KR20130044303A - 루프-매개 등온 증폭(ｌａｍｐ)의 서열 특이적 실시간 모니터링 - Google Patents

루프-매개 등온 증폭(ｌａｍｐ)의 서열 특이적 실시간 모니터링 Download PDF

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Abstract

동일한 종 내에서 다른 집단들로부터 선택된 병원체의 선택된 균주들을 빠르게 구별할 수 있는 유전자-기반 진단이 기술되어 있다. DNA의 LAMP의 서열-특이적, 실시간 모니터링은 "동화 프로브(assimilating probe)"로서 칭하여지는, 올리고누클레오티드 프로브를 사용함으로써 달성될 수 있다. 이러한 동화 프로브는 두 개의 올리고누클레오티드 가닥을 포함하는데, 하나의 가닥은 켄처(quencher)(켄칭 프로브로서 칭하여짐)를 포함하며, 다른 하나의 가닥은 형광단(fluorophore)(형광 프로브로서 칭하여짐)을 포함한다. 형광 신호는, 두 개의 가닥이 LAMP 반응 동안에 서로 전위될 때 나타난다. 방출된 형광을 모니터링함으로써, 서열 특이적 증폭이 검출될 수 있다.

Description

루프-매개 등온 증폭(ＬＡＭＰ)의 서열 특이적 실시간 모니터링 {SEQUENCE SPECIFIC REAL-TIME MONITORING OF LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION (LAMP)}
관련 출원에 대한 상호 참조문헌
본 출원은 2010년 6월 22일에 발명의 명칭 "SYSTEMS AND METHODS FOR SEQUENCE SPECIFIC REAL-TIME MONITORING OF LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION (LAMP)"으로 출원된 미국가특허출원번호 제61/357,428호를 우선권으로 주장하며, 이러한 문헌 전체는 본원에 참고로 포함되고 본 명세서의 일부로서 여겨져야 한다.
연방 지원 연구(FEDERALLY SPONSORED R&D)와 관련한 기술
본 발명은 미국농무부(USDA-NRI)에 의해 부여된 승인번호 2006-55605-16683 및 07-55605-17843 및 프로젝트 HAW00559-04G에 따라 정부 지원 아래 이루어진 것이다. 정부는 본 발명의 정당한 권리를 갖는다.
병원성 박테리아(pathogenic bacteria)는 식물, 동물, 및 인간에게서 질환을 야기시킬 수 있는 박테리아이다. 병원성 박테리아의 다양성으로 인하여, 매우 다양한 병원성 박테리아 및 수반되는 질환들이 존재한다. 이러한 질환들의 예는 식물에서 시듬병(wilt), 연부병(soft rots) 및 마름병(blight), 개에서 파르보바이러스(parvovirus), 편모충, 및 로키산 홍반열(Rocky Mountain Spotted Fever), 및 인간에게서 결핵(tuberculosis), 폐렴(pneumonia), 및 파상풍(tetanus)을 포함할 수 있다.
박테리아성 병원체에 의해 야기된 질환은 재산과 생명에 큰 손실을 초래할 수 있다. 예를 들어, 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)은 200개 넘는 식물 종에서 시듬병을 야기시키는 박테리아성 병원체이다. 주로 감자 작물에 영향을 미치는 이러한 병원체의 하나의 종, 즉 race 3 biovar 2는 매년 약 9억 5천 달러 이상의 손실을 야기시키는 것으로 추정되었다.
박테리아성 질환의 전염을 늦추고 막는 것은 먼저, 병원성 박테리아의 존재를 확인함을 포함한다. 그러나, 병원성 박테리아의 검출 기술들은 비교적 느릴 수 있다. 또한, 이러한 기술들은 다른 종들로부터의 박테리아성 병원체의 선택된 종들을 구별하지 못할 수 있다. 생물학적 병원체들을 적절히 확인하는 것에 대한 불능(inability)의 결과로서, 질병 발생(outbreak)을 억누르고 퇴치하기 위한 조치가 과도하게 지연될 수 있다.
이에 따라, 선택된 병원체 균주(pathogen strain)를 신속하게 검출하고 선택된 동일한 종 내에서의 다른 집단들로부터 병원체 균주의 서브-집단(sub-population)들을 구별할 수 있는 검출 기술들을 개발하는데 큰 관심을 갖는다.
일 양태에서, 표적 DNA의 루프-매개 등온 증폭(LOOP-mediated isothermal amplification; LAMP)을 모니터링하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 일반적으로 표적 DNA 및 상기 표적 DNA를 증폭시킬 수 있는 하나 이상의 LAMP 프라이머(primer)를 포함하는 LAMP 반응 혼합물을 제공하는 것을 포함한다. 동화 프로브(assimilating probe)는 상기 LAMP 반응 혼합물에 첨가될 수 있으며, 여기서 동화 프로브는 두 개의 올리고누클레오티드 가닥을 포함하는데, 제 1 올리고누클레오티드 가닥은 3' 단부에 위치된 켄처 프로브(quencher probe)를 포함하며, 상기 동화 프로브의 제 2 올리고누클레오티드 가닥은 5' 단부에서 콘주게이션된 형광단(fluorophore)을 포함한다. LAMP 반응 혼합물에 첨가되는 제 2 올리고누클레오티드 가닥의 양 대 제 1 올리고누클레오티드 가닥의 양의 비는 1 미만:1일 수 있다. DNA 폴리머라제는 또한 동화 프로브를 포함하는 LAMP 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 동화 프로브 및 DNA 폴리머라제를 포함하는 LAMP 반응 혼합물에 의해 방출되는 형광이 측정될 수 있다.
다른 양태에서, 표적 DNA의 루프-매개 등온 증폭(LAMP)을 모니터링하기 위한 동화 프로브가 제공된다. 이러한 프로브는 통상적으로 제 1 올리고누클레오티드 가닥의 3' 단부에 위치된 켄처 프로브를 포함하는 제 1 올리고누클레오티드 가닥을 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 프로브는 제 2 올리고누클레오티드 가닥의 5' 단부에 콘주게이션된 형광단을 포함하는 제 2 올리고누클레오티드 가닥을 포함한다. 또한, 제 2 올리고누클레오티드 가닥의 양 대 제 1 올리고누클레오티드 가닥의 양의 비는 일부 구체예에서 1 미만:1일 수 있다.
도 1은 온도 제어를 위한 레이저 드라이버(laser driver) 및 혼성화 프로브(hybridization probe)를 모니터링하기 위한 형광계(fluorometer)에 대한 회로의 개략도이다.
도 2는 CD-기반 플랫폼에서 방사선원의 개략도이다.
도 3a는 본 발명의 일 구체예의 주문 제작된 형광계 및 레이저 드라이버에 대한 회로판 설계도(circuit board layout)의 개략도이다.
도 3b는 도 3a의 주문 제작된 형광계 및 레이저 드라이버에 대한 장착된 회로판(populated circuit board)의 광학 사진이다. 고온계 해드(pyrometer head)는 폴리카보네이트 CD 위에 추가로 도시된다.
도 4는 다양한 크기의 반응 웰(reaction well)을 갖는 ABS에서의 인쇄된 CD의 광학 사진이다.
도 5는 열전대(thermocouple)에 의해 측정된 실제 웰 온도와 비교하여 비-접촉 온도계(예를 들어, 고온계)로부터 추정된, 보정된 웰 온도의 플롯이다. 웰을 통한 방사선의 투과 및 웰 표면으로부터 주변 방사선의 반사를 위한 계수들을 추정하기 위해 사용되는 교정 데이타(calibration data)는 삽도(inset)에 도시되어 있다.
도 6은 반응 웰에서 약 주변 온도 내지 약 65℃의 설정값(set point)의 온도 제어를 나타낸 온도 측정의 플롯이다.
도 7은 약 0.4 μM의 분자 지퍼(molecular zipper)를 갖는 rsfliC LAMP에 대한 상대적 형광 대 시간의 플롯이다.
도 8은 분자 지퍼 구조의 형성 전에 LAMP 반응 혼합물에 형광 가닥 및 켄처 가닥을 직접적으로 첨가함으로써 rsfliC LAMP 반응을 실시간 모니터링함을 도시한 상대적 형광 대 시간의 플롯이다.
도 9는 rsfliC 표적화된 동화 프로브 (0.08 μM의 형광 가닥 및 0.16 μM의 켄처 가닥)를 갖는 람다 파지 LAMP 및 rsfliC LAMP에 대한 상대적 형광 대 시간의 플롯이다.
도 10은 rsfliC LAMP 증폭의 종말점 검출 및 rsfliC LAMP 반응의 속도 관찰을 위한 분자 비콘(molecular beacon)의 사용을 도시한 상대적 형광 대 시간의 플롯이다.
도 11은 증가된 농도의 Bst DNA 폴리머라제와 함께 rk2208.1 및 rsfliC 프라이머 세트를 사용할 때 측정된 형광을 도시한 상대적 형광 대 시간의 플롯이다.
도 12는 증가된 농도의 Bst DNA 폴리머라제와 함께 rk2208.1 프라이머 세트를 사용하여 얻어진 관찰 가능한 형광 증가를 도시한 상대적 형광 대 시간의 플롯이다.
도 13은 검출 한계값(detection threshold)에 도달하기 위한 시간 대 도 12로부터의 데이타에서의 Bst DNA 폴리머라제 함량의 플롯이다.
도 14는 동화 프로브로 모니터링된, loopF 프라이머 없이, 프라이머 세트 rk2208.1과의 LAMP 반응에 대한 상대적 형광 대 시간의 플롯이다. 형광 가닥은 약 0.08 μM, 약 0.4 μM, 및 약 0.8 μM의 농도로 제공되었으며, 켄처 가닥은 약 0.16 μM, 약 0.8 μM, 및 약 1.6 μM의 농도로 제공되었다.
도 15는 상이한 농도의 동화 프로브 형광 가닥 및 켄처 가닥을 갖는 loopF 프라이머와의 rk2208.1 LAMP 반응에 대한 상대적 형광 대 시간의 플롯이다. 켄처 가닥의 농도는 형광 가닥의 대략 두 배이다.
도 16은 본 발명의 동화 프로브 및 삽입 염료(intercalating dye)(EvaGreen)의 구체예를 이용한 LAMP 반응에 대한 상대적 형광 대 시간의 플롯이다.
도 17은 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및 박테리오파지 람다 게놈 DNA에 대한 다중 LAMP 반응에 대한 상대적 형광 대 시간의 플롯이다.
도 18은 살로넬라 엔테리카용 플루오레세인(fluorescein) 라벨링된 동화 프로브를 사용하여 살모넬라 엔테리카 및/또는 박테리오파지 람다 게놈 DNA를 증폭시키는 다중 LAMP 반응에 대한, 플루오레세인에 대한 스펙트럼 셋팅(spectral setting)을 이용하여 관찰된 상대적 형광 대 시간의 플롯이다.
도 19는 람다 파지에 대한 cy3 라벨링된 동화 프로브를 사용하여 살모넬라 엔테리카 및/또는 박테리오파지 람다 게놈 DNA를 증폭시키는 다중 LAMP 반응에 대한, cy3에 대한 스펙트럼 셋팅을 이용하여 관찰된 상대적 형광 대 시간의 플롯이다.
본원에서 사용되는 용어 "대략," "약," 및 "실질적으로"는 요망되는 기능을 계속 수행하거나 요망되는 결과를 달성하는 기술된 양에 가까운 양을 나타낸다. 예를 들어, "대략," "약," 및 "실질적으로"는 기술된 양의 10% 미만 내, 5% 미만 내, 1% 미만 내, 0.1% 미만 내, 또는 0.01% 미만 내의 양을 칭할 수 있다.
본 발명의 구체예들은 동일한 종 내의 다른 집단으로부터 선택된 병원체의 선택된 균주를 신속하게 구별할 수 있는 유전자-기반 진단법(gene-based diagnostics)을 기술한다. 예는, 박테리오파지 람다, 랄스토니아 솔라나세아룸의 race 3 biovar 2 균주, 랄스토니아 솔라나세아룸, 살모넬라 엔테리카, 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 표적 DNA의 루프-매개 등온 증폭 (LAMP)의 서열-특이적, 실시간 모니터링은 LAMP 프라이머 및 표적 DNA를 포함하는 혼합물에 본원에서 "동화 프로브"로서 칭하여지는 특정의 올리고누클레오티드 프로브의 첨가를 통해 달성될 수 있다.
동화 프로브 자체는 두 개의 별개 올리고누클레오티드 가닥을 포함할 수 있다. 제 1 올리고누클레오티드 가닥은 켄처(quencher)(켄칭 프로브(quenching probe)로서 칭하여짐)를 포함할 수 있으며, 제 2 올리고누클레오티드 가닥은 형광단(형광 프로브로서 칭하여짐)을 포함할 수 있다. 형광 신호는, LAMP 반응 동안에 두 개의 가닥들이 서로 변위될 때 발생한다. 방출된 형광을 모니터링함으로써, LAMP 반응이 검출될 수 있다.
