CN113337582B

CN113337582B - 一种单管多重核酸检测的方法

Info

Publication number: CN113337582B
Application number: CN202110622235.4A
Authority: CN
Inventors: 邹秉杰; 盛楠
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2021-06-03
Filing date: 2021-06-03
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2041-06-03
Also published as: CN113337582A

Abstract

本发明公开了一种单管多重核酸检测的方法，所述单管多重核酸检测方法包括以下步骤：在单管中寡核苷酸探针与待测靶标杂交后，通过不同待测靶标对应的核酸酶酶切反应最大速率时的温度不同，进而分析各反应温度下酶切反应速率的变化从而判断反应体系中待测靶标的种类，从而实现多重核酸检测。本发明提出的通过分析酶切反应最大速率对应的温度来进行单管内多个核酸靶标检测的方法，实现了一种荧光标记对4种以上的靶标核酸进行检测，克服了常见基于荧光标记探针法进行多靶标检测时受荧光检测通道限制而无法进行6种以上靶标检测的瓶颈，方法通用性好，并且方法特异性高、灵敏度高，可实现单碱基差异分辨率；发夹荧光标记探针通用，检测成本低。

Description

一种单管多重核酸检测的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种单管多重核酸检测的方法。

背景技术

核酸检测对疾病的早期诊断、治疗监测及预后评估发挥着日益重要的作用。由于疾病相关的核酸标志物众多，核酸多重检测技术显得尤其重要。高通量测序法、微阵列芯片等技术虽然实现了通量极高的多靶标并行检测，但因操作繁琐、成本高、周期长等因素限制了它们广泛应用。因此，类似于荧光定量PCR的单管多重靶标检测技术依然受到青睐。现有的核酸单管多重检测方法大都利用不同的荧光标记的探针来实现核酸靶标的识别，如基于TaqMan探针的荧光定量PCR就是通过不同荧光标记的检测探针同时对多个核酸靶标进行定量检测。然而，这类方法受荧光检测通道的限制，一般仅能实现单管内同时检测2～6种靶标，且荧光检测通道数目越多，仪器售价越高，增加了核酸多重检测的成本。如何用一种荧光标记就能检测多个靶标是核酸多重检测的难点。虽然高分辨率熔解曲线技术(high-resolution melting，HRM)采用双链嵌合饱和染料对PCR扩增产物进行熔解曲线分析，利用不同靶标扩增产物的熔解温度不同实现了一个荧光检测通道对多种核酸靶标的区分。然而，该方法需保证扩增片段长度、碱基序列及GC含量存在差异，因此对产物片段区域的选择和引物设计要求较高，造成检测条件难以优化；此外，HRM技术对温控设备的性能要求很高，控温精度需在0.02～0.1℃，需要高性能的荧光定量PCR仪。韩国Seegene公司的TOCE^TM技术也能实现利用单个荧光标记区分多种核酸靶标，该技术针对不同的靶标序列除设计特异性的引物外，还设计有一条带有寡核苷酸序列标签的Pitcher探针，扩增过程中Pitcher探针能与靶标特异性杂交，经5’核酸酶识别切割释放Pitcher探针上的寡核苷酸标签，其能与标记了荧光基团和淬灭基团的Catcher探针结合，发生延伸反应产生荧光信号，由于不同的靶标可与带有不同寡核苷酸序列标签的Pitcher探针杂交，切割产生的不同序列标签与对应的Catcher探针延伸后的序列长度不同，在反应结束后进行熔解曲线分析，根据熔解温度不同判断靶标种类。尽管TOCE^TM技术只用一种荧光标记能够区分多个靶标，但该技术依然基于熔解曲线分析，在进行Pitcher序列设计与条件优化时仍然较复杂，并且难以区分单个碱基差异的靶序列。

发明内容

发明目的：本发明针对现有单管多重核酸检测技术受荧光通道限制而使检测靶标重数受限的问题，提出一种通过监测酶切反应速率来实现单管多核酸靶标检测的新方法，该方法利用1种荧光标记即可对4种以上的靶标进行检测，可有效改善单管多重核酸检测受荧光通道的限制的问题。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种单管多重核酸检测的方法，所述单管多重核酸检测方法包括以下步骤：在单管中寡核苷酸探针与待测靶标杂交后，通过不同待测靶标对应的核酸酶酶切反应最大速率时的温度不同，进而分析各反应温度下酶切反应速率的变化从而判断反应体系中待测靶标的种类，从而实现多重核酸检测。

