CN104745694A

CN104745694A - 一种转基因水稻科丰6的恒温探针法检测引物组、检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN104745694A
Application number: CN201510117414.7A
Authority: CN
Inventors: 黄曦; 黄裴
Original assignee: Hua Mai Bio Tech Ltd Suzhou
Current assignee: Hua Mai Bio Tech Ltd Suzhou
Priority date: 2015-03-17
Filing date: 2015-03-17
Publication date: 2015-07-01

Abstract

本发明公开了一种转基因水稻科丰6的恒温探针法检测引物组、检测试剂盒及检测方法。检测引物组包括外引物、内引物、环引物和探针引物。为避免假阳性扩增，本发明在检测引物组中引入特异性分子探针，该探针可实时与产物扩增产生的靶标片段特异性结合并发出荧光信号，如扩增产物为非靶标基因，该探针不与扩增的产物进行结合，无荧光信号发出，检测结果仍为阴性。该检测方法克服恒温检测技术的不足，将进一步引领恒温检测技术的在检测中的推广应用。

Description

一种转基因水稻科丰6的恒温探针法检测引物组、检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物品种的检测试剂盒及其检测方法，具体涉及一种转基因水稻科丰6的恒温探针法检测引物组、检测试剂盒及检测方法。

背景技术

自转基因作物投入商业化种植来，全球转基因作物种植面积累计已经超过10亿公顷。2010年，全球29个国家的1540万农民种植了共1.48亿公顷的转基因作物。自1996年至2010年，全球转基因作物的种植面积增加了87倍。种植转基因作物排名前十位的国家种植面积首次均超过了100万公顷。目前，世界各国已进行田间试验的转基因作物超过5000种，批准商品化的转基因作物有160多种，包括玉米、大豆、油菜、番茄、马铃薯、甜椒、木瓜、甜菜、烟草、水稻等。从世界范围看，转基因的推广已经带来了巨大的社会和经济效益。然而转基因粮食在带来巨大社会和经济效益的同时也存在许多问题，主要集中在转基因食品的安全性以及对生态环境的安全性方面，包括对人和动物健康的风险，对生态环境与农业的风险，对非目标生物的风险。近来在全球范围内引起场转基因生物安全性的争论，支持和反对两派争锋相对，势不两立，为便于消费者区分及选购，各国分别提出对转基因食品进行标识管理，并对最低含量作出规定。因此建立快速有效的检测方法体系，对作物及食品进行区分尤为重要。

目前转基因作物的检测主要是检测样品是否含有外源蛋白质（基因表达产物）和是否含有外源基因（DNA）。转基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫原理的酶联免疫吸附法（ELISA）试纸条检测、Western杂交等方法检测，但是这种方法要求高质量高稳定性的抗体，否则因准确性不够，只能作为辅助检测手段，另因检测靶标是蛋白，经深加工的食品蛋白已发生变性，故外源蛋白质检测方法对于深加工的食品检测具有一定局限性。转基因作物的核酸检测方法主要有PCR检测技术、恒温检测技术。然而PCR检测技术存在如下问题，1）PCR方法反应体系和操作过程比较复杂，需要专业人员；2)所需PCR仪价格昂贵，检测时间长；3)电泳常用染料EB为强致癌物质，有较强毒性，且难以实行现场检测，所以PCR检测技术在基层仍未得到推广应用。

恒温基因扩增技术具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，自建立来已得到广泛的应用，并在原基础上发展出采用SYBR Green染色法、钙黄绿素法、浊度法、荧光染料法等不同结果伴读方法，适合现场及快速检测，已在基层得到推广应用，但所采用的SYBR Green染色法、钙黄绿素法、浊度法、荧光染料法等在检测原理上具有先天的不足，都以核酸扩增产物或副产物为靶标进行直接检测，如检测中所发生的是非特异扩增，检测结果仍为阳性结果，即以上的测试方法存在检测结果为假阳性的问题（特异性差的问题），开发一种可避免假阳性的转基因检测试剂盒是目前亟待解决的难题。

为避免假阳性扩增，本发明在检测引物组中引入特异性分子探针，该探针可实时与产物扩增产生的靶标片段特异性结合并发出荧光信号，如扩增产物为非靶标基因，该探针不与扩增的产物进行结合，无荧光信号发出，检测结果仍为阴性。该检测方法克服恒温检测技术的不足，将进一步引领恒温检测技术的在检测中的推广应用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种转基因水稻科丰6的恒温检测试引物组。

本发明的另一个目的在于提供一种转基因水稻科丰6的恒温检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供一种转基因水稻科丰6的恒温检测方法。。

本发明所采用的技术方案如下：

转基因水稻科丰6的恒温检测引物组，包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2、环引物和探针引物，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物1：5’- ACGTAGTGCGTACCGCCGTGTG-3’；

