KR102481869B1 - 단일 세포를 캡슐화하는 방법, 캡슐화된 세포 및 이의 용도 - Google Patents

단일 세포를 캡슐화하는 방법, 캡슐화된 세포 및 이의 용도 Download PDF

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스티븐 노어버그
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드미트리 케이. 포코로크
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Abstract

본 명세서에서 제공 시스템, 방법 및 조성물의 실시형태는 단일 세포를 캡슐화하는 중공 비드에 관한 것이다. 일부 실시형태는 핵산 시퀀싱, 핵산 라이브러리 제조, 메틸화 상태 결정, 게놈 변이체 확인 또는 단백질 분석을 포함하여 중공 비드 내에 캡슐화된 단일 세포에 대해 다중의 공동-분석을 수행하는 것을 포함한다.

Description

단일 세포를 캡슐화하는 방법, 캡슐화된 세포 및 이의 용도{METHODS OF ENCAPSULATING SINGLE CELLS, THE ENCAPSULATED CELLS AND USES THEREOF}
본 명세서에서 제공 시스템, 방법 및 조성물은 단일 세포를 캡슐화하는 중공 비드, 중공 비드를 제조하는 방법, 및 예를 들어 공간 지수 시퀀싱 및 핵산 라이브러리 제조를 포함하여, 캡슐화된 세포에 다중 공동-분석(multiple co-assay)을 수행하기 위해 중공 비드를 사용하는 방법에 관한 것이다.
생물학적 샘플에 존재하는 특정 핵산 서열의 검출은, 예를 들어 미생물의 확인 및 분류, 감염성 질환의 진단, 유전자 이상의 검출 및 특성화, 암과 관련된 유전적 변화의 확인, 질병에 대한 유전적 감수성 연구 및 다양한 유형의 치료에 대한 반응을 측정하기 위한 방법으로 사용되어 왔다. 생물학적 샘플에서 특정 핵산 서열을 검출하는 일반적인 기술은 핵산 시퀀싱이다.
차세대 시퀀서는 시퀀싱 실행당 대량의 게놈 데이터를 생성하는 강력한 도구이다. 이 많은 양의 데이터를 해석하고 분석하는 것은 어려울 수 있다. 단일 세포 DNA 시퀀싱은 게놈 이질성을 연구하기 위한 하나의 도구로서 떠오르고 있다. 구체적으로, 다수의 반복된 게놈 영역을 보유하는 마이크로바이옴은 단일 세포로부터 DNA 서열을 수득함으로써 시퀀싱 될 수 있다. 단일 세포에서 다중 효소 반응을 수행하는 것은 다중 분석법을 통해 단일 세포 내에서 세포 내 생체분자를 제한하고 접근하는데 어려움이 있기 때문에 신뢰할 수 없다. 예를 들어, 많은 세포 기반 분석은 세포 내 분자를 확보하지 못하여 분석 수행 동안 생체 분자의 손실을 초래한다.
본 개시내용은 단일 세포 상에서 다중 공동-분석을 수행하기 위한 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것으로, 여기서 단일 세포는 중공 비드 내에 캡슐화되어, 단일 세포가 단일 세포상에서 순차적으로 수행되는, 예를 들어, 용해(lysis), DNA 분석, RNA 분석, 단백질 분석, 태깅(tagmentation), 핵산 증폭, 핵산 시퀀싱, DNA 라이브러리 제조, 시퀀싱을 사용한 트랜스포사제 접근성 크로마틱 분석(transposase accessible chromatic using sequencing: ATAC-seq), 연속성 보존 전치 시퀀싱(Contiguity-preserving transposition sequencing: CPT-seq), 단일 세포 조합 인덱스 시퀀싱(single cell combinatorial indexed sequencing: SCI-seq), 또는 단일 세포 게놈 증폭, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 다중 공동 분석을 수행하기 위해 한정(confined)된다.