其中，反应体系中含有可与待测靶核酸序列特异性杂交的寡核苷酸探针以及可特异性切割与待测靶标杂交的探针的核酸酶，各待测靶标与其对应的寡核苷酸探针杂交的熔解温度各不相同，当体系中存在待测靶标时，核酸酶在设定的寡核苷酸探针熔解温度范围内以最大速率切割探针，通过测定酶切反应最大速率对应的反应温度来判定体系中的待测靶标种类；

反应体系中用的核酸酶需当寡核苷酸探针与待测靶标杂交后才对探针进行切割，其中，所述核酸酶包括核酸内切酶、核酸外切酶或切刻内切酶中的一种。

其中，所述酶切反应速率通过测定酶切时寡核苷酸探针被切断后引发的荧光信号与电信号改变或反应体系颜色变化等方式来进行监测，或利用切割后的探针引发的其他化学反应来监测。

其中，所述酶切反应最大速率时的温度进行多重靶标检测的方法与常规的核酸扩增反应相偶联以实现对低浓度靶标的检测，所述核酸扩增反应为聚合酶链式反应、核酸环介导等温扩增反应、依赖核酸序列的扩增、滚环扩增反应、连接扩增反应、重组酶聚合酶扩增反应中的任意一种。

其中，所述核酸酶为flap核酸内切酶，所述反应为可催化核酸侵入反应，所述反应体系中包含针对靶核酸特异性序列分别设计的一条上游探针和一条下游探针(图1)，两条探针与靶标核酸杂交后，上游探针3’末端须有1个碱基侵入到下游探针与靶标杂交的双链区域(图2)，此时，flap核酸内切酶会识别上下游探针形成的侵入结构，并切割下游探针被侵入的碱基，使下游探针5’端至少有1个碱基被切断并与下游探针分离。

其中，所述核酸侵入反应为指级联核酸侵入反应，该反应中包含针对靶标核酸序列设计的一条上游探针、一条下游探针以及一个与靶标序列无关的发夹探针(图3)，上下游探针与靶标核酸杂交后，上游探针3’末端须有1个碱基侵入到下游探针与靶标杂交的双链区域，下游探针5’端含有一段与靶标核酸序列无关的寡核苷酸片段成为flap片段，该片段与发夹探针3’区域杂交，flap核酸内切酶识别上下游探针与靶标核酸杂交形成的侵入结构，并切割下游探针被侵入的碱基，使下游探针5’端的flap片段与下游探针断开，切割产生的flap片段与发夹探针杂交后其3’末端有1个碱基侵入到发夹探针5’双链区域(图4)，flap核酸内切酶会识别该侵入结构并切割发夹探针5’端，使发夹探针5’端至少有1个碱基被切断并与发夹探针分离。

其中，所述检测方法通过设计不同待测靶标对应不同熔解温度的上下游探针来使反应温度从高向低或从低向高变化时，各靶标对应的上下游探针在一定温度范围内才与靶标杂交形成侵入结构，进而造成各靶标均在一个各自独有的温度范围产生最快的酶切反应速率，根据最大酶切反应速率出现的温度范围可判定反应体系中存在哪种或哪几种待测靶标。

其中，酶切反应速率可通过测定酶切时寡核苷酸探针被切断后引发的荧光信号与电信号改变或反应体系颜色变化等方式来进行监测，或利用切割后的探针引发的其他化学反应来监测，选切割反应发生时荧光信号的变化来进行监测，具体方式为在下游探针或发夹探针的5’末端标记荧光基团，在被上游探针或flap片段3’末端碱基侵入的下游探针或发夹探针上的碱基后1～5个碱基处标记淬灭基团，当flap核酸内切酶切割下游探针或发夹探针后，荧光基团会因切割与淬灭基团分离，产生荧光信号(图5)，通过荧光信号变化来监测酶切速率；通过设计不同待测靶标对应不同熔解温度的上下游探针来使反应温度从高向低或从低向高变化时，各靶标对应的上下游探针在一定温度范围内才与靶标杂交形成侵入结构，进而造成各靶标均在一个各自独有的温度范围产生最快的酶切反应速率，根据最大酶切反应速率出现的温度范围可判定反应体系中存在哪种或哪几种待测靶标(图6)。

