JP2023526062A - 組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して修飾塩基を有する核酸の生成 - Google Patents

Abstract

本明細書に開示されるのは、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を使用して、修飾塩基を有するヌクレオチドを含む一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）足場を生成する方法を含む。組換えＴｄＴは、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列又はその断片を含むことができ、例えば、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２０と機能的に同等の１つ又は複数の位置に１つ又は複数のアミノ酸置換変異を含む。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０２３，７３６号の利益を主張し、その全内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

（配列表の参照）
本出願は、電子フォーマットでの配列表と共に出願されている。配列表は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿４７ＣＸ－３１１９７３－ＷＯと題されたファイル（２０２０年５月１１日作成、５２Ｋｂのサイズ）として提供される。配列表の電子フォーマット中の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

（発明の分野）
本開示は、概して、核酸を生成する分野、例えば、修飾塩基を有する核酸を生成する分野に関する。

単クローン性は、合成による配列決定（sequencing-by-synthesis：ＳＢＳ）の効率を改善することができる。ＳＢＳの単クローン性は、個々の鋳型ポリヌクレオチドシード及びクラスター、又は個々の鋳型ポリヌクレオチドからの播種及びクラスタリングからのポリヌクレオチド生成物が、基材表面上の空間的に異なる位置にある場合に起こり得る。

本明細書に開示されるのは、核酸を修飾する方法の実施形態を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）及び修飾塩基を含むヌクレオシド三リン酸を提供することを含む。方法は、（ｂ）ｓｓＤＮＡ及び修飾塩基を含むヌクレオシド三リン酸を、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）と接触させてｓｓＤＮＡ足場を生成することを含むことができる。ｓｓＤＮＡ足場は、ヌクレオシド三リン酸からの修飾塩基を含む１つ又は複数のヌクレオチドが組み込まれたｓｓＤＮＡを含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２０と機能的に同等の１つ又は複数の位置に１つ又は複数のアミノ酸置換変異を含むことができる。

いくつかの実施形態では、方法は、（ｃ）ｓｓＤＮＡ足場を第１のアダプタオリゴヌクレオチド及び第２のアダプタオリゴヌクレオチドと接触させて、核酸担体を生成することを更に含む。ｓｓＤＮＡ足場を第１のアダプタオリゴヌクレオチドと接触させることは、ｓｓＤＮＡ足場を第１のアダプタオリゴヌクレオチドを含む第１のアダプタ及び第１のポリマーと接触させることを含むことができる。ｓｓＤＮＡ足場を第２のアダプタオリゴヌクレオチドと接触させることは、ｓｓＤＮＡ足場を第２のアダプタオリゴヌクレオチドを含む第２のアダプタ及び第２のポリマーと接触させることを含むことができる。第１のアダプタは、共有結合した、第１のアダプタオリゴヌクレオチド及び第１のポリマーを含むことができる。第２のアダプタは、共有結合した、第２のアダプタオリゴヌクレオチド及び第２のポリマーを含むことができる。ｓｓＤＮＡ足場は、第３のポリマーを含むことができる。第１のアダプタオリゴヌクレオチドは、第１のアダプタ配列、又はその逆相補体を含むことができる。第２のアダプタオリゴヌクレオチドは、第２のアダプタ配列、又はその逆相補体を含むことができる。核酸担体は、第１のアダプタオリゴヌクレオチド及び第２のアダプタオリゴヌクレオチドに付着したｓｓＤＮＡ足場を含むことができる。いくつかの実施形態では、方法は、（ｄ）第１のアダプタ配列、又はその逆相補体、第２のアダプタ配列、又はその逆相補体、及び核酸ハイブリダイゼーション配列を含む核酸鋳型を提供することを更に含む。方法は、（ｅ）核酸担体を核酸鋳型と接触させて、核酸鋳型の核酸ハイブリダイゼーション配列を介して核酸担体の鋳型捕捉部位にハイブリダイズした核酸鋳型を有する核酸担体を生成することを含むことができる。方法は、（ｆ）複数の増幅された核酸を生成するために、核酸鋳型とハイブリダイズした核酸担体上で増幅を実行して、複数の増幅された核酸の各々が核酸鋳型の配列を含むように伸長された、第１のアダプタオリゴヌクレオチド、及び第２のアダプタオリゴヌクレオチド、又はそれらの逆相補体を生成することを含むことができる。増幅は、例えば、ブリッジ増幅又は除外増幅とすることができる。方法は、（ｇ）複数の増幅された核酸を使用して核酸鋳型の配列を決定することを含むことができる。

本明細書に開示されるのは、核酸を修飾する方法の実施形態を含む。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）第１の核酸及び第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸を提供することを含む。この方法は、（ｂ）第１の反応において、第１の温度で第１の反応時間、第１の核酸及び第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸を組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）と接触させて、第２の核酸を生成させることを含むことができる。第２の核酸は、第１のヌクレオシド三リン酸から第１の修飾塩基を含む１つ又は複数の第１のヌクレオチドと組み込まれた第１の核酸を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２０と機能的に同等の１つ又は複数の位置に１つ又は複数のアミノ酸置換変異を含むことができる。

いくつかの実施形態では、第１の核酸及び第２の核酸のうちの１つ又は複数は、一本鎖核酸、３’オーバーハングを有する二本鎖核酸、３’凹部を有する二本鎖核酸、又はそれらの組合わせを含む。第１の核酸及び第２の核酸のうちの１つ又は複数は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むことができる。第１の核酸及び第２の核酸のうちの１つ又は複数のヌクレオチドの少なくとも５０％は、デオキシリボヌクレオチドを含むことができる。第１の核酸及び第２の核酸のうちの１つ又は複数は、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）を含むことができる。第１の核酸及び第２の核酸のうちの１つ又は複数は、少なくとも１つのリボヌクレオチドを含むことができる。

いくつかの実施形態では、第２の核酸は、２つ以上、又は３つ以上の第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオチド第１の核酸を含む。第２の核酸中の第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオチドの２つ以上、又は３つ以上は連続的とすることができる。第１のヌクレオシド三リン酸の第１の修飾塩基は、修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシン、修飾チミン、又は修飾ウラシルを含むことができる。第１のヌクレオシド三リン酸は、５－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサ－ペンタデカノイル－アミノアリル）－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸（アジド－ＰＥＧ４－アミノアリル－ｄＵＴＰ）、Ｎ^６－（６－アジド）ヘキシル－３’－デオキシアデノシン－５’－三リン酸（Ｎ^６－（６－アジド）ヘキシル－３’－ｄＡＴＰ）、又はそれらの組合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、共有結合した、第１のヌクレオシド三リン酸は、第１の修飾塩基及び第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、第１の反応時間は、少なくとも１秒である。第１の温度は、少なくとも１６℃～少なくとも５８℃とすることができる。第１の反応における第１の核酸の濃度は、少なくとも１０ｎＭとすることができる。第１の反応における第１のヌクレオシド三リン酸の濃度は、少なくとも０．１μＭとすることができる。第１の反応における組換えＴｄＴの濃度は、少なくとも１０ｎＭとすることができる。

いくつかの実施形態では、第１の核酸及び第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸を提供することは、第１の核酸、第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸、及び第２のヌクレオシド三リン酸塩を提供することを含む。第１の核酸及び第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸を組換えＴｄＴに接触させることは、第１の核酸、第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸、及び第２のｖを、組換えＴｄＴと、第１の反応における第１の温度で第１の反応時間にわたって接触させて、第２の核酸を生成することを含むことができる。第２の核酸は、第１のヌクレオシド三リン酸からの（ｉ）からの第１の修飾塩基を含む１つ又は複数の第１のヌクレオチドと、（ｉｉ）１つ又は複数の第２のヌクレオチドと、を含む第１の核酸を含むことができる。

いくつかの実施形態では、１つ又は複数の第２のヌクレオチドの各々は、第２のヌクレオシド三リン酸からの第２の修飾塩基を含む。第２のヌクレオシド三リン酸の第２の修飾塩基は、修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシン、修飾チミン、又は修飾ウラシルを含むことができる。第１のヌクレオシド三リン酸の第１の修飾塩基及び第２のヌクレオシド三リン酸の第２の修飾塩基は、同じ未修飾塩基の修飾を含むことができる。第１のヌクレオシド三リン酸の第１の修飾塩基及び第２のヌクレオシド三リン酸の第２の修飾塩基は、異なる未修飾塩基の修飾を含むことができる。いくつかの実施形態では、共有結合した、第２のヌクレオシド三リン酸は、第２の修飾塩基及び第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、第２のヌクレオチドの各々は、第２のヌクレオシド三リン酸からの第２の未修飾塩基を含む。第２のヌクレオシド三リン酸の第２の未修飾塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、又はウラシルを含むことができる。第１の修飾塩基は、第２の未修飾塩基の修飾を含むことができる。

いくつかの実施形態では、第１の修飾塩基及び第２のヌクレオシド三リン酸を含む第１のヌクレオシド三リン酸を、約１：１００～約１００：１の範囲の比率で第１の核酸と接触させる。第１の修飾塩基及び第２のヌクレオチドを含む第１のヌクレオチドは、約１：１００～約１００：１の範囲の比で第２の核酸に組み込むことができる。

いくつかの実施形態では、第１の核酸及び第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸を提供することは、第１の核酸、第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸、及び複数の第２のヌクレオシド三リン酸塩を提供することを含む。第１の核酸及び第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸を組換えＴｄＴに接触させることは、第１の核酸、第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸、及び複数の第２のヌクレオシド三リン酸を、組換えＴｄＴと、第１の反応における第１の温度で第１の反応時間にわたって接触させて、第２の核酸を生成することを含むことができる。第２の核酸は、第１の修飾塩基を含む１つ又は複数の第１のヌクレオチドと、複数の第２のヌクレオシド三リン酸からの１つ又は複数の第２のヌクレオチドと、を含む第１の核酸を含むことができる。

いくつかの実施形態では、複数の第２のヌクレオシド三リン酸は、デオキシリボースアデニン三リン酸、デオキシリボースグアニン三リン酸、デオキシリボースシトシン三リン酸、デオキシリボースチミン三リン酸、デオキシリボースウラシル三リン酸、又はそれらの組合わせを含む。複数の第２のヌクレオシド三リン酸のうちの２つは、約１：１００～約１００：１の範囲の比で第１の核酸と接触させることができる。第２のヌクレオチドのうちの２つは、約１：１００～約１００：１の範囲の比で第２の核酸に組み込まれ得る。複数の第２のヌクレオシド三リン酸のうちの少なくとも１つ、又はそれぞれは、第２の未修飾塩基を含むことができる。複数の第２のヌクレオシド三リン酸のうちの少なくとも１つ、又はそれぞれは、第２の修飾塩基を含むことができる。

いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの修飾塩基及び未修飾塩基は、約１：１００～約１００：１の範囲の比で第２の核酸に組み込まれ得る。修飾塩基は、第１の修飾塩基及び／又は第２の核酸に組み込まれた複数の第２のヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、又はそれぞれの塩基を含むことができる。未修飾塩基は、第２の核酸に組み込まれた複数の第２のヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、又はそれぞれの塩基を含むことができる。

いくつかの実施形態では、第２の核酸のヌクレオチド塩基の少なくとも１％は、修飾塩基を含む。修飾塩基は、第２の核酸全体に分配され得る。修飾塩基は、第２の核酸全体にわたってランダムに分布することができる。第２の核酸は、複数の２つ以上の連続した修飾塩基を含むことができる。複数の連続した修飾塩基は、３つ以上の連続した修飾塩基を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の核酸のヌクレオチド塩基の少なくとも１％は、第１の修飾塩基を含む。

いくつかの実施形態では、第１の核酸は、核酸鋳型に結合することができる鋳型捕捉部位を含む。鋳型捕捉部位は、鋳型捕捉配列を含むことができる。核酸鋳型は、鋳型捕捉配列の逆相補体と少なくとも９０％の配列同一性を有し、鋳型捕捉配列にハイブリダイズすることができる配列を含むことができる。核酸鋳型は、一本鎖ＤＮＡを含むことができる。

いくつかの実施形態では、第１のヌクレオシド三リン酸の第１の修飾塩基及び第２の核酸中の第１のヌクレオチドのうちの１つ又は複数は、官能基を含む。第１の修飾塩基の官能基は、クリック化学反応に関与することができる。第１のヌクレオシド三リン酸の第１の修飾塩基及び第２の核酸の第１のヌクレオチドは、飽和又は不飽和、置換又は非置換の直鎖又は分岐脂肪族炭素鎖を含むことができる。第１の修飾塩基の官能基及び塩基は、飽和又は不飽和、置換又は非置換の直鎖又は分岐脂肪族炭素鎖によって接続された第１の修飾塩基の２つの末端にあり得る。

いくつかの実施形態では、方法は、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドを提供することを更に含む。方法は、第２の反応において第２の温度で第２の反応時間、第２の核酸を第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドと接触させて、１つ又は複数の第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドに付着した第２の核酸を含む第３の核酸を生成することを含むことができる。

いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドを提供することは、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドを提供することを含む。第２の核酸を第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドと接触させることは、第２の反応において第２の温度で第２の反応時間、第２の核酸を第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドと接触させて、１つ又は複数の第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び１つ又は複数の第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドに付着した第２の核酸を含む第３の核酸を生成することを含むことができる。

いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドは、第１のアダプタ配列、又はその逆相補体を含む。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドは、第２のアダプタ配列、又はその逆相補体を含むことができる。いくつかの実施形態において、第１のアダプタ配列はＰ５配列を含む。第２のアダプタ配列は、Ｐ７配列を含むことができる。

いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドのうちの１つ又は複数は、約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド長である。第３の核酸は、約１０～約１，０００，０００の第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドを含むことができる。第３の核酸は、約１０～約１，０００，０００の第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、第３の核酸は、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドのうちの１つ又は複数に付着した第２の核酸を含む。第３の核酸は、第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドのうちの１つ又は複数に付着した第２の核酸を含むことができる。

いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドを提供することは、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び第１のポリマーを含む第１のアクセサリーを提供することを含む。第２の核酸を第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドと接触させることは、第２の反応において第２の温度で第２の反応時間、第２の核酸を第１のアクセサリーと接触させて、第１のアクセサリーの１つ又は複数に付着した第２の核酸を含む第３の核酸を生成することを含むことができる。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドを提供することは、第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び第２のポリマーを含む第２のアクセサリーを提供することを含むことができる。第２の核酸を第２のアクセサリーと接触させることは、第２の反応において第２の温度で第２の反応時間、第２の核酸及び第２のアクセサリーを接触させて、第２のアクセサリーの１つ又は複数に付着した第２の核酸を含む第３の核酸を生成することを含むことができる。第１のアクセサリーは、共有結合した、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び第１のポリマーを含むことができる。第２のアクセサリーは、共有結合した、第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び第２のポリマーを含むことができる。

いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は第１のポリマーは、第１の官能基を含む。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドは、第２の官能基を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は第１のポリマーの第１の官能基、及び第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は第２のポリマーの第２の官能基は、同一である。第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドの第１の官能基は、第１のヌクレオチドの第１の修飾塩基の官能基と反応して共有結合を形成することができる。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は第２のポリマーの第２の官能基は、第１のヌクレオチドの第１の修飾塩基の官能基と反応して共有結合を形成することができる。

いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は第１のポリマーの第１の官能基は、クリック化学反応に関与することができる。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は第２のポリマーの第２の官能基は、クリック化学反応に関与することができる。いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は第１のポリマーの第１の官能基は、第１のヌクレオチドの第１の修飾塩基の官能基とのクリック化学反応に関与することができる。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は第２のポリマーの第２の官能基は、第１のヌクレオチドの第１の修飾塩基の官能基とのクリック化学反応に関与することができる。

いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は第１のポリマーの第１の官能基、第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は第２のポリマーの第２の官能基、第１のヌクレオシド三リン酸の第１の修飾塩基の官能基、及び第１のヌクレオチドの官能基のうちの１つ又は複数は、独立して、アジド、アルキニル、アルケニル、チオール又はニトロンである。第１のヌクレオチドの第１の修飾塩基の官能基及び第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド若しくは第１のポリマーの第１の官能基、又は第１のヌクレオチドの第１の修飾塩基の官能基及び第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド若しくは第２のポリマーの第２の官能基、又はその両方は、以下の対から選択することができる。（ｉ）アジド／アルキニル、（ｉｉ）アルキニル／アジド、（ｉｉｉ）チオール／アルキニル、（ｉｖ）アルキニル／チオール、（ｖ）アルケニル／チオール、（ｖｉ）チオール／アルケニル、（ｖｉｉ）アジド／シクロオクチニル、（ｖｉｉｉ）シクロオクチニル／アジド；（ｉｘ）ニトロン／シクロオクチニル、及び（ｘ）シクロオクチニル／ニトロン。第１のヌクレオチドの第１の修飾塩基の官能基は、アジドとすることができる。第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は第１のポリマーの第１の官能基、及び第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は第２のポリマーの第２の官能基のうちの１つ又は複数は、独立して、アルキニルとすることができる。

いくつかの実施形態では、クリック化学反応は、銅触媒アジド－アルキン環付加（ＣｕＡＡＣ）を含む。共有結合は、トリアゾリルを含むことができる。ＣｕＡＡＣは、Ｃｕ（Ｉ）安定化リガンドを含むことができる。Ｃｕ（Ｉ）安定化リガンドは、３－［４－（｛ビス［（１－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－１，２，３トリアゾール－４－イル）メチル］アミノ｝メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル］プロパノール（ＢＴＴＰ）、３－［４－（｛ビス［（１－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－１，２，３トリアゾール－４－イル）メチル］アミノ｝メチル）－１Ｈ－１，２，３トリアゾール－１－イル］プロピル硫酸水素（ＢＴＴＰＳ）、２－［４－（｛ビス［（１－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミノ｝メチル）－１Ｈ－１，２，３トリアゾール－１－イル］エチル硫酸水素（ＢＴＴＥＳ）、２－［４－｛（ビス［（１－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミノ）メチル｝－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル］－酢酸（ＢＴＴＡＡ）、バソフェナントロリンジスルホネート二ナトリウム塩（ＢＰＳ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）、トリス－（（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）アミン（ＴＢＴＡ）、トリス（３－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）、Ｎ^ε－（（（１Ｒ，２Ｒ）－２－アジドシクロペンチルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン（ＡＣＰＫ）、及び４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ－１，８－ナフタルイミド（４－ＤＭＮ）からなる群から選択することができる。

いくつかの実施形態では、クリック化学反応は、菌株促進アジド－アルキン環付加（ＳＰＡＡＣ）を含む。共有結合は、シクロオクタ－トリアゾリルを含むことができる。いくつかの実施形態では、クリック化学反応は、アルキンヒドロチオール化を含む。共有結合は、アルケニルスルフィドを含むことができる。いくつかの実施形態では、クリック化学反応は、アルケンヒドロチオール化を含む。共有結合は、硫化アルキルを含むことができる。いくつかの実施形態では、クリック化学反応は、菌株促進アルキン－ニトロン環付加（ＳＰＡＮＣ）を含む。共有結合は、オクタヒドロシクロオクタ－イソオキサゾリルを含むことができる。シクロオクチニルは、ジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）又はその誘導体とすることができる。いくつかの実施形態では、クリック化学反応は生体適合性である。

いくつかの実施形態では、第２の温度は、約２０℃～約６５℃である。第２の温度は、０℃未満とすることができる。第２の温度は、約－４℃～約－２０℃とすることができる。いくつかの実施形態では、第２の反応時間は、少なくとも１秒である。

いくつかの実施形態では、方法は、（ｃ）第１のアダプタ配列、又はその逆相補体、第２のアダプタ配列、又はそれらの逆相補体を含む核酸鋳型、並びに第３の核酸上の鋳型捕捉部位にハイブリダイズすることができる核酸ハイブリダイゼーション配列を提供することを更に含む。方法は、（ｄ）第３の核酸を核酸鋳型と接触させて、核酸鋳型の核酸ハイブリダイゼーション配列を介して、第３の核酸上の鋳型捕捉部位にハイブリダイズした核酸鋳型を用いて第３の核酸を生成することを含むことができる。方法は、（ｅ）核酸鋳型とハイブリダイズした第３の核酸に対する増幅を実施して、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドのうちの１つ又は複数に付着した第３の核酸、核酸鋳型の配列を含むように伸長された第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドのうちの１つ又は複数、あるいはそれらの逆相補体を含む第４の核酸を生成することを含むことができる。増幅は、例えば、ブリッジ増幅又は除外増幅とすることができる。方法は、（ｆ）第４の核酸を使用して核酸鋳型の配列を決定することを含むことができる。核酸鋳型の核酸ハイブリダイゼーション配列は、鋳型捕捉部位の逆相補体を含むことができる。

いくつかの実施形態では、第１の核酸、第２の核酸、第３の核酸、及び／又は第４の核酸は、第３のポリマーを含む。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む。Ｇｌｕ１９１と機能的に同等の位置でのアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９１Ａｌａ、Ｇｌｕ１９１Ａｒｇ、Ｇｌｕ１９１Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９１Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９１Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１９１Ｇｌｎ、Ｇｌｕ１９１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ１９１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９１Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１９１Ｍｅｔ、Ｇｌｕ１９１Ｐｈｅ、Ｇｌｕ１９１Ｐｒｏ、Ｇｌｕ１９１Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１９１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９１Ｔｒｐ、Ｇｌｕ１９１Ｔｙｒ、又はＧｌｕ１９１Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９１Ａｌａ、Ｇｌｕ１９１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９１Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９１Ｍｅｔ、又はＧｌｕ１９１Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９１Ｖａｌとすることができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ１９３Ａｌａ、Ｌｙｓ１９３Ａｒｇ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｃｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｙ、Ｌｙｓ１９３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１９３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ１９３Ｌｅｕ、Ｌｙｓ１９３Ｍｅｔ、Ｌｙｓ１９３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ１９３Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１９３Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１９３Ｔｒｐ、Ｌｙｓ１９３Ｔｙｒ、ｏｒ Ｌｙｓ１９３Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、又はＬｙｓ１９３Ｔｈｒとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎとすることができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９４Ａｌａ、Ｇｌｕ１９４Ａｒｇ、Ｇｌｕ１９４Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９４Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ１９４Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９４Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１９４Ｍｅｔ、Ｇｌｕ１９４Ｐｈｅ、Ｇｌｕ１９４Ｐｒｏ、Ｇｌｕ１９４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１９４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９４Ｔｒｐ、Ｇｌｕ１９４Ｔｙｒ、又はＧｌｕ１９４Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９４Ａｌａ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９４Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９４Ｍｅｔ、又はＧｌｕ１９４Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙとすることができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸又は芳香族アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ａｓｐ２４２Ａｌａ、Ａｓｐ２４２Ａｒｇ、Ａｓｐ２４２Ａｓｎ、Ａｓｐ２４２Ｃｙｓ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｎ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｕ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｈｉｓ、Ａｓｐ２４２Ｉｌｅ、Ａｓｐ２４２Ｌｅｕ、Ａｓｐ２４２Ｌｙｓ、Ａｓｐ２４２Ｍｅｔ、Ａｓｐ２４２Ｐｈｅ、Ａｓｐ２４２Ｐｒｏ、Ａｓｐ２４２Ｓｅｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｈｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｒｐ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、又はＡｓｐ２４２Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ａｓｐ２４２Ａｓｎ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｎ、Ａｓｐ２４２Ｐｈｅ、Ａｓｐ２４２Ｓｅｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｈｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｒｐ、又はＡｓｐ２４２Ｔｙｒとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒとすることができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、負電荷アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ２８７Ａｌａ、Ｌｙｓ２８７Ａｒｇ、Ｌｙｓ２８７Ａｓｎ、Ｌｙｓ２８７Ａｓｐ、Ｌｙｓ２８７Ｃｙｓ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２８７Ｈｉｓ、Ｌｙｓ２８７Ｉｌｅ、Ｌｙｓ２８７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ２８７Ｍｅｔ、Ｌｙｓ２８７Ｐｈｅ、Ｌｙｓ２８７Ｐｒｏ、Ｌｙｓ２８７Ｓｅｒ、Ｌｙｓ２８７Ｔｈｒ、Ｌｙｓ２８７Ｔｒｐ、Ｌｙｓ２８７Ｔｙｒ、又はＬｙｓ２８７Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ２８７Ａｓｐ又はＬｙｓ２８７Ｇｌｕとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕとすることができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｐｈｅ２９６Ａｌａ、Ｐｈｅ２９６Ａｒｇ、Ｐｈｅ２９６Ａｓｎ、Ｐｈｅ２９６Ａｓｐ、Ｐｈｅ２９６Ｃｙｓ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｎ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｙ、Ｐｈｅ２９６Ｈｉｓ、Ｐｈｅ２９６Ｉｌｅ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｙｓ、Ｐｈｅ２９６Ｍｅｔ、Ｐｈｅ２９６Ｐｒｏ、Ｐｈｅ２９６Ｓｅｒ、Ｐｈｅ２９６Ｔｈｒ、Ｐｈｅ２９６Ｔｒｐ、Ｐｈｅ２９６Ｔｙｒ、又はＰｈｅ２９６Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｐｈｅ２９６Ａｌａ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｙ、Ｐｈｅ２９６Ｉｌｅ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２９６Ｍｅｔ、又はＰｈｅ２９６Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕとすることができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｍｅｔ２９９Ａｌａ、Ｍｅｔ２９９Ａｒｇ、Ｍｅｔ２９９Ａｓｎ、Ｍｅｔ２９９Ａｓｐ、Ｍｅｔ２９９Ｃｙｓ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｎ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｕ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｙ、Ｍｅｔ２９９Ｈｉｓ、Ｍｅｔ２９９Ｉｌｅ、Ｍｅｔ２９９Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｍｅｔ２９９Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２９９Ｐｒｏ、Ｍｅｔ２９９Ｓｅｒ、Ｍｅｔ２９９Ｔｈｒ、Ｍｅｔ２９９Ｔｒｐ、Ｍｅｔ２９９Ｔｙｒ、又はＭｅｔ２９９Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｍｅｔ２９９Ａｒｇ、Ｍｅｔ２９９Ｈｉｓ、又はＭｅｔ２９９Ｌｙｓとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓとすることができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｔｈｒ３４２Ａｌａ、Ｔｈｒ３４２Ａｒｇ、Ｔｈｒ３４２Ａｓｎ、Ｔｈｒ３４２Ａｓｐ、Ｔｈｒ３４２Ｃｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｎ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｕ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３４２Ｈｉｓ、Ｔｈｒ３４２Ｉｌｅ、Ｔｈｒ３４２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ３４２Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｍｅｔ、Ｔｈｒ３４２Ｐｈｅ、Ｔｈｒ３４２Ｐｒｏ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、Ｔｈｒ３４２Ｔｒｐ、Ｔｈｒ３４２Ｔｙｒ、又はＴｈｒ３４２Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｔｈｒ３４２Ａｓｎ、Ｔｈｒ３４２Ｃｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｎ、Ｔｈｒ３４２Ｐｒｏ、又はＴｈｒ３４２Ｓｅｒとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒとすることができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｈｉｓ４２１Ａｌａ、Ｈｉｓ４２１Ａｒｇ、Ｈｉｓ４２１Ａｓｎ、Ｈｉｓ４２１Ａｓｐ、Ｈｉｓ４２１Ｃｙｓ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｎ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｕ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｙ、Ｈｉｓ４２１Ｉｌｅ、Ｈｉｓ４２１Ｌｅｕ、Ｈｉｓ４２１Ｌｙｓ、Ｈｉｓ４２１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２１Ｐｈｅ、Ｈｉｓ４２１Ｐｒｏ、Ｈｉｓ４２１Ｓｅｒ、Ｈｉｓ４２１Ｔｈｒ、Ｈｉｓ４２１Ｔｒｐ、Ｈｉｓ４２１Ｔｙｒ、又はＨｉｓ４２１Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｈｉｓ４２１Ａｓｎ、Ｈｉｓ４２１Ｃｙｓ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｎ、Ｈｉｓ４２１Ｐｒｏ、Ｈｉｓ４２１Ｓｅｒ、又はＨｉｓ４２１Ｔｈｒとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｈｉｓ４２１Ｐｒｏとすることができる。

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の２つ以上の位置に２つ以上のアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の２つ以上の位置における２つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの２つ以上を含むことができる。

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の３つ以上の位置に３つ以上のアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の３つ以上の位置における３つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの３つ以上を含むことができる。

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の４つ以上の位置に４つ以上のアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の４つ以上の位置における４つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの４つ以上を含むことができる。

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の５つ以上の位置に５つ以上のアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の５つ以上の位置における５つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの５つ以上を含むことができる。

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の６つ以上の位置に６つ以上のアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の６つ以上の位置における６つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの６つ以上を含むことができる。

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の７つ以上の位置に７つ以上のアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の７つ以上の位置における７つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの７つ以上を含むことができる。

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の８つ以上の位置に８つ以上のアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の８つ以上の位置における８つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの８つ以上を含むことができる。

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の８つの位置に８つのアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の８つの位置における８つのアミノ酸置換変異は、それぞれＬｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏとすることができる。

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置に９つのアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置における９つのアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏとすることができる。

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも９０％同一であり得るアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１１と少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１２と少なくとも８０％同一であり得るアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、４７℃以上の温度で安定である。組換えＴｄＴは、５０℃以上の温度で安定であり得る。組換えＴｄＴは、５５℃以上の温度で安定であり得る。組換えＴｄＴは、５８℃以上の温度で安定であり得る。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性は、同じ試験温度における配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、又は１２０％である。試験温度は、３７℃、４７℃、５０℃、５５℃、又は５８℃とすることができる。

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、小さなユビキチン様修飾剤（small ubiquitin-like modifier：ＳＵＭＯ）断片を含む。ＳＵＭＯ断片は、配列番号１３と少なくとも８０％同一であり得るアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、組換えＴｄＴのＮ末端にＳＵＭＯ断片を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことができる。組換えＴｄＴは、組換えＴｄＴのＣ末端にＳＵＭＯ断片を含むことができる。

