CN103717753A - 用于遗传和生物分析的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于对多核苷酸进行测序以及对涉及其他生物分子的反应和结合事件进行检测的系统和方法。这些系统和方法可采用无腔室的装置和纳米传感器来高通量地检测或表征这类反应。因为在许多实施方案中该系统是可重复使用的，所以与一次性使用的装置相比，该系统可以经受更加复杂和改进的工程化。

Description

用于遗传和生物分析的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年5月27日提交的美国临时申请No.61/491,081、2011年12月1日提交的美国临时申请No.61/565,651、2012年4月4日提交的美国临时申请No.61/620,381和2012年2月15日提交的序号为13/397,581的美国申请的优先权和权益，其中每一个申请均通过引用整体并入本文。该PCT申请于2012年5月29日向美国受理局提交，因为5月28日周一为联邦假日。
本申请进一步涉及PCT/US2011/054769，后者通过引用整体并入本文。
关于联邦政府资助的研究和开发的声明
本发明的各方面是借助于由IRS所授予的合格治疗剂开发基金(Qualifying Therapeutic Discovery Grant)在政府支持下与美国健康与人类服务部(Department of Health and Human Services)协力完成的。美国政府在本发明中享有一定的权利。
发明背景
快速且成本有效的遗传和生物分析方法，包括高通量DNA测序，仍然是推动个性化药物和诊断测试的一个重要方面。目前的高通量或小型化系统具有限制。例如，目前用于DNA测序的系统，包括那些采用光学检测的系统，是笨重的和昂贵的，并且具有有限的通量。虽然一些系统使用传感器和测序流动池来解决这些限制，但是这些通常是一次性使用的抛弃式物品，这大大增加了使用者的成本，并且限制了该传感器的复杂性，因为该传感器必须针对一次性使用而成本有效地制造。乳液PCR提供了一些优势，然而当测序在整个克隆群体中不是“同相”进行时，对克隆DNA群体的测序可能会展示出有限的精确度，这实际上转而会导致短的读取长度。
对于用于遗传和生物分析的系统和方法，特别是用于灵敏和成本有效的高度平行或克隆测序反应的方法和系统，存在着需求。
发明内容
本文描述的方面和实施方案涉及用于多核苷酸测序以及检测涉及其他生物分子的反应和结合事件的系统和方法。这些系统和方法可采用无腔室的装置和/或纳米传感器来高通量地检测和/或表征此类反应。因为在许多实施方案中该系统是可重复使用的，所以与一次性使用的装置相比，该系统可以经受更加复杂和改进的工程化。
在一些实施方案中，本发明提供了用于多核苷酸测序的方法和系统，该多核苷酸可以是单独的双链或单链多核苷酸，或者在其他实施方案中，是多核苷酸的克隆群体。例如，本发明的一个方面提供了一种用于平行或克隆多核苷酸测序(parallel or clonal polynucleotidesequencing)的方法，该方法包括：对靶多核苷酸群体的第一部分进行测序，校正相位误差(phase error)，然后对靶多核苷酸群体的第二下游部分进行测序。在多个实施方案中，该多核苷酸测序可包括以下一项或多项：对珠粒阵列的克隆测序，对核苷酸掺入的电子检测，和用于分离或集中反应成分的电子孔。
例如，相位误差可通过加入三种核苷酸碱基的组合以在第一次出现被排除的碱基时停止多核苷酸群体来校正。相位误差也可通过如本文详述的掺入反应的组合和/或顺序来校正。替代地或者除此之外，相位误差可通过将链终止核苷酸可逆地掺入同相多核苷酸链中来校正。替代地或除此之外，相位误差可通过加入一个或多个多核苷酸夹(clamp)来校正，该夹与靶多核苷酸杂交以停止测序反应。在一些实施方案中，该夹被变性、去稳定或降解以继续进行测序反应。在其他实施方案中，至少一个夹具有不能被延伸的3’终止核苷酸，因此在去除3’终止核苷酸时，该夹变为后续下游测序的引物。
可以定期进行重新定相，或者备选地，可以监测该反应的信号损失，并进行重新定相以恢复测序信号。
在另一个方面，本发明提供了一种用于减少平行或克隆多核苷酸测序中的前导相位误差的方法。根据该方面的方法包括在竞争反应的存在下对靶多核苷酸群体进行测序，其中该竞争反应包含核苷酸碱基或全部四种核苷酸碱基的核苷酸衍生物。通常，四种核苷酸碱基中有三种将不能掺入到正在生长的多核苷酸链中，从而降低聚合酶掺入不正确核苷酸的倾向。根据该方面，多核苷酸测序可任选地包括以下一项或多项：对珠粒阵列的克隆测序，对核苷酸掺入的电子检测，和用于分离或集中反应成分的电子孔。多种核苷酸衍生物是已知的并在本文中描述，它们可被聚合酶结合，但不掺入到正在生长的多核苷酸链中。
在另外其他的方面，本发明提供了一种用于减少平行或克隆多核苷酸测序反应中的滞后相位误差的方法。根据该方面，该方法包括在测序反应过程中将聚合酶堆积在靶多核苷酸群体上或其附近，以使得聚合酶对于每个活性聚合位点基本上是可用的。替代地或者除此之外，该方法包括将修复蛋白或单链DNA结合蛋白结合至靶多核苷酸群体上。任选地，该多核苷酸测序反应包括以下一项或多项：对珠粒阵列的克隆测序，对核苷酸掺入的电子检测，和用于分离或集中反应成分的电子孔。堆积可以是聚合酶与引物(包括与模板多核苷酸杂交的不可延伸的引物)的天然结合的结果。
在另外其他的方面，本发明提供了用于重复核苷酸测序以致可分析数个测序运行(run)的序列数据的方法。根据该方面，该方法包括提供环化的DNA测序模板，和通过确定核苷酸被具有5’至3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶掺入的顺序来对该模板进行测序。该方面还可任选地包括以下一项或多项：对珠粒阵列的克隆测序，对核苷酸掺入的电子检测，和用于分离或集中反应成分的电子孔。根据该方面的DNA聚合酶可以是高度持续性的并且具有降低的外切核酸酶活性。高度持续性的聚合酶可结合在适于测定核苷酸掺入的生物传感器上或其附近。
在一些实施方案中，该方法通过将聚合酶连接至一个体积中的生物传感器上，并使具有缔合的引物的DNA模板进入该体积并杂交并且被聚合酶(或接近聚合酶)保留，来对单一DNA分子进行测序。随后，可在引物被聚合酶延伸之后确定该序列。
在另外其他的方面，本发明提供了一种无腔室的装置，该装置包含：电磁传感器阵列，用于在电磁传感器上或其附近携带或保持感兴趣的分子的磁性载体，和用于通过液体流动和/或电磁去除来去除磁性载体的机构。电磁传感器可以是纳米针或纳米桥中的一种，并且该装置可进一步包含局部放大器(local amplifier)。在一些实施方案中，电磁传感器具有狭窄的结构，并且在该结构下被蚀刻，以使得传感器表面的两侧易于获得pH的变化或电导率的变化(accessible to changes inpH or to changes in conductivity)。本文所述的装置和方法可包括一项或多项改进，包括引入具有降低的ζ电势的材料，使用允许多核苷酸掺入和灵敏的pH测量的试剂，和相对于为了测序反应而保持多核苷酸模板的珠粒或基质处于最佳距离和配置的纳米传感器的设计和制造。
基于以下详细描述，本发明的其他方面和实施方案对于本领域技术人员来说是显而易见的。
附图说明
图1A示出了完整的集成系统以及一些子系统的示意细节。图1B示出了样品和文库制备子系统的示意细节。图1C示出了DNA断裂和纯化子系统的示意细节。图1D示出了PDMS文库制备子系统。
图2示出了磁性和虚拟限制阵列。
图3示出了用于虚拟孔的电场的Comsol模拟。
图4A-4D示出了PDMS阀调子系统的示意图、图片和制成品。
图5示出了组合的纳米针(NanoNeedle)传感器和磁阵列元件的实施方案。
图6示出了可将磁珠定位在固定位置的磁阵列的两种形式。
图7示出了可将珠粒定位在固定位置的磁阵列的实施方案。
图8示意性地描绘了利用“泄漏阀”来定位珠粒的阵列的元件。
图9描绘了与用于检测的氧化还原反应相关的模拟电压和电流曲线。
图10图示了DNA结合蛋白的电荷分布。
图11示出了用于平面磁性粒子的磁阵列的示意图。
图12示意性地图示了具有珠粒的组合的磁体、虚拟孔和纳米针阵列元件。
图13A-13E示出了各种富集模块实施方案的图示、图片和显微照片。
图14图示了现有流动池的珠粒加载密度。
图15示意性地图示了阀调系统和对于具有邻近阀控制的多通道流动池的接口。
图16示意性地图示了纳米针和珠粒阵列元件中阻抗的简单模型。
图17示意性地描绘了钻蚀的(under-etched)层叠纳米针。
图18是钻蚀的层叠纳米针阵列的显微照片。
图19示意性地描绘了钻蚀的层叠纳米针的2D阵列。
图20是钻蚀的层叠纳米针的2D阵列的显微照片。
图21A-C示意性地描绘了单侧接触纳米针阵列的元件。
图22A-D示意性且概略地示出了双侧接触纳米针阵列的元件。
图23示意性地描绘了纳米桥(NanoBridge)的元件。
图24A-C示意性地描绘了环形纳米桥的视图。
图25示意性地描绘了用于单分子测序的纳米针阵列。
图26图示了来自纳米针阵列元件的测序数据和测序数据的线性。
具体实施方式
本发明提供了用于DNA测序和其他类型生物或遗传分析的方法和系统。本发明提供了用于对克隆DNA群体或单分子DNA的阵列进行测序(包括通过电子测序)从而提供低成本和方便的测序平台的方法和系统。在一些方面，本发明提供了在对DNA克隆群体进行测序的过程中监测和/或校正相位误差从而提高精确度和读取长度的方法。此外，本发明提供了用于对DNA单分子进行测序从而避免此类相位误差的方法和传感器。在其他方面，本发明提供了阵列，包括磁阵列，和用于高度平行反应的虚拟反应器。在一些实施方案中，这些系统包括用于检测DNA测序过程中的生物反应或相互作用(包括核苷酸的掺入)的纳米传感器。此外，本发明提供了用于对DNA样品进行扩增和测序的集成系统。
测序相位误差的监测和校正
如本文所用的“相位误差”被定义为克隆群体中的一些模板多核苷酸比共识状态(consensus state)更多或更少地延伸的事件。对于在相对于共识片段不应该加入碱基的地方加入了碱基的片段，这种相位误差被认为是“前导的(leading)”。对于在相对于共识片段应该加入碱基的地方没有加入碱基的其他模板分子，该多核苷酸被认为是“滞后的(lagging)”。由于聚合酶是不完美的，在具有长延伸反应作为基于集落的测序过程的一部分的集落中，一些相位误差是不可避免的。相位误差限制了商业克隆测序系统的读取长度。
“前导测序掺入误差”是指通过不正确的核苷酸添加而领先于主导序列的序列。这种不正确的添加可能是由聚合酶错误造成的，尤其是当在非竞争反应中使用高浓度的dNTP时。或者，前导测序掺入误差可能是由dNTP的不充分洗涤或非特异性结合造成的，该dNTP随后可被释放和掺入。“滞后测序掺入误差”是指由于错过了正确核苷酸的添加而落后于主导序列的序列；这可能是由于非最佳反应条件、空间位阻、二级结构或聚合酶抑制的其他来源而发生的。较长的循环时间可给予聚合酶更多的掺入错误核苷酸的机会。同样，不易接近的DNA可导致掺入正确核苷酸的机会不足。可以预期，可优化温度、步骤时间、聚合酶选择、核苷酸浓度、盐浓度和缓冲液选择来使掺入误差最小化。
例如，DNA样品可能在与引物互补的区域之后的第一区域具有TGTTC序列。流体循环可首先引入dCTP，第二接着引入dTTP，第三接着引入dATP，第四接着引入dGTP，中间穿插洗涤步骤。在流体循环的第一部分中，作为所述第一循环的一部分流入的dCTP分子可能没有被正确地从孔结构中洗出。在流体循环的第二部分中，作为所述第二循环的一部分流入的dTTP分子可能没有被正确地从孔结构中洗出。在第一流体循环的第一和第二部分过程中，不应掺入dNTP。在流体循环的第三部分过程中，可引入并且可掺入dATPs，因为dATP与样品的第一个碱基T互补。在流体循环的该第三部分过程中还可掺入停止非特异性结合的任何被非特异性结合的dCTP分子。在掺入dATP分子之后可掺入这些未结合的dCTP分子。在掺入dCTP分子之后，可随后掺入两个dATP分子，这可导致克隆珠粒的一些分子具有前导测序相位误差。因此单克隆珠粒的一些分子可变为“异相的”。
当一次给聚合酶提供单一核苷酸或核苷酸类似物时，错误率通常显著高于提供所有四种核苷酸或核苷酸类似物时的错误率。这是可能会发生的，尽管按照kpol/Kd,app测量的催化效率具有巨大差异，错配的核苷酸可能比匹配的核苷酸低4个log或更多。其大部分是由于Kd,app的差异。例如，Klenow聚合酶具有每106-108个碱基中一个碱基的错误掺入率。相比较而言，通过目前的利用单一天然dNTP掺入的商业系统进行的聚合酶延伸反应可被限制为100-1000个碱基。这些系统中的聚合酶把几乎所有时间都耗费在试图错误掺入碱基上，从而导致显著的“前导”相位误差。另外，不能在掺入流体流动循环中掺入碱基的聚合酶可导致移相(dephasing)，这是由于缺乏所述聚合酶，接着在随后的掺入流体流动循环中存在聚合酶，或是由于dNTP浓度和掺入时间的足够低的组合，使得碱基未被掺入，从而导致“滞后”相位误差。即使当加入该系统中的核苷酸是下一个将要加入的核苷酸时，反应时间也必须足够长，以便完成可能为8个或更多个核苷酸的均聚物或可能受到较少空间位阻影响的DNA链的反应。
在一个方面，本发明提供了用于平行或克隆多核苷酸测序的方法。在某些实施方案中，该方法包括对模板多核苷酸群体的第一部分进行测序和校正相位误差。然后继续对所述靶多核苷酸群体的第二下游部分进行测序。在多个实施方案中，测序可包括以下一项或多项：对多核苷酸群体阵列(例如，珠粒阵列)的克隆测序，对核苷酸掺入的电子检测，和用于分离或集中测序反应成分的电子孔。在多个实施方案中，本发明提供了用于监测和校正前导相和滞后相的方法，并且可单独地或以任意组合使用本文所述的各种方法。
如本文所用的“克隆”意指基本上所有的珠粒或粒子群体都可以具有相同的模板核酸序列。在一些实施方案中，可以存在两个与单一样品DNA片段有关的群体，如“配对法(mate pair)”、“配对末端法(paired ends)”或其他类似的方法所希望的；这些群体可以按大致类似的数目存在于珠粒或粒子上，并且可以随机地分布于珠粒或粒子上。
在一些实施方案中，通过以与可能以其他方式正常进行的不同的顺序掺入核苷酸来提供测序而将集落进行重新定相。例如，如果系统主要具有滞后相位误差(不同于前导相位误差)，例如每个碱基仅具有1%的滞后误差(且所有四种不同的碱基具有相似的滞后误差率)，则在已掺入20个碱基之后，仅超过75%的集落成员可能是同相的，而20%以上可能滞后一个碱基。到已对70个碱基完成测序时，少于一半的集落成员将为同相的，35%将滞后一个碱基，13%将滞后两个碱基，且3%将滞后三个碱基。所以，对于其中理想位置以粗体示出的以下示例性掺入序列实例(…CGATCGATCGA)，50%的集落在第四个碱基(T)处将为同相的，35%将滞后1个碱基(A)，13%将滞后两个碱基(G)，且3%将滞后3个碱基(C)。如果先前的碱基掺入顺序为CGAT，并且提供了C，则滞后误差将继续并且将略有升高。相反，如果C被排除，提供的下一个碱基为G，则前导碱基将不会被延伸，而在所示的第一个G处滞后两个碱基的集落的部分将被延伸；如果下一个提供的是A，则大多数的集落现在将为同相的。如果一次或多次提供不含C的三种碱基的组合，例如GAT，则任何相位误差将集中于C碱基。因此在统计上一些序列可变为更加异相的，但是可使得大多数序列为更加同相的。还可以非常相似的方式使用两种碱基的组合来对集落进行重新定相，并且可以使用两种碱基和三种碱基组的混合物。在重新定相之后，可将系统恢复为四种碱基的组合并且可以根据需要经常地重复进行重新定相。
在其他实施方案中，可以根本不使用四种碱基的组合，而是仅使用交替的三种和两种碱基组。在又一个实施方案中，以核苷酸的三种和两种碱基组的任意组合加入四种碱基，在一些实施方案中交替使用两种或三种碱基组的组合物。在一些实施方案中，所述碱基组还可包括不可掺入的核苷酸(unincorporable nucleotides)的使用。在其他实施方案中，以两种、三种或四种碱基的组合使用的核苷酸和/或不可掺入的核苷酸的浓度可在循环间或组间变化。
在某些实施方案中，相位误差通过从测序反应中排除至少一种核苷酸碱基来进行校正。例如，相位误差可通过加入三种核苷酸碱基的组合来进行校正，从而在第一次出现被排除的核苷酸碱基处中止克隆群体中每种新生的多核苷酸。
在某些其他实施方案中，相位误差通过将链终止核苷酸可逆地掺入同相多核苷酸链中来进行校正。一旦滞后相链已经赶上了同相链，则将终止核苷酸去除。当正被测序的序列包括均聚物区域时，该方法可能是最有利的。例如，在以下的序列片段….AGCTCCC中，其中集落的同相部分已经掺入了T碱基，其中大部分滞后序列已经掺入了C、G和A碱基作为集落成员的最后碱基，如果提供C’终止核苷酸，随后提供碱基组合AGT、AGT，则可能存在显著双峰群体，其中序列….AGC’和….AGCTC’占主导。而后可从C’核苷酸上去除所述终止子，并且可提供另一种C’终止核苷酸，产生两种主要的序列：….AGC和AGCTCC’。C’终止的核苷酸之后可接着碱基组合AGT、AGT，从而产生两种群体：….AGCT和….AGCTCC’。而后可将终止子去除，并且随后可提供非终止的C核苷酸，从而主要产生单一序列：….AGCTCCC。
在一些实施方案中，基于参考序列预期在某些位置(例如，均聚区域)有相位误差，因此允许在测序中在适当的地方有效地实施相位校正。
这些方法对于具有误差例如滞后误差的主要来源的那些系统可能是最有效的。可用于重新定相的碱基组合可以单独地加入以便可以确定完整的掺入顺序，或者可以一起加入以便可以用一小部分缺失数据来完成重新定相。在一些实施方案中，可逆终止子可以在测序过程或方法过程中重复使用，并且可以与可掺入的或不可掺入的核苷酸组合。
在另外其他的实施方案中，相位误差通过加入一种或多种寡核苷酸夹来进行校正，该夹与靶多核苷酸杂交以停止测序反应，从而去除相位误差。这种夹可以是PNA片段、DNA片段或与DNA序列特异性结合的其他天然的或非天然的分子。在用于靶向重新测序的系统中，特定的寡核苷酸可用作“夹”。可以在可提供引物序列的同时、可提供引物序列之前、可提供引物序列之后、已完成任何测序反应之前或已完成一些测序反应之后提供“夹”。针对每种模板可提供多种不同的靶向或非靶向夹。
所述夹可以是随机的或靶向DNA模板的特定区域。DNA片段或其他夹可通过使用组蛋白、阳离子鱼精蛋白、重组酶和已知可稳定双螺旋DNA的其他分子来进一步稳定化。然后测序反应(sequencereactions)可以继续进行直至夹所处的点。可使用单一碱基、两种碱基的组合、三种碱基的组合或同时使用四种碱基进行额外的掺入反应。可定位所述夹以便可以将所述夹隔开，以使得在引物的3’端与所述夹之间存在(平均)10至50个碱基，或者可定位为使得在引物的3’端与所述夹之间存在(平均)10至100个碱基，或者可定位为使得在引物的3’端与所述夹之间存在(平均)100至500个碱基，或者可定位为使得在引物的3’端与所述夹之间存在(平均)300至500个碱基，或者可定位为使得在引物的3’端与所述夹之间存在(平均)1000至5000个碱基或更多，或者可定位为使得在引物的3’端与所述夹之间存在(平均)2000至5000个碱基。
在一些实施方案中，夹可具有可特异性杂交的特定数目的碱基，并且可具有可用于稳定所述夹的额外的碱基。如果所述夹的序列不靶向于特定区域，而是一种非靶向夹，则可使用几个标准来选择夹的序列，所述标准包括夹的稳定性，选定的夹序列在感兴趣的基因组或相似性质的基因组或感兴趣的染色体或感兴趣的转录组中的频率。完整的夹的杂交稳定性，包括任何非特异性碱基如脱氧肌苷、5-硝基吲哚或脱碱基核苷酸，或者可以包括在US7,575,902(其通过引用整体并入本文)中所述的任何通用碱基，并且可包括选定为夹的特定碱基的碱基的稳定性。
在一些实施方案中，所述夹可以包含5、6、7、8、9、10个或更多个特定的碱基。所述夹可用于多种DNA集落，其中基本上所有的集落均可具有与其他DNA集落不同的DNA序列。在一些实施方案中，可使用包含单组特异性杂交dNTPs的单夹类型。在其他实施方案中，使用多夹类型，其中特异性杂交碱基的数目、顺序或间距可能是不同的。例如，可以利用两个不同的六聚体夹来减小如果仅利用了两个六聚体夹之一将会发生的、以DNA碱基为单位测量的、从引物到该夹或在一个夹与下一个夹之间的平均间距，但是可能大于在使用一个五聚体夹时可能发生的。在一些实施方案中，以DNA碱基为单位测量的、从引物至夹或夹与夹之间的间距可因为夹序列的选择而改变，因为不同六聚体在转录组中的表现存在显著差异(大于20倍)(Anderson等人RNA V14(5))。
在一些实施方案中，随后通过升高温度、改变pH或离子浓度来去除夹(在定相之后)，从而导致夹的变性，但留下较长的延伸引物，该引物随后可在去除夹之后被进一步延伸。在其他实施方案中，夹可包含切口位点(nick site)，该切口位点随后可被合适的切口酶或内切核酸酶切刻，这可使得夹去稳定，足以使其变性。在一些实施方案中，夹可包含可切割的连接体位点，其中所述可切割的连接体位点可以是可化学切割的或可光学切割的。在一些实施方案中，可提供在3’位置终止的碱基作为夹的一部分。随后可在已加入核苷酸后去除所述终止子，以便实现重新定相。所述终止子可使用化学或光化学过程去除。在一些实施方案中，将不同类型的可切割连接体位点(例如，独特的可切割连接位点)的组合用于不同的夹，以便可以在开始任何测序之前或已开始进行测序之后提供具有不同连接体类型的夹，并且可以使用不同的可切割机构以一种允许模板DNA多次重新定相的顺序来使夹变性。
在一些实施方案中，该方法包括在已发生测序和重新定相过程之后加入夹。在其他的实施方案中，加入额外的夹的过程可重复多次，如2-5次、4-10次或多于10次。
在一些实施方案中，可以对在邻近所述夹的位置之前的所有碱基在可进行掺入时收集数据；在其他实施方案中，可能不对在邻近所述夹的位置之前的所有碱基进行数据采集。
在一些实施方案中，所述夹可与非链置换聚合酶组合使用，以使得当所述聚合酶通过聚合过程到达所述夹时，所述聚合酶不能置换所述夹。在其他的实施方案中，所述夹的5’碱基可使用不能被所述聚合酶可能具有的5’至3’外切核酸酶活性所切割的非天然连接体来连接。在备选的实施方案中，所述聚合酶可以是非链置换聚合酶并且可以进一步缺乏5’至3’外切核酸酶活性。
在进一步的实施方案中，链置换聚合酶可以与对所述链置换聚合酶的链置换具有抗性的夹组合使用。所述夹，特别是在该夹的5’端，可由对链置换聚合酶的链置换活性具有抗性的非天然碱基组成。这样的碱基可包含脱碱基的碱基如已脱嘌呤的碱基，或合成碱基如PNA、核碱基的阿糖基衍生物、核糖核苷酸、2’-O-烷基核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸，或具有甲基磷酸酯连接的碱基。
在一些实施方案中，该夹在定相后用作引物。所述夹在其3’末端可包括可逆终止子，其中进行引物延伸反应直至该夹基本上阻止进一步的延伸。进一步延伸后可以接着是从夹的3’末端去除终止子，这允许聚合酶引发从所述夹/引物开始的引物延伸反应。
在一些实施方案中，将单一夹/引物用于一个集落或一组集落，其中所述引物与所述夹之间的距离可显著大于通常会发生移相之前的平均测序长度，例如，当为了确定DNA的结构而需要使用所述夹时，例如创造支架并去除由于重复序列造成的序列不确定性。在一些实施方案中，引物与夹/引物之间的距离可以是移相之前的平均序列“读取长度”的两倍长，或者可以是移相之前的平均序列“读取长度”的两倍长至五倍长，或者可以是移相之前的平均序列“读取长度”的五倍长至二十倍长，或者可以是移相之前的平均序列“读取长度”的二十倍长至五十倍长。在该实施方案中可任选地利用额外的夹/引物来扩大读取长度，和/或进一步阐述DNA集落的结构。在一些实施方案中，平均读取长度为约50个核苷酸，或约100个核苷酸，或约200个核苷酸，或约300个核苷酸，或约400个核苷酸，或约500个核苷酸。在其他实施方案中，夹/引物用于一个集落或一组集落，其中所述引物与所述夹/引物之间或从夹/引物到下一个夹/引物的距离可以类似于正常将发生移相之前的平均测序长度，例如，如扩大平均测序长度的读取长度所希望的。
如果由于在夹(包括任何稳定部分(stabilizing moeity))与聚合酶(或连接酶)之间的相互作用而导致在掺入停止点中存在任何变异，则夹重新定相方法可与先前所述的一种方法组合，由于夹的序列是已知的所以这可能是有利的，从而允许添加除夹序列的第一个碱基之外的碱基，可能接着添加除夹序列的第二个碱基之外的碱基，或在夹序列的任何其他已知部分处的任何停止。
为了允许短杂交探针作为重新定相试剂，可使用稳定化合物如肼屈嗪或抗肿瘤抗生素cc-1065。同样，探针可以是PNA或LNA探针，其可提供双重功能，即提供较牢固的结合，和通过例如在探针的3’端使用终止子而不需要防止探针被聚合酶延伸。此外，探针可以是单链体、可以与靶DNA杂交以产生更加稳定的三链体的双链体，或者可以是三链体，该三链体可与靶DNA杂交形成四链体。在一些实施方案中，探针可以以两部分或更多部分提供，其中一部分可以是杂交的单链体，而第二部分可以杂交以产生三链体。在一些实施方案中，可提供探针复合物的额外部分，从而允许形成四链体，或除原模板之外还与超过两个部分形成双链体。
在其他实施方案中，滞后移相可通过在将被延伸和测序的DNA上或其附近“堆积”聚合酶来降低，以使得许多聚合酶对于每个活性聚合位点均是可用的。所述堆积可由聚合酶与DNA的天然结合而产生。这种结合可正常地产生，例如，当使用Klenow聚合酶时，其中Klenow聚合酶具有内在的ssDNA和dsDNA结合。
此外，在一些实施方案中，除通用或靶向引物之外，还给DNA提供3’终止的随机引物，其中所述通用或靶向引物可能不会终止，并且其中所述聚合酶可结合在所述随机引物的3’终止端，以及所述通用或靶向引物的3’端。由于所述随机引物可被终止，所以所述随机引物可能不会延伸，并因此对从所述通用或靶向引物延伸该链所伴随的信号可能没有贡献。在该实施方案中，聚合酶可能缺乏3’至5’外切核酸酶活性，以使得不能降解所述随机引物，导致堆积能力的丧失。
在备选的实施方案中，可采用至少在3’末端使用核苷酸类似物的随机引物代替3’终止的随机引物，其中聚合酶将与随机引物结合，但不会将其延伸。在该实施方案中，聚合酶可具有3’至5’外切核酸酶活性，只要所述3’至5’外切核酸酶活性在去除核苷酸类似物方面实际上无活性。在一些实施方案中，对于结合至所述3’终止的随机引物的聚合酶，或至少在3’末端位置具有一个或多个核苷酸类似物的随机引物，可能期望Kd较小。所述含有核苷酸类似物的随机引物可以是嵌合的，其中所述嵌合体包含天然核苷酸和核苷酸类似物、多种类型的核苷酸类似物，或天然核苷酸和多种类型的核苷酸类似物。
在进一步的实施方案中，随机引物可以是3’终止的随机引物，其中该随机引物的3’末端进一步在3’(终止的)位置包含硫代磷酸核苷酸，以使得随机引物进一步对3’至5’外切核酸酶活性具有抗性。3’硫代磷酸引物可从例如IDT(Integrated DNA Technologies)购买到。在该实施方案中，可使用具有3’至5’外切核酸酶活性的天然聚合酶如phi29，而无需对聚合酶进行突变以使外切核酸酶活性失活从而防止所述随机引物的降解。这样的硫代磷酸酯可以是α-S或α-R立体异构体。随机引物还可包含5’硫代磷酸酯，以便可以抑制5’至3’外切核酸酶活性。或者，随机引物包含3’倒置的dT，其相对于随机引物的3’位置可起到防止聚合和外切核酸酶活性的作用。双脱氧核苷酸可用作终止子。所述终止子可以是可逆终止子、虚拟终止子、连接至核苷酸碱基上的终止子，或连接至核苷酸的糖的任意位置上的终止子。随机引物中的核苷酸可以是天然碱基或可以是合成碱基。所述随机引物可包含dNTP，或可包含与PNA、RNA、LNA、5-硝基吲哚、脱氧肌苷或其他非天然dNTP组合的嵌合体。
堆积的聚合酶还可结合至珠粒的表面，传感器的表面，传感器之间的间隙区域，连接至所述珠粒、传感器或间隙区域上的基团、连接体或聚合物。这样的结合可以结合至不可延伸的外切核酸酶抗性DNA、合成DNA或其他线性聚合物的额外链，或者可以是其他结合基团如抗体，其中该结合基团可直接结合至所述聚合物，或者可以结合至可与所述聚合酶络合的中间蛋白质。
