 결합할 수 있거나 상기 폴리머라제와 복합체화될 수 있는 중간체 단백질에 결합될 수 있는, 항체와 같은 다른 결합 기일 수 있다.
비축된 폴리머라제가 바람직한 오차율 내에서 지체 탈위상화를 방지하고 염기(들)를 혼입시키기 위해 DNA 가닥의 활성 혼입 부위와 분리된 폴리머라제를 치환할 수 있을 것임을 확실하게 하기 위해, 활성 혼입 부위로부터의 폴리머라제의 Koff 및 Koff 비축 부위(들) 및 비축된 폴리머라제의 수, 및 연장 기간 사이의 상대적 동역학에서의 관계는 적절해야 한다. 예를 들어, Koff가 활성 혼입 부위, 및 비축 부위(들) Koff 및 Kon 둘 다에 있어 동일한 경우에 Koff는 20개의 혼입 유체 주기와 동등하고, 20개의 비축된 폴리머라제를 갖는 것의 경우에 또 다른 폴리머라제가 활성 합체 부위에 결합할 수 있게 될 확률은 50% 미만이다. 이는 비축 부위의 Koff를 감소시키고, 비축 부위의 Kon을 증가시킴으로써 개선될 수 있으며, 단 유체 유동으로의 폴리머라제의 손실이 문제가 될 수 있다. 비 천연 염기, 종결인자, 또는 폴리머라제의 결합 부위로의 처리성을 정상적으로 감소시킬 수 있는 단백질의 회합을 이용함으로서 Koff를 감소시킬 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 폴리머라제는 단일 유형의 폴리머라제일 수 있거나, 또는 다양한 유형의 폴리머라제의 조합일 수 있다. 일반적으로, 상업화된 보다 처리성의 폴리머라제는 보다 낮은 혼입 오차율을 갖고, 이에 따라 고도 처리성 폴리머라제를 주로 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 한 유형의 폴리머라제가 또 다른 유형의 폴리머라제보다 유의하게 더 긴 Koff를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 폴리머라제가 적절한 경우에 임의의 염기를 혼입할 수 있도록, 분리된 임의의 보다 고도 처리성 (더 긴 Koff) 폴리머라제를 치환할 수 있는 보다 짧은 Koff 폴리머라제를 갖는 것이 또한 적절할 수 있다. 이에 따라, 덜 처리성의 Koff가 혼입 유체 주기에 할당된 기간 미만인 것이 적절할 수 있고, 폴리머라제가 혼입에 이용 가능할 것임을 확실하게 하기 위해 보다 처리성 폴리머라제가 연장 프라이머(들)의 결합 부위로부터 분리되어야 한다.
2종 이상의 유형의 폴리머라제를 사용하는 것이 바람직한 일부 실시양태에서, 보다 처리성의 폴리머라제가 연장될 프라이머에 우선적으로 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 덜 처리성의 폴리머라제를 첨가하기 전에 보다 처리성의 폴리머라제가 연장될 프라이머에 결합하도록 하는 것이 바람직할 수 있다 (그와 회합된 ssDNA 및 또는 dsDNA 결합 모이어티를 가질 수 있음). 다른 실시양태에서, 폴리머라제가 ssDNA 또는 dsDNA의 일부에 직접 결합할 수 있도록, 결합 모이어티가 폴리머라제에 첨가될 수 있도록 상기 폴리머라제를 변형시키거나 돌연변이시키는 것이 바람직할 수 있다.
폴리머라제의 비축은 주기적으로 재보충될 수 있다. 상기 보충은 모든 혼입 주기와 함께 일어날 수 있거나, 또는 적절한 횟수의 혼입 주기가 일어난 후에 일어날 수 있다. 보충 사이의 주기의 수는 비축 방법에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 비축 방법이 랜덤 프라이머 상의 저장인 경우, 가닥 치환 또는 랜덤 프라이머의 5'→3' 엑소뉴클레아제 소화를 이용하여, 상기 랜덤 프라이머가 폴리머라제에 의해 치환될 수 있으므로, 비축 위치의 수는 범용 또는 표적화 프라이머의 연장에 의해 감소된다. 예를 들어, 제2 결합 메커니즘이 이중 가닥 DNA에 결합하기 위해 존재하는 경우, 비축된 폴리머라제의 수는 유지될 수 있다.
특정 실시양태에서, 방법은 신호의 손실에 대한 반응을 모니터링하고, 서열분석 신호를 회복하기 위해 재위상화하는 것을 포함한다. 예를 들어, 예로서 단일 염기에 대해 예상된 것보다 더 적을 수 있으나 지상 오차가 존재했을 경우에 예상될 신호 수준이 나타나거나, 또는 단일 염기에 대해 관찰된 신호 수준의 감소가 나타난 경우, 서열분석 반응으로부터의 데이터가 모니터링될 수 있고, 필요하다고 관찰되는 경우에 재위상화가 수행될 수 있다. 상기 관찰은 신호가 지상 오차로부터 통계적으로 유래할지의 여부를 결정하는데 있어서 명목상 서열을 고려할 수 있다. 상기 관찰은 서열분석 유체 주기 또는 일련의 서열분석 유체 주기에 대한 신호 수준의 히스토그램을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재위상화는 4개의 혼입가능한 뉴클레오티드를 사용하는 것들, 뿐만 아니라 탈위상화를 최소화하는 것과 관련하여 상기 기재된 모든 것들을 비롯하여, 모든 클론 서열분석 시스템에 대해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재위상화는 에멀젼 PCR, 또는 대안적으로 본원에 기재된 자기 또는 비드 어레이와 관련하여, 임의로 전자적 서열분석과 관련하여 수행된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 각 위치에 대한 각 주기에 대한 예상 배경 수준을 결정하기 위해 초기 및/또는 후기 데이터를 사용함으로써 위상 오차를 감소시키기 위해 보정이 수행될 수 있다. 서열 문맥에서의 각각의 염기에 있어서, 각각의 염기에 대해 예상된 위상 오차, 및 미리 결정된 지상 및 진상 오차의 양을 이용하여 실제 염기를 결정하는 것을 보조할 수 있다. 상기 오차 수정은 또한 어레이 상의 인접 반응으로부터의 위상 오차, 뿐만 아니라 각각의 센서로부터 수신된 신호에 대한 인접 반응의 영향을 고려할 수 있다.
일부 실시양태에서, 진상 및 지상 오차 사이의 분포는 한 유형의 위상 오차가 다른 유형의 위상 오차 보다 더 높은 비율로 발생할 수 있도록 영향을 받는다. 한 실시양태에서, 지상 오차가 진상 오차보다 더 가능성이 있도록, dNTPS의 농축이 제한될 수 있다. 추가 실시양태에서, 이어서 보다 가능한 위상 오차 유형에 대해 수정하기 위해 재위상화가 수행될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 위상 오차의 두 유형 모두에 대해 수정하기 수행되며, 여기서 상기 방법은 하나의 위상 오차 유형에 대해 수정하고, 이어서 다른 유형의 위상 오차에 대해 수정한다. 위상 수정에 대한 상기 방법(들)은 서열 과정을 통하여 주기적으로 반복될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재위상화에 대한 유체 패턴은 고정될 수 있다. 예를 들어, 고정된 패턴은 수행되는 재위상화 방법 사이에 고정된 횟수의 유체 서열분석 주기를 가질 수 있거나, 또는 유체 서열분석 주기의 수는 예를 들어 수행되는 재위상화 방법 사이의 유체 서열분석 주기의 수를 감소시킴으로써 서열분석 과정 동안 변화할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 병렬 또는 클론 폴리뉴클레오티드 서열분석에서 진상 오차를 감소시키는 방법을 제공한다. 이러한 측면에 따른 방법은 경쟁적 반응의 존재 하에 폴리뉴클레오티드 집단을 서열분석하는 것을 포함한다. 경쟁적 반응은 4개의 모든 뉴클레오티드 염기에 대한 뉴클레오티드 염기 또는 뉴클레오티드 유도체를 포함하며, 여기서 4개의 뉴클레오티드 염기 중 3개는 성장하는 폴리뉴클레오티드 가닥으로 혼입 불가능하다. 서열분석은 폴리뉴클레오티드 집단의 어레이 (예를 들어, 비드 어레이)의 클론 서열분석, 뉴클레오티드 혼입의 전자적 검출, 및 서열분석 반응 성분을 단리 또는 농축하기 위한 전자 웰 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서 혼입 불가능한 뉴클레오티드는 (비제한적으로) PNA 뉴클레오티드, LNA 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 아데닌 모노포스페이트, 아데닌 디포스페이트, 아데노신, 데옥시아데노신, 구아닌 모노포스페이트, 구아닌 디포스페이트 구아노신, 데옥시구아노신, 티민 모노포스페이트, 티민 디포스페이트 5-메틸우리딘, 티미딘, 시토신 모노포스페이트, 시토신 디포스페이트 시티딘, 데옥시시티딘, 우라실 모노포스페이트, 우라실 디포스페이트, 우리딘 및 데옥시우리딘으로부터 선택될 수 있다. 일반적으로, 혼입 불가능한 뉴클레오티드는 폴리머라제에 의해 결합되지만, 폴리머라제에 의해 성장하는 폴리뉴클레오티드 가닥으로 혼입되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 혼입 불가능한 뉴클레오티드의 농축은 혼입 불가능한 뉴클레오티드 각각에 대한 폴리머라제 활성에 비례한다. 상기 혼입 불가능한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체는 표지되지 않을 수 있거나, 광학적으로 표지될 수 있거나, 또는 전하 표지될 수 있다.
일부 실시양태에서, 혼입가능한 dNTP의 농축은 진상 및 지상 오차율 둘 다에서의 감소를 허용하면서, 혼입가능한 dNTP의 농축과 비례하여 증가될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 주형의 집단에서 지상 오차를 감소시키는 방법을 제공한다. 방법은 서열분석 반응 동안 표적 폴리뉴클레오티드에 또는 근처에 폴리머라제 효소를 비축하여 폴리머라제가 각각의 또는 실질적으로 각각의 활성 중합 부위에 대해 이용가능하도록 하는 것을 포함한다.
대안적으로 또는 추가로, 본 방법은 복구 단백질 또는 단일 가닥 DNA 결합 단백질을 표적 폴리뉴클레오티드에 결합시켜, 다른 것들 중 2차 구조를 제거하거나 진행성을 돕는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다르게는 폴리머라제 활성을 방해하여 지상 오차를 일으킬 수 있는 단일 가닥 DNA의 2차 구조를 감소시키는 것이 필요할 수 있다. 한 실시양태에서, 단일 가닥 DNA에 결합하는 단백질을 사용한다. 그러한 단백질에는 복구 단백질, 예컨대 박테리아 RecA DNA 복구 단백질, HIV 뉴클레오캡시드 단백질, T4 박테리오파지 유전자 산물 32, 송아지 흉선 UP1, 엡스타인-바르 바이러스 BALF2, 또는 시판되는 단일 가닥 결합 단백질, 예컨대 에피센터(Epicentre) E. 콜라이 단일 가닥 결합 단백질, 및 또한 기타 다수가 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 단일 가닥 결합 단백질은 또한 폴리머라제의 진행성을 돕는 역할을 할 수 있다. 다른 실시양태에서, 또한, 다른 모이어티, 예컨대 엡스타인-바르 바이러스 BMRF1, 삼중나선 S. 세레비지아에 증식 세포 핵 항원, T4 박테리오파지 유전자 산물 45, 티오레독신 E. 콜라이 PolIII 완전효소, 진핵 클램프 단백질 PCNA, 또는 다른 DNA 슬라이딩 클램프 단백질, 또는 다른 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA 결합 모이어티가 폴리머라제의 진행성을 도울 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리머라제 진행성은 폴리머라제에 대한 돌연변이, 예컨대 여러 가능성 중 Phi29 폴리머라제로의 나선-헤어핀-나선 도메인의 부가, 또는 살라스(Salas) 등의 문헌 [PNAS 107 16506]에 기재된 바와 같은 키메라(chimerical) 폴리머라제의 사용, 티오레독신 결합 도메인의 부가, 고세균성 슬라이딩 클램프, DNA 결합 단백질 Sso7d, 아연 핑거 도메인, 류신 지퍼의 부가에 의해 향상될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 추가 변형되어, 하나 초과의 진행성 향상 돌연변이, 예컨대 폴리머라제의 각각의 말단에 이중 가닥 및 단일 가닥 결합 모이어티 둘 다를 첨가한 돌연변이가 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 그러한 결합 모이어티는 또한 폴리머라제에 간접적으로 결합되어, 예를 들어 폴리머라제를 돌연변이시킴으로써 스트렙타비딘 모이어티를 첨가하고, 돌연변이를 통해 비오틴 모이어티를 상술한 바와 같은 단일 가닥 DNA 결합 모이어티 및/또는 이중 가닥 DNA 결합 모이어티에 첨가할 수 있다. 따라서, 폴리머라제는 스트렙타비딘 비오틴 결합을 통해 단일 또는 이중 가닥 DNA 결합 모이어티에 결합되고, 추가로 상기 단일 또는 이중 가닥 결합 모이어티를 통해 DNA에 결합될 것이다. 다른 실시양태에서, 다른 결합 모이어티를 이용하여 폴리머라제를 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 결합 모이어티에 결합시키고, 여기서 추가의 모이어티가 돌연변이를 통해 폴리머라제 및 단일 또는 이중 가닥 결합 모이어티 각각에 첨가될 수 있고, 여기서 폴리머라제 및 단일 또는 이중 가닥 결합 모이어티에 첨가된 추가의 모이어티는 상호 결합 친화도를 갖는다. 추가 실시양태에서, 모이어티는 돌연변이를 통해 폴리머라제, 단일 가닥 DNA 결합 모이어티 및 이중 가닥 DNA 결합 모이어티 중 하나에 첨가될 수 있고, 여기서 돌연변이를 통해 첨가된 모이어티는 이어서 또 다른 폴리머라제, 단일 가닥 DNA 결합 모이어티 및 이중 가닥 DNA 결합 모이어티에 결합되어 폴리머라제가 단일 또는 이중 가닥 DNA 결합 모이어티에 결합되게 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 비축은 비-연장가능 프라미어에 대한 폴리머라제의 결합을 이용하여 달성된다. 특정 실시양태에서, 비-연장가능 프라이머는 폴리머라제의 3' 엑소뉴클레아제 활성에 영향을 받지 않는다. 일부 실시양태에서의 비-연장가능 프라이머는 3' 종결 랜덤 프라이머이고, 연장 프라이머는 범용 또는 표적화 프라이머이다. 폴리머라제는 랜덤 프라이머의 3' 종결된 말단, 뿐만 아니라 범용 또는 표적화 프라이머의 3' 말단에 결합한다. 예를 들어, 3' 종결 프라이머는 3' 종결 위치에 티오포스페이트 뉴클레오티드를 포함함으로써, 상기 3' 종결 프라이머가 3' → 5' 엑소뉴클레아제 활성에 저항성이 되게 할 수 있다.
이러한 측면에 따른 서열분석은 폴리뉴클레오티드 집단의 어레이 (예를 들어, 비드 어레이)의 클론 서열분석, 뉴클레오티드 혼입의 전자적 검출, 및 서열분석 반응 성분을 단리 또는 농축하기 위한 전자 웰 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
전자적 서열분석과 관련하여, 일부 실시양태에서, 합성에 최적인 것보다 낮은 이온 농도를 이용하여, 검출기의 운전을 개선하기에 충분히 낮은 이온 농도를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 이는 위상 오차를 일으키고, 목적하는 것보다 짧은 서열 길이를 초래할 수 있다. 상기 낮은 이온 농도로 가능한 서열 길이보다 긴 서열 길이를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 검출에 최적인 조건과 합성에 최적인 조건을 교대함으로써 효과적인 판독 길이를 증가시킨다. 예를 들어, 본 방법은 상기 DNA 연장 반응의 최적의 판독에 필요한 낮은 이온성 농도를 이용하면서 가능한 전장에 대해 서열분석 반응을 수행하고, 연장된 프라이머 가닥을 용융 제거하고, 신규한 프라이머 및 dNTP를 도입하고, 합성에 최적인 이온 농도를 이용하면서 합성 반응을 진행시키는 것을 포함할 수 있다. 연장된 프라이머 가닥을 용융 제거하고, 신규한 프라이머 및 dNTP를 도입하고, 합성에 최적인 이온 농도를 이용하면서 합성 반응을 진행한 후, 검출에 적절한 조건으로 조건을 변화시키는 과정은, 이 과정이 더 이상 유용한 데이터를 생성하지 못할 때까지 여러 번 반복할 수 있다. 이용되는 합성 단계의 수를 결정하는 것은 통계적인 것일 수 있으므로, 상기 과정은 역전될 수 있고, 즉, 합성에 최적인 조건으로 합성을 수행한 후, 검출에 적절한 조건을 이용하여 합성을 수행하고, 이어서 연장된 프라이머 가닥을 용융 제거하고, 신규한 프라이머를 도입하고, 검출에 적절한 이온성 농도를 이용할 수 있다.
검출 감수성을 최적화하기 위해서, 적합한 효소 동역학에 바람직할 수 있는 농도보다 낮은 이온 및/또는 dNTP 농도가 바람직할 수 있다. 이는 목적하는 것보다 긴 혼입 시간 및/또는 큰 지상 오차를 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 혼입 주기 동안 하나 초과 농도의 dNTP를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 낮은 농도의 dNTP 및/또는 이온을 이용한 단일 혼입 주기를 수행하여 센서의 노이즈에 대한 감수성 및 신호를 최적화하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, dNTP 및/또는 이온 농도가 낮은 용액을 유동 셀로 유동시켜 측정이 이루어질 수 있다. 이어서, 즉시 연장된 프라이머로의 혼입에 최적인 dNTP 및/또는 이온 농도를 갖는 용액을 이용하여 최소의 탈위상화가 발생하게 할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 고농도의 dNTP를 유동 셀로 유동시켜 신속한 최적의 혼입 반응을 일으키면서 최소의 탈위상화를 제공할 수 있다. 이어서, 신속하게 dNTP가 적거나 없으며 적절하게 낮은 이온 농도를 갖는 시약 용액을 이용하여 최적의 센서 판독을 얻을 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 뉴클레오티드의 신속한 혼입을 위해 최적 농도의 dNTP 및/또는 이온을 갖는 시약 용액을 유동 셀로 유동시켜, dNTP의 상당 부분을 필요에 따라 다양한 콜로니에 혼입시키고, 이 후 매우 신속하게 최적의 센서 판독에 최적인 시약 용액을 유동 셀로 유동시킨 후, 다양한 프라이머의 연장된 프라이머로의 뉴클레오티드의 혼입에 적절한 농도의 dNTP 및/또는 이온 농도를 갖는 시약 용액을 유동 셀로 유동시킬 수 있다. 제1 시약 용액은, 연장된 시간 간격에 사용될 시약 용액의 뉴클레오티드 농도보다 충분히 높을 수 있는 뉴클레오티드 농도를 가질 수 있고, 폴리머라제 혼입 오류는 현저한 수준으로 일어날 수 있다.
폴리머라제 효율이 각 염기마다 상이할 수 있으므로, 다양한 농도의 다양한 dNTP, 다양한 완충제, 다양한 양이온 농도, 다양한 농도의 폴리머라제, 다양한 유형의 폴리머라제 또는 이들의 임의의 조합을 이용하여 혼입 비율을 최적화하고, 위상 오차의 정도를 최소화하고, 혼입 오류의 정도를 최소화하며, 판독 길이를 최대화하는 것이 바람직할 수 있다.
특정 실시양태에서, 다양한 뉴클레오티드 또는 혼입 불가능한 뉴클레오티드 유사체의 농축 수준을 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 각각에 대한 상대적인 폴리머라제 활성과 매칭시킨다. 예를 들어, dTTP 결합 비율은 다른 뉴클레오티드와 관련된 2 초과의 요인에 의해 상이한 것으로 측정되었다. 다른 3개의 뉴클레오티드는 그의 폴리머라제 결합 비율과 더 많이 인접할 수 있지만, 여전히 서로 10 퍼센트 넘게 상이하다. 이러한 차이는, 고유의 뉴클레오티드에 대해 다양한 혼입 불가능한 뉴클레오티드 유사체에 대한 폴리머라제 결합 비율을 비교할 때 더 커질 수 있다.
추가 실시양태에서, 동등한 폴리머라제 연장에 필요한 혼입 불가능한 뉴클레오티드의 농도는, 혼입 불가능한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 사용하지 않는 서열분석 반응에 제공될 수 있는 하나 이상의 혼입 가능한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체에 대해 최소의 탈위상화를 갖는 최적의 프라이머 연장을 위한 농도보다 높거나, 같거나, 낮으며, 이는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 오혼입 가능성을 혼입 불가능한 뉴클레오티드 유사체의 농도가 폴리머라제 연장 효율에 매칭되도록 제공되는 경우나 혼입 불가능한 뉴클레오티드 유사체가 혼입 가능한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체에 비해 낮은 폴리머라제 연장 효율을 갖는 농도로 제공되는 경우보다 낮게 한다. 대안적으로, 혼입 불가능한 뉴클레오티드 유사체는 혼입 가능한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체에 비해 낮은 폴리머라제 결합 비율을 갖는 농도로 제공됨으로써, 반응이, 혼입 불가능한 뉴클레오티드의 폴리머라제 결합 비율이 혼입 가능한 뉴클레오티드 유사체 결합 비율과 동일하거나 높은 경우에 일어나는 것보다 높은 비율로 진행될 수 있게 할 수 있다.
다른 실시양태에서, 제공된 혼입 가능한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 농도는, 다양한 dNTP에 대한 혼입 비율이 좀 더 동일할 수 있도록 변경될 수 있다. 농도는 필요한 경우 다양한 완충제 조건, pH, 폴리머라제, 및 임의의 폴리머라제 클램프 복합체 또는 폴리머라제를 안정화시키는 데 사용될 수 있는 다른 모이어티와의 상호작용에 대해 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 혼입 불가능한 뉴클레오티드는 핵염기의 혼입을 유발하지 않는 시약 세트의 일부로 사용된다. 그러한 시약 세트는, 예를 들어 혼입 가능한 핵염기의 신규 세트의 도입 전에 혼입 가능한 핵염기의 이전 세트를 세척 제거할 수 있다. 또한, 그러한 세척 단계는 트리포스페이트 핵염기를 디포스페이트 또는 모노포스페이트로 분해시키는 포스파타제를 포함할 수 있어, 임의의 나머지 트리포스페이트는 분해되어 혼입 불가능해질 것이다. 혼입 불가능한 핵염기는 폴리머라제의 포켓에서 다음 염기에 상보적인 위치를 차지할 수 있고, 이는, 폴리머라제의 엄지영역(thumb)을 여전히 닫혀있게 하여 혼입 불가능한 핵염기의 혼입을 시도하고 DNA로부터 상기 폴리머라제의 해리를 감소시킴으로써 폴리머라제의 진행성을 효과적으로 증가시키는 역할을 할 수 있다.
상기 접근법을 3개의 혼입 불가능한 뉴클레오티드 유사체 및 1개의 혼입 가능한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 존재할 수 있는 반응 조건, 또는 2개의 혼입 불가능한 뉴클레오티드 유사체 및 2개의 혼입 가능한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 존재할 수 있는 반응 조건, 또는 1개의 혼입 불가능한 뉴클레오티드 유사체 및 3개의 혼입 가능한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 존재할 수 있는 반응 조건에 대해 이용할 수 있다.
상기 반응 조건 및 혼입 불가능한 뉴클레오티드 유사체와 함께 사용될 수 있는 검출 방법은 혼입 또는 혼입 사건의 임의의 형태의 전자적 감지, 예컨대 ISFET, CHEMFET, 나노니들, 나노브릿지, 화학발광 검출, 형광 검출, 예컨대 Qdot 또는 다른 비표준 형광단의 검출, 및 삽입 형광단의 검출, 형광원 잔기를 사용한 검출을 포함할 수 있다.
비드 어레이 및 전자적 서열분석 (본원에 기재된 것과 같음)을 이용하는 본 발명의 추가 실시양태에서, 공(null) 비드 또는 공 센서 영역 (관련된 콜로니를 갖지 않는 센서 영역)을 참조용으로 사용할 수 있으며; 이는 온도의 변화, 벌크 시약의 전도도 또는 pH의 변화, 또는 전도도 또는 pH에서의 국부적인 변화를 보완할 수 있다. 시스템의 제어는 위상 오차의 제한 및 확인을 보조하며, 이에 의해 판독 길이를 연장시킬 것이다.
FET pH 센서에 대한 통상의 실시는 기준 전극을 사용하는 것이며; FET pH 센서의 어레이에 대한 몇몇 설계는 각 검출 채널에 대한 참조 채널을 사용하며; 다른 것은 일련의 검출 채널에 대한 참조 채널을 갖는다. 그러나, 검출기의 국부적인 pH는 DNA 콜로니의 존재에 영향을 받으며, 제2 가닥의 DNA의 길이의 변화는 중합 반응에 의해 연장된다. 단일 유형의 뉴클레오티드가 한꺼번에 유동 셀에 도입된다는 화학적 성질의 사용에서, 대부분의 검출기 채널은 그 검출기에서 일어나는 반응을 갖지 않을 것이며; 실제로 대부분의 검출기 채널은 발생하는 반응을 갖지 않을 것이다. 따라서, 한 실시양태에서 이웃하는 검출기를 참조 채널로서 사용하여, 이웃하는 검출기인 검출기 내에서 중합 반응이 일어나는 검출기로 변화하는 pH 또는 이온 농도를 측정하는 기회를 데이터 분석 알고리즘에 제공한다. 이는 관심있는 검출기에 국부적인 pH 또는 이온 농도 수준의 검출, 또는 다른 노이즈 공급원의 검출을 허용하며, 또한 크로스토크(crosstalk)의 검출을 허용하여, 크로스토크 디컨볼루션 기능을 모니터링 및 변형하도록 할 수 있다.
특정 실시양태에서, 공 비드 (DNA 콜로니를 갖지 않거나, 또는 합성 반응에 의한 서열분석을 위해 사용되는 것과 동일한 프라이머를 갖지 않는 콜로니를 가짐)를 사용하여 몇몇 검출기가 거기에서 발생하는 중합 반응을 갖지 않는 것을 보장하도록 할 수 있다. 적절한 프라이머를 갖는 DNA의 콜로니를 갖는 비드를 유동 셀에 도입하여, 검출기 상의 랜덤 세트의 위치에 놓을 수 있다. 후속적으로, 앞서 기재된 것과 같은 일련의 공 비드를 유동 셀에 도입함으로써, 공 비드가 유동 셀에 이미 존재하는 비드에 의해 이미 점유되지 않은 랜덤 위치를 점유하도록 할 수 있다. 시약을 유동 셀에 도입하고, 이어서 공 비드를 사용하여 pH 및/또는 이온 농도 수준을 모니터링하여, 분석 알고리즘이 백그라운드 수준 및/또는 크로스토크 디컨볼루션 기능을 보다 수월하게 측정할 수 있도록 한다.
또 다른 실시양태에서, 공 비드는 샘플 비드와 함께 쌍으로 도입되며, 신호는 차동 증폭기를 사용하여 측정되어, 백그라운드 및 크로스토크의 변화를 직접적으로 디컨볼루션하기 위한 분석 알고리즘의 필요를 제거한다.
또 다른 실시양태에서, 현재 유체 주기에서의 혼입 반응을 갖지 않는 인접 비드 또는 센서 영역을 참조로서 사용할 수 있다. 큰 집단의 상이한 서열의 서열분석시 평균적으로 대부분의 비드 또는 센서 영역이 혼입 반응을 갖지 않기 때문에, 혼입 반응이 없는 이들 위치를 추가적으로 참조용으로 사용할 수 있다. 참조로서, 혼입 반응이 없는 비드 또는 센서 영역은 또한 비어있는 센서 또는 공 비드에 비해 우수한 참조를 제공할 수 있는데, DNA 폴리머라제 및 비드가 관심있는 공간에 존재하며 표면 화학 및 생성된 백그라운드 반대 이온 농도에서의 임의의 변화가 보다 잘 매칭될 것이기 때문이다. 비드 또는 센서 영역 상의 상이한 콜로니는 다른 비드 및/또는 센서 영역과 관련된 콜로니 DNA 또는 연장된 프라이머의 길이와는 상이한 길이의 콜로니 DNA 및/또는 연장된 프라이머를 가질 수 있으며, 이에 따라 센서와 상호작용할 수 있도록 존재하는 상이한 양의 전하를 가질 확률이 크다.
이에 따라, 본 발명의 일부 실시양태에서, 소프트웨어는 센서와 관련된 DNA 및/또는 연장된 프라이머의 상대적 길이, 및 생성된 상이한 전하 및 신호 수준, 및 또한 영향을 줄 수 있는 센서에 대한 비드 또는 콜로니의 위치에 대한 보완을 필요로할 수 있다. 소프트웨어는 상기 센서에의 비드의 도입 이전의 각 센서와 관련된 신호 수준; 비드의 도입 이후, 그러나 프라이머 및/또는 폴리머라제의 도입 이전의 각 센서와 관련된 신호 수준; 프라이머 및/또는 폴리머라제의 도입 이후, 그러나 합성 반응에 의한 서열 분석에서의 제1 뉴클레오티드의 도입 이전의 각 센서와 관련된 신호 수준; 프라이머 없는 콜로니와 관련된 신호 수준; 상이한 길이의 DNA를 가질 수 있는 콜로니와 관련된 신호 수준; 및 상이한 길이의 DNA를 가질 수 있는 혼성화 프라이머를 갖는 콜로니와 관련된 신호 수준의 기록을 보존할 수 있다. 소프트웨어는 얼마나 많은 염기가 각 프라이머에 추가되는지를 추적할 수 있다. 신호 수준은 절대 수준이거나 또는 상이한 센서 사이의 상대 수준일 수 있다. 소프트웨어는 개개의 센서에 대한 신호 수준을 측정하기 위한 참조로서의 다양한 인접 또는 근접 센서를 사용하여, 각 세트의 콜로니에 대한 DNA의 길이, 연장된 프라이머의 길이, 및 센서에 대한 비드 또는 콜로니의 위치결정의 결과로서 생성될 수 있는 신호 수준을 보완할 수 있다. 또한, 소프트웨어는 dNTP를 갖지 않는 시약 부피와 dNTP를 갖는 시약 부피 사이의 전이에 대한 센서의 상대적 위치를 보완할 수 있다. 추가적으로, 소프트웨어는 확산의 기능으로서의 dNTP 농도의 변화, 및/또는 연장된 프라이머로의 혼입의 결과로서의 dNTP 농도 고갈을 보완할 수 있다. 확산의 양은 동일한 서열분석 실행 또는 이전 서열분석 실행으로부터 일 수 있는 동일한 칩으로부터의 초기의 데이터로부터, 또는 동일한 기기 상에서 이용된 이전 칩 또는 다른 기기 상에서 이용된 다른 칩으로부터의 서열분석 데이터로부터 특성분석될 수 있다. 예상되는 고갈 수준은 유동 셀을 통해 이동하는 dNTP를 갖지 않는 시약 부피 및 dNTP를 갖는 시약 부피 사이의 전이로서 생성된 데이터를 기초로 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 공지된 서열을 갖거나 또는 상이한 공지된 서열을 갖는 대조 비드가 사용된다. 공지된 서열은 상이한 공지된 길이의 단독중합체 실행을 가질 수 있으며, 알려지지 않은 길이의 단독중합체 실행의 길이를 보다 잘 측정하기 위한 시스템의 반응을 보정하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 공지된 서열은 신호 또는 백그라운드 신호의 수준의 측정에서 유용할 수 있는데, 연장된 프라이머의 길이 및 혼입 사건이 발생하는지의 여부가 미리 공지되어 있기 때문이다. 대조 비드는 기기 문제를 샘플 정제용 문제로부터 구별하기 위해 사용할 수 있다. 공지된 서열을 갖는 대조 비드는 시스템의 외부에서 생성되며, 그에 부착된 DNA의 콜로니와 함께 도입될 수 있거나, 또는 대조 DNA는 비드 상에 DNA 콜로니를 생성하기 이전 또는 이후에 샘플 DNA와 혼합되거나 또는 샘플 DNA에 도입될 수 있거나, 또는 달리 센서와 결합되도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인접 비드로부터의 표준화와 함께 사용하기 위하여 본원에서 기재된 것과 유사한 방식으로 신호 수준을 모니터링 및 보관할 수 있다.
광학 수차와 유사한 방식으로, 검출기에 의해 검출되는 종의 확산은 상이한 검출기 간의 크로스토크를 유발할 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 어레이 상의 상이한 센서로부터 취해진 데이터의 디컨볼루션은 광학 시스템으로부터의 점상 강도 분포 함수를 디컨볼루션하기 위해 사용되는 것과 유사한 방식으로 수행될 수 있다. 사용되는 디컨볼루션 기능은 부분적으로는 검출 시점에서의 유동 셀의 온도, 및 또한 유동 셀을 통한 유속에 의존할 수 있으며, 이는 특정 콜로니의 보다 많은 크로스토크 "하향"을 유발하는 경향이 있다. 상기 디컨볼루션을 위해 이용되는 디컨볼루션 기능은 고정된 디컨볼루션 기능일 수 있거나, 또는 최적합 알고리즘의 일부로서 유도될 수 있다.
센서 어레이는 자가 보정하도록 제조되어, 증폭 효율, 비드 크기 및 로딩, 센서 상의 비드 배치 등과 같은 변수에 대한 보정을 가능하도록 한다. 일반적으로, DNA 샘플을 증폭하여 비드 상에 DNA의 모노클로날 집단을 생성하는 단계에서, 제1 프라이머를 상기 증폭 반응 이전에 샘플 DNA와 라이게이션할 수 있다. 서열분석 과정에서, 상기 DNA 샘플에 라이게이션된 상기 제1 프라이머와 상보적인 제2 프라이머가 제공된다. 상기 제2 프라이머는 상기 제1 프라이머에 비해 짧은 몇개의 염기일 수 있다. 따라서, 각각의 모노클로날 비드는 증폭 효율과 무관한 밀도의 공지된 초기 서열을 가지며, 이는 상기 상보적 제2 프라이머에 의해 매칭되지 않는 상기 제1 프라이머의 부분이 될 것이다. 이는 염기 서열에 관한 사전 지식을 허용할 수 있으며, 공지된 길이의 단독중합체 실행과 같은 보정 서열을 포함할 수 있다.
대안적 실시양태에서, 그러한 보정은 서열분석 반응이 완료된 이후에 일어날 수 있거나, 또는 다르게는 다양한 염기가 서열분석 반응에서 서열분석된 이후에 일어날 수 있다. 통계적으로, 서열분석 반응에서의 대부분의 유체 주기는 개개의 비드에서의 염기 혼입을 유발하지 않을 것이다. 유체 주기로부터의 이후의 대부분의 공통된 결과는 단일 염기의 혼입일 것이다. 따라서, 데이터 세트를 분석할 수 있으며, 적절한 신호 수준을 각 비드에 대해 설정할 수 있다.
추가 실시양태에서, 비드 상의 클론 집단 중 일부의 손실, 비드 상의 클론 집단 중 일부의 위상 진상 또는 지상의 서열분석 또는 다른 인자와 같은 인자의 결과로서, 서열분석 과정 동안의 유체 주기 감소에서의 염기 혼입에 대한 신호 수준, 및 유체 주기에서의 염기 혼입을 갖지 않는 것에 대한 백그라운드로서 상시 보완/보정이 수행될 수 있다. 이에 따라, 신호 수준은 얼마나 큰 신호가 단일 염기 혼입되거나, 염기 혼입이 없거나, 또는 단독중합체 실행으로 인한 다중 염기 혼입된 유체 주기 동안에 예상될 수 있는지에 관해 서열분석 과정에서의 각 지점에서 산출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 역상 정렬이 수행될 수 있으며, 여기서 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라제가 적어도 1개의 dNTP가 누락된 dNTP 풀과 함께 사용된다. 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라제는 제공된 dNTP 풀에서의 dNTP 이후의 염기를 제거할 것이며, 이 지점에서 평형이 달성되며 추가의 뉴클레오티드가 제거되지는 않을 것이다. 이는 진상 오차로 인해 혼입되는 임의의 염기를 제거하기 위해 수행될 수 있다. 다른 실시양태에서, 엑소뉴클레아제 활성을 허용하지 않는 1개 이상의 염기 유형, 예컨대 티오포스페이트 뉴클레오티드가 혼입될 수 있다. 이어서, 엑소뉴클레아제 활성은 혼입 불가능한 뉴클레오티드의 제거에 사용되어, 엑소뉴클레아제 활성에 대한 동역학을 개선시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 초기 혼입은 엑소- 폴리머라제, 이어서 엑소+ 폴리머라제 또는 또 다른 뉴클레아제를 사용하여 수행되어, 뉴클레아제 활성에 저항성인 임의의 염기를 다른 뉴클레오티드 또는 티오포스페이트 뉴클레오티드에서 제거할 수 있다.
단일 및/또는 반복된 폴리뉴클레오티드 서열분석
또 다른 측면에서, 본 발명은 반복된 및/또는 단일 폴리뉴클레오티드 서열분석을 위한 방법을 제공한다. 이러한 측면에서의 방법은 원형화된 DNA 서열분석 주형을 제공하는 단계, 및 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제에 의해 뉴클레오티드 혼입 서열을 결정함으로써 주형을 서열분석하는 단계를 포함한다. 이러한 측면에 따른 서열분석은 폴리뉴클레오티드 집단 어레이 (예를 들어, 비드 어레이)의 클론 서열분석, 뉴클레오티드 혼입의 전자적 검출, 및 서열분석 반응 성분을 단리 또는 농축하기 위한 전자 웰 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, DNA 폴리머라제는 고도 처리성이고, 감소된 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다. 추가로, DNA 폴리머라제는 뉴클레오티드의 혼입을 측정하도록 맞춰진 바이오센서 상에 또는 근처에 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열분석 전에 폴리머라제를 폴리뉴클레오티드에 미리 결합시키는 것을 포함한다. 이러한 측면에 따라, 본 발명은 위상화 또는 재위상화를 보정할 필요를 피한다.
단일 DNA 분자는 나노니들 바이오센서 (본원에 자세하게 기재되어 있음)에 의해 서열분석될 수 있다. 폴리머라제 효소가 상기 센서에 부착된다. DNA 샘플 연관 프라이머는 이어서, 예를 들어 압력 유도 유동, 전기-삼투 유도 유동 및 또는 이동, 또는 유사한 수단을 이용하여, 폴리머라제 부착 센서를 갖는 부피 내에 진입될 수 있다. DNA 샘플로부터의 단일 분자는 이어서 센서 어레이에서 센서에 부착된 폴리머라제에 의해 결합될 수 있다. 추가의 단일 DNA 분자는 또한 센서 어레이에서 다른 센서에 결합된 다른 폴리머라제에 의해 결합될 수 있다.
동일한 DNA 샘플의 반복 측정을 가능하게 하기 위해, DNA 샘플은 원형화될 수 있고, 폴리머라제는 가닥 치환 폴리머라제일 수 있다. 따라서, 완전히 원형 DNA 샘플 둘레로 다중 주기 동안 프라이머 연장 반응을 지속시켜, DNA 샘플은 반복해서 서열분석될 수 있다. 상기 가닥에 대한 데이터는 이어서 감소된 데이터 프로세싱을 사용하여 보다 정확한 컨센서스 서열 내로 전환될 수 있다. 형광단 검출을 이용한 시스템에 대한 독특한 장점에 있어, 이러한 측면에서의 시스템은 폴리머라제의 판독 길이의 최대 능력을 사용하며, 이는 광독성에 의해 감소된 판독 길이를 가짐으로써 아무 방해를 받지 않는다.
단일 분자는 집단이 1개인 모노클로날 집단의 경우이다. 이와 같이, 모노클로날 DNA에 관련된다는 생각은 또한 전형적으로 단일 분자 조건 상황에 적용된다.