本明細書に開示されるのは、本開示の核酸を修飾する任意の方法によって得られる第２の核酸の実施形態を含む。本明細書に開示されるのは、本開示の核酸を修飾する任意の方法によって得られる第３の核酸の実施形態を含む。本明細書に開示されるのは、本開示の核酸を修飾する任意の方法によって得られる第４の核酸の実施形態を含む。

本明細書に記載されている主題の１つ又は複数の実施の詳細が、添付の図面及び以下の説明に記述されている。その他の特徴、態様、及び利点は、本明細書、図面、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。本概要も以下の発明を実施するための形態も、本発明の主題の範囲を定義又は制限するものと言っているわけではない。

一本鎖ＤＮＡ足場、担体、及びナノ粒子を生成する非限定的な例示的なプロセスを示す概略図である。 ＳＵＭＯ－ＴｄＴ（配列番号１４）と、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ（配列番号１２）のアミノ酸１３９～５２０（配列番号１）との非限定的な例示的配列アラインメントを示す図である。ＳＵＭＯ－ＴｄＴは、アミノ酸位置１２３～５０４にＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのアミノ酸１３９～５２０、及びアミノ酸位置２２～１１９にＮ末端ＳＵＭＯタグ（配列番号１３）を含む組換えＴｄＴを指す。強調されている９つのアミノ酸は、本明細書中で同定されるＳＵＭＯ－ＴｄＴにおける置換変異である。ＳＵＭＯ－ＴｄＴ（及びそのバリアント）における置換変異のアミノ酸位置及びＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴにおける対応する位置を示す。 ＮＥＢ及びＴｄＴ３－２からの市販のＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を示す非限定的な例示的なゲルグラフである。 １分間及び６０分間の市販のＮＥＢ ＴｄＴによるアジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰ及び天然ヌクレオチドによるＴｄＴ伸長の結果を示している非限定的な例示的ゲルグラフである。 １分間及び６０分間の市販のＮＥＢ ＴｄＴによるアジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰ及び天然ヌクレオチドによるＴｄＴ伸長の結果を示している非限定的な例示的ゲルグラフである。 １分間及び６０分の、ＴｄＴ３－２及び市販のＮＥＢ ＴｄＴによるアジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰ又はアジド－ヘキシル－ｄＡＴＰを用いたＴｄＴ伸長の結果を示す非限定的な例示的なゲルグラフである。 １分間及び６０分の、ＴｄＴ３－２及び市販のＮＥＢ ＴｄＴによるアジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰ又はアジド－ヘキシル－ｄＡＴＰを用いたＴｄＴ伸長の結果を示す非限定的な例示的なゲルグラフである。 １分間及び６０分の、ＴｄＴ３－２及び市販のＮＥＢ ＴｄＴによるアジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰ又はアジド－ヘキシル－ｄＡＴＰを用いたＴｄＴ伸長の結果を示す非限定的な例示的なゲルグラフである。

以下の詳細な説明では、添付の図面を参照し、添付の図面は本明細書の一部をなす。図面において、同様の記号は、文脈上特に指示されない限り、典型的には同様の構成要素を特定する。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載される例示的な実施形態は、限定することを意図するものではない。本明細書に提示される主題の趣旨又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を加え得る。本開示の態様は、本明細書に全般的に記載され、図面に例示されるように、多種多様な異なる構成で配置され、置換され、組み合わされ、分離され、及び設計され得ることが容易に理解され、それらの全てが本明細書で明示的に企図されており、本明細書の開示の一部をなす。

本明細書で参照される全ての特許、公開された特許出願、その他の刊行物、及びＧｅｎＢａｎｋからの配列、及び本明細書で参照されるその他のデータベースは、関連技術に関してそれら全体が本明細書に参照により組み込まれる。

多くのシーケンシングプラットフォーム上は、「合成時解読」（sequencing by synthesis、ＳＢＳ）技術、及び検出のための蛍光ベースの方法を使用する。例えば、鋳型ポリヌクレオチドのライブラリは、播種として知られるプロセスにおいて基質の表面に付着して、播種された鋳型ポリヌクレオチドを生成することができる。次いで、クラスター化ポリヌクレオチドと呼ばれる各播種鋳型ポリヌクレオチドの複数のコピーを、クラスター化と呼ばれるプロセスで、鋳型ポリヌクレオチドが播種された場所に近接した表面に付着させて合成することができる。続いて、クラスター化ポリヌクレオチドの新生コピーは、例えば、蛍光標識でヌクレオチドを組み込むことによって合成することができる。クラスター化ポリヌクレオチドの新生コピーに組み込まれたヌクレオチドは、組み込まれた各ヌクレオチドを同定するシグナル（例えば、蛍光シグナル）を放出することができる。鋳型ポリヌクレオチドが最初に播種された場所に近接した播種された鋳型ポリヌクレオチドのコピーのクラスター化は、シグナルの増幅をもたらし、したがって検出を改善する。

播種及びクラスタリングはまた、互いに異なる鋳型ポリヌクレオチドが、クラスタリングによって、それぞれ単一の鋳型ポリヌクレオチドの播種から得られるコピーされたポリヌクレオチドの空間的に個別のクラスターをもたらすように、互いに十分に遠位の表面の位置上に播種、又はその位置に付着される場合にも良好に進み、この条件は一般的に単クローン性と呼ばれる。例えば、鋳型ポリヌクレオチドのライブラリは、異なるヌクレオチド配列を有する多数の鋳型ポリヌクレオチドを含むことができる。２つのそのような鋳型ポリヌクレオチドが基材の表面上で近すぎる場合、クラスタリングにより、クラスター化されたポリヌクレオチドの空間的に混じり合った集団をもたらされる場合があり、そのうちの一部は、近くに播種された鋳型ポリヌクレオチドのうちの１つの配列を有し得、別のものは表面上の近くにも播種された別の鋳型ポリヌクレオチドの配列を有し得る。又は、互いに非常に近接して播種された２つの異なる鋳型ポリヌクレオチドから形成された２つのクラスターは、互いに隣接しすぎているか、又は互いに隣接している可能性があり、その結果、ＳＢＳプロセスで使用されるイメージングシステムは、クラスター間に基質に付着したクラスター化ポリヌクレオチドの空間的な混合がないか又は最小限であっても、組み込まれたヌクレオチドによって生成されたシグナルを別個のクラスターとして区別することができない可能性がある。そのような不利な条件は、一般に、多クローン性と称され得る。存在する場合、多クローン性クラスターから明確な配列情報を得るためには、より困難で、時間がかかり、費用がかかり、効率が低く、より複雑なデータ分析を必要とする場合がある。

単クローン性は、鋳型ポリヌクレオチドからのコピーされたポリヌクレオチドをそれぞれ有する単一のナノ粒子を基板の単一のウェル（例えば、フローセル）に分配することによっても達成することができる。足場（例えば、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）足場）は、鋳型ポリヌクレオチドの複数のコピーの「担体」として機能することができる。鋳型分子の複数のコピーを有する担体は、立体衝突又は障害によって他の高分子が同じウェルを占有することを排除することによって、基板上の単一ウェルを占有することができるナノ粒子とすることができる。基材の単一のウェルを占める単一ナノ粒子は、単クローン性をもたらすか、又は単クローン性に近い可能性がある。

本明細書に開示されるのは、足場を生成する方法の実施形態を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）及び修飾塩基を含むヌクレオシド三リン酸を提供することを含む。方法は、（ｂ）ｓｓＤＮＡ及び修飾塩基を含むヌクレオシド三リン酸を、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）と接触させてｓｓＤＮＡ足場を生成することを含むことができる。ｓｓＤＮＡ足場は、ヌクレオシド三リン酸からの修飾塩基を含む１つ又は複数のヌクレオチドが組み込まれたｓｓＤＮＡを含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２０と機能的に同等の１つ又は複数の位置に１つ又は複数のアミノ酸置換変異を含むことができる。方法は、（ｃ）第１のアダプタオリゴヌクレオチド及び第２のアダプタオリゴヌクレオチドと接触させて、核酸担体を生成することを含むことができる。第１のアダプタオリゴヌクレオチドは、第１のアダプタ配列を含むことができる。第２のアダプタオリゴヌクレオチドは、第２のアダプタ配列を含むことができる。核酸担体は、第１のアダプタオリゴヌクレオチド及び第２のアダプタオリゴヌクレオチドに付着したｓｓＤＮＡ足場を含むことができる。方法を使用して、担体からナノ粒子を生成することができる。例えば、方法は、第１のアダプタ配列、又はその逆相補体、第２のアダプタ配列、又はその逆相補体、及び核酸ハイブリダイゼーション配列を含む核酸鋳型を提供することを更に含むことができる。方法は、（ｅ）核酸担体を核酸鋳型と接触させて、核酸鋳型の核酸ハイブリダイゼーション配列を介して核酸担体の鋳型捕捉部位にハイブリダイズした核酸鋳型を有する核酸担体を生成することを含むことができる。方法は、（ｆ）複数の増幅された核酸を生成するために、核酸鋳型とハイブリダイズした核酸担体上で増幅を実行して、複数の増幅された核酸の各々が核酸鋳型の配列を含むように伸長された、第１のアダプタオリゴヌクレオチド、及び第２のアダプタオリゴヌクレオチド、又はそれらの逆相補体を生成することを含むことができる。増幅は、例えば、ブリッジ増幅又は除外増幅とすることができる。複数の増幅された核酸を有する担体は、本明細書ではナノ粒子と呼ばれる。方法は、（ｇ）複数の増幅された核酸を使用して核酸鋳型の配列を決定することを含むことができる。十分な空間的寸法を有するナノ粒子は、立体的衝突又は障害によって、他のナノ粒子が同じウェルを占有することを排除することによって、基材上の単一ウェル（例えば、フローセル）を占有することができ、したがって、単クローン性又は単クローン性に近いものをもたらす。

本明細書に開示されるのは、核酸を修飾する方法の実施形態を含む。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）第１の核酸及び第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸を提供することを含む。この方法は、（ｂ）第１の反応において、第１の温度で第１の反応時間、第１の核酸及び第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸を組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）と接触させて、第２の核酸を生成させることを含むことができる。第２の核酸は、第１のヌクレオシド三リン酸から第１の修飾塩基を含む１つ又は複数の第１のヌクレオチドと組み込まれた第１の核酸を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２０と機能的に同等の１つ又は複数の位置に１つ又は複数のアミノ酸置換変異を含むことができる。

複数の修飾塩基を組み込んだ一本鎖ＤＮＡ分子の生成
修飾ヌクレオチドを組み込んだ足場（例えば、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）足場）を生成することができる。足場は、鋳型分子の複数のコピーの「担体」として機能することができる。鋳型分子の複数のコピーを有する担体は、立体衝突又は障害によって他の高分子が同じウェルを占有することを排除することによって、基板（例えば、１００、１，０００、１０，０００以上のウェル等の複数のウェルを含むフローセル）上の単一ウェル（例えば、マイクロウェル）を占有することができるナノ粒子であり得る。それぞれ１つのナノ粒子を有する基材上の単一ウェルは、単クローン性をもたらすか、又は単クローン性に近い可能性がある。あるいは、ｓｓＤＮＡ足場は、鋳型の単一のコピーを担持することができる。足場は、アンカーオリゴの逆相補体の複数のコピー又はアンカーオリゴの逆相補体を有することができる。足場は、アンカーオリゴの逆相補体の複数のコピーの存在又はアンカーオリゴの逆相補体の存在のために、所与のウェル中の全ての「アンカー」オリゴを結合及び封鎖することができ、したがって、単一の鋳型をウェルごとに捕捉することができる。

そのようなｓｓＤＮＡ足場を生成又は構築するための１つの方法は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）等のｓｓＤＮＡポリメラーゼを使用して、塩基上のアジド基等の修飾を有するヌクレオチドをプライマー鎖にランダムに組み込む。しかしながら、市販のＴｄＴは、おそらく立体衝突による複数の連続塩基修飾ヌクレオチドを容易に組み込まない。

本明細書に開示される組換えＴｄＴの実施形態は、塩基修飾ヌクレオチド、例えば、塩基にコンジュゲートしたＰＥＧ鎖を有するヌクレオチド（本明細書ではＰＥＧ－ヌクレオチドと呼ばれる）の組込みにおいて、熱安定性であり、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標），Ｉｎｃ．（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）等の市販のＴｄＴよりも良好（はるかに良好）である。例えば、ＮＥＢ ＴｄＴは、１～２個のＰＥＧ－ヌクレオチドを組み込んだ後に停止し、組換えＴｄＴは、複数のＰＥＧ－ヌクレオチドを直列に組み込むことができる。

したがって、本明細書に開示される任意の組換えＴｄＴは、モノクローナルクラスター化のための「担体」の生成を含む、異なる目的のために様々な種類の塩基修飾ヌクレオチドを担持するｓｓＤＮＡの生成のための優れた触媒とすることができる。

図１は、一本鎖ＤＮＡ足場、担体、及びナノ粒子を生成する非限定的な例示的なプロセスを示す概略図である。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）足場１２０ｓは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ１１２（ＴｄＴ）を使用することによって合成することができる。ＴｄＴ１１２は、鋳型を必要又はコピーすることなく、一本鎖ＤＮＡ鎖１０４の３’－ヒドロキシル末端に１０８ｎｔ＿ｍ，１０８ｎｔ＿ｕを組み込むことができる。ＴｄＴ１１２の使用によって合成されたｓｓＤＮＡ足場１２０ｓのサイズは、足場１２０ｓが合成される重合プロセスの期間を変更することによって制御することができる。

ＤＮＡ足場１２０ｓは、修飾塩基を有するヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍ及び未修飾塩基を有するヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｕの存在下で合成することができる。修飾塩基を有するヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍ及び未修飾塩基を有するヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｕの相対濃度に応じて、ＤＮＡ足場１２０ｓに組み込まれるヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍ、１０８ｎｔ＿ｕの一定の割合は、修飾塩基を有するヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍである。ＤＮＡ足場１２０ｓを合成するときに、修飾塩基を有する１つ又は複数のタイプのヌクレオシド三リン酸１０８ｎｔ＿ｍが存在することができ、修飾された塩基を有する１つ又は複数のタイプのヌクレオチド１２０ｎｔ＿ｍをＤＮＡ足場１２０ｓに組み込むことができる。

この非限定的な例では、アクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｓ１、１２４ａｓ２は、核酸担体１２０ｃを形成するためにｓｓＤＮＡ足場に結合して示されている。アクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｓ１、１２４ａｓ２は、クリック化学反応において、ヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍの官能基の機能的部分１０８ｆｍと相互作用することができる。例えば、足場１２０ｓに組み込まれたヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍの修飾塩基の官能基１０８ｆｍは、アクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１、１２４ａｏ２上で官能基１２４ｆｍ１、１２４ｆｍ２と反応することができる。

単一の鋳型捕捉部位１０４ｔｃｓがｓｓＤＮＡ足場１２０ｓの末端（例えば、５’末端）に存在する。四尖星形は、足場１２０ｓ上のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍの修飾塩基の官能基１０８ｆｍを示す。アクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１、１２４ａｏ２は、Ｐ５配列、又はその逆相補体、あるいはＰ７配列、又はその逆相補体を含むことができる。アクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１、１２４ａｏ２上の五尖星形は、足場１２０ｓ内のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍの修飾塩基の官能基１０８ｆｍと相互作用することができる官能性基１２４ｆｍ１、１２４ｍ２を示す。

次いで、鋳型核酸又はポリヌクレオチド１２８の５’末端が、非共有結合ワトソン・クリック塩基対合ハイブリダイゼーションによって核酸担体１２０ｃの相補的５’末端の単一鋳型捕捉部位１０４ｔｃｓに結合することが示される。次いで、クラスタリングプロセスを核酸担体１２０ｃ上で行う。核酸担体１２０ｃにハイブリダイズしない鋳型核酸１２８の部分は、Ｐ５配列又はその逆相補体、及びＰ７配列又はその逆相補体にハイブリダイズすることができる配列を含むことができる。例えば、鋳型核酸１２８は、Ｐ５配列、又はその逆相補体、及びＰ７配列、又はそれらの逆相補体を含有することができる。複数回の重合の後、鋳型捕捉部位１０４ｔｃｓにハイブリダイズすることができる鋳型核酸１２８の５’末端以外の、鋳型ポリヌクレオチド１２８の担体結合コピー及び／又は逆相補体は、Ｐ５及びＰ７アクセサリーオリゴヌクレオチドの３’末端から延在することによって合成される。

核酸の修飾
本明細書に開示されるのは、足場を生成し、担体を生成し、ナノ粒子を生成し、核酸鋳型を配列決定する方法を含む。図１を参照すると、方法は、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）１０４及び修飾塩基を含むヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍを提供することを含むことができる。方法は、ｓｓＤＮＡ１０４、及び修飾塩基を含むヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍを、作用１１６ａで組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）１１２で接触させて、ｓｓＤＮＡ足場１２０ｓを生成することを含むことができる。ｓｓＤＮＡ足場１２０ｓは、ヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍから修飾塩基を含む１つ又は複数のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍと共に組み込まれたｓｓＤＮＡ１０４を含むことができる。組換えＴｄＴ１０８は、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２０と機能的に同等の１つ又は複数の位置に１つ又は複数のアミノ酸置換変異を含むことができる。

方法は、作用１１６ｂにおいて、ｓｓＤＮＡ足場１２０ｓを、第１のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１（例えば、Ｐ５配列を含むオリゴヌクレオチド）、又は第１のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１及び第２のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２（例えば、Ｐ７配列を含むオリゴヌクレオチド）を含む第１のアダプタ、又は第２のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２を含む第２のアダプタと接触させて、核酸担体１２０ｃを生成することを含むことができる。第１のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１は、第１のアダプタ配列１２４ａｓ１（例えば、Ｐ５配列）、又はその逆相補体を含むことができる。第２のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２は、第２のアダプタ配列１２４ａｓ（例えば、Ｐ７配列）、又はその逆相補体、又はそれらの逆相補体を含むことができる。核酸担体１２０ｃは、第１のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１及び第２のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２に付着したｓｓＤＮＡ足場１２０ｓを含むことができる。

いくつかの実施形態では、ｓｓＤＮＡ足場１２０ｓを第１のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１と接触させることは、ｓｓＤＮＡ足場を第１のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１及び第１のポリマーを含む第１のアダプタと接触させることを含む。ｓｓＤＮＡ足場１２０ｓを第２のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２と接触させることは、ｓｓＤＮＡ足場を第２のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２及び第２のポリマーを含む第２のアダプタと接触させることを含むことができる。第１のアダプタは、共有結合した、第１のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１及び第１のポリマーを含むことができる。第２のアダプタは、共有結合した、第２のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２及び第２のポリマーを含むことができる。ｓｓＤＮＡ足場１２０ｓは、第３のポリマーを含むことができる。

方法は、第１のアダプタ配列１２４ａｓ１、又はその逆相補体、第２のアダプタ配列１２４ａｓ２、又はそれらの逆相補体を含む核酸鋳型１２８、並びに鋳型捕捉部位１０４ｔｃｓにハイブリダイズすることができる核酸ハイブリダイゼーション配列１２８ｔｃｓを提供することを含むことができる。方法は、作用１１６ｃで核酸担体１２０ｃを核酸鋳型と接触させて、核酸鋳型１２８の核酸ハイブリダイゼーション配列１２８ｔｃｓを介して核酸担体１２０ｃの鋳型捕捉部位１０４ｔｃｓにハイブリダイズされた核酸鋳型１２８を有する核酸担体１２０ｃを生成することを含むことができる。鋳型捕捉部位１０４ｔｃｓは、核酸鋳型１２８の核酸ハイブリダイゼーション配列１２８ｔｃｓにハイブリダイズすることができる。核酸鋳型１２８の鋳型捕捉部位１０４ｔｃｓ及び核酸ハイブリダイゼーション配列１２８ｔｃｓは、逆相補体とすることができる。鋳型捕捉部位１０４ｔｃｓ及び核酸鋳型１２８の核酸ハイブリダイゼーション配列１２８ｔｃｓの逆相補体は、同一又は実質的に同一であり得る（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％同一）。方法は、核酸鋳型１２８の配列又はその逆相補体を含むように伸長された第１のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１又は第２のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２をそれぞれ含む複数の増幅核酸１３２を生成するために、核酸鋳型１２８とハイブリダイズした核酸担体１２０ｃに対して動作１１６ｄで増幅（例えば、ブリッジ増幅又は排除増幅）を実行することを含むことができる。複数の増幅された核酸を有する担体は、本明細書ではナノ粒子１２０ｎと称され、この方法は、１つ又は複数の複数の増幅された核酸１３２を使用して核酸鋳型１２８の配列を決定することを含むことができる。

本明細書に開示されるのは、核酸を修飾する方法を含む。図１を参照すると、方法は、第１の核酸１０４（例えば、一本鎖デオキシリボ核酸）及び第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍを提供することを含むことができる。方法は、第１の反応において第１の温度で第１の反応時間、第１の核酸１０４及び第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍを組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）１１２と接触させて、相互作用１１６ａで第２の核酸１２０ｓ（例えば、キャリア）を生成することを含むことができる。第２の核酸１２０ｓ（例えば、核酸足場）は、第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍからの第１の修飾塩基を含む一つ以上の第１のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍが組み込まれた第１の核酸１０４を含むことができる。組換えＴｄＴ１１２は、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２０と機能的に同等の１つ又は複数の位置に１つ又は複数のアミノ酸置換変異を含むことができる。

核酸、ヌクレオチド、及びヌクレオシド三リン酸
いくつかの実施形態では、第１の核酸１０４は、一本鎖核酸、３’オーバーハングを有する二本鎖核酸、３’凹部を有する二本鎖核酸、又はそれらの組合わせを含む。第２の核酸１２０ｃは、一本鎖核酸、３’オーバーハングを有する二本鎖核酸、３’凹部を有する二本鎖核酸、又はそれらの組合わせを含むことができる。第１の核酸１０４は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むことができる。第２の核酸１２０ｓは、デオキシリボ核酸を含むことができる。

第１の核酸１０４、又は第２の核酸１２０ｃ（あるいは本開示の任意の核酸）の長さは、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、第１の核酸又は第２の核酸（あるいは本開示の任意の核酸）の長さは、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、２００００００、３００００００、４００００００、５００００００、６００００００、７００００００、８００００００、９００００００、１０００００００、又はこれらの値、ヌクレオチドのいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれに近い。いくつかの実施形態では、第１の核酸又は第２の核酸（又は本開示の任意の核酸）の長さは、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、２００００００、３００００００、４００００００、５００００００、６００００００、７００００００、８００００００、９００００００、又は１０００００００ヌクレオチドである。

デオキシリボヌクレオチドを含む第１の核酸１０４又は第２の核酸１２０ｃのヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍ、１０８ｎｔ＿ｕの割合及び数は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、デオキシリボヌクレオチドを含む第１の核酸又は第２の核酸のヌクレオチドの割合は、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、デオキシリボヌクレオチドを含む第１の核酸又は第２の核酸のヌクレオチドのパーセンテージは、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。例えば、第１の核酸１０４のヌクレオチドの少なくとも５０％は、デオキシリボヌクレオチドを含むことができる。例えば、第２の核酸１２０ｓのヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍ、１０８ｎｔ＿ｕの少なくとも５０％は、デオキシリボヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、デオキシリボヌクレオチドを含む第１の核酸又は第２の核酸のヌクレオチドの数は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、２００００００、３００００００、４００００００、５００００００、６００００００、７００００００、８００００００、９００００００、１０００００００、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、デオキシリボヌクレオチドを含む第１の核酸又は第２の核酸のヌクレオチドの数は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、２００００００、３００００００、４００００００、５００００００、６００００００、７００００００、８００００００、９００００００、１０００００００である。

いくつかの実施形態では、第１の核酸１０４は、一本鎖核酸を含む。第２の核酸１２０ｃは、一本鎖核酸を含むことができる。第１の核酸１０４は、一本鎖デオキシリボ核酸を含むことができる。第２の核酸１２０ｃは、一本鎖デオキシリボ核酸を含むことができる。リボヌクレオチドを含む第１の核酸１０４又は第２の核酸１２０ｃのヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍ、１０８ｎｔ＿ｕの割合及び数は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、リボヌクレオチドを含む第１の核酸又は第２の核酸のヌクレオチドの割合は、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、デオキシリボヌクレオチドを含む第１の核酸又は第２の核酸のヌクレオチドのパーセンテージは、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％である。例えば、第１の核酸のヌクレオチドの最大１％は、リボヌクレオチドを含むことができる。例えば、第２の核酸のヌクレオチドの最大１％は、リボヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、リボヌクレオチドを含む第１の核酸又は第２の核酸のヌクレオチドの数は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、２００００００、３００００００、４００００００、５００００００、６００００００、７００００００、８００００００、９００００００、１０００００００、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、リボヌクレオチドを含む第１の核酸又は第２の核酸のヌクレオチドの数は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、２００００００、３００００００、４００００００、５００００００、６００００００、７００００００、８００００００、９００００００、又は１０００００００である。例えば、第１の核酸１０４は、少なくとも１つのリボヌクレオチドを含むことができる。例えば、第２の核酸１２０ｃは、少なくとも１つのリボヌクレオチドを含むことができる。

第２の核酸１２０ｃは、第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオチド１０８ｎｓｔ＿ｍの数と共に組み込まれた第１の核酸１０４を含むことができる。第２の核酸１２０ｓに組み込まれた第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオチド１０８ｎｓｔ＿ｍの数は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、第２の核酸に組み込まれた第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオチドの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、２００００００、３００００００、４００００００、５００００００、６００００００、７００００００、８００００００、９００００００、１０００００００、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、第２の核酸に組み込まれた第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオチドの数は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、２００００００、３００００００、４００００００、５００００００、６００００００、７００００００、８００００００、９００００００、又は１０００００００である。例えば、第２の核酸１２０ｃは、第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオチド１０８ｎｓｔ＿ｍの２つ以上又は３つ以上で組み込まれた第１の核酸１０４を含む。

第２の核酸１２０ｓに組み込まれた第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオチド１０８ｎｓｔ＿ｍの割合は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、第２の核酸に組み込まれた第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオチドの割合は、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、第２の核酸に組み込まれた第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオチドの割合は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲である。

第２の核酸１２０ｃ中の第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍの２つ以上、又は３つ以上は連続的とすることができる。第２の核酸１２０ｃは、第１の修飾塩基を含む連続する第１のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍの１つ又は複数の領域を含むことができる。第１の修飾塩基を含む連続した第１のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍの領域の数（複数可）は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、第１の修飾塩基を含む連続する第１のヌクレオチドの領域の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、第１の修飾塩基を含む連続する第１のヌクレオチドの領域の数は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、又は１００００である。第２の核酸１２０ｃの領域内の第１の修飾塩基を含む連続した第１のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍの数は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、第２の核酸の領域における第１の修飾塩基を含む連続した第１のヌクレオチドの数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、第２の核酸の領域における第１の修飾塩基を含む連続した第１のヌクレオチドの数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、又は１００００あるいはそれらに近い。

第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍの第１の修飾塩基（又は本開示のヌクレオシド三リン酸の任意の修飾塩基）は、修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシン、修飾チミン、又は修飾ウラシルを含むことができる。第１のヌクレオシド三リン酸（又は本開示の任意のヌクレオシド三リン酸）は、例えば、５－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサ－ペンタデカノイル－アミノアリル）－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸（アジド－ＰＥＧ４－アミノアリル－ｄＵＴＰ）、Ｎ^６－（６－アジド）ヘキシル－３’－デオキシアデノシン－５’－三リン酸（Ｎ^６－（６－アジド）ヘキシル－３’－ｄＡＴＰ）、又はそれらの組合わせを含むことができる。

いくつかの実施形態では、第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍは、第１の修飾塩基及び第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド（例えば、Ｐ７アダプタオリゴヌクレオチド、又は（例えば、Ｐアダプタオリゴヌクレオチド））を含む。第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍは、共有結合した第１の修飾塩基及び第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドを含むことができる。

反応
第１の核酸１０４及び第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍが組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ１１２と接触する第１の反応時間は、異なる実施形態では異なり得る。例えば、第１の反応時間は、少なくとも１０分である（分）。いくつかの実施形態において、第１の反応時間（又は本開示の任意の反応時間）は、１秒、２秒、３秒、４秒、５秒、６秒、７秒、８秒、９秒、１０秒、１１秒、１２秒、１３秒、１４秒、１５秒、１６秒、１７秒、１８秒、１９秒、２０秒、２１秒、２２秒、２３秒、２４秒、２５秒、２６秒、２７秒、２８秒、２９秒、３０秒、３１秒、３２秒、３３秒、３４秒、３５秒、３６秒、３７秒、３８秒、３９秒、４０秒、４１秒、４２秒、４３秒、４４秒、４５秒、４６秒、４７秒、４８秒、４９秒、５０秒、５１秒、５２秒、５３秒、５４秒、５５秒、５６秒、５７秒、５８秒、５９秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、３１分、３２分、３３分、３４分、３５分、３６分、３７分、３８分、３９分、４０分、４１分、４２分、４３分、４４分、４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、５１分、５２分、５３分、５４分、５５分、５６分、５７分、５８分、５９分、６０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態において、第１の反応時間（又は本開示の任意の反応時間）は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、１秒、２秒、３秒、４秒、５秒、６秒、７秒、８秒、９秒、１０秒、１１秒、１２秒、１３秒、１４秒、１５秒、１６秒、１７秒、１８秒、１９秒、２０秒、２１秒、２２秒、２３秒、２４秒、２５秒、２６秒、２７秒、２８秒、２９秒、３０秒、３１秒、３２秒、３３秒、３４秒、３５秒、３６秒、３７秒、３８秒、３９秒、４０秒、４１秒、４２秒、４３秒、４４秒、４５秒、４６秒、４７秒、４８秒、４９秒、５０秒、５１秒、５２秒、５３秒、５４秒、５５秒、５６秒、５７秒、５８秒、５９秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、３１分、３２分、３３分、３４分、３５分、３６分、３７分、３８分、３９分、４０分、４１分、４２分、４３分、４４分、４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、５１分、５２分、５３分、５４分、５５分、５６分、５７分、５８分、５９分、６０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲である。

第１の反応において、第１の核酸１０４及び第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍを組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ１１２と接触させる第１の反応温度は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、第１の反応温度（又は本開示の任意の反応温度）は、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、第１の反応温度（又は本開示の任意の反応温度）は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲である。例えば、第１の温度は、少なくとも３７℃～少なくとも５８℃とすることができる。

