ES2322904T3 - Medio y metodo para la deteccion de secuencias nucleotidicas diana usando ensayos de ligamiento con pares de sondas oligonucleotidicas mejoradas. - Google Patents
Medio y metodo para la deteccion de secuencias nucleotidicas diana usando ensayos de ligamiento con pares de sondas oligonucleotidicas mejoradas. Download PDFInfo
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Abstract
Un par de sondas oligonucleotídicas (K) que comprende: a) una primera sonda oligonucleotídica (P1) que comprende una primera sección de pinza (C1), que es capaz de hibridar con una segunda sección de pinza (C2) de una segunda sonda oligonucleotídica (P2), y una primera sección diana (T1) en su extremo 3'' que es capaz de hibridar con una primera sección (S1) de una secuencia de ADN diana (D) a detectar; b) una segunda sonda oligonucleotídica (P2) que comprende una segunda sección de pinza (C2), que es capaz de hibridar con la primera sección de pinza (C1) de la primera sonda oligonucleotídica (P1), y una segunda sección diana (T2) en su extremo 5'' que es capaz de hibridar con un segunda sección (S2) de la secuencia de ADN diana (D) a detectar; donde la primera y la segunda secciones (S1, S2) de la secuencia de ADN diana (D) están localizadas esencialmente adyacentes entre sí en la secuencia de ADN diana (D), donde el extremo 3'' de la primera sección diana (T1) y el extremo 5'' de la segunda sección diana (T2) son capaces de ligarse entre sí cuando el extremo 3'' de la primera sección diana (T1) y el extremo 5'' de la segunda sección diana (T2) están hibridados con S1 y S
Description
Medio y método para la detección de secuencias
nucleotídicas diana usando ensayos de ligamiento con pares de sondas
oligonucleotídicas mejoradas.
La presente invención se refiere al campo de la
biología molecular y la biotecnología. En particular, la invención
se refiere al campo de la detección de ácidos nucleicos, más en
particular al diseño y composición de (colecciones) de sondas que
pueden usarse para la detección de ácidos nucleicos. La invención
también se refiere a métodos para la detección de ácidos nucleicos
usando las sondas y composiciones. La invención proporciona
adicionalmente sondas que son capaces de hibridar con una secuencia
diana de interés, cebadores para la amplificación de sondas
ligadas, el uso de estas sondas y cebadores en la identificación y/o
detección de secuencias nucleotídicas que están relacionadas con
una amplia diversidad de rasgos genéticos y genes. La invención
también proporciona kits de cebadores y/o sondas adecuados para su
uso en el método de acuerdo con la invención.
Existe un interés que crece rápidamente en la
detección de secuencias de ácido nucleico específicas. Este interés
no solamente ha surgido del borrador de la secuencia de nucleótidos
recientemente descrita del genoma humano y la presencia en el
mismo, así como en los genomas de muchos otros organismos, de una
abundante cantidad de polimorfismos de un único nucleótido (SNP),
sino también de las tecnologías de marcaje tales como AFLP y el
reconocimiento general de la relevancia de la detección de
secuencias de ácido nucleico específicas como una indicación de,
por ejemplo, enfermedades heredadas genéticamente. La detección de
los diversos alelos del gen BRCA 1 del cáncer de mama para explorar
la susceptibilidad al cáncer de mama es sólo uno de numerosos
ejemplos. El reconocimiento de que la presencia de sustituciones de
un único nucleótido (y otros tipos de polimorfismos genéticos tales
como inserciones/deleciones pequeñas; indels) en genes proporciona
una amplia diversidad de información que también se atribuye a este
interés aumentado. Ahora generalmente se reconoce que estas
sustituciones de un único nucleótido son una de las causas
principales de una cantidad significativa de enfermedades
hereditarias monogénica y multigénicamente, por ejemplo, en seres
humanos, o están implicadas de otro modo en el desarrollo de
fenotipos complejos tales como rasgos de función en plantas y
especies ganaderas. Por tanto, las sustituciones de un único
nucleótido están, en muchos casos, relacionadas también con o al
menos son indicativas de rasgos importantes en seres humanos,
plantas y especies de animales.
El análisis de estas sustituciones de un único
nucleótido y los indels producirá una abundancia de información
valiosa, que tendrá extensas implicaciones sobre la medicina y la
agricultura en los términos más amplios posibles. Se prevé, por
ejemplo, generalmente que estos desarrollos producirán medicaciones
específicas de paciente. Para analizar estos polimorfismos
genéticos, existe una necesidad creciente de métodos adecuados,
fiables y rápidos que posibiliten la manipulación de grandes
cantidades de muestras y grandes cantidades de (predominantemente)
SNP en un modo de elevada productividad, sin comprometer
significativamente la calidad de los datos obtenidos. Uno de los
métodos principales usados para el análisis de los ácidos nucleicos
de una secuencia conocida se basa en la hibridación de dos sondas
con una secuencia diana y, cuando las sondas han hibridado de forma
adyacente a la secuencia diana, el ligamiento de las sondas.
El principio OLA (Ensayo de Ligamiento de
Oligonucleótidos (Oligonucleotide Ligation Assay) se ha descrito,
entro otros, en el documento US 4.988.617 (Landegren et al.).
Esta publicación describe un método para determinar la secuencia de
un ácido nucleico en una región de una secuencia de ácido nucleico
conocida que tiene una posible mutación conocida. Para detectar la
mutación, se seleccionan oligonucleótidos que hibriden con segmentos
inmediatamente adyacentes de la secuencia a determinar. Una de las
sondas oligonucleotídicas seleccionadas tiene una región final
donde uno de los nucleótidos de la región final es complementario al
nucleótido normal o al nucleótido mutado en la posición
correspondiente en la secuencia de ácido nucleico conocida. Se
proporciona una ligasa que conecta covalentemente las dos sondas
cuando están correctamente apareadas y se localizan inmediatamente
adyacentes entre sí. La presencia o ausencia de las sondas unidas es
una indicación de la presencia de la secuencia conocida y/o la
mutación.
Abbot et al. en el documento WO 96/15271
desarrollaron un método para un procedimiento de amplificación y
ligamiento combinado que comprende la hibridación y ligamiento de
sondas adyacentes. Estas sondas están provistas de un segmento de
longitud adicional, cuya secuencia, de acuerdo con Abbot et
al., no tiene importancia. La introducción deliberada de
diferencias de longitud pretende facilitar la discriminación en base
a la longitud de fragmentos en técnicas basadas en gel.
El documento WO 97/45559 (Barany et al.)
describe un método para la detección de diferencias de secuencia de
ácido nucleico usando combinaciones de reacciones de detección con
ligasa (LDR) y reacciones en cadena de la polimerasa (PCR). Se
describen métodos que comprenden la hibridación de pares de sondas
específicas de alelo con una secuencia diana y el posterior
ligamiento con una ligasa termoestable. La amplificación de los
productos ligados con cebadores marcados de forma fluorescente
produce un producto amplificado marcado de forma fluorescente. La
detección de los productos se basa en la separación por tamaño o
movilidad electroforética o en una serie dirigible.
Más en particular, una de las desventajas del
medio y los métodos descritos por Barany et al. reside en la
capacidad de combinación limitada cuando la discriminación se basa
inter alia en la longitud de los pares de sondas específicos
de alelo. La discriminación entre secuencias que se pueden
distinguir por solamente una diferencia de longitud relativamente
pequeña no es, en general, sencilla y pueden requerirse condiciones
cuidadosamente optimizadas para llegar a la capacidad de resolución
deseada. La discriminación entre secuencias que tienen una
diferenciación de longitud más grande es, en general, más fácil de
conseguir. Esto puede proporcionar un aumento en la cantidad de
secuencias que pueden analizarse en la misma muestra.
Otras soluciones que se han sugerido en la
técnica tales como el uso de sondas circulares (tipo candado) en
combinación con amplificación isotérmica tal como amplificación por
círculo rodante (RCA) se consideran rentables a causa de las
características de hibridación mejoradas de las sondas circulares y
el carácter isotérmico de la RCA. La sonda tipo candado
generalmente se reconoce porque tiene características superiores en
comparación con las sondas lineales convencionales (Nilsson et
al. Human mutation, 2002, 19, 410-415; Science
1994, 265: 2085-2088).
Sin embargo, proporcionar las sondas
nucleotídicas más largas necesarias para su uso como sondas tipo
candado es un obstáculo adicional a superar. En la técnica, las
secuencias nucleotídicas sintéticas se producen por síntesis
química de oligonucleótidos paso a paso convencional con un
rendimiento de aproximadamente el 98,5% por nucleótido añadido.
Cuando se sintetizan sondas más largas (más largas de aprox. 60
nucleótidos) el rendimiento generalmente baja y la fiabilidad y
pureza de la secuencia producida sintéticamente están generalmente
reconocidas como un problema.
El problema específico de proporcionar sondas
más largas se ha resuelto por Schouten et al. (documento WO
01/61033). El documento WO 01/61033 describe la preparación de
sondas más largas para su uso en ensayos de
ligamiento-amplificación. Proporcionaron sondas que
son considerablemente más largas que las que pueden obtenerse por
métodos de síntesis química convencional para evitar el problema
asociado con la discriminación basada en la longitud de productos
amplificados usando geles de bloque o electroforesis capilar,
concretamente que se usa solamente una pequeña parte de la ventana
de detección/capacidad de resolución de hasta una 1 kilobase de
longitud cuando se sintetizan sondas OLA por medios químicos. Con un
límite superior en la práctica de aproximadamente
100-150 bases para oligonucleótidos sintetizados
químicamente de acuerdo con el actual estado de la tecnología, esto
provoca productos de amplificación que son de menos de 300 pares de
bases de longitud como mucho, pero a menudo mucho menos (véase
Barany et al.). La dificultad de generar dichas sondas largas
(más de aproximadamente 150 nucleótidos) con suficiente pureza y
rendimiento por medios químicos la ha rebatido Schouten et
al., usando un método en el que las sondas se han obtenido por
una polimerización dirigida por molde, enzimática in vivo,
por ejemplo, por la acción de una ADN polimerasa en una célula
adecuada, tal como un fago M13. Esto viene seguido después por
digestión con enzimas de restricción proporcionando una corta
secuencia oligonucleotídica para crear una secuencia parcialmente
bicatenaria para crear un extremo 5' fosforilado de la sonda
larga.
Sin embargo, la producción y purificación de
dichas "sondas biológicas" requieren una colección de cepas
hospedadoras adecuadas que contengan el fago M13 que confiere las
variaciones de longitud deseadas y el uso de múltiples
oligonucleótidos cortos sintetizados químicamente en el proceso, de
modo que su uso es muy laborioso y consume mucho tiempo, por tanto
es costoso y no adecuado para el desarrollo de ensayos de elevada
productividad.
Otra desventaja del uso de sondas circulares es
que el uso de la amplificación por círculo rodante (RCA) que está
habitualmente asociado con sondas tipo candado provoca la formación
de largos concatémeros. Son ejemplos de los mismos inter
alia los documentos US 5.876.924, WO 98/04745 y WO 98/04746 de
Zhang et al. que describen el ligamiento de sondas
circulares o circularizables. Zhang et al. describen la
amplificación de sondas circulares usando cebadores
oligonucleotídicos en RCA, usando una ADN polimerasa con actividad
de desplazamiento de cadena, generando de este modo una concatémero
largo de la sonda circular, partiendo de la extensión del primer
cebador. Un segundo cebador hibrida posteriormente con el
concatémero largo y la elongación del mismo proporciona una segunda
generación de concatémeros y facilita la amplificación exponencial.
La detección se basa generalmente en la hibridación de sondas
marcadas. Sin embargo, este método ha demostrado ser menos deseable
en un modo de elevada productividad. Una de las razones es que, para
un método de elevada productividad basado en la discriminación de
longitud, el uso de RCA provoca la formación de concatémeros largos.
Estos concatémeros son problemáticos, ya que no son adecuados para
la detección de elevada productividad basada en la detección basada
en la longitud ya que esto requiere una etapa de preparación
adicional (por ejemplo, digestión con enzimas de restricción) para
crear un producto de amplificación claramente detectable.
El documento US 6.221.603 describió una sonda
circular, que contiene un sitio de restricción. La sonda se
amplifica usando RCA y los concatémeros resultantes se restringen al
sitio de restricción. Los fragmentos de restricción después se
separan por longitud y se detectan. La separación y la detección se
realizan sobre una plataforma electroforética capilar, tal como el
equipo MegaBACE disponible en Molecular Dynamics
Amersham-Pharmacia. Para la detección (costosa)
pueden incorporarse dNTP marcados en los fragmentos durante la
amplificación, o los fragmentos pueden detectarse por tinción o por
sondas de detección marcadas. La digestión por las enzimas de
restricción es una etapa adicional en el método para la detección
exitosa de las secuencias diana y esta etapa adicional puede
afectar a la fiabilidad del método. Además, los métodos para marcar
los fragmentos que se describen en el documento US 6.221.603 no
permiten utilizar completamente la capacidad de la detección
simultánea de múltiples colores proporcionada la mayoría de las
plataformas de detección tales como MegaBACE u otras. El documento
US 5.424.413 describe sondas de hibridación de sondas de ácido
nucleico que tienen al menos una cadena de ácido nucleico que tiene
al menos dos regiones específicas diana separadas que hibridan con
una secuencia de ácido nucleico diana, y al menos dos regiones de
brazo distintas que no hibridan con el ácido nucleico diana pero
que tienen regiones complementarias que son capaces de hibridar
entre sí. Estas regiones están diseñadas de tal modo que, en
condiciones de hibridación apropiadas, las regiones de brazo
complementarias no hibridarán entre sí en ausencia del ácido
nucleico diana; pero, en presencia del ácido nucleico diana, las
regiones específicas de diana de la sonda hibridarán con el ácido
nucleico diana, y las regiones de brazo complementarias hibridarán
entre sí, formando de este modo una estructura de ácido nucleico
ramificada.
Por consiguiente, existe la necesidad de sondas
oligonucleotídicas que combinen las ventajas de los diversos tipos
de sondas de ligamiento descritas en este documento. Uno de los
objetivos de la presente invención es proporcionar dichas sondas.
Otro objetivo de la presente invención es evitar las desventajas de
las sondas habitualmente usadas que se han mencionado anteriormente
en este documento, en particular la síntesis química o enzimática
poco fiable o laboriosa de oligonucleótidos relativamente largos. Un
objetivo adicional de la invención es proporcionar sondas que sean
adecuadas para métodos de detección de elevada productividad.
También es un objetivo de la presente invención proporcionar un
método eficaz, fiable y/o de elevada productividad para la
detección de secuencias nucleotídicas diana, preferiblemente
realizando ensayos de ligamiento de oligonucleótidos.
En esta invención se ha propuesto eliminar o al
menos disminuir los problemas existentes en la técnica intentando
al mismo tiempo mantener los aspectos ventajosos de la misma, y
mejorar adicionalmente la tecnología. Otros problemas en la técnica
y soluciones proporcionados a los mismos por la presente invención
llegarán a quedar claros a lo largo de toda la descripción, las
figuras y las diversas realizaciones y ejemplos.
Se ha descubierto que por un diseño específico
de las sondas de ligamiento pueden superarse muchos de los
problemas expuestos anteriormente. En la presente invención, para
cada secuencia diana dada a detectar, se diseña preferiblemente al
menos un par de dos sondas de modo que cada sonda en el par sea
capaz de hibridar con una parte de la secuencia diana y las sondas
respectivas en el par comprendan cada una adicionalmente una
sección que sea complementaria a la sección correspondiente de las
otras sondas en el par de modo que ambas sondas sean capaces de
hibridar entre sí. Las dos sondas en el par se diseñan de tal modo
que, cuando hibridan entre sí, cada una también es capaz de
hibridar con una secuencia diana. Cuando hibridan entre sí, las dos
sondas imitan o funcionan como sondas tipo candado cuando se usan en
un ensayo de ligamiento de oligonucleótidos para la detección de
una secuencia nucleotídica diana, mientras que en las posteriores
etapas de amplificación y detección, las sondas pueden funcionar
como un producto de ligamiento lineal.
Uno de los aspectos de la invención se refiere a
un método para la detección de una secuencia nucleotídica diana en
una muestra, que comprende proporcionar al menos un par de una
primera y una segunda sonda oligonucleotídica para cada secuencia
nucleotídica diana a detectar en la muestra, por lo cual la primera
sonda oligonucleotídica tiene una sección en su extremo 5' que es
complementaria a una primera parte de una secuencia diana y la
segunda sonda oligonucleotídica tiene una sección en su extremo 3'
que es complementaria a una segunda parte de la secuencia diana, y
por lo cual la primera sonda oligonucleotídica comprende
adicionalmente una sección de pinza que es capaz de hibridar con
una sección de pinza complementaria localizada en la segunda sonda
oligonucleotídica por lo cual las secciones de pinza son
esencialmente no complementarias a la secuencia diana, permitiendo
que las sondas oligonucleotídicas hibriden con la secuencia diana,
proporcionando un medio para conectar la primera y la segunda
sondas oligonucleotídicas y permitiendo que la primera y la segunda
sondas oligonucleotídicas se conecten cuando hibridan con secciones
adyacentes de la secuencia diana para producir una sonda conectada
correspondiente a una secuencia diana en la muestra.
Uno de los aspectos de la invención se refiere a
un par de sondas (K) que comprende una primera sonda (P1) que
comprende una primera sección diana (T1) y una primera sección de
pinza (C1), y una segunda sonda (P2) que comprende una segunda
sección diana (T2) y una segunda sección de pinza (C2), donde la
primera y la segunda secciones de pinza (C1, C2) son capaces de
hibridar entre sí.
En una realización, la invención se refiere un
par de sondas oligonucleotídicas (K) que comprende:
a) una primera sonda oligonucleotídica (P1) que
comprende una primera sección de pinza (C1), que es capaz de
hibridar con una segunda sección de pinza (C2) de una segunda sonda
oligonucleotídica (P2), y una primera sección diana (T1) que es
capaz de hibridar con una primera sección (S1) de una secuencia de
ADN diana (D) a detectar;
b) una segunda sonda oligonucleotídica (P2) que
comprende una segunda sección de pinza (C2), que es capaz de
hibridar con la primera sección de pinza (C1) de la primera sonda
oligonucleotídica (P1), y una segunda sección diana (T2) que es
capaz de hibridar con una segunda sección (S2) de la secuencia de
ADN diana (D) a detectar, donde la primera y la segunda secciones
(S1, S2) de la secuencia de ADN diana (D) están localizadas
esencialmente adyacentes entre sí en la secuencia de ADN diana (D),
donde el extremo 3' de la primera sección diana (T1) y el extremo
5' de la segunda sección diana (T2) son capaces de ligarse entre sí
cuando el extremo 3' de la primera sección diana (T1) y el extremo
5' de la segunda sección diana (T2) están hibridadas con S1 y
S2.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando el par de sondas se pone en contacto, en
condiciones de hibridación, con una muestra que comprende una
secuencia diana, las dos secciones diana T1 y T2 de las sondas
hibridarán con la primera sección S1 y la segunda sección S2 de la
secuencia de ADN diana.
Las secciones de pinza C1 y C2 están diseñadas
de tal modo que en las condiciones en las que hibridan T1 y T2 con
la secuencia de ADN diana, C1 y C2 también hibridan entre sí,
formando una pinza. La configuración de las sondas hibridadas ahora
se parece a una sonda de tipo candado (en términos de
características de hibridación específica de diana) con una
pinza.
Las sondas de la presente invención tienen las
características de hibridación ventajosas de las sondas tipo
candado en términos de la cinética de hibridación favorable, pero
también tienen las características ventajosas de las sondas de
hibridación lineales en términos de ausencia de formación de
concatémeros durante la etapa de amplificación. Por tanto, las
sondas de la presente invención combinan las ventajas de ambos tipos
de sondas. Las sondas de la presente invención tienen una longitud
que permanece dentro de los dominios en que pueden sintetizarse de
forma fiable usando síntesis química convencional u otras técnicas,
lo que es una ventaja económica significativa. Una ventaja
adicional es que las sondas de la presente invención pueden ser de
mejor calidad (es decir pureza) obviando de este modo la
purificación adicional de las sondas, en comparación con las sondas
tipo candado (más largas) que está conectado con la ventaja técnica
de que dichas sondas son capaces de reducir significativamente la
proporción señal a ruido. Por tanto, las sondas de la presente
invención combinan las características ventajosas de las sondas
circularizables/tipo candado con la síntesis y pureza/calidad
ventajosas de los oligonucleótidos lineales de longitud
relativamente corta.
El método de la presente invención para la
detección de secuencias diana de este modo saca provecho de las
ventajas tanto de las sondas lineales como de las de tipo candado
evitando al mismo tiempo la síntesis engorrosa de oligonucleótidos
largos (sondas tipo candado) y la cinética de hibridación
desfavorable de un par de sondas lineales no unidas en la
hibridación con las secciones diana de la secuencia diana a
detectar.
El par de sondas oligonucleotídicas están
diseñadas de tal modo que para cada secuencia diana en una muestra,
se proporciona un par que comprende una primera (P1) y una segunda
sonda (P2), por lo cual cada una de las sondas contienen una
sección (T1, T2) en uno de los extremos finales que es
complementaria a una parte de la secuencia diana (S1, S2).
Preferiblemente las partes complementarias (S1, S2) de la secuencia
diana están localizadas esencialmente adyacentes entre sí. Sin
embargo, en ciertas realizaciones de la invención los extremos de
las partes complementarias (S1, S2) en las sondas no están
localizadas de forma adyacente entre sí en la secuencia diana.
Dichas realizaciones incluyen, por ejemplo, las realizaciones
descritas a continuación en ligamiento de huecos.
Dentro de un par de sondas oligonucleotídicas,
la primera sonda oligonucleotídica tiene una sección T1 en su
extremo 5' (fosforilado) que es complementaria a una primera parte
S1 de una secuencia diana y la segunda sonda oligonucleotídica en
el par tiene una sección T2 en su extremo 3' (hidroxilado) que es
complementaria a una segunda parte S2 de la secuencia diana. Por
tanto, cuando el par de sondas hibrida con las partes
complementarias (S1, S2) de una secuencia diana, el extremo 5' de
la primera sonda oligonucleotídica está preferiblemente adyacente
esencialmente al extremo 3' de la segunda sonda oligonucleotídica de
modo que los extremos respectivos de las dos sondas pueden ligarse
para formar un enlace fosforilado u otro enlace covalente de
cualquier modo adecuado para proporcionar una "sonda
conectada".
Para cada secuencia diana para la que tiene que
determinarse la presencia o ausencia en una muestra, se diseña un
par específico de una primera y una segunda sondas
oligonucleotídicas con secciones complementarias a las partes
complementarias de cada secuencia diana como se ha descrito
anteriormente. Por tanto, en el método de la invención, para cada
secuencia diana que está presente en una muestra, puede obtenerse
una sonda conectada correspondiente (específica).
Por tanto, en el método de la invención se usa
preferiblemente al menos un par de dos sondas oligonucleotídicas.
Sin embargo, en ciertas realizaciones, en particular en las
realizaciones de ligamiento de huecos, el par de dos sondas puede
complementarse con una tercera sonda oligonucleotídica o una sonda
oligonucleotídica adicional. En dicho casos, las terceras sondas
oligonucleotídicas o las sondas oligonucleotídicas adicionales
preferiblemente comprenden, o más preferiblemente constan de una
secuencia nucleotídica que es complementaria a una tercera parte o
una parte adicional de la secuencia diana a detectar, de tal modo
que después de una hibridación satisfactoria con la secuencia
diana, junto con la primera y la segunda sondas oligonucleotídicas,
la primera, la segunda, la tercera y la sonda adicional pueden
conectarse o ligarse para formar una sonda conectada (véase a
continuación).