도 25는 장치 및 방법을 나타내고 예시하며, 이에 의해 단일 DNA 분자 (2507)는 나노니들 바이오센서 어레이 (2500)에 의해 서열분석될 수 있다. 폴리머라제 효소 (2506)는 센서 (2501)에 부착될 수 있다. DNA 샘플 연관 프라이머는 이어서, 예를 들어 압력 유도 유동, 전기영동 유도 유동 및 또는 이동, 또는 유사한 수단을 이용하여, 상기 폴리머라제 부착 센서를 갖는 부피 내에 진입될 수 있다. DNA 샘플 (2507)로부터의 단일 분자는 이어서 센서 어레이 (2500)에서 센서 (2501)에 부착된 폴리머라제에 의해 결합될 수 있다. 추가의 단일 DNA 분자 (2507)는 또한 센서 어레이 (2500)에서 센서 (2501)에 결합된 다른 폴리머라제 (2506)에 의해 결합될 수 있다.
한 실시양태에서, 4개의 자연 dNTP (2502) 중 1개는 이어서 센서를 갖는 채널 부피 (2504) 내로 흘러들어갈 수 있다. dNTP가 샘플 DNA (2507)에서 다음 염기에 상보적인 경우, 이것은 결합되거나 혼입될 수 있다. 이어서, 센서 어레이 (2500)의 각 적절한 위치에서 나노니들 센서 (2501)는 연장된 프라이머 DNA의 국부 전하에서 생성된 변화를 검출할 수 있으며, 이는 혼입 사건의 검출을 가능하게 한다. 샘플이, 상기 센서 (2501)를 갖는 채널 부피 (2504) 내로 도입되는 dNTP (2502)의 유형과 상보적인 열에서 1개 초과의 염기를 갖는 경우, dNTP (2502)의 제2 또는 후속 결합 및 혼입은 상기 나노니들 센서 (2501)에 의해 검출될 수 있다. dNTP (2502)는 이어서 센서 (2501)를 함유하는 채널 부피 (2504)의 밖으로 세척될 수 있다.
특정 실시양태에서, 4개의 천연 dNTP 중 1개는 이어서 센서를 갖는 부피 내로 흘러들어간다. dNTP가 샘플 DNA에서 다음 염기에 상보적인 경우, 이것은 결합되거나 혼입될 수 있다. 이어서, 센서 어레이의 각 적절한 위치에서 나노니들 센서는 국부 전하에서 생성된 변화를 검출할 수 있으며, 이는 연장된 프라이머 DNA의 전하 변화의 결과일 수 있거나 또는 다른 전하 변화의 결과일 수 있고, 이는 혼입 사건의 검출을 가능하게 한다. 샘플이, 상기 센서를 갖는 부피 내로 도입되는 dNTP의 유형과 상보적인 열에서 1개 초과의 염기를 갖는 경우, dNTP의 제2 또는 후속 결합 및 혼입은 상기 나노니들 센서에 의해 검출될 수 있다. dNTP는 이어서 센서를 함유하는 부피의 밖으로 세척될 수 있다.
상이한 dNTP는 이어서 센서 어레이 부피 내로 흘러들어갈 수 있으며, 이는 혼입 사건의 검출을 가능하게 한다. 후속 세척 주기, 4개의 dNTP 중 한번에 각 1개씩 도입, 및 혼입 사건의 검출은 상이한 샘플 DNA 서열의 결정을 가능하게 한다.
또 다른 실시양태에서, 4개 이하의 상이한 뉴클레오티드는 동시에 전달될 수 있고, 뉴클레오티드가 혼입된 것에 관한 결정은 혼입 반응과 연관된 동역학적 관찰에 의해 결정될 수 있다.
대안적 실시양태에서, 샘플 DNA는, 프라이머가 시스템 내로 도입되고 샘플 DNA와 혼성화되도록 한 후 결합된 폴리머라제가 샘플 DNA와 결합할 수 있는 센서와 충분히 근접한 센서 사이의 영역, 폴리머라제 또는 센서 중 하나와 결합할 수 있다. 후속적으로, 프라이머 연장의 완결 및 연관된 샘플 DNA 서열의 결정 후, 연장된 프라이머는 샘플 DNA가 용매화되어 있는 용액의 온도 또는 pH, 또는 상기 용액의 온도 또는 pH 둘 다를 변화시킴으로써 용융될 수 있다. 이어서, 프라이머를 재도입시키고, 샘플 DNA가 용매화되어 있는 용액의 온도 또는 pH를 프라이머 연장에 적절한 조건, 예를 들어 뉴클레오티드 및 양이온의 적절한 농도로 복구하여, 샘플을 재서열분석할 수 있다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 천연 dNTP일 수 있다. 다른 실시양태에서, dNTP는 전하 변경 구조를 사용하여 변경될 수 있다. 전하 변경 구조는 폴리포스페이트와 회합, 결합 또는 접합될 수 있고, 후속적으로 혼입 과정의 일부로서 절단되며, 이는 전하 변경 구조를 절단, 분리 또는 제거하는 분리 과정에 대한 필요를 제거한다.
대안적 실시양태에서, 전하 변경 구조는 종결인자이고, 따라서 dNTP의 당의 3' 위치에 회합, 결합 또는 접합되고, 따라서 이는 종결인자로서 작용할 수 있다. 검출은 혼입 과정의 결과로서 발생할 수 있거나, 또는 전하 변경 구조의 절단이 원인일 수 있다.
다른 실시양태에서, 전하 변경 구조는 dNTP 당의 2' 또는 4' 위치에 회합, 결합 또는 접합될 수 있다. 추가 실시양태에서, 전하 변경 구조는 뉴클레오티드의 염기에 회합, 결합 또는 접합될 수 있다. 전하 변경 구조는 종결인자로서 작용하고, 추가의 dNTP의 혼입을 예방할 수 있다.
연결, 회합 또는 접합은 물리적 과정, 예를 들어 온도 변화의 결과로서 깨질 수 있거나, 화학적 과정의 결과로서 깨질 수 있거나, 또는 광화학적 반응의 결과로서 깨질 수 있다. 연결, 회합 또는 접합은 각 뉴클레오티드 혼입 후에 깨질 수 있거나, 또는 몇몇 뉴클레오티드가 혼입될 수 있고, 혼입된 뉴클레오티드의 수는 상기 혼입(들)의 결과로서 추가되는 전하량의 측정 결과로서 결정될 수 있다.
추가 실시양태에서, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드는 한번에 사용되고, 이는 한번에 다중 염기의 첨가 및 상응하는 큰 신호를 가능하게 한다. 프라이머의 연장을 완료한 후, 데이터 수집과 관련하여, 연장된 프라이머를 용융시키고, 새로운 프라이머를 첨가하고, 상이한 순서의 dNTP 조합을 이용하여 연장 과정을 다시 수행할 수 있다. 이 과정은 혼입의 길이에 관한 정보와 함께, dNTP가 이전 세트의 dNTP의 완결에 뒤따르지 않는다는 것을 결정하며, 상기 길이 결정은 정확할 필요는 없다.
동일한 DNA 샘플의 반복된 측정을 가능하게 하기 위해, DNA 샘플은 원형화될 수 있고, 폴리머라제는 가닥 치환 폴리머라제일 수 있거나, 또는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라제일 수 있다. 따라서, 원형 DNA 샘플 둘레로 다중 주기 동안 프라이머 연장 반응을 지속시켜, DNA 샘플은 반복해서 서열분석될 수 있다. 형광단 검출을 이용한 시스템에 대한 독특한 장점에 있어, 본 발명의 특정 실시양태에서의 시스템은 폴리머라제의 판독 길이의 최대 능력을 사용할 수 있으며, 이는 광독성에 의해 감소된 판독 길이를 가짐으로써 아무 방해를 받지 않는다. 일부 실시양태에서, 가닥 치환 효소가 사용될 수 있으며, 따라서 전하 및 회합된 반대 이온의 증가를 발생시킨다. 다른 실시양태에서, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라제가 사용될 수 있으며, 이는 순전하를 동일하게 남아있게 하고, 양전하 및 또는 히드록시드 이온을 생성하며, 이는 전도성의 증가로서 측정될 수 있거나, 또는 ISFET, ChemFET 또는 나노브릿지 센서의 표면을 사용하여 이온 상호작용의 결과로서 측정될 수 있다.
센서와 결합 또는 회합된 폴리머라제는 고도 처리 폴리머라제일 수 있으며, 이는 더 많은 염기를 혼입되게 하고, 이어서 더 적은 처리성 폴리머라제와 함께 발생할 수 있다. 폴리머라제는 phi29, 레플리피(RepliPHI), 마그니피(MagniPhi)®, 퀄리피(QualiPhi)®, T4 (E. 콜라이 T4), F-530, B104 또는 다른 고도 처리 폴리머라제일 수 있다. 폴리머라제는 감소된 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖거나 또는 상기 활성을 갖지 않도록 개질될 수 있거나, 또는 폴리머라제는 그의 천연 형태에서 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않거나 거의 갖지 않을 수 있다. 유사하게는, 임의의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 감소되거나 실질적으로 제거되도록 변형될 수 있다. 열안정성 폴리머라제 또는 다른 유형의 DNA 또는 RNA 폴리머라제는, 예를 들어 벤트(Vent) (틀리(Tli)/써모쿠스 리터랄리스(Thermoccus Literalis)), 벤트 엑소-(Vent exo-), 딥 벤트(Deep Vent), 딥 벤트 엑소-(Deep Vent exo-), 타큐(Taq) (써무스 아쿠아티쿠스), 핫 스타트 타큐(Hot Start Taq), 핫 스타트 엑스 타큐(Hot Start Ex Taq), 핫 스타트 LA 타큐(Hot Start LA Taq), 드림타큐(DreamTaq)TM, 탑타큐(TopTaq), 레드타큐(RedTaq), 타큐레이트(Taqurate), 노바타큐(NovaTaq)TM, 수퍼타큐(SuperTaq)TM, 스토펠 프레그먼트(Stoffel Fragment), 디스코버라스(Discoverase)TM dHPLC, 9°Nm, 푸전(Phusion)®, 롱암프 타큐(LongAmp Taq), 롱암프 핫 스타트 타큐(LongAmp Hot Start Taq), 원타큐(OneTaq), 푸전® 핫 스타트 플렉스 (Hot Start Flex), 크림손 타큐(Crimson Taq), 헤모 클렌타큐(Hemo KlenTaq), 클렌타큐(KlenTaq), 피어 핫 스타트(Phire Hot Start) II, 다이나자임(DyNAzyme) I, 다이나자임 II, M-MulV 리버스 트랜스크립트(M-MulV Reverse Transcript), 파이로파지(PyroPhage)®, Tth (써모스 터모필루스 HB-8(Thermos termophilus HB-8)), Tfl, 아믈리썸(Amlitherm)TM, 바실루스 DNA(Bacillus DNA), 디스플레이스에이스(DisplaceAce)TM, Pfu (피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)), Pfu 터보(Turbo)®, 피펀즈(Pfunds), 리프로패스트(ReproFast), 파이로베스트(PyroBest)TM, 베라세큐(VeraSeq), 마코(Mako), 만타(Manta), Pwo (피로코쿠스, 워세이(woesei)), 이그잭트런(ExactRun), KOD (써모코쿠스 코닥카라엔시스(thermococcus kodakkaraensis)), Pfx, 레프로핫(ReproHot), 사크(Sac) (술폴로부스 액시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius)), Sso (술폴로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)), 트루(Tru) (써무스 러버(Thermus ruber), Pfx50TM (써모코쿠스 질리기(Thermococcus zilligi)), 악큐프라임(AccuPrime)TM GC-리치(GC-Rich) (파이롤로버스 푸마리우스(Pyrolobus fumarius)), 피로코쿠스 스피시즈 GB-D(Pyrococcus species GB-D), Tfi (써무스 필리포미스(Thermus filiformis)), Tfi 엑소-, 써말에이스(ThermalAce)TM, 타크(Tac) (써모플라즈마 액시도필룸(Thermoplasma acidophilum)), Mth (M. 써모아우토트로피쿰(M. thermoautotrophicum)), Pab (피로코쿠스 아비씨(Pyrococcus abyssi)), Pho (피로코쿠스 호리코시히(Pyrococcus horikosihi), B103 (피코비리나에 박테리오파지 B103(Picovirinae Bacteriophage B103)), Bst (바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)), Bst 라지 프래그먼트(Bst Large Fragment), Bst 2.0, Bst 2.0 웜스타트(WarmStart), Bsu, 써미네이터(Therminator)TM, 써미네이터TM II, 써미네이터TM III, 써미네이터TM γ, T7 DNA, E. 콜라이 폴리머라제 I, 케노우(Kenow) (E. 콜라이) 프래그먼트, 클레노우 프래그먼트 엑소-(Klenow fragment exo-), T4 DNA, 술폴로부스(Sulfolobus) DNA 폴리머라제 IV, AMV 역전사효소, 인간 폴리머라제 뮤, 인간 폴리머라제 뮤-h6, DNA 폴리머라제 I (E. 콜라이), T7 RNA (E. 콜라이 T7), SP6 (E. 콜라이 SP6) RNA, E. 콜라이 폴리 (A), 폴리 (U), T3 RNA가 사용될 수 있다.
폴리머라제 및 또는 DNA는 센서에 또는 근처에 직접 결합될 수 있거나, 또는 링커를 통해 결합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 참조로 포함되는 US 7,270,981에 기재된 바와 같은 레콤비나제 폴리머라제 증폭의 변이체가 서열분석에 사용된다. 일부 실시양태에서, 증폭된 DNA 주형은 이중 가닥일 수 있고, 인풋 프라이머는 레콤비나제, 예를 들어 RecA 또는 RAD51과 복합될 수 있다. 상기 복합된 프라이머는 이중 가닥 DNA에 결합될 수 있고, 레콤비나제의 도움으로 상기 이중 가닥 DNA의 두 가닥 중 일부를 대체할 수 있다. 폴리머라제는 이어서 상기 폴리머라제가 핵염기를 혼입시킬 수 있을 만한 프라이머의 적절한 말단에 결합되고 상기 프라이머를 연장시킬 수 있다. 단일 가닥 결합 단백질이 첨가되어 이중 가닥 DNA 중 프라이머와 혼성화되지 않은 가닥에 결합할 수 있다. 결과적으로, 과반수의 반대 이온이 감지를 위해 존재할 수 있고, 이에 의해 상기 반대 이온은 DNA의 새로이 합성한 가닥과 회합할 수 있고, 그밖의 반대 이온은 상기 단일 가닥 결합 단백질과 회합할 수 있다. 추가의 장점은 단일 가닥 DNA 주형의 사용으로 생성된 2차 구조에서 기인하는 문제가 감소된다는 점이다.
무-챔버 반응기 및 가상 반응기
다른 측면에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 서열분석하기 위한 무-챔버 장치를 제공한다. 상기 장치는 전자기 센서, 주형 폴리뉴클레오티드를 전자기 센서에 또는 근처에 전달하거나 유지시키는 자기 담체, 및 액체 유동 및/또는 전자기 제거를 통해 자기 담체를 제거하는 메카니즘을 포함한다. 특정 실시양태에서, 전자기 센서는 나노니들 또는 나노브릿지 중 하나이고, 장치는 국부 증폭기를 추가로 포함한다. 전자기 센서는 협소한 구조를 가질 수 있고, 센서 표면의 양 측면이 pH에서의 변화, 또는 전도성에서의 변화에 접근가능하도록 상기 구조 하에서 에칭될 수 있다.
일부 실시양태에서, 시스템은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 표제 "무-에멀젼 폴리뉴클레오티드 증폭 및 서열분석을 위한 자기 어레이(Magnetic Arrays for Emulsion-Free Polynucleotide Amplification and Sequencing)"의 미국 가출원 61/389,484에 기재된 바와 같은 자기 어레이를 사용한다. 시스템은 도 5에 도해로 표시된다.
도 5는 나노니들 어레이 내의 단일 요소(500) 및 자석(516)을 도시하며, 여기서 기판(504)은 상기 기판(504) 위 및 비드(502) 아래에 전극(506)을 가질 수 있거나, 또는 상기 전극(506)과 상기 기판 사이의 간격 또는 부착 층(표시하지 않음) 상에 전극(506)을 가질 수 있다. 상기 전극(502)은 따라서 비드의 디바이(Debye) 층 내에 속할 수 있다. 유전 층(508)은 상기 기판(504) 위에 놓일 수 있고, 또한 상기 전극(506)의 일부를 덮을 수 있고, 상기 비드(502)가 제 위치에 유지되는 경우에 상기 비드(502)에 필요한 공간보다 더 클 수 있는 함몰부 또는 컷아웃(cutout)을 추가로 가질 수 있다. 상기 유전체는 자기력이 상기 비드(502)의 표면을 끌어당길 수 있는 것에 맞서는 표면을 제공하는 것을 포함하는 다중 기능을 제공할 수 있다. 자석(516) 및 상기 비드(502)의 상호작용으로부터 생성된 자기력은 상기 전극(502)에 대하여 및 유전체(508)에 대하여 하향으로 가해지는 힘을 사용하여 상기 비드(502)를 유지시키고 위치하도록 한다. 제2 층 유전체(512)는 상기 유전체(508)에 적용되어, 상부 전극(514)이 상기 제2 층 유전체(512) 상에서 조작될 수 있을 만큼 유전성 물질의 전체 두께의 높이를 추가로 연장하면서, 유의한 시약이 상기 비드(502)에 접근하게 할 수 있다. 상기 상부 전극(514), 유전체, 및 제2 유전체(512)는, 상기 상부 전극이 상기 비드의 디바이 거리 내에 속할 수 있도록, 및 추가로 상기 비드(502)의 중간점에 근접할 수 있도록 위치될 수 있다. 상기 상부 전극(514)은, 특히 상기 상부 전극(514)이 상기 비드(502)의 디바이 거리 내에 속하는 경우에 상기 비드(502)의 중심선 위에 있을 수 있고, 또는 상기 상부 전극(514)의 윗면이 상기 비드(502)와 상기 전극(506) 사이의 접촉점의 수직으로부터 10 내지 90 도의 각도로 상기 비드와 접촉할 만큼 상기 비드(502)의 중심선 아래에 있을 수 있다. 상기 비드(502)와 상기 상부 전극의 윗면 사이의 접촉점의 수직으로부터의 상기 각도는 30 내지 85 도, 45 내지 80 도, 또는 60 내지 75 도일 수 있다. 상기 자석(516)은 상기 기판(504) 내로 함몰되거나, 상기 기판(504) 상에, 또는 유전체(508) 상에 있을 수 있지만, 상기 비드(502)가 상기 전극(506) 쪽으로 당겨질 만큼 하향의 힘이 상기 비즈(502)에 적용되도록, 상기 비드(502)의 중심선 아래에 있어야 한다. 상기 자석(516)은 또한, 비드(502)가 어레이 내 제 위치에 있는 경우 상기 비드의 중심에 대하여 상쇄되도록 위치시켜서, 상기 비드(502)의 상기 상부 전극(514)에 대한 디바이 거리 내에 속하도록 상기 비드(502)가 상기 상부 전극 쪽으로 당겨지게 해야 한다. 나노니들 어레이 내 단일 요소(500) 및 자석(516)의 각 요소는 상기 요소 사이에 추가의 간격 층 또는 부착 층을 가질 수 있다. 상기 디바이 거리는 고 농도의 염, 저 농도의 염, 탈이온수, 또는 물에 혼화성인 비수성 유체와 혼합(comingled)된 수용액에 의해 형성될 수 있는 디바이 거리를 포함할 수 있다.
도 2는 본원에 기재된 다양한 실시양태에 따른 조합된 가상 웰 및 자기 어레이의 현미경사진이다. 상기 어레이 내 대부분의 위치는 가상 웰 구조가 위치된 지점에서 자석 사이의 위치에 단일 비드를 갖는다. 일부 위치는 단일 비드 초과를 갖는다. 또한 대부분의 자석 말단은 그 위에 위치된 비드를 갖는다.
상기 자기 어레이는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 US 7,682,837에 기재된 것과 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "비드"란, 구형 또는 비-구형인 비드, 모이어티 또는 입자를 의미하고, 여기서 상기 비드, 모이어티 또는 입자는 다공성이거나, 또는 고체이거나, 또는 고체의 혼합물이고 다공성이며, 상자성, 초-상자성, 반자성, 또는 강자성일 수 있는 자기 비드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "비드 포획 특징"이란, 센서에 대하여 고정된 위치에 단일 비드를 일시적으로 유지시킬 수 있고, 기판 상의 국부 자기 구조, 즉 비드의 위치를 고정하는 힘으로서 외부 자석, 국부 자기 구조, 반 데르 발스 힘, 또는 중력을 포함할 수 있는 오목부를 포함할 수 있는 특징을 의미한다. 상기 비드는 공유 결합 또는 비-공유 결합에 의해 제 위치에 결합될 수 있다.
본원에 사용된 "감금(confinement)"이란, 하나의 비드 또는 입자에서 생성된 분자(예를 들어, DNA)가 동일한 비드 또는 입자와 회합된 채 머물러서, 비드 또는 입자의 클론 성질을 실질적으로 유지하는 경우를 지칭한다.
본원에 사용된 "격리하다"란, 비드 또는 입자의 클론 성질을 유지하는데 필요한 바와 같이, 하나의 가상 웰로부터 또 다른 가상 웰로의 이주, 확산, 유동, 또는 다른 이동을 막는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "국부화된 자기 특징"이란, 실질적으로 편평한 기판 상에 개별적 비드를 유지시키는, 실질적으로 편평한 기판 상에 형성되는 자기 특징을 의미한다.
본원에 사용된 "국부화된 자장"이란, 제1 자기 영역의 북극과 제2 자기 영역의 남극 사이의 일정 공간에 실질적으로 존재하거나, 단일 자기 영역의 북극과 남극 사이의 일정 공간에 실질적으로 존재하는 자장을 의미한다.
본원에 사용된 "입자"란, 비-비드 모이어티, 예를 들어 분자, 분자의 응집체, 고체 입자에 결합된 분자, 또는 입자, 및 당업계에 공지된 다른 형태를 의미한다.
본원에 사용된 "단일 상 액체"는 밀도, 굴절률, 비중과 같은 특성을 포함하는 전체적인 물리적 특성이 비교적 균일한 액체로서, 수성, 수혼화성 및 유기 혼합물을 포함할 수 있지만, 비 혼화성 액체, 예를 들어 오일 및 물은 포함하지 않는다. 잠재적으로 액체가 단일 상 액체로서 간주되지 않도록 만드는 것으로 간주되지 않는 물리적 특성 중에는 pH, 전하 밀도, 및 이온 농도 또는 온도의 국부 편차가 포함된다.
본원에 사용된 "실질적으로 편평한"이란, 작은 받침대, 위로 솟은 구획, 구멍, 오목부, 또는 거친 부분(asperity)이 장치의 국부 평면에 대하여 40 μm를 초과하지 않도록 할 것이다. 뒤틀림, 휨, 커핑(cupping) 또는 다른 편평형 왜곡으로 인한 변형은 일반적으로 허용되는 오프셋의 일부를 이루는 것으로 간주되지 않는다. 본원에 기재된 바와 같은 용도에 대해 필수적이지 않을 수 있으면서 40μm를 초과하는 돌출부 또는 오목부는, 장치가 실질적으로 편평한 것으로 간주되는 것을 방해하지 않는다. 치수가 40μm 초과인 유체 채널 및/또는 상기 유체 채널을 생성하는 구조는 또한 장치가 실질적으로 편평한 것으로 간주되는 것을 방해하지 않는다.
본원에 사용된 "가상 웰(virtual well)"이란, 목적 반응 또는 상호작용에 필요한 기간 동안, 관심 있는 종 또는 종 세트, 전형적으로는 DNA 또는 비드가 이웃하는 "가상 웰"로 일반적으로 이주하지 않는, 국부 전기장 또는 국부 자장 감금 구역을 지칭한다.
본원에 사용된 "전극"이란, 상기 어레이에 전기력 또는 자기력을 형성하거나 적용하는 용도의 임의의 구조로서 정의된다. 그러한 구조는 장 또는 힘을 점멸함으로써 관심있는 시기에 어레이 내의 특정한 영역 (예를 들어 단리 어레이 또는 감금 내 요소의 중간 영역)으로 생체분자를 단리하거나 또는 그의 전달을 조종하는데 사용될 수 있다.
본원에 개시된 장치의 실시양태에서, 장치는 뉴클레오티드의 혼입을 감지하는, 질화규소 층을 포함하는 감지 표면을 포함한다.
본원에 개시된 장치의 실시양태에서, 복수 개의 자기 비드는 주형 폴리뉴클레오티드를 전달하도록 설정되고, 여기서 상기 자기 비드는 뉴클레오티드 혼입에 효과적인 pH 수준에서 낮은 제타 전위 물질을 갖는다.
가상 나노반응기 또는 "무-챔버 어레이"는 전기력, 자기력 또는 전자기력을 통해 입자를 포획, 유지, 감금, 단리 또는 이동시키는 어레이 내에서 입자 (예를 들어, 비드, 세포, DNA, RNA, 단백질, 리간드, 생체분자, 다른 미립자 모이어티, 또는 그의 조합)를 검출하거나 조종할 수 있고, 입자의 반응 및/또는 검출 및/또는 상기 입자를 수반하는 반응에 사용될 수 있다. 상기 "가상 나노반응기"는 비드, 세포, 다른 생체분자, 또는 그의 담체의 포획/유지/조종을 위한 강력한 도구를 제공하고, 모이어티를 후속적으로 전기력, 자기력, 또는 전자기력을 사용하여 어레이 내의 다른 픽셀 또는 영역과 상이한 상기 어레이의 픽셀 또는 영역의 모이어티를 농축하거나, 감금시키거나, 또는 단리할 수 있다. 한 실시양태에서 어레이는 유체 환경에 존재한다. 감지는 전하, pH, 전류, 전압, 열, 광학 측정, 또는 다른 방법에 의해 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서 본원에 기재된 무-챔버 장치는 서열분석 반응 동안 뉴클레오티드를 더 우수하게 세척되도록 하고, 이후에 잘못된 주기에 부적절하게 혼입될 수 있는 비결합된 및 비특이적으로 결합된 뉴클레오티드 모두를 포함할 수 있는 잔류 뉴클레오티드의 수를 감소시킴으로써, 서열분석 위상 오차의 유도를 감소시킬 수 있다.
DNA 서열분석 이외에, "무-챔버" 어레이 또는 "가상" 나노반응기를 사용하는 다양하고 상이한 분자 생물학 응용이 구상된다. 어레이는 도구, 예를 들어, 세포 분류기로서 사용될 수 있고, 후속적으로 어레이는 상기 세포에서 관심있는 하나 이상의 생화학적 사건 또는 반응을 위한 분류, 측정 또는 조종을 포함할 수 있는 분자 생물학을 추가로 수행할 수 있다 (예를 들어, 약물 스크리닝, 또는 생체분자 검출). 가상 나노반응기 어레이는 세포 모니터링 및 분석에 사용될 수 있고, 예를 들어, 시스템은 어레이 내에 포획되고/거나 가상 나노반응기와 회합하는 감지 요소에 인접한 세포의 전기 신호를 측정할 수 있다. 어레이는 희귀 세포의 스크리닝을 위하여, 예를 들어, 약물 개발을 위한 약물 스크리닝에서 반응의 검출을 위하여, 또는 암성 세포의 선택 및 시험을 위하여 사용될 수 있다. 다양한 실시양태에서 검정 또는 검출 표적은 세포 생물학, 약물 스크리닝, 및 특정한 세포 유형, DNA, RNA (핵산), 단백질, 하전된 소분자, 리간드, 또는 다른 생체분자의 검출을 위한 모니터링을 포함한다.
다른 실시양태에서, 추가의 전극 (또는 가상 벽/펜스) 요소는 어레이 내 각 전기적 감금 또는 단리 요소와 회합하는 다른 두 전극을 둘러쌀 수 있다.
일부 실시양태에서, 시스템은 픽셀 당 다중 비드 또는 세포를 포획하는데 사용되고, 목적 시간에 또는 상이한 응용에 대해 필요할 수 있는 어레이의 "가상 벽"에서 상기 요소와 회합하는 센서에서의 변화에 대응하여, 전자기장의 크기, 형상 또는 기간을 점, 멸 또는 변경할 수 있다. 예를 들어 시스템은 1 세트의 비드 또는 세포를 포획하고 이어서 상기 장에 의한 영향을 덜 받는 또 다른 모이어티를 포획하기 위하여 장 강도를 증가시킬 수 있다. 전기장은 DC 또는 AC 또는 상이한 조합의 장의 조합일 수 있다.
도 3은 콤솔 시뮬레이션으로 발생시킨, 전극 (304A 및 304B)에 적용된 장으로 인해 생성된 4분의 1 실린더형 구조 (300)의 3D 등전위 장 강도 곡선 (306)을 도시하는 도표이다. 장의 실질적 방사 비대칭(radial asymmetry)에 따른 결과로, 장 기울기가 가장 집중되는 일정 공간 (308)은 중심 전극 (304B)과 가까워지고, 이는 도 2에 나타낸 자기 어레이에 의해 비드가 유지될 수 있는 지점이다.
다른 실시양태에서, 가상 나노반응기(들)는 생체분자 과정의 다중 단계, 예를 들어, 전기장에서 이동하는 입자(들)의 비드 증량(enrichment), 마이크로유체 샘플-준비(prep) 및 라이브러리 준비, 예를 들어 DNA 온칩(on-chip) 추출, DNA 전단(shearing), DNA 농축물의 온칩 정상화(normalization), 무-에멀젼 증폭, 감지 (이는 이중-감지 또는 다중-감지 서열분석 검출기를 활용하는 센스플러스(SensePlus) 감지를 포함할 수 있고, 서열분석 과정의 판독 시간을 연장하기 위한 과도(transient) 및/또는 정상(steady) 상태의 전자적 서열분석 및 재위상화 방법을 활용할 수 있음)에 사용되고/거나 그와 조합되고, 여기서 상기 다중 단계는 완전히 통합된 전자적 게놈 분석기 시스템을 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 가상 나노반응기의 다중 어레이가 사용된다. 가상 나노반응기의 상이한 어레이는 상이한 생물학적 반응, 과정 또는 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 어레이 또는 어레이의 세트는 DNA 추출에 사용되고, 여기서 상기 어레이 세트 내의 상이한 어레이 또는 세트 내의 상이한 구성원은 상이한 샘플로부터의 세포를 보유할 수 있거나, 또는 단일 샘플로부터의 상이한 유형의 세포, 또는 그의 조합을 보유할 수 있다. 예를 들어, 상이한 샘플은 상이한 어레이에 보유될 수 있고, 단일 샘플 종양으로부터의 상이한 유형의 암세포는 단일 어레이의 상이한 지역 내에 보유될 수 있다. 상이한 세포 유형은 분류 또는 분리될 수 있거나, 또는 세포 유형은 상기 세포가 가상 나노반응기의 상기 어레이 상의 개별적 위치에 포획되고 유지된 후에 개별적 세포로부터 유래된 데이터의 결과로서 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 다수의 생물학적 반응, 과정 또는 방법은 단일 샘플 또는 모이어티가 가상 나노반응기 내 제 위치에 유지되는 동안 상기 단일 샘플 또는 모이어티 상에서 수행될 수 있다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 생물학적 반응, 과정 또는 방법은 가상 나노반응기 어레이(들) 내의 한 위치(들)의 샘플(들) 또는 모이어티(들) 상에서 수행될 수 있고 그 후 상기 샘플(들) 또는 모이어티(들)는 또 다른 가상 나노반응기 어레이(들) 내의 또 다른 위치(들)로 전달 또는 이동될 수 있다.
일부 실시양태에서, 전기적 농축 및 감금 가상 나노반응기의 어레이는 핵산의 포획/단리의 목적 외에도 그밖에 본원에 기재된 바와 같이 핵산의 서열분석 및 증폭을 위하여 사용된다. 일부 실시양태에서, 전기적 농축 및 감금은 임의의 하전된 모이어티와 함께 사용되고, 이때 시간 주기, 모이어티 농도, 이동성, 농도, 국부 점도, 국부 중합체의 가교 백분율, 또는 하전된 모이어티(들)의 농도는 개별적 가상 나노반응기 내에 충분한 감금을 유지하도록 전기적 감금 구조의 간격, 및/또는 사용된 장 강도, 및/또는 장 기울기의 크기에 영향을 미친다. 상이한 가상 나노반응기 사이의 용인될 수 있는 교차 오염(cross contamination) 수준은 상이한 응용에 대하여 및 생물학적 반응, 과정 또는 방법의 상이한 단계마다 다를 수 있다. 예를 들어, 핵산 증폭 반응 과정이 근접한 가상 나노반응기의 상이한 샘플 상에서 수행된 경우, 교차 오염은 PCR 반응의 초기 열적 주기 동안에 문제가 될 수 있는 반면, PCR 반응의 이후 주기 동안의 교차 오염은 프라이머가 다수 소모되면서 다른 가상 나노반응기로부터의 교차 오염 뉴클레오티드의 유의한 증폭을 막기 때문에 특별히 우려되지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체는 뉴클레오티드 또는 다른 모이어티의 이주율(migration rate)을 감소시키는데 사용된다. 예를 들어, 중합체는 부분적으로 얽혀진(entangled) 중합체, 예를 들어 POP-7TM, 또는 아가로스, 폴리아크릴아미드, 또는 전분 겔일 수 있다. 가교의 농도 및/또는 백분율은 가상 나노반응기 내의 감금이 목적되는 상이한 모이어티에 대하여 다양한 이동성이 요구되는 한 다양할 수 있다. 중합체는 상기 생물학적 반응, 과정, 또는 방법에 사용된 샘플 모이어티 또는 다른 모이어티가 도입되기 전, 그와 동시에, 또는 그 후에, 가상 나노반응기의 일정 공간에 도입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 전기적 농축 및 감금은 다른 생체분자 또는 생물학적 모이어티가 결합된 모이어티, 예를 들어 항체가 결합될 수 있는 전하를 가진 비드를 포획하는데 사용되고, 여기서 상기 비드는 후속적으로 단백질을 포획하는데 사용될 수 있고, 상기 비드는 추가로 전기적 농축 및 감금 어레이를 사용하여 포획될 수 있다.
일부 실시양태에서, 가상 나노반응기는 서열분석 이외에 다수의 상이한 응용에 사용될 수 있고, 예를 들어 상기 가상 나노반응기는 DNA가 비드 상에 있고, 상기 비드가 가상 나노반응기에 의해 제 자리에 유지되는 혼성화 어레이 (애피(Affy) 또는 애질런트 DNA 마이크로 어레이와 유사함)로서 활용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 가상 나노반응기는 상기 비드가 어레이 내에 도입되는 디지털 PCR에 사용된다. 검출은 어레이의 각 요소와 회합되는 전자 센서 어레이로 수행될 수 있거나, 또는 검출은 광학 수단을 사용하여 특정한 핵산의 존재 또는 양을 검출할 수 있다. 디지털 PCR은 상대론적인 방식으로 샘플 내의 표적의 농도를 정량화하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 가상 나노반응기 내로의 샘플의 농축은 더 큰 민감도를 갖는 정량화를 가능케 한다. 일부 실시양태에서, 어레이의 일부 지역에서만 농축을 사용하고 다른 지역에서는 사용하지 않는 것이 더 큰 농축 정량화 동적 범위를 가능하게 할 수 있다. 추가 실시양태에서, 샘플 모이어티를 상기 가상 나노반응기로부터 부분적으로 "밀어" 내기 위해 DC 농도장 (concentration field)이 역전될 수 있다. 일부 실시양태에서, 농축의 조합, 비농축, 및 샘플 모이어티를 상이한 지역으로 밀어내는 것은 디지털 PCR, 또는 임의의 다른 목적하는 생물학적 반응, 과정, 또는 방법의 동적 범위를 추가로 확장하는 것을 도울수 있다. 상이한 프라이머를 갖는 비드는 본원에 기재된 바와 같은 가상 나노반응기 어레이의 상이한 지역으로 도입되어 여러 표적에 대한 동시 디지털 PCR 반응을 가능하게 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 가상 나노웰은 상기 비드에 컨쥬게이트된 프라이머에 결합된 DNA의 완전 연장 반응을 위해 사용된다. 추가 실시양태에서, 상기 가상 나노반응기는 라이게이션 반응 검출에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 생체분자 또는 흥미 있는 다른 모이어티 (예컨대 DNA, 세포, 단백질) 또는 생체분자 또는 흥미 있는 다른 모이어티의 담체 (예컨대 비드, 입자, 또는 다른 모이어티)의 일시적 또는 단시간 단리, 또는 유지 또는 농축을 위한 전자기장을 발생시키기 위해 상기 시스템은 전자석, 영구 자석, 또는 전극을 사용할 수 있거나, 또는 다른 상이한 하부시스템을 사용할 수 있다. 상기 전자기장은 자장, 전장(electric field), 또는 그 둘의 조합일 수 있다. 상기 전장은 DC 전장, AC 전장, 펄스 DC 전장, 비-사인곡선형 AC 전장, 펄스 AC 전장, 또는 그의 조합일 수 있다. 가상 벽 (또는 펜스)을 갖는 나노반응기는 생체분자 또는 그의 담체를 유지, 포획, 농축, 단리, 또는 조작하기 위한 전장 또는 자장으로 사용되거나 또는 만들어질 수 있다.
2 세트 이상의 전극 구조가 이용되는 일부 실시양태에서, 가상 벽 또는 단리 벽 또는 펜스는 전자기장의 규모, 형상 또는 주기에 대해 목적하는 시간에서 켜지거나 꺼지거나, 또는 수정될 수 있고, 상기 시간은 고정된 시간이거나, 또는 전극 구조의 어레이의 특정 구성원과 관련된 센서로부터의 변화에 대한 반응일 수 있다. 전자기장의 규모, 형상 또는 주기에 대해 켜거나 끄거나, 또는 수정하는 것은 전극 구조의 어레이에서 농축, 밀폐, 또는 단리된 입자, 비드, 세포, 생체분자 또는 흥미 있는 다른 모이어티의 움직임을 조절하는데 사용되거나, 또는 반응에서 사용될 수 있는 생체분자 또는 흥미 있는 다른 모이어티, 예컨대 단백질 검출에서 항원 또는 2차 항체, 또는 DNA 또는 RNA 서열분석에서 뉴클레오티드, 또는 세포 상호작용에서 2차 세포, 또는 약물 스크리닝 및 모니터링에서 약물 또는 세포를 조절하는데 사용될 수 있다. 이 특징은 용이한 접근 및 유연한 조작, 및 또는 혼합을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 가상 나노반응기 어레이는 시스템 내로의 DNA 인풋의 양 및/또는 농도를 정규화하고, 입력(entry)에 대한 피드백 및/또는 제어를 발생시킬 수 있고, 이는 이어서 본원에 기재된 바와 같은 시스템 내로의 상기 DNA, 또는 다른 생체분자 또는 다른 모이어티 인풋의 양 및/또는 농도를 제어하는데 사용될 수 있다. 상기 시스템은 검출 또는 서열분석 어레이의 실시간 정규화의 목적을 위해 추가로 사용될 수 있다.