또한, 동화 프로브의 구체예는 선택된 표적 DNA의 증폭이 일어날 때 실질적인 변위(displacement)를 일으키는 가닥들을 포함할 수 있다. 이에 따라, 동화 프로브는 표적 DNA의 증폭이 일어나지 않을 때 실질적으로 형광을 내지 않을 수 있고, 표적 DNA의 증폭이 존재할 때 실질적으로 형광을 낼 수 있다. 이에 따라, 표적 DNA의 증폭의 검출은 서열-특이적일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 동화 프로브는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 이의 통상적인 의미를 채택할 수 있고, 서로 혼성화되지 않을 때 그리고 또한 형광 프로브 및 켄칭 프로브가 함께 혼성화될 때 형광 프로브 및 켄칭 프로브를 추가로 언급할 수 있다.
하기에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, LAMP 반응 혼합물 내에 동화 프로브의 존재는 LAMP 반응이 진행되는 속도를 느리게 할 수 있다. 그러나, 동화 프로브의 존재로 인하여 LAMP 반응 속도에 대한 동화 프로브의 효과를 감소시키는 동화 프로브의 파라미터가 확인되었다. 이러한 파라미터는, 켄처 프로브에 대한 형광 프로브의 비율, 동화 프로브를 생성시키기 위한 가닥(형광 프로브 및 켄처 프로브)들을 혼합하는 방식, 및 동화 프로브의 전체 양을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. LAMP 반응 속도에 대한 동화 프로브의 효과를 감소시킴으로써, LAMP 반응의 실시간 모니터링이 촉진된다. 이러한 파라미터는 또한 LAMP 반응을 검출하는데 요구되는 시간을 줄여서 실시간 검출을 추가로 촉진시키기 위해 선택된 범위 내에서 변경될 수 있다.
별도의 LAMP 반응들에 대해 디자인된 동화 프로브의 구체예는 또한 하나 초과의 독특한 유전자 서열의 실시간 검출(다중 검출(multiplexed detection))을 위해 사용될 수 있다. LAMP 반응들의 다중 검출을 실시간으로 수행하기 위하여, 각 동화 프로브는 독립적으로 모니터링될 수 있는 스펙트럼으로 독특한 형광단을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 이러한 유전자-기반 실시간 진단법의 적용을 촉진시키는 기재-기반(substrate-based) 하드웨어 플랫폼을 나타낸다. 일부 구체예에서, 플랫폼은 컴팩트 디스크(CD) 또는 LAMP 반응을 수행하기 위한 웰로 패턴화된 다른 기재(substrate)를 포함한다. 일부 구체예에서, 고온계(pyrometer)는 기재-기반 플랫폼의 반응 웰 내의 온도를 모니터링하기 위해 비-접촉 온도 센서로서 사용될 수 있다. 고온계는 반응 웰로부터 방출된 열복사선(thermal radiation)의 측정을 기초로 하여 기재의 반응 웰 내의 온도를 추정할 수 있다. 교정 절차(calibration procedure)는 반응 웰을 시일링하는 투명 필름 및 물의 존재로 인하여 고온계에 의해 측정된 온도의 오차를 보정하기 위해 추가로 개발된다. 이러한 온도 측정은 가열원(heating source)을 제어하기 위해 추가로 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 반응 웰 내의 온도는 그 안에서 일어나는 LAMP 반응에 대해 대략 일정하게 유지될 수 있다.
유익하게, 이러한 툴(tool)은 병원체의 정확한 구별을 촉진시킬 수 있고, 예를 들어 적시의 관리 결정(management decision)을 질환의 도입에 응하여 이루어질 수 있게 한다. 기술된 구체예들은 예를 들어 낮은 리소스 셋팅(resource setting)에서의 임상적 진단(clinical diagnostics), 및 군인 및 국토 보완 요원(military and homeland security personnel)에 의한 생물학적 제제의 식별을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 여러 다른 상황에서도 유용할 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
일 구체예에서, LAMP에 의한 DNA의 선택된 서열의 실시간 검출 방법이 제공된다. 이러한 방법은 선택된 기재(예를 들어, CD)에 패턴을 형성시켜 반응 웰을 형성시킴을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 반응 웰에, 본원에 기술된 바와 같이 LAMP 반응 혼합물 및 동화 프로브를 첨가함을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 방법은 웰을 시일링하고 상기 웰에 표적 DNA를 첨가함을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 방법은 웰의 함유물을 열원(예를 들어, 레이저)를 이용하여 형광을 유도시키기에 충분한 온도로 가열시킴을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 방법은 또한 형광을 검출함을 포함할 수 있다.
하드웨어 디자인
LAMP 공정들은 개개 LAMP 반응들을 위한 복수의 웰을 포함하는 기재 상에서 수행될 수 있다. 이러한 기재는 플라스틱, 금속 또는 복합물과 같은 당해 분야에 공지된 임의의 재료일 수 있다. 일부 구체예에서, 컴팩트 디스크 (CD) 플랫폼은 DNA 증폭 및 검출을 위한 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 공정들을 수행하기 위해 사용될 수 있다. CD 플랫폼은 샘플 제조 및 반응 단계의 자동화를 가능하게 할 뿐만 아니라 양호한 밀폐(containment)를 제공한다. 본원에 일반적으로 CD 기재에 관하여 기술되어 있지만, 복수의 반응 웰을 제공하는 다른 기재들이 사용될 수 있다.
LAMP 반응은 CD 또는 다른 기재 내에 함유된 반응 웰들 내에서 수행된다. 특정 구체예에서, 이러한 반응 웰은 패턴화(patterning)에 의해 제작될 수 있다. CD와 같은 기재에서의 패턴은 고속 프로토타이핑(rapid prototyping)을 위한 레이저 및/또는 프린팅, 부피 형성(volume production)을 위한 사출 성형, 및 컴팩트 디스크 또는 당해 분야에 공지된 바와 같은 다른 기재를 패턴화하기 위한 다른 메카니즘을 포함하지만 이로 제한되지 않는 메카니즘들에 의해 생성될 수 있다.
예를 들어, 일 구체예에서, 패턴은 블랙 폴리카보네이트(black polycarbonate)(예를 들어, Lexan)의 디스크 상에서 레이저 조각기(laser engraver)(예를 들어, Venus-30, GCC Systems, Taipei Hsien, Taiwan)를 이용하여 생성될 수 있다. 다른 구체예에서, 폴리카보네이트 블랭크 디스크(polycarbonate blank disc)는 컴퓨터 수치 제어(CNC) 기계로 패턴화될 수 있다. 다른 구체예에서, 패턴화된 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌 (ABS) 디스크는 3D 프린터(예를 들어, SST 1200, Dimension Inc, Eden Prairie MN)를 이용하여 전부 형성될 수 있다. 디스크의 단면 형태는 요망되는 적용에 따라 제작될 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 웰들은 일반적으로 환형 단면을 갖는 실린더 배치(cylindrical configuration)로 제작될 수 있다.
일부 구체예에서, LAMP 모니터링을 위해 사용되는 기재의 두께는 약 1.2 mm 내지 약 1.8 mm 범위 내일 수 있다. 그러나, 기재의 구체예가 당해 분야에 공지된 다른 폴리머와 같으나 이로 제한되지 않는 재료들로부터 형성될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
반응 웰들의 단면적은 또한 필요한 경우에 변경될 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 환형 단면을 갖는 실린더 배치를 지닌 웰의 구체예에서, 반응 웰의 직경은 제한 없이, 웰에서 수행되는 특정 반응을 기초로 하여 변경될 수 있다. 일부 구체예에서, 웰 직경의 수치는 약 3 mm 내지 약 4 mm, 또는 이들 사이의 임의의 수치일 수 있다.
다른 비제한적인 예에서, 반응 웰들 중 하나 이상은 벽(wall) 및 채널(channel) 중 하나 이상에 의해 둘러싸여질 수 있다. 유리하게, 벽 및/또는 채널의 존재는 반응 웰 둘레의 절연을 개선시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 벽 두께의 수치는 약 0.5 mm 내지 5 mm의 범위 내에서 선택될 수 있다. 특정 구체예에서, 채널 두께의 수치는 약 0.5 내지 약 5 mm 범위 내의 수치를 갖도록 선택될 수 있다. 그러나, 벽 두께 및 채널 두께가 필수적인 경우에, LAMP 모니터링을 위해 적합한 임의의 수치를 취하도록 선택될 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 달리 주지되지 않는 한, 하기에서 논의되는 실시예에서 이용되는 반응 웰 두께 및 채널 두께는 각각 약 1 mm 및 약 2 mm이다. 일부 구체예에서, 반응 웰 및 채널의 깊이는 반응 웰 및/또는 채널 아래 5mm, 4mm, 3mm, 2mm, 1mm, 0.5mm, 0.3 mm 또는 그 미만의 기재 물질을 유지시키도록 선택될 수 있다. 하기 실시예에서, 반응 웰 및 채널의 깊이는 반응 웰 아래 약 0.3 mm의 디스크 재료의 깊이를 유지시키도록 선택되었다.
CD 또는 다른 기재의 온도는 비-접촉 온도 센서를 이용하여 기록될 수 있다. 일 구체예에서, 비-접촉 온도 센서는 광원 및 검출기를 포함한 고온계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 소형 광학 헤드를 구비한 상업적 고온계는 가요성 케이블(예를 들어, MID20LTCB3, Raytek, Santa Cruz, CA)에 부착될 수 있다. 대안적으로, 모놀리틱 타입(예를 들어, MLX90614ESF-BAA, Melexis, Ieper Belgium)은 반응 웰의 배치에 인접한 회로판 상에 직접적으로 탑재될 수 있다. 교정을 위하여, 표준 온도는 열전대(예를 들어, 미세 열전대 와이어로부터 제조된 K 타입 열전대, 예를 들어 Omega Engineering, Stamford, CT)를 이용하여 기록될 수 있다. 열전대 와이어는 소프트웨어 보정된 멀티-미터(multi-meter)(예를 들어, Fluke 186, Everett, WA)에 연결될 수 있다.
하기에 더욱 상세하게 기술되는 바와 같이, 비-접촉 온도 센서의 교정을 용이하게 하기 위하여, 웰들은 실질적으로 증류수(또는 다른 비-반응성 액체)로 채워지고 접착제 후면을 지닌 투명 필름(예를 들어, 마이크로시일 'B' 접착제 시일, Bio-Rad, Hercules CA)로 덮혀질 수 있다. 유리하게, 반응 웰에서 비-방출 액체 및 필름의 효과를 보정하기 위해 비-접촉 온도 센서를 교정함으로써, 반응 웰 내의 온도는 더욱 정확하게 제어될 수 있다.
반응 웰의 가열은 또한 열원에 의해 수행될 수 있다. 열원은, 당해 분야에 공지된 바와 같은, 접촉 및 비-접촉 소스를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 열원은 광학적 가열 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 광학적 장치는 반응 웰의 하부측에서 지향되는 디포커싱된 레이저(defocused laser)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가열은 대략적으로 웰의 하부측 상으로 향하는 대략 150 mW에서 작동하는 808 nm 적외선 레이저 다이오드 모듈(예를 들어, icetec-UK)을 이용함으로써 달성될 수 있다. 레이저는 디스크의 버닝(burning)을 방지하고 웰에 열을 균일하게 분포시키기 위하여 거의 디포커싱될 수 있다. 레이저의 출력은 마이크로제어기(예를 들어, Fox LP3500, Rabbit Semiconductor, Davis, CA)로부터의 펄스 폭 변조된(PWM) 신호에 의해 구동되는 논리 옵토 커플러(optocoupler)(도 1 참조)에 의해 게이팅된 n-채널 출력 MOSFET를 통해 제어될 수 있다.
온도를 제어하기 위하여, 제어기는 고온계로부터의 피드백을 이용하여 변형된 비례-적분 제어 루틴(proportional-integral control routine)으로 프로그래밍될 수 있다. 고온계 피드백은 하기에 기술된 바와 같이, 눈금 보정(calibration correction)을 적용한 후에, 마이크로제어기에 의해 수용될 수 있다. 광학적 온도 검출을 수행하기 위하여, 샘플은 예를 들어 선택된 파장을 갖는 고강도 광원에 의해 비스듬하게 비춰질 수 있다. 일 구체예에서, 광원은 약 450 nm 내지 약 475 nm 범위 내에서 선택된 파장(예를 들어, 대략 470 nm)에서 광을 방출하는 청색 발광 다이오드(LED)를 포함할 수 있다. 이러한 조명을 가능하게 하는 LED 광원의 일 예는 Agilent Technologies(Santa Clara, CA)에 의해 제작된 HLMP CB28 STD00이다.