为了保证堆积的聚合酶能够替代为了掺入碱基并防止在期望的误差率内的滞后移相而已经与DNA链活性掺入位点解离的聚合酶，来自活性掺入位点的聚合酶的Koff和堆积的聚合酶的Koff堆积位点及数目与延伸期之间的相对动力学的关系必须是适当的。例如，如果Koff对于活性掺入位点和堆积位点Koff和Kon是相同的，并且Koff相当于20个掺入流体循环，如果有20种堆积的聚合酶，则另一种聚合酶将成为可用于结合至活性掺入位点的几率小于50%。这可通过降低堆积位点的Koff和增加堆积位点的Kon来改善，需要提醒的是，聚合酶由于流体流动的损失可能是一个问题。可通过利用非天然碱基、终止子或可正常降低聚合酶的持续性的蛋白质与结合位点的缔合来降低Koff。
替代地或者除此之外，聚合酶可以是单一类型的聚合酶或者可以是不同类型的聚合酶的组合。通常，商业化的更加持续性的聚合酶具有较低的掺入误差率，并且因此可能期望主要使用高度持续性的聚合酶。一种类型的聚合酶比另一种类型的聚合酶具有显著更长的Koff可能是所希望的。使较短Koff的聚合酶可用于替代解离的任何更高度持续性(较长Koff)的聚合酶也可能是合适的，以便聚合酶将可用于在适当时掺入任何碱基。因此，较低持续性的聚合酶的Koff低于为掺入流体循环而分配的时间长度可能是合适的，以便确保在更加持续性的聚合酶从延伸引物的结合位点上解离时聚合酶将可用于掺入。
在优选使用两种或更多种类型的聚合酶的一些实施方案中，可能期望优先将更加持续性的聚合酶结合至待延伸的引物。因此可能期望使更加持续性的聚合酶在加入较低持续性的聚合酶之前结合至待延伸的引物，该较低持续性的聚合酶可以有ssDNA和/或dsDNA结合部分与之缔合。在其他实施方案中，可能期望对聚合酶进行修饰或突变以便可将结合部分加至所述聚合酶中，从而使得聚合酶可直接结合至ssDNA或dsDNA的部分。
聚合酶的堆积可以定期得到补充。在每个掺入循环或在已发生适当数目的掺入循环之后均可以发生所述补充。补充之间的循环数可以根据堆积方法而变化。例如，如果堆积方法为在随机引物上储存，则堆积位置的数目随着通用或靶向引物的延伸而减少，因为所述随机引物可被聚合酶利用链置换或随机引物的5’至3’外切核酸酶消化而替代。例如，如果与双链DNA的结合存在第二结合机制，则堆积的聚合酶的数量可以得到保持。
在某些实施方案中，该方法包括监测反应的信号损失，和重新定相以恢复测序信号。例如，可监测来自测序反应的数据，并且当观察到需要时可进行重新定相，例如，看到这样的信号水平，该种信号水平可能低于对单一碱基的预期，但如果存在滞后相位误差时则将是符合期望的，或看到对单一碱基观察到的信号水平降低。所述观察结果可在确定信号在统计学上是否由滞后相位误差所造成时考虑标称序列。所述观察结果可包括一个测序流体循环或一组测序流体循环的信号水平的直方图。
在一些实施方案中，可对任何克隆测序系统(包括利用四种可掺入核苷酸的那些系统，以及以上针对移相最小化而描述的所有那些系统)进行重新定相。在一些实施方案中，重新定相与乳液PCR一起进行，或者备选地，与本文所述的磁阵列或珠粒阵列，任选地与电子测序一起进行。
在本发明的一个实施方案中，可通过使用较早和/或较晚的数据确定每个位置、每个循环的预期背景水平来进行补偿以减少相位误差。对于每个碱基、对于序列环境中的每个碱基和以前确定的滞后和前导误差的量所预期的相位误差可用于帮助确定实际碱基。这种误差校正还可考虑来自阵列上邻近的反应的相位误差，以及邻近反应对从每个传感器接收到的信号的影响。
在一些实施方案中，前导和滞后相位误差之间的分布受到影响，使得一种类型的相位误差可以比另一种类型的相位误差以更高的比率发生。在一个实施方案中，可以限制dNTP的浓度，以使得滞后相位误差比前导相位误差更具可能性。在进一步的实施方案中，随后可进行重新定相以校正更可能的相位误差类型。在其他实施方案中，该方法用来校正两种类型的相位误差，其中该方法校正一种相位误差类型，然后校正另一种类型的相位误差。可在测序过程中定期重复相位校正的所述方法。在一些实施方案中，用于重新定相的流体模式可以是固定的。例如，固定的模式可在进行重新定相方法之间具有固定数目的流体测序循环，或者流体测序循环的数目可在测序过程中变化，例如，通过减少进行重新定相方法之间的流体测序循环的数目。
在另一个方面，本发明提供了一种用于减少平行或克隆多核苷酸测序中的前导相位误差的方法。根据该方面的方法包括在竞争反应的存在下对多核苷酸群体进行测序。该竞争反应包括核苷酸碱基或所有四种核苷酸碱基的核苷酸衍生物，其中这四种核苷酸碱基中有三种不能掺入正在生长的多核苷酸链中。测序可包括以下一项或多项：对多核苷酸群体阵列(例如，珠粒阵列)的克隆测序，对核苷酸掺入的电子检测，和用于分离或集中测序反应成分的电子孔。在各种实施方案中，不可掺入的核苷酸可选自(不限于)PNA核苷酸、LNA核苷酸、核糖核苷酸、单磷酸腺嘌呤、二磷酸腺嘌呤、腺苷、脱氧腺苷、单磷酸鸟嘌呤、二磷酸鸟嘌呤、鸟苷、脱氧鸟苷、单磷酸胸腺嘧啶、二磷酸胸腺嘧啶、5-甲基尿苷、胸苷、单磷酸胞嘧啶、二磷酸胞嘧啶、胞苷、脱氧胞苷、单磷酸尿嘧啶、二磷酸尿嘧啶、尿苷和脱氧尿苷。通常，不可掺入的核苷酸被聚合酶结合，但不能被聚合酶掺入正在生长的多核苷酸链中。在一些实施方案中，不可掺入的核苷酸的浓度与聚合酶对每种不可掺入的核苷酸的活性有关。所述不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物可以是未标记的、光标记的或电荷标记的。
在一些实施方案中，可掺入的dNTP的浓度可相对于可掺入的dNTP的浓度而增加，从而允许前导和滞后误差率的降低。
在另一个方面，本发明提供了一种用于减少多核苷酸模板群体中的滞后相位误差的方法。该方法包括在测序反应过程中将聚合酶堆积在靶多核苷酸上或其附近，以使得聚合酶对于每种或基本上每种活性聚合位点是可用的。
替代地或者除此之外，该方法包括将修复蛋白或单链DNA结合蛋白结合至靶多核苷酸上，以便尤其去除二级结构或有助于持续性。在一些实施方案中，可能期望减少可以其他方式干扰聚合酶活性从而导致滞后相位误差的单链DNA的二级结构。在一个实施方案中，使用与单链DNA结合的蛋白质。此类蛋白质可包括修复蛋白如细菌RecA DNA修复蛋白、HIV核壳蛋白、T4噬菌体基因产物32、小牛胸腺UP1、EB病毒BALF2，或商业化的单链结合蛋白如Epicentre大肠杆菌(E.coli)单链结合蛋白，以及许多其他蛋白质。在一些实施方案中，所述单链结合蛋白还可能有助于聚合酶的持续性。在其他实施方案中，其他部分也可能有助于聚合酶的持续性，如EB病毒BMRF1、三链体酿酒酵母(S.Cerevisiae)增殖细胞核抗原、T4噬菌体基因产物45、硫氧还蛋白(thieoredoxin)、大肠杆菌PolIII全酶、真核夹蛋白PCNA，或其他DNA滑动夹蛋白，或其他双链或单链DNA结合部分。
在一些实施方案中，聚合酶持续性可通过聚合酶突变来增强，如向Phi29聚合酶中加入螺旋-发夹-螺旋结构域，或使用如Salas等人在PNAS10716506中所述的嵌合(chimerical)聚合酶，加入硫氧还蛋白结合结构域，加入古细菌滑动夹、DNA结合蛋白Sso7d、锌指结构域、亮氨酸拉链，以及其他可能性。在一些实施方案中，可进一步对聚合酶进行修饰以便使用多于一种持续性增强的突变，如在聚合酶的各自末端添加双链和单链结合部分的突变。在一些实施方案中，这样的结合部分还间接结合至聚合酶上，以便例如通过使聚合酶突变而添加链霉亲和素部分，并且通过突变将生物素部分添加至单链DNA结合部分和/或双链DNA结合部分，如以上所述的那些部分。聚合酶因此将通过链霉亲和素生物素结合而结合至单链或双链DNA结合部分上，并进一步通过所述单链或双链DNA结合部分结合至DNA上。在其他实施方案中，采用其他结合部分来将聚合酶结合至单链或双链DNA结合部分上，其中可通过突变将额外的部分添加至聚合酶和单链或双链结合部分中的每一个上，其中添加至聚合酶和单链或双链结合部分上的额外的部分具有相互结合亲和力。在进一步的实施方案中，可通过突变将一个部分添加至聚合酶、单链DNA结合部分和双链DNA结合部分之一上，其中通过突变添加的部分然后可以结合至聚合酶、单链DNA结合部分和双链DNA结合部分中的另一个上，以使得聚合酶结合至单链或双链DNA结合部分上。
在一些实施方案中，通过利用聚合酶与不可延伸的引物的结合来实现堆积。在某些实施方案中，不可延伸的引物不受聚合酶的3’外切核酸酶活性的影响。在一些实施方案中，不可延伸的引物为3’终止的随机引物，并且延伸引物为通用或靶向引物。聚合酶结合在随机引物的3’终止的末端，也结合至通用或靶向引物的3’端。例如，3’终止的引物在3’终止位置可包含硫代磷酸核苷酸，以使得所述3’终止的引物对3’至5’外切核酸酶活性具有抗性。
根据该方面的测序可包括以下一项或多项：对核苷酸群体阵列(例如，珠粒阵列)的克隆测序，对核苷酸掺入的电子检测，和用于分离或集中测序反应成分的电子孔。
关于电子测序，在一些实施方案中可能期望使用比对于合成而言最佳的浓度更低的离子浓度，以便具有对于改进的检测器运行而言足够低的离子浓度。这可导致定相误差，和比期望的更短的序列长度。可能期望具有比利用所述低离子浓度可能得到的更长的序列长度。因此，在一个实施方案中，通过对于最佳检测条件与最佳合成条件的交替来增加有效读取长度。例如，该方法可包括在使用所述DNA延伸反应的最佳读取所需的低离子浓度的同时对可能的全长进行测序反应，使延伸的引物链解链，引入新的引物和dNTP，以及在使用对于合成而言最佳的离子浓度的同时继续进行合成反应。使延伸的引物链解链，引入新的引物和dNTP，以及在使用对于合成而言最佳的离子浓度的同时继续进行合成反应，随后将条件改变为适合于检测的条件，以上过程可以重复多次，直至该过程不再产生有用的数据。由于对使用多少合成步骤的确定可能是统计学的，所以可以逆转该过程，利用最佳的合成条件进行合成，而后利用适合于检测的条件进行合成；随后可以接着使延伸的引物链解链，引入新的引物，以及使用适合于检测的离子浓度。
为了优化检测灵敏度，低于适当的酶动力学可能需要的浓度的离子和/或dNTP浓度可能是期望的。这可导致比所期望的更长的掺入时间和/或更多的滞后相位误差。在一些实施方案中，在单一掺入循环过程中可能期望使用多于一种dNTP浓度。例如，可能期望利用低浓度的dNTP和/或离子进行单一掺入循环，以便优化传感器的灵敏度和信噪比。因此，具有低浓度的dNTP和/或离子的溶液可流入流动池中以便可以进行测定。这之后紧接着可以是具有一定浓度的dNTP和/或离子的溶液，该浓度对于向延伸的引物中的掺入而言是最佳的，使得可发生最低的移相。在备选的实施方案中，高浓度的dNTP可以流入流动池中，以便可以发生快速的、最佳的掺入反应，从而提供最低的移相。这之后可以立即接着具有低或无dNTP和适当低的离子浓度的试剂溶液，以便可以进行最佳的传感器读取。
在另一个实施方案中，具有对于快速掺入核苷酸而言最佳的dNTP和/或离子浓度的试剂溶液可流入流动池中以便根据需要将dNTP的重要部分迅速掺入多种集落中，随后非常迅速地使对于最佳传感器读取而言最佳的试剂溶液流入流动池，接着使具有dNTP和/或离子浓度的试剂溶液以适合于将核苷酸掺入各种引物的延伸引物中的浓度流入流动池。第一试剂溶液可以具有对于在一段延长的时间内使用试剂溶液可能足够高的核苷酸浓度，聚合酶掺入误差可能以显著的水平发生。
因为聚合酶对于每种碱基的效率可能是不同的，所以需要使用不同浓度的不同dNTP，使用不同的缓冲液、不同的阳离子浓度、不同的聚合酶浓度、不同类型的聚合酶或它们的任意组合来优化掺入率，使相位误差量最小化，使掺入误差量最小化，并使读取长度最大化。
在某些实施方案中，不同核苷酸或不可掺入的核苷酸类似物的浓度水平与聚合酶针对每种核苷酸或核苷酸类似物的相对活性相匹配。例如，已经测得dTTP结合率相对于其他核苷酸相差两倍以上。其他三种核苷酸在它们的聚合酶结合率方面可能是非常接近的，但相对于彼此仍具有10%以上的不同。在比较不同的不可掺入的核苷酸类似物相对于天然核苷酸的聚合酶结合率时，差异可能甚至更大。
在进一步的实施方案中，等效聚合酶延伸所需的不可掺入的核苷酸的浓度高于、等于或低于可以为不利用不可掺入的核苷酸或核苷酸类似物的测序反应提供的、对于一种或多种可掺入的核苷酸或核苷酸类似物具有最低移相的最佳引物延伸的浓度，使得核苷酸或核苷酸类似物的错误掺入的概率低于提供不可掺入的核苷酸类似物的浓度使得聚合酶延伸效率相匹配的情况，或以相对于可掺入的核苷酸或核苷酸类似物具有较低聚合酶延伸效率的浓度提供不可掺入的核苷酸类似物的情况。或者，可以相对于可掺入的核苷酸或核苷酸类似物具有较低聚合酶结合率的浓度来提供不可掺入的核苷酸类似物，以使得相比如果不可掺入的核苷酸的聚合酶结合率等于或高于可掺入的核苷酸类似物结合率时将会发生的，该反应可以以更高的速率进行。
在其他实施方案中，提供的可掺入的核苷酸或核苷酸的浓度可以改变，以使得不同dNTP的掺入率可更加相等。可根据需要针对不同的缓冲条件、pH、聚合酶和与任何聚合酶夹复合物或可用来稳定聚合酶的其他部分的相互作用来改变浓度。
在一些实施方案中，不可掺入的核苷酸用作并非意在导致核酸碱基掺入的试剂组的一部分。这种试剂组可以，例如，意在在引入一组新的可掺入核酸碱基之前洗掉先前的一组可掺入核酸碱基。这种洗涤步骤还可包括将三磷酸核酸碱基降解为二磷酸或单磷酸的磷酸酶，以便任何残留的三磷酸将会降解并且将因此成为不可掺入的。不可掺入的核酸碱基可占据聚合酶袋中与下一个碱基互补的位置，并且可有助于有效地增加聚合酶的持续性，因为聚合酶的指状突将保持关闭，从而试图掺入不可掺入的核酸碱基，并降低所述聚合酶从DNA上的解离。
上述方法可用于如下的反应条件：其中可能存在三种不可掺入的核苷酸类似物和一种可掺入的核苷酸或核苷酸类似物，或者其中存在两种不可掺入的核苷酸类似物和两种可掺入的核苷酸或核苷酸类似物，或者其中可能存在一种不可掺入的核苷酸类似物和三种可掺入的核苷酸或核苷酸类似物。
可与上述反应条件以及不可掺入的核苷酸类似物一起使用的检测方法可包括掺入或掺入事件的任何形式的电子感测，包括ISFET、CHEMFET、纳米针、纳米桥、化学发光检测、荧光检测，包括对量子点或其他非标准荧光团的检测，和对嵌入荧光团的检测、使用荧光部分的检测。
在本发明的采用珠粒阵列和电子测序(如本文所述)的进一步的实施方案中，空珠粒或空传感器区域(不具有相关联的集落的传感器区域)可用作参比；这样的参比可以补偿温度的变化、本体试剂的电导率或pH的变化或电导率或pH的局部变化。对系统的控制将帮助限制和鉴定相位误差，从而扩大读取长度。
FET pH传感器的惯例是使用参比电极；FET pH传感器阵列的一些设计使用针对每个检测通道的参比通道；其他的具有针对一组检测通道的参比通道。但是检测器的局部pH受到存在DNA集落的影响，并且随通过聚合反应扩大DNA第二链的长度而变化。在使用一次将单一类型的核苷酸引入流动池中的化学方法时，许多检测器通道将不会有反应在该检测器上发生；实际上大多数检测器通道将不会有反应发生。因此，在一个实施方案中，使用相邻检测器作为参比通道，当pH或离子浓度在与具有聚合反应发生的检测器相邻的检测器中变化时为数据分析算法提供测量pH或离子浓度的机会。这允许检测pH或离子浓度水平或感兴趣的检测器的局部噪声的其他来源，并且还可允许检测串扰，允许监测和改变串扰去卷积函数。
在某些实施方案中，使用空珠粒(不具有DNA集落，或具有的集落不含有与将用于合成测序反应的引物相同的引物)确保一些检测器将不会有聚合反应在其上发生。可将具有含有适当引物的DNA集落的珠粒引入流动池，采用检测器上的一组随机位置。随后，可将一组如前所述的空珠粒引入流动池中，由此空珠粒可占据尚未被流动池中已经存在的珠粒所占据的随机位置。随着试剂引入流动池，然后利用空珠粒监测pH和/或离子浓度水平，从而使得该分析算法能够更好地确定背景水平和/或串扰去卷积函数。
在另一个实施方案中，空珠粒与样品珠粒成对引入，并且使用差分放大器来测定信号，从而避免了对将背景和串扰变化进行直接去卷积的分析算法的需求。
在另外其他的实施方案中，在目前的流体循环中不具有掺入反应的相邻珠粒或传感器区域可用作参比。因为通常当对不同序列的大群体进行测序时大多数珠粒或传感器区域将不具有掺入反应，所以可将这些不具有掺入反应的位置用作额外的参比。作为参比，不具有掺入反应的珠粒或传感器区域还可提供相对于空传感器或空珠粒的更好的参比，因为DNA聚合酶和珠粒将存在于感兴趣的体积中，并且表面化学和得到的背景反荷离子浓度的任何变化将可能更好地匹配。珠粒或传感器区域上的不同集落很可能可以具有长度不同于与其他珠粒和/或传感器区域相关联的集落DNA和/或延伸引物的集落DNA和/或延伸引物，并因此可存在可与传感器相互作用的不同量的电荷。
因此，在本发明的一些实施方案中，可能需要软件来补偿与传感器相关联的DNA和/或延伸引物的相对长度和得到的不同电荷和信号水平，以及珠粒或集落相对于传感器的位置，这些可能会有影响。软件可保存信号水平的记录：在将珠粒引入所述传感器之前与每种传感器相关；在引入珠粒之后但在引入引物和/或聚合酶之前；在引入引物和/或聚合酶之后但在合成测序反应中引入第一核苷酸之前；与无引物的集落相关；与可具有不同长度的DNA的集落相关；以及与具有杂交引物的集落相关的信号水平，该集落可具有不同长度的DNA。软件可追踪已经向每个引物中添加了多少碱基。信号水平可以是绝对水平，或不同传感器之间的相对水平。软件可使用许多其他邻近的或最接近的传感器作为参比，以测定单独的传感器的信号水平，从而补偿每组集落的DNA长度、延伸引物的长度和可能由于珠粒或集落相对于传感器的定位而产生的信号水平。软件还可补偿传感器相对于不具有dNTPs的试剂体积与具有dNTPs的试剂体积之间的过渡的相对位置。软件可进一步补偿由于向延伸引物中的掺入，dNTP浓度随扩散和/或dNTP浓度消耗的变化。扩散量可由以下数据来表征：来自可在相同测序运行中或来自先前的测序运行的相同芯片的早期数据，或来自在相同仪器上使用的先前的芯片的测序数据，或来自在其他仪器上使用的其他芯片的数据。预期的消耗水平可基于在不具有dNTPs的试剂体积与具有dNTPs的试剂体积之间的过渡穿过流动池时产生的数据来确定。
在一些实施方案中，使用具有已知序列或具有不同的已知序列的对照珠粒。已知序列可具有不同已知长度的均聚物运行，并且可用于校准系统的响应以便更好地确定未知长度的均聚物运行的长度。已知序列在确定信号或背景信号水平中也可以是有用的，因为延伸的引物的长度和掺入事件是否已经发生都将预先得知。对照珠粒可用于将仪器问题与样品制备问题区分开。具有已知序列的对照珠粒可在系统之外产生，并与连接在其上的DNA集落一同引入，或者对照DNA可与样品DNA混合或在样品DNA之前或之后引入，以在珠粒上产生DNA集落或以其他方式与传感器相关联。在一些实施方案中，可以采用与本文所述用于由相邻珠粒进行标准化的方式相似的方式监测和存储信号水平。
以类似于光学像差的方式，通过检测器检测的种类(species)的扩散将导致不同检测器之间的串扰。在本发明的一个实施方案中，可以用一种方式进行自阵列上不同传感器获得的数据的去卷积，该方式类似于用于将来自光学系统的点扩散函数进行去卷积的方式。使用的去卷积函数可部分地取决于检测时流动池的温度，以及通过流动池的流速，其常常可导致特定集落“下游”的更多串扰。用于所述去卷积的去卷积函数可以是固定的去卷积函数，或者可以作为最佳适配算法的一部分而导出。
传感器阵列可以进行自我校准，从而允许校准诸如扩增效率、珠粒大小和负载、珠粒在传感器上的位置等变量。通常，在扩增DNA样品以在珠粒上产生DNA单克隆群体时，可在所述扩增反应之前将第一引物连接至样品DNA上。在测序过程中，提供与已连接至所述DNA样品的所述第一引物互补的第二引物。所述第二引物可以比所述第一引物短几个碱基。因此，每个单克隆珠粒具有独立于扩增效率的密度的已知初始序列，其将是不被所述互补的第二引物匹配的所述第一引物的部分。这可允许预先了解碱基序列，并且可包括校准序列如已知长度的均聚物运行。
在备选的实施方案中，这种校准可发生在测序反应完成之后，或备选地在已在测序反应中对许多碱基进行了测序之后。在统计学上，测序反应中的大多数流体循环在单独的珠粒上将不会导致碱基掺入。流体循环的下一个最常见的结果将是单一碱基的掺入。因此，可对数据组进行分析，并且可对每个珠粒设定合适的信号水平。
在进一步的实施方案中，当流体循环中碱基掺入的信号水平在测序过程中降低时，可实施正在进行的补偿/校准，并且在流体循环中不具有碱基掺入的背景是诸如以下的因素的结果：珠粒上一些克隆群体的损失、珠粒上一些克隆群体的测序相超前或测序相滞后或其他因素。因此，可以就对由于均聚物运行而具有单一碱基掺入、无碱基掺入或多碱基掺入的流体循环在测序过程的每个点上可期望产生多少信号来计算信号水平。
在一些实施方案中，可进行反相对齐，其中具有3’至5’外切核酸酶活性的聚合酶与缺少至少一种dNTP的dNTP池一起使用。具有3’至5’外切核酸酶活性的聚合酶将会去除碱基，回退至所提供的dNTP池中的下一个dNTP，在该点处将会达到平衡，并且将不会有进一步的核苷酸被去除。这可能为了去除由于前导相位误差已经掺入的任何碱基而进行。在其他实施方案中，可掺入不允许外切核酸酶活性的一种或多种碱基类型，如硫代磷酸核苷酸。而后可通过去除不可掺入的核苷酸来使用外切核酸酶活性，从而改善外切核酸酶活性的动力学。在其他实施方案中，可利用exo-聚合酶来进行初始掺入，而后使用exo+聚合酶或另一种核酸酶来去除任意碱基，回退至硫代磷酸核苷酸或抗核酸酶活性的其他核苷酸。
单一和/或重复的多核苷酸测序
在另一个方面，本发明提供了一种用于重复和/或单一多核苷酸测序的方法。该方面的该方法包括提供环化的DNA测序模板，和通过确定核苷酸被具有5’至3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶掺入的顺序来对该模板进行测序。根据该方面的测序可包括以下一项或多项：对多核苷酸群体阵列(例如，珠粒阵列)的克隆测序，对核苷酸掺入的电子检测，和用于分离或集中测序反应成分的电子孔。在多个实施方案中，DNA聚合酶是高度持续性的并且具有降低的外切核酸酶活性。此外，DNA聚合酶可结合在适用于测定核苷酸的掺入的生物传感器上或其附近。在一些实施方案中，该方法包括在测序之前将聚合酶预先结合至多核苷酸上。根据该方面，本发明避免了对校正定相或重新定相的需求。
可通过纳米针生物传感器(在本文中详细描述)对单一DNA分子进行测序。聚合酶连接至传感器上。而后可使用例如压力诱导流动、电渗诱导流动和/或迁移或类似的方式，使具有缔合的引物的DNA样品进入具有连接有聚合酶的传感器的体积中。来自DNA样品的单一分子随后可被连接至传感器阵列中的传感器上的聚合酶结合。额外的单一DNA分子也可被结合至传感器阵列中的其他传感器上的其他聚合酶结合。
为了允许重复测定相同DNA样品，可将DNA样品环化，并且聚合酶可以是链置换聚合酶。因此，可通过使引物延伸反应完全围绕环状DNA样品继续进行多个循环而对DNA样品进行重复测序。而后可将该链的数据转化为更精确的共有序列，具有减少的数据处理。在相对于采用荧光团检测的系统的明显优势中，该方面的系统利用聚合酶的读取长度的完整能力，而不受读取长度被光毒性缩短的阻碍。
单分子是单克隆群体的一种情况，其中群体为1。因此，关于单克隆DNA的想法通常也适用于单分子状态的情况。
图25描述和图示了一种装置和方法，单一DNA分子2507可借此通过纳米针生物传感器阵列2500进行测序。聚合酶2506可连接至传感器2501上。而后可利用例如压力诱导流动、电渗诱导流动和/或迁移或类似的方式，使具有缔合的引物的DNA样品进入具有连接有所述聚合酶的传感器的体积中。来自DNA样品的单一分子2507随后被连接至传感器阵列2500中的传感器2501上的聚合酶结合。额外的单一DNA分子2507也可被结合至传感器阵列2500中的传感器2501上的其他聚合酶2506结合。
在一个实施方案中，四种天然dNTP之一2502随后流入具有传感器的通道体积2504中。如果dNTP与样品DNA2507中的下一个碱基是互补的，则可被结合并掺入。而后纳米针传感器2501可检测所导致的延伸引物DNA的局部电荷的变化，从而允许在传感器阵列2500的每个适当位置检测掺入事件。如果样品具有与已经引入具有所述传感器2501的通道体积2504内的dNTP2502类型互补的多于一个连续碱基，则dNTP2502的第二或随后的结合和掺入可通过所述纳米针传感器2501来检测。而后可从含有传感器2501的通道体积2504中洗掉dNTP2502。
在某些实施方案中，四种天然dNTP之一随后流入具有传感器的体积中。如果dNTP与样品DNA中的下一个碱基是互补的，则被结合并掺入。而后纳米针传感器可检测所导致的局部电荷的变化，这可能是延伸的引物DNA的电荷变化的结果，或者可能是其他电荷变化的结果，从而允许在传感器阵列的每个适当位置检测掺入事件。如果样品具有与已经引入具有所述传感器的体积内的dNTP类型互补的多于一个连续碱基，则dNTP的第二或随后的结合和掺入可通过所述纳米针传感器来检测。而后可从含有传感器的体积中洗掉dNTP。
不同的dNTP随后可流入传感器阵列体积，从而允许检测掺入事件。随后的洗涤、每次一个引入四种dNTP之一和掺入事件检测的循环，允许确定不同的样品DNA序列。
在又一个实施方案中，可同时递送多达四种不同的核苷酸，并且可以通过观测与掺入反应相关的动力学来确定掺入了哪种核苷酸。
在备选的实施方案中，样品DNA可结合至聚合酶、传感器或传感器之间的区域中的一种上，其紧邻(in immediate proximity to)传感器使得被结合的聚合酶在已将引物引入系统并允许与样品DNA杂交之后可结合样品DNA。随后，在完成引物延伸和样品DNA序列的相关测定之后，可通过改变样品DNA在其中溶剂化的溶液的温度或pH或溶液的温度和pH两者来使延伸的引物解链。而后可通过重新引入引物并将样品DNA在其中溶剂化的溶液的温度或pH恢复至适合引物延伸的条件(包括合适的核苷酸和阳离子浓度)来对样品进行重新测序。
在一些实施方案中，核苷酸可以是天然dNTP。在其他实施方案中，可利用改变电荷的结构对dNTP进行修饰。改变电荷的结构可与多磷酸缔合、结合和偶联，随后作为掺入过程的一部分进行切割，从而避免了对用于切割、分离或去除改变电荷的结构的单独过程的需求。
在备选的实施方案中，改变电荷的结构为终止子，并因此与dNTP的糖的3’位置缔合、结合或偶联，并且因此可充当终止子。检测可作为掺入过程的结果而发生，或者可由改变电荷的结构的切割引起。
在其他实施方案中，改变电荷的结构可与dNTP糖的2’或4’位置缔合、结合或偶联。在更进一步的实施方案中，改变电荷的结构可与核苷酸的碱基缔合、结合或偶联。改变电荷的结构可充当终止子，从而防止额外的dNTP的掺入。
连接、缔合或偶联可由于物理过程如温度变化而被破坏，或可由于化学过程而被破坏，或可由于光化学反应而被破坏。连接、缔合或偶联可在每个核苷酸掺入之后被破坏，或者可掺入几个核苷酸，并且可以通过测定由于所述掺入而增加的电荷的量来确定掺入的核苷酸的数量。
在进一步的实施方案中，每次使用两种或三种核苷酸，从而允许每次加入多个碱基和相应的大信号。在完成引物延伸和相关数据收集之后，将延伸的引物解链，加入新的引物，并且可使用不同顺序的dNTP组合再次进行延伸过程。该过程确定了哪些dNTP没有跟在前一组dNTP完成之后，以及关于掺入长度的信息，其中所述长度确定不必是精确的。
为了允许重复测定相同的DNA样品，可将DNA样品环化，同时聚合酶可以是链置换聚合酶，或者可以是具有5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶。因此可通过使引物延伸反应围绕环状DNA样品继续进行多个循环来对DNA样品进行重复测序。在相对于采用荧光团检测的系统的明显优势中，在本发明某些实施方案中的系统可采用聚合酶的读取长度的完整能力，而不受读取长度被光毒性缩短的阻碍。在一些实施方案中，可使用链置换酶，因此导致电荷和相关的反荷离子的增加。在其他实施方案中，可使用具有5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶，从而使静电荷保持不变，同时产生质子和/或氢氧根离子，其可根据电导率的增加进行测量，或者可作为离子与ISFET、ChemFET或纳米桥传感器表面的相互作用的结果进行测量。
