CN103451291B

CN103451291B - Cry1Ab/Cry1Ac抗虫基因RPA检测方法

Info

Publication number: CN103451291B
Application number: CN201310390769.4A
Authority: CN
Inventors: 金芜军; 宛煜嵩; 徐潮; 张秀杰; 苗朝华; 黄卫红
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2013-09-02
Filing date: 2013-09-02
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2033-09-02
Also published as: CN103451291A

Abstract

本发明公开了一种适用于重组酶聚合酶等温扩增技术（RecombinasePloymeraseAmplification,RPA）用于鉴定含有转Cry1Ab/Cry1Ac基因（Cry1Ab基因，Cry1Ac基因或Cry1Ab/c融合基因）抗虫植物的引物及探针组合，其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示。同时，本发明还公开了一种鉴定转有该基因植物的方法：提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的引物进行RPA快速扩增及实时荧光检测，如果得到明显的扩增曲线，则证明所检样品DNA中含有转Cry1Ab/Cry1Ac基因成分。本发明提供了转Cry1Ab/Cry1Ac基因抗虫作物的基因特异性的RPA检测方法。

Description

Cry1Ab/Cry1Ac抗虫基因RPA检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及的是用于重组酶聚合酶等温扩增技术（Recombinase Ploymerase Amplification, RPA）技术快速鉴定抗虫转Bt基因植物中Cry1Ab/Cry1Ac基因（Cry1Ab基因，Cry1Ac基因或Cry1Ab/c融合基因）成分。

背景技术

目前DNA扩增是核酸检测的主要方法，常用的PCR检测需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。近年来，核酸恒温扩增技术得到了长足的发展，与传统PCR相比核酸恒温扩增技术不需要昂贵的PCR仪，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便，快速，灵敏等优点。RPA技术是模拟生物体内DNA复制、基于重组酶聚合酶介导的扩增原理发展而来，利用重组酶和引物形成微丝在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时, 在单链DNA结合蛋白的帮助下, 使模板DNA解链, 引物与模板DNA开始配对形成复制所需自由的3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸, 形成新的DNA互补链反应产物也是以指数级增长。与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物长度通常为30-35nt。引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度增加，引物序列的设计与选择对RPA的结果至关重要。在RPA扩增体系中加入一个荧光标记的探针便可实现模板扩增的实时监测，该探针中部两个T碱基上各标记一个荧光集团（FAM和BHQ1），在两个集团之间有一个脱碱基位点（dSpacer），该位点可被一种来自大肠杆菌的核酸外切酶识别，该酶具有3’-5’外切酶活性，可以使两个荧光集团分离，从而使荧光信号与扩增产物的累积相同步。结合一个便携式的荧光扩增检测仪便可在10-20分钟内检测到荧光曲线。RPA技术极大地缩短了检测时间，简化了反应程序，与DNA快速提取技术相结合使野外检测成为可能，具有广泛的应用前景。

PCR技术对转基因产品检测的方法有筛选检测，基因特异性检测，构建特异性检测和转化体特异性检测。其中基因特异性检测是指对转化的外源目的基因进行检测。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）是一种寄生在昆虫体内的细菌，它可以产生由Bt基因编码的杀虫晶体蛋白使一些宿主害虫致病。通过生物技术手段将Bt杀虫基因整合到农作物基因组中，使一些作物具有抗虫特性。

目前转Bt基因植物及其产品种类繁多，引起了公众的广泛关注，建立一种快速简便的室外检测方法具有重要意义，可用于市场监管和例行监测，为转基因生物安全管理提供技术支撑。在已报道的转基因植物检测方法中，主要是利用PCR仪在实验室中进行常规的检测，该方法还不能进一步满足转基因产品的快速检测。国内外目前还没有利用RPA技术对转Cry1Ab/Cry1Ac基因植物做基因特异性鉴定。

发明内容

针对上述领域的空白，本发明提供了准确、快速、简便检测转Cry1Ab和/或Cry1Ac基因（Cry1Ab基因，Cry1Ac基因或Cry1Ab/c融合基因）的水稻、玉米及棉花等基因特异性的RPA检测方法。