자기 또는 전자기 또는 전기 포획 및 또는 유지를 통한 비드, 또는 세포 또는 다른 생체분자, 입자, 또는 흥미 있는 다른 모이어티의 포획 (단리, 밀폐 또는 농축)을 위한 어레이는, 어레이의 구성요소 당 2개 세트의 "포획 구성요소" (GENIUS 바 또는 다른 곳에 기재된 바와 같은 자기 어레이의 구성요소)를 포함하고, 1개 세트의 포획 구성요소로 1개 모이어티의 포획 (단리, 밀폐 또는 농축), 및 흥미 있는 제2 모이어티의 후속 포획 (단리, 밀폐 또는 농축)을 가능하게 하도록 구조화될 수 있다. 상기 포획은 상이한 순서 및 상이한 구조로 실행될 수 있고, 어레이 구성요소 당 2 세트 초과의 포획 구성요소를 포함할 수 있으며 상응하게, 추가의 포획 단계는 각각의 어레이 구성요소에서 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 전기 농축 및 밀폐 어레이는 B-세포가 결합된 하전된 비드, 예를 들어 단백질, 폴리사카라이드, 또는 다른 면역원이 전달되고 후속적으로 B-세포를 포획하기 위해 사용될 수 있는 자기 비드를 포획하기 위해 사용될 수 있다. 상기 하전된 비드는 상기 전기 농축 및 밀폐 어레이를 사용하여 후속적으로 포획될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 전기 농축 및 밀폐 어레이는 단백질, 폴리사카라이드, 또는 다른 면역원이 결합될 수 있는 B-세포를 포획하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 상기 전기 농축 및 밀폐 어레이는 다른 탄수화물 또는 당지질이 결합된 하전된 비드, 예를 들어 탄수화물 결합 모듈을 포함하는 단백질 또는 펩티드가 결합될 수 있는 하전된 비드를 포획하기 위해 사용된다. 상기 하전된 비드는 탄수화물 또는 당지질을 포획하기 위해 후속적으로 사용될 수 있고, 여기서 상기 하전된 비드는 추가로 상기 전기 농축 및 밀폐 어레이를 사용하여 후속적으로 포획될 수 있다. 그러한 탄수화물 또는 당지질 결합 모이어티는 탄수화물 활성 효소, 예컨대 글리코시드 히드롤라제, 렉틴, 갈렉틴, 인텔렉틴, 펜트락신, 셀렉틴, 어드헤션, 또는 히알루로난을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 어레이는 화학적 스크리닝 적용을 위해 사용되고 비-생체분자는 시스템으로 시험되거나 모니터링되거나 측정될 수 있다. 예를 들어, 약물 효과의 측정이 요구되는 약물 스크리닝 용도에서, 시스템은 예를 들어, 각각 그들 각자의 비드 상에서 약 100, 1000, 10,000, 또는 1,000,000 개의 상이한 약물 후보를 이용할 수 있고, 상기 비드는 "가상 나노반응기" 어레이에 포획 및 유지될 수 있다. 상기 시스템은 후속적으로 비드와 흥미 있는 세포 또는 세포 세트 간의 상호작용 및 상호작용의 측정을 가능하게 할 수 있고 전기 밀폐는 어레이에서 픽셀의 단리를 위해 사용되어 고처리량 및 빠른 약물 스크리닝 시스템을 제공한다.
일부 실시양태에서, 전기 농축 및 밀폐 어레이는 다중의 상이한 유형의 생체분자가 결합된, 합한 세트의 하전된 비드를 포획하기 위해 사용된다. 합한 세트의 하전된 비드는 결합된 상이한 유형의 생체분자 또는 생물학적 모이어티를 갖는 다중 세트의 하전된 비드를 포함할 수 있다. 이는 하나의 생체분자 또는 생물학적 모이어티를 한 세트의 하전된 비드 상에 결합시킬 수 있는 한 유형의 결합 모이어티일 수 있고, 상이한 생체분자 또는 생물학적 모이어티를 상이한 세트의 비드 상에 결합시킬 수 있는 상이한 유형의 결합 모이어티일 수 있다. 상기 합한 세트의 하전된 비드는 세트의 하전된 비드가 다중 결합 모이어티가 결합된 하전된 비드를 포함할 수 있는 하전된 비드 수 세트를 또한 포함할 수 있다.
추가 실시양태에서, 상기 합한 세트의 비드는 표지를 추가로 포함할 수 있고, 이때 상기 표지는 상이한 세트의 비드를 구별한다. 상기 표지는 광학 표지, 예컨대 형광 염료, 생화학적 표지, 예컨대 DNA, 금속 입자 표지, 임의의 다른 유형의 표지, 또는 상이한 유형의 표지의 조합일 수 있다. 상기 표지는 어떤 유형의 비드가 어레이 전기 농축 및 밀폐 특징의 각 구성요소에 존재할 수 있는지 결정하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 다양한 생체분자 반응에 기인하는 상호작용 및 비드의 상이한 검출 방법은 상기 비드의 검출의 결과로서 관찰될 수 있다. 상기 검출은 나노니들 센서, 나노브릿지 센서, 켐FET 센서, ISFET 검출기, 광학 센서, 예컨대 형광 검출기, SERS 검출기, 흡수 검출기, PH 검출기, 전도도 검출기, 질량 공명 검출기, 열량계 검출기, 또는 생체분자 반응, 또는 다른 유형의 반응의 검출에 적합한 임의의 다른 유형의 검출기의 결과로서 유효화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 센서는 어레이의 각 위치에서 전기 농축 및 밀폐 특징과 합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 전기 농축 및 밀폐는 충전된 모이어티를 직접 포획하기 위해 사용되고, 이때 상기 충전된 모이어티는 다른 생체분자 또는 생물학적 모이어티에 결합된다. 예를 들어 항체 또는 단백질에 결합된 항체는 농축되거나 밀폐될 수 있고, 여기서 상기 항체 또는 단백질에 결합된 항체는 후속적으로 단백질 또는 추가의 항체를 포획하기 위해 사용될 수 있다
일부 실시양태에서, 상기 "가상 나노반응기" 어레이는 흥미 있는 생체분자, 예컨대 DNA, RNA, 또는 다른 반응물 또는 더욱 효율적인 합성을 위한 시약을 농축시킴으로써 반응 속도를 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 유동 셀의 부분으로서 밸브화 (valving) 시스템을 통합하는 것이 바람직하다. 상기 밸브화 시스템은 상이한 샘플이 상기 유동 셀의 상이한 섹션을 위해 사용될 수 있도록 샘플의 유동 셀 섹션으로의 유동을 가능하게 한다. 다른 실시양태에서, 밸브화 시스템은 유동 셀에 인접하여 통합되고, 이로써 밸브화 시스템 및 유동 셀은 서로 실링 계면을 형성할 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 밸브화 시스템 및 상기 유동 셀은 단일 마운트 상에서 서로에게 인접할 수 있고, 이때 상기 밸브화 시스템 및 상기 유동 셀은 둘 다 상기 마운트에 탑재될 수 있다. 상기 밸브화 시스템은 유체가 상기 유동 셀의 상기 섹션 내로 유입 되기 전에 상기 밸브화 시스템으로부터 제거될 수 있도록 하기 위해 폐 밸브(들)를 또한 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 밸브화 시스템에 상당한 불감 (dead) 부피가 있는 경우, 이전 유체로부터의 허용 불가능한 수준의 상호 오염을 가질 수 있는 유체를 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, 밸브화 장치를 유동 셀과 통합하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 밸브화 배위는 다양한 인풋을 포함할 수 있고, 이는 4개의 dNTPs (예를 들어, 서열분석 반응)에 대한 인풋을 포함할 수 있고, 이는 또한 완충제, 염, 효소, 및 뉴클레오티드의 혼입에 요구되는 임의의 다른 모이어티를 함유할 수 있다. 인풋은 또한 다양한 완충제 및 세척 시약, 폴리머라제를 함유하는 완충제를 위해 이용될 수 있고, 이는 또한 중합에 필요한 염 및 임의의 다른 모이어티, 유동 셀로부터 임의의 코팅을 벗겨내기 위해 필요한 시약, 유동 셀을 재-코팅하기 위해 필요할 수 있는 시약, 포스파타아제를 또한 포함하는 완충제, 또는 다른 시약을 함유할 수 있다.
한 실시양태에서, 밸브화 장치는 PDMS로 제조된다. 또 다른 실시양태에서 밸브화 장치는 자기로 또는 공압으로 활성화된 탄성중합체 밸브로 유리로부터 제조된다.
일부 실시양태에서, 상기 밸브화 및 유체 PDMS 매니폴드를 규소 장치에 결합시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 PDMS 및 상기 규소 장치 사이의 결합 강도를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 결합 강도를 개선하기 위해 플라즈마 활성화된 PDMS를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 너무 많은 출력이나 너무 큰 압력을 갖는 플라즈마 처리는 실제로 규소에 대한 PDMS의 결합 강도를 감소시킬 수 있기 때문에, 낮은 출력 수준 및 압력을 사용하는 것이 중요할 수 있다. 탕 등 (Tang et al)은 적절한 출력 및 압력 수준을 문헌 [2006 J. Phys.: Conf. Ser. 34 155]에서 기재한다. 한 실시양태에서 500 밀리 토르 내지 30 밀리토르의 압력 및 10 내지 60 와트의 출력 수준을 사용하면서 예를 들어 790 시리즈 플라즈마-섬 (Plasma-Therm)을 사용하는 것이 적합하다.
PDMS 또는 다른 유사한 물질로 제조한 장치에 대해, 시약의 유량을 제어하기 위해 압력 밸브를 사용하는 것이 가능하다. 그러한 밸브를 사용하여 여러 밸브를 서로 아주 가까이 두는 것이 가능하고, 상기 밸브는 중앙 채널에 매우 가까울 수 있어, 불감 부피를 감소시키고, 밸브 (406)을 갖는 3개의 시약 인풋 라인 (402)를 갖는 시약 밸브 시스템 (400)을 도시하는 도 4a에 도시된 바와 같이, 이들 각각은 압력 제어 라인 (404)의 통제 하에 유동 셀 (408)에 대한 인풋을 향해 흐르도록 구성될 수 있다.
더 많은 시약 인풋이 요구되는 더 복잡한 시스템에 대하여, 도 4a의 간단한 밸브 시스템 (400)은 3개의 시약 인풋 라인 (402)만을 갖기 때문에 불충분하다. 도 4b 및 4c에 도시된 바와 같은 대안적 실시양태에서, 훨씬 많은 인풋이 가능하다. 이러한 접근법은 또한 채널의 불감 부피를 처리하는 것을 허용한다. 도 4b에서, 인풋은 dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 완충제 1, 완충제 2, 및 샘플에 대한 인풋 포트, 및 폐기물 1, 폐기물 2, 및 폐기물 3에 대한 아웃풋 포트를 포함한다. 제어 라인은 활성화된 포트 사이의 유동의 방향을 제어하기 위한 추가의 제어 라인을 가지며, 각각의 인풋 및 아웃풋 포트에 대해 가동된다. 폐기물 포트는 이전 유동으로부터의 임의의 잔여 시약이 제거될 수 있도록 유동 셀의 직전에 나타나며, 밸브화 시스템에서의 임의의 불감 부피로부터의 확산 없이 하나의 시약에서 또 다른 시약으로의 매우 깨끗한 전이를 가능하게 한다. 도 4c는 모든 인풋 밸브 포트 위치가 상기 인풋 밸브 포트 위치에서 출구 (폐기물) 포트로 두 방향의 경로를 갖도록 타원형 유동 경로를 갖는 밸브화 시스템을 도시한다. 도 4a에 도시된 바와 같은 밸브는 도 4b, 4c에 도시된 각각의 밸브 또는 도 4d에 도시된 바와 같은 시약 밸브화 시스템 (430)의 물리적 실시양태에 나타나는 각각의 밸브에 사용될 수 있고, 도 4d에서 PDMS 밸브 시스템 (440)의 사진이 도시된다.
한 실시양태는 각각의 인풋 포트가 활성화된 경우, 적절한 시약이 시스템으로 도입될 수 있도록 각각의 인풋 라인에서 각각의 인풋 포트 제어 밸브까지 공기 또는 다른 오염물의 퍼징을 허용한다. 예를 들어, dATP 라인을 청소하기 위해서, dATP 제어 라인 및 폐기물 1 상부 제어 라인이 활성화되어 dATP 라인에서의 공기 및 임의의 원치않는 시약이 dATP 밸브를 통해 배출 폐기물 1로 흘러나오도록 유발할 수 있다. 다른 실시양태에서, dCTP 제어 라인 및 폐기물 1 상부 제어 라인, dTTP 및 폐기물 1 상부 제어 라인, 및 dGTP 제어 라인 및 폐기물 1 하부 제어 라인을 각각 활성화함으로써 dCTP, dTTP, 및 dGTP 라인의 오염물을 퍼징하거나 청소할 수 있다. 샘플 라인으로부터 오염물을 퍼징하거나 제거하기 위해 샘플 제어 라인 및 폐기물 2 제어 라인이 활성화될 수 있다.
서열분석 어셈블리를 교체한 후에 모든 라인으로부터 오염물을 퍼징 및 제거하는 것이 필요할 수 있다. 유사하게 시약 병 또는 용기를 교체하거나 재충전한 후에 시약 라인으로부터 오염물을 퍼징하거나 제거하는 것이 필요할 수 있다. 오염물의 퍼징 또는 제거에 대한 추가의 필요는 기기가 사용되지 않는 시간의 기간에 기인할 수 있고, 이는 임의의 시약 라인이, 분해를 겪도록 주위온도 미만으로 냉각될 필요가 있는 시약을 함유하는 것을 허용할 수 있다; 예를 들어, 폴리머라제 함유 시약 중의 폴리머라제는 주위 온도에의 연장된 노출을 겪을 수 있다.
일부 실시양태에서, 매니폴드의 이전 사용으로부터 남은 임의의 시약이 제거될 수 있도록 유동 셀의 인풋으로 이어지는 매니폴드를 채우는 것이 바람직하다. 예를 들어, 유동 셀 내로 dATP를 도입하기 전에, dATP 제어 라인, 상부 액체 제어 라인, 및 폐기물 2 제어 라인이 활성화될 수 있다. dATP 시약은 이어서 dATP 인풋 라인으로부터, 상부 액체 루프의 양측을 돌아, 상부 액체 영역 및 하부 액체 영역 사이의 채널을 통해 흐르기 시작하여, 폐기물 2 밸브를 통해 나와 폐기물 2 라인 내로 흐를 것이다. 대안적으로, 유동 셀 내로 dCTP를 도입하기 전에, dCTP 제어 라인, 상부 액체 제어 라인, 및 폐기물 2 제어 라인이 활성화될 수 있다. dCTP 시약은 이어서 dCTP 인풋 라인으로부터, 상부 액체 루프의 양측을 돌아, 상부 액체 영역 및 하부 액체 영역 사이의 채널을 통해 흐르기 시작하여 폐기물 2 밸브를 통해 나와 폐기물 2 라인 내로 흐를 것이다. 유사하게, 유동 셀 내로 dTTP를 도입하기 전에, dTTP 제어 라인, 하부 액체 제어 라인, 및 폐기물 2 제어 라인이 활성화될 수 있다. dTTP 시약은 이어서 dTTP 인풋 라인으로부터, 하부 액체 루프의 양측을 돌아, 하부 액체 영역 및 하부 액체 영역 사이의 채널을 통해 흐르기 시작하여 폐기물 2 밸브를 통해 나와 폐기물 2 라인 내로 흐를 것이다. 유사하게, 유동 셀 내로 dGTP를 도입하기 전에, dGTP 제어 라인, 하부 액체 제어 라인, 및 폐기물 2 제어 라인이 활성화될 수 있다. dGTP 시약은 이어서 dGTP 인풋 라인으로부터, 하부 액체 루프의 양측을 돌아, 하부 액체 영역 및 하부 액체 영역 사이의 채널을 통해 흐르기 시작하여 폐기물 2 밸브를 통해 나와 폐기물 2 라인 내로 흐를 것이다.
완충제 1은 주요 유동 셀 (암청색)을 통해 유동하여, B1C 대조군 라인, 및 W3C 대조군 라인을 활성화함으로써 폐기물 3 포트를 나가게 될 수 있다. 대안적으로, 완충제 1은 B1C 대조군 라인, 및 W2C 대조군 라인을 활성화함으로써 폐기물 2 포트를 유동하여 나가게 될 수 있다. 또 다른 대안적 사용에서, 완충제 1은 완충제 1 대조군 라인, 상부 액체 대조군 라인, 및 폐기물 1 상부 대조군 라인을 활성화함으로써 액체 매니폴드의 상부 섹션을 통해 폐기물 1 라인을 유동하여 나가게 될 수 있다. 유사하게, 하부 액체 매니폴드는 완충제 1 대조군 라인, 하부 액체 대조군 라인, 및 폐기물 1 하부 대조군 라인을 활성화함으로써 완충제 1과 플러싱될 수 있다. 시간 순서인 또는 함께 활성화되는 이들 영역의 조합으로 유동을 활성화시키는 것은 전체 액체 매니폴드를 깨끗하게 하는 것이 버블, 다른 오염물, 또는 dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 완충제 2, 또는 샘플 입력 포트를 통해 시스템으로 도입될 수 있었던 임의의 다른 액체의 세척액 또는 퍼지를 제거할 수 있게 한다.
일부 실시양태에서, 열적으로 성장된 이산화규소보다 더 높은 결합 강도를 갖는 규소 장치 위에 패시베이션 층을 사용하는 것이 바람직하다. 탕(Tang) 등은 PSG (PECVD 포스포실리케이트 유리), USG (PECVD 언도프된 실리케이트 유리), Si3N4 (LPCVD 질화규소)를 포함하여 개선된 결합 강도를 제공하는 몇몇 패시베이션 층을 기재한다.
PDMS 밸빙(valving) 매니폴드를 사용하는 일부 시스템에서, PDMS로 삽입된 핀 또는 니들은 시약 라인을 밸빙 매니폴드에 연결하기 위해 사용된다. 이것이 단단한 부착을 위해 제공되지만, 다수의 시약 라인을 PDMS 밸빙 매니폴드에 부착하는 것은 시간 소모적이고 오류가 있기 쉽다. 따라서, 일부 실시양태에서, 시약 라인이 밸빙 매니폴드가 아닌 인터페이스 매니폴드에 연결된 인터페이스 매니폴드를 사용하는 것이 바람직할 수 있고, 인터페이스 매니폴드는 밸빙 매니폴드에 연결될 수 있다. 시약 라인은 핀 또는 니들에 부착될 수 있고, 이는 인터페이스 매니폴드에 부착될 수 있다. 핀 또는 니들은 접착제로 고정됨으로써, 용접 또는 브레이징에 의해, 프레스 피트를 사용함으로써, 또는 몇몇 다른 수단에 의해 인터페이스 매니폴드에 영구히 부착될 수 있다. 대안적으로, 라인은 인터페이스 매니폴드에 직접 연결될 수 있고, 여기서 라인은 조립 또는 o-고리에 의해, 또는 당업계에 공지된 바와 같은 몇몇 다른 수단에 의해 보유될 수 있다.
일부 실시양태에서, 인터페이스 매니폴드는 시약이 인터페이스 블록에서 밸빙 매니폴드로 유동할 수 있도록 밸빙 매니폴드에 밀봉식으로 접속할 수 있다. 인터페이스 매니폴드와 밸빙 매니폴드 사이의 인터페이스는 칩/유동 셀 및/또는 밸빙 매니폴드의 대체를 가능하게 하기 위하여 사용자에 의해 사용되는 인터페이스일 수 있다.
일부 실시양태에서, 인터페이스 매니폴드는 결합에 의해 형성된 내부 채널을 가질 수 있고, 상기 결합은 융합 결합, 용매 결합 또는 접착제 결합을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 확산 뿐만 아니라 벽 상호작용 때문에 채널의 가장자리에서의 유동 속도에 대한 채널의 중심에서의 유동 속도의 차이의 결과로 발생하는 시약의 혼합의 양을 최소화하는 것을 비롯하여 유동 셀의 활성 부분으로의 경로 길이를 최소화하는 것은 몇몇 이유에서 중요할 수 있다. 일부 실시양태에서, 온도 조절되지 않는 부피에서의 폴리머라제와 같은 시약의 분해를 막기 위하여, 온도 조절되지 않는 부피를 최소화하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시약에 접촉하는 물질에 대한 비특이적 결합 때문에 다수의 시약에서 보편적인 유동 영역에서 또한 발생할 수 있는 시약의 교차 오염을 동시적으로 최소화하기 위하여 배관(plumbing) 부피를 최소화하는 것이 바람직할 수 있다.
도 1은 자성 또는 상자성 비드가 자성 어레이에 의해 감각 영역 상에 고정된 본 발명의 한 실시양태의 도식적 묘사를 예시한다. 자성 어레이는 발명의 명칭이 "Magnetic Arrays for Emulsion-Free Polynucleotide Amplification and Sequencing"인 미국 가출원 61/389,484에 기재되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 보유된 자성 또는 상자성 비드는 DNA의 모노클로날 집단을 가질 수 있다. 상기 비드는 각각의 센서 상에 오직 1개의 비드에 충분한 여유가 있는 크기여서, 센서와 비드 사이에 1 대 1 대응을 제공할 수 있다. 각각의 센서 상에 오직 1개의 비드만을 위한 여유가 있을 수 있지만, 비드가 비드 상에 정렬된 경우 비드 사이에 여유가 존재하여, 센서 사이에 감소된 누화(cross-talk)가 야기될 수 있다. 예를 들면, 한 세트의 비드는 가로로 약 8 마이크로미터인 센서 상에 위치된 직경 약 10 마이크로미터일 수 있고, 센서는 약 15 마이크로미터 떨어져 있어서, 비드 사이에 대략 5 마이크로미터 공간이 야기될 수 있다. 센서의 크기는 센서 상에 보유될 2개의 비즈에 대해 불충분한 여유가 존재하는 경우, 비드보다 더 클 수 있다. 비드, 센서, 및 간격의 크기는 달라질 수 있다. 다른 실시양태에서, 비드는 크기 면에서 10 마이크로미터 초과, 예컨대 약 15 마이크로미터, 약 20 마이크로미터, 약 25 마이크로미터, 또는 그보다 큰 크기일 수 있다. 추가 실시양태에서, 비드는 10 마이크로미터 미만, 예컨대 약 5 마이크로미터, 약 3 마이크로미터, 약 2 마이크로미터, 약 1 마이크로미터, 또는 1 마이크로미터 미만일 수 있다. 센서는 비드의 크기에 맞추어 조정된 크기일 수 있고, 따라서 가로 8 마이크로미터 크기보다 더 크거나 작을 수 있고, 어쩌면 가로 1 마이크로미터 미만에서 약 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20 또는 그 이상의 마이크로미터까지의 범위일 수 있다. 센서 사이의 간격은 또한 15 마이크로미터 초과, 또는 15 마이크로미터 미만일 수 있고; 센서 간격은 센서들 사이에서 1 마이크로미터 미만에서 약 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25 또는 그 이상의 마이크로미터까지의 범위일 수 있다.
도 1에 나타낸 바와 같은 무-챔버 자성 체류 구조는 그 유동이 도 2에 나타낸 것과 같은 웰 구조에 의해 저해되지 않기 때문에, 뉴클레오티드, 폴리머라제 및 다른 성분의 개선된 유동을 허용할 수 있고, 이로써 비드가 웰에 존재한다면 보다 나은 세척, 보다 완전한 염기의 혼입, 및 보다 빠른 순환 시간이 가능할 것이다. 웰 구조에서, 예컨대 도 2에 나타낸 것과 같은 비드 및 연합된 DNA는 접근 및 유동을 방해하므로, 도 2에 나타낸 바와 같은 비드의 모든 부분에 대해 충분한 확산을 허용하도록 폴리머라제 및 뉴클레오티드의 보다 높은 농도가 요구될 수 있다. 상기 보다 높은 농도의 dNTP 및 폴리머라제는 상기 폴리머라제에 의한 오편입 때문에 오차 비율을 증가시킬 수 있고, 이로써 보다 높은 수준의 서열분석 진상 오차가 도 1에 나타낸 바와 같은 무-챔버 구조에서 발생할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 어레이는 재사용가능하다 (예를 들어, 단일 사용이 아님). 서열분석의 비용은 다수의 부분을 갖는데, 전자 센서를 사용하는 서열분석의 경우, 주요 비용 중 하나는 프로세싱된 규소 자체, 즉, 센서의 비용이다. 이는 센서가 재사용가능하지 않지만 단일 사용 후 버려야 하는 경우 특히 그럴 수 있다. DNA가 센서에 결합되지 않으므로 상기 기재된 자성 어레이는 재사용을 꽤 쉽게 가능하게 하고, 비드는 상기 비드를 제 자리에 유지하는 자장을 감소시키거나 제거함으로써 쉽게 제거될 수 있다. 비드가 대신에 구조로 고정되는 경우, 제거는 더욱 어려울 수 있다.
한 실시양태에서, 자성 또는 상자성 비드일 수 있는 비드가 웰에서 빠져나와 셀을 통해 시약을 유동하게 함으로써 유동 셀로부터 후속적으로 제거되도록, 비드는 구조, 또는 웰의 어레이로 고정되고, 자장을 적용시킴으로써 제거된다.
일부 실시양태에서, 자성 특징의 어레이는 상기 핵산의 서열분석 및 증폭을 위해 본원에 달리 기재된 것과 같이 핵산의 포획/단리 이외의 목적으로 사용된다. 이는 세포 (예를 들어, 암 세포, B-세포), 단백질, 당단백질, 당지질, 항체, 사카라이드 또는 폴리사카라이드, 및 이미 기재된 것과 같은 다른 잔기의 포획을 포함한다.
일부 실시양태에서, 보유된 비드에 결합된 연합 세포는 비드가 자성 어레이에 위치상 고정되는 동안 용해된다. 보유된 비드는 증폭 및/또는 서열분석 표적 뉴클레오티드 서열을 위한 부착된 프라이머 또는 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다. 프라이머는 범용 프라이머, 또는 각각의 비드에 결합된 세포의 유형과 연합된 특정 서열에 표적화된 프라이머일 수 있거나, 또는 바코드가 있는 범용 프라이머 또는 범용 프라이머 세트일 수 있다. 예를 들면, 바코드는 각각의 비드에 결합된 세포 유형, 또는 상이한 프라이머 유형의 조합과 연합된다. 일부 실시양태에서, 세포를 용해시킨 후, 역전사 및/또는 증폭 반응을 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 증폭은 특정 RNA의 양이 각각의 비드 및 그로 인한 각각의 세포 유형에 대해 결정될 수 있는 실시간 PCR 반응이다. 다른 실시양태에서, 증폭 반응은 PCR 반응 또는 등온 반응이고, 상기 비드 상에 클로날 집단을 형성할 수 있거나, 또는 각각의 클론 유형이 상이한 프라이머를 사용할 수 있는 멀티클로날 집단을 형성할 수 있다. 다른 실시양태에서, 각각의 비드 유형 및 그로 인한 각각의 세포 유형과 연합된 증폭된 서열(들)의 서열을 결정하기 위하여 합성 반응에 의한 서열분석이 후속적으로 수행된다.
추가 실시양태에서, 세포의 용해 후, DNA, RNA 또는 특정 전하의 다른 분자가 보유될 수 있고, 비드는 제거될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 비드가 상기 자성 어레이로 도입될 수 있다. 새로이 도입된 비드는 본원에 기재된 바와 같은 새로이 도입된 비드와 연합된 상이한 프라이머 유형을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 자성 특징의 어레이는 바람직한 위치가 자성 또는 상자성 비드 또는 입자에 의해 유지되도록 형상화될 수 있다. 상기 바람직한 위치는 센서(들)에 대해 입자를 적절하게 위치시키고/거나 고정된 위치에서 입자를 유지하기 위하여 요망될 수 있고, 그 결과 입자 및 입자에 부착된 전하는 상기 센서(들)에 대해 움직이지 않는다. 일부 실시양태에서, 바람직한 위치는 적어도 부분적으로 도 6에 나타낸 바와 같은 자성 어레이 요소 형상의 배위로부터 야기될 수 있다. 도 6은 어레이에서의 적어도 일부의 형상이 자성 플럭스의 밀도가 자성 어레이의 다른 말단 또는 몇몇 다른 부재보다 자성 어레이 부재의 한쪽 말단에서 보다 농축되도록 형상화될 수 있는 2개의 상이한 배위 (600)를 예시한다. 최상부 두 쌍의 자성 요소에서, 좌측 사다리꼴 자성 어레이 요소 (604)는 상기 사다리꼴 자성 어레이 요소의 북쪽 기둥에서보다 남쪽 기둥에서 더 좁다. 자성 어레이 요소로부터 발산하는 전체 플럭스 수준이 2개의 말단에서 동일해야 하므로, 사다리꼴 자성 어레이 요소 (604)의 보다 좁은 말단에서의 플럭스 밀도가 상기 사다리꼴 자성 어레이 요소의 보다 넓은 말단에서보다 더 높을 것이다. 보다 높은 플럭스의 농축은 자성 또는 상자성 요소에서 발휘되는 보다 높은 힘과 부합하므로, 우측에 있는 유사한 크기의 자성 어레이 요소 (606) (여기서 우측에 있는 자성 어레이 요소 (606)에서의 요소는 유사한 크기이지만 직사각형이어서 보다 낮은 플럭스 밀도 및 힘을 가짐)에 의해 발휘되는 것보다 높은 힘이 상기 사다리꼴 자성 어레이 요소 (604)의 보다 좁은 말단에 의해 자성 또는 상자성 입자 또는 비드 (602) 상에서 발휘될 것이다. 유사하게, 우측에 있는 유사한 크기의 사다리꼴 자성 어레이 요소 (608) (여기서 우측에 있는 자성 어레이 요소 (608)에서의 요소는 자성 또는 상자성 입자 또는 비드 (602)를 향해 배향된 그의 보다 넓은 말단을 가짐)에 의해 발휘되는 것보다 높은 힘이 사다리꼴 자성 어레이 요소 (604)의 보다 좁은 말단에 의해 자성 또는 상자성 입자 또는 비드 (602) 상에서 발휘될 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 자성 또는 상자성 입자, 또는 도 7에 나타낸 바와 같은 비드 (702)의 움직임을 억제하도록, 추가의 특징이 자성 어레이의 제조의 일부로서 도입될 수 있다. 나타낸 실시양태에서, 자성 또는 상자성 입자 또는 비드 (702)는 좌측 사다리꼴 자성 어레이 요소 (704)의 좁은 말단을 향해 우선적으로 당겨지고, 2개의 포스트 (710)와 접촉하도록 당겨질 뿐 아니라 어레이의 표면과 접촉하도록 아래로 당겨져서, 상기 자성 또는 상자성 입자 또는 비드 (702)를 완전히 안정화하도록 3개의 접촉 점을 제공한다. 포스트 및 자성 어레이 요소는 이온, dNTP 효소 및 다른 잔기에 의한 최대 접근을 허용하도록 최소량의 표면 접촉 면적을 제공할 수 있다. 포스트 및 자성 어레이 부재는 센서 어레이의 상이한 부재들 사이에서 재현가능한 신호 수준을 제공하도록, 센서 요소에 대한 단단한 저항성을 가지고 위치할 수 있다.
추가 실시양태에서, 자성 또는 상자성 입자가 웰의 상부 코너 상에 위치할 수 있도록, 작은 웰이 사용된다. 웰은 효소, dNTP, 이온 및 다른 잔기에 의해 자성 또는 상자성 입자의 최하부에 보다 잘 접근하도록 하기 위하여, 둥근형일 수 있거나, 자성 또는 상자성 구조가 일반적으로 구형인 경우 둥근형 이외에 몇몇 다른 형상일 수 있다.
일부 실시양태에서, 자성 어레이는 혼성화 검출, 혼성화 철수(pullout), 또는 서열분석을 위한 클로날 집단을 생성하기 위해 사용된다. 검정은 증폭이 발생한 자성 어레이의 위치에 있는 비드로 수행될 수 있거나, 또는 비드는 증폭 반응이 일어나는 지역 또는 부피에서 또 다른 위치로 이동할 수 있다. 제2 위치는 또한 검정을 수행하기 위해 자성 고정화를 사용할 수 있거나, 또는 상이한 고정화, 예컨대 비오틴 스트렙타비딘 결합을 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 센서는 비드 상의 DNA와 연합된 전하와 센서 사이의 상호작용을 최대화하도록, 자성 또는 상자성 입자 하에 직접 위치된다. 다른 실시양태에서, 비드는 고정되어 자유롭게 회전할 수 없는 방식으로 결합 또는 연합될 수 있다. 수성 환경에 접근하지 않는 결과로 반응이 억제될 수 있는 표면과 직접 접촉하는 지역과 반대로, 수성 환경에 대한 자유로운 접근을 갖는 입자의 지역에 대한 접근을 허용하고 폴리머라제, dNTP 및 다른 잔기에 대한 접근이 허용되고 그 후 센서에 의해 판독될 수 있는 최적의 효소적 반응을 가질 수 있도록, 센서를 상자성으로부터 중심을 벗어나게 위치시키는 것이 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 자성 또는 상자성 입자의 모든 표면으로의 효소, dNTP 및 이온에 의한 최적 접근을 제공하기 위해 자성 또는 상자성 입자를 회전시키기 위해 채널에서 발생하는 시차 유동을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 시차 유동은 작은 채널의 전형적인 포물선형 유동으로부터 기인하며, 여기서 채널의 표면에서의 벌크 유속은 0이고, 채널에서의 최대 유속은 전형적으로 상기 채널의 중심에서 최고이다. 이는 채널의 하단과 자성 또는 상자성 입자의 상단 간의 유의한 유속 차이를 초래할 수 있다. 자성 또는 상자성 입자의 상단과 하단 간의 유속 차이는 입자 크기, 채널의 높이 및 폭, 및 채널에서의 평균 유속의 함수일 것이다. 자성 또는 상자성 입자에 부착될 수 있는 DNA 및/또는 다른 잔기는 상기 자성 또는 상자성 입자의 상단에서의 비교적 높은 유속으로 인해 자성 또는 상자성 입자의 상단 상에서 항력 또는 견인력을 제공할 수 있다. 하단에서의 유속은 반대로 본질적으로 0으로 유지될 것이며, 따라서 상당한 회전 추동력을 생성한다. 다른 물리적 특징과 잠재적으로 조합된 자성 어레이 요소는 상기 자성 또는 상자성 입자의 위치를 유지시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 유속은 센서를 판독하고 따라서 일정한 평균 회전비를 유지하면서 dNTP 및/또는 다른 시약을 도입하고 유동시키면서 일정한 유속에서 유지된다. 다른 실시양태에서, 자성 또는 상자성 입자의 상당한 진동 및 움직임을 방지하기 위해 센서를 판독하면서 유속을 감소시키는 것이 바람직하다. 또 다른 실시양태에서, 자성 또는 상자성 입자의 더 큰 표면적이 센서와 상호작용하도록 허용하기 위해 센서를 판독할 때 유동 셀을 통해 시약을 유동시키면서 유속을 증가시키는 것이 바람직하다. 이는 증가된 평균화 효과를 허용할 수 있으며, 이는 자성 또는 상자성 입자의 표면 상의 DNA 부착 밀도의 변동으로 인한 센서 판독 변동, 또는 입자 형상의 불균칙성으로 인한 센서 판독 변동을 감소시킬 수 있다.
다른 실시양태에서, 자성 또는 상자성 입자의 회전비 또는 이동비를 변형시키기 위해 유속 속도의 변화로부터 기인하는 것과 다른 힘이 사용된다. 일부 실시양태에서, 플럭스 수준은 자성 어레이 요소의 더 높은 투과성의 결과로서 자성 어레이 요소를 통해 커플링될 수 있는 외부 자석의 이동의 결과로서 변형될 수 있다. 대안적 실시양태에서, 입자와 상호작용하는 플럭스의 양에 영향을 미치기 위해 전자석이 사용된다. 자성 플럭스의 양의 이러한 변화는 자성 또는 상자성 입자에 작용하는 마찰력을 감소시킬 수 있으며, 이는 대략 회전을 허용한다.
또 다른 실시양태에서, 자성 또는 상자성 입자를, 부분적으로 비드 및 결합된 DNA의 분극성의 결과로서 회전시키기 위해 자기장 또는 전기장이 사용된다.
일부 실시양태에서, 센서와 일대일 대응으로 회합된 적절한 위치로 유동 셀을 통한 위치 자성 또는 상자성 입자로의 시약의 유동으로부터 기인하는 것 이외의 힘을 사용하는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 자성 또는 상자성 입자는 유동 셀 또는 셀들로의 시약 스트림에서 유동될 수 있고, 더 높은 비율의 자성 또는 상자성 입자가 그러한 추가 자석 또는 전자석의 사용 없이 발생되는 것보다 센서와 일대일 대응으로 회합되도록 센서와 회합된 위치로 입자를 이동시키기 위해 자석 또는 전자석이 사용된다.
자성 어레이는 또한 어레이 위치로의 비드의 사실상 완전한 배정을 허용한다. 저속 유동은 원심분리의 요구 없이 비드와 어레이 위치 간에 일대일 대응으로 어레이에서 비드의 국재화된 체류를 가능하게 하기에 충분하다. 한 실시양태에서, 심지어 어레이 상의 충전 대 미충전 위치의 더 높은 수준이 필요하거나 바람직한 경우에도, 비드가 유동 셀에 재도입될 수 있도록 시약 유동은 순환될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 시약 유동은 비드가 유동 셀에 도입될 수 있을 때 정지되거나 저속화될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 시약 유동의 방향은 잠재적으로 수회 역전될 수 있으며, 이는 비드가 어레이를 충전시킬 기회를 더 많이 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 비드는 후속 서열분석 과정에서 사용될 수 있도록 저장 위치에 대한 유입구 또는 출구를 통해 비드를 유동시킴으로써 비드를 유동 셀로 유동시킨 후 유지된다. 비드가 의도된 비드 위치 이외의 위치에서 점착하는 것을 방지하기 위해, 유동을 증가시켜 임의의 약하게 유지된 비드를 제거하나, 바르게 유지된 비드를 유지시킬 수 있다. 화학적 과정, 예컨대 서열분석 또는 증폭이 완결된 후, 비드는 체류 장 플럭스를 감소시킴으로써, 비드를 어레이로부터 멀리 견인하는 새로운 장을 첨가함으로써, 유체의 유속을 증가시킴으로써, 표면 장력을 포함할 수 있는, 기포와 회합된 공기 물 계면을 사용함으로써, 또는 상기 단계의 임의의 조합에 의해 제거될 수 있다.
특정 실시양태에서, 도 3에 나타낸 바와 같이, 전극의 어레이는 DC 장 또는 유전이동 장, 또는 양자 모두를 사용하여 대전된 비드를 유지하는데 사용된다. 자성 어레이와 마찬가지로, 비드를 유지하는데 웰 구조가 필요하지 않으며, 이는 용액 중 성분의 자유 유동을 허용한다. 용액 중 대전된 성분, 예컨대 DNA 샘플, 뉴클레오티드, 효소 및 다른 대전된 잔기가 어레이 위의 부피를 통해 용이하게 유동할 수 있는가를 확신하기 위해, 대전된 비드를 유지하기에 충분한 진동 주파수가 사용되나, 용액 중 잔기가 유지되는 비드로부터 멀리 유동하거나 확산하도록 허용하도록 충분히 느리다. 센서와 일대일 대응으로 회합된 함몰부의 첨가는 우수한 검출을 허용하는 센서와 비드 간의 우수한 정렬을 가져올 수 있다. 대안적 실시양태에서, 페데스탈 또는 등록 지주(registration post) 또는 다른 3차원 구조가 사용되며, 예를 들어 우수한 유체 유동을 위해 혼입될 수 있다.
비드가 어레이에 일대일 대응으로 국재화될 수 있는 대안적 실시양태에서, 비드는 자기장 또는 전기장에 의해 제자리로 제공될 수 있으며, 이어서 대안적 수단, 예컨대 DNA 혼성화, 비오틴 스트렙타비딘 결합, 티올 결합, 광-활성화된 결합, 공유 결합 등에 이해 제자리에 유지될 수 있다. 결합은 온도 변화, 빛 적용에 의해, 또는 비드를 상기 자기장 또는 전기장에 의해 일대일 대응으로 유지시키면서 결합 시약 또는 촉매 중에서 세척함으로써 개시될 수 있다. 결합이 발생된 후, 자기장 또는 전기장 강도는 세기 또는 주파수를 변화시킬 수 있으며, 잠재적으로 꺼진다. 결합은 가역적일 수 있으며, 이는 비드가 센서의 어레이 위의 부피에서 세척되는 것을 허용한다.
