MX2012014917A - Monitoreo en tiempo real, especifico de secuencia de la amplificacion isotermica mediada por asa (lamp). - Google Patents

Abstract

Se describen diagnósticos a base de genes capaces de discriminar rápidamente cepas seleccionadas de un patógeno seleccionado de otras poblaciones dentro de la misma especie. Se puede lograr el monitoreo en tiempo real, específico de secuencia de LAMP de ADN a través del uso de sondas de oligonucleótido referidas como "sondas absorbentes". Las sondas absorbentes incluyen dos hebras de oligonucleótido, una que incluye un inhibidor (referido como la sonda inhibidora) y otra que incluye un Fluoróforo (referido como la sonda fluorescente). Resulta una señal fluorescente cuando se desplazan las dos hebras una de la otra durante la reacción de LAMP. Al monitorizar la fluorescencia emitida, se puede detectar la amplificación específica de secuencia.

Description

MONITOREO EN TIEMPO REAL, ESPECIFICO DE SECUENCIA DE AMPLIFICACION ISOTERMICA MEDIADA POR ASA (LAMP) Campo de la Invención Las bacterias patógenas son aquellas bacterias que provocan enfermedad en plantas, animales, y seres humanos. Debido a la diversidad de las bacterias patógenas, existe una gran variedad de bacterias patógenas y enférmedades acompañantes. Los ejemplos de estas enfermedades pueden incluir marchitamiento, putrefacción débil y tizón en plantas, parvovirus, giardia, y fiebre de las montañas rocosas en perros, y tuberculosis, pneumonía, y tétanos en seres humanos .

Antecedentes de la Invención Las enfermedades provocadas por patógenos bacterianos pueden provocar daño significativo a la propiedad y a la vida. Por ejemplo, Ralstonia solanacearum es un patógeno bacteriano que provoca marchitamiento en más de 200 especies vegetales. Una especie de este patógeno que afecta principalmente cultivos de patata, raza 3 biovar 2, se ha estimado que provoca daños de más de aproximadamente $950 millones cada año.

La desaceleración y prevención de la transmisión de enfermedades bacterianas comprende primero identificar la presencia de la bacteria patógena. Sin embargo, pueden ser Ref . : 237919 relativamente lentas las técnicas para la detección de bacterias patógenas. Adicionalmente , estas técnicas pueden ser incapaces de discriminar las especies seleccionadas de un patógeno bacteriano de otras especies . Como resultado de la incapacidad para identificar apropiadamente patógenos bacterianos, se pueden retrasar indebidamente las acciones para contener y erradicar epidemias .

Por lo tanto, existe interés significativo en desarrollar tecnologías de detección que serían capaces de detectar cepas seleccionadas de patógenos de forma rápida y que discriminen las sub-poblaciones de la cepa seleccionada de patógeno de otras poblaciones dentro de la misma especie.

Breve Descripción de la Invención En un aspecto, se proporcionan métodos para monitorizar la amplificación isotérmica mediada por asa (LAMP, por sus siglas en, inglés) de un ADN objetivo o diana. Los métodos comprenden en general proporcionar una mezcla de reacción de LAMP que comprende un ADN objetivo y uno o más cebadores de LAMP capaces de amplificar el ADN objetivo. Se puede adicionar una sonda absorbente a la mezcla de reacción de LAMP, donde la sonda absorbente comprende dos hebras de oligonucleótido, en donde una primera hebra de oligonucleótido comprende una sonda inhibidora colocada en un extremo 3 ' y en donde una segunda hebra de oligonucleótido de la sonda absorbente comprende un fluoróforo conjugado en un extremo 51. Una relación de la cantidad de la segunda hebra de oligonucleótido a la cantidad de la primera hebra de oligonucleótido que se adiciona a la mezcla de reacción de LAMP puede ser menos de 1:1. También se puede adicionar una ADN-polimerasa a la mezcla de reacción de LAMP que incluye la sonda absorbente. Se puede medir la fluorescencia emitida por la mezcla de reacción de LAMP que incluye la sonda absorbente y la ADN-polimerasa.

En otro aspecto, se proporcionan sondas absorbentes para monitorizar la amplificación isotérmica mediada1 por asa (LAMP) de un ADN objetivo. Las sondas comprenden típicamente una primera hebra de oligonucleótido que comprende una sonda inhibidora colocada en un extremo 3' de la hebra. Em algunas modalidades, la sonda comprende una segunda hebra de oligonucleótido que comprende un fluoróforo conjugado en un extremo 5' de la hebra. Adicionalmente, la relación de la cantidad de la segunda hebra de oligonucleótido a la , rimera hebra de oligonucleótido puede ser menor de 1:1 en algunas modalidades .

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es una ilustración esquemática de un circuito para un accionador láser para control de temperatura y fluorómetro para monitorizar las sondas de hibridación; La Figura 2 es una ilustración esquemática de fuentes de radiación en la plataforma basada en CD; La Figura 3A es una ilustración esquemática de una disposición de tarjeta de circuito para un fluorómetro habitual y accionador láser de una modalidad de la > presente descripción; La Figura 3B es una fotografía óptica1, de una tarjeta de circuito poblada para el fluorómetro habitual y accionador láser de la Figura 3A. El cabezal de pirómetro se ilustra adicionalmente por arriba de un CD de policarbonato; La Figura 4 es una fotografía óptica dé un CD impreso en ABS con concavidades de reacción de varios tamaños ; La Figura 5 es una gráfica de temperaturas corregidas de concavidad estimadas de un termómetro sin contacto (por ejemplo, pirómetro) en comparación a las temperaturas reales de concavidad medidas por un termopar. En el encarte se ilustran los datos de calibración usados para estimar los coeficientes para la transmisión de radiación a través de la concavidad y la reflexión de la radiación ambiente de la superficie de concavidad; La Figura 6 es una gráfica de mediciones de temperatura que muestra el control de temperatura en una concavidad de reacción desde aproximadamente temperatura ambiente a un punto de ajuste de aproximadamente 65 °C; La Figura 7 es una gráfica de fluorescencia relativa versus tiempo para LAMP de rsfliC con aproximadamente 0.4 µ? de una cremallera molecular; La Figura 8 es una gráfica de fluorescencia relativa versus tiempo que ilustra el monitoreo en tiempo real de la reacción de LAMP de rsfliC por adición de hebra de fluorescencia y hebra inhibidora directamente en la mezcla de reacción de LAMP antes de la formación de la estructura de cremallera molecular; La Figura 9 es una gráfica de fluorescencia relativa versus tiempo para LAMP de rsfliC y LAMP 1 de fase lambda con sonda absorbente dirigida a rsfliC (0.08 µ? de hebra de fluorescencia y 0.16 µ? de hebra inhibidora); La Figura 10 es una gráfica de fluorescencia relativa versus tiempo que ilustra el uso de , balizas moleculares para la detección de punto final de las amplificaciones de LAMP de rsfliC y observaciones de velocidad de la reacción de LAMP de rsfliC; La Figura 11 es una gráfica de fluorescencia relativa versus tiempo que ilustra la fluorescencia medida cuando se usan los conjuntos de cebadores rk2208.1 y, rsfliC en combinación con concentraciones incrementadas de ADN-polimerasa Bst; La Figura 12 es una gráfica de fluorescencia relativa versus tiempo que ilustra los incrementos observados de fluorescencia obtenidos usando el conjunto de cebadores rk2208.1 con concentraciones incrementadas de ADN-polimerasa Bst; La Figura 13 es una gráfica de tiempo para alcanzar un umbral de detección versus contenido de ADN-polimerasa Bst en los datos de la Figura 12; La Figura 14 es una gráfica de fluorescencia relativa versus tiempo para reacciones de LAMP 1 con el conjunto de cebadores rk2208.1, sin el cebador asa F, que se monitoriza con una sonda absorbente. La hebra de fluorescencia se proporcionó en concentraciones de aproximadamente 0.08 µ?, aproximadamente 0.4 µ?, y aproximadamente 0.8 µ? y se proporcionó la hebra inhibidora en concentraciones de aproximadamente 0.16 µ?, aproximadamente 0.8 µ?, y aproximadamente 1.6 µ ; i La Figura 15 es una gráfica de fluorescencia relativa versus tiempo para las reacciones de rk2208.1 LAMP con el cebador asa F con diferentes concentraciones de las sonda absorbente, hebras de fluorescencia y 1 hebras inhibidoras . La concentración de las hebras inhibidoras fue aproximadamente dos veces aquella de las hebras de fluorescencia; La Figura 16 es una gráfica de fluorescencia i relativa versus para reacciones de LAMP usando modalidades de la sonda absorbente de la presente descripción y tinte de intercalación (EvaGreen) ; La Figura 17 es una gráfica de fluorescencia relativa versus tiempo para reacciones multiplexadas de LAMP para Salmonella entérica y ADN genómicos de bacteriófago lambda; La Figura 18 es una gráfica de fluorescencia relativa observada usando ajustes espectrales para fluoresceína versus tiempo para reacciones multiplexadas de LAMP que amplifican Salmonella entérica y/o ADN genómicos de bacteriófago lambda que usan sondas absorbentes marcadas con fluoresceína para Salmonella entérica; y La Figura 19 es una gráfica de fluorescencia relativa observada usando ajustes espectrales para cy3 versus tiempo para reacciones multiplexadas de LAMP que amplifican Salmonella entérica y/o ADN genómicos de bacteriófago lambda que usan sondas absorbentes marcadas con cy3 paira fago lambda.

Descripción Detallada de la Invención Los términos "aproximadamente", "cerca de", y "sustancialmente" como se usan en la presente representan una cantidad cercana a la cantidad señalada que desempeña (aún una función deseada o logra un resultado deseado. Por ejemplo, los términos "aproximadamente" , "cerca de" , y "sustancialmente" pueden referirse a una cantidad que está dentro de menos de 10% de, dentro de menos de 5% de, dentro de menos de 1% de, dentro de menos de 0.1% de, o dentro de menos de 0.01% de la cantidad señalada.

Las modalidades de la descripción presentan diagnósticos a base de gen capaces de discriminar rápidamente cepas seleccionadas de patógenos seleccionados de otras poblaciones dentro de la misma especie. Los ejemplos pueden incluir, pero no se limitan a, bacteriófago lambda, capas I. raza 3 biovar 2 de Ralstonia solanacearum, Ralstonia solanacearum, Salmonella entérica, y Staphylococcus aureus. 1 El monitoreo en tiempo real, específico de secuencia de la amplificación isotérmica mediada por asa (LAMP, por sus siglas en inglés) de ADN objetivo se puede lograr a través de la adición de sondas de oligonucleótido, particulares, referidas en la presente como "sondas absorbentes" , a una mezcla que incluye cebadores de LAMP y el ADN objetivo.

Las sondas absorbentes por sí mismas pueden1 incluir dos distintas hebras de oligonucleótido. Una primera hebra de oligonucleótido puede incluir un inhibidor (referido como la sonda inhibidora) y una segunda hebra de oligonucleótido puede incluir un fluoróforo (referido como la sonda fluorescente) . Resulta una señal fluorescente cuando 'las dos hebras se desplazan una de la otra durante la reacción de LAMP. Al monitorizar la fluorescencia emitida, se puede detectar la reacción de LAMP.

Adicionalmente, las modalidades de las sondas absorbentes pueden incluir hebras que experimentan desplazamiento sustancial cuando se presenta la amplificación de un ADN objetivo, seleccionado. Por lo tanto, las sondas absorbentes no pueden emitir sustancialmente fluorescencia cuando no se presenta la amplificación del ADN objetivo y pueden emitir sustancialmente fluorescencia cuando se presenta la amplificación del ADN objetivo. De esta manera, puede ser específica de la secuencia a la detección de la amplificación del ADN objetivo.

Como se usa en la presente, el término sonda absorbente puede adoptar su significado habitual como se entiende por un experto en la técnica y puede referirse adicionalmente a la sonda fluorescente y a la sonda absorbente cuando no se hibridan entre sí y también cuando se hibridan conjuntamente la sonda fluorescente y la sonda absorbente .

Como se analiza en mayor detalle más adelante, la presencia de las sondas absorbentes dentro de la mezcla de reacción de LAMP puede desacelerar la velocidad a la cual prosigue la reacción de LAMP. Sin embargo, se han identificado parámetros de las sondas absorbentes que reducen el efecto de la sonda absorbente en la velocidad de reacción de LAMP debido a la presencia de la sonda absorbente. Estos parámetros incluyen, pero no se limitan a, la relación de la sonda fluorescente a la sonda inhibidora, la manera de mezclar las hebras (la sonda fluorescente y la sonda inhibidora) para crear la sonda absorbente, y la cantidad total de la sonda absorbente. Al reducir los efectos de la sonda absorbente en la velocidad de reacción de LAMP, se facilita el monitoreo en tiempo real de la reacción de LAMP. Estos parámetros también se pueden variar dentro de intervalos seleccionados para reducir el tiempo requerido para detectar las reacciones de LAMP, que facilita adicionalmente la detección en tiempo real .