其中，所述荧光基团包括目前常用的各种荧光标记物，但不限于这些荧光标记物，如Pacific Blue、Oregon Green、Bodipy FL-X、FAM、TET、Bodipy R6G-X、JOE、HEX、Cy3、Rhodamine Red、TAMRA、Texas Red-X、ROX、Cy3.5或VIC等；所述的淬灭基团包括目前常用的各种淬灭剂，但不限于这些淬灭剂，如Dabcyl、Eclipse、BHQ-1、BHQ-2、QYS-7等。

其中，所述一种荧光基团标记可用于n种靶标特异性不同熔解温度的探针，m种荧光基团可对n×m重靶标的检测，所述n为3～6，m为2～6。

其中，通过最大酶切反应速率时的温度进行多重靶标检测的方法可与常规的核酸扩增反应相偶联以实现对低浓度靶标的检测。核酸扩增反应可为聚合酶链式反应(PCR)、核酸环介导等温扩增反应(LAMP)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增反应(RCA)、连接扩增反应(LCR)、重组酶聚合酶扩增反应(RPA)中的任意一种，优选PCR。

有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明提出的通过分析酶切反应最大速率对应的温度来进行单管内多个核酸靶标检测的方法，实现了一种荧光标记对4种以上的靶标核酸进行检测，克服了常见基于荧光标记探针法进行多靶标检测时受荧光检测通道限制而无法进行单管6种以上靶标检测的瓶颈。本发明优选的核酸侵入反应中的核酸酶识别上下游探针与靶标杂交形成的侵入结构，无序列偏好性，适用于任何序列的靶标检测，方法通用性好，并且方法特异性高，可实现单碱基差异分辨率；发夹荧光标记探针通用，检测成本低。

附图说明

图1为本发明中的带条码序列的下游检测探针示意图；

图2为本发明中的靶标与上下游检测探针形成的核酸侵入反应结构示意图；

图3为本发明中的发夹探针结构示意图；

图4为本发明中flap寡核苷酸片段与发夹探针形成的侵入结构示意图；

图5为本发明中级联核酸侵入反应原理图；

图6为本发明方法中的温度解码靶标原理示意图。；

图7为本发明实施例1检测靶标2和4的实时扩增曲线；

图8为本发明实施例1检测靶标2和4的荧光信号速率图谱；

图9为本发明实施例2检测靶标1、3和4的实时扩增曲线；

图10为本发明实施例2检测靶标1、3和4的荧光信号速率图谱；

图11为本发明实施例3检测不同拷贝数合成靶标的实时扩增曲线和荧光信号速率图谱。

具体实施方式

本发明以人工合成的4种序列不同的核酸片段作为检测靶标进行多重检测检测来对技术介绍。

根据4种待测靶标分别设计特异性PCR扩增引物及核酸侵入反应探针，每种靶标的上游引物可同时充当核酸侵入反应中的上游探针，核酸侵入反应的下游探针中flap编码序列与对应的荧光标记发夹探针杂交时的T_m值存在4℃～6℃温度差异；每种靶标核酸对应的下游探针与靶标互补序列的T_m值需参考flap编码序列与对应的荧光标记发夹探针杂交时的T_m值设计，使不同靶标扩增产物引发的级联核酸侵入反应最适的反应温度(即荧光信号变化速率最大值对应的反应温度T_max)存在4℃～6℃温度差异。

4种靶标及对应的引物和探针序列如下(5’-3’)：

靶标1(SEQ ID NO.1)：

CCGTAGTTGATACCACTCGTAGCACTAATATGACATTATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGGTACATATAAAAATGATAATTTTAAGGAATATGTACGTCATGTTGAAGAATATGACTTACAGTTTGTTTTTCAGCTTTGCAAAATTACACTAACTGCA

