CN109971881B - 一种鉴定多价转基因抗虫水稻基因型的引物对及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定多价转基因抗虫水稻基因型的引物对及方法。本发明针对转基因水稻TT51‑1（转cry1Ab/cry1Ac融合基因）、T2A‑1（转cry2A基因）和T1C‑19（转cry1C基因），设计了一系列多重引物，用于在水稻选育材料中检测单价、二价、三价转Bt基因的基因型，以便尽快确认Bt基因的纯合或者杂合状态，解决抗虫表型鉴定无法区分单价和多价的问题；实验表明，本发明的检测方法特异性好、不需要借助较昂贵或较费时的检测手段，能够加快抗虫转基因水稻的选育进程。
Description
技术领域
本发明属于农业生物工程技术领域，具体涉及一种鉴定多价转基因抗虫水稻基因型的引物对及方法，用于含cry1Ab/cry1Ac融合基因、cry2A基因和cry1C基因的稻种资源的鉴定和辅助选育。
背景技术
水稻鳞翅目害虫是水稻丰产和稳产的重要影响因素之一。稻纵卷叶螟、二化螟、三化螟对我国水稻生产造成的损失可占总产量的5％～10％，其主要危害表现为造成叶片枯白、枯心苗、白穗。目前在水稻中尚未发现对水稻鳞翅目害虫具有抗性的稻种资源，因此过去对螟虫的防治主要以施用农药为主，但也存在防治效果不佳、农药残毒污染、增加成本等问题。Bt基因是来自于苏云芽孢杆菌的一种杀虫基因，其表达蛋白可特异性毒杀鳞翅目、鞘翅目等不同昆虫，是目前农业生产上转基因育种主要使用的抗虫基因。但在抗虫育种及生产中发现，随着Bt杀虫剂的大量应用，会使害虫产生抗性，作用不持久，而使其应用具有一定的风险。因为不同的Bt蛋白在昆虫体内的受体并不相同，因此同时利用多个Bt基因的多价抗虫水稻，可以获得抗虫性状的持久利用。
目前国内水稻科学家们已经培育出一系列的转Bt基因抗虫水稻，如转基因水稻TT51-1(转cry1Ab/cry1Ac融合基因)，转基因水稻T2A-1(转cry2A基因)，转基因水稻T1C-19(转cry1C基因)等(Tu et al.,2000；Ye et al.,2001a；Chen et al.,2005；Tang et al.,2006)，并利用这些转化事件通过杂交和系统选育的方法，培育了一批具有商业生产潜力的转基因水稻新品种。在这些选育过程中，选育Bt基因纯合的优良单株是决定育种进程的一个关键因素。目前常用的检测Bt基因的分子标记主要是根据外源插入片段序列设计的特异显性标记，该标记可以检测目标基因的有无，无法判断当代植株的纯合或杂合基因型，需要在下一代对基因型或者表型进行群体验证(邓鸿铃等,2007；Tang et al.,2006；Yang etal.,2011)。在筛选含多个Bt抗性基因的纯合后代时，利用显性标记对基因型进行筛选或者通过表型鉴定效率都会更低，费时费力。根据转基因插入位点附近的序列设计多重PCR标记，可以有效鉴别基因型的纯合和杂合(欧阳波等,2006；贾芝琪等,2009；张焕春等,2012)，特别是在多价抗性纯合后代的筛选中，能提高效率，加快育种进程。多重PCR具有高通量、节省样品的优点，但同时在引物设计、反应条件优化上也存在着不小的技术难度。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于针对已经获得转基因安全证书的转基因水稻TT51-1(转cry1Ab/cry1Ac融合基因)、以及在转基因育种研究中被广泛使用的供体材料T2A-1(转cry2A基因)和T1C-19(转cry1C基因)，设计了一系列多重引物，用于在水稻选育材料中检测单价、二价、三价转Bt基因的基因型，以便尽快确认Bt基因的纯合或者杂合状态，解决抗虫表型鉴定无法区分单价和多价的问题，能够加快抗虫转基因水稻的选育进程。
本发明的另一目的在于，提供一种鉴定多价Bt基因转基因抗虫水稻基因型的方法。
本发明的第三个目的在于，提供上述多重引物及鉴定多价Bt基因转基因抗虫水稻基因型的方法在含cry1Ab/cry1Ac融合基因、cry2A基因和cry1C基因的稻种资源的鉴定和辅助选育中的应用。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
第一方面，提供用于在水稻选育材料中检测单价、二价、三价转Bt基因的基因型的引物组合，所述Bt基因为cry1Ab/cry1Ac融合基因、cry2A基因和cry1C基因的任意一种，该引物组合由引物组1、引物组2、引物组3组成，其中，
引物组1由3条引物组成：
1AR1的序列为5’-ttgagaagttagagttccgtc-3’；
1AL1的序列为5’-cagcacatcattggtagagt-3’；
1AI1的序列为5’-tcgtcgtttggtatggc-3’；
引物组1的1AR1和1AI1为检测部分cry1Ab/cry1Ac融合基因及插入点右侧的水稻基因组片段的引物，产物大小为937bp；引物组1的1AR1和1AL1为检测cry1Ab/cry1Ac融合基因插入位点两侧的水稻基因组片段的引物，产物大小为718bp；
引物组2由3条引物组成：
2AL1的序列为5’-gttggtcacggactgtcaag-3’；
2AR1的序列为5’-tcgtcaacgaatcttcctgt-3’；
2AI1的序列为5’-cccagataagggaattaggg-3’；
引物组2的2AL1和2AI1为检测部分cry2A基因及插入点左侧的水稻基因组片段的引物，产物大小为600bp；引物组2的2AL1和2AR1为检测cry2A基因插入位点两侧的水稻基因组片段的引物，产物大小为434bp；
引物组3由3条引物组成：