外引物2：5’- GAATCGAGCTTGATCCAGAGTTC-3’；

内引物1：

5’- CCTGATATCTGTACAATGGCATTGAGGAGGCGTTGTACTGAGAACCATGCTGCG-3’；

内引物2：5’- GCCAGGCAAGTGTCGTTGCCTCATCTTCATCCCTGGACTTGC-3’；

环引物：5’- GACGTTGCTGATTTCTGTTACAAAC-3’；

探针引物：FAM-AATTCTAGTGCAGATGCATGAATGAATT-BHQ-1。

一种转基因水稻科丰6的恒温检测试剂盒，其包括如上所述的恒温检测引物组。

所述试剂盒中还包括：DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照和阴性对照。

所述LAMP反应液包括10mM dNTP、150mM MgSO₄水溶液，二者的体积比是7～9：2～4。

所述阳性对照为转基因水稻科丰6的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。

一种转基因水稻科丰6的检测方法，包括如下步骤：

（1）提取待检样品DNA。

（2）恒温基因扩增反应：利用权利要求1所述的恒温检测引物组对待检样品进行恒温扩增，扩增时将检测管放置在可提供恒温及荧光检测的仪器上，每30～60s采集一次荧光信号；

恒温基因扩增反应体系的25μl反应体系含有：内引物1 0.2μM，内引物2 0.2μM，外引物1 1.6μM，外引物2 1.6μM，环引物0.8μM，探针引物0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，待检样品DNA 2μl ，用超纯水补齐到25μl；

恒温基因扩增反应的程序为：60～63℃反应20～60min。

（3）结果判断：根据有无“S”型扩增曲线判断阴阳性结果，有“S”型扩增曲线为阳性结果，反之为阴性结果。

本发明的有益效果在于：

本发明基于恒温扩增技术，在引物组中引入特异性探针引物，可实时监测反应的过程，并可有效降低假阳性的发生，该发明具有高特异性、高灵敏度、鉴定简便、快速高效、操作简便等有益效果：

（1）高特异性：本发明根据转基因水稻科丰6的外源基因与内源基因结合处设计了5条特异性引物，应用上述5条引物，扩增靶序列，具有很强的品系特异性，同时在引物体系中引入特异性探针引物，只有特异性探针引物与扩增靶片段结合时才有荧光信号发出，仪器才判为阳性，有效的进一步提高特异性，避免因形成引物二聚体及非靶标基因扩增造成的假阳性；

（2）快速高效：整个扩增只用20～60min即可完成，扩增产量可达10⁹～10¹⁰个拷贝；

（3）操作简便：扩增完成后，无需电泳，开盖加入荧光染料，仪器可根据荧光探针与扩增靶标结合发出的荧光信号自动判读检测结果；

（4）高灵敏度：最低检测极限可达到0.01%。

附图说明

图1为实施例3灵敏度检测图；

图2为实施例4特异性检测图；

图3为实施例5实际样品检测图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1 转基因水稻科丰6的恒温检测试剂盒的建立

转基因水稻科丰6的恒温检测试剂盒，包括如下组分：

（1）LAMP检测引物组，引物序列如下所示：

外引物1：5’- ACGTAGTGCGTACCGCCGTGTG-3’（SEQ ID NO.1）；

外引物2：5’- GAATCGAGCTTGATCCAGAGTTC-3’（SEQ ID NO.2）；

内引物1：

5’- CCTGATATCTGTACAATGGCATTGAGGAGGCGTTGTACTGAGAACCATGCTGCG-3’（SEQ ID NO.3）；

内引物2：5’- GCCAGGCAAGTGTCGTTGCCTCATCTTCATCCCTGGACTTGC-3’（SEQ ID NO.4）；

环引物：5’- GACGTTGCTGATTTCTGTTACAAAC-3’（SEQ ID NO.5）；

探针引物：FAM-AATTCTAGTGCAGATGCATGAATGAATT-BHQ-1（SEQ ID NO.6）。

（2）反应液：含有10mM dNTP、150mM MgSO4水溶液，二者的体积比是7～9：2～4；

（3）DNA聚合酶

（4）对照：阳性对照为转基因水稻科丰6的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的双蒸水。

实施例2 转基因水稻科丰6的恒温检测方法

利用实施例1的转基因水稻科丰6的恒温检测试剂盒对样品进行检测，步骤如下：

（1）提取待检样品DNA。

（2）恒温基因扩增反应：利用权利要求1所述的恒温检测引物组对待检样品进行恒温扩增，扩增时将检测管放置在可提供恒温及荧光检测的仪器上，如ABI7500仪器，每30～60s采集一次荧光信号；