Las modalidades de las sondas absorbentes diseñadas para separar las reacciones de LAMP se pueden usar también para la detección en tiempo real de más de una secuencia génica única (detección multiplexada) . A fin de realizar la detección multiplexada de reacciones de LAMP en tiempo real, cada sonda absorbente puede emplear un fluoróforo espectralmente único que se puede monitorizar en forma independiente.

Las modalidades adicionales de la descripción presentan una plataforma de equipo a base de substrato que facilita la aplicación de estos diagnósticos basados en genes en tiempo real. En algunas modalidades, la plataforma incluye un disco compacto (CD) u otro substrato grabado con patrones con concavidades para realizar reacciones de LAMP. En algunas modalidades, se puede emplear un pirómetro como un sensor de temperatura sin contacto para monitorizar la temperatura dentro de las concavidades de reacción de la plataforma a base de substrato. El pirómetro puede estimar la temperatura dentro de las concavidades de reacción del substrato a base de las mediciones de la radiación térmica emitida de la concavidad de reacción. Adicionalmente se desarrolla un procedimiento de calibración para corregir errores en la temperatura medida por el pirómetro debido a la presencia de agua y una película transparente que sella las concavidades de reacción. Estas mediciones de temperatura se pueden usar adicionalmente para controlar una fuente de calentamiento. De esta manera, la temperatura dentro de las concavidades de reacción se puede mantener aproximadamente constante para las reacciones de LAMP que se presentan en las mismas.

Provechosamente estas herramientas pueden facilitar la discriminación exacta de patógenos, y por ejemplo, permitir que se hagan decisiones oportunas de manejo en respuesta a la introducción de la enfermedad. Se puede entender que las modalidades descritas pueden ser útiles en muchos otros contextos, igualmente, incluyendo, pero no limitado a, diagnósticos clínicos, tal como en escenarios de bajos recursos, e identificación de agentes biológicos por personal de seguridad nacional y militar.

En una modalidad, se proporciona un método de detección en tiempo real de secuencias seleccionadas > de ADN por LAMP. El método puede comprender formar patrones en un substrato seleccionado (por ejemplo, un CD) para formar concavidades de reacción. El método puede comprender además adicionar una mezcla de reacción de LAMP y una sonda absorbente, como se describe en la presente, a las concavidades de reacción. El método puede comprender adicionalmente sellas las concavidades y adicionar1 un ADN objetivo a las concavidades. El método puede comprender adicionalmente calentar los contenidos de las concavidades con una fuente de calor (por ejemplo, un láser) a una temperatura suficiente para inducir fluorescencia. El método puede comprender también detectar la fluorescencia.

Diseño del Equipo Físico Los procesos de LAMP se pueden llevar a cabo en un substrato que comprende una pluralidad de concavidades para las reacciones individuales de LAMP. El substrato puede ser de cualquier material conocido en la técnica, tal como plástico, metales, o productos compuestos. En algunas modalidades, se puede usar una plataforma de disco compacto (CD) para llevar a cabo procesos de Amplificación Isotérmica Mediada por asa (LAMP, por sus siglas en inglés) para amplificación y detección de ADN. La plataforma de CD ¡permite la automatización de los pasos de reacción y de preparación de muestra, así como proporciona buena contención. Aunque se describe en general en la presente en términos 1 de un substrato de CD, se pueden usar otros substratos que proporcionen una pluralidad de concavidades de reacción.

Se realizan las reacciones de LAMP dentro de las concavidades de reacción contenidas dentro del CD u otro substrato. En ciertas modalidades, las concavidades de reacción se pueden fabricar por grabado de patrones . Los patrones en el substrato, tal como los CD, se pueden crear por mecanismos que incluyen, pero no se limitan a, láser y/o impresión para formación rápida de prototipos, moldeo por inyección para producción en volumen, y otros mecanismos para grabar con patrones discos compactos y otro substrato1 como se conoce en la técnica.

Por ejemplo, en una modalidad, se pueden crear patrones usando un grabador láser (por ejemplo, Venus-30, GCC Systems, Taipei Hsien, Taiwan) en discos de policarbonato negro (por ejemplo, Lexan) . En otra modalidad, los discos de policarbonato sin trabajar se pueden grabar con patrones con una máquina de control numérico por computadora (CNC) . En una Í modalidad adicional, se pueden producir discos de acrilonitrilo-butadieno-estireno (ABS) grabados con patrones en su totalidad usando una impresora 3D (por ejemplo, SST 1200, Dimensión Inc, Edén Prairie MN) . La forma en, sección transversal de los discos se puede fabricar de acuerdo con la aplicación deseada. Por ejemplo, en ciertas modalidades, se pueden fabricar las concavidades en una configuración cilindrica que tiene una sección transversal en ¡ general circular .

En algunas modalidades, el espesor de los substratos empleados para monitoreo de LAMP puede estar dentro del intervalo entre aproximadamente 1.2 mm a aproximadamente 1.8 mm. Sin embargo, se puede entender que se pueden formar modalidades de los substratos a partir de materiales tal como otros polímeros como se conoce en la técnica, sin límite.

El área de sección transversal de las concavidades de reacción también se puede variar, como sea necesario. Por ejemplo, en modalidades de concavidades que tienen configuraciones cilindricas con una sección transversal en general circular, se puede variar el diámetro de la concavidad de reacción en base a la reacción particular realizada en la concavidad, sin límite. En algunas modalidades. El valor del diámetro de la concavidad puede ser de aproximadamente 3 mm a aproximadamente 4 mm, o cualquier valor entre estos.

En ejemplos adicionales no limitantes, una más de las concavidades de reacción pueden estar circundadas por una o más de una pared y un canal. De forma benéfica, la presencia de la pared y/o canal puede mejorar el aislamiento alrededor de una concavidad de reacción. El valor del , espesor de pared, en ciertas modalidades, se puede seleccionar dentro del intervalo entre aproximadamente 0.5 mm a 5 mm. El valor del espesor de canal, en ciertas modalidades, se puede seleccionar para tener un valor dentro del intervalo de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 5 mm. Sin embargo, se puede entender que el espesor de pared y el espesor de canal se pueden seleccionar para adoptar cualquier valor adecuado para el monitoreo por LAMP, como sea necesario. A menos que se señale de otro modo. El espesor de la concavidad de reacción y el espesor de canal, empleados en los ejemplos analizados más adelante, fueron respectivamente, aproximadamente 1 mm y aproximadamente 2. En algunas modalidades, la profundidad de la concavidad de reacción y canal se puede seleccionar para retener 5mm, 4mm, 3mm, 2mm, lmm, 0.5mm, 0.3 mm o menos de material de substrato bajo la concavidad de reacción y/o canal. En los ejemplos posteriores, la profundidad de la concavidad de la reacción y canal se seleccionó para retener aproximadamente 0.3' mm del espesor de un material de disco bajo la concavidad de reacción.

La temperatura del CD u otros substratos se puede registrar usando un sensor de temperatura sin contacto. En una modalidad, el sensor de temperatura sin contacto puede comprender un pirómetro que incluye una fuente de luz y un detector. Por ejemplo, se puede unir un pirómetro comercial con un cabezal óptico miniatura a un cable flexible (por ejemplo (por ejemplo, MID20LTCB3 , Raytek, Santa Cruz, CA) . De manera alternativa, se puede montar un tipo monolítico (por ejemplo MLX90614ESF-BAA, Melexis, leper Bélgica) directamente en una tarjeta de circuitos adyacente a la colocación de la concavidad de reacción. Para calibración, la temperatura normal se puede registrar usando un termopar (por ejemplo, un termopar tipo K producido de alambre fino de termopar, por ejemplo, Omega Engineering, Stamford, CT) . El alambre de termopar se puede conectar a un multicentro compensado por software (por ejemplo, Fluke 186, Everett, WA) .

Como se describe en mayor detalle más adelante, a fin de facilitar la calibración del sensor de temperatura sin contacto, las concavidades se pueden rellenar sustancialmente con agua destilada (u otro líquido no reactivo) y cubrir con una película transparente con respaldo adhesivo (por ejemplo, sellos adhesivos Microseal 'B', Bio- ad, Hercules CA) . Provechosamente, al calibrar el sensor de temperatura sin contacto para compensar los efectos de los líquidos no emisores y películas en la concavidad de reacción, se puede controlar de forma más precisa la temperatura dentro1 de las concavidades de reacción.

Mediante una fuente de calor también se puede realizar el calentamiento de las concavidades de reacción. Las fuentes de calor pueden incluir, pero no se limitan a, fuentes de contacto y sin contacto, como se conoce1 en la técnica. En una modalidad, la fuente de calor puede comprender un dispositivo óptico de calentamiento. Por ejemplo, el dispositivo óptico puede comprender un láser desfocado que se dirige a la parte inferior de las concavidades de reacción. Por ejemplo, se puede lograr el calentamiento al usar un módulo de diodos láser infrarrojo de 808 nm (por ejemplo, icetec-UK) que opera aproximadamente 150 m dirigido a aproximadamente sobre la parte inferior de la concavidad. El láser se puede desenfocar aproximadamente para inhibir el quemado del disco y para distribuir uniformemente el calor en la concavidad. La potencia del láser se puede controlar a través de un MOSFET n-canal accionado por un optoacoplador lógico (ver Figura 1) accionado por señal modulada por ancho de impulso (P M, por sus siglas en inglés) desde un micro-controlador (por ejemplo, Fox LP3500 Rabbit Semiconductor, Davis, CA) .

Para proporcionar control de temperatura, y el controlador se puede programar con una rutina de control proporcional- integral , modificada usando retroalimentación del pirómetro. La retroalimentación del pirómetro sé puede recibir por el micro-controlador después de que se aplica una corrección de calibración, como se describe más adelante. Para realizar la detección óptica de temperatura, la muestra se puede iluminar en forma oblicua, por ejemplo, por una fuente de luz de alta intensidad que tiene una longitud de onda seleccionada. En una modalidad, la fuente de luz puede comprender un diodo emisor de luz azul (LED) que emite luz a una longitud de onda selecciona dentro del intervalo entre aproximadamente 450 nm a aproximadamente 475 nm (por ejemplo, aproximadamente 470 nm) . Un ejemplo de una fuente de luz de LED capaz de esta iluminación es HLMP CB28 STD00, fabricado por Agilent Technologies, Santa Clara, CA.

La radiación térmica emitida de la concavidad de reacción se puede detectar por un detector. En una modalidad, el detecto puede comprender un fotodiódo colocado adyacente a la fuente de luz . El detector se puede montar para recolectar la radiación térmica desde la fuente de la concavidad que ha viajado a través del agua y la película transparente. El detecto se puede operar usando un circuito de fotoamplificador de alta ganancia (por ejemplo, T-5 Series, Intor Inc., Socorro NM) que opera entre el intervalo entre aproximadamente 1010 V/A - 1012 V/A, como se ilustra en la Figura 1. Los espectros de excitación y emisión medidos por el detector se pueden ajustar usando filtros de interferencia de pasabanda estrecha (por ejemplo, Intor) . Sin embargo, se puede entender que en modalidades alternativas, se puede usar un sensor de temperatura de contacto en lugar de o en unión con el detector de fotodiódo, descrito anteriormente.

Calibración de Sensor de Temperatura sin Contacto Un sensor de temperatura sin contacto sé puede seleccionar para medición de temperatura en el sistema para impedir contaminación, tal como en la plataforma de CD desechable. Por ejemplo, se puede emplear un pirómetro como el sensor de temperatura sin contacto. Sin embargo, el detector mide la radiación térmica emitida desde la fuente de la concavidad de reacción a fin de determinar la temperatura en el área sondeada (por ejemplo, una temperatura de una concavidad individual o temperatura promedio de un grupo seleccionado de concavidades) . Esta radiación térmica pasa a través del líquido de reacción (por ejemplo, el agua) y el material empleado para sellar las concavidades (por ejemplo, la película transparente), la presencia de la película. Sin que se limite por teoría, se cree que, puesto que estos materiales poseen baja emisividad, pueden introducir reflexiones en la radiación que se origina desde dentro de la concavidad así como la radiación térmica del ambiente circundante. Como resultado, estos materiales ¡ pueden introducir errores en la temperatura calculada de la radiación térmica medida por el pirómetro.