1CL1的序列为5’-ctttgcgtttgatgttcttc-3’；
1CR1的序列为5’-ttctgcttgttgatcgagtc-3’；
1CI1的序列为5’-agttcccagataagggaatt-3’；
引物组3的1CL1和1CI1为检测部分cry1C基因及插入点左侧的水稻基因组片段的引物，产物大小为495bp；引物组3的1CL1和1CR1为检测cry1C基因插入位点两侧的水稻基因组片段的引物，产物大小为792bp。
第二方面，提供含有上述引物组合的用于在水稻选育材料中多重PCR检测单价、二价、三价转Bt基因的基因型的试剂盒。
第三方面，提供在水稻选育材料中检测单价、二价、三价转Bt基因的基因型的方法，所述方法利用上述引物组合进行多重PCR检测转基因水稻。
具体地，所述方法包括以下步骤：
(1)提取水稻植株的基因组DNA；
(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，将上述引物组合加入到同一PCR反应体系，进行PCR扩增；
(3)反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，染色后于凝胶成像系统下观察，并判断水稻样品的基因型。
优选地，所述步骤(1)采用碱裂解法提取基因组DNA。
优选地，所述步骤(2)中PCR反应体系为30μL：2×PCR Master Mix缓冲液15μL、9条浓度为10μM引物按照1AR1：1AL1：1AI1：2AL1：2AR1：2AI1：1CL1：1CR1：1CI1为0.4:0.15:0.45:0.4:0.1:0.5:0.4:0.15:0.45加入、总DNA2μL、无菌水补足至30μL。
优选地，所述步骤(2)的PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸5min。
优选地，所述步骤(3)中采用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，
如果只含有937bp特征条带，则为cry1Ab/cry1Ac融合基因的纯合体；
如果只同时含有937bp和718bp特征条带，则为cry1Ab/cry1Ac融合基因的杂合体；
如果只含有600bp特征条带，则为cry2A基因的纯合体；
如果只同时含有600bp和434bp特征条带，则为cry2A基因的杂合体；
如果只含有495bp特征条带，则为cry1C基因的纯合体；
如果只同时含有495bp和792bp特征条带，则为cry1C基因的杂合体；
如果含有3条带，则为一基因杂合一基因纯合的二价水稻样品、或三个基因均为纯合的三价水稻样品；
如果含有4条带，则为两基因杂合的二价水稻样品、或一基因杂合两基因纯合的三价水稻样品；
如果含有5条带，则为两基因杂合一基因纯合的三价水稻样品；
如果含有6条带，则为三基因杂合的水稻样品。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、在本发明中，针对已经获得转基因安全证书的转基因水稻TT51-1(转cry1Ab/cry1Ac融合基因)、以及在转基因育种研究中被广泛使用的供体材料T2A-1(转cry2A基因)和T1C-19(转cry1C基因)，设计了一系列多重引物，用于在水稻选育材料中检测单价、二价、三价转Bt基因的基因型，以便尽快确认Bt基因的纯合或者杂合状态，解决抗虫表型鉴定无法区分单价和多价的问题，能够加快抗虫转基因水稻的选育进程；
2、本发明设计的九引物PCR扩增体系产物条带清晰，条带大小区分明显，在普通琼脂糖凝胶上即可有效区分，不需要借助荧光探针或者聚丙烯酰胺凝胶电泳等较昂贵或较费时的检测手段，检测限为25ng；
3、在不同PCR反应体系中的测试结果表明，用常用的国产或者进口PCR反应试剂均能获得较好的扩增结果；对DNA模板的测试结果也表明，不论是经过裂解、抽提、纯化的基因组DNA，还是粗提未经纯化的基因组DNA，均能得到一致的检测结果。
附图说明
图1为设计三引物的原理；
图2为三引物PCR体系在水稻材料中的扩增，其中M:DL2000 marker；1:9311；2：TT51；3：9311/TT51；4：R988；5：T2A-1；6：R988/T2A-1；7：超泰B；8：T1C-19；9：超泰B/T1C-19；
图3为三引物的两两组合检测对转基因抗虫水稻双价基因型的检测，其中图3A：1AL1+1AR1+1AI1+2AL1+2AR1+2AI1六引物组合检测cry1Ab/1Ac和cry2A双价转基因水稻；1：9311/TT51；2：R988/T2A-1；3-11：9311/TT51 X R988/T2A-1 F2后代中不同Bt基因型单株；图3B:1AL1+1AR1+1AI1+1CL1+1CR1+1CI1六引物组合检测cry1Ab/1Ac和cry1C双价转基因水稻；1：9311/TT51；2：超泰B/T1C-19；3-11：9311/TT51 X超泰B/T1C-19 F2后代中不同Bt基因型单株；图3C：2AL1+2AR1+2AI1+1CL1+1CR1+1CI1六引物组合检测cry2A和cry1C双价转基因水稻；1：R988/T2A-1；2：超泰B/T1C-19；3-11：R988/T2A-1 X超泰B/T1C-19 F2后代中不同Bt基因型单株。
图4为九引物PCR体系检测三价转基因水稻，图4A为不同引物浓度使用量的扩增效果；图4B为体系24引物配比在9311/TT51//R988/T2A-1(cry1Ab/1Ac(+/+)cry2A(+/+))xT1C-19(cry1C(+/+))的F2代植株中，利用多引物检测体系分别筛选含有单价、双价、三价不同BT基因型的水稻单株；图4C为体系24引物配比在不同方法提取DNA中，及在不同DNA聚合酶mix中的适用性。