与传感器结合或关联的聚合酶可以是高度持续性的聚合酶，其比持续性较低的聚合酶允许掺入更多的碱基。该聚合酶可以是phi29、RepliPHI、
Figure BDA0000462836930000301
T4(大肠杆菌T4)、F-530、B104或其他高度持续性的聚合酶。可对聚合酶进行修饰，使其具有降低的或没有3’至5’外切核酸酶活性，或者该聚合酶的天然形式可能不具有或几乎没有3’至5’外切核酸酶活性。同样，可对任何5’至3’外切核酸酶活性进行修饰以使其降低或几乎消除。可使用热稳定的聚合酶或其他类型的DNA或RNA聚合酶，如：Vent(Tli/附岸热球菌(Thermoccus Literalis))、Vent exo-、Deep Vent、Deep Vent exo-、Taq(水生栖热菌(Thermus aquaticus))、热启动Taq、热启动Ex Taq、热启动LA Taq、DreamTaqTM、TopTaq、RedTaq、Taqurate、NovaTaqTM、SuperTaqTM、Stoffel片段、DiscoveraseTMdHPLC、9°Nm、
Figure BDA0000462836930000302
LongAmp Taq、LongAmp热启动Taq、OneTaq、Crimson Taq、Hemo KlenTaq、KlenTaq、Phire热启动II、DyNAzymeI、DyNAzyme II、M-MulV Reverse Transcript、Tth(嗜热栖热菌(Thermos termophilus)HB-8)、Tfl、AmlithermTM、芽孢杆菌DNA、DisplaceAceTM、Pfu(激烈火球菌(Pyrococcus furiosus))、PfuPfunds、ReproFast、PyroBestTM、VeraSeq、Mako、Manta、Pwo(沃氏火球菌(pyrococcus,woesei))、ExactRun、KOD(thermococcuskodakkaraensis)、Pfx、ReproHot、Sac(嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius))、Sso(硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus))、Tru(红栖热菌(Thermus ruber))、Pfx50TM(速生热球菌属(Thermococcuszilligi))、AccuPrimeTMGC-Rich(Pyrolobus fumarius)、火球菌GB-D、Tfi(丝状栖热菌(Thermus filiformis))、Tfi exo-、ThermalAceTM、Tac(嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum))、(Mth嗜热自养甲烷杆菌(M.thermoautotrophicum))、Pab(深海火球菌(Pyrococcus abyssi))、Pho(Pyrococcus horikosihi)、B103(Picovirinae噬菌体B103)、Bst(嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus))、Bst大片段、Bst2.0、Bst2.0WarmStart、Bsu、TherminatorTM、TherminatorTMII、TherminatorTMIII、TherminatorTMγ、T7DNA、大肠杆菌聚合酶I、Kenow(大肠杆菌)片段、Klenow片段exo-、T4DNA、硫化叶菌DNA聚合酶IV、AMV逆转录酶、人聚合酶mu、人聚合酶mu-h6、DNA聚合酶I(大肠杆菌)、T7RNA(大肠杆菌T7)、SP6(大肠杆菌SP6)RNA、大肠杆菌Poly(A)、Poly(U)、T3RNA。
聚合酶和/或DNA可直接结合至传感器上或其附近，或者可以通过连接体结合。
在一些实施方案中，如通过引用并入本文的US7,270,981中所述的重组酶聚合酶扩增的变体用于测序。在一些实施方案中，扩增的DNA模板可以是双链的，并且输入引物可与重组酶如RecA或RAD51复合。所述复合的引物可结合至双链DNA上，并且借助于重组酶，可置换所述双链DNA的两条链的一部分。而后聚合酶可结合至引物的适当末端，使得所述聚合酶能够掺入核酸碱基并延伸所述引物。可加入单链结合蛋白，其结合至不与引物杂交的双链DNA的链上。因此，可存在大量反荷离子用于感测，借此所述反荷离子可与DNA的新合成的链缔合，并且额外的反荷离子可与所述单链结合蛋白缔合。额外的优势为由于使用单链DNA模板产生的二级结构所导致的问题减少。
无腔室反应器和虚拟反应器
在其他方面，本发明提供了一种用于对多核苷酸进行测序的无腔室装置。该装置包含电磁传感器，用于在电磁传感器上或其附近携带或保持模板多核苷酸的磁性载体，和用于通过液体流动和/或电磁去除来去除磁性载体的机构。在某些实施方案中，电磁传感器是纳米针或纳米桥之一，并且该装置进一步包含局部放大器。电磁传感器可具有狭窄的结构，并且可在该结构下被蚀刻，以使得传感器表面的两侧易于获得pH的变化或电导率的变化。
在一些实施方案中，该系统采用如题为“Magnetic Arrays forEmulsion-Free Polynucleotide Amplification and Sequencing”的美国临时申请61/389,484中所述的磁阵列，该申请通过引用整体并入本文。该系统在图5中概略地示出。
图5描绘了纳米针阵列中的单一元件500和磁体516，其中基质504在所述基质504上和珠粒502下可具有电极506，或在所述电极506和所述基质之间的间距或粘附层(未示出)上具有电极506。所述电极502因此可位于珠粒的德拜层内。介电层508可位于所述基质504的上方，并且还可覆盖所述电极506的一部分，并且可进一步具有凹槽或开孔(cutout)，该凹槽或开孔可大于当将所述珠粒502保持就位时所述珠粒502所需的间距。所述电介质可发挥多种功能，包括提供一个表面，磁力可相对于该表面拉动所述珠粒502的表面。由磁体516和所述珠粒502的相互作用产生的磁力用于保持和定位所述珠粒502，对所述电极502并对电介质508向下施加一个力。电介质512的第二层可应用于所述电介质508，提供试剂对于所述珠粒502的重要的接近，同时进一步扩展介电材料的总厚度的高度，以使得可在电介质512的所述第二层上制造上部电极514。可定位所述上部电极514、电介质和第二电介质512，使得所述上部电极可处于所述珠粒的德拜长度内，并且可进一步接近于所述珠粒502的中点。所述上部电极514可在所述珠粒502的中心线上方，特别是如果所述上部电极514处于所述珠粒502的德拜长度内时，或者可以在所述珠粒502的中心线下方，以使得所述上部电极514的顶部与所述珠粒以与所述珠粒502和所述电极506之间的接触点的垂线成10-90度的角度进行接触。与所述珠粒502和所述上部电极顶部之间的接触点的垂线的所述角度可以为30-85度、45-80度或60-75度。所述磁体516可嵌入所述基质504中，位于所述基质504上方或位于电介质508上方，但应当位于所述珠粒502的中心线下方，以便对所述珠粒502施加下向力，从而朝所述电极506向下牵拉所述珠粒502。当所述珠粒位于阵列中的适当位置时，所述磁体516应进一步相对于珠粒502的中心偏移放置，以便朝所述上部电极牵拉所述珠粒502，从而使得所述珠粒502进入所述珠粒502至所述上部电极514的德拜长度内。纳米针阵列中的单一元件500的每个元件和磁体516可在所述元件之间具有额外的间隔层或粘附层。所述德拜长度可包括可由高浓度盐、低浓度盐、去离子水或与在水中可混溶的非水流体共混合的水溶液造成的德拜长度。
图2是根据本文所述的多个实施方案的组合虚拟孔和磁阵列的显微照片。所述阵列中的大多数位置具有单一珠粒，其位置在定位有虚拟孔结构的点处的磁体之间。一些位置具有超过一个珠粒。磁体的大多数末端也有珠粒位于其上。
磁阵列可以用与US7,682,837中所述的方式相似的方式来使用，该专利通过引用整体并入本文。
如本文所用的“珠粒”意指为球形或非球形的珠粒、部分或粒子，其中所述珠粒、部分或粒子为多孔的或实心的或实心和多孔的混合，并且可包括可能为顺磁性、超顺磁性、反磁性或铁磁性的磁珠。
如本文所用的“珠粒捕获特征”意指这样一些特征，它们可以将单一珠粒相对于传感器暂时地保持在固定位置，并且可以包括在基质上的局部磁性结构，可以包括外磁体、局部磁牲结构、范德瓦尔斯力或重力作为固定珠粒位置的力的凹陷。可通过共价或非共价结合将珠粒结合就位。
如本文所用的“限制”是指当在一个珠粒或粒子处产生的分子(例如DNA)保持与同一珠粒或粒子缔合，从而基本上维持这些珠粒或粒子的克隆性质时的情况。
如本文所用的“分离”意指必要时防止从一个虚拟孔迁移、扩散、流动或以其他方式运动到另一个虚拟孔，以维持这些珠粒或粒子的克隆性质。
如本文所用的“局部化磁性特征”意指在基本上呈平面的基质上产生的、用以将单独的珠粒保持在所述基本上呈平面的基质上的磁性特征。
如本文所用的“局部化磁场”意指基本上存在于第一磁性区域的北极与第二磁性区域的南极之间的体积中或者基本上存在于单一磁性区域的北极与南极之间的体积中的磁场。
如本文所用的“粒子”意指非珠粒部分，例如分子、分子的聚集体、与固体粒子结合的分子，或粒子，以及本领域中已知的其他形式。
如本文所用的“单相液体”是整体具有相对均一的物理特性(包括如密度、折射率、比重等特性)的液体，并且可以包括水溶液、可混溶的水性和有机混合物，但不包括不可混溶的液体，例如油和水。在被认为不会潜在地使液体被视作不是单相液体的物理特性中包括pH、电荷密度以及离子浓度或温度的局部变化。
如本文所用的“基本上呈平面”应当允许小基座、凸起段、孔洞、凹陷，或相对于器件的局部平面不超过40μm的不平度。因翘曲、扭转、深拉或其他平面变形所致的变化通常不被视为构成所允许的偏差的一部分。对于在此描述的用途可能并非是必要的、但超过40μm的突起或凹陷不会妨碍到将器件视作是基本上呈平面的。具有大于40μm尺寸的流体通道和/或用以产生所述流体通道的结构也不会妨碍到将器件视作是基本上呈平面的。
如本文所用的“虚拟孔”是指局部电场或局部磁场限制区，其中感兴趣的种类或种类组，典型地为DNA或珠粒，在所期望的反应或相互作用必需的一段时间期间通常不会迁移到相邻的“虚拟孔”中。
如本文所用的“电极”被定义为用于在这样的阵列中产生或应用电力或磁力对的任何结构。这样的结构可用于由打开和关闭场或力所产生的、在感兴趣的时间将生物分子向阵列中的特定区域(例如，限制阵列或分离阵列中的元件的中部区域)递送中的分离或操作。
在本文公开的装置的实施方案中，该装置包含用于感测核苷酸掺入的感测表面，该感测表面包含氮化硅层。
在本文公开的装置的实施方案中，将多个磁珠配置为用于携带模板多核苷酸，其中这些磁珠在对于核苷酸掺入有效的pH水平下具有低ζ电势。
虚拟纳米反应器或“无腔室阵列”可检测或操纵阵列中的粒子(例如，珠粒、细胞、DNA、RNA、蛋白质、配体、生物分子、其他微粒状部分或它们的组合)，其中所述阵列通过电力、磁力或电磁力捕获、保持、限制、分离或移动粒子，并且可用于反应和/或粒子的检测和/或涉及所述粒子的反应。所述“虚拟纳米反应器”提供了一种用于捕获/保持/操纵珠粒、细胞、其他生物分子或它们的载体的强大工具，并且随后可集中、限制或分离该阵列中与使用电力、磁力或电磁力的所述阵列中的其他像素或区域不同的像素或区域中的部分。在一个实施方案中，阵列处于流体环境中。可通过测量电荷、pH、电流、电压、热量、光学或其他方法来进行感测。
在某些实施方案中，本文所述的无腔室装置允许在测序反应过程中更好地洗涤核苷酸，可通过降低剩余核苷酸的数量来降低前导测序相位误差，该剩余核苷酸可包括随后可被不恰当地掺入不正确的循环中的未结合和非特异性结合的核苷酸。
除了DNA测序，还设想了使用“无腔室”阵列或“虚拟”纳米反应器的各种不同的分子生物学应用。该阵列可用作一种工具，例如，用作细胞分选仪，并且随后该阵列还可以对所述细胞进行分子生物学，这可包括分选、对一种或多种感兴趣的生物化学事件或反应的测定或操纵(例如，药物筛选或生物分子检测)。虚拟纳米反应器阵列可用于细胞监测和分析，例如，该系统可测量细胞的电学特征，其中所述细胞被捕获至阵列中和/或邻近与虚拟纳米反应器相关联的传感元件。该阵列可用于筛选稀有细胞，例如，用于检测药物筛选中的反应以用于药物开发，或用于选择和检测癌细胞。在许多实施方案中，测定或检测目标包括细胞生物学、药物筛选和特定细胞类型的监测，DNA、RNA(核酸)、蛋白质、带电小分子、配体或其他生物分子的检测。
在其他实施方案中，另一电极(或虚拟壁/围栏)元件可包括阵列中的另外两个与每个电气限制或分离元件相关联的电极。
在一些实施方案中，该系统用于在每个像素中捕获多个珠粒或细胞，并且可在期望的时间或响应于对于不同应用可能需要的“虚拟壁”阵列中与所述元件相关联的传感器处的变化而打开、关闭或改变电磁场的大小、形状或周期。例如，该系统可捕获一组珠粒或细胞，并且随后增加场强以捕获较少受到所述场影响的另一部分。电场可以是DC或AC或所述场的不同组合的组合。
图3是由Comsol模拟得到的图示，描绘了由施加于电极304A和304B的场得到的、圆柱形结构300的四分之一的3D等电位场强度曲线306。由于场基本上是径向不对称的，场梯度最集中的体积308靠近中心电极304B，在这个点上珠粒可被如图2所示的磁阵列保持。
在其他实施方案中，虚拟纳米反应器用于生物分子过程中的多个步骤和/或与之组合，例如，在电场中移动的粒子的珠粒富集，微流体样品制备和文库制备，如DNA的芯片上提取、DNA的剪切、DNA浓度的芯片上标准化、无乳液扩增、传感，其可包括利用双传感或多传感测序检测器的SensePlus传感，其可利用瞬态和/或稳态电子测序和重新定相方法来扩大测序过程的读取长度，其中所述多个步骤可导致完全集成的电子基因组分析仪系统。
在一些实施方案中，使用虚拟纳米反应器的多个阵列。虚拟纳米反应器的不同阵列可用于不同的生物反应、过程或方法。在一些实施方案中，一个阵列或一组阵列用于DNA的提取，其中所述阵列组中的不同阵列或一组中的不同成员可保留来自不同样品的细胞，或者可保留来自单一样品的不同类型的细胞，或其组合。例如，不同的样品可保持在不同的阵列中，并且来自单一样品肿瘤的不同类型的癌细胞可保留在单一阵列的不同区域中。可分选或隔离不同的细胞类型，或者可在捕获所述细胞并将其保留在虚拟纳米反应器的所述阵列上的单独位置之后，由来源于单独的细胞的数据来确定细胞类型。
在一些实施方案中，可对单一样品或部分进行几种生物反应、过程或方法，同时将其保持在虚拟纳米反应器内的适当位置。在其他实施方案中，可在将所述样品或部分转移或移动至另一虚拟纳米反应器阵列中的另一位置之前，对虚拟纳米反应器阵列的位置中的样品或部分进行一种或多种生物反应、过程或方法。
在一些实施方案中，出于本文其他地方针对核酸测序和扩增所述的除核酸捕获/分离之外的目的，使用电集中和限制虚拟纳米反应器的阵列。在一些实施方案中，电集中和限制与任何带电部分一起使用，其中时间期限、部分的集中、移动性、浓度、局部粘度、局部聚合物的交联百分比或带电部分的集中影响电限制结构的间距和/或所使用的场强和/或场梯度大小，以便维持单独的虚拟纳米反应器内的充分限制。不同虚拟纳米反应器之间的、可容忍的交叉污染水平对于不同应用以及在生物反应、过程或方法中的不同步骤可以是不同的。例如，如果核酸扩增反应过程在相邻虚拟纳米反应器中对不同样品进行，则交叉污染在PCR反应的早期热循环过程中可能成为问题，而PCR反应的后期循环过程中的交叉污染可能不会受到特别关注，因为引物可被大量消耗，从而防止了来自其他虚拟纳米反应器的交叉污染核苷酸的显著扩增。
在一些实施方案中，利用聚合物降低核苷酸或其他部分的迁移率。例如，聚合物可以是部分缠结的聚合物如POP-7TM或琼脂糖、聚丙烯酰胺或淀粉凝胶。浓度和/或交联百分比可根据需要针对期望在虚拟纳米反应器中进行限制的不同部分的不同迁移率而改变。可在引入所述生物反应、过程或方法中使用的样品部分或其他部分之前、同时或之后将聚合物引入虚拟纳米反应器的体积中。
在一些实施方案中，利用电集中和限制来捕获已结合有其他生物分子或生物部分的部分，例如，可以结合抗体的具有电荷的珠粒，并且其中所述珠粒随后可用于捕获蛋白质，并且其中随后可进一步使用电集中和限制阵列来捕获所述珠粒。
在一些实施方案中，虚拟纳米反应器可用于除测序之外的几种不同的应用，例如，所述虚拟纳米反应器可用作杂交阵列(类似于Affy或Agilent DNA微阵列)，其中DNA在珠粒上，并且通过虚拟纳米反应器将所述珠粒保持在适当的位置。在其他实施方案中，虚拟纳米反应器用于数字PCR，其中将所述珠粒引入阵列中。可利用与阵列的每个元件相关联的电子传感器阵列进行检测，或检测可采用光学手段，以检测特定核酸的存在或量。数字PCR可用于以相对的方式来量化样品内的靶标的浓度。
在一些实施方案中，如本文所述将样品集中于虚拟纳米反应器中允许更高灵敏度的定量。在一些实施方案中，在阵列的一些区域中而不在其他区域中使用集中可允许更高浓度定量动态范围。在进一步的实施方案中，可使DC集中场反转以便将样品部分部分地“推”离所述虚拟纳米反应器。在一些实施方案中，集中、无集中和推动样品部分进入不同区域的组合可帮助进一步扩大数字PCR或任何其他期望的生物反应、过程或方法的动态范围。可将具有不同引物的珠粒引入如本文所述的虚拟纳米反应器阵列的不同区域中，这允许对几种靶标同时进行数字PCR反应。
在一些实施方案中，虚拟纳米孔用于结合至与所述珠粒偶联的引物上的DNA的完全延伸反应。在进一步的实施方案中，所述虚拟纳米反应器可用于连接反应检测。
在一些实施方案中，所述系统可使用电磁体、永磁体或电极或其他不同的子系统来产生电磁场，用于短暂的或部分时间的分离，或保持或集中生物分子或其他感兴趣的部分(例如DNA、细胞、蛋白质)或生物分子或其他感兴趣的部分的载体(例如珠粒、粒子或其他部分)。所述电磁场可以是磁场、电场或两者的组合。所述电场可以是DC场、AC场、脉冲DC场、非正弦AC场、脉冲AC场或它们的组合。具有虚拟壁(或围栏)的纳米反应器可与电场或磁场一同使用或创建，以保持、捕获、集中、分离或操纵生物分子或其载体。
在采用两组或更多组电极结构的一些实施方案中，可打开或关闭虚拟壁或分离壁或围栏，或在期望的时间对电磁场的大小、形状或周期进行修改，其可以是固定的时间，或者可以响应于与电极结构阵列的特定成员相关联的传感器的变化。打开或关闭或对电磁场的大小、形状或周期进行修改可用于控制在电极结构阵列中集中的、限制的或分离的粒子、珠粒、细胞、生物分子或其他感兴趣的部分的移动，或用于控制可在反应中使用的生物分子或其他感兴趣的部分，如蛋白质检测中的抗原或第二抗体，或DNA或RNA测序中的核苷酸，或细胞相互作用中的次级细胞，或药物筛选和监测中的药物或细胞。该特征可用于提供容易的获取和灵活的操作和/或混合。
在一些实施方案中，虚拟纳米反应器阵列将输入到系统中的DNA的量和/或浓度归一化，并且可产生对进入的反馈和/或控制，而后其可用于控制所述DNA或输入到本文所述的系统中的其他生物分子或其他部分的量和/或浓度。该系统可进一步用于检测或测序阵列的实时归一化的目的。
可对用于通过磁或电磁或电捕获和/或保持而捕获(分离、限制或集中)珠粒或细胞或其他生物分子、粒子或其他感兴趣的部分的阵列进行结构化，以使其针对每个阵列元件包含两组“捕获元件”(如本文其他地方所述的磁阵列的GENIUS棒或元件)，从而允许用一组捕获元件捕获(分离、限制或集中)一个部分，并且随后捕获(分离、限制或集中)感兴趣的第二部分。所述捕获可以不同的顺序并利用不同的结构进行，并且每个阵列元件可包括两组以上的捕获元件，并且相应地，可在每个阵列元件处进行额外的捕获步骤。
在一些实施方案中，电集中和限制阵列可用于捕获已结合有B细胞的带电珠粒，例如携带蛋白质、多糖或其他免疫原的磁珠，并且其中珠粒随后可用于捕获B细胞。随后可使用所述电集中和限制阵列来捕获带电珠粒。在一些实施方案中，电集中和限制阵列用于捕获可与蛋白质、多糖或其他免疫原结合的B细胞。
在一些实施方案中，电集中和限制阵列用于捕获已结合有其他碳水化合物或糖脂的带电珠粒，例如，可结合包含碳水化合物结合模块的蛋白质或肽的带电珠粒。带电珠粒随后可用于捕获碳水化合物或糖脂，并且其中随后可使用所述电集中和限制阵列进一步捕获带电珠粒。这样的碳水化合物或糖脂结合部分可包含碳水化合物活性酶，如糖苷水解酶、凝集素、半乳凝素、内凝集素、穿透素、选择蛋白、黏附素(adhesion)或透明质酸。
在一些实施方案中，该阵列用于化学筛选应用，并且可利用该系统测试或监测或测定非生物分子。例如，在其中需要测定药物效应的药物筛选的用途中，该系统可采用，例如，约100、1000、10,000或1,000,000种不同的候选药物，每种均在其自己的珠粒上，其中所述珠粒可被捕获并保持在“虚拟纳米反应器”阵列中。该系统随后可允许珠粒与感兴趣的细胞或一组细胞之间的相互作用或对相互作用的测定，其中电限制用于阵列中像素的分离，提供高通量和快速的药物筛选系统。
在一些实施方案中，电集中和限制阵列用于捕获已经结合有多种不同类型的生物分子的一组组合的带电珠粒。这组组合的带电珠粒可包含结合有不同类型的生物分子或生物部分的多组带电珠粒。这可以是可结合一组带电珠粒上的一种生物分子或生物部分的一种类型的结合部分，和可结合一组不同珠粒上的不同生物分子或生物部分的不同类型的结合部分。所述组合的带电珠粒组还可包含多组带电珠粒，其中该组带电珠粒可包含结合有多种结合部分的带电珠粒。
在进一步的实施方案中，所述组合的珠粒组可进一步包含标记物，其中该标记物在不同组珠粒之间进行区分。所述标记物可以是光学标记物如荧光染料、生物化学标记物如DNA、金属粒子标记物、任何其他类型的标记物，或不同类型的标记物的组合。所述标记物可用于确定哪种类型的珠粒可以在阵列的电集中和限制特征的每个元件上。
在一些实施方案中，可作为所述珠粒的检测的结果来观察珠粒的不同检测方法和由各种生物分子反应引起的相互作用。所述检测可作为以下传感器的结果来实现：纳米针传感器、纳米桥传感器、ChemFET传感器、ISFET检测器、光学传感器如荧光检测器、SERS检测器、吸收检测器、PH检测器、电导检测器、质量共振检测器、量热计检测器，或适合于检测生物分子反应或其他类型反应的任何其他类型的检测器。在一些实施方案中，所述传感器可在具有电集中和限制特征的阵列中的每个位置进行组合。
在一些实施方案中，电集中和限制用于直接捕获带电部分，其中所述带电部分结合至其他生物分子或生物部分。例如，可以集中或限制抗体或结合至蛋白质的抗体，其中所述抗体或结合至蛋白质的抗体随后可用于捕获蛋白质或其他的抗体。
在一些实施方案中，“虚拟纳米反应器”阵列通过集中感兴趣的生物分子如DNA、RNA或用于更高效合成的其他反应物或试剂来提高反应速率。
在一些实施方案中，期望集成阀调系统作为流动池的一部分。所述阀调系统能够使样品流至流动池的部分，以使得不同样品可用于所述流动池的不同部分。在其他实施方案中，邻近流动池集成阀调系统，由此阀调系统和流动池可彼此形成密封界面。在其他实施方案中，所述阀调系统和所述流动池可在单一底座(mount)上彼此邻近，其中所述阀调系统和所述流动池可安装至所述底座上。所述阀调系统还可包含排污阀，使得流体可在流入所述流动池的所述部分之前从所述阀调系统中去除。例如，如果在所述阀调系统中存在显著的死体积，则可能需要去除与前面的流体可能有不可接受水平的交叉污染的流体。
在一些实施方案中，可能期望集成阀调装置和流动池。这种阀调配置可包括多种输入，其可包括四种dNTP(例如，用于测序反应)的输入，其还可包含缓冲液、盐、酶和核苷酸掺入需要的任何其他部分。也可采用以下试剂的输入：多种缓冲液和洗涤试剂，含有聚合酶的缓冲液(其还可含有盐和聚合所需的任何其他部分)，从流动池上剥去任何涂料所需的试剂，重新涂覆流动池可能需要的试剂，还包括磷酸酶的缓冲液，或其他试剂。
在一个实施方案中，阀调装置是由PDMS制造的。在另一个实施方案中，阀调装置是由玻璃制造的，具有磁力或气动激活的弹性体阀。
在一些实施方案中，可能期望将所述阀调和流体PDMS歧管结合至硅器件上。可能期望增加所述PDMS与所述硅器件之间的结合强度。
在本发明的一个实施方案中，可能期望使用等离子体激活的PDMS来改善结合强度。因为具有太大功率或太大压力的等离子体处理实际上可降低PDMS与硅的结合强度，所以使用较低的功率水平和压力可能是重要的。Tang等人在2006J.Phys.:Conf.Ser.34155中描述了合适的功率和压力水平。在一个实施方案中，合适的是使用500毫托(mili Torr)至30毫托的压力和10-60瓦特的功率水平，同时使用，例如，790系列Plasma-Therm。
对于由PDMS或其他类似材料制造的装置，可以使用压力阀来控制试剂的流动。利用这类阀，有可能使数个阀彼此非常靠近，并且这些阀可能非常接近中央通道，从而减少了死体积，如图4A中所示，该图示出了具有三个试剂输入线402和阀406的试剂阀系统400，每一个试剂输入线可配置为在压力控制线404的控制下流向流动池408的输入端。
对于其中需要更多的试剂输入的更复杂的系统，图4A的简单的阀系统400是不够的，因为其仅具有三个试剂输入线402。在如图4B和4C中所示的备选实施方案中，能够使用更多的输入。这种方法还允许清除通道的死体积。在图4B中，输入包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、缓冲液1、缓冲液2和样品的输入端口，废弃物1、废弃物2和废弃物3的输出端口。控制线位于每个输入和输出端口的适当位置，具有额外的控制线来控制激活的端口之间的流动方向。废弃物端口紧接在流动池之前显示，以便可去除来自先前流动的任何剩余的试剂，从而允许从一种试剂到另一种试剂的非常干净的过渡，而没有从阀调系统中的任何死体积的扩散。图4C描绘了具有椭圆形流动路径的阀调系统，使得所有输入阀端口位置具有从所述输入阀端口位置以两个方向通至出口(废弃物)端口的路径。在图4A中示出的阀可用于图4B、图4C中所示的每种阀或用于图4D中所示的试剂阀调系统430的物理实施方案中，其中示出了PDMS阀系统440的照片。
一个实施方案允许清除每个输入线直到每个输入端口控制阀的空气或其他污染，以便当每个输入端口激活时，可将合适的试剂引入该系统。例如，为了净化dATP线，可激活dATP控制线和废弃物1上方控制线，使dATP线中的空气和任何不期望的试剂流动通过dATP阀并流出废弃物1。在其他实施方案中，可通过分别激活dCTP控制线和废弃物1上方控制线、dTTP和废弃物1上方控制线以及dGTP控制线和废弃物1下方控制线来清理或清除dCTP、dTTP和dGTP线中的污染物。为了清除或去除来自样品线的污染物，可激活样品控制线和废弃物2控制线。
在更换测序组装件之后，可能需要从所有管线中清除或去除污染物。同样，在更换或再充填试剂瓶或容器之后可能需要从试剂线清除或去除污染物。一段时间未使用仪器则可能进一步需要清除或去除污染物，这可使得含有需要在低于环境温度下冷却的试剂的任何试剂线遭受退化；例如，含有聚合酶的试剂中的聚合酶可遭受长期暴露于环境温度。