Preferiblemente, se proporciona un grupo de
múltiples pares de una primera y segunda sondas oligonucleotídicas,
donde cada par es complementario a una secuencia diana específica y
el grupo como conjunto es complementario a la multiplicidad de
secuencias diana en la muestra. Un par de la primera y segunda
sondas oligonucleotídicas para una secuencia diana dada en una
muestra al menos diferirá en la secuencia nucleotídica de los pares
de sondas para otras secuencias diana, y preferiblemente también
diferirá en longitud de pares de sondas para otra secuencia diana,
más preferiblemente un par de sondas para una secuencia diana dada
producirá una sonda conectada y/o una sonda conectada amplificada
(amplicones, obtenidos después de la amplificación opcional de las
sondas conectadas) que difiere en longitud de las sondas conectadas
correspondientes a otras dianas en la muestra como se describe a
continuación. Como alternativa, las sondas conectadas y/o amplicones
correspondientes a diferentes dianas pueden tener una longitud
idéntica si pueden distinguirse de otro modo, por ejemplo, por
marcadores diferentes como se describe a continuación. Como
alternativa, las sonda conectadas y/o amplicones pueden
distinguirse en base a la secuencia o masa en lugar de la longitud,
usando métodos basados en hibridación con sondas (marcadas) o
series o espectrometría de masas, respectivamente.
Las secciones diana en las sondas de la presente
invención comprenden cada una, independientemente, de
aproximadamente 15 a 35, preferiblemente de 18 a 32, más
preferiblemente de 20 a 30 nucleótidos.
En una realización preferida, la sección diana
contiene al menos un nucleótido específico de alelo, preferiblemente
en el extremo 3' de una sección diana adyacente al extremo 5'
fosforilado de segunda sonda. La presencia de un nucleótido
específico de alelo en la sonda permite la detección de un alelo SNP
específico de un locus. Cuando está presente el nucleótido
específico de alelo complementario en la secuencia diana S, las dos
sondas formarán un dúplex apareado que puede ligarse para formar
una sonda conectada. La detección de la sonda conectada es una
indicación de la presencia de ese alelo específico en la muestra. En
una realización, la muestra puede estar provista de uno o más
grupos de pares de sondas, preferiblemente dos o más, más
preferiblemente tres o más grupos de sondas. Combinando cada uno de
los grupos con un cebador que sea capaz de amplificar selectivamente
solamente un grupo entre los otros grupos, puede obtenerse un
aumento adicional en la productividad ya que puede usarse un ensayo
de ligamiento para la detección de diferentes grupos de secuencias
diana.
La sección de pinza está preferiblemente
localizada en o cerca del extremo de la sonda que está distal a la
sección diana, es decir, cuando la sección diana está localizada en
el extremo 3', la sección de pinza se localiza más hacia el extremo
5' y viceversa. La sección de pinza no está necesariamente
localizada en la posición más distal en el extremo 5' o el extremo
3', puede estar seguido de otras secciones analizadas en este
documento a continuación. Las secciones de pinza están diseñadas
preferiblemente de tal modo que no sean capaces de hibridar con las
secciones diana. Las secciones de pinza de la primera y la segunda
sonda del par son capaces de hibridar entre sí. Las secciones de
pinza están preferiblemente diseñadas de tal modo que dos secciones
de pinza complementarias tengan una afinidad de unión más elevada
entre sí que la afinidad de unión de la sección diana de la sonda
por su parte complementaria en la secuencia nucleotídica diana. Esto
significa en la práctica que las secciones de pinza, cuando
hibridan entre sí, forman un dúplex más fuerte que el híbrido entre
la sección diana y su complemento en la secuencia nucleotídica diana
y/o la hibridación de las pinzas complementarias tiene lugar a
temperaturas más elevadas que la hibridación de la sección
complementaria diana de las sondas con la diana. En otras palabras,
la sección de pinza hibridada se desnaturaliza, en condiciones por
lo demás comparables, a una temperatura más elevada o en condiciones
de mayor rigurosidad que la temperatura de desnaturalización de las
secciones complementarias a la diana en el par de sondas. Esto
permite elegir las condiciones durante el método de la invención de
modo que la pinza hibridada o bloqueada permanece hibridada o
cerrada al menos hasta que las sondas se conectan para producir una
sonda conectada. La pinza bloqueada puede abrirse desnaturalizando
la sonda (conectada) a una temperatura o en circunstancias que
permitan la desnaturalización de la pinza bloqueada.
Un par de sondas que tiene pinzas bloqueadas
expresa cinética de hibridación y comportamiento similar o idéntico
como lo hacen las sondas circulares o de tipo candado. Las dos
sondas de un par pueden añadirse por separado después de lo cual
las secciones de pinza hibridan entre sí en la muestra o, como
alternativa, las dos sondas pueden bloquearse antes de añadirse a
la muestra.
En una realización preferida la pinza tiene una
temperatura de desnaturalización (o temperatura de fusión, Tm) que
excede la temperatura de desnaturalización de las secciones
complementarias diana en el par de sondas en al menos 1ºC,
preferiblemente 5ºC, más preferiblemente 10ºC, en comparación la Tm
más baja de la sección T1 o T2. La temperatura de desnaturalización
de una secuencia oligonucleotídica puede calcularse/estimarse a
partir de la composición de nucleótidos usando las fórmulas
generales para la Tm = (4*G o C)+(2*A o T) o Tm =
(4*G/C)+(2*A/T)-5ºC (Meinkoth et al. Anal.
Biochem. (1984) 138: 267-284). Otras fórmulas son
igualmente aplicables ya que la esencia recae en la diferencia en
la temperatura de desnaturalización entre las secciones (Tm
[pinza]-Tm [diana]). Esto puede conseguirse no
solamente variando la longitud de las secciones de pinza sino
también variando el contenido de GC de la pinza, ya que un par de
bases GC aumenta la Tm en aproximadamente 2ºC en comparación con un
par de bases AT. Una sección de pinza típica comprende de 10 a 30,
preferiblemente de 15 a 25 y más preferiblemente de 18 a 24
nucleótidos. Cuando el contenido de GC es inferior, esta cantidad
de nucleótidos puede aumentar siempre que se obtengan las
características de hibridación deseadas. Como alternativa, pueden
usarse nucleótidos modificados que aumenten la hibridación entre las
dos secciones de pinza. Ejemplos de los mismos son nucleótidos que
tienen características de hibridación mejoradas, tales como Ácidos
Nucleicos Bloqueados tales como los descritos en los documentos WO
99/14226, WO 00/56748, WO 00/66604 y WO 01/25478, Ácidos Péptido
Nucleicos u otras moléculas que estabilicen o potencian la
hibridación del ADN tales como compuestos de unión al surco menor y
otros, tales como los descritos en el documento EP 0 974 672.
El contenido de GC de la pinza puede variar,
donde el contenido de GC de la sección de pinza varía de más del 50
al 100%, preferiblemente más del 60%, más preferiblemente más del
70%, mucho más preferiblemente más del 80% y está preferiblemente
en el intervalo del 90-100%. Por tanto la mayoría de
las secciones de pinza contendrán combinaciones A/T en una base más
incidental o estructural. Un grupo preferido de secciones de pinza
son secuencias ZIP enriquecidas en GC (Iannone et al. (2000),
Cytometry 39: pág. 131-140). Preferiblemente la
sección de pinza comprende al menos uno, preferiblemente al menos 2,
3, 4 ó 5 nucleótidos seleccionados entre el grupo compuesto por G y
C, más que cada uno de T1 y T2.
En una realización preferida, cuando están
implicados grupos de pares, puede proporcionarse una sección de
pinza diferente para cada par de sondas en el grupo. La sección de
pinza está diseñada de tal modo que una pinza para un primer par de
sondas y las pinzas para un segundo par de sondas o un par de sondas
adicional se pueden distinguir entre sí y preferiblemente no
hibridan de forma cruzada entre sí en las condiciones usadas en el
ensayo de ligamiento. Cada par de sondas comprende una pinza única,
evitando de este modo la hibridación cruzada entre pinzas de
diferentes pares de sondas en una muestra. Para este fin, la sección
de pinza puede comprender nucleótidos adicionales o las secuencias
oligonucleotídicas de la sección de pinza pueden ser únicas dentro
del grupo. El uso de secciones de pinza únicas para cada par de
sondas en un grupo posibilita la detección de múltiples secuencias
diana en una muestra simultáneamente. Esta realización también
posibilita la detección de una o más secuencias diana diferentes en
múltiples muestras posteriormente, usando la misma colección de
pares de sondas. Esta realización posibilita adicionalmente que
pueda usarse el mismo grupo de pares de sondas una y otra vez para
la detección de diferentes secuencias diana.
Preferiblemente, cuando se usan diferentes
pinzas en un grupo de pares de sondas, estas pinzas tienen una Tm
que está dentro de un pequeño intervalo, preferiblemente entre
aproximadamente 60-90ºC, más preferiblemente entre
65-88ºC, mucho más preferiblemente entre
70-85ºC. Como se sabe, las características de
hibridación de los ácidos nucleicos también están influidas por las
concentraciones salinas. Como se usa en este documento, la
comparación de características de hibridación en general o
temperaturas de desnaturalización en particular de los
oligonucleótidos se considera en concentraciones salinas
comparables, a menos que se indique otra cosa.
Pinzas alternativas que pueden usarse en la
presente invención son ácidos nucleicos que contienen enlaces
fotodegradables. Después del ligamiento, puede eliminarse el enlace
fotodegradable y amplificarse y/o detectarse la sonda
conectada.
Las sondas oligonucleotídicas de la presente
invención pueden comprender adicionalmente una secuencia rellenadora
(R1, R2) de una longitud variable. Cada sonda en el par puede
contener un rellenador. La longitud del rellenador varía de 0 a
1000, preferiblemente de 0 a 500, más preferiblemente de 1 a 100 y
mucho más preferiblemente de 1 a 50. El rellenador puede ser una
secuencia única que se conoce como una secuencia de código Zip como
se describe por Iannone et al. (2000), Cytometry 39: pág.
131-140. El rellenador puede estar localizado entre
la sección diana y la pinza o puede incorporarse en la pinza o en el
extremo distal de la sección diana. El rellenador puede usarse para
conferir diferencias de longitud entre las sondas o las sondas
conectadas pero también puede usarse para conferir diferencias de
masa para la detección basada en masa o secuencias dirigibles (ZIP)
para detección basada en hibridación.
En una realización adicional, la invención se
refiere a una serie de al menos tres oligonucleótidos adecuados
para el genotipado de SNP, que comprende:
a) una primera sonda oligonucleotídica (P1) que
comprende una primera sección de pinza (C1) que es capaz de
hibridar con una segunda sección de pinza (C2) de una segunda sonda
oligonucleotídica (P2) y una primera sección diana (T1) que es
capaz de hibridar con una primera sección (S1) de una secuencia de
ADN diana (D) a detectar;
b) una segunda sonda oligonucleotídica (P2) que
comprende una segunda sección de pinza (C2) que es capaz de
hibridar con la primera sección de pinza (C1) de la primera sonda
oligonucleotídica (P1) y una segunda sección diana (T2) que es
capaz de hibridar con una segunda sección (S2) de la secuencia de
ADN diana (D) a detectar;
c) al menos una tercera sonda oligonucleotídica
(P3) que comprende la segunda sección de pinza (C2) que es capaz de
hibridar con la primera sección de pinza (C1) de la primera sonda
oligonucleotídica (P1) y la segunda sección diana (T2) que es capaz
de hibridar con la segunda sección (S2) de la secuencia de ADN diana
(D) a detectar;
donde la segunda sonda y la tercera sonda
contienen un nucleótido específico de alelo, preferiblemente
localizado en el extremo de una sección diana de la serie de
sondas;
donde el nucleótido específico de alelo de la
segunda y la tercera sondas corresponde con alelos del SNP a
detectar;
donde la segunda y la tercera sondas contienen
una sección adicional (rellenadora) que discrimina entre los
productos de ligamiento (amplificados) de la primera sonda con la
segunda sonda y la tercera sonda.
Para facilitar la amplificación de los pares de
sondas conectadas, pueden incorporarse sitios de unión de cebador
(B1, B2) en las sondas. Los sitios de unión de cebador se localizan
preferiblemente en otras partes de la sonda diferentes de la
sección diana, preferiblemente entre las secciones de pinza y las
secciones diana. Los sitios de unión de cebador son capaces de
unirse a cebadores para inicial la elongación del cebador o la
amplificación. Preferiblemente dentro de un grupo de pares de
sondas, los sitios de unión de cebador son universales, es decir
solamente se incorpora un grupo predeterminado de sitios de unión de
cebador en la sonda para posibilitar la elongación combinada del
cebador o amplificación a partir de una cantidad limitada de
cebadores, tales como cebadores que comprenden una o más bases
selectivas en su extremo 3', tal como se conocen a partir de AFLP
(documento EP 0 534 858).
Las funciones del rellenador, los sitios de
unión de cebador y la sección de pinza en una sonda pueden
combinarse y pueden inter-relacionar en el sentido
de que una parte específica de la sonda puede funcionar como (parte
de) una sección de pinza durante la hibridación y el ligamiento, al
mismo tiempo o en otro momento puede funcionar como (parte de) un
sitio de unión de cebador para la elongación de
cebador/amplificación y de nuevo al mismo tiempo o en otro momento
funciona como un rellenador para conferir la diferencia basada en
plataforma de detección y deseada tal como se describe en este
documento a continuación.
En su definición más amplia, la secuencia diana
puede ser cualquier secuencia nucleotídica de interés. La secuencia
diana puede ser cualquier secuencia de la que se desea su
determinación/detección, por ejemplo porque es indicativa, está
asociada o es representativa de una cierta enfermedad o composición
genética o trastorno. La secuencia diana preferiblemente es una
secuencia nucleotídica que contiene, representa o está asociada con
un polimorfismo. El término polimorfismo en este documento se
refiere a la existencia de dos o más secuencias alternativas
determinadas genéticamente o alelos en una población. Un marcador o
sitio polimórfico es el locus en el que existe divergencia de
secuencia. Los marcadores preferidos tienen al menos dos alelos,
existiendo cada uno a una frecuencia de más del 1%, y más
preferiblemente más del 10% o el 20% de una población seleccionada.
Un locus polimórfico puede ser tan pequeño como de un par de bases.
Los marcadores polimórficos incluyen polimorfismos de longitud de
fragmentos de restricción, repeticiones en tándem de número variable
(VNTR), regiones hipervariables, minisatélites, repeticiones
dinucleotídicas, repeticiones trinucleotídicas, repeticiones
tetranucleotídicas, repeticiones de secuencia simple, y elementos
de inserción tales como Alu. La primera forma alélica identificada
se denomina arbitrariamente como la forma de referencia y las otras
formas alélicas se denominan como alelos alternativos o variantes.
La forma alélica que existe más frecuentemente en una población
seleccionada a veces se menciona como la forma de tipo silvestre.
Los organismos diploides pueden ser homocigóticos o heterocigóticos
para las formas alélicas. Un polimorfismo dialélico tiene dos
formas. Un polimorfismo trialélico tiene tres formas. Un
polimorfismo de un único nucleótido existe en un sitio polimórfico
ocupado por un único nucleótido, que es el sitio de variación entre
secuencias alélicas. El sitio está habitualmente precedido por y
seguido de secuencias altamente conservadas del alelo (por ejemplo,
secuencias que varían en menos de 1/100 ó 1/1000 miembros de las
poblaciones). Un polimorfismo de un único nucleótido habitualmente
surge debido a la sustitución de un nucleótido por otro en el sitio
polimórfico. Los polimorfismos de un único nucleótido también pueden
surgir a partir de la deleción de un nucleótido o una inserción de
un nucleótido con relación a un alelo de referencia. Otros
polimorfismos incluyen deleciones o inserciones (pequeñas) de varios
nucleótidos, conocidos como indels. Una secuencia diana preferida
es una secuencia diana que está asociada con un marcador AFLP®, es
decir un polimorfismo que es detectable con AFLP®.
En la muestra de ácido nucleico, los ácidos
nucleicos que comprenden la diana pueden ser cualquier ácido
nucleico de interés. Aunque los ácidos nucleicos en la muestra
habitualmente están en forma de ADN, la información de la secuencia
nucleotídica contenida en la muestra puede ser de cualquier fuente
de ácidos nucleicos, incluyendo por ejemplo ARN, ARN poliA^{+},
ADNc, ADN genómico, ADN organular tal como ADN mitocondrial o de
cloroplastos, ácidos nucleicos sintéticos, bibliotecas de ADN,
bancos de clones o cualquier selección o combinación de los mismos.
El ADN en la muestra de ácido nucleico puede ser bicatenario,
monocatenario, y ADN bicatenario desnaturalizado en ADN
monocatenario. La desnaturalización de secuencias bicatenarias
produce dos fragmentos monocatenarios, que pueden, uno o los dos,
analizarse por sondas específicas para las cadenas respectivas. Las
muestras de ácido nucleico preferidas comprenden secuencias diana
en ADNc, ADN genómico, fragmentos de restricción, fragmentos de
restricción ligados a adaptadores, fragmentos de restricción ligados
a adaptadores amplificados, fragmentos AFLP o fragmentos obtenidos
en una preamplificación con molde AFLP.
Se prefiere que una muestra contenga dos o más
secuencias diana diferentes, es decir dos o más se refiere a la
identidad en lugar de la cantidad de las secuencias diana en la
muestra. En particular, la muestra comprende al menos dos
secuencias diana diferentes, en particular al menos 10,
preferiblemente al menos 25, más preferiblemente al menos 50, más
en particular al menos 100, preferiblemente al menos 250, más
preferiblemente al menos 500 y mucho más preferiblemente al menos
1000 secuencias diana adicionales. En la práctica, la cantidad de
secuencias diana en una muestra que puede analizarse está limitada,
entre otros, por la cantidad de sondas conectadas que pueden
detectarse. Por ejemplo, demasiados pares diferentes de la primera y
la segunda sondas oligonucleotídicas en un muestra puede corromper
la fiabilidad de un etapa de amplificación combinada.
Una limitación adicional está formada, por
ejemplo, por la cantidad de fragmentos en una muestra que puede
resolverse por la plataforma de detección usada. La cantidad también
puede estar limitada por el tamaño del genoma del organismo o la
complejidad del transcriptoma de un tipo celular particular del que
se obtiene la muestra de ADN o ADNc, respectivamente.
El método de la presente invención comprende la
hibridación del par de sondas con la secuencia diana y el
ligamiento de las dos sondas cuando hibridan adyacentes entre sí en
la secuencia diana.
En una realización del método de la presente
invención, la etapa de hibridación/ligamiento se realiza
directamente en la secuencia diana o en una representación de la
misma. Las sondas conectadas resultantes después se detectan,
preferiblemente después de amplificarse. El método preferiblemente
es un método para determinar la presencia o ausencia de una o más
secuencias diana en una muestra de ácido nucleico. El método
preferiblemente comprende las etapas de:
a) proporcionar a una muestra de ácido nucleico
un par de una primera y una segunda sonda oligonucleotídica para
cada secuencia diana a detectar en la muestra, por lo cual la
primera sonda oligonucleotídica tiene una sección en su extremo 5'
que es complementaria a una primera parte de una secuencia diana y
la segunda sonda oligonucleotídica tienen una sección en su extremo
3' que es complementaria a una segunda parte de la secuencia diana,
por lo cual la primera y la segunda parte de la secuencia diana
están preferiblemente localizadas adyacentes entre sí, y donde la
primera sonda oligonucleotídica comprende adicionalmente una sección
de pinza que es capaz de hibridar con una sección de pinza
complementaria localizada en la segunda sonda oligonucleotídica,
donde las secciones de pinza son esencialmente no complementarias a
la secuencia diana;
b) permitir que las pinzas hibriden;
c) permitir que las sondas oligonucleotídicas
hibriden con las partes correspondientes de las secuencias diana
por lo cual las secciones complementarias diana de la primera y
segunda sondas oligonucleotídicas están localizadas preferiblemente
adyacentes;
d) proporcionar un medio para conectar la
primera y la segunda sondas oligonucleotídicas hibridadas con la
secuencia diana;
e) permitir que las secciones complementarias de
la primer y la segunda sondas oligonucleotídicas hibridadas se
conecten, para producir una sonda conectada correspondiente a una
secuencia diana en la muestra; y,
f) detectar las sondas conectadas, por lo cual
opcionalmente las sondas conectadas se amplifican antes de la
detección para producir una muestra amplificada que comprende las
sondas conectadas amplificadas (amplicones).
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En una realización preferida de la presente
invención, la sección de pinza hibrida (cerrada o bloqueada) durante
la etapa de hibridación/ligamiento (es decir, las etapas (b) y (c)
se combinan en una etapa). En una realización preferida el par de
sondas puede añadirse a la muestra en forma de dos sondas separadas
que en las condiciones de partida del método hibridarán con sus
secciones de pinza respectivas de la sonda correspondiente dentro
del par. En otra realización las dos sondas en el par pueden
hibridar con sus secciones de pinza antes de añadirse a la muestra.
Cuando las dos secciones de pinza en un par de sondas hibridan,
antes o durante la etapa de hibridación/ligamiento (c), las dos
sondas funcionan como una única sonda circular con las
características de hibridación y ligamiento ventajosas asociadas
habitualmente con las sondas tipo candado, es decir, cinética de
hibridación aumentada atribuida al entrelazado de la sonda circular
con la secuencia diana y el aumento concomitante en la estabilidad,
potenciando de este modo las posibilidades de un ligamiento exitosos
y correcto y reduciendo la cantidad de acontecimientos
insatisfactorios o falsos positivos. Después de la hibridación de
las sondas con la secuencia diana y el ligamiento, las sondas
ligadas o conectadas se someten, preferiblemente, a un tratamiento
de desnaturalización. Esto puede abrir la pinza. La sonda conectada
puede amplificarse usando uno o más cebadores para proporcionar
sondas conectadas amplificadas para facilitar la detección.
Cuando la sección de pinza no se desnaturaliza
sino que sigue cerrada durante la etapa de amplificación, la sonda
conectada aún puede considerarse como una molécula lineal, pero con
extremos hibridados. La amplificación e incluso la amplificación
exponencial aún es posible, con la condición de que haya una
posición en la que pueda(n) hibridar el(los)
cebador(es) de amplificación. Preferiblemente, los sitios de
unión de cebador provistos en las sondas son diferentes de la
sección de pinza para permitir que hibride(n) el(los)
cebador(es).
En una realización del método de la invención,
la etapa de hibridación/ligamiento también puede realizarse sobre
un producto de amplificación de la secuencia diana. La sección
relevante de la secuencia diana entonces se (pre-)amplifica después
de que se añada el par de sondas y se realice la etapa de
ligamiento. En esta realización, el marcador se proporciona
habitualmente en la sonda. Las sondas de la presente invención
entonces tienen la ventaja de características de hibridación
mejoradas en comparación con las sondas lineales convencionales. Un
ejemplo de dicho ensayo de amplificación-ligamiento
está presente en el documento WO 97/45559 (PCR primaria/PCR
secundaria/Reacción de detección del ligamiento).
