JP2013530705A - ループ媒介性等温増幅(lamp)の配列特異的実時間モニタリング - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国仮特許出願第61/357,428号(表題「SYSTEMS AND METHODS FOR SEQUENCE SPECIFIC REAL−TIME MONITORING OF LOOP−MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION(LAMP)」、2010年6月22日出願)に対して優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に加入され、そして本明細書の一部とみなされるべきである。
本発明は、助成番号2006−55605−16683及び07−55605−17843で政府支援を受けて行われ、そして米国農務省(USDA−NRI)により認められたプロジェクトHAW00559−04Gであった。政府は本発明に所定の権利を有する。
病原性細菌は、植物、動物、及びヒトにおいて病害を引き起こし得る細菌である。病原性細菌の多様性のために、多種多様な病原性細菌及び付随する病害が存在する。これらの病害の例としては、植物における立ち枯れ病、軟腐病、及び胴枯れ病、イヌにおけるパルボウイルス、ジアルジア(giardia)、及びロッキー山紅斑熱、並びにヒトにおける結核、肺炎、及び破傷風が挙げられる。
一局面において、標的DNAのループ媒介性等温増幅(LOOP−mediated isothermal amplification)(LAMP)をモニタリングする方法が提供される。本方法は、一般的に、標的DNA、及び標的DNAを増幅することができる1つ又はそれ以上のLAMPプライマーを含むLAMP反応混合物を供給することを含む。同化(assimilating)プローブがLAMP反応混合物に加えられ得、ここでこの同化プローブは2つのオリゴヌクレオチド鎖を含み、第一のオリゴヌクレオチド鎖は3’末端に位置するクエンチャープローブを含み、そして同化プローブの第二のオリゴヌクレオチド鎖は、5’末端に結合されたフルオロフォアを含む。LAMP反応混合物に加えられる第一のオリゴヌクレオチド鎖の量に対する第二のオリゴヌクレオチド鎖の量の比は、1:1未満であり得る。DNAポリメラーゼを、同化プローブを含むLAMP反応混合物に加えてもよい。同化プローブ及びDNAポリメラーゼを含むLAMP反応混合物により発せられる蛍光を測定することができる。
本明細書で使用される用語「約(approximately)」、「約(about)」、及び「実質的に」は、望まれる機能をなお果たすか又は望まれる結果をなお達成する、示された量に近い量を表す。例えば、用語「約(approximately)」、「約(about)」、及び「実質的に」は、示された量の10%未満以内、5%未満以内、1%未満以内、0.1%未満以内、又は0.01%未満以内を指し得る。
LAMPプロセスは、個々のLAMP反応のための複数のウェルを含む基板上で行われ得る。基板は当該分野で公知のいずれかの材料、例えばプラスチック、金属、又は複合材料のものであり得る。いくつかの実施態様において、コンパクトディスク(CD)プラットフォームは、DNA増幅及び検出のためのループ媒介性等温増幅(LAMP)を行うために使用され得る。CDプラットフォームは、サンプル調製及び反応工程の自動化を可能にし、さらに良好な閉じ込め(containment)をもたらす。CD基板の点から本明細書において一般的に記載されるが、複数の反応ウェルを提供する他の基板が使用され得る。
非接触温度センサーは、例えば使い捨てのCDプラットフォームにおいて、汚染を防止するようにシステムにおける温度測定のために選択され得る。例えば、パイロメーターは非接触温度センサーとして使用され得る。しかし検出器は、調べられた領域における温度(例えば、個々のウェルの温度又は選択された一群のウェルの平均温度)を決定するために、反応ウェルの表面から発せられる熱放射を測定する。この熱放射は、反応液(例えば水)、そしてウェルを密封するために使用される材料(例えば透明フィルム)フィルムの存在)を通過する。理論により限定されないが、これらの材料は低い放射率を有するので、ウェルの内側から発生する放射、さらには周囲からの熱放射に反射を導入し得ると考えられる。結果として、これらの材料は、パイロメーターにより測定される熱放射から計算された温度に誤差を導入し得る。
図3Aは、本開示の実施態様のカスタムの蛍光光度計及びレーザードライバーのための回路基板レイアウトの略図である。
ループ媒介性増幅(LAMP)は、等温的に、かつテンプレートDNAを変性させることなく遺伝子複製を達成するために使用され得る。LAMPはまた、細胞を溶解も抽出もすることなくその標的DNAを増幅することができるが、より低い検出限界をもたらす。LAMPの実施態様は以下の書類に詳細に記載され、それらは各々それらの全体が参照により加入される。
・Y. Mori、et al.、「Detection of loop−mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation」 Biochemical.Biophys.