在一些实施方案中，期望填充通向流动池的输入的歧管，以便可以去除先前使用该歧管剩余的任何试剂。例如，在将dATP引入流动池之前，可激活dATP控制线、上方液体控制线和废弃物2控制线。而后dATP试剂将从dATP输入线开始、围绕上方液体回路的两侧、通过上方液体区与下方液体区之间的通道流动，并通过废弃物2阀流出进入废弃物2线。或者，在将dCTP引入流动池之前，可激活dCTP控制线、上方液体控制线和废弃物2控制线。而后dCTP试剂将从dCTP输入线开始、围绕上方液体回路的两侧、通过上方液体区与下方液体区之间的通道流动，并通过废弃物2阀流出进入废弃物2线。同样，在将dTTP引入流动池之前，可激活dTTP控制线、下方液体控制线和废弃物2控制线。而后dTTP试剂将从dTTP输入线开始、围绕下方液体回路的两侧、通过下方液体区与下方液体区之间的通道流动，并通过废弃物2阀流出进入废弃物2线。同样，在将dGTP引入流动池之前，可激活dGTP控制线、下方液体控制线和废弃物2控制线。而后dGTP试剂将从dGTP输入线开始、围绕下方液体回路的两侧、通过下方液体区与下方液体区之间的通道流动，并通过废弃物2阀流出进入废弃物2线。
可通过激活B1C控制线和W3C控制线，使缓冲液1流动通过主流动池(深蓝色)，并流出废弃物3端口。或者，可通过激活B1C控制线和W2C控制线，使缓冲液1流出废弃物2端口。在另一个备选用途中，可通过激活缓冲液1控制线、上方液体控制线和废弃物1上方控制线，使缓冲液1通过液体歧管的上方部分流出废弃物1线。同样，可通过激活缓冲液1控制线、下方液体控制线和废弃物1下方控制线，用缓冲液1冲洗下方液体歧管。按时间顺序激活或一起激活在这些区域组合中的流动能够使整个液体歧管的净化成为清除气泡、其他污染物，或作为可能已经由dATP、dTTP、dCTP、dGTP、缓冲液2或样品输入端口引入系统中的任何其他液体的洗涤或清除。
在一些实施方案中，需要在比热生长二氧化硅具有更高结合强度的硅器件上使用钝化层。Tang等人描述了提供提高的结合强度的几种钝化层，包括PSG(PECVD磷硅酸盐玻璃)、USG(PECVD未掺杂的硅玻璃)、Si3N4(LPCVD氮化硅)。
在一些使用PDMS阀调歧管的系统中，使用插入PDMS中的销钉或针来将试剂线连接至阀调歧管上。虽然这提供了牢固的连接，但是将许多试剂线连接至PDMS阀调歧管上是耗时且容易出错的。因此，在一些实施方案中，可能需要使用接口歧管，其中试剂线连接至接口歧管上，而不是连接至阀调歧管上，并且接口歧管可连接至阀调歧管上。试剂线可附接至销钉或针上，该销钉或针可附接至接口歧管上。销钉或针可永久附接在接口歧管上，用粘合剂、通过焊接或钎焊、通过利用压入配合或通过一些其他手段固定就位。或者，管线可直接连接至接口歧管，可通过配件或O形环或通过本领域已知的一些其他手段将它们保持在接口歧管上。
在一些实施方案中，接口歧管可密封地接合至阀调歧管，使得试剂可从接口块流入阀调歧管。接口歧管与阀调歧管之间的接口可以是由用户使用以便能够更换芯片/流动池和/或阀调歧管的接口。
在一些实施方案中，接口歧管可具有通过粘合形成的内部通道，这种粘合可包括熔融粘结、溶剂粘结或粘合剂粘合。
在一些实施方案中，由于几个原因，使通往流动池的有源部分的路径长度最小化可能是重要的，包括使试剂的混合量最小化，这由于壁的相互作用以及扩散引起的通道中心处流速与通道边缘处流速的差异而发生。在一些实施方案中，可能还需要使不受温度控制的体积最小化，以便防止试剂如聚合酶在不受温度控制的体积中的降解。在一些实施方案中，可能理想的是使管道体积最小化以同时使试剂的交叉污染最小化，由于与接触所述试剂的材料的非特异性结合，所述试剂的交叉污染也可能在多种试剂共同的流动区域中发生。
图1图示了本发明的一个实施方案的示意图，其中通过磁阵列将磁珠或顺磁珠在传感区域上固定就位。该磁阵列在题为“MagneticArrays for Emulsion-Free Polynucleotide Amplification and Sequencing”的美国临时申请61/389,484中描述，该申请通过引用整体并入本文。保留的磁珠或顺磁珠可具有DNA的单克隆群体。可以设置珠粒的大小以使得存在每个传感器上只有一个珠粒的充分空间，因此提供传感器与珠粒之间的一一对应。虽然可能存在每个传感器上仅有一个珠粒的空间，但当珠粒在珠粒上对齐时珠粒之间可能存在空间，从而导致传感器之间的串扰减少。例如，一组珠粒的直径可以是约10微米，位于横跨约8微米的传感器上(over sensors which are about8micronsacross)，并且传感器可间隔约15微米，从而在珠粒之间产生大约5微米的间距。如果空间不足以使两个珠粒保持在传感器上，则传感器的大小可大于珠粒。珠粒、传感器和间距的大小可以变化。在其他实施方案中，珠粒的大小可以大于10微米，如约15微米、约20微米、约25微米或更大。在进一步的实施方案中，珠粒可小于10微米，如约5微米、约3微米、约2微米、约1微米或小于1微米。传感器的大小可以设置为与珠粒的大小对齐，并因此大小可以跨越大于或小于8微米，可能跨越从小于1微米至约1、2、3、5、10、15、20或更多微米。传感器之间的间距还可以大于15微米，或可以小于15微米；传感器间距可从传感器之间小于1微米至约1、2、3、5、10、15、20、25或更多微米。
如图1中所示的无腔室磁性保持结构可允许改善核苷酸、聚合酶和其他成分的流动，因为它们的流动不受孔结构的阻碍，如该图2中所示，从而允许更好地洗涤，碱基的更完整掺入，并且如果珠粒位于孔中则可能具有更快的循环时间。在孔结构中，如图2所示的珠粒和相缔合的DNA妨碍可及性和流动，从而可能需要较高浓度的聚合酶和核苷酸才能允许充分扩散至如图2中所示的珠粒的所有部分。由于所述聚合酶引起的错误掺入，所述较高浓度的dNTP和聚合酶可增加误差率，从而导致前导测序相位误差的水平高于使用如图1所示的无腔室结构可能发生的水平。
在一些实施方案中，本文所述的阵列是可重复使用的(例如，不是一次性使用)。测序成本具有多个部分；对于使用电子传感器的测序，主要成本之一是经加工的硅本身即传感器的成本。如果传感器不是可重复使用的，而是在一次使用后必须丢弃，可能尤其如此。以上所述的磁阵列使得重新使用相当简单，因为DNA不结合至传感器上，并且可以通过减少或去除将所述珠粒固定就位的磁场而容易地将珠粒去除。如果是用一种结构将珠粒固定就位，则去除可能会更加困难。
在一个实施方案中，通过结构或孔阵列将珠粒固定就位，并通过施加磁场来去除，使得珠粒(可以是磁珠或顺磁珠)被从孔中抽出，并随后通过使试剂通过流动池流动来从流动池中除去。
在一些实施方案中，磁特征的阵列用于除本文针对所述核酸的测序和扩增另外描述的核酸捕获/分离之外的用途。这些用途包括细胞(例如，癌症细胞，B-细胞)、蛋白质、糖蛋白、糖脂、抗体、糖或多糖和已经描述的其他部分的捕获。
在一些实施方案中，在将珠粒在磁阵列中保持就位的同时将结合到保留的珠粒上的相关细胞裂解。保留的珠粒可进一步包含用于对靶核苷酸序列进行扩增和/或测序的附加的引物或引物组。该引物可以是通用引物，或靶向至与结合至每个珠粒的细胞类型相关的特定序列的引物，或者可以是带有条码的通用引物或通用引物组。例如，条码与结合至每个珠粒的细胞类型相关，或者是不同的引物类型的组合。在一些实施方案中，细胞裂解后，可以进行逆转录和/或扩增反应。在一些实施方案中，所述扩增是实时PCR反应，其中可针对每个珠粒，并因此针对每种细胞类型来确定特定RNA的量。在其他实施方案中，扩增反应是PCR反应或等温反应，并且在所述珠粒上可以产生克隆群体，或者可以产生多克隆群体，其中每种克隆类型可以使用不同的引物。在其他实施方案中，随后进行合成测序反应，以确定与每种珠粒类型相关的，并因此与每种细胞类型相关的扩增序列的序列。
在进一步的实施方案中，细胞裂解后，可以保留DNA、RNA或具有特定电荷的其他分子，并且可以除去珠粒。在一些实施方案中，可向所述磁阵列中引入额外的珠粒。如本文所述，新引入的珠粒可以具有与新引入的珠粒相缔合的不同的引物类型。
在一些实施方案中，可以配置磁特征的阵列以使得通过磁性或顺磁性珠粒或粒子保持优选的位置。可能需要这样的优选位置以便相对于一个或多个传感器适当地定位粒子，和/或使粒子保持在固定位置，以使得粒子与附着在粒子上的电荷不会相对于所述一个或多个传感器而移动。在一些实施方案中，如图6所示，优选的位置可能至少部分地是由磁阵列元件的形状的配置导致的。图6图示了两种不同的配置600，其中可以配置阵列中的至少一些形状，以使得所述磁通量的密度更多地集中在磁阵列成员的一端(相对于磁阵列的一些其他成员的另一端)。在最上面的两对磁性元件中，左梯形磁阵列元件604的南极比所述梯形磁阵列元件的北极更狭窄。由于自磁阵列元件发出的总通量水平在两端必须是相同的，所以梯形磁阵列元件604的较狭窄端的通量密度将高于所述梯形磁阵列元件的较宽端。由于较高浓度的通量对应于施加到磁性或顺磁性元件上的较高的力，所以由所述梯形磁阵列元件604的较窄端在磁性或顺磁性粒子或珠粒602上施加的力将高于由右侧上类似大小的磁阵列元件606施加的力，其中在右侧上的磁阵列元件606上的元件具有类似的大小，但是矩形的，并因此具有较低的通量密度和力。同样，由梯形磁阵列元件604的较窄端在磁性或顺磁性粒子或珠粒602上施加的力将高于由右侧上类似大小的梯形磁阵列元件608施加的力，其中在右侧上的磁阵列元件608上的元件以其较宽端朝向磁性或顺磁性粒子或珠粒602。
在本发明的另一个实施方案中，附加特征可以作为磁阵列制造的一部分而引入，从而抑制如图7中所示的磁性或顺磁性粒子或珠粒702的移动。在所示的实施方案中，优先朝左侧梯形磁阵列元件704的窄端牵拉磁性或顺磁性粒子或珠粒702，并且拉至与两个支柱710接触，以及向下拉至与阵列表面接触，从而提供三个接触点，以充分地稳定所述磁性或顺磁性粒子或珠粒702。支柱和磁阵列元件可以提供最小的表面接触面积，以便允许离子、dNTP酶和其他部分的最大接近。支柱和磁阵列成员可相对于所述传感器元件以严格的公差定位，以便在传感器阵列的不同成员之间提供可再现的信号水平。
在进一步的实施方案中，使用小孔，以使得磁性或顺磁性粒子可停留在孔的上角。孔可以是圆形的，或者如果磁性或顺磁性结构的形状通常是球形的，则孔可以是圆形以外的一些形状，以便允许酶、dNTP、离子和其他部分更好地接近磁性或顺磁性粒子的底部。
在一些实施方案中，磁阵列用来产生用于杂交检测、杂交抽出(hybridization pullout)或测序的克隆群体。可以用磁阵列中发生扩增的位置上的珠粒来进行该试验，或可将珠粒从发生了扩增反应的区域或体积移至另一位置。所述第二位置也可以采用磁性固定化来进行该试验，或者可以采用不同的固定化，如生物素链霉亲和素结合。在一些实施方案中，传感器直接定位于磁性或顺磁性粒子下方，以使与珠粒和传感器上的DNA相关联的电荷之间的相互作用最大化。在其他实施方案中，珠粒可以以这种固定的且不能自由旋转的方式结合或缔合。可能需要偏离顺磁体的中心来定位传感器，从而允许接近如下的粒子区域，与直接与表面接触的、其中由于不能接近水性环境而可能使反应受到抑制的区域相比，该粒子区域允许自由接近水性环境并接近聚合酶、dNTP和其他部分，并且可以具有随后可通过传感器读取的最佳的酶反应。
在一些实施方案中，需要使用发生在通道中的差别流动来旋转磁性或顺磁性粒子，从而提供酶、dNTP和离子对所述磁性或顺磁性粒子的所有表面的最佳接近。所述差别流动是由小通道特有的抛物线流动造成的，其中通道表面的体积流速(bulk flow rate)为零，并且通道中的最大流速通常在所述通道的中心是最高的。这可能会导致在通道的底部和磁性或顺磁性粒子的顶部之间的显著流速差。磁性或顺磁性粒子的顶部与底部之间的流率的差异将是粒子大小、通道的高度和宽度以及通道中的平均流速的函数。DNA和/或可连接到磁性或顺磁性粒子上的其他部分，由于在所述磁性或顺磁性粒子顶部的相对较高的流速，可以在磁性或顺磁性粒子顶部提供拖动或牵拉。相反，底部的流速将基本上保持为零，从而产生显著的旋转动力。潜在地与其他物理特征相组合的磁阵列元件可以保持所述磁性或顺磁性粒子的位置。
在一些实施方案中，将流速维持在恒定的流速，同时引入dNTPs和/或其他试剂并使之流动，并同时读取传感器，从而保持恒定的平均转速。在其他实施方案中，需要在读取传感器的同时降低流速，以防止磁性或顺磁性粒子的显著振动和移动。在另外其他的实施方案中，当读取传感器时需要在试剂通过流动池流动的同时增加流速，以便使磁性或顺磁性粒子的更大的表面积与传感器相互作用。这可使平均效果增强，增强的平均效果可以降低由于磁性或顺磁性粒子表面上的DNA附着密度的变化而引起的传感器读数的变化，或由于粒子形状的不规则性而引起的传感器读数的变化。
在其他实施方案中，可以利用除由流速变化导致的力以外的力来改变磁性或顺磁性粒子的旋转或移动速率。在一些实施方案中，通量水平可由于外部磁体的移动而改变，该外部磁体可由于磁阵列元件的较高磁导率而通过磁阵列元件耦合。在备选的实施方案中，利用电磁体来影响与粒子相互作用的通量的量。磁通量的量的这些变化可以减小作用在磁性或顺磁性粒子上的摩擦力，从而允许或多或少的旋转。
在另外其他的实施方案中，利用磁场或电场来旋转磁性或顺磁性粒子，部分是由于珠粒和相关DNA的可极化性而导致的。
在一些实施方案中，除了由试剂通过流动池流动而导致的力之外，还需要使用一个力来将磁性或顺磁性粒子定位在与传感器一一对应地关联的适当位置中。在一些实施方案中，磁性或顺磁性粒子可以在试剂流中流动到一个或多个流动池中，并且利用磁体或电磁体使粒子移动至与传感器相关的位置中，使得与未使用这些附加磁体或电磁体时发生的情况相比，有更高比例的磁性或顺磁性粒子与传感器一一对应地关联。
磁阵列还允许将珠粒几乎完全分配至阵列位置。低速流动足以使珠粒在阵列中以珠粒和阵列位置之间一一对应的形式局部保留，而无需离心。在一个实施方案中，如果需要或期望在阵列上有比未填充位置更高水平的填充位置，则可以使试剂流进行循环，使得珠粒可以重新引入流动池中。在另一个实施方案中，试剂流动可随着珠粒被引入流动池而停止或减慢。在另一个实施方案中，试剂流动的方向可以颠倒(可能几次)，从而为珠粒提供更多填充阵列的机会。在又一个实施方案中，在使珠粒流入流动池之后通过使珠粒流动通过存储位置的入口或出口来保留珠粒，从而使它们可用于随后的测序过程。为了防止珠粒粘在目标珠粒位置以外的其他位置上，可以增加流动以去除任何弱保持的珠粒，而仍保留正确保持的珠粒。完成化学过程如测序或扩增后，可以通过降低保留场通量、通过增加将珠粒拉离阵列的新场、通过增加流体的流速、通过使用可包括表面张力的与气泡相关的空气水界面或以上步骤的任何组合而将珠粒去除。
在某些实施方案中，如图3中所示，使用DC场或介电泳场，或两者，用电极阵列保留带电珠粒。由于使用了磁阵列，不需要孔结构来保留珠粒，从而允许组分在溶液中自由流动。为了确保溶液中的带电成分如DNA样品、核苷酸、酶和其他带电部分可以容易地流经阵列上的体积，使用足以保留带电珠粒的振动频率，但其足够慢从而允许溶液中的这些部分远离保留的珠粒流动或扩散。以一一对应的形式与传感器相关联的凹陷的加入可导致珠粒与传感器之间更好的对准，从而允许更好的检测。在备选的实施方案中，使用基座(pedestals)或对准支柱(registration posts)或其他三维结构，例如，为了可以引入更好的流体流。
在其中珠粒可与阵列一一对应地定位的备选实施方案中，可通过磁场或电场使珠粒进入位置，并且随后可以通过备选方法如DNA杂交、生物素链霉亲和素结合、硫醇结合、光激活的结合、共价结合等保持就位。可在珠粒被所述磁场或电场一一对应地保持的同时，通过温度的变化、光的应用或者通过在结合试剂或催化剂中洗涤来启动结合。发生结合后，可使磁场或电场强度在强度或频率上发生变化，有可能被关闭。这种结合可以是可逆的，从而允许珠粒从传感器阵列上的体积中洗出。
在一些实施方案中，磁性或顺磁性粒子在其上可以具有表面涂层，该表面涂层具有足够的孔隙率，从而为聚合酶或其他酶以及样品DNA、dNTP离子和其他部分提供了穿过它的入口。该涂层可以被配置为使得引物可以适当的间距连接，并且可由此提供更大的样品DNA密度，并因此提供更大的电荷密度，以便与位于此处的传感器相互作用。所述涂层可以是琼脂糖、聚丙烯酰胺或其他交联聚合物的涂层，或者可以由多孔玻璃制成。
在其他实施方案中，珠粒可配置有涂层，以便相对于当所述DNA、蛋白质或其他带电部分与没有所述表面涂层的所述珠粒相互作用时可导致的非特异性结合的量，最小化或减少DNA、蛋白质或其他带电部分的非特异性结合。所述涂层可以类似于本文所述的用于流动池、传感器、富集模块或磁阵列的表面上的涂层，并且本文针对一种表面所述的任何涂层可在其他表面上使用。
在一些实施方案中，珠粒具有磁芯，该磁芯上可以具有不可渗透的涂层。所述涂层可与DNA的多条链结合、连接或缔合。例如，每一条DNA链均可以是基本上相同的滚环扩增子，从而提供DNA的多条链，其中每条链均具有一个DNA靶标的多个连续拷贝。
图8图示了用于与阵列中的传感器一一对应地保留珠粒的备选方法和系统的一个实施方案。图8图示了系统800，凭借该系统激活单独的控制线810，并因此结构812的一层连续地扩展至基质804与流体结构802之间的流动池体积806中，从而通过在激活控制线810时移动过量的珠粒808，迫使珠粒808从超过与传感器一一对应的水平脱离。然后可在测序循环过程中将珠粒808固定就位。在图8中可以看出，有足够的空间供液体在控制线下流动，但没有足够的空间供珠粒移动。当已完成一组测序循环时，可使控制线去激活，并且随后可通过流体通过传感器阵列区流动而去除珠粒808。
在备选的实施方案中，珠粒的数目可以低于传感器的数目。珠粒的数目可以接近传感器的数目，其中控制线被激活，以便利用传感器使珠粒定位。可通过在传感器阵列区中交替流动方向、引入振动或或振荡等来辅助所述定位，使得珠粒进行频繁的移动，直到移动被充分激活的控制线阻止时，所述控制线过低而不能使珠粒能够从一个传感器区移动到另一个传感器区。珠粒的进一步移动与控制线的进一步激活相结合将有助于使珠粒更完全地集中在传感器上。
在进一步的备选实施方案中，形状类似于图8中所示的形状的结构可以被模制、机械加工或以其他方式形成，以使得形状类似于当控制线被完全激活时将发生的形状。所述结构可以相对于覆盖有珠粒的传感器阵列而缓慢降低。
在又一个实施方案中，为了使较高百分比的传感器具有相关联的珠粒，可在通过上述结构中的一种将一组珠粒定位之后，通过生物素链霉亲和素结合、硫醇结合等将珠粒附接至传感器上。然后可向传感器阵列区中引入额外的珠粒，并重复该过程。如果结合剂定位于传感器上方的区域，如先前所述进行的那样，则由该结构捕获或挤压的任何多余的珠粒将不结合，并且可以在开始测序循环之前将其洗掉。
在又一实施方案中，可向传感器阵列区中引入显著过量的珠粒。可激活传感器阵列区出口处的单一控制线以捕集该组珠粒。水性条件和/或温度可以改变，以允许珠粒结合至传感器。而后可通过释放控制线从而允许珠粒随水性试剂流出传感器阵列区而除去过量的珠粒。
一些实施方案由于引入了可基于先前的传感器设计制造的可逆还原层而结合了pH感测与电化学检测。这类传感器可从SenovaSystems获得。在测序循环过程中，如果碱基已经掺入与传感器相关联的珠粒中，则将会发生还原反应。可测量降低的水平，并且在完成测序循环后，可向传感器上施加电压，导致表面氧化，使其返回到其原始状态，此时其可用于下一个测序循环。
在一些实施方案中，使用磁珠，而无需磁阵列。磁珠以均一的间距自组装成单层，其间距可以受到使用外部磁铁来改变局部场强的影响。可以使所述磁珠以与传感器阵列的间距相匹配的间距隔开，然后可以如先前所述通过改变水性条件、温度等使其结合至传感器阵列上。为了使珠粒与传感器能够对准，结合后珠粒的缓慢平移或移动可能是合适的。这种平移或移动可能需要在多个维度(可包括X，Y，θ)和间距上发生。与传感器一一对应地关联的凹陷的加入可导致珠粒和传感器之间的更好的对准，从而允许更好地进行检测。
图11图示了不同的实施方案，其中磁性、顺磁性、非磁性粒子可以具有除球形以外的形状，以用于具有磁性保持的传感器阵列(1102)、具有电限制的传感器阵列或具有自组装的粒子的传感器阵列。所述粒子可以呈平面、圆形、矩形(1104)、星形、六角形(1106)或呈另一种形状。在其他实施方案中，该粒子可以呈树枝状，从而扩大了所述粒子的表面积。所述树枝状粒子可以总体上呈球形、平面、椭圆形或任何其他形状。在另外其他的实施方案中，所述粒子可以是多孔的；如果所述粒子是多孔的，那么孔径可以具有足够的大小以允许DNA、聚合酶、dNTP以及引物延伸测序或其他应用所必需的其他部分在适当时自由移动。
在另一个实施方案中，不需要磁棒阵列，可用通过使用滚环扩增产生的DNA球代替珠粒。该DNA球随后可由DNA核酸酶消化。在另一个实施方案中，所述球可以由单体或聚合物如聚苯乙烯制成，其可在测序后使用有机溶剂如丙酮溶解，从而通过相同的过程释放附接的DNA，这两者随后均可通过使试剂通过所述流动池流动而从流动池中除去。
在又一个实施方案中，可通过附接至孔上的部分与附接至珠粒上的部分之间的结合来将珠粒固定就位。孔可以比珠粒的半径短，并且可以具有圆形以外的形状，从而使试剂可在珠粒的周围流动，而珠粒可以结合在所述孔的入口处的几个点上。所述结合可以是链霉亲和素生物素结合、DNA DNA结合、DNA PNA结合、PNA PNA结合、硫醇Au结合、光活化的结合、共价结合等。可以通过升高温度或通过引入降低孔上的部分与珠粒上的部分之间的亲和力的试剂来释放所述结合，从而允许通过使试剂通过所述流动池流动而将珠粒从流动池中除去。可通过对珠粒和孔结构进行超声处理来进一步诱导珠粒从已结合有所述珠粒的孔中移出。为了从所述流动池中去除所述珠粒，可在试剂通过流动池流动的同时进行超声处理。
在如临时申请61/491081中所述的在无腔室系统中扩增DNA的过程中，各种因素均可能进行优化。这其中包括频率、电压和用于限制聚合酶、靶DNA和产生的扩增子的限制“池”的大小和形状。如果仅考虑限制，将可能限制扩增子的几乎任何大小，而不考虑所述扩增子的小尺寸。然而，为了能有足够强的场来保证适当的限制，该场可以阻止PCR或等温扩增过程中聚合酶掺入碱基的适当活性，或者可以从靶DNA延伸的引物与聚合酶的复合物中抽出聚合酶和/或延伸的引物。在一个实施方案中，期望根据扩增子的大小来优化频率、电压和限制池的大小的组合。
在一些实施方案中，扩增反应是反向PCR扩增、热启动PCR扩增、甲基化特异性PCR扩增(MSP)、巢式PCR扩增、逆转录反应、逆转录PCR扩增(RT-PCR)、递降PCR扩增、序列间特异性PCR扩增(ISSR-PCR)、在较低变性温度下的共扩增(COLD-PCR)、固相扩增、桥式PCR扩增或单引物桥式扩增。
在一些实施方案中，扩增反应为解旋酶依赖性扩增(HDA)、切口酶扩增(NEAR)、重组酶聚合酶反应(RPA)、转录介导的扩增(TMA)、自动维持序列复制(3SR)、基于核酸的扩增(NASBA)、信号介导的RNA技术扩增(SMART)、回路介导的DNA等温扩增(LAMP)、等温多重置换扩增(IMDA)、固相等温、桥式等温、单引物等温扩增(SPIA)、环状解旋酶依赖性扩增(cHDA)或滚环扩增。
在产生用于电泳集中或限制的DC场中，可以构建电解产物。这些包括水合氢离子和氢氧根离子。为了使这些离子的影响最小化，可对DC场进行脉冲调制(pulsed)，从而使净DC相当低。在一些实施方案中，DNA迁移至更靠近中心电极后，脉冲占空比(pulse duty cycle)可降低。在其他实施方案中，该过程可以使用DC来集中DNA，然后用AC来保持所述电解产物的集中或限制。在其他实施方案中，可以使用DC和AC两者进行集中和限制。
在一些实施方案中，使用脉冲场凝胶电泳。例如，可以使用非正弦AC波形，其中较高的正电压可以被较长但较短(longer but shorter)的负电压来平衡，以使平均电压基本上为零。较高的正电压可用于聚合物集中，使得DNA的复制在聚合物溶液中发生。与在较高强度的电场中的迁移相比，该聚合物溶液可有效地引起DNA向较低场的方向的较低迁移，这可能由此增加DNA的迁移率。以这种方式，由于AC波形的平衡的性质，DNA可更多地以期望的方向迁移，而其他分子如Mg自由地来回移动。迁移差异可能也是频率依赖性的，因此，可以捕获不同大小的DNA。脉冲场凝胶电泳可以是1D或2D，并且可以使用箝位电场、横向交变场电泳或旋转凝胶电泳，其中任何一个可以使用凝胶、缠结聚合物或另一种筛分基体。
在产生介电泳场中，通常使用正弦波形。虽然这对于严格用于限制或分离不同种类的应用可能是理想的，但其可能会导致在限制体积内可以进行生化反应的系统的问题。例如，高场可能会导致局部加热。在一个实施方案中，可以替代地使用修正的正弦波形。例如，修正后的正弦波形可以在正弦曲线的顶部或在该正弦波形的任何其他点去除电压，从而允许局部扩散，允许扩增子与引物的杂交，聚合酶与双链DNA的结合，以及核苷酸或核苷酸类似物的结合和掺入。该场随后可在适当的一段时间之后恢复。同一过程可以按照修正后的正弦波形在符号相反的峰处发生。在其他实施方案中，任何其他的交流电波形可用于集中或限制。或者，正弦波形的中断在每个循环仅可发生一次，或可以每几个循环发生一次，或在多个循环中发生一次，因此，任何“散落的”扩增子可被捕获至具有最低场强的区域，并返回到该限制体积的主体积中。或者，可以使用其他波形如方形、梯形、非对称波形等。
在一些实施方案中，可以在小的微流体装置中产生单克隆珠粒。在一个实施方案中，电极和磁体可被制造在薄片上，其中可将上表面粘合或熔合就位，从而产生集成微流体装置。该微流体装置上可具有电和流体连接。然后，例如通过真空或空气压力，可将微流体装置放置为与第一加热板良好热接触。第二板可位于上面处于不同的温度。可以选择两个温度以促进PCR扩增。在完成一个温度点之后，例如通过真空或空气压力，可将卡转移或使其接触上方加热板。因为只有薄卡和卡中的试剂需要改变温度，所以该系统可以具有快速的温度转变，并消耗最小的功率。
在提供最小热质量的其他实施方案中，内置于扩增微流体装置中的电极可用作电阻加热器来局部加热液体。在一些实施方案中，利用电极的电阻变化来测量温度以便进行更好的热控制。在其他实施方案中，传感器如纳米桥或纳米针(本文所述的)用作温度传感器，以便更好地控制感兴趣的区域。
在一些实施方案中，可能需要由DNA的单一拷贝进行DNA扩增。如果在扩增过程的早期扩增中，如在PCR扩增的第一循环中产生了聚合酶错误，则该错误将激增，使得可能无法区分正确序列和错误序列。热稳定聚合酶通常比嗜温聚合酶或嗜热聚合酶具有高得多的错误率，嗜温聚合酶和嗜热聚合酶可能不适合于PCR，因为它们在PCR的变性步骤中失活。因此，在一些实施方案中，PCR反应的最初部分需要使用高度精确的聚合酶，其中高度精确的聚合酶没有足够的热稳定性来防止在PCR过程中失活，但可以提供比更加热稳定的聚合酶更好的精确度。高度精确的聚合酶可以具有低Koff，使得在可能足够稳定从而防止在PCR扩增的变性步骤中显著失活的其他聚合酶的存在下，高度精确的聚合酶基本上结合到活性延伸位点。
在一些实施方案中，在引入更加热稳定的聚合酶之前将高度精确的聚合酶引入至具有引物和模板的体积中。在其他实施方案中，加热激活热稳定的聚合酶，使得任何加热激活的聚合酶对于PCR的第一循环将是无活性的。
在其他实施方案中，使用等温和PCR扩增反应的组合。初始扩增可以通过高度精确的非热稳定聚合酶来进行，而随后的扩增可以通过基本上不被PCR的变性步骤灭活的不太精确的热稳定聚合酶来进行。
在一个备选的实施方案中，在传感器阵列中的单独传感器的区域中产生克隆群体。该传感器可以是纳米针或纳米桥或其他用来检测聚合事件的传感器。在一个实施方案中，引物优先附接在传感器的表面上。由于材料的差异，引物可优先附接，其中传感器的材料比传感器阵列的传感器之间的区域更有利于附接。在备选的实施方案中，可向传感器阵列的传感器之间的区域应用掩罩(mask)，而后可进行表面改性。随后，可以将掩罩去除；留下传感器阵列的传感器之间的、尚未进行表面改性的区域。表面改性可以包括生物素的连接、施加金层和在本领域中已知的各种其他方法。
随后引物可被优先应用到传感器阵列中传感器的表面上的区域。在一个实施方案中，由于生物素链霉亲和素结合导致引物连接，其中链霉亲和素连接至引物的5'端。在另一个实施方案中，硫醇基团可连接到引物的5'端，而后引物的5'端可结合至先前施加在传感器上的金层上，从而形成Au-S键。如果需要进行PCR反应，则可以用DTPA修饰该引物，使得形成2个硫醇-金键，从而防止在PCR中常用的60-95℃温度下可能以其他方式发生的分解。