第１の反応における第１の核酸１０４の濃度は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態において、第１の反応（又は本開示の任意の反応）における第１の核酸（又は本開示の任意の核酸）の濃度は、０．０１ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．３ｎＭ、０．４ｎＭ、０．５ｎＭ、０．６ｎＭ、０．７ｎＭ、０．８ｎＭ、０．９ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態において、第１の反応（又は本開示の任意の反応）における第１の核酸（又は本開示の任意の核酸）の濃度は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、０．０１ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．３ｎＭ、０．４ｎＭ、０．５ｎＭ、０．６ｎＭ、０．７ｎＭ、０．８ｎＭ、０．９ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、又は１００μＭである。例えば、第１の反応における第１の核酸１０４の濃度は、少なくとも１０ｎＭとすることができる。

第１の反応における第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍの濃度は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態において、第１の反応（又は本開示の任意の反応）における第１のヌクレオシド三リン酸（又は本開示の任意のヌクレオチド三リン酸）の濃度は、０．００１μＭ、０．００２μＭ、０．００３μＭ、０．００４μＭ、０．００５μＭ、０．００６μＭ、０．００７μＭ、０．００８μＭ、０．００９μＭ、０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０３μＭ、０．０４μＭ、０．０５μＭ、０．０６μＭ、０．０７μＭ、０．０８μＭ、０．０９μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態において、第１の反応（又は本開示の任意の反応）における第１のヌクレオシド三リン酸（又は本開示の任意のヌクレオチド三リン酸）の濃度は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、０．００１μＭ、０．００２μＭ、０．００３μＭ、０．００４μＭ、０．００５μＭ、０．００６μＭ、０．００７μＭ、０．００８μＭ、０．００９μＭ、０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０３μＭ、０．０４μＭ、０．０５μＭ、０．０６μＭ、０．０７μＭ、０．０８μＭ、０．０９μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、又は１００μＭである。例えば、第１の反応における第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍの濃度は、少なくとも０．１μＭとすることができる。

第１の反応における組換えＴｄＴ１１２の濃度は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、第１の反応における組換えＴｄＴの濃度は、０．０１ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．３ｎＭ、０．４ｎＭ、０．５ｎＭ、０．６ｎＭ、０．７ｎＭ、０．８ｎＭ、０．９ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの態実施形態では、第１の反応における組換えＴｄＴの濃度は、少なくとも、少なくとも約、多くとも約、又は多くとも約、０．０１ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．３ｎＭ、０．４ｎＭ、０．５ｎＭ、０．６ｎＭ、０．７ｎＭ、０．８ｎＭ、０．９ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、又は１００μＭである。例えば、第１の反応における組換えＴｄＴ１１２の濃度は、少なくとも０．１μＭとすることができる。

追加のヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸
いくつかの実施形態では、第１の核酸及び第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸を提供することは、第１の核酸、第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸、及び第２のヌクレオシド三リン酸塩（例えば、ヌクレオチド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｕ）を提供することを含む。第１の核酸及び第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸をブロック１１６ａで組換えＴｄＴに接触させることは、第１の核酸、第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸、第２のヌクレオシド三リン酸塩と、組換えＴｄＴとを、ブロック１１６ａにおいて第１の反応で第１の温度で第１の反応時間にわたって接触させて、第２の核酸１２０ｃを生成することを含むことができる。第２の核酸１２０ｓは、（ｉ）第１のヌクレオシド三リン酸から第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオチド１０８ｎｓｔ＿ｍの１つ又は複数、及び（ｉｉ）１つ又は複数の第２のヌクレオチド（例えば、未修飾塩基を含むヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｕ）が組み込まれた第１の核酸１０４を含むことができる。

いくつかの実施形態では、１つ又は複数の第２のヌクレオチドの各々は、第２のヌクレオシド三リン酸からの第２の修飾塩基を含む。第２のヌクレオシド三リン酸の第２の修飾塩基は、修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシン、修飾チミン、又は修飾ウラシルを含むことができる。第２のヌクレオシド三リン酸（又は本開示の任意のヌクレオシド三リン酸）は、例えば、５－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサ－ペンタデカノイル－アミノアリル）－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸（アジド－ＰＥＧ４－アミノアリル－ｄＵＴＰ）、Ｎ^６－（６－アジド）ヘキシル－３’－デオキシアデノシン－５’－三リン酸（Ｎ^６－（６－アジド）ヘキシル－３’－ｄＡＴＰ）、又はそれらの組合わせを含むことができる。

いくつかの実施形態では、第２のヌクレオシド三リン酸は、第２の修飾塩基及び第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド（例えば、Ｐ７アダプタオリゴヌクレオチド、又はＰ５アダプタオリゴヌクレオチド）を含む。第２のヌクレオシド三リン酸は、共有結合した、第２の修飾塩基及び第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドを含むことができる。

第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍの第１の修飾塩基及び第２のヌクレオシド三リン酸の第２の修飾塩基は、同じ未修飾塩基の修飾、例えばアデニン（又はグアニン、シトシン、チミン若しくはウラシル）の修飾を含むことができる。第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍの第１の修飾塩基及び第２のヌクレオシド三リン酸の第２の修飾塩基は、アデニン及びグアニンの修飾等の異なる未修飾塩基の修飾を含むことができる。

いくつかの実施形態では、第２のヌクレオチドの各々は、第２のヌクレオシド三リン酸からの第２の未修飾塩基（例えば、未修飾塩基１０８ｎｓｔ＿ｕを有するヌクレオシド三リン酸）を含む。第２のヌクレオシド三リン酸の第２の未修飾塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、又はウラシルを含むことができる。第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍの第１の修飾塩基は、第２の未修飾塩基の修飾を含むことができる。例えば、第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍは、修飾アデニンを含み得、第２のヌクレオシド三リン酸は、アデニンを含むことができる。

第１の反応における第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍ（又は本開示の任意のヌクレオシド三リン酸塩、例えば第２のヌクレオシド三リン酸）である全ヌクレオシド三リン酸のパーセンテージは、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態において、第１の反応における第１のヌクレオシド三リン酸（又は本開示の任意のヌクレオシド三リン酸）である全ヌクレオシド三リン酸の割合は、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、第１の反応における第１のヌクレオシド三リン酸（又は本開示の任意のヌクレオシド三リン酸）である全ヌクレオシド三リン酸の割合は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．９％である。

第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍ及び第２のヌクレオシド三リン酸（又は全ての第２のヌクレオシド三リン酸を含む２つ以上の第２のヌクレオシド三リン酸）は、異なる実施形態において異なる比率で第１の核酸１０４と接触させることができる。いくつかの実施形態では、第１の核酸と接触させる、第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸と第２のヌクレオシド三リン酸（又は全ての第２のヌクレオシド三リン酸を含む２つ以上の第２のヌクレオシド三リン酸）との比は、１：１０００、１：９００、１：８００、１：７００、１：６００、１：５００、１：４００、１：３００、１：２００、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、第１の核酸と接触させる、第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸と第２のヌクレオシド三リン酸（又は全ての第２のヌクレオシド三リン酸を含む２つ以上の第２のヌクレオシド三リン酸）との比は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、１：１０００、１：９００、１：８００、１：７００、１：６００、１：５００、１：４００、１：３００、１：２００、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、又は１０００：１である。例えば、第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍ及び第２のヌクレオシド三リン酸を、約１：１００～約１００：１の範囲の比で第１の核酸１０４と接触させる。

第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍ及び第２のヌクレオチド（又は全ての第２のヌクレオシド三リン酸を含む２つ以上の第２のヌクレオシド三リン酸）は、異なる実施形態において異なる比率で第２の核酸１２０ｓに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、第２の核酸に組み込まれる、第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオチドと第２のヌクレオチド（又は全ての第２のヌクレオシド三リン酸を含む２つ以上の第２のヌクレオシド三リン酸）との比は、１：１０００、１：９００、１：８００、１：７００、１：６００、１：５００、１：４００、１：３００、１：２００、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、第２の核酸に組み込まれている、第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオチドと第２のヌクレオチド（又は全ての第２のヌクレオシド三リン酸を含む２つ以上の第２のヌクレオシド三リン酸）との比は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、１：１０００、１：９００、１：８００、１：７００、１：６００、１：５００、１：４００、１：３００、１：２００、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、又は１０００：１である。例えば、第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍ及び第２のヌクレオチド（例えば、１０８ｎｔ＿ｕ）は、約１：１００～約１００：１の範囲の比率で第２の核酸１２０ｓに組み込まれ得る。

いくつかの実施形態では、第１の核酸１０４及び第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍを提供することは、第１の核酸１０４、第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍ、及び複数の第２のヌクレオシド三リン酸を提供することを含む。第１の核酸１０４及び第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍを作用１１６ａで組換えＴｄＴ１１２と接触させることは、第１の核酸１０４、第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍ、及び複数の第２のヌクレオシド三リン酸を、第１の反応の第１の温度で第１の反応時間にわたって組換えＴｄＴ１１２と接触させて、１１１６ａで第２の核酸１２０ｓを生成することを含むことができる。第２の核酸１２０ｓは、第１の修飾塩基を含む１つ又は複数の第１のヌクレオチド１１０８ｎｔ＿ｍと、複数の第２のヌクレオシド三リン酸からの１つ又は複数の第２のヌクレオチドと、を含む第１の核酸１０４を含むことができる。

いくつかの実施形態では、複数の第２のヌクレオシド三リン酸は、デオキシリボースアデニン三リン酸、デオキシリボースグアニン三リン酸、デオキシリボースシトシン三リン酸、デオキシリボースチミン三リン酸、デオキシリボースウラシル三リン酸、又はそれらの組合わせを含む。各々が第２の未修飾塩基を含む複数のヌクレオシド三リン酸の第２のヌクレオシド三リン酸の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲等、異なる実施形態において異なり得る。例えば、複数の第２のヌクレオシド三リン酸のうちの少なくとも１つ、又はそれぞれは、第２の未修飾塩基を含むことができる。各々が第２の修飾塩基を含む複数のヌクレオシド三リン酸の第２のヌクレオシド三リン酸の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲等、異なる実施形態において異なり得る。例えば、複数の第２のヌクレオシド三リン酸のうちの少なくとも１つ、又はそれぞれは、第２の修飾塩基を含むことができる。それぞれが第２の修飾塩基を含む第２のヌクレオシド三リン酸とそれぞれが第２の未修飾塩基を含む第２のヌクレオシド三リン酸との比は、異なる実施形態では、例えば、１：１０００、１：９００、１：８００、１：７００、１：６００、１：５００、１：４００、１：３００、１：２００、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、又は１０００：１とすることができる。

複数の第２のヌクレオシド三リン酸のうちの２つは、異なる実施形態では、第１の核酸１０４と異なる比率で接触させることができる。いくつかの実施形態において、第１の核酸と接触させる複数の第２のヌクレオシド三リン酸のうちの２つの比は、１：１０００、１：９００、１：８００、１：７００、１：６００、１：５００、１：４００、１：３００、１：２００、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態において、いくつかの実施形態において、第１の核酸と接触させる複数の第２のヌクレオシド三リン酸のうちの２つの比は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、１：１０００、１：９００、１：８００、１：７００、１：６００、１：５００、１：４００、１：３００、１：２００、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、又は１０００：１である。例えば、複数の第２のヌクレオシド三リン酸のうちの２つは、約１：１００～約１００：１の範囲の比で第１の核酸と接触させることができる。

複数の第２のヌクレオシド三リン酸のうちの２つは、異なる実施形態において異なる比率で第２の核酸１２０ｓに組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、第２の核酸に組み込まれる複数の第２のヌクレオシド三リン酸のうちの２つの比は、１：１０００、１：９００、１：８００、１：７００、１：６００、１：５００、１：４００、１：３００、１：２００、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態において、いくつかの実施形態において、第２の核酸に組み込まれる複数の第２のヌクレオシド三リン酸のうちの２つの比は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、１：１０００、１：９００、１：８００、１：７００、１：６００、１：５００、１：４００、１：３００、１：２００、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、又は１０００：１である。例えば、第２のヌクレオチドのうちの２つは、約１：１００～約１００：１の範囲の比で第２の核酸に組み込まれ得る。

ヌクレオチドの修飾塩基及び未修飾塩基は、異なる実施形態において異なる比率で第２の核酸１２０ｃに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの修飾塩基及び未修飾塩基を、１：１０００、１：９００、１：８００、１：７００、１：６００、１：５００、１：４００、１：３００、１：２００、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い比で第２の核酸１２０ｃに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの修飾塩基及び未修飾塩基を、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、１：１０００、１：９００、１：８００、１：７００、１：６００、１：５００、１：４００、１：３００、１：２００、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、又は１０００：１の比で第２の核酸に組み込むことができる。例えば、ヌクレオチドの修飾塩基及び未修飾塩基は、約１：１００～約１００：１の範囲の比で第２の核酸に組み込まれ得る。修飾塩基は、第１の修飾塩基及び／又は第２の核酸に組み込まれた複数の第２のヌクレオチドのうちの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１，０００）、又はそれぞれの塩基を含むことができる。未修飾塩基は、第２の核酸に組み込まれた複数の第２のヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、又はそれぞれの塩基を含むことができる。

修飾塩基を含む第２の核酸１２０ｓのヌクレオチド塩基のパーセンテージは、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、修飾塩基（又は未修飾塩基）を含む第２の核酸のヌクレオチド塩基の割合は、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、修飾塩基（又は未修飾塩基）を含む第２の核酸のヌクレオチド塩基の割合は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．９％である。例えば、第２の核酸のヌクレオチド塩基の少なくとも１％は、修飾塩基を含む。例えば、第２の核酸のヌクレオチド塩基の少なくとも１％は、第１の修飾塩基を含む。修飾塩基は、第２の核酸全体に分配され得る。修飾塩基は、第２の核酸全体にわたってランダムに分布することができる。

第２の核酸１２０ｃは、連続修飾（又は未修飾塩基）の多数の領域を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の核酸１２０ｃ中の連続する修飾（又は未修飾塩基）の領域の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、第２の核酸１２０ｃ中の連続する修飾（又は未修飾塩基）の領域の数は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、又は１００００である。第２の核酸１２０ｃ中の連続修飾（又は未修飾塩基）の領域の長さは、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、第２の核酸中の連続修飾（又は未修飾塩基）の領域の長さは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、第２の核酸中の連続修飾（又は未修飾塩基）の領域の長さは、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、又は１００００である。例えば、第２の核酸１２０ｃは、２つ以上、又は３つ以上の連続した修飾塩基等の複数の連続した修飾塩基を含むことができる。

キャリア
図１を参照すると、第１の核酸１０４は、核酸鋳型１２８に結合する（例えば、ハイブリダイズする）ことができる鋳型捕捉部位１０４ｔｃｓを含むことができる。鋳型捕捉部位１０４ｔｃｓは、鋳型捕捉配列を含むことができる。核酸鋳型１２８は、鋳型捕捉配列にハイブリダイズすることができる配列を含むことができる。鋳型捕捉配列及び鋳型捕捉配列の逆相補体にハイブリダイズすることができる核酸鋳型１２８の配列は、異なる実施形態において異なる配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、鋳型捕捉配列及び鋳型捕捉配列の逆相補体にハイブリダイズすることができる核酸鋳型の配列は、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、鋳型捕捉配列及び鋳型捕捉配列の逆相補体にハイブリダイズすることができる核酸鋳型の配列は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、多くとも約、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。例えば、核酸鋳型１２８は、鋳型捕捉の逆相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むことができる。核酸鋳型１２８は、一本鎖ＤＮＡ等の一本鎖核酸を含むことができる。

いくつかの実施形態では、第２の核酸１２０ｓに組み込まれた第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍ及び第１のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍの第１の修飾塩基のうちの１つ又は複数は、官能基１０８ｆｍを含む。第１の修飾塩基の官能基１０８ｆｍは、クリック化学反応に関与することができる。第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍの第１の修飾塩基及び第２の核酸１２０ｓの第１のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍは、第１の、飽和又は不飽和、置換又は非置換の直鎖又は分岐脂肪族炭素鎖を含むことができる。第１の修飾塩基の官能基及び塩基は、第１の、飽和又は不飽和、置換又は非置換の直鎖又は分岐脂肪族炭素鎖によって共有結合された第１の修飾塩基の２つの末端にあり得る。例えば、第１のヌクレオシド三リン酸は、５－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサ－ペンタデカノイル－アミノアリル）－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸（アジド－ＰＥＧ４－アミノアリル－ｄＵＴＰ）又はＮ６－（６－アジド）ヘキシル－２’デオキシ－アデノシン－５’－三リン酸（Ｎ^６－（６－アジド）ヘキシル－ｄＡＴＰ）とすることができる。

第２のヌクレオシド三リン酸の第２の修飾塩基及び第２の核酸１２０ｓに組み込まれた第２のヌクレオチドのうちの１つ又は複数は、官能基を含むことができる。第２の修飾塩基の官能基は、クリック化学反応に関与することができる。第２のヌクレオシド三リン酸の第２の修飾塩基及び第２の核酸１２０ｓの第２のヌクレオチドは、第２の、飽和又は不飽和、置換又は非置換の直鎖又は分岐脂肪族炭素鎖を含むことができる。第２の修飾塩基の官能基及び塩基は、第２の、飽和又は不飽和、置換又は非置換の直鎖又は分岐脂肪族炭素鎖によって共有結合された第２の修飾塩基の２つの末端にあり得る。

脂肪族炭素鎖は、修飾塩基（例えば、第２の核酸１２０ｓ中の第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍ及び第１のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍの第１の修飾塩基、又は第２の核酸１２０ｓ中の第２のヌクレオシド三リン酸及び第２のヌクレオチドの第２の修飾塩基）の塩基に共有結合（例えば、単結合、二重結合、若しくは三重結合、又は共役）することができる。官能基（例えば、第１の官能基１０８ｆｍ又は第２の官能基）は、単結合、二重結合、又は三重結合によって脂肪族炭素鎖に共有結合することができる。

脂肪族炭素鎖は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、脂肪族炭素鎖は飽和である。いくつかの実施形態では、脂肪族炭素鎖は不飽和である。いくつかの実施形態では、脂肪族炭素鎖は置換されている。いくつかの実施形態では、脂肪族炭素鎖は、非置換である。いくつかの実施形態では、脂肪族炭素鎖は、直鎖である。いくつかの実施形態では、脂肪族炭素鎖は、分岐状である。いくつかの実施形態では、脂肪族炭素鎖の長さは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、脂肪族炭素鎖の長さは、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００である。脂肪族炭素鎖は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い、エチレングリコール（－ＯＣＨ_２ＣＨ_２－）繰返し単位の数、ｎを有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、少なくとも、少なくとも約、又は多くとも、又は多くとも約、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００の、エチレングリコール（－ＯＣＨ_２ＣＨ_２－）繰返し単位の数、ｎを有する。

第２の核酸１２０ｓに組み込まれた、第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍ及び第１のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍの第１の修飾塩基の１０８ｆｍの官能基並びに第２の核酸１２０ｓに組み込まれた、第２のヌクレオシド三リン酸及び第２のヌクレオチドの第２の修飾塩基の官能基は、同一であっても異なっていてもよい。第２の核酸１２０ｓに組み込まれた複数の第２のヌクレオシド三リン酸及び第２のヌクレオチドのうちの２つの修飾塩基の官能基は、同一であっても異なっていてもよい。第２の核酸１２０ｓに組み込まれた複数の第２のヌクレオシド三リン酸及び第２のヌクレオチドのうちの全ての修飾塩基の官能基は、同一であっても異なっていてもよい。

方法は、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１（例えば、Ｐ５アダプタオリゴヌクレオチド）、又は第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１を含む第１のアクセサリーを提供することを含む。この方法は、作用１１６ｃで、第２の反応において第２の温度で第２の反応時間、第２の核酸１２０ｓを第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１と接触させて、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１の１つ又は複数に付着した第２の核酸１２０ｃを含む第３の核酸１２０ｃ（例えば、キャリア）を生成することを含むことができる。

いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１を提供することは、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１及び第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２（例えば、Ｐ７アダプタオリゴヌクレオチド）、又は第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２を含む第２のアクセサリーを提供することを含む。第２の核酸１２０ｓを第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１と接触させることは、第２の反応において第２の温度で第２の反応時間、第２の核酸１２０ｓを第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１及び第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２と接触させて、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１の１つ又は複数及び第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２の１つ又は複数に付着した第２の核酸１２０ｓを含む第３の核酸１２０ｃを生成することを含むことができる。

いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドを提供することは、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１及び第１のポリマーを含む第１のアクセサリーを提供することを含む。第２の核酸１２０ｓを第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１と接触させることは、第２の反応において第２の温度で第２の反応時間、第２の核酸１２０ｓを第１のアクセサリーと接触させて、第１のアクセサリーの１つ又は複数に付着した第２の核酸１２０ｓを含む第３の核酸１２０ｃを生成することを含むことができる。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２を提供することは、第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２及び第２のポリマーを含む第２のアクセサリーを提供することを含むことができる。第２の核酸１２０ｓを第２のアクセサリーと接触させることは、第２の反応において第２の温度で第２の反応時間、第２の核酸１２０ｓ及び第２のアクセサリーを接触させて、第２のアクセサリーの１つ又は複数に付着した第２の核酸１２０ｓを含む第３の核酸１２０ｃを生成することを含むことができる。第１のアクセサリーは、共有結合した、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１及び第１のポリマーを含むことができる。第２のアクセサリーは、共有結合した、第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２及び第２のポリマーを含むことができる。

任意のアクセサリーオリゴヌクレオチドが付着している又は付着していない第３の核酸１２８ｃ（又は本開示の任意の核酸）の寸法（例えば、直径）は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、第３の核酸（又は本開示の任意の核酸）の寸法は、０．４ｎｍ、０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１０００ｎｍ、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、第３の核酸（又は本開示の任意の核酸）の寸法は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、０．０４ｎｍ、０．０５ｎｍ、０．０６ｎｍ、０．０７ｎｍ、０．０８ｎｍ、０．０９ｎｍ、０．１ｎｍ、０．２ｎｍ、０．３ｎｍ、０．４ｎｍ、０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、又は１０００ｎｍである。

いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２は、第１のアダプタ配列１２４ａｓ１、又はその逆相補体を含む。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドは、第２のアダプタ配列１２４ａｓ２、又はその逆相補体を含むことができる。いくつかの実施形態において、第１のアダプタ配列はＰ５配列を含む。第２のアダプタ配列は、Ｐ７配列を含むことができる。

本開示の第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド（例えば、第１のヌクレオチド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍ中の第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１又は第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド）、第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド（例えば、第２のヌクレオチド三リン酸中の第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２又は第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド）、又は任意のオリゴヌクレオチドの長さは、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド（又は第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド、又は本開示の任意のオリゴヌクレオチド）の長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又はこれらの値、ヌクレオチドのいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド（又は第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド、又は本開示の任意のオリゴヌクレオチド）の長さは、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００ヌクレオチドである。例えば、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び／又は第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドは各々、約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド長とすることができる。

第３の核酸１２０ｃは、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１のうちの１つ又は複数に付着した第２の核酸１２０ｓを含むことができる。第３の核酸１２０ｃは、第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドのうちの１つ又は複数に付着した第２の核酸１２０ｓを含むことができる。第３の核酸１２０ｃは、異なる実施形態では、異なる数の第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド、又は第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、第３の核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、２００００００、３００００００、４００００００、５００００００、６００００００、７００００００、８００００００、９００００００、１０００００００、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド、又は第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドを含むか、又は含む。いくつかの実施形態では、第３の核酸は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、２００００００、３００００００、４００００００、５００００００、６００００００、７００００００、８００００００、９００００００、又は１０００００００の第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド、又は第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドを含む。例えば、第３の核酸は、約１０～約１００００００の第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドを含むことができる。例えば、第３の核酸は、約１０～約１，０００，０００の第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドを含むことができる。

いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドを提供することは、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び第１のポリマーを含む第１のアクセサリーを提供することを含む。第２の核酸を第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドと接触させることは、第２の反応において第２の温度で第２の反応時間、第２の核酸を第１のアクセサリーと接触させて、第１のアクセサリーの１つ又は複数に付着した第２の核酸を含む第３の核酸を生成することを含むことができる。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドを提供することは、第２のポリマーと共に第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドを含む第２のアクセサリーを提供することを含むことができる。第２の核酸を第２のアクセサリーと接触させることは、第２の反応において第２の温度で第２の反応時間、第２の核酸及び第２のアクセサリーを接触させて、第２のアクセサリーの１つ又は複数に付着した第２の核酸を含む第３の核酸を生成することを含むことができる。第１のアクセサリーは、共有結合した、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び第１のポリマーを含むことができる。第２のアクセサリーは、共有結合した、第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び第２のポリマーを含むことができる。

図１を参照すると、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１は、第１の官能基１２４ｆｍ１を含む。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２は、第２の官能基１２４ｆｍ２を含むことができる。第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１の第１の官能基１２４ｆｍ１は、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１の５’末端にあり得る。第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１の第１の官能基１２４ｆｍ１は、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１のヌクレオチド間結合に付着することができる。第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの修飾塩基は、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１の第１の官能基１２４ｆｍ１を含むことができる。第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１の第１の官能基１２４ｆｍ１は、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１のヌクレオチドの糖に付着することができる。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２の第２の官能基１２４ｆｍ２は、第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２の５’末端にあり得る。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２の第２の官能基１２４ｆｍ２は、第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２のヌクレオチド間結合に付着することができる。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの修飾塩基は、第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２の第２の官能基１２４ｆｍ２を含むことができる。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２の第２の官能基１２４ｆｍ２は、第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２のヌクレオチドの糖に付着することができる。

いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１の第１の官能基１２４ｆｍ１及び第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２の第２の官能基１２４ｆｍ２は、同一である。第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１の第１の官能基１２４ｆｍ１は、第１のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍの第１の修飾塩基の官能基１０８ｆｍと反応して共有結合を形成することができる。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２の第２の官能基１２４ｆｍ２は、第１のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍの第１の修飾塩基の官能基１０８ｆｍと反応して共有結合を形成することができる。第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１の第１の官能基１２４ｆｍ１は、第２のヌクレオチドの第２の修飾塩基の官能基と反応して共有結合を形成することができる。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２の第２の官能基１２４ｆｍ２は、第２のヌクレオチドの第２の修飾塩基の官能基と反応して共有結合を形成することができる。

いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１の第１の官能基１２４ｆｍ１は、クリック化学反応に関与することができる。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２の第２の官能基１２４ｆｍ２は、クリック化学反応に関与することができる。いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１の第１の官能基１２４ｆｍ１は、第２の核酸に組み込まれた第１のヌクレオチド１２８ｎｔ＿ｍの第１の修飾塩基の官能基１０８ｆｍ（又は第２のヌクレオチドの第２の修飾塩基の官能基）とのクリック化学反応に関与することができる。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２の第２の官能基１２４ｆｍ２は、第１のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍの第１の修飾塩基の官能基１０８ｆｍ（又は第２のヌクレオチドの第２の修飾塩基の官能基）とのクリック化学反応に関与することができる。

いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１の第１の官能基１２４ｆｍ１、第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１の第２の官能基１２４ｆｍ２、第１のヌクレオシド三リン酸１０８ｎｓｔ＿ｍの第１の修飾塩基の官能基１０８ｆｍ、第１のヌクレオチド１０８ｎｔ＿ｍの官能基１０８ｆｍ、第２のヌクレオシド三リン酸の第２の修飾塩基の官能基、及び第２のヌクレオチドの官能基は、独立して、アジド、アルキニル、アルケニル、チオール、ニトロン、又はそれらの組合わせである。第１のヌクレオチドの第１の修飾塩基の官能基及び第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドの第１の官能基、第１のヌクレオチドの第１の修飾塩基の官能基及び第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドの第２の官能基、第２のヌクレオチドの第２の修飾塩基の官能基及び第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドの第１の官能基、及び／又は第２のヌクレオチドの第２の修飾塩基の官能基及び第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドの第２の官能基は、以下の対から独立して選択することができる。（ｉ）アジド／アルキニル、（ｉｉ）アルキニル／アジド、（ｉｉｉ）チオール／アルキニル、（ｉｖ）アルキニル／チオール、（ｖ）アルケニル／チオール、（ｖｉ）チオール／アルケニル、（ｖｉｉ）アジド／シクロオクチニル、（ｖｉｉｉ）シクロオクチニル／アジド；（ｉｘ）ニトロン／シクロオクチニル、及び（ｘ）シクロオクチニル／ニトロン。例えば、第１のヌクレオチドの第１の修飾塩基の官能基及び／又は第２のヌクレオチドの第２の修飾塩基の官能基は、独立してアジドとすることができる。第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドの第１の官能基及び／又は第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドの第２の官能基は、独立してアルキニルとすることができる。

いくつかの実施形態では、クリック化学反応は、銅触媒アジド－アルキン環付加（ＣｕＡＡＣ）を含む。共有結合は、トリアゾリルを含むことができる。ＣｕＡＡＣは、Ｃｕ（Ｉ）安定化リガンドを含むことができる。Ｃｕ（Ｉ）安定化リガンドは、３－［４－（｛ビス［（１－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－１，２，３トリアゾール－４－イル）メチル］アミノ｝メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル］プロパノール（ＢＴＴＰ）、３－［４－（｛ビス［（１－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－１，２，３トリアゾール－４－イル）メチル］アミノ｝メチル）－１Ｈ－１，２，３トリアゾール－１－イル］プロピル硫酸水素（ＢＴＴＰＳ）、２－［４－（｛ビス［（１－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミノ｝メチル）－１Ｈ－１，２，３トリアゾール－１－イル］エチル硫酸水素（ＢＴＴＥＳ）、２－［４－｛（ビス［（１－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミノ）メチル｝－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル］－酢酸（ＢＴＴＡＡ）、バソフェナントロリンジスルホネート二ナトリウム塩（ＢＰＳ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）、トリス－（（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）アミン（ＴＢＴＡ）、トリス（３－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）、Ｎ^ε－（（（１Ｒ，２Ｒ）－２－アジドシクロペンチルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン（ＡＣＰＫ）、及び４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ－１，８－ナフタルイミド（４－ＤＭＮ）からなる群から選択することができる。

