CN103525936A - 应用rpa技术对转基因水稻科丰6号品系特异性鉴定 - Google Patents

Abstract

本发明首次提供转基因抗虫水稻科丰6号品系特异性的RPA检测方法。具体公开了一种适用于重组酶聚合酶等温扩增技术（Recombinase Ploymerase Amplification,RPA）鉴定含有转基因抗虫水稻科丰6号的引物及探针组合，其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示。本发明还公开了一种鉴定含有转基因抗虫水稻科丰6号的方法：提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的引物进行RPA快速扩增及实时荧光检测，如果得到明显的扩增曲线，则证明所检样品中含有转基因抗虫水稻科丰6号的成分。

Description

应用RPA技术对转基因水稻科丰6号品系特异性鉴定

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及应用重组酶聚合酶等温扩增技术（Recombinase Ploymerase Amplification, RPA）鉴定转基因抗虫水稻特异性方法，及其相应的引物和探针组合。 

背景技术

目前DNA扩增是核酸检测的主要方法，常用的PCR检测需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。近年来，核酸恒温扩增技术得到了长足的发展，与传统PCR相比核酸恒温扩增技术不需要昂贵的PCR仪，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便，快速，灵敏等优点。RPA技术是模拟生物体内DNA复制、基于重组酶聚合酶介导的扩增原理发展而来，利用重组酶和引物形成微丝在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时, 在单链DNA结合蛋白的帮助下，使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配对形成复制所需自由的3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，形成新的DNA互补链反应产物也是以指数级增长。与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物长度通常为30-35nt。引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度增加，引物序列的设计与选择对RPA的结果至关重要。在RPA扩增体系中加入一个荧光标记的探针便可实现模板扩增的实时监测，该探针中部两个T碱基上各标记一个荧光集团（FAM和BHQ1），在两个集团之间有一个脱碱基位点（dSpacer），该位点可被一种来自大肠杆菌的核酸外切酶识别，该酶具有3’-5’外切酶活性，可以使两个荧光集团分离，从而使荧光信号与扩增产物的累积相同步。结合一个便携式的荧光扩增检测仪便可在10-20分钟内检测到荧光曲线。RPA技术极大地缩短了检测时间，简化了反应程序，与DNA快速提取技术相结合使野外检测成为可能，具有广泛的应用前景。 

PCR技术对转基因产品检测的方法有筛选检测，基因特异性检测，构建特异性检测和转化体特异性检测。由于外源基因在受体基因组插入位点的唯一性特征，因此根据外源插入DNA序列与水稻基因组的连接区域设计RPA引物进行检测具有很高的特异性，可特异性地检测该转化体及其衍生品系。 

转基因抗虫水稻科丰6号已经进入安全评价阶段，具有良好的商业化前景。目前我国尚未批准科丰6号的商业化种植，为防止转基因水稻未经安全批准进入生产流通环节，迫切需要建立快速简便检测方法，用于市场监管和例行监测。 

目前，已报道的转基因植物检测方法中，主要是利用PCR仪在实验室中进行常规的检测，该方法还不能进一步满足转基因产品的快速检测。国内外目前还没有利用RPA技术对转基因水稻科丰6号做品系特异性鉴定。 

发明内容

针对上述领域的空白，本发明提供了准确、快速、简便检测转基因水稻科丰6号品系特异性的RPA检测方法。 

本发明提供的技术方案是：一种用于通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定转基因抗虫水稻科丰6号的引物，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。 

本发明还提供一种通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定转基因抗虫水稻科丰6号的试剂盒，该试剂盒包含上述的引物和探针。 

本发明还提供一种通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定转基因抗虫水稻科丰6号的方法：提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物进行荧光快速检测，如果得到明显的扩增曲线，则证明所检样品为转基因抗虫水稻科丰6号。实施步骤为：向RPA扩增试剂盒推荐反应的50μL扩增体系中加入引物各2μL（10μmol/L），探针0.5μL（10μmol/L），模板DNA 50ng。RPA扩增检测仪（或荧光定量PCR仪）39摄氏度反应20分钟。 

本发明方法是根据外源插入DNA序列与水稻基因组的连接区域设计大量RPA特异性引物，从中筛选出一套可快速有效检测出转基因水稻科丰6号成分的引物及探针组合。利用该对引物进行荧光快速检测，以转基因水稻科丰6号基因组DNA为模板可以得到明显的扩增曲线，而非转基因水稻明恢63和其他转基因水稻品系华恢1号等4种水稻材料的基因组DNA为模板扩增均没有扩增曲线。将模板用水稀释至10000,2000,500,100,50个拷贝，结果显示可以检测到100个拷贝的靶标分子，证明该方法具有较高的灵敏度，这是现有技术不能达到的灵敏水平。本发明首次提供转基因抗虫水稻科丰6号品系特异性的RPA检测方法。该方法使生物技术产品在准确、快速检测方面的能力得到提高。 

  