靶标1对应的上游引物/上游探针(SEQ ID NO.2)：CCG TAG TTG ATA CCA CTC GTAGCA CTA ATA TGA C

靶标1对应的下游引物(SEQ ID NO.3)：TGC AGT TAG TGT AAT TTT GCA AAG CTGAAA AAC A

靶标1对应的下游探针(SEQ ID NO.4)：CGA CGA CCG AGG CCA TTA TGC ACT GAAGTA ACT AAG GAA GG-PO₃

靶标1对应的报告发夹探针(SEQ ID NO.5)：FAM-TCTT(BHQ1)AGC CGG TTT TCCGGC TAA GAG CCT CGG TCG TCG-C6-NH₂

靶标2(SEQ ID NO.6)：

TGTGGTAGATACCACTCCCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGC

靶标2对应的上游引物/上游探针(SEQ ID NO.7)：TGT GGT AGA TAC CAC TCC CAGTAC CAA TTT AAC

靶标2对应的下游引物(SEQ ID NO.8)：GCA TCA TAT TGC CCA GGT ACA GGA GA

靶标2对应的下游探针(SEQ ID NO.9)：GAC CGA CAG CCA CAA TAT GTG CTT CTACAC AG-PO₃

靶标2对应的报告发夹探针(SEQ ID NO.10)：FAM-TCTT(BHQ1)AGC CGG TTT TCCGGC TAA GAT GGC TGT CGG TC-C6-NH₂

靶标3(SEQ ID NO.11)：

GTTACTGTTGTTGATACTACACGCAGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGG

靶标3对应的上游引物/上游探针(SEQ ID NO.12)：GTT ACT GTT GTT GAT ACTACA CGC AGT ACA AAT ATG TC

靶标3对应的下游引物(SEQ ID NO.13)：CCC CAT GTC GTA GGT ACT CCT TAA AGTTAGT

靶标3对应的下游探针(SEQ ID NO.14)：ACC AGC AAC ACA TTA TGT GCT GCC ATATCT ACT TCA GA

靶标3对应的报告发夹探针(SEQ ID NO.15)：FAM-TCT T(BHQ1)AGC CGG TTT TCCGGC TAA GAT GTT GCT GGT-C6-NH₂

靶标4(SEQ ID NO.16)：

GGGTAATCAATTATTTGTTACTGTAGTAGATACTACTAGAAGTACTAACATGACTATTAGTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATATGATGCACGAAAAATTAATCAGTACCTTAGACATGTGG

靶标4对应的上游引物/上游探针(SEQ ID NO.17)：GGG TAA TCA ATT ATT TGTTAC TGT AGT AGA TAC TAC TAG AAG TAC TAA CAT GAC

靶标4对应的下游引物(SEQ ID NO.18)：CCA CAT GTC TAA GGT ACT GAT TAA TTTTTC GTG CA

靶标4对应的下游探针(SEQ ID NO.19)：GAA CAG ACG ACT ATT AGT ACT GCT ACAGAA CAG TTA AGT AAA TAT GAT

靶标4对应的报告发夹探针(SEQ ID NO.20)：FAM-TCTT(BHQ1)AGC CGG TTT TCCGGC TAA GAT CGT CTG TTC-C6-NH₂

加粗序列为各靶标对应的flap编码序列。

设计靶标1的荧光速率最大值对应的温度与PCR扩增温度接近，68℃～72℃，靶标2、靶标3和靶标4的速率最大值所处温度位于梯度降温阶段，T_max依次为61℃左右、57℃左右和52℃左右。监测反应全程的荧光信号，并绘制实时扩增阶段曲线和梯度降温阶段速率曲线。由于靶标1对应的荧光速率最大值所处温度与扩增阶段的退火延伸温度接近，因此，靶标1理论阳性信号为PCR阶段的S型扩增曲线，靶标2、靶标3和靶标4的荧光信号变化速率最大值所处温度位于梯度降温阶段，因此理论荧光信号变化速率图谱分别在61℃左右、57℃左右和52℃左右有峰值。

实施例1用酶切反应最大速率时的温度差异进行两重核酸靶标(靶标2和4)的检测

配制反应体系：体系组成为10mMTris-HCl(pH 8.5)，0.05％Tween-20，7.5mMMgCl₂，30mM NaCl，0.125μM除靶标3以外各靶标上下游引物(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18)，0.5μM靶标3的上下游引物(SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13)，0.25mM dNTP，0.25μM靶标1的下游探针(SEQ ID NO.4)，1μM靶标2的下游探针(SEQ ID NO.9)，0.25μM靶标3的下游探针(SEQ ID NO.13)，0.25μM靶标4的下游探针(SEQ ID NO.19)，75nM 4种发夹探针(SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.20)，0.25UTaq酶，400U重组flap核酸内切酶1(重组flap核酸内切酶1的表达及活性测定方法的建立，盛楠等，生物工程学报)，测试管中分别加入10000拷贝的靶标2和靶标4合成模板，对照管中以无核酶双蒸水作阴性对照(NTC)。

Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR仪运行程序：94℃2min；94℃15s，72℃40s，读取荧光信号，共60个循环；72℃～35℃，以1℃为梯度降温，每个温度下孵育20s，读取FAM荧光信号。

结果示于图7和图8，实线为合成模板或阴性对照，图中不同颜色的虚线为4种靶标的理论荧光信号曲线。图7表明，测试管中实时扩增阶段无阳性信号，表明待测模板中无靶标1，图8的速率图谱中在61℃和52℃出现两个速率峰值，分别对应为靶标2和靶标4的T_max，此外，阴性对照管(NTC)全程无阳性信号，表明待测模板中有且仅有靶标2和4，反应特异性良好，并且通过观测最大酶切速率时的反应温度可实现同时检测2种靶标。实施例2用酶切反应最大速率时的温度差异进行三重核酸靶标(靶标1、3和4)的检测。

配制反应体系：体系组成为10mM Tris-HCl(pH 8.5)，0.05％Tween-20，7.5mMMgCl₂，30mM NaCl，0.125μM除靶标3以外各靶标上下游引物(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18)，0.5μM靶标3的上下游引物(SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13)，0.25mM dNTP，0.25μM靶标1的下游探针(SEQ ID NO.4)，1μM靶标2的下游探针(SEQ ID NO.9)，0.25μM靶标3的下游探针(SEQ ID NO.13)，0.25μM靶标4的下游探针(SEQ ID NO.19)，75nM 4种发夹探针(SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.20)，0.25U Taq酶，400U 5’flap核酸内切酶1，测试管中加入10000拷贝的靶标1、3和4的合成模板，对照管中以无核酶双蒸水作阴性对照(NTC)。

Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR仪运行程序：94℃ 2min；94℃ 15s，72℃ 40s，读取荧光信号，共60个循环；72℃～35℃，以1℃为梯度降温，每个温度下孵育20s，读取FAM荧光信号。

结果示于图9和图10，实线为合成模板或阴性对照，图中不同颜色的虚线为4种靶标理论荧光信号曲线。图9表明，测试管中实时扩增阶段有阳性信号，表明待测模板中存在核酸靶标1，图10的速率图谱中在56℃存在一个包含57℃和52℃特征峰的融合峰，相应的包含了为靶标3和4的T_max，此外，阴性对照管(NTC)全程无阳性信号，表明待测模板中同时存在靶标1、3和4。

实施例3用酶切反应最大速率时的温度差异方法分别检测不同拷贝数的靶标1、2、3和4。

配制反应体系：体系组成为10mM Tris-HCl(pH 8.5)，0.05％Tween-20，7.5mMMgCl2，30mM NaCl，0.125μM除靶标3以外各靶标上下游引物(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18)，0.5μM靶标3的上下游引物(SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13)，0.25mM dNTP，0.25μM靶标1的下游探针(SEQ ID NO.4)，1μM靶标2的下游探针(SEQ ID NO.9)，0.25μM靶标3的下游探针(SEQ ID NO.13)，0.25μM靶标4的下游探针(SEQ ID NO.19)，75nM 4种发夹探针(SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.20)，0.25U Taq酶，400U 5’flap核酸内切酶1，测试管中分别加入10⁰、10¹、10²、10³和10⁴拷贝的合成靶标1、2、3和4，对照管中以无核酶双蒸水作阴性对照(NTC)。

结果示于图11。靶标1在扩增阶段出现扩增曲线，检测灵敏度可达到10²拷贝/管(8.3aM)；靶标2、3和4分别在预期的61℃、57℃和52℃左右出现最大切割速率峰，灵敏度均可达到10拷贝/管(0.83aM)；表明方法的检测灵敏度在10-100拷贝/管(0.83-8.3aM)，与传统PCR检测方法相当，但本方法利用单色荧光即可在单管内同时检测4种靶标。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一种单管多重核酸检测的方法