반응 웰로부터 방출된 열복사선은 검출기에 의해 검출될 수 있다. 일 구체예에서, 검출기는 광원에 인접하게 위치된 광다이오드(photodiode)를 포함할 수 있다. 검출기는 물 및 투명 필름을 통해 이동하는 웰의 표면으로부터의 열복사선을 수집하기 위해 탑재될 수 있다. 검출기는 도 1에 예시된 바와 같이, 약 1010 V/A 내지 1012 V/A의 범위 내에서 작동하는 고성능 광증폭기 회로(high gain photoamplifier circuit)(예를 들어, T-5 Series, Intor Inc., Socorro NM)를 이용하여 작동될 수 있다. 검출기에 의해 측정된 여기 및 방출 스펙트럼은 좁은 밴드 통행 간섭 필터(narrow band pass interference filter)(예를 들어, Intor)를 이용하여 조정될 수 있다. 그러나, 다른 구체예에서, 접촉 온도 센서가 상술된 광다이오드 검출기 대신에 또는 이와 함께 사용될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
비-접촉 온도 센서의 교정
시스템에서의 온도 측정을 위한 비-접촉 온도 센서는 예를 들어 일회용 CD 플랫폼에서 오염을 방지하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 고온계는 비-접촉 온도 센서로서 이용될 수 있다. 그러나, 검출기는 조사된 구역에서의 온도(예를 들어, 개개 웰의 온도 또는 선택된 웰 그룹의 평균 온도)를 결정하기 위하여 반응 웰의 표면으로부터 방출된 열복사선을 측정한다. 이러한 열복사선은 반응 액체(예를 들어, 물) 및 웰을 시일링하기 위해 사용되는 재료(예를 들어, 필름의 존재 시에 투명 필름)를 통과한다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이러한 재료들이 낮은 방사율(emissivity)을 지니기 때문에, 이러한 재료들은 웰의 내측으로부터 비롯된 복사선 뿐만 아니라 주변으로부터의 열복사선의 반사를 일으킬 수 있을 것으로 사료된다. 결과적으로, 이러한 재료들은 고온계에 의해 측정된 열복사선으로부터 계산된 온도에 오차를 발생시킬 수 있다.
고온계는 이러한 오차를 보정하기 위해 교정될 수 있다. 하기에서 논의되는 바와 같이, 반응 웰 내의 온도는, 정류 상태의 가열원으로부터의 상이한 광출력에 따라, 고온계, 뿐만 아니라 반응 웰과 접촉한 열전대를 이용하여 측정될 수 있다. 이러한 측정은 고온계에 의해 측정된 온도를 기초로 하여 반응 웰의 정확한 온도를 계산하는 교정 모델에 입력될 수 있다.
CD-기반 검출 시스템(200)은 방사선원과 함께, 도 2에 개략적으로 예시된다. 시스템(200)은 하나 이상의 반응 웰(204)을 갖는 기재(202)(예를 들어, 플라스틱 디스크, 예를 들어 폴리카보네이트, 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(ABS), 또는 다른 적합한 플라스틱 재료)를 포함한다. 투명 필름(206)은 반응 웰(204)에 오염물이 들어가는 것을 방지하기 위하여 반응 웰(204) 위에 배치될 수 있다.
검출기(210)는 기재(202)로부터 방출된 열복사선을 측정하기 위하여 기재(202) 위에 위치될 수 있다. 일부 구체예에서, 검출기(210)는 고온계를 포함할 수 있다. 교정 모델은 반응 웰 내의 물질(예를 들어, LAMP 반응 혼합물, 웰을 덮는 보호 필름)을 통한 열복사의 투과 및 기재 자체에 의한 입사 형광의 흡수로 인한 검출기(210)의 온도 측정에서의 오차를 보정하기 위하여 이용될 수 있다. 도 1에 예시된 바와 같이, Ec는 반응 웰(204)의 온도를 제어하기 위해 열원으로부터 기재(202)에 흡수되는 열복사선이다. ΕT는 반응 웰(204)의 표면으로부터 방출된 열복사선이다. Et는 반응 웰(204) 및 투명 필름(206)을 통해 투과되어 검출기(210)에 도달하는 반응 웰(204)의 표면으로부터의 열복사선의 부분이다. Eamb는 투명 필름(206)에 영향을 미치는 주변부로부터 방출된 열복사선이다. Er은 검출기(210)로 반사되는 주변 열 에너지의 부분이다. 일 구체예에서, 교정 모델은 반응 웰(204)의 표면으로부터 또는 주변부로부터 비롯되고 반응 웰(204)에서의 물 또는 투명 필름(206)을 관통하거나 이러한 표면에서 반사한 후 검출기(210)에서 검출되는 실질적으로 모든 복사선을 추정할 수 있다.
이러한 환경 하에서 맥스웰 방정식의 해(solution)는 이들의 개개 경계에서 다양한 물질들의 정규화된 파동 임피던스(normalized)와 관련된 반사 및 투과 계수가 된다. 이들의 파동 임피던스는 또한, 파동이 진행하는 물질의 개개 투전율 및 투자율과 관련이 있다. 전체 결과는, 반응 웰(204)로부터 비롯된 전체 열복사선의 부분(a)이 검출기(210)에 도달하고 주변부로부터 비롯된 전체 열복사선의 부분(b)이 검출기(210)에 도달하기 위해 반응 웰(204)로부터 반사된다는 것이다.
회색체(gray body)에 적용되는 스테판-볼츠만 법칙(Stefan-Boltzmann's law)으로부터, 바디(body)에 의해 방출된 전체 열 에너지(E)는 방정식 1에 따라 물질의 방사율(ε), 및 투명 필름(206)의 표면의 절대 온도(T)와 관련이 있다:
Figure pct00001
상기 식에서, σ는 스테판-볼츠만 상수이다. 검출기(210)는 물질의 선택된 방사율을 가정하여, 고온계(210)의 검출기에 도달하는 열복사선을 기초로 하여 투명 필름(206)의 표면 온도를 추정할 수 있다. 고온계(210)의 검출기에 도달하는 전체 열에너지(E)는 하기 방정식 2에 따라 명시된 온도(Ti)를 계산하기 위해 사용될 수 있다:
Figure pct00002
Et는 반응 웰(204) 내의 반응 물질의 부피 및 투명 필름(206)을 통해 투과한 후에 검출기 고온계(210)에 도달하는 반응 웰(204)로부터 비롯된 열복사선이다. Er은 투명 필름(206)의 표면에서 반사된 후에 검출기(210)에 도달하는 주변부로부터의 열에너지이다(예를 들어, 도 2 참조).
스테판-볼츠만의 법칙, 및 상기 방정식에서의 항들 각각에 상기로부터의 실험 계수 a 및 b를 적용하여, 방정식 3이 얻어질 수 있다.
Figure pct00003
εset는 검출기(210)의 방사율 셋팅이다. 특정 구체예에서, 내정값(default value)은 εset에 대해 가정될 수 있다(예를 들어, 약 0.95). 그러나, 다른 방사율 값이 검출기(210)에 따라 채택될 수 있다. εwell은 반응 웰 표면의 방사율이다. εamb는 주변 온도 Tamb에서 주변 물질의 방사율이다.
온도 Ti, Tamb, 및 T는 서로 관련될 수 있다. 예를 들어, 방정식 3을 재배열함으로써, Ti는 Tamb, T 및 A 및 B로 칭하여지는 실험 계수, 및 투과 및/또는 반사 손실에 대한 보정을 포함하는 주변 환경의 항으로 표현될 수 있다:
Figure pct00004
실험 계수 A 및 B는 시스템(예를 들어, 웰)의 방사율의 비를 나타내고, 일정한 주변 온도(Tamb)에서 실제 웰 온도(T)의 네제곱에 따라 명시된 온도(Ti)의 네제곱의 선형 회귀(linear regression)를 수행함으로써 결정될 수 있다. 실제 웰 온도(T)에 대해 방정식 4a를 풀어서, 계수 A 및 B를 얻는다. 이러한 계수들은 또한, 방정식 5에 따라 Ti를 판독하는 제공된 검출기 온도로부터 T를 추정하기 위해 사용될 수 있다:
Figure pct00005
이러한 방식으로, 검출기(210)는 비-접촉 온도 측정의 정확성을 개선시키기 위해 교정될 수 있다. 그러나, 다른 구체예에서, 온도 측정은 반응 웰과 접촉하는 열전대와 같은 다른 메카니즘에 의해 획득될 수 있다.
형광계 및 레이저 드라이버
도 3a는 본 발명의 일 구체예의 주문 제작된 형광계 및 레이저 드라이버에 대한 회로판 설계도의 개략도이다.
도 3b는 도 3a의 주문 제작된 형광계 및 레이저 드라이버에 대한 장착된 회로판의 사진이다. 고온계 해드는 폴리카보네이트 CD 위에 추가로 예시된다.
루프 매개 등온 증폭 및 검출:
루프 매개 증폭(LAMP)은 주형 DNA를 변성시키지 않으면서 유전자 복제를 등온적으로 달성하기 위해 사용될 수 있다. LAMP는 또한 세포를 용해시키거나 추출하지 않으면서 이의 표적 DNA를 증폭시킬 수 있으며, 이는 보다 낮은 검출 한계를 나타낸다. LAMP의 구체예는 하기 문헌들에서 상세하게 기술되어 있으며, 이러한 문헌들 각각은 전문이 참고로 포함된다.
● N. Tsugunori, et al., "Loop-mediated isothermal amplification of DNA," Nucleic Acids Research, Vol. 28, No. 12, June 15, 2000.
● Y. Mori, et al., "Detection of Loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation," Biochemical . Biophys . Res . Comm ., Vol. 289, No. 1, p. 150-154, Nov. 23, 2001.
● K. Nagamine, "Isolation of single-stranded DNA from loop-mediated isothermal amplification products," Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 290, No. 4, p. 1195-1198, Feb 1, 2002.
● K. Nagamine, et al., Accelerated reaction by Loop-mediated isothermal amplification using loop primers," Molecular and Cellular Probes, Vol. 16, No. 3, p. 223-229, June 2002.
일 구체예에서, LAMP는 네 개의 프라이머의 세트를 사용할 수 있다. 이러한 네 개의 프라이머는 6개의 별개의 서열을 인식할 수 있고 예를 들어 Bst DNA 폴리머라제 큰 단편에 의해 자동-사이클링 가닥-변위 DNA 합성(auto-cycling strand-displacing DNA synthesis)에 따를 수 있다. LAMP 반응을 위한 프라이머는 내부 프라이머(예를 들어, FIP 및 BIP) 및 외부 프라이머(예를 들어, F3 및 B3)일 수 있다. LAMP 반응은 표적 DNA 상의 이의 개개 프라이밍 사이트(priming site)(예를 들어, F2c 또는 B2c)에 대한 각 내부 프라이머(예를 들어, FIP 또는 BIP)의 혼성화에 의해 개시될 수 있다. 외부 프라이머(예를 들어, F3 또는 B3)는 2차로 표적 DNA 상의 이의 프라이밍 사이트(예를 들어, F3c 또는 B3c)에 혼성화하고 내부 프라이머로부터 이미 연장된 DNA 서열들을 변위시카는 신규한 상보적 서열의 합성을 개시한다. 이의 결과는 양 단부에서 줄기-루프 구조를 형성시킬 수 있는 DNA 서열이다. 이러한 자동프라이밍된 "덤-벨(dumb-bell)" 구조는 LAMP 자동-사이클링 증폭을 위한 출발 물질이다.
LAMP 반응은 또한 루프 프라이머로서 칭하여지는, 추가 프라이머를 이용하여 촉진될 수 있다. 루프 프라이머는 표적 DNA 주형으로부터 전사된 루프의 섹션에 혼성화할 수 있다. 이러한 추가 프라이밍(priming)은 LAMP 반응을 촉진시키며, 정확한 출발 물질의 전사를 요구하는 바, LAMP 선택성을 개선시킬 수 있다. 특정 구체예에서, LAMP 반응은 등온 조건 하에서 요망되는 범위 내에서 선택된 온도 수치에서, 예를 들어 약 60℃ 내지 약 70℃, 또는 약 60℃ 내지 약 65℃의 온도에서 수행될 수 있다. 증폭 생성물은 줄기-루프 DNA일 수 있는데, 이는 통상적으로 표적의 여러 역위 반복물(inverted repeat)을 갖는다. 이러한 역위 반복물은 통상적으로 다중 루프를 갖는 콜리플라워(cauliflower)-유사 구조를 나타낸다.
LAMP에 의해 DNA의 양성 증폭(positive amplification)을 검출하기 위해 다양한 메카니즘들이 개발되었다. 일 양태에서, DNA의 양성 증폭은 SYBR Green 또는 EvaGreen?과 같은 삽입 염료를 사용하여 실시간 모니터링될 수 있다. SYBR Green은 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 또는 호열성 헬리카제-의존성 증폭(tHDA)에 대한 억제 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 반대로, EvaGreen은 PCR에 대한 보다 낮은 억제 효과를 갖는 것으로 보고되었고, 또한 LAMP 반응을 검출하기 위해 사용되었다. 그러나, 하기에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, LAMP 반응에 대한 EvaGreen의 높은 억제 효과가 관찰될 수 있다. 또한, 이러한 메카니즘은 DNA 생성물의 서열 특이적 확인을 허용하지 않는다. 그러나, 특히, 이러한 메카니즘은 DNA 생성물의 서열 특이적 확인을 허용하지 않는다. 오히려, 이러한 기술은 단지 양성 증폭을 검출한다.