いくつかの実施形態では、クリック化学反応は、菌株促進アジド－アルキン環付加（ＳＰＡＡＣ）を含む。共有結合は、シクロオクタ－トリアゾリルを含むことができる。いくつかの実施形態では、クリック化学反応は、アルキンヒドロチオール化を含む。共有結合は、アルケニルスルフィドを含むことができる。いくつかの実施形態では、クリック化学反応は、アルケンヒドロチオール化を含む。共有結合は、硫化アルキルを含むことができる。いくつかの実施形態では、クリック化学反応は、菌株促進アルキン－ニトロン環付加（ＳＰＡＮＣ）を含む。共有結合は、オクタヒドロシクロオクタ－イソオキサゾリルを含むことができる。シクロオクチニルは、ジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）又はその誘導体とすることができる。いくつかの実施形態では、クリック化学反応は生体適合性である。

相互作用１１６ｃで第２の反応において第２の核酸１２０ｓが第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１及び／又は第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２と接触する第２の温度は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、第２の温度は、－９０℃、－８９℃、－８８℃、－８７℃、－８６℃、－８５℃、－８４℃、－８３℃、－８２℃、－８１℃、－８０℃、－７９℃、－７８℃、－７７℃、－７６℃、－７５℃、－７４℃、－７３℃、－７２℃、－７１℃、－７０℃、－６９℃、－６８℃、－６７℃、－６６℃、－６５℃、－６４℃、－６３℃、－６２℃、－６１℃、－６０℃、－５９℃、－５８℃、－５７℃、－５６℃、－５５℃、－５４℃、－５３℃、－５２℃、－５１℃、－５０℃、－４９℃、－４８℃、－４７℃、－４６℃、－４５℃、－４４℃、－４３℃、－４２℃、－４１℃、－４０℃、－３９℃、－３８℃、－３７℃、－３６℃、－３５℃、－３４℃、－３３℃、－３２℃、－３１℃、－３０℃、－２９℃、－２８℃、－２７℃、－２６℃、－２５℃、－２４℃、－２３℃、－２２℃、－２１℃、－２０℃、－１９℃、－１８℃、－１７℃、－１６℃、－１５℃、－１４℃、－１３℃、－１２℃、－１１℃、－１０℃、－９℃、－８℃、－７℃、－６℃、－５℃、－４℃、－３℃、－２℃、－１℃、０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態では、第２の温度は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、－９０℃、－８９℃、－８８℃、－８７℃、－８６℃、－８５℃、－８４℃、－８３℃、－８２℃、－８１℃、－８０℃、－７９℃、－７８℃、－７７℃、－７６℃、－７５℃、－７４℃、－７３℃、－７２℃、－７１℃、－７０℃、－６９℃、－６８℃、－６７℃、－６６℃、－６５℃、－６４℃、－６３℃、－６２℃、－６１℃、－６０℃、－５９℃、－５８℃、－５７℃、－５６℃、－５５℃、－５４℃、－５３℃、－５２℃、－５１℃、－５０℃、－４９℃、－４８℃、－４７℃、－４６℃、－４５℃、－４４℃、－４３℃、－４２℃、－４１℃、－４０℃、－３９℃、－３８℃、－３７℃、－３６℃、－３５℃、－３４℃、－３３℃、－３２℃、－３１℃、－３０℃、－２９℃、－２８℃、－２７℃、－２６℃、－２５℃、－２４℃、－２３℃、－２２℃、－２１℃、－２０℃、－１９℃、－１８℃、－１７℃、－１６℃、－１５℃、－１４℃、－１３℃、－１２℃、－１１℃、－１０℃、－９℃、－８℃、－７℃、－６℃、－５℃、－４℃、－３℃、－２℃、－１℃、０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、又は９０℃である。例えば、第２の温度は、約２０℃～約６５℃である。例えば、第２の温度は、０℃未満とすることができる。例えば、第２の温度は、約－４℃～約－２０℃であり得る。

相互作用１１６ｃで第２の反応において第２の核酸１２０ｓが第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１及び／又は第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２と接触する第２の反応時間は、異なる実施形態では異なり得る。例えば、第２の反応時間は、少なくとも１０分である（分）。いくつかの実施形態において、第２の反応時間（又は本開示の任意の反応時間）は、１秒、２秒、３秒、４秒、５秒、６秒、７秒、８秒、９秒、１０秒、１１秒、１２秒、１３秒、１４秒、１５秒、１６秒、１７秒、１８秒、１９秒、２０秒、２１秒、２２秒、２３秒、２４秒、２５秒、２６秒、２７秒、２８秒、２９秒、３０秒、３１秒、３２秒、３３秒、３４秒、３５秒、３６秒、３７秒、３８秒、３９秒、４０秒、４１秒、４２秒、４３秒、４４秒、４５秒、４６秒、４７秒、４８秒、４９秒、５０秒、５１秒、５２秒、５３秒、５４秒、５５秒、５６秒、５７秒、５８秒、５９秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、３１分、３２分、３３分、３４分、３５分、３６分、３７分、３８分、３９分、４０分、４１分、４２分、４３分、４４分、４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、５１分、５２分、５３分、５４分、５５分、５６分、５７分、５８分、５９分、６０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施形態において、第２の反応時間（又は本開示の任意の反応時間）は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、１秒、２秒、３秒、４秒、５秒、６秒、７秒、８秒、９秒、１０秒、１１秒、１２秒、１３秒、１４秒、１５秒、１６秒、１７秒、１８秒、１９秒、２０秒、２１秒、２２秒、２３秒、２４秒、２５秒、２６秒、２７秒、２８秒、２９秒、３０秒、３１秒、３２秒、３３秒、３４秒、３５秒、３６秒、３７秒、３８秒、３９秒、４０秒、４１秒、４２秒、４３秒、４４秒、４５秒、４６秒、４７秒、４８秒、４９秒、５０秒、５１秒、５２秒、５３秒、５４秒、５５秒、５６秒、５７秒、５８秒、５９秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、３１分、３２分、３３分、３４分、３５分、３６分、３７分、３８分、３９分、４０分、４１分、４２分、４３分、４４分、４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、５１分、５２分、５３分、５４分、５５分、５６分、５７分、５８分、５９分、６０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲である。

図１を参照すると、方法は、第１のアダプタ配列１２４ａｓ１、又はその逆相補体、及び第２のアダプタ配列１２４ａｓ２、又はその逆相補体を含む核酸鋳型１２８を提供することを含むことができる。方法は、第３の核酸１２０ｃを核酸鋳型１２８と接触させて、作用１１６ｃで第３の核酸１２０ｃ上の鋳型捕捉部位１０４ｔｃｓにハイブリダイズする核酸鋳型１２８を用いて第３の核酸１２０ｃを生成することを含むことができる。この方法は、作用１１６ｄで、核酸鋳型１２８とハイブリダイズした第３の核酸１２０ｃに対して増幅（例えば、ブリッジ増幅又は排除増幅）を実施して、核酸鋳型１２８の配列又はその逆相補体を含むように伸長された１つ又は複数の第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１及び１つ又は複数の第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２に付着した第３の核酸１２０ｃを含む第４の核酸１２０ｎ（本明細書ではナノ粒子と呼ばれる）を生成することを含むことができる。方法は、第４の核酸１２０ｎを使用して核酸鋳型１２８の配列を決定することを含むことができる。

ナノ粒子１２０ｎ（又は第２の核酸１２０ｓ、例えば足場、又は第３の核酸１２０ｃ、例えば担体）の寸法（例えば、直径）は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施態様では、ナノ粒子（又は第２の核酸、又は第３の核酸）の寸法は、０．４ｎｍ、０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１０００ｎｍ、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い。いくつかの実施態様では、ナノ粒子（又は第２の核酸、又は第３の核酸）の寸法は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、０．４ｎｍ、０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、又は１０００ｎｍである。十分な空間的寸法を有するナノ粒子は、立体的衝突又は障害によって、他のナノ粒子が同じウェルを占有することを排除することによって、基材上の単一ウェル（例えば、フローセル）を占有することができ、したがって、合成による配列決定において単クローン性又は単クローン性に近いものをもたらす。

ポリマー
いくつかの実施形態では、ｓｓＤＮＡ足場１２０ｓを第１のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１と接触させることは、ｓｓＤＮＡ足場を第１のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１及び第１のポリマーを含む第１のアダプタと接触させることを含む。ｓｓＤＮＡ足場１２０ｓを第２のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２と接触させることは、ｓｓＤＮＡ足場を第２のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２及び第２のポリマーを含む第２のアダプタと接触させることを含むことができる。第１のアダプタは、共有結合した、第１のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１及び第１のポリマーを含むことができる。第２のアダプタは、共有結合した、第２のアダプタオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２及び第２のポリマーを含むことができる。いくつかの実施形態では、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドを提供することは、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１及び第１のポリマーを含む第１のアクセサリーを提供することを含む。第２の核酸１２０ｓを第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１と接触させることは、第２の反応において第２の温度で第２の反応時間、第２の核酸１２０ｓを第１のアクセサリーと接触させて、第１のアクセサリーの１つ又は複数に付着した第２の核酸１２０ｓを含む第３の核酸１２０ｃを生成することを含むことができる。第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２を提供することは、第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２及び第２のポリマーを含む第２のアクセサリーを提供することを含むことができる。第２の核酸１２０ｓを第２のアクセサリーと接触させることは、第２の反応において第２の温度で第２の反応時間、第２の核酸１２０ｓ及び第２のアクセサリーを接触させて、第２のアクセサリーの１つ又は複数に付着した第２の核酸１２０ｓを含む第３の核酸１２０ｃを生成することを含むことができる。第１のアクセサリーは、共有結合した、第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１及び第１のポリマーを含むことができる。第２のアクセサリーは、共有結合した、第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ２及び第２のポリマーを含むことができる。

いくつかの実施形態では、第１の核酸（例えば、一本鎖ＤＮＡ鎖１０４）、第２の核酸（例えば、足場１２０ｓ）、第３の核酸（例えば、担体１２０ｃ）、及び／又は第４の核酸（例えば、ナノ粒子１２０ｎ）は、第３のポリマーを含む。第１の核酸、第２の核酸、第３の核酸及び／又は第４の核酸は各々、１つ又は複数の第３のポリマーを含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の核酸、第２の核酸、第３の核酸及び／又は第４の核酸はそれぞれ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い、第３のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸、第２の核酸、第３の核酸及び／又は第４の核酸はそれぞれ、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００の第３のポリマーを含む。

いくつかの実施形態では、ポリマー（例えば、第１のアダプタ又は第１のアクセサリーの第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１に共有結合した第１のポリマー、あるいは第２のアダプタ若しくは第２のアクセサリーの第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド１２４ａｏ１に共有結合した第２のポリマー、あるいは第１の核酸、第２の核酸、第３の核酸、及び／又は第４の核酸の第３のポリマー）は、１つの繰返し単位を有するホモポリマーとすることができる。例えば、ポリマーは、別の例としてポリスチレンを含むことができ、ポリマーは、ポリ（ジメチルシロキサン）を含むことができる。例えば、ポリマーは、ポリエチレンテレフタレートを含むことができる。別の例として、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリマーは、２つ以上の異なる繰り返し単位（２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の異なる繰り返し単位等）を有するヘテロポリマー（コポリマーとしても知られている）とすることができる。いくつかの実施形態では、ポリマーの繰返し単位は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲であるか、あるいはそれらに近い繰返し単位の数、ｎを有することができる。

ある例では、使用されるポリマーとしては、ＰＡＺＡＭとしても知られているポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－コ－アクリルアミド）、

等の例を挙げることができ、式中、ｎは、１～２０，０００の範囲の整数であり、ｍは、１～１００，０００の範囲の整数である。

いくつかの例では、アクリルアミドモノマーは、アジドアセトアミドペンチルアクリルアミドモノマー

を含んでいてもよい。いくつかの例では、アクリルアミドモノマーは、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド

を含んでもよい。

「ヘテロポリマー」は、少なくとも２つの異なる繰り返しサブユニット（モノマー）の大分子である。「アクリルアミドモノマー」は、構造

又はその置換された類似体（例えば、メタクリルアミド又はＮ－イソプロピルアクリルアミド）を有するモノマーである。アクリルアミド基及びアジド基を含むモノマーの例は、上に示すアジドアセトアミドペンチルアクリルアミドである。「アルキル」は、完全に飽和している（すなわち、二重結合も三重結合も含有しない）直鎖又は分岐炭化水素鎖を指す。例示的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、及び三級ブチルが挙げられる。例として、表記「Ｃ_１～４アルキル」は、アルキル鎖中に１～４個の炭素原子が存在すること、すなわち、アルキル鎖が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、及びｔ－ブチルからなる群から選択されることを示す。

例では、ポリマーはヘテロポリマーであってもよく、ヘテロポリマーは、

又はその置換された類似体等のアクリルアミドモノマーを含んでもよい（「置換された」とは、指定の基における１つ又は複数の水素原子の別の原子又は基による置換を指す）。例では、ポリマーはヘテロポリマーであり、アジド含有アクリルアミドモノマーを更に含んでいてもよい。いくつかの態様では、ヘテロポリマーは、

及び任意に

を含み、式中、各Ｒ^ｚは、独立して、Ｈ又はＣ_１～４アルキルである。

いくつかの態様では、ヘテロポリマーは、以下の構造を含むことができ、

式中、ｘは、１～２０，０００の範囲の整数であり、ｙは、１～１００，０００の範囲の整数であるか、又は

であり、式中、ｙは１～２０，０００の範囲の整数であり、ｘ及びｚは整数であり、ｘ及びｚの合計は、１～１００，０００の範囲内であり得、各Ｒ^ｚは、独立して、Ｈ又はＣ_１～４アルキルであり、ｘ：ｙの比は、それぞれ、約１０：９０～約１：９９であり得るか、又は約５：９５であり得、あるいは（ｘ：ｙ）：ｚは、約８５：１５～約９５：５であり得るか、又は約９０：１０であり得（式中、ｘ：（ｙ：ｚ）は、約１：（９９）～約１０：（９０）、又は約５：（９５））であり得る。これらの例では、「約」は、あるものの相対量が、列挙された比で記載された量と最大５％異なっていてもよいことを意味する。

核酸産物
本明細書に開示されるのは、本開示の核酸を修飾する任意の方法によって得られる第２の核酸（例えば、足場１２０ｓ）の実施形態を含む。本明細書に開示されるのは、本開示の核酸を修飾する任意の方法によって得られる第３の核酸（例えば、担体１２０ｃ）の実施形態を含む。本明細書に開示されるのは、本開示の核酸を修飾する任意の方法によって得られる第４の核酸（例えば、ナノ粒子１２０ｎ）の実施形態を含む。

組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
配列
いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも９０％同一であり得るアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１１と少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１２と少なくとも８０％同一であり得るアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、ウシ若しくはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ（例えば、配列番号１２）と、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％あるいはそれらに近い同一性であるアミノ酸配列、又はそれらの断片（例えば、配列番号１２）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、ウシ若しくはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ（例えば、配列番号１２）と、少なくとも、少なくとも約、多くとも、若しくは多くとも約、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲同一であるアミノ酸配列、又はその断片（例えば、配列番号１２）を含む。例えば、組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも９０％同一であり得るアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１と少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、組換えＴｄＴは、ウシ又はＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴの断片に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、例えばＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのアミノ酸１３９～５２０（例えば、配列番号１）を含む。図２は、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのアミノ酸１３９～５２０の配列を示す。例えば、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）は、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、ウシ若しくはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのバリアント、又はウシ若しくはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ断片（例えば、配列番号１１）のバリアントと配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、組換えＴｄＴは、配列番号１１と少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含むことができる。

置換変異
組換えＴｄＴは、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の１つ又は複数の位置に１つ又は複数のアミノ酸置換変異（例えば、配列番号１２）を含むことができる。各アミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン又はバリンへのアミノ酸置換変異とすることができる。

各アミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、親水性アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸への置換変異とすることができる。非極性アミノ酸は、例えば、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、又はバリンとすることができる。極性アミノ酸は、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、又はチロシンとすることができる。極性アミノ酸は、例えば、酸性極性アミノ酸、塩基性極性アミノ酸、又は非酸性非塩基性極性アミノ酸とすることができる。塩基性極性アミノ酸又は正電荷アミノ酸は、例えば、アルギニン、ヒスチジン、又はリジンとすることができる。酸性アミノ酸又は負電荷アミノ酸は、例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸とすることができる。非酸性非塩基性アミノ酸は、例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、又はチロシンとすることができる。疎水性アミノ酸は、例えば、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンとすることができる。芳香族アミノ酸は、例えば、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、又はチロシンとすることができる。脂肪族（非芳香族）アミノ酸は、例えば、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、又はバリンとすることができる。小アミノ酸は、例えば、アラニン、グリシン、プロリン、又はセリンとすることができる。親水性アミノ酸は、例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、又はトレオニンとすることができる。分岐鎖アミノ酸は、例えば、イソロイシン、ロイシン、バリンとすることができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異への変異を含む。Ｇｌｕ１９１と機能的に同等の位置でのアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９１Ａｌａ、Ｇｌｕ１９１Ａｒｇ、Ｇｌｕ１９１Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９１Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９１Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１９１Ｇｌｎ、Ｇｌｕ１９１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ１９１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９１Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１９１Ｍｅｔ、Ｇｌｕ１９１Ｐｈｅ、Ｇｌｕ１９１Ｐｒｏ、Ｇｌｕ１９１Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１９１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９１Ｔｒｐ、Ｇｌｕ１９１Ｔｙｒ、又はＧｌｕ１９１Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９１Ａｌａ、Ｇｌｕ１９１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９１Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９１Ｍｅｔ、又はＧｌｕ１９１Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９１Ｖａｌとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号２に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アスパラギン、グルタミン、セリン又はトレオニンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ１９３Ａｌａ、Ｌｙｓ１９３Ａｒｇ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｃｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｙ、Ｌｙｓ１９３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１９３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ１９３Ｌｅｕ、Ｌｙｓ１９３Ｍｅｔ、Ｌｙｓ１９３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ１９３Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１９３Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１９３Ｔｒｐ、Ｌｙｓ１９３Ｔｙｒ、ｏｒ Ｌｙｓ１９３Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、又はＬｙｓ１９３Ｔｈｒとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号３に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９４Ａｌａ、Ｇｌｕ１９４Ａｒｇ、Ｇｌｕ１９４Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９４Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ１９４Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９４Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１９４Ｍｅｔ、Ｇｌｕ１９４Ｐｈｅ、Ｇｌｕ１９４Ｐｒｏ、Ｇｌｕ１９４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１９４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９４Ｔｒｐ、Ｇｌｕ１９４Ｔｙｒ、又はＧｌｕ１９４Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９４Ａｌａ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９４Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９４Ｍｅｔ、又はＧｌｕ１９４Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号４に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸又は芳香族アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン又はチロシンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ａｓｐ２４２Ａｌａ、Ａｓｐ２４２Ａｒｇ、Ａｓｐ２４２Ａｓｎ、Ａｓｐ２４２Ｃｙｓ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｎ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｕ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｈｉｓ、Ａｓｐ２４２Ｉｌｅ、Ａｓｐ２４２Ｌｅｕ、Ａｓｐ２４２Ｌｙｓ、Ａｓｐ２４２Ｍｅｔ、Ａｓｐ２４２Ｐｈｅ、Ａｓｐ２４２Ｐｒｏ、Ａｓｐ２４２Ｓｅｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｈｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｒｐ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、又はＡｓｐ２４２Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ａｓｐ２４２Ａｓｎ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｎ、Ａｓｐ２４２Ｐｈｅ、Ａｓｐ２４２Ｓｅｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｈｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｒｐ、又はＡｓｐ２４２Ｔｙｒとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号５に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、負電荷アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アスパラギン酸又はグルタミン酸へのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ２８７Ａｌａ、Ｌｙｓ２８７Ａｒｇ、Ｌｙｓ２８７Ａｓｎ、Ｌｙｓ２８７Ａｓｐ、Ｌｙｓ２８７Ｃｙｓ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２８７Ｈｉｓ、Ｌｙｓ２８７Ｉｌｅ、Ｌｙｓ２８７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ２８７Ｍｅｔ、Ｌｙｓ２８７Ｐｈｅ、Ｌｙｓ２８７Ｐｒｏ、Ｌｙｓ２８７Ｓｅｒ、Ｌｙｓ２８７Ｔｈｒ、Ｌｙｓ２８７Ｔｒｐ、Ｌｙｓ２８７Ｔｙｒ、又はＬｙｓ２８７Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ２８７Ａｓｐ又はＬｙｓ２８７Ｇｌｕとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号６に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｐｈｅ２９６Ａｌａ、Ｐｈｅ２９６Ａｒｇ、Ｐｈｅ２９６Ａｓｎ、Ｐｈｅ２９６Ａｓｐ、Ｐｈｅ２９６Ｃｙｓ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｎ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｙ、Ｐｈｅ２９６Ｈｉｓ、Ｐｈｅ２９６Ｉｌｅ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｙｓ、Ｐｈｅ２９６Ｍｅｔ、Ｐｈｅ２９６Ｐｒｏ、Ｐｈｅ２９６Ｓｅｒ、Ｐｈｅ２９６Ｔｈｒ、Ｐｈｅ２９６Ｔｒｐ、Ｐｈｅ２９６Ｔｙｒ、又はＰｈｅ２９６Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｐｈｅ２９６Ａｌａ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｙ、Ｐｈｅ２９６Ｉｌｅ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２９６Ｍｅｔ、又はＰｈｅ２９６Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号７に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アルギニン、アルギニン、ヒスチジン、又はリジンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｍｅｔ２９９Ａｌａ、Ｍｅｔ２９９Ａｒｇ、Ｍｅｔ２９９Ａｓｎ、Ｍｅｔ２９９Ａｓｐ、Ｍｅｔ２９９Ｃｙｓ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｎ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｕ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｙ、Ｍｅｔ２９９Ｈｉｓ、Ｍｅｔ２９９Ｉｌｅ、Ｍｅｔ２９９Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｍｅｔ２９９Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２９９Ｐｒｏ、Ｍｅｔ２９９Ｓｅｒ、Ｍｅｔ２９９Ｔｈｒ、Ｍｅｔ２９９Ｔｒｐ、Ｍｅｔ２９９Ｔｙｒ、又はＭｅｔ２９９Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｍｅｔ２９９Ａｒｇ、Ｍｅｔ２９９Ｈｉｓ、又はＭｅｔ２９９Ｌｙｓとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号８に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アスパラギン、シスチン、グルタミン、プロリン、又はセリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｔｈｒ３４２Ａｌａ、Ｔｈｒ３４２Ａｒｇ、Ｔｈｒ３４２Ａｓｎ、Ｔｈｒ３４２Ａｓｐ、Ｔｈｒ３４２Ｃｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｎ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｕ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３４２Ｈｉｓ、Ｔｈｒ３４２Ｉｌｅ、Ｔｈｒ３４２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ３４２Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｍｅｔ、Ｔｈｒ３４２Ｐｈｅ、Ｔｈｒ３４２Ｐｒｏ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、Ｔｈｒ３４２Ｔｒｐ、Ｔｈｒ３４２Ｔｙｒ、又はＴｈｒ３４２Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｔｈｒ３４２Ａｓｎ、Ｔｈｒ３４２Ｃｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｎ、Ｔｈｒ３４２Ｐｒｏ、又はＴｈｒ３４２Ｓｅｒとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号９に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、極性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は親水性アミノ酸への変異を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、アスパラギン、シスチン、グルタミン、プロリン、セリン、又はトレオニンへのアミノ酸置換変異であり得る。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｈｉｓ４２１Ａｌａ、Ｈｉｓ４２１Ａｒｇ、Ｈｉｓ４２１Ａｓｎ、Ｈｉｓ４２１Ａｓｐ、Ｈｉｓ４２１Ｃｙｓ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｎ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｕ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｙ、Ｈｉｓ４２１Ｉｌｅ、Ｈｉｓ４２１Ｌｅｕ、Ｈｉｓ４２１Ｌｙｓ、Ｈｉｓ４２１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２１Ｐｈｅ、Ｈｉｓ４２１Ｐｒｏ、Ｈｉｓ４２１Ｓｅｒ、Ｈｉｓ４２１Ｔｈｒ、Ｈｉｓ４２１Ｔｒｐ、Ｈｉｓ４２１Ｔｙｒ、又はＨｉｓ４２１Ｖａｌとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｈｉｓ４２１Ａｓｎ、Ｈｉｓ４２１Ｃｙｓ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｎ、Ｈｉｓ４２１Ｐｒｏ、Ｈｉｓ４２１Ｓｅｒ、又はＨｉｓ４２１Ｔｈｒとすることができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｈｉｓ４２１Ｐｒｏとすることができる。組換えＴｄＴは、配列番号１０に対する配列同一性閾値を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の２つ以上の位置に２つ以上のアミノ酸置換変異を含む。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の３つ以上の位置に３つ以上のアミノ酸置換変異を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の４つ以上の位置に４つ以上のアミノ酸置換変異を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の５つ以上の位置に５つ以上のアミノ酸置換変異を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の６つ以上の位置に６つ以上のアミノ酸置換変異を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の７つ以上の位置に７つ以上のアミノ酸置換変異を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の８つ以上の位置に８つ以上のアミノ酸置換変異を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置に８つのアミノ酸置換変異を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置に９つのアミノ酸置換変異を含むことができる。

いくつかの実施形態では、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の２つ以上の位置における２つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの２つ以上を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の３つ以上の位置における３つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの３つ以上を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の４つ以上の位置における４つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの４つ以上を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の５つ以上の位置における５つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの５つ以上を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の６つ以上の位置における６つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの６つ以上を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の７つ以上の位置における７つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの７つ以上を含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の８つ以上の位置における８つ以上のアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏを含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置における８つのアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏを含むことができる。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の９つの位置における９つのアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏを含むことができる。

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の８つの位置に８つのアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の８つの位置における８つのアミノ酸置換変異は、それぞれＬｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏとすることができる。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置に９つのアミノ酸置換変異を含む。配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置における９つのアミノ酸置換変異は、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏとすることができる。

熱安定性
いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、４７℃以上の温度で安定である。組換えＴｄＴは、５０℃以上の温度で安定であり得る。組換えＴｄＴは、５５℃以上の温度で安定であり得る。組換えＴｄＴは、５８℃以上の温度で安定であり得る。

組換えＴｄＴは熱的に安定であり得る。組換えＴｄＴは、異なる実施形態では異なる温度で安定であり得る。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、又はこれに近い温度、あるいはこれらより高い温度で安定であり得る。例えば、組換えＴｄＴは、４７℃以上の温度で安定であり得る。組換えＴｄＴは、５０℃以上の温度で安定であり得る。組換えＴｄＴは、５５℃以上の温度で安定であり得る。組換えＴｄＴは、５８℃以上の温度で安定であり得る。組換えＴｄＴは、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲の温度で安定であり得る。

活性
いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性は、同じ試験温度における配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、又は１２０％である。試験温度は、３７℃、４７℃、５０℃、５５℃、又は５８℃とすることができる。

組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性は、ウシ若しくはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ又はその断片よりも高くても低くてもよい。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性は、同じ試験温度における、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ、又は配列番号１４の組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性の、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、１３０％、１３１％、１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、１４５％、１４６％、１４７％、１４８％、１４９％、１５０％、１５１％、１５２％、１５３％、１５４％、１５５％、１５６％、１５７％、１５８％、１５９％、１６０％、１６１％、１６２％、１６３％、１６４％、１６５％、１６６％、１６７％、１６８％、１６９％、１７０％、１７１％、１７２％、１７３％、１７４％、１７５％、１７６％、１７７％、１７８％、１７９％、１８０％、１８１％、１８２％、１８３％、１８４％、１８５％、１８６％、１８７％、１８８％、１８９％、１９０％、１９１％、１９２％、１９３％、１９４％、１９５％、１９６％、１９７％、１９８％、１９９％、２００％、又はそれらに近いか、あるいはそれらを超える。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性は、同じ試験温度における、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ、又は配列番号１４の組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性の、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、１３０％、１３１％、１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、１４５％、１４６％、１４７％、１４８％、１４９％、１５０％、１５１％、１５２％、１５３％、１５４％、１５５％、１５６％、１５７％、１５８％、１５９％、１６０％、１６１％、１６２％、１６３％、１６４％、１６５％、１６６％、１６７％、１６８％、１６９％、１７０％、１７１％、１７２％、１７３％、１７４％、１７５％、１７６％、１７７％、１７８％、１７９％、１８０％、１８１％、１８２％、１８３％、１８４％、１８５％、１８６％、１８７％、１８８％、１８９％、１９０％、１９１％、１９２％、１９３％、１９４％、１９５％、１９６％、１９７％、１９８％、１９９％、２００％、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲である。例えば、組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性は、同じ試験温度における、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ、又は配列番号１４の組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性の、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、又は１２０％であり得るか、又は少なくともそれらであり得る。

試験温度は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、試験温度は、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、又はこれに近い温度、あるいはこれらより高い温度である。例えば、試験温度は、３７℃、４７℃、５０℃、５５℃、又は５８℃とすることができる。いくつかの実施形態では、試験温度は、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲である。

追加の構成要素
いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、小さなユビキチン様修飾剤子（small ubiquitin-like modifier：ＳＵＭＯ）断片を含む。ＳＵＭＯ断片は、配列番号１３と少なくとも８０％同一であり得るアミノ酸配列を含む。組換えＴｄＴは、組換えＴｄＴのＮ末端にＳＵＭＯ断片を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１４と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことができる。組換えＴｄＴは、配列番号１５と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことができる。組換えＴｄＴは、組換えＴｄＴのＣ末端にＳＵＭＯ断片を含むことができる。

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、Ｈｉｓ－タグ又はグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ等の精製用タグを含む。精製用のタグは、組換えＴｄＴのＮ末端に、組換えＴｄＴのＣ末端に、又は組換えＴｄＴの内部にあり得る。組換えＴｄＴは、精製のためのタグと別の構成要素（例えば、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ断片）又は組換えＴｄＴの残りとの間にプロテアーゼ切断配列、例えばＬｅｕＶａｌＰｒｏＡｒｇ／ＧｌｙＳｅｒ（トロンビン切断部位）又はＬｅｕＧｌｕＶａｌＬｅｕＰｈｅＧｌｎ／ＧｌｙＰｒｏ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断部位）を含むことができる。

いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴは、小さなユビキチン様修飾剤（ＳＵＭＯ）タンパク質、又はその断片を含む。組換えＴｄＴにおけるＳＵＭＯタンパク質又はその断片の配列は、異なる実施形態において異なり得る。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴ中のＳＵＭＯタンパク質又はその断片は、ＳＵＭＯタンパク質（例えば、酵母におけるｍｉｆ ｔｗｏ３のサプレッサー、ＳＭＴ３）と、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、又はそれに近い同一性であるアミノ酸配列、あるいはその断片（例えば、配列番号１３のアミノ配列を含むＳＵＭＯ断片）を含む。例えば、組換えＴｄＴ中のＳＵＭＯ断片は、配列番号１３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、組換えＴｄＴ中のＳＵＭＯタンパク質又はその断片は、ＳＵＭＯタンパク質（例えば、酵母におけるｍｉｆ ｔｗｏ３のサプレッサー、ＳＭＴ３）と、少なくとも、少なくとも約、多くとも、又は多くとも約、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列、あるいはその断片（例えば、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＳＵＭＯ断片）を含む。

組換えＴｄＴにおけるＳＵＭＯ断片の位置は、異なる実施形態において異なり得る。いくつかの実施形態において、組換えＴｄＴは、組換えＴｄＴのＮ末端にＳＵＭＯ断片を含む。いくつかの実施形態において、組換えＴｄＴは、組換えＴｄＴのＣ末端にＳＵＭＯ断片を含む。

組換えＴｄＴは、ＳＵＭＯ断片を含む組換えＴｄＴ（例えば、配列番号１４又は配列番号１５のアミノ酸配列を含むＳＵＭＯ断片を有する組換えＴｄＴ）に対する配列同一性又はほぼ配列同一性閾値を有するアミノ酸配列を含むことができる。組換えＴｄＴは、ＳＵＭＯ断片（例えば、配列番号１４、又は配列番号１５）を含む組換えＴｄＴに対する配列同一性閾値を上回る、およそ上回る、下回る、およそ下回る配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。組換えＴｄＴは、ＳＵＭＯ断片（例えば、配列番号１４、又は配列番号１５）を含む組換えＴｄＴに対する、配列同一性閾値（少なくとも、少なくとも約、多くとも、多くとも約で）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。配列同一性閾値は、異なる実施形態では異なり得る。いくつかの実施形態では、配列同一性閾値は、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、又はこれらの値のいずれか２つの間の数若しくは範囲である。例えば、組換えＴｄＴは、配列番号１４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。別の例として、組換えＴｄＴは、配列番号１５と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。

配列決定
ライブラリ調製
ポリヌクレオチドを含むライブラリは、オリゴヌクレオチドアダプタを標的ポリヌクレオチドに付着させるために任意の好適な方法で調製され得る。本明細書で使用される場合、「ライブラリ」は、所与の供給源又は試料からのポリヌクレオチドの集団である。ライブラリは、複数の標的ポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「標的ポリヌクレオチド」は、配列決定に望ましいポリヌクレオチドである。標的核酸は、本質的に既知又は未知の配列の任意の核酸であってもよい。それは、例えば、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡの断片であり得る。配列決定は、ターゲットポリヌクレオチドの全体又は一部の配列の決定をもたらし得る。標的ポリヌクレオチドは、ランダムに断片化された一次ポリヌクレオチド試料に由来し得る。標的ポリヌクレオチドは、各標的断片の末端にユニバーサルプライマー配列を配置することによって増幅に好適な鋳型に処理され得る。標的ポリヌクレオチドはまた、ｃＤＮＡへの逆転写によって一次ＲＮＡサンプルから得ることができる。

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され得、典型的にはホスホジエステル結合を通して互いに共有結合した２つ以上のヌクレオチドモノマーを含む分子を指す。ポリヌクレオチドは、典型的には、オリゴヌクレオチドよりも多くのヌクレオチドを含有する。限定ではなく例示の目的で、ポリヌクレオチドは、１５、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、又はそれを超えるヌクレオチドを含有すると考えられ得るが、オリゴヌクレオチドは、１００、５０、２０、１５以下のヌクレオチドを含有すると考えられ得る。

ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができる。これらの用語は、同等物として、ヌクレオチド類似体から作製されたＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかの類似体を含み、一本鎖（センス又はアンチセンス等）及び二本鎖ポリヌクレオチドに適用可能であることを理解されるべきである。本明細書で使用するこの用語はまた、例えば逆転写酵素の作用によって、ＲＮＡテンプレートから産生される相補的又はコピーＤＮＡであるｃＤＮＡも包含する。

一次ポリヌクレオチド分子は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）形態（例えば、ゲノムＤＮＡ断片、ＰＣＲ及び増幅産物等）に由来し得るか、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡとして一本鎖形態で発生し、ｄｓＤＮＡ形態に変換され得る。例として、当技術分野で周知の標準的な技術を使用して、ｍＲＮＡ分子を二本鎖ｃＤＮＡにコピーすることができる。一次ポリヌクレオチドの正確な配列は、一般に、本明細書で提示される開示に対して重要ではなく、既知であっても未知であってもよい。

いくつかの実施形態では、一次標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子である。そのような実施形態の一態様では、特定の試料から単離されたＲＮＡは、当該技術分野で既知の技術を使用して、最初に二本鎖ＤＮＡに変換される。次いで、二本鎖ＤＮＡは、ライブラリ特異的タグでタグ付けされたインデックスとすることができる。ライブラリ特異的インデックスタグを含むそのような二本鎖ＤＮＡの異なる調製物は、異なる供給源又は試料から単離されたＲＮＡから並列に生成され得る。続いて、異なるライブラリ特異的インデックスタグを含む二本鎖ＤＮＡの異なる調製物を混合し、共に配列決定し、ライブラリ特異的インデックスタグ配列の存在によってそれが単離され／由来するライブラリに関して決定された各配列決定された断片の同一性を配列決定し得る。

いくつかの実施形態では、一次標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子である。例えば、一次ポリヌクレオチドは、生物の遺伝的補体全体を表し得、イントロン及びエクソン配列（コード配列）の両方、並びにプロモーター及びエンハンサー配列等の非コード調節配列を含む、ヒトＤＮＡ分子等のゲノムＤＮＡ分子である。例えば、特定の染色体又はその一部等の、ポリヌクレオチド配列又はゲノムＤＮＡの特定のサブセットも使用され得ることが想定され得る。多くの実施形態では、一次ポリヌクレオチドの配列は、既知ではない。ＤＮＡ標的ポリヌクレオチドは、ランダム断片化プロセス等の断片化プロセスの前又は後、及びアダプタオリゴヌクレオチドのライゲーションの前、最中、又はその後のいずれかに、化学的又は酵素的に処理され得る。

好ましくは、一次標的ポリヌクレオチドは、配列決定に好適な適切な長さに断片化される。標的ポリヌクレオチドは、任意の好適な様式で断片化され得る。好ましくは、標的ポリヌクレオチドは、ランダムに断片化される。ランダム断片化とは、例えば、酵素的、化学的、又は機械的手段による、非規則的な様式でのポリヌクレオチドの断片化を指す。そのような断片化方法は、当該技術分野で既知であり、標準的な方法を利用する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）。明確にするために、このようなより小さい断片の特異的ＰＣＲ増幅によってより大きいポリヌクレオチド片のより小さい断片を生成することは、より大きいポリヌクレオチド片が無傷のままであるため（すなわち、ＰＣＲ増幅によって断片化されていない）、より大きいポリヌクレオチド片を断片化することと等価ではない。更に、ランダム断片化は、切断を含む及び／又は切断を取り囲むヌクレオチドの配列同一性又は位置に関係なく断片を生成するように設計される。

いくつかの実施形態では、ランダム断片化は、約５０塩基対の長さ～約１５００塩基対の長さ、例えば５０～７００塩基対の長さ又は５０～５００塩基対の長さの断片を生成するための、噴霧又は超音波処理等の機械的手段によるものである。

機械的手段（例えば、噴霧、超音波処理、及びハイドロシェア）によるポリヌクレオチド分子の断片化は、平滑及び３’－及び５’－オーバーハング末端の不均一な混合物を有する断片をもたらし得る。断片末端は、例えば、クローニングベクターの平滑部位に挿入するのに最適な末端を生成するために、当該技術分野で知られている方法又はキット（Ｌｕｃｉｇｅｎ ＤＮＡ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｋｉｔ等）を使用して修復され得る。特定の実施形態では、核酸集団の断片末端は、平滑末端である。断片末端は、平滑末端であってもよく、リン酸化されてもよい。リン酸部分は、酵素処理によって、例えば、ポリヌクレオチドキナーゼを使用して導入することができる。

いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、例えば、単一のデオキシヌクレオチド、例えばデオキシアデノシン（Ａ）を、例えばＰＣＲ産物の３’末端に付加する非鋳型依存性末端トランスフェラーゼ活性を有するＴａｑポリメラーゼ又はＫｌｅｎｏｗエキソマイナスポリメラーゼ等のある種のＤＮＡポリメラーゼの活性によって、単一のオーバーハングヌクレオチドを用いて調製される。そのような酵素は、標的ポリヌクレオチド二重鎖の各鎖の平滑末端３’末端に単一ヌクレオチド「Ａ」を付加するために利用され得る。したがって、Ｔａｑ又はＫｌｅｎｏｗ ｅｘｏ ｍｉｎｕｓポリメラーゼとの反応によって、標的ポリヌクレオチド二重鎖の各末端修復二重鎖の３’末端に「Ａ」を付加することができ、一方、アダプタポリヌクレオチド構築物は、アダプタ構築物の各二重鎖領域の３’末端に適合する「Ｔ」オーバーハングが存在するＴ構築物であり得る。この末端修飾はまた、標的ポリヌクレオチドの自己ライゲーションを防止し、その結果、組み合わされたライゲーションされたアダプタ－標的ポリヌクレオチドの形成に対するバイアスが存在する。

いくつかの実施形態では、断片化は、例えば、国際公開第２０１６／１３０７０４号に記載されているようなタグメンテーションによって達成される。そのような方法では、トランスポザーゼを使用して、二本鎖ポリヌクレオチドを断片化し、ユニバーサルプライマー配列を二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖に付着させる。得られた分子はギャップ充填され、例えば、付着したユニバーサルプライマー配列に相補的な配列を有する３’末端と、アダプタの他の配列を含む５’末端とを含むプライマーを使用してＰＣＲ増幅によって伸長され得る。

アダプタは、任意の他の好適な様式で標的ポリヌクレオチドに付着し得る。いくつかの実施形態では、アダプタは、ユニバーサルプライマー配列を有する標的ポリヌクレオチドへのアダプタの一部のライゲーションを含む、２段階プロセス等の多段階プロセスで導入される。第２の工程は、付着したユニバーサルプライマー配列に相補的な配列を有する３’末端と、アダプタの他の配列を含む５’末端とを含むプライマーを使用した、例えばＰＣＲ増幅による伸長を含む。例として、そのような伸長は、米国特許第８，０５３，１９２号に記載されているように実行され得る。得られた以前に伸長されたポリヌクレオチドの５’末端に追加の配列を提供するために、追加の伸長が実行され得る。

いくつかの実施形態では、アダプタ全体は、断片化標的ポリヌクレオチドに連結される。好ましくは、ライゲーションされたアダプタは、二本鎖標的ポリヌクレオチドに連結される二本鎖領域を含む。好ましくは、二本鎖領域は、機能を損なうことなく可能な限り短い。この文脈において、「機能」は、標準的な反応条件下で安定な二重鎖を形成する二本鎖領域の能力を指す。いくつかの実施形態では、標準反応条件は、アダプタを形成する２つの鎖が標的分子へのアダプタのライゲーション中に部分的にアニールされたままであるように、当業者に周知である酵素触媒ポリヌクレオチドライゲーション反応（例えば、酵素に適切なライゲーション緩衝液中の４℃～２５℃の範囲の温度でのインキュベーション）のための反応条件を指す。ライゲーション方法は当技術分野で公知であり、標準的な方法を利用することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）。そのような方法は、ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼ酵素を利用して、共有結合が形成されるように、この場合にはアダプタ二重鎖オリゴヌクレオチド及び標的ポリヌクレオチド二重鎖の２つのポリヌクレオチド鎖の末端の結合をもたらすか又は触媒する。アダプタ二重鎖オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド３’－ＯＨへのライゲーションを促進するために、５’－リン酸部分を含有し得る。標的ポリヌクレオチドは、剪断プロセスからの残留物又は酵素処理工程を使用して添加された５’－リン酸部分のいずれかを含有してもよく、ライゲーションに適した３’－ＯＨを得るために末端修復され、場合によりオーバーハング塩基（１つ又は複数）によって伸長されている。この文脈において、付着は、以前に共有結合していないポリヌクレオチド鎖の共有結合を意味する。本発明の特定の態様では、そのような付着は、２つのポリヌクレオチド鎖間のホスホジエステル結合の形成によって行われるが、共有結合の他の手段（例えば、非ホスホジエステル骨格結合）を使用してもよい。アダプタの標的ポリヌクレオチドへのライゲーションは、例えば、米国特許第８，０５３，１９２号に更に詳細に記載されている。

任意の好適なアダプタは、上述のような任意の好適なプロセスを介して標的ポリヌクレオチドに付着され得る。アダプタは、ライブラリ特異的インデックスタグ配列を含む。インデックスタグ配列は、サンプルが配列決定のために固定化される前に、各ライブラリからの標的ポリヌクレオチドに付着され得る。インデックスタグは、それ自体が標的ポリヌクレオチドの一部によって形成されるのではなく、増幅のための鋳型の一部となる。インデックスタグは、テンプレート調製工程の一部として標的に添加されるヌクレオチドの合成シーケンスであり得る。したがって、ライブラリ特異的インデックスタグは、特定のライブラリの標的分子のそれぞれに付着した核酸配列タグであり、その存在は、標的分子が単離されたライブラリを示すか、又はそのライブラリを同定するために使用される。

好ましくは、インデックスタグ配列は、２０ヌクレオチド以下の長さである。例えば、インデックスタグ配列は、１～１０ヌクレオチド又は４～６ヌクレオチド長とすることができる。４ヌクレオチドインデックスタグは、同じアレイ上で２５６個のサンプルを多重化する可能性を与え、６塩基インデックスタグは、同じアレイ上で４，０９６個のサンプルを処理することを可能にする。

アダプタは、多重化可能性を増加させることができるように、２つ以上のインデックスタグを含み得る。

アダプタは、好ましくは、二本鎖領域と、２つの非相補的一本鎖を含む領域とを含む。アダプタの二本鎖領域は、任意の好適な数の塩基対であり得る。好ましくは、二本鎖領域は、２つの部分的に相補的なポリヌクレオチド鎖のアニーリングによって形成される、典型的には５つ以上の連続する塩基対を含む短い二本鎖領域である。アダプタのこの「二本鎖領域」とは、２本鎖がアニールされ、いずれかの特定の構造的立体配座を意味しない領域を指す。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、２０個以下の連続する塩基対、例えば１０個以下又は５個以下の連続する塩基対を含む。

二本鎖領域の安定性は、標準的なワトソン－クリック塩基対よりも強い塩基対合を示す非天然ヌクレオチドを含めることによって増加し得、したがってその長さは減少する可能性がある。好ましくは、アダプタの２つの鎖は、二本鎖領域において１００％相補的である。

アダプタが標的ポリヌクレオチドに付着している場合、非相補的一本鎖領域は、配列決定されるポリヌクレオチドの５’及び３’末端を形成し得る。「非相補的一本鎖領域」という用語は、アダプタを形成する２つのポリヌクレオチド鎖の配列が、２つの鎖がＰＣＲ反応のための標準的なアニーリング条件下で互いに完全にアニーリングすることができない程度の非相補性を示すアダプタの領域を指す。

非相補的一本鎖領域は、二本鎖領域を形成する同じ２つのポリヌクレオチド鎖の異なる部分によって提供される。一本鎖部分の長さの下限は、典型的には、例えば、プライマー伸長のためのプライマーの結合、ＰＣＲ及び／又は配列決定のための適切な配列を提供することによって決定される。理論的には、一般に、例えば、１つ又は複数の取り付けステップ後のアダプタ－標的構築物からの未結合アダプタの分離を容易にするために、アダプタの全長を最小にすることが有利であることを除いて、一致しない領域の長さに上限はない。したがって、アダプタの非相補的一本鎖領域は、５０以下の連続ヌクレオチド長、例えば４０以下、３０以下、又は２５以下の連続ヌクレオチド長であることが一般に好ましい。

ライブラリ特異的インデックスタグ配列は、一本鎖、二本鎖領域、又はアダプタの一本鎖及び二本鎖領域にまたがってもよい。好ましくは、インデックスタグ配列は、アダプタの一本鎖領域にある。

アダプタは、インデックスタグ配列に加えて、任意の他の好適な配列を含んでもよい。例えば、アダプタは、典型的にはアダプタの５’又は３’末端に位置するユニバーサル伸長プライマー配列及び配列決定のために得られるポリヌクレオチドを含むことができる。ユニバーサル伸長プライマー配列は、固体基質の表面に結合した相補的プライマーにハイブリダイズし得る。相補的プライマーは、ポリメラーゼ又は他の適切な酵素が、ハイブリダイズしたライブラリポリヌクレオチドを鋳型として使用して配列を伸長するためにヌクレオチドを付加することができる遊離３’末端を含み、その結果、ライブラリポリヌクレオチドのリバース鎖が固体表面にカップリングされる。そのような伸長は、配列決定実行又はクラスター増幅の一部であり得る。

いくつかの実施形態では、アダプタは、１つ又は複数のユニバーサル配列決定プライマー配列を含む。ユニバーサル配列決定プライマー配列は、配列決定プライマーに結合して、インデックスタグ配列、標的配列、又はインデックスタグ配列及び標的配列の配列決定を可能にし得る。

アダプタの正確なヌクレオチド配列は、一般に、本発明にとって重要ではなく、例えば、ユニバーサル伸長プライマー及び／又は配列決定プライマーの特定のセットのための結合部位を提供するために、所望の配列要素が最終的にアダプタ由来の鋳型のライブラリの共通配列に含まれるように、使用者によって選択され得る。

アダプタオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合等のエキソヌクレアーゼ耐性修飾を含有し得る。

好ましくは、アダプタは、ヌクレオチドの第１のアダプタ－標的－第２アダプタを有するポリヌクレオチドを生成するために、標的ポリペプチドの両端に取り付けられる。第１及び第２のアダプタは、同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、第１及び第２のアダプタは同じである。第１及び第２のアダプタが異なる場合、第１及び第２のアダプタのうちの少なくとも１つは、ライブラリ特異的インデックスタグ配列を含む。

「第１のアダプタ－標的－第２のアダプタ配列」又は「アダプタ－標的－アダプタ」配列は、互いに対する、及び標的に対するアダプタの配向を指し、配列が、例えばリンカー配列等の追加の配列を含まない場合があることを必ずしも意味するわけではないことが理解されるであろう。

他のライブラリも同様の方法で調製することができ、それぞれが少なくとも１つのライブラリ特異的インデックスタグ配列又は他のライブラリからのインデックスタグ配列若しくはインデックスタグ配列の組合わせとは異なるインデックスタグ配列の組合わせを含む。

本明細書で使用される場合、「付着した」又は「結合した」は、標的配列に対するアダプタの文脈において互換的に使用される。上記のように、任意の好適なプロセスを使用して、アダプタを標的ポリヌクレオチドに付着させることができる。例えば、アダプタは、リガーゼとのライゲーションを通して、アダプタの一部分のライゲーションと、アダプタの更なる部分又は残りの部分を含むプライマーを用いたＰＣＲ等の伸長によるアダプタの更なる部分又は残りの部分の付加との組合わせによって、アダプタの一部を組み込むための転移、及びアダプタの更なる部分又は残りの部分を含むプライマーを用いたＰＣＲ等の伸長によるアダプタの更なる部分又は残りの部分の付加によって等、標的に付着され得る。などに基づいて、組み込みイベントを検出することができる。好ましくは、付着アダプタオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに共有結合している。

アダプタが標的ポリヌクレオチドに付着した後、結果として生じるポリヌクレオチドは、組み込まれていないアダプタの少なくとも一部を除去することによって、アダプタ標的－アダプタポリヌクレオチドへの純度を高めるためにクリーンアッププロセスに供され得る。電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィーなどの任意の好適なクリーンアッププロセスが使用されてよい。いくつかの実施形態では、固相逆固定化（ＳＰＲＩ）常磁性ビーズを用いて、アダプタ標的－アダプタポリヌクレオチドを非結合アダプタから分離することができる。そのようなプロセスは、得られたアダプタ標的アダプタポリヌクレオチドの純度を高めることができるが、いくつかの未結合アダプタオリゴヌクレオチドは残存する可能性がある。

シークエンシングのための固定されたサンプルの調製
次いで、１つ又は複数の供給源からの複数のアダプタ－標的－アダプタ分子を固定化し、配列決定の前に増幅する。１つ又は複数の供給源からのアダプタ－標的－アダプタ分子を基質に付着させるための方法は、当技術分野において公知である。同様に、固定化されたアダプタ－標的－アダプタ分子を増幅するための方法には、ブリッジ増幅及び結合平衡除外増幅が含まれるが、これらに限定されない。配列決定の前に固定化及び増幅する方法は、例えば、Ｂｉｇｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ（ＵＳ ８，０５３，１９２），Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ＷＯ２０１６／１３０７０４），Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（ＵＳ ８，８９５，２４９），ａｎｄ Ｐｉｐｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（ＵＳ ９，３０９，５０２）に記載されている。

次いで、プールされた試料を含む試料を、配列決定の準備として固定化することができる。配列決定は、単一分子のアレイとして実施することも、配列決定の前に増幅することもできる。増幅は、１つ又は複数の固定化プライマーを使用して実施することができる。固定化されたプライマーは、平面上、又はビーズのプール上のローンであり得る。ビーズのプールは、エマルジョンの各「区画」に単一のビーズを有するエマルジョン中に単離され得る。「区画」当たり１つの鋳型のみの濃度では、単一の鋳型のみが各ビーズ上で増幅される。

本明細書で使用するとき、用語「固相増幅」は、形成時に増幅産物の全て又は一部が固体支持体上に固定化されるように、固体支持体上又は固体支持体と関連して実施される任意の核酸増幅反応を指す。具体的には、この用語は、順方向及び逆方向増幅プライマーの一方又は両方が固体支持体上に固定されていることを除いて、標準溶液相増幅に類似した反応である固相ポリメラーゼ連鎖反応（固相ＰＣＲ）及び固相等温増幅を包含する。固相ＰＣＲは、一方のプライマーがビーズに固定され、もう一方が遊離溶液にあるエマルジョンや、一方のプライマーが表面に固定され、もう一方が遊離溶液にある固相ゲルマトリックスでのコロニー形成などの系を対象としている。

いくつかの実施形態では、固体支持体はパターン化された表面を含む。「パターン化された表面」は、固体支持体の露出層内又はその上における、異なる領域の配置を指す。例えば、１つ又は複数の領域は、１つ又は複数の増幅プライマーが存在する特徴であり得る。この特徴は、増幅プライマーが存在しない間質領域によって分離され得る。いくつかの実施形態では、パターンは、行及び列にある特徴のｘ－ｙフォーマットであり得る。いくつかの実施形態では、パターンは、特徴及び／又は間質領域の反復配列であり得る。いくつかの実施態様では、パターンは、特徴及び／又は間質領域のランダム配列であり得る。本明細書に記載の方法及び組成物で使用することができる例示的なパターン化された表面は、米国特許第８，７７８，８４８号、同第８，７７８，８４９号、及び同第９，０７９，１４８号、並びに米国特許出願公開第２０１４／０２４３２２４号、に記載されており、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、固体支持体は、表面にウェル又は窪みのアレイを含む。これは、フォトリソグラフィ、スタンピング技術、成形技術、及びマイクロエッチング技術を含むがこれらに限定されない様々な技術を使用して、当該技術分野において一般的に知られているように製造することができる。当該技術分野において理解されるように、使用される技術は、アレイ基板の組成及び形状に依存する。

パターン付き表面内の特徴は、ガラス、シリコン、プラスチック、又はポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド）（ＰＡＺＡＭ、例えば、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／１８４７９６号、国際公開第２０１６／０６６５８６号及び同第２０１５／００２８１３号を参照されたい）等のパターン化された共有結合ゲルを有する他の好適な固体支持体上のウェル（例えば、マイクロウェル又はナノウェル）配列におけるウェルであってもよい。このプロセスは、配列決定のために使用されるゲルパッドを作成し、これは、多数のサイクルで配列決定動作にわたって安定であり得る。ポリマーをウェルに共有結合することは、様々な用途の間に、構造化基材の寿命全体にわたってゲルを構造化特徴部に維持するのに有用である。しかしながら、多くの実施形態では、ゲルは、ウェルに共有結合される必要はない。例えば、いくつかの条件では、構造化基質のどの部分にも共有結合されていないシランフリーのアクリルアミド（ＳＦＡ、例えば、米国特許第８，５６３，４７７号を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）をゲル材料として使用することができる。

特定の別の実施形態では、構造化基材は、ウェル（例えば、マイクロウェル又はナノウェル）を用いて固体支持材料をパターニングし、パターン化された支持体をゲル材料（例えば、ＰＡＺＡＭ、ＳＦＡ、又はその化学修飾された変異体）、例えばＳＦＡのアジド化型（アジド－ＳＦＡ）など）でコーティングし、ゲルコーティングされた支持体を、例えば化学研磨又は機械研磨によって研磨することによって作製することができ、それによって、ウェル内にゲルを保持するが、ウェル間の構造化基材の表面の間隙領域から実質的に全てのゲルを除去又は不活性化する。ゲル材料にプライマー核酸を付着させることができる。次いで、標的核酸（例えば、断片化されたヒトゲノム）の溶液を、個々の標的核酸がゲル材料に付着したプライマーとの相互作用を介して個々のウェルに播種するように、研磨された基質と接触させることができる。ゲル材料が存在しないか不活性であるため、ターゲット核酸は間質領域を占有しない。標的核酸の増幅は、介在領域内のゲルの不在又は非活性が、増殖する核酸コロニーの外向きの移動を防止するため、ウェルに限定されるであろう。プロセスは、好都合に製造可能であり、スケール変更可能であり、従来のマイクロ又はナノ製造方法を利用する。

本発明は、１つの増幅プライマーのみが固定される「固相」増幅法（他のプライマーは通常は遊離溶液中に存在する）を包含するが、固体支持体には、固定化された順方向及び逆方向プライマーの両方が提供されることが望ましい。実際には、増幅プロセスは増幅を維持するために過剰なプライマーを必要とするため、「複数」の同一の順方向プライマー及び／又は固体支持体上に固定化された「複数」の同一の逆方向プライマーが存在するであろう。本明細書における順方向及び逆方向プライマーへの言及は、文脈が別段の指示をしない限り、「複数の」そのようなプライマーを包含するものとして解釈されるべきである。

当業者に理解されるように、任意の所与の増幅反応は、増幅される鋳型に特異的な少なくとも１つのタイプの順方向プライマー及び少なくとも１つのタイプの逆方向プライマーを必要とする。しかしながら、特定の実施形態では、順方向及び逆方向プライマーは、同一配列の鋳型特異的部分を含んでもよく、完全に同一のヌクレオチド配列及び構造（任意の非ヌクレオチド修飾を含む）を有してもよい。換言すれば、１つのタイプのプライマーのみを用いて固相増幅を行うことができ、そのような単一プライマー法は、本発明の範囲内に包含される。他の実施形態は、同一の鋳型特異的配列を含むが、いくつかの他の構造的特徴において異なる順方向及び逆方向プライマーを使用してもよい。例えば、一方のタイプのプライマーは、他方には存在しない非ヌクレオチド修飾を含み得る。

本開示の全ての実施形態では、固相増幅用プライマーは、好ましくは、プライマーの５’末端又はその付近で固体支持体への単一点共有結合によって固定され、プライマーの鋳型特異的部分をその同族鋳型及びプライマー伸長を含まない３’ヒドロキシル基に自由にアニーリングさせる。当該技術分野において既知の任意の好適な共有結合手段をこの目的のために使用することができる。選択された付着化学的物質は、固体支持体の性質、及びそれに適用される任意の誘導体化又は官能化に依存する。プライマー自体は、付着を促進するために非ヌクレオチド化学修飾であってもよい部分を含んでもよい。特定の実施形態では、プライマーは、５’末端にホスホロチオエート又はチオホスフェートなどの硫黄含有求核剤を含んでもよい。固体に支持されたポリアクリルアミドヒドロゲルの場合、この求核剤はヒドロゲルに存在するブロモアセトアミド基に結合する。プライマー及び鋳型を固体支持体に付着させるより具体的な手段は、国際公開第０５／０６５８１４号に完全に記載されるように、重合アクリルアミド及びＮ－（５－ブロモアセトアミドイルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）からなるヒドロゲルへの、５’ホスホロチオエート付着を介している。

本開示の特定の実施形態は、例えば、ポリヌクレオチド等の生体分子への共有結合を可能にする反応基を含む中間材料の層又はコーティングの適用によって「機能化」された不活性基材又はマトリックス（例えば、ガラススライド、ポリマービーズ等）から構成される固体支持体を利用することができる。このような支持体の例としては、ガラスなどの不活性基質上に支持されるポリアクリルアミドヒドロゲルが挙げられるが、これに限定されない。このような実施形態では、生体分子（例えば、ポリヌクレオチド）は、中間材料（例えば、ヒドロゲル）に直接共有結合してもよいが、中間材料は、それ自体が基質又はマトリックス（例えば、ガラス基質）に非共有結合してもよい。用語「固体支持体への共有結合」は、このタイプの配置を包含するように適宜解釈されるべきである。