Res.Comm.、Vol.289、No.1、p.150−154、Nov.23、2001.
・K. Nagamine,「Isolation of single−stranded DNA from loop−mediated isothermal amplification products」 Biochemical and Biophysical Research Communications、Vol.290、No.4、p.1195−1198、Feb 1、2002.
・K. Nagamine、et al.、Accelerated reaction by loop−mediated isothermal amplification using loop primers」 Molecular and Cellular Probes、Vol.16、No.3、p.223−229、June 2002.
。これらのパラメーターとしては、クエンチャープローブに対する蛍光プローブの量の比、LAMP反応混合物に同化プローブを加える方法、及びLAMPアンプリコンの単鎖ループ上のアニーリング部位に関して競合する同化プローブの総量が挙げられる。例えば、LAMP反応混合物中の同化プローブの存在はLAMP反応速度の減少を引き起こし得るが、パラメーター値が選択された範囲内にある場合、LAMP反応混合物中の同化プローブの存在がLAMP反応速度を抑制する程度は無視できるほどになり得る。
様々な異なるLAMPプライマーセットを使用して同化プローブの性能を評価した:ラムダファージLAMP、rk1249.1、rk2208.1、rk2403.1、rsfliC、並びにSe01及びSpa1。rsfliC LAMPプライマーセットは、この種の大部分のメンバーに存在する青枯病菌(Rs)フラゲリンサブユニットC(fliC)遺伝子を標的とするように設計されている。
MgSO4、約0.1% Triton X−100及びテンプレートDNAを含有する反応混合物約25μl(総体積)で行った。温度制御のためにサーマルサイクラーを使用して、約0.2mlのマイクロチューブ中で反応を行った。この混合物を約95℃の温度に約5分間加熱し、次いで約8U Bst DNAポリメラーゼラージフラグメント(例えばNew England Biolabs、Inc.、Beverly、MA)を加える前に氷上で冷却した。
カスタムの蛍光光度計を使用して、分子ビーコンを含有するがLAMPアンプリコンを含有しないネガティブコントロールと比較して、ループ領域の1つを標的とする分子ビーコンで標識されたLAMP産物間の差異を首尾よく観察した(データは示していない)。ABSに様々なサイズの反応ウェルをプリントしたカスタムのCDを図4に示す。
温度較正を、較正技術を評価するために上で考察したように行った。較正測定を、パターン形成したABS及びポリカーボネートにおける反応ウェルで行い、そしてウェル及び透明フィルムを通した放射損失にもかかわらず高度に正確な非接触温度測定値が得られた。例えば、図5は、K型熱電対により測定された実際のウェル温度と比較した、非接触温度計(例えばパイロメーター)から見積もられた補正されたウェル温度を示す。円はポリカーボネートに切削されたウェルから測定されたデータを表し、一方で三角形はABSに切削されたウェルから測定されたデータを表す。ウェルを通る放射伝達及びウェル表面からの周囲放射の反射についての係数を見積もるために使用された較正データを図5の挿入図に示す。ポリカーボネートCDにおける個々の較正されたウェルの温度において観察された標準誤差は約0.35℃であった。同じ較正を合計で5つのウェル(ABSに形成されたいくつかのパターンを含む)に適用し、測定された温度における標準誤差約0.93℃を得た。後者の結果は、観察された温度における熱放射のスペクトル範囲にわたって、ABS及びポリカーボネートの放射率が非常に類似しているということを示唆する。
a) 細菌株及びDNA精製