본 명세서에서 제공 일부 실시형태는 단일 세포를 캡슐화하는 중공 비드에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 중공 비드는 중합체 쉘(polymer shell) 및 중합체 쉘 내에 배치된 단일 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합체 쉘은 단일 세포를 유지하면서 중합체 쉘을 통한 시약의 확산을 허용하는 기공을 포함한다.
추가적인 실시형태는 중공 비드 내에 캡슐화 된 단일 세포에 대해 다수의 순차적인 공동-분석을 수행하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 중공 비드를 수득하는 단계를 포함하고, 여기서 중공 비드는 단일 세포를 캡슐화하고 단일 세포를 시약과 순차적으로 접촉시켜 다수의 순차적인 공동-분석을 수행한다.
본 명세서에서 제공 일부 실시형태는 중공 비드 내에 단일 세포를 캡슐화하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 단일 세포를 중합체와 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계 및 상기 혼합물을 가교 오일과 혼합하여 단일 세포를 캡슐화하는 중합체 쉘을 형성하는 단계를 포함하되, 여기서 상기 중합체 쉘은 단일 세포를 유지하면서 상기 중합체 쉘을 통해 시약의 확산을 허용하는 기공을 포함한다.
1.본 발명의 하나의 관점은 단일 세포를 캡슐화하는 중공 비드로서,
중합체 쉘 및 상기 중합체 쉘 내에 배치된 단일 세포를 포함하되,
상기 중합체 쉘은 상기 단일 세포를 유지하면서 상기 중합체 쉘을 통한 시약의 확산을 허용하는 기공을 포함하는, 중공 비드를 제공한다.
2. 상기 중합체 쉘의 내부가 수성 환경을 포함할 수 있다.
3. 상기 중합체 쉘 내에 배치된 상기 단일 세포는 상기 중합체 쉘과 상호 작용이 없고/없거나 상기 중합체 쉘과 접촉하지 않을 수 있다.
4. 상기 중공 비드는 직경이 약 20㎛ 내지 약 200㎛일 수 있다.
5. 상기 중합체 쉘은 4-암(arm) 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함할 수 있다.
6. 상기 중합체는 PEG, PEG-아크릴레이트, PEG-아민, PEG- 카복실레이트, PEG-다이티올, PEG-에폭사이드, PEG-아이소시아네이트, PEG-말레이미드, 폴리아크릴산(PAA), 폴리(메틸메타크릴레이트)(PMMA), 알지네이트, 폴리스티렌(PS), 폴리스티렌 설포네이트(PSS), 폴리비닐피롤리돈(PVPON), 아크릴 아마이드, N,N'-비스(아크릴로일) 시스타민, 폴리프로필렌 옥사이드(PPO), 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(N-아이소프로필 아크릴아마이드)(PNIPAAm), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(락트-코-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(비닐설폰산)(PVSA) 폴리(L-아스파르트산), 폴리(L-글루탐산), 폴리라이신, 한천, 아가로스, 헤파린, 알지네이트 설페이트, 덱스트란 설페이트, 히알루로난, 펙틴, 카라기난, 젤라틴, 키토산, 셀룰로스, 콜라겐, 비스아크릴아마이드, 다이아크릴레이트, 다이알릴아민, 트라이알릴아민, 다이비닐설폰, 다이에틸렌글리콜다이알릴에테르, 에틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 폴리메틸렌 글리콜다이아크릴 레이트, 폴리에틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 트리메틸로프로판 트리메타크릴레이트 에톡실화된 트리메틸올 트리아크릴레이트, 또는 에톡실화된 펜타에리트리톨 테트라 아크릴레이트, 또는 이들의 조합 또는 혼합물을 포함할 수 있다.
7. 상기 중합체 쉘은 PEG-말레이미드/다이티올 오일, PEG-에폭사이드/아민 오일, PEG-에폭사이드/PEG-아민 또는 PEG-다이티올/PEG-아크릴레이트를 포함할 수 있다.