일부 실시양태에서, 자성 또는 상자성 입자는 그 위에 폴리머라제 또는 다른 효소, 뿐만 아니라 샘플 DNA, dNTP 이온 및 다른 잔기가 이를 통과하여 접근하는 것을 제공하기에 충분한 기공률을 갖는 표면 코팅을 가질 수 있다. 코팅은 프라이머가 적절한 간격으로 부착될 수 있고, 이에 의해 샘플 DNA의 더 큰 밀도를 제공하여 이에 의해 위치된 센서와 상호작용하도록 대전될 수 있도록 구성될 수 있다. 상기 코팅은 아가로스, 폴리아크릴아미드 또는 다른 가교 중합체일 수 있거나, 또는 다공성 유리로 제조될 수 있다.
다른 실시양태에서, 비드는 DNA, 단백질 또는 다른 대전된 잔기가 표면 코팅 없이 상기 비드와 상호작용할 때 초래될 수 있는 비특이적 결합의 양에 비해 상기 DNA, 단백질 또는 다른 대전된 잔기의 비특이적 결합을 최소화하거나 감소시키도록 구성된 코팅을 가질 수 있다. 상기 코팅은 유동 셀, 센서, 풍부화 모듈 또는 자성 어레이의 표면 상에 사용하기 위한 본원에 기재된 코팅과 유사할 수 있으며, 한 표면을 위한 본원에 기재된 임의의 코팅이 다른 표면 상에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 비드는 자성 코어를 갖고, 코어는 그 위에 불투과성 코팅을 가질 수 있다. 상기 코팅은 DNA의 다중 가닥과 결합, 부착 또는 회합될 수 있다. 예를 들어, DNA 가닥은 각각 실질적으로 동일한 롤링 써클 앰플리콘일 수 있으며, 이는 DNA의 다중 가닥을 제공하며, 여기서 각각의 가닥은 한 DNA 표적의 다중 인접 카피를 갖는다.
도 8은 비드를 어레이에서 센서와 일대일 대응으로 유지시키기 위한 대안적 방법 및 시스템에 대한 한 실시양태를 예시한다. 도 8은 시스템 (800)을 예시하며, 여기서 개별적 컨트롤 라인 (810)이 활성화되고, 따라서 구조 (812)의 한 층이 기판 (804) 및 유체성 구조 (802) 사이의 유동 셀 부피 (806)로 순차적으로 팽창되고, 컨트롤 라인 (810)이 활성화될 때 과량의 비드 (808)를 대체함으로써 센서와 일대일 대응을 초과하는 수준으로 비드 (808)를 밀어낸다. 비드 (808)는 이어서 서열분석 주기 동안 제자리에 유지될 수 있다. 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 비드 이동을 위한 불충분한 공간이나 컨트롤 라인 아래에 액체 유동을 위한 충분한 공간이 있다. 서열분석 주기의 세트가 완결된 경우, 컨트롤 라인이 비활성화될 수 있고, 이어서 비드 (808)가 센서 어레이 영역을 통한 유체 유동에 의해 제거될 수 있다.
대안적 실시양태에서, 비드의 개수는 센서의 개수보다 낮을 수 있다. 비드의 개수는 센서의 개수와 인접할 수 있으며, 컨트롤 라인은 비드가 센서와 국재화되도록 활성화된다. 상기 국재화는 센서 어레이 영역에서 유동 방향을 교대로 하고, 떨림 또는 진동 등을 도입함으로써 보조될 수 있으며, 이와 같이 비드는 컨트롤 라인을 충분히 활성화시킴으로써 움직임이 방지되는 그러한 시간까지 빈번한 움직임을 경험하며, 상기 컨트롤 라인은 비드가 한 센서 영역로부터 또 다른 영역으로 이동하는 것이 가능하도록 허용하기에 너무 낮다. 컨트롤 라인의 추가 활성화와 조합된 비드의 추가 이동은 센서보다 비드를 더욱 완전히 중심으로 작용하게 할 것이다.
추가의 대안적 실시양태에서, 도 8에 나타낸 바와 유사한 형상을 갖는 구조는, 형상이 컨트롤 라인이 완전히 활성화되는 것이 발생하는 형상과 유사하도록 성형, 기기화 또는 이와 달리 형성될 수 있다. 상기 구조는 비드 커버된 센서 어레이보다 천천히 더 낮아질 수 있다.
또 다른 추가 실시양태에서, 더 높은 백분율의 센서가 회합된 비드를 갖게 하기 위해, 비드는 비드 세트가 상기 언급된 구조 중 하나에 의해 국재화된 후 비오틴 스트렙타비딘 결합, 티올 결합 등에 의해 센서에 부착될 수 있다. 이어서 추가 비드가 센서 어레이 영역에 도입되고, 과정이 반복될 수 있다. 사전에 기재된 바와 같이 실행될 수 있는 바와 같이, 결합제가 센서 위의 구역으로 국재화되는 경우, 구조에 의해 포획되거나 죄어진 임의의 과량의 비드는 결합하지 않을 것이고, 서열분석 주기를 시작하기 전에 세척될 수 있다.
또 다른 추가 실시양태에서, 상당한 과량의 비드가 센서 어레이 영역에 도입될 수 있다. 센서 어레이 영역으로부터 출구에서의 단일 컨트롤 라인은 비드 세트를 트랩핑하기 위해 활성화될 수 있다. 수성 조건 및/또는 온도는 비드의 센서로의 결합을 허용하도록 변화될 수 있다. 이어서 과량의 비드가 수성 시약과 센서 어레이 영역 밖으로 비드를 유동시키는 컨트롤 라인을 방출시킴으로써 제거될 수 있다.
일부 실시양태는 이전 센서 디자인 위에 제작될 수 있는 가역적 환원성 층의 혼입의 결과로서 전기화학 검출과 pH 감지를 조합한다. 그러한 센서는 세노바 시스템즈(Senova Systems)로부터 이용가능하다. 서열분석 주기 동안, 염기가 센서와 회합된 비드에 혼입되는 경우 환원성 반응이 발생할 것이다. 환원의 수준은 측정될 수 있고, 서열분석 주기의 완결 후, 전압이 센서 상에 인상을 남길 수 있으며, 이는 표면의 산화를 유발시켜, 그의 원래 상태로 되돌아오게 하고, 그 결과 이는 다음 서열분석 주기를 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 자성 비드는 자성 어레이 없이 사용된다. 자성 비드는 그 자체 균일한 간격으로 단층으로 조립되며, 그의 간격은 외부 자석의 사용에 의해 영향을 받아, 국부 자장 강도를 변화시킬 수 있다. 상기 자성 비드는 센서 어레이의 간격과 매칭되는 간격으로 분리되도록 유발될 수 있으며, 이어서 사전에 기재된 바와 같이 수성 조건, 온도 등을 변화시킴으로써 센서 어레이에 결합하도록 유발될 수 있다. 센서와 비드의 정렬을 가능하게 하기 위해 결합 후 비드의 느린 번역 또는 이동이 적절할 수 있다. 그러한 번역 또는 이동이 x, y, 세타 및 간격을 포함할 수 있는 다중 치수에서 발생할 필요가 있을 수 있다. 일대일 대응으로 센서와 회합된 함몰부는 우수한 검출을 허용하는 센서와 비드 간의 우수한 정렬을 가져올 수 있다.
도 11은 자성, 상자성, 비-자성 입자가 자성 체류 (1102)를 갖는 센서 어레이, 전기적 구속을 갖는 센서 어레이, 또는 자가 조립 입자를 갖는 센서 어레이와 사용하기 위한 구형 이의외 형상일 수 있는 다양한 실시양태를 예시한다. 입자는 평면형, 원형, 직사각형 (1104), 별 형상, 6각형 (1106) 또는 다른 형상일 수 있다. 다른 실시양태에서, 입자는 상기 입자의 표면적을 확대시킨 수지상일 수 있다. 상기 수지상 입자는 일반적으로 구형, 평면형, 타원형 또는 임의의 다른 형상일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 입자는 다공성일 수 있으며; 상기 입자가 다공성인 경우, 세공 크기는 적절한 경우 프라이머 연장 서열분석 또는 다른 적용을 위해 필수적인 DNA, 폴리머라제, dNTP 및 다른 잔기의 자유 이동을 허용하도록 충분한 크기일 수 있다.
자성 막대 어레이를 필요로 하지 않는 또 다른 실시양태에서, 비드는 롤링 써클 증폭을 사용함으로써 생성되는 DNA 공으로 대체될 수 있다. 이어서 DNA 공은 DNA 뉴클레아제에 의해 소화될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 공은 단량체 또는 중합체, 예컨대 폴리스티렌으로부터 제작될 수 있으며, 이는 서열분석 다음에 유기 용매, 예컨대 아세톤을 사용하여 용해될 수 있으며, 따라서 동일한 과정에 의해 부착된 DNA를 분리한 후, 양자 모두 상기 유동 셀을 통해 시약을 유동시킴으로써 유동 셀로부터 제거될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 웰에 부착된 모이어티와 비드에 부착된 모이어티 간의 결합에 의해 비드를 제자리에 유지시킬 수 있다. 웰은 비드의 반경보다 더 짧을 수 있고, 시약이 비드 주변으로 흐를 수 있도록 원형이 아닌 다른 형상을 가질 수 있으며, 비드는 상기 웰의 입구에 있는 여러 지점에서 결합될 수 있다. 이 결합은 스트렙타비딘 비오틴 결합, DNA DNA 결합, DNA PNA 결합, PNA PNA 결합, 티올 Au 결합, 광활성화 결합, 공유 결합 등일 수 있다. 상기 결합은 온도를 증가시킴으로써, 또는 웰 상의 모이어티와 비드 상의 모이어티 간의 친화도를 감소시키는 시약을 도입함으로써 해제될 수 있으며, 그에 따라 시약을 상기 유동 셀을 통해 유동시킴으로써 비드는 유동 셀로부터 제거될 수 있다. 비드 및 웰 구조에 음파처리를 함으로써 비드를 상기 비드가 결합되어 있는 웰로부터 이동하도록 추가로 유도할 수 있다. 상기 유동 셀로부터 상기 비드를 제거하기 위해 시약이 유동 셀을 통해 흐르게 됨과 동시에 음파처리를 실시할 수 있다.
가출원 61/491081에 기재된 바와 같은, DNA를 무챔버 시스템에서 증폭시키는 과정에서, 다양한 인자를 잠재적으로 최적화에 적용할 수 있다. 이들 중에는 주파수, 전압, 및 폴리머라제, 표적 DNA 및 생성된 앰플리콘을 구속하기 위해 사용되는 구속 "셀"의 크기 및 형상이 포함된다. 구속이 유일한 고려사항인 경우에는, 상기 앰플리콘의 작은 크기를 무시한다면 거의 임의의 크기의 앰플리콘을 구속하는 것이 가능할 것이다. 그러나, 전계가 적절한 구속을 보장하기에 충분히 강할 수 있게 하기 위해, 전계는 PCR 또는 등온 증폭 과정 동안 폴리머라제의 적절한 염기 혼입 활성을 방지할 수 있거나, 또는 표적 DNA 연장된 프라이머 및 폴리머라제의 복합체로부터 폴리머라제 및 또는 연장된 프라이머를 끌어당길 수 있다. 한 실시양태에서는, 앰플리콘의 크기에 따라, 주파수, 전압 및 구속 셀의 크기의 조합을 최적화하는 것이 바람직하다.
일부 실시양태에서, 증폭 반응은 역 PCR 증폭, 핫 스타트(hot start) PCR 증폭, 메틸화 특이 PCR 증폭 (MSP), 네스티드(nested) PCR 증폭, 역전사 반응, 역전사 PCR 증폭 (RT-PCR), 터치다운(Touchdown) PCR 증폭, 서열간 특이 PCR 증폭 (ISSR-PCR), 낮은 변성 온도에서의 동시-증폭 (COLD-PCR), 고체 상 증폭, 브릿지 PCR 증폭, 또는 단일 프라이머 브릿지 증폭이다.
일부 실시양태에서, 증폭 반응은 헬리카제 의존성 증폭 (HDA), 니킹(nicking) 효소 증폭 (NEAR), 레콤비나제 폴리머라제 반응 (RPA), 전사 매개 증폭 (TMA), 자가 유지 서열 복제 (3SR), 핵산 기반 증폭 (NASBA), RNA에 대한 신호 매개 증폭 기술 (SMART), DNA에 대한 루프 매개 등온 증폭 (LAMP), 등온 다중 치환 증폭 (IMDA), 고체 상 등온, 브릿지 등온, 단일 프라이머 등온 증폭 (SPIA), 원형 헬리카제 의존성 증폭 (cHDA), 또는 롤링 써클 증폭이다.
전기영동 농축 또는 구속을 위한 DC 전계를 생성함에 있어서, 전기분해 생성물이 구축될 수 있다. 이들에는 히드로늄 및 히드록시드 이온이 포함된다. 이들 이온으로부터의 영향을 최소화하기 위해 DC 전계를 펄스화하여 순(純) DC가 훨씬 더 낮아지도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서 DNA가 중심 전극에 보다 가까이 이동한 후 펄스 듀티 사이클을 감소시킬 수 있다. 다른 실시양태에서 이 과정은 DNA를 농축시키기 위해 DC를 사용하고, 이어서 상기 전기분해 생성물의 농축 또는 구속을 유지하기 위해 AC를 사용할 수 있다. 다른 실시양태에서는 농축 및 구속을 위해 DC 및 AC 둘 모두를 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 펄스장 겔 전기영동이 사용된다. 예를 들어, 비-사인곡선형 AC 파형이 사용될 수 있는데, 이때 보다 높은 양전압은 보다 길지만 보다 짧은 음전압에 의해 평균 전압이 실질적으로 0이 되도록 균형이 맞춰질 수 있다. 중합체 용액 중에서 DNA의 전개가 일어나도록, 보다 높은 양전압이 중합체 농축과 함께 사용될 수 있다. 중합체 용액은 보다 높은 강도의 전계에서의 이동과 비교하여 보다 낮은 전계 방향 중에서 DNA의 보다 낮은 이동을 효과적으로 유발할 수 있는데, 이로 인해 DNA의 이동성이 증가될 수 있다. 이러한 방식으로 DNA는 목적하는 방향으로 더 많이 이동할 수 있는 반면, Mg와 같은 다른 분자들은 AC 파형의 균형잡힌 성질로 인해 자유로이 앞뒤로 이동한다. 이동에서의 변화는 또한 주파수 의존적일 수 있고, 그에 따라 상이한 크기의 DNA가 포획될 수 있다. 펄스장 겔 전기영동은 1D 또는 2D일 수 있으며, 컨투어 클램프드(contour clamped) 전계, 횡방향 교번 자계 전기영동, 또는 회전 겔 전기영동을 사용할 수 있는데, 이들은 모두 겔, 복합 중합체, 또는 또 다른 사분(sieving) 매트릭스 중 하나와 함께 사용될 수 있다.
유전영동 전계를 생성함에 있어서, 전형적으로 사인곡선형 파형이 사용된다. 이것은 엄격하게 상이한 종의 구속 또는 분리를 목적으로 한 적용에 이상적일 수 있지만, 구속 부피 내에서 생화학 반응이 수행될 수 있는 시스템의 경우 문제를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 높은 전계는 국부적인 가열을 일으킬 가능성이 있다. 한 실시양태에서, 변형된 사인곡선형 파형이 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 변형된 사인곡선형 파형은 사인곡선의 상부에서, 또는 사인곡선형 파형 중의 다른 임의의 지점에서 전압이 제거되게 할 수 있는데, 이는 국부적 확산을 허용하여, 프라이머에 대한 앰플리콘의 혼성화, 이중체 DNA에 대한 폴리머라제의 결합, 및 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 결합 및 혼입을 가능하게 한다. 전계는 그 후 적절한 시간 기간 후에 회복될 수 있다. 동일한 과정이 변형된 사인곡선형 파형 내의 반대 신호 피크에서 일어날 수 있다. 다른 실시양태에서는, 농축 또는 구속을 위해 임의의 다른 교류 파형이 사용될 수 있다. 대안적으로, 사인곡선형 파형 중의 간섭이 매 주기마다 1회 일어날 수 있거나, 또는 여러 주기마다 1회 일어날 수 있거나, 또는 다수의 주기 중에 1회 일어날 수 있는데, 그에 따라 임의의 "표류(stray)" 앰플리콘이 가장 낮은 전계 강도 영역에서 포획되어 구속 부피 중의 주요 부피로 복귀될 수 있다. 대안적으로 사각형, 사다리꼴, 비대칭 파동 형태 등과 같은 다른 파동 형태가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서 소형 마이크로유체 장치 내에서 모노클로날 비드가 생성될 수 있다. 한 실시양태에서 전극 및 자석이 얇은 시트 상에 제작될 수 있으며, 여기서 상부 표면이 제 위치에서 결합 또는 융합되어 통합 마이크로유체 장치를 생성할 수 있다. 이 마이크로유체 장치에는 전기 및 유체 연결부가 만들어질 수 있다. 이 마이크로유체 장치는 이어서, 예를 들어 진공 또는 공기 압력에 의해, 제1의 가열된 플레이트에 대해 양호하게 열 접촉되는 곳에 위치할 수 있다. 제2 플레이트는 상이한 온도에서 그 위에 위치할 수 있다. 이들 두 온도는 PCR 증폭을 용이하게 하도록 선택될 수 있다. 하나의 온도 지점이 완성된 후, 카드는 상부의 가열된 플레이트와 접촉하도록 (예를 들어 진공 또는 공기 압력에 의해) 이동되거나 또는 유도될 수 있다. 온도 변화를 위해 오로지 얇은 카드 및 상기 카드 중의 시약만이 필요하기 때문에 상기 시스템은 빠른 온도 전이를 가질 수 있고, 최소량의 동력을 소비할 수 있다.
최소량의 열 질량을 제공하는 다른 실시양태에서, 증폭 마이크로유체 장치 내로 구축된 전극이 국부적으로 액체를 가열시키는 저항성 가열기로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서는 보다 양호한 열 제어를 위한 온도 측정을 위해 전극의 저항 변화가 이용된다. 다른 실시양태에서는 관심 영역에 대한 보다 양호한 제어를 위한 온도 센서로서 나노브릿지(NanoBridge) 또는 나노니들(NanoNeedle) (본원에 기재됨)과 같은 센서가 사용된다.
일부 실시양태에서, DNA의 단일 복제본으로부터 DNA 증폭을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 증폭 과정의 초기 지점에서, 예컨대 PCR 증폭 중의 제1 주기에서 증폭 중에 폴리머라제 오류가 일어나는 경우, 이 오류는 급증하여, 올바른 서열과 오류 서열 간에 분별이 불가능하게 될 정도로 될 것이다. 열안정성 폴리머라제는 전형적으로 중온성 폴리머라제 또는 호열성 폴리머라제 (이들은 PCR의 변성 단계 동안 불활성화되는 바 PCR에 적합하지 않을 수 있다)보다 훨씬 더 높은 오류 비율을 갖는다. 따라서, 일부 실시양태에서, PCR 반응의 초기 부분에 있어서 고도로 정확한 폴리머라제를 사용하는 것이 바람직한데, 여기서 고도로 정확한 폴리머라제는 PCR 동안의 불활성화를 방지하기에 충분히 열안정성이지는 않지만, 보다 열안정성인 폴리머라제보다 더 양호한 정확성을 제공할 수 있다. 고도로 정확한 폴리머라제는, PCR 증폭의 변성 단계 동안의 상당한 불활성화를 방지하기에 충분히 안정할 수 있는 다른 폴리머라제의 존재 하에서 활성 연장 부위에 실질적으로 결합하도록 낮은 Koff를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 고도로 정확한 폴리머라제는 보다 열안정성인 폴리머라제의 도입 전에 프라이머 및 주형이 있는 부피에 도입된다. 다른 실시양태에서, 열안정성인 폴리머라제는 열 활성화되는데, 그에 따라 임의의 열 활성화된 폴리머라제는 PCR의 제1 주기(들) 동안 불활성이 될 것이다.
다른 실시양태에서 등온 및 PCR 증폭 반응의 조합이 사용된다. 초기 증폭은 고도로 정확한 비(非) 열 안정성 폴리머라제에 의해 실시될 수 있고, 후속 증폭은 PCR의 변성 단계에 의해 실질적으로 불활성화되지 않는 보다 덜 정확한 열 안정성 폴리머라제에 의해 실시될 수 있다.
대안적 실시양태에서, 센서 어레이 중의 개별 센서 영역에서 클론 집단이 생성된다. 센서는 나노니들 또는 나노브릿지 또는 중합 사건을 검출하는 다른 센서일 수 있다. 한 실시양태에서, 프라이머는 센서의 표면에 우선적으로 부착된다. 프라이머는 물질에서의 차이의 결과로서 우선적으로 부착될 수 있는데, 여기서 센서의 물질은 부착에 있어서 센서 어레이의 센서들 사이의 영역보다 더 유리하다. 대안적 실시양태에서, 센서 어레이의 센서들 사이의 영역에 마스크가 적용될 수 있으며, 이어서 표면 개질이 실시될 수 있다. 후속적으로, 마스크는 제거될 수 있는데; 그에 따라 표면 개질이 실시되지 않은 센서 어레이의 센서들 사이의 영역이 남게 된다. 표면 개질에는 비오틴 부착, 금 층의 적용 및 당업계에 공지된 다양한 다른 방법이 포함될 수 있다.
이어서 프라이머는 센서 어레이 중의 센서의 표면 상의 영역에 우선적으로 적용될 수 있다. 한 실시양태에서, 프라이머는 비오틴 스트렙타비딘 결합의 결과로서 부착되는데, 여기서 스트렙타비딘은 프라이머의 5' 말단에 부착된다. 또다른 실시양태에서, 티올 기가 프라이머의 5' 말단에 부착될 수 있는데, 이는 이어서 사전에 센서 위에 적용된 금 층에 결합되어, Au-S 결합을 형성할 수 있다. PCR 반응이 요망되는 경우, 프라이머를 DTPA로 개질시켜 2개의 티올 금 결합이 형성되도록 할 수 있는데, 그에 따라 다른 경우에는 PCR에서 상용되는 60 내지 95C 온도에서 일어날 수 있는 용해가 방지된다.
한 세트의 서열분석 주기가 완료된 후, 프라이머는 제거 및 대체된다. 완충제 조건은, 낮은 pH에서 고농도의 GuHCl과 같이, 비오틴 스트렙타비딘 결합을 약화시키도록 변경될 수 있다; 대안적으로 온도를 70C 이상으로 증가시켜 비오틴 스트렙타비딘 결합이 파괴되도록 할 수 있다. 승온시에 티올 결합이 이와 유사하게 파괴될 수 있다. 폴리머라제 및 DNA에 대한 손상이 더 이상 중요하지 않은 바 공격적 수단이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 연장된 프라이머와 표면 간의 결합, 예컨대 공유 결합을 파괴하기 위해 유기 시약이 사용된다. 연장된 프라이머의 제거 후, 신규한 프라이머를 센서 위의 부피 내로 흘려보내어, 장치가 또 다른 세트의 DNA 샘플에 대한 또 다른 세트의 서열분석 주기 동안 다시 사용될 수 있게 할 수 있다.
도 12에 도식적으로 도시된 바와 같이 일부 실시양태에서, 센서 어레이는 전극으로 구성된 추가의 어레이 (1206)가 구비된 요소 (1200)를 가질 수 있는데, 이는 유전영동 농축의 실시를 위해 사용될 수 있다. 유전영동 농축은 초기에 샘플 DNA dNTP, 및 프라이머를 각각의 센서 영역으로 유인하기 위해 실시될 수 있다. 이어서 샘플 DNA 분자가 위치된 각 센서의 영역에서 증폭이 시작될 수 있다. 증폭 과정 동안, 유전영동의 힘은 또한 앰플리콘을 유지함으로써 증폭 단계에 있는 상이한 센서 영역들 간의 교차 오염을 방지하는데 도움이 될 수 있다. 폴리클로날 영역이 생성되지 않도록 확실히 하기 위해, 투입 DNA의 농도는 대부분의 센서 영역이 1개 또는 0개의 샘플 DNA 분자를 갖도록 충분히 낮을 필요가 있다. DNA 샘플은 증폭 방법론에 따라 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 증폭 반응은 PCR 반응, 또는 등온 반응 중 어느 하나일 수 있다. 일부 실시양태에서 추가의 전극 (1206)은 센서의 전압 수준과 비교해 동일한 전압을 갖는 것으로 제시된다. 대안적 실시양태에서 센서의 양 측면의 전극은 서로에 대해 반대 신호의 전압을 가질 수 있다.
상기 센서 어레이 요소 (1200)는 기판 (1212) 상에 제작될 수 있으며, 자기 또는 상자성 입자 또는 비드 (1202)의 체류 동안 이용되는 자석 (1216)을 가질 수 있는데, 여기서 상기 자기 또는 상자성 입자 또는 비드는 전극 (1204), 유전체 (1210) 및 또는 상부 전극 (1208)에 대항하여 아랫쪽으로 유지될 수 있다. 검출에는 상기 전극 (1204) 및 상기 상부 전극 (1208)이 이용될 수 있으며, 유전영동 농축/구속에는 전극 (1204) 및 외부 전극 (1206)이 이용될 수 있는데, 여기서 상기 외부 전극은 단일 전극을 포함할 수 있거나 또는 다중 전극을 포함할 수 있다.
증폭은 한 프라이머가 비드의 표면 상에 있고, 제2 프라이머가 용액 중에 있는 고체 상 증폭일 수 있거나, 또는 증폭은 모든 프라이머가 비드 상에 있는 고체 상일 수 있다. 대안적으로, 증폭은 두 프라이머가 용액 중에 존재하고, 한 프라이머, 또는 두 프라이머가 비드 상에 또한 존재하여 수행될 수 있다.
전극 배위는 유동 셀의 두 주요 평면 상의 평면 전극을 포함한 다양한 상이한 형태를 취할 수 있거나, 또는 비드의 반대 표면 상에 한 전극, 및 각각의 검출기 위치와 연관된 보다 작은 전극들의 세트가 존재할 수 있다.
도 12는 서열분석 반응에서 센서의 어레이 중 센서 위의 증폭 영역의 사용을 도시한다. 증폭 반응이 완료된 후에, 센서 어레이 위의 부피를 세척하고, 앰플리콘, 폴리머라제 및 dNTP를 제거할 수 있다. 폴리머라제 및 개별적 dNTP는 센서 어레이 위의 부피로 흘러들어가, 결합, 혼입 및 혼입 이벤트의 검출을 허용하고, 상이한 증폭된 샘플 DNA 분자의 서열을 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 센서는 몇몇 목적, 예컨대, 예를 들어 비드의 도입시 비드의 존재의 검출, 비드와 연관된 증폭 (예를 들어, 실시간 PCR 증폭 또는 종점 PCR 증폭)의 검출 및 서열분석 반응의 검출을 위해 사용된다.
클로날 비드를 생성할 때, 큰 백분율의 비드가 DNA 주형을 갖지 않을 것이다. 또한, 다른 것은 불량한 증폭을 가질 수 있다. 이들 비드는 유용한 서열분석을 제공하지 않으며, 따라서 이들 비드를 제거하여 기기 처리량 및 시약 활용을 개선하는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 주형이 없거나 최소량의 주형을 갖는 비드는 전기장을 사용하여 분리된다. 비드 상에서 증폭이 일어난 비드는 증폭된 DNA로부터 보다 많은 고정된 음전하를 갖고, 비드 상에서 증폭이 일어나지 않은 비드는 전기영동 분리를 사용하여 이들로부터 분리될 수 있다. 이는 자기 어레이 중 대부분의 위치가 증폭 반응을 한 비드에 의해 차지된 것으로 묘사된 도 3에 나타내어진 바와 같은 상황을 허용하고, 따라서 서열분석 반응에서의 사용에 적합하다.
주형으로 완전히 로딩된 비드는 보다 높은 전하를 갖고, 따라서 전기장에서 단지 프라이머 또는 약간의 주형을 갖는 비드보다 더 멀리 이동할 것이다. 도 13a, 도 13b 및 도 13c에 나타낸 바와 같은 한 실시양태에서, 이러한 분리는 모듈을 통한 흐름에서 일어난다. 제1 유체 주입구 (1311A)는 혼합된 비드가 주입되도록 한다. 제2 유입구 (1312A)는 비드가 없는 완충 용액이 주입되도록 한다. 제1 출구 (1311B)는 제1 유입구 (1311A)로부터 하류에 있다. 제2 출구 (1312B)는 제2 유입구 (1312A)로부터 하류에 있다.
유체 유량은 보다 많은 액체가 제2 유입구에 흐르도록 유체 저항 또는 펌핑 속도에 의해 설정될 수 있다. 도 13b에 나타낸 실시양태에서, 유입구 및 유출구 폭은 상이한 유체 저항을 생성하도록 다양할 수 있으나, 유체 저항을 변화시키는 다른 방법, 예컨대 상이한 길이 또는 높이를 예상할 수 있거나, 또는 강화 모듈 (300)에 대한 시스템 외부 부분에 유동 제한기를 사용할 수 있다. 유사하게 제1 출구 (1311B) 및 제2 출구의 유체 저항을 변화시켜 보다 많은 액체가 제1 출구 (1311B)를 흘러나가도록 할 수 있다. 이러한 설정에서 흐름에 대해 수직인 작은 속도가 없는 비드는 제1 유출구 포트 (1311B)를 빠져나갈 것이다. 추가의 유출 채널이 추가되어 중간 수준의 주형을 갖는 비드의 분리를 용이하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 유출 채널에서의 유량은 각각의 출구 채널을 위한 개별 펌프를 제공함으로써 직접 조절될 수 있다.
전극의 쌍 (1313)이 제공될 수 있으며, 이는 분리 섹션 (1310)에서의 유체 흐름에 대해 수직인 전기장의 생성을 가능하게 하고, 이에 따라 주형 로딩된 비드가 유입구 (1311A)를 통하여 강화 모듈 (1300)로 들어갈 수 있고, 그동안 추가의 시약이 제2 주입구 (1312A)를 통해 모듈로 도입될 수 있고 이는 제2 출구 (1312B) 방향의 흐름 경로 밖으로 이동할 수 있다. 유체 포트 (1309)는 시스템 배관으로의 연결을 가능하게 한다.
전극 (1313)은 전기영동과 상용성인 임의의 전극 물질로 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서 별개의 금속 와이어를 사용할 수 있으나, 미량 금속이 또한 예상될 수 있다. 금속, 예컨대 백금, 백금/이리듐, 금 및 다른 귀금속 또는 합금, 뿐만 아니라 내부식성 물질, 예컨대 스테인레스 스틸이 예상될 수 있다. 비 금속 전극이 또한 예상될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 유체 유량은, 제2 출구보다 제1 출구를 나와 흐르는 더 많은 또는 더 적은 유체가 비드 유량 스트림의 조정을 가능하게 하도록, 유체 저항 또는 펌핑 속도에 의해 설정될 수 있다. 또 다른 실시양태에서 비드 스트림은 유입구 및 유출구 유체 유동 둘 다에 의해 조절될 수 있다.
강화 모듈 (1300)을 통한 유동은 비전도성 물질, 예컨대 성형 플라스틱, 유리, 세라믹 또는 성형가능한 중합체, 예컨대 PDMS, 또는 비전도성 코팅으로 코팅될 수 있는 전도성 물질, 또는 이들 물질의 조합, 또는 다른 물질과의 조합으로 설정될 수 있다. 유체 성분은 클램프 메카니즘과 융합되거나, 결합되거나 또는 규합되어 분리 섹션 (1308)을 포함한 강화 모듈을 생성할 수 있다. 한 실시양태에서 강화 모듈은 성형된 상부 부분 (1308) 및 평평한 기재 (1302)를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 강화 모듈은 2개 초과의 부분, 예컨대 예를 들어 3, 4, 5개 이상의 성분으로 구성될 수 있다. 2개의 성분이 사용될 수 있는 경우에, 유체 또는 조절 채널이 어느 1개의 성분에 형성될 수 있도록 양 측면은 평평하지 않은 표면을 가질 수 있다. 보다 많은 성분이 사용되는 경우에, 이들 중 임의의 1개는, 이들이 채널, 오목부 또는 돌출부를 포함하도록 평면 또는 형상을 가질 수 있거나, 또는 이들이 채널, 오목부 또는 돌출부를 포함하도록 평면 또는 형상의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 강화 모듈의 1개 이상의 성분의 표면 또는 표면의 일부는 상당한 전기삼투 유동을 야기하기에 충분한 제타 전위를 갖는다. 달리 상기 전기삼투 유동으로부터 초래될 수 있는 임의의 혼합 또는 난류를 최소화하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제타 전위 및 생성된 전기삼투 유동이 상당히 감소되도록 TiO2, ZrO2, 또는 BaTiO3과 같은 물질이 선택된다. 일부 실시양태에서, 제타 전위 및 제타 전위와 pH 변화 사이의 관계는 표면 코팅에 따라 변화될 수 있다. 일부 실시양태에서 제타 전위는, 실리카의 pH 의존을 갖는 경우에, pH의 변화와 함께 상당히 변화할 수 있다. 다른 경우에서, 제타 전위는, BaTiO3의 pH 의존을 갖는 경우에, pH에 대하여 매우 약간, 특히 pH 7.5 내지 pH 9 범위의 pH 범위에서 변화한다.
다른 실시양태에서, 표면 코팅(들), 예컨대 PEG (폴리 에틸렌 글리콜), 메틸 셀룰로스, n-도데실-B-D-말토시드, 아크릴아미드, 플루오린화 알칸 쇄, PTFE, 아크릴레이트, 또는 다른 가교된 또는 부분적으로 가교된 중합체가 사용되어 제타 전위를 변화시키거나, 또는 표면 코팅의 조합이 사용되어 전기삼투 유동을 유사하게 최소화한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 전기삼투 유동 제한 섹션의 수성 부피를 채우는데 사용된다.
다른 실시양태에서, 도 13c에 나타낸 바와 같은 물리적 구조는 전기내방삼투 흐름으로 인한 원치않는 혼합 및 난류를 감소시키거나 제거하는데 사용된다. 이러한 구조는 유동 속박 섹션 (1320)을 가질 수 있고, 상기 유동 속박 섹션(들) (1320)은 분리 섹션 (1308)의 두 측면 상에 사용될 수 있다. 전기장은 전극 (나타내지 않음)으로부터 완충제 저장소 섹션(들) (1322)로 분배될 수 있다. 상기 전극은 보조 주입구 포트(들) (1324)에 위치할 수 있고, 포트는 완충제를 완충제 저장소 섹션(들) (1322) 및 유동 속박 섹션(들) (1320)로 및 그를 통해 보내는데 사용될 수 있다. 대안적 실시양태에서 전극은 강화 모듈 (1300)의 외부에 있을 수 있는 전압 공급원과 전기적 연결을 갖는 완충제 저장소 섹션(들) (1322)에 위치할 수 있다. 주입 비드 및 시약은 주입구 포트 (1311A) 및 (1312A)를 통해 상기 분리 섹션 (1308)으로 보내질 수 있거나, 또는 시약은 주입구 포트 (1311A) 및 (1312A)를 통해 보내지고 비드는 중심 주입구 포트 (1326)를 통해 보내질 수 있다. 비드는 출구 포트 (1311B) 및 (1312B) 사이에서 분리될 수 있다.
대안적 실시양태에서 전극은 강화 모듈로 전류를 흐르게 하는 유체 연결을 갖는 도 13c에 나타낸 구조로부터 분리된 완충제 저장소(들)에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 완충제 저장소(들)은, 한 방향의 임의의 흐름이 반대 방향의 흐름과 반드시 만나는 밀폐된 유동 셀로 일어날 수 있는 수반되는 난류를 갖는 원형 흐름을 갖기 보다는 강화 유동 셀을 가로지르는 한 방향 초과의 전기내방삼투 흐름을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서 전압은 주기적으로 정지되어 유체 저장소가 그의 평형 상태로 되돌아 가도록 할 수 있으며, 여기서 각각의 저장소의 액체 수준은 전기삼투 펌핑 후에 동일한 수준에 있다. 다른 실시양태에서, 상기 저장소의 부피 또는 단면은 상기 전기삼투 펌핑과 상당한 관계가 있으며, 이에 따라 비드 세트 또는 다중 비드 세트는 상기 유체 저장소가 그의 평형 상태로 되돌아 가도록 하기 전에 분리되거나 강화될 수 있다.
다른 실시양태에서 제타 전위 크기는 실란올 기를 이온화가능한 실란올 기의 수를 감소시키는 화합물, 예컨대 트리메틸클로로실란으로 보호함으로써 감소된다. 도 13d 및 13e는 도 13c에 나타낸 바와 같은 구조의 사용을 현미경사진으로 도시하며, 여기서 주입구 비드 (1314)의 스트림은 도 13d에 적용되는 장 없이 도시되었으며, 따라서 모든 주입구 비드 (1314)는 이들이 보다 낮게 하전된 비드 (1314A)인 것처럼 출구 (1311B)로 이동하고, 유출구 포트 (1312B)로 끌려가는 보다 높게 하전된 비드 (1314B)로 보이는 비드는 없다. 도 13c에 나타낸 유동 속박 섹션 (1320)이 보다 자세히 나타나 있으며, 유체 통로 (1316) 및 지지체 칼럼 (1318)이 나타나 있다. 상기 분리 섹션 (1308)에 장이 적용된 도 13e에서, 주입구 비드 (1314)의 상기 스트림은 출구 포트 (1311A)로 이동하는 낮게 하전된 비드 (1314A), 및 출구 포트 (1312B)로 끌려가고 이동하는 보다 높게 하전된 비드 (1314B)로 분리된다.
일부 실시양태에서, 분리 섹션 (1308), 유체 주입구 (1311A), (1312A), 유체 출구 (1311B), (1312B), 분리 섹션 (1308), 전기내방삼투 유동 제한 섹션(들) (1320) 및 완충제 저장소(들) (1322)의 두께 또는 깊이는 동일할 수 있다. 다른 실시양태에서, 상이한 섹션에 대한 두께 또는 깊이는 상이할 수 있으며, 예를 들어 전기내방삼투 유동 제한 섹션(들) (1320)의 두께는 분리 섹션 (1308) 또는 완충제 저장소(들) (1322)의 두께보다 작을 수 있다.
일부 실시양태에서, 강화 모듈의 분리 섹션 (308) 및 다른 유체 섹션의 두께 또는 깊이는 10 내지 1000 μm이고; 다른 실시양태에서 강화 모듈의 두께 또는 깊이는 20 내지 200 μm, 50 내지 150 μm, 200 내지 500 μm 또는 70 내지 130 μm이다.
일부 실시양태에서 전기내방삼투 유동 제한 섹션(들) (313)의 유동 제한기의 폭은 10 내지 1000 μm이고, 다른 실시양태에서, 유동 제한기의 폭은 20 내지 200 μm, 50 내지 150 μm, 200 내지 500 μm, 또는 70 내지 130 μm이다.
일부 실시양태에서 강화 구역의 길이는 2mm 이하, 2mm 내지 10mm, 10mm 내지 100mm 일 수 있다. 일부 실시양태에서 강화 구역의 폭은 1mm 이하, 1mm 내지 4mm, 4mm 내지 10 mm 및 10mm 내지 100mm일 수 있다.
일부 실시양태에서, 강화 모듈 (1300)은 비드의 상이한 배치 사이에 존재할 수 있는 다양한 전하 수준을 보상하기 위한 피드백 시스템 (나타내지 않음)을 갖는다. 이러한 피드백 시스템은 이어서 전기영동 전압이 비드의 특정한 배치에 대해 자동적으로 조절되고, 비드의 후속 배치에 대해 자동적으로 조절되도록 할 수 있다. 상기 피드백 시스템은 반사광, 흡수광, 굴절광, 형광, 비드에 대한 전기용량 커플링, 비드와 연관된 디바이(Debye) 층의 직접 전도성 검출, 비드의 ISFET/ChemFET 검출을 사용할 수 있거나, 또는 임의의 다른 적절한 검출 수단을 사용할 수 있다. 상기 검출 수단은 비드의 검출이 1개 이상의 유체 출구 (1311B) 및 (1312B)에서 또는 이와 연관되어 유발되도록 설정될 수 있거나, 또는 비드의 검출이 분리 섹션 (1308)에서 또는 이와 연관되어 유발되도록 설정될 수 있다.