El pirómetro se puede calibrar para corregir estos errores. Como se analiza más adelante, la temperatura dentro de una concavidad de reacción, como una función de diferentes potencia ópticas de la fuente de calentamiento en el estado estable, se puede medir usando el pirómetro, así como termopares en contacto con la concavidad de reacción. Estas mediciones se pueden introducir en un modelo de calibración que calcula la temperatura correcta de una concavidad de reacción en base a la temperatura medida por él pirómetro.

Un sistema 200 de detección a base de CD se ilustra esquemáticamente en la Figura 2 junto con fuentes de radiación. El sistema 200 incluye un substrato 202 (por ejemplo, un disco de plástico tal como policárbonato, Acrilonitrilo-Butadieno-Estireno (ABS) , u otro material adecuado de plástico) que tiene una o más concavidades de reacción 204. Se puede colocar una película transparente 206 sobre la concavidad de reacción 204 para inhibir qué entren los contaminantes a las concavidades de reacción 204.

Se puede colocar un detector 210 por arriba del substrato 202 para medir la radiación térmica emitida desde el substrato 202. En algunas modalidades, el detector 210 puede comprender un pirómetro. Se puede emplear un modelo de calibración para corregir los errores en las mediciones de temperatura del detector 210 debido a la transmisión de la radiación térmica a través de materiales dentro ! de la concavidad de reacción (por ejemplo, la mezcla de reacción de LAMP, película protectora que cubre la concavidad) y la absorbancia de fluorescencia incidente por el substrato mismo. Como se ilustra en la Figura 1, Ec es la radiación térmica que se absorbe en el substrato 202 desde la fuente de calor para controlar la temperatura de la concavidad de reacción 204. ET es la radiación térmica emitida desde la superficie de la concavidad de reacción 204. Et es la porción de la radiación térmica desde la superficie de la concavidad de la reacción 204 que se transmite a través de la concavidad de reacción 204 y la película transparente 206 para alcanzar el detector 210. Eamb es la radiación térmica emitida ¡desde el ambiente circundante que golpea en la película transparente 206. Er es la porción de la energía térmica ambiente que se refleja al detector 210. En una modalidad, el modelo de calibración puede asumir que sustancialmente toda la radiación que se origina de la superficie de la concavidad de reacción 204 o del ambiente circundante y se detecta en el detector 210 después de cruzar a través de ya sea el, agua en la concavidad de reacción 204 y la película transparente 206 o después de reflejarse de estas superficies.

Las soluciones de las ecuaciones de Maxwell bajo estas circunstancias dan por resultado los coeficientes de reflexión y de transmisión que se relacionan , a las impedancias de onda normalizadas de los varios materiales en sus respectivos límites . Estas impedancias de onda se relacionan a su vez a las permicividades eléctricas respectivas y las permeabilidades magnéticas respectivas de los materiales a través de los cuales pasa la onda. El resultado neto es que una fracción, a, de la radiación térmica total que se origina de la concavidad de reacción 204 alcanza el detector 210 y una fracción, b, de la radiación térmica total que se origina del ambiente circundante se refleja lejos de la concavidad de reacción 204 para alcanzar el detector 210.

De la ley de Stefan-Boltzmann aplicada a un cuerpo gris, la energía térmica total emitida por un cuerpo E, se relaciona a la emisividad, e, del material y la temperatura absoluta T de la superficie de la película transparente 206 de acuerdo a la Ecuación 1 : E = es?4 (1) donde s es la constante de Stefan-Boltzmann. El detector 210 puede estimar la temperatura de la superficie de la película transparente 206 en base a la radiación térmica que alanza el detector del pirómetro 210, asumiendo una emisividad seleccionada del material. La energía térmica total que alcanza el detector del pirómetro 210, E, se puede usar para calcular la temperatura indicada i de acuerdo a la Ecuación 2 : Ei = Et + Er (2) Et es la radiación térmica que se origina de la concavidad de reacción 204 que alcanza el pirómetro de detector 210 después de la transmisión a través del volumen del material de reacción dentro de la concavidad de reacción 204 y la película transparente 206. Er es la energía térmica del ambiente circundante que alcanza el detector del detector 210 después de reflejarse de la superficie de la película transparente 206 (ver, por ejemplo, Figura 2) .

Aplicando la ley de Stefan-Boltzmann, y los coeficientes empíricos a y b de lo anterior a cada uno de los términos en la ecuación precedente, se puede obtener la Ecuación 3 : ¡ sset s??4 = aeweii s?4 + b amb s T arab (3) eset es el ajuste de emisividad del detector 210. En ciertas modalidades, un valor por defecto se puede asumir para set (por ejemplo, aproximadamente 0.95) . Sin embargo, se pueden adoptar otros valores de emisividad, dependiendo del detector 210. ewen es la emisividad de la superficie de la concavidad de reacción. eamb es la emisividad de los materiales circundantes a temperatura ambiente Tamt>.

Las temperaturas Ti, Tamb, y T pueden estar i relacionadas entre sí. Por ejemplo, al re-arreglar la Ecuación 3, Ti se puede expresar en términos de amb, T, y los coeficientes empíricos, referidos como A y B, y el ambiente, incluyendo correcciones para las pérdidas de transmisión y/o reflexión: Ti = AT4+BTabm4 (4a) A = (a weii) / set) (4b) B = (beabi) / set) (4c) Los coeficientes empíricos A y B representan las relaciones de las emisividades del sistema (por ejemplo, la concavidad) y se · pueden determinar al realizar una regresión lineal de la cuarta potencia de las temperaturas indicadas Ti como una función de la cuarta potencia de los valores verdaderos T de la concavidad, a una temperatura ambiente constante Tamb. La solución de la Ecuación 4a para la temperatura real T de concavidad produce los coeficientes A y B. Estos coeficientes a su vez se pueden usar para estimar T a partir de una lectura de termoeratura de detector, determinada de De esta manera, el detector 210 se puede calibrar para mejorar la exactitud de las mediciones de temperatura sin contacto. Sin embargo, en otras modalidades, las mediciones de temperatura se pueden obtener por otros mecanismo, tal como por un termopar en contacto con la concavidad de reacción.

Fluorómetro y Accionador Láser La Figura 3A es una ilustración esquemática de una disposición de tarjeta de circuitos para un fluorómetro y accionador láser habituales de una modalidad de la presente descripción.

La Figura 3B es una fotografía de una tarjeta de circuitos, poblada, para un fluorómetro y accionador láser habituales de la Figura 3A. Se ilustra adicionalménte un cabezal de pirómetro por arriba de un CD de policarbonato . Detección y Amplificación Isotérmica Mediada por asa Se puede usar la amplificación mediada por asa (LAMP, por sus siglas en inglés) para lograr la replicación génica de forma isotérmica y sin desnaturalización del ADN de plantilla. La LAMP también puede amplificar su ADN objetivo sin lisar ni extraer células pero que da por resultado menor límite de detección. Las modalidades de LAMP se describen en detalle en los siguientes documentos, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

- N. Tsugunori, et al., "Asa -mediated isothermal amplification of ADN," Nucleic Acids Research, Vol . 28, No. 12, June 15, 2000.

- Y. Mori, et al., "Detection of asa -mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation, " Biochemical. Biophys . Res. Comm., Vol. 289, No. 1, p. 150-154, Nov. 23, 2001.

- K. Nagamine, "Isolation of single-stranded ADN from asa -mediated isothermal amplification products," Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 290, No. 4, p. 1195-1198, Feb 1, 2002.

- K. Nagamine, et al., Accelerated reaction by asa -mediated isothermal amplification using asa primers" , Molecular and Cellular Probes, Vol. 16, No. 3, p. 223-229, June 2002.

En una modalidad, LAMP puede emplear un conjunto de cuatro cebadores . Estos cuatro cebadores pueden reconocer seis distintas secuencias y dependen de las síntesis1 de ADN de desplazamiento de hebra de auto-ciclo, por ejemplo por el fragmento grande de ADN-polimerasa Bst. Los cebadores para la reacción de LAMP pueden ser los cebadores interiores (por ejemplo, FIP y BIP) y los cebadores exteriores (por ejemplo, F3 y B3) . La reacción de LAMP se puede iniciar por hibridación de cualquier cebador interior (por ejemplo, FIP o BIP) o su respectivo sitio de cebadura (por ejemplo, F2c o B2c) en el ADN objetivo o diana. El cebador exterior (por ejemplo, F3 o B3) híbrida secundariamente a su sitio de cebadura (por ejemplo, F3c o B3c) en el ADN objetivo inicia la síntesis de una nueva secuencia complementaria que desplaza las secuencias de ADN ya extendidas desde el cebador interior. El resultado es una secuencia de ADN que puede formar estructuras de tallo-asa en ambos extremos. Esta estructura auto-cebada tipo "pesa de gimnasio" es el material de inicio para la amplificación de auto-ciclo de LAMP.

La reacción de LAMP también se puede acelerar usando cebadores adicionales referidos como cebadores de asa. Los cebadores de asa pueden hibridar a las secciones de la asa que se transcribieron de la plantilla de ADN objetivo. Esta cebadura adicional puede acelerar la reacción de, LAMP y puede mejorar la selectividad de LAMP puesto que requiere la transcripción del material de inicio correcto. En ciertas modalidades, la reacción de LAMP se puede llevar a cabo bajo condiciones isotérmicas a valores de temperatura seleccionados dentro del intervalo deseado, por ejemplo entre aproximadamente 60 °C a aproximadamente 7Ó°C, o aproximadamente 60 °C a aproximadamente 65°C. Los productos de amplificación pueden ser ADN de tallo-asa, que poseen típicamente varias repeticiones invertidas del objetivo. O diana. Las repeticiones invertidas exhiben típicamente una estructura tipo coliflor con múltiples asas.

Se han desarrollado una variedad de mecanismos para detectar la amplificación positiva de ADN por LAMP. En un aspecto, la amplificación positiva de ADN se puede monitorizar en tiempo real usando tintes de intercalación tal como Verde SYBR o EvaGreenMR. Se conoce que el Verde SYBR tiene un efecto inhibidor para la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) o para la amplificación termófila dependiente de helicasa (tHDA) . En contraste, se ha reportado que EvaGreen tiene un menor efecto inhibidor para PCR y también se ha usado para detectar la reacción de LAMP. Sin embargo, como se analiza en mayor detalle más adelante, se puede observar un alto efecto inhibidor de EvaGreen para las i, reacciones de LAMP. Adicionalmente , este mecanismo no : permite una conformación específica de secuencia del producto t de ADN. Sin embargo, de forma notable, este mecanismo no permite la configuración específica de secuencia del producto de ADN. Más bien, la técnica detecta solamente amplificación positiva. '' ? 28 ? ?? En otra modalidad, una reacción de LAMP positiva se puede identificar al medir la turbidez blanca de la mezcla de reacción de LAMP. La turbidez blanca es indicativa de una reacción positiva de LAMP, puesto que el pirofosfato de magnesio es un subproducto de la reacción de LAMP. Sin embargo, en tanto que la turbidez puede proporcionar una indicación que se presenta una amplificación positiva, la turbidez misma no _ es un indicador concluyente ique una secuencia especifica de interés ha experimentado LAMP. Por lo tanto, la dependencia en la turbidez solo para determinar la especificidad de secuencia es susceptible a mayor proporción de positivos falsos.

Los métodos de detección basados en transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET, por sus siglas en inglés) tal como balizas moleculares,'1 sondas i Taqman, y cremalleras moleculares, son técnicas que proporcionan monitoreo en tiempo real, específico de secuencia de los procesos de amplificación de ADN. Una baliza i: molecular comprende una sonda de ácido nucleico que posee una I: estructura de tallo-asa auto-complementaria que se conjuga a una molécula fluorescente en un extremo y a una molécula i inhibidora en el extremo opuesto. En la ausencia, de una secuencia objetivo, no se emite fluorescencia, puesto que el inhibidor está cerca al fluoróforo debido a la secuencia de tallo-asa de complemento. Cuando la región de asa híbrida al objetivo o diana, el inhibidor y el fluoróforo se separan uno del otro y se puede detectar la emisión fluorescente.

Sin embargo, de forma notable, puede ser difícil el uso de balizas moleculares para monitorizar LAMP. Por ejemplo, las balizas moleculares pueden ser pobremente accesibles a los productos de dsDNA tal como ampli'Cones de LAMP bajo condiciones isotérmicas. Adicionalmente , eri general no se emplean sondas Taqman para detectar reacciones de LAMP puesto que la ADN-polimerasa Bst carece de actividad de exonucleasa. Sin embargo, se puede emplear cualquiera de estas técnicas en ciertas modalidades .