本发明提供的技术方案是：一种用于通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定含有转Cry1Ab和/或Cry1Ac基因抗虫植物的引物，其正向引物序列如SEQ ID No.1所述，反向引物序列如SEQ ID No.2所述，探针如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供一种通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定含有转Cry1Ab/Cry1Ac基因植物的方法：提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物进行荧光快速检测，如果得到明显的扩增曲线，则证明所检样品为转Cry1Ab/Cry1Ac基因产品。实施步骤为：向RPA扩增试剂盒推荐反应的50μL扩增体系中加入引物各2μL（10μmol/L），探针0.5μL（10μ mol/L），模板DNA 50ng。RPA扩增检测仪（或荧光定量PCR仪）39摄氏度反应15分钟，或者当待测样品的 DNA为粗提取DNA为模板时，反应30分钟。

本发明方法是通过比对Cry1Ab基因、Cry1Ac基因及Cry1Ab/c融合基因的序列，寻找保守区段，设计大量RPA引物及探针，从中筛选出一套可快速有效检测出Cry1Ab/Cry1Ac基因成分的引物及探针组合。利用该对引物进行快速扩增及实时荧光检测，以转基因水稻华恢1号（TT51-1）等6种阳性样品的基因组DNA为模板可以得到明显的扩增曲线，以非转基因水稻明恢63和玉米两种阴性样品的基因组DNA为模板扩增均没有扩增曲线（图1）。将阳性模板TT51-1基因组DNA用水稀释至10000，2000，500，100，50个拷贝，结果都有扩增曲线（图2），该方法具有较高的灵敏度。以转基因水稻TT51-1和棉花Mon531叶片为材料进行DNA简单粗提取，RPA实验结果表明阳性材料均有扩增曲线（图3），这样极大摆脱了检测过程中对仪器的要求并缩短了检测时间，为RPA方法用于野外检测提供了有力的技术支持。本发明首次提供转Cry1Ab/Cry1Ac基因抗虫作物的基因特异性的RPA荧光检测方法。该方法使生物技术产品在准确、快速检测方面的能力得到提高。

附图说明

图1为Cry1Ab/Cry1Ac特异性检测图，其中，1：转Cry1Ab基因玉米Bt11；2：转Cry1Ab/c融合基因水稻TT51-1；3：转Cry1Ac基因水稻科丰6号；4：转Cry1Ab基因水稻克螟稻1；5：转Cry1Ac基因棉花Mon531；6：转Cry1Ac基因棉花Mon15985；7：非转基因水稻明恢63；8：非转基因玉米。

图2 为灵敏度试验图，从1到6模板拷贝数依次为10000；2000；500；100；50；0

图3为植物叶片基因组粗提取用于RPA方法分析图，其中，1和2：TT51-1；3和4：Mon531；5：明恢63。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）中所述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件。

首先，设计引物：根据TT51-1 （Cry1Ab/c, GenBank No. EU880444）、Mon531（Cry1Ac, GenBank No. AR656168）、Bt11（Cry1Ab, GenBank No. GV597352）和Mon15985（Cry1Ac, GenBank No. EA135632）四种材料中含有的不同抗虫基因序列进行对比并在在保守区设计通用引物和探针。RPA对引物长度要求为30-35nt，这就容易导致在恒温条件下产生大量的引物二聚体从而影响实验效果，RPA实验需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化，筛选，个别碱基的替换或增减都会对实验结果产生重要影响。本实验中设计并筛选出了一对灵敏度高且特异性好的引物用于RPA荧光检测，引物和探针序列见SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3（表1）。

注：FAM:发光基团；dSpacer：脱碱基位点；BHQ1：淬灭基团；phosphate：磷酸基团

1．实验材料

（1）植物材料

转基因水稻TT51-1（转Cry1Ab/c融合基因），转基因水稻科丰6号（转Cry1Ac基因），转基因水稻克螟稻1（转Cry1Ab基因），非转基因水稻明恢63，转基因棉花Mon531（转Cry1Ac基因），转基因棉花Mon15985（转Cry1Ac基因）种子粉末（含量1%），转基因玉米Bt11种子粉末（转Cry1Ab基因），非转基因棉花。