在完成一组测序循环后，去除并替换引物。可以改变缓冲液条件，以削弱生物素链霉亲和素键，如低pH的高浓度GuHCl；或者，可以将温度升高至70℃以上以使生物素链霉亲和素键断裂。同样可以在升高的温度下使硫醇键断裂。可以使用攻击性的手段，因为对聚合酶和DNA的损害不再是重要的。在一个实施方案中，使用有机试剂来打破延伸的引物和表面之间的结合，如共价结合。在去除延伸的引物后，可使新的引物流入传感器上的体积中，从而使该装置能够再次用于对另一组DNA样品进行的另一组测序循环。
在如图12中示意性描绘的一些实施方案中，传感器阵列可以具有设置有电极1206的附加阵列的元件1200，其可以用来进行介电泳集中。在开始时可以进行介电泳集中，以将样品DNA、dNTP和引物吸引至每个传感器区域。而后可在DNA样品位于其中的每个传感器的区域开始扩增。在扩增过程中，介电泳力也可以有助于防止由于保留扩增子而在进行扩增的不同传感器区域之间的交叉污染。为了确保不产生多克隆区域，输入DNA的浓度需要足够低，使得多数传感器区域具有一个或零个样品DNA分子。DNA样品可以是单链或双链的，这取决于扩增方法。扩增反应可以是PCR反应或等温反应。在一些实施方案中，显示附加电极1206具有相对于所述传感器的电压水平相同的电压。在备选的实施方案中，在传感器任一侧上的电极可以具有相对于彼此符号相反的电压。
所述传感器阵列元件1200可以在基质1212上制造，并且可以具有用于保留磁性或顺磁性粒子或珠粒1202的磁体1216，其中所述磁性或顺磁性粒子或珠粒可以保持为向下抵靠电极1204，抵靠电介质1210和/或上部电极1208。检测可以利用所述电极1204和所述上部电极1208，而介电泳集中/限制可利用电极1204和外电极1206，其中所述外电极可以包括单个电极，或者可以包括多个电极。
扩增可以是固相扩增，其中一个引物在珠粒的表面上，而第二引物在溶液中，或者扩增可以是所有的引物都在珠粒上的固相扩增。或者，可以进行其中两个引物都存在于溶液中以及一个引物或两个引物也存在于珠粒上的扩增。
电极配置可以采取各种不同的形式，包括在流动池的两个主平面上的平面电极，或者可以有一个电极在珠粒的相对表面上，而一组较小的电极与每个检测器位置相关联。
图12图示了在测序反应中使用在传感器阵列中的传感器上方的扩增的区域。在完成了扩增反应之后，可以对该传感器阵列上方的体积进行洗涤，从而去除扩增子、聚合酶以及dNTP。然后可以使聚合酶和单独的dNTP流入在该传感器阵列上方的体积中，允许进行结合、掺入以及掺入事件的检测，从而确定不同的扩增的样品DNA分子的序列。
在一些实施方案中，传感器用于多种用途，例如，当引入珠粒时检测珠粒的存在，检测与该珠粒相关的扩增(例如，实时PCR扩增或终点PCR扩增)，以及检测测序反应。
在产生克隆珠粒时，高百分比的珠粒将不具有DNA模板。此外，其他的可能具有不良的扩增。这些珠粒不能提供有用的测序，所以希望去除这些珠粒以提高仪器通量和试剂的利用率。在一些实施方案中，使用电场分离没有或具有最少量的模板的珠粒。在其上已发生扩增的珠粒具有来自扩增的DNA的较多固定的负电荷，并且可以通过使用电泳分离来将它们与其上未发生扩增的珠粒进行分离。这允许如图3中所示的情况，其中磁阵列中的多数位置被描述为被已发生扩增反应的珠粒占据，并因此适于在测序反应中使用。
完全地装载有模板的珠粒具有更高的电荷，因此在电场中将比仅具有引物或少量模板的珠粒移动得更远。在如图13A、图13B和图13C中所示的一个实施方案中，这种分离在流通式模块中进行。第一流体输入1311A允许注入混合的珠粒。第二入口1312A允许注入不含珠粒的缓冲溶液。第一出口1311B位于第一入口1311A的下游。第二出口1312B位于第二入口1312A的下游。
流体的流速可以根据流体阻力或泵送速度来设定，以使得更多的液体流入该第二入口中。在图13B所示的实施方案中，可以改变入口和出口的宽度以产生不同的流体阻力，但是可以预期改变流体阻力的其他方法(例如不同的长度或高度)，或在富集模块300外部的系统的部分中使用限流器。类似地，可以改变第一出口1311B和第二出口的流体阻力，以使得更多的液体流出第一出口1311B。在这样的设置中，不具有较小的垂直于流动的速度的珠粒将会离开第一出口端口1311B。可以添加额外的输出通道以有助于对具有中等水平的模板的珠粒进行分离。在一些实施方案中，每个输出通道中的流速可以通过为每个出口通道提供单独的泵来得到直接控制。
可以提供一对电极1313，这些电极能够产生垂直于分离部分1310中的流体流动的电场，以使得装载有模板的珠粒(其可以通过入口1311A被带入富集模块1300，而附加试剂可以通过第二输入1312A被引入该模块中)可离开流动路径朝向第二出口1312B迁移。流体端口1309允许与系统管道连接。
电极1313可以是由与电泳相容的任何电极材料制成的。在一些实施方案中，可以使用离散的金属线，但是金属迹线也是可以预期的。可以预期使用多种金属，例如铂、铂/铱、金以及其他贵金属或合金，以及耐腐蚀材料，例如不锈钢。还可以预期使用非金属电极。
在另一个实施方案中，流体的流速可以通过流体阻力或泵送速度来设定，使得相比第二出口有更多或更少的流体流出第一出口，从而允许对珠粒流动流的操纵。在又一个实施方案中，珠粒流可以通过入口和出口流体流动来调节。
流通式富集模块1300可以由非导电材料例如模制的塑料、玻璃、陶瓷或可模制的聚合物(例如PDMS)，或由可涂有不导电涂层的导电材料，或这些材料的组合，或与其他材料的组合来构造。可用夹紧机构将流体组件熔合、粘合或保持在一起来产生包括分离部分1308的富集模块。在一个实施方案中，富集模块可以包括模制的上部片块1308，和平基质1302。在其他实施方案中，富集模块可以由两个以上的片块例如三个、四个、五个或更多个组件组成。如果可以使用两个组件，则两侧可以具有非平面的表面，以使得可在任一组件中形成流体通道或控制通道。如果使用多个组件，则它们中的任何一个可以是平面的或成形为使得它们包括通道、凹陷或凸起，或者可以是平面的和成形为使得它们包括通道、凹陷或凸起的组合。
在一些实施方案中，富集模块的一个或多个组件的表面或表面的一部分具有足以引起显著电渗流的ζ电势。可能需要使可能由所述电渗流导致的任何混合或湍流最小化。在一些实施方案中，选择诸如TiO2、ZrO2或BaTiO3的材料，以使得ζ电势和产生的电渗流显著降低。在一些实施方案中，ζ电势和ζ电势与pH变化之间的关系可根据表面涂层而变化。在一些实施方案中，ζ电势可以随pH的变化而显著变化，二氧化硅的pH依赖性就是这样。在其他情况下，相对于pH值，尤其是在pH7.5至pH9的pH范围内，ζ电势的变化非常小，BaTiO3的pH依赖性就是这样。
在其他实施方案中，使用表面涂层如PEG(聚乙二醇)、甲基纤维素、正十二烷基-B-D-麦芽糖苷、丙烯酰胺、氟化烷烃链、PTFE、丙烯酸酯或其他交联的或部分交联的聚合物来改变ζ电势，或者使用表面涂层的组合来类似地使电渗流最小化。在一些实施方案中，使用聚合物来填充电渗流限制部分的水性体积。
在其他实施方案中，如图13C中所示的物理结构用于减少或消除由电渗流造成的不期望的混合和湍流。这样的结构可以具有流动限制部分1320，并且所述流动限制部分1320可以在分离部分1308的两侧上使用。电场可从电极(未示出)通过缓冲液贮存部分1322分布。所述电极可定位在辅助输入端口1324，其可用于使缓冲液进入并通过缓冲液贮存部分1322和流动限制部分1320。在备选的实施方案中，电极定位在缓冲贮存部分1322，电连接至电压源，该电压源可以位于富集模块1300的外部。可将输入珠粒和试剂通过输入端口1311A和1312A带入所述分离部分1308，或者可将试剂通过输入端口1311A和1312A带入，而珠粒通过中心输入端口1326带入。可在输出端口1311B和1312B之间对珠粒进行分离。
在一个备选的实施方案中，电极定位在与图13C所示的结构分离的缓冲液储件(reservoir)中，其具有流体连接，以允许电流流入富集模块。在一些实施方案中，缓冲液储件允许电渗流更多地以一个方向横跨富集流动池，而不是具有伴随着密封流动池将发生的湍流的循环流动，其中在一个方向上的任何流动必须与相反方向的流动相匹配。在一些实施方案中，电压可以周期性地停止，以允许流体储件返回其平衡状态，其中在电渗泵送之后每个储件中的液面处于同一水平上。在其他实施方案中，所述储件的体积或横截面相对于所述电渗泵送是显著的，使得可在允许所述流体储件返回其平衡状态之前分离或富集珠粒组或多个珠粒组。
在其他实施方案中，通过用减少可电离的硅烷醇基数目的化合物如三甲基氯硅烷保护硅烷醇基来降低ζ电势的大小。图13D和13E以显微照相示出了如图13C中所示的结构的使用，其中图13D中示出了没有施加场的输入珠粒流1314，因此所有的输入珠粒1314都被携带至输出1311B，犹如它们是带有较低电荷的珠粒1314A，并且似乎没有珠粒是被牵引至出口端口1312B的带有更高电荷的珠粒1314B。更详细地示出了图13C中所示的流动限制部分1320，示出了流体通道1316，和支撑柱1318。在图13E中，向所述分离部分1308施加场，并且将所述输入珠粒流1314分离成被携带至输出端口1311A的带有低电荷的珠粒1314A，并且将带有更高电荷的珠粒1314B牵引并携带至输出端口1312B。
在一些实施方案中，分离部分1308、流体输入1311A、1312A、流体输出1311B、1312B、分离部分1308、电渗流限制部分1320和缓冲液储件1322的厚度或深度可以是相同的。在其他实施方案中，不同部分的厚度或深度可以是不同的，例如，在电渗流限制部分1320的厚度可以小于分离部分1308或者缓冲液储件1322的厚度。
在一些实施方案中，分离部分1308和富集模块的其他流体部分的厚度或深度为10-1000μm；在其他实施方案中，富集模块的厚度或深度为20-200μm、50-150μm、200-500μm或70-130μm。
在一些实施方案中，电渗流限制部分中的限流器1313的宽度为10-1000μm，在其他实施方案中，流动限制的宽度为20-200μm、50-150μm、200-500μm或70-130μm。
在一些实施方案中，富集区的长度可高达2mm、2mm-10mm、10mm-100mm。在一些实施方案中，富集区的宽度可高达1mm、1mm-4mm、4mm-10mm和10mm-100mm。
在一些实施方案中，富集模块1300具有反馈系统(未示出)，以补偿不同批次珠粒之间可能存在的不同电荷水平。这样的反馈系统随后可允许针对特定批次的珠粒自动调节电泳电压，并且针对后续批次的珠粒自动重新调节。所述反馈系统可以使用反射光、吸收光、折射光、荧光、与珠粒的电容耦合、与珠粒相关的德拜层的直接电导率检测、珠粒的ISFET/ChemFET检测，或者可以使用任何其他合适的检测手段。所述检测手段可以配置为使得珠粒的检测在一个或多个流体输出1311B和1312B中完成或与之相关，或者可以配置为使得珠粒的检测在分离部分1308中实现或与之相关。
在一些实施方案中，在一批珠粒的分离过程中使用该反馈系统，调节流速和电渗压，使得珠粒得到最佳分离并流入每个输出1311B和1312B中的标称期望位置。所述流速控制可以通过使用施加到所述流动上的可变压力、施加到所述流动上的可变真空、所述流动中的可变限制或它们的任意组合来完成。
在一些实施方案中，可能需要集中珠粒浆液。在一个实施方案中，使珠粒溶液通过磁体以保持珠粒。通过去除磁场或使用更高的流速，可以以更集中的形式释放珠粒。
在一些实施方案中，使用富集模块300将带负电荷的DNA与蛋白质分离，包括在将可能为所述DNA和所述蛋白质以及所述细胞膜片段的起源的细胞裂解后，可与所述DNA混合的细胞膜片段。在一些实施方案中，可能需要将DNA从大部分可带正电荷的蛋白质中分离出来，并且还需要将DNA从在中性pH下可带负电荷的蛋白质如人血清脱铁运铁蛋白、甲状腺球蛋白或BSA中分离出来。这类在中性pH下可带负电荷的蛋白质通常具有高于4.0的pKa值，而DNA的pKa值为1.0。蛋白质的电泳迁移率通常比高度带负电荷的DNA的电泳迁移率低得多，从而允许在富集模块300中容易地分离DNA。这种分离可在低pH值如低于7的pH值、pH6-7、pH5-6，pH4-5或pH3-4下进行，从而允许富集模块在低于所述蛋白质的pKa和高于DNA的pKa下运行。
在一些实施方案中，DNA可在基本上与任何蛋白质和细胞膜分离后被介电泳捕获。所述介电泳捕获可在流体出口311B、312B中实现，或者可在分离模块中实现。在所述介电泳捕获之后，可将缓冲液，例如，从如先前所述用于实现与蛋白质或细胞膜分离的低pH变为例如适合于PCR、等温扩增或测序的缓冲液，其中该pH大概是最佳的或另外适合于例如聚合酶活性。
如果珠粒粘在电极上，如果必要的话，可以定期地降低或甚至是反转施加到电极1313上的电压。所用的电压可以大于电解所需要的电压(在25C、pH7下是1.23V)，或者可以小于电解所需要的电压。更高的电压和更窄的间距对这些珠粒提供更高的场强度和更大的力。该系统上的电压可以通过以下方式进行校准：使不带有模板或带有有限模板的珠粒流动，并且设定电压和/或流速，以使得这些珠粒不会移动得远到足以进入第二出口，同时带有模板的珠粒可以被引导到第二出口中。
也可以预期非流通式富集模块。在一个实施方案中，将珠粒引入腔室中，并且磁场或重力会向下牵拉这些珠粒。建立将具有模板的珠粒向上牵拉的电场。在一些实施方案中，可以在正电极前面添加捕获膜或过滤器以促进珠粒的集中。
在一个实施方案中，通过在相同的仪器中进行的作用和方法而将珠粒从流动池中除去，其中流动池用于检测反应，例如测序反应。
在另一个实施方案中，从其中的流动池用于检测反应如测序反应的仪器中取出流动池组件，并移动到另一仪器或装置，其中将珠粒从流动池中除去。
在另一个实施方案中，从其中的流动池用于检测反应如测序反应的仪器中取出流动池组件，并运送到中央整修部位(centralrefurbishment site)，其中将珠粒从流动池中除去。
在另一个实施方案中，从其中的流动池用于检测反应如测序反应的仪器中取出流动池组件，并移动到另一仪器或装置，其中涂层可被施加、去除和/或重新施加到流动池和/或流体歧管。
在另一个实施方案中，从其中的流动池用于检测反应如测序反应的仪器中取出流动池组件，并运送到中央整修部位，其中涂层可被施加、去除和/或重新施加到流通池和/或流体歧管。
在一些实施方案中，流动池和/或流体歧管具有不同的表面涂层。这样的表面涂层用于减少各种试剂中的部分与所述流动池或流体歧管的表面的非特异性结合。在一些实施方案中，旨在减少非特异性结合的涂层可以包括PEG(聚乙二醇)、BSA(牛血清白蛋白)、PEI(聚乙烯亚胺)、PSI(聚琥珀酰亚胺)、DDM(正十二烷基-b-D-麦芽糖苷(n-dodecyl-b-D-maltocide))、氟化涂层、特氟龙涂层、硅烷化涂层或其他适当的涂层。
在一个实施方案中，通过在相同仪器中进行的作用和方法而将该涂层施加、去除和/或重新施加到流动池和/或流体歧管，其中该流动池用于检测反应，如测序反应。
在一些实施方案中，由于可基于先前的传感器设计制造的可逆还原层的引入，传感器结合了pH感测与电化学检测。这类传感器可从Senova Systems获得。在测序循环过程中，如果碱基已经掺入与传感器相关联的珠粒中，则将会发生还原反应。可测量降低的水平，并且在完成测序循环后，可向传感器上施加电压，导致表面氧化，使其返回到其原始状态，此时其可用于下一个测序循环。
如图9中所示，在一些实施方案中，可以进行氧化还原反应，其中氧化还原电势可包括AC电势904与标称DC电势902的组合，其中标称DC电势902是正弦波的一半，其从零伏开始，上升到最大值，又返回零伏，其中可将所述AC电势904叠加在所述标称DC上。AC电势904的波形可以具有10倍于标称DC电势902的频率，或者AC电势904的波形可以具有10-100倍于标称DC电位902的频率，或者AC电势904的波形可以具有100-1000、1000-10,000、10,000-100,000、100,000-1,000,000、1,000,000-10,000,000倍于标称DC电势902的频率。AC电势904的波形可以是正弦波形、三角波形、方波形或任何其他种类的对称或不对称波形。DC电势的波形可以是半正弦波、等腰三角波形、锯齿波形或起始于零伏、上升至最大值并又从那里返回到零伏的任何其他波形。所叠加的AC电势904的波形的幅度可以是恒定的，或者可以在DC电势902波形期间变化，例如，当DC波形接近于零时，AC波形可以较小，而当DC波形达到其最大电势时，AC波形可以增大。由AC电势904和标称DC电势902的组合所产生的电流906可以是应用的电势的非线性函数。
在将其中收集的数据量最小化的一个实施方案中，除了提高反应速度之外，可能还希望对准具有半导体电子器件正常存在的直线性质的有源区(active area)。在先前的系统中，活性反应的位置可能不与检测器阵列很好地对准。优选的是，与常规相反，以严格的直线形式布置检测器电子器件，该常规是如图14中所示使试剂从芯片1400的边角1404A和1404B进出。这种方法既阻止了与试剂流(reagent slug)的对准，又浪费了芯片的大量区域，因为试剂流不能很好地(或根本不能)流至芯片1402的其他边角，并且由于从芯片的中心到芯片边角1404A和1404B处的入口和出口端口的横截面积的较大差异，而造成流动(和加载效率1406)的不均匀性。
在一个实施方案中，如图15中所示的多个流体入口1512A可用于多流动池传感器装置1500中，从而允许芯片面积的更大利用率，以及相对于所述芯片和所述芯片读取结构的更均匀和对准的试剂流。在一些实施方案中，可以在不同的时间将样品引入到流动池的不同通道中，从而允许使用不同的样品，而无需条码编码或用于样品鉴定的其他手段。多流动池传感器装置可以具有多个流动池1510，每个流动池具有输入端口1512A、输出端口1512B和废料线1516，并且其中可以配置每个输入和输出端口以便优化流经所述流动池1510内的传感器阵列的流动的均匀性，潜在地具有成角度的侧壁和/或表面粗糙度，以便优化所述流动均匀性。所述流动池可进一步配置有阀1504和对所述阀的控制1506，其用于控制样品和/或其他试剂十分接近于流动池1510的流动。可使用输入端口1502引入样品和其他试剂。
在一些实施方案中，在一个过程或一组过程中在不同的时间引入样品。例如，将已经历扩增反应并因此具有延伸的引物的第二组珠粒引入与芯片相关联的流动池的通道中，其中该芯片的另一通道可能已经具有第一组珠粒。该第一组珠粒可能已经经历扩增反应并因此其中含有延伸的引物，并且具有该第一组珠粒的通道可能已经暴露于一个测序循环，或者可能已经暴露于多个测序循环。在另一个实施方案中，将第二组珠粒引入至其中含有第一组珠粒的相同通道中。在其中可如本文其他地方所述在阵列的单一区域中进行扩增和测序的另一个实施方案中，一个通道中的一组珠粒可以经历等温扩增，而另一通道中的第二组珠粒可以经历测序反应。
在其中第一过程可能需要温度变化而第二过程则不需要温度变化的一些实施方案中，当温度变化发生时第二过程可以暂时停止或中止，并且随后可在温度恢复至先前的温度之后开始。例如，在与珠粒缔合的引物被延伸后，扩增反应过程可能需要将第二链解链并去除，以使互补的未延伸引物可与和珠粒缔合的引物杂交，从而使得合成测序反应可以开始。在升高具有多个通道的芯片的温度之前，具有一组经历测序反应的珠粒的通道可以暂停测序反应，并且可致动共定位的虚拟纳米反应孔电极。以这种方式，部分杂交的延伸引物与每个虚拟纳米反应孔保持定位，而未与通道中的珠粒缔合的延伸引物可脱离与珠粒缔合的引物，而后从该通道中去除。
如果样品太大，则该系统可以将其分到多个流体通道或芯片上，或者如果样品是可组合的，则对其进行组合(例如带有条码的样品)。在一些实施方案中，提供到仪器的样品将准备好进行测序。在其他实施方案中，样品可以被该仪器处理从而产生准备测序的样品。
在另一个实施方案中，通向单一流动池或电润湿的多个输入端口用于将样品引入流动池的部分中，从而允许一次使用更多的样品，而无交叉污染的风险。
在另一个实施方案中，可提供电润湿系统以在流动池的一部分内移动试剂，而不产生试剂界面，从而完全防止了在试剂到达流动池的期望部分之前的试剂的任何混合，并可因此提供极其快速的试剂转换。
在一些实施方案中，例如，当使含有dNTP的试剂流动通过传感器定位于其内的流动池时，期望一种试剂与另一种试剂之间具有较快的转换。这可能有助于提供在其中存在的dNTP基本为零的浓度与具有通过聚合酶掺入来延伸或进一步延伸引物所期望的dNTP浓度的试剂之间的较快转换。这可允许在碱基掺入的起始时间与以下时间之间有较短的时间，在该时间时，显著百分比的引物或延伸引物已经有掺入流动池中不同集落中的适当位置的新引入的核苷酸。这种较短的时间可允许在每单位时间一个或多个传感器的信号水平的较大变化，这可改善信噪比。电子传感器通常具有噪声，噪声可以包括热噪声和闪烁噪声，这两者可通过缩短用传感器感测集成信号的时间间隔来最小化。
与在其中存在的dNTP基本为零的浓度与具有通过聚合酶掺入来延伸或进一步延伸引物所期望的dNTP浓度的试剂之间发生较慢转换的系统形成对比，获得这种快速转换。这种较慢的转换可由于dNTP从含有dNTP的试剂溶液向最初具有的dNTP基本为零的试剂溶液的扩散而发生。这可在引入到传感器定位于其中以供检测测序反应或另一种反应的流动池之前，在通过试剂流经的长通道进行转换的同时发生。由于通道宽度、试剂流经的边角、试剂流经的通道的表面的不规则性、通过其将试剂引入流动池的通道的缓流或通过流动池的缓流的改变可导致进一步的混合。
在一个实施方案中，通道长度可以在流体系统的以下两点之间显著缩短：在一个点中，在存在的dNTP基本为零的浓度与具有通过聚合酶掺入来延伸或进一步延伸引物所期望的dNTP浓度的试剂之间产生转换；在另一个点中，试剂被引入流动池中。所述试剂与所述流动池之间转换的产生之间的所述通道长度可以为1微米或更小、1-5微米、5-20微米、20-100微米、100微米至300微米、300微米至1毫米、1毫米至3毫米、3毫米至10毫米或10毫米至30毫米。通常，流体系统中产生所述试剂之间的转换的位置与所述制剂被引入所述流动池的位置之间的距离越短，以及流体系统或所述距离中的边角的流动横截面大小的转换数越少，dNTP或其他部分的扩散将越低，并因此在具有基本为零的dNTP浓度的试剂与在流动池中的每个传感器处具有期望的dNTP浓度的试剂之间的时间范围将越短。
使聚合反应的时间最小化也可以改善与聚合反应检测相关的信噪比。与检测器相关的噪声可以是与时间相当一致的，并且产生的信号的总积算量无论其产生时间长度如何都可以是相同的。因此，通过加快与聚合酶结合相关的时间和/或通过在将dNTP引入试剂流时提供dNTP浓度的快速转换来减少采集数据所用的时间可以将在分析中必须处理的噪声量最小化。因此，可降低必须由分析软件来处理的噪声带宽。
在传感器靠近出口端口的一些情况下，需要掺入的dNTP的数量可能足够大，使得dNTP的消耗可导致产生用于通过聚合酶掺入来延伸引物的期望dNTP浓度的时间增加。较低的dNTP浓度、在流动池中具有较多集落的较长距离、具有用于延伸的较多引物的较大集落均可导致产生足够dNTP浓度的时间的增加。在一些实施方案中，利用多个输入端口来提供通向单一流动池的输入，以确保每个传感器和/或集落处dNTP的可用性。在一些实施方案中，在流动池上方、在PDMS液体歧管的附加层中提供试剂通道。可提供与图42中所示的那些类似的重复组的控制线，其可控制与图42中所示的那些类似的重复组的阀，并且流动通过与图42中所示的那些类似的重复组的歧管，其然后可以提供备选的流动池输入，在流体中产生两种试剂之间的界面的点与第二或后续流动池输入端口之间具有短距离。
与新一代测序相关的一个重要问题是产生的数据量巨大。一些系统针对测序数据的每种有用的碱基可以产生平均3000个或更多个数据点。对数据的存储和分析显著地增加了新一代测序的总成本。在一些实施方案中，通过获得较少的数据，以最简单的方式进行数据缩减。聚合酶活性可明显比使具有dNTP的试剂完全通过流动池所需的时间更快；因此在dNTP甚至到达所述流动池出口附近的集落之前，接近流动池入口的DNA集落可能已经彻底完成接下来的合成。如果在检测发生在流动池中的任意位置的反应所需要的时间内获取整个流动池的数据，则许多数据将来自流动池中未发生反应的区域。根据dNTP试剂流穿过流动池所需的时间，和聚合的速度，流动池中的大多数集落或者将正在等待dNTP，或者将已完成其合成反应，而不是掺入dNTP并由此产生有用的数据。
在一些实施方案中，检测器电子器件的读取与试剂流通过流动池的运动同步。含有dNTP的试剂流可能首先进入流动池，但尚未在流动池中移动得足够远以使dNTP结合并掺入任何集落。在该时间点，可能根本不采集数据。在稍后的时间点，试剂流将已经充分进入流动池以与第一区域中的集落组相互作用。在该时间点，数据可能取自与第一区域中的集落相关的检测器，但可能不取自流动池的其他区域。在稍后的第二时间点，试剂流可能已经充分进入流动池以开始与第二区域中的集落组相互作用。在该时间点，取决于试剂流的速度和聚合酶的速度，数据可能取自与第二区域中的集落相关的检测器，并且可能仍需要取自第一区域，但可能不需要取自流动池的其他区域。在稍后的第三时间点，试剂流已充分通过流动池以开始与流动池中的最后一组集落相互作用。在该时间点，数据可能取自与最后区域中的集落相关的检测器。取决于试剂流的速度、聚合酶的速度、流动池的长度和集落的大小，一些数据可能仍然需要取自先前的区域，如紧接所述最后一组集落之前的区域，但可能不需要取自流动池的其他区域。
在其他实施方案中，可进行具有相位延迟的时分复用以将不同的样品彼此区分开。
由于在系统中使用的阀门的速度可以变化，并且管、通道和端口的大小可以在系统和消耗品之间发生变化，流速也可以变化。为了适应所述变化，第一组数据取自系统或消耗品，之前的数据可以为其提供关于系统中的流速的适当指导，可能需要采集更多的数据，以便可以保证捕获与测序反应相关的数据。
在一个实施方案中，采集时间可以由先前的列或由来自同一列的前一周期的数据来适应性地确定。例如，如果典型的检测事件在接近采集时间结束时发生，则在下游样品的下一采集期开始之前可增加额外的延迟。同样，如果典型的检测事件在接近采集时间开始时发生，则下游样品的下一采集期可以较早开始。
区域的大小在示图中显示为一个集落宽度，但区域的宽度可以大于一个集落宽度。例如，如果流动池从入口到出口为1000个集落宽，则区域可以是一个集落宽、10个集落宽、100个集落宽、500个集落宽或之间的任意数值。因此，在试剂流移动通过流动池时从其中获取数据的区域可能会从一个传感器到数十个传感器，到数百个传感器宽度不等，当试剂流穿过流动池以及当聚合反应完成时随其移动。
可以在读取芯片时完成区域的宽度的读取，从而防止生成和丢弃数据的需要。这可以以与可用于读取CMOS图像传感器的分区的方式类似的方式来完成，从而可以一次读出总行或列的子集。根据装置的结构，也许有可能选择单独的传感器，因为有可能选择一些CMOS传感器中的单独像素。或者，如果针对传感器阵列的每列使用单独的模拟数字转换器将芯片结构设计成一次读出完整的一行，则可以读出该芯片，从而选择行的哪些子集是期望的。行的子集将随着试剂流前进通过流动池以及随着流动池的区域在所述区域中的集落处完成聚合反应而变化。在一些实施方案中，比较器的所述单独的模拟数字转换器与每一列相关，其中计数器也可以与每一列相关，从而允许模拟信号同时转换为数字信号，同时允许有更多的时间、潜在的多个数量级的更多时间用于模拟-数字转换，同时伴随着信噪比的改善。在其他实施方案中，模拟数字转换器可以是逐次逼近装置。在其他实施方案中，可以使用像素平行读出方法。
所收集的数据区域的宽度必须大到足够以解释多种因素，以确保采集所有有效数据。这些因素包括试剂流流速的变化，试剂流可在接近流动池的边缘时由于与表面的相互作用而流动较慢。其他因素可以包括由于聚合酶的浓度而导致的聚合速度的变化、dNTP浓度的变化、温度变化、集落密度的变化、针对一个或多个集落掺入的碱基的重复数，等等。任何这些可能需要所采集的数据宽度更长。
如前所述，用于延伸引物的dNTP可以是可被天然或修饰聚合酶掺入的天然dNTP、修饰的dNTP，或天然dNTP和修饰的dNTP两者。如果使用修饰的dNTP，则修饰可以用作可逆终止子、虚拟终止子，或者可以改变掺入的核苷酸的电荷，以便更容易地进行检测。因此，在一些实施方案中，测序反应在均聚物运行中掺入所有碱基，或者可以在均聚物运行中一次掺入一个碱基，从而减少当均聚物运行中的碱基数很大时确定均聚物运行中的碱基数的困难。