图5为九引物PCR检测三价转基因的检测极限，对模板量为100ng至1.57ng的不同基因组DNA利用体系24进行检测。当浓度低至25ng以下时，不再能有效区分出6条目的带。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】材料准备
转Bt基因纯合系TT51(cry1Ab/1Ac)、T2A-1(cry2A)、T1C-19(cry1C)由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室/国家植物基因研究中心(武汉)提供。非转基因水稻9311、R988、超泰B由杂交水稻国家重点实验室(武汉大学)保存。
分别用9311与TT51、R988与T2A-1、超泰B与T1C-19杂交，以获得的F1自交得F2用于筛选单价Bt转基因的不同基因型植株；同时将三个F1彼此间两两杂交，在杂交F2后代中筛选双价Bt转基因的不同基因型；在9311/TT51//R988/T2A-1的F2后代中筛选出双价纯合cry1Ab/1Ac(+/+)cry2A(+/+)基因型的水稻单株，再与T1C-19(cry1C)杂交，在杂交F2后代中筛选三价Bt转基因的不同基因型。
【实施例2】引物设计
由NCBI数据库中查询得到TT51(Genebank:EU880444.1)的外源片段插入序列及插入位点两侧水稻基因组序列，T2A-1(Genbank：HQ161063.1)的部分外源片段序列及插入位点左侧水稻基因组序列，T1C-19(Genbank:HQ161062.1)的部分外源片段序列及插入位点左侧水稻基因组序列。如图1所示，根据TT51插入序列及两侧基因组序列设计L+R及I+R组合用于分别检测基因组片段和插入事件。根据T2A-1和T1C-19插入序列及左侧基因组序列设计L+I引物组合检测插入事件，在插入位点右侧选取1kb左右基因组片段设计R引物，用L+R组合检测基因组片段。所有引物利用Premier5软件设计，引物序列及扩增产物信息见表1，由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。
表1引物序列及扩增产物
【实施例3】DNA提取
剪下大约1～2cm长的水稻叶片放于2mL圆底离心管中，并在其中加入钢珠和40μL0.25mol/L NaOH溶液，放在QIAGEN Tissuelyser样品打样机中磨碎匀浆，再加入160μL0.05mol/L(pH＝8.0)Tris-HCl，振荡混合摇匀后12000r/min离心，取上清。
【实施例4】体系优化
4.1三引物PCR体系对转基因水稻材料扩增的特异性检测
因为所设计的引物退火温度均在52-57℃之间，在此区间做梯度PCR测试发现温度影响较小，最终选用56℃作为体系的退火温度。
考虑到三引物多重PCR扩增体系中存在1个正向引物L和2个反向引物I、R，引物相互之间的竞争对扩增效果会有影响。所以，设计了几个不同引物使用量的PCR反应体系，最终选用最为合适的PCR扩增体系：
检测cry1Ab/1Ac的三引物，1AR1：1AL1：1AI1或1AR1：1AL1：1AI2均按照0.5:0.2:0.3的比例进行混合扩增；
检测cry2A的三引物，2AL1：2AR1：2AI1按照0.5:0.15:0.35的比例进行混合扩增；
检测cry1C的三引物，1CL1：1CR1：1CI1或1CL2：1CR2：1CI2均按照0.5:0.15:0.35的比例进行混合扩增；
PCR反应体系为30μL，其中包含2×mix15μL(诺唯赞green mix)，DNA模板2μL和合适量的三引物。(引物浓度为10μmol/L，引物使用量根据优化结果确定)。PCR反应程序为95℃反应5min，然后进入三温度循环，每个循环包括94℃反应30s，56℃反应45s，72℃反应1min，共30个循环，最后72℃反应5min。为了进一步验证三引物体系扩增产物是否为目标序列，对引物L+R,L/R+I,L+R+I在不同水稻材料中扩增出的片段进行测序，过程步骤见【实施例5】，测序结果表明扩增结果与设计一致，均扩增出目标片段。
由图2所示，在转基因纯系材料TT51、T2A-1、T1C-19中，仅能扩出特异转基因事件条带，分别为937bp的A、600bp的C和495bp的E特征条带；在转基因阴性材料9311、R988、超泰B中，仅能扩出基因组序列条带，分别为718bp的B、434bp的D和792bp的F特征条带；在转基因杂合材料9311/TT51、R988/T2A-1、超泰B/T1C-19中，能扩出两条预期大小条带，分别为A和B特征条带、C和D特征条带以及E和F特征条带。
本实施例能区分转基因杂合体、转基因纯合体和非转基因材料，在杂合体中扩增出清晰的片段，片段大小分别与纯合体和阴性材料中的片段大小一致，表现在杂合体两条片段的扩增量几乎一致。
4.2双价转基因水稻材料扩增及条件优化
为了测试不同Bt基因的三引物体系能否同时使用以检测双价转基因水稻，将9311/TT51、R988/T2A-1和超泰B/TIC-19两两杂交，在杂交后代中利用三种三引物体系检测筛选出不同基因型的双价水稻单株，以这些后代DNA作为模板，分别利用不同引物组合进行PCR扩增。
设计了几个不同引物使用量的PCR反应体系，最终选用最为合适的PCR扩增体系：
检测cry1Ab/1Ac和cry2A的六引物，1AR1：1AL1：1AI1：2AL1：2AR1：2AI1按照0.4:0.1:0.5:0.4:0.1:0.5的比例进行混合扩增；