일부 실시양태에서 피드백 시스템은 비드의 배치의 분리 동안 유동 및 전기삼투 전압을 조절하는데 사용되어, 비드가 최적으로 분리되고 각각의 출구 (1311B) 및 (1312B)의 명목상 목적 위치로 흐른다. 상기 유동 조절은 상기 유동에 적용되는 다양한 압력, 상기 유동에 적용되는 다양한 진공, 상기 유동에서의 다양한 제한 또는 그의 임의의 조합을 사용하여 유발될 수 있다.
일부 실시양태에서, 비드 슬러리를 농축해야 할 필요가 있을 수 있다. 하나의 실시양태에서, 비드 용액에 자석을 통과시켜 비드를 유지한다. 자장의 제거 또는 비드의 더 높은 유속을 사용하여 보다 더 농축된 형태로 비드를 방출시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 농후 모듈 (300)을 사용하여, 음성으로 하전된 DNA 및 단백질 및 세포 막 단편이 기원할 수 있는 세포를 용해한 후 상기 DNA와 혼합할 수 있는 상기 세포 막 단편을 비롯한, 단백질로부터 음성으로 하전된 DNA를 분리한다. 일부 실시양태에서, 대부분이 양성으로 하전될 수 있는 단백질로부터 DNA를 분리하고, 인간 혈청 아포트랜스페린, 티로글로불린, 또는 BSA와 같은 중성 pH에서 음성으로 하전될 수 있는 단백질로부터 DNA를 또한 분리하는 것이 바람직할 수 있다. DNA의 pKa가 1.0인 반면, 중성 pH에서 음성으로 하전될 수 있는 이러한 단백질은 전형적으로 pKa 값이 4.0 초과이다. 단백질의 전기영동 이동성은 전형적으로 매우 음성으로 하전된 DNA의 전기영동 이동성보다 훨씬 낮고, 이는 농후 모듈 (300)에서의 DNA의 용이한 분리를 가능케한다. 이러한 분리를 pH 7 미만, pH 6 내지 7, pH 5 내지 6, pH 4 내지 5, 또는 pH 3 내지 4와 같은 낮은 pH에서 수행할 수 있으며, 이는 상기 단백질의 pKa 미만, 및 DNA의 pKa 초과에서 농후 모듈을 수행하는 것을 가능케한다.
일부 실시양태에서, DNA를 임의의 단백질 및 세포 막으로부터 실질적으로 분리한 후 유전영동으로 포획할 수 있다. 상기 유전영동 포획은 유동성 유출구 (311B, 312B)에서 실시할 수 있거나, 분리된 모듈에서 실시할 수 있다. 상기 유전영동 포획 후, 완충제를 예를 들어 단백질 또는 세포 막으로부터의 분리가 수행되도록 상기에 기재한 바와 같은 낮은 pH로부터 예를 들어 PCR, 등온 증폭, 또는 서열 분석에 적합한 완충제로 교체할 수 있으며, 여기서 pH는 대략 최적화되거나, 예를 들어 폴리머라제 활성을 위해 적합하다.
전극 (1313)에 적용되는 전압을 주기적으로 낮추거나 심지어 역전시킬 수 있으며, 필요할 경우 비드를 전극에 고정되어야 한다. 사용된 전압은 전기분해에 요구되는 것(25C 및 pH 7에서 1.23V)보다 더 클 수 있거나, 전기분해에 필요한 전압보다 더 작을 수 있다. 더 높은 전압 및 더 좁은 간격은 비드에 더 높은 자장 세기 및 보다 큰 힘을 제공한다. 비드가 주형과 함께 제2 유출구로 바로 향할 수 있는 반면 비드가 제2 유출구에 유입될만큼 충분하게 이동하지 않을 수 있도록 제한된 주형이 있거나 없는 비드를 흐르게하고 전압 및, 또는 유속을 설정함으로써 시스템 상에서의 전압을 보정할 수 있다.
비-관통 농후 모듈을 또한 예상할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 비드를 챔버에 도입하고 자장 또는 중력에 의해 비드가 아래로 당겨진다. 전기장은 주형을 갖는 비드를 위로 당겨지도록 설정된다. 일부 실시양태에서, 포획 막 또는 필터를 양극의 앞에 추가하여 비드를 농축하는 것을 촉진할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 유동 셀을 서열 분석 반응과 같은 반응을 감지하는데 사용하는 동일한 기기내에서 수행되는 작용 및 방법의 결과로서 유동 셀로부터 비드를 제거한다.
또 다른 실시양태에서, 서열 분석 반응과 같은 반응을 감지하는데 유동 셀이 사용되는 기기로부터 유동 셀 어셈블리를 제거하고, 비드가 유동 셀로부터 제거되는 다른 기기 또는 장치로 이동시킨다.
또 다른 실시양태에서, 서열 분석 반응과 같은 반응을 감지하는데 유동 셀이 사용되는 기기로부터 유동 셀 어셈블리를 제거하고, 비드가 유동 셀로부터 제거되는 중앙 재연마(refurbishment) 부위에 수송한다.
또 다른 실시양태에서, 서열 분석 반응과 같은 반응을 감지하는데 유동 셀이 사용되는 기기로부터 유동 셀 어셈블리를 제거하고, 코팅을 유동 셀 및/또는 유동성 매니폴드에 적용, 제거 및/또는 재적용할 수 있는 다른 기기 또는 장치에 이동시킨다.
또 다른 실시양태에서, 서열 분석 반응과 같은 반응을 감지하는데 유동 셀이 사용되는 기기로부터 유동 셀 어셈블리를 제거하고, 코팅을 유동 셀 및 또는 유동성 매니폴드에 적용, 제거 및/또는 재적용할 수 있는 중앙 재연마 부위에 수송한다.
일부 실시양태에서, 유동 셀 및/또는 유동성의 매니폴드는 다양한 표면 코팅을 갖는다. 이러한 표면 코팅을 사용하여, 상기 유동 셀 또는 유동성의 매니폴드에서 표면에 대한 다양한 시약의 잔기의 비특이적 결합을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 비특이적 결합을 감소시키기 위한 코팅은 PEG (폴리에틸렌 글리콜), BSA (소 혈청 알부민), PEI (폴리에틸렌이민), PSI (폴리숙신이미드), DDM (n-도데실-b-D-말토시드), 플루오린화 코팅, 테플론 코팅, 실란화 코팅, 또는 다른 적절한 코팅을 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 서열 분석 반응과 같은 반응을 감지하는데 유동 셀을 사용하여 동일한 기기내에서 수행되는 작용 및 방법의 결과로서의 유동 셀 및 또는 유동성 매니폴드에 대해 코팅을 적용, 제거 및/또는 재적용한다.
일부 실시양태에서, 센서는 이전 센서 디자인을 조작할 수 있는 가역적으로 축소시킬 수 있는 층의 혼입의 결과로서 전기화학 검출과 pH 감지를 겸비한다. 이러한 센서는 세노바 시스템즈(Senova Systems)로부터 입수할 수 있다. 서열 분석 주기 동안, 염기를 센서와 연관된 비드에 혼입시킨 경우 환원 반응이 발생할 것이다. 환원 수준을 측정할 수 있고, 서열 분석 주기의 완결 후, 센서 상에 전압을 주어 표면의 산화를 일으키고, 그의 원래 상태로 재생시켜, 다음 서열 분석 주기에 이를 사용할 수 있도록 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 도 9에 도시된 바와 같이, 산화환원 전위는 공칭 DC 전위 (902)와 조합된 AC 전위 (904)의 조합을 포함할 수 있으며, 여기서 공칭 DC 전위 (902)는 0 볼트에서 출발하여 최대까지 증가하고, 0 볼트로 되돌아오는 사인파의 절반이며, 여기서 상기 AC 전위 (904)는 상기 공칭 DC 상에 겹쳐질 수 있는 산화환원 반응을 수행할 수 있다. AC 전위 (904) 파형은 공칭 DC 전위 (902) 보다 10배 높은 주파수일 수 있거나, AC 전위 (904) 파형은 공칭 DC 전위 (902) 보다 10 내지 100배 높은 주파수일 수 있거나, AC 전위 (904) 파형은 공칭 DC 전위 (902) 보다 100 내지 1000, 1000 내지 10,000, 10,000 내지 100,000, 100,000 내지 1,000,000, 1,000,000 내지 10,000,000배 높은 주파수일 수 있다. AC 전위 (904) 파형은 사인곡선형 파형, 삼각파형, 정사각형 파형, 또는 임의의 다른 종류의 대칭 또는 비대칭 파형일 수 있다. DC 전위 파형은 0 볼트에서 출발하여 최대까지 증가하고 그 뒤에 0 볼트로 되돌아오는 사인파, 이등변 삼각형 파형, 톱날 파형, 또는 임의의 다른 파형의 절반일 수 있다. 겹쳐지는 AC 전위 (904) 파형의 크기는 일정할 수 있거나, DC 전위 (902) 파형 동안 변할 수 있으며, 예를 들어, AC 파형은 DC 파형이 0에 가까운 경우 더 작을 수 있고, AC 파형은 DC 파형이 그의 최대 전위에 도달하는 만큼 증가할 수 있다. AC 전위 (904) 및 공칭 DC 전위 (902)의 조합으로부터 생성된 전류 (906)은 적용된 전위의 비 선형 함수일 수 있다.
한 실시양태에서, 수집된 데이터량을 최소화하는 경우 반응 속도를 증가시키는 것 이외에 반도체 전자기기의 직선적 특성이 일반적으로 발생하는 활성 영역을 정렬하는 것이 바람직할 수 있다. 이전 시스템에서, 활성 반응의 위치가 검출기의 어레이와 잘 정렬되지 않을 수 있다. 도 14에서 도시한 바와 같이 칩 (1400)의 코너 (1404A) 및 (1404B)에 들어가고 이로부터 나오는 시약을 도입하는 통상과는 반대로, 엄격한 직선 방식으로 검출기 전자기기를 배열하는 것이 바람직하다. 이러한 접근 모두는 칩 (1404A) 및 (1404B)의 코너에서 유입구 및 유출구 포트로의 칩의 중심으로부터 단면적에서의 큰 차이로 인해 유동 (및 로딩 효율 (1406))의 불균일을 발생시키는 것뿐 아니라, 시약 슬러그로의 정렬을 방지하고, 시약 슬러그가 칩 1402의 다른 코너로 잘(또는 전혀) 유동하지 못할 수 있고, 칩의 상당한 지역을 낭비한다.
한 실시양태에서, 도 15에 도시한 바와 같은 다중 유동성 유입구 (1512A)를 다중 유동 셀 센서 장치 (1500)에 사용하여, 칩 지역의 더 많은 이용을 가능케하고, 칩 및 상기 칩 판독 구조에 대한 보다 더 균일하고 정렬된 시약 유동을 가능케한다. 일부 실시양태에서, 유동 셀의 상이한 채널에 대한 상이한 시간에 샘플을 도입할 수 있으며, 이는 샘플 확인을 위한 바아(bar) 코딩 또는 다른 수단을 필요로 하지 않으면서 상이한 샘플이 사용될 수 있게 한다. 다중 유동 셀 센서 장치는 각각의 유동 셀에 대해, 유입구 포트 (1512A), 유출구 포트 (1512B) 및 폐기로의 라인 (1516)을 갖는 다중 유동 셀 (1510)을 가질 수 있으며, 여기서 각 유입구 및 유출구 포트는 잠재적으로는 유동 균일성이 최적화되도록 각진 측면 벽 및 또는 표면 조도를 갖는 상기 유동 셀 (1510)에서 센서 어레이를 흐르는 균일성이 최적화되도록 설정될 수 있다. 상기 유동 셀을 또한 샘플의 유동 및 또는 유동 셀 (1510)에 대한 즉각적 근접성에서의 다른 시약을 조절하기 위한 밸브 (1504) 및 상기 밸브 (1506)에 따라 컨트롤을 갖도록 구성될 수 있다. 샘플 및 다른 시약을 유입구 포트 (1502)를 사용하여 도입할 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법 또는 방법의 세트에서 상이한 시간에 샘플을 도입한다. 예를 들어, 증폭 반응을 거쳐 그 결과로 연장된 프라이머를 갖는 비드의 제 2 세트를 칩과 연관된 유동 셀의 채널로 도입하며, 여기서 칩의 또 다른 채널이 이미 비드의 제1 세트를 가질 수 있다. 비드의 제1 세트는 증폭 반응을 이미 거쳤을 수 있고 그 결과로 이에 함유된 연장된 프라이머를 가질 수 있으며, 비드의 제1 세트를 갖는 채널이 서열 분석 주기에 노출되었거나, 서열 분석 주기의 수에 노출되었을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 비드의 제2 세트를 비드의 제1 세트가 함유된 동일한 채널에 도입한다. 또 다른 실시양태에서, 또 다른 채널에서 비드의 제2 세트가 서열 분석 반응을 거칠 수 있는 동안, 증폭 및 서열 분석이 본원의 다른 곳에 기재된 대로 어레이의 단일 지역에서 수행될 수 있는 경우, 1 채널에서의 하나의 비드 세트는 등온 증폭을 거칠 수 있다.
온도 변화가 제1 방법에 필요할 수 있으나 제2 방법에 필요하지 않을 수 있는 일부 실시양태에서, 제2 방법은 온도 변화가 일어나는 동안 일시적으로 중단 또는 중지될 수 있으며, 이어서 온도가 이전 온도로 돌아온 후, 개시될 수 있다. 예를 들어, 증폭 반응 방법은 연장된 비드와 연관된 프라이머 후 제2 가닥을 녹여내고 제거하여 상호보완적인 연장되지 않은 프라이머를 비드에 연관된 프라이머와 하이브리드화할 수 있어서, 합성 반응에 의한 서열 분석을 개시할 수 있도록 하는 것이 필요할 수 있다. 다중 채널로 칩의 온도를 상승시키기 전에, 서열 분석 반응을 거친 비드 세트를 갖는 채널은 서열 분석 반응을 중지시킬 수 있으며, 공동-국소화 가상 나노반응 웰 전극을 작동시킬 수 있다. 이 방식에서, 채널에서 비드와 연관되지 않은 연장된 프라이머가 비드와 연관된 프라이머로부터 해리될 수 있는 반면, 하이브리드화된 부분적으로 연장된 프라이머를 각각 가상 나노반응 웰로 국소화시키고, 이어서 채널로부터 제거한다.
상기 시스템은 다중 유동적 채널 또는 칩이 매우 큰 경우 샘플을 분할할 수 있거나, 다중 유동적 채널 또는 칩이 조합가능한 경우(예를 들어 바코드 샘플) 샘플을 조합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기기에 제공된 샘플을 서열 분석을 위해 준비할 수 있다. 다른 실시양태에서, 서열 분석 준비 샘플을 생성시키기 위해 샘플을 기기에 의해 제조할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 단일 유동 셀 또는 일렉트로-웨팅으로의 다수의 도입 포트를 사용하여 유동 셀의 일부로 샘플을 도입하며, 이는 교차 오염의 위험 없이 한번에 보다 많은 샘플을 사용할 수 있게 한다.
또다른 실시양태에서, 시약 접촉면을 발생시키지 않으면서 유동 셀의 일부 내로 시약이 이동하게 하기 위해 (이에 따라 유동 셀의 원하는 부분에 시약이 도달하기 전에 시약들이 혼합되는 것이 완전히 방지됨) 일렉트로-웨팅 시스템을 제공할 수 있으며, 이에 따라 일렉트로-웨팅 시스템은 시약에서의 매우 급진적인 전이를 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 센서가 위치하는 유동 셀을 통해 dNTP 함유 시약이 유동할 때, 하나의 시약과 또다른 시약 사이에 보다 급진적인 전이가 있는 것이 바람직하다. 이는 본질적으로 0의 dNTP가 존재하는 농도 사이에서 프라이머를 확장시키거나 또는 추가로 확장시키는 폴리머라제에 의한 혼입을 위한 목적하는 dNTP의 농도를 갖는 시약으로의 보다 빠른 전이를 제공하도록 도울 수 있다. 이는 염기 혼입의 개시 시간과 프라이머 또는 확장된 프라이머의 상당한 백분율이 새로이 도입된 뉴클레오티드가 유동 셀 중의 상이한 콜로니에서의 적절한 지점에 혼입되게 하는 시간 사이의 기간을 보다 짧게 할 수 있다. 보다 짧은 시간은 단위 시간당 센서 또는 센서들의 신호 레벨의 보다 큰 변화를 가능하게 할 수 있고, 이는 신호 대 노이즈를 개선할 수 있다. 전자 센서는 전형적으로 열적 노이즈 및 플리커 노이즈를 포함할 수 있는 노이즈를 갖게 할 수 있으며, 상기 열적 노이즈 및 플리커 노이즈 둘다는 시간 간격을 줄임으로써 최소화할 수 있고 그 동안 통합 신호는 센서에 의해 감지된다.
본질적으로 0의 dNTP가 존재하는 농도 사이에서 보다 느린 전이가 일어나는 시스템과는 대조적으로 이러한 빠른 전이가 프라이머를 확장시키거나 또는 추가로 확장시키는 폴리머라제에 의한 혼입을 위한 목적하는 dNTP의 농도를 갖는 시약에서 도출된다. 이러한 보다 느린 전이는 dNTP 함유 시약 용액으로부터의 dNTP가 처음에 본질적으로 0의 dNTP를 갖는 시약 용액으로의 확산의 결과로서 일어날 수 있다. 이는 서열분석 반응 또는 또 다른 반응의 검출을 위해 센서가 위치하는 유동 셀로 도입되기 전에 시약이 유동하는 긴 채널을 통해 전이되는 동안 일어날 수 있다. 추가적인 혼합은 채널 폭, 시약이 유동하는 코너, 시약이 유동하는 채널의 표면의 불균일성, 시약이 유동 셀에 도달하게 되는 채널을 통한 느린 유동, 또는 유동 셀을 통한 느린 유동으로부터 발생할 수 있다.
일 실시양태에서, 본질적으로 0의 dNTP가 존재하는 농도 사이에서 프라이머를 확장시키는 폴리머라제에 의한 혼입을 위한 목적하는 dNTP의 농도를 갖는 시약으로의 전이가 발생하는 유체 시스템에서의 지점과 시약이 유동 셀에 도입되는 유체 시스템에서의 지점 사이의 채널 길이는 실질적으로 감소될 수 있다. 상기 시약과 상기 유동 셀 사이의 전이 발생 사이의 상기 채널 길이는 1 마이크로미터 이하, 1 내지 5 마이크로미터, 5 내지 20 마이크로미터, 20 내지 100 마이크로미터, 100 마이크로미터 내지 300 마이크로미터, 300 마이크로미터 내지 1 밀리미터, 1 밀리미터 내지 3 밀리미터, 3 밀리미터 내지 10 밀리미터, 또는 10 밀리미터 내지 30 밀리미터일 수 있다. 일반적으로, 상기 시약 사이의 전이가 발생하는 유체 시스템에서의 지점과 상기 시약이 상기 유동 셀에 도입되는 지점 사이의 거리가 보다 짧고, 유체 시스템의 유동 단면의 크기에서의 전이 또는 상기 거리에서의 코너의 개수가 보다 적을수록, dNTP 또는 다른 모이어티의 확산이 보다 적을 것이며, 이에 따라 유동 셀에서 각 센서에서 목적하는 dNTP 농도를 갖는 시약과 본질적으로 0의 dNTP의 농도를 갖는 시약 사이의 시간 프레임이 보다 짧아질 것이다.
중합 반응을 위한 시간을 최소화할 경우 중합 반응의 검출과 관련된 신호 대 노이즈가 또한 개선될 수 있다. 검출기와 관련된 노이즈는 시간과 상당히 일치할 수 있으며, 발생하는 신호의 전체 통합 양은 발생되는 시간의 기간과는 무관하게 동일할 수 있다. 따라서, 시약 슬러그에 도입될 때 dNTP의 농도에서의 빠른 전이를 제공함으로써 및/또는 폴리머라제의 결합과 관련된 시간을 촉진함으로써 데이터가 취해질 수 있는 시간을 감소시키면 분석에서 처리하여야 하는 노이즈의 양이 최소화될 수 있다. 그 결과, 분석 소프트웨어로 처리하여야 하는 노이즈 대역폭이 감소될 수 있다.
일부 경우에, 센서가 출구 포트의 근처에 있는 경우, 혼입에 필요한 dNTP의 수는 dNTP의 고갈이 시간을 증가시켜 프라이머를 확장시키는 폴리머라제에 의한 혼입을 위한 목적하는 dNTP 농도를 발생시킬 수 있을 만큼 충분히 클 수 있다. 보다 낮은 dNTP의 농도, 유동 셀 중에서 보다 많은 콜로니를 갖는 보다 긴 거리, 연장을 위한 프라이머가 보다 많은 보다 큰 콜로니는 모두 충분한 dNTP 농도를 발생시키는 시간을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 도입 포트를 사용하여 단일 유동 셀로의 도입을 제공하여 각각의 센서 및/또는 콜로니에서 dNTP의 이용률을 보장한다. 일부 실시양태에서, PDMS 액체 매니폴드의 추가의 층에서 유동 셀의 상부에 시약 채널이 제공된다. 도 42에 나타낸 바와 유사한 두 세트의 조절 라인이 제공될 수 있고, 이는 도 42에 나타낸 바와 유사한 두 세트의 밸브 및 도 42에 나타낸 바와 유사한 두 세트의 매니폴드를 통한 유동을 조절할 수 있으며, 이는 이어서 두 시약 사이에서 접촉면이 생성되는 유체 중의 지점 사이에서 짧은 거리를 갖는 유동 셀로의 대안적 도입 및 유동 셀로의 제2 또는 후속 도입 포트를 제공할 수 있다.
차세대 서열분석과 관련된 상당한 문제점은 많은 양의 데이터가 생성된다는 것이다. 몇몇 시스템은 서열분석 데이터의 각각의 유용한 염기에 대해 평균적으로 3000 이상의 데이터 지점을 발생시킬 수 있다. 데이터의 저장 및 분석이 차세대 서열분석의 전체 비용에 유의하게 추가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 데이터 감축은 보다 적은 데이터를 수득함으로써 가장 간단한 방식으로 수행된다. 폴리머라제 활성은 dNTP를 갖는 시약을 유동 셀로 완전히 가져오게 하는데 필요한 시간보다 유의하게 빠를 수 있어서, 이에 따라 유동 셀의 유입구에 가까운 DNA 콜로니는 dNTP가 상기 유동 셀의 출구 근처의 콜로니에 도달하기도 전에 다음 합성을 완전히 완료할 수 있다. 유동 셀 중 어딘가에서 일어나는 반응을 검출하는데 필요한 시간 동안 전체 유동 셀에 대해 데이터가 수득되는 경우, 많은 데이터는 반응이 일어나지 않는 유동 셀의 영역으로부터 나올 것이다. dNTP 시약 슬러그를 유동 셀로 이동시키는데 필요한 시간 및 중합 속도에 따라, 유동 셀 중의 대부분의 콜로니는 dNTP의 혼입보다는 dNTP를 위해 대기 중이거나 그의 합성 반응을 완료하였을 것이므로, 이에 따라 유용한 데이터가 생성된다.
일부 실시양태에서, 검출기 전자장치의 해독은 시약 슬러그의 유동 셀로의 이동과 동시에 발생한다. dNTP 함유 시약 슬러그는 처음에 유동 셀로 들어갈 수 있으나, dNTP를 위한 유동 셀로 이동하기에 아직 충분하지 않고 임의의 콜로니에 결합하거나 혼입한다. 이 시점에서, 데이터를 취하는 것이 결코 가능하지 않을 것이다. 이 시점보다 약간 이후에, 시약 슬러그는 제1 영역 중의 콜로니 세트와 충분히 상호작용하는 유동 셀로 들어갈 것이다. 이 시점에서, 데이터는 제1 영역 중의 콜로니와 관련된 검출기로부터 취해질 수 있으나, 유동 셀의 다른 영역에 대해 취해지지 않을 수 있다. 제2 시점 이후에, 시약 슬러그는 제2 영역 중의 콜로니 세트와 충분히 상호작용하기 시작하는 유동 셀에 들어갈 수 있다. 이 시점에서, 데이터는 제2 영역에서 콜로니와 관련된 검출기로부터 취해질 수 있고, 또한 제1 영역으로부터 여전히 취해질 필요가 있을 수 있으나, 시약 슬러그의 속도 및 폴리머라제의 속도에 따라, 유동 셀의 다른 영역에 대해 취해질 필요가 없을 수 있다. 제3 시점 이후에, 시약 슬러그는 유동 셀 중의 콜로니의 마지막 세트와 충분히 상호작용하기 시작하는 유동 셀로 이동한다. 이 시점에서, 마지막 영역 중의 콜로니와 관련된 검출기로부터 데이터가 취해질 수 있다. 콜로니의 상기 마지막 세트 직전의 영역과 같은 이전 영역으로부터 일부 데이터가 여전히 취해질 필요가 있을 수 있으나, 시약 슬러그의 속도, 폴리머라제의 속도, 유동 셀의 길이, 콜로니의 크기에 따라 유동 셀의 다른 영역에 대해 취해질 필요가 없을 수 있다.
다른 실시양태에서, 상 지연을 갖는 시분할 다중방식(time multiplexing)은 서로에게서 상이한 샘플을 구별해 내기 위해 수행할 수 있다.
시스템에서 사용되는 밸브의 속도가 다르기 때문에, 관, 채널 및 포트의 크기가 시스템에서 시스템까지 또한 소모품에서 소모품까지 다를 수 있고, 유동 또한 다를 수 있다. 상기 변형을 수용하기 위해, 이전 데이터는 시스템의 유동에 관한 적합한 안내를 제공할 수 있기 때문에 시스템 또는 소모품으로부터 취득한 제1 세트의 데이터, 보다 더 많은 데이터를 취득할 필요가 있으며, 이로 인해 서열분석 반응에 관련되는 데이터가 수집된다고 확신할 수 있다.
한 실시양태에서 수집 시기는 이전 칼럼으로부터, 또는 동일한 칼럼의 이전 주기의 데이터로부터 순응적으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 전형적인 검출 사건이 수집 시간 말미 근처에서 일어나는 경우 추가 지연이 하류 샘플의 다음 수집 기간의 개시 전에 추가될 수 있다. 유사하게는 전형적인 검출 사건이 수집 시간의 개시 근처에서 일어나는 경우 하류 샘플의 다음 수집 기간이 더 빨리 시작될 수 있다.
영역의 크기는 1개의 콜로니 넓이로 도해에 나타내지만, 영역의 폭은 1개의 콜로니 넓이보다 더 클 수 있다. 예를 들어, 유동 셀이 유입구에서 출구까지 1000개의 콜로니 넓이인 경우, 영역은 1개의 콜로니 넓이, 10개의 콜로니 넓이, 100개의 콜로니 넓이, 500개의 콜로니 넓이, 또는 그 사이의 임의의 갯수일 수 있다. 따라서, 유동 셀을 통해 시약 슬러그가 이동할 때의 시점에서 취득한 데이터로부터의 영역은, 시약 슬러그가 유동 셀을 관통할 때 및 중합 반응이 완료될 때 시약 슬러그가 함께 이동하기 때문에, 1개의 센서에서부터 10개의 센서, 100개의 센서 넓이까지 달라질 수 있다.
판독되는 영역의 폭은 데이터를 생성하고 폐기하는 필요를 방해하기 때문에 칩을 판독하는 시점에 행할 수 있다. 이는, CMOS 이미지 센서 하위면적을 판독하는데 이용될 수 있는 것과 유사한 방식으로 행할 수 있으며, 이에 의해 칼럼의 전체 열의 하위세트를 동시에 판독해 낼 수 있다. 장치 구조에 따라, 특정 CMOS 센서에서 개별적 화소를 선택하는 것이 가능하기 때문에, 개별적 센서를 선택하는 것이 가능할 수 있다. 대안적으로, 각 컬럼의 센서 어레이에 대한 분리된 아날로그 디지털 변환기를 이용함으로써, 칩 구조가 동시에 열을 완전히 판독하기 위해 고안된 경우; 칩은 원하는 열의 하위세트를 선택하여 판독할 수 있다. 열의 하위세트는 시약 슬러그가 유동 셀을 통해 진전할 때 변할 수 있고, 또한 유동 셀의 면적은 상기 면적 내의 콜로니에서 중합 반응을 완료한다. 일부 실시양태에서, 비교측정기의 상기 분리된 아날로그 디지털 변환기는 각 컬럼에 결합되며, 여기서 카운터는 또한 각 컬럼에 결합될 수 있고, 그렇게 함으로써 더 많은 시간, 즉 노이즈에 대한 신호에서의 수행자 개선과 함께 아날로그 디지털 전환에 대한 잠재적으로 다중 오더의 규모 더 많은 시간을 허용하면서, 아날로그 신호를 디지털 신호로 동시 전환 가능하게 한다. 다른 실시양태에서, 아날로그 디지털 변환기는 연차 근사 장치일 수 있다. 다른 실시양태에서, 화소 평행 판독 접근법(pixel parallel readout approach)을 이용할 수 있다.
수집된 데이터 영역의 폭은 모든 유효한 데이터를 취득하였다는 것을 보증하기 위해 다양한 인자를 확인하는데 매우 충분히 필요하다. 이러한 인자는 시약 슬러그의 유량의 변화를 포함하며, 표면과의 상호작용으로 인해 유동 셀의 가장자리 근처에서 흐름이 더 느릴 수 있다. 다른 인자는, 다른 것들 중에서도 폴리머라제의 농축으로 인한 중합 속도의 변화, dNTP의 농축의 변화, 온도 변화, 콜로니 밀도 변화, 콜로니 또는 콜로니들에 혼입되는 염기의 반복 수를 포함할 수 있다. 이들 중 임의의 것은 취득하는 데이터의 폭을 더 오랫동안 요구할 수 있다.
상기에 기재된 바와 같이, 프라이머를 연장하기 위한 dNTP는, 고유 dNTP, 고유 또는 변형 폴리머라제에 의해 혼입가능한 변형 dNTP, 또는 고유 dNTP 및 변형 dNTP 둘다일 수 있다. 변형 dNTP를 사용하는 경우, 변형은 역 종료자, 사실상 종료자로서 작용할 수 있거나, 보다 용이한 검출을 위해 혼입되는 뉴클레오티드의 변화를 변화시킬 수 있다. 따라서 일부 실시양태에서, 단독중합체 실행의 염기 수가 매우 큰 경우 단독중합체 실행의 염기 수를 결정하는데 어려움을 감소시키기 위해, 서열분석 반응은 단독중합체 실행의 모든 염기를 혼입시킬 수 있거나, 또는 단독중합체 실행 시에 1개의 염기를 혼입시킬 수 있다.
콜로니 DNA에 대한 폴리머라제의 확산 및 결합과 관련되는 동역학은 dNTP의 확산, 결합, 혼입과 관련되는 동역학보다 두드러지게 더 길 수 있다. 결과적으로, 중합이 일어나는 동안의 시간 주기는, 폴리머라제를 갖는 시약 슬러그 내에 도입한 다음 dNTP를 갖는 시약 슬러그 내에 도입한 것과 비교하여, dNTP를 갖는 동일 시약 슬러그 내에 폴리머라제를 도입한 경우 더 길 수 있다. 따라서, 데이터의 양을 최소화하려는 노력이 이로울 수 있어서, 폴리머라제를 유동 셀로 가져와서 폴리머라제가 콜로니 DNA와 결합하도록 한 다음, dNTP를 도입시킨다. 상기 폴리머라제가 연작용 폴리머라제, 즉 상기 폴리머라제가 주기 사이에서 잘 유지되는 것인 경우, 폴리머라제는 dNTP와 결합하여 분리된 전달에 대한 필요를 제거할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 포스파타제 및 폴리머라제를 포함하는 세척액의 전달은 잔류 뉴클레오티드의 효과적 제거 및 단일 유동성 전달의 보충을 허용할 수 있다. 다른 실시양태에서, 시약은, 가수분해를 통한 포스페이트 기의 제거에 의한 dNTP를 효과적으로 제거하기 위해 폴리머라제 없이 포스파타제를 포함한다. 포스파타제는 새우 알칼리성 포스파타제, 소 장 포스파타제, 또는 또 다른 포스파타제일 수 있다.
일반적으로, 대부분의 클로날 DNA 서열분석 시스템에 대하여, 데이터 신호의 양을 최대화시키기 위해, 표면 상에 가능한 한 많은 DNA를 갖는 것이 바람직하다. 그러나, DNA가 표면 상에 랜덤하게 위치하는 경우, DNA의 간격은 후속 중합 반응에서 입체 장해를 야기시킬 수 있다.
다수의 상이한 서열분석 적용에서, 표적 DNA 또는 프라이머는 기질의 표면에 결합될 수 있다. 부착 방법의 결과로서, 표적 DNA 및 프라이머는 표면에 랜덤하게 위치할 수 있고, 충분히 아주 근접할 수 있어 입체 장해가 폴리머라제 연장 동안 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이머와 오버랩핑되는 DNA와 혼성화하는 동안 프라이머가 기질에 부착되거나, 결합되거나, 연관되며, 이는 폴리머라제에 대한 프라이밍 부위를 제공할 수 있다. 상기 프라이머 및 오버랩핑 DNA는 폴리머라제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 상기 프라이머의 결합을 방해하는 스페이서로 제공되어, 예를 들어 각각의 DNA 가닥에 대한 폴리머라제에 대한 공간이 충분하지 않을 때에, 입체 장해가 발생될 수도 있다. 상기 폴리머라제 및 오버랩핑 DNA는 후속적으로 제거될 수 있어, 표적 DNA가 프라이머 연장 동안 프라이머에 부착되거나, 결합되거나 또는 연관되는 상기 기질과 혼성화될 수 있으며, 상기 프라이머 연장은 증폭 목적 또는 서열분석 목적을 위해서일 수 있다. 대안적으로, 프라이머는, 더 긴 DNA에 대한 필요를 없애면서, 폴리머라제가 결합할 수 있는 연장된 말단을 갖는 헤어핀 형태로 존재할 수 있다. 주형의 비오틴 스트렙타비딘 결합을 이용하는 경우일지라도, 스트렙타비딘의 크기 (3 nm)는 폴리머라제에 대한 공간 (7 내지 10 nm)가 존재하여 DNA 분자를 적당한 간격으로 두기에는 불충분하다. 한 실시양태에서, 표적 DNA를 적절하게 간격을 둘 수 있어, 입체 장해가 발생하지 않을 수 있다. 이는, 예를 들어 이중 가닥 DNA와, 서열분석 반응에 사용될 수 있는 폴리머라제보다 더 작거나 유사하거나 또는 더 큰 크기의 폴리머라제와의 복합체를 이용함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA에 결합하며 적절한 크기일 수 있는 다른 단백질을 사용할 수 있으며, 이는 후속 서열분석 반응에 대해 의도되는 폴리머라제를 포함한다. 폴리머라제는 연작용성일 수 있어서 부착 공정 동안 결합된 상태로 존재하며, 또한 여기에 연관되는 추가의 결합 잔기를 추가로 가질 수 있어서, 폴리머라제가 DNA 결합 공정 동안 제자리에 남아 있는 능력을 추가로 향상시킬 수 있다. 대안적으로, 단백질 이외의 다른 잔기를 DNA 간격을 두기 위해서 이용할 수 있고, 그 다음에 제거하여 간격을 둔 DNA가 입체 장해를 피하도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서 기질의 표면이 DNA로 포화되지 않을 수 있다는 것이 바람직할 수 있다. 폴리머라제가 추정적으로 100 옹스트롬보다 더 큰 직경인 것과는 대조적으로, dsDNA 가닥은 20 옹스트롬의 직경 (2 nm)이다. 예를 들어, 이. 콜라이 22S RNA 폴리머라제는 135 옹스트롬의 직경이며 (Kitano et al J. Biochemistry 1969 65 1-16); 따라서 상기 폴리머라제를 이용하여 간격을 둔 DNA는, 포화된 배열의 상기 기질과 결합된 dsDNA에 상대적으로 2 퍼센트 (2^2/13.5^2*100) 포화 수준으로 간격을 둘 수 있다. 폴리머라제는 크기가 두드러지게 다양할 수 있고, 예를 들어, 상기에 언급된 이. 콜라이 22S RNAP의 경우 13.5nm인 반면, 비. 스트레아로테르모필루스(B. strearothermophilus) DNA 폴리머라제 I 직경은 9nm로 보고되어 있다 (Kiefer et al Nature Vol. 391 15 304). 일부 실시양태에서, 주형 카피 수를 센서 크기에 매치시키는 것이 바람직할 수 있고; 따라서 일부 실시양태에서 상대적으로 작은 수의 주형 카피를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 실시양태에서, 큰 수의 주형 카피를 이용하는 것이 바람직하다. 따라서, 일부 실시양태에서, 1,000 내지 1,000,000 주형 카피, 또는 10,000 내지 100,000 주형 카피, 또는 100,000 내지 1,000,000 주형 카피를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 실시양태에서, 1,000,000 내지 100,000,000 주형 카피, 예컨대 1,000,000 내지 5,000,000 주형 카피, 5,000,000 내지 20,000,000 주형 카피, 또는 20,000,000 내지 100,000,000 주형 카피를 이용하는 것이 바람직할 수 있다.
입체 장해는 DNA 주형의 목적 길이가 길어서 대부분이 아닌 상기 DNA가 기질에 대해 수직이 아닌 경우 간격이 폴리머라제의 크기와 동일한 경우 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 주형은 폴리머라제보다 기질 상에 잠재적으로 더 많은 공간을 취하면서 "볼 업(ball up)"하기에 충분히 길다. 일부 경우에, ssDNA 및/또는 dsDNA 결합 모이어티는 DNA를 간격화하는데 사용될 수 있으며, 상기 DNA는 DNA 프라이머일 수 있고, 상기 ssDNA 및/또는 dsDNA 결합 모이어티는 다른 간격 잔기에 결합됨으로써, 입체 장해는 상기 ssDNA 및/또는 dsDNA 결합 모이어티 및 회합된 추가의 간격 잔기의 간격 및 후속 제거에 의해 최소화된다. 상기 간격 잔기는 다른 단백질일 수 있거나, 상기 DNA 주형에 바람직한 것과 유사한 길이의 DNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, 목적 폴리머라제의 크기 및 주형의 목적 길이에 따라 다를 수 있는 포화 부착된 DNA에 대한 부착된 DNA의 포화도의 수준은 0.001 내지 40%일 수 있거나, 0.01 내지 15%일 수 있거나, 0.1 내지 5%일 수 있거나, 0.5 내지 2%일 수 있다.