プールされたサンプルは、ビーズ上で増幅されてもよく、各ビーズは、順方向及び逆方向増幅プライマーを含有する。特定の実施形態では、本発明の第１の態様、第２の態様又は第３の態様に従って調製された鋳型のライブラリを使用して、固相増幅、より具体的には固相等温増幅によって、内容が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／０１００９００号、米国特許第７，１１５，４００号、国際公開第００／１８９５７号及び国際公開第９８／４４１５１号に記載されているものに類似している、核酸コロニーのクラスター化アレイを調製する。用語「クラスター」及び「コロニー」は、本明細書において交換可能に使用され、複数の同一の固定化核酸鎖及び複数の同一の固定化された相補的核酸鎖から構成される、固体支持体上の別個の部位を指す。「クラスター化アレイ」という用語は、そのようなクラスター又はコロニーから形成されるアレイを指す。この文脈では、用語「アレイ」は、クラスターの順序付けられた配置を必要とするものとして理解されるべきではない。

「固相」又は「表面」という用語は、プライマーが平坦な表面、例えば、ガラス、シリカ若しくはプラスチック顕微鏡スライド、又は類似のフロー細胞デバイスや、ビーズであって、１つ又は２つのプライマーが付着し、ビーズが増幅される、ビーズに取り付けられている平面アレイか、ビーズが増幅された後の表面上のビーズのアレイのいずれかを意味するために使用される。

クラスター化された配列は、国際公開第９８／４４１５１号に記載されているような熱サイクルのプロセス、又は温度が一定に維持され、試薬の変化を使用して延伸及び変性のサイクルが行われるプロセスを使用して調整され得る。このような等温増幅法は、国際公開第０２／４６４５６号及び米国特許出願公開第２００８／０００９４２０号に記載されている。これらは、全体が参照により本明細書に組み込まれる。等温プロセスで必要とされる温度がより低いため、これは特に好ましい。

本明細書に記載されるか、又は当技術分野において一般的に既知の増幅方法のいずれも、固定化ＤＮＡ断片を増幅するために、ユニバーサル又はターゲット特異的なプライマーと共に使用され得ることが理解されるであろう。増幅のための適切な方法には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，００３，３５４号に記載されているように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）及び核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれるが、これらに限定されない。上記の増幅方法を用いて、対象とする１つ又はそれ以上の核酸を増幅することができる。例えば、多重ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなどを含むＰＣＲを利用して、固定化ＤＮＡ断片を増幅することができる。いくつかの実施形態では、対象となるポリヌクレオチドに特異的に指向されるプライマーは、増幅反応に含まれる。

ポリヌクレオチドの増幅に好適な他の方法としては、オリゴヌクレオチド伸長及びライゲーション、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５－２３２（１９９８））、及びオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）技術を含み得る（一般に米国特許第７，５８２，４２０号、同第５，１８５，２４３号、同第５，６７９，５２４号、及び同第５，５７３，９０７号、欧州特許第０ ３２０ ３０８（Ｂ１）号、欧州特許第０ ３３６ ７３１（Ｂ１）号、欧州特許第０ ４３９ １８２（Ｂ１）号、国際公開第９０／０１０６９号、国際公開第８９／１２６９６号、及び国際公開第８９／０９８３５号参照）。これらの増幅方法は、固定化ＤＮＡ断片を増幅するように設計され得ることが理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、増幅法は、対象の核酸に特異的に指向されるプライマーを含有するライゲーションプローブ増幅又はオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）反応を含んでもよい。いくつかの実施形態では、増幅法は、対象の核酸に特異的に指向されるプライマーを含有するプライマー伸長ライゲーション反応を含んでもよい。対象の核酸を増幅するよう特異的に設計され得るプライマー伸長及びライゲーションプライマーの非限定的な例として、増幅は、米国特許第７，５８２，４２０号及び同第７，６１１，８６９号により例示されるように、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイに使用されるプライマー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を挙げることができる。

本開示の方法で使用され得る例示的な等温増幅法としては、例えば、Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：５２６１－６６（２００２）、又は例えば米国特許第６，２１４，５８７号により例示される等温鎖置換核酸増幅によって例示される複数置換増幅（ＭＤＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。本開示で使用され得る他の非ＰＣＲ系方法としては、例えば、Ｗａｌｋｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｖｉｒｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、１９９５年に記載されている鎖置換増幅（ＳＤＡ）、米国特許第５，４５５，１６６号、及び同第５，１３０，２３８号、並びにＷａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６９１－９６（１９９２年）、又は、例えばＬａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３：２９４－３０７（２００３年）に記載されている過分岐鎖置換増幅が挙げられる。等温増幅法は、ゲノムＤＮＡのランダムプライマー増幅のために、鎖置換Ｐｈｉ ２９ポリメラーゼ又はＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大型断片、５’→３’エキソ－で使用することができる。これらのポリメラーゼの使用は、それらの高い加工性及び鎖置換活性の利点を利用する。高い加工性により、ポリメラーゼは、１０－２０ｋｂの長さの断片を産生できる。上記に述べたように、低加工性を有するポリメラーゼ及びＫｌｅｎｏｗポリメラーゼなどの鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して、等温条件下でより小さな断片を産生することができる。増幅反応、条件及び成分の更なる説明は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６７０，８１０号の開示に詳細に記載されている。

本開示において有用な別のポリヌクレオチド増幅法は、例えばＧｒｏｔｈｕｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（５）：１３２１－２（１９９３）に記載されているように、５’領域に続いてランダム３’領域を有する２ドメインプライマーの集団を使用する、タグ付きＰＣＲである。増幅の第１のラウンドは、ランダムに合成された３’領域からの個々のハイブリダイゼーションに基づいて、熱変性ＤＮＡ上で多数の開始を可能にするために行われる。３’領域の性質により、開始部位はゲノム全体にランダムであると考えられる。その後、未結合のプライマーを除去し、一定の５’領域に相補的なプライマーを使用して更なる複製を行ってもよい。

いくつかの実施形態では、等温増幅は、排除増幅（ＥｘＡｍｐ）とも呼ばれる、結合平衡除外増幅（ＫＥＡ）を使用して行うことができる。本開示の核酸ライブラリは、増幅試薬を反応させて、部位に播種した個々のターゲット核酸からそれぞれがアンプリコンの実質的にクローン性集団を含む複数の増幅部位を産生する工程を含む方法を使用して作製することができる。いくつかの実施形態では、増幅反応は、それぞれの増幅部位の容量を満たすのに十分な数のアンプリコンが産生されるまで進行する。このように、既に播種された部位を容量まで満たすと、ターゲット核酸がその部位に着地して増幅するのを阻害し、それによってその部位でアンプリコンのクローン集団を産生する。いくつかの実施形態では、第２のターゲット核酸がその部位に到達する前に増幅部位が容量まで満たされていなくても、見かけのクローン性を達成することができる。いくつかの条件下では、第１のターゲット核酸の増幅は、その部位に輸送される第２のターゲット核酸からのコピーの産生を有効に上回るか又は圧倒するのに十分な数のコピーが作製される点まで進行し得る。例えば、直径５００ｎｍ未満の円形特徴部上でブリッジ増幅プロセスを使用する実施形態では、第１のターゲット核酸に対する指数増幅の１４サイクル後、同じ部位での第２のターゲット核酸からの汚染は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォーム上での配列合成分析に悪影響を及ぼすのに不十分な数の汚染アンプリコンを生成することが決定された。

アレイ内の増幅部位は、特定の実施形態では完全にクローン性であり得るが、そうである必要はない。むしろ、いくつかの用途では、個々の増幅部位は、主に第１の標的核酸からのアンプリコンで占められ、また、第２のターゲット核酸からの低レベルの汚染アンプリコンを有することもできる。アレイは、汚染レベルがアレイのその後の使用に許容できない影響を有さない限り、低レベルの汚染アンプリコンを有する１つ又は複数の増幅部位を有することができる。例えば、アレイが検出用途で使用される場合、許容可能なレベルの汚染は、検出技術の信号対雑音比又は分解能に許容できない方法で影響を与えないレベルである。したがって、見かけのクローン性は、一般に、本明細書に記載の方法によって作製されるアレイの特定の使用又は用途に関連する。特定の用途のために個々の増幅部位で許容できる汚染の例示的なレベルとしては、最大で０．１％、０．５％、１％、５％、１０％又は２５％の汚染アンプリコンを含むが、これらに限定されない。アレイは、これらの例示的なレベルの汚染アンプリコンを有する１つ又は複数の増幅部位を含み得る。例えば、アレイ内の増幅部位の最大５％、１０％、２５％、５０％、７５％、又は更には１００％に、汚染されたアンプリコンが含まれている可能性がある。アレイ又はその他の部位集合において、部位の少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％以上がクローン性であるか、又は見かけでクローン性であり得ることが理解されよう。

いくつかの実施形態では、結合平衡除外は、別のイベント又はプロセスが発生することを効果的に排除するために、十分に速い速度でプロセスが生じるときに生じ得る。アレイの部位に溶液から標的核酸をランダムに播種し、増幅プロセスで標的核酸のコピーを生成して播種部位の各々を容量まで満たす核酸アレイの作製を例として取り上げる。本開示の結合平衡除外法によれば、播種及び増幅プロセスは、増幅速度が播種速度を超える条件下で同時に進行することができる。したがって、第１のターゲット核酸によって播種された部位でコピーが作製される比較的速い速度は、増幅のためにその部位を播種することから、第２の核酸を効果的に排除する。結合平衡除外増幅法は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３/０３３８０４２号の開示に詳細に記載されているように実施することができる。

結合平衡除外は、増幅を開始するための比較的遅い速度（例えば、標的核酸の第１のコピーを作製する遅い速度）対標的核酸のその後のコピー（又は標的核酸の第１のコピー）を作製するための比較的速い速度を利用することができる。前の段落の例では、結合平衡除外は、比較的遅い速度の標的核酸播種（例えば、比較的遅い拡散又は輸送）対核酸種のコピーで部位を満たすために増幅が生じる比較的速い速度のために生じる。別の例示的な実施形態において、結合平衡除外は、部位を播種した標的核酸の第１のコピーの形成の遅延（例えば、遅延又は遅い活性化）対部位を満たすために後続のコピーが作製される比較的速い速度のために生じ得る。この例では、個々の部位にいくつかの異なる標的核酸が播種されている場合がある（例えば、増幅前にいくつかの標的核酸が各部位に存在し得る）。しかしながら、任意の所与の標的核酸の第１のコピー形成がランダムに活性化され得、これにより、後続のコピーが生成される速度と比較して第１のコピー形成の平均速度が比較的遅くなる。この場合、個々の部位にいくつかの異なる標的核酸が播種されている場合があるが、結合平衡除外により、それらの標的核酸のうちの１つのみの増幅が可能になる。より具体的には、第１の標的核酸が増幅のために活性化されると、その部位はそのコピーで急速に満たされ、それにより、第２の標的核酸のコピーがその部位で作製されるのが防止される。

増幅試薬は、アンプリコン形成を促進する更なる成分を含むことができ、場合によってはアンプリコン形成の速度を増加させる。一実施例は、リコンビナーゼである。リコンビナーゼは、反復的な浸潤／伸長を可能にすることによって、アンプリコン形成を促進することができる。より具体的には、リコンビナーゼは、標的核酸をアンプリコン形成の鋳型として使用するポリメラーゼによる標的核酸の浸潤及びポリメラーゼによるプライマーの伸長を促進することができる。このプロセスは、浸潤／伸長の各ラウンドから産生されたアンプリコンが後続のラウンドで鋳型として機能する鎖反応として繰り返すことができる。変性サイクル（例えば、加熱又は化学変性による）は必要とされないため、このプロセスは標準的なＰＣＲよりも迅速に行うことができる。したがって、リコンビナーゼ促進増幅は、等温的に行うことができる。増幅を促進するために、リコンビナーゼ促進増幅試薬中に、ＡＴＰ、又は他のヌクレオチド（又は場合によってはその非加水分解性類似体）を含めることが望ましい。リコンビナーゼと一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質の混合物は、ＳＳＢが増幅を更に促進できるため、特に有用である。リコンビナーゼ促進増幅のための代表的な製剤としては、ＴｗｉｓｔＤｘ社（ケンブリッジ、英国）によりＴｗｉｓｔＡｍｐキットとして市販されているものが挙げられる。リコンビナーゼ促進増幅試薬の有用な成分及び反応条件は、各々参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２２３，４１４号及び米国特許第７，３９９，５９０号に記載されている。

アンプリコン形成を促進し、場合によってはアンプリコン形成の速度を増加させるために増幅試薬に含めることができる成分の別の例は、ヘリカーゼである。ヘリカーゼは、アンプリコン形成の連鎖反応を可能にすることによって、アンプリコン形成を促進することができる。変性サイクル（例えば、加熱又は化学変性による）は必要とされないため、このプロセスは標準的なＰＣＲよりも迅速に行うことができる。したがって、ヘリカーゼ促進増幅は、等温的に行うことができる。ヘリカーゼと一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質の混合物は、ＳＳＢが増幅を更に促進できるため、特に有用である。ヘリカーゼ促進増幅のための代表的な製剤としては、Ｂｉｏｈｅｌｉｘ社（ビバリー、マサチューセッツ州）からＩｓｏＡｍｐキットとして市販されているものが挙げられる。更に、ヘリカーゼタンパク質を含む有用な製剤の例は、各々参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，３９９，５９０号及び米国特許第７，８２９，２８４号に記載されている。

アンプリコン形成を促進し、場合によってはアンプリコン形成の速度を増加させるために増幅試薬に含めることができる成分の更に別の例は、起点結合タンパク質である。

配列決定における使用
アダプタ－標的－アダプタ分子の表面への付着に続いて、固定化及び増幅されたアダプタ－標的－アダプタ分子の配列が決定される。配列決定は、任意の適切な配列決定技術を使用して行うことができ、鎖の再合成を含む、固定化及び増幅されたアダプタ－標的－アダプタ分子の配列を決定する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｂｉｇｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（ＵＳ ８，０５３，１９２），Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ＷＯ２０１６／１３０７０４），Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（ＵＳ ８，８９５，２４９），ａｎｄ Ｐｉｐｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（ＵＳ ９，３０９，５０２）に記載されている。

本明細書に記載の方法は、様々な核酸シークエンシング方法と併せて使用することができる。特に適用可能な技術は、核酸が、それらの相対的位置が変化しないようにアレイ内の固定位置に取り付けられ、アレイが繰り返し撮像されるものである。例えば、１つのヌクレオチド塩基型を別のヌクレオチド塩基型と区別するために使用される異なる標識と一致する異なる色チャネルで画像が得られる実施形態は、特に適用可能である。いくつかの実施形態では、標的核酸のヌクレオチド配列を決定するプロセスは、自動化プロセスであり得る。好ましい実施形態としては、合成によるシークエンシング（「ＳＢＳ」）技術が挙げられる。

ＳＢＳ技術は、一般に、鋳型鎖に対するヌクレオチドの反復的添加による、新生核酸鎖の酵素的伸長を伴う。ＳＢＳの従来の方法では、単一のヌクレオチドモノマーが、各送達においてポリメラーゼの存在下でターゲットヌクレオチドに提供され得る。しかしながら、本明細書に記載の方法では、送達中のポリメラーゼの存在下で、２つ以上のタイプのヌクレオチドモノマーをターゲット核酸に提供することができる。

ＳＢＳは、ターミネーター部分を有するヌクレオチドモノマー、又はターミネーター部分を欠くヌクレオチドモノマーを使用することができる。ターミネーターを含まないヌクレオチドモノマーを使用する方法としては、例えば、以下に更に詳細に記載されるように、γ－リン酸標識ヌクレオチドを用いたピロ配列決定及び配列決定が挙げられる。ターミネーターを含まないヌクレオチドモノマーを使用する方法では、各サイクルに添加されるヌクレオチドの数は、一般に可変であり、鋳型配列及びヌクレオチド送達のモードに依存する。ターミネーター部分を有するヌクレオチドモノマーを利用するＳＢＳ技術では、ターミネーターは、ジデオキシリヌクレオチドを利用する従来のＳａｎｇｅｒシークエンシングの場合のように使用されるシークエンシング条件下で有効に不可逆的であり得るか、又はターミネーターは、Ｓｏｌｅｘａ社（現在はＩｌｌｕｍｉｎａ社）によって開発されたシークエンシング方法の場合のように可逆的であり得る。

ＳＢＳ技術は、標識部分を有するヌクレオチドモノマー、又は標識部分を欠くヌクレオチドモノマーを使用することができる。したがって、標識の蛍光などの標識の特性、分子量又は電荷などのヌクレオチドモノマーの特性、ピロリン酸の放出などのヌクレオチドの組み込みの副生成物などに基づいて、組み込みイベントを検出することができる。２つ以上の異なるヌクレオチドが配列決定試薬中に存在する実施形態では、異なるヌクレオチドは互いに区別可能であってもよく、あるいは２つ以上の異なる標識は、使用される検出技術の下で区別可能であり得る。例えば、シークエンシング試薬中に存在する異なるヌクレオチドは、異なる標識を有することができ、それらは、Ｓｏｌｅｘａ社（現Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）によって開発されたシークエンシング方法によって例示される適切な光学系を使用して区別することができる。

好ましい実施形態としては、ピロシークエンシング技術が挙げられる。パイロシークエンシングは、特定のヌクレオチドが新生鎖に組み込まれるときに無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．，Ｋａｒａｍｏｈａｍｅｄ，Ｓ．，Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．（１９９６）「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｌｅａｓｅ．」Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４２（１）、８４－９、Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．（２００１）「Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｈｅｄｓ ｌｉｇｈｔ ｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．」Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１）、３－１１、Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．，Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．（１９９８）「Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７５），３６３；米国特許第６，２１０，８９１号、同第６，２５８，５６８号及び同第６，２７４，３２０号、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ピロシークエンシングにおいて、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフラーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に即座に変換されることによって検出することができ、生成されたＡＴＰのレベルはルシフェラーゼで生成された光子を介して検出される。シークエンシングされる核酸は、アレイ中の特徴部に付着させることができ、アレイは、アレイの特徴部にヌクレオチドを組み込むことにより産生される化学発光シグナルを捕捉するために画像化することができる。アレイを特定のヌクレオチド型（例えば、Ｔ、Ｃ、又はＧ）で処理した後に、画像を得ることができる。各ヌクレオチド型の添加後に得られる画像は、アレイ内のどの特徴部が検出されるかに関して異なる。画像内のこれらの差異は、アレイ上の特徴部の異なる配列コンテンツを反映する。しかしながら、各特徴部の相対的な位置は、画像内で変わらないままである。画像は、本明細書に記載の方法を使用して記憶、処理、及び分析することができる。例えば、アレイを各異なるヌクレオチド型で処理した後に得られる画像は、可逆的ターミネーターベースのシークエンシング方法のための異なる検出チャネルから得られる画像について、本明細書に例示されるものと同じ方法で処理することができる。

別の例示的な種類のＳＢＳでは、サイクル配列決定は、例えば、国際公開第０４／０１８４９７号及び米国特許第７，０５７，０２６号に記載されているような開裂可能な又は光漂白可能な染料標識を含む可逆的ターミネーターヌクレオチドを段階的に添加することによって達成され、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。この手法は、Ｓｏｌｅｘａ（ｎｏｗ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）によって商品化されており、国際公開第９１／０６６７８号及び同第０７／１２３，７４４号にも記載されており、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。終端の両方を逆転させることができ、蛍光標識が開裂された蛍光標識ターミネーターの可用性は、効率的な循環可逆的終端（ＣＲＴ）シークエンシングを容易にする。ポリメラーゼはまた、これらの修飾されたヌクレオチドを効率的に組み込み、かつそこから伸長するように共操作することもできる。

好ましくは、可逆的ターミネーターベースの配列決定実施形態では、標識は、ＳＢＳ反応条件下での伸長を実質的に阻害しない。しかしながら、検出標識は、例えば、開裂又は分解によって取り外し可能であり得る。画像は、アレイ化された核酸特徴部への標識の組み込み後に捕捉することができる。特定の実施形態では、各サイクルは、アレイへの４つの異なるヌクレオチド型の同時送達を伴い、各ヌクレオチド型は、スペクトル的に異なる標識を有する。次に、４つの異なる標識の１つに選択的な検出チャネルをそれぞれ使用して、４つの画像を得ることができる。あるいは、異なるヌクレオチド型を順次追加することができ、各追加工程の間にアレイの画像を得ることができる。このような実施形態では、各画像は、特定の型のヌクレオチドを組み込んだ核酸特徴部を示す。各特徴部のシーケンスコンテンツが異なるため、様々な画像に様々な特徴部が存在するか、存在しない。しかしながら、特徴部の相対的な位置は、画像内で変わらないままである。このような可逆的ターミネーター－ＳＢＳ法から得られる画像は、本明細書に記載されるように保存、処理、及び分析することができる。画像捕捉工程に続いて、標識を除去することができ、その後のヌクレオチド添加及び検出のサイクルのために可逆的ターミネーター部分を除去することができる。特定のサイクルで検出された後、及び後続のサイクルの前に標識を除去すると、サイクル間のバックグラウンド信号及びクロストークを低減できるという利点がある。有用な標識及び除去方法の例を以下に記載する。

特定の実施形態では、ヌクレオチドモノマーの一部又は全ては、可逆的ターミネーターを含み得る。このような実施形態では、可逆的ターミネーター／開裂可能なフルオロフォアは、３’エステルを介してリボース部分に結合したフルオロフォアを含むことができる（Ｍｅｔｚｋｅｒ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１５：１７６７－１７７６（２００５）、これは参照により本明細書に組み込まれる）。他の手法は、ターミネーターの化学を蛍光標識の切断から分離している（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｕｐａｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：５９３２－７（２００５））。Ｒｕｐａｒｅｌ ｅｔ ａｌは、少量の３’アリル基を使用して伸長をブロックするが、パラジウム触媒で短時間処理することで簡単にブロックを解除できる可逆性ターミネーターの開発について説明している。フルオロフォアは、長波長ＵＶ光への３０秒の曝露によって容易に開裂することができる光開裂可能リンカーを介して基に付着された。したがって、ジスルフィド還元又は光開裂のいずれかを開裂可能なリンカーとして使用することができる。可逆的終端への別の手法は、ｄＮＴＰ上に嵩高な染料を配置した後に続く自然終端の使用である。ｄＮＴＰ上の帯電した嵩高な染料の存在は、立体障害及び／又は静電障害を介して効果的なターミネーターとして作用することができる。１つの組み込みイベントの存在は、染料が除去されない限り、それ以上の結合を防止する。染料の開裂は、フルオロフォアを除去し、終端を効果的に逆転させる。修飾ヌクレオチドの例はまた、米国特許第７，４２７，６７３号、及び同第７，０５７，０２６号に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載の方法及びシステムと共に利用することができる追加の例示的なＳＢＳシステム及び方法は、米国特許出願公開第２００７／０１６６７０５号、同第２００６／０１８８９０１号、同第２００６／０２４０４３９号、同第２００６／０２８１１０９号、同第２０１２／０２７０３０５号、及び同第２０１３／０２６０３７２号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第０５／０６５８１４号、米国特許出願公開第２００５／０１００９００号、並びに国際公開第０６／０６４１９９号及び国際公開第０７／０１０，２５１号に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

いくつかの実施形態は、４つ未満の異なる標識を使用する４つの異なるヌクレオチドの検出を使用することができる。例えば、ＳＢＳは、組み込まれた資料である米国特許公開第２０１３／００７９２３２号に記載される方法及びシステムを使用して実施することができる。第１の例として、ヌクレオチド型の対は、同じ波長で検出することができるが、対のうちの１つのメンバーに対する強度の差に基づいて、又は、対の他の部材について検出された信号と比較して明らかなシグナルを出現又は消失させる、対の１つのメンバーへの変化（例えば、化学修飾、光化学修飾、又は物理的改質を行うことを介して）に基づいて区別され得る。第２の例として、４つの異なるヌクレオチド型のうちの３つを特定の条件下で検出することができ、一方、第４のヌクレオチド型は、それらの条件下で検出可能な標識がないか、又はそれらの条件下で最小限に検出される（例えば、バックグラウンド蛍光による最小限の検出など）。最初の３つのヌクレオチド型を核酸に組み込むことは、それらの対応するシグナルの存在に基づいて決定することができ、第４のヌクレオチド型を核酸に組み込むことは、任意のシグナルの不在又は最小限の検出に基づいて決定することができる。第３の例として、１つのヌクレオチド型は、２つの異なるチャネルで検出される標識を含むことができ、一方、他のヌクレオチド型は、チャネルのうちの１つ以下で検出される。前述の３つの例示的な構成は、相互に排他的であるとは見なされず、様々な組み合わせで使用することができる。３つ全ての実施例を組み合わせた例示的な実施形態は、第１のチャネルで検出される第１のヌクレオチド型（例えば、第１の励起波長によって励起されたときに第１のチャネルで検出される標識を有するｄＡＴＰ）、第２のチャネルで検出される第２のヌクレオチド型（例えば、第２の励起波長によって励起されたときに第２のチャネルで検出される標識を有するｄＣＴＰ）、第１及び第２のチャネルの両方において検出される第３のヌクレオチド型（例えば、第１及び／又は第２の励起波長によって励起されたときに両方のチャネルで検出される少なくとも１つの標識を有するｄＴＴＰ）、及びいずれのチャネルでも検出されないか、又は最小限に検出される、標識のない第４のヌクレオチド型（例えば、標識のないｄＧＴＰ）を使用する蛍光ベースのＳＢＳ法である。

更に、組み込まれた資料である米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２号に記載のように、シークエンシングデータは、単一のチャネルを使用して得ることができる。このようないわゆる１つの染料シークエンシング方法では、第１のヌクレオチド型は標識されるが、第１の画像が生成された後に標識が除去され、第２のヌクレオチド型は、第１の画像が生成された後にのみ標識される。第３のヌクレオチド型は、第１及び第２の画像の両方においてその標識を保持し、第４のヌクレオチド型は、両方の画像において標識されていないままである。

いくつかの実施形態は、ライゲーション技術による配列決定を使用することができる。このような技術は、ＤＮＡリガーゼを使用してオリゴヌクレオチドを組み込み、そのようなオリゴヌクレオチドの組み込みを識別する。オリゴヌクレオチドは、典型的には、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列中の特定のヌクレオチドの同一性と相関する異なる標識を有する。他のＳＢＳ方法と同様に、標識されたシークエンシング試薬で核酸配列のアレイを処理した後、画像を得ることができる。各画像は、特定の型の標識を組み込んだ核酸特徴部を示す。各特徴部のシーケンスコンテンツが異なるため、様々な画像に様々な特徴部が存在するか、存在しないが、特徴部の相対的な位置は、画像内で変わらないままである。ライゲーションベースのシークエンシング方法から得られる画像は、本明細書に記載されるように保存、処理、及び分析することができる。本明細書に記載の方法及びシステムと共に利用することができる例示的なＳＢＳシステム及び方法は、米国特許第６，９６９，４８８号、同第６，１７２，２１８号、及び同第６，３０６，５９７号に記載されており、開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態は、ナノ細孔配列決定を利用することができる（Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．Ｗ．＆ Ａｋｅｓｏｎ，Ｍ．「Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｕｌｔｒａｒａｐｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．」Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，１４７－１５１（２０００）；Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．ａｎｄ Ｄ．Ｂｒａｎｔｏｎ，「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｂｙ ｎａｎｏｐｏｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３５：８１７－８２５（２００２）、Ｌｉ，Ｊ．，Ｍ．Ｇｅｒｓｈｏｗ，Ｄ．Ｓｔｅｉｎ，Ｅ．Ｂｒａｎｄｉｎ，ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｇｏｌｏｖｃｈｅｎｋｏ，「ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２：６１１－６１５（２００３）、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。そのような実施形態では、標的核酸はナノ細孔を通過する。ナノ細孔は、α－ヘモリジンなどの合成孔又は生体膜タンパク質であり得る。標的核酸がナノ細孔を通過するとき、各塩基対は、細孔の電気コンダクタンスの変動を測定することによって識別することができる。（米国特許第７，００１，７９２号、Ｓｏｎｉ，Ｇ．Ｖ．＆ Ｍｅｌｌｅｒ，「Ａ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｕｌｔｒａｆａｓｔ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅ ｎａｎｏｐｏｒｅｓ．」Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３，１９９６－２００１（２００７）；Ｈｅａｌｙ，Ｋ．「Ｎａｎｏｐｏｒｅ－ｂａｓｅｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ．」Ｎａｎｏｍｅｄ．２，４５９－４８１（２００７）；Ｃｏｃｋｒｏｆｔ，Ｓ．Ｌ．，Ｃｈｕ，Ｊ．，Ａｍｏｒｉｎ，Ｍ．＆ Ｇｈａｄｉｒｉ，Ｍ．Ｒ．「Ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｄｅｖｉｃｅ ｄｅｔｅｃｔｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．」Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０，８１８－８２０（２００８）、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ナノ細孔シークエンシングから得られるデータは、本明細書に記載されるように、保存、処理、及び分析することができる。具体的には、データは、本明細書に記載される光学画像及び他の画像の例示的な処理に従って、画像として処理することができる。

いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを含む方法を利用することができる。ヌクレオチドの組み込みは、例えば、米国特許第７，３２９，４９２号及び同第７，２１１，４１４号（両方とも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようなフルオロフォア含有ポリメラーゼとγ－リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用を介して検出することができ、又はヌクレオチドの組み込みは、例えば、米国特許第７，３１５，０１９号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようなゼロモード導波路、並びに、例えば、米国特許第７，４０５，２８１号及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号（両方とも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような蛍光ヌクレオチド類似体及び操作ポリメラーゼを使用して検出することができる照明は、蛍光標識されたヌクレオチドの組み込みが低バックグラウンドで観察され得るように、表面繋留ポリメラーゼの周囲のゼプトリットルスケールの体積に制限することができる（Ｌｅｖｅｎｅ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．「Ｚｅｒｏ－ｍｏｄｅ ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，６８２－６８６（２００３）；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．「Ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ．」Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３３，１０２６－１０２８（２００８）；Ｋｏｒｌａｃｈ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｚｅｒｏ－ｍｏｄｅ ｗａｖｅｇｕｉｄｅ ｎａｎｏ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５，１１７６－１１８１（２００８）、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。このような方法から得られる画像は、本明細書に記載されるように、記憶、処理、及び分析することができる。

