FI114399B - Menetelmä ekstensiotuotteiden määrittämiseksi - Google Patents

Description

114395

Menetelmä ekstensiotuotteiden määrittämiseksi

Keksinnön ala 5

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää ja reagensseja ektensiotuotteiden määrittämiseksi reaktioissa, joihin sisältyy nukleiinihapon ketjun pidentäminen, esim. syklisessä minisekvensoinnissa, ja tämän menetelmän käyttöä tunnistettaessa spesifisiä pistemutaatioita ja geneettisiä vaihteluja.

10

Keksinnön tausta

Pistemutaatiot, yhden nukleotidin muutokset geenissä, ovat ihmisen perinnöllisten tautien tärkein syy. Diagnostisiin tarkoituksiin on ollut tarjolla monia tekniikoita 15 tunnettujen pistemutaatioiden havaitsemiseksi. Nämä menetelmät voidaan luokitella perustuviksi joko erilaiseen hybridisaatiokinetiikkaan täysin ja osittain komplementaaristen DNA-juosteiden välillä tai entsyymiavusteiseen pistemutaation havaitsemiseen (Landegren, et ai., 1998).

: ·' · 20 Radioaktiivisesti leimatuilla oligonukleotidikoettimilla suoritettu klassinen ASO

' ' ' (alleelispesifmen oligonukleotidihybridisaatio) (Wallace, et ai., 1979), joka on vuosien varrella kehittynyt kineettiseksi homogeeniseksi määritysjärjestelmäksi (Whitcombe, et ai., 1998; Wittwer, et ai., 1997a; Wittwer, et ai., 1997b), osoittaa . . tämän alan nopeat edistysaskeleet. Satojen tai tuhansien mutaatioiden tutkiminen tuli 25 mahdolliseksi kun osoitettiin, että suuritiheyksisiä DNA-rivejä voidaan syntetisoida suoraan lasipinnalle (Fodor, et ai., 1991; Lipshutz, et ai., 1999). Myös tämä nopeasti kasvava DNA-mikroarraytekniikka perustuu erilaiseen hybridisaatioon täysin ja , ·. · osittain komplementaaristen DNA-juosteiden välillä.

30 Entsyymiavusteiset menetelmät perustuvat tavallisesti joko DNA-polymeraasin tai ! DNA-ligaasin (Barany, 1991; Landegren, et ai., 1988; Wallace, et ai., 1979) - . entsyymiaktiivisuuksiin. Alkuperäinen yhdelle näytteelle tehtävä • · pistemutaatiomääritys (Syvänen, et ai., 1990) (Ihalainen, et ai, 1994) on kehittynyt ’ · · ·' riviformaatissa suoritettavaksi moninkertaiseksi määritykseksi (Kurg, et ai., 2000; 2 114399

Pastinen, et ai., 1997; Pastinen, et ai., 1996; Pastinen, et ai., 2000; Shumaker, et ai., 1996) ja sitä voidaan käyttää pistemutaatioiden tai yhden nukleotidin polymorfismien (SNP:t) havaitsemiseen. Kaikissa näissä järjestelmissä havaittavissa oleva reaktiotuote muodostuu vain jos testinäyte on määritysympäristössä täysin 5 komplementaarinen kohdesekvenssin suhteen (Syvänen, 1999). DNA-polymeraasiin perustuvien määritysten tapauksessa reaktiotuote muodostuu vain jos templaatti-DNAissa olevalle sekvenssille komplementaarinen nukleosiditrifosfaatti on tarjolla reaktioseoksessa.

10 Nykyään on olemassa monia hyvin karakterisoituj a työkaluj a tunnettuj en pistemutaatioiden havaitsemiseksi, mutta yksittäisen testin hinta on suhteellisen korkea. Tästä on tullut suuri huolenaihe geneettisen tutkimuksen uusimpien vaiheiden aikana, koska on käymässä ilmeiseksi, että erot yksilöiden välillä aiheutuvat pienistä eroista, kuten SNP:istä, joita sijaitsee satunnaisesti 1 - 2 kb:n 15 välein genomissamme (Sachidanandam, et ai., 2001). Jo ainakin 1,4x106 SNP:tä on saatavilla julkisissa tietokannoissa (Sachidanandam, et ai., 2001), ja lukumäärä tulee kasvamaan ajan mittaan, ja SNP:istä on tulossa tehokas geneettisen ja biolääketieteellisen tutkimuksen työkalu. Nämä erot ovat hyvin hyödyllisiä myös . . tautia aiheuttavien tai niille altistavien geenien tunnistamisessa ja ' . 20 hienokartoituksessa. Etenkin multifaktoriaalisia tauteja tutkitaan tätä nykyä SNP- genotyypitystä käyttäen. Eräs SNP:n genotyypityksen käyttämisen pääongelmista on, että SNP ei ole yksin tarpeeksi informatiivinen, ja esim. tautiin liittyvien alleelien tunnistamiseksi tehokkaasti tarvitaan useiden SNPriden saqa, joka sijaitsee kapealla alueella kromosomia (SNP-haplotyyppi), mikä johtaa siihen, että on tutkittava 25 useampia SNP-markkereita kuin perinteisiä markkereita (Dawson, 1999; Isaksson, et ah, 2000; Martin, et ai., 2000) ja hyvin monimutkaisia algoritmeja on kehitettävä (Morris, et ai., 2000) ennen kuin luotettavia tuloksia voidaan saada.

: ” ‘ Tavallisimmin käytettyjä menetelmiä näiden yhden nukleotidin erojen löytämiseksi , · * 30 on ollut geenin polymorfisen alueen suora DNA-sekvensointi, useimmiten .,.. · kohdekudoksesta eristetyn genomisen DNA:n tai mRNA:n polymeraasiketjureaktiolla (PCR) monistamisen jälkeen. Kuitenkin, johtuen * ‘ suurimittakaavaisten ihmisen sekvensointiprojektien aikana kerättyjen käsittelemättömien sekvensointitietojen valtavien määrien saatavuudesta, suuri määrä 3 114399 SNP:itä on tunnistettu in silico vertaamalla saatavilla olevia monista henkilöistä saatuja sekvenssejä.

Eräs suurimmista vaikeuksista riittävien SNP-tulosmäärien saamisessa on niiden 5 havaitsemiseen nykyään käytettävien menetelmien monimutkaisuus sekä niiden korkea hinta. Eräs suurimmista SNP-genotyyppausmenetelmän kustannuksista on määrityksissä käytettävien oligonukleotidialukkeiden modifioiminen. Oligonukleotidialukkeiden leimaaminen tai muut modifikaatiot, tavallisesti kytkeminen ankkuroivaan tai fluoresoivaan detektointiyksikköön, yhdessä näiden 10 kytkentäreaktioiden jälkeisten pakollisten puhdistusvaiheiden kanssa lisäävät yksittäisen oligonukleotidin hintaa. Jos yhteen projektiin tarvitaan satoja modifioituja oligonukleotideja, tulee tästä ajan myötä suuri kustannus. Houkuttelevimmalla mahdollisuudella, DNA-rivitekniikan käytöllä, on hyvin korkea ennakkohinta ja kun rivi on painettu, ei mitään muutoksia määrityksen formaattiin ja SNP-valikoimaan 15 voida tehdä painamatta liuskoja uudelleen.