Rs株GMI1000(R1B3)及びUW551(R3B2)を、Norman及びAlvarez(Norman、D.、and Alvarez、A. M.,「A rapid method for presumptive identification of Xanthomonas campestris pv. dieffenbachiae and other xanthomonads」 Plant Disease、73、654−658(1989)、その全体が参照により本明細書に加入される)にしたがって、改変塩化テトラゾリウム(TZC)寒天培地で増殖させた。Rs株を約48〜72時間約28℃でインキュベートした。DNAを、製造者の指示に従ってWizard(R)ゲノムDNA精製キット(Promega Corp.、Madison、WI)を用いてこれらの細胞から精製し、そして分光光度法で定量した。ラムダDNA LAMP反応のために、精製したラムダDNAを購入した(New England Biolabs、Inc.、Beverly、MA)。
単一増幅検出のための同化プローブの実施態様において、そうではないと示されている場合以外は、LAMP反応を25μlの総体積を有するLAMP反応混合物を使用して行った。特定の実施態様において、反応混合物は、約1.6μM FIP及びBIP、約0.2μMのF3及びB3プライマー、並びに約0.4μM濃度のループプライマーを含んでいた。
単一増幅検出のための同化プローブの実施態様において、同化プローブの蛍光鎖を、rsfliCループB又はrk2208.1ループFプライマー配列を3’末端に、そしてクエンチャープローブに相補的な配列を5’末端に含有するように設計した。同化プローブ中の消光鎖にアニーリングされた場合に、クエンチャー鎖の3’末端に結合されたクエンチャー分子(例えばブラックホールクエンチャー−1)が蛍光を効果的に消光するように、蛍光分子(例えばフルオレセイン)を蛍光プローブの5’末端に結合させた。各プライマー及びプローブの分子構造/配列を表1にまとめる。
LAMP反応を実時間でモニタリングするための分子ジッパーの性能を調べるために、分子ジッパーをYiらにより以前に記載されたプロトコル(Yi、J.Z.、W.D.Zhang、and D.Y.Zhang、「Molecular Zipper:a fluorescent probe for real−time isothermal DNA amplification」Nucleic Acids Research、34(2006)、その全体が参照により加入される)にしたがって形成した。rsfliC LAMPプライマーセットをこの実験において使用し、そして蛍光プローブを、表1に示されるように、rsfliC LAMPループBプライマー配列を3’末端側に含有するように設計した。最終濃度約0.4μMの分子ジッパーをrsfliC LAMP反応混合物と混合し、そしてこの混合物を約65℃で約120分間インキュベートした。
反応速度を実質的に犠牲にすることなく実時間でrsfliC LAMP反応をモニタリングするために、約0.08μMの蛍光プローブ及び約0.16μMのクエンチャープローブを二本鎖分子ジッパー構造の形成前に直接反応混合物に含有させた。反応混合物を約65℃で約120分間インキュベートし、そして蛍光シグナルをiQ5実時間PCR検出システムを使用して観察した。
分子ジッパーの蛍光プローブとクエンチャープローブとの比を、rsfliC LAMP反応をモニタリングするための同化プローブを提供するために調整した。蛍光プローブのバックグラウンドシグナルを減少させるために、クエンチャープローブに対する蛍光プローブの比を約1:2まで低くした。LAMP反応をモニタリングするために、約0.08の蛍光プローブ及び約0.16μMのクエンチャープローブを含む結果として得られた約0.08μMの同化プローブをrsfliC LAMP反応混合物と混合した。蛍光及びクエンチャープローブの配列特異性を検証するために、ラムダDNA LAMPプライマーセットを実時間LAMPのためのコントロールとしてrsfliC同化プローブと共に使用した。
rsfliC LAMP反応の真の速度を決定するために、表1に示される分子ビーコンを、rsfliCループF及びループB領域を標的とするように設計した。約0.4μMの分子ビーコンをrsfliC LAMP反応に加え、そして約65℃でそれぞれ約0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60分間インキュベートした。各反応を、約80℃で約10分間インキュベートすることにより終了させた。分子ビーコンを含むrsfliC LAMP混合物の蛍光強度を、反応を終了させた後に約25℃で測定した。分子ビーコンが反応を遅らせなかったことを検証するために、分子ビーコンを用いずに様々な間隔で停止させた反応を、rsfliCアンプリコンの存在を確認するためにアガロースゲル電気泳動にかけた。