\newpage
En la etapa de hibridación (c) del método, se
pone en contacto una o una multiplicada de secuencias diana
diferentes, es decir, al menos dos secuencias diana diferentes, con
una o una multiplicidad de pares de sondas oligonucleotídicas
específicas en condiciones de hibridación. Los pares de sondas
oligonucleotídicas posteriormente se dejan hibridar con las partes
complementarias, preferiblemente adyacentes, de las múltiples
secuencias diana en la muestra. Los métodos y condiciones para la
hibridación de específica de sondas oligonucleotídicas con las
secuencias diana complementarias son bien conocidos en la técnica
(véase, por ejemplo, en Sambrook y Russel (2001) ``Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (3ª edición), Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Habitualmente, después de mezclar las sondas
oligonucleotídicas y las secuencias diana, los ácidos nucleicos se
desnaturalizan por incubación (generalmente entre 94ºC y 96ºC)
durante un corto periodo de tiempo (por ejemplo, de 30 segundos a 5
minutos) en un tampón salino. La muestra que contiene las sondas
desnaturalizadas y las secuencias diana después se deja enfriar
hasta una temperatura de hibridación óptima para la hibridación
específica de las sondas y las secuencias diana, que habitualmente
es aproximadamente 5ºC por debajo de la temperatura de fusión del
híbrido entre la sección complementaria (sección diana) de la sonda
y su secuencia complementaria (en la secuencia diana). Para evitar
la hibridación inespecífica o ineficaz de una de las dos sondas en
un par cebador, o en una muestra con múltiples secuencias diana, se
prefiere que, dentro de una muestra, las secciones de las sondas
que son complementarias a las secuencias diana sean de temperaturas
de fusión similares, preferiblemente idénticas, entre las
diferentes secuencias diana presentes en la muestra. Por tanto, las
secciones complementarias de la primera y la segunda sondas
preferiblemente difieren en menos de 20, 15, 10, 5, ó 2ºC en la
temperatura de fusión. Esto se facilita usando secciones
complementarias de la primera y la segunda sondas con una longitud
similar y contenido de G/C similar, las secciones complementarias
preferiblemente difieren en menos de 20, 15, 10, 5, ó 2 nucleótidos
de longitud y sus contenidos de G/C difieren en menos del 30, 20,
15, 10, ó 5%. Complementario como se usa en este documento significa
que una primera secuencia nucleotídica es capaz de hibridar
específicamente con una segunda secuencia nucleotídica en
condiciones de rigurosidad normales. Una secuencia nucleotídica que
se considera complementaria a otra secuencia nucleotídica puede
contener una cantidad minoritaria, es decir, preferiblemente menos
del 20, 15, 10, 5 ó 2%, de desapareamientos. Como alternativa,
puede ser necesario compensar los desapareamientos, por ejemplo, por
la incorporación de los llamados nucleótidos universales, tales
como, por ejemplo, los descritos en el documento
EP-A 974 672, incorporado en este documento por
referencia o con LNA o PNA. Como la hibridación de las sondas con
las secuencias diana depende de la concentración, la hibridación se
realiza preferiblemente en un pequeño volumen, es decir menos de 25
\mul, preferiblemente menos de 10 \mul. En estas condiciones de
hibridación, la hibridación de las sondas con las secuencias diana
habitualmente es rápida y no necesita proceder durante más de 5, 10
ó 15 minutos, aunque puede usarse un tiempo de hibridación más largo
siempre que se mantenga la temperatura de hibridación para evitar
una hibridación inespecífica. Los tiempos de hibridación más largos
son más importantes/necesarios para amplificaciones cuantitativas
que dependen de la ocupación completa de la diana por las sondas de
ligamiento para permitir el control de las cantidades relativas de
secuencias diana entre las muestras.
En una realización preferida de la invención, se
han obtenido excelentes resultados por tiempos de hibridación
prolongados tales como hibridación durante una noche o más tiempo,
tal como 10 veces 1 hora). Los tiempos de hibridación prolongados
pueden ser ventajosos en estos ensayos ya que se reduce la
diferencia en la señal debida a diferentes eficacias de hibridación
y se considera deseable conseguir la hibridación y el ligamiento
completos de todas las sondas para las cuales esté presente una
secuencia diana. Se han obtenido excelentes resultados por una
etapa de hibridación-ligamiento combinada usando una
ligasa termoestable descrita en este documento. En esta
realización, la hibridación-ligamiento se realizó
dejando que las sondas hibridaran durante 1 hora en presencia de
una ligasa termoestable, seguido de una etapa de desnaturalización.
La repetición de estas etapas al menos 2 veces proporcionó buenos
resultados. La repetición de estas etapas 10 veces proporcionó
excelentes resultados.
Para evitar la evaporación durante la
desnaturalización y la hibridación, también pueden calentarse las
paredes y las tapas de las cámaras de reacción (es decir, los tubos
o los pocillos de microtitulación) a la misma temperatura que la
mezcla de reacción que se consigue habitualmente por el uso de un
equipo de amplificación de ADN comercial. En sondas
oligonucleotídicas preferidas la longitud de la sección
complementaria a la diana es preferiblemente de al menos 15, 18 ó
20 nucleótidos y preferiblemente de no más de 30, 40, ó 50
nucleótidos y las sondas preferiblemente tienen una temperatura de
fusión de la sección diana de al menos 50ºC, 55ºC o 60ºC.
Las sondas que no son complementarias a una
parte de la secuencia diana o que contienen demasiados
desapareamientos no hibridarán o hibridarán solamente a un grado
reducido con la secuencia diana cuando la muestra se someta a
condiciones de hibridación. Por consiguiente, es menos probable que
suceda el ligamiento. La cantidad de productos de ligamiento falsos
a partir de estas sondas en general no será, por lo tanto,
suficiente y mucho más pequeña que los productos de ligamiento
bona fide de modo que se autocompletarán durante la posterior
amplificación combinada. Por consiguiente, no se detectarán o
solamente a un grado minoritario.
Un método de la invención preferido comprende
adicionalmente una etapa para la eliminación de sondas
oligonucleotídicas que no están hibridadas con secuencias diana y/o
que no están conectadas/ligadas. La eliminación de dichas sondas se
realiza preferiblemente antes de la amplificación, y preferiblemente
por digestión con exonucleasas.
Por la retirada/eliminación de las sondas
oligonucleotídicas que no están conectadas/ligadas puede conseguirse
una reducción significativa de la amplificación diana independiente
de ligamiento (incorrecta), provocando una proporción
señal-a-ruido aumentada. Una
solución para eliminar uno o más de los componentes no
conectados/ligados sin retirar el contenido de la información de
las sondas conectadas es usar la exonucleasa para digerir las
sondas oligonucleotídicas no conectadas/ligadas. Bloqueando el
extremo que no está ligado, por ejemplo, el extremo 3' de la sonda
oligonucleotídica cadena abajo, puede hacerse que una sonda sea
sustancialmente resistente a la digestión, mientras que la otra sea
sensible. Solamente la presencia de la secuencia del producto de
ligamiento de longitud completa entonces evitará la digestión de la
sonda conectada. Los grupos de bloqueo incluyen el uso de un grupo
tiofosfato y/o el uso de grupos del azúcar
2-O-metil ribosa en la estructura.
Las exonucleasas incluyen Exo I (3'-5'), Exo III
(3'-5'), y Exo IV (tanto 5'-3' como
3'-5'), requiriendo la última el bloqueo en ambos
lados. Un modo conveniente para bloquear ambas sondas es usar una
sonda "tipo candado" larga (véase, M. Nilsson et. al.,
"Padlock Probes: Circularising Oligonucleotides for Localised DNA
Detection", Science 265: 2085-88 (1994), que se
incorpora por la presente por referencia), aunque no es de ninguna
manera necesario.
Una ventaja del uso de exonucleasas, por
ejemplo, una combinación de Exo I (específica para hebra sencilla)
y Exo III (específica para doble hebra), es la capacidad de destruir
tanto el ADN diana como una de las sondas oligonucleotídicas,
dejando las secuencias del producto de ligamiento sustancialmente
sin digerir. Usando un tratamiento con exonucleasa antes de la
amplificación, una o ambas (sin ligar) sondas oligonucleotídicas en
cada serie se reducen sustancialmente, y por tanto la hibridación de
las sondas oligonucleotídicas restantes con el ADN diana original
(que también está sustancialmente reducido por el tratamiento con
exonucleasa) y la formación de productos de ligamiento aberrantes
que pueden servir como un sustrato adecuado para la amplificación
por PCR por la serie de cebadores oligonucleotídicos se reduce
sustancialmente.
Los extremos 5'-fosforilados y
3'-hidroxilado respectivos de un par de primera y
segunda sondas oligonucleotídicas que hibridan esencialmente
adyacentes a las partes complementarias de una secuencia diana se
conectan en la etapa (c) para formar un enlace covalente por
cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Los extremos de
las sondas pueden conectarse enzimáticamente en un enlace
fosfodiéster por una ligasa, preferiblemente una ADN ligasa. Las
ADN ligasas son enzimas capaces de catalizar la formación de un
enlace fosfodiéster entre (los extremos de) dos cadenas
polinucleotídicas unidades en sitios adyacentes en una cadena
complementaria. Las ADN ligasas habitualmente requieren ATP (EC
6.5.1.1) o NAD (EC 6.5.1.2) como cofactor para sellar las mellas en
el ADN bicatenario. Las ADN ligasas adecuadas para su uso en la
presente invención son la ADN ligasa T4, la ADN ligasa de E.
coli o preferiblemente una ligasa termoestable como, por
ejemplo, la ligasa de Thermus aquaticus (Taq), la ADN ligasa
de Thermus thermophilus, o la ADN ligasa de Pyococcus.
Como alternativa, puede usarse el autoligamiento químico de
extremos polinucleotídicos modificados para ligar dos sondas
oligonucleotídicas hibridadas en sitios adyacentes en las partes
complementarias de una secuencia diana (Xu y Kool, 1999, Nucleic
Acid Res. 27: 875-881).
Tanto el ligamiento químico como el enzimático
suceden de forma mucho más eficaz en complejos
sonda-secuencia diana perfectamente apareados en
comparación con complejos en que una o las dos sondas forman un
desapareamiento con la secuencia diana en, o cerca del sitio de
ligamiento (Wu y Wallace, 1989, Gene 76:245-254; Xu
y Kool, supra). Para aumentar la especificidad de
ligamiento, es decir, las eficacias de ligamiento relativas de
oligonucleótidos perfectamente apareados en comparación con
oligonucleótidos desapareados, el ligamiento se realiza
preferiblemente a temperaturas elevadas. Por tanto, en una
realización preferida de la invención, se emplea una ADN ligasa que
permanece activa a 50 - 65ºC durante tiempos prolongados, pero que
se inactiva fácilmente a temperaturas más elevadas, por ejemplo,
las usadas en la etapa de desnaturalización durante una PCR,
habitualmente 90-100ºC. Una de dichas ADN ligasas es
una ADN ligasa que requiere NAD de una bacteria
Gram-positiva (cepa MRCH 065) que se conoce a partir
del documento WO 01/61033. Esta ligasa se conoce como "Ligasa
65" y está disponible en el mercado en MRC Holanda,
Ámsterdam.
En una realización alternativa, por ejemplo,
dirigida a la identificación de indels, los extremos respectivos de
las secciones complementarias de la primera y la segunda sondas
pueden hibridarse de tal modo que se deje un hueco. Este hueco
puede llenarse con un (tercer) oligonucleótido adecuado y ligarse.
Dichos métodos son conocidos en la técnica como "ligamiento de
huecos" y se describen inter alia en el documento WO
00/77260. Otra posibilidad para llenar este hueco es por extensión
de un extremo de la sonda usando una polimerasa y una ligasa en
combinación con nucleótidos sencillos, opcionalmente
preseleccionados entre A, T, C, o G, o di-, trioligonucleótidos u
otros oligonucleótidos pequeños. En caso de que la secuencia diana
sea ARN, otra posibilidad más para llenar el hueco es por extensión
de un extremo de la sonda usando la transcriptasa inversa y una
ligasa en combinación con nucleótidos sencillo,
opcionalmente preseleccionados entre A, T, C, o G, o di-, trioligonucleótidos u otros oligonucleótidos pequeños.
opcionalmente preseleccionados entre A, T, C, o G, o di-, trioligonucleótidos u otros oligonucleótidos pequeños.
En un aspecto de la presente invención, puede
introducirse una etapa discriminatoria adicional antes del
ligamiento. En ciertas realizaciones, la primera o la segunda sonda
oligonucleotídica del par se diseña de tal modo que una de las dos
sondas se extienda más allá del punto de ligamiento previsto de su
sección específica de diana. Preferiblemente, la sonda se extiende
con una secuencia que no es complementaria a la secuencia diana. En
el caso de una correcta hibridación de las secuencias específicas de
diana de las dos sondas con la secuencia diana, se forma una
estructura de escisión ahorquillada donde el extremo 3' de la
sección específica de diana de la sonda no extendida hibrida con la
secuencia diana, mientras que el extremo 5' extendido de la otra
sonda, que no es complementario a la secuencia diana, forma un
brazo monocatenario (véase la Fig. 4). La estructura de escisión
ahorquillada obtenida de este modo es un sustrato para la actividad
nucleasa 5' de ADN polimerasas, mencionadas en este documento como
agente de escisión, o agente de segmentación. Un agente de
segmentación preferido es una ADN polimerasa modificada que tiene
actividad nucleasa 5' pero que carece de actividad sintética o una
endonucleasa FEN. Un ejemplo de dicha estructura de escisión
ahorquillada y dicho agente de segmentación se describe en los
documentos EP 601834 y US 5795763 (Third Wave Technologies). Un
ejemplo de una nucleasa FEN es la metalonucleasa específica de
estructura multifuncional FEN-1
(exonucleasa-1 cinco' o
endonucleasa-1 de solapamiento), que también
funciona como una endonucleasa para solapamientos de ADN 5'
(Revisado en Hosfield et al., 1998, Cell, 95:135).
En ciertas realizaciones el agente de
segmentación puede ser una ADN polimerasa nativa pero
preferiblemente el agente de segmentación es una forma modificada
que carece de la actividad sintética de la ADN polimerasa. Las ADN
polimerasas adecuadas con actividad nucleasa 5' y que pueden
modificarse para inactivar su actividad sintética son polimerasas
de, por ejemplo, Thermus thermophilus, Thermus
aquaticus, Escherichia coli, y Thermus flavus, o
una forma modificada del producto del gen 6 del bacteriófago T7 o
endonucleasa FEN. Se mencionan otros agentes de segmentación
adecuados inter alia en los documentos US6635463, US6562611,
US6555357, US6458535, US6348314, US6090606, US6090543, US6001567,
US5994069, US5985557, US5843669, US5846717, US5837450, US5614402,
W094/29482, W097/27214, W098/23774, W098/42873.
Después de la incubación de la estructura de
escisión ahorquillada con un agente de segmentación adecuado,
sucederá la escisión en la sonda extendida, justo entre el primer
nucleótido desapareado de la secuencia de extensión y el primer
nucleótido apareado de la sección específica de diana de la sonda
extendida. La secuencia de extensión por tanto se elimina y los dos
extremos de las secciones específicas de diana de la primera y la
segunda sondas del par hibridarán inmediatamente adyacentes entre
sí, en caso de un apareamiento perfecto con la secuencia diana,
permitiendo de este modo el ligamiento de las dos sondas para formar
una sonda conectada (véase la Fig. 4). Este principio es válido
para y puede aplicarse a cualquier ensayo OLA convencional y los
ensayos de la presente invención parecidos y puede formar una mejora
inventiva de la tecnología OLA mejorando adicionalmente la
fidelidad de la tecnología OLA. El principio es válido para sondas
no circularizables, circularizables y
semi-circularizables (como se describe en este
documento) del mismo modo.
En ciertas realizaciones, el método general para
los ensayos OLA comprende una etapa donde se forma una estructura
de escisión que comprende la secuencia del ácido nucleico diana, una
primera sonda y una segunda sonda. En ciertas realizaciones, la
primera sonda comprende una primera región específica de diana que
es capaz de hibridar con una primera sección de la secuencia del
ácido nucleico diana para formar un primer dúplex. En ciertas
realizaciones, la segunda sonda comprende una segunda región
específica de diana que es capaz de hibridar con una segunda
sección de la secuencia del ácido nucleico diana para formar un
segundo dúplex. En ciertas realizaciones, la primera y la segunda
secciones de la secuencia del ácido nucleico diana son contiguas de
modo que el primero y el segundo dúplex son contiguos. En ciertas
realizaciones, la primera sonda o la segunda sonda comprende una
región adicional (E), una región extendida, preferiblemente un
extremo 5' extendido, que no es capaz de hibridar con la secuencia
del ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la región
adicional (extendida) está localizada en el extremo de la primera o
la segunda sonda en la posición del sitio de unión (es decir, el
sitio potencial de ligamiento del ensayo OLA) entre la primera y la
segunda secciones de la secuencia del ácido nucleico diana. En
ciertas realizaciones, la región adicional (extendida) proporciona
una sección no hibridada de la primera o la segunda sonda para crear
de este modo una estructura de escisión (ahorquillada). Ciertas
realizaciones comprenden exponer la estructura de escisión a un
agente de escisión que preferiblemente escinden la estructura de
escisión de un modo independiente de la secuencia de la estructura
de escisión que provoca la escisión de la estructura de escisión
cuando la estructura de escisión y el agente de escisión se incuban
en condiciones en las que puede suceder la escisión. En ciertas
realizaciones, la escisión de la estructura de escisión provoca la
eliminación de la región adicional (extendida). En ciertas
realizaciones, la eliminación de la región adicional (extendida)
por escisión de la estructura de escisión provoca la localización
adyacente de la primera y la segunda sondas.
En un aspecto, la invención se refiere al uso de
un agente de escisión, preferiblemente antes del ligamiento, en
ensayos OLA. En ciertas realizaciones, el agente de escisión se usa
para eliminar un saliente (es decir la región adicional o
extendida) de la primera o la segunda sonda localizado en el punto
previsto de ligamiento de modo que puedan ligarse la primera y la
segunda sondas. Las características del agente de escisión son que
la escisión sucede cuando las dos sondas hibridan adyacentes entre
sí en la secuencia diana y una de las sondas tiene un saliente en
el punto donde las sondas hibridan adyacentes. En ciertas
realizaciones, la escisión sucede preferiblemente sólo cuando las
dos sondas hibridan adyacentes entre sí en la secuencia diana y una
de las sondas tiene un saliente en el punto donde las sondas
hibridan adyacentes. La escisión del saliente proporciona dos
sondas que hibridan adyacentes en la secuencia diana y que pueden
ligarse. Una de las ventajas técnicas de esta etapa de escisión es
que la etapa de escisión proporciona el fosfato 5' en el extremo de
las sondas necesario para el ligamiento. Proporcionar el fosfato 5'
puede usarse como alternativa para la síntesis de oligonucleótidos
convencional donde la fosforilación en el extremo 5' es una de las
etapas finales en la síntesis de oligonucleótidos. Una ventaja
técnica adicional es que se aumenta significativamente la
selectividad y especificidad de la reacción de ligamiento posterior
debido a la selectividad mejorada del agente de escisión para
escindir solamente estructuras de escisión, es decir, aquellas
estructuras en las que le nucleótido en el saliente es
complementario o capaz de hibridar con el nucleótido de la secuencia
diana.
En ciertas realizaciones dirigidas a la
detección específica de alelo de SNP en secuencias diana, el
nucleótido específico de alelo se incorpora en la sonda que
contiene la región adicional (extendida). Por tanto, una sonda del
par comprende una sección específica de diana que hibrida
esencialmente adyacente al SNP a investigar. La otra sonda del par
comprende una sección específica de diana que contiene el nucleótido
que es complementario al SNP a investigar y, adyacente a ese
nucleótido, la región adicional (extendida). Hay una representación
generalizada de esta realización, aplicable a todos los ensayos OLA
y parecidos de la presente invención que implica el uso de una
región adicional (extendida) en las Fig. 6A, 6B y 7. Esta
realización permite que tanto la etapa de escisión como la etapa de
ligamiento sucedan solamente en caso de que las dos secciones diana
estén en perfecto apareamiento en el punto de ligamiento/escisión y
esta realización mejora adicionalmente la especificidad.
La introducción de la etapa de escisión en el
ensayo OLA combina la especificidad del Ensayo Invader monoplex
(Third Wave Technologies) con la capacidad flexible combinada de
ensayos OLA SNPWave. Esto permite, por ejemplo, medir las
frecuencias de SNP en muestras combinadas o complejas u otras formas
de medición cuantitativa de secuencias tales como perfilado de
transcritos no rutinario, o medición cuantitativa de niveles de
contaminación de patógenos en suelo, alimentos, agua etc.
El uso de esta etapa adicional en ensayos OLA
proporciona ventajas significativas y encuentra aplicación en, por
ejemplo, en el campo del análisis cuantitativo de frecuencias
alélicas en, por ejemplo, exploraciones poblacionales o en el campo
de la identificación de mutantes de baja frecuencia en muestras
complejas.
Las sondas conectadas se amplifican usando al
menos uno, preferiblemente un par de cebadores correspondientes a
los sitios de unión de cebador. En una realización preferida, se usa
al menos uno de los cebadores o el mismo par de cebadores para la
amplificación de dos o más sondas conectadas diferentes en una
muestra, preferiblemente para la amplificación de todas las sondas
conectadas en una muestra. Dicho cebador a veces se menciona como
cebador universal ya que estos cebadores son capaces de cebar la
amplificación de todas las sondas que contienen el sitio de unión
del cebador universal correspondiente y por consiguientes de todas
las sondas ligadas que contienen el sitio de unión del cebador
universal. Los diferentes cebadores que se usan en la amplificación
son, preferiblemente, esencialmente iguales en eficacia de
hibridación y cebado. Por tanto, los cebadores en una muestra
preferiblemente difieren en menos de 20, 15, 10, 5, ó 2ºC en
temperatura de fusión. Esto puede conseguirse como se ha resumido
anteriormente para la sección complementaria de las sondas
oligonucleotídicas. A diferencia de la secuencia de las secciones
complementarias, la secuencia de los cebadores no está dictaminada
por la secuencia diana. Las secuencias cebadores pueden, por lo
tanto, diseñarse convenientemente ensamblando la secuencia de
tetrámeros de nucleótidos donde cada tetrámero contiene una A, T, C
y G o de otros modos que aseguren que el contenido de G/C y la
temperatura de fusión de los cebadores son idénticos o muy
similares. La longitud de los cebadores (y los sitios de unión de
cebador correspondientes en las marcas de las sondas) es
preferiblemente de al menos 12, 15 ó 17 nucleótidos y
preferiblemente de no más de 25, 30, 40 nucleótidos.
En una realización preferida, al menos dos de
las sondas oligonucleotídicas que son complementarias a al menos
dos secuencias diana diferentes en una muestra comprenden un sitio
de unión de cebador que es complementario a una única secuencia
cebadora. Por tanto, preferiblemente se usa al menos uno del primer
y del segundo cebador en un par cebador para la amplificación de
sondas conectadas correspondientes a al menos dos secuencias diana
diferentes en una muestra, más preferiblemente para la amplificación
de sondas conectadas correspondientes a todas las secuencias diana
en una muestra. Preferiblemente, solamente se usa un único primer
cebador y en algunas realizaciones se usa solamente un único primer
y un único segundo cebador para la amplificación de todas las
sondas conectadas. El uso cebadores universales para la
amplificación de múltiples fragmentos diferentes habitualmente es
ventajoso para la eficacia de la etapa de amplificación.