检测cry1Ab/1Ac和cry1C的六引物，1AR1：1AL1：1AI1：1CL1：1CR1：1CI1按照0.5:0.05:0.45:0.5:0.05:0.45的比例进行混合扩增；
检测cry2A和cry1C的六引物，2AL1：2AR1：2AI1：1CL1：1CR1：1CI1按照0.4:0.15:0.45:0.4:0.15:0.45的比例进行混合扩增；
PCR反应体系为30μL，其中包含2×mix15μL(诺唯赞green mix)，DNA模板2μL和合适量的六引物。(引物浓度为10μmol/L，引物使用量根据优化结果确定)。PCR反应程序为95℃反应5min，然后进入三温度循环，每个循环包括94℃反应30s，56℃反应45s，72℃反应1min，共30个循环，最后72℃反应5min。由图3A～C可以看出，不同的6引物组合能够在双价转基因材料中扩增出预期大小条带。
4.3三价转基因水稻材料扩增及条件优化
进一步，将9311/TT51 X R988/T2A-1 F2后代中基因型为cry1Ab/1Ac(+/+)cry2A(+/+)的单株与T1C-19杂交，获得基因型为cry1Ab/1Ac(+/-)cry2A(+/-)cry1C(+/-)水稻材料，用于检测9引物组合的扩增效果。在单价三引物扩增的基础上，把各自适合的引物体系混合在一起后对三价杂合的水稻材料进行PCR扩增，发现可以出现6条大小不同的目的条带，但有的太为微弱。
因此针对9引物组合，本发明设计了不同引物使用量的PCR反应体系。一共设计了27种九引物组合的浓度配比，如表2所示。
PCR反应体系为30μL，其中包含2×mix15μL(诺唯赞green mix)，DNA模板2μL和合适量的九条引物。(引物浓度为10μmol/L，引物使用量根据优化结果确定)。PCR反应程序为95℃反应5min，然后进入三温度循环，每个循环包括94℃反应30s，56℃反应45s，72℃反应1min，共30个循环，最后72℃反应5min。结果由图4A可见，体系24的扩增效果最好，6条扩增条带均清晰可见，其引物配比是，1AR1：1AL1：1AI1：2AL1：2AR1：2AI1：1CL1：1CR1：1CI1为0.4:0.15:0.45:0.4:0.1:0.5:0.4:0.15:0.45。
表2九引物扩增的不同比例
在9311/TT51//R988/T2A-1(cry1Ab/1Ac(+/+)cry2A(+/+))X T1C-19(cry1C(+/+))的F2代植株中，利用三引物检测体系分别筛选含有单价、双价、三价不同BT基因型的水稻单株，用于检测九引物检测体系的特异性。利用体系24的引物配比，对不同基因型的转基因材料进行了检测(图4B)，结果表明9引物PCR体系可以准确区分三种Bt基因的不同基因型。根据杂交亲本的基因型状况不同，利用该检测方法能够在F2或者F3代中快速鉴定出单价、双价和三价Bt转基因水稻的转基因纯合单株。
本发明中1CL2、1CR2和1CI2的组合，以及IAL1、IAR1和IAI2的组合在三价检测体系中效果不佳，条带大小区分不明显，因此不做进一步配比优化。在聚合多价Bt基因的检测过程中，会涉及到大量的DNA提取，按照传统的CTAB提取方法，需要抽提、沉淀，费时费力。利用NaOH和Tris-HCl能快速提取水稻DNA用于PCR检测，但提取的DNA质量不如传统CTAB提取方法。本发明同时也检测了该PCR体系对不同提取方法所获得的DNA模板以及对不同商用PCR扩增试剂的通用性(图4C)，发现对于碱裂解法粗提的DNA和CTAB提取的DNA作为模板进行扩增效果没有明显差别，对不同的商用试剂也有很好的兼容性。
实施例5、引物PCR扩增产物测序
将表1所列的引物进行PCR扩增获得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，回收包含目标片段的胶块，用南京诺唯赞生物科技有限公司生产的DNA胶回收试剂盒回收目标片段DNA，送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。
测序结果如下，黑体标注为所用引物序列，下划线标注为因转基因事件而插入的非水稻外源序列，无下划线标注为水稻基因组序列。
SEQ ID No：14:
SEQ ID No：15:
SEQ ID No：16:
SEQ ID No：17:
SEQ ID No：18:
SEQ ID No：19:
SEQ ID No：20:
SEQ ID No：21:
SEQ ID No：22:
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种鉴定多价转基因抗虫水稻基因型的引物对及方法
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgagaagtt agagttccgt c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagcacatca ttggtagagt 20
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<212> DNA
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tcgtcgtttg gtatggc 17
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gttggtcacg gactgtcaag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 9