いくつかのＳＢＳ実施形態は、伸長産物へのヌクレオチドの組み込み時に放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づくシークエンシングは、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ社（ギルフォード、コネチカット州、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社子会社）から市販されている電気検出器及び関連技術、又は米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号、同第２００９／０１２７５８９号、同第２０１０／０１３７１４３号、及び同第２０１０／０２８２６１７号に記載されており、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。結合平衡除外を使用してターゲット核酸を増幅するための本明細書に記載の方法は、プロトンを検出するために使用される基質に容易に適用することができる。より具体的には、本明細書に記載の方法を使用し、プロトンを検出するために使用されるアンプリコンのクローン集団を産生することができる。

上記のＳＢＳ方法は、複数の異なる標的核酸が同時に操作されるように、多重形式で有利に実施することができる。特定の実施形態では、異なる標的核酸は、共通の反応容器又は特定の基質の表面で処理することができる。これにより、シークエンシング試薬の簡便な送達、未反応試薬の除去、及び組み込みイベントの検出を多重に可能になる。表面結合された標的核酸を使用する実施形態では、標的核酸はアレイ形式であり得る。アレイ形式では、標的核酸は、典型的には、空間的に区別可能な様式で表面に結合され得る。標的核酸は、直接共有結合、ビーズ若しくは他の粒子への付着、又は表面に付着したポリメラーゼ若しくは他の分子への付着によって結合され得る。アレイは、各部位（特徴部とも呼ばれる）における標的核酸の単一コピーを含むか、又は同じ配列を有する複数のコピーは、各部位若しくは特徴部に存在することができる。複数のコピーは、以下で更に詳細に記載されるブリッジ増幅又はエマルジョンＰＣＲ等の増幅方法によって産生することができる。

本明細書に記載の方法は、例えば、少なくとも約１０個の特徴部／ｃｍ^２、１００個の特徴部／ｃｍ^２、５００個の特徴部／ｃｍ^２、１，０００個の特徴部／ｃｍ^２、５，０００個の特徴部／ｃｍ^２、１０，０００個の特徴部／ｃｍ^２、５０，０００個の特徴部／ｃｍ^２、１００，０００個の特徴部／ｃｍ^２、１，０００，０００個の特徴部／ｃｍ^２、５，０００，０００個の特徴部／ｃｍ^２、又はそれ以上を含む、様々な密度のいずれかの特徴部を有するアレイを使用することができる。

本明細書に記載の方法の利点は、複数の標的核酸の迅速かつ効率的な検出を、並行な提供することである。したがって、本開示は、上記で例示されるものなどの当技術分野において既知の技術を使用して核酸を調製及び検出することができる統合システムを提供する。したがって、本開示の統合システムは、増幅試薬及び／又はシークエンシング試薬を１つ又は複数の固定化されたＤＮＡ断片に送達することができる流体成分を含むことができ、システムは、ポンプ、弁、リザーバー、流体ラインなどの構成要素を含む。フローセルは、標的核酸を検出するための統合システムで構成及び／又は使用することができる。例示的なフローセルは、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８号及び米国特許出願第１３／２７３，６６６号に記載されおり、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる。フローセルについて例示されるように、統合システムの流体成分の１つ又はそれ以上を増幅方法及び検出方法に使用することができる。核酸シークエンシングの実施形態を一例として取ると、統合システムの流体構成要素の１つ又は複数を、本明細書に記載の増幅方法、及び上記に例示したようなシークエンシング方法におけるシークエンシング試薬の送達に使用することができる。あるいは、統合システムは、増幅方法を実行し、検出方法を実行するための別個の流体システムを含み得る。増幅された核酸を作成し、また核酸の配列を決定することができる統合配列決定システムの例としては、ＭｉＳｅｑ（商標）プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及び参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／２７３，６６６号に記載のデバイスが挙げられるが、これらに限定されない。

上述した実施形態のいくつかの態様が、以下の実施例において更に詳細に開示されるが、これらは、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。

実施例１
熱安定性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの進化
この実施例は、ランダム変異誘発及び同定された変異の組合わせによる熱安定性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの進化を実証する。約１０，０００個のＴｄＴ変異体をスクリーニングした後、触媒特性を維持しながら、ＳＵＭＯ－ＴｄＴよりも１０℃高い熱安定性を有するＴｄＴ３－２が見出された。

変異体ライブラリは、ランダム変異誘発を介して生成した。第１の変異体ライブラリは、親鋳型としてＳＵＭＯ－ＴｄＴを使用した。本開示におけるＳＵＭＯ－ＴｄＴは、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）ＴｄＴのアミノ酸１３９～５２０と、溶解性及び発現を改善するＮ末端ＳＵＭＯタグと、を含む組換えＴｄＴを指す。表１は、ＳＵＭＯ－ＴｄＴの配列を示す。図２は、ＳＵＭＯ－ＴｄＴ（配列番号１４）と、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴ（配列番号１２）のアミノ酸１３９～５２０（配列番号１）との非限定的な例示的配列アラインメントを示す。２７９０変異体のライブラリを４７℃で１分間熱処理してスクリーニングした。このラウンドでは、熱安定性変異体ＴｄＴ１－１及びＴｄＴ１－２を熱安定性として同定した（表２Ａ及び２Ｂ）。ＴｄＴ１－１及びＴｄＴ１－２は、ＳＵＭＯ－ＴｄＴと比較して、熱処理なしの場合、及び熱処理有の場合に、著しく高いＦＲＥＴ読み出しを有する。また、ＴｄＴ１－１及びＴｄＴ１－２は、熱処理後にそれらの活性の割合がより大きい。

第２ラウンドのスクリーニングのために、ＴｄＴ１－１を親として使用して７６３６のライブラリサイズを生成した。ＴｄＴ１－１はＴｄＴ１－２と比較して熱処理なしのＦＲＥＴ読み出しが高かったため、ＴｄＴ１－１を親鋳型として選択した。ＴｄＴ変異体のＦＲＥＴ読み出しは、ＴｄＴ変異体の酵素活性を示した。第２ラウンドのスクリーニングを５０℃で１分間熱処理して行い、４つの熱安定性変異体を同定した（ＴｄＴ２－１、ＴｄＴ２－２、ＴｄＴ２－３、ＴｄＴ２－４）（表２Ａ及び２Ｂ）。４つの変異体は、熱処理なし及び熱処理条件下の両方で、ＴｄＴ１－１よりも有意に高いＦＲＥＴ読み出しを有する。４つ全ての変異体はまた、５０℃で１分間供した後、それらの活性のはるかに高い割合を保持した。

ＴｄＴ２－１、ＴｄＴ２－２、ＴｄＴ２－３、及びＴｄＴ２－４から同定された変異の組合わせは、熱安定性の相乗的な増加をもたらすと推測された。熱安定性スクリーニングの第３のラウンドでは、２つの変異体ライブラリを作製した。変異体ライブラリのうちの１つは、ＴｄＴ２－１、ＴｄＴ２－２、ＴｄＴ２－３、及びＴｄＴ２－４に見出される変異の異なる組合わせを有するＴｄＴ１－１鋳型に基づく。他の変異体ライブラリを、ＴｄＴ１－３を親鋳型として利用することを除いて同様に作製した。ＴｄＴ１－３は、ＴｄＴ１－１及びＴｄＴ１－２の変異の組合わせから構成されていた（表２Ａ及び２Ｂ）。ＴｄＴ１－１ベースの変異体ライブラリを５５℃で１分間の熱ショックでスクリーニングした。このライブラリから上位変異体として特定されたＴｄＴ３－１（表２Ａ及び２Ｂ）は、熱ショックの有無にかかわらずはるかに高いＦＲＥＴ読み出しを有し、熱ショック後のそのＦＲＥＴ活性のより高い割合を保持した。ＴｄＴ１－３ベースの変異体ライブラリの１分間にわたる５８℃での熱処理によるスクリーニングは、室温及び熱ショック処理の両方で有意に高いＦＲＥＴ読み出しを有するＴｄＴ３－２の発見をもたらした（表２Ａ及び２Ｂ）。ＴｄＴ３－２は、５８℃に１分間かけた後、そのＦＲＥＴ活性の少なくとも半分を保持した。これは、ＴｄＴ３－２がＴｄＴ１－３よりも有意に活性であり、熱安定性が高いことを示唆している。表２Ａ及び２Ｂに示されるように、ＴｄＴ３－２は、Ｔ３２６Ｓを除いて、各ラウンドのスクリーニングからの上位変異体から同定された変異の大部分を担持する。表１は、ＴｄＴ３－２のアミノ酸配列を示す。

４７℃で、取込みを有するバンドの強度が５分間、１０分間及び２０分間同じままであるので、市販のＴｄＴ及びＳＵＭＯ－ＴｄＴを５分以内に変性させた。対照的に、ＴｄＴ３－２は２０分間活性であり、２０分間の反応でより多くの取込みが見られた。５８℃では、市販のＴｄＴ及びＳＵＭＯ－ＴｄＴは活性ではなかったが、バンドの強度がその後同じままであるので、ＴｄＴ３－２は５分以内に変性した。この観察は、ＴｄＴ３－２がＳＵＭＯ－ＴｄＴよりも熱安定性が高く、ＴｄＴ３－２がより高い温度で依然として活性であることを確認する。

まとめると、これらのデータは、この実施例で同定された９つのアミノ酸置換が、個別に又は任意の組合わせで、ＴｄＴ触媒活性を維持しながら、アミノ酸置換（複数可）を含むＴｄＴ変異体の熱安定性を増加させることができることを示している。更に、この実施例で特定されたＴｄＴ変異体は、ＴｄＴ触媒活性を維持しながら熱安定性であり得る。

実施例２
複数の修飾塩基を組み込んだ一本ＤＮＡ分子の生成
この実施例は、ＴｄＴ変異体を使用して、複数の修飾塩基を組み込んだ一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子を生成することを実証する。

修飾ヌクレオチドを組み込んだ足場（例えば、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）足場）を生成することができる。足場は、鋳型分子の複数のコピーの「担体」として機能することができる。鋳型分子の複数のコピーを有する担体は、立体衝突又は障害によって他の高分子が同じウェルを占有することを排除することによって、基板（例えば、１００、１，０００、１０，０００以上のウェル等の複数のウェルを含むフローセル）上の単一ウェル（例えば、マイクロウェル）を占有することができるナノ粒子であり得る。それぞれ１つのナノ粒子を有する基材上の単一ウェルは、単クローン性をもたらすか、又は単クローン性に近い可能性がある。あるいは、ｓｓＤＮＡ足場は、鋳型の単一のコピーを担持することができる。足場は、アンカーオリゴの逆相補体の複数のコピー又はアンカーオリゴの逆相補体を有することができる。足場は、アンカーオリゴの逆相補体の複数のコピーの存在又はアンカーオリゴの逆相補体の存在のために、所与のウェル中の全ての「アンカー」オリゴを結合及び封鎖することができ、したがって、単一の鋳型をウェルごとに捕捉することができる。

そのようなｓｓＤＮＡ足場を生成又は構築するための１つの方法は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）等のｓｓＤＮＡポリメラーゼを使用して、塩基上のアジド基等の修飾を有するヌクレオチドをプライマー鎖にランダムに組み込む。しかしながら、市販のＴｄＴは、おそらく立体衝突による複数の連続塩基修飾ヌクレオチドを容易に組み込まない。

熱安定性ＴｄＴ変異体（本明細書ではＴｄＴ３－２又はＣＭ１２と呼ばれる）は、塩基修飾ヌクレオチドを組み込むことにおいて、市販のＮＥＢ ＴｄＴよりもはるかに良好であった。この特性は、ＮＥＢ由来の市販のＴｄＴ及びＴｄＴ３－２を、塩基にコンジュゲートしたＰＥＧ鎖を有するヌクレオチドの組込みについて試験した際に発見された。ＮＥＢ ＴｄＴは、一般に１～２個のＰＥＧ－ヌクレオチドを組み込んだ後に停止し、一方、ＴｄＴ３－２は、複数のＰＥＧ－ヌクレオチドを連続して組み込んだ。

したがって、この変異体は、モノクローナルクラスタリングのための本開示の「担体」の生成を含む、異なる目的のための様々な種類の塩基修飾ヌクレオチドを担持するｓｓＤＮＡの生成のための優れた触媒を表す。

図３は、アジド－ＰＥＧ４－アミノアリル－ｄＵＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；＃ＮＵ－１７０５Ｓ）（この実施例ではアジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰ又はＡｚ－Ｕと呼ばれる）の、ＴｄＴ３－２又は市販のＮＥＢ ＴｄＴによる５－カルボキシフルオレセイン（５’ＦＡＭ）標識オリゴヌクレオチドプライマー上への組込みの試行を示す非限定的な例示的ゲルグラフである。上記のように、個々のレーンでは、１００％アジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰ又は５０％アジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰ＋５０％ｄＮＴＰを用いて、ＴｄＴ３－２又はＮＥＢ ＴｄＴのいずれかで異なる反応を設定した。図３のレーン１及び３を比較すると、６０分で、ＴｄＴ３－２が、ＮＥＢからの市販のＴｄＴと比較して（レーン３の隣のアスタリスクによって示される生成物を参照）、アジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰをはるかに組み込むことができた（レーン１の隣のアスタリスクによって示される生成物を参照されたい）。ＴｄＴ３－２は、市販のＮＥＢ ＴｄＴと比較して、１００％アジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰの存在下で大幅に改善された複数の組込みを示した（アスタリスクの隣のバンドを比較）。図３のレーン３に示すように、ＮＥＢ ＴｄＴはアジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰを非常にゆっくりと組み込んだ。ＮＥＢ ＴｄＴは、６０分等の長時間の後にのみ、５つ～７つの分子のアジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰを組み込むことができた。レーン２及び４は、アジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰ及びｄＮＴＰの５０：５０混合物を使用し、その後、ＮＥＢ ＴｄＴは、レーン３で見られるＮＥＢ ＴｄＴによる１００％アジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰの制限された組み込みがより低い活性によるものではなく、むしろ、ＰＥＧ修飾ヌクレオチドデータと一致する塩基修飾ヌクレオチドの連続的な組込みから生じる立体衝突によるものであったことを示した。

図４Ａ～図４Ｂは、１分間及び６０分間の市販のＮＥＢ ＴｄＴによるアジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰ及び天然ヌクレオチドによるＴｄＴ伸長の結果を示している非限定的な例示的ゲルグラフである。図４Ａは、良好な組込みが１分で見られたことを示す（左側（ＬＨＳ）半分）。ジベンゾシクロオクチン－Ｃｙ３（ＤＢＣＯ－Ｃｙ３）の添加は機能するように見えたが、高強度のヌクレオチド－ＤＢＣＯ－Ｃｙ３コンジュゲートによって影が薄くなった（右側（ＲＨＳ）の半分の小塊）。図４Ｂは、６０分のインキュベーションがはるかに高い分子量生成物をもたらしたことを示す。より高いアジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰヌクレオチド濃度では、ＤＢＣＯ－Ｃｙ３の添加は、生成物の消失をもたらし（ＬＨＳ半分及びＲＨＳ半分のアスタリスクを参照）、コンジュゲーションが成功したことを示唆している。

図５Ａ～５Ｃは、ＴｄＴ３－２及び市販のＮＥＢ ＴｄＴによって、アジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰ又はＮ６－（６－アジド）ヘキシル－ｄＡＴＰ（この例ではアジド－ヘキシル－ｄＡＴＰ又はＡｚ－Ａと呼ばれる）を用いたＴｄＴ伸長の結果を示す非限定的な例示的なゲルグラフである。図５Ａは、アジド－ｄＵの数回の組込みが、ＮＥＢ ＴｄＴよりもＴｄＴ３－２で見られたことを示す。図５Ｂは、純粋なアジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰ（左側の最初のレーン）で見られる数十の組込みを示す。ｄＮＴＰとの混合により、ＮＥＢ ＴｄＴを有する高ＭＷ生成物が得られたが、組み込まれているアジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰの割合は不明であった。ＰＥＧ４－ｄＵＴＰは、試験した条件でアジド－ヘキシル－ｄＡＴＰよりも良好に機能するようであった。図５Ｂに可視化されたゲルをＳＹＢＲ－Ｇｏｌｄで染色し、図５Ｃで視覚化した。

したがって、ＴｄＴ３－２の変異は、より高い熱安定性を可能にすることとは別に、塩基修飾ヌクレオチドの組込みにおけるより大きな柔軟性も可能にした。この特性は、ｓｓＤＮＡ足場の生成及び塩基修飾ヌクレオチドの連続的な組込みが必要とされる他の用途において非常に興味深い。例えば、ＴｄＴ３－２は、アジド－ＰＥＧ４－ｄＵＴＰヌクレオチドの連続付加を含む足場を生成するための触媒として使用することができる。次いで、好適な部分は、例えば、クリック化学を使用してアジド基にコンジュゲートされる。

まとめると、これらのデータは、ＴｄＴのアミノ酸置換が熱安定性を改善し、アミノ酸置換を含むＴｄＴが複数の塩基修飾ヌクレオチドを組み込む能力を改善できることを示している。

用語
前述の実施形態のうちの少なくともいくつかにおいて、一実施形態で使用される１つ又は複数の要素は、このような交換が技術的に実行可能でない場合を除いて、別の実施形態で互換的に使用することができる。当業者であれば、特許請求される主題の範囲から逸脱することなく、上記の方法及び構造に、種々のその他の省略、追加、及び修正がなされてもよいことを理解するであろう。このような修正及び変更は全て、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、主題の範囲内に含まれることが意図される。

本明細書における実質的に任意の複数形及び／又は単数形の用語の使用について、当業者は、文脈及び／又は用途に適切なように、複数形から単数形に、及び／又は単数形から複数形に置き換えることができる。明確性のために、種々の単数形／複数形の順列が本明細書に明示的に記載されてもよい。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでない旨を明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書における「又は」への任意の言及は、特に指示しない限り、「及び／又は」を包含することを意図する。

全般的に、本明細書で使用される用語、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本体）で使用される用語は、概して、「オープン」ターム（open terms）として意図される（例えば、用語「含む（including）」は、「～を含むがこれらに限定されない（including but not limited to）」と解釈されるべきであり、用語「有する（having）」は、「少なくとも有する（having at least）」と解釈されるべきであり、用語「含む（includes）」は、「～を含むがこれらに限定するものではない（includes but is not limited to）」と解釈されるべきであるなど）ことが、当業者によって理解されるであろう。導入された請求項記載の具体的な数が意図されている場合、このような意図が請求項に明示的に列挙され、このような記載がない場合、このような意図は存在しないことも、当業者には更に理解されるであろう。例えば、理解を助けるために、以下の添付の特許請求の範囲は、請求項の記載を導入するための導入句「少なくとも１つの（at least one）」及び「１つ又は複数の（one or more）」の使用を含んでもよい。しかしながら、このような語句の使用は、同じ請求項が、「１つ又は複数の」又は「少なくとも１つの」、及び「ａ」若しくは「ａｎ」などの不定冠詞を含む（例えば、「ａ」及び／又は「ａｎ」が、「少なくとも１つの」又は「１つ又は複数の」の意味に解釈されるべきである）場合であっても、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による請求項記載の導入が、このような導入された請求項記載を含む任意の特定の請求項を、このような記載のうちの１つのみを含む実施形態に限定するものと解釈すべきではなく、請求項記載を導入するために使用される不定冠詞の使用についても同じく当てはまる。更に、導入された請求項記載の具体的な数が明示的に列挙されている場合であっても、このような記載が、少なくとも列挙された数の意味（例えば、「２つの記載」の無修飾の記載は、その他の修飾がないと、少なくとも２つの記載又は２つ以上の記載を意味する）で解釈されるべきであることを、当業者は認識するであろう。更に、「Ａ、Ｂ、及びＣなどのうちの少なくとも１つ」と類似した常套句が使用される場合には、全般的に、このような構造は、当業者がこの常套句を理解するであろう意味において意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」としては、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢともに、Ａ及びＣともに、Ｂ及びＣともに、並びに／又はＡ、Ｂ、及びＣともに、などを有するシステムが挙げられるが、これらに限定されない）。「Ａ、Ｂ、又はＣなどのうちの少なくとも１つ」と類似した常套句が使用される場合には、全般的に、このような構造は、当業者がこの常套句を理解するであろう意味において意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」としては、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢともに、Ａ及びＣともに、Ｂ及びＣともに、並びに／又はＡ、Ｂ、及びＣともに、などを有するシステムが挙げられるが、これらに限定されない）。本明細書、特許請求の範囲、又は図面にかかわらず、２つ以上の代替用語を提示する実質上任意の離接語及び／又は語句は、用語のうちの１つ、用語のいずれか、又は両方の用語を含む可能性を企図することが理解されるべきであると、当業者には更に理解されるであろう。例えば、語句「Ａ又はＢ」は、「Ａ」又は「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むと理解されるであろう。

加えて、本開示の特徴又は態様がマーカッシュ群の観点で記載されている場合、それによって、当業者は、本開示がまた、マーカッシュ群の構成要素の任意の個々の構成要素又はサブグループの観点でも記載されていることを認識するであろう。

当業者には理解されるように、書面による説明を提供するという観点からなどの任意の及び全ての目的において、本明細書に開示される全ての範囲はまた、任意の及び全ての可能なサブ範囲並びにそれらのサブ範囲の組合わせも包含する。任意の列挙された範囲は、同じ範囲が、少なくとも等半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解されることを十分に記載し可能にするものとして容易に認識することができる。非限定的実施例として、本明細書で説明される各範囲は、下部３分の１、中部３分の１、及び上部３分の１などに容易に分解することができる。また、当業者には理解されるように、「最大で（up to）」、「少なくとも（at least）」、「より大きい（greater than）」、「より小さい（less than）」などの全ての言語は、列挙された数を含み、続いて上述のように下位範囲に分解され得る範囲を指す。最後に、当業者には理解されるように、範囲は、各個々の構成要素を含む。したがって、例えば、１～３個の物品を有する群は、１個、２個、又は３個の物品を有する群を意味する。同様に、１～５個の物品を有する群は、１個、２個、３個、４個、又は５個の物品を有する群などを意味する。

本明細書では様々な態様及び実施形態が開示されてきたが、他の態様及び実施形態は、当業者には明らかであろう。本明細書に開示される様々な態様及び実施形態は、説明のためのものであり、以下の特許請求の範囲によって示される真の範囲及び趣旨により、限定することを意図するものではない。

Claims (162)