Tästä syystä kehitettiin keksinnön mukainen halpa, selkeä ja yksinkertainen menetelmä ekstensiotuotteiden, siis pidennettyjen oligonukleotidialukkeiden, läsnäolon määrittämiseksi reaktioissa, joihin sisältyy nukleiinihappoketjun 20 pidentäminen. Keksintö koskee myös tehokasta tapaa esim. SNPriden havaitsemiseksi käytettävän syklisen minisekvensoinnin tulosten määrittämiseksi.

, Tässä kuvatun uuden menetelmän tärkein etu on se, että kun SNP analysoidaan, ,. tarvitaan vain kolme halpaa modifioimatonta perusaluketta, kaksi PCR-monistusta • varten potilaan genomisen DNA:n kiinnostavan alueen monistamiseksi, ja toinen 25 syklistä minisekvensointia (cMS) varten edeltävästä PCR-monistuksesta peräisin olevassa templaattinukleiinihapossa olevan spesifisen aseman (SNP) tutkimiseksi.

Jos SNP:n detektio suoritetaan molemmissa juosteissa, vain yksi modifioimaton ; ‘ . aluke tarvitaan lisänä. Keksinnön mukainen menetelmä on joustava ja sallii SNP:iden : ' ’ tutkimisen missä tahansa järjestyksessä ja SNP:itä voidaan haluttaessa lisätä , ·, 30 kokonaiskaavioon tai poistaa siitä. Tämä on tärkeätä kiinnostavaa aluetta ... * hienokartoitettaessa. Vain vähäisiä optimointeja tai modifikaatioita tarvitaan erilaisia ’.' SNP:itä testattaessa. Detektio perustuu fluoresenssidetektioon ja voidaan tehdä I · tavallisella levyfluorometrillä ja se mukautuu nesteenkäsittelyvaiheiden täydelliseen automaatioon.

4 114395

Keksinnön mukainen menetelmä liittyy myös menetelmään, joka hyödyntää fluoresenssin resonanssienergiansiirtoa (FRET), mikä tarkoittaa etäisyydestä riippuvaista vuorovaikutusta kahden väriainemolekyylin elektronisesti viritettyjen 5 tilojen välillä, joissa viritysenergia siirtyy luovuttajamolekyyliltä vastaanottajamolekyylille ilman fotonin lähettämistä. Primääriset olosuhteet FRETiiä varten ovat (i) luovuttaja- (lähde) ja vastaanottaja- (kohde) molekyylien on oltava hyvin lähellä toisiaan (tyypillisesti 10-100 Ä), (ii) vastaanottajan absorptiospektrin täytyy olla päällekkäinen luovuttajan fluoresenssiemissiospektrin kanssa. Tällaisilla 10 energiansiirtokytketyillä väriaineilla leimattuja koettimia kuvataan esim. US-patentissa nro 6,028,190.

Fluoresenssi on osoittautunut monikäyttöiseksi työkaluksi lukemattomille sovellutuksille. Se on tehokas tekniikka molekulaaristen vuorovaikutusten 15 tutkimiseen analyyttisessä kemiassa, biokemiassa, solubiologiassa, fysiologiassa, nefrologiassa, kardiologiassa, fotokemiassa, ja ympäristötieteessä. Se tarjoaa ilmiömäisen herkkyyden nanomolaaristen pitoisuuksien kanssa työskentelevälle analyyttiselle kemistille tai biologisen tieteen tutkijalle. Fluoresenssi tarjoaa , kuitenkin enemmän kuin pelkkää signaalinkeruukykyä. Uudet edistysaskeleet 20 laitteiston, ohjelmiston, koettimien ja sovellutusten osalta ovat johtaneet suosion räjähdysmäiseen kasvuun tekniikalle, joka havaittiin ensimmäisen kerran yli 150 vuotta sitten.

Fluoresenssin teoreettisten perusteiden tultua paremmin ymmärretyiksi syntyi 25 tehokkaampi sovellutusten sarja, joka tuottaa yksityiskohtaista tietoa monimutkaisista molekyyleistä ja niiden reaktioreiteistä. Biokemiallisten lajien sitoutumista voidaan helposti tutkia in situ. Etäisyyksiä makromolekyylien sisällä >' · voidaan mitata. Proteiinien laskostumisen dynamiikkaa voidaan tutkia. Ionien ; " 1 pitoisuuksia elävien solujen sisällä voidaan mitata. Kalvon rakennetta ja toimintaa * · ’ ' 30 voidaan tutkia fluoresoivilla koettimilla. Lääkkeiden vuorovaikutuksia • · solureseptorien kanssa voidaan tutkia. Pienen pieniä määriä fluoresoivia materiaaleja • (· voidaan havaita ja tunnistaa seoksissa. Öljynäytteistä voidaan tehdä I » '; sormenjälkikartoitus ja tunnistaa niitä fluoresenssinsa perusteella. Molekyylin < · » 5 114395 virittyneen tilan elektronista rakennetta ja dynamiikkaa voidaan tulkita. Nämä ovat vain muutamia esimerkkejä nykyaikaisten fluoresenssitekniikoiden sovellutuksista.

Fluoresenssi on ilmiö, jossa tietyn aallonpituuden omaavan valon absorptiota seuraa 5 pidemmillä aallonpituuksilla tapahtuva valon emissio. Fluoresenssin aiheuttava aallonpituudesta riippuvaisen intensiteetin jakautuminen tunnetaan eksitaatiospektrinä, ja emittoidun energian aallonpituudesta riippuvaisen intensiteetin jakautuminen tunnetaan fluresenssiemissiospektrinä. Fluoresenssidetektiolla on kolme tärkeää etua valoon perustuviin tutkimusmenetelmiin verrattuna: suuri 10 herkkyys, suuri nopeus, ja turvallisuus. Turvallisuuden kohta tarkoittaa sitä tosiasiaa, että näytteisiin ei vaikuteta eivätkä ne tuhoudu prosessissa, eikä mitään vaarallisia sivutuotteita synny. Herkkyys on tärkeä kysymys, koska fluoresenssisignaali on verrannollinen tutkittavan aineen pitoisuuteen. Suhteellisen pienillä ionipitoisuuksien muutoksilla elävissä soluissa voi olla merkittäviä fysiologisia vaikutuksia. Siinä 15 missä absorbanssimittaukset voivat luotettavasti määrittää vain kymmenesosamikromolaarisen suuruisia pitoisuuksia, voivat fluoresenssitekniikat mitata tarkasti miljoona kertaa pienempiä pitoisuuksia, piko-ja jopa femtomolaarisia.

Alle attomoolin (<10~18 moolia) määriä voidaan havaita.

' 20 Käyttämällä fluoresenssia voidaan seurata hyvin nopeita pitoisuuden muutoksia.

. Pikosekunnin luokkaa olevia muutoksia fluoresenssin voimakkuudessa voidaan tarvittaessa havaita. Ei-invasiivisena tekniikkana fluoresenssi ei häiritse näytettä.