agttcccaga taagggaatt 20
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttgctacagg catcgtg 17
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caatcatgga gcaacaaacc 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcatattaac agcgatccga aa 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cccagataag ggaattaggg 20
<210> 14
<211> 718
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagcacatca ttggtagagt gaagaaactg aatctttaaa atagagagca gaaattacca 60
tatccatggt tgagcgagag gggattgcgg ctgggggaag agacattgga ccgatttgga 120
gagaggaact gaaaagcccc aaattgactt cgttctggag ctgggctaca gtcgtcgact 180
ttcaagcatc agtacaggaa ggataaaaag tgccgaacat ggagacagat aagcagtagt 240
ggtggggcta cgaacatatt ccttttcctt ctggacgcta ccactcatat gttccaaaat 300
tacaaatttg tcctttgtat ttgttgcaat tttcatgtaa gaaatccaac gaggctctgt 360
ttttttttat tggccttgtt tggatcctca gagctattaa atagccctgc agaatcttac 420
tatttaggag tattaaacgt agattaccga caaaaccgat tccataaccc taggctattt 480
tgcaagacaa atctaatgat gtatattaat ccatgattag cgactgatta ctgtagcatc 540
actgtagcaa atcatggatt aatatacctc gttagattcg tctcgtaaaa tagcctatgg 600
gttttgtcat taatctacgt ttaatacttc taaatagcaa gattccggag ggctatttaa 660
tagccctccg gatccaaaca gagccattga tcatgtcgac ggaactctaa cttctcaa 718
<210> 15
<211> 937
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 60
tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 120
aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 180
atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 240
tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 300
catagcagaa ctttaacccc cgaacatcgc ctcgctccag tcaatgaccg ctgttatgcg 360
gccattgatt tgtagagaga gactggtgat ttcagcgggc atgcctgcag gtcgactcta 420
gaggatcccg gacgagtgct ggggcagata agcagtagtg gtggggctac gaacatattc 480
cttttccttc tggacgctac cactcatatg ttccaaaatt acaaatttgt cctttgtatt 540
tgttgcaatt ttcatgtaag aaatccaacg aggctctgtt tttttttatt ggccttgttt 600
ggatcctcag agctattaaa tagccctgca gaatcttact atttaggagt attaaacgta 660
gattaccgac aaaaccgatt ccataaccct aggctatttt gcaagacaaa tctaatgatg 720
tatattaatc catgattagc gactgattac tgtagcatca ctgtagcaaa tcatggatta 780
atatacctcg ttagattcgt ctcgtaaaat agcctatggg ttttgtcatt aatctacgtt 840
taatacttct aaatagcaag attccggagg gctatttaat agccctccgg atccaaacag 900
agccattgat catgtcgacg gaactctaac ttctcaa 937
<210> 16
<211> 963
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 60
cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 120
tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 180
cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 240
agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 300
cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aacccccgaa catcgcctcg 360
ctccagtcaa tgaccgctgt tatgcggcca ttgatttgta gagagagact ggtgatttca 420
gcgggcatgc ctgcaggtcg actctagagg atcccggacg agtgctgggg cagataagca 480
gtagtggtgg ggctacgaac atattccttt tccttctgga cgctaccact catatgttcc 540
aaaattacaa atttgtcctt tgtatttgtt gcaattttca tgtaagaaat ccaacgaggc 600
tctgtttttt tttattggcc ttgtttggat cctcagagct attaaatagc cctgcagaat 660
cttactattt aggagtatta aacgtagatt accgacaaaa ccgattccat aaccctaggc 720
tattttgcaa gacaaatcta atgatgtata ttaatccatg attagcgact gattactgta 780
gcatcactgt agcaaatcat ggattaatat acctcgttag attcgtctcg taaaatagcc 840
tatgggtttt gtcattaatc tacgtttaat acttctaaat agcaagattc cggagggcta 900
tttaatagcc ctccggatcc aaacagagcc attgatcatg tcgacggaac tctaacttct 960
caa 963
<210> 17
<211> 434
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gttggtcacg gactgtcaag ggcatgcagc tttcagcttt gcattcgttg atgttgatgt 60
gttatccact aacagttgtg tgctctgctt atgtttatat gttgtcagcg atcaaataag 120
ttcaaagtgc tctgctagtg ctgctgatgc caacacgccc aatcttggag cagcagatgc 180
gaccacgctc aacaacctcg cagcacctgc tgcgcaagtt cactgaagct tcaactaatc 240
tgtaagtcgt atcgtatctc gtcaattcca attcagacaa ataacataac ctgattgatt 300
gattgataat ataatctagt acttctctgt gagatatgat gatactccgt ttgcattgca 360
atttatttat cggtggcatg catggcttgg caggtaccaa tagctagcag gcagacagga 420
agattcgttg acga 434
<210> 18
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gttggtcacg gactgtcaag cgcatgcagc tttcagcttt gcattcgttg atgttgatgt 60
gttatccact aacagttgtg tgctctgctt atgtttatat gttgtcagcg atcaaataag 120
ttcaaagtgc tctgctagtg ctgctgatgc caacacgccc aatcttggag cagcagatgc 180
gaccacgctc aacaacctcg cagcacctgc tgcgcaagtt cactgaagct tcaactaatc 240
tgtaagtcgt atcgtatctc gtcaattcca attcagacaa ataacataac ctgattgatt 300
gattgataat ataatctagt acttctctgt gagatatgat gatactccgt ttgcattgca 360
atttgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg gacgttttta 420
atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact ggattttggt 480
tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac atactaaggg 540
tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc cttatctggg 600
<210> 19