Las sondas conectadas obtenidas del ligamiento
de las secciones de las sondas hibridadas de forma adyacente se
amplifican en la etapa (d), usando un par cebador, preferiblemente
que consta de un par de cebadores para cada una de las sondas
conectadas en la muestra. El par cebador comprende cebadores que son
complementarios a secuencias de unión de cebador que están
presentes en las sondas conectadas. Un par cebador habitualmente
comprende un primer y al menos un segundo cebador, pero puede
constar de solamente un único cebador que ceba en ambas
direcciones. Se han obtenido excelentes resultados usando cebadores
que son en la técnica como cebadores AFLP tales como los descritos
inter alia en el documento EP 0 534 858 y en Vos et
al., Nucleic Acid Research, 1995, vol. 23:
4407-44014.
4407-44014.
En una realización preferida, al menos uno de
los cebadores complementario a los sitios de unión de cebador de la
primera y la segunda sondas oligonucleotídicas en la muestra
comprende un marcador, preferiblemente el segundo cebador comprende
un marcador. El marcador puede seleccionarse entre un gran grupo,
que comprende entre otros, restos fluorescentes y/o fosforescentes
tales como colorantes, cromóforos, o enzimas, antígenos, metales
pesados, sondas magnéticas, restos fosforescentes, marcadores
radiactivos, restos quimioluminiscentes o restos de detección
electroquímica. Preferiblemente, el marcador es un colorante
fluorescente o fosforescente, más preferiblemente seleccionado
entre el grupo de FAM, HEX, TET, JOE, NED, y (ET-)ROX. Colorantes
tales como FITC, Cy2, Rojo Texas, TAMRA, Alexafluor 488^{TM},
Bodipy^{TM} FL, Rodamina 123, R6G, Bodipy 530, Alexafluor
532^{TM} e IRDyes^{TM} de Licor que se usan en la plataforma NEN
Glober IR^{2} también son adecuados para su uso en la presente
invención. Preferiblemente el marcador puede elegirse entre los
colorantes fluorescentes o fosforescentes del grupo compuesto por
FAM, TET, JOE, NED, HEX, (ET-)ROX, FITC, Cy2, Rojo Texas, TAMRA,
Alexafluor 488^{TM}, Bodipy^{TM} FL, Rodamina 123, R6G, Bodipy
530, Alexafluor 532^{TM} e IRDyes^{TM}.
Usando un par cebador que comprende cebadores
marcados de forma diferente, puede duplicarse la cantidad de sondas
conectadas que pueden discriminarse en una muestra y por tanto la
cantidad de secuencias diana en una muestra para cada marcador
adicional. Por tanto, para cada marcador adicional que se usa en una
muestra, se duplica la cantidad de secuencias diana que puede
analizarse en una muestra. La cantidad máxima de marcadores que
puede usarse en una muestra en un método de elevada productividad
está gobernada principalmente por las limitaciones en las
capacidades de detección de las plataformas de detección
disponibles. Actualmente, una de las plataformas más frecuentemente
usadas (MegaBACE, de Molecular
Dynamics-Amersham-Biosciences Ltd.)
permite la detección simultánea de hasta cuatro colorantes
fluorescentes, que son FAM, JOE o HEX, NED y (ET-)ROX. Sin embargo,
también son adecuados instrumentos de electroforesis capilar
alternativos, que incluyen ABI310, ABI3100, ABI3700
(Perkin-Elmer Corp.), CEQ2000 XL (Beckman Coulter) y
otros. Los ejemplos no limitantes de dispositivos de electroforesis
basados en geles de bloque incluyen ABI377 (Perkin Elmer Corp.) y el
sistema de secuenciación de ADN IR^{2} global, disponible en
LI-COR, Lincoln, Nebraska, USA.
Cualquier amplificación de las sondas conectadas
puede conseguirse satisfactoriamente con una pinza bloqueada, o
preferiblemente, con una pinza abierta, es decir, la sonda conectada
está en forma de una molécula lineal, en oposición a la forma
circular de la sonda conectada con la pinza bloqueada. Cualquier
amplificación posterior de las sondas conectadas de la invención
puede conseguirse usando tecnologías de amplificación simples y bien
conocidas tales como PCR. Una de las ventajas de usar técnicas
convencionales tales como PCR es que el producto de amplificación
resultante no consta de un ordenamiento lineal de múltiples unidades
(concatémeros) en oposición a las representaciones lineales
concatenadas amplificadas, que típicamente se producen por la
amplificación de sondas tipo
candado.
candado.
En la etapa de amplificación del método de la
invención, las sondas conectadas se amplifican para producir un
amplicón (detectable) por cualquier método de amplificación de
ácidos nucleicos adecuado conocido en la técnica. Los métodos de
amplificación de ácidos nucleicos habitualmente emplean uno o dos
cebadores, dNTP, y una (ADN) polimerasa. Un método preferido para
la amplificación es la PCR. La "PCR" o "Reacción en Cadena
de la Polimerasa" es un procedimiento rápido para la
amplificación enzimática in vitro de un segmento de ADN
específico. El ADN a amplificar se desnaturaliza calentando la
muestra. En la presente invención, esta etapa de desnaturalización
es preferiblemente de tal modo que la sección de pinza de las sondas
conectadas también se desnaturaliza. En presencia de la ADN
polimerasa y un exceso de desoxinucleótidos trifosfato,
oligonucleótidos que hibridan específicamente con la secuencia
diana, se ceba la síntesis de ADN nuevo. Una ronda de síntesis
produce nuevas cadenas de longitud determinada que, como las cadenas
parentales, pueden hibridar con los cebadores después de la
desnaturalización e hibridación. El segundo ciclo de
desnaturalización, hibridación y síntesis produce dos productos
monocatenarios que juntos componen un producto bicatenario
diferenciado, exactamente la longitud entre los extremos del
cebador y preferiblemente desprovisto de la sección de pinza. Este
producto diferenciado se acumula exponencialmente con cada ronda
sucesiva de amplificación. En el transcurso de aproximadamente 20 a
30 ciclos, puede conseguirse una amplificación de un millón de veces
del fragmento diferenciado. Los productos de PCR son bien conocidos
en la técnica, y se describen en libros de texto de laboratorio
convencionales, por ejemplo Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1995).
Las condiciones adecuadas para la aplicación de PCR en el método de
la invención se describen en el documento EP-A 0 534
858 y en Vos et al. (1995; Nucleic Acids Res.
23:4407-4414), donde se amplifican múltiples
fragmentos de ADN entre 70 y 700 nucleótidos y que contienen
secuencias de unión de cebador idénticas con casi la misma eficacia
usando un par cebador. Otros métodos de amplificación combinados
y/o isotérmicos que pueden aplicarse incluyen, por ejemplo, LCR,
replicación de secuencia auto-sostenida (3SR),
amplificación de ARN medicada por
Q-\beta-replicasa, amplificación
por círculo rodante (RCA) o amplificación por desplazamiento de
hebra (SDA). En algunos casos, esto puede requerir el reemplazo de
los sitios de unión de cebador en las secciones complementarias no
diana de las sondas por un sitio de unión a (ARN) polimerasa
adecuado.
adecuado.
El término "amplicón" como se usa en este
documento se refiere al producto de la etapa de amplificación de
las sondas conectadas o ligadas. El término amplicón como se usa en
este documento por tanto se refiere a una sonda conectada
amplificada. Después de la etapa de ligamiento donde se conectan las
dos secciones específicas de diana mediante una ligasa, la sonda
conectada o ligada puede combinarse con uno o más cebadores y una
polimerasa y amplificarse. La sonda ligada, los cebadores, la
polimerasa y/u otros parámetros y variables son tales que la
amplificación produce representaciones lineales amplificadas de la
sonda conectada, en oposición a las representaciones lineales
concatenadas amplificadas, que se producen típicamente por la
amplificación de sondas tipo candado. En la presente invención el
amplicón es un oligonucleótido lineal que tiene una longitud que
preferiblemente no excede sustancialmente la longitud de la sonda
conectada. La longitud mínima del amplicón es al menos la suma de
la longitud de las dos secciones complementarias diana. Se prefiere
que la longitud del amplicón corresponda a la longitud de la sonda
conectada, preferiblemente menos la longitud proporcionada por las
dos secciones de pinza de la primera y la segunda sonda. Es más
preferido que la longitud del amplicón sea indicativa del
ligamiento de la primera y la segunda sondas correspondientes.
Preferiblemente, un amplicón es una representación monomérica de la
sonda conectada
amplificada.
amplificada.
Las diversas realizaciones de la presente
invención proporcionarán detalles adicionales a este respecto.
En una realización preferida particular, uno o
más de los cebadores usados en la etapa de amplificación de la
presente invención es un cebador selectivo. Un cebador selectivo se
define en este documento como un cebador que, además de su
secuencia universal que es complementaria a un sitio de unión de
cebador que está presente en todos o la mayoría de las primeras o
las segundas sondas, contiene una región que comprende los llamados
"nucleótidos selectivos" y que están preferiblemente presentes
solamente en un subconjunto de los pares de sondas. La región que
contiene los nucleótidos selectivos está localizada en el extremo 3'
del cebador universal.
El principio de los nucleótidos selectivos se
describe inter alia en el documento EP-A 534
858 y en Vos et al., Nucleic Acid Research, 1995, vol. 23,
4407-4414. Los nucleótidos selectivos son
complementarios a los nucleótidos de las sondas (ligadas) que están
localizadas adyacentes a la secuencia cebadora. Los nucleótidos
selectivos generalmente no forman parte de la región en las sondas
(ligadas) que está descrita como la secuencia cebadora universal.
Los cebadores que contienen nucleótidos selectivos se indican como
cebadores +N, en que N indica la cantidad de nucleótidos selectivos
presentes en el extremo 3' del cebador. N se selecciona
preferiblemente entre A, C,
T o G.
T o G.
N también puede seleccionarse entre diversos
nucleótidos alternativos, es decir, compuestos que son capaces de
imitar el comportamiento de nucleótidos ACTG pero que además de ello
tienen otras características tales como la capacidad de hibridación
mejorada en comparación con los nucleótidos ACTG o la capacidad de
modificar la estabilidad del dúplex producido por la hibridación.
Ejemplos de los mismos son PNA, LNA, inosina etc. Cuando la
amplificación se realiza con más de un cebador, tal como con PCR
usando dos cebadores, uno o los dos cebadores pueden estar
equipados con nucleótidos selectivos. La cantidad de nucleótidos
selectivos puede variar, dependiendo de la especie o de otros
detalles que los puede determinar un especialista en la técnica. En
general, la cantidad de nucleótidos selectivos es de no más de 10,
pero al menos 5, preferiblemente 4, más preferiblemente 3, más
preferiblemente 2 y de forma especialmente preferida es 1 nucleótido
selectivo.
Un cebador +1 por tanto contiene un nucleótido
selectivo, un cebador +2 contiene 2 nucleótidos selectivos etc. Un
cebador sin nucleótidos selectivos (es decir un cebador
convencional) puede describirse con un cebador +0 (sin nucleótidos
selectivos añadidos). Cuando se añade un nucleótido selectivo
específico, éste se describe por la anotación +A o +C etc.
Amplificando un par de sondas (ligadas) con un
cebador selectivo, se obtiene un subconjunto de sondas (ligadas),
con la condición de que se incorpore la base complementaria en la
posición apropiada en el subconjunto deseado de las sondas que se
supone que se amplificarán selectivamente conjuntamente usando el
cebador selectivo de este modo, opcionalmente pueden amplificarse
selectivamente otros subconjuntos usando otras combinaciones de
cebadores selectivos. Usando un cebador +1, por ejemplo, el factor
de combinación de la mezcla amplificada se reduce en un factor 4 en
comparación con la mezcla de sondas ligadas antes de la
amplificación. Pueden conseguirse mayores reducciones usando
cebadores con múltiples nucleótidos selectivos, es decir, se obtiene
una reducción de factor 16 de la proporción de combinación original
con 2 nucleótidos selectivos etc. y también pueden conseguirse
diferentes subconjuntos por diferentes combinaciones de bases
selectivas en una de las sondas (por ejemplo, +2/+0 y +0/+2).
Cuando se desarrolla un ensayo que, después del
ligamiento, tiene que amplificarse selectivamente, se prefiere que
la sonda contenga el nucleótido complementario adyacente a la
secuencia de unión de cebador. Esto permite la
pre-selección de la sonda ligada a amplificar
selectivamente.
El uso de cebadores selectivos en la presente
invención ha demostrado ser ventajoso cuando se desarrollan ensayos
basados en ligamiento con elevadas proporciones de combinación de
las que posteriormente solamente tiene que analizarse un
subconjunto específico lo que provoca una reducción adicional de los
costes de la reacción de ligamiento por dato puntual. Diseñando
cebadores junto con nucleótidos selectivos adyacentes, pueden
seleccionarse de antemano las partes específicas de la muestra que
tienen que amplificarse por separado.
Uno de los ejemplos en que esto es útil y
ventajoso es en el caso de muestras que contienen solamente
cantidades mínimas de ADN y/o para la identificación de diferentes
(cepas de) patógenos. Por ejemplo, en un ensayo dirigido a la
detección de diversas cepas de ántrax (Bacillus antracis),
para cada una de las cepas se diseña un par de sondas
representativas. La detección de la presencia o ausencia de este par
de sondas ligadas (o una parte característica de las mismas)
después de la etapa de hibridación y ligamiento del método de la
invención puede servir como identificación de la cepa de interés.
La amplificación selectiva con cebadores diseñados específicamente
(cada cebador selectivo está unido a una cepa específica) puede
amplificar selectivamente secuencias diana derivadas de/de diversas
cepas, que permite su identificación detectando los amplicones
resultantes. Por ejemplo, la amplificación con un cebador +A
amplifica selectivamente las sondas ligadas dirigidas a la cepa X
donde un cebador +G amplifica selectivamente las sondas ligadas
dirigidas a la cepa Y. Si se desea, por ejemplo, en el caso de
pequeñas cantidades de ADN de muestra, una primera amplificación
opcional con un cebador +0 aumentará la cantidad de sondas ligadas,
facilitando de este modo la amplificación selectiva.
Por ejemplo, un cebador universal de 20
nucleótidos llega a ser un cebador selectivo por la adición de un
nucleótido selectivo en su extremo 3', siendo ahora la longitud
total del cebador de 21 nucleótidos. Véase a este respecto también
la Figura 15. Si, sin embargo, se desea mantener la longitud total
de los cebadores constante, el cebador universal puede acortarse en
su extremo 5' en la cantidad de nucleótidos selectivos añadida al
extremo 3'. Por ejemplo, la adición de dos nucleótidos selectivos en
el extremo 3' de la secuencia cebadora puede combinarse con la
ausencia (o eliminación) de dos nucleótidos del extremo 5' del
cebador universal, en comparación con el cebador universal
original. Por tanto, se remplaza un cebador universal de 20
nucleótidos por un cebador selectivo de 20 nucleótidos. El uso de
cebadores selectivos basados en cebadores universales tiene la
ventaja de que los parámetros de amplificación tales como
rigurosidad y temperaturas pueden permanecer esencialmente iguales
para la amplificación con diferentes cebadores selectivos o variarse
solamente a un grado minoritario. Preferiblemente, la amplificación
selectiva se realiza en condiciones de rigurosidad aumentada en
comparación la amplificación no selectiva. Con rigurosidad aumentada
se entiende que las condiciones para la hibridación del cebador con
la sonda ligada son tales que la polimerasa usada en la etapa de
amplificación solamente extenderá los cebadores selectivos
perfectamente apareados. La amplificación específica de solamente
los cebadores perfectamente apareados puede conseguirse en la
práctica por el uso de un llamado perfil de PCR touchdown (con
rampa decreciente de temperaturas) donde la temperatura durante la
etapa de hibridación de cebadores se disminuye progresivamente en,
por ejemplo, 0,5ºC para permitir cebadores perfectamente hibridados.
Las condiciones de rigurosidad adecuadas son, por ejemplo, como se
describe para la amplificación AFLP en el documento EP 0 534 858 y
en Vos et al., Nucleic Acid Research, 1995, vol.
23,4407-4414. Los especialistas en la técnica,
basados en las directrices, encuentran modos de adaptar las
condiciones de rigurosidad para adecuar sus necesidades específicas
sin alejarse de la esencia de la invención.
Una de las ventajas adicionales de la
amplificación selectiva de sondas ligadas es que puede adaptarse
fácilmente un ensayo con una elevada proporción de combinación para
la detección con métodos o en plataformas que prefieren o requieren
una proporción de combinación inferior.
Los amplicones o sondas conectadas de la
presente invención pueden detectarse en una plataforma de detección
adecuada. La discriminación entre amplicones o sondas conectadas
derivadas de diferentes secuencias diana puede basarse en la
longitud, secuencia o masa como parámetro principal. La detección de
las muestras (marcadas) se realiza por un detector para producir
datos de detección. El detector depende, por supuesto, del sistema
general en que se realiza la separación (longitud, masa o secuencia
o una combinación de los mismos) pero también, si es aplicable,
depende del marcador que está presente en el cebador, tal como un
marcador fluorescente o radiactivo.
Son ejemplos de plataformas de detección
adecuadas las plataformas de detección basadas en la longitud, las
plataformas de detección basadas en la secuencia y las plataformas
de detección basadas en la masa.
Uno de muchos ejemplos de detección basada en la
longitud es la detección basada en electroforesis (electroforesis
capilar, electroforesis en gel de bloques, electroforesis en gel
continuo de detector fijo) y preferiblemente la electroforesis
capilar tal como se realiza en el equipo MegaBACE disponible en
Molecular Dynamics Amersham-Biosciences o usando
nano-tecnología tal como
Lab-on-a-Chip u
otros dispositivos micro-fluidic. La diferencia en
la longitud del amplicón que se está detectando puede
proporcionarse por el uso de a rellenador.
Los amplicones en una muestra se analizan
preferiblemente en un dispositivo electroforético. El dispositivo
electroforético preferiblemente separa los diferentes amplicones en
una muestra amplificada en base a la longitud, después de lo cual
los amplicones separados pueden detectarse como se describe en este
documento. El dispositivo electroforético preferiblemente es un
dispositivo de múltiples canales en que las múltiples muestras se
procesan electroforéticamente en múltiples canales, preferiblemente
en paralelo. El dispositivo electroforético tiene una localización
de aplicación (por canal) para la aplicación (carga) de la muestra
amplificada a procesar electroforéticamente, un área de separación
sobre la que migran los fragmentos de la muestra por electroforesis,
y preferiblemente también un dispositivo de detección localizado en
una localización de detección distal de la localización de
aplicación. El dispositivo de detección habitualmente comprenderá un
fotomultiplicador para la detección de fluorescencia,
fosforescencia o quimioluminescencia. Como alternativa, en el caso
de electroforesis en gel, los fragmentos separados pueden
detectarse en el gel, por ejemplo, por autorradiografía o
fluorografía.
Para discriminar entre diferentes secuencias
diana en la muestra, se usa preferiblemente una diferencia en la
longitud de los amplicones correspondientes respectivos. Separando
los amplicones en base a la longitud, puede determinarse la
presencia de las secuencias diana correspondientes de la muestra.
Por consiguiente, en una realización preferida de la presente
invención, la discriminación entre los amplicones derivados de
diferentes secuencias diana en una muestra se basa en una diferencia
de longitud entre los amplicones respectivos correspondientes a
diferentes secuencias diana en una muestra o muestra
amplificada.
Preferiblemente, la diferencia de longitud se
proporciona por la longitud de la(s) secuencia(s)
rellenadora(s) en las sondas oligonucleotídicas de la
invención. Incluyendo en al menos una de las sondas
oligonucleotídicas del par de la invención, pero preferiblemente en
ambas sondas del par, un rellenador de una longitud predeterminada,
puede controlarse la longitud de cada sonda conectada amplificada en
una muestra amplificada de modo que se posibilite una
discriminación adecuada basada en diferencias de longitud de los
amplicones obtenidos. En una realización preferida de una sonda del
par de acuerdo con la invención, el rellenador se localiza entre la
sección de la sonda complementaria a la secuencia diana y la
secuencia de unión de cebador. Propiamente dicho, la longitud total
del rellenador se proporciona por la combinación de la longitud del
rellenador en la primera sonda y la longitud del rellenador en la
segunda sonda. Por consiguiente, en una realización preferida, tanto
las primeras sondas oligonucleotídicas como las segundas sondas
oligonucleotídicas comprenden un rellenador. La diferenciación de
longitud entre los amplicones obtenidos de secuencias diana de la
muestra se elige preferiblemente de tal modo que los amplicones
puedan distinguirse en base a su longitud. Esto se consigue usando
secuencias rellenadoras o combinaciones de secuencias rellenadoras
en la primera y/o la segunda sonda del par de sondas, que (juntas)
provocan diferencias de longitud que pueden distinguirse en
dispositivos electroforéticos. Por tanto, desde la perspectiva de
la potencia de resolución, las diferencias de longitud entre las
diferentes sondas conectadas amplificadas, que pueden estar
causadas por sus rellenadores, son lo más grandes posibles. Sin
embargo, por varias consideraciones importantes diferentes, como se
ha indicado anteriormente en este documento, las diferencias de
longitud entre los diferentes amplicones son preferiblemente lo más
pequeñas posible: (1) el límite superior que existe en la práctica
con respecto a la longitud de sondas sintetizadas químicamente de
aproximadamente 100-150 bases como mucho; (2) la
amplificación menos eficaz de fragmentos más grandes; (3) las
posibilidades aumentadas de eficacias de amplificación diferenciales
de fragmentos con un gran variación de longitud; y (4) el uso de
inyecciones múltiples de muestras de detección en el dispositivo de
detección que funciona mejor con fragmentos en un estrecho intervalo
de longitud. Preferiblemente, las diferencias de longitud entre las
secuencias a determinar y proporcionadas por los rellenadores son al
menos suficientes para permitir la discriminación entre
esencialmente todas las sondas conectadas amplificadas. Por
definición, en base a procedimientos de síntesis química, enzimática
y biológica de ácidos nucleicos, la diferencia mínima de tamaño
utilizable entre diferentes amplicones en una muestra amplificada es
una base, y esta diferencia de tamaño se adapta a la potencia de
resolución de la mayoría de los dispositivos de electroforesis,
especialmente en los intervalos de tamaño inferiores. Por tanto, en
base a lo anterior, se prefiere usar ensayos combinados con
productos de amplificación con diferencias de longitud en una única
base (par). En una realización preferida, la diferencia de longitud
entre diferentes amplicones en una muestra amplificada es de al
menos dos nucleótidos. En una rea particularmente preferida de la
invención, los amplicones correspondientes a diferentes secuencias
diana en una muestra tienen una diferencia de longitud de dos
nucleótidos.
nucleótidos.