Las cremalleras moleculares son moléculas que comprenden un fragmento de ADN, corto, parcialmente de doble hebra. Una primera hebra de la cremallera molecular1 incluye un inhibidor en el extremo 31 y se puede refiere como una sonda inhibidora. Una segunda hebra de la cremallera molecular incluye una hebra parcialmente complementaria que tiene un fluoróforo conjugado en el extremo 5' y una secuencia cebadora complementaria a un pedazo seleccionado de ADN objetivo tal como fago lambda F, fago lambda B, rkl249.1 F, rk2208.1 F, rk2403.1 F, rsfliC B, rsfliC F, SeOl F, SE01 B, spal.. Esta segunda hebra se puede referir como una sonda fluorescente. Los ejemplos del inhibidor pueden incluir, pero no se limitan a, DABCYL, TAMRA, y los inhibidores de Hoyo Negro (BHQ, por sus siglas en inglés) (Biosearch Technologies, Novato, CA) . Los ejemplos del fluoroforo pueden incluir, pero no se limitan a, fluoresceína, cy3 , cy5, y cualquier número de puntos cuánticos como se conozca en la técnica. El extremo conjugado del fluoroforo se alinea con el inhibidor en la construcción montada de la cremallera. En ciertas modalidades, las hebras de la cremallera molecular necesitan ser complementarias, con la excepción del segmento saliente no acoplado de la hebra fluorescente que actúa como un cebador en una reacción de polimerización de ADN. En algunas modalidades, la cremallera molecular se puede configurar tal que, cuando se hibridan entre sí dos hebras de la cremallera, se inhibe sustancialmente la fluorescencia.

Una señal fluorescente resulta de la cremallera molecular cuando se desplazan las dos hebras de la cremallera. Como resultado, las cremalleras moleculares se pueden usar en LAMP. En modalidades adicionales, al1 diseñar la región saliente para hibridar a la región de asa del producto de LAMP, puede presentarse la separación de la cremallera molecular por la actividad desplazadora de hebra de la ADN-polimerasa Bst durante el transcurso de la reacción de polimerización resultante. También, en modalidades adicionales, al configurar la secuencia de cremallera con una temperatura de fusión mayor de aquella del proceso de LAMP (por ejemplo, aproximadamente 65°C) , se pueden usar cremallera moleculares para el monitoreo en tiempo real en la reacción de LAMP con una baja señal de fondo. Brevemente se han demostrado cremalleras moleculares para el monitoreo en tiempo real de la amplificación de rodamiento-círculo RCA) y amplificación de ramificación (RAM, por sus siglas en inglés) . 1 En las cremalleras moleculares, lá sonda fluorescente y la sonda inhibidora se mezclan típicámente en cantidades aproximadamente iguales y se hibridan para formar cremalleras de doble hebra. Por ejemplo, en ciertas modalidades, se pueden incubar cantidades iguales de la zona fluorescente de la sonda inhibidora (por ejemplo, aproximadamente 20 µ?) a aproximadamente 95 °C durante aproximadamente 5 min, y se enfrían lentamente hasta aproximadamente temperatura ambiente a fin de formar la cremallera molecular de doble hebra.

La sonda de cremallera molecular hibrídada se adiciona a la mezcla de reacción de LAMP. En algunas modalidades, la sonda de cremallera molecular hibridada se puede adicionar para proporcionar un valor de concentración final seleccionado en el intervalo entre aproximadamente 0 a aproximadamente 100 µ?. En ciertas modalidades, la concentración de la cremallera molecular puede tener un valor seleccionado dentro del intervalo entre aproximadamente 0 µ? a aproximadamente 10 µ?. En modalidades adicionales, la concentración de la cremallera molecular puede estar dentro del intervalo de entre aproximadamente 0 µ? a aproximadamente 1 µ?. En una modalidad, la concentración de la cremallera molecular puede ser aproximadamente 0.4 µ?.

En algunas modalidades, la presente descripción proporciona técnicas mejoradas de detección. Un par de sondas marcadas de oligonucleótido, referidas en la presente como una "sonda absorbente" se ha diseñado para realizar monitoreo en tiempo real, específico de secuencia de LAMP de ADN usando el principio de FRET. El par de sondas es análogo a las cremalleras moleculares analizadas anteriormente. Sin embargo, las cremalleras moleculares y las modalidades de las sondas absorbentes de la presente descripción son al menos diferentes con respecto a su implementación del proceso de reacción .

La Tabla 1 ilustra modalidades de sonda fluorescente y sonda inhibidora para el uso con diferentes cebadores de LAMP y diferentes organismos objetivo.

Tabla 1.- Conjuntos de cebadores de LAMP y sondas absorbentes ara or anismos ob etivo o diana La estructura molecular/secuencia de cada uno de los cebadores y sondas se resume en la Tabla 2. 1 Tabla 2.- Cebadores de LAMP, sonda absorbentes, y balizas moleculares Varios parámetros que corresponden a las sondas absorbentes se han identificado que, en algunas modalidades, pueden mejorar de forma significativa el desempeño de las sondas absorbentes en comparación a otras técnicas de detección. Estos parámetros incluyen la relación de la cantidad de la sonda absorbentes a la sonda inhibidora, la manera en la cual se adiciona la sonda fluorescente a la mezcla de reacción de LAMP, y la cantidad total de la sonda absorbente que compite para sitios de fijación en la asa de hebra individual del amplicón de LAMP. Por ejemplo, tan tanto que la presencia de las sonda absorbentes en la mezcla de reacción de LAMP puede provocar que disminuya la velocidad de reacción de LAMP, cuando los valores de los parámetros están dentro de intervalos seleccionados, el grado al | cual la presencia de las sondas absorbentes en la mezcla de reacción I de LAMP inhibe la velocidad de reacción de LAMP puede llegar a ser insignificante.

Con respecto a la sonda fluorescente y a la sonda i inhibidora, en ciertas modalidades, la relación de la sonda fluorescente a la sonda inhibidora se puede seleccionar para que sea menos de aproximadamente 1:1 (por ejemplo, mayores concentraciones de la sonda inhibidora que la sonda fluorescente) . Los ejemplos de estas relaciones pueden incluir, pero no se limitan a, menos de aproximadamente 1:1.1, menos de aproximadamente 1:1.2, menos de aproximadamente 1:1.3, menos de aproximadamente 1:1.4, menos de aproximadamente 1:1.5, menos de aproximadamente 1:1.6, menos de aproximadamente 1:1.7, menos de aproximadamente 1:1.8, menos de aproximadamente 1:1.9, y más pequeño . Los ejemplos de estas relaciones pueden incluir adicionalmente , pero no se limitan a, menos de aproximadamente 1:2, menos de aproximadamente 1:3, menos de aproximadamente 1:4, menos de aproximadamente 1:5 y más pequeño.

Provechosamente, se ha encontrado que las relaciones dentro de este intervalo reducen el gradó al cual la presencia de la sonda absorbente inhibe la velocidad de la reacción de LAMP y reduce el grado de fluorescencia ' de fondo que confunde la detección. Por ejemplo, como se analiza en mayor detalle más adelante, el ejemplo 4 ilustra que las relaciones de la sonda fluorescente a la sonda inhibidora de aproximadamente 1:1 (por ejemplo, cremalleras moleculares) no proporciona sustancialmente incremento en la señal de fluorescencia después de la incubación a aproximadamente 65°C durante aproximadamente 120 minutos, con un fondo, de alta fluorescencia, indicativo de montaje incompleto de las hebras fluorescentes en las cremalleras moleculares a la temperatura de reacción.

En contraste, cuando se emplean relaciones de sonda fluorescente a sonda inhibidora de aproximadamente 1:2, se observaron mayores cantidades de amplicón después 1 de una incubación de aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 65°C (Ejemplo 6) . En algunas modalidades, se pueden, obtener resultados similares para relaciones menores de aproximadamente 1:2.

En modalidades adicionales, la manera de mezclar las hebras de la sonda absorbente en la mezcla de reacción de LAMP se puede variar para incrementar la velocidad de la reacción de LAMP, y de esta manera, para reducir el tiempo necesario para generar una cantidad de ADN objetivo amplificado, suficiente para la detección. La sonda fluorescente y la sonda inhibidora pueden estar en un estado no hibridado con respecto una a la otra cuando se adicionan a la mezcla de reacción de LAMP . Es decir, la sonda fluorescente y la sonda inhibidora se pueden adicionar de forma separada a la mezcla de reacción de LAMP. Esto es en contraste al caso de las cremalleras moleculares, donde las sondas fluorescentes e inhibidoras se hibridan conjuntamente y luego se adicionan a la mezcla de reacción de LAMP. En ciertas modalidades, las sondas fluorescentes y las sondas inhibidoras de la presente descripción se pueden adicionar concurrentemente a la mezcla de reacción de LAMP con otras o a diferentes momentos .

Se observa que la adición de la sonda fluorescente y la sonda inhibidora directamente a la mezcla de reacción de LAMP, de manera individual, como lo opuesto adicionar una estructura de sonda absorbente de doble hebra, que comprende la sonda fluorescente y la sonda inhibidora) a la mezcla de reacción de LAMP, está relativamente sin inhibir la velocidad de reacción de LAMP, dando por resultado una más rápida indicación de una reacción positiva (Ejemplo 5) .

En modalidades adicionales, se ha identificado que la concentración de polimerasa se puede variar para tener influencia en la velocidad de reacción de LAMP, y de este modo disminuir el tiempo necesario para identificar una reacción positiva. Por ejemplo, en una modalidad, las concentraciones de polimerasa pueden ser mayores que iguales a aproximadamente 8U, mayores que o iguales a aproximadamente 16U, mayores que o iguales a aproximadamente 24U, mayores que o iguales a aproximadamente 32U, etc., por ejemplo, de la polimerasa, se pueden usar para incrementar la velocidad de reacción de LAMP y disminuir el tiempo de detección.

Por ejemplo, como se analiza en mayor detalle más adelante (Ejemplo 8) , se detectó la fluorescencia después de aproximadamente 20 minutos usando el conjunto de cebadores rk2208.1 y aproximadamente 8U de ADN-polimerasa Bst. En contraste, cuando se duplica la cantidad de ADN-polimerasa Bst desde aproximadamente 8U a aproximadamente 16U, se detectó la fluorescencia después de aproximadamente 10 minutos . Este resultado indica que la velocidad de reacción de LAMP es aproximadamente el doble con una duplicación de la concentración de polimerasa. Adicionalmente , el incremento de la concentración de polimerasa se anticipa que disminuye el tiempo de detección. También se cree que las ganancias adicionales en la velocidad son aproximadamente lineales hasta aproximadamente el punto donde las velocidades de fijación de cebador, limitantes de velocidad, llegan a ser limitantes puesto que se exceden por la velocidad de polimerización catalizada por enzima.

La cantidad total de la sonda absorbente dentro de la mezcla de reacción también se puede variar para tener influencia en la velocidad de la reacción de LAMP y en el comienzo de la fluorescencia observable. Se ha identificado que el tiempo de detección se reduce de forma significativa al incrementar las cantidades de las sondas fluorescentes inhibidoras que se adicionan a la mezcla de reacción (por ejemplo, ver Ejemplo 10) . Por ejemplo, como se analiza en el Ejemplo 8, la cantidad de sonda fluorescente adicionada a la mezcla de reacción de LAMP puede ser mayor de aproximadamente 0.08 µ?, mayores que o iguales a aproximadamente 0.4 µ?, mayores que o iguales a aproximadamente 0.8 µ?, etc., y las concentraciones respectivas de las sondas inhibidoras pueden ser mayores que o iguales a aproximadamente 0.16 µ?, mayores que o iguales a aproximadamente 1.6 µ?, etc.

En modalidades adicionales, la relación de sonda fluorescente a la sonda inhibidora puede ser ménor de aproximadamente 1:1. Los ejemplos de estas relaciones pueden incluir, pero no se limita a, menos de aproximadamente 1:1.5, menos de aproximadamente 1:2, menos de aproximadamente 1:2.5, menos de aproximadamente 1:3, menos de aproximadamente 1:3.5, menos de aproximadamente 1:1.4, menos de aproximadamente 1:1.4.5, menos de aproximadamente 1:5, menos de aproximadamente 1:5.5, menos de aproximadamente 1:1.60, menos de aproximadamente 1:1.65, menos de aproximadamente 1:1.70, menos de aproximadamente 1:1.75, menos de aproximadamente 1:1.80, menos de aproximadamente 1:8.5, menos de aproximadamente 1:9, menos de aproximadamente 1:9.5, y más pequeño. Los ejemplos de estas relaciones pueden1 incluir además, pero no se limitan a, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1 : 5 y más pequeño.