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctttgcgttt gatgttcttc accacctgat gtgatggtta acttccctct actccctgat 60
gcttttagtt ataaagagta atttgcaagg actcttgcca gaagagagta cagtgattat 120
tagttgagca tttcttctga aactggttgt tgatagagtt acttagaatg aatgaattaa 180
atgggggatg atgattgtat gagtggggca aaggaacatg cagtgccatg gtcctgaata 240
ttccccaatc atggagcaac aaaccaaatc aaattgcaca ctgtgtgaat gtgatgtgtg 300
tgagagtgag aaagagagag agagagcaaa cagccaagca aacataccta caacacagtt 360
gctcctggct tatcacattg tggacctggg gtgttgggag gactgctttg ccttgatgaa 420
gtgtctgtca tatgatacca taatatcaga tggtgaaaaa attgtggaat ggaactgtgt 480
gggctttctt cttcttcttt atgttgtctg attgattgtt tgtttgttgg tagcattatt 540
aatggcggaa aggagaggat gagcaggact caggagtggg tgaatgcatt cattttggtt 600
tgtaaattgg ccctggtaat ttgcagtgta cagtagggag ttactactgt gctgtgctct 660
ctgcctgcaa tgcccagtgt tgcacaagca ctgcagtgca cgtctctctc gtgccagtgc 720
cagtgccaat gccatgctta caacagtctg ctctgtcttg ggttcagttg atgactcgat 780
caacaagcag aa 792
<210> 20
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ctttgcgttt gatgttcttc accacctgat gtgatggtta acttccctct actccctgat 60
gcttttagtt ataaagggta atttgcaagg actcttgcca gaagagagta cagtgattat 120
tagttgagca tttcttctga aactggttgc tgatagagtt acttagaatg aatgaattaa 180
atgggggatg atgattgtat gagtggggca aaggaacatg cagtgccatg gtcctgaata 240
ttccccaatc atggagcaac aaaccaaatc aaattgcaca ctgtgtgaat aacacattgc 300
ggacgttttt aatgtactga attaacgccg aattaattcg ggggatctgg attttagtac 360
tggattttgg ttttaggaat tagaaatttt attgatagaa gtattttaca aatacaaata 420
catactaagg gtttcttata tgctcaacac atgagcgaaa ccctatagga accctaattc 480
ccttatctgg gaact 495
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caatcatgga gcaacaaacc aaatcaaatt gcacactgtg tgaatgtgat gtgtgtgaga 60
ctgagaaaga gagagagaga gagagcaaac agccaagcaa acatacctac aacacagttg 120
ctcctggctt atcacattgt ggacctgggg tgttgggagg actgctttgc cttgatgaag 180
tgtctgtcat atgataccat aatatcagat ggtgaaaaaa ttgtggaatg gaactgtgtg 240
ggctttcttc ttcttcttta tgttgtctga ttgattgttt gtttgttggt agcattatta 300
atggcggaaa ggagaggatg agcaggactc aggagtgggt gaatgcattc attttggttt 360
gtaaattggc cctggtaatt tgcagtgtac agtagggagt tactactgtg ctgtgctctc 420
tgcctgcaat gcccagtgtt gcacaagcac tgcagcgcac gtctctctcg tgccagtgcc 480
aatgccatgc ttacaacagt ctgctctgtc ttgggttcag ttgatgactc gatcaacaag 540
cagaagctgg aaagagaaga gaaaattgga aaaataaaaa aagaaacaag aacagctact 600
gcagacttta cagtttcgcc attgctgagc tgacgatccc ttcctgggct gggttcacat 660