일부 실시양태에서, 기질에 대해 DNA를 부착, 결합 또는 회합하면서 폴리머라제 또는 다른 스페이서, 특히 프라이머가 부착된 상기 기질을 연장하도록 의도된 폴리머라제보다 긴 폴리머라제를 사용함으로써, 입체 장해는 유의하게 완화될 것이다. 추가 실시양태에서, 폴리머라제는 또한 착물의 유효한 크기를 증가시키는 작용을 할 수 있는 임의의 다른 헬퍼 단백질 또는 다른 잔기가 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 판독 시약 용액의 디바이 길이는 탈이온수와 유사하며, 그 정의는 10-7 몰의 H+ 및 OH- 농도 및 680 nm의 생성된 디바이 길이를 갖는다. 다른 실시양태에서, 판독 용액의 이온 농도는 약 1 마이크로몰이고, 이는 약 300nm의 디바이 길이가 된다. 이는 반응 동안 판독될 수 있다. 다른 실시양태에서, 판독 용액은 전체 수성 용매가 아닐 수 있는 이온성 용매를 포함하며, 이는 용액에서 보다 낮은 전하 수준을 허용하고 따라서 보다 긴 디바이 길이를 가능하게 하고, 나노브릿지 (본원에 기재됨)를 허용하여 보다 많은 비드를 감지한다. 예를 들어, 판독 용액은 직경이 1 마이크로미터 초과, 예컨대 2, 3, 5 또는 그 이상의 마이크로미터인 비드의 감지를 허용할 수 있다. 비수성 용매를 포함하는 판독 용액은 증류수보다 낮은 전도성을 가질 수 있으며, 이는 벌크 용액을 통과하는 전류에 반대되는 DNA를 회합하는 반대 이온을 통과하는 전류의 보다 높은 비율을 허용한다. 용매는 물과 혼화성일 수 있으며, 목적 잔기의 용해도를 가질 수 있고; 일부 대표적인 용매로는 DMSO, 알콜 및 에테르를 들 수 있다. 상기 혼화성 용매는 물보다 낮은 H+ 및 OH- 농도를 갖는 보다 낮은 고유 이온 농도를 가질 수 있다. 상기 용매는 물과 함께 사용되어 부분적으로 낮은 농도의 수소 이온을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이온 농도는 1 마이크로몰 이하, 예컨대 1 마이크로몰 내지 0.5 마이크로몰, 0.1 마이크로몰 내지 0.5 마이크로몰, 0.01 마이크로몰 내지 0.1 마이크로몰, 0.001 마이크로몰 내지 0.01 마이크로몰, 또는 0.001 마이크로몰 미만일 수 있다. 다른 실시양태에서, 판독 시약의 이온 농도는 1 마이크로몰 초과, 예컨대 1 밀리몰, 2 밀리몰, 5 밀리몰, 또는 그보다 높은 이온 농도일 수 있다. 일부 실시양태에서, 센서는 국부 전하, 국부 전도성 또는 국부 수소 이온 농도로 변화를 검출할 수 있다.
중합에 사용되는 많은 상업용 완충제는 중합에 요구되지 않는 많은 양의 나트륨 또는 염화칼륨을 함유하며, 추가로 무겁게 완충될 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 Bst 폴리머라제에 적용가능한 것으로 기재된 NEB 등온 증폭 완충제 (1X)는 20mM 트리스-HCl, 10mM (NH4)2SO4, 50mM KCl, 2mM MgSO4 및 0.1% 트윈-20을 함유하고; NEB Phi29 DNA 폴리머라제 반응 완충제 (1X)는 50mM 트리스-HCl, 10mM (NH4)2SO4, 10mM MgCl2 및 4mM 디티오테이트롤을 함유한다. 완충 시약은 센서로서 나노브릿지 또는 ISFET를 사용하는 경우 pH 측정을 간섭하며, 높은 이온 농도는 나노니들 센서를 사용하는 경우 측정을 간섭할 수 있는 높은 백그라운드 수준을 생성한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 보다 낮은 농도의 pH 완충제 및 또는 보다 낮은 전체 이온 농도를 갖는 완충제 시약을 사용하는 것이 바람직하다.
일부 실시양태에서, 디바이 길이를 최대화하기 위해 매우 낮은 이온 강도 시약을 사용하는 것이 바람직하다. 그러한 실시양태에 대해, 효소적 반응에 필요한 것보다 많지 않은 염을 갖는 시약을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 시약에 대해, 염의 양을 최소화하는 것, 예를 들어 NaCl 또는 KCl의 양을 감소시키거나 최소화하고, 충분한 Mg를 사용하는 것이 바람직하다. 충분한 Mg는 시약에 사용되는 뉴클레오티드의 농도와 동일한 농도를 포함할 수 있고, 추가의 Mg가 DNA에 대한, 그리고 추가의 Mg가 DNA에 회합된 유동 셀의 폴리머라제에 대한 반대 이온으로서 작용한다. 따라서, 필요한 농도는 뉴클레오티드 농도, 유동 셀의 DNA의 양 및 길이, 폴리머라제 분자의 수 및 사용된 시약의 부피의 함수일 것이다.
이온 농도가 매우 낮은 일부 실시양태에서, pH는 주변 공기에 의해 영향을 받을 수 있다. 탄산을 형성하는 CO2의 존재를 최소화하는 임의의 노력 후에 잔류할 수 있는 임의의 잔류 CO2는 pH를 감소시킨다. 완충 시약은 이온 농도에 기여하며; 따라서 완충의 양을 최소화하는 것이 또한 바람직하다. 충분한 완충을 갖는 것과 충분히 낮은 이온 강도를 갖는 것 사이의 충돌을 완화시키는 요구는 몇몇 실시양태에 의해 달성될 수 있다. 한 실시양태는 2가지 완충제, 예를 들어 트리스 HCl에 반대되는 트리스 및 HEPES의 배합물을 함께 사용함으로써, 트리스와 HEPES 둘다 완충에 기여할 수 있다. 이상적으로, 두 완충제는 감소된 이동성을 위해 고분자량/전하를 가질 것이다. 또 다른 실시양태에서, 물과 혼화성일 수 있는 유기 시약, 예컨대 알콜 (예를 들어, 에탄올)이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 임의의 1가 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+를 완충제로부터 제거하여 DNA 또는 비드 상의 반대이온 분포로의 변화를 야기하는 2가 Mg++에 대한 경쟁적 반응을 회피하는 것이 바람직하다.
일부 실시양태에서, 비드에 회합된 전하는 전기 전하/전도성 센서의 범위를 감소시키거나, 센서의 노이즈에 대한 신호를 강등시킬 수 있다. 그 결과, 일부 실시양태에서, 예를 들어 표면 상의 술페이트 또는 다른 음성으로 하전된 잔기의 양을 변화시킴으로써, 비드의 표면 상에 존재하는 전하의 양을 최소화하는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 소량의 음전하를 가져서, DNA 또는 뉴클레오티드가 비드의 표면에 결합하지 않지만, 센서의 역학 범위에서 유의한 감소가 없도록 충분하지 않은 전하를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 다른 실시양태에서, 비드는 DNA 프라이머가 부착된 경우 비드가 음으로 하전되도록 약한 양전하를 가질 수 있다. 에탄올과 같은 용매를 함유하는 용액은 DNA의 부착을 허용하는 비드를 용매화하는데 사용될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 라이게이션은 중합 이외에 사용될 수 있다. 탐침 올리고의 4 풀이 사용될 수 있으며, 단일 탐침 풀 내의 각각의 탐침의 제1 염기는 동일하다. 신호 수준에서 부수적 증가를 갖는 다중 라이게이션이 일어날 수 있도록 탐침은 가역적으로 종결된 꼬리를 사용할 수 있거나, 네이티브 꼬리를 가질 수 있다. 다중 dNTP 및 폴리머라제의 사용과 유사한 방식으로, 1 풀 초과의 올리고 (모든 탐침이 단일 염기로 출발함)는 합해질 수 있고, 다시 라이게이션의 수와 신호 수준의 부수적 증가를 가질 수 있다. 제2 가닥은 제거될 수 있고, 상기 프라이머의 길이가 이전 프라이머의 길이보다 짧아지거나 길어질 수 있는 신규한 프라이머가 도입될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 부착된 DNA 분자는 헤어핀 프라이머를 가질 수 있으며, 헤어핀 프라이머의 부분은 제한 부위를 갖는다. 후속적으로, 프라이머 연장의 완결 및 샘플 DNA 서열의 수반되는 결정 후, 제한 부위는 적절한 엔도뉴클레아제 효소 또는 니킹 효소에 의해 절단될 수 있고, 연장된 프라이머는 샘플 DNA가 용매화되는 용액의 온도 또는 pH의 하나를 변화시킴으로써 용융될 수 있다. 샘플은 이어서 샘플 DNA가 용매화되는 용액의 온도 또는 pH를, 뉴클레오티드 및 양이온의 적절한 농도를 비롯한 프라이머 연장에 적절한 조건으로 회복시킨 후 재현탁될 수 있다. 대안적 실시양태에서, 효소를 대체하는 가닥, 또는 5'에서 3'로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를, 제2 가닥을 제거할 필요 없이 사용할 수 있다.
추가 실시양태에서, 화학적으로 절단될 수 있는 연결이 효소적 절단에 대한 필요 없이 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리머라제 및 또는 임의의 다른 헬퍼 단백질이 회합된 반대 이온의 수를 최소화하는 것이 바람직하다. 따라서, 폴리머라제 중 하전된 아미노산, 예컨대 Glu, Asp, Lys, His, 및 Arg를, 매우 보존적 치환으로, 예컨대 각각 Glu를 Gln로, Glu를 His로, Asp를 Asn으로, Arg를 Gln으로, His를 Tyr로, Lys를 Arg로, Lys를 Gln으로, Lys를 Glu로, 또는 보존적 치환으로, 예컨대 Glu를 Arg로, Glu를 Asn으로, Glu를 His로, Glu를 Ser로, Asp를 Gln으로, Asp를 Ser로, Arg를 Asn으로, Arg를 Glu로, Arg를 His로, His를 Arg로, His를 Gln으로, His를 Glu로, lys를 Asn으로, Lys를 Ser로, 보다 분지성 BLOSUM45 정렬을 이용하여 치환하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 치환은 하전된 아미노산으로부터 비하전된 아미노산으로일 수 있거나, 비하전된 아미노산으로부터 하전된 아미노산으로일 수 있고, 비하전된 아미노산으로부터 하전된 아미노산으로 변화된 아미노산은 반대 전하의 하전된 아미노산에 인접함으로써, 전하는 반대 이온에 대한 필요를 제거 또는 감소하면서 상기 하전된 아미노산 사이에 공유될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유동성 환경과 직접 상호작용하는 단백질의 부분 상에 상기 단백질이 결합될 수 있는 ssDNA와 상호작용하는 것과 반대로 상기 치환을 시키는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보다 긴밀한 결합을 제공하기 위해 상기 ssDNA와 상호작용하고 결합하는 위치 내에 추가로 양으로 하전된 아미노산을 첨가하는 것이 바람직할 수 있다.
예를 들어, 도 10에 나타난 바와 같이 (문헌 [Hollis et al PNAS 98 17 9557]), 단일 SSB의 양으로 하전된 부분 (통상적으로 삼원 생체내)은 1002의 부분으로서 더 짙은 회색을 나타냄으로써, ssDNA가 결합하는 상기 SSB의 부분을 나타낸다. 도 10은 반대로 1000의 부분으로서 더 짙은 회색에서 양으로 하전될 수 있는 상기 SSB의 부분을 나타내고, 따라서 SSB가 ssDNA에 결합할 때 축적되는 추가의 반대 이온을 야기할 수 있고, 나노브릿지의 감수성 구역 상에 전하의 영향, 또는 ssDNA에 근접한 부피의 전도성을 국부적으로 증가시키는 것에 기인한 증가된 백그라운드 전류 변화를 야기한다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제, 또는 ssDNA 또는 dsDNA 결합 친화도를 갖는 단백질일 수 있는 DNA 결합 단백질은 상기 단백질(들)의 관심의 DNA 가닥(들)의 결합이, 네이티브 DNA 결합 단백질(들)이 관심의 상기 DNA 가닥(들)에 결합한 경우 일어날 수 있는 것보다 낮은 백그라운드 전류 변화를 초래하도록 돌연변이될 수 있다. 일부 실시양태에서, 백그라운드 전류 변화는 돌연변이된 단백질(들)의 관심의 상기 DNA 가닥(들)에의 결합의 결과로서 일어나, 유체와 상호작용하는 돌연변이된 단백질의 감소된 전하의 결과로서, 또는 상기 돌연변이된 단백질(들)과 관심의 상기 DNA 가닥(들) 사이의 증가된 전하 상호작용의 결과로서 관심의 상기 DNA 가닥(들)에 회합될 수 있는 반대 이온의 수를 감소시키는 돌연변이된 단백질(들)의 결과로서, 단백질(들)이 관심의 상기 DNA 가닥(들)에 결합되지 않고 백그라운드 전류에 대해 백그라운드 전류의 관찰가능한 변화를 초래하지 않을 수 있다. 다른 실시양태에서, 백그라운드 전류 변화는 돌연변이된 단백질(들)의 관심의 상기 DNA 가닥(들)에의 결합의 결과로서 일어나, 유체와 상호작용하는 돌연변이된 단백질의 감소된 전하의 결과로서, 또는 상기 돌연변이된 단백질(들)과 관심의 상기 DNA 가닥(들) 사이의 증가된 전하 상호작용의 결과로서 관심의 상기 DNA 가닥(들)에 회합될 수 있는 반대 이온의 수를 감소시키는 돌연변이된 단백질(들)의 결과로서, 단백질(들)이 관심의 상기 DNA 가닥(들)에 결합되지 않고 백그라운드 전류에 대한 백그라운드 전류의 감소를 초래할 수 있다.
다른 실시양태에서, 닉 부위를 갖는 프라이머가 제공될 수 있다. 추가 실시양태에서, 니킹 엔도뉴클레아제에 대한 필요를 제거하면서 다중 인접 프라이머가 제공될 수 있다. 프라이머는 라이게이션된 프라이머에 상보적일 수 있거나, DNA의 표적화된 섹션에 상보적일 수 있다. 서열분석 프라이머는 증폭 반응을 통해 클론 세대에 사용되는 프라이머의 전부 또는 일부를 포함할 수 있거나, 증폭을 위한 프라이머의 부분으로서 사용되지 않을 수 있는 영역을 포함할 수 있거나, 증폭 반응에서 프라이머에 사용되는 두 영역, 및 증폭 반응에 사용되지 않는 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 신호의 측정의 품질은 센서를 앞에서 가격하는 시약의 샤프함에 의존할 수 있으며, 수집 시간 윈도우 크기는 특히 염기 혼입의 결과로서 순간적인 pH 변화를 검출하기 위한 시약이 센서와 접촉하는 경우에 의존할 수 있다. 파두의 샤프함은 예를 들어 시약이 유동성 라인, 밸브 및 유동 셀 자체를 통해 움직이는 동안 확산에 의해 감소될 수 있다. 타이밍을 보다 잘 제어하고 확산을 최소화, 특히 시약 전달을 효과적이게 하는 데 필요한 시간을 최소화하기 위해, 전기장 반발 전하가 활성 시약을 유지하는데 사용될 수 있고, 예를 들어 dNTP는 유입 포트에서 배출 포트로 유동 셀의 길이를 따라 초기 전달 동안 센서 어레이의 평면에 수직인 축에서 센서로부터 멀리 유지될 수 있다. 이후에 전기장은 시약을 센서로 끌어오도록 변화되거나 반전될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전기장은 판독 시간 윈도우를 보다 잘 제어하기 위해 상이한 시간에서 센서 어레이의 상이한 섹션 상에서 활성화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유동 셀을 통한 시약의 유동은 층류일 수 있고, 반응 챔버로/그의 상부로 전달되는 시약(들)은 시약의 유동에 대해 수직인 축으로의 확산에 의해서만 발생하는 혼합과 함께 거기에 머무를 것이다. 이는 혼입을 원할 때까지 지연시키기 위해 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 층류 및 전기장을 둘 다 합하여, 센서로의 전달을 제어할 수 있다.
다른 실시양태에서, 온도는 낮게 유지될 수 있으며, 이로써 시약이 전달되는 동안 폴리머라제 활성이 최소화되고, 이어서 반응이 개시되도록 한다.
확산 효과를 최소화하기 위해, 서열 분석을 위해 필요한 모든 뉴클레오티드는 시스템에 존재할 수 있으며, 유일한 반응 촉발 인자는 마그네슘 이온일 수 있다. 마그네슘 이온은 반응의 다른 성분, 예컨대 폴리머라제 및 dNTP에 비해 더 큰 확산 속도를 갖는다. 이들 또는 다른 실시양태에서, 저장소 및 반응의 온도는 폴리머라제 효소의 활성화 온도보다 낮게 유지될 수 있다. 이로써 반응은 정확한 온도 제어에 의해 촉발될 수 있고, 따라서 확산 한계를 극복한다. 예를 들어, 이들 실시양태에서, 어레이의 병렬 반응은 거의 동시일 수 있다. 활성화 온도는 당업계에 공지되어 있고/거나 임의의 특정한 실시양태에 대해 실험적으로 결정될 수 있다. 클레나우 폴리머라제에 대한 활성화 온도는 대략 4℃이고, Taq에 대한 활성화 온도는 대략 60℃이다. 또 다른 실시양태에서, 반응은 반응 전에 나노입자 또는 소포에서 격리되어 적절한 외부 자극 (예를 들어, 레이저 또는 온도)에 의해 방출될 수 있는 필요한 반응 보조-인자의 도입에 의해 촉발될 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플 제조 방법의 일부로서, "바코드"가 각각의 샘플과 회합될 수 있다. 이 과정에서, 짧은 올리고가 프라이머에 첨가되고, 여기서 각각의 상이한 샘플은 프라이머 이외에도 상이한 올리고를 사용한다. 프라이머 및 바코드는 라이브러리 생성 과정의 일부로서 각각의 샘플에 라이게이션된다. 따라서, 각각의 콜로니 생성과 관련있는 증폭 과정 동안에, 프라이머 및 짧은 올리고 또한 증폭된다. 바코드의 회합이 라이브러리 제조 방법의 일부로서 수행되기 때문에, 클론 집단의 생성에서 1개 초과의 라이브러리, 따라서 1개 초과의 샘플을 사용하는 것이 가능하다. 합성 DNA 바코드가 프라이머의 일부로서 포함될 수 있으며, 여기서 상이한 합성 DNA 바코드가 각각의 라이브러리에 대해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 라이브러리는 유동 셀에 도입되면서 혼합될 수 있고, 각각의 샘플의 동일성은 서열분석 과정의 일부로서 결정될 수 있다.
샘플 분리 방법은 샘플 식별자와 함께 이용될 수 있다. 예를 들어, 칩은 4개의 별도의 채널을 가질 수 있고, 4개의 상이한 바코드를 사용할 수 있으며, 따라서 16개의 상이한 샘플의 동시 작동이 가능하다. 이는 확실한 샘플 확인을 여전히 제공하면서도 보다 짧은 바코드의 사용을 허용한다.
나노센서 및 검출 방법 및 시스템
일부 실시양태에서, DNA 콜로니의 서열을 결정하기 위해 전하 또는 pH 감수성 검출기를 사용한다. 콜로니는 비드 상에서 생성될 수 있으며, 상기 비드에 프라이머, 폴리머라제 및 dNTP를 제공하면서 상기 비드를 센서 위치로 전이시킬 수 있으며, 그동안 dNTP의 혼입으로 인한 전하 또는 pH의 변화를 관찰한다. 센서 위치와 콜로니 사이의 일대일 교환이 있을 수 있다.
본원에 개시된 장치의 실시양태에서, 복수 개의 자기 비드 중 1개가 놓여 있는 오목부의 가장자리에 맞는 원호 형상으로 형성된 1개 이상의 전극을 갖는 복수 개의 나노니들 센서를 사용한다.
나노센서는 비-구형 비드 또는 입자의 직경 또는 장축 상에서 측정시 0.1, 1, 5, 10 또는 20 마이크로미터 중 하나보다 작은 비드 또는 입자를 검출하도록 고안된 센서이다. 대안적으로, 상기 센서는 상기 비드 또는 입자와 회합된 모이어티에 대해 감수성일 수 있거나, 또는 상기 비드 또는 입자와 회합된 모이어티를 포함하는 반응으로부터의 반응 생성물 또는 부산물에 대해 감수성일 수 있다. 상기 모이어티는 DNA 단편, 수소 이온, 또는 반대 이온일 수 있는 다른 이온을 포함할 수 있으며, 따라서 상기 비드 또는 입자와 회합될 수 있거나, 또는 상기 비드 또는 입자에 결합되거나 회합된 모이어티와 회합될 수 있다. 나노센서는 나노브릿지, 나노니들 또는 ISFET 센서를 포함할 수 있다. 나노니들은 전극들의 활성 지역 사이의 국소적 환경의 전도도를 측정하기 위해 위치하는 2개의 전극을 포함하는 임피던스 측정 센서일 수 있다. "나노브릿지"는 저항성 장치의 활성 지역에 근접한 전하에 반응할 수 있는 센서를 포함할 수 있는 저항성 장치를 지칭하며, 상기 저항성 장치는 추가로 반도체 장치일 수 있다.
일부 실시양태에서, "폴리뉴클레오티드 추출 증폭 및 서열분석을 위한 통합된 시스템 및 방법{Integrated system and methods for polynucleotide extraction amplification and sequencing}"을 발명의 명칭으로 하는 미국 가출원 61/389,490 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 나노니들은 pH 센서로서 기능한다.
상기 센서는 US7,932,034 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 혼입 사건과 관련있는 일시적인 특성의 검출을 위해 사용될 수 있다.
본원에 개시된 장치의 실시양태에서, 복수 개의 자기 비드 중 1개를 바로 옆에서 부분적으로 둘러싼 활성 지역을 갖는 복수 개의 나노브릿지 센서를 사용한다. 예를 들어, 활성 지역의 반경은 자기 비드의 반경보다 작을 수 있다.
상기 장치의 실시양태에서, 복수 개의 나노브릿지 센서는 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드로의 혼입을 측정하도록 맞춰질 수 있고, 각각의 나노브릿지 센서는 활성 지역 및 전도 소자를 갖는다. 전도 소자는 활성 지역의 작업 기능을 매칭시키는 작업 기능을 갖는다.
본 발명의 전류의 일부 실시양태에서, 상기 센서는 나노니들 센서, 나노브릿지 센서, ISFET 센서, ChemFET, 나노와이어 FET, 탄소 나노튜브 FET, 다른 유형의 전하, 전도도 또는 pH 검출 센서, 또는 서열분석 반응을 위해 비드 또는 콜로니가 위치할 수 있는 각각의 센서 위치에서 상이한 유형의 센서의 조합일 수 있다. 개별 센서는 단지 단일 양상, 예컨대 전하, 전도도 또는 pH를 이용하여 검출할 수 있거나, 또는 개별 센서는 한 가지가 넘는 양상을 이용하여, 예컨대 전하 및 pH 둘 다에 대해 반응하여 검출할 수 있다. 센서는 유사한 정보 또는 상보적 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 센서 위치에서 1개의 센서는 pH 변화에 대해 반응할 수 있는 반면에, 센서 위치에서 또 다른 센서는 전도도 변화에 대해 반응할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개의 센서는 pH, 전도도 또는 전하의 국소적 변화를 검출할 수 있는 반면에, 또 다른 센서는 기준 센서로 사용된다. 한 실시양태에서, 기준 센서는 임의의 시약과 접촉하지 않도록 위치할 수 있으며, 온도, 전력 공급 전압 등의 변화를 보상하기 위해 사용될 수 있다.
다른 공급원, 예컨대 나노브릿지, 나노니들 또는 FET일 수 있는 센서에 직접 부착된 DNA로의 DNA의 결합으로 인해 또는 하전된 cDNA, RNA, 단백질, 지질, 탄수화물의 결합으로 인해 전하 농도의 변화가 일어날 수 있으며, 전하의 변화는 또한 효소적 반응으로 인해, 또는 한 센서의 감지 영역 내에서 및 또 다른 센서의 감지 영역 내에서 주로 일어나도록 충분히 국소화될 수 있는 임의의 다른 화학 반응으로 인해 일어날 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노니들 센서, 나노브릿지 센서 및 자기 보유 구조물의 조합이 이용된다. 나노니들 구조물은 자기 어레이 소자를 구성하는 자기 구조물 아래에 위치할 수 있거나, 또는 나노니들 구조물은 자기 어레이 소자를 구성하는 자기 구조물의 상부에 위치할 수 있다. 다른 실시양태에서, 나노니들은 자기 어레이 소자를 구성하는 구조물에 대해 직각으로 또는 약간 다른 각도로 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노니들 센서는 DNA 중합 사건에 의해 생성된 이온으로 인한 임피던스 변화를 측정할 수 있다.
다른 실시양태에서, 나노니들은 DNA의 혼입으로 인한 임피던스 표면 변화를 측정한다. DNA의 각각의 염기는 음전하를 갖는다. 염기가 첨가되기 때문에, 전하는 더욱 음성이 된다. 상기 추가의 전하는 DNA 코팅된 비드의 표면의 전도도를 변화시킬 수 있는 양성 반대 이온을 유인한다. 상기 임피던스 변화는 또한 DNA에 결합하는 분자로 인해 일어날 수 있다. 전하가 고정된 분자 (비드에 결합된 DNA)와 회합되기 때문에, 국소적 유체 환경이 중합 조건으로부터 변화된다. 예를 들어, 염기 혼입을 위해 제1 완충제를 사용할 수 있고, 이전 측정으로부터의 전도도 변화를 측정하기 위해 제2 완충제를 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 비드에 부착된 주형 DNA에 염기가 첨가됨에 따라, 나노니들 센서는 비드의 임피던스 변화를 측정하도록 구성된다. 다른 실시양태에서, 상기 DNA 주형은 기판 또는 상기 기판 상의 코팅에 부착되거나 그와 회합될 수 있거나, 또는 장치 전극 또는 상기 전극 상의 코팅에 부착되거나 그와 회합될 수 있다. 성능을 개선시키기 위해, 다른 임피던스를 감소시키는 것이 바람직하다.
센서 임피던스는 다른 임피던스에 의해 지배될 수 있다. 예를 들어, 전극과 비드와 회합된 디바이 층 사이에서 벌크 시약의 임피던스는, 나노니들의 전극과 DNA가 결합된 비드 사이의 물리적 정렬이 양호하지 않을 경우 비드와 회합된 디바이 층을 통한 임피던스에 비해 클 수 있다. 예를 들어, 벌크 시약의 임피던스가 전극들 사이의 전체 임피던스의 90%를 구성하는 경우, 비드 상의 DNA 및 그의 회합된 반대 이온의 임피던스는 전극들 사이의 전체 임피던스의 10%를 구성하고, DNA 및 회합된 반대 이온의 임피던스에서의 1% 변화는 전극들 사이의 전체 임피던스에서의 0.1% 변화를 일으킬 것이다. 전극들 사이의 벌크 시약의 임피던스는, 벌크 용액의 이온 농도가 높을 경우 비드와 회합된 디바이 층을 통한 임피던스에 비해 작을 수 있다.
도 16은 비드를 갖는 나노니들 센서에 대한 단순 회로 (1600)을 개략적으로 예시한다. 상기 센서는 기생 정전용량 (1614) 및 기생 저항 (도시되지 않음)을 가질 수 있다. 상기 센서는 각각의 전극 (1612)와 회합된 이중 층 정전용량 (1610)을 추가로 가질 수 있다. DNA와 회합된 반대 이온, 또는 비드 (1606)에 결합, 부착 또는 회합된 다른 샘플로부터 생성된 저항은 벌크 유체 (1602)로부터 생성된 저항, 비드 (1606)의 표면 상의 전하와 회합된 반대 이온을 통한 전도도로부터의 저항, 및 센서 (1608)의 표면 상의 전하와 회합된 반대 이온을 통한 전도도로부터의 저항과 병렬일 수 있다. 복잡성을 추가할 수 있는 회로의 추가의 일부분은 이중 층 정전용량 (1610)과 비드 (1606)의 표면 상의 전하와 회합된 반대 이온을 통한 전도도로부터의 저항 및 센서 (1608)의 표면 상의 전하와 회합된 반대 이온을 통한 전도도로부터의 저항 사이의 저항 (도시되지 않음)을 포함한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 두 전극과 비드 사이의 거리를 최소화하는 것이 바람직하다. 다른 실시양태에서, 가능한 한 비드로부터의 반대 이온을 측정하여, 가능한 한 상기 비드의 전체 표면으로부터 평균하는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 상기 비드의 반대 측에 상기 전극을 위치시켜서, 가능한 방식으로 전류가 상기 비드의 전체 표면에 걸쳐 유동하게 하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 실시양태에서, 가능한 한 작지 않은 전극을 가져서, 상기 전극으로부터 방출되는 전류 경로의 전류 밀도가 가장 작은 전류 밀도를 갖는 전류 경로의 지점에서의 전류 경로보다 유의하게 높지 않는 것이 바람직하다. 예를 들어, 전극을 무한히 작게 만들 수 있는 경우, 상기 무한히 작은 전극으로부터 방출되는 전류 밀도는 무한히 클 것이다. 또 다른 예에서, 전극은 상기 비드의 양 말단에 구형 캡을 포함하고, 상기 구형 캡에 의해 형성된 원의 원주는 상기 비드의 대원의 길이의 1/2이다. 최대 전류 밀도는 구형 캡들 사이의 중간에서 대원에 비해 구형 캡에서 2배만큼 높을 것이다. 일부 실시양태에서, 비드 표면 상에서 최대 전류 대 최소 전류의 비는 2:1일 수 있고; 다른 실시양태에서, 비드 표면 상에서 최대 전류 대 최소 전류의 비는 2:1 내지 3:1, 3:1 내지 4:1, 4:1 내지 6:1, 6:1 내지 9:1, 9:1 내지 15:1, 15:1 내지 30:1, 또는 30:1 내지 100:1일 수 있다.
일부 실시양태에서, 전극은 반도체 기술을 이용하여 제작되고, 비드에 인접한 전극의 지역은 전극의 두께와 동일한 높이를 갖는다. 전극을 비드로부터 짧은 거리로, 예컨대 0.1 디바이 길이 내지 0.3 디바이 길이, 0.3 디바이 길이 내지 1.0 디바이 길이, 1.0 디바이 길이 내지 3.0 디바이 길이, 3.0 디바이 길이 내지 10.0 디바이 길이, 또는 10.0 디바이 길이 내지 100 디바이 길이로 유지하는 것이 바람직할 수 있다. 디바이 길이는 상기 비드 및 상기 전극의 디바이 길이의 상가적 조합으로 고려된다. 대안적으로, 전극이 비드의 대원의 원주의 절반의 분획인 길이를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 상기 분획은 상기 비드의 대원의 원주 절반의 0.01 내지 0.03, 상기 비드의 대원의 원주 절반의 0.03 내지 0.1, 상기 비드의 대원의 원주 절반의 0.1 내지 0.3, 상기 비드의 대원의 원주 절반의 0.3 내지 0.75일 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스템은 전극과 비드 사이에 소정의 거리를 유지하며, 비드의 대원의 원주의 절반의 분획이 되도록 전극을 제작한다.
일부 실시양태에서, 비드에 결합, 부착 또는 회합된 DNA와 관련이 있는 반대 이온을 지나는 측정 전류 일부를 최대화하기 위해서 벌크 시약을 지나는 전류를 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 그 결과로서, 일부 실시양태에서는 비드에 근접한 벌크 시약의 부피를 물리적으로 감소시켜서 DNA 반대 이온으로부터의 임피던스 기여가 최대화되도록 하는 것이 바람직하다. 다른 실시양태에서는, DNA 반대 이온의 측정을 위한 전극에 근접한 비드를 보유하는 구조물의 표면적을 최소화하는 것이 바람직하다. 추가의 실시양태에서, 상기 비드의 제타 전위 및/또는 DNA 반대 이온의 측정을 위한 전극에 근접한 비드를 보유하는 구조물의 표면(들)을 최소화하는 것이 바람직하다.
나노니들 구조물은 많은 수의 단일 DNA 분자 또는 콜로니가 동시에 서열분석될 수 있도록 하는 나노니들 어레이로 제작될 수 있다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 나노니들 센서 구조물 (1700)은 규소 기판 (1701)을 갖도록 제작될 수 있고, 상기 기판에 에칭된 800 nm 깊이의 채널 (1702)을 가질 수 있다. 상기 기판 상에 200 nm 두께의 산화규소 층 (1703), 그 위에 80 nm 두께의 전도성 p+ 규소 층 (1704), 그 위에 30 nm 두께의 산화규소 층 (1705), 그 위에 80 nm 두께의 전도성 p+ 규소 층 (1706), 그 위에 20 nm 두께의 산화규소 층 (1707)이 제작될 수 있다. 상기 채널은 구조물이 제작된 후에 생성될 수 있다. 상기 구조물은, 산화물 층 또는 레지스트 층이 최종 구조물 내에 보유될 수 있는 모든 섹션을 덮도록 하여 생성될 수 있다. 화학적 습윤 에칭, 플라즈마 에칭, 또는 증기 상 에칭이 상기 구조물 하부로부터 규소 또는 다른 유사 기판을 제거하는데 이용될 수 있다. 이후, 이온 밀링 단계를 이용하여, 상기 구조물의 전도성 팁을 노출시킬 수 있다.
상기 모든 물질 및 그의 두께는 달라질 수 있다. 대안적으로, 기판 내의 채널은 산화물 층을 사용하여 제작될 수 있고 채널 용적 내에는 레지스트 층을 갖도록 할 수 있다. 이어서, 상기 산화물 및 레지스트의 최상부 위에 산화물 및 전도체 층을 제작하여, 상기 구조물의 하부 에칭이 필요없을 수 있다. 도 18은 도 17에 개략적으로 도시된 것과 유사한 방식으로 제작된 단일 연부 나노니들 어레이를 예시한다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 이러한 구조물은 기판 (1903) 내에 형성된 채널 (1902)의 양면 모두에 센서 (1901)를 가질 수 있다. 폴리머라제 및/또는 표적 DNA (1904)는 상기 센서의 활성 영역에 부착될 수 있다. 센서 자체는 폴리머라제 및/또는 표적 DNA를 센서의 활성 영역에 전기영동적으로 및/또는 유전영동적으로 국소화하는데 사용될 수 있다. 표적 DNA는 단일 이중 가닥, 단일 가닥 DNA 표적, 또는 고리화된 DNA 표적일 수도 있고, PCT/US2011/054769에 기재된 바와 같이 국소 증폭이 센서의 활성 영역에서 대신 행해질 수도 있다. 도 20은 도 19에 개략적으로 도시된 것과 유사한 방식으로 제작된 맞물린 나노니들 어레이를 예시한다.
이어서, 뉴클레오티드 또는 프로브 (1905)가 제공될 수 있고, 합성 과정에 의한 서열분석 또는 라이게이션 과정에 위한 서열분석이 시작될 수 있다.
나노니들 또는 나노브릿지의 감수성을 개선시키기 위해서 국소 증폭기가 제공될 수 있다. 증폭기는 BJT 또는 FET일 수 있다. 일부 실시양태에서, 각 센서 마다 1개의 증폭기 회로를 갖거나 동일 증폭기를 공유하는 다중 센서를 갖는 증폭기가 사용된다. 다른 실시양태에서, 일부 증폭은 각각의 센서와 관련이 있을 수 있고, 추가의 증폭 및/또는 다른 관련 회로망이 여러 센서 사이에서 공유되거나 멀티플렉스화된다. 센서는 협소한 구조물로 제작될 수 있고, 상기 구조물 하부에서 에칭되어 양면 모두가 pH의 변화 또는 전도성의 변화에 접근가능할 수 있다. 장치의 표면은 샘플 분자의 결합에 더 넓은 표면적이 제공될 수 있도록 매끈하지 않을 수 있다. 나노니들의 전극과 관련된 표면은 금 또는 백금일 수도 있고, 또는 백금 블랙, 산화이리듐, 또는 Ppy/PSS이어서 표면적 및 관련 이중 층 정전용량을 증가시킬 수도 있다.
이온의 전기 농축이 일어나서 DNA, 폴리머라제, 프라이머 뉴클레오티드, 및 나노니들 또는 나노브릿지 센서의 활성 영역에 필요한 다른 시약을 농축시킬 수 있다. 상기 농축은 훨씬 더 많은 샘플이 각 센서에 부착 또는 회합되게 하여 전체 게놈 증폭의 필요성을 감소시킨다.
비드 상의 DNA 임피던스의 최적의 측정을 방해할 수 있는 또 다른 인자는 비드 표면의 제타 전위와 관련된 디바이 층으로 인한 반대 이온 및/또는 센서 표면의 제타 전위와 관련된 디바이 층으로 인한 반대 이온을 포함한다. 이들 반대 이온은 비드 상의 DNA의 반대 이온과 관련이 있는 목적 전류와 연계될 수 있고/거나 대등할 수 있는 전류를 야기할 수 있다. 추가로, 제타 전위가 달라짐에 따라 디바이 길이 및 관련 반대 이온의 수가 그에 따라 조화 변동될 수 있다. 상기 제타 전위는 pH, 염 농도 및 다양한 다른 인자의 변화를 비롯한 완충제 조건의 변화에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 상기한 조화 변동은 DNA의 측정에 혼동을 야기할 수 있다. 따라서, 제타 전위를 최소화하고 또한 완충제 조건 변동에 따른 제타 전위의 변동도 최소화하는 것이 바람직하다.
일부 실시양태에서, 센서는 규소를 사용하여 제작될 수 있다. 이산화규소는 중합 활성에 전형적으로 유용한 pH, 예컨대 pH 7 내지 9에서 유의한 제타 전위 크기를 갖지만, 질화규소의 제타 전위 크기는 이산화규소에 비해 유의하게 더 적다. 따라서, 일부 실시양태에서, 규소 센서 장치 및 상기 규소 센서 장치와 접촉할 수 있는 임의의 성분 사이의 계면에서는 질화규소를 사용하여 제타 전위 및 그와 동시에 관련 디바이 층에 존재할 수 있는 반대 이온을 통한 전류를 최소화한다.
일부 실시양태에서, 센서 표면에 코팅물을 적용한다. 센서는 규소, 이산화규소, PDMS, 토파즈(Topaz)™ 또는 다른 다양한 중합체 또는 그의 조합물로 제작될 수 있고, 여기서 상기 전극 및/또는 코팅물은 예컨대 TiO2, ZrO2, 또는 산화인듐주석, BaTiO3과 같은 물질을 포함하여 제타 전위 및 생성된 디바이 층이 유의하게 감소되도록 할 수 있다. 다른 실시양태에서, 표면 코팅물(들), 예컨대 PEG (폴리 에틸렌 글리콜), PTFE, 폴리 L 리신, 아크릴레이트, 메틸 셀룰로스, n-도데실-B-D-말토시드, 아크릴아미드, 플루오린화 알칸 쇄, 또는 다른 가교되거나 부분적으로 가교된 중합체를 혼입하여 제타 전위를 변형시키거나, 또는 표면 코팅물의 조합물을 사용하여 제타 전위 및 그와 동시에 디바이 길이를 유사하게 최소화한다. 다른 실시양태에서, 제타 전위 크기는 이온화가능한 실란올 기의 수를 감소시키는 트리메틸클로로실란과 같은 화합물로 실란올 기를 보호함으로써 감소된다.