En ciertas modalidades, la cantidad de la sonda fluorescente y la sonda inhibidora se puede mantener itan baja como sea posible en tanto que se proporcionan a un nivele detectables de fluorescencia cuando toma lugar la amplificación positiva de ADN por LAMP en la mezcla de reacción de LAMP. De esta manera, se puede realizar aún la detección en tanto que se elimina sustancialménte la reducción en la velocidad de reacción de LAMP debido a la presencia de la sonda absorbente. En ciertas modalidades, la cantidad de la sonda fluorescente puede estar dentro del intervalo entre aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.4 µ?. En modalidades adicionales, la cantidad de la sonda inhibidora se puede seleccionar dentro del intervalo entre aproximadamente 0.02 a aproximadamente 0.8 µ?. En otras modalidades, al cantidad total de la sonda absorbente puede i estar dentro del intervalo entre aproximadamente 0.03 µ? a aproximadamente 1.2 µ?.

Como se analiza en mayor detalle más adelante en los ejemplo, se ha determinado en el Ejemplo 10 que mayores cantidades de la sonda absorbente en la mezcla de reacción de LAMP dieron por resultado retrasos más prolongados en el comienzo de la detección de fluorescencia. Esto puede presentarse puesto que las sondas absorbentes inhiben la velocidad de la reacción de LAMP cuando están presentes en grandes cantidades. Por ejemplo, un incremento de 10 veces en las concentraciones de sonda fluorescente y de sonda inhibidora (por ejemplo, aproximadamente 0.08 µ? y aproximadamente 0.16 µ? a aproximadamente 0.8 µ? y11.6 µ?, respectivamente) proporciona un incremento de aproximadamente i 6 veces en el tiempo de detección de fluorescencia, desde aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 120 minutos.

Ej emplos En los ejemplos posteriores, las modalidades de las sondas absorbentes se prueban para valorar, su capacidad para monitorizar las reacciones de LAMP. También se realzaron comparaciones entre modalidades de la sonda absorbente y las técnicas de detección que emplean cremalleras moleculares, balizas moleculares, y tintes de intercalación.

Cebadores de LAMP Se usan una variedad de diferentes conjuntos de Cebadores de LAMP para evaluar el desempeño de las sondas absorbentes: fago lambda LAMP, rkl249.1, rk2208.1, rk2403.1, rsfliC y, SeOl, y Spal. El conjunto de cebadores de LAMP rsfliC se diseñó para seleccionar como objetivo el gen de la subunidad C de flagelina (fliC) de Ralstonia solanacearum (Rs) , que está presente en la mayoría de los miembros de la especie.

Los conjuntos de cebadores rkl249.l rk2208.l y rk2403.1 se diseñan para seleccionar como objetivo la región de secuencia de ADN única a un subgrupo de cepas de Rs clasificadas como Race3Biovar2 (R3B2) . El conjunto de cebadores de LAMP de ADN de bacteriófago Lambda se diseñó para seleccionar como objetivo el ADN de fago lambda. El conjunto de cebadores SeOl se diseñó para seleccionar como objetivo Salmonella. entérica. El conjunto de cebadores de LAMP Spal se diseñó para seleccionar como objetivo Staphylococcus aureus .

En una modalidad, los cebadores de LAMP sé pueden obtener un proveedor. En otras modalidades, los cebadores de LAMP se pueden diseñar como derivatizado . Un ejemplo de estos cebadores de LAMP pueden incluir, pero no se limitan a, aquellos descritos en Kubota, R. , B. G. Vine, A. M. Alvarez, y D. M. Jenkins, "Detection of Ralstonia solanacearum by loop-mediated isothermal amplification" , Phytopathology. 98 (9) : 1045-1051 (2008), la totalidad de lo cual se incorpora de este modo como referencia. La secuencia de cada uno de los conjuntos de cebadores y las hebras de sondas absorbentes sondas se pueden encontrar en la Tabla 2.

En los experimentos analizados más adelante, se emplearon los protocolos de Kubota et al. para amplificar de manera selectiva diferentes secuencias objetivo. ' En una modalidad, los objetivos de ADN comprendieron uno de bacteriófago lambda, raza 3 biovar 2 cepas de Ralstonia solanacearum, Ralstonia solanacearum, Salmonella entérica y Staphylococcus aureus usando información de comparación de secuencia proporcionada por los co-autores Schell y Alien (datos no mostrados) .

En una modalidad, se realizaron reacciones! de LAMP en mezclas de reacción de aproximadamente 25 µ? (volumen total) que contienen aproximadamente 1.6 µ? de FIP y, de BIP, concentraciones de aproximadamente 0.2 µ? del cebador F3 y B3, concentraciones de aproximadamente 0.4 µ? del cebador de asa B, aproximadamente 400 µ? de desoxinucleósido-trijfosfatos (dNTP) , betaína de aproximadamente 1.0 M (por ejemplo, Sigma-Aldrich Corp., St Louis, MO) , Tris-HCl 20 mM (aproximadamente pH 8.8), KC1 aproximadamente 10 mM, (NH4)2S04 aproximadamente 10 mM, MgS04 aproximadamente 6 mM, Tritón X-100 aproximadamente al 0.1% y ADN de plantilla. Las reacciones se llevaron a cabo en microtubos de aproximadamente 0.2 mi, usando ciclador térmico para control de temperatura. Las mezclas se calentaron a una temperatura de aproximadamente 95 °C durante aproximadamente 5 minutos, luego se enfriaron en hielo antes de la adición de aproximadamente 8 U de fragmento grande de ADN-polimérasa Bst (por ejemplo, New England Biolabs, Inc., Beverly, MA)¡.

En otra modalidad, se realizaron reacciones de LAMP de tiempo real multiplexadas en 25 µ? que contiene tanto los conjuntos de cebadores de LAMP de fago lambda y de LAMP SeOl a las siguientes concentraciones: FIP y BIP 1.6 µ?; F3 y B3 0.2 µ?, y asa F y B 0.4 µ?. Las sondas absorbentes estuvieron contenidas en la mezcla de reacción a concentraciones de 0.08 µ? cada una de las sondas FAM SeOl F, sonda FAM SeOl, B, y la sonda -de lambda fago F, y 0.4 µ? de la sonda inhibidora 01.

Otras concentraciones de reactivo fueron como sigue: dNTP 400 µ?; betaína 1.0 M (Sigma-Aldrich Corp., St Louis, MO) ; Tris-HCl 20 mM (pH 8.8); KCl 10 mM, (NH4)2S04 10 mM; MgS04 8 mM; Tritón X-100 al 0.1%; 8 U de fragmento grande de ADN-polimerasa Bst (New England Biolabs) , y; ADN de plantilla (50 ng de ADN de Salmonella entérica y/o 5 ng para ADN lambda) .

Para el monitoreo en tiempo real de reacciones de LAMP, las reacciones se incubaron a 65 °C durante 60 min y las señales de fluorescencia (fluoresceína; Aex/em = 500/530, Cy3; Aex/em = 550/570) se midieron cada minuto usando ! sistema de detección de PCR en tiempo real iQ5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) . Las reacciones entonces se terminaron al calentar a 80 °C durante 10 minutos. Se corrieron reacciones en cuadruplicado para cada muestra y los valores de fluorescencia se promediaron para cada conjunto de muestras para cada punto de tiempo de reacción. Para comparación de i los datos de fluorescencia entre canales, todos los valores de fluorescencia se normalizaron a los valores donde 0 y 1,000 RFU corresponde respectivamente a los valores mínimo y I; máximo de fluorescencia observados para las muestras promediadas con el intervalo más grande de los valores de fluorescencia en el canal dado durante la reacción.

Después de la adición de la polimerasa, la mezcla se incubó a aproximadamente 65 °C durante aproximadamente 60 min. La reacción se terminó al calentar a aproximadamente 80 °C para desnaturalizar la polimerasa. Los productos amplificados se sometieron a electroforesis a aproximadamente 85V durante aproximadamente 90 min a través de un1' gel de agarosa al 2% (1 x Tris-acetato - EDTA) , seguido por tinción con bromuro de etidio, usando marcadores apropiados de tamaño (por ejemplo, Hyper ladder II; Bioline EUA, Inc., Randolph, MA) .

Las reacciones de LAMP se monitorizaron en tiempo real usando cremalleras moleculares y sondas absorbentes. Se diseñó una cremallera molecular para que seleccione como objetivo la región del asa de un amplicón de LAMP que resulta de cebadores específicos de la especie (por ejemplo, cebadores que dan por resultado la amplificación de ADN de todas las cepas de Ralstonia solanacearum) . En una modalidad, la cremallera molecular se produjo al mezclar aproximadamente 2 µ? de hebra positiva (fluoróforo) y henra negativa (inhibidor) en un amortiguador que contiene Tris-HCl i aproximadamente 100 mM (aproximadamente pH 8.0) y EDTA aproximadamente 100 mM (pH de aproximadamente 8.0), calentando a aproximadamente 95 °C durante aproximadamente 5 min, y enfriando lentamente a temperatura ambiente. Se uso una concentración de aproximadamente 0.04 µ? de la cremallera molecular para la reacción de LAMP en tiempo real .

Estas cremalleras moleculares entonces se adicionaron a las mezclas de reacción con los cebadores de i.

LAMP selectivos de especie, el ADN objetivo (por ejemplo, Ralstonia solanacearum) , y a los controles negativos (por ejemplo, ADN de fago lambda, mezclas de reacción < que no contienen ADN) . ¡ Para examinar la capacidad de una sonda absorbente para detectar reacciones de LAMP, también se produjo una sonda absorbente diseñada para que seleccione como objetivo i; la región asa de un amplicón de LAMP que resulta de cebadores específicos de la especie. En ciertas modalidades, la hebra i, positiva (fluoróforo) y hebra negativa (inhibidor)' se mantuvieron separadas una de la otra y se adicionaron directamente a la mezcla de LAMP. La relación de concentraciones del fluoróforo e extintor fue menos de a aproximadamente 1:1, respectivamente.

La capacidad de las cremalleras moleculares y de las sondas absorbentes para detectar reacciones de LAMP que se presentan en las de reacción de LAMP se determinó de la fluorescencia emitida de las mezclas de reacción. Por ejemplo, se midió la fluorescencia un sistema de1 PCR de tiempo real iQ5 (por ejemplo, Bio-Rad, Hercules CA) .

Ejemplo 1.- Desempeño de equipo físico El fluorómetro habitual se usó para observar exitosamente las diferencias entre los productos de LAMP marcados con una baliza molecular que selecciona como objetivo una de las regiones asa, en comparación a un control negativo que contiene balizas moleculares, pero sin amplicón de LAMP (datos no mostrados) . Un CD impreso habitual en ABS con cavidades de reacción de varios tamaños se muestra en la Figura 4.

Ejemplo 2.- Examen de control y calibración de temperatura Se realizó la calibración de temperatura , como se analiza anteriormente para evaluar la técnica de calibración. Se llevaron a mediciones de calibración en las concavidades de reacción en el ABS marcado con patrones y en policarbonato y produjeron mediciones de temperatura sin contacto, altamente exactas, a pesar de las pérdidas de radiación a través de la concavidad y de la película transparente. Por ejemplo, la Figura 5 ilustra las temperaturas corregidas de concavidad estimadas de un termómetro sin contacto (por ejemplo, pirómetro) en comparación a las temperaturás reales de concavidad medidas por un termopar tipo K. Los círculos representan datos medidos de concavidades cortadas en policarbonato, en tanto que los triángulos representan datos medidos de concavidades cortadas en ABS . Los datos de calibración usados para estimar coeficientes para transmisión de radiación a través de la concavidad y reflexión de radiación ambiente desde la superficie de la concavidad se ilustran en el inserto de la Figura 5. El error estándar observado en la temperatura, de una concavidad individualmente calibrada en un CD de policarbonato fue aproximadamente 0.35°C. La aplicación de la misma calibración en un total de cinco concavidades, incluyendo i algunos patrones en el ABS, produjeron un error normal en la temperatura medida de aproximadamente 0.93°C. Esté último resultado sugiere que, sobre el intervalo espectral para la radiación térmica a las temperaturas observadas, son muy similares las emisividades del ABS y el policarbonato.