8. 상기 단일 세포는 포유동물 세포일 수 있다.
9. 상기 시약은 효소, 화학물질(chemical) 및 50 염기쌍 미만의 크기를 갖는 프라이머를 포함할 수 있다.
10.상기 시약은 리소자임, 단백질 분해효소 K, 랜덤 헥사머, 폴리머라제(Φ29 DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Bsu 폴리머라제), 트랜스포사제(Tn5), 프라이머(P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매 효소(caltalyzing enzyme), 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 버퍼 또는 2가 양이온을 포함할 수 있다.
11.본 발명의 다른 관점은 중공 비드 내에 단일 세포를 캡슐화하는 방법으로서,
스페이서 오일 내에서 단일 세포를 중합체와 혼합하여 혼합물 (a)를 형성하는 단계; 및
혼합물 (a)를 가교 오일과 혼합하여 상기 단일 세포를 캡슐화하는 중합체 쉘을 형성하는 단계
를 포함하되, 상기 중합체 쉘은 상기 단일 세포를 유지하면서 상기 중합체 쉘을 통해 시약의 확산을 허용하는 기공을 포함하는, 중공 비드 내에 단일 세포를 캡슐화하는 방법을 제공한다.
12. 상기 중공 비드의 직경이 약 20㎛ 내지 약 200㎛일 수 있다.
13. 상기 중합체가 4-암 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함할 수 있다.
14. 상기 4-암 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 PEG-아크릴레이트, PEG-아민, PEG-카복실레이트, PEG-다이티올, PEG-에폭사이드, PEG-아이소시아네이트 및 PEG-말레이미드로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
15. 상기 스페이서 오일은 미네랄 오일 또는 플루오로카본 오일을 포함할 수 있다.
16. 상기 가교 오일은 오일에 용해된 다이티올 또는 아민을 포함할 수 있다.
17. 상기 단일 세포는 포유동물 세포일 수 있다.
18. 상기 시약은 효소, 화학물질 및 50 염기쌍 미만의 크기를 갖는 프라이머를 포함할 수 있다.
19. 상기 시약은 리소자임, 단백질 분해효소 K, 랜덤 헥사머, 폴리머라제(Φ29 DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Bsu 폴리머라제), 트랜스포사제(Tn5), 프라이머(P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매화 효소, 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 버퍼, 세제 또는 2가 양이온을 포함할 수 있다.
20. 상기 혼합은 상기 단일 세포, 상기 중합체, 상기 스페이서 오일 및 상기 가교 오일을 액적 발생기에 투입하는 것을 포함할 수 있다.
21. 상기 액적 발생기는 미세유체 칩(microfluidic chip)일 수 있다.
22. 상기 단일 세포는 고정제와의 접촉에 의해 혼합 전에 고정될 수 있다.
23. 상기 고정제가 메탄올 또는 에탄올과 같은 알코올 또는 파라-포름알데하이드와 같은 알데하이드를 포함할 수 있다.
24. 본 발명의 또 다른 관점은 중공 비드 내에 캡슐화된 단일 세포에 대해 다중의 순차적 공동-분석(multiple sequential co-assay)을 수행하는 방법으로서,
상기 단일 세포를 캡슐화하는 중공 비드를 수득하는 단계; 및
상기 단일 세포를 시약과 순차적으로 접촉시켜 다중의 순차적 공동-분석을 수행하는 단계
를 포함하는, 중공 비드 내에 캡슐화된 단일 세포에 대해 다중의 순차적 공동-분석을 수행하는 방법을 제공한다.