; Fluoresenssisignaalin synnyttämiseen vaadittavat eksitaatiovalon tasot ovat matalia, vähentäen fotovalkaisun vaikutuksia. Eläviä kudoksia voidaan näin ollen tutkia ilman 25 mitään haittavaikutuksia sen luonnolliselle fysiologiselle käyttäytymiselle.

Vertikaalisen fotometrian tekniikkaa käytetään tavallisesti mikrolevylaitteiden •'. ’ kanssa. Ei ainoastaan siksi, että se mahdollistaa matriisityyppisen levyn mittaamisen : ’' ‘ vaan koska se tarjoaa myös eräitä kiinnostavia etuja. Vertikaalisen fotometrian . ·, ’ 30 tärkein piirre on se, että absorbanssi ei ole näytteen pitoisuuden funktio, vaan on ainoastaan riippuvainen kyvetissä olevan absorboivan aineen määrästä. Siksi haihtumisen tai kerrostumisen vaikutus käytännössä poistuu. Sama tekniikka on nykyään tavallisesti käytössä mikrolevyfluorometreissä samoin eduin.

6 114399

Jos fluoresoivien molekyylien liike näytteessä on siinä määrin rajoitettua, että emissiosta vastaavan sähköisen dipolioskillaattorin orientaatio on sama tai kiinteässä suhteessa eksitoidun fotonin absorptiosta vastaavaan sähköiseen dipolioskillaattoriin, polarisoituu emissiovalo vaikka eksitaatiovalo on polarisoitumatonta. Jos 5 detektiojärjestelmän herkkyys on riippuvainen emission polarisaatiotilasta, voi fluoresenssin voimakkuuden mittaamisessa esiintyä virheitä.

Toisaalta anisotropian aikariippuvuus saattaa tarjota tärkeätä informaatiota virittyneiden tilojen tutkimiselle. Steady-state-fluoresenssianisotropiasta voidaan 10 saada elektronisten siirtymien ja fluoroforin mikroympäristön yksityiskohtia.

Anisotropia- (tai polarisaatio-) -mittaukset tuottavat tietoa fluoresenssin kestoaikana tapahtuvista molekulaarisista liikkeistä. Siten ei ole yllättävää, että fluoresenssianisotropian aikariippuvaisen vaimenemisen mittaaminen on vieläkin informatiivisempaa makromolekyylien rotaatio-ja diffuusioliikkeiden osalta.

15

Vertikaalisesti mittaavien fluorometrien rakenne kuvataan viitteissä Suovaniemi (1994), Tiusanen (1992) ja Harjunmaa (1986).

i » i · * 1 ·

» I

* ♦ 114395

Keksinnön yhteenveto

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää pidennetyn oligonukleotidialukkeen läsnäolon määrittämiseksi alukkeenpidennysreaktioseoksessa geneettisen vaihtelun 5 tai polymorfismin havaitsemiseksi nukleiinihapponäytteessä, joka menetelmä sisältää seuraavat vaiheet: a) kiinnostuksen kohteena olevalle polymorfismille spesifisen modifioimattoman minisekvensointialukkeen templaatista riippuvainen pidentäminen leimatulla 10 deoksinukleosidi(5')trifosfaatilla (dNTP) olosuhteissa, jotka ovat alukkeen pidennykselle soveltuvat; b) vaiheesta (a) peräisin olevan reaktioseoksen käsittely yksijuosteisten ekstensiotuotteiden saamiseksi, tai jos ekstensiotuotteet ovat jo yksijuosteisia, 15 käytetään suoraan vaihetta c) tai d); c) valinnaisesti pidennetyn oligonukleotidialukkeen erottaminen reaktioseoksesta; d) mainitun pidennetyn oligonukleotidialukkeen saattaminen kosketuksiin 20 fluoresoivan reagenssin kanssa mainittuun pidennettyyn oligonukleotidialukkeeseen sitoutumista varten; ja : e) mainitun geneettisen vaihtelun tai polymorfismin läsnäolon määrittäminen : mittaamalla fluoresenssin emission voimakkuus eksitaation jälkeen.

25

Edullisesti menetelmässä käytetyn leimatun dNTP:n leima on fluoresoiva detektio-osa, joka voi olla fluoresoiva väriaine, tai erotusosa, joka voi olla esimerkiksi * | · biotiini.

’ ·. 30 Edullisesti menetelmän vaiheessa d) reaktioseoksessa olevat yksijuosteiset , · ·. ekstensiotuotteet saatetaan kosketuksiin pidennetyn oligonukleotidialukkeen 3'- päähän sitoutuvan fluoresoivan reagenssin kanssa energiansiirtymissuhteen ;,; muodostamiseksi mainitun fluoresoivan detektio-osan ja mainitun fluoresoivan reagenssin välille fluoresenssin resonanssienergian siirtymisen (FRET) 114399 aikaansaamiseksi mainitun fluoresoivan detektio-osan ja mainitun fluoresoivan reagenssin välille. Tämä energiansiirtymissuhde perustuu siis energian siirtymiseen ns. donorifluoroforin ja akseptorifluoroforin välillä.

5 Edullisesti mainitun pidennetyn oligonukleotidialukkeen läsnäolo määritetään menetelmän vaiheessa e) mittaamalla useammalla kuin yhdellä aallonpituudella mainitun fluoresoivan detektio-osan ja mainitun fluoresoivan reagenssin emissiospektrejä.

10 Edullisesti menetelmän vaiheessa a) vain yksi nukleotidi liitetään mainitun modifioimattoman oligonukleotidialukkeen 3'-päähän. Keksintö koskee siis erityisesti esim. syklistä minisekvensointia.

Edullisesti menetelmässä käytettävä fluoresoiva reagenssi on yksijuosteista DNA:ta 15 sitova fluoresoiva väriaine.

Keksinnön mukaisessa eräässä suoritusmuodossa pidennetty oligonukleotidialuke immobilisoidaan menetelmän vaihtoehtoisessa vaiheessa c) kiinteälle tukialustalle, joka on päällystetty mainitulle erotusosalle spesifisellä reseptorilla. Jos biotiinia 20 käytetään mainittuna erotusosana, niin mainittu pidennetty oligonukleotidialuke immobilisoidaan vaiheessa c) kiinteälle tukialustalle, joka on päällystetty streptavidiinilla tai avidiinilla.

Esillä oleva keksintö koskee myös vertikaalista valonsädettä käyttävää fluorometriaa.

9 114399

Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuvio 1 esittää cMS-alukkeisiin sitoutuneen ssDNA-spesifisen fluoresoivan reagenssin (OliGreen®) emissioiden suhdetta aallonpituuksilla 635 nm ja 535 nm, 5 kun käytettiin cMS-alukkeen eri pitoisuuksia.

Kuvio 2 esittää kaavamaista piirrosta, joka kuvaa esimerkin 1 vaiheet, rxn, reaktio; w/, kanssa; w/o, ilman; F-dNTP, dNTP fluoresenssileimalla mutantti- (mut) tai villityyppiselle (WT) alleelille.

10

Kuvio 3 esittää tuloksia, kun potilasnäytteitä seulottiin esimerkin 1 mukaisella menetelmällä testi-SNP:n, faktori V Leiden -mutaation, Arg506Gln suhteen.