La Figura 6 ilustra mediciones transientes de temperatura que muestran control de temperatura a un punto de ajuste de aproximadamente 65 °C en una concavidad de reacción usando solo mediciones de temperatura, sin contacto, corregidas. Los datos indican que el punto de ajuste se alcanzó en el espacio de aproximadamente un minuto. Adicionalmente , el análisis de los datos encuentra que el error medio cuadrático del sistema después de alcanzar el punto de ajuste fue aproximadamente 0.27°C. Estos resultados I indican que la temperatura dentro de las concavidades de reacción se puede controlar a un alto grado( usando modalidades del proceso descrito de calibración.

A fin de mejorar el intervalo y velocidad de control de temperatura, el ADN se puede desnaturalizar antes de LAMP . En una modalidad, esto se puede realizar usando láser de mayor potencia que aquel usado para calentar la concavidad. En modalidades adicionales, el diseño de la concavidad de reacción se puede alterar para limitar su masa térmica y para mejorar el aislamiento.

Ejemplo 3.- Ajuste de reacción de LAMP a) Cepas bacterianas y purificación de ADN Las cepas de Rs GMI1000 (R1B3) y UW551 (R3B2) se cultivaron en medio de agar con cloruro de tetrazolio (TZC) modificado de acuerdo con Norman y Alvarez (Norman, D. , y Alvarez, A. M. , "A rapid method for presumptive Identification of Xa.nthomon.as campestris pv. dieffenbachiae and other xanthomonads" , Plant Disease, 73, 654-658 (1989), la descripción de la cual se incorpora de este modo como referencia. Las cepas Rs se incubaron durante aproximadamente 48-72 horas a aproximadamente 28°C. Los ADN se purificaron de estas células con el equipo de purificación de ADN genómico WizardMR, (Promega Corp., Madison, WI) de acuerdo a las i instrucciones- del fabricante y se cuantificaron dé manera espectrofotométrica . Para la reacción de LAMP de ADN lambda, se compró ADN lambda purificado (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) .

Se cultivó adicionalmente una cepa de Staphylococcus aureus usando un medio de caldo de Lisogenia (LB, por sus siglas en inglés) y se incubó ' durante aproximadamente 18-24h a aproximadamente 38 °C. Las células se suspendieron en ddH20 y se aniquilaron térmicamente a 100 °C durante 15 min.

En las modalidades de detección multiplexada, se cultivó adicionalmente una cepa de Salmonella entérica en medio agar de xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) (Zaj ic-Satler i y Gragas, 1977) y se incubó durante 18-24h a 38 °C. Se purificó el ADN de estas células con el queipo de purificación de ADN genómico izardMR, (Promega Corp., I: Madison, WI) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y se cuantificó de manera espectrofotométrica. Para la reacción de LAMP de fago lambda, se compró ADN lambda purificado (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) . b) Reacciones de LAMP En modalidades de sondas absorbentes para detección de amplificación individual, excepto donde se señala de otro modo, las reacciones de LAMP se realizaron usando mezcla de reacción de LAMP que tienen un volumen total de 25 , µ?. En ciertas modalidades, las mezclas de reacción comprendieron FIP y BIP de aproximadamente 1.6 µ?, aproximadamente 0.2 µ? del cebador F3 y B3 , y concentraciones de aproximadamente 0.4 µ? del cebador de asa.

Otras concentraciones de reactivo en la mezcla de reacción de LAMP fueron como sigue: d TPs de aproximadamente 400 µ?, betaína de aproximadamente 1.0 M (Sigma-Aldrich Corp., St Louis, MO) , Tris-HCl de aproximadamente 20 mM (pH de aproximadamente 8.8), CK1 de aproximadamente 1 10 mM, (NH4)2S04 de aproximadamente 10 mM, MgS0 de aproximadamente 6 mM, Tritón X-100 de aproximadamente al 0.1% y aproximadamente 50 ng (o aproximadamente 50PG de ADN lambda) del ADN de plantilla.

Para el conjunto de cebadores de LAMP de rsfliC, se usó el ADN genómico purificado de la cepa GMI1000 como el control positivo, y para el conjunto de cebadores de LAMP rk2208.1 se usó el ADN de la cepa UW551 como el control positivo. Las mezclas se calentaron a aproximadamente 95 °C durante aproximadamente 5 minutos, luego se enfriaron en hielo antes de la adición de aproximadamente 8 U de fragmento grande de ADN-polimerasa Bst (New England Biolabs) . Inmediatamente después de la adición de la polimerasa, la reacción se incubó a aproximadamente 65°C durante aproximadamente 60 min y luego se terminó la reacción al calentar a aproximadamente 80 °C.

Para modalidades de sondas absorbentes para i detección de amplificación multiplexada, excepto donde se señala de otro modo, las reacciones de LAMP se realizaron usando mezclas de reacción de LAMP que tienen un volumen total de 25 µ?. En otras modalidades, las mezclas de reacción comprendieron FIP y BIP de aproximadamente 1.6 µ?, F3; y B3 de aproximadamente 0.2 µ?, y asa F y B de aproximadamente 0.4 µ?. También estuvieron contenidas sondas absorbentes en la mezcla de reacción a concentraciones de aproximadamente 0.08 µ? para cada una de la sonda FAM SeOl F, y la sonda 'FAM SeOl B, la sonda de fago lambda F, y aproximadamente 0.4 µ? de la sonda inhibidora 01.

Otras concentraciones de reactivos en la mezcla de reacción de LAMP fueron como sigue: d TP 400 µ?; betáína 1.0 M (Sigma-Aldrich Corp., St Louis, MO) ; Tris-HCl 20 mM (pH 8.8) ; KC1 10 mM, (NH4)2S04 10 mM; MgS04 8 mM; Tritón X-100 al 0.1%; 8 U de fragmento grande de ADN-polimerasa Bst (New England Biolabs) , y; ADN de plantilla (50 ng de ADN de Salmonella entérica y/o 5 ng para ADN lambda) .

Para el monitoreo en tiempo real de las reacciones de LAMP, las reacciones se incubaron a 65 °C durante 60 min y se midieron las señales de fluorescencia (fluoresceína; Aex/em = 500/530, Cy3; Aex/em = 550/570) cada minuto usando el sistema de detección de PCT de tiempo real iQ5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) . Entonces las reacciones se terminaron al calentar a 80 °C durante 10 minutos. Se f corrieron reacciones en cuadruplicado para cada muestra y se promediaron los valores de fluorescencia para cada conjunto de muestras para cada punto de tiempo de reacción.

Para comparación de los datos fluorométricos entre los canales, todos los valores de fluorescencia se normalizaron a valores donde 0 y 1,000 RFU corresponden respectivamente a los valores máximo y mínimo fluorescencia observados para las muestras promediadas con el intervalo más grande de los valores de fluorescencia en el canal dado durante el reacción.

La cantidad de ADN de plantilla adicionad a ía mezcla i de reacción se varió, dependiendo de los cebadores de LAMP usados. Por ejemplo, en el caso del cebador de fago Lambda, se adicionaron aproximadamente 5 ng de ADN de bacteriófago lambda. En el caso de los cebadores rkl249.1, rk2208, y rk2403.1, se adicionaron aproximadamente 50 g de ADN Ralstonia solanacearum Raza 3 Biovar2. En el caso del cebador rsfliC, se adicionaron aproximadamente 50 g de ADN de Ralstonia solanacearum. En el caso del cebador SeOl, se adicionaron aproximadamente 50 ng de ADN de Salmonella entérica. En el caso del cebador Spal, se adicionaron aproximadamente 1.0 µ? de células térmicamente aniquiladas de ADN de Staphylococcus aureus. c) Diseño de sondas absorbentes para reacciones de LAMP En modalidades de sondas absorbente para detección de amplificación individual, la hebra fluorescente de la sonda absorbente se diseñó para contener las secuencias de los cebadores rsfliC asaB o rk2208.1 en el extremo 3', y una secuencia complementaria a la sonda inhibidora en el extremo 5' . Una molécula fluorescente (por ejemplo fluoresceína) se conjugó al extremo 5' de las sondas fluorescentes, tal que cuando se fijó a la hebra inhibidora en la sonda absorbente, una molécula inhibidora (por ejemplo inhibidor de hoy negro 1) conjugada al extremo 3' de la hebra inhibidora inhibió efectivamente la fluorescencia. La estructura molecular/ secuencia de cada cebador y sonda se resumen en la Tabla 1.

En modalidades de sondas absorbentes para detección de amplificación multiplexada, la hebra fluorescente de sonda absorbente se diseñó para contener secuencias de cebadores SeOl asaF, SeOl asaB o fago lambda asaF en el extremo 3', y una secuencia complementaria a la sonda inhibidora en el extremo 5'. La molécula de fluoresceína se conjugó al extremo 5' de la sonda SeOl F yla sonda SeOl B, y se conjugó la molécula Cy3 al extremo 5' de la sonda fago lambda F, tal que cuando se fijó a la hebra inhibidora en la sonda absorbente, un molécula inhibidora (por ejemplo inhibidor de hoyo negro 1) conjugado al extremo 3' de la hebra inhibidora 1 inhibió efectivamente la fluorescencia. La estructura molecular/secuencia de cada cebador y sonda se resumen en la Tabla 2.

Ejemplo 4.- Evaluación cremalleras moleculares para reacciones de LAMP de rsfliC Para examinar el desempeño de las cremalleras moleculares para monitorizar las reacciones de LAMP en tiempo real, se formaron cremalleras moleculares siguiendo el protocolo previamente descrito por Yi, et al (Yi, J. Z., W. D. Zhang, y D. Y. Zhang, "Molecular Zipper: a fluorescent probé for real-time isothermal DNA amplification" , N cleic Acids Research, 34 (2006) , el contenido de lo cual se incorpora como referencia. El conjunto de cebadores de LAMP rsfliC se usó en este experimento y se diseñó la sonda fluorescente para contener secuencia de cebador de la LAMP de rsfliC asaB en el lado del extremo 3', como se ilustra en la Tabla 1. Una concentración final de aproximadamente 0.4 µ? de la cremallera molecular se mezcló con la mezcla de reacción de LAMP y rsfliC, y la mezcla se incubó a aproximadamente 65 °C durante aproximadamente 120 min.

La señal de fluorescencia se observó usando el ¦ i; sistema de detección de PCR en tiempo real iQ5. Se usó ADN genómico (50 ng) de la cepa Rs, GMI1000, para muestras positivas y se usó agua doblemente destilada (ddH20) ( como un control negativo. Ambos tratamientos se prepararon en triplicado, y los datos de las réplicas se promediaron para generar un perfil promedio de fluorescencia a todo lo largo del transcurso de una reacción determinada (por ejemplo, Figura 7) .

Como se ilustra en la Figura 7, no se observó diferencia significativa en los perfiles de fluorescencia de los dos tratamientos (ADN genómico de GMI1000 vs ddH20) usando cremalleras moleculares. Adicionalmente, no se observó incremento en la señal de fluorescencia durante el transcurso de cualquier reacción. Ambos tratamientos exhibieron una señal de fluorescencia del fondo sustancialmente alta, indicativa de montaje sustancialmente incompleto de las hebras fluorescentes en las cremalleras moleculares a la temperatura de reacción.

Ejemplo 5.- Monitoreo en tiempo real de la reacción de LAMP de rsfliC usando sondas absorbentes Para monitorizar las reacciones de LAMP de rsfliC en tiempo real, sin sacrificar sustancialmente la velocidad de reacción, se incluyen aproximadamente 0.08 µ? de sonda fluorescente y aproximadamente 0.16 µ? de la sonda inhibidora directamente en la mezcla de reacción antes de la formación de la estructura de cremallera molecular de doble hebra. Las mezclas de reacción se incubaron a aproximadamente 65 °C durante aproximadamente 120 min y la señal de fluorescencia se observó usando el sistema de detección de PCR en tiempo I. real iQ5.

I La Figura 8 ilustra que la señal de fluorescencia de la reacción LAMP de rsfliC en la presencia de precursores de sondas absorbentes aparece después de aproximadamente 30 min de incubación, sustancialmente consistente con la velocidad de reacción de rsfliC tal como se pone en claro usando balizas moleculares (Experimento 6) . La hibridación de las hebras de la sonda absorbente y la adición de la sonda absorbente hibridada a la mezcla de reacción de LAMP i interfiere de forma significa con la reacción de LAMP de rsfliC, dando por resultado indicación retrasada de una reacción positiva. Sin embargo, al adicionar las sondas fluorescentes e inhibidora directamente a la mezcla de reacción de LAMP de rsfliC, se mejoró drásticamente la velocidad de LAMP de rsfliC, reflejado la velocidad de la reacción de LAMP de rsfliC no inhibida.