恒温基因扩增反应的程序为：60～63℃反应20～60min。

实施例3灵敏度试验

使用实施例1中的试剂盒和实施例2的方法，对不同浓度的已知样品进行检测，具体过程如下：

（1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取已知浓度的样品DNA，转基因水稻科丰6的含量如下：1%、0.1%、0. 05%、0.01%、0.005%、0.001%的样品；

（2）恒温基因扩增反应：在200μl PCR管配制反应体系：引物液1μl，反应液 12.5μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA 2μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；用含目的基因的大肠杆菌质粒DNA作为阳性对照，用双蒸水作为阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，将反应管放置在ABI7500仪器上，设置1min采集1次信号，63℃反应45min；

（3）结果判断：反应结束后，根据“S”型扩增曲线判断结果。结果显示浓度为1%、0.1%、0. 05%、0.01%的样品有明显的“S”型扩增曲线，表明试剂盒灵敏度可达到0.01%，如图1所示。

实施例4特异性试验

用实施例1的试剂盒和实施例2的方法进行特异性验证，分别对分离纯化的转基因水稻科丰6、BT176、BT11、EVENT98140、59122、MON810、MON88017、MON89034、MON863、GA21，转基因大豆MON89788，转基因水稻BT63，转基因土豆EH92-527-1，转基因油菜T45，转基因棉花GHB614，非转基因玉米、水稻、小麦、油菜、棉花进行鉴定。

鉴定结果显示：转基因玉米BT176、BT11、EVENT98140、59122、MON810、MON88017、MON89034、MON863、GA21，转基因大豆MON89788，转基因水稻BT63，转基因土豆EH92-527-1，转基因油菜T45，转基因棉花GHB614，非转基因玉米、水稻、小麦、油菜、棉花反应管均无“S”型扩增曲线，转基因水稻科丰6的反应管有“S”型扩增曲线，结果表明该试剂盒具有良好的特异性，如图2所示。

实施例5 实际样品检测

利用实施例1的试剂盒和实施例2的方法对已知2个阳性的科丰6水稻样品和2个已知阴性的水稻样品进行检测，结果显示已知阳性的样品有明显的“S”型扩增曲线，已知阴性的水稻样品无“S”型扩增曲线，如图3所示。

以上实施例表明，本发明的检测方法可有效降低假阳性的发生，具有高特异性、高灵敏度、鉴定简便、快速高效、操作简便等有益效果。

<110> 苏州华麦生物科技有限公司

<120> 一种转基因水稻科丰6的恒温探针法检测引物组、检测试剂盒及检测方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgtagtgcg taccgccgtg tg 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaatcgagct tgatccagag ttc 23

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctgatatct gtacaatggc attgaggagg cgttgtactg agaaccatgc tgcg 54

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccaggcaag tgtcgttgcc tcatcttcat ccctggactt gc 42

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gacgttgctg atttctgtta caaac 25

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aattctagtg cagatgcatg aatgaatt 28

Claims

1.转基因水稻科丰6的恒温检测引物组，包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2、环引物和探针引物，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物1：5’- ACGTAGTGCGTACCGCCGTGTG-3’；

外引物2：5’- GAATCGAGCTTGATCCAGAGTTC-3’；

内引物1：

5’- CCTGATATCTGTACAATGGCATTGAGGAGGCGTTGTACTGAGAACCATGCTGCG-3’；

内引物2：5’- GCCAGGCAAGTGTCGTTGCCTCATCTTCATCCCTGGACTTGC-3’；

环引物：5’- GACGTTGCTGATTTCTGTTACAAAC-3’；

探针引物：FAM-AATTCTAGTGCAGATGCATGAATGAATT-BHQ-1。

2.一种转基因水稻科丰6的恒温检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的恒温检测引物组。

3.根据权利要求2所述的转基因水稻科丰6的恒温检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照和阴性对照。

4.根据权利要求3所述的转基因水稻科丰6的恒温检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液包括10mM dNTP、150mM MgSO₄水溶液，二者的体积比是7～9：2～4。

5.根据权利要求3所述的转基因水稻科丰6的恒温检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为转基因水稻科丰6的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。

6.一种转基因水稻科丰6的检测方法，包括如下步骤及特征：

（1）提取待检样品DNA；

7.根据权利要求6所述的转基因水稻科丰6的检测方法，其特征在于，所述恒温基因扩增反应体系的25μl反应体系含有：内引物1 0.2μM，内引物2 0.2μM，外引物1 1.6μM，外引物2 1.6μM，环引物0.8μM，探针引物0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，待检样品DNA 2μl ，用超纯水补齐到25μl。

8.根据权利要求6所述的转基因水稻科丰6的检测方法，其特征在于，所述恒温基因扩增反应的程序为：60～63℃反应20～60min。