与聚合酶向集落DNA的扩散或结合相关的动力学可能会明显长于与dNTP的扩散、结合和掺入相关的动力学。因此，如果将聚合酶加入具有dNTP的相同试剂流内，与加入具有聚合酶的试剂流内、随后加入具有dNTP的试剂流内相比，发生聚合的时间长度可能更长。因此，可能有利于实现数据量的最小化，以使聚合酶进入流动池，从而允许在引入dNTP之前聚合酶结合至DNA集落。如果该聚合酶是连续性聚合酶，使得所述聚合酶在循环之间很好地得到保留，则聚合酶可以与dNTP组合以消除对单独递送的需求。在另一个实施方案中，包括磷酸酶和聚合酶的洗液的递送可以允许在一次流体递送中有效地消除残余的核苷酸并补充聚合酶。在其他实施方案中，试剂包括磷酸酶而不含聚合酶，以通过经水解去除磷酸基团而有效地消除dNTP。磷酸酶可以是虾碱性磷酸酶、小牛肠磷酸酶或另一种磷酸酶。
通常，对于大多数克隆DNA测序系统，期望在表面上具有尽可能多的DNA，以便使数据信号的量最大化。然而，由于DNA随机地位于表面上，DNA的间距可能在后续聚合反应中导致空间位阻。
在许多不同的测序应用中，靶DNA或引物可以结合至基质的表面上。作为连接方法的结果，靶DNA和引物可以随机地位于表面上，并且可能足够接近以致在聚合酶延伸过程中出现空间位阻。在一些实施方案中，引物与基质连接、结合或缔合，同时杂交至与引物重叠的DNA，其可为聚合酶提供引发位点。所述引物和重叠的DNA还可以包含聚合酶，该聚合酶可以用作隔离物，以防止所述引物的结合，使得将会出现空间位阻，例如，当在DNA的每条链上对于聚合酶没有足够的空间时。随后可除去所述聚合酶和重叠的DNA，以使靶DNA可与所述基质连接、结合或缔合的引物杂交以用于引物延伸，其可以用于扩增目的或用于测序目的。或者，引物可以是具有聚合酶可结合的延伸末端的发夹的形式，从而消除对较长的DNA的需求。即使使用模板的生物素链霉亲和素结合，链霉亲和素的大小(3nm)也可能不足以使DNA分子恰当地间隔开从而存在聚合酶的空间(7至10nm)。在一个实施方案中，可将靶DNA适当地间隔开，以使得不会发生空间位阻。这可以通过以下方式实现：例如，使用具有双链DNA和聚合酶的复合物，其大小小于、类似于或大于将用于测序反应的聚合酶。或者，可以使用结合至双链或单链DNA并且可以具有适当大小的其他蛋白质，包括打算用于随后的测序反应的聚合酶。该聚合酶可以是连续性的，使之在连接过程中保持结合，并且可以进一步具有与之缔合的额外的结合部分，以进一步增强聚合酶在DNA结合过程中保持就位的能力。或者，可以使用除蛋白质以外的部分将DNA间隔开，然后将其去除，从而产生隔开的DNA，以避免空间位阻。在一些实施方案中，可能期望基质的表面可以不被DNA饱和。dsDNA链的直径为20埃(2nm)，不同于可能大于100埃的聚合酶的直径。例如，大肠杆菌22S RNA聚合酶的直径为135埃(Kitano等人，J.Biochemistry1969651-16)；因此，相对于饱和配置中结合至所述基质的dsDNA，使用所述聚合酶间隔开的DNA可以以2%(2^2/13.5^2*100)的饱和水平间隔开。聚合酶的大小可显著变化，例如，据报道嗜热脂肪芽孢杆菌(B.strearothermophilus)DNA聚合酶I的直径为9nm(Kiefer等人Nature Vol.39115304)，与之相比，以前引用的大肠杆菌22S RNAP为13.5nm。在一些实施方案中，可能需要使模板拷贝数与传感器的大小相匹配；因此，在一些实施方案中，可能需要使用数量相对较少的模板拷贝。在其他实施方案中，需要使用大量的模板拷贝。因此，在一些实施方案中，可能需要使用1,000-1,00,000个模板拷贝，或10,000-100,000个模板拷贝，或100,000-1,000,000个模板拷贝。在其他实施方案中，可能需要使用1,000,000-100,000,000个模板拷贝，如1,000,000-5,000,000个模板拷贝、5,000,000-20,000,000个模板拷贝或20,000,000-100,000,000个模板拷贝。
当间距等于聚合酶的大小时、当DNA模板的期望长度很长时，仍可能出现空间位阻，使得许多(如果不是大部分的话)所述DNA不垂直于基质。在一些实施方案中，DNA模板足够长从而“成团”，可能比聚合酶占用基质上的更多的空间。在某些情况下，ssDNA和/或dsDNA结合部分可用于使DNA间隔开，其中所述DNA可以是DNA引物，并且其中所述ssDNA和/或dsDNA结合部分可以结合到其他间隔部分，从而通过间隔和随后去除所述ssDNA和/或dsDNA结合部分和缔合的附加间隔部分来使空间位阻最小化。所述间隔部分可以是其他蛋白质，或者可以是与所述DNA模板期望的具有类似长度的DNA。在一些实施方案中，可取决于所需聚合酶的大小和模板的所需长度，连接的DNA的饱和水平相对于饱和的连接的DNA可以是0.001-40%，或可以是0.01-15%，或可以是0.1-5%，或可以是0.5-2%。
在一些实施方案中，通过在将DNA连接、结合或缔合至基质的同时使用聚合酶或其他间隔物，尤其是比打算用于延伸所述基质连接的引物的聚合酶更大的聚合酶，空间位阻将显著减轻。在进一步的实施方案中，聚合酶还可以具有任何其他的辅助蛋白质或可用于增加该复合物的有效大小的其他部分。
在一些实施方案中，读取试剂溶液的德拜长度类似于去离子水的德拜长度，按照定义其具有10-7摩尔的H+和OH-浓度，和所得的680nm的德拜长度。在其他实施方案中，读取溶液的离子浓度约为1微摩尔，这导致约300nm的德拜长度。这可以允许在反应过程中读取。在其他实施方案中，读取溶液包含可以不是完全水性的溶剂的离子溶剂，从而允许在溶液中有较低的电荷水平，因此能够得到较长的德拜长度，并允许用纳米桥(如本文所述的)来感测更多的珠粒。例如，读取溶液可允许感测直径大于1微米例如2、3、5微米或更大的珠粒。包含非水溶剂的读取溶液可以具有低于蒸馏水的电导率，从而允许与通过本体溶液的电流相比，有更高比例的电流通过与DNA相关的反荷离子。该溶剂可以是与水可混溶的，并且可以具有期望的部分的溶解度；一些代表性的溶剂包括DMSO、醇和醚。所述可混溶的溶剂可以具有较低的固有离子浓度，具有比水更低的H+和OH-浓度。所述溶剂可以与水一起使用，部分地提供低浓度的氢离子。在一些实施方案中，离子浓度可以小于或等于1微摩尔，如1微摩尔至0.5微摩尔、0.1微摩尔至0.5微摩尔、0.01微摩尔至0.1微摩尔、0.001微摩尔至0.01微摩尔、或小于0.001微摩尔。在其他实施方案中，读取试剂的离子浓度可以高于1微摩尔，例如，1毫摩尔、2毫摩尔、5毫摩尔或更高的离子浓度。在一些实施方案中，所述传感器可能能够检测局部电荷、局部电导率或局部氢离子浓度的变化。
用于聚合的许多商业缓冲液含有大量聚合所不需要的氯化钠或氯化钾，并且可以进一步被重度缓冲。例如，通常被描述为适用于Bst聚合酶的NEB等温扩增缓冲液(1X)含有20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、2mM MgSO4和0.1%的吐温-20；NEB phi29DNA聚合酶反应缓冲液(1X)含有50mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM MgCl2和4mM二硫苏糖醇。当使用纳米桥或ISFET作为传感器时，缓冲试剂干扰pH测量，并且高离子浓度产生在使用纳米针传感器时可干扰测量的高背景水平。
因此，在一些实施方案中，期望使用具有较低的pH缓冲液浓度和/或较低的总离子浓度的缓冲试剂。
在一些实施方案中，期望使用离子强度非常低的试剂，以便使德拜长度最大化。对于这类实施方案，可能期望使用不具有比酶反应所需的更多的盐的试剂。对于此类试剂，期望使盐的量最小化，例如使NaCl或KCl的量减少或最小化，并使用足够的Mg。足够的Mg可以包括与试剂中使用的核苷酸的浓度相等的浓度，额外的Mg作为DNA的反荷离子，并且额外的Mg用于流动池中与DNA相关的聚合酶。因此，所需的浓度将是核苷酸浓度、流动池中DNA的量和长度、聚合酶分子的数量以及所用的试剂的体积的函数。
在离子浓度非常低的一些实施方案中，pH可受到周围空气的影响。在使形成碳酸的CO2的存在最小化的任何努力后可能仍然保留的任何残留CO2会降低pH。缓冲试剂有助于离子浓度；因此还期望使缓冲的量最小化。对于在具有足够的缓冲与具有足够低的离子强度之间的矛盾，可通过多种实施方案来实现其缓和需求。一个实施方案同时使用两种缓冲液，例如，组合的Tris和HEPES，而不同于Tris HCl，从而Tris和HEPES两者可以有助于缓冲。理想地，两种缓冲溶液将具有高分子量/电荷来降低移动性。在另一个实施方案中，可以使用可与水混溶的有机试剂，如醇(例如，乙醇)。
在一些实施方案中，期望从缓冲液中消除任何一价阳离子，如Na+或K+，从而避免导致DNA或珠粒上的反荷离子分布变化的相对于二价Mg++的竞争反应。
在一些实施方案中，与珠粒相关联的电荷可缩小电荷/电导率传感器的范围，或降低传感器的信噪比。因此，在一些实施方案中，期望通过例如改变表面上的硫酸根或其他带负电荷的部分的量使珠粒表面上存在的电荷量最小化。在一些实施方案中，可能期望有少量的负电荷，从而使DNA或核苷酸不结合在珠粒的表面上，但是没有足够的电荷，使得传感器的动态范围没有显著降低。在其他实施方案中，珠粒可具有少量正电荷，使得当DNA引物连接时，珠粒变成带负电的。含有溶剂如乙醇的溶液可用于使珠粒溶剂化以允许DNA的连接。
在又另一个实施方案中，可以使用连接而不是聚合。可以使用四个探针寡核苷酸池，其中单个探针池中每个探针的第一碱基是相同的。这些探针可以使用可逆终止的尾部，或者可以具有天然尾部，使得可发生多个连接，伴随信号水平的增加。以类似于使用多种dNTP和聚合酶的方式，可以组合超过一个寡核苷酸池(所有探针从单一碱基开始)，也伴随着连接数和信号水平的增加。可去除第二链并引入新引物，其中所述引物的长度可短于或长于先前引物的长度。
在又另一个实施方案中，连接的DNA分子可具有发夹引物，其中该发夹引物的一部分具有限制位点。随后，在完成引物延伸和样品DNA序列的相关测定之后，该限制位点可被适当的内切核酸酶或切口酶切割，并且可通过改变样品DNA在其中被溶剂化的溶液的温度或pH之一来使延伸的引物解链。而后可在将样品DNA在其中被溶剂化的溶液的温度或pH恢复至适合于引物延伸的条件(包括合适的核苷酸和阳离子浓度)之后对样品进行重新测序。在备选的实施方案中，可以使用链置换酶或具有5’至3’外切核酸酶活性的酶，从而避免对去除第二条链的需要。
在进一步的实施方案中，可以提供可被化学切割的连接，从而避免对酶切的需要。
在一些实施方案中，期望使与聚合酶和/或任何其他辅助蛋白质相关联的反荷离子的数量最小化。因此，可能需要使用更发散的BLOSUM45比对，用非常保守的置换或用保守置换来置换聚合酶中的带电氨基酸如Glu、Asp、Lys、His和Arg，这种非常保守的置换例如分别是Glu到Gln、Glu到His、Asp到Asn、Arg到Gln、His到Tyr、Lys到Arg、Lys到Gln、Lys到Glu，这种保守置换例如是Glu到Arg、Glu到Asn、Glu到His、Glu到Ser、Asp到Gln、Asp到Ser、Arg到Asn、Arg到Glu、Arg到His、His到Arg、His到Gln、His到Glu、lys到Asn、Lys到Ser。所述置换可以是从带电氨基酸到不带电氨基酸，或者可以是从不带电氨基酸到带电氨基酸，其中从不带电氨基酸变为带电氨基酸的氨基酸可与电荷相反的带电氨基酸相邻，由此可在所述带电氨基酸之间共享电荷，从而消除或减少了对反荷离子的需要。
在一些实施方案中，可能期望在直接与流体环境相互作用而不是与所述蛋白质可结合的ssDNA相互作用的蛋白质部分上进行所述置换。在一些实施方案中，可能期望在与所述ssDNA相互作用和结合的位置中加入额外的带正电的氨基酸，以提供更紧密的结合。
例如，如图10中所见(Hollis等人，PNAS98179557)，作为1002的部分以较深的灰色示出了单一SSB(在体内正常为三元的)的带正电的部分，从而示出了结合ssDNA的所述SSB的部分。相反，图10以较深的灰色示出了所述可带正电荷的SSB的部分，作为1000的一部分，并且其因此可导致额外的反荷离子在SSB与ssDNA结合时积累，从而由于电荷对纳米桥的敏感区域的影响，或通过局部增加接近ssDNA的体积的电导率而导致背景电流变化的增加。在一些实施方案中，可对可能是聚合酶或具有ssDNA或dsDNA结合亲和力的蛋白质的DNA结合蛋白进行突变，以使得所述蛋白质与感兴趣的DNA链的结合导致比如果天然DNA结合蛋白与所述感兴趣的DNA链结合时可能发生的更低的背景电流变化。在一些实施方案中，相对于没有蛋白质与所述感兴趣的DNA链结合时的背景电流，由于突变的蛋白质与所述感兴趣的DNA链的结合而发生的背景电流变化可能未导致可观察到的背景电流的变化，这是由于与流体相互作用的突变蛋白质的电荷减少，或是由于突变的蛋白质减少了可与所述感兴趣的DNA链相关的反荷离子的数量，因为所述突变的蛋白质与所述感兴趣的DNA链之间的电荷相互作用增加。在其他实施方案中，相对于没有蛋白质与所述感兴趣的DNA链结合时的背景电流，由于突变的蛋白质与所述感兴趣的DNA链的结合而发生的背景电流变化可导致背景电流降低，这是由于与流体相互作用的突变蛋白质的电荷减少，或是由于突变的蛋白质减少了可与所述感兴趣的DNA链相关的反荷离子的数量，因为所述突变的蛋白质与所述感兴趣的DNA链之间的电荷相互作用增加。
在其他实施方案中，可以提供具有切口位点的引物。在更进一步的实施方案中，可以提供多个相邻的引物，从而避免了对切口内切核酸酶的需要。引物可与连接的引物互补，或者可以与DNA的靶向部分互补。测序引物可包含通过扩增反应用于克隆产生的所有或一部分引物，或者可包含不可以用作扩增引物的一部分的区域，或者可包含用于扩增反应中的引物的区域和不用于扩增反应的区域。
在一些实施方案中，信号测量的质量可依赖于试剂正面撞击传感器的锐度，并且收集时间窗口的大小可以依赖于试剂何时接触传感器，尤其是用于检测由于碱基掺入而导致的瞬时pH变化。波阵面的锐度可通过例如试剂移动通过流体管线、阀和流动池本身时的扩散而降低。为了更好地控制时机和使扩散最小化，尤其是使实现试剂递送所需的时间最小化，可利用电场排斥电荷保持活性试剂，例如，在沿流动池从输入端口到输出端口的长度的初始递送过程中，dNTP可在垂直于传感器阵列平面的轴线上保持远离传感器。随后可将电场关闭或逆转为将试剂拉向传感器。在一些实施方案中，可在不同时间于传感器阵列的不同部分上激活电场，以允许更好地控制读出时间窗口。
在一些实施方案中，试剂通过流动池的流动可以是层流，并且递送至反应室/在反应室顶部递送的试剂将停留在那里，仅由于在垂直于试剂流动的轴线上的扩散而发生混合。这可以用于延迟掺入，直至需要时。在一些实施方案中，层流和电场可以组合起来以控制向传感器的递送。
在其他实施方案中，可以保持温度较低，以使得在递送试剂时聚合酶活性最小化，然后提高以使反应开始。
为了使扩散效应最小化，序列分析所需的所有核苷酸可存在于系统中，并且仅有的反应触发因素可能是镁离子。镁离子比其他反应成分如聚合酶和dNTP具有更高的扩散速率。在这些或其他实施方案中，储件和反应的温度可以保持在低于聚合酶的激活温度。因此可通过精确的温度控制来触发反应，从而克服了扩散限制。例如，在这些实施方案中，阵列的平行反应可以是几乎同时的。激活温度是本领域中已知的，和/或可以针对任何特定实施方案而经实验确定。Klenow聚合酶的激活温度为约4℃，而Taq的激活温度为约60℃。在另外其他的实施方案中，可以通过引入所需的反应辅因子来触发反应，该反应辅因子可在反应前被隔离在纳米粒子或囊泡中，并利用适当的外部刺激(例如，激光或温度)而释放。
在一些实施方案中，作为样品制备过程的一部分，“条码”可以与每个样品进行关联。在该过程中，将短的寡核苷酸添加到引物上，其中每个不同的样品除引物之外还使用不同的寡核苷酸。将引物和条码连接到每个样品上，作为文库生成过程的一部分。因此在与产生每个集落相关的扩增过程中，引物和短寡核苷酸也得到扩增。因为条码的关联是作为文库制备过程的一部分进行的，所以可能在产生克隆群体中使用超过一个文库，并因此使用超过一个样品。可以包括合成DNA条码作为引物的一部分，其中针对每个文库可使用不同的合成DNA条码。在一些实施方案中，当将不同的文库引入流动池时可将它们进行混合，并且可作为测序过程的一部分来确定每个样品的身份。
样品分离方法可以与样品标识符一起使用。例如，芯片可以有4个独立的通道，并使用4种不同的条码，以允许16个不同的样品同时运行。这允许使用更短的条码，同时仍提供明确的样品鉴定。
纳米传感器和检测方法与系统
在一些实施方案中，利用电荷或pH敏感的检测器确定DNA集落的序列。集落可在珠粒上产生，可将珠粒转移至设置有引物、聚合酶和dNTP的传感器位置，同时观察由于dNTP的掺入而导致的电荷或pH的变化。在传感器位置与集落之间可能存在一一对应。
在本文公开的装置的实施方案中，采用多个纳米针传感器，它们具有以圆弧形状形成的至少一个电极，该圆弧形状符合所述多个磁珠中的一个位于其中的凹陷的边缘。
纳米传感器是设计为检测对于非球形珠粒或粒子在直径或长轴上测量为小于0.1、1、5、10或20微米之一的珠粒或粒子的传感器。或者，传感器可以对与所述珠粒或粒子缔合的部分或对与反应产物或副产物缔合的部分敏感，其中所述反应包括与所述珠粒或粒子缔合的部分。所述部分可包括DNA片段、氢离子或其他离子，所述其他离子可以是反荷离子，因此与所述珠粒或粒子或同所述珠粒或粒子结合或缔合的部分相关联。纳米传感器可以包括纳米桥、纳米针或ISFET传感器。纳米针可以是包括两个电极的阻抗测量传感器，该电极定位为用于测量电极的有源区之间的局部环境的电导率。“纳米桥”是指电阻器件，该电阻器件可包括可响应于接近所述电阻器件的有源区的电荷的传感器，并且其中所述电阻器件还可以是半导体器件。
在一些实施方案中，如在题为“Integrated system and methods forpolynucleotide extraction amplification and sequencing”的美国临时申请61/389,490(其通过引用整体并入本文)中所述，纳米针作为pH传感器起作用。
这些传感器可用于检测与在US7,932,034(其通过引用整体并入本文)中所述的掺入事件相关的瞬态特性。
在本文公开的装置的实施方案中，采用多个纳米桥传感器，它们具有部分环绕并且十分接近多个磁珠之一的有源区。例如，有源区的半径可能小于磁珠的半径。
在该装置的实施方案中，多个纳米桥传感器适于测量核苷酸向多核苷酸中的掺入，并且每个纳米桥传感器均具有有源区和导电元件。导电元件具有与有源区的功函数相匹配的功函数。
在本发明的一些实施方案中，传感器可以是纳米针传感器、纳米桥传感器、ISFET传感器、chemFET、纳米线FET、碳纳米管FET、其他类型的电荷、电导率或pH检测传感器，或不同类型的传感器在每个传感器位置处的组合，其中珠粒或集落可定位为用于测序反应。单个传感器可以仅使用单一的模式例如电荷、电导率或pH进行检测，或者单个传感器可以使用超过一种模式如响应于电荷和pH进行检测。这些传感器可以提供类似的信息，或者他们提供补充信息。例如，在传感器位置处的一个传感器可响应于pH的变化，而在传感器位置处的另一个传感器可响应于电导率的变化。在一些实施方案中，一个传感器可以检测pH、电导率或电荷的局部变化，而另一个传感器用作参考。在一个实施方案中，可放置参考传感器使其不接触任何试剂，并且可用于补偿温度、电源电压等的变化。
电荷浓度的变化可起因于其他来源，包括DNA与直接连接到传感器上的DNA的结合，该传感器可以是纳米桥、纳米针或FET，或者可起因于带电荷的cDNA、RNA、蛋白质、脂类、糖类的结合；电荷的变化还可起因于酶促反应，或可充分局部化为主要发生在一个传感器的感测区域内以及另一个传感器的感测区域内的任何其他化学反应。
在一些实施方案中，使用纳米针传感器、纳米桥传感器和磁性保持结构的组合。该纳米针结构可位于构成磁阵列元件的磁结构下方，或者纳米针结构可位于构成磁阵列元件的磁结构的顶部。在其他实施方案中，纳米针可与构成磁阵列元件的结构呈正交或一些其他角度地定位。
在一些实施方案中，纳米针传感器可以测量由于通过DNA聚合事件产生的离子而导致的阻抗变化。
在其他实施方案中，纳米针测量由于DNA的掺入而导致的阻抗表面的变化。DNA的每个碱基具有负电荷。由于碱基的加入，电荷变得更为负性。这种额外的电荷吸引了阳性反荷离子，该反荷离子可以改变DNA涂覆的珠粒表面的电导率。这种阻抗变化也可能起因于结合至DNA的分子。因为电荷是与固定分子(结合至珠粒的DNA)相关联的，局部流体环境相比聚合条件发生改变。例如，一种缓冲液可用于碱基掺入，而第二种缓冲液可用于测量电导率相比以前的测量的变化。
在一些实施方案中，纳米针传感器被配置用于测量将碱基加至连接至珠粒的模板DNA上时所述珠粒的阻抗变化。在其他实施方案中，所述DNA模板可与基质或所述基质上的涂层连接或缔合，或者可与装置的电极或所述电极上的涂层连接或缔合。为了提高性能，期望减少其他阻抗。
传感器的阻抗可以由其他阻抗支配。例如，如果纳米针电极与DNA所结合的珠粒之间的物理对准不好，则电极和与珠粒相关的德拜层之间的本体试剂的阻抗相对于通过与珠粒相关的德拜层的阻抗可以是很大的。例如，如果本体试剂的阻抗构成电极之间的总阻抗的90%，并且珠粒上的DNA及其相关的反荷离子的阻抗构成电极之间的总阻抗的10%，则DNA及相关反荷离子的阻抗的1%的变化将导致电极之间总阻抗的0.1%的变化。如果本体溶液的离子浓度很高，则电极之间本体试剂的阻抗相对于通过与珠粒相关的德拜层的阻抗可能是很小的。
图16示意性地图示了具有珠粒的纳米针传感器的简化电路1600。该传感器可以具有寄生电容1614和寄生电阻(未示出)。该传感器还可以具有与每个电极1612相关联的双层电容1610。由与珠粒结合、连接或缔合的DNA或其他样品相关的反荷离子所产生的电阻1606，可以与由本体流体所产生的电阻1602、由通过与珠粒表面上的电荷相关的反荷离子的电导率产生的电阻1606以及由通过与传感器表面上的电荷相关的反荷离子的电导率产生的电阻1608相并联。可增加复杂性的该电路的额外部分包括双层电容1610之间的电阻(未示出)和由通过与珠粒表面上的电荷相关的反荷离子的电导率产生的电阻1606，以及由通过与传感器表面上的电荷相关的反荷离子的电导率产生的电阻1608。
因此，在一些实施方案中，需要使两个电极和珠粒之间的距离最小化。在其他实施方案中，需要测量来自尽可能多的珠粒的反荷离子，从而允许从所述珠粒的尽可能多的完整表面进行平均。在一些实施方案中，可能需要将所述电极定位于所述珠粒的两侧，从而允许电流以尽可能平稳的方式流过所述珠粒的整个表面。在其他实施方案中，期望具有尽可能不那么小的电极，以使得从所述电极发出的电流路径的电流密度不会显著高于电流路径中电流密度最小的点的电流路径。例如，如果可以将电极制成无限小，那么所述无限小的电极发出的电流密度将无限大。在另一个实例中，电极包含处于所述珠粒相对端的球冠，并且由球冠形成的圆的圆周为所述珠粒的大圆长度的一半。最大电流密度将是球冠处的两倍，因为它处于球冠之间的大圆的中部。在一些实施方案中，珠粒表面上最大电流与最小电流的比值可以是2:1；在其他实施方案中，珠粒表面上最大电流与最小电流的比值可以为2:1至3:1、3:1至4:1、4:1至6:1、6:1至9:1、9:1至15:1、15:1至30:1或30:1至100:1。
在一些实施方案中，利用半导体技术来制造电极，并且与珠粒相邻的电极区域具有等于电极厚度的高度。可能需要保持电极与珠粒有小的距离，如从0.1德拜长度到0.3德拜长度，从0.3德拜长度到1.0德拜长度，从1.0德拜长度到3.0德拜长度，从3.0德拜长度到10.0德拜长度，或从10.0德拜长度到100德拜长度。德拜长度被认为是所述珠粒和所述电极的德拜长度的相加组合。或者，可期望电极具有珠粒的大圆的一半圆周的一部分的长度。所述部分可以为所述珠粒的大圆的一半圆周的0.01至0.03，所述珠粒的大圆的一半圆周的0.03至0.1，所述珠粒的大圆的一半圆周的0.1至0.3，所述珠粒的大圆的一半圆周的0.3至0.75。在一些实施方案中，该系统保持了电极和珠粒之间的距离，并制造了电极使其成为珠粒的大圆的一半圆周的一部分。
在一些实施方案中，可能期望降低通过本体试剂的电流，以便使通过与珠粒结合、连接或缔合的DNA相关的反荷离子的测量电流部分最大化。因此，在一些实施方案中，期望以物理方法降低接近于珠粒的本体试剂的体积，以使得DNA反荷离子的阻抗贡献最大化。在其他实施方案中，期望使将珠粒保持在靠近用于测量DNA反荷离子的电极的结构的表面积最小化。在另一个实施方案中，期望使珠粒的ζ电势和/或将珠粒保持在靠近用于测量DNA反荷离子的电极的结构的表面最小化。
纳米针结构可以制造于纳米针阵列中，从而允许同时对大量的单一DNA分子或集落进行测序。
如图17所示，纳米针传感器结构1700可以利用硅基质1701来制造，并且可具有蚀刻于所述基质中的800nm深的通道1702。200nm厚度的氧化硅层1703可以在基质上制造，接着是80nm厚度的导电性p+硅层1704，接着是30nm厚度的氧化硅层1705，接着是80nm厚度的导电性p+硅层1706，而后是20nm厚度的氧化硅层1707。可在该结构被制造后创建通道。可产生该结构以使得氧化物层或抗蚀剂层覆盖可以在最终结构中保留的所有部分。可利用化学湿蚀刻、等离子体蚀刻或气相蚀刻来从该结构下面去除硅或其他相似的基质。然后可以使用离子研磨步骤暴露出该结构的导电尖端。
所有厚度均可变化，材料也是。基质中的通道可备选地使用氧化物层、利用抗蚀剂层在通道体积中制造。然后可在氧化物和抗蚀剂的顶部制造氧化物层和导体层，从而避免对钻蚀(under-etch)该结构的需求。图18图示了以与图17中示意性描述的相似的方式制造的单端纳米针阵列。
如图19所示，这样的结构可在基质1903中形成的通道1902的两侧具有传感器1901。聚合酶和/或靶DNA1904可连接至传感器的有源区。传感器本身可用于将聚合酶和/或靶DNA电泳和/或介电泳地定位至该传感器的有源区。靶DNA可以是单一双链、单链DNA靶标或环化的DNA靶标，或者可以在该传感器的有源区的适当位置上进行局部扩增，如PCT/US2011/054769所述。图20图示了以与图19中示意性描述的相似的方式制造的交叉的纳米针阵列。
然后可以提供核苷酸或探针1905，并且可以开始合成测序过程或连接测序过程。
为了提高纳米针或纳米桥的灵敏度，可提供局部放大器。放大器可以是BJT或FET。在一些实施方案中，放大器针对每个传感器使用一个放大器电路，或者使用共享相同放大器的多个传感器。在其他实施方案中，一些扩增可以与每个传感器相关，并且附加扩增和/或其他相关电路在不同的传感器之间是共享的或多路复用的。该传感器可以被制造成狭窄的结构，并且可以在该结构下被蚀刻以使得两侧可以获得pH的变化或电导率的变化。该装置的表面可以是粗糙的，从而允许有更大的表面积用于结合样品分子。与纳米针的电极相关联的表面可以是金或铂，或者可以是铂黑、氧化铱或Ppy/PSS，以增加表面积和相关的双层电容。
可以实现离子的电集中，从而集中纳米针或纳米桥传感器的有源区所需的DNA、聚合酶、引物、核苷酸和其他试剂。所述集中允许更多样品与每个传感器连接或缔合，从而减少对全基因组扩增的需求。
可阻止对珠粒上DNA阻抗的最佳测量的另一个因素包括由与珠粒表面的ζ电势相关的德拜层导致的反荷离子和/或由与传感器表面的ζ电势相关的德拜层导致的反荷离子。这些反荷离子可导致与珠粒上DNA的反荷离子相关的期望电流可以是串联和/或并联的电流。另外，随着ζ电势的变化，德拜长度和相关的反荷离子的数量可以一致地变化。所述ζ电势可随着缓冲液条件的变化(包括pH值、盐浓度和各种其他因素的变化)而变化。所述一致变化因此可混淆对DNA的测定。因此，期望使ζ电势最小化，并使ζ电势随缓冲液条件变化的变化最小化。