Puesto que la sonda de ADN de doble hebra está en la condición de equilibrio dinámico a aproximadamente 65°C, las moléculas de sonda fluorescente e inhibidora se están disociación y reasociación de forma constante, facilitando la interacción de las sondas con amplicones de LAMP. Para suprimir la fluorescencia de fondo bajo estas condiciones, la concentración de la sonda inhibidora debe ser mayor que aquella de la sonda fluorescente de modo que la fluorescencia no inhibida solo se presenta cuando esta última se absorbe en el amplicón de LAMP.

Ejemplo 6.- Examen de relación de sondas de fluorescencia y de inhibición en la velocidad de reacción de LAMP La relación de las sondas fluorescente e inhibidora de las cremalleras moleculares se ajustó para proporcionar sondas absorbentes para monitorizar la reacción de LAMP de rsfliC. A fin de reducir la señal de fondo de la sonda fluorescente, se disminuyó la relación de la sonda fluorescente a la sonda inhibidora a aproximadamente 1:2. Para monitorizar la reacción de LAMP, se mezclaron aproximadamente 0.08 µ de la sonda absorbente resultante que comprende aproximadamente 0.08 de sonda fluorescente y aproximadamente 0.16 µ? de sonda inhibidora con la mezcla de reacción de LAMP de rsfliC. A fin de verificar la especificidad de secuencia de las sondas fluorescente e inhibidora, se usó el conjunto de cebadores de LAM^ de ADN lambda con sonda absorbedora de rsfliC como un control para LAMP de tiempo real .

Las señales de fluorescencia asociadas con asimilación de la sonda de asimilación en el amplicón de LAMP se observaron solo de la mezcla de reacción de LAMP de rsfliC con ADN genómico GMI1000 y no de la reacción de LAMP de ADN lambda. Esta observación demuestra la especificidad de secuencia de la sonda absorbente de rsfliC.

También se realizó análisis de electroforesis en gel agarosa para confirmar la presencia de los amplicones de LAMP de tanto rsfliC como de ADN lambda en las reacciones respectivas. El perfil de fluorescencia (Figura 9) indicó que la reacción de LAMP de rsfliC se puede detectar usando la concentración determinada de la sonda absorbente pero solo después de una incubación de aproximadamente 60 min a i. aproximadamente 65 °C. En contraste, la reacción de LAMP de rsfliC en la ausencia de la sonda absorbente dio por resultado típicamente grandes cantidades de amplicón en el espacio de aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 65 °C. Esto se puede observar por la acumulación del subproducto precipitado de pirofosfato de magnesio de la reacción de polimerización y al sondear la reacción detenida a varios intervalos con balizas moleculares (ver Experimento 7 posterior) o electroforesis en gel . Este resultado' sugiere que la presencia de la sonda absorbente puede inhibir la fijación de los cebadores de asa en la reacción de LAMP, i retrasando su progreso completo. Por lo tanto, la concentración total de la sonda absorbente se puede variar I. dentro de un intervalo seleccionado para permitir que prosiga i la reacción de LAMP a velocidad completa en tanto que aún se permite la detección específica de secuencia en tiempo real. Ejemplo 7.- Medición de velocidad de conjunto de cebadores de LAMP de rsfliC por baliza molecular.

A fin de determinar la velocidad verdadera de la reacción de LAMP de rsfliC, se diseñaron balizas moleculares como se muestra en la Tabla 1 para que se seleccionen como objetivo las regiones asaF y asaB de rsfliC. Se adicionaron aproximadamente 0.4 µ? de la baliza molecular a las reacciones de LAMP de rsfliC y se incubaron a aproximadamente 65°C durante aproximadamente 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 minutos, respectivamente. Cada reacción se terminó al incubar a aproximadamente 80 °C durante aproximadamente 10 min. La intensidad de la fluorescencia de las mezclas de LAMP de rsfliC con balizas moleculares se midió a aproximadamente 25 °C después de terminar las reacciones. Para verificar que las balizas moleculares no retrasan las reacciones, las reacciones detenidas a varios intervalos sin balizas moleculares se sometieron a electroforesis en gel de agarosa a fin de confirmar la presencia de amplicones de rsfliC.

La Figura 10 ilustra los resultados para fluorescencia relativa como una función del tiempo. Los resultados de la Figura 10 muestran que ambas [balizas moleculares para las regiones asaF y B de rsfliC, fueron capaces exitosamente de hibridar a sus regiones objetivo del amplicón de LAMP de rsfliC. La especificidad de secuencia de ambas balizas moleculares también se confirmó usando reacción I, de LAMP de ADN lambda como un control negativo (datos no mostrados) . Los datos de balizas moleculares indica adicionalmente que la proliferación de cantidades dete'ctables de amplicón de la reacción de LAMP de rsfliC se presenta en el espacio de aproximadamente 30 min de incubación y se presenta saturación en aproximadamente 55 min de incubación.

El análisis por electroforesis en gel de agarosa de la reacción de rsfliC sin balizas moleculares también mostró la aparición de bandas débiles que inician en aproximadamente 30 min (datos no mostrados) , que correlacionan en el comienzo de la fluorescencia en las reacciones que contienen balizas moleculares. Estos resultados, en comparación a aquellos del Experimento 6, soportan la conclusión que las cremalleras moleculares disminuyen significativamente la velocidad de reacción de LAMP de rsfliC.

Ejemplo 8.- Influencia de concentración incrementada de polimerasa en velocidad de reacción de LAMP Se usaron conjuntos de cebadores de LAMP de rsfliC y rk2208.1 específicos R3B2 para iniciar las reacciones de LAMP y se monitorizaron en tiempo real usando las correspondientes sondas absorbentes con la concentración de aproximadamente 0.08 µ? de sonda fluorescente y aproximadamente 0.16 µ de sondas inhibidoras. Las sondas absorbentes se incluyeron directamente en la mezcla de reacción antes de la formación de la estructura de cremallera molecular de doble hebra. Para investigar las limitaciones cinéticas de la velocidad de reacción, se corrieron reacciones con cada conjunto de cebadores usando diferentes cantidades (aproximadamente 8U o aproximadamente 16U) de ADN-polimerasa Bst.

Como se ilustra en la Figura 11, la reacción de LAMP que usa el conjunto de cebadores rk2208.1 dio por resultado incrementos observables de fluorescencia en el espacio de 20 minutos cuando se usan aproximadamente 8U de i ADN-polimerasa Bst, y se incrementa en el espacio de aproximadamente 10 minutos cuando se usa aproximadamente 16U. La reacción de LAMP con el conjunto de cebadores de ! LAMP de rsfliC dio por resultados incrementos observables de fluorescencia en el espacio de aproximadamente 30 min, a pesar de la concentración de ADN-polimerasa Bst.

Este resultado indicó que la constante de velocidad de unión hacia delante de los pasos fijadores de cebador, limitantes de velocidad de la reacción de rk2208.11 fueron significativamente mayores que las velocidades I, correspondientes en la reacción de rsfliC. Esta vélocidad mejorada de fijación fue significativo suficiente tal que se i pueden observar ganancias cinéticas proporcionales en la reacción de rk2208.1 al incrementar la actividad de polimerasa. Se pueden observar ganancias adicionales por los incrementos correspondientes en la concentración de polimerasa en la reacción.

Ejemplo 9.- Examen adicional de la influencia de la concentración ADN-polimerasa Bst con LAMP de rk2208.1 en la velocidad de detección y cinética de reacción Se usaron conjuntos de cebadores de LAMP de rk2208.1 específicos R3B2 para iniciar las reacciones de LAMP y se monitorizaron en tiempo real usando las correspondientes sondas absorbentes con concentraciones de , aproximadamente 0.08 µ? de sonda fluorescente y aproximadamente 0.16 µ? de sonda inhibidora. Se incluyeron sondas absorbentes directamente en la mezcla de reacción antes de la formación de la estructura de cremallera molecular de doble hebra. Para investigar las limitaciones cinéticas de la velocidad de reacción, las reacciones con cada conjunto de cebadores se corrieron usando diferentes cantidades, aproximadamente 0 U, aproximadamente 4 U, aproximadamente 8 U, aproximadamente 12 U, aproximadamente 16 U, aproximadamente 20 U, aproximadamente 24 U, aproximadamente 28 U, y aproximadamente 32 U) de de ADN Bst.

La reacción de LAMP que usa el conjunto de cebadores rk2208.1 dio por resultado incrementos observables de fluorescencia en el espacio de aproximadamente 30 ¡minutos cuando se adicionaron aproximadamente 4 U de ADN-polimerasa Bst (Figura 12) . Se observó fluorescencia en un corto; tiempo, después de aproximadamente 20 minutos, con un incremento en la concentración de polimerasa a aproximadamente 8 U. El incremento de la concentración de polimerasa a ¡ más de aproximadamente 15 U (por ejemplo, aproximadamente 15 U, aproximadamente 20 U, aproximadamente 24 U, aproximadamente 28 U, y aproximadamente 32 U) dio por resultado fluorescencia observable en el espacio de aproximadamente 10 a 15 minutos.

El incremento de la concentración de ADN-polimerasa Bst proporciona además un incremento en el tiempo para alcanzar velocidad máxima. La Figura 13 ilustra la relación con el tiempo para alcanzar la velocidad máxima de ganancia de fluorescencia por minuto. El tiempo a velocidad máxima se disminuye de aproximadamente 40 minutos a aproximadamente 15 minutos con una concentración creciente de ADN-polimerasa Bst desde aproximadamente 4 U a aproximadamente 32 U.

Ejemplo 10.- Examen de composición de sonda absorbente para conjunto de cebadores de LAMP de rk2208.1 sin cebador de asa El conjunto de cebadores de LAMP de rk2208.1, sin cebador de asa, se usó para determinar el impacto' de las cantidades de sonda fluorescente y sonda inhibidora en el tiempo para detectar fluorescencia de la mezcla de reacción de LAMP. Las reacciones se corrieron usando concentraciones de sonda fluorescentes de aproximadamente 0.08 µ?, aproximadamente 0.4 µ?, y aproximadamente 0.8 µ?, mezclados respectivamente con concentraciones de sonda inhibidora de aproximadamente 0.16 µ?, aproximadamente 0.8 µ?, y aproximadamente 1.6 µ? en la reacción de LAMP, sin cebadores de asa. Los resultados de estas pruebas se ilustran en la Figura 14. Los círculos representan bajas concentraciones de sonda (aproximadamente 0.08 µ? de sonda fluorescente y aproximadamente 0.16 µ? de sonda inhibidora), los triángulos son concentraciones medias de sonda (aproximadamente, 0.4 µ? de sonda fluorescente y aproximadamente 0.8 µ? de sonda inhibidora) , y los rectángulos son concentraciones medias altas de sonda (aproximadamente 0.8 µ? de sonda fluorescente y aproximadamente 1.6 µ? de sonda inhibidora). Los símbolos sombreados son reacciones que incluyen ADN de plantilla y los símbolos abiertos son control negativo (ddH20) .

Como se ilustra en la Figura 14, en general, la presencia de mayores cantidades de la sonda absorbente en una mezcla de reacción dio resultado retrasos más prolongados al comienzo del incremento observable de fluorescencia. Este resultado confirmó que mayores concentraciones de sonda absorbentes puede interferir con la velocidad de la reacción de LAMP de rk2208.1. Este experimento también demuestra que la sonda absorbente de se puede incorporar en el amplicón de LAMP, aun en la ausencia del cebador de ASA. Estos resultados sugieren además que la inhibición de reacción por la sonda absorbente afecta los pasos en el proceso de LAMP, además de la fijación y extensión del cebador de asa.

Ejemplo 11.- Examen de composición de sonda absorbente para conjunto de cebadores de LAMP de rk2208.1 con cebador 'de asa Para determinar el efecto de la composición de sonda absorbente en la reacción de LAMP incluyendo cebadores de asa, se repitió el Experimento 10 después de incluir los cebadores de asa en las reacciones. Los resultados del experimento se ilustran en la Figura 15, donde los círculos representan bajas concentraciones de sonda (aproximadamente 0.08 µ? de sonda fluorescente y aproximadamente 0.16 µ? de sonda inhibidora) , los triángulos son concentraciones medias de sonda (aproximadamente 0.4 de sonda fluorescente µ? y aproximadamente 0.8 µ? de sonda inhibidora), y los rectángulos son concentraciones medias altas de sonda (aproximadamente 0.8 de sonda fluorescente µ? y aproximadamente 1.6 µ? de sonda inhibidora). Los símbolos sombreados son reacciones que incluyen ADN de plantilla y los símbolos abiertos son control negativo (ddH20) .