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 158

<212> DNA

<213> 靶标1(Artificial Sequence)

<400> 1

ccgtagttga taccactcgt agcactaata tgacattatg cactgaagta actaaggaag 60

gtacatataa aaatgataat tttaaggaat atgtacgtca tgttgaagaa tatgacttac 120

agtttgtttt tcagctttgc aaaattacac taactgca 158

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 靶标1对应的上游引物/上游探针(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgtagttga taccactcgt agcactaata tgac 34

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 靶标1对应的下游引物(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcagttagt gtaattttgc aaagctgaaa aaca 34

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 靶标1对应的下游探针(Artificial Sequence)

<400> 4

cgacgaccga ggccattatg cactgaagta actaaggaag g 41

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 靶标1对应的报告发夹探针(Artificial Sequence)

<400> 5

agccggtttt ccggctaaga gcctcggtcg tcg 33

<210> 6

<211> 78

<212> DNA

<213> 靶标2(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtggtagat accactccca gtaccaattt aacaatatgt gcttctacac agtctcctgt 60

acctgggcaa tatgatgc 78

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 靶标2对应的上游引物/上游探针(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtggtagat accactccca gtaccaattt aac 33

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 靶标2的下游引物(Artificial Sequence)

<400> 8

gcatcatatt gcccaggtac aggaga 26

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 靶标2的下游探针(Artificial Sequence)

<400> 9

gaccgacagc cacaatatgt gcttctacac ag 32

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 靶标2对应的报告发夹探针(Artificial Sequence)

<400> 10

tcttagccgg ttttccggct aagatggctg tcggtc 36

<210> 11

<211> 112

<212> DNA

<213> 靶标3(Artificial Sequence)

<400> 11

gttactgttg ttgatactac acgcagtaca aatatgtcat tatgtgctgc catatctact 60

tcagaaacta catataaaaa tactaacttt aaggagtacc tacgacatgg gg 112

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 靶标3对应的上游引物/上游探针(Artificial Sequence)

<400> 12

gttactgttg ttgatactac acgcagtaca aatatgtc 38

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 靶标3对应的下游引物(Artificial Sequence)

<400> 13

ccccatgtcg taggtactcc ttaaagttag t 31

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 靶标3对应的下游探针(Artificial Sequence)

<400> 14

accagcaaca cattatgtgc tgccatatct acttcaga 38

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 靶标3对应的报告发夹探针(Artificial Sequence)

<400> 15

tcttagccgg ttttccggct aagatgttgc tggt 34

<210> 16

<211> 125

<212> DNA

<213> 靶标4(Artificial Sequence)

<400> 16

gggtaatcaa ttatttgtta ctgtagtaga tactactaga agtactaaca tgactattag 60

tactgctaca gaacagttaa gtaaatatga tgcacgaaaa attaatcagt accttagaca 120

tgtgg 125

<210> 17

<211> 54

<212> DNA

<213> 靶标4对应的上游引物/上游探针(Artificial Sequence)

<400> 17

gggtaatcaa ttatttgtta ctgtagtaga tactactaga agtactaaca tgac 54

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 靶标4对应的下游引物(Artificial Sequence)

<400> 18

ccacatgtct aaggtactga ttaatttttc gtgca 35

<210> 19

<211> 48

<212> DNA

<213> 靶标4对应的下游探针(Artificial Sequence)

<400> 19

gaacagacga ctattagtac tgctacagaa cagttaagta aatatgat 48

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> 靶标4对应的报告发夹探针(Artificial Sequence)

<400> 20

tcttagccgg ttttccggct aagatcgtct gttc 34

Claims

1.一种单管多重核酸检测的方法，其特征在于，所述单管多重核酸检测方法包括以下步骤：在单管中寡核苷酸探针与待测靶标杂交后，通过不同待测靶标对应的核酸酶酶切反应最大速率时的温度不同，进而分析各反应温度下酶切反应速率的变化从而判断反应体系中待测靶标的种类，从而实现多重核酸检测，所述核酸酶为flap核酸内切酶，所述反应为可催化核酸侵入反应，所述反应体系中包含针对靶核酸特异性序列分别设计的一条上游探针和一条下游探针，两条探针与靶标核酸杂交后，上游探针3’末端须有1个碱基侵入到下游探针与靶标杂交的双链区域，此时，flap核酸内切酶会识别上下游探针形成的侵入结构，并切割下游探针被侵入的碱基，使下游探针5’端至少有1个碱基被切断并与下游探针分离；所述flap核酸内切酶的Gen ID: 1483479；所述待测靶标包括靶标1、靶标2、靶标3和靶标4；