25. 상기 다중의 순차적 공동-분석은 용해, DNA 분석, RNA 분석, 단백질 분석, 태깅(tagmentation), 핵산 증폭, 핵산 시퀀싱, DNA 라이브러리 제조, 시퀀싱을 이용한 트랜스포사제 접근성 크로마틱 분석(transposase accessible chromatic using sequencing: ATAC-seq), 연속성 보존 전치 시퀀싱(contiguity-preserving transposition sequencing: CPT-seq), 단일 세포 조합 인덱스 시퀀싱(single cell combinatorial indexed sequencing: SCI-seq), 또는 단일 세포 게놈 증폭, 또는 순차적으로 수행되는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
26. 상기 단일 세포를 캡슐화하는 중공 비드가 고체 지지체 상에 시딩될 수 있다.
27. 상기 고체 지지체는 에칭된 표면, 웰, 플로우-셀 장치, 미세유체 채널, 비드 또는 칼럼일 수 있다.
본 발명은 단일 세포를 캡슐화하는 중공 비드, 중공 비드를 제조하는 방법, 및 예를 들어 공간 지수 시퀀싱 및 핵산 라이브러리 제조를 포함하여, 캡슐화된 세포에 다중 공동-분석(multiple co-assay)을 수행하기 위해 중공 비드를 사용하는 방법을 제공하는 발명의 효과를 갖는다.
도 1은 세포를 캡슐화하는 중공 비드를 제조하는데 사용될 수 있는 미세 유체 액적 발생기 시스템의 실시형태의 개략도이다.
도 2는 수성 완충액의 존재 하에서 크기가 확장될 수 있는 중공 비드의 실시형태의 마이크로그래프 이미지 및 개략도를 도시한다. 마이크로그래프 이미지는 (왼쪽에서 오른쪽으로) 탈수된 비드; 초기에 수상과 접촉된 비드; 부풀어 오르기 시작하는 비드; 그리고 완전히 부푼 비드를 나타낸다.
도 3은 온도 또는 화학적 수단에 의해 비드 기공도를 증가시키기 위한 실시형태를 나타내는 개략도이다. 도 3에 도시된 바와 같이 비드 기공성의 증가는 비드 내외부로의 입자의 흐름을 증가시킬 수 있으며, 기공성을 제어하는 것은 비드 내외로 흐르는 입자 (입자 크기 포함)의 제어를 제공한다.
도 4는 단일 세포 위에 중합체의 단량체 단위를 침착시킴(depositing)으로써 디바이스-프리 세포 캡슐화 방법의 실시형태를 예시하는 개략도이다.
도 5는 디바이스-프리 방법에 의해 형성된 중합체 내 캡슐화된 세포의 실시형태를 예시하는 개략도이며, 여기서 중합체 쉘은 특이적 결합 분자와의 특정한 상호 작용을 통해 세포에 부착된다.
도 6은 비드 내에 캡슐화된 세포를 나타내며, 형광 염료로 염색된 비드의 마이크로그래프 이미지를 보여준다. 상기 마이크로그래프 이미지는 (왼쪽에서 오른쪽으로) 유리 PEG-말레이미드를 표적으로 하는 티올-특이적 형광단으로 염색; 유리 -SH기를 표적으로 하는 텍사스 레드 형광단으로 염색; Hoechst 염색으로 염색한 핵을 나타낸다.
도 7은 세포를 캡슐화하는 중공 비드에 대해 다중 공동-분석을 수행하는 방법의 실시예를 나타내는 개략도이다. 도 7은 ATAC-seq 단편을 생성하기 위해 태깅, cDNA 합성을 개시하기 위한 역전사 및 인덱스 라이브러리를 생성하기 위한 PCR 반응을 수행하는 실시형태를 나타낸다.
도 8은 세포를 캡슐화하는 중공 비드에 대해 다중 공동-분석을 수행하는 방법의 실시예를 나타내는 개략도이다. 도 8은 ATAC-seq 단편을 생성하기 위한 태깅, cDNA 합성을 개시하기 위한 역전사 및 전장 RNA 시퀀싱을 위한 무작위 연장을 통한 PCR 반응으로 인덱스 라이브러리를 생성하는 실시형태를 나타낸다.