Como se ilustra en la Figura 15, las sondas absorbentes para rk2208.1 a las concentraciones más bajas probadas (aproximadamente 0.08 µ? de sonda fluorescente y aproximadamente 0.16 µ? de sonda inhibidora) dieron por resultado señales de fluorescencia después de aproximadamente 20 min. A una concentración media (aproximadamente 0.4 µ de sonda fluorescente y aproximadamente 0.8 µ de sonda inhibidora) se dio por resultado fluorescencia incrementada después de aproximadamente 70 minutos. Las reacciones que incluyen las concentraciones más altas de sonda absorbentes (aproximadamente 0.8 µ de sonda fluorescente y aproximadamente 1.6 µ? de sonda inhibidora) no dieron por resultado fluorescencia incrementada en ningún punto durante la reacción de aproximadamente 120 minutos. Esto confirma que mayores concentraciones de sondas absorbentes interfieren con la velocidad de reacción de LAMP de rk2208.1, y que la presencia de la sonda de asaF de rk2208.1 mejora la velocidad de reacción.

Ejemplo 12.- Evaluación de influencia de tinte de intercalación (EvaGreen) en la velocidad y reacción de LAMP A fin de valorar la influencia del tinte de intercalación (EvaGreen) en la reacción de LAMP, se adicionó EvaGreen a la mezcla de reacción de LAMP de rk2208.1 (con y sin cebador de asaF de rk2208.1), y las reacciones se observaron al medir la señal de fluorescencia. El tiempo para el comienzo de la fluorescencia incrementada bajo estas condiciones se comparó a la velocidad de reacción de LAMP de rk2208.1 con composición óptima de sonda absorbente. Los resultados de este experimento se ilustran en la Figura 16.

La reacción de LAMP de rk2208.1 (con y sin cebador de asaF de rk2208.1) con EvaGreen mostró señal de fluorescencia después de incubación de aproximadamente 30 y aproximadamente 80 min, respectivamente. La reacción de LAMP de rk2208.1 con sonda absorbente mostró reacción en el espacio de aproximadamente 20 min. Estos resultados sugieren que el tinte de intercalación inhibe significativamente la reacción de LAMP de rk2208.1. EvaGreen puede interferir con la eficiencia de ADN-polimerasa Bst, puesto que esta enzima tiene actividad de desplazamiento de hebra y el tinte de intercalación estabiliza el ADN de doble hebra.

Ejemplo 13.- Examen de desempeño de sonda absorbente para detección simultánea basada en LAMP de ADN genómicos de bacteriófago lambda y de Salmonella entérica 1 La Figura 17 es una gráfica de fluorescencia relativa versus tiempo para reacciones de LAMP que amplifican ADN genómicos de bacteriófago lambda y de Salmonella entérica . Se midieron valores de fluorescencia en el canal de fluoresceína (Aex/em = 500/530 marca de sonda para SeOlF) y Cy3 (Aex/em = 550/570 marca de sonda para fago lambda F) . Las muestras que contienen ADN genómicos tanto de Salmonella entérica como bacteriófago lambda se representan por círculos sólidos^**', los controles negativos sin ADN de plantilla se representan por círculos abiertos^- ' ' , las muestras con solo ADN genómico de Salmonella ent rica se representan por triángulos sólidos ( /^1), y aquellas con solo ADN genómico de bacteriófago lambda se representan por diamantes sólidos La Figura 18 es una gráfica de fluorescencia relativa versus tiempo para reacciones de LAMP que amplifican ADN genómicos de Salmonella entérica y/o bacteriófago lambda. Se midieron valores de fluorescencia en el canal de fluoresceína (Aex/em = 500/530 marca de sonda para SeOlF) durante la detección multiplexada usando sondas absorbentes . Las muestras con ADN genómicos tanto de Salmonella entérica como de bacteriófago lambda se representan por círculos sólidos (^)' , los controles negativos con ddH20 se representan por círculos abiertos (O) , las muestras con solo AD genómico de Salmonella entérica se representan por triángulos sólidos (^)¡, y aquellas con solo ADN genómico de bacteriófago lambda se representan por diamantes sólidos (^)· .

La Figura 19 es una gráfica de fluorescencia relativa versus tiempo para reacciones de LAMP que amplifican ADN genómicos de Salmonella entérica y/o bacteriófagó lambda. Se midieron valores de fluorescencia en el canal Cy3 (Xex/em = 550/570 marca de sonda para fago lambda F) durante la detección multiplexada con sondas absorbentes. Las muestras con ADN genómicos tanto de Salmonella. ent rica 1 como de bacteriófago lambda se representan por círculos sólidos (®)> , los controles negativos con ddH20 se representan por círculos abiertos (O) , las muestras con solo ADN genómico de Salmonella entérica se representan por triángulos sólidos (^??, y las muestras con solo ADN genómico de bacteriófago lambda se representan por diamantes sólidos (^)· .

Notablemente, en cada uno de los ejemplos de las Figuras 17, 18 y 19, al usar sondas absorbentes, únicas específicas de secuencia, patógenos individuales con fluoróforos espectralmente únicos, se pueden detectar de forma específica al mismo tiempo diferentes patógenos.

En resumen, las modalidades de varias nuevas tecnologías poderosas se describen que solas o en cualquier combinación, pueden permitir la tipificación más rápida de sub-poblaciones relacionadas de patógenos bacterianos que, a pesar de presentar determinantes antigénicos muy similares, pueden variar considerablemente en la especificidad del hospedador, virulencia, u otras características biológicas importantes para la propagación de la enfermedad. Las tecnologías basadas en genes se pueden transferir fácilmente dado los datos de secuencia para discriminar las varias poblaciones de interés. Al usar un planteamiento isotérmico a la replicación de ADN, se mejora la sensibilidad y selectividad de detección aun en volúmenes de muestra relativamente grandes sin el gasto adicional, complejidad y sin requisitos de energía del equipo de ciclización térmica.

Se demuestra la capacidad para controlar la temperatura de proceso para la reacción de LAMP en un medio de disco compacto usando un láser de especificaciones similares a los medios digitales normales y con mediciones de temperatura sin contacto después de corregir las pérdidas de 1 transmisión a través de la concavidad de reaccxon y reflexión i de la radiación térmica ambiente.

También se demuestra la capacidad para observar el progreso de la replicación de LAMP en tiempo real usando sondas ópticas. Se han identificado parámetros que tienen influencia en las condiciones para hibridación de las sondas moleculares y pueden dar por resultado velocidad y sensibilidad mejoradas de detección. Estos parámetros pueden incluir la relación de la sonda inhibidora a la fluorescente, la manera de mezclado de las hebras para crear la sonda absorbente, la concentración de polimerasa, y la cantidad total de sonda absorbente dentro de la mezcla de reacción de LA P.

El desempeño de un fluorómetro habitual con el sistema basado en CD sugiere que la reacción se puede monitorizar en tiempo real en el medio CD, y están en curso experimentos para demostrar esto de forma definitiva. La integración de este sistema de detección y control sin contacto con secuenciación de base centrífuga de la captura de muestra, lavado, lisis y extracción de ADN puede dar por resultado un sistema rápido y amigable al usuario para permitir la detección de patógenos en el campo y en situaciones de cuarentena animal y vegetal.

Aunque la descripción anterior ha mostrado, descrito y señalado las nuevas características f ndamentales j de las presentes enseñanzas, se entenderá que varias omisiones, sustituciones, cambios y/o adiciones en la forma del detalle del aparato como se ilustrada, así como j los usos del mismo, se pueden hacer por aquellos expertos en la técnica, sin apartarse del alcance de las presentes enseñanzas. En consecuencia, el alcance de las presentes enseñanzas no se debe limitar al análisis anterior, sino que se debe definir por las reivindicaciones anexas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (20)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad ? lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para monitorizar la amplificación isotérmica mediada por asa (LAMP) de un ADN objetivo o diana, caracterizado porque comprende: poner en contacto una onda absorbente una ADN-polimerasa con una mezcla de reacción de LAMP, en donde la mezcla de reacción de LAMP comprende el ADN objetivo y uno o más cebadores de LAMP que hibridan con el ADN objetivo, en donde la sonda absorbente comprende una primera y segunda hebras de oligonucleótido, en donde la primera hebra de oligonucleótido comprende una sonda inhibidora en un extremo 3' y en donde la segunda hebra de oligonucleótido de la sonda absorbente comprende un fluoróforo en un extremo 5'; en donde la relación de la cantidad de la segunda hebra de oligonucleótido a la cantidad de la primera hebra de oligonucleótido es menos de 1:1; medir la fluorescencia emitida por la mezcla de reacción de LAMP que se ha puesto en contacto con la sonda absorbente y la ADN-polimerasa.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor comprende DABCYL, TAMRA, y un inhibidor de hoyo negro. ¡

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fluoróforo comprende fluoresceína, cy3 , cy5, o uno o más puntos cuánticos.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera hebra de oligonucleótido y la segunda hebra de oligonucleótido no se hibridan entre si.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración del ADN-polimerasa es mayor que o igual a 8U.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad de la primera [hebra de oligonucleótido está dentro del intervalo entre 0.02 a 0.8 µ?.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad de la segunda hebra de oligonucleótido está entre el intervalo entre 0.01 µ? a 0.4 µ?.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ADN objetivo comprende ADN bacteriófago lambda, cepas raza 3 biovar 2 de Ralstonia solanacearum, Ralstonia solanacearum, Salmonella entérica, o Staphylococcus aureus .

9. Una sonda absorbente para monitorizar la amplificación isotérmica mediada por asa (LAMP) de un ADN objetivo o diana, caracterizada porque comprende: una primera hebra de oligonucleotido que comprende una sonda inhibidora en un extremo 3 ' de la primera hebra de oligonucleotido; una segunda hebra de oligonucleotido que comprende un fluoróforo en un extremo 5' de la segunda hebra de oligonucleotido; en donde la relación de la cantidad de la segunda hebra de oligonucleotido a la primera hebra de oligonucleotido es menos de 1:1.

10. La sonda de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el fluoróforo comprende fluoresceína, cy3 , cy5, o uno o más puntos cuánticos.

11. La sonda de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la el inhibidor comprende DABCYL, TAMRA, o un inhibidor de hoyo negro.

12. La sonda de conformidad con la reivindicaciones 9, caracterizada porque la primera hebra de oligonucleotido y la segunda hebra de oligonucleotido no hibridan entre sí.

13. La sonda de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la cantidad de la primera hebra de oligonucleotido está dentro del intervalo entre 0.02 a 0.8 µ?.

14. La sonda de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la cantidad de la segunda ¡hebra de oligonucleótido está dentro del intervalo entre ?.?? µ? a 0.4 µ?.

15. La sonda de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la segunda hebra de oligonucleótido comprende un segmento no acoplado saliente que no es complementario a la primera hebra de oligonucleótido.

16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sonda absorbente se 1 pone en contacto con la mezcla de reacción de LAMP antes dé que la ADN-polimerasa se ponga en contacto con la mezcla de reacción de LAMP.

17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ADN-polimerasa se pone en .contacto con una mezcla de reacción de LAMP que comprende una sonda absorbente .

18. El método para detectar la presencia o ausencia de un ADN objetivo, caracterizado porque comprende poner en contacto una sonda absorbente y una ADN-polimerasa con una mezcla de reacción de LAMP, en donde la mezcla de reacción de LAMP comprende una muestra que se va a probar para la presencia; de ADN objetivo y uno o más cebadores de LAMP capaces de amplificar el ADN objetivo, en donde la sonda absorbente comprende una primera y una segunda hebras de oligonucleotido en donde la primera hebra de oligonucleotido comprende una son inhibidora en un extremo 3' y en donde la segunda hebra de oligonucleotido de la sonda absorbente comprende un fluoroforo en un extremo 5'; en donde la relación de la cantidad de la segunda hebra de oligonucleótido a la cantidad de la primera hebra de oligonucleotido es menos de 1:1, y detectar la presencia o ausencia del ADN objetivo.

19. El método de conformidad con la reivindicación i. 18, caracterizado porque la detección comprende medir la fluorescencia emitida por la mezcla de reacción de LAMP que se ha puesto en contacto con la sonda absorbente y la ADN-polimerasa.

20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende: detectar simultáneamente la presencia o ausencia de i diferentes ADN objetivo o diana, en donde el uno o más cebadores de LAMP capaces de i identificar el ADN objetivo son capaces de amplificar diferentes ADN objetivo, en donde se ponen en contacto múltiples* sondas absorbentes con la mezcla de reacción de LAMP.