다른 구체예에서, 양성 LAMP 반응은 LAMP 반응 혼합물의 백색 탁도(white turbidity)를 측정함으로써 확인될 수 있다. 백색 탁도는, 마그네슘 피로포스페이트가 LAMP 반응의 부산물인 바, 양성 LAMP 반응의 나타내는 것이다. 그러나, 탁도가 양성 증폭이 일어나는 징후(indication)를 제공할 수 있지만, 탁도 자체는 고려되는 특정 서열이 LAMP를 수행한다는 결정적인 지시제가 아니다. 이에 따라, 서열 특이성을 결정하기 위한 탁도 단독의 의존은 긍정 오류율을 더욱 높이기 쉽다.
분자 비콘, Taqman 프로브 및 분자 지퍼와 같은 형광 공명 에너지 전이(FRET) 기반 검출 방법은 DNA 증폭 공정의 실시간, 서열-특이적 모니터링을 제공하는 기술이다. 분자 비콘은 한쪽 단부에 형광 분자에 콘주게이트되고 다른 한쪽 단부에 켄처 분자에 컨주게이트된 자가-상보적 줄기-루프 구조를 갖는 핵산 프로브를 포함한다. 표적 서열의 부재 하에, 어떠한 형광도 방출되지 않는데, 왜냐하면 켄처가 상보적 줄기 루프 서열로 인해 형광단에 가까이 있기 때문이다. 루프 영역이 표적에 혼성화할 때, 켄처 및 형광단은 서로 분리되며 형광 방출이 검출될 수 있다.
그러나, 특히 LAMP를 모니터링하기 위한 분자 비콘의 사용은 어려울 수 있다. 예를 들어, 분자 비콘은 등온 조건 하에서 LAMP 앰플리콘과 같은 dsDNA 생성물에 접근하는데 좋지 않을 수 있다. 또한, Taqman 프로브는 일반적으로, Bst DNA 폴리머라제가 엑소누클레아제(exonuclease) 활성이 없기 때문에 LAMP 반응을 검출하는데 사용되지 못한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 임의의 기술들은 특정 구체예에서 사용될 수 있다.
분자 지퍼는 일부 이중 가닥의 짧은 DNA 단편을 포함하는 분자이다. 분자 지퍼의 제 1 가닥은 3' 단부에 켄처를 포함하고, 켄칭 프로브로서 칭하여질 수 있다. 분자 지퍼의 제 2 가닥은 5' 단부 상에 콘주게이트된 형광단 및 표적 DNA, 예를 들어 람다 파지 F, 람다 파지 B, rk1249.1F, rk2208.1F, rk2403.1F, rsfliC B, rsfliC F, Se01 F, SE01 B, spal.의 선택된 비트에 대해 상보적인 프라이밍 서열을 갖는 일부 상보적인 가닥을 포함한다. 이러한 제 2 가닥은 형광 프로브로서 칭하여질 수 있다. 켄처의 예는 DABCYL, TAMRA, 및 Black Hole 켄처(BHQ) (Biosearch Technologies, Novato, CA)를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 형광단의 예는 플루오레세인, cy3, cy5, 및 당해 분야에 공지된 임의 수의 양자점을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 형광단 콘주게이트된 단부는 어셈블링된 지퍼 구조에서 켄처와 맞춰진다. 특정 구체예에서, 분자 지퍼의 가닥들은 DNA 중합 반응에서 프라이머로서 작용하는 형광 가닥의 오버행 매칭되지 않는 세그먼트를 제외하고 상보적이어야 한다. 일부 구체예에서, 분자 지퍼는, 지퍼의 두 개의 가닥이 서로 혼성화될 때, 형광이 실질적으로 켄칭되도록 구성될 수 있다.
형광 신호는 지퍼의 두 개의 가닥이 변위될 때 분자 지퍼로부터 형성된다. 결과적으로, 분자 지퍼는 LAMP에서 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, LAMP 생성물의 루프 영역에 혼성화시키기 위해 오버행 영역(overhanging region)을 설계함으로써, Bst DNA 폴리머라제의 가닥-변위 활성에 의한 분자 지퍼의 분리는 뒤따르는 중합 반응의 과정 동안에 일어날 수 있다. 또한, 다른 구체예에서, LAMP 공정의 용융 온도(예를 들어, 약 65℃)를 초과하는 용융 온도를 갖는 지퍼 서열을 구성함으로써, 분자 지퍼는 낮은 백그라운드 신호와 함께 LAMP 반응에서 실시간 모니터링을 위해 사용될 수 있다. 분자 지퍼는 종래에 회전환 증폭(Rolling-circle amplification; RCA) 및 세분화 증폭(ramification amplification; RAM)의 실시간 모니터링에 대해 입증되었다.
분자 지퍼에서, 형광 프로브 및 켄처 프로브는 통상적으로 대략적으로 동일한 양으로 혼합되고 혼성화되어 이중 가닥 지퍼를 형성한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 동일한 양의 형광 프로브 및 켄처 프로브(예를 들어, 약 20 μM)는 이중-가닥 분자 지퍼를 형성시키기 위해 약 95℃에서 약 5분 동안 인큐베이션되고 약 실온으로 서서히 냉각될 수 있다.
혼성화된 분자 지퍼 프로브는 LAMP 반응 혼합물에 첨가된다. 일부 구체예에서, 혼성화된 분자 지퍼 프로브는 약 0 내지 약 100 μM 범위에서 선택된 최종 농도 값을 제공하기 위해 첨가될 수 있다. 특정 구체예에서, 분자 지퍼의 농도는 약 0 μM 내지 약 10 μM 범위 내에서 선택된 값을 가질 수 있다. 다른 구체예에서, 분자 지퍼의 농도는 약 0 μM 내지 약 1 μM의 범위 내일 수 있다. 일 구체예에서, 분자 지퍼의 농도는 약 0.4 μM일 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 개선된 검출 기술을 제공한다. 본원에서 "동화 프로브"로서 칭하여지는 한 쌍의 라벨링된 올리고누클레오티드 프로브들은 FRET의 원리를 이용하여 DNA의 LAMP의 서열-특이적, 실시간 모니터링을 수행하도록 설계되었다. 프로브 쌍은 상기에 논의된 분자 지퍼와 유사하다. 그러나, 분자 지퍼 및 본 발명의 동화 프로브의 구체예는 이들의 반응 공정의 실행에 대하여 적어도 상이하다.
표 1은 상이한 LAMP 프라이머 및 표적 유기체에 사용하기 위한 형광 프로브 및 켄처 프로브의 구체예를 예시한 것이다.
표 1 - 표적 유기체에 대한 LAMP 프라이머 세트 및 동화 프로브
Figure pct00006
프라이머 및 프로브 각각의 분자 구조/서열은 하기 표 2에 요약되어 있다.
표 2 - LAMP 프라이머, 동화 프로브, 및 분자 비콘
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
일부 구체예에서 다른 검출 기술과 비교하여 동화 프로브의 성능을 현저하게 개선시킬 수 있는 동화 프로브와 관련된 여러 파라미터들이 확인되었다. 이러한 파라미터들은 켄처 프로브에 대한 형광 프로브의 양의 비율, 동화 프로브가 LAMP 반응 혼합물에 첨가되는 방식, 및 LAMP 앰플리콘의 단일 가닥 루프 상의 어닐링 사이트와 경쟁하는 동화 프로브의 전체 양을 포함한다. 예를 들어, 파라미터 값이 선택된 범위 내일 때, LAMP 반응 혼합물 중에 동화 프로브의 존재가 LAMP 반응 속도를 느리게 할 수 있지만, LAMP 반응 혼합물 중의 동화 프로브의 존재가 LAMP 반응 속도를 억제하는 정도는 무시해도 될 정도일 수 있다.
형광 프로브 및 켄처 프로브와 관련하여, 특정 구체예에서, 형광 프로브 대 켄처 프로브의 비는 약 1 미만:1 (예를 들어, 형광 프로브에 비해 켄처 프로브의 농도가 더욱 높음)이도록 선택될 수 있다. 이러한 비의 예는 약 1 미만:1.1, 약 1 미만:1.2, 약 1 미만:1.3, 약 1 미만:1.4, 약 1 미만:1.5, 약 1 미만::1.6, 약 1 미만:1.7, 약 1 미만:1.8, 약 1 미만:1.9, 및 이보다 작은 비를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 비의 예는 또한, 약 1 미만:2, 약 1 미만:3, 약 1 미만:4, 약 1 미만:5 및 보다 작은 비를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
유리하게, 이러한 범위 내의 비는 동화 프로브의 존재가 LAMP 반응 속도를 저해하는 정도를 감소시키고 백그라운드 형광 교란 검출(background fluorescence confounding detection)의 정도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 하기에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 실시예 4는 대략 1:1의 형광 프로브 대 켄처 프로브의 비(예를 들어, 분자 지퍼)는, 약 65℃에서 약 120분 동안 인큐베이션한 후에, 반응 온도에서 분자 지퍼에서의 형광 가닥들의 불완전한 어셈블리를 나타내는, 높은 형광 백그라운드와 함께, 형광 신호의 실질적인 어떠한 증가도 제공하지 않음을 예시한다.
반대로, 대략 1:2의 형광 프로브 대 켄처 프로브 비를 사용할 때, 약 65℃에서 약 60분 동안의 인큐베이션 후에 많은 양의 앰플리콘이 관찰되었다(실시예 6). 일부 구체예에서, 약 1 미만:2의 비의 경우에 유사한 결과들이 얻어질 수 있다.
다른 구체예에서, LAMP 반응 혼합물에 동화 프로브의 가닥들을 혼합하는 방식은 LAMP 반응 속도를 증가시키고 이에 따라 검출을 위해 충분한 증폭된 표적 DNA의 양을 생성시키기 위해 요구되는 시간을 감소시키기 위해 변경될 수 있다. 형광 프로브 및 켄처 프로브는 LAMP 반응 혼합물에 첨가될 때, 서로에 대하여 비혼성화된 상태로 존재할 수 있다. 다시 말해서, 형광 프로브 및 켄처 프로브는 LAMP 반응 혼합물에 별도로 첨가될 수 있다. 이는 형광 및 켄처 프로브가 함께 혼성화한 후에 LAMP 반응 혼합물에 첨가되는 분자 지퍼의 경우와 반대되는 경우이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 형광 프로브 및 켄처 프로브는 LAMP 반응 혼합물에 서로 동시에 또는 상이한 시간에 첨가될 수 있다.
LAMP 반응 혼합물에 이중 가닥 동화 프로브 구조(형광 프로브 및 켄처 프로브를 포함)를 첨가하는 것과는 대조적으로, LAMP 반응 혼합물에 형광 프로브 및 켄처 프로브를 개별적으로 직접 첨가하는 경우에, LAMP 반응 속도가 비교적 저해되지 않고 보다 빠른 양성 반응 표시를 나타낸다는 것이 관찰되었다(실시예 5).
다른 구체예에서, 폴리머라제 농도가 LAMP 반응 속도에 영향을 미치고 이에 따라 양성 반응을 확인하기 위해 요구되는 시간을 줄이기 위해 변경될 수 있다는 것이 확인되었다. 예를 들어, 일 구체예에서, 폴리머라제 농도는 약 8U 이상, 약 16U 이상, 약 24U 이상, 약 32U 이상, 등일 수 있다. 이러한 폴리머라제의 농도는 LAMP 반응 속도를 증가시키고 검출 시간을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 하기에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이(실시예 8), 형광은 rk2208.1 프라이머 세트 및 약 8U Bst DNA 폴리머라제를 사용하여 약 20분 후에 검출되었다. 반대로, 약 8U에서 약 16U로 Bst DNA 폴리머라제의 양을 두 배로 늘릴때, 형광은 약 10분 후에 검출되었다. 이러한 결과는, LAMP 반응 속도가 폴리머라제 농도를 두 배로 늘림에 따라 대략 2배인 것으로 나타낸다. 폴리머라제 농도를 더욱 증가시키는 것은 검출 시간을 감소시키는 것으로 예상된다. 또한, 속도에 있어 추가적인 이득이 이러한 것들이 효소 촉매화된 중합 속도에 의해 초과됨에 따라 속도 제한 프라이머 어닐링 속도가 제한되는 포인트까지 대략 선형적인 것으로 사료된다.
반응 혼합물 내의 동화 프로브의 전체 양은 또한 LAMP 반응 속도 및 관찰 가능한 형광의 개시에 영향을 미치게 하기 위해 변경될 수 있다. 검출 시간은 반응 혼합물에 첨가되는 형광 및 켄처 프로브의 양을 증가시킴으로써 크기 감소되는 것으로 확인되었다(예를 들어, 실시예 10). 예를 들어, 실시예 8에서 논의되는 바와 같이, LAMP 반응 혼합물에 첨가되는 형광 프로브의 양은 약 0.08 μM 초과, 약 0.4 μM 이상, 약 0.8 μM 이상일 수 있으며, 켄처 프로브의 개개 농도는 약 0.16 μM 이상, 약 1.6 μM 이상 등일 수 있다.