La productividad puede aumentarse por el uso de
múltiples cebadores marcados. Uno de los problemas asociados con el
uso de diferentes marcadores en una muestra es la interferencia
cruzada o interferencia cruzada residual. La interferencia cruzada
o interferencia cruzada residual, como se usa en este documento, se
refiere al solapamiento entre los espectros de emisión de
diferentes marcadores (fluorescentes). Por ejemplo, cuando se usan
colorantes fluorescentes, cada colorante tiene un espectro de
emisión (y absorción) diferente. En el caso de dos colorantes en
una muestra, estos espectros pueden solapar y pueden causar una
alteración de la señal, que contraviene la calidad de los datos
obtenidos. Particularmente, cuando dos fragmentos nucleotídicos a
detectar en una muestra están marcados con un marcador diferente y
uno de los fragmentos está presente en una cantidad abundante
mientras que el otro está presente solamente en cantidades mínimas,
la interferencia cruzada residual puede causar que la señal medida
del fragmento que está presente en solamente cantidades mínimas
derive principalmente de la emisión de otro marcador con un
espectro de emisión solapante que está contenido abundantemente en
un fragmento con tamaño idéntico de otro muestra. También puede
suceder el efecto recíproco del otro colorante, pero en este
ejemplo su efecto es probablemente menor a causa de las diferencias
de abundancia entre los amplicones marcados con los
colorantes
respectivos.
respectivos.
Chehab et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 86:9178-9182 (1989) han intentado discriminar
entre alelos uniendo diferentes colorantes fluorescentes a alelos
competidores en un único tubo de reacción seleccionando
combinaciones de marcadores de modo que el máximo de emisión de un
colorante coincida esencialmente con el mínimo de emisión del otro
colorante. Sin embargo, a una cierta longitud de onda a la que un
colorante expresa un máximo de absorción, siempre hay algo de
absorción restante de otro colorante presente en la muestra,
especialmente cuando la muestra contiene múltiples colorantes.
Se descubrió que esta ruta para el análisis
combinado estaba limitada en escala por los relativamente pocos
colorantes que pueden resolverse en el espectro. Uno de los
problemas principales con el uso de múltiples colorantes es que los
espectros de emisión de diferentes marcadores fluorescentes a menudo
solapan. Las señales de los datos sin procesar resultantes tienen
que corregirse para la contribución de fragmentos de tamaño similar
que se detectan simultáneamente y están marcados con otro colorante
fluorescente por un proceso llamado corrección de interferencia
cruzada. La corrección de la interferencia cruzada se realiza
habitualmente por medios matemáticos, en base a los espectros de
absorción teóricos conocidos para ambos colorantes, después de la
recogida de los datos "sin procesar" desde el dispositivo de
detección. La corrección matemática se basa en los espectros
teóricos e ignora que los espectros de emisión de los marcados son
sensibles y a menudo están afectados por la composición de la
muestra de detección. Esta sensibilidad puede afectar al brillo y/o
la longitud de onda de la emisión. Esto significa que parámetros
tales como el pH, la temperatura, la intensidad de la luz de
excitación, las interacciones no covalentes, la concentración salina
y la fuerza iónica influyen mucho en el espectro de emisión
resultante. En particular, se sabe que la presencia de sales
residuales en una muestra afecta a la señal de fluorescencia
emitida por el colorante y es un factor crítico en el caso de
detección por electroforesis capilar usando inyección
electrocinética porque esto entonces también afecta a la eficacia
de inyección. Por tanto, el solapamiento espectral es una fuente
potencial de error que impacta negativamente en la calidad de los
datos en el caso de detección combinada usando diferentes
colorantes
fluorescentes.
fluorescentes.
La presente invención proporciona una solución a
este problema de modo que pueden usarse dos (o más) marcadores con
espectros solapantes en la misma muestra sin afectar
significativamente a la calidad de los datos. Mediante una
combinación predeterminada de diferencias de longitud y marcadores,
se obtiene un aumento en la cantidad de secuencias nucleotídicas
diana que puede detectarse en una muestra mientras que la calidad de
los datos permanece al menos constante. En una realización
preferida de la invención, el solapamiento espectral entre dos
secuencias marcadas de forma diferente se reduce por la introducción
de una diferencia de longitud entre las dos secuencias. Esta
diferencia de longitud relacionada con el marcador puede
proporcionarse mediante la longitud de la secuencia rellenadora
como se describe en este documento. La cantidad de diferentes
marcadores que puede usarse en la misma muestra en el presente
método es al menos dos, preferiblemente al menos tres, más
preferiblemente al menos cuatro. La cantidad máxima de marcadores
está funcionalmente limitada por el mínimo de solapamiento
espectral que permanece aceptable, que para la mayoría de las
aplicaciones típicamente representa una cantidad de menos del 15
por ciento de la señal verdadera, preferiblemente menos del 10 por
ciento, más preferiblemente menos del 5 por ciento y mucho más
preferiblemente menos del 1 por ciento de la señal verdadera.
Para evitar la influencia potencial de la
interferencia cruzada residual sobre la calidad de los datos en el
caso de que diferentes muestras estén marcadas con múltiples
colorantes fluorescentes con espectros de emisión solapantes y se
detecten simultáneamente fragmentos con longitud idéntica en el
mismo proceso, en una realización preferida particular se prefiere
elegir secuencias rellenadoras de modo que los amplicones difieran
en al menos dos pares de bases dentro de una serie combinada y
difieran en un único par de bases entre series combinadas marcadas
con los diferentes colorantes que tienen espectros solapantes.
Haciendo esto, puede elegirse la longitud de los fragmentos
marcados con los colorantes respectivos de modo que se evite la
influencia potencial de la interferencia cruzada residual sobre la
calidad de los datos porque se definen combinaciones únicas de
tamaños de fragmento y colorante de marcaje.
Una realización preferida particular de la
invención se refiere a un método en que se obtiene una muestra que
comprende amplicones a partir de una multiplicidad de secuencias
diana. Estos amplicones están marcados de forma diferente,
definiendo de este modo grupos de amplicones que llevan el mismo
marcador. Dentro de cada grupo, el rellenador proporciona una
diferencia de longitud de al menos dos, preferiblemente dos
nucleótidos. Entre dos grupos con marcadores que tienen
solapamiento espectral, el rellenador proporciona una diferencia de
longitud de un nucleótido, produciendo de forma eficaz un grupo que
tiene un número par de nucleótidos y un grupo que tiene un número
impar de nucleótidos como se ha descrito anteriormente.
En un aspecto, la presente invención se refiere
a un método para la discriminación y detección mejoradas de
secuencias diana en una muestra, que comprende proporcionar al menos
dos o más grupos de sondas oligonucleotídicas, donde los amplicones
obtenidos con diferentes grupos de sondas oligonucleotídicas tienen
diferentes marcadores, donde sustancialmente cada sonda conectada
amplificada dentro de un grupo tiene el mismo marcador, donde dentro
de un grupo de amplicones marcados de forma idéntica se proporciona
una diferencia de longitud entre cada sonda marcada de forma
idéntica dentro de ese grupo, donde entre el primer y el segundo
grupo se proporciona una diferencia de longitud adicional de modo
que cada sonda conectada amplificada en la muestra amplificada esté
caracterizada por una combinación de longitud de la secuencia y el
marcador.
En una realización preferida del método de la
invención, se proporcionan al menos dos grupos de pares de una
primera y una segunda sondas oligonucleotídicas en una muestra, por
lo cual cada grupo de sondas oligonucleotídicas tiene secuencias de
marca con al menos un sitio de unión de cebador específico de grupo.
Las sondas conectadas de cada grupo se amplifican a partir de un
par cebador donde al menos uno del primer y el segundo cebadores es
complementario al sitio de unión de cebador específico de grupo, y
por lo cual al menos uno del primer y el segundo cebadores de un
grupo comprende un marcador específico de grupo. En cada grupo, un
amplicón correspondiente a una secuencia diana en la muestra,
difiere en longitud de un amplicón correspondiente a una secuencia
diana diferente en la muestra. Los marcadores específicos de grupo
son preferiblemente de tal modo que el dispositivo de detección
puede distinguir entre los diferentes marcadores específicos de
grupo. La diferencia de longitud se proporciona preferiblemente por
la longitud de la secuencia rellenadora. Preferiblemente en esta
realización del método de la invención, una primera parte de los
grupos tiene amplicones que tienen un número par de nucleótidos y
una segunda parte de los grupos tiene amplicones que tienen un
número impar de nucleótidos. Preferiblemente, los grupos de
amplicones que tienen un número par de nucleótidos y los grupos de
amplicones que tienen un número impar de nucleótidos están marcados
con marcadores (fluorescentes), que tiene el mínimo solapamiento en
sus espectros de emisión. Por tanto, se marcan dos grupos de sondas
conectadas amplificadas, teniendo cada grupo un número impar de
nucleótidos, con marcadores que tienen el mínimo solapamiento en sus
espectros de emisión. Se sostiene lo mismo para los dos grupos de
sondas conectadas amplificadas, teniendo cada grupo un número par
de nucleótidos. Se marcan dos grupos de sondas conectadas
amplificadas, teniendo un grupo un número impar de nucleótidos y
teniendo el otro grupo un número par de nucleótidos, con marcadores
que tienen un solapamiento mayor en sus espectros de emisión. Las
nociones relativas que se usan en este documento de "el mínimo
solapamiento en sus espectros de emisión" y "tienen un
solapamiento mayor en sus espectros de emisión" se refieren a un
grupo de marcadores del que puede hacerse una selección de los
marcadores para su uso en la presente invención. Este grupo de
marcadores puede depender de la plataforma de detección usada hasta
otros factores tales como los descritos en este documento
anteriormente. En una realización particularmente preferida de este
método, se producen un primer y un segundo grupos de amplicones que
tienen un número par de nucleótidos y se producen un tercer y
cuarto grupos de sondas amplificadas conectadas que tienen un número
impar de nucleótidos y por lo cual el primer y el segundo grupo
están marcados con FAM y NED, respectivamente, y el tercer y el
cuarto grupo están marcados con (ET-)ROX y JOE o HEX,
respectivamente; o viceversa, por lo cual el primer y el
segundo grupo están marcados con (ET-)ROX y JOE o HEX,
respectivamente, y el tercer y el cuarto grupo están marcados con
FAM y NED, respectivamente. Por tanto, en estas realizaciones, los
marcadores fluorescentes se eligen de tal modo que los grupos de
amplicones que co-migran, porque ambos contienen
fragmentos con números pares o impares de nucleótidos, tienen
marcadores que tienen el mínimo solapamiento en sus espectros de
emisión, evitando de este modo lo más posible la interferencia
cruzada en la detección de amplicones en diferentes grupos (véase
también a continuación).
En una realización preferida para evitar la
interferencia cruzada es, por lo tanto, deseable combinar una
diferencia en la longitud con un diferente marcador cuando se
analiza una serie de amplicones de tal modo que se evita la
influencia del solapamiento espectral sobre la calidad de los datos
por diferencias de longitud entre los amplicones marcados con los
colorantes que tienen espectros de emisión solapantes.
Se prefiere que, en cada muestra, las sondas
conectadas derivadas de cada secuencia diana difieran de cualquier
otra sonda conectada en la muestra en la longitud, y/o en el
marcador o, preferiblemente en la combinación de la longitud y el
marcador. Para proporcionar una separación adecuada de los
amplicones de diferente longitud se prefiere que la diferencia de
longitud entre dos sondas conectadas diferentes sea de al menos dos
nucleótidos, preferiblemente dos. Cuando se detectan polimorfismos,
se prefiere que la diferencia en la longitud entre dos o más alelos
(SNP) del polimorfismo no sea de más de dos, asegurando de este modo
que la eficacia de la amplificación es similar entre diferentes
alelos o formas del mismo polimorfismo. Esto implica que
preferiblemente ambos alelos se amplifican con el mismo par de
cebadores y por tanto se marcarán con el mismo colorante.
En una realización preferida, por ejemplo
dirigida a la detección de diferentes alelos de una multiplicidad
de loci, la distribución entre longitudes impares/pares dentro de un
grupo puede diseñarse del siguiente modo. Dos loci L1, L2 están
cada uno representado por dos alelos A11, A12 para L1 y A21, A22
para L2. Las longitudes de los diversos alelos (o sondas ligadas y
amplificadas que representan esos alelos) son tales que
A11>A12>A21>A22; A12-A11=2;
A22-A21=2; A12-A21=3. Entre los
grupos G1 y G2 que llevan marcadores que pueden tener un
solapamiento en sus espectros, puede haber una diferencia de
longitud de 1 nucleótido. Por tanto,
G1(A11)-G2(A11)=1, por tanto el grupo
comienza con una longitud par o impar.
Esta distribución tiene algunas ventajas
significativas en comparación la distribución más densamente
compactada descrita en este documento. Se sabe que debido a las
diferencias conformacionales esas diferentes secuencias de longitud
idéntica generalmente difieren en su movilidad electroforética.
Cuando hay solamente una diferencia de longitud de un nucleótido,
esto puede causar solapamiento entre los picos si las secuencias son
de una movilidad muy diferente. Por ejemplo la diferencia en la
movilidad entre dos alelos de un locus (A11, A12), será menor que
la diferencia en la movilidad entre dos alelos de diferentes loci
(A12, A21). Cuando hay una diferencia significativa en la movilidad
entre A12 y A21, eso puede conducir a una detección poco fiable.
Creando distribuciones de longitud como las descritas en este
documento puede evitarse esto. La productividad inferior entonces
se pondera frente a la fiabilidad de la detección.
El problema del solapamiento entre los espectros
de los diferentes marcadores entonces se evita adecuadamente. Esto
se representa esquemáticamente en la Tabla A.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
En una realización de la presente invención, se
proporciona entre los amplicones dentro de un grupo, una diferencia
de longitud de dos y tres nucleótidos alternante, es decir 0, 2, 5,
7, 10, 12 etc. El otro grupo entonces tiene una diferencia de
longitud de 1, 3, 6, 8, 11, 13 etc. En base a la información
descrita en este documento, los especialistas en la técnica pueden
determinar otros modos para variar las diferencias de longitud
dentro de un intervalo.
Para llegar a un método de elevada productividad
de una combinación de muestras, se tratan varias muestras de forma
similar para generar de este modo una multiplicidad de muestras de
detección amplificadas que después pueden analizarse en un
dispositivo de múltiples canales que es al menos capaz de detectar
los marcadores y/o diferencias de longitud. Los dispositivos
adecuados se han descrito anteriormente en este documento.
Para aumentar la productividad en plataformas
electroforéticas se han desarrollado métodos que se describen en
esta solicitud y se describen habitualmente como inyección múltiple.
Inyectando múltiples muestras que contienen fragmentos de
longitudes predeterminadas diferenciadas en la misma matriz
electroforética y/o en cortos procesos consecutivos, puede
aumentarse la productividad. Todos los fragmentos detectables tienen
preferiblemente una longitud dentro de un margen específico y puede
detectarse solamente una cantidad limitada de fragmentos en una
muestra, provocando, por tanto, la ventaja de la amplificación
selectiva para la reducción de la proporción de combinación por la
selección de un subconjunto de las sondas conectadas en la etapa de
amplificación, un subconjunto de amplicones.
Los métodos de la presente invención pueden
realizarse sobre dos o más muestras de ácido nucleico, conteniendo
cada una dos o más ácidos nucleicos diana diferentes, para producir
dos o más muestras amplificadas en las que se analiza la presencia
o ausencia de sondas conectadas y amplificadas.
El análisis combinado de las muestras
amplificadas siguiendo el método de la invención comprende aplicar
al menos parte de una muestra amplificada a un dispositivo
electroforético para la posterior separación y detección.
Preferiblemente dicha muestra amplificada contiene, o al menos se
sospecha que contiene, sondas conectadas amplificadas, lo que es
una indicación de que una secuencia diana ha hibridado con las
sondas oligonucleotídicas proporcionadas y que esas sondas han
hibridado de forma adyacente en la secuencia diana complementaria de
modo que cuando se han conectado, es decir, se han ligado.
Posteriormente, una muestra amplificada se somete a una etapa de
separación durante un periodo de tiempo seleccionado antes de que se
presente una siguiente muestra amplificada.
En el método de la invención, se aplican
consecutivamente (partes de) dos o más muestras amplificadas
diferentes al mismo canal del dispositivo electroforético.
Dependiendo de las condiciones de electroforesis, el periodo de
tiempo entre dos (o más) muestras amplificadas aplicadas
consecutivamente es tal que la sonda conectada amplificada de
migración más lenta en una muestra amplificada se detecta en la
localización de detección, antes de que se detecte la sonda
conectada amplificada de migración más rápida de una muestra
amplificada aplicada posteriormente en la localización de
detección. Por tanto, los intervalos de tiempo entre inyecciones
múltiples posteriores en un canal del dispositivo se eligen de tal
modo que las muestras aplicadas consecutivamente después de la
separación no solapen en un punto de detección.
El método de acuerdo con la invención permite el
análisis de elevada productividad de una multiplicidad de muestras
que comprenden, cada una, una multiplicidad de secuencias diana
diferentes por la inyección consecutiva de muestras amplificadas,
que comprenden sondas conectadas amplificadas correspondientes a las
secuencias diana en las muestras, en un canal de un dispositivo
electroforético de múltiples canales tal como un dispositivo de
electroforesis capilar. El método de acuerdo con la invención
permite el análisis de una multiplicidad de secuencias diana en una
multiplicidad de muestra en una multiplicidad de canales, aumentando
significativamente de este modo la productividad de las varias
muestras que pueden analizarse en un tramo de tiempo dado en
comparación con métodos convencionales para el análisis de
secuencias nucleotídicas. Este método saca provecho de muestras que
contienen amplicones a detectar que son de un intervalo de tamaño
diferenciado ya que de este modo el periodo de tiempo entre las
sucesivas inyecciones puede reducirse significativamente en
comparación con métodos en que no se hace uso de muestras que
contienen secuencias a detectar que no están dentro de un intervalo
de tamaño diferenciado.
El periodo de tiempo seleccionado evita que
muestras aplicadas consecutivamente después de la separación tengan
un solapamiento de sondas conectadas en el punto de detección. El
periodo de tiempo seleccionado está influenciado por i). la
longitud de las sondas conectadas amplificadas; ii). la variación de
longitud en las sondas conectadas amplificadas; y iii). el
dispositivo de detección y sus condiciones de funcionamiento. La
aplicación de las muestras y la separación de las muestras
aplicadas consecutivamente en el mismo canal puede realizarse
repetidamente en uno o más canales, preferiblemente simultáneamente
para permitir la separación electroforética consecutiva de
múltiples muestras en un canal y/o el análisis simultáneo de
múltiples muestras en múltiples canales y/o el análisis simultáneo
de múltiples muestras en múltiples canales realizado
consecutivamente.
El periodo de tiempo entre dos muestras
amplificadas cargadas consecutivamente puede determinarse
experimentalmente antes de ejecutar el método. Este periodo de
tiempo se selecciona de tal modo que, dadas las características de
una muestra amplificada, especialmente la diferencia en la longitud
entre las sondas conectadas amplificadas más cortas y más largas en
una muestra amplificada, así como otros factores experimentales
tales como las concentraciones de gel (matriz) y/o tampón, la
fuerza iónica, etc., los fragmentos en una muestra amplificada se
separen a un grado tal en la localización de detección que se
localiza en el extremo opuesto (distal) de la localización de
aplicación donde se aplicó la muestra, que las diferentes sondas
conectadas amplificadas en una muestra puedan detectarse
individualmente. Después de aplicar la última muestra amplificada,
puede continuarse la separación durante un periodo de tiempo
adicional para permitir que las sondas conectadas amplificadas de
la última muestra se separen y detecten. La combinación del periodo
de tiempo seleccionado entre la aplicación de dos muestras
consecutivas y el periodo de tiempo adicional opcional se elige de
tal modo que en la localización de detección las diferentes sondas
conectadas amplificadas en muestras aplicadas consecutivamente se
separen de tal modo que puedan detectarse individualmente, a pesar
de la limitada variación de longitud que existe entre las
diferentes sondas conectadas amplificadas dentro una única muestra.
Por tanto se evitan los patrones de migración solapantes cuando se
aplican (inyectan) consecutivamente muestras que contienen
fragmentos de longitud variable en el dispositivo
electroforético.
Usando el método de acuerdo con la invención, en
principio es posible y preferido aplicar, cargar o inyectar de
forma continua las muestras. Preferiblemente, el dispositivo es
capaz de realizar dicha operación automáticamente, por ejemplo,
controlado por un ordenador programable. Preferiblemente, el
dispositivo de múltiples canales es adecuado para dicha operación o
está al menos equipado para una operación prolongada sin manteniendo
tal como reemplazo de tampones, partes etcétera. Sin embargo, en la
práctica, generalmente no es éste el caso. Cuando se presenta una
muestra final generalmente es necesario continuar la separación
durante un periodo de tiempo adicional hasta que se ha detectado el
último fragmento de la muestra final.
En una realización preferida de la invención,
los rellenadores presentes tanto en la primera como en la segunda
sondas oligonucleotídicas del par de la invención se usan para
proporcionar las diferencias de longitud (es decir, de 0 a 500
nucleótidos, bases o pares de bases) entre las sondas conectadas
amplificadas. La longitud total de las sondas conectadas
amplificadas y la variación en la longitud está gobernada
principalmente por las técnicas por las que se analizan estos
fragmentos. En el método de inyección múltiple de elevada
productividad de la presente invención, se prefiere que el
intervalo de longitudes de las sondas conectadas amplificadas en
una muestra amplificada tenga un límite inferior de 40, 60, 80, ó
100 y un límite superior de 120, 140, 160, ó 180 nucleótidos, bases
o pares de bases, para plataformas de electroforesis convencionales
(capilares). Es particularmente preferido que el intervalo de
longitudes de las sondas conectadas amplificadas varíe de 100 a 140
nucleótidos. Sin embargo, estas cantidades están muy relacionadas
con los límites actuales de las técnicas actualmente conocidas. En
base al conocimiento proporcionado por esta invención, los
especialistas en la técnica son capaces de adaptar estos parámetros
cuando se aplican otras circunstancias.
La fiabilidad de la amplificación combinada se
mejora adicionalmente limitando la variación en la longitud de las
sondas conectadas amplificadas. Las limitaciones en la variación de
longitud de las sondas conectadas amplificadas se prefieren para
usar la inyección múltiple de forma más eficaz y adicionalmente
provoca una reducción de la amplificación preferente de sondas
conectadas amplificadas más pequeñas en una reacción de
amplificación competitiva con sondas conectadas más grandes. Esto
mejora la fiabilidad del método de elevada productividad de la
presente invención. Junto con el protocolo de inyección múltiple que
se describe en este documento, estas medidas, solas o en
combinación proporcionan un aumento significativo en la
productividad en comparación con la técnica. Una mejora adicional
de la elevada productividad se obtiene limitando la cantidad de
diferentes sondas conectadas amplificadas en una muestra. Se
considera más eficaz y económico limitar la capacidad de
combinación de la etapa de ligamiento/amplificación en combinación
con la introducción de un protocolo de inyección múltiple. Uno de
los aspectos más ventajosos de la presente invención recae en la
combinación del par de sondas innovador, el ligamiento combinado,
la amplificación combinada, preferiblemente con un único par
cebador o con múltiples pares cebadores que amplifican cada uno
múltiples sondas conectadas, la inyección repetida y la detección
combinada de diferentes marcadores, opcionalmente en combinación con
el cebado selectivo que permite la flexibilidad en la proporción de
combinación entre las etapas de ligamiento y amplificación. Uno de
los aspectos ventajosos adicionales de la presente invención reside
en la aplicación combinada de diferencias de longitud con
diferentes marcadores (solapantes) de tal modo que cada sonda
conectada y por tanto cada secuencia diana dentro de una muestra
pueda caracterizarse por una combinación única de longitud y
marcador. Esto permite una mejora significativa de la eficacia del
análisis de secuencias diana así como una reducción significativa
en los costes para cada diana analizada.