rsfliC及びR3B2特異的rk2208.1 LAMPプライマーセットを使用してLAMP反応を開始させ、約0.08μM濃度の蛍光プローブ及び約0.16μMのクエンチャープローブで対応する同化プローブを使用して実時間でモニタリングした。同化プローブを、二本鎖分子ジッパー構造の形成前に反応混合物中に直接含めた。反応速度の動力学的制約を調べるために、各プライマーセットを用いた反応を異なる量(約8U又は約16U)のBst DNAポリメラーゼを使用して行った。
R3B2特異的rk2208.1 LAMPプライマーセットを使用してLAMP反応を開始し、そして約0.08μM蛍光プローブ及び約0.16μMクエンチャープローブの濃度を用いて対応する同化プローブを使用して実時間でモニタリングした。二本鎖分子ジッパー構造の形成前に反応混合物に同化プローブを直接含有させた。反応速度の動力学的制約を調べるために、各プライマーセットとの反応を、異なる量(約0U、約4U、約8U、約12U、約16U、約20U、約24U、約28U、及び約32U)のBst DNAを使用して行った。
ループプライマーを含まないrk2208.1 LAMPプライマーセットを、LAMP反応混合物から蛍光を検出するための時間に対する蛍光プローブ及びクエンチャープローブの量の影響を決定するために使用した。ループプライマーを用いないLAMP反応において、それぞれ約0.16μM、約0.8μM、及び約1.6μMのクエンチャープローブ濃度と混合された、約0.08μM、約0.4μM、及び約0.8μの蛍光プローブ濃度を使用して反応を行った。これらの試験の結果を図14に示す。円は低いプローブ濃度(約0.08μM蛍光プローブ及び約0.16μMクエンチャープローブ)を表し、三角形は中程度のプローブ濃度(約0.4μM蛍光プローブ及び約0.8μMクエンチャープローブ)であり、そして四角形は高い中程度のプローブ濃度(約0.8μM蛍光プローブ及び約1.6μMクエンチャープローブ)である。網掛けの記号はテンプレートDNAを含む反応であり、そして白抜きの記号はネガティブコントロール(ddH2O)である。
ループプライマーを含むLAMP反応に対する同化プローブ組成の効果を決定するために、ループプライマーを反応に含めた後に実験10を繰り返した。実験の結果を図15に示し、ここで円は低いプローブ濃度(約0.08μM蛍光プローブ及び約0.16μMクエンチャープローブ)を表し、三角形は中程度のプローブ濃度(約0.4μM蛍光プローブ及び約0.8μMクエンチャープローブ)であり、そして四角形は高い中程度のプローブ濃度(約t0.8μM蛍光プローブ及び約1.6μMクエンチャープローブ)である。網掛けの記号はテンプレートDNAを含む反応であり、そして白抜きの記号はネガティブコントロール(ddH2O)である。
挿入色素(EvaGreen)のLAMP反応に対する影響を評価するために、EvaGreenをrk2208.1 LAMP反応混合物に加え(rk2208.1ループFプライマーを含むもの及び含まないもの)、そして蛍光シグナルを測定することにより反応を観察した。これらの条件下での増加した蛍光の開始の時間を、最適な同化プローブ組成を用いるrk2208.1 LAMP反応の速度と比較した。この実験の結果を図16に示す。
LAMP反応を有意に阻害するということを示唆した。この酵素は鎖置換活性を有し、そして挿入色素は二本鎖DNAを安定化するので、EvaGreenはBst DNAポリメラーゼの有効性を妨害し得る。