다른 구체예에서, 형광 프로브 대 켄처 프로브의 비는 약 1 미만:1일 수 있다. 이러한 비의 예는 약 1 미만:1.5, 약 1 미만:2, 약 1 미만:2.5, 약 1 미만:3, 약 1 미만:3.5, 약 1 미만:1.4, 약 1 미만:1.4.5, 약 1 미만:5, 약 1 미만:5.5, 약 1 미만:1.60, 약 1 미만:1.65, 약 1 미만:1.70, 약 1 미만:1.75, 약 1 미만:1.80, 약 1 미만:1.85, 약 1 미만:9, 약 1 미만:9.5, 및 보다 작은 비를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 비의 예는 또한 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 약 1:5 및 보다 작은 비를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
특정 구체예에서, 형광 프로브 및 켄처 프로브의 양은 LAMP에 의한 DNA의 양성 증폭이 LAMP 반응 혼합물에서 일어날 때 검출 가능한 수준의 형광을 제공하면서 가능한 한 낮게 유지될 수 있다. 이러한 방식으로, 검출은, 동화 프로브의 존재로 인하여 LAMP 반응 속도의 감소를 실질적으로 없애면서 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 형광 프로브의 양은 약 0.01 내지 약 0.4 μM의 범위 내일 수 있다. 다른 구체예에서, 켄처 프로브의 양은 약 0.02 내지 약 0.8 μM 범위 내에서 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 동화 프로브의 전체 양은 약 0.03 μM 내지 약 1.2 μM 범위 내일 수 있다.
하기 실시예에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 실시예 10에서 LAMP 반응 혼합물 중의 보다 많은 양의 동화 프로브가 형광 검출 개시의 보다 긴 지연을 나타내는 것이 결정되었다. 이는, 많은 양으로 존재할 때 동화 프로브가 LAMP 반응의 속도를 저해시키기 때문에 일어날 수 있다. 예를 들어, 형광 프로브 및 켄처 프로브 농도의 10배 증가(예를 들어, 각각 약 0.08 μM 및 약 0.16 μM에서 약 0.8 μM 및 1.6 μM)는 약 20분에서 120분으로, 형광 검출 시간의 대략 6배 증가를 제공한다.
실시예
하기 실시예에서, 동화 프로브(assimilating probe)의 구체예는 LAMP 반응을 모니터링하는 이의 능력을 평가하기 위해 시험된다. 동화 프로브의 구체예와 분자 지퍼, 분자 비콘 및 삽입 염료를 이용한 검출 기술들 간의 비교가 또한 수행된다.
LAMP 프라이머
여러 다른 LAMP 프라이머 세트를 사용하여 동화 프로브, 즉 람다 파지 LAMP, rk1249.1, rk2208.1, rk2403.1, rsfliC 및, Se01, 및 Spa1의 성능을 평가하였다. rsfliC LAMP 프라이머 세트를 종들의 대부분의 일원에 존재하는, 랄스토니아 솔라나세아룸 (Rs) 플라젤린 서브유닛 C (fliC) 유전자를 표적화하도록 디자인하였다.
rk1249.1, rk2208.1, 및 rk2403.1 프라이머 세트를 Race3Biovar2 (R3B2)로서 분류되는 Rs 균주의 서브그룹에 대해 독특한 DNA 서열 영역을 표적화하도록 디자인하였다. 람다 파지 DNA LAMP 프라이머 세트를 람다 파지 DNA를 표적화하도록 디자인하였다. Se01 프라이머 세트를 살모넬라 엔테리카를 표적화하기 위해 설계하였다. Spa1 LAMP 프라이머 세트를 스타필로코커스 아우레우스를 표적화하기 위해 설계하였다.
일 구체예에서, LAMP 프라이머는 공급업체로부터 획득될 수 있다. 다른 구체예에서, LAMP 프라이머는 유도체화로서 디자인될 수 있다. 이러한 유도체화된 LAMP 프라이머의 일 예는 문헌[Kubota, R., B. G. Vine, A. M. Alvarez, and D. M. Jenkins, "Detection of Ralstonia solanacearum by loop-mediated isothermal amplication," Phytopathology. 98(9): 1045-1051 (2008)]에 기술된 LAMP 프라이머를 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않으며, 상기 문헌 전체는 본원에 참고로 포함된다. 프라이머 세트 및 동화 프로브 가닥 각각에 대한 서열은 표 2에서 확인될 수 있다.
하기에서 논의되는 실험에서, 쿠보타 등(Kubota et al.)의 프로토콜을 이용하여 상이한 표적 서열들을 선택적으로 증폭시켰다. 일 구체예에서, DNA 표적은 공동 저자 Schell 및 Allen에 의해 제공된 서열 비교 정보(데이타는 기술하지 않음)를 이용하여 박테리오파지 람다, 랄스토니아 솔라나세아룸의 race 3 biovar 2 균주, 랄스토니아 솔라나세아룸, 살모넬라 엔테리카, 및 스타필로코커스 아우레우스 중 하나를 포함한 것이다.
일 구체예에서, LAMP 반응을 약 1.6 μM FIP 및 BIP, 약 0.2 μM 농도의 F3 및 B3 프라이머, 약 0.4 μM 농도의 루프 B 프라이머, 약 400 μM 데옥시누클레오시드 트리포스페이트 (dNTP), 약 1.0 M 베타인 (예를 들어, Sigma-Aldrich Corp, St Louis, MO), 20 mM 트리스-HCl (대략 pH 8.8), 약 10 mM KCl, 약 10 mM (NH4)2S04, 약 6 mM MgS04, 약 0.1% 트리톤 X-100 및 주형 DNA를 함유한 대략 25 ㎕ (전체 부피) 반응 혼합물에서 수행하였다. 온도 제어를 위해 서멀 사이클러(thermal cycler)를 이용하여 대략 0.2 ml 마이크로튜브에서 반응을 수행하였다. 상기 혼합물을 약 5분 동안 약 95℃의 온도로 가열하고, 이후에, 얼음 상에서 냉각시킨 후에, 약 8 U Bst DNA 폴리머라제 큰 단편(예를 들어, New England Biolabs, Inc., Beverly, MA)을 첨가하였다.
다른 구체예에서, 하기 농도에서 Se01 LAMP 및 람다 파지 LAMP 프라이머 세트 둘 모두를 함유하는 25 ㎕로 다중 실시간 LAMP 반응을 수행하였다: 1.6 μM FIP 및 BIP; 0.2 μM F3 및 B3, 및 0.4 μM 루프 F 및 B. 각각 0.08 μM 농도의 FAM Se01 F 프로브, FAM Se01 B 프로브, 및 람다 파지 F 프로브, 및 0.4 μM의 켄처 프로브 01의 농도로 반응 혼합물에 동화 프로브를 함유시켰다.
다른 시약 농도는 하기와 같다: 400 μM dNTP; 1.0 M 베타인 (Sigma-Aldrich Corp, St Louis, MO); 20 mM 트리스-HCl (pH 8.8); 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2S04; 8 mM MgS04; 0.1% 트리톤 X-100; 8 U Bst DNA 폴리머라제 큰 단편 (New England Biolabs), 및 주형 DNA (살모넬라 엔테리카 DNA의 경우에 50 ng 및/또는 람다 DNA의 경우에 5ng).
LAMP 반응의 실시간 모니터링을 위하여, 반응을 65℃에서 60분 동안 인큐베이션하였으며, 형광 신호 (플루오레세인; λex/em = 500/530, Cy3; λex/em = 550/570)를 iQ5 실시간 PCR 검출 시스템 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)을 이용하여 매분 마다 측정하였다. 이후에, 10분 동안 80℃로 가열시켜 반응을 종결시켰다. 각 샘플에 대해 4배수 반응(Quadruplicate reaction)을 수행하였으며, 샘플의 각 세트에 대해, 반응의 각 시간 포인트에 대한 형광 값을 평균처리하였다. 채널들 간의 형광 데이타의 비교를 위하여, 모든 형광 값은, 0 및 1,000 RFU가 반응 동안 제공된 채널 상에서 가장 큰 범위의 형광 값을 갖는 평균처리된 샘플에 대해 관찰된 최소 형광 값 및 최대 형광 값 각각에 대응하는 값으로 정규화되었다.
폴리머라제를 첨가한 후에, 상기 혼합물을 약 65℃에서 약 60분 동안 인큐베이션하였다. 폴리머라제를 변성시키기 위하여 약 80℃로 가열시켜 반응을 종결시켰다. 증폭된 생성물을 약 85V에서 약 90분 동안 약 2% 아가로즈 겔(1×트리스-아세테이트-EDTA)을 통해 전기영동시킨 후에, 적절한 크기 마커(예를 들어, Hyper ladder II; Bioline USA, Inc., Randolph, MA)를 이용하여 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색시켰다.
LAMP 반응을 분자 지퍼 및 동화 프로브를 이용하여 실시간 모니터링하였다. 분자 지퍼는 종 특이적 프라이머(예를 들어, 랄스토니아 솔라나세아룸의 모든 균주로부터 DNA의 증폭을 야기시키는 프라이머)로부터 얻어진 LAMP 앰플리콘(amplicon)의 루프 영역을 표적화하도록 디자인되었다. 일 구체예에서, 약 2 μM의 양성 가닥(형광단) 및 음성 가닥(켄처)을 약 100 mM 트리스-HCl (약 pH 8.0) 및 약 10 mM EDTA (약 8.0의 pH)를 함유한 완충액에 혼합하고 약 95℃에서 약 5분 동안 가열하고 실온으로 서서히 냉각시켜 분자 지퍼를 생산하였다. 약 0.04 μM 농도의 분자 지퍼를 실시간 LAMP 반응을 위해 사용하였다.
이후에, 이러한 분자 지퍼를 종-선택적 LAMP 프라이머, 표적 DNA(예를 들어, 랄스토니아 솔라나세아룸)를 지닌 반응 혼합물에, 및 음성 대조군(예를 들어, 람다 파지로부터의 DNA, 또는 DNA를 함유하지 않은 반응 혼합물)에 첨가하였다.
동화 프로브가 LAMP 반응을 검출하는 능력을 시험하기 위하여, 종 특이적 프라이머로부터 얻어진 LAMP 앰플리콘의 루프 영역을 표적화하도록 디자인된 동화 프로브를 또한 생산하였다. 특정 구체예에서, 양성 가닥(형광단) 및 음성 가닥(켄처)을 서로 분리된 상태로 유지시키고 LAMP 혼합물에 직접 첨가하였다. 형광단 및 켄처의 농도의 비는 각각 약 1 미만:1이었다.
분자 지퍼 및 동화 프로브가 LAMP 반응 혼합물에서 일어나는 LAMP 반응을 검출하는 능력을 반응 혼합물로부터 방출된 형광으로부터 결정하였다. 예를 들어, 형광을 IQ5 실시간 PCR 시스템(예를 들어, Bio-Rad, Hercules CA)을 이용하여 측정하였다.
실시예 1 - 하드웨어 성능
주문 제작된 형광계를 이용하여 분자 비콘을 함유하지만 LAMP 앰플리콘을 함유하지 않은 음성 대조군(데이타 미도시됨)과 비교하여, 루프 영역들 중 하나를 표적화하는 분자 비콘으로 라벨링된 LAMP 생성물들 간의 차이를 성공적으로 관찰하였다. 다양한 크기의 반응 웰을 갖는 ABS에서의 주문 제작된 프린팅된 CD는 도 4에 나타내었다.
실시예 2 - 온도 교정 및 제어 시험
교정 기술을 평가하기 위하여 상기에 논의된 바와 같이 온도 교정을 수행하였다. 교정 측정을 패턴화된 ABS 및 폴리카보네이트에서 반응 웰 상에서 수행하고, 웰 및 투명 필름을 통한 복사선 손실에도 불구하고 매우 정확한 비-접촉 온도 측정을 산출하였다. 예를 들어, 도 5는 타입 K 열전대에 의해 측정된 실제 웰 온도와 비교하여 비-접촉 온도계(예를 들어, 고온계)로부터 추정된 보정된 웰 온도를 도시한 것이다. 원은 폴리카보네이트에서 절단된 웰로부터 측정된 데이타를 나타낸 것이며, 삼각형은 ABS에서 절단된 웰로부터 측정된 데이타를 나타낸 것이다. 웰을 통한 복사선의 투과 및 웰 표면으로부터 주변 방사선의 반사에 대한 계수를 추정하기 위해 사용된 보정 데이타는 도 5의 삽도(inset)에 도시되었다. 폴리카보네이트 CD 상의 개별적으로 교정된 웰의 온도에서 관찰된 표준 오차는 대략 0.35℃이다. ABS에 일부 패턴화된 것을 포함하는 총 5개의 웰 상에서 동일한 교정을 적용하여, 약 0.93℃의 측정된 온도에서 표준 오차를 산출하였다. 후자의 결과는, 관찰된 온도에서 열복사선에 대한 특정 범위에 걸쳐 ABS 및 폴리카보네이트의 방사율은 매우 유사하다는 것을 시사한다.