Kontrollinäytteet normaalille genotyypille, homo-ja heterotsygoottisille mutanttigenotyypeille sekä nollanäytteille (H20) esitetään.

15

Kuvio 4 esittää tuloksia, kun potilasnäytteitä seulottiin esimerkin 2 mukaisella menetelmällä testi-SNP:n, faktori V Leiden -mutaation, Arg506Gln suhteen.

Kontrollinäytteet normaalille genotyypille, homo-ja heterotsygoottisille , . mutanttigenotyypeille sekä nollanäytteille (H20) esitetään.

’::. 20

Kuvio 5 esittää fluoresenssimittauksen geometrioita näyteastian ollessa esim. mikrolevykyvetti. Paksu musta nuoli esittää eksitaatiosignaalin suunnan. Ohuet harmaat nuolet osoittavat emissiosignaalien suunnan. Neljä eri konfiguraatiota • esitetään (a, b, c ja d) 25

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus . ( Seuraavassa kuvataan menetelmä ekstensiotuotteiden määrittämiseksi reaktioissa, ;'" joihin sisältyy nukleiinihappoketjun pidentäminen ja sen käyttäminen SNP:n ’ ‘ 30 havaitsemismenetelmässä. 1 · Keksinnön mukaisen SNP-seulontamenetelmän ensimmäinen vaihe on potilaan ; DNA- tai RNA-näytteen tavanomainen PCR-monistus tai vastaavasti RT-PCR- monistus, mutaatiolokusta varten spesifistä alukeparia käyttäen. Sitten PCR- '· 114399 alukkeet ja dNTP:t hajotetaan Exo I - SAP -käsittelyllä, kuten suurimmassa osassa nykyisiä detektiojäijestelmiä. Tietenkin on olemassa vaihtoehtoisia menetelmiä alukkeiden ja dNTP:den poistamiseksi loppuun saatetusta polymeraasireaktiosta, esim. erilaisia suodatusmenetelmiä. Seuraava vaihe on modifioimattoman syklisen 5 minisekvensointi- (cMS) -alukkeen pidentäminen templaatista riippuvaisella tavalla käyttämällä fluoresoivalla väriaineella, kuten Texas Red, leimattua dNTP:tä syklisessä alukkeen pidennysreaktiossa. Detektioalukkeen syklisestä leimaamisesta johtuen leimaustehokkuus on suurempi kuin tavanomaisessa kiinteän faasin minisekvensoinnissa, mikä johtaa suureen signaali-kohinasuhteeseen. Syklisen 10 minisekvensoinnin vaiheessa edeltävästä PCR-vaiheesta johdettu templaattinukleiinihappo saatetaan alttiiksi rinnakkaisille alukkeenpidennysreaktioille, joilla on sama spesifinen cMS-aluke, mutta kukin reaktio sisältää vain yhdentyyppisen leimatun dNTP:n. Kullekin reaktiolle valitut dNTPriden tyypit, esim. dATP, dCTP, dGTP tai dTTP, ovat riippuvaisia tutkittavan 15 nukleotidiaseman variaatiosta. Aluke hybridisoituu templaattiin siten, että alukkeen 3’-pää sitoutuu nukleotidiin, joka on välittömästi tutkittavan nukelotidiaseman vieressä. Kiinteän faasin minisekvensointimenetelmä kuvataan yksityiskohtaisesti US-patentissa nro 6,013,431, ja syklisen alukkeenpidennysreaktion etuja spesifisiä , DNA-sekvenssien seulonnassa käsitellään US-patentissa nro 5,710,028.

20

Koska käytetään jotain dNTP:tä, voidaan cMS-vaiheessa käyttää halpoja tavallisia termostabiileja DNA-polymeraasientsyymejä. Pidennetty ja näin ollen esimerkiksi Texas Red'llä leimattu aluke detektoidaan sitten fluoresenssin resonanssienergiasiirtoon (FRET) perustuvalla järjestelmällä sen jälkeen, kun 25 loppuun saatettuihin cMS-reaktioihin on lisätty oligonukleotidille tai yksijuosteiselle DNAlle (ssDNA) spesifinen fluoresoiva väriaine (kuten OliGreen®, Molecular Probes). Johtuen pidennettyyn alukkeeseen sitoutuneiden kahden väriaineen välisestä ;' 1, lyhyestä etäisyydestä oligonukleotidille tai yksijuosteiselle DNAlle (ssDNA) : " ‘ spesifisestä cMS-alukkeeseen tasaisesti jakautuneesta fluoresoivasta väriaineesta t » ’ 30 tuleva fluoresenssienergia siirtyy sen nukleotidin fluoresenssileimaan, joka liitettiin < · alukkeen 3’-päähän alukkeen pidennysreaktion aikana. Tämä fluoresenssileima 1, 1 toimii fluoresoivana detektio-osana keksinnön mukaisessa menetelmässä. Jos !! käytettävä fluoresoiva detektio-osa on Texas Red -väriaine, on fluoresenssin voimakkuuden määrä suoraan verrannollinen liittyneen Texas Red -leimatun π 114399 nukleotidin määrään. Tätä kontrolloi DNA-polymeraasin tiukka hyväksyttävän nukleotidin valinta templaatti-DNA-sekvenssin eli siis alkuperäisen templaatti-DNA -sekvenssin perusteella.

5 Kuvattu keksinnön mukainen menetelmä erotteli genotyypit erinomaisesti.

Alukkeenpidennysreaktioita valmistettaessa on kuitenkin aina pieniä teknisiä eroja pipetointitilavuuksissa, ja tämä voi aiheuttaa teknistä vaihtelua. Tämän vaihtelun häiritsevä vaikutus voidaan välttää käyttämällä seuraavaa strategiaa esillä olevan keksinnön mukaisia tuloksia mitattaessa. Menetelmän herkkyys kasvaa, kun vain 10 fluoresoivan detektio-osan emissiosignaalin mittaamisen asemesta mitataan emissiosignaalit sekä fluoresoivasta detektio-osasta että yksijuosteiselle DNA:lle spesifisestä fluoresoivasta väriaineesta, ja tulosten määrittämiseksi lasketaan sitten niiden välinen suhde. Mittaus useammalla kuin kahdella aallonpituudella kahden väriaineen emissiospektreistä on myös hyödyllistä laskettaessa energian siirtymisen 15 määrää. Fluoresenssin voimakkuuden tulokset voidaan saada eksitoimalla näytettä näyteastiassa peittämättömän nestepinnan sivun läpi tai näyteastian pohjasivun läpi ja mittaamalla emittoitunut säteily eksitaatiopuolelta. Vaihtoehtoisesti fluoresenssin voimakkuuden tulokset saadaan mittaamalla emittoitunut säteily eksitaatiosivun vastakkaiselta puolelta. Näyteastia voi olla esimerkiksi mikrolevykyvetti tai kiinteä ': ‘. 20 tukialusta. Fluoresenssin mittauksen geometriat esitetään kuviossa 5. Isotrooppisesti : emittoitunut fluoresenssivalo voidaan periaatteessa mitata lähes missä tahansa ; · · I kulmassa eksitaatiosignaalin suunnan suhteen. Eksitaatio signaalin kulma näyteastian • : tai näytepinnan suhteen voi lisäksi vaihdella.