도 9는 세포를 캡슐화하는 중공 비드에 대해 다중의 공동-분석을 수행하는 방법의 실시예를 도시한 개략도이다. 도 9는 2 라운드의 인덱스 스플릿 라이게이션 및 1 라운드의 인덱스 PCR을 사용하는 3-계층 조합 인덱스 방법(three-tier combinatorial indexing approach)을 나타낸다.
도 10은 세포를 캡슐화하는 중공 비드에 대해 다중 공동-분석을 수행하는 방법의 실시예를 나타내는 개략도이다. 도 10은 인덱싱된 트랜스포솜과의 조합 인덱싱에 대한 다중 공동-분석을 보여준다.
도 11은 세포를 캡슐화하는 중공 비드에 대해 다중 공동-분석을 수행하는 방법의 실시예를 나타내는 개략도이다. 도 11은 단일 세포 전체 게놈 증폭에 대한 다중 공동-분석을 나타낸다.
도 12는 세포를 캡슐화하는 중공 비드로 전체 게놈 라이브러리를 제조하는 방법의 실시형태를 예시하는 흐름도이다.
다음의 상세한 설명에서 그 일부를 형성하는 첨부 도면을 참조한다. 도면에서, 달리 지시하지 않는 한 유사한 기호는 전형적으로 유사한 구성 요소를 나타낸다. 상세한 설명, 도면 및 청구범위에 설명된 예시적인 실시예는 제한적인 것으로 의도된 것이 아니다. 본 명세서에 제시된 주제의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 다른 실시예들이 이용될 수 있고 다른 변경이 이루어질 수 있다. 본 명세서에 일반적으로 설명되고 도면에 도시된 바와 같이 본 개시의 양태는 매우 다양한 상이한 구성으로 배열, 대체, 조합, 분리 및 설계될 수 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 명시적으로 고려된다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
본 명세서에서 제공 실시형태는 단일 세포를 캡슐화하는 중공 비드, 중공 비드를 제조하는 방법, 및 중공 비드 내에 캡슐화된 단일 세포에 대해 다중 공동-분석을 수행하는 방법에 관한 것이다. 상기 중공 비드는 세포의 존재하에 혼합되고 세포를 캡슐화하는 중공 비드를 형성하는 하이드로겔 중합체 및 가교제를 포함할 수 있다. 상기 중공 비드는 중공 비드 내에 세포를 유지하면서 중공 비드를 통한 시약의 확산을 허용하여 반응이 중공 비드 내에서 발생하도록 하는 공극을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 중공 비드는 세포 연속성을 유지하면서 동일한 단일 세포상에서 공동 분석을 수행할 수 있게 한다. 특히, 본 명세서에서 제공 방법, 시스템 및 조성물은 캡슐화 된 세포 내에서 세포 내 생체 분자를 한정(confining)하고 접근할 수 있게 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 중공 비드는 본 명세서에서 연속성 입자(contiguity particle)로 지칭된다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "연속성 입자"는 단일 세포를 캡슐화하는 중공 비드를 지칭한다.