일부 실시양태에서, 감지될 DNA가 부착된 비드의 제타 전위를 감소시켜서, 상기 제타 전위로 인해 비드의 표면에 회합된 반대 이온으로 인해 생성된 전류를 그와 동시에 감소시키는 것이 바람직하다. 따라서, 일부 실시양태에서, 효과적인 중합이 예상되는 pH 수준에서 낮은 제타 전위를 갖는 물질로 비드를 제작하는 것이 바람직하거나, 또는 비드를 효과적인 중합이 예상되는 pH 수준에서 낮은 제타 전위를 갖는 물질로 코팅할 수 있으며, 예를 들어 PEG (폴리 에틸렌 글리콜), PTFE, 폴리 L 리신, 아크릴레이트, 메틸 셀룰로스, n-도데실-B-D-말토시드, 아크릴아미드, 플루오린화 알칸 쇄, 또는 다른 가교되거나 부분적으로 가교된 중합체를 사용하여 제타 전위를 변형시키거나, 또는 표면 코팅물의 조합물을 사용하여 제타 전위 및 그와 동시에 디바이 길이를 유사하게 최소화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 완충제 시약으로 야기될 수 있는 pH 변동을 최소화하는 것이 바람직하고, 그와 동시에 이온 농축을 최소화하는 것이 바람직할 수 있다. 그 결과로서, 고정된 pH를 유지하면서 완충 용량이 거의 없는 시약을 사용하는 것이 바람직하다. 완충제는 일부 경우에 검정 또는 방법의 일부로서 탈기될 수 있고, 이후에 CO2가 완충제 시약으로 용해됨에 따라 상기 완충제의 pH가 변할 수 있다. 일부 실시양태에서, CO2와 완충제 시약 사이의 상호작용을 제한하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 대기 기체를 제외시키고 CO2를 포함하지 않는 다른 기체, 예컨대 질소, 아르곤, 또는 다른 정제된 기체, 또는 CO2를 함유하지 않는 기체 혼합물 또는 상기 시약 완충제 내로 달리 용해될 수 있는 다른 기체를 제공하여 이온 농도 및/또는 pH를 변화시키는 것이 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 시스템은 외부 기체 공급원, 예컨대 산업용 기체 실린더를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 기체 실린더는 유체가 잔류하는 기기에 대해 외부에 위치한다. 다른 실시양태에서, 산업용 기체 실린더는 기기 내의 구획 안에 배치된다. 다른 실시양태에서, CO2 스크러버/탈기기/기포제거기, 예를 들어 재생가능한 금속 산화물 시스템, 크래프트(Kraft) 공정 시스템, 활성탄 시스템, 시스테크 에이에프(Systec AF)® 또는 포리덱스(Poridex)™와 같은 막을 사용할 수 있는 막 시스템을 사용한다. 상기 CO2 스크러버/탈기기/기포제거기는 상기 기기 내에 설치될 수도 있고, 또는 상기 기기에 대해 외부에 존재할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 나노니들 센서와 같은 센서를 위한 센서 전극을 비드에 인접하게 위치시켜서 나노니들 전극과 비드 사이에서 벌크 시약 부피의 양을 최소화하는 것이 바람직할 수 있다. 한 실시양태는 도 2a, 도 2b 및 도 2c에 나타낸 바와 같이 오목부 내에 고정된 비드를 가질 수 있다. 오목부는 기판 상에 침착된 물질로 형성될 수 있고, 오목부를 형성하는 물질은 상기 물질 상에 형성된 나노니들의 쌍을 가질 수 있다. 전극은 오목부의 연부에 순응하여 비드의 연부에 순응하는 아크에 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 오목부는 1개 면 또는 2개 면에서 유체에 완전히 접근가능할 수도 있고, 또는 오목부는 깊이에 대한 폭 비율이 1.0 미만일 수도 있고, 또는 깊이에 대한 폭의 비율이 1.0 내지 0.9, 0.9 내지 0.8, 0.8 내지 0.7, 0.7 내지 0.6, 0.6 내지 0.5, 0.5 내지 0.4, 0.4 내지 0.3, 0.3 내지 0.2, 0.2 내지 0.1 또는 0.1 내지 0.01일 수도 있다.
일부 실시양태에서, 오목부는 비드에 근접한 시약의 부피를 최소화한다. 오목부는 비드의 형상에 순응하여 오목부 바닥이 전극 높이에서의 오목부 단면보다 더 협소한 형상일 수 있다. 다른 실시양태에서, 오목부의 유효 깊이가 비드 직경의 절반보다 더 크도록 전극이 추가의 물질의 층으로 덮여서 비드에 근접한 벌크 시약의 부피를 추가로 감소시킨다.
따라서, 전극은 비드의 표면과 접촉할 수도 있고, 또는 비드 또는 입자 및 그에 부착되거나 결합된 DNA 표면의 디바이 길이 내에 있을 수도 있다. 일부 실시양태에서, 전극은 곡선형이어서 전극이 비드 반경과 유사한 반경으로 곡선을 이루어, 전극과 비드 사이에 보다 양호한 커플링이 이루어진다. 이러한 장치는 나노니들 전극 사이에서 벌크 시약 용액에 의해 전체 임피던스에 가해지는 영향을 최소로 하고, 비드 또는 입자의 표면에 부착되거나 결합된 DNA 또는 DNA 주위의 반대 이온에 의한 영향을 최대로 한다.
일부 실시양태에서, 나노니들은 비드 또는 메카니즘을 유지하는 다른 샘플에 일치하도록 형상화된 센서의 활성 지역을 갖는다. 예를 들어, 원호로 형상화될 수 있으며, 상기 원호의 곡선은 비드의 곡선에 맞춰지도록 배향된다. 또한, 오프셋이거나 나노니들 쌍 중 다른 하나의 나노니들 보다 "짧도록" 배열된 상기 나노니들 쌍 중의 하나의 나노니들을 가져, 원호의 내부 반경이 더 큰 직경과 동일한 중심을 가질 수 있다. 상기 오프셋은 나노니들 쌍과 연관된 감지 영역의 부피를 증가시킬 수 있고, 감지 영역과 연관된 장의 배향 및 그 결과 감지 영역의 배향을 추가로 변화시켜, 감지 영역이 기판에 평행하기보다는 비드의 중심으로 더 배향되도록 할 수 있다.
도식적 측면도 21a 및 도식적 상면도 도 21b에 나타낸 바와 같은 대안적 실시양태에서, 하나의 전극 (2105)은 기판 (2102)에 직접 부착되거나 상기 기판 상의 또 다른 층에 부착되어, 상기 기판으로부터 단리될 수 있다. 나노니들의 제2 전극 (2105)은 고정된 위치에 비드 또는 입자 (2101)를 배치하는데 사용되는 센서의 유전체 (2113) 부분 상에 부착될 수 있다. 그 결과, 비드 또는 입자 (2101)가 두 전극 (2101, 2105)과 접촉하여, 비드 또는 입자 및 비드 또는 입자에 부착 또는 결합된 DNA와 연관된 디바이 길이 내에서 반대 이온으로부터 생성되는 임피던스와는 반대로, 나노니들 전극 사이의 전체 임피던스에 벌크 시약 용액의 영향을 최소화한다.
일부 실시양태에서, 하나 또는 두 전극은, 상기 전극이 전극(들)과 비드 사이에 보다 낮거나 보다 규칙적인 임피던스를 제공하기 위해 비드의 곡선에 맞게 제작될 수 있다. 만곡은 오목부의 가장자리에 인접할 수 있거나, 또는 계면의 더 넓은 면적 및 더 낮은 전류 밀도가 가능하도록 오목부의 가장자리로부터 약간 더 멀 수 있다.
도 21c에 나타낸 바와 같이 추가 실시양태에서, 비드 또는 입자 (2101)는 기판 (2102) 상에 고정될 수 있다. 나노니들 (2100)의 제1 전극 (2105A)은 기판 (2102)에 바로 부착되거나, 상기 기판 (2102)에 점착된 점착층 (도시하지 않음)에 바로 부착될 수 있다. 이어서 유전 층 (2114)은 상기 제1 전극 (2105A)을 덮도록 제작될 수 있다. 이어서 나노니들 (2100)의 제2 전극 (2105B)은 유전체 (2114) 및 및 나노니들 (2100)의 상기 제1 전극 (2105A) 위에 제작될 수 있다. 제2 전극 (2105B)은 비드 또는 입자의 곡선에 맞게 더 짧아질 수 있다. 길이의 차이는 비드 또는 입자 (2101)의 직경과, 두 전극 (2105) 및 전극 (2105) 사이의 유전체 (2114)의 두께의 함수가 된다. 이런 식으로, 전극 (2105)은 비드 또는 입자 (2101)와 접촉할 수 있거나, 비드 또는 입자 (2101)에 매우 가깝게 근접할 수 있어, 비드 또는 입자 (2101) 및 비드 또는 입자 (2101)에 부착 또는 결합된 DNA와 연관된 디바이 길이 내에서 반대 이온으로부터 생성된 임피던스가 벌크 시약의 임피던스보다 크다.
추가 실시양태에서, 전극은 상기 전극이 오목부의 가장자리에 인접하지 않도록 제작될 수 있으나, 대신 전극 바로 옆에서 전류 밀도가 감소될 수 있도록 가장자리로부터 짧은 거리로 제작된다.
도 22a에서, 나노니들 (2200)은, 나노니들 (2200)이 유전체 (2203)에서 오목부의 각 측면 상에 전극 (2205)을 가지며, 비드 (2201)가 기판 (2202) 상에서 유지되고, 상기 전극 (2205)에 메탈리제이션 (2204)이 사용될 수 있는 측면도로 도식적으로 나타낸다. 도 22a에 나타낸 바와 같이, 유전성 물질 (2203)의 두께는 비드 (2201) 직경의 1/2과 유사할 수 있고, 비드 (2201)가 두 전극 (2205)에 대해 계속해서 상기 비드 (2201)의 디바이 길이 이내이도록 하는 동안 오목부 폭은 비드 (2201)의 직경보다 약간 더 클 수 있다. 유전체 (2203)의 상기 두께는 비드 (2201)의 체류를 허용하고, 상기 비드 (2201)를 두 전극 (2205)의 상기 비드 (2201)의 디바이 길이 내로 유지하는 두께일 수 있다.
도 22b에서, 나노니들 (2200)은, 나노니들 (2200)이 유전체 (2203)에서 오목부의 각 측면 상에 전극 (2205)을 가지며, 비드 (2201)가 기판 (2202) 위에서 유지되고, 전극 (2205)에 메탈리제이션 (2204)이 사용될 수 있는 측면도로 도식적으로 나타낸다. 도 22a에 나타낸 바와 같이, 유전성 물질 (2203)은 비드 (2201) 직경의 1/2보다 작을 수 있고, 가능하게는 유전성 물질 (2203) 두께는 비드 직경의 1/4 내지 1/3이며, 오목부 폭은 비드 (2201)가 기판 (2202) 위에 매달리도록 비드 (2201)의 직경 보다 작을 수 있다. 비드 (2202)와 전극 (2205)의 인접은 비드 (2201)가 두 전극 (2205)의 비드 (2201)의 디바이 길이 이내이도록 비드 (2202)와 전극 (2205) 사이에 공간 근접성을 유지한다.
도 22c에서, 나노니들 (2200)은, 나노니들 (2200)이 전극 (2205)을 가지며, 상기 전극 (2205)이 유전성 물질 (2203)에서 오목부 직경이 비드 (2201)의 직경보다 작은 결과로서 비드에 인접함을 유지하도록 곡선화되어, 비드 (2201)와 전극 (2205) 사이에서 접촉하거나 인접하는 지점에 상응하는 원호 위 바로 옆에 비드가 위치하는 상면도로 도식적으로 나타낸다.
도 22d는 도 22b 및 도 22c에서와 유사하나, 비드 (2201)에 실질적으로 유체공학적으로 접근하는 나노니들 구조 (2200)의 3차원 투명도를 나타낸다. 비드 (2201)는 기판 (2202) 위에 매달려 유지되고, 대신 유전성 물질 (2203) 위에 제작된 전극 (2205A)에 대향하여 유지되나 (여기서, 상기 전극 (2205A) 및 유전성 물질 (2203)은 비드 (2201) 디바이 길이의 디바이 길이 이내이도록 형상화됨), 비드 (2201)의 만곡에 부합하도록 곡선화되지 않아, 비드 및 전극 (2205) 및/또는 유전성 물질 (2203) 사이에 라인 접촉을 갖는 대신에 비드 (2201) 및 전극 또는 유전성 물질 (2203) 사이에 3개 또는 4개의 접촉점을 갖는다. 또한, 도 23d는 나노니들 구조 (2200)에서 비드 (2201)를 그 자리에 유지시키는 힘을 가하는 자석 (2208)을 도시한다.
나노니들은, 길이를 늘리고 동시에 나노브릿지 채널의 폭을 좁히기 위해 이중 나선 또는 세르펜틴 패턴으로 배열될 수 있다. 지나치게 넓은 감지 영역은 비교적 낮은 임피던스를 갖고, 예를 들어 비드의 중심에 비해 비드의 가장자리에서 다른 영역보다 국부 전하 밀도가 작게 변하는 감지 영역의 지역을 가질 수 있다. 따라서, "지나치게 넓은" 감지 영역은 또한 임피던스가 적게 변할 수 있고, 감지 영역의 아주 일부 부분으로서 전하에 국부 변화를 일으키는 결합 또는 반응에 의해 유의하게 영향을 받을 수 있다. 반면, 지나치게 길고 얇은 나노니들은, 임의의 전류 변화가 지나치게 작아 노이즈에 대해 우수한 신호를 감지할 수 없을 만큼 큰 임피던스를 가질 수 있다. 따라서, 나노브릿지 센서와 연관된 채널의 폭 및 길이는 상기 나노브릿지 센서가 요구되는 특정 용도에 맞춰질 필요가 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 나노니들은 단일 나노니들의 부분으로서 다양한 활성 영역을 갖도록 배열된다. 활성 영역은 단일 샘플에 대해 다양한 위치에 위치하여, 샘플 영역으로부터 다수의 상이한 지역의 평균을 제공함으로써, 샘플 영역의 위치에서의 변화, 예를 들어 센서에 대해 비드의 약간의 오정렬 또는 표면상에서 부하 밀도의 변화는 센서에 있어 노이즈에 대한 신호에 영향을 덜 준다.
스트리밍 전위는 1859년에 퀸크(Quinke)에 의해 처음 관찰되었고, 모세혈관에서 널리 공지된 현상이며; 다른 인자들 중에서도 유동, 제타 전위 및 유체의 전도성의 함수이다. 따라서, 전압은 나노니들 상에 걸릴 수 있고, 전극 사이의 유동 또는 거리에서의 변화는 나노브릿지에 걸린 편향에 공간적으로 또는 일시적으로 변화를 일으킬 수 있다.
다른 실시양태에서는, 나노니들 전극을 유체의 유동에 평행하게 배향시켜, 전극이 유체의 유동에 직각인 경우에 그러한 것처럼 나노니들의 전극 사이에 걸리는 잠재적 가변성 스트리밍 전위가 아닌 것이 바람직하다.
일부 실시양태에서, 나노니들은, 구동 회로로부터 DC 편향 수준 또는 칩 센서 내로부터의 누설로 인한 영향이 출력 신호에 영향을 주는 것을 방지하기 위해, 하나 또는 두 전극과 연관된, 국부 커패시터 또는 커패시터와 짝지어진다.
추가의 대안적 실시양태에서, 도 23에 나타낸 바와 같은 나노브릿지 센서 구조 (2300)는 상기 언급된 나노니들 센서 대신에 사용된다. 나노브릿지 센서는 나노브릿지에 대해 기술된 바와 같은 원형 또는 선형 DNA, 선형 또는 헤어핀 프라이머, 폴리머라제를 비롯하여 나노니들과 동일한 방식으로 사용될 수 있고, 어레이로서 제작될 수 있다.
나노브릿지 센서 구조 (2300)는 상기 반도체 활성 지역 영역 (2305)을 덮을 수 있고, 상기 반도체 활성 지역 영역 (2305) 위로 추가의 유전체 코팅 (2350)을 가질 수 있는, 기판 (2360), 유전체 절연체 (2310), 2개의 고급 도핑된 반도체 영역 (2304A 및 2304B), 저급 도핑된 반도체 활성 지역 영역 (2305), 추가의 메탈리제이션 층 (2340)을 포함하는 규소-온-절연체(silicon-on-insulator) 장치를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노브릿지는 전하의 국부 변화를 감지한다. 유동 셀에 인접한 나노브릿지 표면의 표면 전하 변화는 유동 셀 제2 층에서의 전하 변화로부터 얻을 수 있다. 이어서 나노브릿지 표면상의 전하의 이들 변화는 나노브릿지에서 전하 분포를 변화시키고, 그 결과 나노브릿지의 전도성을 변화시킬 수 있다. 따라서, 전하 변화를 갖는 나노브릿지 표면의 지역은, 나노브릿지의 다른 표면적이 표면 전하에 변화를 가질 수 없는 것에 반해 나노브릿지의 연관 부피에서 전도도의 변화를 가질 수 있고, 따라서 그의 연관 부피에서 전도도에 변화를 가질 수 없다. 반도체 물질의 유형에 따라, 나노브릿지는 나노브릿지 반도체 물질에서 도핑의 양 및 균일성, 및 나노브릿지의 표면 상에서의 전하의 신호(양성 또는 음성)로 구성되며 (n 또는 p 유형), 전하의 변화가 표면 전하의 양 또는 밀도를 증가시키든지 감소시키든지 전도도를 증가시키거나 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 디바이 길이 내에 위치하는 비드 상에서의 전하의 변화는 이중 층의 두 층에 국부적으로 존재하는 전하의 양 또는 농도에 상응하는 변화를 일으킨다. 전하의 양에서의 상기 변화는 국부 이온 농도, 및 따라서 표면 층 정전용량, 및 디바이 길이 내 시약의 전도도와 직접 관련된다. 전하의 상기 변화는 표면 층의 상대 전하 및 비드 상에서의 전하 변화에 따라 증가되거나 또는 감소될 수 있다.
클론 비드의 서열분석을 위한 일부 실시양태에서, 나노브릿지 센서가 사용된다. 나노브릿지 센서는 나노니들과 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
대안적 실시양태에서, 나노브릿지는 국부 온도 변화를 감지하며, 따라서 어느 정도는 온도 센서로서 작용할 수 있다.
대안적 실시양태에서, 나노브릿지는 뉴클레오티드 혼입을 검출하는 온도 센서 및/또는 pH 센서로서 작동하도록 배열될 수 있다. 이 방법은 그의 전문이 본원에 포함되는 "DNA 서열분석을 위한 열 및 pH 측정" 명칭의 미국 특허 출원 제20080166727호에 추가로 개시되어 있다.
본 발명은 pH 및/또는 온도 검출에 기초하는 폴리뉴클레오티드 서열분석을 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 시스템 및 방법은 pH 및/또는 온도 변화의 시각적 또는 광학적 검출을 가능하게 하는 염료 또는 양자 점을 추가로 사용 (또는 별법으로 사용)할 수 있다. 이 모니터링은 벌크 용액의 모니터링을 가능하게 하거나, 각 콜로니와 연관된 부피의 국부 모니터링을 가능하게 하거나, 벌크 용액 및 각 콜로니와 연관된 부피 둘 다의 모니터링을 가능하게 할 수 있다.
다른 실시양태에서, 나노브릿지 센서의 어레이는, 채널 크기를 더 최소화하고, DNA 서열 분석 반응으로부터 생성된 전하와 상호작용하는 표면적을 최대화하도록 하부에 에칭된다. 다른 실시양태에서, 나노브릿지 센서의 어레이는 하부에 에칭되지 않거나, 또는 보다 탄탄한 구조를 제공하도록 부분적으로 에칭될 수 있다. 또다른 추가 실시양태에서, 나노브릿지 센서의 어레이는 한 면에 교대로 나열되고, 이어서 다른 면에 교대로 나열되는 전위 증폭기와 같이, 전위 특징을 가지며, 센서가 두 측면으로부터 서로간에 삽입된, 빗살 배위로 나열되도록 배열된다. 또 다른 실시양태에서, 나노브릿지 센서의 어레이는 증폭기와 같이 전위 특징이 센서 어레이의 한 측면에 모두 나열되도록 배열된다.
일부 실시양태에서, 나노브릿지 센서는 감지 채널의 폭 및 길이가 감지 용도를 위한 최적의 감도를 위해 나열되도록 배열된다. 변화는 샘플 영역의 간격 및 크기, 목적하는 모이어티를 감지하는 것과 연관된 전하, 및 감지 영역과 국부 증폭기 사이의 나노브릿지의 전도성 부분과 같은 비감지 영역에서 나노브릿지의 임피던스 또는 기타 연관 임피던스와 관련될 수 있다.
일부 실시양태에서, 센서는 도 24a, 도 24b 및 도 24c에 제시된 바와 같이, 활성 지역이 비드 또는 입자 (2401)을 부분적으로 둘러싸도록 그리고 비드 또는 입자 (2401)에 바로 근접하도록 제작된 나노브릿지 센서 (2400)이다. 센서는 기판 (2402)를 포함하며, 그 위에 유전체층 및/또는 반도체 물질 (2403)이 적용될 수 있다. 나노브릿지 (2405)의 활성 지역은 비드 또는 입자 (2401)의 대부분을 둘러싸도록 제작될 수 있다. 금속화 라인 (2404)는 반도체 물질 (2404A)의 보다 고도의 도핑 영역에 연결되어 나노브릿지의 활성 지역 (2405)와 접속할 수 있다. 도 24a는 활성 지역 (2405)의 내부 부분이 비드 또는 입자, 및 거기에 결합될 수 있는 DNA의 디바이 길이 내에 있는 "고리" 나노브릿지의 측면도이다. 활성 지역은 부분적으로 또는 완전히 비드 또는 입자의 디바이 길이 내에 존재하며, 이로 인해 전체 활성 지역의 임피던스를 비드 또는 입자에 결합하거나 연결된 전하의 변화 및/또는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 혼입 사례에 대응하여 변경시킬 수 있다. 고리의 직경 및 연결된 지지 구조 (2403)은 비드가 고리 내부에 딱 맞도록 규격화될 수 있다.
대안적으로, 도 24b에 제시된 바와 같이, 고리 및 지지체 구조 (2400)은 특히 자장에 따르는 경우, 비드가 나노브릿지 (2405)의 활성 지역의 고리에 따라 좌우될 수 있도록 비드 또는 입자 (2401)의 직경보다 작게 규격화되어, 고리가 비드 또는 입자 (2401) 및 거기에 결합된 DNA의 디바이 길이 내에 반드시 존재하게 할 수 있다. 도 24c는 나노니들의 활성 지역 (2405)를 넘어 비드 (2401)의 오버랩, 및 활성 지역 (2405)의 임피던스를 측정하기 위한 수단을 제공하는 전기 전도체 (2404)를 보여주는 고리 구조로 수행된 나노브릿지 (2400)의 상면도이다.
일부 실시양태에서, 나노브릿지 센서의 형상은 자기성 또는 상자성 입자와 보다 큰 상호작용을 제공하도록 최적화된다. 상기 나노브릿지 센서는 나선형, 세르펜틴 형상 또는 다른 비선형 형상이거나, 또는 전류용 협채널을 유지하면서 보다 큰 표면적을 제공하여 나노브릿지의 채널을 통해 유동하도록 하기 위해 가변적 단면을 가진 형상일 수 있다.
전기 전도체 (2404)는 나노브릿지의 고도로 도핑된 영역 (도시하지 않음)에 연결될 수 있고, 이어서 나노브릿지의 활성 지역 (2405)에의 전기 연결을 제공한다. 대안적으로, 나노브릿지의 전기 전도체 (2404)는 나노브릿지 전기 전도체 (2404)를 제작함으로써 옴 접속부를 갖는 나노브릿지의 활성 지역 (105)에 직접 연결되어 일함수가 나노브릿지의 활성 지역 (2405)의 일함수와 부합될 수 있다. 알루미늄의 일함수 값은 가볍게 도핑된 규소의 일함수 값에 가까우나, 완전히 일치하지는 않는다. 보다 완벽하게 일치시키기 위해, 알루미늄 합금이 대안적으로 이용될 수 있다.
유동 전위는 1859년에 퀸케(Quinke)에 의해 처음 관찰되었고, 모세혈관에서 익히 공지된 현상이며, 다른 요인들 중 유동률, 제타 전위, 유체 전도성의 함수이다. 따라서, 전압은 나노브릿지 ISFET 또는 다른 chemFET 센서에 가해질 수 있으며, 전극 사이의 유동률 또는 거리의 변화는 나노브릿지에 가해지는 바이어스의 공간적 또는 일시적 변형을 야기할 수 있다.
일부 실시양태에서, 센서의 감광 지역에 가해지는 바이어스 전압의 변동을 감소시키기 위해, 상이한 나노브릿지 또는 ISFET 센서 사이에 일렬로 제작될 수 있는 기준 전극을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기준 전극은 어레이 나노브릿지 또는 ISFET의 어레이의 기판 상에, 어레이 나노브릿지 또는 ISFET의 각 나노브릿지 또는 ISFET 사이에 제작된다. 상기 전극은 상기 나노브릿지 또는 ISFET 어레이의 구조물의 일부로서 금속화에 의해 상호연결될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 전극 세트는 상기 나노브릿지 또는 ISFET 어레이의 구조물의 부분으로서 금속화를 이용하여 상호연결된다. 다른 실시양태에서, 기준 전극은 나노브릿지 또는 ISFET 센서의 고정수 또는 가변수가 나노브릿지 또는 ISFET 어레이의 각 나노브릿지 또는 ISFET 사이에 있도록 제작된다. 추가 실시양태에서, 바이어스 전압차는 소프트웨어 또는 펌웨어에 의해 보상될 수 있으며, 여기서, 전압 바이어스의 효과를 측정하고, 맵핑하고, 상기 맵을 사용하여 나노브릿지 또는 ISFET의 어레이로부터의 신호 수준의 변화를 보상할 수 있다.
일부 실시양태에서, 기준 전극을 사용하여 나노브릿지 및/또는 나노니들, 또는 ChemFET의 어레이일 수 있는 센서 전극 또는 센서 장치의 활성 지역에 대해 시약 유체를 바이어스한다. 일부 실시양태에서, 기준 전극은 센서 장치의 부분이 되도록 구성된다. 추가 실시양태에서, 기준 전극들 중 하나 이상이 센서 장치와 연결된 유동 셀의 부분이거나 또는 이들과 연결된 다중 기준 전극이 존재한다. 다른 실시양태에서, 2개 이상의 기준 전극이 센서 장치와 연결된다. 일부 실시양태에서, 다중 기준 전극은 어레이의 구성원 전부에서 실질적으로 유사한 시약 전압을 유지하는데, 이는 유체 두께가 충분히 얇아 센서 어레이의 표면 상에 상당한 저항을 일으키는 유동 셀에서는 어려울 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가 전극이 제공되어 유동 셀에서 대부분의 시약 용액을 바이어스할 수 있다. 이 전극은 다른 시간에서 샘플 및/또는 다른 시약을 농축시키는데 사용된 전극(들)과 동일한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 전극(들)에 가해지는 전압을 사용하여 그의 반응 곡선의 최적 지점에서 검출기를 바이어스할 수 있으며, 예를 들어, 적절한 오프셋을 제공하여 수득량을 최적화할 수 있고, 아날로그 디지털 변환기의 이용가능한 동력학 범위 내에서 최대 신호를 제공하여 A/D 양자화 오류를 최소화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 바이어스 수준은 서열 반응이 진행됨에 따라 변형될 수 있고, 센서에 가장 가까운 전하의 양은 변화한다. 일부 실시양태에서, 판독은 센서를 사용하여 취할 수 있고, 그 이후 바이어스 수준은 변화되고 뒤이어 다시 센서를 판독하여, 바이어스 전압의 변경으로 인한 임의의 비선형성 또는 예기치 못한 오프셋이 관찰될 수 있고, 소프트웨어에 의해 보상된다. 일부 실시양태에서, 양전하는 비드 또는 콜로니 상에 또는 그 근처에 제공되어, 센서는 적절한 수준으로 바이어스될 수 있다.
일부 실시양태에서, 다중 기준 전극은 나노니들 센서, 나노브릿지 센서, ISFET 센서 또는 ChemFET 센서와 함께 사용될 수 있다.
전자 센서, 예컨대 ChemFET는 폭넓은 동력학 범위를 가지도록 설계될 수 있으며, 그 자체로 약간의 pH 센서를 갖는 경우이다. 이들은 대안적으로 보다 작은 동력학 범위를 가지지만 보다 높은 감수성을 가지도록 설계될 수 있다. 한 실시양태에서, 센서의 동력학 범위 및 센서의 감수성 둘 다는 추가의 요소를 포함함으로써 활성 영역을 바이어스하는 시스템으로 최적화된다. 상기 요소는 기준 전극 또는 전극일 수 있으며, 여기서, 가변 전압은 기준 전극(들) 및 센서(들)의 활성 지역 (예를 들어, ChemFET 또는 나노브릿지) 사이에 가해질 수 있다. 전압의 조정은 센서와 상호작용하는 전하의 양의 폭넓은 변화에도 불구하고, 고도로 민감한 검출을 가능케 할 수 있다. 예를 들어, 센서는 표적 DNA가 긴 100 염기 쌍인 서열분석 반응과 함께 작동하도록 최적화될 수 있다. 대안적으로, 표적 DNA가 긴 1000 염기 쌍인 경우, 센서는 센서의 동력학 범위 내에서 더 이상 작동하지 않을 것이다. 이어서, 기준 전극(들)과 활성 지역 사이의 전압은 센서가 그의 동력학 범위 내에서 작동하게 되도록 조정될 수 있다. 서열분석 반응 기간에서, 신장된 프라이머가 500 염기 쌍으로 신장된 경우, 센서는 다시 그의 동력학 범위 내에 존재하지 않을 수 있다. 참조 전압은 다시 센서가 그의 동력학 범위 내에 도입되도록 변형될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 백 게이트는 많은 동일한 방식으로 사용될 수 있다. 추가의 개선에서, 백 게이트는 센서 어레이의 상이한 지역에 대한 백 게이트의 상이한 섹션일 수 있도록 분할될 수 있다. 각 센서용 개별적 백 게이트를 가질 수 있도록 다수의 섹션이 존재하여, 프라이머가 신장된 상이한 서열 의존성 비율을 보상할 수 있다.
일부 실시양태에서, 참조 전압(들)은 나노니들 센서, 나노브릿지 센서, ISFET 센서 또는 ChemFET 센서를 사용하는 경우 변경된다.
일부 실시양태에서, 폴리머라제 혼입의 측정을 수행하여 DNA 표적의 서열을 측정한다. 다중 측정이 전형적으로, 혼입 프로파일이 적절하게 포획되고 측정되는 것을 보장하기 위해, 예를 들어 단독중합체 실행에서 혼입되는 염기의 수를 측정하기 위해 요구될 수 있다. 그러한 측정은 혼입 반응의 부산물, 예컨대 PPi 또는 히드로늄 이온을 측정할 수 있다. 센서의 큰 어레이의 경우, 그러한 측정은 불충분한 신호 대 소음을 방지하여 서열분석 데이터와 함께 목적하는 오류 비율을 제공하면서 센서의 감수성을 처리할 수 있는 매우 높은 데이터 수집 비율을 필요로 할 수 있다. 위상 오차와 함께 오류의 균형을 유지하고, 판독 길이, 및 어느 염기 및 얼마나 많은 염기가 혼입되는지를 정확하게 측정함과 함께 오류의 균형을 유지하는 것은 어려울 수 있다. 이는 위상 오차 없이 폴리머라제가 정확하게 기능하기 위해 센서 정확도에 대한 낮은 이온 농도 및 보다 높은 농도가 필요한 결과일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 2개 이상의 상이한 시약 조건을 서열분석 동안에 사용하며, 시약 조건 중 적어도 1 세트는 폴리머라제 정확도 및 탈위상화의 최소화에 대해 최적화되고, 제2 시약은 검출을 위해, 예를 들어 매우 낮은 이온 강도를 가짐으로써 최적화된다. 혼입 사례로부터 별도로 센서의 판독은 서열분석 데이터 정확도 및 판독 길이를 개선시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 센서가 폴리머라제 혼입 사례를 포획하기 위해 더이상 높은 데이터 비율로 판독되도록 강요되지 않는 경우, 보다 적은 데이터가 요구되지만, 대신 잠재적으로 겨우 단일 시간뿐인 적은 횟수의 시간을 판독할 수 있다. 전자는 또한 센서 소음이 유의하게 감소될 수 있도록 충분히 긴 시간 상수를 가질 수 있다. 추가로, 일부 실시양태에서, 감소된 데이터 요건은 데이터 프로세싱 하드웨어, 데이터 전송 요건 및 데이터 저장 요건을 단순화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 판독 완충제는 폴리머라제 효소에 대해 사용하기에 적합한 것보다 낮은 이온 농도일 수 있다. 일부 실시양태에서, 판독 완충제의 이온 농도는 혼입 완충제의 이온 농도의 3 분의 1일 수 있거나, 또는 다른 실시양태에서, 판독 완충제의 이온 농도는 혼입 완충제의 이온 농도의 3 분의 1 내지 10 분의 1, 혼입 완충제의 농도의 10 분의 1 내지 30 분의 1, 혼입 완충제의 이온 농도의 30 분의 1 내지 100 분의 1, 또는 혼입 완충제의 이온 농도의 100 분의 1 내지 1000 분의 1일 수 있다.
일부 실시양태에서, 혼입 완충제 및 판독 완충제의 pH는 실질적으로 동일한 pH일 수 있다. 다른 실시양태에서, 혼입 완충제 및 판독 완충제의 pH는 주목할 만큼 상이할 수 있으며, 예를 들어 혼입 완충제의 pH는 폴리머라제 효소의 최적 활성 및/또는 정확도에 대해 최적화된, 예컨대 pH 8.5인 반면, 판독 완충제는 판독 완충제의 전도성을 최소화하는 pH, 예컨대 pH 7.0 (예를 들어, OH- 및 H+의 농도는 10-7 몰로 동일함)이다. 일부 실시양태에서, OH-의 유동성은 H+의 것보다 낮기 때문에, 최소량의 판독 완충제 전도성을 위한 최적 pH는 pH 7.0보다 약간 높다. 따라서, 일부 실시양태에서, 판독 완충제의 pH는 pH 6.5 내지 pH 8.0, pH 6.8 내지 pH 7.5, 또는 pH 7.0 내지 pH 7.2인 반면, 혼입 완충제의 pH는 pH 7.5 내지 pH 9.0, pH 8.0 내지 pH 8.8, 또는 pH 8.3 내지 pH 8.5이다.
일부 실시양태에서, 상이한 시약 완충제는 나노니들 센서, 나노브릿지 센서, ISFET 센서 또는 ChemFET 센서와 함께 사용된다.
일부 실시양태에서, 각 센서의 판독 노이즈를 줄이기 위해 각각의 센서에 주어진 시간의 양을 최대화하도록 인티그레이터(integrator)가 센서에 혼입된다. 인티그레이터는 어레이에 각각의 센서와 연관된 커패시터를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 센서는 정전용량 센서로 구성되고, 여기서 전류 유동은 없지만, 화학 주기 동안 전하의 축적은 있다. 일부 실시양태에서, 인티그레이팅 장치 또는 용량 장치, 센서는 각각의 픽셀에 대해 국부 증폭 전자장치를 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 전하는 CCD와 유사한 방식으로 리드아웃 포트(readout port)로 이동된다.
일부 실시양태에서, 인티그레이터는 센서의 한 부분으로 사용되고, 여기서 센서는 나노니들 센서, 나노브릿지 센서, ISFET 센서, 또는 ChemFET 센서를 포함한다.
각각의 장치와 연관된 리드아웃 포트가 1개 이상 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치의 각각의 코너는 리드아웃 포트를 가질 수 있고; 다른 실시양태에서, 장치의 반대 면을 따라 다수의 포트가 존재할 수 있어, 리드아웃 속도를 감소시킬 수 있고, 개선된 신호가 노이즈와 연관된다. 다른 실시양태에서, 리드아웃 전기 회로망은 어레이를 행 또는 열로 나눌 수 있다. 다른 실시양태에서, 리드아웃 전기 회로망은 채널 지지체 또는 채널 분리 피쳐(features) 아래에 놓일 수 있다. 추가 실시양태에서, 리드아웃 전기 회로망의 다중 세트가 존재할 수 있고, 여기서 센서의 어레이는 다중 서브어레이로 나눠지고, 리드아웃 전기 회로망의 다중 세트는, 리드아웃 전기 회로망이 채널 지지체 또는 채널 분리 피쳐와 일치하도록 위치된다. 일부 실시양태에서, 최소량의 시약 부피를 갖는 유동 셀을 사용하는 것이 바람직할 수 있고; 이와 같이 유동 셀의 높이를 가능한 한 짧게 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 유동 셀은 높이가 300 마이크로미터 이하, 100 마이크로미터 이하, 또는 50 마이크로미터 이하인 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1 ㎠ 또는 이 이상, 잠재적으로 10 ㎠일 수 있는 반도체 장치를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 센서 칩의 폭의 상당한 양을 커버하기에 충분히 넓은 유동 셀은, 다른 표면에 대하여 유동 셀의 1개 또는 2개의 주요 표면의 편평도로 인해, 특히 한 표면이 성형된 플라스틱 부분 또는 PDMS 또는 유사한 중합체 부분인 경우, 기계적 공차(tolerances)에 큰 어려움을 가질 수 있다. 그 결과, 편평도 공차가 목적하는 공차를 넘어서 팽창되거나 붕괴되는 것을 막기 위해, 지지체 포스트, 채널 또는 다른 지지체 형상을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, 시스템은 Fin FET와 유사한 방식으로 배열된 브릿지 센서와 같은 센서를 사용할 수 있고, 여기서 채널의 2개 또는 3개 면은 접근가능하여, 예를 들어 채널의 표면에 결합된 DNA와 같은 주변과 상호작용할 수 있다. 센서 채널은 상기 채널의 수평 단면보다 큰 기판에 직각인 수직 차원을 가질 수 있다. 이러한 장치는 샘플에 접근가능한 표면이 하나인 장치보다 더 큰 민감도를 가질 수 있다.
다른 실시양태에서, 평면 또는 광택 평면 전극과 이용가능할 수 있는 보다 더 큰 표면적을 제공하는 물질을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 흑색 백금, 백금 금속 스폰지, 또는 백금도금된 금속 (백금도금된 백금일 수도 있음), 백금도금된 티타늄, 백금도금된 이리듐, 백금도금된 니오븀, 백금도금된 탄탈럼, 백금도금된 지르코늄, 또는 다른 백금도금된 금속을 전극 물질로 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 전극은 기준 전극일 수도 있거나, 또는 나노니들의 일부로서 전극일 수도 있다. 다른 실시양태에서, 상기 전극 표면은 백금 금속 족의 다른 구성원: 팔라듐, 로듐, 루테늄, 이리듐 또는 오스뮴으로 제조되고, 이는 백금과 유사한 방식으로 사용되어 평면 또는 광택 전극 보통(would) 형태보다 훨씬 더 넓은 표면적을 갖는 전극 표면을 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 백금도금의 과정에는 지지체 물질을, 잠재적으로 왕수(aqua regia), HCl, 및 HNO3를 이용하는 세정, 이어서 클로로백금산 및 아세트산납을 이용할 수 있는 도금 과정이 포함될 수 있다.
다른 실시양태에서, 전극 표면은 이리듐 옥시드, 티타늄 니트레이트, 또는 폴리피롤/폴리(스티렌술포네이트) 전도성 중합체를 포함할 수 있다. 상기 이리듐 옥시드의 제조는 표준 포토리소그래피 공정을 사용하여 스퍼터링함으로써 수행될 수 있다. 문헌 [Malleo et al (Review of Scientific Instruments 81, 016104)]에는, 빛나는(bright) 백금 전극에 대한 다른 물질의 유효 계면 정전용량에서의 증가가, 흑색 백금에 대해 240배 더 높고, 이리듐 옥시드에 대해 75배 더 높고, 폴리피롤/폴리(스티렌술포네이트) 전도성 중합체에 대해 790배 더 높은 범위로 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 더 큰 표면적을 갖는 센서는 나노니들 센서, 나노브릿지 센서, ISFET 센서, 또는 ChemFET 센서와 함께 사용된다.
일부 실시양태에서, 나노니들, 나노브릿지, ChemFET 또는 ISFET는 센서가 규소, 용융 실리카, 유리 또는 다른 유사한 물질과 같은 기판의 표면 상에 생성되도록 제조된다. 다른 실시양태에서, 센서는 기판보다 위에 수직으로 또는 수평으로 투영하도록 제조되어, 센서는 유체 및 시약에 좀 더 접근 가능하게 된다. 유체 및 시약에 대한 보다 큰 접근가능성은, 일어날 서열분석 반응에 필요한 시간을 줄일 수 있고, 보다 낮은 농도의 시약이 사용될 수 있게 하고, 센서의 활성 영역과 연관된 표면적을 증가시킴으로써 센서의 민감도를 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 전극(들)은 문헌 [Zhao et. al. (p59-73 SPIE Vol 5219 Nanotubes and Nanowires)]에 기재된 입사각의 여각(glancing angle) 증착을 이용할 수 있는 치우친 회전된 증착 접근(angled rotated deposition approach)을 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 본원에 전문이 참조로 포함된 US 6,046,097에 기재된 PVD 방법론을 사용하여 제조될 수 있다.