25 Esimerkin 1 tapauksessa OliGreen® oli yksijuosteiselle DNAille spesifinen fluoresoiva väriaine ja Texas Red -väriainetta käytettiin fluoresoivana detektio-osana, ja ne toimivat donorifluoroforinaja vastaavasti vastaanottajafluoroforina.

' · ’ OliGreen® -väriaineella on absorptiomaksimi noin 498 imussa ja emissiomaksimi noin 518 nm:ssa, ja Texas Red -väriaineella on absorptiomaksimi noin 596 imussa ja :‘ . 30 emissiomaksimi noin 620:ssa. Siten Texas Red -emission ja OliGreen® -emission : ‘ voimakkuuksien välisen suhteen määrittämiseksi signaalit mitattiin vastaavasti • · aallonpituuksilla 635 nm ja 535 nm. Kaikki muutokset suhteessa 635/535 nm : : johtuivat FRET'stä Texas Red -leimaan OliGreen® -väriaineesta, koska 114399 ekstensiotuotteiden ja Texas Red -leiman puuttuessa OliGreen® -emissiovoimakkuuksien suhde näillä aallonpituuksilla pysyi vakiona, kun eri määriä oligonukleotideja oli läsnä reaktiossa (kuvio 1).

5 Eräs keksinnön mukaisen menetelmän etu on, että laadunvalvonta on helpompaa kuin tavanomaisissa menetelmissä, koska voidaan syntetisoida templaattijuostetta jäljittelevä modifioimaton perusoligonukleotidi ja liittää kiinnostava polymorfismi oligon synteesin aikana, ja käyttää sitten tätä oligoa templaattina monistetun potilas-DNA:n sijasta. Näin ollen antamalla käyttöön yksi ainoa oligonukleotidi voidaan 10 välttää eräs SNP-genotyyppauksen tavallisista ongelmista, heterotsygoottisen kontrolli-DNA:n käyttäminen määrityksen toimintakyvyn testaamiseksi.

Chen ja Kwock esittivät FRET'n käyttämisen periaatteen pistemutaation detektoimisessa ja SNP-genotyyppauksessa jo muutamia vuosia sitten. Sekä DNA-15 ligaasia (Chen, et ai., 1998) että DNA-polymeraasia (Chen and Kwok, 1997; Chen, et ai., 1997) on käytetty näissä homogeenisissä määrityksissä. Esillä olevan työn avainhavainto on kuitenkin se, että epäspesifistä ssDNA-väriainetta voidaan käyttää yhtenä fluoroforeista FRET-määrityksessä. Tällä on kaksi tärkeätä etua. Ensiksikin, koska vain halpoja modifioimattomia oligonukleotideja käytetään määrityksessä, ':' 20 alenee yhden SNP:n analyysin hinta dramaattisesti. Toiseksi, toisin kuin : · ·: tavanomaisissa järjestelmissä, joissa yksi fluoresoiva molekyyli liitetään detektio- ; · · oligonukleotidin 5 ’-päähän, tässä määrityksessä fluoresoiva väriaine jaetaan edullisesti pitkin oligonukleotidin runkoa. Näin ollen saatavilla on monia lähdefluorokromeja ja kriittinen tekijä FRET-määrityksessä, optimaalinen etäisyys 25 lähde- ja kohdefluorokromien välillä, saadaan aikaan.

Fluoresenssipolarisaatiota (FP) voidaan myös käyttää SNP-detektioon (Chen, et ai., 1999; Gibson, et ai., 1997), ja tämäkään menetelmä ei vaadi mitään modifioituja oligonukleotideja ja määrityksen formaatti on hyvin samankaltainen kuin keksinnön 30 mukainen menetelmä. Tässä määrityksessä väriaineella leimatun ddNTP-: * ·. terminaattorin FP muuttuu detektioalukkeeseen sitoutumisen johdosta. Tärkeimmät .: erot FP:n ja FRET:n välillä ovat, että on käytettävä spesifistä FP-mittaukseen ' · ‘. kykenevää fluorometriä, ja että PCR- ja Exo-SAP -vaiheiden optimointi on tehtävä paljon huolellisemmin dNTP:iden poistamiseksi täydellisesti PCR:stä. Syy tähän on '3 114399 se, että fluoresenssileimatun väriaineen määrän on oltava pieni, että kyettäisiin havaitsemaan muutos FP:ssa ja sittenkin muutos FP-signaalissa on suhteellisen pieni, mikä tekee määrityksen alttiiksi teknisille virheille. Keksinnön mukaisessa menetelmässä signaali-kohinasuhde on suuri, sallien luotettavamman 5 genotyypityksen.

Tämä keksintö koskee myös menetelmää, jossa keksinnön mukaisen SNP-seulontaprosessin ensimmäinen vaihe on mutanttilokuksen tavallinen PCR-monistus käyttäen spesifistä alukeparia ja alukkeet ja dNTP.t hajotetaan Exo I - SAP 10 -käsittelyssä, kuten edellä esitettiin. Tämä voidaan tehdä myös esim. erilaisilla suodatusmenetelmillä. Seuraava vaihe on kuitenkin modifioimattoman cMS-alukkeen templaattiriippuvainen pidentäminen biotinyloidulla dNTP:llä syklisessä alukkeenpidennysreaktiossa, kuten minisekvensointireaktiossa. Sitten pidennettyjä siten biotinyloitunut aluke erotetaan, esim. pyydystämällä aluke kiinteälle alustalle, 15 kuten 384-kuoppaisen mikrotiitterilevyn pohjaan, jossa on Neutravidin- (Pierce) tai streptavidiinipäällystys, jolla on korkea affiniteetti biotiinimolekyyleille. Siten biotiinia voidaan käyttää erotusosana esillä olevassa menetelmässä.

Sitoutumattomien alukkeiden pois pesemisen jälkeen mitataan sitoutuneen alukkeen ‘ määrä, yksinkertaisesti lisäämällä jokin yksijuosteiselle DNA:lle (ssDNA) spesifinen 20 fluoresenssiväriaine. Fluoresenssin voimakkuuden määrä reaktiossa on suoraan verrannollinen liittyneen biotinyloidun nukleotidin määrään, jota kontrolloi DNA-polymeraasin tiukka hyväksyttävän nukleotidin valinta templaatti-DNA-sekvenssin ja siten alkuperäisen templaatti-DNA-sekvenssin perusteella,.