본 명세서에 기재된 연속성 입자는 차세대 세포 구획화 접근법에 사용될 수 있고 개별 세포에 대해 다중-분석물 분석을 가능하게 한다. 본 명세서에 기재된 연속성 입자 및 사용 방법은 수백만 개의 세포가 개별적으로 분석될 수 있게 하여 샘플 준비 비용을 감소시키고 샘플 연속성을 유지한다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 에멀션, 고정화 또는 다른 미세 구획과 같은 외부 구획화 전략(미세 유체)을 사용하지 않고 세포 연속성을 유지한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 연속성 입자는 단일 세포를 분석하기 위한 분석에 사용될 수 있다. 단일 세포에서 수행될 수 있는 분석은 예를 들어 세포 용해, DNA 분석, RNA 분석, 핵산 서열 분석, 단백질 분석, 태깅, 핵산 증폭, DNA 라이브러리 제조, 시퀀싱을 이용한 트랜스포사제 접근성 크로마틱 분석(ATAC-seq), 연속성 보존 전치 시퀀싱(CPT-seq), 단일 세포 조합 인덱스 시퀀싱(SCI-seq), 또는 단일 세포 게놈 증폭, 또는 순차적으로 수행되는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
10,000, 50,000, 100,000, 500,000 또는 백만 개의 단일 세포와 같은 10,000 내지 백만개의 단일 세포 등의 다수의 단일 세포에 대해 공동-분석을 동시에 수행하기 위하여 단일 세포에 대해 하나 이상의 분석을 수행하기 위한 연속성 입자의 사용은 다수의 연속성 입자에 대해 동시에 사용될 수 있다.
상기 연속성 입자의 기공 크기는 하나 이상의 분석 수행 동안 중공 비드 내부에 단일 세포 자체를 유지하거나 더 큰 핵산(> 300bps)과 같은 다른 더 큰 입자를 유지하면서 효소, 화학물질(chemical) 및 더 작은 크기의 프라이머(< 50 bps)와 같은 시약의 확산을 허용하도록 설계될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "시약"(reagent)은 샘플과 반응, 상호 작용, 희석 또는 샘플에 첨가하기에 유용한 제제 또는 2 종 이상의 제제의 혼합물을 기술하고, 용해, 핵산 분석, 핵산 증폭 반응, 단백질 분석, 태깅 반응, ATAC-seq, CPT-seq 또는 SCI-seq 반응 또는 기타 분석을 위한 제제를 포함하여, 본 명세서에 기재된 분석에 사용되는 제제를 포함할 수 있다. 따라서, 시약은 예를 들어 버퍼, 화학물질, 효소, 폴리머라제, 50 개 미만의 염기쌍을 갖는 프라이머, 주형 핵산, 뉴클레오타이드, 표지, 염료 또는 뉴클레아제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 시약은 리소자임, 단백질 분해 효소 K, 랜덤 헥사머, 폴리머라제(예컨대, Φ29 DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Bsu 폴리머라제), 트랜스포사제(예컨대, Tn5), 프라이머 (예컨대, P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매화 효소, 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 버퍼 또는 2가 양이온을 포함한다.
연속성 입자(Contiguity Particle)
일부 실시형태에서, 중공 비드는 하이드로겔 조성물로부터 제조된 중합체 쉘을 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "하이드로겔"은 유기 중합체 (천연 또는 합성)가 공유, 이온 또는 수소 결합을 통해 가교되어 물 분자를 포획하여 겔을 형성하는, 3 차원 개방-격자 구조를 생성할 때 형성된 물질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 상기 하이드로겔은 생체 적합성 하이드로겔일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "생체 적합성 하이드로겔"은 살아 있는 세포에 독성이 없고 포획된 세포로 산소와 영양분을 충분히 확산시켜 생존력을 유지하게 하는 겔을 형성하는 중합체를 지칭한다. 