도 6은 단지 보정된 비-접촉 온도 측정을 이용하여 반응 웰에서 약 65℃의 설정값까지의 온도 제어를 나타내는 순간 온도 측정을 도시한 것이다. 이러한 데이타는, 설정값이 약 1분 내에 도달되는 것으로 나타낸다. 또한, 데이타의 분석은, 설정값에 도달한 후에 시스템 제곱근 평균 오차가 약 0.27℃임을 발견하였다. 이러한 결과는, 반응 웰 내의 온도가 기술된 교정 공정의 구체예를 이용하여 높은 정도로 제어될 수 있음을 나타낸다.
온도 제어의 범위 및 속도를 개선시키기 위하여, DNA는 LAMP 이전에 변성될 수 있다. 일 구체예에서, 이는 웰을 가열시키기 위해 사용되는 것 보다 높은 출력의 레이저를 이용하여 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 반응 웰의 디자인은 이의 열용량을 제한하고 단열(insulation)을 개선시키도록 변경될 수 있다.
실시예 3 - LAMP 반응 셋업
a) 박테리아 균주 및 DNA 정제
Rs 균주 GMI1000 (R1B3) 및 UW551 (R3B2)을 노르만(Norman) 및 알바레즈(Alvarez)의 문헌[Norman, D., and Alvarez, A. M., "A rapid method for presumptive identification of Xanthomonas campestris pv . dieffenbachiae and other xanthomonads," Plant Disease, 73, 654-658 (1989), 이러한 문헌 전체는 본원에 참고로 포함됨]에 따라 개질된 테트라졸륨 클로라이드(TZC) 아가 배지 상에서 성장시켰다. Rs 균주를 약 28℃에서 약 48 내지 72 시간 동안 인큐베이션시켰다. DNA를 제조업체 설명서에 따라 Wizard? Genomic DNA 정제 키트(Promega Corp., Madison, WI)를 이용하여 이러한 세포들로부터 정제하고 분광학적 분석으로 정량화하였다. 람다 DNA LAMP 반응을 위하여, 정제된 람다 DNA를 구입하였다(New England Biolabs, Inc., Beverly, MA).
스타필로코커스 아우레우스 균주를 Lysogeny 브로쓰(Lysogeny broth; LB) 배지를 이용하여 추가로 성장시키고 약 38℃에서 약 18 내지 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 세포들을 ddH2O에 현탁시키고 100℃에서 15분 동안 열사(heat-kill)시켰다.
다중 검출의 구체예에서, 살모넬라 엔테리카 균주를 자일로즈-라이신-데스옥시콜레이트(XLD) 아가 배지(Zajic-Satler and Gragas, 1977) 상에서 추가로 성장시키고, 38℃에서 18 내지 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. DNA를 제조업체 설명서에 따라 Wizard? Genomic DNA 정제 키트(Promega Corp., Madison, WI)로 이러한 세포들로부터 정제하고, 분광학적 분석으로 정량화하였다. 람다 파지 LAMP 반응을 위하여, 정제된 람다 DNA를 구입하였다(New England Biolabs, Inc., Beverly, MA).
b) LAMP 반응
단일 증폭 검출을 위한 동화 프로브의 구체예에서, 달리 주지되는 것을 제외하고, 25 ㎕의 전체 부피를 갖는 LAMP 반응 혼합물을 사용하여 LAMP 반응을 수행하였다. 특정 구체예에서, 반응 혼합물은 약 1.6 μM FIP 및 BIP, 약 0.2 μM의 F3 및 B3 프라이머, 및 약 0.4 μM 농도의 루프 프라이머를 포함한다.
LAMP 반응 혼합물 중의 다른 시약 농도는 하기와 같다: 약 400 μM dNTP, 약 1.0 M 베타인(Sigma-Aldrich Corp, St Louis, MO), 약 20 mM 트리스-HCl (pH 약 8.8), 약 10 mM KCl, 약 10 mM (NH4)2S04, 약 6 mM MgS04, 약 0.1 % 트리톤 X-100 및 약 50 ng (또는 람다 DAN에 대해 약 50pg)의 주형 DNA.
rsfliC LAMP 프라이머 세트에 대하여, GMI1000 균주의 정제된 게놈 DNA를 양성 대조군으로서 사용하였으며, rk2208.1 LAMP 프라이머 세트에 대하여, UW551 균주의 DNA를 양성 대조군으로서 사용하였다. 상기 혼합물들을 약 5분 동안 약 95℃로 가열한 후에, 얼음 상에서 냉각시키고, 이후에 약 8 U Bst DNA 폴리머라제 큰 단편 (New England Biolabs)을 첨가하였다. 상기 폴리머라제를 첨가한 직후에, 반응을 약 65℃에서 약 60분 동안 인큐베이션시키고, 이후에 약 80℃로 가열시켜 반응을 종결시켰다.
다중 증폭 검출을 위한 동화 프로브의 구체예에 대하여, 달리 주지되는 것을 제외하고, 25 ㎕의 전체 부피를 갖는 LAMP 반응 혼합물을 사용하여 LAMP 반응을 수행하였다. 특정 구체예에서, 반응 혼합물은 약 1.6 μM FIP 및 BIP, 약 0.2 μM F3 및 B3, 및 약 0.4 μM 루프 F 및 B를 포함하였다. 동화 프로브는 또한 FAM Se01 F 프로브, FAM Se01 B 프로브 및 람다 파지 F 프로브 각각에 대해 약 0.08 μM, 및 켄처 프로브 01에 대해 약 0.4 μM 농도로 반응 혼합물에 함유되었다.
LAMP 반응 혼합물 중의 다른 시약 농도는 하기와 같다: 400 μM dNTP; 1.0 M 베타인(Sigma-Aldrich Corp, St Louis, MO); 20 mM 트리스-HCl (pH 8.8); 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2S04; 8 mM MgS04; 0.1% 트리톤 X-100; 8 U Bst DNA 폴리머라제 큰 단편 (New England Biolabs), 및 주형 DNA (살모넬라 엔테리카 DNA에 대해 50 ng 및/또는 람다 DNA에 대해 5 ng).
LAMP 반응의 실시간 모니터링을 위하여, 반응을 65℃에서 60분 동안 인큐베이션시키고, 형광 신호(플루오레세인; λex/em = 500/530, Cy3; λex/em = 550/570)를 iQ5 실시간 PCR 검출 시스템 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)을 이용하여 매 분마다 측정하였다. 이후에, 10분 동안 80℃로 가열시켜 반응을 종결시켰다. 4배수 반응을 각 샘플에 대해 진행시키고, 형광 값을 각 샘플 세트에 대해 각 반응 시간 포인트 동안에 평균처리하였다.
채널들 간의 형광 데이타의 비교를 위하여, 모든 형광 값은, 0 및 1,000 RFU가 반응 동안 제공된 채널 상에서 가장 큰 범위의 형광 값을 갖는 평균처리된 샘플에 대해 관찰된 최소 형광 값 및 최대 형광 값 각각에 대응하는 값으로 정규화되었다.
반응 혼합물에 첨가되는 주형 DNA의 양을 사용되는 LAMP 프라이머에 따라 변경시켰다. 예를 들어, 람다 파지 프라이머의 경우에, 약 5 ng 박테리오파지 람다 DNA를 첨가하였다. rk1249.1, rk2208, 및 rk2403.1 프라이머의 경우에, 약 50 g 랄스토니아 솔라나세아룸 Race3 Biovar2 DNA를 첨가하였다. rsfliC 프라이머의 경우에, 약 50 g 랄스토니아 솔라나세아룸 DNA를 첨가하였다. Se01 프라이머의 경우에, 약 50 ng 살모넬라 엔테리카 DNA를 첨가하였다. Spa1 프라이머의 경우에, 약 1.0 ㎕의 스타필로코커스 아우레우스 DNA의 열사된 세포를 첨가하였다.
c) LAMP 반응을 위한 동화 프로브의 디자인
단일 증폭 검출을 위한 동화 프로브의 구체예에서, 3' 단부에 rsfliC loopB 또는 rk2208.1 loopF 프라이머 서열 및 5' 단부에 켄처 프로브에 대해 상보적인 서열을 함유하도록 동화 프로브의 형광 가닥을 디자인하였다. 동화 프로브에서의 켄칭 가닥으로 어닐링될 때, 켄처 가닥의 3' 단부에 컨주게이션된 켄처 분자(예를 들어, BlackHoleQuecher-1)가 형광을 효과적으로 켄칭하도록, 형광 분자(예를 들어, 플루오레세인)를 형광 프로브의 5' 단부에 컨주게이션시켰다. 각 프라이머 및 프로브의 분자 구조/서열은 표 1에 요약되어 있다.
다중 증폭 검출을 위한 동화 프로브의 구체예에서, 3' 단부에 Se01 loopF, Se01 loopB 또는 람다 파지 loopF 프라이머 서열, 및 5' 단부에 켄처 프로브에 대해 상보적인 서열을 함유하도록 동화 프로브의 형광 가닥을 디자인하였다. 동화 프로브에서 켄칭 가닥으로 어닐링될 때, 켄처 가닥의 3' 단부에 컨주게이션된 켄처 분자(예를 들어, BlackHoleQuecher-1)가 형광을 효과적으로 켄칭시키도록, 플루오레세인 분자를 Se01 F 프로브 및 Se01 B 프로브의 5' 단부에 컨주게이션시키고, Cy3 분자를 람다 파지 F 프로브의 5' 단부에 컨주게이션시켰다. 각 프라이머 및 프로브의 분자 구조/서열은 표 2에 요약되어 있다.
실시예 4 - rsfliC LAMP 반응을 위한 분자 지퍼의 평가
LAMP 반응을 실시간으로 모니터링하기 위한 분자 지퍼의 성능을 시험하기 위하여, 종래 문헌[Yi, et al (Yi, J. Z., W. D. Zhang, and D. Y. Zhang, "Molecular Zipper: a fluorescent probe for real-time isothermal DNA amplification," Nucleic Acids Research, 34 (2006), 이러한 문헌 전체는 참고로 포함된다]의 프로토콜에 따라 분자 지퍼를 형성시켰다. 이러한 실험에서 rsfliC LAMP 프라이머 세트를 사용하였고, 표 1에 기술된 바와 같이 3' 단부측에 rsfliC LAMP loopB 프라이머 서열을 함유하도록 형광 프로브를 디자인하였다. 약 0.4 μM의 최종 농도의 분자 지퍼를 rsfliC LAMP 반응 혼합물과 혼합하고, 상기 혼합물을 약 65℃에서 약 120분 동안 인큐베이션시켰다.
iQ5 실시간 PCR 검출 시스템을 이용하여 형광 신호를 관찰하였다. Rs 균주, GMI1000의 게놈 DNA (50ng)를 양성 샘플용으로 사용하였으며, 이중 증류수(ddH2O)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 두 가지 처리 모두를 삼배수(in triplicate)로 제조하고, 복제물로부터의 데이타를 평균처리하여 제공된 반응의 과정 전반에 걸쳐 평균 형광 프로파일을 형성시켰다(예를 들어, 도 7).
도 7에 도시된 바와 같이, 분자 지퍼를 이용하여 두 가지 처리(GMI1000 게놈 DNA 대 ddH20)의 형광 프로파일에서 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 또한, 각 반응의 과정 동안에 형광 신호의 증가가 관찰되지 않았다. 두 가지 처리 모두는 실질적으로 높은 백그라운드 형광 신호를 나타내었는데, 이는 반응 온도에서 분자 지퍼로의 형광 가닥의 실질적으로 불완전한 어셈블리를 나타내는 것이다.
실시예 5 - 동화 프로브를 이용한 rsfliC LAMP 반응의 실시간 모니터링
반응 속도를 실질적으로 희생시키지 않으면서 rsfliC LAMP 반응을 실시간으로 모니터링하기 위하여, 약 0.08 μM 형광 프로브 및 약 0.16 μM의 켄처 프로브를 반응 혼합물에 직접 포함시킨 후에, 이중 가닥 분자 지퍼 구조를 형성시켰다. 반응 혼합물을 약 65℃에서 약 120분 동안 인큐베이션시키고, 형광 신호를 iQ5 실시간 PCR 검출 시스템을 이용하여 관찰하였다.