25 Esillä olevaa keksintöä kuvataan seuraavin esimerkein, joiden ei tarkoiteta rajoittavan keksinnön piiriä.

Esimerkki 1 30 SNP-genotyyppi määritettiin sykliminisekvensointi- (cMS) -tekniikalla, joka on ·. modifioitu alkuperäisestä kiinteän faasin minisekvensoinnista (US-patentti nro 6,013,431). Esimerkin 1 vaiheet kuvaava kaavamainen piirros esitetään kuviossa 2. Templaattina käytettävää DNA:ta uutettiin pakastetuista EDTA-verinäytteistä tavanomaisia menetelmiä käyttäen. Alukkeet PCR-monistusta varten reunustivat 14 114399 polymorfista SNP-kohtaa, tässä tapauksessa Factor V Leiden -mutaatiota (Arg506Gln, vastaten nukleotidimuutosta G:stä A:ksi genomin koodaavassa DNA-juosteessa) antaen vastustuskyvyn proteiini C:lle ja kohonneen tromboosiriskin potilaassa. Alukkeiden sekvenssit olivat 5'-TCT CTT GAA GGA AAT GCC CCA-3' 5 ja 5'-GGG CTA ATA GGA CTA CTT CTA-3’. Viisi μΐ templaatti-DNAta (5 ng/μΐ) lisättiin 40 pl:aan PCR Mastermix'iä, joka oli ennalta jaettu 96-kuoppaisiin PCR-levyihin. PCR-monistus suoritettiin DNA-polymeraasin reaktiopuskurissa, jota oli täydennetty 25 pM:lla PCR-alukkeita, 200 pM:lla dNTP:ta, ja 0,5 yksiköllä termostabiilia DNA-polymeraasia. Monistus suoritettiin käyttäen 64 °C => 58 °C 10 Touch down PCR -ohjelmaa MJ Research Tetrad -syklilaitteessa tekemällä seuraavat syklit 35 kertaa: 96 °C:ssa 1 min, progressiivisesti alentaen annealing-lämpötilaa 64 °C:sta 58 °C:een 1 min ajan ja 72 °C:ssa 2 min, 96 °C:ssa tapahtuneen 5 min alkuinkubaation j älkeen.

PCR-monistuksen jälkeen poistettiin reagoimattomat dNTP:t ja alukkeet lisäämällä 15 0,2 yksikköä katkaravun alkalista fosfataasia (SAP) ja 1 yksikkö Exonuclease I:stä (EXO I) 10 pl:ssa DNA-polymeraasin reaktiopuskuria 2,5 plraan PCR-reaktiota.

Alukkeiden ja dNTP:den hajotus suoritettiin 37 °C:ssa 45 min ajan, minkä jälkeen entsyymit inaktivoitiin inkuboimalla 80 °C:ssa 15 min.

20 Kaksi 5 μ1:η erää entsyymikäsitellystä PCR-tuotteesta siirrettiin uusiin PCR-levyihin (Thermo-Fast 384, ABgene, Epsom, Surrey). Sen jälkeen lisättiin 5 μΐ alukkeen pidennyksen pääseosta, joka sisälsi 5 pmoolia cMS-aluketta 5'-GAG CAG ATC CCT GGA CAG GC-3', 0,5 U termostabiilia DNA-polymeraasia ja 10 pmoolia Texas Red -leimattua dGTP:ta tai dATPtta, yksi leimattu dNTP erää kohden, vastaavasti WT-ja 25 mutaatioalleelien detektoimiseksi. Levy peitettiin levynsulkijalla (Microseal 384, MJ Research), ja syklinen alukkeenpidennys suoritettiin tekemällä syklit 96 °C:ssa 10 sekunnin ajan ja 56 °C:ssa 10 sekunnin ajan, 50 sykliä. Syklien tekemisen jälkeen pidennetyn cMS-alukkeen määrä kvantitoitiin fluoresenssin energiaresonanssisiirron , · · (FRET) järjestelmällä, kun oli lisätty 5 μΐ yksijuosteiselle DNAdle spesifistä 30 fluoresoivaa väriainetta OliGreen® (Molecular Probes, Eugene OR), jota oli . , laimennettu 1:50 TE-puskurilla (10 mM TR1S- HC1, pH 7,0, ImM EDTA). Levyä .inkuboitiin huoneenlämmössä 10 min ajan jatkuvasti ravistellen. Näytteiden fluoresenssivoimakkuus mitattiin eksitaatiolla 485 nm:ssa ja emissiolla 535:ssa ja 15 114399 635 nm:ssa. 635/535 nm:n suhdetta käytettiin genotyypitykseen. Jos cMS-aluke pidentyi syklivaiheen aikana, fluoresenssin emissioenergiaa 01iGreen:stä siirtyi Texas Red -väriaineeseen läheisestä etäisyydestä johtuen, johtaen kohoneeseen 635/535 nm -emissiosuhteeseen. Kuten kuviossa 3 esitetään, osoittavat testi-SNP:n, 5 faktori V Leiden -mutaatio Arg506Gln, osalta tutkitut näytteet erinomaisen erottumisen genotyyppien välillä.

Esimerkki 2 10 Templaattina käytettävää DNA:ta uutettiin pakastetuista EDTA-verinäytteistä tavanomaisia menetelmiä käyttäen. Alukkeet PCR-monistusta varten reunustivat polymorfista SNP-kohtaa, tässä tapauksessa Factor V Leiden -mutaatiota (Arg506Gln, vastaten nukleotidimuutosta G:stä A:ksi genomin koodaavassa DNA-juosteessa) antaen vastustuskyvyn proteiini C:lle ja kohonneen tromboosiriskin 15 potilaassa. Alukkeiden sekvenssit olivat 5'-TCT CTT GAA GGA AAT GCC CCA-3' ja 5'-GGG CTA ATA GGA CTA CTT CTA-3'. Viisi μΐ templaatti-DNAta (5 ng/μΐ) lisättiin 40 pl:aan PCR Mastermix'iä, joka oli ennalta jaettu 96-kuoppaisiin PCR-levyihin. PCR-monistus suoritettiin DNA-polymeraasin reaktiopuskurissa, jota oli täydennetty 25 pM:lla PCR-alukkeita, 200 pM:lla dNTPrta, ja 0,5 yksiköllä 20 termostabiilia DNA-polymeraasia. Monistus suoritettiin käyttäen 64 °C => 58 °C Touch down PCR -ohjelmaa MJ Research Tetrad -syklilaitteessa tekemällä syklit 96 °C:ssa 1 min, progressiivisesti alentaen annealing-lämpötilaa 64 °C:sta 58 °C:een 1 min ajan ja 72 °C:ssa 2 min, 96 °C:ssa tapahtuneen 5 min alkuinkubaation jälkeen.. PCR-monistuksen jälkeen poistettiin reagoimattomat dNTP:t ja alukkeet lisäämällä 25 0,2 yksikköä katkaravun alkalista fosfataasia (SAP) ja 1 yksikkö Exonuclease I:stä (EXO I) 10 piissä DNA-polymeraasin reaktiopuskuria 2,5 pl:aan PCR-reaktiota.

Alukkeiden ja dNTP:iden hajotus suoritettiin 37 °C:ssa 45 min ajan, minkä jälkeen ;,, entsyymit inaktivoitiin inkuboimalla 80 °C:ssa 15 min.