일부 실시형태에서 상기 하이드로겔 물질은 알기네이트, 아크릴아마이드 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG-아크릴레이트, PEG-아민, PEG-카복실레이트, PEG- 다이티올, PEG-에폭사이드, PEG-아이소시아네이트, PEG-말레이미드, 폴리아크릴산(PAA), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리스티렌(PS), 폴리스티렌 설포네이트(PSS), 폴리비닐피롤리돈(PVPON), N,N'-비스(아크릴로일)시스타민, 폴리프로필렌옥사이드(PPO), 폴리(하이드록시에틸메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(N-아이소프로필 아크릴아마이드)(PNIPAAm), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(락트 코-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(비닐설폰산)(PVSA), 폴리(L-아스파르트산), 폴리(L-글루탐산), 폴리라이신, 한천, 아가로스, 헤파린, 알긴산 설페이트, 덱스트란 설페이트, 히알루로난, 펙틴, 카라기난, 젤라틴, 키토산, 셀룰로스, 콜라겐, 비스아크릴아마이드, 다이아크릴레이트, 다이알릴 아민, 트라이알릴 아민, 다이비닐 설폰, 다이에틸렌 글리콜 다이알릴 에테르, 에틸렌 글리콜 다이아크릴레이트, 폴리메틸렌 글리콜 다이아크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 다이아크릴레이트, 트리메틸로프로판 트리메타 크릴레이트, 에톡실화된 트리메틸올 트리아크릴레이트, 또는 에톡실화된 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트, 또는 이들의 조합 또는 혼합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 알지네이트, 아크릴아마이드 또는 PEG 기반 물질이다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 아크릴레이트-다이티올, 에폭사이드-아민 반응 화학 물질을 갖는 PEG 기반 물질이다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 PEG-말레이미드/다이티올 오일, PEG-에폭사이드/아민 오일, PEG-에폭사이드/PEG-아민 또는 PEG-다이티올/PEG-아크릴레이트를 포함하는 중합체 쉘을 형성한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 물질은 세포 내 생체 분자를 손상시킬 수 있는 자유 라디칼의 생성을 피하기 위해 선택된다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 10 내지30% 중합체와 물 같은 60 내지 90% 유체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 하이드로겔의 수분 함량은 약 70 내지 80%이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 수치를 변경할 때 "약" 또는 "대략"이라는 용어는 수치에서 발생할 수 있는 변형을 지칭한다. 예를 들어, 특정 기질 또는 구성 요소의 제조에서의 차이를 통해 변형이 발생할 수 있다. 일 실시형태에서, 용어 "약"은 인용된 수치의 1%, 5% 또는 최대 10% 이내를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 중합체 쉘은 단일 세포를 캡슐화하는 내부를 갖는 쉘을 갖는 중공 비드의 중합체 표면이다. 본 명세서에 기재된 중공 비드의 특성으로 인해, 상기 연속성 입자는 다중 분석 후에 유전 물질을 보유할 수 있고, 물리적 인 힘, 절단 화학물질, 또는 중합체 쉘의 두께에 따른 삼투 불균형을 발생시킴으로써 방출될 수 있다.
하이드로겔은 친수성 바이오 폴리머 또는 합성 폴리머를 가교시킴으로써 제조될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 가교제를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "가교제"는 적절한 염기 단량체와 반응할 때 3 차원 네트워크를 형성할 수 있는 분자를 지칭한다. 하나 이상의 가교제를 포함할 수 있는 하이드로겔 폴리머의 예는 히알루로난, 키토산, 한천, 헤파린, 설페이트, 셀룰로스, 알기네이트(알기네이트 설페이트 포함), 콜라겐, 덱스트란 (덱스트란 설페이트 포함), 펙틴, 카라기난, 폴리라이신, 젤라틴(젤라틴 타입 A 포함), 아가로스, (메트)아크릴 레이트-올리고락티드-PEO-올리고락티드-(메트)아크릴레이트, PEO-PPO-PEO 공중합체(Pluronics), 폴리(포스파젠), 폴리(메타크릴레이트), 폴리(N-비닐피롤리돈), PL(G)A-PEO-PL(G)A 공중합체, 폴리(에틸렌이민), 폴리에틸렌글리콜(PEG)-티올, PEG-아크릴레이트, 아크릴아마이드, N,N'-비스(아크릴로일) 시스타민, PEG, 폴리 프로필렌 옥사이드(PPO), 폴리아크릴산, 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(메틸메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(N-아이소프로필 