El protocolo de inyección múltiple puede
realizarse en una diversidad de formas. Una de estas formas es la
carga múltiple de dos o más muestras en la misma matriz. Esto se
considera ventajoso ya que la matriz se reutiliza realizando cortos
procesos consecutivos, aumentando de este modo la eficacia y la
productividad. Otra forma es la carga múltiple de dos o más
muestras en la misma matriz en el mismo proceso. Se prefiere
reutilizar la matriz realizando cortos procesos consecutivos. En
esta realización, se inyecta y separa una primera muestra. Tan
pronto como se detecta el último fragmento, se carga la siguiente
muestra. Preferiblemente, entre estos dos cortos procesos
consecutivos no se remplaza la matriz de modo que los procesos se
realizan en la misma matriz. Esto proporciona eficacia adicional y
una economía mejorada ya que tienen que suceder menos cambios en la
matriz, reduciendo la cantidad de artículos consumibles de este tipo
de análisis (es decir, tampones, etc.), reduciendo el coste por
dato puntual. Además, pueden evitarse los reemplazos que consumen
mucho tiempo de la matriz en gran medida, aumentando adicionalmente
la eficacia del método.
En sí mismos, se han descrito ciertos aspectos
de la carga múltiple o inyección múltiples, inter alia, en
los documentos US6156178 y WO 01/04618. La última publicación
describe un aparato y un método para el análisis con productividad
aumentada de pequeños compuestos usando múltiples inyecciones
espaciadas temporalmente. La publicación describe que las muestras
que comprenden cebadores, extendidos en un nucleótido (extensión de
cebador de un único nucleótido o SnuPE, también conocido como
minisecuenciación) podrían detectarse usando múltiples inyecciones
espaciadas temporalmente en un dispositivo de electroforesis
capilar. La minisecuenciación se basa en la hibridación de un
cebador complementario con una secuencia diana previamente
amplificada. La posterior extensión del cebador con un nucleótido
marcado proporcionado por separado proporciona la identificación
del nucleótido adyacente al cebador. Principalmente, el producto de
extensión de cebador es de longitud constante. Para aumentar la
productividad, se sugiere el uso de inyecciones sucesivas de
productos de extensión de la misma longitud por proceso. Para
aumentar adicionalmente la productividad, pueden usarse cebadores de
una longitud diferente, que varían típicamente de 15 a 25
nucleótidos. En contraste, la presente invención contempla analizar
los propios productos de amplificación combinada directamente con
una variación de longitud típicamente entre 50 y 150 nucleótidos.
Esto es significativamente más económico que la minisecuenciación o
SnuPE como se ha descrito anteriormente en este documento porque se
amplifican múltiples secuencias diana en una única reacción,
mientras que con la minisecuenciación o SnuPE la amplificación se
realiza individualmente para cada secuencia diana. Además, el uso
de cebadores de una longitud diferente y complementarios a la
secuencia diana compromete la eficacia de la posterior etapa de
amplificación necesaria en el método de la presente invención.
La eficacia de la presente invención puede
ilustrarse del siguiente modo. Cuando se usa un dispositivo
electroforético capilar con 96 canales y capaz de detectar cuatro
marcadores simultáneamente, que permite 12 inyecciones posteriores
por proceso por canal con un periodo de tiempo seleccionado mínimo
optimizado empíricamente entre las inyecciones, una muestra que
contenga 20 secuencias diana de interés permite la detección con
elevada productividad de 96 (canales) * 12 (inyecciones) * 20
(dianas) * 4 (marcadores) = 92160 secuencias diana, usando el método
de la presente invención. En el caso de detección de SNP
co-dominante, pueden detectarse datos con respecto
a 46080 SNP en un único proceso.
La muestra puede suministrarse con un patrón del
tamaño de los fragmentos nucleotídicos que comprende uno o más
fragmentos nucleotídicos de longitud conocida. Los métodos para
preparar y usar los patrones de tamaño nucleotídicos son bien
conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook y Russel,
2001, supra). Dicho patrón de tamaño forma la base para la
determinación apropiada del tamaño de los amplicones en la muestra
y, por tanto, para la identificación apropiada del fragmento
detectado. El patrón de tamaño se suministra preferiblemente con
cada muestra y/o con cada inyección. Un patrón de tamaño contiene
preferiblemente una diversidad de longitudes que abarcan
preferiblemente la región completa de longitudes a analizar. En una
realización particular de la invención, se considera ventajoso
añadir patrones de tamaño flanqueantes de los que pueden derivarse
los tamaños de los amplicones por interpolación. Un patrón de tamaño
flanqueante es un patrón de tamaño que comprende al menos dos
secuencias oligonucleotídicas marcadas de las que preferiblemente
una tiene una longitud que es al menos una base más corta que la
sonda conectada amplificada más corta y preferiblemente una que es
al menos una base más larga que la sonda conectada amplificada más
larga para permitir la interpolación y minimizar la introducción de
una variación de longitud adicional en la muestra. Un patrón de
tamaño flanqueante preferido contiene un nucleótido que es un
nucleótido más corto que la sonda conectada amplificada más corta y
uno que es al menos una base más largo que la sonda conectada
amplificada más larga y está marcado con al menos un colorante que
es idéntico al marcador usado para marcar los amplicones contenidos
en la muestra.
Una forma conveniente para ensamblar un patrón
de tamaño adecuado es por síntesis química (habitual) de
oligonucleótidos de las longitudes apropiadas, que se marcan en el
extremo con un marcador adecuado. El patrón de tamaño se aplica con
cada muestra aplicada consecutivamente para que sirva de referencia
de tamaño local para determinar el tamaño de los fragmentos de
muestra cargados. El patrón de tamaño puede aplicarse en el mismo
canal o carril del dispositivo electroforético que la muestra a
analizar, es decir, junto con la muestra, o puede aplicarse en un
canal o carril paralelo de un dispositivo de múltiples
canales/carriles. El patrón de tamaño flanqueante puede marcarse
con cualquiera de los marcadores usados en el método. Si el patrón
de tamaño se aplica en el mismo canal del dispositivo, los
fragmentos del patrón se marcan preferiblemente con un marcador que
pueda distinguirse de los marcadores usados para la detección de
los amplicones en una muestra.
Ejemplos de plataformas de detección basada en
la secuencia son microseries en fase sólida y fase fluida.
Preferiblemente, se usan series dirigibles de forma única donde la
sonda contiene una única secuencia (tal como una secuencia ZIP)
proporcionando de este modo que la sonda ligada (y amplificada)
hibride con un punto predeterminado en la serie donde está
localizada la secuencia ZIP complementaria (cZIP). Los métodos de
detección basados en series hoy en día son corrientes y la
tecnología está ampliamente extendida, lo que permite que los
especialistas en la técnica creen una serie adecuada para la
detección de los pares de sondas ligados de la presente
invención.
Un ejemplo de plataformas basadas en masa es
MALDI-TOF. Los analitos a detectar tienen cada uno
una masa diferente. Esto puede conseguirse, por ejemplo, por la
incorporación de una secuencia rellenadora que comprende un sitio
de restricción en (una de) las sondas. Cuando las sondas ligadas se
someten a restricción antes de la detección (opcionalmente después
de la amplificación), se obtiene un conjunto de
fragmentos/oligonucleótidos, que tiene cada uno una masa diferente
que está asociada con la presencia o ausencia de una secuencia diana
en la
muestra.
muestra.
Una realización de la invención usando detección
basada en la masa se refiere a un método para determinar la
presencia o ausencia de una secuencia diana en una muestra de ácido
nucleico, donde se determina la presencia o ausencia de la
secuencia diana por un ensayo de ligamiento de oligonucleótidos en
combinación con un método de detección basado en la masa molecular
y donde cada secuencia diana en la muestra está representada por un
rellenador y la detección de las secuencias diana se basa en la
detección de la presencia o ausencia de un fragmento que comprende
dicho rellenador.
Un aspecto preferido de la invención se refiere
a un método para determinar la presencia o ausencia de al menos una
secuencia diana (2) en una muestra de ácido nucleico, que comprende
las etapas de:
proporcionar a una muestra de ácido nucleico un
par de una primera y una segunda sonda oligonucleotídica de acuerdo
con la invención para cada secuencia diana a detectar en la muestra,
por lo cual la primera sonda oligonucleotídica tiene una sección en
su extremo 5' que es complementaria a una primera parte de una
secuencia diana y la segunda sonda oligonucleotídica tiene una
sección en su extremo 3' que es complementaria a una segunda parte
de la secuencia diana, por lo cual la primera y la segunda partes de
la secuencia diana están localizadas preferiblemente adyacentes
entre sí, y por lo cual una o más de la primera y la segunda sondas
oligonucleotídicas comprenden adicionalmente una o más secuencias de
unión de cebador y uno o más rellenadores y un sitio de restricción
para una enzima de restricción, estando localizado dicho sitio de
restricción entre el sitio de unión de cebador y la sección de la
sonda oligonucleotídica que es complementaria a la primera o la
segunda parte de la secuencia diana y donde el rellenador está
localizado entre el sitio de restricción y el sitio de unión de
cebador y donde la primera sonda oligonucleotídica comprende una
primera sección de pinza, que es capaz de hibridar con una segunda
sección de pinza de la segunda sonda oligonucleotídica y donde la
segunda sonda oligonucleotídica comprende una segunda sección de
pinza, que es capaz de hibridar con la primera sección de pinza de
la primera sonda oligonucleotídica;
permitir que las sondas oligonucleotídicas
hibriden con las partes adyacentes de la secuencia diana por lo
cual las secciones complementarias de la primera y la segunda sondas
oligonucleotídicas están adyacentes;
proporcionar un medio para conectar la primera y
la segunda sondas oligonucleotídicas hibridadas de forma adyacente
con la secuencia diana y permitir que las secciones complementarias
de la primera y la segunda sondas oligonucleotídicas hibridadas de
forma adyacente se conecten, para producir una sonda conectada
correspondiente a una secuencia diana en la muestra;
amplificar las sondas conectadas a partir de un
par cebador para producir una muestra amplificada que comprende
sondas conectadas amplificadas;
digerir las sondas conectadas amplificadas con
la enzima de restricción para producir un fragmento detectable;
detectar la presencia o ausencia de la secuencia
diana detectando la presencia o ausencia del fragmento detectable
por un método de detección basado en la masa molecular.
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En la etapa (e), las sondas conectadas
amplificadas se escinden o cortan. La escisión de las sondas
conectadas amplificadas puede conseguirse por cualquier medio
conocido en la técnica siempre que se obtenga una cadena de
nucleótidos escindida o cortada reproducible. Reproducible a este
respecto se refiere a la preferencia de que el medio para escindir
o cortar corte la secuencia nucleotídica en la misma posición de la
secuencia de las sondas conectadas amplificadas. El medio para
escindir la sonda conectada amplificada puede ser químico o
enzimático, pero es preferiblemente enzimático, tal como una enzima
de restricción. Una enzima de restricción preferida es una
endonucleasa de restricción. Una sonda conectada amplificada se
escinde preferiblemente por la enzima de restricción en el sitio de
restricción que se proporcionó en la marcada de una de las sondas.
La escisión de las sondas conectadas amplificadas produce extremos
nivelados en los que los nucleótidos terminales de ambas cadenas
como resultantes de la etapa de restricción están apareados, o
extremos escalonados en los que uno de los extremos resultante de
la etapa de restricción sobresale para dar una única extensión de
cadena (corta). Preferiblemente, el sitio de restricción se
reconoce por una endonucleasa de restricción específica de
secuencia. En principio puede usarse cualquier endonucleasa de
restricción conocida en la técnica, siempre que produzca un corte
reproducible. La escisión de las sondas conectadas amplificadas en
la muestra produce un fragmento detectable.
Las propias endonucleasas de restricción son
ampliamente conocidas en la técnica. Una enzima de restricción
adecuada puede tener una secuencia de reconocimiento de 4, 5, 6, 7,
u 8 o más nucleótidos. Preferiblemente, la endonucleasa de
restricción es un agente de corte por frecuente (es decir, tiene una
secuencia de reconocimiento de más de 4 nucleótidos).
Preferiblemente, la enzima de restricción es una enzima de tipo II o
una enzima de tipo IIs. Las enzimas de restricción preferidas son
EcoRI, HindIII, BamHI. Otras enzimas de restricción preferidas son
enzimas de restricción 6-cortadoras, preferiblemente
las 6-cortadoras que son relativamente
económicas.
La digestión de las sondas conectadas
amplificadas en la etapa (e), por ejemplo con endonucleasas de
restricción, produce fragmentos detectables (que comprenden la
secuencia rellenadora) y los restos de las sondas conectadas
amplificadas (fragmentos de desecho). Los fragmentos de desecho
comprenden las secciones complementarias ligadas. La digestión con
una endonucleasa de restricción produce un fragmento detectable que
es bicatenario. Tanto los fragmentos detectables como los
fragmentos de desecho constan de dos cadenas, una denominada como la
cadena superior y la otra como la cadena inferior. El fragmento
detectable puede someterse a un tratamiento de desnaturalización
para proporcionar las cadenas superior e inferior por separado. La
cadena inferior es esencialmente complementaria a la cadena
superior, es decir, la parte más grande de la secuencia nucleotídica
de la cadena superior e inferior son complementarias, con la
excepción de aquellos nucleótidos que son parte de un extremo
escalonado o adhesivo, esencialmente como se ha descrito
anteriormente en este documento. Puede detectarse la cadena superior
o la cadena inferior, o tanto la cadena superior como la cadena
inferior.
La detección se basa en la detección de la
presencia o ausencia del fragmento detectable. La detección del
fragmento detectable es preferiblemente indicativa de la presencia o
ausencia de las sondas conectadas amplificadas en la muestra
amplificada y por tanto de la secuencia nucleotídica diana en la
muestra de ácido nucleico. Preferiblemente, la detección se basa en
la detección de la cadena superior y/o la inferior del fragmento
detectable. La detección de la cadena inferior además de la cadena
superior tiene la ventaja de que se obtiene la confirmación directa
de la presencia o ausencia de la secuencia diana in
duplo.
La detección puede realizarse directamente en la
muestra digerida, pero se prefiere que, antes de la detección, el
fragmento detectable se aísle, se purifique o separe de las sondas
conectadas amplificadas digeridas. El fragmento detectable puede
aislarse, purificarse o separarse de las sondas conectadas
amplificadas digeridas por medios conocidos en la técnica tales
como purificación en columna de centrifugación, purificación en fase
inversa o, preferiblemente por técnicas de marcaje de afinidad
tales como una combinación de
biotina-estreptavidina, combinada con un vehículo
adecuado tal como perlas magnéticas, filamentos de sondas etc. El
aislamiento, purificación o separación también pueden realizarse
después de un tratamiento de desnaturalización sobre las cadenas
superior y/o inferior.
El fragmento detectable está marcado
preferiblemente con un marcador de afinidad. El marcador de afinidad
se localiza preferiblemente en el extremo final del fragmento
detectable, localizado distal del sitio de restricción o, después
de la digestión, lo que queda del sitio de restricción. La cadena
superior y/o la cadena inferior del fragmento detectable pueden
estar equipadas con el marcador de afinidad. Preferiblemente es la
cadena inferior la que comprende el marcador de afinidad y la
secuencia rellenadora. El concepto de cadena superior se usa
generalmente para indicar que la secuencia nucleotídica de la cadena
superior al menos en parte corresponde a la parte de la marca que
comprende el rellenador, el sitio de restricción y el sitio de unión
de cebador, es decir, la cadena superior contiene una secuencia
nucleotídica que es esencialmente idéntica a la de la sonda. La
cadena inferior es la cadena complementaria a la cadena superior y
se obtiene después de una primera ronda de amplificación por
extensión de un cebador complementario al sitio de unión de cebador
en la cadena superior y dicho cebador está preferiblemente equipado
con un marcador de afinidad. Por consiguiente, la cadena inferior
contiene una secuencia que corresponde a la secuencia nucleotídica
de uno de los cebadores. En una realización preferida particular,
la cadena inferior está equipada con el marcador de afinidad.
Preferiblemente, la cadena inferior se aísla de la muestra que
comprende los fragmentos detectables desnaturalizados,
preferiblemente por el marcador de afinidad. Preferiblemente, es la
cadena inferior la que se detecta usando espectrometría de masas.
Por tanto, la detección de la cadena inferior proporciona la
información relativa a la presencia o ausencia de la cadena de
nucleótidos diana.
El marcador de afinidad puede usarse para el
aislamiento de la cadena superior y/o inferior de la mezcla de
sondas conectadas amplificadas digeridas. Como marcador de afinidad,
se prefiere una combinación de
biotina-estreptavidina. La cadena superior, la
cadena inferior o el fragmento detectable con marcador de afinidad
puede detectarse posteriormente usando técnicas de detección
basadas en la masa molecular.
Como se usa en este documento, la expresión
marcador de afinidad también abarca marcadores de afinidad que se
acoplan mediante los llamados "enlazadores" (que tienen una
cierta masa molecular) localizados entre la secuencia nucleotídica
de la marca y el marcador de afinidad real.
En una realización alternativa, el marcador de
afinidad se proporciona en la marca que no comprende la combinación
sitio de restricción-rellenador. Esto permite el
aislamiento de las sondas conectadas amplificadas antes de la etapa
de digestión. La mezcla resultante, después de la restricción y la
desnaturalización opcional, puede analizarse directamente usando
espectrometría de masas. Como la masa de los fragmentos detectables,
o las cadenas superior o inferior, es conocida o puede al menos
calcularse, los fragmentos de desecho (es decir, los restos de las
sondas conectadas amplificadas digeridas) no comprometen
significativamente la detección ya que los fragmentos detectables,
y tanto la cadena superior como la inferior, están dentro de un
intervalo de masa conocido y
diferente.
diferente.
Las técnicas de detección basadas en la masa
molecular son, por ejemplo, espectrometría de masas y más en
particular las técnicas de espectrometría de masas que son adecuadas
para la detección de moléculas grandes tales como oligonucleótidos.
Ejemplos de estas técnicas son desorción e ionización por láser
asistida por matriz-tiempo de vuelo
(MALDI-TOF), HPLC-MS,
GC-MS etcétera. Habitualmente las técnicas de
detección basadas en la masa molecular prefieren que las muestras
sometidas contengan oligonucleótidos en una forma monocatenaria. En
el caso de que se haya aislado el fragmento detectable en forma de
un oligonucleótido bicatenario, el fragmento detectable
preferiblemente se desnaturaliza, usando técnicas conocidas en la
técnica, para producir oligonucleótidos monocatenarios, por
ejemplo, tales como los descritos en este documento como las cadenas
superior y/o inferior.
Después de la digestión con una endonucleasa de
restricción, el fragmento detectable obtenido comprende
preferiblemente un rellenador, los restos del sitio de restricción,
y el sitio de unión de cebador. Opcionalmente puede unirse un
marcador de afinidad a la cadena superior y/o inferior,
opcionalmente mediante un enlazador. La masa a detectar por tanto
es la suma de la masa molecular del sitio de unión de cebador, el
rellenador, los restos del sitio de restricción y el marcador de
afinidad opcional y el enlazador opcional.
Para distinguir entre diferentes secuencias
diana en una muestra de ácido nucleico, los fragmentos detectables
están diseñados de tal modo que un fragmento detectable
correspondiente a una secuencia diana en la muestra difiere en masa
de un fragmento detectable correspondiente a otra secuencia diana en
la muestra. Por consiguiente, una muestra que comprende múltiples
secuencias diana comprende (después del ligamiento, amplificación y
digestión) múltiples fragmentos detectables, cada fragmento
detectable con una masa diferente. Después de la desnaturalización
de los fragmentos detectables en las cadenas superior e inferior
respectivas, las diversas cadenas superiores tienen, cada una, una
masa diferente. Asimismo, las diversas cadenas inferiores tienen,
cada una, una masa diferente. Preferiblemente, la diferencia de
masa entre dos fragmentos detectables diferentes (y por tanto entre
dos cadenas superiores o inferiores respectivamente) se proporciona
por la diferencia de masa del rellenador.
Puede considerarse que la cadena superior o la
cadena inferior comprende una sección constante y una sección
variable. La sección constante comprende el sitio de unión de
cebador, el marcador de afinidad opcional (incluyendo el enlazador
opcional) y los restos del sitio de restricción. La sección variable
comprende el rellenador. La sección constante es constante dentro
de una muestra y es de una masa constante. La sección variable
preferiblemente proporciona la diferencia en la masa entre cadenas
que corresponden con diferentes nucleótidos diana en una
muestra.
muestra.
\newpage
En una realización de la presente invención, el
fragmento detectable (y por consiguiente) las sondas
oligonucleotídicas están diseñadas de tal modo que la sección
constante también es variada en masa. Esto permite la creación de
múltiples regiones dentro de un espectro de masa. Cada región tendrá
un límite inferior y un límite superior, definiendo de este modo
una ventana. El límite inferior de la ventana está definido por la
masa de la secuencia constante. Usando diferentes secuencias
constantes, pueden definirse diferentes regiones. Preferiblemente,
estas regiones no solapan. Dentro de una región se crea una
diferencia de masa entre los oligonucleótidos a detectar por la
diferencia de masa entre los rellenadores esencialmente como se ha
descrito en este documento anteriormente. El límite superior de la
región es al menos la suma del límite inferior de la región y el
rellenador con la masa más grande. Por ejemplo, dos secciones
constantes tienen una masa de 6.489 Dalton y 8.214, respectivamente.
Secuencias rellenadotas de hasta dos nucleótidos proporcionan 15
combinaciones diferentes (incluyendo la secuencia de un rellenador,
por tanto masa 0), cada una con un peso molecular diferente, que
varía de 0 hasta 642 (AG o GA). Esto permite dos regiones, una que
varía de 6.489 Dalton a 7.131 Dalton y una región de 8.214 Dalton a
8.856 Dalton. Esto permite un aumento de la capacidad de combinación
de la presente invención. Esto también permite la combinación de
muestras antes del análisis de masas. Las dos cosas aumentarán la
elevada productividad de la presente
invención.
invención.
Para diseñar rellenadores que puedan usarse en
las sondas de la presente invención y que sean capaces de
proporcionar una pasa única para cada fragmento detectable y por
tanto la cadena superior o la cadena inferior en la muestra, los
rellenadores preferiblemente tienen que cumplir los siguientes
requisitos: i) una cantidad limitada de bases consecutivas
idénticas para evitar que resbale la polimerasa durante la etapa de
amplificación; ii) ausencia de sitio de reconocimiento interna para
la enzima de restricción; iii) diferencia de masa mínima para
asegurar la resolución adecuada; iv) ausencia de formación de
horquillas, por ejemplo con otras partes de las sondas de
ligamiento, por ejemplo, debido a la hibridación intramolecular.