30 Kaksi 5 μ1:η erää entsyymikäsitellystä PCR-tuotteesta siirrettiin uusiin PCR-levyihin (Thermo-Fast 384, ABgene, Epsom, Surrey). Sen jälkeen lisättiin 5 μΐ alukkeen .. ’; pidennyksen pääseosta, joka sisälsi 5 pmoolia cMS-aluketta 5'-GAG CAG ATC CCT

> I » GGA CAG GC-3', 0,5 U termostabiilia DNA-polymeraasia ja 10 pmoolia Texas Red i6 114399 -leimattua dGTP:tatai dATP:ta, yksi leimattu dNTP erää kohden, vastaavasti WT-ja mutaatioalleelien detektoimiseksi. Levy peitettiin levynsulkijalla (Microseal 384, MJ Research), ja syklinen alukkeenpidennys suoritettiin tekemällä syklit 96 °C:ssa 10 sekunnin ajan ja 56 °C:ssa 10 sekunnin ajan, 50 sykliä. Syklien tekemisen jälkeen 5 koko reaktioseos siirrettiin streptavidiinilla päällystettyjen mustien 384-mikrovelyjen kuoppiin (384 black NeutrAvidin with Superblocker, Pierce). Levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa yhden tunnin ajan, biotinyloidun alukkeen kuoppiin sitoutumisen sallimiseksi. Levyt pestiin levynpesijässä, minkä jälkeen lisättiin 50 μΐ yksijuosteiselle DNAlle spesifistä fluoresoivaa väriainetta OliGreen® (Molecular 10 Probes, Eugene OR), jota oli laimennettu 1:250 TE-puskurilla (10 mM TRIS- HC1, pH 7,0, ImM EDTA). Levyä inkuboitiin huoneenlämmössä 10 min ajan jatkuvasti ravistellen ja kuoppaan tarttuneen cMS-alukkeen määrä kvantitoitiin mittaamalla fluoresenssi eksitaatiolla 485 imussa ja emissiolla 535 imussa. Kuten kuviossa 4 esitetään, osoittavat testi-SNP:n, faktori V Leiden -mutaatio Arg506Gln, osalta 15 tutkitut näytteet erinomaisen erottumisen genotyyppien välillä.

Viitteet

Barany, F. (1991) Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase, Proceedings of the National Academy of Sciences of the 20 United States of America, 88, 189-93.

Chen, X. ja P.Y. Kwok (1997) Template-directed dye-terminator incorporation (TDI) assay: a homogeneous DNA diagnostic method based on fluorescence resonance energy transfer, Nucleic Acids Research, 25, 347-53.

Chen, X., L. Levine ja P.Y. Kwok (1999) Fluorescence polarization in 25 homogeneous nucleic acid analysis, Genome Research, 9, 492-8.

Chen, X., K.J. Livak ja P.Y. Kwok (1998) A homogeneous, ligase-mediated DNA diagnostic test, Genome Research, 8, 549-56.

Chen, X., B. Zehnbauer, A. Gnirke ja P.Y. Kwok (1997) Fluorescence energy ;. _ transfer detection as a homogeneous DNA diagnostic method, Proceedings of the 30 National Academy of Sciences of the United States of America, 94, 10756-61.

V Dawson, E. (1999) SNP maps: more markers needed? [news], Molecular

Medicine Today, 5,419-20.

17 77 4399

Fodor, S.P., J.L. Read, M.C. Pirrung, L. Stryer, A.T. Luja D. Solas (1991) Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis, Science, 251, 767-73.

Gibson, N.J., H.L. Gillard, D. Whitcombe, R.M. Ferrie, C.R. Newton ja S.

5 Little (1997) A homogeneous method for genotyping with fluorescence polarization,

Clinical Chemistry, 43, 1336-41.

Harjunmaa H. (1986) Theory, design and immunological applications of a vertically measuring fluorometer, doctoral thesis, University of Helsinki.

Ihalainen, J., H. Siitari, S. Laine, A.C. Syvänen ja A. Palotie (1994) Towards 10 automatic detection of point mutations: use of scintillating microplates in solid-phase minisequencing, Biotechniques, 16, 938-43.

Isaksson, A., U. Landegren, A.C. Syvänen, P. Bork, C. Stein, F. Ortigao ja A.J.

Brookes (2000) Discovery, scoring and utilization of human single nucleotide polymorphisms: a multidisciplinary problem, European Journal of Human Genetics, 15 8, 154-6.

Kurg, A., N. Tonisson, I. Georgiou, J. Shumaker, J. Tollett ja A. Metspalu (2000) Arrayed primer extension: solid-phase four-color DNA resequencing and mutation detection technology, Genetic Testing, 4, 1-7.

Landegren, U., R. Kaiser, J. Sanders ja L. Hood (1988) A ligase-mediated gene 20 detection technique, Science, 241, 1077-80.

Landegren, U., Nilsson M. ja Kwok, P-Y (1998) Reading bits of genetic information: Methods for single-nucleotide polymorphism analysis, Genome

Research, 8, 769-776.

Lipshutz, R.J., S.P. Fodor, T.R. Gingeras ja D.J. Lockhart (1999) High density 25 synthetic oligonucleotide arrays, Nature Genetics, 21, 20-4.

Martin, E.R., E.H. Lai, J.R. Gilbert, A.R. Rogala, A.J. Afshari, J. Riley, K.L.

Finch, J.F. Stevens, K.J. Livak, B.D. Slotterbeck, S.H. Slifer, L.L. Warren, P.M.

Conneally, D.E. Schmechel, I. Purvis, M.A. Pericak-Vance, A.D. Roses ja J.M.

Vance (2000) SNPing away at complex diseases: analysis of single-nucleotide : . 30 polymorphisms around APOE in Alzheimer disease, American Journal of Human

Genetics, 67, 383-94.

; Morris, A.P., J.C. Whittaker ja D.J. Balding (2000) Bayesian fine-scale mapping of disease loci, by hidden Markov models, American Journal of Human Genetics, 67,155-69.

„ 114399

Pastinen, T., A. Kurg, A. Metspalu, L. Peltonen ja A.C. Syvänen (1997) Minisequencing: a specific tool for DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide arrays, Genome Research, 7, 606-14.

Pastinen, T., J. Partanen ja A.C. Syvänen (1996) Multiplex, fluorescent, solid-5 phase minisequencing for efficient screening of DNA sequence variation, Clinical Chemistry, 42, 1391-7.

Pastinen, T., M. Raitio, K. Lindroos, P. Tainola, L. Peltonen ja A.C. Syvänen (2000) A system for specific, high-throughput genotyping by allele-specific primer extension on microarrays, Genome Research, 10, 1031-42.

10 Sachidanandam, R., D. Weissman, S.C. Schmidt, J.M. Kakol, L.D. Stein ja M.

G. (2001) A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms, Nature, 409, 928-33.

Shumaker, J.M., A. Metspalu ja C.T. Caskey (1996) Mutation detection by solid phase primer extension, Human Mutation, 7, 346-54.

15 Suovaniemi O. (1994) Automated instrumentation for clinical and research laboratories, doctoral thesis, University of Helsinki.

Syvänen, A-C (1999) From gels to chips: ’’Minisequencing” primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms, Human Mutation, 13, 1-10.

20 Syvänen, A-C, K. Aalto-Setala, L. Harju, K. Kontula ja H. Söderlund (1990) A

primer-guided nucleotide incorporation assay in the genotyping of apolipoprotein E, · Genomics, 8, 684-92.

Tiusanen, T. (1992) Inner-filter correction with a fluorometer-based multifunctional instrument, doctoral thesis, University of Helsinki.