도 8은 동화 프로브 전구체의 존재 하에 rsfliC LAMP 반응의 형광 신호가 약 30분의 인큐베이션 후에 분자 비콘을 이용하여 설명된 바와 같이 rsfliC 반응 속도와 실질적으로 일치하여, 나타남을 도시한 것이다(실험 6). 동화 프로브의 가닥의 혼성화 및 LAMP 반응 혼합물에 혼성화된 동화 프로브의 첨가는 rsfliC LAMP 반응을 유의미하게 방해하여, 양성 반응의 지연된 징후를 나타낸다. 그러나, rsfliC LAMP 반응 혼합물에 직접 형광 및 켄처 프로브를 첨가함으로써, 프로브를 갖는 rsfliC LAMP의 속도는 크게 개선되어, 저해되지 않은 rsfliC LAMP 반응의 속도를 반영한다.
이중 가닥 DNA 프로브는 약 65℃에서 동적 평형 조건 하에 존재하며, 형광 및 켄처 프로브 분자는 끊임없이 해리되고 재결합되어, 프로브와 LAMP 앰플리콘의 상호작용을 촉진시킨다. 이러한 조건 하에서 백그라운드 형광을 억제하기 위하여, 켄처 프로브의 농도는, 형광 프로브가 LAMP 앰플리콘에 동화될 때에 단지 비켄칭된 형광이 일어나도록, 형광 프로브의 농도 보다 높아야 한다.
실시예 6 - LAMP 반응 속도에 대한 형광 및 켄처 프로브의 비의 실험
rsfliC LAMP 반응을 모니터링하기 위해 동화 프로브를 제공하기 위하여 분자 지퍼의 형광 및 켄처 프로브의 비를 조정하였다. 형광 프로브의 백그라운드 신호를 줄이기 위하여, 형광 프로브 대 켄처 프로브의 비는 약 1:2로 낮춰졌다. LAMP 반응을 모니터링하기 위하여, 약 0.08 μM의 형광 프로브 및 약 0.16 μM의 켄처 프로브를 포함하는 약 0.08 μM의 얻어진 동화 프로브를 rsfliC LAMP 반응 혼합물과 혼합하였다. 형광 및 켄처 프로브의 서열 특이성을 확인하기 위하여, 람다 DNA LAMP 프라이머 세트를 실시간 LAMP를 위한 대조군으로서 rsfliC 동화 프로브와 함께 사용하였다.
LAMP 앰플리콘에 동화 프로브의 동화와 관련된 형광 신호를 람다 DNA LAMP 반응으로부터가 아닌 단지 GMI1000 게놈 DNA를 지닌 rsfliC LAMP 반응 혼합물로부터 관찰하였다. 이러한 관찰은 rsfliC 동화 프로브의 서열 특이성을 설명한다.
개개 반응에서 rsfliC 및 람다 DNA LAMP 앰플리콘 둘 모두의 존재를 확인하기 위하여 아가로즈 겔 전기영동 분석을 추가로 수행하였다. 형광 프로파일(도 9)은, rsfliC LAMP 반응이 제공된 농도의 동화 프로브를 이용하여 검출될 수 있지만, 단지 약 65℃에서 약 60분의 인큐베이션 이후에 검출될 수 있음을 나타내었다. 반대로, 동화 프로브의 부재 하에서의 rsfliC LAMP 반응은 통상적으로 약 65℃에서 약 60분 내에 다량의 앰플리콘을 형성시켰다. 이는 중합 반응의 침전된 마그네슘 피로포스페이트 부산물의 축적 및 분자 비콘(하기 실험 7 참조) 또는 겔 전기영동으로 여러 간격에서 정지된 반응을 프로빙(probing)함으로써 관찰될 수 있다. 이러한 결과는, 동화 프로브의 존재가 LAMP 반응에서 루프 프라이머의 어닐링을 억제하여 이의 전체 진행을 지연시킬 수 있음을 시사한다. 이에 따라, 동화 프로브의 전체 농도는 실시간 서열 특이적 검출을 가능하게 하면서 LAMP 반응을 전속력으로 진행시키기 위해 선택된 범위 내에서 변경될 수 있다.
실시예 7 - 분자 비콘에 의한 rsfliC LAMP 프라이머 세트의 속도 측정
rsfliC LAMP 반응의 실제 속도를 결정하기 위하여, rsfliC loopF 및 loopB 영역을 표적화하도록 표 1에 기술된 분자 비콘을 디자인하였다. 약 0.4 μM의 분자 비콘을 rsfliC LAMP 반응에 첨가하고, 약 65℃에서 각각 대략 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 분 동안 인큐베이션하였다. 약 80℃에서 약 10분 동안 인큐베이션하여 각 반응을 종결시켰다. 분자 비콘을 지닌 rsfliC LAMP 혼합물의 형광 강도를, 반응을 종결시킨 후에 약 25℃에서 측정하였다. 분자 비콘이 반응을 지연시키지 않음을 확인하기 위하여, 분자 비콘이 없이 여러 간격에서의 정지된 반응들을 아기로즈 겔 전기영동으로 처리하여 rsfliC 앰플리콘의 존재를 확인하였다.
도 10은 시간에 따른 상대적 형광에 대한 결과를 도시한 것이다. 도 10의 결과는 rsfliC loopF 및 B 영역에 대한 두 가지 분자 비콘 모두가 rsfliC LAMP 앰플리콘의 이들의 표적 영역에 성공적으로 혼성화할 수 있다는 것을 나타낸다. 두 가지 분자 비콘 모두의 서열 특이성을 또한 음성 대조군(데이타 미도시됨)으로서 람다 DNA LAMP 반응을 이용하여 확인하였다. 분자 비콘 데이타는 rsfliC LAMP 반응으로부터의 검출 가능한 양의 앰플리콘의 증식이 30분의 인큐베이션 내로 일어나고 포화가 대략 약 55분의 인큐베이션에 일어남을 추가로 나타낸다.
분자 비콘 없는 rsfliC 반응의 아가로즈 겔 전기영동 분석은 또한 약 30분에 개시하는 희미한 밴드의 출현(데이타 미도시됨)을 나타내는데, 이는 분자 비콘 함유 반응에서 형광의 개시와 연관성이 있다. 이러한 결과는, 실험 6으로부터의 결과와 비교하여, 분자 지퍼가 rsfliC LAMP 반응 속도를 크게 감소시킨다는 결론을 지지한다.
실시예 8 - LAMP 반응 속도에 대한 증가된 폴리머라제 농도의 영향
LAMP 반응을 개시하기 위해 rsfliC 및 R3B2 특이적 rk2208.1 LAMP 프라이머 세트를 사용하였으며, 약 0.08 μM 형광 프로브 및 약 0.16 μM 켄처 프로브의 농도를 갖는 상응하는 동화 프로브를 이용하여 실시간으로 모니터링하였다. 동화 프로브를 반응 혼합물에 직접 포함시킨 후에, 이중 가닥 분자 지퍼 구조를 형성시켰다. 반응 속도의 동력학적 제약을 조사하기 위하여, 각 프라이머 세트와의 반응을 상이한 양(약 8U 또는 약 16U)의 Bst DNA 폴리머라제를 이용하여 진행시켰다.
도 11에 도시된 바와 같이, 관찰 가능한 형광을 형성시킨 rk2208.1 프라이머 세트를 사용한 LAMP 반응은, 약 8U를 사용할 때, 약 20분 내에 증가하고, 약 16U를 사용할 때, 약 10분 내에 증가한다. 관찰 가능한 형광을 형성시키는 rsfliC LAMP 프라이머 세트와의 LAMP 반응은 Bst DNA 폴리머라제 농도와는 무관하게 약 30분 내에 증가한다.
rk2208.1 반응의 속도 제한 프라이머 어닐링 단계의 포워드 결합 속도 상수(foward bonding rate constant)의 결과를 나타낸 이러한 결과는 rsfliC 반응에서 상응하는 속도 보다 매우 크다. 이러한 개선된 어닐링 속도(annealing rate)는 동력학적 비례 이득(proportional kinetic gain)이 폴리머라제 활성을 증가시킴으로써 rk2208.1 반응에서 관찰될 수 있을 정도 매우 충분하다. 추가 이득은 반응에서 폴리머라제 농도의 상응하는 증가에 의해 관찰될 수 있다.
실시예 9 - 검출 속도 및 반응 동력학에 대한 rk2208 .1 LAMP 를 갖는 Bst DNA 폴리머라제 농도의 영향의 추가 시험
LAMP 반응을 개시하기 위하여 R3B2 특이적 rk2208.1 LAMP 프라이머 세트를 사용하였으며, 약 0.08 μM 형광 프로브 및 약 0.16 μM 켄처 프로브의 농도를 갖는 상응하는 동화 프로브를 사용하여 실시간으로 모니터링하였다. 동화 프로브를 반응 혼합물에 직접 포함시킨 후에, 이중 가닥 분자 지퍼 구조를 형성시켰다. 반응 속도의 동력학 제약을 조사하기 위하여, 각 프라이머 세트와의 반응을 상이한 양, 약 0 U, 약 4 U, 약 8 U, 약 12 U, 약 16 U, 약 20 U, 약 24 U, 약 28 U, 및 약 32 U)의 Bst DNA를 사용하여 진행하였다.
관찰 가능한 형광을 나타내는 rk2208.1 프라이머 세트를 사용한 LAMP 반응은 약 4 U의 Bst DNA 폴리머라제를 사용할 때 약 30분 내에 증가한다(도 12). 형광은 약 8U로 폴리머라제 농도를 증가시킴에 따라 약 20분 후인, 보다 짧은 시간에 관찰되었다. 약 15 U 보다 큰(예를 들어, 약 15U, 약 20 U, 약 24 U, 약 28 U, 및 약 32 U) 폴리머라제 농도의 증가는 약 10 내지 15분 내에 관찰 가능한 형광을 나타내었다.
Bst DNA 폴리머라제 농도의 증가는 최대 속도에 도달하는 시간의 증가를 또한 제공한다. 도 13은 분당 형광 이득의 최대 속도에 도달하는 시간과 관련성을 도시한 것이다. 최대 속도에 도달하는 시간은 Bst DNA 폴리머라제 농도가 약 4U에서 약 32U로 증가함에 따라 약 40분에서 약 15분으로 감소된다.
실시예 10 - 루프 프라이머 없는 rk2208 .1 LAMP 프라이머 세트를 위한 동화 프로브 조성물의 시험
루프 프라이머를 지니지 않은 rk2208.1 LAMP 프라이머 세트를 사용하여 LAMP 반응 혼합물로부터 형광을 검출하기 위한 시간에 대한 형광 프로브 및 켄처 프로브의 양의 영향을 결정하였다. 루프 프라이머 없이, LAMP 반응에서 약 0.16 μM, 약 0.8 μM, 및 약 1.6 μM의 켄처 프로브와 각각 혼합된, 약 0.08 μM, 약 0.4 μM, 및 약 0.8 μM의 형광 프로브 농도를 사용하여 반응을 진행시켰다. 이러한 시험 결과는 도 14에 도시되었다. 원은 낮은 프로브 농도이며(약 0.08 μM 형광 프로브 및 약 0.16 μM 켄처 프로브), 삼각형은 중간 정도의 프로브 농도이며(약 0.4 μM 형광 프로브 및 약 0.8 μM 켄처 프로브), 사각형은 중고(high medium) 프로브 농도이다(약 0.8 μM 형광 프로브 및 약 1.6 μM 켄처 프로브). 음영 기호는 주형 DNA를 포함한 반응이며, 오픈 기호(open symbol)는 음성 대조군(ddH2O)이다.
일반적으로, 도 14에 도시된 바와 같이, 반응 혼합물에 보다 많은 양의 동화 프로브의 존재는 관찰 가능한 형광 증가의 개시에 있어 보다 긴 지연을 나타내었다. 이러한 결과는, 보다 높은 농도의 동화 프로브가 rk2208.1 LAMP 반응의 속도를 저해할 수 있다는 것을 확인한다. 이러한 실험은 또한, 동화 프로브가 심지어 루프 프라이머의 부재 하에 LAMP 앰플리콘에 도입될 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는, 동화 프로브에 의한 억제가 루프 프라이머의 어닐링 및 확대 이외에, LAMP 공정에서의 단계에 영향을 미친다는 것을 추가로 시사한다.
실시예 11 - 루프 프라이머를 지닌 rk2208 .1 LAMP 프라이머 세트를 위한 동화 프로브 조성물의 시험
루프 프라이머를 포함한 LAMP 반응에 대한 동화 프로브 조성물의 효과를 결정하기 위하여, 반응에서 루프 프라이머를 포함시킨 후에 실험 10을 반복하였다. 실험 결과는 도 15에 도시되어 있는데, 여기서 원형은 낮은 프로브 농도(약 0.08 μM 형광 프로브 및 약 0.16 μM 켄처 프로브)이며, 삼각형은 중간 정도의 프로브 농도(약 0.4 μM 형광 프로브 및 약 0.8 μM 켄처 프로브)이며, 사각형은 중고 프로브 농도(약 0.8 μM 형광 프로브 및 약 1.6 μM 켄처 프로브)이다. 음영 기호는 주형 DNA를 포함한 반응이며, 오픈 기호는 음성 대조군(ddH2O)이다.