（2）酶与试剂

分子生物学试剂，TwistAmp DNA Amplification Exo Kits 购自TwistDX公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物和探针由北京生工生物技术有限公司合成。

（3）实验仪器

DNA处理仪器：低温混合球磨仪MM400（Retsch）

荧光检测仪：RPA扩增检测仪（Twista）或荧光定量PCR仪。

其它仪器包括：恒温水浴锅、电子天平、离心机、涡旋仪、纯水仪、恒温培养箱等。

2．实验方法和过程

（1）植物基因组DNA的提取

a.水稻嫩叶片或玉米、棉花种子粉末作为DNA提取材料，依照TianGen Plant Genomic DNA Kit（Cat#DP-305）试剂盒的操作手册，进行植物总DNA的提取。

b.植物基因组粗提取：剪取水稻或棉花叶片100mg放于2.0mL离心管中，将离心管放入液氮中冷冻片刻，拿出后迅速用枪头将其捣碎。向管中放入600mL去离子双蒸水溶解，之后可将溶解液作为模板直接加入RPA反应体系中进行检测。

（2） DNA浓度和纯度测定

使用NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Scientific）测定DNA的纯度和浓度，并用去离子双蒸水调节DNA浓度至40-50ng/μL。

（3）引物扩增

本实施例中用于PRA方法扩增植物基因组中外源插入基因的一个片段，以此来鉴定转Cry1Ab/Cry1Ac基因水稻，棉花和玉米，模板浓度为40-50ng/μL。

RPA扩增体系为：总体系50μL，向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp Exo反应管中加入再水化缓冲液29.5μL，醋酸镁溶液2.5μL（280mmol/L），引物各2μL（10μmol/L），探针0.5μL（10μmol/L），模板DNA 50ng，剩余用水补足；

引物扩增程序：RPA扩增检测仪39摄氏度反应15分钟（粗提取DNA为模板反应30分钟）。

3．实验结果

根据Cry1Ab/Cry1Ac基因序列设计正向引物和反向引物，对转基因水稻TT51-1等8种样品基因组DNA进行RPA荧光检测，能够快速准确地鉴定出样品中是否含有Cry1Ab/Cry1Ac基因，其中在TT51-1等6种样品有明显的荧光曲线，而非转基因水稻明恢63和非转基因玉米两种材料中均没有扩增曲线，结果与预期相符，如图1中所示。将模板用水稀释至10000，2000，500，100，50个拷贝，结果都有扩增曲线（图2）。以转基因水稻TT51-1和棉花Mon531叶片为材料进行DNA简单粗提取，RPA实验结果表明阳性材料均有扩增曲线（图3），说明利用本发明设计的引物和方法鉴定转Cry1Ab/Cry1Ac基因植物具有较高的准确性，灵敏性，且使用于植物田间的转基因检测。

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>Cry1Ab/Cry1Ac抗虫基因RPA检测方法

<160> 3

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<400> 1

GCTATCCCAT TGTTCGCAGT CCAGAACTA CCAAGT

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<400> 2

CCTAGTAAGG TCGTTGTAAC GGCTATTGAT GGTTG

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<400> 3

TAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTACGGTTTGGGCAAAG

Claims

1.一种用于通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定含有转Cry1Ab和/或Cry1Ac基因成分的RPA引物对和探针组合，其特征在于：其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。

2.一种鉴定含有转Cry1Ab和/或Cry1Ac基因抗虫植物的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含权利要求1所述的引物对和探针组合。

3.一种通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定含有转Cry1Ab和/或Cry1Ac基因抗虫植物的方法，其特征在于：提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物对和探针组合进行快速扩增及实时荧光检测，如果得到明显的扩增曲线，则证明所检样品为转Cry1Ab和/或Cry1Ac基因产品。

4．如权利要求3所述的方法，其特征在于：

RPA扩增体系为：总体系50μL，向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp Exo反应管中加入再水化缓冲液29.5μL，280mmol/L醋酸镁溶液2.5μL，10μmol/L引物各2μL，10μmol/L探针0.5μL，模板DNA 50ng，剩余用水补足；

扩增程序为：RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪于39摄氏度反应15分钟，或者当待测样品的 DNA为粗提取DNA为模板时，反应30分钟。