25 Wallace, R.B., J. Shaffer, R.F. Murphy, J. Bonner, T. Hirose ja K. Itakura (1979) Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch, Nucleic Acids Research, 6, 3543-57.

Whitcombe, D., J. Brownie, H.L. Gillard, D. McKechnie, J. Theaker, C.R.

Newton ja S. Little (1998) A homogeneous fluorescence assay for PCR amplicons: ; ·. 30 its application to real-time, single-tube genotyping, Clinical Chemistry, 44, 918-23.

:' Wittwer, C.T., M.G. Herrmann, A.A. Moss ja R.P. Rasmussen (1997a) t t : Continuous fluorescence monitoring of rapid cyclic DNA amplification,

Biotechniques, 22, 130-1, 134-8.

19 114399

Wittwer, C.T., K.M. Ririe, R.V. Andrew, D.A. David, R.A. Gundry ja U.J.

Balis (1997b) The LightCycler: a micro volume multisample fluorimeter with rapid temperature control, Biotechniques, 22, 176-81.

Claims (19)

20 114399

1. Menetelmä pidennetyn oligonukleotidialukkeen läsnäolon määrittämiseksi alukkeenpidennysreaktioseoksessa geneettisen vaihtelun tai polymorfismin 5 havaitsemiseksi nukleiinihapponäytteessä, tunnettu siitä, että menetelmä sisältää seuraavat vaiheet: a) kiinnostuksen kohteena olevalle polymorfismille spesifisen modifioimattoman minisekvensointialukkeen templaatista riippuvainen pidentäminen leimatulla 10 deoksinukleosidi(5')trifosfaatilla (dNTP) olosuhteissa, jotka ovat alukkeen pidennykselle soveltuvat; b) vaiheesta (a) peräisin olevan reaktioseoksen käsittely yksijuosteisten ekstensiotuotteiden saamiseksi, tai jos ekstensiotuotteet ovat jo yksijuosteisia, 15 käytetään suoraan vaihetta c) tai d); c) valinnaisesti pidennetyn oligonukleotidialukkeen erottaminen reaktioseoksesta; d) mainitun pidennetyn oligonukleotidialukkeen saattaminen kosketuksiin 20 fluoresoivan reagenssin kanssa mainittuun pidennettyyn oligonukleotidialukkeeseen sitoutumista varten; ja . e) mainitun geneettisen vaihtelun tai polymorfismin läsnäolon määrittäminen . mittaamalla fluoresenssin emission voimakkuus eksitaation jälkeen. 25 .. t

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun leimatun dNTP:n leima on fluoresoiva detektio-osa.

. · · ·. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että dNTP-nukleotidi, -· · ‘. 30 joka liitetään templaatista riippuvaisesti modifioimattoman oligonukleotidialukkeen 1!! ^ 3'-päähän menetelmän vaiheessa a), on peräisin reaktiossa läsnä olevasta dATP:stä, «’ dCTP: stä, dGTP: stä tai dTTP: stä j a on leimattu fluoresoivalla väriaineella. I % i 21 114399

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmän vaiheessa d) reaktioseoksessa olevat yksijuosteiset ekstensiotuotteet saatetaan kosketuksiin pidennetyn oligonukleotidialukkeen 3'-päähän sitoutuvan fluoresoivan reagenssin kanssa energiansiirtymissuhteen muodostamiseksi mainitun fluoresoivan 5 detektio-osan ja mainitun fluoresoivan reagenssin välille fluoresenssin resonanssienergian siirtymisen (FRET) aikaansaamiseksi mainitun fluoresoivan detektio-osan ja mainitun fluoresoivan reagenssin välille.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu 10 energiansiirtymissuhde perustuu energian siirtymiseen donorifluoroforin ja akseptorifluoroforin välillä.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun pidennetyn oligonukleotidialukkeen läsnäolo määritetään menetelmän vaiheessa e) 15 mittaamalla useammalla kuin yhdellä aallonpituudella mainitun fluoresoivan detektio-osan ja mainitun fluoresoivan reagenssin emissiospektrejä.

7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitulla fluoresoivalla reagenssilla, joka toimii donorifluoroforina, on absorptiomaksimi noin 20 498 nm:n kohdalla ja emissiomaksimi noin 518 nm:n kohdalla, ja mainitulla fluoresoivalla detektio-osalla, joka toimii akseptorifluoroforina, on absorptiomaksimi t * noin 596 nm:n kohdalla ja emissiomaksimi noin 620:ssa.

. 8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmän . 25 vaiheessa a) vain yksi nukleotidi liitetään mainitun modifioimattoman . · · ·, oligonukleotidialukkeen 3'-päähän.

.:. 9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu . ‘''. nukleiinihapponäyte sisältää potilasnäytteestä peräisin olevan PCR- tai RT-PCR - *. 30 tuotteen. f

· · • · • · > · • 10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmää t t · ;;; käytetään varmistamaan pistemutaatioita, esimerkiksi SNPritä, alleelisuutta, tai ' ’ ‘ * ihmisen tai eläimen genotyyppiä. / 22 114399

11. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu fluoresoiva reagenssi on yksijuosteista DNA:ta sitova fluoresoiva väriaine.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys menetelmän vaiheessa e) suoritetaan eksitoimalla reaktioseoksen näytettä näyteastiassa mainitun näyteastian peittämättömän nestepinnan sivun läpi tai mainitun näyteastian pohjasivun läpi ja mittaamalla emittoitunut säteily eksitaation puolelta. 10

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys menetelmän vaiheessa e) suoritetaan eksitoimalla reaktioseoksen näytettä näyteastiassa mainitun näyteastian peittämättömän nestepinnan sivun läpi tai mainitun näyteastian pohjasivun läpi ja mittaamalla emittoitunut säteily 15 eksitaatiopuolen vastakkaiselta puolelta.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun leimatun dNTP:n leima on erotusosa.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pidennetty oligonukleotidialuke immobilisoidaan menetelmän vaiheessa c) kiinteälle t 1 tukialustalle, joka on päällystetty mainitulle erotusosalle spesifisellä reseptorilla.

. 16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biotiinia . 25 käytetään mainittuna erotusosana ja mainittu pidennetty oligonukleotidialuke .. immobilisoidaan vaiheessa c) kiinteälle tukialustalle, j oka on päällystetty streptavidiinilla tai avidiinilla. Il· , · · ·.

17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun * » 30 pidennetyn oligonukleotidialukkeen läsnäolo määritetään menetelmän vaiheessa e) • I t mittaamalla useammalla kuin yhdellä aallonpituudella mainitun fluoresoivan * · •' reagenssin emissiospektriä. / I · * $ » # * · » 114399

18. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitulla fluoresoivalla reagenssilla on absorptiomaksimi noin 498 nm:n kohdalla ja emissiomaksimi noin 518 nm:n kohdalla.

19. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että dNTP- nukleotidi, joka liitetään templaatista riippuvaisesti modifioimattoman oligonukleotidialukkeen 3-päähän menetelmän vaiheessa a), on peräisin reaktiossa läsnä olevasta dATP:stä, dCTP:stä, dGTPrstä tai dTTP:stä ja on leimattu biotiinilla. 1 / » > » « J 24 114399