Los rellenadotes adecuados para su uso en la
invención pueden diseñarse usando un método que calcula todas las
posibles secuencias rellenadoras hasta una longitud predeterminada y
que cumple los criterios enumerados anteriormente
(i-iv). Este método puede realizarse usando un
programa informático en un ordenador. Este método puede
considerarse una invención en sí mismo. El programa informático
puede proporcionarse en un portador de datos diferentes tal como
disquete. El método comienza proporcionando el límite superior de
longitud de la secuencia rellenadora. El método posteriormente
calcula todas las posibles permutaciones de secuencias
nucleotídicas y a través de un proceso de eliminación y selección
aplica los criterios i-iii enumerados anteriormente
en este documento. La cantidad de bases consecutivas permisibles
puede proporcionarse por separado o puede predeterminarse. El sitio
de reconocimiento para la enzima de restricción puede proporcionarse
como una entrada diferente, pero también puede obtenerse de una
base de datos de sitios de reconocimiento conocidos para la enzima
de restricción, dependiendo de si se permite o no la presencia de
secuencias de reconocimiento de otras enzimas de restricción. La
diferencia de masa mínima también puede proporcionarse como una
entrada diferente o como un parámetro determinado. La formación de
horquillas puede comprobarse usando un programa de selección de
cebadores de PCR convencional tal como Primer Designer versión 2.0
(copyright 1990, 1991, Scientific and Educational software). Las
secuencias rellenadoras resultantes pueden presentarse al usuario en
un formato adecuado, por ejemplo en un portador de
datos.
datos.
El método de acuerdo con la invención permite el
análisis de una multiplicad de secuencias diana aumentando
significativamente de este modo la productividad de la cantidad de
muestras que puede analizarse. "Productividad" como se usa en
este documento, define un parámetro relativo que indica la cantidad
de muestras y secuencias diana que puede analizarse por unidad de
tiempo.
En una variante de la tecnología, se combina el
material de partida (ADN) de múltiples individuos de tal modo que
se carguen menos muestras de detección que contienen este material
en el dispositivo de detección. Esto puede ser ventajoso en el caso
del Desequilibrio de Enlaces (mapeado LD) cuando el objetivo es
identificar sondas conectadas amplificadas (tal como las que
representan alelos SNP) que sean específicas para una combinación
particular de muestras de partida, por ejemplo combinaciones de
material de partida obtenido de individuos que tienen diferentes
fenotipos para un rasgo particular.
Un aspecto de la invención se refiere al uso del
método en una diversidad de aplicaciones. La aplicación del método
de acuerdo con la invención se encuentra en, aunque sin limitación,
técnicas tales como genotipado, perfilado de transcritos, mapeado
genético, descubrimiento de genes, selección asistida por
marcadores, control de calidad de semillas, selección de híbridos,
mapeado QTL, análisis de segregantes agrupados, determinación de
huellas de ADN y análisis de microsatélites. Otro aspecto se refiere
a la detección con elevada productividad simultánea de la
abundancia cuantitativa de secuencias de ácido nucleico diana. Este
procedimiento se conoce habitualmente como Análisis de Segregantes
Agrupados (BSA).
\newpage
Una aplicación preferida particular del método
de acuerdo con la invención se encentra en la detección de
polimorfismos de un único nucleótido (SNP). Una primera sonda
oligonucleotídica del de acuerdo con la invención comprende una
parte que es complementaria a una parte de la secuencia diana que
está preferiblemente localizada adyacente al sitio polimórfico, es
decir, el nucleótido polimórfico único. Una segunda sonda
oligonucleotídica del par de acuerdo con la invención es
complementaria a la parte de la secuencia diana de modo que su base
terminal está localizada en el sitio polimórfico, es decir, es
complementaria al nucleótido polimórfico único. Si la base terminal
es complementaria al nucleótido presente en el sitio polimórfico en
una secuencia diana, hibridará con la secuencia diana y producirá
el ligamiento de las dos sondas. Cuando el nucleótido final, es
decir, el nucleótido específico de alelo no se aparea, no sucederá
el ligamiento o sucederá solamente a un bajo nivel y el
polimorfismo permanecerá sin detectar.
Cuando una de las secuencias diana en una
muestra deriva de o contiene un polimorfismo de un único nucleótido
(SNP), además de las sondas específicas para ese alelo, pueden
proporcionarse sondas adicionales que no solamente permite la
identificación del alelo, sino también la identificación de cada uno
de los posibles alelos del SNP (valoración
co-dominante). Para este fin, puede proporcionarse
una combinación de tipos de sondas: un tipo de sonda es igual para
todos los alelos de interés y uno o más del otro tipo de sonda es
específico para cada uno de los posibles alelos. Estas una o más
sondas de otro tipo contienen la misma secuencia complementaria
pero difieren en que cada una contiene un nucleótido,
preferiblemente en el extremo, que corresponde al alelo específico.
La sonda específica de alelo puede proporcionarse en una cantidad
correspondiente a la cantidad de alelos diferentes esperados. El
resultado es que puede caracterizarse un SNP por la combinación de
un tipo de sonda con cuatro sondas del otro tipo (específicas de
alelo), que identifican los cuatro alelos teóricamente posibles
(uno para A, T, C, y G), incorporando secuencias rellenadoras de
diferentes longitudes (preferidas) o diferentes marcadores en las
sondas específicas de alelo.
En una realización particular, preferiblemente
dirigida a la identificación de polimorfismos de un único
nucleótido, la primera sonda oligonucleotídica del par de acuerdo
con la invención está dirigida a una parte de la secuencia diana
que no contiene el sitio polimórfico y la segunda sonda
oligonucleotídica del par de acuerdo con la invención contiene,
preferiblemente en el extremo distal de la secuencia de unión de
cebador, uno o más nucleótidos complementarios al sitio polimórfico
de interés. Después del ligamiento de las sondas adyacentes, la
sonda conectada es específica para uno de los alelos de un
polimorfismo de un único nucleótido. La secuencia rellenadora
contenida en la primera sonda oligonucleotídica es preferiblemente
indicativa del locus que tiene que analizarse. La secuencia
rellenadora contenida en la segunda sonda es preferiblemente
indicativa del nucleótido complementario al sitio polimórfico.
Para identificar el alelo del sitio polimórfico
en la secuencia diana, puede proporcionarse un par de sondas
oligonucleotídicas donde se proporciona una primera sonda y una o
más segundas sondas (en este caso el par de sondas puede contener
más de dos sondas). Cada segunda sonda entonces contiene un
nucleótido específico en el extremo de la secuencia complementaria,
preferiblemente el extremo 3', en combinación con una longitud
conocida del rellenador. Por ejemplo, en el caso de un polimorfismo
A/C, la segunda sonda puede contener un nucleótido T específico en
combinación con una longitud de rellenador de 2 nucleótidos y otra
segunda sonda para es polimorfismo combina un nucleótido G
específico con una longitud de rellenador de 0. Como los cebadores
y las partes complementarias de las sondas tienen preferiblemente la
misma longitud, esto crea una diferencia de longitud de las sondas
conectadas amplificadas resultantes de 2 nucleótidos. En caso de que
se desee la presencia y/o la ausencia de los cuatro nucleótidos
teóricamente posibles del sitio polimórfico, la combinación
rellenador-nucleótido específico puede adaptarse en
consecuencia. En esta realización, puede considerarse que la
información específica de locus se acopla a la longitud del
rellenador en la primera sonda y la información específica de alelo
del sitio polimórfico se acopla a la longitud del segundo
rellenador. La longitud combinada de los dos rellenadores entonces
puede verse como indicativa de la combinación
locus-alelo. En una muestra que contiene múltiples
secuencias diana, amplificadas con el mismo par de cebadores de
amplificación (y por tanto marcador) o con múltiples pares de
cebadores de amplificación con marcadores que tienen espectros de
emisión solapantes, las longitudes combinadas del rellenador se
eligen de tal modo que todas las sondas conectadas sean de una
longitud única. En una realización preferida, este principio puede
extenderse a al menos diez loci con al menos dos alelos por locus.
Una ventaja adicional del uso de dos rellenadores, uno en cada
sonda, es que incorporando la mayor parte de la longitud del
rellenador en la primera sonda (es decir, la sonda específica de
locus) las sondas específicas de alelo pueden seguir siendo más
cortas, es decir, con la cantidad mínima de bases suficiente para
la discriminación entre las sondas específicas de alelo, que ahorra
costes. La incorporación de la secuencia rellenadora completa en la
sonda específica de alelo requeriría la síntesis de la mayor parte
de la secuencia rellenadora dos veces.
La secuencia diana contiene una secuencia
nucleotídica conocida derivada de un genoma. Dicha secuencia no
contiene necesariamente un polimorfismo, pero es, por ejemplo,
específica de un gen, un promotor, un segmento de introgresión o un
transgén o contiene información con respecto a un rasgo de
producción, resistencia a enfermedades, rendimiento, vigor del
híbrido, que es indicativo de tumores u otras enfermedades y/o
función génica en seres humanos, animales y plantas. Para este fin,
las partes complementarias de la primera sonda y la segunda sonda
están diseñadas para que correspondan con una, preferiblemente
única, secuencia diana en el genoma, asociada con la información
deseada. Las partes complementarias en la secuencia diana se
localizan adyacentes entre sí. En el caso de que la secuencia diana
deseada esté presente en la muestra, las dos sondas hibridarán de
forma adyacente y después del ligamiento y la amplificación pueden
detectarse.
AFLP, su aplicación y tecnología se describe en
Vos et al., Nucleic Acids Research, vol. 23, (1995),
4407-4414 así como en los documentos
EP-A 0 534 858 y US 6045994, todos incorporados en
este documento por referencia. Para una descripción adicional de
AFLP, sus ventajas, sus realizaciones, sus técnicas, enzimas,
adaptadores, cebadores y compuestos adicionales, herramientas y
definiciones usados, se hace referencia explícita a los pasajes
pertinentes de las publicaciones mencionadas anteriormente en este
documento con relación a AFLP. AFLP y su tecnología relacionada es
una técnica de identificación de huellas de ADN poderosa para la
identificación de, por ejemplo, marcadores genéticos específicos
(los llamados marcadores AFLP), que puede ser indicativo de la
presencia de ciertos genes o rasgos genéticos o puede usarse, en
general, para comparar muestras de ADN, ADNc o ARN de origen o
patrón de restricción conocido. Los marcadores AFLP están, en
general, asociados con la presencia de sitios polimórficos en una
secuencia nucleotídica a analizar. Dicho polimorfismo puede estar
presente en el sitio de restricción, en los nucleótidos selectivos,
por ejemplo, en forma de indels o sustituciones o en el resto del
fragmento de restricción, por ejemplo en forma de indels o
sustituciones. Una vez se ha identificado un marcador AFLP como
tal, puede identificarse el polimorfismo asociado con el marcador
AFLP y pueden desarrollarse sondas para su uso en el ensayo de
ligamiento de la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una sonda de ácido nucleico que comprende una parte que
es capaz de hibridar con parte de una secuencia diana, una parte que
es capaz de funcionar como una sección de pinza y que
preferiblemente comprende adicionalmente una secuencia de unión de
cebador y/o un rellenador. La invención también se refiere a un par
de sondas, que comprende preferiblemente dos o más sondas donde cada
sonda comprende una parte que es complementaria a parte de una
secuencia diana y donde las partes complementarias de las sondas se
localizan esencialmente adyacentes en la secuencia diana y donde
cada sonda comprende adicionalmente un rellenador, estando
localizado dicho rellenador esencialmente cerca de la parte
complementaria y una secuencia de unión de cebador localizada
esencialmente adyacente al rellenador y donde cada sonda comprende
adicionalmente una sección de pinza donde la sección de pinza es
capaz de hibridar con una sección de pinza complementaria en al
menos una de las otras sondas en el par de sondas.
La invención, en un aspecto adicional, se
refiere al uso de un par de sondas en el análisis de al menos una
secuencia nucleotídica y preferiblemente en la detección de un
polimorfismo de un único nucleótido, donde el par comprende
adicionalmente al menos una sonda adicional que contiene un
nucleótido que es complementario al alelo SNP conocido.
Preferiblemente, el par comprende una sonda para cada alelo de un
polimorfismo de un único nucleótido específico. El uso de un par de
sondas se prefiere adicionalmente en un método para la detección
con elevada productividad de polimorfismos de un único nucleótido
donde la longitud del primer rellenador en la primera sonda es
específica para un locus de un polimorfismo de un único nucleótido y
la longitud o la presencia del segundo rellenador en la segunda
sonda es específica para un alelo del polimorfismo de un único
nucleótido.
Otro aspecto de la invención se refiere a los
cebadores y más en particular al par de cebadores que comprende un
primer cebador y uno o más segundos cebadores, donde cada segundo
cebador contiene un marcador y dicho segundo cebador comprende una
secuencia nucleotídica que es específica para dicho marcador.
La presente invención también encuentra
realizaciones en forma de kits. Los kits de acuerdo con la invención
son, por ejemplo, kits que comprenden (pares de) sondas adecuadas
para su uso en el método así como un kit que comprende cebadores,
adicionalmente la presente invención proporciona un kit de
combinación, que comprende cebadores y sondas, preferiblemente todo
equipado adecuadamente con enzimas, tampones, etcétera.
La invención también se refiere al uso de un par
de sondas o dos o más pares de sondas de acuerdo con la invención
en la detección o determinación de la presencia o ausencia de una
secuencia diana en al menos una muestra.
Figura 1: Representación esquemática de la
estructura y funcionalidad de sondas tipo cerradura. Las sondas
(P1, P2) contienen, cada una, una sección específica de diana (T1,
T2) complementaria a una sección (S1, S2) de la secuencia diana
(D). Las sondas contienen, cada una, una sección de pinza (C1, C2)
capaz de hibridar entre sí. Las sondas contienen, cada una, una
sección de unión de cebador (B1, B2) capaz de hibridar con un
cebador. Las sondas pueden hibridar con al secuencia diana. Cuando
las sondas han hibridado adyacentes en la secuencia diana, las
sondas pueden ligarse junto con una ligasa. La pinza puede
desnaturalizarse después de lo cual los cebadores pueden hibridar
con la sondas conectadas y las sondas conectadas pueden amplificarse
o multiplicarse, por ejemplo usando PCR u otra técnica de
amplificación adecuada. Después de la amplificación, pueden
detectarse las sondas ligadas y
amplificadas.
amplificadas.
Figura 2: Comparación entre ensayos tipo candado
y tipo cerradura. Las líneas de tomate A, B, C, y D se ensayaron
con un par de sondas tipo candado de combinación 10 y un par de
sondas tipo cerradura de combinación 10, diseñadas sobre los mismos
loci. Todos los ligamientos contenían 100 ng de ADN genómico. Para
lo ensayos tipo candado, se usaron 0,5 fmol de cada sonda, para los
ensayos tipo cerradura, se usaron 0,5 fmol de cada sonda específica
de alelo y 1 fmol de cada sonda específica de locus. La imagen de
las trazas MegaBACE se generó con el software SNPXtractor (Keygene
N.V.), que convierte electroferogramas en imágenes en
pseudo-gel.
Figura 3: Representación de los perfiles de
intensidad de fluorescencia de sondas FRET tipo cerradura. Perfil:
2 min. 94ºC+ 10 * (15 s. 94ºC, 60 min. 60ºC) + 4 min. cont. La
formación de la pinza se observa a aproximadamente 75ºC.
Figura 4: Representación esquemática y
generalizada de un ensayo de ligamiento de oligonucleótidos (basado
en las sondas de la invención) donde, cuando se hibridan una primera
sonda y una segunda sonda con la secuencia diana, una de las sondas
contiene un saliente y/o solapamiento (E) en el punto previsto de
ligamiento. El saliente puede eliminarse usando una enzima que
escinde estas estructuras de escisión de un modo altamente
específico después de lo cual pueden proceder el ligamiento, la
amplificación y la detección del modo convencional.
La sección I representa la realización en la que
una de las sondas contiene un nucleótido (aquí representado por A)
que es complementario al nucleótido en la posición correspondiente
en la secuencia diana (aquí representado por T). La otra sonda
contiene el saliente (E) que contiene el nucleótido (aquí
representado por A) en la primera posición desapareada y donde el
nucleótido en la posición desapareada es complementario al
nucleótido en la secuencia diana a detectar (aquí representado por
T). Esto provocará la formación de la estructura de escisión y la
posterior escisión por el agente de escisión. La estructura
escindida resultante puede ligarse. La posterior amplificación
proporcionará una serie de de amplicones que son indicativos de la
secuencia diana en la muestra.
La sección II representa una realización similar
a la sección I con la diferencia de que el nucleótido en la sonda
en el punto previsto de ligamiento no aparea con la secuencia diana.
El nucleótido en la primera posición desapareada en el saliente no
aparea con el nucleótido en la secuencia diana. Puede formarse la
estructura de escisión y puede escindirse el saliente. Sin embargo,
incluso si el saliente se escinde, las dos sondas no se ligarán ya
que hay un desapareamiento en las sondas, que evita el ligamiento.
Por consiguiente, tampoco será satisfactoria ninguna
amplificación.
La sección III representa una realización en la
que el nucleótido en la primera posición desapareada en el saliente
no aparea con el nucleótido en la secuencia diana. No se formará la
estructura de escisión y no se escindirá el saliente. No sucederá
ligamiento o amplificación.
Figura 5: demuestra los experimentos donde se
mezclaron partes específicas de alelo marcadas con HEX 5' de sondas
tipo cerradura (1b y 2b) con partes específicas de locus marcadas
con rojo de metilo 3' de sondas tipo cerradura (1 y 2).
Figura 6A: Representación esquemática y
generalizada de un ensayo de ligamiento de oligonucleótidos
específicos de SNP o específicos de alelo donde el nucleótido
específico de alelo se proporciona en la sonda que contiene la
región adicional (extendida) y donde la estructura de escisión se
forma con i) el nucleótido de la secuencia diana que está
localizado adyacente al SNP a investigar, ii) el nucleótido de la
sonda que hibrida con el nucleótido de i), y iii) el nucleótido de
la otra sonda que está localizado en la región adicional (extendida)
y adyacente al nucleótido específico de alelo en la sonda. En esta
realización, la estructura de escisión se forma adyacente al SNP.
Esto mejora la especificidad.
Figura 6B: Representación esquemática de dos
ensayos de ligamiento de oligonucleótidos específicos de alelo o
específicos de SNP, donde en el primer ensayo la estructura de
escisión se forma por los nucleótidos localizados adyacentes al SNP
a investigar, representados como N, y donde en el segundo ensayo la
estructura de escisión se forma por los nucleótidos del SNP a
investigar, representado como A o T.
Figura 7: Demuestra la aplicabilidad general de
la realización de la Figura 6A y 6B para ensayos OLA en general, es
decir, cuando se usan sondas lineales (1), sondas
circularizables/tipo candado (2) y sondas
semi-circularizables/tipo cerradura (3) de la
presente invención.
Se aisló el ADN de material foliar de 4 líneas
de tomate homocigóticas usando métodos conocidos per se, por
ejemplo, esencialmente como se describe en el documento EP 0 534
858, y se almacenó en solución TE 1X (Tris-HCl 10
mM pH 8,0 que contenía EDTA 1 mM). Las concentraciones se
determinaron por mediciones UV en un espectrofotómetro (MERK)
usando procedimientos convencionales, y se ajustaron a 100 ng/\mul
usando TE 1X.
\vskip1.000000\baselineskip
Los SNP seleccionados se identificaron y se
resumen en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionaron las sondas oligonucleotídicas
circular tipo candado (orientación 5'-3') para
discriminar los alelos SNP para cada uno de los loci SNP descritos
en el Ejemplo 2. Todas las sondas están fosforiladas en el extremo
5'. Las secuencias se resumen en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionaron las sondas lineales tipo
cerradura (orientación 5'-3') para discriminar los
alelos SNP para cada uno de los loci SNP descritos en el Ejemplo 2.
Las regiones de unión de PCR están subrayadas, las secuencias
rellenadoras están doblemente subrayadas y la sección de pinza está
en negrita. Los cebadores inversos están fosforilados en el extremo
5': p o PH indica fosforilado. Las secuencias se resumen en la Tabla
3.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de uno de los cebadores usado para
la amplificación por PCR era complementaria a las regiones de unión
de cebador de PCR incorporadas en las sondas de ligamiento descritas
en los Ejemplos 3 y 4. La secuencia del segundo cebador de PCR
apareaba con la región de unión de cebador de PCR de la sonda.
Habitualmente el cebador directo está marcado. La concentración de
los oligonucleótidos se ajustó a 50 ng/\mul. La secuencia de los
cebadores en orientación 5'-3' se representa en la
Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cuatro muestras (muestras 1-4)
de líneas de tomate homocigóticas (Ejemplo 1) se sometieron a una
reacción de ligamiento de oligonucleótidos combinada usando una
mezcla de 20 sondas tipo candado (2 sondas por locus) o 30 sondas
tipo cerradura (3 sondas por locus). Las condiciones usadas fueron
tampón de ADN ligasa Taq 1x (NEB), 0,2 U/\mul de ADN ligasa Taq,
y 0,05 fmol/\mul de cada sonda en un volumen de 10 \mul. El
ligamiento se realizó en un termociclador (Perkin Elmer) con las
siguientes condiciones de ciclado: 2 minutos a 94ºC + 10 * (15
segundos a 94ºC + 60 minutos a 60ºC) + 4ºC continuamente. Después
del ligamiento, se diluyeron los 10 \mul de producto de
ligamiento con 30 \mul de tampón de ADN ligasa Taq 1x. Se usaron
diez \mul de las reacciones de ligamiento diluidas para realizar
una PCR usando un cebador E00k marcado combinado con M00k. El
candor E00k estaba marcado con JOE para posibilitar la detección en
el MegaBACE. Las condiciones usadas en la PCR fuero 30 ng de
cebador E00k marcado y 30 ng de cebador M00k, tampón I Accuprime 1x,
0,4 \mul de polimerasa Accuprime (Invitrogen) en 10 \mul de
producto de ligamiento diluido en una reacción de PCR de 20 \mul.
La PCR se realizó en un termociclador con las siguientes condiciones
de ciclado: 2 minutos a 94ºC + 35 * (15 segundos a 94ºC + 30
segundos a 56ºC + 60 segundos a 68ºC) + 4ºC continuamente. El
producto de PCR se purificó usando Sephadex 50 y se diluyó 80 veces
con MQ. El producto de PCR diluido se analizó en el MegaBACE. Los
resultados se presentan en la Fig. 2.