도 26은 나노니들 서열분석 반응의 1 실행으로부터의 데이터를 나타내고, 여기서 실행 데이터는 크기조정되고, 염기 혼입의 선형 플롯에 대하여 나타내어 진다. 혼입되면 안되는 dNTP는 대부분 이전 데이터와 겹쳐 보이고, 다중 혼입 염기 데이터는 상당히 우수한 선형성을 갖는 것으로 나타난다 (R2 = 0.9974).
대안적 실시양태에서, 시스템 또는 방법은 효소적 반응과 같은 단일 분자 반응의 동역학을 검출한다. 일부 실시양태에서, 반응은 혼성화 반응일 수 있고, 여기서 혼성화 프로브가 부착된 비드 또는 입자는 센서보다 위의 위치에 유지되도록 할 수 있고, 혼성화 반응으로부터 생성된 센서 또는 센서들에 근접한 전하의 변화가 측정될 수 있다. 대안적 실시양태에서, 혼성화 프로브는 센서 상에 또는 이에 근접하여 부착될 수 있고, 여기서 혼성화 반응의 진행으로부터 생성된 전하의 변화가 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전기장은 DNA를 시약 용액으로부터 부피로 농축하는 데에 사용될 수 있고, 여기서 혼성화 프로브가 부착되고, 이는 비드 또는 입자 상에 존재할 수 있거나, 상기 센서 상에 또는 이에 근접하여 존재할 수 있다. 상기 전기장은 DC 장(field), AC 장, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 실시간 PCR 반응은, dNTP의 앰플리콘으로의 혼입, 및/또는 높은 이동도의 피로포스페이트 및 히드로늄 이온의 방출로부터 생성되는 전도성의 변화 또는 전하 존재의 변화를 모니터링하는 센서 또는 센서들을 사용하여 모니터링된다. 대안적 실시양태에서, 표적 DNA를 증폭시키는 등온 반응은 dNTP의 앰플리콘으로의 혼입으로부터 전도성의 생성된 변화에 의해 검출된다. 다른 실시양태에서, 센서는 면역-PCR 반응의 진행을 모니터링하고, 여기서 샌드위치 검정은 항원을 포획하고, 검출기 항체는 여기에 부착된 프로브 DNA 올리고를 가지며, 여기서 실시간 PCR 검정은, 사전에 기재된 바와 같이 전도성 또는 전하의 변화를 검출함으로써 항원의 존재 및 양을 검출하고 정량화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 등온 반응은 관심 항원을 감지하고 정량화한다.
일부 실시양태에서, 단백질 검출은 반응의 직접적인 측정에 의해, 샌드위치 검정에 의해, 또는 압타머를 사용한 측정에 의해, 또는 반대 이온의 변화 또는 전하의 변화가 센서에 결합되거나, 부착되거나, 연관될 수 있는 표적과 연관된 다른 적절한 방법에 의해 효과적일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 센서 또는 센서들에 결합되거나 이에 근접한 핵산 압타머를 사용하여 표적의 존재 및 양을 검출한다. 압타머는 표적에 결합할 수 있으며, 이는 사전에 기재된 바와 같이 상기 센서에 의해 검출될 수 있는 전하를 변화시킨다. 대안적 실시양태에서, 압타머는 상기 센서 또는 센서들에 부착되거나 이에 근접하고, 이에 대한 표적의 결합의 결과로서 전도성의 증가가 검출된다.
추가의 실시양태에서, 평활 말단 라이게이션은 리간드의 3' 및 5' 말단 상에서의 상이한 결합 시약을 갖는 리간드를 사용하여 수행될 수 있다. 나노니들의 전극은 결합을 위한 상보적 시약과 접합될 수 있으며, 예를 들어 리간드의 3' 말단은 티올기를 가질 수 있고, 1 전극은 금으로 제조될 수 있고, 리간드의 5' 말단은 PNA 서열을 가질 수 있고, 제2 전극은 상기 PNA 서열에 보체를 가질 수 있다. DNA의 가닥은 이어서 나노니들의 지역으로 전기영동적으로 및/또는 유전영동적으로 농축될 수 있고, 여기서 상기 DNA 가닥은 이어서 1 전극과 연관된 1 말단, 및 나노니들의 제2 전극과 연관된 다른 말단과 결합될 수 있다. 폴리머라제 및 프라이머는 DNA 가닥에 결합될 수 있거나 이후에 도입될 수 있다. 혼입 시 측정은 이어서 DNA와 연관된 반대 이온의 매우 더 큰 전도성과 합해진 DNA의 임피던스의 직접적 측정으로부터 행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노브릿지 또는 나노니들일 수 있는 센서 장치는 디지털 출력 데이터를 발생시킨다. 상기 디지털 출력은 USB2, USB3, 파이어와이어(Firewire), Gige, 단일 링크 또는 이중 링크 DVI, HDMI, S/PIF, ADAT 광파이프, AES3, MADI-X, I2S, AC'97, MC'97, McASP, S-비디오, ATM, SONET, SDH, UTP, STP, AUI, HDLC, 802.1, ARP, VLAN, HDLC, ATM, 프레임 릴레이(Frame Relay), 큐인큐(Q in Q), PPP, BSC, DDCMP, 반얀(Banyan), CDMA2000, DECnet, CDPD, FUNI, CDMA, X.25, GPRS, GR-303, H.323, NFS, ISDNSS7, TCIP, UMTS, WAP,XNS, MDLP, 인피니밴드(Infiniband) 및 기타 다수를 비롯한 임의의 많은 출력 물리적/데이터 링크/프로토콜 포맷을 포함할 수 있다.
상기 출력은 MPEG 1, MPEG 2, MPEG4, DVA, AVI, MOV, MPG, 비디오 CD, RM, WMA, WMV, WAV, FLC, FLI, BMP, PCX, TGA, TIF, JPG, PCT, GIF, 플래쉬(Flash), 퀵타임(QuickTime), MP3, 또는 이들의 서열과 같은 압축된 포맷일 수 있다.
상기 센서 장치는 1개 초과의 디지털 I/O 연결을 가지도록 구성될 수 있고, 1개 초과의 출력 포맷을 가질 수 있으며; 예를 들어 하나의 디지털 연결은 상기 센서의 작업을 조절하는데 사용될 수 있는 한편, 하나 이상의 디지털 연결은 센서로부터 기기의 일부일 수 있는 추가의 장치 (이 센서가 일부임)로 데이터를 전송한다. 상기 추가의 장치는 데이터 저장, 장치일 수 있거나 컴퓨터 장치일 수 있다. 상기 추가의 장치는 GPU, 또는 GPU 어레이와 같은 GPU의 세트일 수 있다.
상기 데이터를 직접 상기 센서에서 경질 디스크로, 직접 상기 센서에서 고체 상태 드라이브로, 또는 직접 상기 센서에서 GPU로, 또는 직접 상기 센서에서 GPU 클러스터, GPU 블레이드 또는 GPU 서버, CPU, 또는 GPU 또는 CPU와 관련된 메모리로 이동시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 기기 또는 시스템은 1개 초과의 센서 가질 수 있다. 그러한 기기 또는 시스템에서, 데이터는 1개 초과의 센서으로부터 모이고, 그 후에 직접 경질 디스크, 고체 상태 드라이브, GPU, GPU 블레이드, GPU 서버, GPU 클러스터, CPU, 또는 GPU 또는 CPU와 관련된 메모리로 직접 보내질 수 있다.
일부 실시양태에서, 단일 센서는 1개 이상의 디지털 출력을 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 디지털 출력은 고체 상태 드라이브 또는 GPU 또는 CPU와 관련된 메모리와 같은 시스템의 또 다른 부분에 직접 연결되도록 환경 설정될 수 있으며, 시스템의 2개 이상의 부분은 MCM (Multi Chip Module) 또는 SIP (System in package)의 부분일 수 있다. 상기 MCM은 적층된 MCM, 퇴적된 MCM, 세라믹 기판 MCM 또는 칩 스택 (chip stack) MCM일 수 있다. 상기 센서는 MCM의 일부이거나, 상기 MCM에서 분리될 수 있다. 상기 센서는 상기 센서를 제거하고 제2 센서를 이용할 수 있도록 구성될 수 있다. 상기 센서를 소켓을 이용하여 서로 연결될 수 있고; 상기 소켓은 PGA (Pin Grid Array)용 ZIP (Zero Insertion Force) 소켓, LGA (Lan Grid Array) 소켓 또는 슬롯켓(slotket)일 수 있다.
상기 데이터는 CAM (Content Addressable Memory) 또는 CAM 메모리의 데이터와 비교될 수 있고, 이는 3겹의 CAM과 같은 DNA 맵핑 중 선택가능한 오류를 허용한다. 상기 CAM 메모리는 TLB (Translation Lookaside Buffers)의 그것과 유사한 방식의 다중 수준을 가질 수 있고, 상기 CAM 또는 TLB의 하나의 수준은 상기 CAM 또는 TLB의 또 다른 수준보다 빠르고 작을 수 있다.
나노니들 또는 나노브릿지의 감수성을 향상시키기 위해서, 국부 증폭기가 제공될 수 있다. 증폭기는 BJT 또는 FET일 수 있다. 상기 센서는 좁은 구조로 제조되고, 두 측면이 구조 하에서 에칭되어 pH, 전도성 또는 국부 전하의 변화에 접근가능하게 될 수 있다. 상기 장치의 표면은 거칠어, 샘플 분자의 결합에 큰 표면적을 허용할 수 있다. 이온의 전기적 가둠은 이후 추가로 기재되는 결과를 가져올 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 이미지 센서 어레이는 CMOS 활성 픽셀 이미지 어레이에 유사한 증폭기 디자인을 사용할 수 있고; 이들은 요구되는 노이즈에 대한 신호에 따라 3개의 트랜지스터, 4개의 트랜지스터, 5개의 트랜지스터 또는 6개의 트랜지스터 회로를 포함할 수 있으며, 글로벌한 셔터 당량은 집적한 회로를 사용하는 것이 목적된다. 상기 증폭기 구조를 상기 이미지 센서 어레이와 1 대 1로 대응되도록 배열하고, 다중 센서용의 통상의 증폭기를 사용하는 것이 달리 가능할 수 있는 것보다 노이즈에 대해 유의하게 더 양호한 신호를 잠재적으로 제공할 수 있다.
집적된 시스템
본 발명은 또한 목적하는 반응 또는 결합이 일어나는 부피로 샘플 및 시약을 국한시키기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 본 발명의 이러한 측면은 전체 게놈 증폭의 요구를 제거하거나 감소시키고, 이어서 요구되는 범위를 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, DNA 서열분석기는 큰 시스템의 부분일 수 있으며, 작업의 흐름의 많은 부분이 자동화된다. 자동화될 수 있는 작업의 흐름 중 이들 부분은 세포 용해, DNA 정제, DNA 증폭, DNA 라이브러리 제조, 콜로니 생성, 서열분석, 1차 분석 및 염기 명명, 대조에 대한 서열의 맵핑, 및 유전 질환 또는 다른 유전적 특성이 존재하는지의 측정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템은 혈액으로부터 암 세포와 같은 세포를 선택하여 유동 세포측정기 또는 바람직하거나 바람직하지 않은 세포의 친화력 회수를 이용하는 방법을 포함하는 많은 기능을 가질 수 있다.
많은 프로젝트가 칩의 전용량을 요구하지 않기 때문에, 단일 칩에서 다중 샘플을 진행시키는 것이 바람직할 수 있다. 다른 프로젝트는 칩의 용량을 넘어서는 단일 샘플을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 샘플은 개별적 튜브, 튜브 스트립, 96-웰 플레이트, 384-웰 플레이트 등에서 기기로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰은 밀봉되어 기기 상에서 수명을 연장시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 판은 냉각되어 샘플 수명을 증가시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 샘플은 로봇 피펫터에 의해 소프트웨어 선택가능 방식에서 접근될 수 있다.
증폭시키기 전에, 비드는 모노클로날 비드를 생성하기 위해 단일 DNA 단편에 의해 충전될 필요가 있다. 전형적으로, DNA 농축이 측정되고, 이어서 희석된 형태로 비드로 도입되어, 평균적으로 1개 미만의 단편이 각각의 비드에 결합된다. 다수의 비드는 0개의 DNA 단편을 가지며, 보다 적은 수는 단일 단편을 가지고, 소수는 2개 이상의 단편을 가진다. 정량화에 요구되는 상기 단계는 개별 기기 및 개별 프로세싱을 종종 요구한다.
한 실시양태에서, 표적 농축은 혼성화 기반 회수(pullout)에 의해 생성된다. 회수 비드와 같은 고체 지지체는 제어된 결합 부위의 수에 의해 관능화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들은 DNA 프라이머 상보물이다. 비증폭된 샘플은 각각의 말단에 결합된 공지된 프라이머를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 회수 비드 상에서 DNA에 대해 혼성화될 수 있다. 혼성화 부위가 완전히 점유된 후 잔류 DNA는 세척될 수 있고, 비드에 결합된 DNA는 후속적으로 변성되어 공지된 DNA 정량을 방출할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 각각의 DNA 단편에 결합된 프라이머는 프라이머 상보물에 결합되고, 삽입 염료의 형광 검출을 이용하여 검출된다. 프라이머 공지된 길이이기 때문에, 신호 수준은 단편의 수에 비례한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리머라제 및 연결된 dNTP가 도입되어 전장 이중 가닥 DNA를 생성시킬 수 있다. 프라이머 신호로부터의 정보와 합한 경우, 전장 삽입 염료 신호 수준은 이어서 평균 단편 길이의 측정을 허용한다.
또 다른 실시양태에서, 유전 영동은 농축물 DNA에 이용된다. 농축 중 또는 후, DNA 농축을 측정하기 위해 전기 전류가 측정된다. 또 다른 실시양태에서, 농축된 DNA는 상기 기재된 삽입 염료의 이용에 의해 정량화된다. 또 다른 실시양태에서, DNA의 농축은 직접 광학적 흡광도에 의해 측정된다. 광학적 흡광도 측정은 예를 들면 260 nm에서의 광을 생성하는 광학적 공급원을 사용할 수 있다.
한 실시양태에서, 샘플은 매우 묽고/묽거나 소량의 샘플 시약으로 제조되고 비드에 충전된다. DNA는 일분의 비드에 결합되고, 이어서 가상 반응기에서 증폭되어 DNA를 갖는 비드를 생성한다. 서열분석 프라이머는 샘플 DNA에 결합된 상보물보다 짧게 제조될 수 있다. 상기 서열이 공지되어 있기 때문에, 정확한 dNTP가 첨가되고 검출된다. 한 실시양태에서, 다중 dNPT는 동시에 첨가된다. 예를 들면, 모든 dNTP가 첨가되면, 폴리머라제는 단편의 말단에 대해 연장되어 큰 신호를 생성한다. 상기 큰 신호는 증폭 과정의 일부로서 생성될 수 있다. 이는 검출을 허용하고 비드의 수를 계수하여 비드가 최소량의 증폭을 갖더라도 DNA를 가질 수 있다. 다수의 비드가 신호를 갖는 방법을 아는 것은 적절한 희것을 허용하여 모노클로날 비드의 이상적인 수를 생성할 수 있다.
유사하게는, 전기 전류, 광학적 신호 또는 샘플에서 DNA의 농축을 가리키는 다른 신호를 이용하여 얻은 측정은 필요하다면 시스템에서 DNA를 최적화하여 사용하는 데 요구되는 희석 수준을 결정하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 희석은 콜로니를 적절하게 생성하는 데 요구된다. 유사하게는 희석은 나노포어 시스템을 위해 요구되어 세공 클로깅 (clogging)을 방지하고, 반대로 듀티 사이클을 최적화여 세공이 DNA 가닥으로 점유될 수 있다. 희석은 에멀젼 PCR 시스템, 브리지 PCR 시스템, 나노포어 서열분석 시스템 또는 단일 분자 광학 시스템의 일부로서 효과적이게 될 수 있다.
다른 실시양태에서, 농축은 시스템의 일부로서 실시될 수 있고, 유전 영동, 혼성화, 에탄올 침전 또는 다른 방법에 의해 효과적이게 되고, DNA의 농축을 증가시켜 에멀젼 PCR 시스템, 브리지 PCR 시스템, 나노포어 서열분석 시스템 또는 단일 분자 광학 시스템을 향상시킬 수 있다.
1차 시스템은 소프트웨어 또는 하드웨어를 이용하여 주형 DNA의 농축을 결정하여 상기와 같이 측정하고, 이어서 증폭 또는 서열분석일 수 있는 상기 시스템의 적절한 다음 단계에서 상기 주형 DNA를 이용하기 전에 요구되는 바와 같이 농축되거나 희석된다. 상기 측정 단계는 보정 단계 전에 이용될 수 있고, 공지된 농축의 DNA를 포함하는 표준을 이용할 수 있거나, 초기에 공지된 농축의 DNA를 이용하며, 농축은 개별적 시스템에 의해 결정된다. 결정된 농축은 상기 1차 시스템에 들어가거가, 이송되거나, 또는 다르게는 전달될 수 있다. 상기 1차 시스템은 1차 시스템에서 보정을 위해 요구되는 임의의 값을 가까이에 저장하거나, 더 큰 시스템의 일부, 개별 컴퓨터 또는 데이터 베이스에 이것을 저장할 수 있다. 상기 보정 정보는 보정 시간, 운전자, 보정에 사용된 샘플 또는 표준, 또는 측정되어 관련 있는 다른 정보과 같은 추가 정보를 포함할 수 있다.
다수의 현재 시스템은 전체 게놈 증폭을 사용하여 그의 프로토콜을 위한 충분한 DNA를 가진다. 전형적인 증폭 방법은 퇴화한 프라이머 및 PCR, 랜덤 육량체 및 등온 증폭 또는 게놈 DNA의 증폭을 위한 다른 방법을 이용할 수 있다. 상기 증폭은 천겹 이상으로 게놈 DNA를 증폭시킬 수 있다. 이 증폭은 바이어스를 도입하고 시간과 자원에 있어 추가의 비용일 수 있다. 샘플을 증폭시기 위한 요구를 감소시키거나 제거하는 능력이 바람직하다. 한 실시양태에서, 충전된 비드는 패킹된 층에 동봉되고 샘플은 이를 통해서 펌핑된다. 샘플은 비드층에 대해서 다중 시간 펌핑되어 샘플을 결합하기 위한 추가 기회를 제공할 수 있다. 부피에 대한 높은 표면적은 최소량의 샘플을 사용하게 한다. 비드는 후속적으로 유동 셀로 이동되며, 이들은 자기 어레이에 의해 제자리에 유지되고, 국부 콜로니는 PCR 또는 등온 증폭에 의해 비드 상에 생성될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 샘플은 무-에멀젼 나노-반응기의 존재하는 전극을 이용하여 증폭 영역에서 농축된다. 한 실시양태에서, 전극은 단일 면 상에 형성될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 전극은 가상 반응기의 면에 대하여 평행한 제2 면을 첨가할 수 있다. 다른 실시양태에서, AC 및 DC 전압 출력의 혼합이 예측된다.
다른 실시양태에서, 전체 게놈 증폭, 또는 엑솜(exome), 게놈의 보존 영역, 암 패널, 또는 관심 있는 다른 표적을 표적으로 하는 증폭과 같은 표적화 증폭은 집적된 시스템 내의 서브시스템의 일부로서 시행될 수 있다. 상기 표적화 증폭은 또한 증폭 과정의 일부로서 상이한 샘플에 대한 바코드를 도입할 수 있다. 증폭된 DNA는 이어서 클론 서열분석 서브시스템 및 방법을 이용하여, 집적된 시스템의 일부일 수 있는 후속 서열분석을 위한 클로날 증폭을 거치기 전, 본원에 설명된 바와 같이 측정된 그의 농축을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, DNA는 상기 집적된 시스템의 일부일 수 있는 단일 분자 서열분석 서브시스템 및 방법을 이용하여 직접 서열분석된다.
다수의 프로젝트가 서열분석 칩 또는 유동 셀의 완전한 사용을 요구하지는 않지만, 단일 칩 또는 유동 셀의 상이한 부분 또는 영역으로 다중 샘플을 충전하는 것이 바람직할 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 칩 또는 유동 셀 어셈블리로 집죽된 밸브를 이용하여 칩 또는 유동 셀 상에 벽에 의해 분리된 개별 구역으로 유도된다. 그러한 밸브는 유동역학 통로로의 집적된 PDMS 밸브일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 개별 입력 및 출력에 의한 개별 구역일 수 있다. 또 다른 실시양태에서 샘플은 국부 전계를 이용하여 칩 또는 유동 셀 상의 개별 구역으로 유도될 수 있다. 양 전계 (positive field)가 인가되어 바람직한 영역으로 DNA를 끌어당길 수 있고, 음 전계 (negative field)가 인가되어 바람직하지 않은 영역으로부터 DNA를 밀어낼 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 전자석을 이용하여 개별 구역으로 유도되어 자성 또는 상자성 비드의 위치잡이를 제어할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 자기 밀봉 포트를 이용하여 개별 레인으로 될 수 있다. 자기 밀봉 포트로는 고무 격막 및 침상물 등을 들 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 샘플은 상이한 시점에서 주입되고, 신규 비드 및 비드 위치는 상기 센서에 대해 사전에 측정된 것에 관련된 센서 신호를 이용하여 결정되고, 비드 위치는 사전에 비어 있을 수 있다.
추가 실시양태에서, 전기 습윤 또는 광 전기 습윤이 샘플을 전달하는 데 이용되어 칩 또는 유동 셀의 영역을 구별하고 분리한다.
일부 실시양태에서, 시약용 용기는 필요하다면 냉각될 수 있다. 예를 들면 샘플, 폴리머라제, 포스파타제 또는 다른 효소들을 포함하는 시약은 예를 들어 약 4 ℃로 냉각이 필요할 수 있다.
일부 실시양태에서, 시약 용기로부터 밸브 다기관으로 유도하는 라인에 함유된 시약의 양은 서열분석 반응을 수행하는 데 필요한 것에 유의하게 관련된 부피를 함유할 수 있다. 이 시약의 폐기를 요하는 것을 방지하기 위해서, 예를 들면 신규 서열분석 실행의 초기에, 이들이 밸브 다기관에 들어가기까지 또는 그 근방에서 시약 용기와 접하는 라인을 냉각시키는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 밸브 다기관은, 시약이 유동 셀로 들어가고, 서열분석 또는 또 다른 반응이 일어나 유동 셀 및 밸브 다기관이 상이한 온도, 예를 들면 각각 약 4 ℃ 및 20 내지 40 ℃에서 작동되는 것이 허용되는 곳으로부터 충분히 분리되고, 이는 또한 밸브 다기관을 냉각하는 데 또한 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열분석의 한 가지 이상의 방법일 수 있는 시스템을 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 서열분석의 제1 방법, 과정 또는 서브시스템은 제1 유형의 정보를 제공하고, 서열분석의 제2 방법, 과정 또는 서브시스템은 제2 유형의 정보를 제공할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 정보의 유형이 DNA 샘플의 구조를 설명할 수 있어, 반복 서열, 예를 들어 단순 서열 반복, 짧은 탠덤 반복, 미소부수체 (microsatellite), 미소부수체 (minisatellite), 다양한 수의 탠덤 반복, 라인 반복과 같은 배치된 반복, Alu 반복과 같은 SINE 반복, 직접 반복 또는 도치된 반복, 또는 DNA의 게놈 또는 다른 바람직한 서열 또는 서열의 적절하고 완전한 어셈블리를 방지할 수 있는 다른 유형의 반복 서열의 길이를 포괄할 수 있는 서열 판독을 가능하게 하는 제1 방법을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들면 높은 정밀도의 서열을 결정하는 데 반드시 요구되지 않을 수 있는 DNA의 구조를 설명할 수 있는 서열분석의 방법, 과정 또는 서브시스템을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들면 한쌍의 서열분석 또는 섬광 서열분석에 의해, 일부 시스템에서 행해지는 것과 같이 다수의 염기 조각이 분리될 수 있는 판독의 연관성을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 긴 서열분석 길이의 판독이 불필요한 것이 아니라면, 예를 들어 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하는 데 매우 높은 정확성을 갖는 서열분석 판독을 제공하는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 또한 서열분석의 방법, 과정 또는 서브시스템을 이용하여, 예들 들어 전체 전사체 분석의 경우 요구될 수 있는 바와 같은, 낮은 정밀도의 다수의 짧은 판독을 제공하는 능력을 제공하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단일 샘플의 경우, 예를 들어 단일 샘플로부터의 단일 뉴클레오티드 다형성 및 구조적 재배열의 검출을 가능하게 하는 상이한 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 단일 시스템 내에서 정제된 핵산을 2개 이상의 분취액으로 분리하고, 이어서 증폭을 포함할 수 있는 상이한 상응하는 라이브러리 정제 방법, 서브시스템 또는 과정을 가지고, 상이한 바람직한 서열분석 방법, 서브시스템 또는 과정에 적절한 상이한 증폭 방법, 서브시스템 및 방법을 이용하는 것이 바람직하다. 상이한 분취액의 크기, 농축 또는 부피는 유사하거나, 동일 또는 상이할 수 있고, 상이한 바람직한 서열분석 결과를 가져오는 데 사용될 수 있는 상이한 서열분석 및/또는 라이브러리 제조 방법, 서브시스템 또는 과정에 적합하게 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상이한 분취액에 대하여 상이할 수 있지만, 이용되는 상기 서브시스템은 동일할 수 있고/있거나 상이한 방법에 이용되는 상기 서브시스템은 동일한 서브시스템이며, 제1 방법이 사용되고 이어서 제2 방법 이상의 후속 방법은 동일한 서브시스템을 이용하여 행할 수 있다. 예를 들어, 상이한 서열분석 방법의 경우 상이한 단편 길이를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어 긴 단편은 서열 구조를 결정하는 데 바람직한 반면, 잘은 단편은 단일 뉴클레오티드 다형성의 결정에 바람직할 수 있다. 따라서, 샘플의 상이한 분취액을 상이한 평균 단편 길이로 단편화하여, 한 분취액의 평균 단편 길이는 길게, 또 다른 분취액보다 잠재적으로 유의하게 길게 하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단편화의 방법은 동일한 것일 수 있고, 예를 들어 소니케이터를 사용할 수 있지만, 상기 분취액으로 소니케이터의 에너지가 인가되는 시간 및/또는 상기 분취액으로 인가되는 소니케이터의 전력 수준이 상이하여, 2개 이상의 분취액에서 샘플의 단편화 수준은 상이하고, 잠재적으로 실질적으로 상이하며, 생성된 단편 길이가 상이하고, 잠재적으로 실질적으로 상이할 수 있다. 다른 실시양태에서, 긴 단편 및 짧은 단편을 생성하기 위한 단일 시스템을 이용하는 것이 바람직하고; 추가의 실시양태에서, 긴 단편에 적절한 크기로 DNA를 단편화하여 분취액을 제거하고, 상기 짧은 단편에 적절한 크기의 나머지 DNA를 추가로 단편화하는 것이 바람직할 수 있다.
다른 실시양태에서, 핵산 샘플의 제1 분취액은 단일 뉴클레오티드 다형성이 결정될 수 있는 게놈 DNA이고, 제2 분취액은 전사체가 바람직할 수 있는 RNA일 수 있다. 단일 뉴클레오티드 다형성의 경우 증폭에 필요한 정확도가 RNA에서 cDNA로의 전환 및 상기 cDNA의 후속 증폭에 필요한 정밀도보다 훨씬 높을 수 있는 바와 같이, 증폭 방법, 서브시스템 또는 방법은 게놈 DNA 및 RNA와 상이하며, RNA에서 cDNA로의 전환은 효과적이고, 증폭 프로토콜은 상이한 분취액의 경우 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 뉴클레오티드 다형성 분석을 위한 게놈 DNA의 증폭보다 전사체 분석을 위한 cDNA의 증폭의 경우 저급 농도 및/또는 저렴한 시약을 사용하는 것일 바람직할 수 있다. 추가 실시양태에서, 단일 뉴클레오티드 다형성 분석을 위한 게놈 DNA의 증폭보다 전사체 분석을 위한 cDNA의 증폭에 대한 순환 시간을 짧게 이용하고, 전사체 분석을 동일한 서열분석 서브시스템을 이용하여 개시하여 대응하는 시간을 가속화하여, 후속적으로 상기 게놈 DNA 단일 뉴클레오티드 다형성 분석에 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 상이한 서열분석 방법, 서브시스템 또는 방법을 이용하여 후속 분석을 위한 핵산 물질의 분리의 임의의 다른 조합을 구상할 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열분석 검출 방법, 서브시스템 또는 방법의 상이한 유형이 사용된다. 실시예에 있어서, 하나의 서브시스템은 그의 전문이 참조로 본원에 각각 도입된 처치 (Church) 등의 US5,795,782, 하넥 (Haneck) 등의 US8,137,569, 코라크 (Korlach) 등의 US7,361,466, 및 클라크 (Clark) 등의 US2011/0177498에 기재되어 있는 단일 분자 서열분석을 사용할 수 있고, 낮은 정확도를 가지고 매우 긴 서열 판독을 가지고, 또 다른 서브시스템은 그의 전문이 참조로 본원에 각각 도입된 맥케넌 (McKernan) 등의 US2009/0181385, 발라수브라마니안 (Balasubramanian)의 US6,833,246, 나이렌 (Nyren) 등의 US6,210891, 브리지험 (Bridgeham) 등의 US7,282,370, 윌리암스 (Williams) 등의 US7,645,596, 로스베르크 (Rothberg) 등의 US7,948,015, 도우마주 (Toumazou) 등의 US8,114,591 및 미야하라 (Miyahara) 등의 US7,888,013에 기재되어 있는 합성법에 의해 서열분석의 광학적 또는 전기화학적 검출을 이용할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 단일 시스템은 2가지 이상의 2 상이한 검출 서브시스템을 가지고, 상기 2가지의 상이한 검출 서브시스템은 상이한 서열분석 방법, 서열분석 검출 방법 또는 서열분석 방법을 이용하고, 상기 상이한 서열분석 방법, 서열분석 검출 방법 또는 서열분석 방법은 동일한 샘플 또는 상이한 샘플에서 동일한 시간으로 수행되거나, 동일한 샘플 또는 상이한 샘플에서 상이한 시간으로 수행될 수 있다.
예시적인 집적된 시스템은 수반되는 도면에 도시된다.
도 1a는 외부 컴퓨팅 장치 (102) 및 집적된 시스템 (104)을 포함할 수 있는 완전한 서열분석 시스템 (100)을 나타낸다. 집적된 시스템은 랙 모듈 (110)을 포함하고, 유체공학 인터페이스 서브시스템 (116), 서열분석/샘플 정제용 카드 (112)의 세트, 각각의 서열분석/샘플 정제용 카드 (112) 상의 개별적 서열분석 서브시스템 (114)을 더 포함할 수 있다. 서열분석/샘플 정제 (120)의 도면은 라이브러리 정제 (122), 재이용 자기 어레이 (124)를 포함하고, 서열분석 데이터 (128)를 발생시키는 서열 검출기 (126)를 더 포함할 수 있다.
도 1b는 완전한 라이브러리 정제용 서브시스템 (130)을 도시하고, 샘플 세포 입력 (131), 세포의 세포 용해 및 단백질 제거 (132)의 결과 비-단편화 게놈 DNA (133)가 되고, 이는 단편화 및 분리 서브시스템 (134)로 입력하고, 이어서 단편화 게놈 DNA (136)을 출력하고, 비드 (135)의 세트와 함께 증폭을 위한 가상의 웰 어레이 (137)로 이송되며, 이어서 상기 비드는 증폭 없이 비드의 세트로부터 증폭이 있는 비드의 세트로 비드 풍부 모율 (139)에서 필드 (138)을 이용하여 분리될 수 있다.
도 1c는 게놈 DNA 단편화 및 분리 시스템 (140)을 도식적으로 도시하며, 이는 비-단편화 게놈 DNA 및 단편화 비드 (142)의 입력을 포함하고, 상기 비-단편화 게놈 DNA가 단편화될 수 있는 단편화 서브시스템 (144)로의 입력이다. 상기 단편화된 DNA는 채널 (146)에서 펌프 또는 전극 (147)으로부터 펌핑 또는 전기 영동 힘을 이용하여 크기에 따라 분리되고, 이어서 유체역학 출력 (148)을 통해 상기 분리 채널 (146)로부터의 출력으로 이동되고, 상기 단편화된 DNA (149)을 출력할 수 있다.
도 1d는 세포 용해 섹션 (152), 단백질 제거 섹션 (154) 및 증폭 섹션 (156)을 포함하는 PDMS 라이브러리 제조 모듈 (150)의 한 실시양태를 나타낸다.
상기에 다양한 실시양태를 기재하였지만, 이들은 단지 실시예로 나타낸 것으로 이해해야 하며, 이로써 제한되는 것은 아니다. 기재된 방법 및/또는 도면은 특정한 순서로 일어나는 특정 사건 및/또는 유동 패턴 및/또는 화학 반응을 나타내며, 특정 사건 및/또는 유동 패턴 및/또는 화학 반응의 순서는 변경될 수 있다. 실시양태가 특히 제시되고 기재되어, 형태 및/또는 세부사항의 다양한 변경이 행해진다고 이해된다.
다양한 실시양태가 특정한 특징 및/또는 성분의 조합을 갖는다고 기재되어 있지만, 다른 실시양태가 상기 논의된 임의의 특징 및/또는 성분의 조합을 갖는 것이 가능하다.

Claims (57)

  1. a. 센서 어레이에 인접한 복수 개의 입자를 제공하는 단계이며, 여기서 상기 복수 개의 개별 입자는 상기 센서 어레이의 개별 센서에 인접하게 위치하여 핵산 샘플로부터 생성된 핵산 분자에 커플링하고, 상기 개별 센서는 서열분석 동안에 상기 센서 어레이의 다른 센서로부터 상기 개별 센서를 단리시키는 가상 벽을 제공하는 것인 단계;
    b. 프라이머를 상기 핵산 분자에 혼성화시키는 단계;
    c. 상기 핵산 분자에 인접한 폴리머라제의 존재 하에 상기 핵산 분자를 뉴클레오티드 염기와 접촉시킴으로써 프라이머 연장 반응을 수행하는 단계;
    d. 상기 프라이머 연장 반응 동안에 하나 이상의 상기 뉴클레오티드 염기와 관련된 혼입 이벤트를 나타내는 신호를 검출하는 단계;
    e. 상기 프라이머 연장 반응 동안에 혼입된 위상 오차를 모니터링하고 수정하는 단계; 및
    f. 감소된 위상 오차에서 상기 핵산 샘플의 서열을 생성하는 단계
    를 포함하는, 핵산 샘플의 서열분석 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 신호가 상기 프라이머 연장 반응을 수반하는 국부 임피던스 변화인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 개별 센서가 상기 개별 입자와 연관된 디바이 층 내의 국부 임피던스 변화를 측정하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 개별 센서가 상기 개별 입자의 디바이 층과 회합된 2개 이상의 전극을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 가상 벽이 국부 전장 또는 국부 자장에 의해 발생되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 가상 벽이 상기 프라이머 연장 반응의 성분을 단리 또는 농축시키는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 위상 오차가 (i) 3개의 뉴클레오티드 염기의 조합을 첨가함으로써, (ii) 동일-위상 폴리뉴클레오티드 가닥에 쇄 종결 뉴클레오티드 염기를 가역적으로 혼입함으로써, 또는 (iii) 상기 핵산 분자에 혼성화하여 상기 프라이머 연장 반응을 중단시키는 올리고뉴클레오티드 클램프를 첨가함으로써 수정되는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 클램프를 변성시키거나, 불안정화시키거나, 분해시켜 상기 프라이머 연장 반응이 계속되도록 하는 단계를 더 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 클램프가 연장될 수 없는 3' 종결 뉴클레오티드 염기를 갖고, 여기서 상기 3' 종결 뉴클레오티드 염기가 임의로 제거됨으로써 후속 하류 프라이머 연장 반응을 위한 프라이머가 되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 혼입을 위한 1개 이상의 뉴클레오티드 염기를 선택함으로써 상기 위상 오차를 수정하여 1 또는 2개의 염기에 의한 지체를 재위상화하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 위상 오차를 나타내는 신호의 손실에 대해 상기 신호를 모니터링하고, 재위상화에 의해 수정하여 상기 신호를 회복하는 단계를 더 포함하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자 상에 또는 근처에 상기 폴리머라제를 비축하는 단계를 더 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 복구 단백질 또는 단일 가닥 결합 단백질을 상기 핵산 분자에 결합시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 폴리머라제에 의해 뉴클레오티드 염기의 혼입 서열을 결정함으로써, 상기 핵산 분자의 서열을 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자가 원형화된 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 폴리머라제가 가닥 치환 폴리머라제인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 염기가 전하 변경 구조에 의해 변경되는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 참조 서열을 기준으로 하여 위상 오차를 예측하는 단계를 더 포함하는 방법.
  19. a. 센서 어레이에 인접한 복수 개의 입자를 제공하는 단계이며, 여기서 상기 복수 개의 개별 입자는 상기 센서 어레이의 개별 센서에 인접하게 위치하여 핵산 샘플로부터 생성된 핵산 분자에 커플링하는 것인 단계;
    b. 프라이머를 상기 핵산 분자에 혼성화시키는 단계;
    c. 상기 핵산 분자에 인접한 폴리머라제의 존재 하에 상기 핵산 분자를 뉴클레오티드 염기와 접촉시킴으로써 프라이머 연장 반응을 수행하는 단계;
    d. 상기 개별 센서를 이용하여, 상기 프라이머 연장 반응 동안에 상기 개별 입자와 연관된 디바이 층 내의 국부 임피던스 변화를 측정하는 단계;
    e. 상기 프라이머 연장 반응 동안에 혼입된 위상 오차를 모니터링하고 수정하는 단계; 및
    f. 감소된 위상 오차에서 상기 핵산 샘플의 서열을 생성하는 단계
    를 포함하는, 감소된 위상 오차에서 핵산 샘플의 서열분석 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 개별 센서가 (i) 상기 개별 입자 또는 (ii) 상기 개별 입자에 커플링된 핵산 분자의 디바이 층에 커플링된 2개 이상의 전극을 포함하는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 개별 센서가 서열분석 동안에 상기 센서 어레이의 다른 센서로부터 상기 개별 센서를 단리시키는 가상 벽을 제공하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 가상 벽이 국부 전장 또는 국부 자장에 의해 발생되는 것인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 가상 벽이 상기 프라이머 연장 반응의 성분을 단리 또는 농축시키는 것인 방법.
  24. 제19항에 있어서, 위상 오차가 (i) 3개의 뉴클레오티드 염기의 조합을 첨가함으로써, (ii) 동일-위상 폴리뉴클레오티드 가닥에 쇄 종결 뉴클레오티드를 가역적으로 혼입함으로써, 또는 (iii) 상기 핵산 분자에 혼성화하여 상기 프라이머 연장 반응을 중단시키는 올리고뉴클레오티드 클램프를 첨가함으로써 수정되는 것인 방법.
  25. 제19항에 있어서, 혼입을 위한 1개 이상의 뉴클레오티드를 선택함으로써 상기 위상 오차를 수정하여 1 또는 2개의 염기에 의한 지체를 재위상화하는 것인 방법.
  26. 제19항에 있어서, 위상 오차를 나타내는 신호의 손실에 대해 상기 국부 임피던스 변화와 관련된 신호를 모니터링하고, 재위상화에 의해 상기 위상 오차를 수정하여 상기 신호를 회복하는 단계를 더 포함하는 방법.
  27. 제19항에 있어서, 상기 핵산 분자가 원형화된 것인 방법.
  28. 제19항에 있어서, 참조 서열을 기준으로 하여 위상 오차를 예측하는 단계를 더 포함하는 방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 연장 반응 동안에 하나 이상의 상기 뉴클레오티드 염기와 관련된 혼입 이벤트를 나타내는 신호를 검출하는 단계를 정상(steady) 상태에서 수행하는 것인 방법.
  30. 제19항에 있어서, 상기 프라이머 연장 반응 동안에 상기 개별 입자와 연관된 디바이 층 내의 국부 임피던스 변화를 측정하는 단계를 정상 상태에서 수행하는 것인 방법.
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