1. 核酸を修飾する方法であって、
   （ａ）一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）及び修飾塩基を含むヌクレオシド三リン酸を提供する工程と、
   （ｂ）前記ｓｓＤＮＡ及び前記修飾塩基を含むヌクレオシド三リン酸を、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）と接触させて、ｓｓＤＮＡ足場を生成する工程であって、前記ｓｓＤＮＡ足場は、前記ヌクレオシド三リン酸から前記修飾塩基を含む１つ又は複数のヌクレオチドで組み込まれた前記ｓｓＤＮＡを含む、工程と、
   を含み、
   前記組換えＴｄＴが、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含み、前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２０と機能的に同等の１つ又は複数の位置に、１つ又は複数のアミノ酸置換変異を含む、核酸を修飾する方法。
2. （ｃ）前記ｓｓＤＮＡ足場を、第１のアダプタ配列を含む第１のアダプタオリゴヌクレオチド及び第２のアダプタ配列を含む第２のアダプタオリゴヌクレオチドと接触させて、前記第１のアダプタオリゴヌクレオチド及び前記第２のアダプタオリゴヌクレオチドに付着した前記ｓｓＤＮＡ足場を含む核酸担体を生成する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記ｓｓＤＮＡ足場を前記第１のアダプタオリゴヌクレオチドと接触させることが、前記ｓｓＤＮＡ足場を、前記第１のアダプタオリゴヌクレオチド及び第１のポリマーを含む第１のアダプタと接触させる工程を含む、請求項１～２のいずれか一項に記載の方法。
4. 前記ｓｓＤＮＡ足場を前記第２のアダプタオリゴヌクレオチドと接触させることが、前記ｓｓＤＮＡ足場を、前記第２のアダプタオリゴヌクレオチド及び第２のポリマーを含む第２のアダプタと接触させる工程を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記第１のアダプタが、共有結合した前記第１のアダプタオリゴヌクレオチドを含み、前記第２のアダプタが、共有結合した前記第２のアダプタオリゴヌクレオチドを含む、請求項３～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ｓｓＤＮＡ足場が第３のポリマーを含む、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。
7. （ｄ）前記第１のアダプタ配列、又はその逆相補体、前記第２のアダプタ配列、又はその逆相補体、及び核酸ハイブリダイゼーション配列を含む核酸鋳型を提供する工程と、
   （ｅ）前記核酸担体を前記核酸鋳型と接触させて、前記核酸鋳型の核酸ハイブリダイゼーション配列を介して前記核酸担体の鋳型捕捉部位にハイブリダイズした前記核酸鋳型を有する前記核酸担体を生成する工程と、
   （ｆ）複数の増幅された核酸を生成するために、前記核酸鋳型とハイブリダイズした前記核酸担体上で増幅を実行して、前記複数の増幅された核酸の各々が前記核酸鋳型の配列を含むように伸長された、前記第１のアダプタオリゴヌクレオチド、及び前記第２のアダプタオリゴヌクレオチド、又はそれらの逆相補体を生成する工程と、
   （ｇ）前記複数の増幅された核酸を使用して前記核酸鋳型の配列を決定する工程と、
   を更に含む、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 核酸を修飾する方法であって、
   （ａ）第１の核酸及び第１の修飾塩基を含む第１のヌクレオシド三リン酸を提供する工程と、
   （ｂ）前記第１の核酸及び前記第１の修飾塩基を含む前記第１のヌクレオシド三リン酸を、第１の反応において第１の温度で第１の反応時間、組換え末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）と接触させて、第２の核酸を生成させる工程であって、前記第２の核酸が、前記第１のヌクレオシド三リン酸からの前記第１の修飾塩基を含む１つ又は複数の第１のヌクレオチドが組み込まれた前記第１の核酸を含む、工程と、
   を含み、
   前記組換えＴｄＴが、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含み、前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２０と機能的に同等の１つ又は複数の位置に、１つ又は複数のアミノ酸置換変異を含む、核酸を修飾する方法。
9. 前記第１の核酸及び前記第２の核酸の１つ又は複数が、一本鎖核酸、３’オーバーハングを有する二本鎖核酸、３’凹部を有する二本鎖核酸、又はそれらの組合わせを含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記第１の核酸及び前記第２の核酸のうちの１つ又は複数が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む、請求項８～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記第１の核酸及び前記第２の核酸のうちの１つ又は複数のヌクレオチドの少なくとも５０％が、デオキシリボヌクレオチドを含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記第１の核酸及び前記第２の核酸の１つ又は複数が一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）を含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記第１の核酸及び前記第２の核酸のうちの１つ又は複数が、少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記第２の核酸が、前記第１の修飾塩基を含む前記第１のヌクレオチドの２つ以上又は３つ以上が組み込まれた前記第１の核酸を含む、請求項８～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記第２の核酸中の前記第１の修飾塩基を含む前記第１のヌクレオチドのうちの２以上又は３以上が連続している、請求項１４に記載の方法。
16. 前記第１のヌクレオシド三リン酸の前記第１の修飾塩基が、修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシン、修飾チミン、又は修飾ウラシルを含む、請求項８～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 第１のヌクレオシド三リン酸が、５－（１５－アジド－４，７，１０，１３－テトラオキサ－ペンタデカノイル－アミノアリル）－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸（アジド－ＰＥＧ４－アミノアリル－ｄＵＴＰ）、Ｎ^６－（６－アジド）ヘキシル－３’－デオキシアデノシン－５’－三リン酸（Ｎ^６－（６－アジド）ヘキシル－３’－ｄＡＴＰ）、又はそれらの組合わせを含む、請求項８～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記第１のヌクレオシド三リン酸が、共有結合した前記第１の修飾塩基及び第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドを含む、請求項８～１６のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記第１の反応時間が少なくとも１秒である、請求項８～１７のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記第１の温度が、少なくとも１６℃～少なくとも５８℃である、請求項８～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記第１の反応における前記第１の核酸の濃度が、少なくとも１０ｎＭである、請求項８～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記第１の反応における前記第１のヌクレオシド三リン酸の濃度が、少なくとも０．１μＭである、請求項８～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記第１の反応における前記組換えＴｄＴの濃度が、少なくとも１０ｎＭである、請求項８～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記第１の核酸及び前記第１の修飾塩基を含む前記第１のヌクレオシド三リン酸を提供することが、前記第１の核酸と、前記第１の修飾塩基を含む前記第１のヌクレオシド三リン酸と、第２のヌクレオシド三リン酸と、を提供することを含み、
    前記第１の核酸及び前記第１の修飾塩基を含む前記第１のヌクレオシド三リン酸を前記組換えＴｄＴと接触させることが、前記第１の反応において、前記第１の温度で前記第１の反応時間、前記第１の核酸、前記第１の修飾塩基を含む前記第１のヌクレオシド三リン酸、及び前記第２のヌクレオシド三リン酸を、前記組換えＴｄＴと接触させて、前記第２の核酸を生成することを含み、
    前記第２の核酸が、（ｉ）前記第１のヌクレオシド三リン酸からの前記第１の修飾塩基を含む前記第１のヌクレオチドの１つ又は複数と、（ｉｉ）１つ又は複数の第２のヌクレオチドとが組み込まれた前記第１の核酸を含む、
    請求項８～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記１つ又は複数の第２のヌクレオチドのそれぞれが、前記第２のヌクレオシド三リン酸からの第２の修飾塩基を含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記第２のヌクレオシド三リン酸の前記第２の修飾塩基が、修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシン、修飾チミン、又は修飾ウラシルを含む、請求項２５に記載の方法。
27. 前記第１のヌクレオシド三リン酸の前記第１の修飾塩基及び前記第２のヌクレオシド三リン酸の前記第２の修飾塩基が、同じ未修飾塩基の修飾を含む、請求項２５～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記第１のヌクレオシド三リン酸の前記第１の修飾塩基及び前記第２のヌクレオシド三リン酸の前記第２の修飾塩基が、異なる未修飾塩基の修飾を含む、請求項２５～２６のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記第２のヌクレオシド三リン酸が、共有結合した前記第２の修飾塩基及び第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドを含む、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記第２のヌクレオチドの各々が、前記第２のヌクレオシド三リン酸からの第２の未修飾塩基を含む、請求項２４に記載の方法。
31. 前記第２のヌクレオシド三リン酸の前記第２の未修飾塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、チミン又はウラシルを含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記第１の修飾塩基が、前記第２の未修飾塩基の修飾を含む、請求項３０～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記第１の修飾塩基を含む前記第１のヌクレオシド三リン酸及び前記第２のヌクレオシド三リン酸が、約１：１００～約１００：１の範囲の比で前記第１の核酸と接触する、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記第１の修飾塩基を含む前記第１のヌクレオチド及び前記第２のヌクレオチドが、約１：１００～約１００：１の範囲の比で前記第２の核酸に組み込まれる、請求項２４～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記第１の核酸及び前記第１の修飾塩基を含む前記第１のヌクレオシド三リン酸を提供することが、前記第１の核酸、前記第１の修飾塩基を含む前記第１のヌクレオシド三リン酸、及び複数の第２のヌクレオシド三リン酸を提供することを含み、
    前記第１の核酸及び前記第１の修飾塩基を含む前記第１のヌクレオシド三リン酸を前記組換えＴｄＴと接触させることが、前記第１の反応において、前記第１の温度で前記第１の反応時間、前記第１の核酸、前記第１の修飾塩基を含む前記第１のヌクレオシド三リン酸、及び前記複数の第２のヌクレオシド三リン酸を、前記組換えＴｄＴと接触させて、前記第２の核酸を生成することを含み、
    前記第２の核酸が、前記第１の修飾塩基を含む前記第１のヌクレオチドのうちの１つ又は複数と、前記複数の第２のヌクレオシド三リン酸からの１つ又は複数の第２のヌクレオチドとを組み込んだ前記第１の核酸を含む、
    請求項８～２０のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記複数の第２ヌクレオシド三リン酸が、デオキシリボースアデニン三リン酸、デオキシリボースグアニン三リン酸、デオキシリボースシトシン三リン酸、デオキシリボースチミン三リン酸、デオキシリボースウラシル三リン酸、又はそれらの組合わせを含む、請求項３５に記載の方法。
37. 前記複数の第２のヌクレオシド三リン酸のうちの２つを、約１：１００～約１００：１の範囲の比で前記第１の核酸と接触させる、請求項３５～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記第２のヌクレオチドのうちの２つが、約１：１００～約１００：１の範囲の比で前記第２の核酸に組み込まれる、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記複数の第２のヌクレオシド三リン酸のうちの少なくとも１つ、又はそれぞれが、第２の未修飾塩基を含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記複数の第２のヌクレオシド三リン酸のうちの少なくとも１つ、又はそれぞれが、第２の修飾塩基を含む、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の方法。
41. ヌクレオチドの修飾塩基及び未修飾塩基が、約１：１００～約１００：１の範囲の比で前記第２の核酸に組み込まれる、請求項８～４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記修飾塩基が、前記第１の修飾塩基及び前記第２の核酸に組み込まれた前記複数の第２のヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、又はそれぞれを含む、請求項４１に記載の方法。
43. 前記未修飾塩基が、前記第２の核酸に組み込まれた前記複数の第２のヌクレオチドの少なくとも１つ又はそれぞれを含む、請求項４１～４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 前記第２の核酸の前記ヌクレオチド塩基の少なくとも１％が、修飾塩基を含む、請求項３５～４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記修飾塩基が、前記第２の核酸全体に分布している、請求項４４に記載の方法。
46. 前記修飾塩基が、前記第２の核酸全体にランダムに分布している、請求項４５に記載の方法。
47. 前記第２の核酸が、複数の２つ以上の連続した修飾塩基を含む、請求項４４～４６のいずれか一項に記載の方法。
48. 前記複数の連続した修飾塩基が、３つ以上の連続した修飾塩基を含む、請求項４７に記載の方法。
49. 前記第２の核酸の前記ヌクレオチド塩基の少なくとも１％が、前記第１の修飾塩基を含む、請求項８～４８のいずれか一項に記載の方法。
50. 前記第１の核酸が、核酸鋳型に結合することができる鋳型捕捉部位を含む、請求項８～４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記鋳型捕捉部位が、鋳型捕捉配列を含み、前記核酸鋳型が、前記鋳型捕捉配列の逆相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、前記鋳型捕捉配列にハイブリダイズすることができる配列を含む、請求項５０に記載の方法。
52. 前記核酸鋳型が一本鎖ＤＮＡを含む、請求項５１に記載の方法。
53. 前記第１のヌクレオシド三リン酸の前記第１の修飾塩基及び前記第２の核酸中の前記第１のヌクレオチドのうちの１つ又は複数が、官能基を含む、請求項８～５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 前記第１の修飾塩基の前記官能基が、クリック化学反応に関与することができる、請求項５３に記載の方法。
55. 前記第１のヌクレオシド三リン酸の前記第１の修飾塩基及び前記第２の核酸の前記第１のヌクレオチドが、飽和又は不飽和、置換又は非置換の直鎖又は分岐脂肪族炭素鎖を含む、請求項５３～５４のいずれか一項に記載の方法。
56. 前記官能基及び前記第１修飾塩基の塩基が、前記飽和又は不飽和、置換又は非置換の直鎖又は分岐脂肪族炭素鎖によって連結された前記第１修飾塩基の両端にある、請求項５５に記載の方法。
57. 第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドを提供する工程と、
    第２の反応において第２の温度で第２の反応時間にわたって前記第２の核酸を前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドと接触させて、前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドのうちの１つ又は複数に付着した前記第２の核酸を含む第３の核酸を生成する工程と、
    を更に含む、請求項８～５６のいずれか一項に記載の方法。
58. 前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドを提供することが、前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドを提供することを含み、
    前記第２の核酸を前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドと接触させることが、前記第２の反応において前記第２の温度で前記第２の反応時間、前記第２の核酸を前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドと接触させて、１つ又は複数の前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び１つ又は複数の前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドに付着した前記第２の核酸を含む前記第３の核酸を生成することを含む、
    請求項５７に記載の方法。
59. 前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドが、第１のアダプタ配列又はその逆相補体を含む、請求項５７～５８のいずれか一項に記載の方法。
60. 前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドが、第２のアダプタ配列又はその逆相補体を含む、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の方法。
61. 前記第１のアダプタ配列がＰ５配列を含む、請求項５９～６０のいずれか一項に記載の方法。
62. 前記第２のアダプタ配列がＰ７配列を含む、請求項５９～６１のいずれか一項に記載の方法。
63. 前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドのうちの１つ又は複数が、約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド長である、請求項５７～６２のいずれか一項に記載の方法。
64. 前記第３の核酸が、約１０～約１，０００，０００の前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドの含む、請求項５７～６３のいずれか一項に記載の方法。
65. 前記第３の核酸が、約１０～約１，０００，０００の前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドを含む、請求項５７～６４のいずれか一項に記載の方法。
66. 前記第３の核酸が、前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドのうちの１つ又は複数に付着した前記第２の核酸を含む、請求項５７～６５のいずれか一項に記載の方法。
67. 前記第３の核酸が、前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドのうちの１つ又は複数に付着した前記第２の核酸を含む、請求項５７～６６のいずれか一項に記載の方法。
68. 前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドを提供することが、前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び第１のポリマーを含む第１のアクセサリーを提供することを含み、前記第２の核酸を前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドと接触させることが、前記第２の反応において、前記第２の温度で前記第２の反応時間、前記第２の核酸を前記第１のアクセサリーと接触させて、前記第１のアクセサリーの１つ又は複数に付着した前記第２の核酸を含む前記第３の核酸を生成することを含む、請求項５７～６７のいずれか一項に記載の方法。
69. 前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドを提供することが、前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び第２のポリマーを含む第２のアクセサリーを提供することを含み、及び／又は前記第２の核酸を前記第２のアクセサリーと接触させることが、前記第２の反応において、前記第２の温度で前記第２の反応時間、前記第２の核酸を前記第２のアクセサリーと接触させて、前記第２のアクセサリーの１つ又は複数に付着した前記第２の核酸を含む前記第３の核酸を生成することを含む、請求項５７～６８のいずれか一項に記載の方法。
70. 前記第１のアクセサリーが、共有結合した、前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び前記第１のポリマーを含み、前記第２のアクセサリーが、共有結合した、前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド及び前記第２のポリマーを含む、請求項６８～６９のいずれか一項に記載の方法。
71. 前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は前記第１のポリマーが、第１の官能基を含む、請求項５７～６７のいずれか一項に記載の方法。
72. 前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は前記第２のポリマーが、第２の官能基を含む、請求項５７～６７のいずれか一項に記載の方法。
73. 前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は前記第１のポリマーの前記第１の官能基、及び前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は前記第２のポリマーの前記第２の官能基が同一である、請求項５７～７３のいずれか一項に記載の方法。
74. 前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は前記第１のポリマーの前記第１の官能基が、前記第１のヌクレオチドの前記第１の修飾塩基の前記官能基と反応して、共有結合を形成することができる、請求項７３に記載の方法。
75. 前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は前記第２のポリマーの前記第２の官能基が、前記第１のヌクレオチドの前記第１の修飾塩基の前記官能基と反応して、共有結合を形成することができる、請求項７３～７４のいずれか一項に記載の方法。
76. 前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は前記第１のポリマーの前記第１の官能基が、クリック化学反応に関与することができる、請求項７１～７５のいずれか一項に記載の方法。
77. 前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は前記第２のポリマーの前記第２の官能基が、クリック化学反応に関与することができる、請求項７１～７６のいずれか一項に記載の方法。
78. 前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は前記第１のポリマーの前記第１の官能基が、前記第１のヌクレオチドの前記第１の修飾塩基の前記官能基とのクリック化学反応に関与することができる、請求項７６～７７のいずれか一項に記載の方法。
79. 前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は前記第２のポリマーの前記第２の官能基が、前記第１のヌクレオチドの前記第１の修飾塩基の前記官能基とのクリック化学反応に関与することができる、請求項７６～７８のいずれか一項に記載の方法。
80. 前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は前記第１のポリマーの前記第１の官能基のうちの１つ又は複数、前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は前記第２のポリマーの前記第２の官能基、前記第１のヌクレオシド三リン酸の前記第１の修飾塩基の前記官能基、及び前記第１のヌクレオチドの前記官能基のうちの１つ又は複数が独立して、アジド、アルキニル、アルケニル、チオール、又はニトロンである、請求項７６～７９のいずれか一項に記載の方法。
81. 前記第１のヌクレオチドの前記第１の修飾塩基の前記官能基及び前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド若しくは前記第１のポリマーの前記第１の官能基、又は前記第１のヌクレオチドの前記第１の修飾塩基の前記官能基及び前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド若しくは前記第２のポリマーの前記第２の官能基、又はその両方が、以下の対、
    （ｉ）アジド／アルキニル、
    （ｉｉ）アルキニル／アジド、
    （ｉｉｉ）チオール／アルキニル、
    （ｉｖ）アルキニル／チオール、
    （ｖ）アルケニル／チオール、
    （ｖｉ）チオール／アルケニル、
    （ｖｉｉ）アジド／シクロオクチニル、
    （ｖｉｉｉ）シクロオクチニル／アジド、
    （ｉｘ）ニトロン／シクロオクチニル、及び
    （ｘ）シクロオクチニル／ニトロン
    から選択される、請求項７６～８０のいずれか一項に記載の方法。
82. 前記第１のヌクレオチドの前記第１の修飾塩基の前記官能基がアジドであり、前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は前記第１のポリマーの前記第１の官能基、及び前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチド又は前記第２のポリマーの前記第２の官能基のうちの１つ又は複数が独立してアルキニルである、請求項７６～８１のいずれか一項に記載の方法。
83. 前記クリック化学反応が、銅触媒アジド－アルキン環付加（ＣｕＡＡＣ）を含み、前記共有結合がトリアゾリルを含む、請求項７６～８２のいずれか一項に記載の方法。
84. 前記ＣｕＡＡＣがＣｕ（Ｉ）安定化リガンドを含む、請求項８３に記載の方法。
85. 前記Ｃｕ（Ｉ）安定化リガンドが、３－［４－（｛ビス［（１－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－１，２，３トリアゾール－４－イル）メチル］アミノ｝メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル］プロパノール（ＢＴＴＰ）、３－［４－（｛ビス［（１－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－１，２，３トリアゾール－４－イル）メチル］アミノ｝メチル）－１Ｈ－１，２，３トリアゾール－１－イル］プロピル硫酸水素（ＢＴＴＰＳ）、２－［４－（｛ビス［（１－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミノ｝メチル）－１Ｈ－１，２，３トリアゾール－１－イル］エチル硫酸水素（ＢＴＴＥＳ）、２－［４－｛（ビス［（１－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミノ）メチル｝－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル］－酢酸（ＢＴＴＡＡ）、バソフェナントロリンジスルホネート二ナトリウム塩（ＢＰＳ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）、トリス－（（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル）アミン（ＴＢＴＡ）、トリス（３－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）、Ｎ^ε－（（（１Ｒ，２Ｒ）－２－アジドシクロペンチルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン（ＡＣＰＫ）、及び４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ－１，８－ナフタルイミド（４－ＤＭＮ）からなる群から選択される、請求項８４に記載の方法。
86. 前記クリック化学反応が、菌株促進アジド－アルキン環付加（ＳＰＡＡＣ）を含み、前記共有結合が、シクロオクタ－トリアゾリルを含む、請求項７６～８２のいずれか一項に記載の方法。
87. 前記クリック化学反応が、アルキンヒドロチオール化を含み、前記共有結合が、アルケニルスルフィドを含む、請求項７６～８２のいずれか一項に記載の方法。
88. 前記クリック化学反応が、アルケンヒドロチオール化を含み、前記共有結合が、硫化アルキルを含む、請求項７６～８２のいずれか一項に記載の方法。
89. 前記クリック化学反応が、菌株促進アルキン－ニトロン環付加（ＳＰＡＮＣ）を含み、前記共有結合が、オクタヒドロシクロオクタ－イソオキサゾリルを含む、請求項７６～８２のいずれか一項に記載の方法。
90. 前記シクロオクチニルが、ジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）又はその誘導体である、請求項８９に記載の方法。
91. 前記クリック化学反応が生体適合性である、請求項７６～９０のいずれか一項に記載の方法。
92. 前記第２の温度が約２０℃～約６５℃である、請求項５７～９１のいずれか一項に記載の方法。
93. 前記第２の温度が０℃未満である、請求項５７～９１のいずれか一項に記載の方法。
94. 前記第２の温度が約－４℃～約－２０℃である、請求項５７～９１のいずれか一項に記載の方法。
95. 前記第２の反応時間が少なくとも１秒である、請求項５７～９４のいずれか一項に記載の方法。
96. （ｃ）前記第１のアダプタ配列又はその逆相補体、前記第２のアダプタ配列又はその逆相補体、及び前記第３の核酸上の前記鋳型捕捉部位にハイブリダイズすることができる核酸ハイブリダイゼーション配列を含む前記核酸鋳型を提供する工程と、
    （ｄ）前記第３の核酸を前記核酸鋳型と接触させて、前記核酸鋳型の前記核酸ハイブリダイゼーション配列を介して前記第３の核酸上の前記鋳型捕捉部位にハイブリダイズした前記核酸鋳型を有する前記第３の核酸を生成する工程と、
    （ｅ）前記核酸鋳型とハイブリダイズした前記第３の核酸に対して増幅を行って、１つ又は複数の前記第１のアクセサリーオリゴヌクレオチドに付着した前記第３の核酸と、前記核酸鋳型の配列を含むように伸長された１つ又は複数の前記第２のアクセサリーオリゴヌクレオチドとを含む第４の核酸、又はその逆相補体を生成する工程と、
    （ｆ）前記第４の核酸を用いて前記核酸鋳型の前記配列を決定する工程と、
    を更に含む、請求項５９～９５に記載の方法。
97. 前記核酸鋳型の前記核酸ハイブリダイゼーション配列が、前記鋳型捕捉部位の逆相補体を含む、請求項９６に記載の方法。
98. 前記第１の核酸、前記第２の核酸、前記第３の核酸、及び／又は前記第４の核酸が、第３のポリマーを含む、請求項８～９７のいずれか一項に記載の方法。
99. Ｇｌｕ１９１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異が、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸、又は親水性アミノ酸を含む、請求項１～９８のいずれか一項に記載の方法。
100. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、Ｇｌｕ１９１Ａｌａ、Ｇｌｕ１９１Ａｒｇ、Ｇｌｕ１９１Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９１Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９１Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１９１Ｇｌｎ、Ｇｌｕ１９１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ１９１Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９１Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１９１Ｍｅｔ、Ｇｌｕ１９１Ｐｈｅ、Ｇｌｕ１９１Ｐｒｏ、Ｇｌｕ１９１Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１９１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９１Ｔｒｐ、Ｇｌｕ１９１Ｔｙｒ、又はＧｌｕ１９１Ｖａｌである、請求項１～９８のいずれか一項に記載の方法。
101. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異がＧｌｕ１９１Ｖａｌである、請求項１～９８のいずれか一項に記載の方法。
102. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異が、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む、請求項１～１０１のいずれか一項に記載の方法。
103. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異が、Ｌｙｓ１９３Ａｌａ、Ｌｙｓ１９３Ａｒｇ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｐ、Ｌｙｓ１９３Ｃｙｓ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１９３Ｇｌｙ、Ｌｙｓ１９３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１９３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ１９３Ｌｅｕ、Ｌｙｓ１９３Ｍｅｔ、Ｌｙｓ１９３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ１９３Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１９３Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１９３Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１９３Ｔｒｐ、Ｌｙｓ１９３Ｔｙｒ、ｏｒ Ｌｙｓ１９３Ｖａｌである、請求項１～１０１のいずれか一項に記載の方法。
104. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異がＬｙｓ１９３Ａｓｎである、請求項１～１０１のいずれか一項に記載の方法。
105. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異が、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む、請求項１～１０４のいずれか一項に記載の方法。
106. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異が、Ｇｌｕ１９４Ａｌａ、Ｇｌｕ１９４Ａｒｇ、Ｇｌｕ１９４Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ａｓｐ、Ｇｌｕ１９４Ｃｙｓ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１９４Ｈｉｓ、Ｇｌｕ１９４Ｉｌｅ、Ｇｌｕ１９４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１９４Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１９４Ｍｅｔ、Ｇｌｕ１９４Ｐｈｅ、Ｇｌｕ１９４Ｐｒｏ、Ｇｌｕ１９４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１９４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ１９４Ｔｒｐ、Ｇｌｕ１９４Ｔｙｒ、又はＧｌｕ１９４Ｖａｌである、請求項１～１０４のいずれか一項に記載の方法。
107. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９４と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異がＧｌｕ１９４Ｇｌｙである、請求項１～１０４のいずれか一項に記載の方法。
108. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異が、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む、請求項１～１０７のいずれか一項に記載の方法。
109. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異が、Ａｓｐ２４２Ａｌａ、Ａｓｐ２４２Ａｒｇ、Ａｓｐ２４２Ａｓｎ、Ａｓｐ２４２Ｃｙｓ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｎ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｕ、Ａｓｐ２４２Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｈｉｓ、Ａｓｐ２４２Ｉｌｅ、Ａｓｐ２４２Ｌｅｕ、Ａｓｐ２４２Ｌｙｓ、Ａｓｐ２４２Ｍｅｔ、Ａｓｐ２４２Ｐｈｅ、Ａｓｐ２４２Ｐｒｏ、Ａｓｐ２４２Ｓｅｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｈｒ、Ａｓｐ２４２Ｔｒｐ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、又はＡｓｐ２４２Ｖａｌである、請求項１～１０７のいずれか一項に記載の方法。
110. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＡｓｐ２４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異がＡｓｐ２４２Ｔｙｒである、請求項１～１０７のいずれか一項に記載の方法。
111. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異が、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、負電荷アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、小アミノ酸又は親水性アミノ酸への変異を含む、請求項１～１１０のいずれか一項に記載の方法。
112. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異が、Ｌｙｓ２８７Ａｌａ、Ｌｙｓ２８７Ａｒｇ、Ｌｙｓ２８７Ａｓｎ、Ｌｙｓ２８７Ａｓｐ、Ｌｙｓ２８７Ｃｙｓ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２８７Ｈｉｓ、Ｌｙｓ２８７Ｉｌｅ、Ｌｙｓ２８７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ２８７Ｍｅｔ、Ｌｙｓ２８７Ｐｈｅ、Ｌｙｓ２８７Ｐｒｏ、Ｌｙｓ２８７Ｓｅｒ、Ｌｙｓ２８７Ｔｈｒ、Ｌｙｓ２８７Ｔｒｐ、Ｌｙｓ２８７Ｔｙｒ、又はＬｙｓ２８７Ｖａｌである、請求項１～１１０のいずれか一項に記載の方法。
113. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ２８７と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異がＬｙｓ２８７Ｇｌｕである、請求項１～１１０のいずれか一項に記載の方法。
114. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異が、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸への変異を含む、請求項１～１１３のいずれか一項に記載の方法。
115. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異が、Ｐｈｅ２９６Ａｌａ、Ｐｈｅ２９６Ａｒｇ、Ｐｈｅ２９６Ａｓｎ、Ｐｈｅ２９６Ａｓｐ、Ｐｈｅ２９６Ｃｙｓ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｎ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｇｌｙ、Ｐｈｅ２９６Ｈｉｓ、Ｐｈｅ２９６Ｉｌｅ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｙｓ、Ｐｈｅ２９６Ｍｅｔ、Ｐｈｅ２９６Ｐｒｏ、Ｐｈｅ２９６Ｓｅｒ、Ｐｈｅ２９６Ｔｈｒ、Ｐｈｅ２９６Ｔｒｐ、Ｐｈｅ２９６Ｔｙｒ、又はＰｈｅ２９６Ｖａｌである、請求項１～１１３のいずれか一項に記載の方法。
116. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＰｈｅ２９６と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異がＰｈｅ２９６Ｌｅｕである、請求項１～１１３のいずれか一項に記載の方法。
117. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸への変異を含む、請求項１～１１６のいずれか一項に記載の方法。
118. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異が、Ｍｅｔ２９９Ａｌａ、Ｍｅｔ２９９Ａｒｇ、Ｍｅｔ２９９Ａｓｎ、Ｍｅｔ２９９Ａｓｐ、Ｍｅｔ２９９Ｃｙｓ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｎ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｕ、Ｍｅｔ２９９Ｇｌｙ、Ｍｅｔ２９９Ｈｉｓ、Ｍｅｔ２９９Ｉｌｅ、Ｍｅｔ２９９Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｍｅｔ２９９Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２９９Ｐｒｏ、Ｍｅｔ２９９Ｓｅｒ、Ｍｅｔ２９９Ｔｈｒ、Ｍｅｔ２９９Ｔｒｐ、Ｍｅｔ２９９Ｔｙｒ、又はＭｅｔ２９９Ｖａｌである、請求項１～１１６のいずれか一項に記載の方法。
119. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＭｅｔ２９９と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異がＭｅｔ２９９Ｌｙｓである、請求項１～１１６のいずれか一項に記載の方法。
120. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異が、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸への変異を含む、請求項１～１１９のいずれか一項に記載の方法。
121. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異が、Ｔｈｒ３４２Ａｌａ、Ｔｈｒ３４２Ａｒｇ、Ｔｈｒ３４２Ａｓｎ、Ｔｈｒ３４２Ａｓｐ、Ｔｈｒ３４２Ｃｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｎ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｕ、Ｔｈｒ３４２Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３４２Ｈｉｓ、Ｔｈｒ３４２Ｉｌｅ、Ｔｈｒ３４２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ３４２Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｍｅｔ、Ｔｈｒ３４２Ｐｈｅ、Ｔｈｒ３４２Ｐｒｏ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、Ｔｈｒ３４２Ｔｒｐ、Ｔｈｒ３４２Ｔｙｒ、又はＴｈｒ３４２Ｖａｌである、請求項１～１１９のいずれか一項に記載の方法。
122. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＴｈｒ３４２と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異がＴｈｒ３４２Ｓｅｒである、請求項１～１１９のいずれか一項に記載の方法。
123. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異は、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、又は分岐鎖アミノ酸への変異を含む、請求項１～１２２のいずれか一項に記載の方法。
124. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異が、Ｈｉｓ４２１Ａｌａ、Ｈｉｓ４２１Ａｒｇ、Ｈｉｓ４２１Ａｓｎ、Ｈｉｓ４２１Ａｓｐ、Ｈｉｓ４２１Ｃｙｓ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｎ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｕ、Ｈｉｓ４２１Ｇｌｙ、Ｈｉｓ４２１Ｉｌｅ、Ｈｉｓ４２１Ｌｅｕ、Ｈｉｓ４２１Ｌｙｓ、Ｈｉｓ４２１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２１Ｐｈｅ、Ｈｉｓ４２１Ｐｒｏ、Ｈｉｓ４２１Ｓｅｒ、Ｈｉｓ４２１Ｔｈｒ、Ｈｉｓ４２１Ｔｒｐ、Ｈｉｓ４２１Ｔｙｒ、又はＨｉｓ４２１Ｖａｌである、請求項１～１２２のいずれか一項に記載の方法。
125. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置のアミノ酸置換変異がＨｉｓ４２１Ｐｒｏである、請求項１～１２２のいずれか一項に記載の方法。
126. 前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の２つ以上の位置に２つ以上のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～１２５のいずれか一項に記載の方法。
127. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の２つ以上の位置における２つ以上のアミノ酸置換変異が、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの２つ以上を含む、請求項１２６に記載の方法。
128. 前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の３つ以上の位置に３つ以上のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～１２５のいずれか一項に記載の方法。
129. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の３つ以上の位置における３つ以上のアミノ酸置換変異が、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの３つ以上を含む、請求項１２８に記載の方法。
130. 前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の４つ以上の位置に４以上のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～１２５のいずれか一項に記載の方法。
131. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の４つ以上の位置における４つ以上のアミノ酸置換変異が、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの４つ以上を含む、請求項１３０に記載の方法。
132. 前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の５つ以上の位置に５つ以上のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～１２５のいずれか一項に記載の方法。
133. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の５つ以上の位置における５つ以上のアミノ酸置換変異が、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの５つ以上を含む、請求項１３２に記載の方法。
134. 前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の６つ以上の位置に６つ以上のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～１２５のいずれか一項に記載の方法。
135. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の６つ以上の位置における６つ以上のアミノ酸置換変異が、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの６つ以上を含む、請求項１３４に記載の方法。
136. 前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の７つ以上の位置に７つ以上のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～１２５のいずれか一項に記載の方法。
137. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の７つ以上の位置における７つ以上のアミノ酸置換変異が、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの７つ以上を含む、請求項１３６に記載の方法。
138. 前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の８つ以上の位置に８つ以上のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～１２５のいずれか一項に記載の方法。
139. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の８つ以上の位置における８つ以上のアミノ酸置換変異が、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏのうちの８つ以上を含む、請求項１３８に記載の方法。
140. 前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の８つの位置に８つのアミノ酸置換変異を含む、請求項１～１２５のいずれか一項に記載の方法。
141. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＬｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の８つの位置における８つのアミノ酸置換変異が、それぞれＬｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏである、請求項１４０に記載の方法。
142. 前記組換えＴｄＴが、配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置に９つのアミノ酸置換変異を含む、請求項１～１２５のいずれか一項に記載の方法。
143. 配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴのＧｌｕ１９１、Ｌｙｓ１９３、Ｇｌｕ１９４、Ａｓｐ２４２、Ｌｙｓ２８７、Ｐｈｅ２９６、Ｍｅｔ２９９、Ｔｈｒ３４２、及びＨｉｓ４２１と機能的に同等の位置における９つのアミノ酸置換変異が、それぞれＧｌｕ１９１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１９３Ａｓｎ、Ｇｌｕ１９４Ｇｌｙ、Ａｓｐ２４２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ２８７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９６Ｌｅｕ、Ｍｅｔ２９９Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３４２Ｓｅｒ、及びＨｉｓ４２１Ｐｒｏである、請求項１４２に記載の方法。
144. 前記組換えＴｄＴが、配列番号１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１４２のいずれか一項に記載の方法。
145. 前記組換えＴｄＴが、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１４２のいずれか一項に記載の方法。
146. 前記組換えＴｄＴが、配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１４２のいずれか一項に記載の方法。
147. 前記組換えＴｄＴが、配列番号１１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１４２のいずれか一項に記載の方法。
148. 前記組換えＴｄＴが、配列番号１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１４２のいずれか一項に記載の方法。
149. 前記組換えＴｄＴが、４７℃以上の温度で安定である、請求項１～１４８のいずれか一項に記載の方法。
150. 前記組換えＴｄＴが、５０℃以上の温度で安定である、請求項１～１４８のいずれか一項に記載の方法。
151. 前記組換えＴｄＴが、５５℃以上の温度で安定である、請求項１～１４８のいずれか一項に記載の方法。
152. 前記組換えＴｄＴが、５８℃以上の温度で安定である、請求項１～１４８のいずれか一項に記載の方法。
153. 前記組換えＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性が、同じ試験温度における配列番号１２のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＴｄＴの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、又は１２０％である、請求項１～１５２のいずれか一項に記載の方法。
154. 前記試験温度が、３７℃、４７℃、５０℃、５５℃、又は５８℃である、請求項１５３に記載の方法。
155. 前記組換えＴｄＴが、小さなユビキチン様修飾剤（ＳＵＭＯ）断片を含む、請求項１～１５４のいずれか一項に記載の方法。
156. 前記ＳＵＭＯ断片が、配列番号１３と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５５に記載の方法。
157. 前記組換えＴｄＴが、前記組換えＴｄＴのＮ末端上のＳＵＭＯ断片を含む、請求項１５５～１５６のいずれか一項に記載の方法。
158. 前記組換えＴｄＴが、配列番号１４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５６に記載の方法。
159. 前記組換えＴｄＴが、配列番号１５と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５６に記載の方法。
     前記組換えＴｄＴが、前記組換えＴｄＴのＣ末端上の前記ＳＵＭＯ断片を含む、請求項１５５～１５６のいずれか一項に記載の方法。
160. 請求項８～１５９のいずれか一項に記載の方法によって得られる第２の核酸。
161. 請求項５７～１５９のいずれか一項に記載の方法によって得られる第３の核酸。
162. 請求項９６～１５９のいずれか一項に記載の方法によって得られる第４の核酸。

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