\newpage
Composiciones de tampón:
Tampón de ADN ligasa Taq 1x
Tris-HCl 20 mM
acetato potásico 25 mM
acetato de magnesio 10 mM
DTT 10 mM
NAD 1 mM
Triton X-100 al 0,1%
(pH 7,6 a 25ºC)
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de ADN polimerasa Taq AccuPrime
1x
Tris-HCl 20 mM (pH 8,4)
KCl 50 mM
MgCl_{2} 1,5 mM
dGTP, dATP, dTTP y dCTP 0,2 mM
proteína AccuPrime^{TM} termoestable
glicerol al 10%
\vskip1.000000\baselineskip
En caso de detección usando el instrumento de
secuenciación capilar MegaBACE 1000, se realizó la desalación y
purificación de las mezclas de reacción de PCR en un formato de 96
pocillos, usando el siguiente procedimiento:
Se cargó Sephadex^{TM} G-50 en
polvo superfino (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) en los
pocillos de una placa de 96 pocillos (MultiScreen®-HV, Millipore
Corporation, Bedford, MA, USA), usando el cargador de columna de 45
microlitros (Millipore Corporation) del siguiente modo:
a) Se añadió Sephadex G-50
superfino al cargador de columna.
b) Se eliminó el exceso de Sephadex de la parte
superior del cargador de columna con un raspador.
c) La placa Multiscreen-HV se
puso bocabajo sobre la parte superior del cargador de columna.
d) La placa Multiscreen-HV y el
cargador de columna se invirtieron ambos.
e) Se liberó el Sephadex G-50
golpeando la parte superior o en el lateral del cargador de
columna.
f) A continuación, el Sephadex
G-50 se hinchó y se aclaró del siguiente modo:
g) Se añadieron 200 \mul de agua
Milli-Q por pocillo usando un pipeteador
multicanal.
h) Se puso un tramo de alineación de centrífuga
sobre la parte superior de una microplaca de 96 pocillos
convencional, la placa Multiscreen-HV se colocó en
la parte superior y las minicolumnas se compactaron por
centrifugación durante 5 min. a 900 g.
i) La placa de 96 pocillos de vació y se colocó
de nuevo.
j) Se repitieron una vez las etapas
5-7.
k) Se añadieron 200 \mul de agua
Milli-Q a cada pocillo para hinchar el Sephadex
G-50 y se incubaron durante 2-3
horas. Ocasionalmente en esta fase, las placas
Multiscreen-HV con minicolumnas hinchadas de
Sephadex G-50 superfino se precintaron firmemente
con parafilm y se almacenaron en un refrigerador a 4ºC hasta su
uso
adicional.
adicional.
l) Se puso un tramo de alineación de centrífuga
sobre la parte superior de una microplaca de 96 pocillos
convencional, la placa Multiscreen-HV se colocó en
la parte superior del ensamblaje y se compactaron las minicolumnas
por centrifugación durante 5 min. a 900 g.
m) Se retiró la microplaca de 96 pocillos.
n) Las mezclas que contenían las sondas
conectadas amplificadas se añadieron cuidadosamente en el centro de
cada pocillo.
o) Usando el tramo de alineación de centrífuga,
se puso la placa Multiscreen-HV sobre la parte
superior de una nueva placa de microtitulación con fondo en U
convencional y se realizó la centrifugación durante 5 min. a 900
g.
p) El producto eluido en la placa de 96 pocillos
convencional (aproximadamente 25 \mul por pocillo) contiene el
producto amplificado.
Las muestras purificadas se diluyeron
25-75 veces en agua Milli-Q antes de
la inyección.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hizo una dilución de factor 800 del patrón de
tamaño ET-900 Rox (Amersham Biosciences) en agua. Se
añadieron 8 \mul de ET-900 Rox diluido a 2 \mul
de muestra purificada. Antes del procesamiento, la muestra que
contenía el patrón de tamaño se desnaturalizó por calor por
incubación durante 1 min. a 94ºC y posteriormente se puso en
hielo.
hielo.
Los capilares MegaBACE se llenaron con matriz
1XLPA (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante. Los parámetros para la inyección
electrocinética de las muestras son los siguientes: 45 s. a 3 kV.
Los parámetros de procesamiento fueron 110 min. a 10 kV. Después del
procesamiento, se realizó la corrección de la interferencia
cruzada, el suavizado de los picos y la corrección de la
interferencia cruzada usando el software Genetic Profiler, versión
1.0 compilación 20001017 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA),
y los electroferogramas generados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñaron sondas tipo cerradura lineales
(5-'3') que contenían grupos fluorescentes en los extremos que
contenían la secuencia de pinza para los loci SNP 34 y 39 descritos
en el Ejemplo 2, para demostrar experimentalmente la formación
específica de pinzas bloqueadas, en base a la incidencia de FRET
(transferencia de energía de resonancia de fluorescencia), que
puede registrarse por un aparato de PCR a tiempo real. El fundamento
subyacente a este procedimiento es que sucede FRET cuando los
fluoróforos donante y aceptor unidos a las respectivas secciones de
pinza de las sondas tipo cerradura directa e inversa están en
cercana proximidad cuando se forma la pinza, provocando FRET del
fluoróforo donante al aceptor que se registra.
A la inversa, cuando las sondas tipo cerradura
no se unen en sus respectivas secciones de pinza, no sucede dicha
transferencia de energía y no se observa señal fluorescente (o una
inferior) del colorante aceptor.
La sonda directa marcada con fluoróforo del
locus SNP 34 está marcada con Rojo de Metilo en su extremo 3'. {SEC
ID 67}. Esta sonda se menciona como sonda FRET tipo cerradura 1. La
sonda tipo cerradura inversa (del alelo A) del locus SNP 34 está
marcada con HEX en su extremo 5'. {SEC ID 63}. Esta sonda se
menciona como sonda FRET tipo cerradura 1A.
La sonda tipo cerradura inversa (del alelo G)
del locus SNP 34 está marcada con HEX en su extremo 5'. {SEC ID
64}. Esta sonda se menciona como sonda FRET tipo cerradura 1B. La
sonda directa marcada con fluoróforo del locus SNP 39 está marcada
con Rojo de Metilo en su extremo 3'. {SEC ID 68}. Esta sonda se
menciona como sonda FRET tipo cerradura 2. La sonda tipo cerradura
inversa (del alelo T) del locus SNP 39 está marcada con HEX en su
extremo 5'. {SEC ID 65}. Esta sonda se menciona como sonda FRET tipo
cerradura 2A.
La sonda tipo cerradura inversa (del alelo G)
del locus SNP 39 está marcada con HEX en su extremo 5'. {SEC ID
66}. Esta sonda se menciona como sonda FRET tipo cerradura 2B.
Se han usado las siguientes sondas:
Mezclar cantidades equimolares de las sondas
FRET tipo cerradura (1 y 1A) o (1 y 1B) y someterlas a las
condiciones de hibridación descritas en el Ejemplo 6 permite
controlar si tiene lugar la hibridación de las pinzas y, si lo
hace, a que temperatura.
Asimismo, mezclar cantidades equimolares de las
sondas FRET tipo cerradura (2 y 2A) o (2 y 2B) y someterlas a las
condiciones de hibridación descritas en el Ejemplo 6 permite
controlar si tiene lugar la hibridación de las pinzas y, si lo
hace, a que temperatura.
A la inversa, no se espera que la mezcla de
cantidades equimolares de las sondas FRET tipo cerradura 1 + 2A o
1 + 2B produzca una sonda tipo cerradura específica para el locus 34
o 39, porque no se espera que tenga lugar la hibridación específica
de sus secciones de pinza. Se aplica lo mismo a la combinación de
sondas FRET tipo cerradura 2 + 1A o 2 + 1B cuando se mezclan en
cantidades equimolares y se someten a las condiciones de
hibridación descritas en el Ejemplo 6.
La Figura 3 muestra los perfiles de intensidad
de fluorescencia esperados del fluoróforo aceptor HEX que se espera
para las combinaciones de sondas mencionadas anteriormente, que
consta de 2 ciclos de desnaturalización e hibridación
repetidos.
El experimento se ha realizado de acuerdo con
las condiciones descritas en el Ejemplo 6, con la única excepción
de que la concentración de las sondas tipo cerradura directa e
inversa se aumentaron hasta 1,0 pmol/\mul en lugar de 0,05
fmol/\mul para cumplir los requisitos de sensibilidad de detección
del detector, el detector de tiempo real ABI PRISM 7700. Aunque
esta diferencia de concentración puede influir en la eficacia de la
hibridación de la pinza, no es probable que afecte a su
especificidad, no la temperatura a la que sucede la formación de la
pinza.
La Figura 5 demuestra los experimentos en los
que se mezclaron partes específicas de alelo marcadas con HEX 5' de
sondas tipo cerradura (1b y 2b) con partes específicas de locus
marcadas con rojo de metilo 3' de sondas tipo cerradura (1 y 2). Si
se forma una pinza, el rojo de metilo entre en cercana proximidad
del marcador HEX e inactiva su emisión a 556 nm. Las pinzas deben
formarse entre 1b y 1 y entre 2b y 2, y no entre 1b y 2 o 2b y
1.
La emisión de HEX se midió en 50 \mul de una
solución de oligo 1 \muM, con el Detector de Secuencia ABI
PRISM^{TM} 7700, usando la señal sin procesar en el recipiente de
longitud de onda 11 al final de cada etapa de temperatura. La
emisión se representa como el porcentaje de la emisión obtenida
cuando se mide el oligo marcado con HEX por separado, en los dos
últimos ciclos del siguiente perfil: 2' 94ºC; 10 * [15'' 94ºC; 60'
60ºC]; 11 * [15'' 94ºC; 30'' 90ºC; 30'' 85ºC; 30'' 80ºC; 30'' 75ºC;
30'' 70ºC; 30'' 65ºC; 15'' a 50'15'' (5' de aumento cada ciclo)
60ºC] seguido de mantenimiento a 25ºC.
La Figura 5 demuestra claramente la
especificidad de la formación de pinza de los pares de sondas que
aparean 1 + 1B (Figura 5A) y 2 + 2B (Figura 5B), pero no entre los
pares de sondas que no aparean 1B + 2 (Figura 5A) o 2B + 1 (Figura
5B). Además, en la Figura 5 se muestra que la formación de pinza
empieza teniendo lugar a aproximadamente 90ºC, que está en línea
con la elevada temperatura de fusión de las pinzas, y se completa a
aproximadamente 70-75ºC en el proceso de
termociclado.
\vskip1.000000\baselineskip
Para comparar el funcionamiento de sondas tipo
cerradura en ensayos de ligamiento con el de sondas tipo candado,
se seleccionaron 4 SNP diferentes (A, B, C, D) y para cada uno se
diseñó una sonda tipo candado y una sonda tipo cerradura. Las
sondas tipo cerradura se solicitaron a la misma compañía que las
sondas tipo candado (Metabion). Se hizo una selección de SNP bien
conocidos derivados de 4 líneas de tomate de modo que para cada
alelo se obtuviera al menos un valor positivo. Los resultados
obtenidos con 100 ng de ADN genómico y 0,5 fmol de cada sonda
específica de alelo se dan en la Figura 2. Es claramente visible la
formación de concatémeros cuando se usan sondas tipo candado a 160
y 240 pb (concatémeros de longitud de sonda tipo candado 80). Los
concatémeros están ausentes cuando se usan las sondas tipo
cerradura.
\vskip1.000000\baselineskip
Para demostrar la viabilidad del enfoque de
ligamiento con agente de segmentación, se extendieron las sondas
inversas de la Tabla 3 (tipo cerradura nº 02W661, 02W662, 02W663,
02W664, 02W665, 02W666, 02W667, 02W668, 02W669, 02W670) en su
extremo 5' con una región adicional que tiene la secuencia
"CACAC". Las sondas extendidas se combinaron con las sondas
directas de la Tabla 3 y se sometieron a un protocolo de hibridación
y ligamiento donde se añaden enzimas (tanto ligasa como agente de
segmentación (obtenidas de Third Wave Inc. y usadas "como
tales" en cantidades que varían entre 1 y 10 microlitros)). La
mezcla resultante se incuba en un termociclador (Perkin Elmer) con
las siguientes condiciones de ciclado: 4 minutos a 94ºC + 240
minutos a 60ºC + 4ºC continuamente. Posteriormente, la mezcla se
amplifica en las condiciones descritas en el Ejemplo 6. Se
encontraron los productos esperados, es decir, las sondas ligadas
con las longitudes correspondientes a los resultados obtenidos con
las sondas inversas de la Tabla 3 que no se extendieron, lo que
indica que la etapa de escisión y la etapa de ligamiento fueron
exitosas, lo que indica que el método funciona. Se realizaron
experimentos en ausencia de (combinaciones de) enzimas. Estos
experimentos demostraron que ambas enzimas son necesarias para que
este tipo de sonda llegue a ser una sonda ligada.
Claims (29)
1. Un par de sondas oligonucleotídicas (K) que
comprende:
a) una primera sonda oligonucleotídica (P1) que
comprende una primera sección de pinza (C1), que es capaz de
hibridar con una segunda sección de pinza (C2) de una segunda sonda
oligonucleotídica (P2), y una primera sección diana (T1) en su
extremo 3' que es capaz de hibridar con una primera sección (S1) de
una secuencia de ADN diana (D) a detectar;
b) una segunda sonda oligonucleotídica (P2) que
comprende una segunda sección de pinza (C2), que es capaz de
hibridar con la primera sección de pinza (C1) de la primera sonda
oligonucleotídica (P1), y una segunda sección diana (T2) en su
extremo 5' que es capaz de hibridar con un segunda sección (S2) de
la secuencia de ADN diana (D) a detectar;
donde la primera y la segunda secciones (S1, S2)
de la secuencia de ADN diana (D) están localizadas esencialmente
adyacentes entre sí en la secuencia de ADN diana (D), donde el
extremo 3' de la primera sección diana (T1) y el extremo 5' de la
segunda sección diana (T2) son capaces de ligarse entre sí cuando el
extremo 3' de la primera sección diana (T1) y el extremo 5' de la
segunda sección diana (T2) están hibridados con S1 y S2.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un par de sondas oligonucleotídicas de
acuerdo con la reivindicación 1, donde las secciones de pinza (C1,
C2) tienen una temperatura de fusión Tm_{c} que es mayor que la
temperatura de fusión Tm_{t} de cada una de las secciones diana
(T1, T2).
3. Un par de sondas oligonucleotídicas de
acuerdo con la reivindicación 2, donde la Tm_{c} de las secciones
de pinza C1/C2 es al menos 1ºC, preferiblemente 5ºC, más
preferiblemente 10ºC, mayor que la Tm_{t} más elevada de las dos
secciones diana T1 y T2.
4. Un par de sondas oligonucleotídicas de
acuerdo con la reivindicación 1-3, donde el
contenido de GC de la sección de pinza varía de más del 50 al 100%,
preferiblemente más del 60%, más preferiblemente más del 70%, mucho
más preferiblemente más del 80% y está preferiblemente en el
intervalo del 90-100%.
5. Un par de sondas oligonucleotídicas de
acuerdo con la reivindicación 1-4, donde la sección
de pinza comprende, al menos uno, preferiblemente al menos uno, más
preferiblemente al menos 2, 3, 4, 5 nucleótidos seleccionados entre
el grupo compuesto por G y C, más que cada una de las secciones
diana T1 p T2 de longitud comparable.
6. Un par de sondas oligonucleotídicas de
acuerdo con la reivindicación 1-3, donde las
secciones de pinza C1 y/o C2 comprenden nucleótidos que tienen una
afinidad de unión aumentada en comparación con nucleótidos
convencionales.
7. Un par de sondas oligonucleotídicas de
acuerdo con la reivindicación 1-6, donde la sección
de pinza comprende de 10 a 30, preferiblemente de 15 a 25, más
preferiblemente de 18 a 24 nucleótidos.
8. Un par de sondas oligonucleotídicas de
acuerdo con la reivindicación 7, done las secciones diana comprenden
cada una independientemente de 15 a 30, preferiblemente de 20 a 25
nucleótidos.
9. Un par de sondas oligonucleotídicas de
acuerdo con la reivindicación 1-8, donde al menos
una de las sondas oligonucleotídicas contiene al menos un sitio de
unión de cebador (B1, B2).
10. Un par de sondas oligonucleotídicas de
acuerdo con la reivindicación 1-8, donde las sondas
oligonucleotídicas contienen al menos una secuencia rellenadora
(R1, R2).
11. Un par de sondas oligonucleotídicas de
acuerdo con la reivindicación 1-8, donde la sección
diana (T1, T2) contiene al menos un nucleótido específico de
alelo.
12. Un par de sondas oligonucleotídicas de
acuerdo con la reivindicación 11, donde el nucleótido específico de
alelo está localizado en el extremo de una sección diana del par de
sondas.
13. Un par de oligonucleótidos de acuerdo con la
reivindicación 11 ó 12, donde se proporciona al menos una sonda
adicional (P3) que contiene una sección diana (T3) que contiene un
nucleótido específico de alelo adicional y donde la sonda (P3) se
distingue de P1 y/o P2.
14. Un par de sondas oligonucleotídicas de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde
la primera o la segunda sonda comprende una región adicional que no
es capaz de hibridar con la secuencia de ácido nucleico diana,
estando localizada dicha región adicional en el extremo de la
primera o la segunda sonda en la posición del sitio de unión entre
la primera y la segunda secciones de la secuencia del ácido
nucleico diana.
\newpage
15. Un par de sondas oligonucleotídicas de
acuerdo con la reivindicación 14, donde la región adicional es
capaz de crear una estructura de escisión y por lo cual la
exposición de la estructura de escisión a un agente de escisión
provocará la escisión de la estructura de escisión cuando se incuben
la estructura de escisión y el agente de escisión en condiciones en
las que pueda suceder la escisión.
16. Un grupo que comprende al menos dos pares de
sondas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-15.
17. Un grupo de acuerdo con la reivindicación
16, donde las secciones de pinza C1 y C2 para cada par de sondas
están diseñadas de tal modo que, para cada par, la combinación de C1
y C2 forma una combinación única dentro del grupo de tal modo que
cada sonda, en circunstancias dadas, hibridará selectivamente con
otra sonda diferente del grupo.
18. Grupo de acuerdo con la reivindicación 17,
donde C1 y C2 contienen adicionalmente una secuencia única.
19. Método para la detección de una secuencia
nucleotídica diana (D) en una muestra, que comprende las etapas
de:
- proporcionar un par de sondas
oligonucleotídicas (K) definidas en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 - 15 a la muestra;
- permitir que las sondas hibriden con la
secuencia diana;
- opcionalmente, proporcionar un agente de
escisión y escindir cualquier estructura de escisión;
- ligar T1 y T2 cuando se localicen de forma
adyacente en la secuencia diana (D); y
- detectar la presencia o ausencia de cualquier
producto de ligamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Método de acuerdo con la reivindicación 19,
donde las sondas ligadas se amplifican antes de la detección.
21. Método de acuerdo con la reivindicación 19,
donde la secuencia diana se amplifica antes de la hibridación de
las sondas.
22. Método de acuerdo con la reivindicación
14-21, donde está presente más de una secuencia
nucleotídica diana (D1...Dn) en la muestra a analizar y donde se
proporciona más de un par de sondas oligonucleotídicas (K1...Kn),
correspondientes a D1...Dn.
23. Método de acuerdo con la reivindicación 19,
donde la sección de pinza C1/C2 de cada par de sondas
oligonucleotídicas (K1...Kn) contiene una secuencia única definida
en la reivindicación 17.
24. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde las sondas contienen una
secuencia única.
25. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde la detección se basa en la
longitud, en la secuencia y/o en la masa.
26. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde la secuencia diana se selecciona
entre el grupo de ADN, ARN, ARN poliA+, ADNc, ADN genómico, ADN
organular tal como ADN mitocondrial o de cloroplastos, ácido
nucleicos sintéticos, bibliotecas de ADN, bancos de clones o
cualquier selección o combinación de los mismos.
27. Conjunto de al menos tres oligonucleótidos
adecuados para el genotipado de SNP, que comprende:
- un par de sondas oligonucleotídicas de acuerdo con la reivindicación 1; y, al menos una tercera sonda oligonucleotídica (P3) que comprende la segunda sección de pinza (C2) que es capaz de hibridar con la primera sección de pinza (C1) de la primera sonda oligonucleotídica (P1) y la segunda sección diana (T2) que es capaz de hibridar con la segunda sección (S2) de la secuencia de ADN diana (D) a detectar;
donde la segunda sonda y la tercera sonda
contienen un nucleótido específico de alelo, preferiblemente
localizado en el extremo de una sección diana del conjunto de
sondas;
donde el nucleótido específico de alelo de la
segunda y la tercera sondas corresponde con los alelos del SNP a
detectar;
donde la segunda y la tercera sondas contienen
una sección adicional (rellenador) que discrimina entre los
productos de ligamiento (amplificados) de la primera sonda con la
segunda sonda y la tercera sonda.
\vskip1.000000\baselineskip
28. Kit que comprende al menos un par de sondas
definidas en cualquiera de las reivindicaciones
1-15.
29. Kit que comprende al menos un grupo de
sondas definidas en cualquiera de las reivindicaciones
16-18.
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Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1319718A1 (en) * | 2001-12-14 | 2003-06-18 | Keygene N.V. | High throughput analysis and detection of multiple target sequences |
| US7785843B2 (en) * | 2004-06-23 | 2010-08-31 | Sequenom, Inc. | Target-specific compomers and methods of use |
| KR20070083924A (ko) * | 2004-11-19 | 2007-08-24 | 와쿠나가 세이야쿠 가부시키 가이샤 | 핵산 검출용 핵산 단편 및 핵산 검출방법 |
| MX2012014917A (es) * | 2010-06-22 | 2013-03-18 | Univ Hawaii | Monitoreo en tiempo real, especifico de secuencia de la amplificacion isotermica mediada por asa (lamp). |
| JP2012050393A (ja) * | 2010-09-02 | 2012-03-15 | Sony Corp | 核酸等温増幅方法 |
| US9184099B2 (en) | 2010-10-04 | 2015-11-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Biosensor devices, systems and methods therefor |
| SG189839A1 (en) | 2010-10-04 | 2013-06-28 | Genapsys Inc | Systems and methods for automated reusable parallel biological reactions |
| US9399217B2 (en) | 2010-10-04 | 2016-07-26 | Genapsys, Inc. | Chamber free nanoreactor system |
| US8585973B2 (en) | 2011-05-27 | 2013-11-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Nano-sensor array |
| EP2714935B1 (en) * | 2011-05-27 | 2017-03-15 | Genapsys Inc. | Systems and methods for genetic and biological analysis |
| US9926596B2 (en) | 2011-05-27 | 2018-03-27 | Genapsys, Inc. | Systems and methods for genetic and biological analysis |
| EP2729580B1 (en) | 2011-07-08 | 2015-09-16 | Keygene N.V. | Sequence based genotyping based on oligonucleotide ligation assays |
| EP2785868B1 (en) | 2011-12-01 | 2017-04-12 | Genapsys Inc. | Systems and methods for high efficiency electronic sequencing and detection |
| WO2013106807A1 (en) * | 2012-01-13 | 2013-07-18 | Curry John D | Scalable characterization of nucleic acids by parallel sequencing |
| WO2013123220A1 (en) * | 2012-02-14 | 2013-08-22 | Cornell University | Method for relative quantification of nucleic acid sequence, expression, or copy changes, using combined nuclease, ligation, and polymerase reactions |
| WO2014152625A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Genapsys, Inc. | Systems and methods for biological analysis |
| WO2015089238A1 (en) | 2013-12-11 | 2015-06-18 | Genapsys, Inc. | Systems and methods for biological analysis and computation |
| EP3126523B1 (en) | 2014-04-01 | 2020-02-19 | Cornell University | Detection of dna methylation using combined nuclease ligation reactions |
| WO2015161054A2 (en) | 2014-04-18 | 2015-10-22 | Genapsys, Inc. | Methods and systems for nucleic acid amplification |
| US9856521B2 (en) * | 2015-01-27 | 2018-01-02 | BioSpyder Technologies, Inc. | Ligation assays in liquid phase |
| US10683534B2 (en) | 2015-01-27 | 2020-06-16 | BioSpyder Technologies, Inc. | Ligation assays in liquid phase |
| US11091810B2 (en) * | 2015-01-27 | 2021-08-17 | BioSpyder Technologies, Inc. | Focal gene expression profiling of stained FFPE tissues with spatial correlation to morphology |
| CN104450697B (zh) * | 2014-12-02 | 2017-01-11 | 中国科学院海洋研究所 | 一种与牡蛎抗病毒特性相关的snp标记及其应用 |
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