附图说明

图1为科丰6号特异性检测图，其中，1：科丰6号（叶片）；2：科丰6号种子粉末（5%）；3：科丰6号种子粉末（1%）；4：华恢1号；5：抗优97；6：克螟稻1；7：明恢63；8：水。 

图2 为灵敏度试验图，从1到6模板拷贝数依次为10000；2000；500；100；50；0。 

  

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。 

下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）中所述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件。 

实施例一：引物的设计和筛选

首先，引物设计和筛选：RPA引物设计时通常需要考虑以下几个因素：（1）GC含量在40%-60%；（2）尽量避免引物内部出现二级结构；（3）避免引物出现重复序列。RPA对引物长度要求为30-35nt，实验中需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化，筛选，个别碱基的替换或增减都会对实验结果产生重要影响。本实验中根据科丰6号转化体特异序列（GenBank No. HM124448）设计了一条探针，在探针的两侧设计了4条上游引物和5条下游引物。以500个拷贝科丰6号基因组DNA为模板对不同引物组合进行荧光筛选，最终选出一对扩增起飞时间短并且荧光信号强的引物用于RPA荧光检测，引物和探针序列见SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3（表1）。

表1 

注：FAM：发光基团；dSpacer：脱碱基位点；BHQ1：淬灭基团；phosphate：磷酸基团

实施例二：用设计的引物对科丰6号进行检测

1．实验材料

（1） 植物材料

转基因水稻科丰6号（叶片），转基因水稻科丰6号种子粉末（含量5%），转基因水稻科丰6号种子粉末（含量1%），转基因水稻克螟稻1（叶片），转基因水稻TT51-1（叶片），转基因水稻抗优97（叶片），非转基因水稻明恢63（叶片）。

（2） 酶与试剂 

分子生物学试剂，TwistAmp DNA Amplification Exo Kits 购自TwistDX公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京生工生物技术有限公司合成。

（3）实验仪器 

DNA处理仪器：低温混合球磨仪MM400（Retsch）

荧光检测仪：RPA扩增检测仪（Twista）或荧光定量PCR仪。

其它仪器包括：恒温水浴锅、电子天平、离心机、涡旋仪、纯水仪、恒温培养箱等。 

2．实验方法和过程 

（1） 水稻基因组DNA的提取

取幼嫩叶片或种子粉末作为DNA提取材料，依照TianGen Plant Genomic DNA Kit（Cat#DP-305）试剂盒的操作手册，进行水稻总DNA的提取。

（2）  DNA浓度和纯度测定 

使用NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Scientific）测定DNA的纯度和浓度，并用去离子双蒸水调节DNA浓度至50ng/μL。

（3）  引物扩增 

本实施例中用于PRA方法扩增外源插入DNA和植物基因组DNA之间的转化体特异序列鉴定转基因水稻科丰6号，模板浓度为50ng/μL。

RPA扩增体系为：总体系50μL，向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp Exo反应管中加入再水化缓冲液29.5μL，醋酸镁溶液2.5μL（280mmol/L），引物各2μL（10μmol/L），探针0.5μL（10μmol/L），模板DNA 50ng，剩余用水补足； 

引物扩增程序：RPA扩增检测仪39摄氏度反应20分钟。

3．实验结果 

根据转化体特异序列设计的正向引物和反向引物即SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，对明恢63，华恢1号，克螟稻1，抗优97和科丰6号水稻基因组DNA进行RPA荧光检测，能够快速准确地鉴定出转基因水稻科丰6号，其中在含有转基因水稻科丰6号的样品中有明显的扩增曲线，而非转基因水稻明恢63和转基因水稻华恢1号等材料中均没有扩增曲线（图1）。将模板用水稀释至10000，2000，500，100，50个拷贝，结果显示该方法可以检测到100个拷贝的靶标分子（图2）。说明用本发明设计的引物鉴定转基因水稻科丰6号具有较高的灵敏度和准确性，且操作简便。

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>应用RPA技术对转基因水稻科丰6号品系特异性鉴定

 

<160> 3

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<400> 1

CAGATTGTCG TTTCCCGCCT TCAGTTTAAA CTATC      

 

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<400> 2

TTCCATGTTT TCTGTAGGGT GGTCTTGGTG GTGCC                   

 

 

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<400> 3

 

AAAGATCAGG ATTTGGGAAG GGCGATC

GGCGAGGCAC ATAT

 

Claims (4)

1.一种用于通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定转基因抗虫水稻科丰6号的引物和探针组合，其特征在于：其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。

2.一种鉴定转基因抗虫水稻科丰6号的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针组合。

3.一种通过重组酶聚合酶等温扩增技术鉴定转基因抗虫水稻科丰6号的方法，其特征在于：提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物及探针组合进行快速扩增及实时荧光检测，如果得到明显的扩增曲线，则证明所检样品含有转基因抗虫水稻科丰6号成分。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：

向RPA扩增试剂盒的50μL扩增体系中加入浓度为10μmol/L引物各2μL，浓度为10μmol/L探针0.5μL，模板DNA 50ng；

扩增程序为：RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪于39摄氏度反应20分钟；

同时进行实时荧光检测。

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