在一些实施方案中，可利用硅来制造传感器。二氧化硅在通常对聚合活性有用的pH(如pH7-9)下具有显著的ζ电势大小；但氮化硅的ζ电势的大小显著小于二氧化硅的ζ电势。因此，在一些实施方案中，将氮化硅用于硅传感器装置和任何可与硅传感器装置进行接触的组件之间的界面上，从而使通过可能位于相关的德拜层中的反荷离子的ζ电势和伴随电流最小化。
在一些实施方案中，在传感器的表面上施加涂层。该传感器可以由硅、二氧化硅、PDMS、TopazTM或其他各种聚合物或它们的组合来制造，其中所述电极和/或涂层可以包括诸如TiO2、ZrO2或氧化铟锡、BaTiO3的材料，以使得ζ电势和得到的德拜层显著降低。在其他实施方案中，掺入表面涂层如PEG(聚乙二醇)、PTFE、聚L-赖氨酸、丙烯酸酯、甲基纤维素、正十二烷基-B-D-麦芽糖苷、丙烯酰胺、氟化烷烃链或其他交联的或部分交联的聚合物来改变ζ电势，或者利用表面涂层的组合类似地使ζ电势和伴随的德拜长度最小化。在其他实施方案中，通过用可减少可电离硅烷醇基数目的化合物如三甲基氯硅烷保护硅烷醇基来降低ζ电势的大小。
在一些实施方案中，需要降低其上连接有待感测的DNA的珠粒的ζ电势，从而降低由于所述ζ电势所致的、由与珠粒表面相关联的反荷离子产生的伴随电流。因此，在一些实施方案中，希望用在预期可有效聚合的pH水平时具有低ζ电势的材料制造珠粒，或者该珠粒可以用在预期可有效聚合的pH水平时具有低ζ电势的材料进行涂覆，例如PEG(聚乙二醇)、PTFE、聚L-赖氨酸、丙烯酸酯、甲基纤维素、正十二烷基-B-D-麦芽糖苷、丙烯酰胺、氟化烷烃链或其他交联的或部分交联的聚合物用于改变ζ电势，或者可以利用表面涂层的组合类似地使ζ电势和伴随的德拜长度最小化。
在一些实施方案中，期望使可由缓冲试剂导致的pH的变化最小化，同时可期望使离子浓度最小化。因此，需要使用具有低缓冲能力同时保持固定的pH的试剂。在一些情况下，作为试验或方法的一部分，可将缓冲液进行脱气；而后当CO2溶解至缓冲试剂后，所述缓冲液可经受pH的变化。在一些实施方案中，可能需要限制CO2与缓冲试剂之间的相互作用。因此，可能需要排除大气气体，并提供不包括CO2的其他气体如氮气、氩气或其他纯化的气体，或不含CO2的气体或可能以其他方式溶解在所述试剂缓冲液中的其他气体的混合物，并因此改变离子浓度和/或pH。
在一些实施方案中，该系统包括外部气体源如工业气瓶。在一些实施方案中，所述气瓶位于流体所在的仪器的外部。在其他实施方案中，将工业气瓶放置在仪器内的隔室内。在其他实施方案中，使用CO2洗涤器/脱气器/脱泡器，如可再生的金属氧化物系统、Kraft工艺系统、活性炭系统、可使用诸如Systec
Figure BDA0000462836930000871
或PoridexTM的膜的膜系统。所述CO2洗涤器/脱气器/脱泡器可内置于所述仪器内，或者可以在所述仪器的外部。
在一些实施方案中，可能需要使传感器如纳米针传感器的传感器电极极为靠近珠粒，以便使在纳米针电极和珠粒之间的本体试剂体积的量最小化。一个实施方案可如图2A、2B和2C所示在凹陷中保持有珠粒。凹陷可由沉积在基质上的材料形成，并且形成凹陷的材料可以在所述材料上形成一对纳米针电极。该电极可以以圆弧形成，该圆弧符合该凹陷的边缘，因此符合珠粒的边缘。在一些实施方案中，所述凹陷可在一侧或两侧充分地易接近流体，或者所述凹陷具有小于1.0的宽深比，或者可具有1.0-0.9、0.9-0.8、0.8-0.7、0.7-0.6、0.6-0.5、0.5-0.4、0.4-0.3、0.3-0.2、0.2-0.1或0.1-0.01的宽深比。
在一些实施方案中，所述凹陷使接近珠粒的试剂的体积最小化。可使凹陷成形以符合珠粒的形状，由此凹陷的底部比凹陷在电极的高度上的横截面更狭窄。在其他实施方案中，电极被附加的材料层覆盖，使得凹陷的有效深度大于珠粒的直径的一半，从而进一步降低了接近珠粒的本体试剂的体积。
电极因此可接触珠粒的表面，或者可在珠粒或粒子表面和与之连接或结合的DNA的德拜长度内。在一些实施方案中，电极是弯曲的，使得电极符合具有与珠粒的半径相似的半径的曲线，从而允许电极与珠粒之间更好的耦合。这样的装置允许使本体试剂溶液对纳米针电极之间的总阻抗具有最小的影响，以及使连接或结合至珠粒或粒子表面的DNA或DNA附近的反荷离子具有最大的影响。
在一些实施方案中，纳米针具有成形为适合珠粒或其他样品保持机构的传感器的有源区。例如，它可成形为弧形，具有定向为与珠粒的曲线对准的圆弧曲线。它也可以具有配置的一对纳米针中的一个纳米针，以使得它偏移或“短于”所述纳米针对中的另一个纳米针，使得该圆弧的内半径具有较大的直径和相同的质心。所述偏移可允许与纳米针对相关的感测区域的体积的增加，并且还可以改变与感测区域相关的场的定向，并因此改变感测区域的定向，从而使感测区域更多地朝向珠粒的中心，而不是平行于基质。
在示意性侧视图图21A和示意性俯视图图21B中所示的备选实施方案中，一个电极2105可直接连接至基质2102上或所述基质的另一个层上，从而允许与所述基质分离。纳米针的第二电极2105可以连接在用于将珠粒或粒子2101定位于固定位置的传感器的电介质2113部分上。因此，珠粒或粒子2101与两个电极2101、2105接触，从而使本体试剂溶液对纳米针电极之间的总阻抗的影响最小化，这不同于与珠粒或粒子或连接或结合至该珠粒或粒子上的DNA相关的德拜长度内的反荷离子所导致的阻抗。
在一些实施方案中，可以制造一个或两个电极，以使得所述电极符合珠粒的曲线，以便在电极和珠粒之间提供更低的且更规则的阻抗。该弯曲可以邻接凹陷的边缘，或者可以稍微远离凹陷的边缘，以允许得到较大的界面面积和较低的电流密度。
在如图21C中所示的另一个实施方案中，可将珠粒或粒子2101在基质2102上保持就位。纳米针2100的第一电极2105A可以直接地连接至基质2102上，或连接至粘附于所述基质2102的粘附层(未示出)上。而后可制造介电层2114以覆盖所述第一电极2105A。然后可在电介质2114和纳米针2100的所述第一电极2105A上制造纳米针2100的第二电极2105B。第二电极2105B可能较短，以便符合珠粒或粒子的曲线。长度的差异将是珠粒或粒子2101的直径和电极2105之间的两个电极2105和电介质2114的厚度的函数。以这种方式，电极2105可与珠粒或粒子2101接触，或者可以非常接近珠粒或粒子2101，以使得由与珠粒或粒子2101和连接或结合至珠粒或粒子2101上的DNA相关的德拜长度内的反荷离子导致的阻抗大于本体试剂的阻抗。
在另一个实施方案中，制造电极以使得所述电极不邻接凹陷的边缘，而是可以制造为与边缘相距短距离，以使得可减小十分接近电极的电流密度。
在图22A中，在侧视图中示意性地图示了纳米针2200，其中所述纳米针2200在电介质2203中的凹陷的每一侧具有电极2205，其中可将珠粒2201保持在基质2202上，并且可以对所述电极2205使用金属镀层2204。如图22A中所示，介电材料2203的厚度可类似于珠粒2201的直径的一半，并且凹陷的宽度可稍大于珠粒2201的直径，同时仍允许珠粒2201处于所述珠粒2201相对于两个电极2205的德拜长度内。电介质2203的所述厚度可以是允许保持珠粒2201的厚度，并且保持所述珠粒2201在两个电极2205的所述珠粒2201的德拜长度内。
在图22B中，在侧视图中示意性地图示了纳米针2200，其中该纳米针2200在电介质2203中的凹陷的每一侧具有电极2205，其中珠粒2201保持在基质2202上，并且对电极2205使用金属镀层2204。如图22A中所示，介电材料2203可小于珠粒2201的直径的一半，介电质材料2203的厚度可能是珠粒直径的四分之一到三分之一，并且凹陷的宽度可小于珠粒2201的直径，以使得珠粒2201悬停于基质2202上。珠粒2202和电极2205极为接近保持了珠粒2202和电极2205之间的空间接近，使得珠粒2201位于两个电极2205的珠粒2201的德拜长度内。
在图22C中，在俯视图中示意性地图示了纳米针2200，其中纳米针2200具有电极2205，由于介电材料2203中的凹陷的直径小于珠粒2201的直径，导致电极2205弯曲以便保持与珠粒极为接近，使得珠粒在相应于珠粒2201与电极2205之间的接触点或紧密接近点的圆弧上保持十分接近。
图22D是类似于图22B和图22C的纳米针结构2200的透明三维立体图，但有大量的通向珠粒2201的流体入口。珠粒2201保持悬停在基质2202之上，并且抵靠电极2205A保持(and is instead held againstelectrodes2205A)，其在介电材料2203上制造，其中电极2205A和介电材料2203成形为处于所述珠粒2201的德拜长度内，但并不弯曲以匹配珠粒2201的曲率，以使得珠粒和电极2205和/或介电材料2203之间不是线接触，而是在珠粒2201和电极或介电材料2203之间存在三点或四点接触。图23D还示出了施加力以将珠粒2201在纳米针结构2200中保持就位的磁体2208。
纳米针可以配置为双螺旋或蛇形模式，以增加纳米桥通道的长度，并同时降低其宽度。感测区域太宽将会具有比较低的阻抗，并且可以具有比其他区域(例如，与珠粒的中心相比在珠粒的边缘处)具有更小的局部电荷密度变化的感测区面积。“太宽”的感测区因此还可具有较小的阻抗变化，因为该感测区仅有一部分可受到导致电荷局部变化的结合或反应的显著影响。相反，太长、太薄的纳米针可能具有大阻抗以致任何电流变化可能太小而不能以良好的信噪比进行感测。因此，与纳米桥传感器相关的通道的宽度和长度将需要针对打算使用所述纳米桥传感器的特定应用进行调整。
在一些实施方案中，纳米针被配置为具有数个有源区作为单一纳米针的一部分。有源区位于相对于单一样品的不同位置，提供来自样品区的数个不同区域的平均值，以使得样品区位置的变化，例如，珠粒相对于传感器的轻微不对准或表面上装填密度的变化，将对传感器的信噪比具有较小的影响。
流动电势最初在1859年由Quinke观察到，并且是毛细管中众所周知的现象；它是流体的流速、ζ电势和电导率等因素的函数。因此，可在纳米针上施加电压，并且流速或电极之间的距离的变化可导致施加在纳米桥上的偏压的空间或时间变化。
在其他实施方案中，期望将纳米针电极平行于流体的流动而定向，以便不会有在纳米针的电极之间施加的潜在可变流动电势，如果电极与所述流体的流动正交则将会出现这种情况。
在一些实施方案中，纳米针与关联于一个或两个电极的局部电容器或电容器耦合，以防止来自驱动电路的DC偏压水平的影响或从芯片传感器内的泄露影响输出信号。
在进一步的备选实施方案中，使用如图23中所示的纳米桥传感器结构2300代替上述纳米针传感器。该纳米桥传感器可以以与纳米针相同的方式使用，包括使用环化的或线性DNA、线性或发夹引物、针对纳米桥描述的聚合酶，并且可以制造成阵列。
该纳米桥传感器结构2300可包含绝缘体上的硅器件，该器件包括基质2360、介电绝缘体2310、两个较高掺杂的半导体区域2304A和2304B、较低掺杂的半导体有源面积区(active area region)2305、进一步的金属化层2340，该金属化层2340可以覆盖所述半导体有源面积区2305，并且可在所述半导体有源面积区上具有另外的介电涂层2350。
在一些实施方案中，纳米桥感测电荷的局部变化。邻接流动池的纳米桥表面的表面电荷的变化可能是由流动池第二层中的电荷变化造成的。纳米桥表面上的这些电荷变化随后可能会改变纳米桥中的电荷分布，并因此改变纳米桥的电导率。具有电荷变化的纳米桥表面的区域可能因此具有在纳米桥的相关体积中的导电性的变化，而纳米桥的其他表面区域可能不具有表面电荷的变化，并因此可能不具有其相关体积中的导电性的变化。取决于构建纳米桥的半导体材料的类型(n或p型)，纳米桥半导体材料中掺杂的量和均匀性，和纳米桥表面上电荷的符号(正或负)，以及电荷的变化是表面电荷的量或密度的增加还是减少，均可增加或降低导电性。
在一些实施方案中，位于德拜长度内的珠粒上的电荷变化引起局部存在于双层的两个层中的电荷量或浓度的相应变化。电荷量的所述变化直接与局部离子浓度有关，并因此还与表面层的电容以及德拜长度内试剂的导电性有关。根据表面层的相对电荷和珠粒上的电荷变化，所述电荷变化可以是增加或减少。
在用于对克隆珠粒进行测序的一些实施方案中，使用纳米桥传感器。该纳米桥传感器可以以类似于纳米针的方式使用。
在一个备选的实施方案中，纳米桥检测局部温度变化，并因此部分地充当温度传感器。
在一个备选的实施方案中，纳米桥可以被配置为作为温度传感器和/或pH传感器来运行，以便检测核苷酸的掺入。在题为“Heat and pHmeasurement for sequencing of DNA”的美国专利申请20080166727中对该方法进行了进一步描述，该申请整体并入本文。
本发明提供了基于pH和/或温度检测用于多核苷酸测序的方法和系统。在一些实施方案中，该系统和方法可以进一步采用(或备选地采用)允许视觉或光学检测pH和/或温度变化的染料或量子点。这种监测可以允许本体溶液的监测，或者可以允许与每个集落相关的体积的局部监测，或者可以允许本体溶液和与每个集落相关的体积两者的监测。
在其他实施方案中，钻蚀纳米桥传感器阵列，从而使通道的大小进一步最小化，并且使与DNA测序反应产生的电荷相互作用的表面积最大化。在其他实施方案中，纳米桥传感器阵列可以不进行钻蚀，或可以部分地蚀刻，以提供更稳固的结构。在更进一步的实施方案中，配置纳米桥传感器阵列使其以梳状配置布置，传感器从两侧在彼此之间交错，潜在的特征如潜在的放大器交替布置在一侧上，然后布置在另一侧上。在另一个实施方案中，布置纳米桥传感器阵列，使得潜在的特征，如放大器，均布置在传感器阵列的一侧。
在一些实施方案中，配置纳米桥传感器，使得为了感测应用具有最佳灵敏度，感测通道的宽度和长度对准。变化可与以下因素有关：样品区域的间隔和大小，与感测期望部分相关的电荷，以及非感测区域中纳米桥的阻抗，如感测区域与局部放大器之间的纳米桥的导电部分，或其他相关阻抗。
在一些实施方案中，如图24A、图24B以及图24C中所示，传感器是纳米桥传感器2400，其中制造有源区，使得该有源区部分地环绕珠粒或粒子2401，并且十分接近珠粒或粒子2401。该传感器可包含基质2402，在基质2402上可以施加介电和/或半导体材料层2403。可制造纳米桥的有源区2405使得它主要环绕珠粒或粒子2401。金属化线2404可以连接至半导体材料的更加高度掺杂区2404A，其然后与纳米桥的有源区2405接合。图24A是“环”纳米桥的侧视图，其中有源区2405的内部部分在珠粒或粒子和可与之结合的DNA的德拜长度内。有源区可以部分或完全地处于珠粒或粒子的德拜长度内，从而导致整个有源区的阻抗响应于与珠粒或粒子结合或缔合的电荷的变化和/或核苷酸或核苷酸类似物的掺入事件而变化。可以设置该环和相关支撑结构2403的直径的大小，使得珠粒紧密地适配在环内。
备选地，如图24B中所示，环和支撑结构2400的大小可设置为小于珠粒或粒子2401的直径，以使得珠粒可搁置在纳米桥的有源区2405的环上，尤其是当通过磁场进行保持时，从而确保该环处于珠粒或粒子2401和与之结合的DNA的德拜长度内。图24C是利用环结构实施的纳米桥2400的俯视图，示出了珠粒2401在纳米针的有源区2405上的重叠，和提供用于测量有源区2405的阻抗的手段的电导体2404。
在一些实施方案中，对纳米桥传感器的形状进行了优化，以提供与磁性或顺磁性粒子的更大的相互作用。所述纳米桥传感器可以成形为螺旋形、蛇形或其他非线性形状或具有可变横截面的形状，以便提供更大的表面积，同时保留供电流通过纳米桥通道流动的狭窄通道。
电导体2404可连接至纳米桥的重掺杂区(未示出)，其然后提供与纳米桥的有源区2405的电连接。或者，纳米桥的电导体2404可直接连接至纳米桥的有源区105，其通过制造纳米桥电导体2404而具有欧姆连接，使得功函数与纳米桥的有源区2405的功函数相匹配。铝的功函数的值接近于轻掺杂硅的功函数的值，但是不是完美匹配。为了产生更完美的匹配，可备选地使用铝合金。
流动电势最初在1859年由Quinke观察到，并且是毛细管中众所周知的现象；它是流体的流速、ζ电势和电导率等因素的函数。因此，可在纳米桥ISFET或其他chemFET传感器上施加电压，并且流速或电极之间的距离的变化可导致施加在纳米桥上的偏压的空间或时间变化。
在一些实施方案中，可能需要使用可在阵列中的不同纳米桥或ISFET传感器之间制造的参比电极，以减少施加在传感器的敏感区域上的偏置电压的变化。在一些实施方案中，在所述纳米桥或ISFET阵列基质上，在阵列纳米桥或ISFET中的每个纳米桥或ISFET之间制造参比电极。所述电极可通过金属化互相连接作为所述纳米桥或ISFET阵列的制造的一部分。在其他实施方案中，所述电极组使用金属化互相连接，作为所述纳米桥或ISFET阵列的制造的一部分。在其他实施方案中，制造参比电极，使得在纳米桥或ISFET阵列中的每个纳米桥或ISFET之间具有固定或可变数目的纳米桥或ISFET传感器。在进一步的实施方案中，偏置电压差可以由软件或固件进行补偿，其中可对偏置电压的影响进行测量和绘图，并且所述图用于补偿来自纳米桥或ISFET阵列的信号水平的变化。
在一些实施方案中，利用参比电极相对于传感器电极或传感器器件的有源区偏置试剂流体，其可以是纳米桥和/或纳米针阵列或chemFET。在一些实施方案中，参比电极被配置为传感器器件的一部分。在进一步的实施方案中，存在多个参比电极，其中一个或多个参比电极是与传感器器件相关的流动池的一部分或与之相关联。在其他实施方案中，两个或更多个参比电极与传感器器件相关联。在一些实施方案中，多个参比电极在该阵列的所有成员处保持基本上相似的试剂电压，这在流体厚度足够薄以在传感器阵列表面上允许有显著阻抗的流动池中可能是困难的。
在一些实施方案中，可提供至少一个附加电极以偏置流动池中的本体试剂溶液。该电极可以是在其他时间用于集中样品和/或其他试剂的相同的电极。在一些实施方案中，施加在电极上的电压可用于将检测器偏置在其响应曲线的最佳点上，例如，以提供适当的偏移量，以优化增益量，其可在模拟-数字转换器的可用动态范围内提供最大的信号，从而可以使A/D量化误差最小化。
在一些实施方案中，可随着测序反应的进行对偏置水平进行修改，并且接近传感器的电荷量发生变化。在一些实施方案中，可使用传感器进行读取，之后，偏置水平可发生改变，接着再次读取传感器，以致可观察到由改变偏置电压而造成的任何非线性或不期望的偏移，并且可通过软件进行补偿。在一些实施方案中，在珠粒或集落上或其附近提供正电荷，以使得可使该传感器偏置到适当的水平。
在一些实施方案中，多个参比电极可以与纳米针传感器、纳米桥传感器、ISFET传感器或chemFET传感器一起使用。
电子传感器如chemFET可设计成具有宽的动态范围，如具有一些pH传感器的情况。它们可备选地设计为具有较小的动态范围，但具有较高的灵敏度。在一个实施方案中，通过在系统中包括偏置有源区的额外的元件，对传感器的动态范围和传感器的灵敏度进行优化。所述元件可以是一个或多个参比电极，其中可在参比电极与传感器(例如，chemFET或纳米桥)的有源区之间施加可变电压。电压的调节可允许高度灵敏的检测，尽管与传感器相互作用的电荷的量有广泛的变化。例如，可优化传感器以用于其中靶DNA为100个碱基对长的测序反应。备选地，如果靶DNA为1000个碱基对长，则传感器在该传感器的动态范围内可能不再工作。而后可调节参比电极和有源区之间的电压，以便允许该传感器在其动态范围内工作。如果在测序反应过程中，延伸的引物已经延伸至500个碱基对，则传感器可能再次不再处于其动态范围内。可再次改变参比电压，以使传感器处于其动态范围内。此外或备选地，可以几乎相同的方式使用背栅。在进一步的改进中，可将背栅分段，使得可以有背栅的不同部分针对传感器阵列的不同区域。可能具有许多部分，以致针对每个传感器可能具有单独的背栅，从而允许补偿不同的序列依赖性的引物延伸速率。
在一些实施方案中，当采用纳米针传感器、纳米桥传感器、ISFET传感器或chemFET传感器时改变参比电压。
在一些实施方案中，对聚合酶的掺入进行测定，以确定DNA靶标的序列。通常可能需要多次测定，以便确保正确地捕获和测量掺入谱，例如，以便确定在均聚物运行中已经掺入的碱基数。这样的测定可以测定掺入反应的副产物，如PPi或水合氢离子。对于传感器的大阵列，这样的测定可能需要非常高的数据采集速率，这可能会挑战传感器的灵敏度，防止不足的信噪比，以提供与测序数据相关的期望错误率。权衡(trade off)与相位错误和因此产生的读取长度相关的误差、以及与精确测定已经掺入了哪种碱基和掺入了多少碱基有关的误差可能存在相关的困难。这可能是传感器的精确度需要低的离子浓度以及为了使聚合酶无相位误差地精确运行而需要更高的浓度的结果。因此，在一些实施方案中，在测序过程中使用两种或更多种不同的试剂条件，其中针对聚合酶的精确度和移相的最小化对至少一组试剂条件进行了优化，并且针对检测对第二试剂进行了优化，例如通过具有非常低的离子强度。与掺入事件分开读取传感器可以提高测序数据的精确度和读取长度。在一些实施方案中，需要较少的数据，因为传感器可能不再被迫以高数据速率进行读取来捕获聚合酶掺入事件，而是可以读取少数几次，可能少至单次。电子器件还可以具有可能足够长从而允许传感器噪声显著降低的时间常数。此外，在一些实施方案中，减少的数据需求可简化数据处理硬件，数据传输需求，以及数据存储需求。
在一些实施方案中，读取缓冲液可具有比用于聚合酶的最佳浓度更低的离子浓度。在一些实施方案中，读取缓冲液的离子浓度可以是掺入缓冲液的离子浓度的三分之一；或者在其他实施方案中，读取缓冲液的离子浓度可以是掺入缓冲液的离子浓度的三分之一至十分之一，掺入缓冲液的离子浓度的十分之一至三十分之一，掺入缓冲液的离子浓度的三十分之一至百分之一，或掺入缓冲液的离子浓度的百分之一至千分之一。
在一些实施方案中，掺入缓冲液和读取缓冲液的pH可以是基本相同的pH。在其他实施方案中，掺入缓冲液和读取缓冲液的pH可以是明显不同的，例如，其中掺入缓冲液的pH针对聚合酶的最佳活性和/或精确度进行优化，如pH8.5，而读取缓冲液具有使读取缓冲液的电导率最小化的pH，如pH7.0(例如，此时OH-和H+的浓度是相同的，为10-7摩尔)。在一些实施方案中，最低读取缓冲液电导率的最佳pH略高于pH7.0，因为OH-的迁移率低于H+的迁移率。因此，在一些实施方案中，读取缓冲液的pH为pH6.5-pH8.0、pH6.8-pH7.5或pH7.0-pH7.2，而掺入缓冲液的pH为pH7.5-pH9.0、pH8.0-pH8.8或pH8.3-pH8.5。
在一些实施方案中，纳米针传感器、纳米桥传感器、ISFET传感器或chemFET传感器使用不同的试剂缓冲液。
在一些实施方案中，将积分器(integrator)与传感器结合以使给予每个传感器的时间量最大化，以减少每个传感器的读取噪声。集成器可包括与阵列中的每个传感器相关联的电容器。在其他实施方案中，传感器配置为电容传感器，其中没有电流流动，而是电荷在化学循环过程中的积累。在集成器件或电容器件的一些实施方案中，传感器可具有针对每个像素的局部放大电子器件。在其他实施方案中，电荷以类似于CCD的方式移动至读出端口。
在一些实施方案中，集成器用作传感器的一部分，其中所述传感器包括纳米针传感器、纳米桥传感器、ISFET传感器或chemFET传感器。
可能存在与每个器件相关联的一个或多个读出端口。在一些实施方案中，该器件的每个角可以具有读出端口；在其他实施方案中，沿该器件的对侧可能存在多个端口，从而允许降低读出速率，以及相关的信噪比的改善。在其他实施方案中，读出电路可将阵列分成列或行。在其他实施方案中，读出电路可以放置在通道支撑或通道分离特征下方。在进一步的实施方案中，可以存在多组读出电路，其中传感器阵列分成多个子阵列，并且定位多组读出电路使得该读出电路与通道支撑或通道分离特征同步。在一些实施方案中，可能需要使用具有最小试剂体积的流动池；因此需要具有尽可能短的流动池高度。例如，可能希望流动池为300微米高或更低，100微米高或更低，或50微米高或更低。在一些实施方案中，可能需要使用半导体器件，其可以是1平方厘米或更大，可能大至10平方厘米。宽度足以覆盖传感器芯片宽度的大部分的流动池可能在机械公差上具有显著困难，原因是流动池的一个或两个主要表面相对于其他表面的平整度，尤其是如果一个表面是模制塑料部件或PDMS或类似聚合物部件时。因此，可能需要使用支撑柱、通道或其他支撑形状，以防止平面度公差缩小或扩大超出期望的公差。
在一些实施方案中，该系统可以使用传感器，如桥式传感器，该传感器以类似于Fin FET的方式布置，由此通道的两个或三个侧面可易于与周围环境例如结合至通道表面上的DNA相互作用。传感器通道可具有垂直于基质的、大于通道的水平横截面的垂直尺寸。这样的器件可以比仅具有一个可接触到样品的表面的器件具有更高的灵敏度。
在其他实施方案中，可能需要使用提供比利用平面电极或抛光的平面电极所可能获得的表面积更大的表面积的材料。在一些实施方案中，可能需要使用铂黑、铂金属海绵或镀铂的金属，其可以是镀铂的铂、镀铂的钛、镀铂的铱、镀铂的铌、镀铂的钽、镀铂的锆或其他镀铂的金属，作为电极材料。所述电极可以是参比电极，或者可以是作为纳米针的一部分的电极。在其他实施方案中，电极表面由铂系金属组中的其他成员制造：钯、铑、钌、铱或锇，它们可以与铂相同的方式使用以形成电极表面，该电极表面的表面积比平面电极或抛光电极将形成的表面积更高。
在一些实施方案中，镀铂过程可包括清洁支撑材料，可能利用王水、HCl和HNO3清洁，随后为可利用氯铂酸和醋酸铅的电镀工艺。
在其他实施方案中，电极表面可包括氧化铱、硝酸钛或聚吡咯/聚(苯乙烯磺酸酯)导电聚合物。所述氧化铱的制造可以通过使用标准光刻工艺进行溅镀来实现。Malleo等人(Review of ScientificInstruments81,016104)描述了不同材料相对于明亮的铂电极的有效界面电容的增加，增加范围为：对于铂黑增高240倍，对于氧化铱增高75倍，以及对于聚吡咯/聚(苯乙烯磺酸酯)导电聚合物增高790倍。
在一些实施方案中，纳米针传感器、纳米桥传感器、ISFET传感器或chemFET传感器使用具有较大表面积的传感器。
在一些实施方案中，制造纳米针、纳米桥、chemFET或ISFET，使得在基质如硅、熔融硅石、玻璃或其他类似材料的表面上产生传感器。在其他实施方案中，制造传感器使得它垂直或水平地突出于基质之上，以便该传感器更容易接近流体和试剂。更容易接近流体和试剂可以缩短发生测序反应所需的时间，从而允许使用较低浓度的试剂，并且通过增加与传感器的有源区相关的表面积来增加传感器的灵敏度。
在一些实施方案中，这些电极可以使用角度旋转沉积方法来制造，可以采用如Zhao等人(p59-73SPIE Vol5219Nanotubes andNanowires)描述的掠射角沉积，或者可以使用在US6,046,097(其通过引用整体并入本文)中所述的PVD方法来制造。
图26示出了来自纳米针测序反应的一次运行的数据，其中运行数据相对于碱基掺入的线性图来衡量和显示。不应掺入的dNTP显示为大部分与先前数据重叠，而多个掺入碱基数据显示为具有相当好的线性关系(R2=0.9974)。
在备选的实施方案中，该系统或方法检测了单分子反应例如酶反应的动力学。在一些实施方案中，该反应可以是杂交反应，由此可以导致连接有杂交探针的珠粒或粒子在传感器上保持就位，并且可以测量由杂交反应导致的最接近一个或多个传感器的电荷的变化。在备选的实施方案中，杂交探针可以连接在传感器上或接近于传感器，由此可以测量由杂交反应的进行导致的电荷变化。在一些实施方案中，可以利用电场将DNA从试剂溶液集中至连接有杂交探针的体积中，其可以在珠粒或粒子上，或者可以在所述传感器上或接近所述传感器。所述电场可以是DC场、AC场或它们的组合。
在一些实施方案中，通过使用一个或多个传感器监测由dNTP向扩增子中的掺入和/或具有较高迁移率的焦磷酸根和水合氢离子的释放而导致的电导率的变化或存在的电荷的变化，来监测实时PCR反应。在一个备选的实施方案中，扩增靶DNA的等温反应通过由dNTP掺入扩增子导致的电导率的变化来检测。在其他实施方案中，传感器监测免疫-PCR反应的进展，其中夹心试验捕获抗原，并且检测器抗体上连接有探针DNA寡聚物，借此实时PCR试验可通过如前所述的电导率或电荷变化的检测来检测和量化抗原的存在和数量。在另一个实施方案中，等温反应检测和量化感兴趣的抗原。