도 15에 도시된 바와 같이, 시험된 가장 낮은 농도(약 0.08 μM 형광 프로브 및 약 0.16 μM 켄처 프로브)에서 rk2208.1을 위한 동화 프로브는 약 20분 후에 형광 신호를 나타내었다. 중간 농도(약 0.4 μM 형광 프로브 및 약 0.8 μM 켄처 프로브)에서는 약 70분 후에 형광의 증가를 나타내었다. 가장 높은 동화 프로브 농도(약 0.8 μM 형광 프로브 및 약 1.6 μM 켄처 가닥)를 포함한 반응은 약 120분 반응 동안 임의의 포인트에서 형과의 증가를 나타내지 않았다. 이러한 결과는, 가장 높은 농도의 동화 프로브가 rk2208.1 LAMP 반응의 속도를 저해하며, rk2208.1 loopF 프라이머의 존재가 반응 속도를 향상시킨다는 것을 확인한다.
실시예 12 - LAMP 반응 및 속도에 대한 삽입 물질( EvaGreen )의 영향 평가
LAMP 반응에 대한 삽입 염료 (EvaGreen)의 영향을 평가하기 위하여, EvaGreen을 rk2208.1 LAMP 반응 혼합물 (rk2208.1 loopF 프라이머를 지니거나 지니지 않음)에 첨가하고, 형광 신호를 측정함으로써 반응을 관찰하였다. 이러한 조건 하에서 형광 증가의 개시를 위한 시간은 최적의 동화 프로브 조성물과의 rk2208.1 LAMP 반응 속도와 비교되었다. 이러한 실험의 결과는 도 16에 도시되어 있다.
EvaGreen과의 rk2208.1 LAMP 반응 (rk2208.1 loopF 프라이머를 지니거나 지니지 않음)은 각각 약 30분 및 약 80분의 인큐베이션 후에 형광 신호를 나타내었다. 동화 프로브와의 rk2208.1 LAMP 반응은 약 20분 내에 반응을 나타내었다. 이러한 결과는, 삽입 염료가 rk2208.1 LAMP 반응을 크게 억제함을 시사한다. EvaGreen은 Bst DNA 폴리머라제의 효율을 방해할 수 있는데, 왜냐하면 이러한 효소가 가닥-치환 활성을 가지며, 삽입 염료는 이중 가닥 DNA를 안정화시키기 때문이다.
실시예 13 - 살모넬라 엔테리카 및 박테리오파지 람다 게놈 DNA 의 동시 LAMP 기반 검출에 대한 동화 프로브 성능의 시험
도 17은 살모넬라 엔테리카 및 박테리오파지 람다 게놈 DNA을 증폭시키는 LAMP 반응에 대한 상대적 형광 대 시간의 플롯이다. 형광 값을 플루오레세인 채널 (λex/em = 500/530- SeO1F에 대한 프로브 라벨) 및 cy3 채널 (λex/em = 550/570- 람다 파지 F에 대한 프로브 라벨) 상에서 측정하였다. 살모넬라 엔테리카 및 박테리오파지 람다 게놈 DNA 둘 모두를 함유한 샘플은 단색 원형(
Figure pct00010
)으로 나타내며, 주형 DNA를 지니지 않은 음성 대조군은 오픈 원형(
Figure pct00011
)으로 나타내며, 단지 살모넬라 엔테리카 게놈 DNA를 지닌 샘플은 단색 삼각형(solid triangle)(
Figure pct00012
)으로 나타낸 것이며, 단지 박테리오파지 람다 게놈 DNA를 지닌 샘플은 단색 다이아몬드(
Figure pct00013
)로 나타낸 것이다.
도 18은 살모넬라 엔테리카 및/또는 박테리오파지 람다 게놈 DNA를 증폭시키는 LAMP 반응에 대한 상대적 형광 대 시간의 플롯이다. 형광 값을 동화 프로브를 사용하여 다중 검출 동안 플루오레세인 채널 (λex/em = 500/530- Se01F에 대한 프로브 라벨) 상에서 측정하였다. 살모넬라 엔테리카 및 박테리오파지 람다 게놈 DNA 둘 모두를 지닌 샘플은 단색 원형(
Figure pct00014
)으로 나타내며, ddH2O를 지닌 음성 대조군은 오픈 원형(○)으로 나타내며, 단지 살모넬라 엔테리카 게놈 DNA를 지닌 샘플은 단색 삼각형(
Figure pct00015
)으로 나타내며, 단지 박테리오파지 람다 게놈 DNA를 지닌 샘플은 단색 다이아몬드(
Figure pct00016
)로 나타낸다.
도 19는 살모넬라 엔테리카 및/또는 박테리오파지 람다 게놈 DNA를 증폭시키는 LAMP 반응을 위한 상대적 형광 대 시간의 플롯이다. 형광 값을 동화 프로브를 사용하여 다중 검출 동안 cy3 채널 (λex/em = 550/570- 람다 파지 F에 대한 프로브 라벨) 상에서 측정하였다. 살모넬라 엔테리카 및 박테리오파지 람다 게놈 DNA 둘 모두를 지닌 샘플은 단색 원형(
Figure pct00017
)으로 나타내며, ddH2O를 지닌 음성 대조군은 오픈 원형(○)으로 나타내며, 단지 살모넬라 엔테리카 게놈 DNA를 지닌 샘플은 단색 삼각형(
Figure pct00018
)으로 나타내며, 단지 박테리오파지 람다 게놈 DNA를 지닌 샘플은 단색 다이아몬드(
Figure pct00019
)로 나타낸다.
특히, 도 17, 도 18 및 도 19의 예 각각에서, 스펙트럼으로 독특한 형광단을 갖는 개개 병원체에 대한 독특한 서열 특이적 동화 프로브를 사용함으로써, 상이한 병원체들은 동시에 특이적으로 검출될 수 있다.
요약하면, 단독으로 또는 임의의 조합으로 여러 강력한 신규한 기술들이 기술되는 구체예들은 매우 유사한 항원 결정요인을 나타냄에도 불구하고 호스트 특이성, 병독성(virulence), 또는 질병 확산에 대해 중요한 다른 생물학적 특징들에 있어 매우 다양할 수 있는 박테리아 병원체의 밀접하게 관련된 서브-집단의 보다 신속한 분류(typing)를 가능하게 할 수 있다. 유전자-기반 기술들은 고려되는 다양한 집단들을 구별하기 위해 제공된 서열 데이타로 용이하게 전달될 수 있다. DNA 복제에 대한 등온 방법을 이용함으로써, 검출 감도 및 선택도는 열적 사이클링 장치의 비용, 복잡성 및 에너지 요건을 부가하지 않으면서 비교적 큰 샘플 부피에서도 개선된다.
표준 디지털 매체와 유사한 사양의 레이저를 이용한 컴팩트 디스크 매체 상에서의 LAMP 반응을 위한 공정 온도를 조절하는 능력 및 반응 웰을 통한 전달 손실 및 주변 열복사의 반사에 대한 보정 후에 비-접촉 온도 측정이 입증된다.
광학적 프로브를 이용하여 실시간으로 LAMP 복제의 진행을 관찰하는 능력이 또한 입증된다. 분자 프로브의 혼성화를 위한 조건에 영향을 미치고 검출 속도 및 감도의 개선을 초래할 수 있는 파라미터들이 확인되었다. 이러한 파라미터들은 켄처 대 형광 프로브의 비, 동화 프로브를 생성시키기 위한 가닥들의 혼합 방식, 폴리머라제 농도, 및 LAMP 반응 혼합물 내의 동화 프로브의 전체 양을 포함할 수 있다.
CD 기반 시스템을 지닌 주문 제작된 형광계의 성능은, 반응이 CD 매체 상에서 실시간으로 모니터링될 수 있으며, 이를 입증하기 위한 실험이 명확하게 계속 진행 중이라는 것을 시사한다. 샘플 캡처, 세척, 용해, 및 DNA 추출의 원심 기반 순서(centrifugal based sequencing)를 갖는 검출 시스템과 이러한 비-접촉 제어의 통합은 실제로 사용되고 동물 및 식물 격리 상황에서 병원체를 검출하기 위한 신속한, 사용자 친화적인 시스템을 형성시킬 수 있다.
상기 설명이 본 교시의 기본적인 신규한 특징들을 나타내고, 기술하고, 적시하지만, 예시된 바와 같은 장치의 세부사항의 형태의 다양한 생략, 치환, 변경 및/또는 부가, 뿐만 아니라 이의 사용이 본 교시의 범위를 벗어나지 않으면서 당업자에 의해 이루어질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 교시의 범위는 상기 논의로 제한되지 않아야 하고, 첨부된 청구범위에 의해 규정되어야 한다.

Claims (16)

  1. 표적 DNA, 및 표적 DNA를 증폭시킬 수 있는 하나 이상의 LAMP 프라이머를 포함하는 LAMP 반응 혼합물을 제공하는 단계;
    상기 LAMP 반응 혼합물에 동화 프로브(assimilating probe)를 첨가하는 단계로서, 동화 프로브가 제 1 올리고누클레오티드 가닥 및 제 2 올리고누클레오티드 가닥을 포함하며, 동화 프로브의 제 1 올리고누클레오티드 가닥이 3' 단부에 위치된 켄처 프로브(quencher probe)를 포함하며 동화 프로브의 제 2 올리고누클레오티드 가닥이 5' 단부에 콘주게이트된 형광단을 포함하며, LAMP 반응 혼합물에 첨가되는 제 2 올리고누클레오티드 가닥의 양 대 제 1 올리고누클레오티드 가닥의 양이 1 미만:1인 단계;
    동화 프로브를 포함하는 상기 LAMP 반응 혼합물에 DNA 폴리머라제를 첨가하는 단계; 및
    동화 프로브 및 DNA 폴리머라제를 포함하는 상기 LAMP 반응 혼합물에 의해 방출된 형광을 측정하는 단계를 포함하는, 표적 DNA의 루프-매개 등온 증폭(LAMP)을 모니터링하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 제 1 올리고누클레오티드 가닥이 DABCYL, TAMRA, 및 Black Hole 켄처 중 하나를 포함하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 형광단이 플루오레세인(fluorescein), cy3, cy5 및 하나 이상의 양자점(quantum dot) 중 하나를 포함하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 제 1 올리고누클레오티드 가닥 및 제 2 올리고누클레오티드 가닥이 LAMP 반응 혼합물에 서로에 대해 비혼성화된 상태(unhybridized state)로 첨가되는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, DNA 폴리머라제의 농도가 8U 이상인 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 반응 혼합물에 첨가된 제 1 올리고누클레오티드 가닥의 양이 0.02 μM 내지 0.8 μM 범위 내인 방법.
  7. 제 1항에 있어서, LAMP 반응 혼합물에 첨가된 제 2 올리고누클레오티드 가닥의 양이 0.01 μM 내지 0.4 μM 범위 내인 방법.
  8. 제 1항에 있어서, LAMP 프라이머가 rsfliC, rk1249.1, rk2208.1, rk2403.1, 람다 파지, Se01, 및 Spa1 중 하나를 포함하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 표적 DNA가 박테리오파지 람다, 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)의 race 3 biovar 2 균주, 랄스토니아 솔라나세아룸, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 중 하나를 포함하는 방법.
  10. 가닥의 3' 단부에 위치된 켄처 프로브를 포함하는 제 1 올리고누클레오티드 가닥; 및
    가닥의 5' 단부에서 콘주게이트된 형광단을 포함하는 제 2 올리고누클레오티드 가닥을 포함하며,
    제 2 올리고누클레오티드 가닥 대 제 1 올리고누클레오티드 가닥의 양의 비가 1 미만:1인, 표적 DNA의 루프-매개 등온 증폭(LAMP)을 모니터링하기 위한 동화 프로브.
  11. 제 10항에 있어서, 형광단이 플루오레세인, cy3, cy5, 및 하나 이상의 양자점 중 하나를 포함하는 프로브.
  12. 제 10항에 있어서, 제 1 올리고누클레오티드 가닥이 DABCYL, TAMRA, 및 Black Hole 켄처 중 하나를 포함하는 프로브.
  13. 제 10항에 있어서, 제 1 올리고누클레오티드 가닥 및 제 2 올리고누클레오티드 가닥이 하나 이상의 LAMP 프라이머 및 표적 DNA를 포함하는 용액과 접촉하기 전에 서로에 대해 비혼성화된 상태로 존재하는 프로브.
  14. 제 10항에 있어서, 제 1 올리고누클레오티드 가닥의 양이 0.02 μM 내지 0.8 μM 범위 내인 프로브.
  15. 제 10항에 있어서, 제 2 올리고누클레오티드 가닥의 양이 0.01 μM 내지 0.4 μM 범위 내인 프로브.
  16. 제 10항에 있어서, 제 1 올리고누클레오티드 및 제 2 올리고누클레오티드가 제 2 올리고누클레오티드 가닥의 매칭되지 않는 오버행 세그먼트(overhanging unmatched segment)에 대한 것을 제외하고 상보적인 프로브.
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