acacaagagc aagaagctga cacgcacaca tcgcatctca tggccatcgg gcgtcgcctg 720
ttgagccatc gccaattcgc catcgcatcc ggatgcgatg ggcggcagtg gcacagtgtg 780
ggctcgcgac agccatggac gacgaccacc acagcggcgg cgaggtctct ctcgagggtt 840
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<210> 22
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caatcatgga gcaacaaacc aaatcaaatt gcacactgtg tgaataacac attgcggacg 60
tttttaatgt actgaattaa cgccgaatta attcggggga tctggatttt agtactggat 120
tttggtttta ggaattagaa attttattga tagaagtatt ttacaaatac aaatacatac 180
taagggtttc ttatatgctc aacacatgag cgaaacccta taggaaccct aattccctta 240
tctggg 246
Claims (8)
1.用于在水稻选育材料中检测单价、二价、三价转Bt基因的基因型的引物组合物，所述Bt基因为cry1Ab/cry1Ac融合基因、cry2A基因和cry1C基因的任意一种，其特征在于，所述引物组合物由引物组1、引物组2、引物组3组成，其中，
引物组1由3条引物组成：
1AR1的序列为5’-ttgagaagttagagttccgtc-3’；
1AL1的序列为5’-cagcacatcattggtagagt-3’；
1AI1的序列为5’-tcgtcgtttggtatggc-3’；
引物组2由3条引物组成：
2AL1的序列为5’-gttggtcacggactgtcaag-3’；
2AR1的序列为5’-tcgtcaacgaatcttcctgt-3’；
2AI1的序列为5’-cccagataagggaattaggg-3’；
引物组3由3条引物组成：
1CL1的序列为5’-ctttgcgtttgatgttcttc-3’；
1CR1的序列为5’-ttctgcttgttgatcgagtc-3’；
1CI1的序列为5’-agttcccagataagggaatt-3’。
2.含有权利要求1所述的引物组合物的用于在水稻选育材料中多重PCR检测单价、二价、三价转Bt基因的基因型的试剂盒。
3.在水稻选育材料中检测单价、二价、三价转Bt基因的基因型的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的引物组合物进行多重PCR检测转基因水稻。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取水稻植株的基因组DNA；
（2）以步骤（1）中提取的DNA为模板，将权利要求1所述的引物组合物加入到同一PCR反应体系，进行PCR扩增；
（3）反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，染色后于凝胶成像系统下观察，并判断水稻样品的基因型。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）采用碱裂解法提取基因组DNA。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR反应体系为30μL：2×PCR Master Mix缓冲液15μL、9条浓度为10μM引物按照1AR1：1AL1：1AI1：2AL1：2AR1：2AI1：1CL1：1CR1：1CI1为0.4:0.15:0.45:0.1:0.5:0.05: 0.4:0.15:0.45加入、总DNA2μL、无菌水补足至30μL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）的PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸5min。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中采用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，
如果只含有937bp特征条带，则为cry1Ab/cry1Ac融合基因的纯合体；
如果只同时含有937bp和718bp特征条带，则为cry1Ab/cry1Ac融合基因的杂合体；
如果只含有600bp特征条带，则为cry2A基因的纯合体；
如果只同时含有600bp和434bp特征条带，则为cry2A基因的杂合体；
如果只含有495bp特征条带，则为cry1C基因的纯合体；
如果只同时含有495bp和792bp特征条带，则为cry1C基因的杂合体；
如果含有3条带，则为一基因杂合一基因纯合的二价水稻样品、或三个基因均为纯合的三价水稻样品；
如果含有4条带，则为两基因杂合的二价水稻样品、或一基因杂合两基因纯合的三价水稻样品；
如果含有5条带，则为两基因杂合一基因纯合的三价水稻样品；
如果含有6条带，则为三基因杂合的水稻样品。
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