在一些实施方案中，可以通过对反应的直接测量，通过对夹心试验的测量，或通过使用适体的测量，或通过其中与可同传感器结合、连接或缔合的靶标相关的反荷离子的变化或电荷的变化的其他适当的方法，来实现蛋白质的检测。
在另一个实施方案中，利用结合至或接近于一个或多个传感器的核酸适体来检测靶标的存在和数量。适体可以结合至靶标，改变电荷，这可以如先前所述通过所述传感器来检测。在一个备选的实施方案中，适体连接至或接近于一个或多个所述传感器，并且检测由于靶标与之结合而导致的电导率的增加。
在另一个实施方案中，可利用在配体的3'和5'端具有不同结合试剂的所述配体来进行平端连接。纳米针的电极可与用于结合的互补试剂进行偶联，例如，配体的3'端可具有硫醇基，并且一个电极可以由金制造，而配体的5'端可具有PNA序列，并且第二电极可具有所述PNA序列的互补体。然后DNA的链可被电泳和/或介电泳地集中至纳米针区域，其中所述DNA链随后可结合至与一个电极相关联的一端以及与纳米针的第二电极相关联的另一端。聚合酶和引物可结合至DNA链，或者可以随后引入。然后可通过对DNA阻抗的直接测定结合与该DNA相关的反荷离子的更大电导率的直接测定而获得对掺入事件的测定。
在一些实施方案中，可以是纳米桥或纳米针的传感器器件产生数字输出数据。所述数字输出可包含大量输出物理/数据链/协议格式中的任一种，包括USB2、USB3、火线(Firewire)、Gige、单链接或双链接DVI、HDMI、S/PIF、ADAT光导管、AES3、MADI-X、I2S、AC’97、MC’97、McASP、超级视频(S-Video)、ATM、SONET、SDH、UTP、STP、AUI、HDLC、802.1、ARP、VLAN、HDLC、ATM、帧中继、Q in Q、PPP、BSC、DDCMP、Banyan、CDMA2000、DECnet、CDPD、FUNI、CDMA、X.25、GPRS、GR-303、H.323、NFS、ISDNSS7、TCIP、UMTS、WAP、XNS、MDLP、无线宽带等。
所述输出可以是压缩格式，如MPEG1、MPEG2、MPEG4、DVA、AVI、MOV、MPG、视频CD、RM、WMA、WMV、WAV、FLC、FLI、BMP、PCX、TGA、TIF、JPG、PCT、GIF、Flash、QuickTime、MP3或其序列。
所述传感器器件可被配置为具有一个以上的数字I/O连接，并且可以具有多于一个输出格式；例如，一个数字连接可以用于控制所述传感器的运行，而一个或多个数字连接将来自传感器的数据发送至附加器件，该附加器件可以是所述传感器是其一部分的仪器的一部分。所述附加器件可以是数据存储器、器件或可以是计算器件。所述附加器件可以是GPU，或一组GPU，如GPU阵列。
所述数据可从所述传感器直接传送至硬盘，从所述传感器直接传送至固态驱动器，或从所述传感器直接传送至GPU，或从所述传感器直接传送至GPU集群、GPU刀片或GPU服务器、CPU或与GPU或CPU相关联的存储器。在一些实施方案中，仪器或系统可以有一个以上的传感器。在这样的仪器或系统中，数据可从一个以上的传感器积累，并从那里直接传送至硬盘、固态驱动器、GPU、GPU刀片、GPU服务器、GPU集群、CPU或与GPU或CPU相关联的存储器。
在一些实施方案中，单个传感器可以具有一个以上的数字输出。在其他实施方案中，数字输出可以被配置为直接连接到该系统的另一部分，如固态驱动器或与GPU或CPU相关的存储器，其中该系统的两个或更多个部分可以是MCM(多芯片模块)或SIP(系统封装)的一部分。所述MCM可以是分层MCM、沉积MCM、陶瓷基质MCM或芯片叠层MCM。该传感器可以是MCM的一部分，或者可与所述的MCM分开。可配置所述传感器使得所述传感器可被去除并且可以利用第二传感器。所述传感器可以使用插座(socket)相互连接；所述插座可以是用于PGA(插针网格阵列)的零插入阻力插座、LGA(平面网格阵列)插座或转接器(slotket)。
可将该数据与CAM(内容可寻址存储器)或在DNA绘图中允许可选数量的误差的CAM存储器如三元CAM中的数据进行比较。所述CAM存储器可以以类似于TLB(转换后备缓冲器)的方式具有多个水平，其中所述CAM或TLB的一个水平可能快于并小于所述CAM或TLB的另一个水平。
为了改善纳米针或纳米桥的灵敏度，可提供局部放大器。该放大器可以是BJT或FET。该传感器可被制造成狭窄的结构，并且可以在该结构下进行蚀刻以使双侧均易于获得pH、电导率或局部电荷的变化。该器件的表面可以是粗糙的，从而允许有更大的表面积用于结合样品分子。离子的电限制可如下文进一步描述的来实现。
在本发明的一些实施方案中，图像传感器阵列可以使用类似于CMOS有源像素图像阵列中的那些放大器设计的放大器设计；根据所需信噪比和如果使用集成电路是否需要全局快门等效(global shutterequivalent)，可包括三晶体管、四晶体管、五晶体管或六晶体管电路。所述放大器结构可以与所述图像传感器阵列一一对应地布置，可能提供比以其他方式利用多个传感器的共有放大器可能获得的信噪比显著更好的信噪比。
集成系统
本发明进一步提供了用于将样品和试剂定位于其中可发生所期望的反应或结合的体积中的方法和系统。本发明的这一方面可以消除或减少对全基因组扩增的需要，并因此降低所需的覆盖范围。
在一些实施方案中，DNA测序仪可以是较大的系统的一部分，该系统中的工作流的多个部分是自动化的。工作流的这些可以自动化的部分可包括细胞裂解、DNA纯化、DNA扩增、DNA文库制备、集落产生、测序、初步分析和碱基判定、序列相对于参照物的定位(mapping)以及确定是否存在遗传疾病或其他遗传特征。在一些实施方案中，该系统可以具有更多的功能，包括利用流式细胞仪或对期望或不期望的细胞的亲和力抽出(affinity pullout)而分选细胞如从血液中分选癌细胞的装置。
可能希望在单一芯片上处理多个样品，因为许多项目不需要芯片的全容量。其他项目可能具有将会超出芯片容量的单一样品。在一些实施方案中，可将一个或多个样品引入到单个管、一排管(tube strips)、96-孔板、384-孔板等中的仪器中。在一些实施方案中，可将样品孔密封以延长在仪器上的寿命。在其他实施方案中，可将板冷却以延长样品的寿命。在其他实施方案中，能够以软件可选的方式通过自动移液器来存取样品。
在扩增之前，需要向珠粒加载单一DNA片段以便产生单克隆珠粒。通常，确定DNA的浓度，然后将其以稀释的形式引至珠粒上，以使得平均少于1个片段将结合至每个珠粒上。许多珠粒具有零个DNA片段，较少数珠粒具有单一片段，并且少数具有2个或更多个片段。定量所需的步骤往往需要单独的仪器和单独的处理。
在一个实施方案中，可通过基于杂交的抽出产生目标浓度。可利用受控数目的结合位点来对固体支撑物(如抽出珠粒)进行功能化。在一些实施方案中，这些为DNA引物互补体。未扩增的样品可在每一端上连接有已知引物。在一些实施方案中，引物可与抽出珠粒上的DNA杂交。在杂交位点被完全占据之后，可洗掉残留的DNA，并且随后可将结合至这些珠粒的DNA变性，从而释放已知量的DNA。
在另一个实施方案中，连接至每个DNA片段的引物结合至引物互补体上，并使用嵌入染料的荧光检测对其进行检测。由于这些引物具有已知的长度，所以信号水平将与片段数成正比。在另一个实施方案中，可引入聚合酶和相关dNTP，从而产生全长双链DNA。当与来自引物信号的信息组合时，全长嵌入染料的信号水平将允许平均片段长度的确定。
在另一个实施方案中，介电泳用于集中DNA。在集中期间或之后测量电流以确定DNA浓度。在另一个实施方案中，通过使用如上所述的嵌入染料对集中的DNA进行定量。在另一个实施方案中，DNA的浓度直接通过光吸收来确定。光吸收确定可以，例如，使用在260nm产生光的光源。
在一个实施方案中，将样品制成非常稀的和/或小体积的样品试剂并加载至珠粒上。DNA将结合至一些珠粒上，然后在虚拟反应器中对其进行扩增从而产生具有DNA的珠粒。可使测序引物短于连接至样品DNA的互补体。由于序列是已知的，所以可以加入并检测到正确的dNTP。在一个实施方案中，同时加入多种dNPT。例如，如果加入了所有的dNTP，则聚合酶会延伸到片段末端，从而产生大信号。所述大信号可作为扩增过程的一部分而产生。这可以允许检测和计数具有DNA的珠粒的数目，即使珠粒具有最低的扩增。知道了有多少珠粒具有信号可允许计算适当的稀释度以产生理想的单克隆珠粒数。
同样，使用表明样品中的DNA浓度的电流、光信号或其他信号进行的测量可用于确定稀释水平，如果有的话，该稀释水平是在系统中以最佳方式利用该DNA所需要的。
在一些实施方案中，需要进行稀释以适当地产生集落。同样，对于纳米孔系统可能需要进行稀释，以便防止孔堵塞，而相反，以便优化孔可被DNA链占据的占空比。稀释可作为乳液PCR系统、桥式PCR系统、纳米孔测序系统或单分子光学系统的一部分来完成。
在其他实施方案中，集中可作为系统的一部分来实现，并且可以通过介电泳、杂交、乙醇沉淀或其他方法来完成，并且可用于增加DNA的浓度以改进乳液PCR系统、桥式PCR系统、纳米孔测序系统或单分子光学系统。
主系统可使用软件或硬件进行所述测定来确定模板DNA的浓度，然后可在将所述模板DNA用于所述系统接下来的适当步骤(可以是扩增或测序)中之前根据需要进行浓缩或稀释。所述确定步骤还可利用现有的校准步骤，该校准步骤可使用包含已知浓度的DNA的标准，或者可以使用在开始时不知道浓度的DNA，其中浓度通过单独的系统来确定。可以将所确定的浓度输入、转移或以其他方式传送到所述主系统。所述主系统可储存该主系统中的局部校准所需的任何值，或者可将其储存在较大系统的一部分中或单独的计算机中或数据库中。所述校准信息还可以包括附加信息，如校准时间、操作者、用于校准的样品或标准，或可被确定为相关的其他信息。
许多现有系统使用全基因组扩增，以便对于它们的方案而言具有足够的DNA。典型的扩增方法可以使用简并引物和PCR、随机六聚体和等温扩增或用于基因组DNA扩增的其他方法。所述扩增可将基因组DNA放大一千倍或更多。这种扩增可以引入偏差，并且是额外的时间和资源成本。减少或消除对扩增样品的需求的能力是所希望的。在一个实施方案中，将待加载的珠粒装入填充床中，并且跨越该填充床泵送样品。可将样品泵送通过珠粒床多次，以便为样品结合提供额外的机会。高的表面积与体积之比应允许使用最少的样品。随后可以使这些珠粒移动至流动池中，从而它们可被磁阵列保持就位，并且可通过PCR或等温扩增在这些珠粒上产生局部集落。
在另一个实施方案中，使用无乳液的纳米反应器的现有电极将样品集中在扩增区域中。在一个实施方案中，可在单一平面上构建多个电极。在另一个实施方案中，可将电极加至与虚拟反应器的平面平行的第二平面上。在其他实施方案中，预期使用AC和DC电压输入的混合物。
在其他实施方案中，全基因组扩增或靶向扩增，如靶向外显子组、基因组的保守区、癌症组(panel)或其他感兴趣的靶标的扩增，可作为集成系统中的子系统的一部分来实施。所述靶向扩增还可针对不同样品引入条码作为扩增过程的一部分。然后可以在进行用于随后测序的克隆扩增之前，使用克隆测序子系统和方法(其可以是集成系统的一部分)，如本文所述地确定扩增的DNA的浓度。替代地或者除此之外，使用可以是所述集成系统的一部分的单分子测序子系统和方法直接对DNA进行测序。
由于许多项目可能不需要充分利用测序芯片或流动池，可能希望将多个样品加载至单一芯片或流动池的不同部分或区域。在一个实施方案中，使用集成到芯片或流动池组件中的阀将样品引导至芯片或流动池上由壁分开的单独区域中。这类阀可以是集成到流体路径中的PDMS阀。在另一个实施方案中，可能存在具有单独的输入和输出的单独区域。在另一个实施方案中，可使用局部电场将样品引导至芯片或流动池上的单独区域中。可以施加正电场将DNA吸引至所需区域，而可施加负电场来将DNA从不期望的区域排斥出去。在另一个实施方案中，可使用电磁体控制磁性或顺磁性珠粒的定位，而将样品引导至单独的区域中。在另一个实施方案中，可使用自密封口将样品递送到单独的通道中。自密封口可包括橡胶隔片和针。
在另一个实施方案中，可以在不同时间点注入样品，并且可使用相对于先前针对所述传感器确定的信号的传感器信号来区分新珠粒和珠粒的位置，其中该珠粒位置在先前是空的。
在进一步的实施方案中，利用电润湿或光电润湿将样品递送至芯片或流动池的不同和单独的区域中。
在一些实施方案中，可以根据需要冷却试剂的容器，例如，含有样品、聚合酶、磷酸酯酶或其他酶的试剂可能需要冷却，例如，冷却至约4摄氏度。
在一些实施方案中，在从试剂容器通往阀歧管的管线中含有的试剂量可以含有一定的体积，该体积相对于进行测序反应所需的体积是显著的。为了避免需要丢弃该试剂，例如，在新的测序运行开始时，可能需要冷却从它们与试剂容器连接之处一直到或接近于它们进入阀歧管之处的管线。在一些实施方案中，阀歧管与试剂进入发生测序或另一反应的流动池的地方充分地分开，以允许流动池和阀歧管在不同温度下进行操作，例如，分别为约4摄氏度和20-40摄氏度，可能也需要冷却阀歧管。
在一些实施方案中，可能需要使用能够进行一种以上的测序方法的系统，其中用于测序的一种方法、过程或子系统提供了一种类型的信息，而用于测序的第二种方法、过程或子系统可提供第二种类型的信息。例如，在一些实施方案中，可能期望提供一种方法，其中的信息类型可阐明DNA样品的结构，从而使序列读数可跨越重复序列的长度，这些重复序列如简单序列重复、短串联重复、微卫星、小卫星、可变数目串联重复、散布重复如LINE重复、SINE重复如Alu重复、同向重复或反向重复，或其他类型的重复序列，其可以防止基因组或DNA的其他所需一个或多个序列的适当的完整组装。在一些实施方案中，可能需要使用例如可阐明DNA结构的用于测序的方法、过程或子系统，其中可能不需要以高的精确度来确定序列。在一些实施方案中，可能需要对可能间隔多个碱基的读取进行关联，如在一些系统中，例如通过配对测序或频闪测序所进行的。在一些实施方案中，期望使用可提供具有非常高的精确度的测序读取值的用于测序的方法、过程或子系统来检测例如单核苷酸多态性，但是其不需要长的测序读取长度。在一些实施方案中，可能进一步需要使用可提供以低精确度提供许多短读取的能力(如全转录组分析可能需要的)的用于测序的方法、过程或子系统。
在一些实施方案中，对于单一样品需要使用不同的方法，从而能够例如检测来自单一样品的单核苷酸多态性和结构重排。在一些实施方案中，需要在单一系统中将纯化的核酸分成两个或更多小份，于是可以具有可包括扩增的不同的相应文库制备方法、子系统或过程，并且可以利用适合于不同期望的测序方法、子系统或过程的不同的扩增方法、子系统和过程。不同小份的大小、浓度或体积可能是类似的、相同的或不同的，并且可根据可用于实现不同期望的测序结果的不同的测序和/或文库制备方法、子系统或过程而适当地不同。在一些实施方案中，该方法可能对于不同的小份而不同，但所使用的子系统可以是相同的，和/或不同的方法所使用的子系统可以是相同的子系统，其中首先使用一种方法，而后可使用相同的子系统进行第二或更多随后的方法。例如，对于不同的测序方法可能需要使用不同的片段长度，其中，例如，对于确定序列结构可能需要长片段，而对于确定单核苷酸多态性可能需要短(或较短)片段。因此，可能需要将样品的不同小份断裂为不同的平均片段长度，其中一个小份的平均片段长度可能较长，可能显著长于另一小份。在一些实施方案中，断裂方法可以是相同的，并且可以使用例如超声波仪，但是超声波仪向所述小份施加能量的时间和/或超声波仪施加至所述小份的功率水平可以是不同的，以使得两个或更多个小份中样品的断裂水平可以是不同的，可能明显不同，并且所得到的片段长度可以是不同的，可能显著不同。在其他实施方案中，可能需要使用单一系统来产生长片段和短片段；在另一个实施方案中，可能期望将DNA断裂为适合于长片段的大小，取出小份，并进一步将剩余的DNA断裂为适合于所述短片段的大小。
在其他实施方案中，核酸样品的一小份可以是可测定其单核苷酸多态性的基因组DNA，并且第二小份可以是可能需要其转录组的RNA。对于该基因组DNA和RNA，扩增方法、子系统或过程可以是不同的，其中可以实现从RNA到cDNA的转化，并且其中对于不同的小份，扩增方案可以是不同的，因为单核苷酸多态性扩增所需的精确度可能大大高于RNA转化为cDNA和所述cDNA的后续扩增所需的精确度。在一些实施方案中，扩增cDNA以供转录组分析比扩增基因组DNA以供单核苷酸多态性分析可能需要使用更低的浓度和/或更便宜的试剂。在进一步的实施方案中，扩增cDNA以供转录组分析比扩增基因组DNA以供单核苷酸多态性分析可能需要使用更短的循环时间，这可以加快回应时间，从而允许使用随后可由所述基因组DNA单核苷酸多态性分析使用的相同测序子系统来开始转录组分析。可以设想使用不同测序方法、子系统或过程来分离核酸材料以供后续分析的任何其他组合。
在一些实施方案中，使用不同类型的测序检测方法、子系统或过程。例如，一个子系统可以使用如Church等人在US5,795,782中、Haneck等人在US US8,137,569中、Korlach等人在US7,361,466中以及Clark等人在US2011/0177498中(均通过引用整体并入本文)所述的单分子测序，其可具有低精确度并且可具有非常长的序列读取，而另一个子系统可使用如McKernan等人在US2009/0181385中、Balasubramanian在US6,833,246中、Nyren等人在US6,210891中、Bridgeham等人在US7,282,370中、Williams等人在US7,645,596中、Rothberg等人在US7,948,015中、Toumazou等人在US8,114,591中以及Miyahara等人在US7,888,013中(均通过引用整体并入本文)所述的合成测序的光学或电化学检测。因此，在一些实施方案中，单一系统可能具有至少两个不同的检测子系统，其中所述两个不同的检测子系统可以使用不同的测序方法、测序检测方法或测序过程，并且其中所述不同的测序方法、测序检测方法或测序过程可以针对相同样品或不同样品在相同的时间进行，或者可针对相同样品或不同样品在不同的时间进行。
示例性的集成系统在附图中示出。
图1A描述了完整的测序系统100，其可包含外部计算装置102和集成系统104。该集成系统可以包含机架模块110，其可进一步包含流体界面子系统116、一组测序/样品制备卡112和在每个测序/样品制备卡112上的单独的测序子系统114。测序/样品制备120的示意图包括文库准备122、可重复使用的磁阵列124，磁阵列124可进一步包含序列检测器126，该序列检测器126产生测序数据128。
图1B描述了完整的文库制备子系统130，其包括样品池输入131，产生未断裂的基因组DNA133的细胞裂解和蛋白质去除132，该未断裂的基因组DNA133可输入至断裂和分离子系统134中，而后可输出断裂的基因组DNA136，断裂的基因组DNA136可以同一组珠粒135一起被运送到虚拟孔阵列137进行扩增，然后可在珠粒富集模块139中利用场138将所述珠粒分离成已扩增珠粒组和未扩增珠粒组。
图1C示意性地图示了基因组DNA断裂和分离系统140，该系统140包括输入未断裂的基因组DNA和断裂珠粒142，其被输入到断裂系统144中，其中可使所述未断裂的基因组DNA断裂。可使用来自泵或电极147的泵送或电泳力将断裂的DNA在通道146中按大小分离，然后可经由流体输出148将其移动至所述分离通道146的输出端，并输出所述断裂的DNA149。
图1D示出了PDMS文库制备模块150的一个实施方案，该模块150包括裂解部分152、蛋白质去除部分154和扩增部分156。
虽然上面已经描述了多个实施方案，但是应当理解，它们仅以举例的方式呈现，而并非限制。在所述的方法和/或图示表明某些事件，和/或流动模式，和/或化学反应以某种顺序发生时，可对某些事件和/或流动模式和/或化学反应的顺序进行修改。虽然已经具体地显示和描述了实施方案，但是应当理解，可进行形式和/或细节上的各种变化。
虽然多个实施方案已被描述为具有特定特征和/或组件的组合，但是具有如上所讨论的任何特征和/或组件的组合的其他实施方案也可能是合理的。

Claims (36)

1.一种用于平行或克隆多核苷酸测序的方法，其包括：
对靶多核苷酸群体的第一部分进行测序；
校正相位误差；和
对该靶多核苷酸群体的第二下游部分进行测序，其中所述多核苷酸测序任选地包括以下一项或多项：
对珠粒阵列的克隆测序，
对核苷酸掺入的电子检测，和
用于分离或集中反应成分的电子孔。
2.如权利要求1所述的方法，其中相位误差通过加入三种核苷酸碱基的组合来校正。
3.如权利要求1所述的方法，其中相位误差通过掺入反应的组合和/或顺序来校正。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述相位误差通过将链终止核苷酸可逆地掺入同相多核苷酸链中来校正。
5.如权利要求1所述的方法，其中相位误差通过加入寡核苷酸夹来校正，所述夹与所述靶核苷酸杂交以使测序反应停止。
6.如权利要求5所述的方法，其中加入多个夹。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述夹被变性、去稳定或降解以继续进行所述测序反应。
8.如权利要求5或6所述的方法，其中至少一个夹具有不能被延伸的3’终止核苷酸，并且其中所述3’终止核苷酸能够任选地被去除，从而变为后续下游测序的引物。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述夹具有独特的可切割位点。
10.如权利要求5-9中任一项所述的方法，其中聚合酶不具有链置换活性或基本的5’至3’外切核酸酶活性，或者所述夹具有不是所述5’至3’外切核酸酶活性或置换活性的底物的5’部分或核苷酸衍生物。
11.如权利要求5-10中任一项所述的方法，其中所述夹包含一种或多种锁定核酸(LNA)或肽核酸(PNA)。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，进一步包括监测该反应的信号损失和重新定相以恢复测序信号。
13.一种用于减少平行或克隆多核苷酸测序中的前导相位误差的方法，该方法包括：
在竞争反应的存在下对靶多核苷酸群体进行测序，所述竞争反应包括核苷酸碱基或针对所有四种核苷酸碱基的核苷酸衍生物，其中所述四种核苷酸碱基中有三种不可掺入到正在生长的多核苷酸链中；
其中所述多核苷酸测序任选地包括以下一项或多项：
对珠粒阵列的克隆测序，
对核苷酸掺入的电子检测，和
用于分离或集中反应成分的电子孔。
14.如权利要求13所述的方法，其中至少一种不可掺入的核苷酸选自PNA核苷酸、LNA核苷酸、核糖核苷酸、单磷酸腺嘌呤、二磷酸腺嘌呤、腺苷、脱氧腺苷、单磷酸鸟嘌呤、二磷酸鸟嘌呤、鸟苷、脱氧鸟苷、单磷酸胸腺嘧啶、二磷酸胸腺嘧啶、5-甲基尿苷、胸苷、单磷酸胞嘧啶、二磷酸胞嘧啶、胞苷、脱氧胞苷、单磷酸尿嘧啶、二磷酸尿嘧啶、尿苷和脱氧尿苷。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述不可掺入的核苷酸被聚合酶结合，但不能被所述聚合酶掺入至正在生长的多核苷酸链中。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述不可掺入的核苷酸的浓度与聚合酶针对每种不可掺入的核苷酸的活性有关。
17.一种用于减少平行或克隆多核苷酸测序中的滞后相位误差的方法，该方法包括：
在测序反应过程中将聚合酶堆积在靶多核苷酸群体上或其附近，使得聚合酶对于每个活性聚合位点基本上是可用的，和/或将修复蛋白或单链DNA结合蛋白结合至该靶多核苷酸群体上；
其中所述多核苷酸测序任选地包括以下一项或多项：
对珠粒阵列的克隆测序，
对核苷酸掺入的电子检测，和
用于分离或集中反应成分的电子孔。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述堆积通过聚合酶与所结合的不可延伸的引物的天然结合来实现。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述不可延伸的引物不受所述聚合酶的3’外切核酸酶活性的影响。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述不可延伸的引物为3’终止的随机引物，并且所述延伸引物为通用引物或靶向引物，并且其中聚合酶结合在所述随机引物的3’终止端处，以及所述通用引物或靶向引物的3’端处。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述3’终止的引物在3’终止位置上包含硫代磷酸核苷酸，使得所述3’终止的引物对3’至5’外切核酸酶活性具有抗性。
22.一种用于重复核苷酸测序的方法，其包括：
提供环化的DNA测序模板，和通过确定核苷酸被具有5’至3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶掺入的顺序来对所述模板进行测序；
其中所述多核苷酸测序任选地包括以下一项或多项：
对珠粒阵列的克隆测序，
对核苷酸掺入的电子检测，和
用于分离或集中反应成分的电子孔。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述DNA聚合酶是高度持续性的并且具有降低的外切核酸酶活性，并且其中所述高度持续性的聚合酶结合在适用于测定核苷酸的掺入的生物传感器上或其附近。
24.如权利要求23所述的方法，进一步包括通过温度变化和pH变化之一来使延伸引物解链。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，进一步包括在测序之前将聚合酶预先结合至所述多核苷酸上。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，进一步包括在珠粒上提供所述靶多核苷酸或模板多核苷酸，并且使所述珠粒与聚合酶/DNA引物复合物接触。
27.一种无腔室装置，其包含：
电磁传感器阵列，
磁性载体，其用于在所述电磁传感器上或其附近携带或保持感兴趣的分子，和
用于通过液体流动和/或电磁去除来除去所述磁性载体的机构。
28.如权利要求27所述的装置，其中所述电磁传感器是纳米针或纳米桥之一，并且其中所述装置进一步包含局部放大器。
29.如权利要求28所述的装置，其中所述电磁传感器具有狭窄的结构，并且在该结构下被蚀刻，以使得所述传感器表面的两侧易于获得pH的变化或电导率的变化。
30.一种用于对单一DNA分子进行测序的方法，该方法包括：
将聚合酶连接在一个体积中的生物传感器上，并使具有缔合的引物的DNA样品进入所述体积并被所述聚合酶保留或接近所述聚合酶；
在所述引物被所述聚合酶延伸之后确定核苷酸掺入的顺序。
31.一种用于对多核苷酸进行测序的装置，该装置包含：用于感测核苷酸掺入的感测表面，所述感测表面包含氮化硅层，以及TiO2、ZrO2和BaTiO3中的一种或多种，从而降低ζ电势。
32.如权利要求31所述的装置，进一步包含：配置用于携带模板多核苷酸的多个磁珠，其中所述磁珠具有在对核苷酸掺入有效的pH水平时为低ζ电势的材料。
33.如权利要求32所述的装置，其包含多个纳米针传感器，所述纳米针传感器具有至少一个以圆弧形状形成的电极，该圆弧形状符合其中放置有所述多个磁珠中的一个的凹陷的边缘。
34.如权利要求32所述的装置，其包含多个纳米桥传感器，所述纳米桥传感器具有部分环绕并且紧邻所述多个磁珠中的一个的有源区。
35.如权利要求34所述的装置，其中所述有源区的半径小于所述磁珠的半径。
36.如权利要求34所述的装置，其中所述多个纳米桥传感器适合于测定核苷酸向多核苷酸上的掺入，所述纳米桥传感器各自具有有源区和导电元件，所述导电元件具有与有源区的功函数相匹配的功函数。
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