図17は、サルモネラ菌及びバクテリオファージラムダゲノムDNAを増幅するLAMP反応についての時間に対する相対的蛍光のプロットである。蛍光値を、フルオレセインチャネル(λex/em=500/530−Se01Fのためのプローブ標識)及びcy3チャネル(λex/em=550/570−ラムダファージFのためのプローブ標識)で測定した。サルモネラ菌及びバクテリオファージラムダゲノムDNAの両方を含有するサンプルを塗りつぶした円(●/●)で表し、テンプレートDNAを含まないネガティブコントロールを白抜きの円(○/○)で表し、サルモネラ菌ゲノムDNAのみを含むサンプルを塗りつぶした三角形(▼/▼)で表し、そしてバクテリオファージラムダゲノムDNAのみを含むサンプルを塗りつぶした菱形(◆/◆)で表す。
Claims (16)
- 標的DNAのループ媒介性等温増幅(LAMP)をモニタリングする方法であって:
標的DNA、及び標的DNAを増幅することができる1つ又はそれ以上のLAMPプライマーを含むLAMP反応混合物を供給する工程;
同化プローブをLAMP反応混合物に加える工程[該同化プローブは、第一及び第二のオリゴヌクレオチド鎖を含み、ここで第一のオリゴヌクレオチド鎖は3’末端に位置するクエンチャープローブを含み、そして同化プローブの第二のオリゴヌクレオチド鎖は5’末端に結合したフルオロフォアを含み;
ここでLAMP反応混合物に加えられる第一のオリゴヌクレオチド鎖の量に対する第二のオリゴヌクレオチド鎖の量の比は、1:1未満である];
DNAポリメラーゼを、同化プローブを含むLAMP反応混合物に加える工程;並びに
同化プローブ及びDNAポリメラーゼを含むLAMP反応混合物により放射される蛍光を測定する工程;
を含む、上記方法。 - 第一のオリゴヌクレオチド鎖が、DABCYL、TAMRA、及びブラックホールクエンチャー(Black Hole Quencher)のうちの1つを含む、請求項1に記載の方法。
- フルオロフォアが、フルオレセイン、cy3、cy5及び1つ又はそれ以上の量子ドットのうちの1つを含む、請求項1に記載の方法。
- 第一のオリゴヌクレオチド鎖及び第二のオリゴヌクレオチド鎖が、互いに対してハイブリダイズしていない状態でLAMP反応混合物に加えられる、請求項1に記載の方法。
- DNAポリメラーゼの濃度が、8Uに等しいか又はそれより高い、請求項1に記載の方法。
- 反応混合物に加えられる第一のオリゴヌクレオチド鎖の量が、0.02〜0.8μMの範囲内である、請求項1に記載の方法。
- LAMP反応混合物に加えられる第二のオリゴヌクレオチド鎖の量が、0.01μM〜0.4μMの範囲内である、請求項1に記載の方法。
- LAMPプライマーが、rsfliC、rk1249.1、rk2208.1、rk2403.1、ラムダファージ、Se01、及びSpa1のうちの1つを含む、請求項1に記載の方法。
- 標的DNAが、バクテリオファージラムダ、青枯病菌のrace3biovar2株、青枯病菌、サルモネラ菌、及び黄色ブドウ球菌のうちの1つを含む、請求項8に記載の方法。
- 標的DNAのループ媒介性等温増幅(LAMP)をモニタリングするための同化プローブであって:
鎖の3’末端に位置するクエンチャープローブを含む第一のオリゴヌクレオチド鎖;及び
鎖の5’末端に結合したフルオロフォアを含む第二のオリゴヌクレオチド鎖;
を含み、
ここで第一のオリゴヌクレオチド鎖に対する第二のオリゴヌクレオチド鎖の量の比は1:1未満である、上記同化プローブ。 - フルオロフォアが、フルオレセイン、cy3、cy5、及び1つ又はそれ以上の量子ドットのうちの1つを含む、請求項10に記載のプローブ。
- 第一のオリゴヌクレオチド鎖が、DABCYL、TAMRA、及びブラックホールクエンチャーのうちの1つを含む、請求項10に記載のプローブ。
- 第一のオリゴヌクレオチド鎖及び第二のオリゴヌクレオチド鎖が、1つ又はそれ以上のLAMPプライマー及び標的DNAを含む溶液と接触する前に、互いに対してハイブリダイズしていない状態にある、請求項10に記載の方法。
- 第一のオリゴヌクレオチド鎖の量が、0.02〜0.8μMの範囲内である、請求項10に記載のプローブ。
- 第二のオリゴヌクレオチド鎖の量が、0.01μM〜0.4μMの範囲内である、請求項10に記載のプローブ。
- 第一及び第二のオリゴヌクレオチドが、第二のオリゴヌクレオチド鎖のオーバーハングした非対応部分を除いて相補的である、請求項10に記載のプローブ。
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