所述靶标1对应的上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，靶标1对应的下游引物序列如SEQID NO.3所示，靶标1对应的下游探针序列如SEQ ID NO.4所示，靶标1对应的报告发夹探针序列如SEQ ID NO.5所示；

所述靶标2对应的上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，靶标2对应的下游引物序列如SEQID NO.8所示，靶标2对应的下游探针序列如SEQ ID NO.9所示，靶标2对应的报告发夹探针序列如SEQ ID NO.10所示；

所述靶标3对应的上游引物序列如SEQ ID NO.12所示，靶标3对应的下游引物序列如SEQ ID NO.13所示，靶标3对应的下游探针序列如SEQ ID NO.14所示，靶标3对应的报告发夹探针序列如SEQ ID NO.15所示；

所述靶标4对应的上游引物序列如SEQ ID NO.17所示，靶标4对应的下游引物序列如SEQ ID NO.18所示，靶标4对应的下游探针序列如SEQ ID NO.19所示，靶标4对应的报告发夹探针序列如SEQ ID NO.20所示。

2.根据权利要求1所述的单管多重核酸检测的方法，其特征在于，所述酶切反应速率通过测定酶切时寡核苷酸探针被切断后引发的荧光信号与电信号改变或反应体系颜色变化等方式来进行监测，或利用切割后的探针引发的其他化学反应来监测。

3.根据权利要求1所述的单管多重核酸检测的方法，其特征在于，所述核酸侵入反应为指级联核酸侵入反应，该反应中包含针对靶标核酸序列设计的一条上游探针、一条下游探针以及一个与靶标序列无关的发夹探针，上下游探针与靶标核酸杂交后，上游探针3’末端须有1个碱基侵入到下游探针与靶标杂交的双链区域，下游探针5’端含有一段与靶标核酸序列无关的寡核苷酸片段成为flap片段，该片段与发夹探针3’区域杂交，flap核酸内切酶识别上下游探针与靶标核酸杂交形成的侵入结构，并切割下游探针被侵入的碱基，使下游探针5’端的flap片段与下游探针断开，切割产生的flap片段与发夹探针杂交后其3’末端有1个碱基侵入到发夹探针5’双链区域，flap核酸内切酶会识别该侵入结构并切割发夹探针5’端，使发夹探针5’端至少有1个碱基被切断并与发夹探针分离。

4.根据权利要求3所述的单管多重核酸检测的方法，其特征在于，所述检测方法通过设计不同待测靶标对应不同熔解温度的上下游探针来使反应温度从高向低或从低向高变化时，各靶标对应的上下游探针在一定温度范围内才与靶标杂交形成侵入结构，进而造成各靶标均在一个各自独有的温度范围产生最快的酶切反应速率，根据最大酶切反应速率出现的温度范围可判定反应体系中存在哪种或哪几种待测靶标。

5.根据权利要求2~4任一项所述的单管多重核酸检测的方法，其特征在于，所述酶切反应速率采用切割反应发生时荧光信号的变化来进行监测，在下游探针或发夹探针的5’末端标记荧光基团，在被上游探针或flap片段3’末端碱基侵入的下游探针或发夹探针上的碱基后1~5个碱基处标记淬灭基团，当flap核酸内切酶切割下游探针或发夹探针后，荧光基团会因切割与淬灭基团分离，产生荧光信号，通过荧光信号变化来监测酶切速率。

6.根据权利要求5所述的单管多重核酸检测的方法，其特征在于，所述荧光基团包括Pacific Blue、Oregon Green、Bodipy FL-X、FAM、TET、Bodipy R6G-X、JOE、HEX、Cy3、Rhodamine Red、TAMRA、Texas Red-X、ROX、Cy3.5或VIC中的一种或几种；所述淬灭基团包括Dabcyl、Eclipse、BHQ-1、BHQ-2、QYS-7 中的一种或几种。