아크릴아마이드)(PNIPAAm), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(락트산-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(비닐설폰산)(PVSA), 폴리(L- 아스파르트산), 폴리(L-글루탐산), 비스아크릴아마이드, 디아크릴레이트, 디알릴 아민, 트라이알릴아민, 디비닐설폰, 디에틸렌 글리콜 다이알릴 에테르, 에틸렌 글리콜 다이아크릴레이트, 폴리메틸렌글리콜 글리콜 다이아크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 다이아크릴 레이트, 트리메틸로프로판 트리메타크릴레이트, 에톡실화된 트리메틸올 트리아크릴레이트 또는 에톡실화된 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트, 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 예를 들어, 조합은 중합체 및 가교제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-티올/PEG-아크릴레이트, 아크릴아마이드/N,N'-비스 (아크릴로일)시스타민 (BACy) 또는 PEG/폴리프로필렌옥사이드(PPO)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 중합체 쉘은 4-암(arm) 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함한다. 일부 실시형태에서는 상기 4-암 폴리에틸렌글리콜은 PEG-아크릴레이트, PEG-아민, PEG-카복실레이트, PEG-다이티올, PEG-에폭사이드, PEG-아이소시아네이트 및 PEG-말레이미드로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 가교제는 순간 가교제 또는 느린 가교제이다. 순간 가교제는 히드로 겔 중합체를 즉시 가교시키는 가교제이며, 본 명세서에서는 클릭 케미스트리로도 지칭된다. 순간 가교제는 다이티올 오일 + PEG-말레이미드 또는 PEG 에폭 사이드 + 아민 오일을 포함할 수 있다. 느린 가교제는 하이드로겔 중합체를 천천히 가교시키는 가교제이며, PEG-에폭사이드 + PEG-아민 또는 PEG-다이티올 + PEG- 아크릴레이트를 포함할 수 있다. 느린 가교제는 가교하는데 몇 시간 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 시간 이상 걸릴 수 있다. 본 명세서에서 제공 일부 실시형태에서, 연속성 입자는 순간 가교제에 의해 제제화되며, 이에 의해 느린 가교제에 비해 세포 상태를 더 잘 보존한다. 이론에 구속되기를 희망함이 없이 세포는 더 긴 가교 시간 동안 세포 내 신호 전달 메카니즘에 의해 생리학적 변화를 겪을 수 있다.
일부 실시형태에서, 가교제는 하이드로겔 중합체에서 이황화 결합을 형성함으로써 하이드로겔 중합체를 연결시킨다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 기공을 갖는 하이드로겔 매트릭스 (예를 들어, 다공성 하이드로겔 매트릭스)를 형성한다. 이들 기공은 중합체 쉘 내에서 추출된 단일 세포 또는 핵산과 같은 충분히 큰 입자를 보유할 수 있지만, 시약과 같은 다른 물질이 기공을 통과하여 중공 비드 내외로 통과할 수 있게 한다. 일부 실시형태에서, 중합체 쉘의 기공 크기는 중합체 농도 대 가교제의 농도의 비를 변화시킴으로써 미세하게 조정된다. 일부 실시형태에서, 중합체 대 가교제의 비는 30:1, 25 : 1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1 , 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20 또는 1:30 또는 상기 언급된 비율 중 임의의 2 개에 의해 정의된 범위 내의 비율이다. 일부 실시형태에서, DNA 프라이머 또는 하전된 화학물질 그룹과 같은 추가 기능이 다른 응용의 요구 사항을 충족시키기 위해 중합체 매트릭스에 그래프팅 될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "다공도(porosity)"는 개방 공간, 예를 들어 기공 또는 다른 개구부로 구성된 하이드로겔의 분율(단위 없음)을 의미한다. 따라서, 다공도는 재료의 공극 공간을 측정하며 전체 부피에 대한 공극 부피의 일부이며 0에서 100% 사이(또는 0에서 1 사이)의 백분율로 표시됩니다. 하이드로겔의 다공도는 0.5 내지 0.99, 약 0.75 내지 약 0.99, 또는 약 0.8 내지 약 0.95의 범위일 수 있다.
중합체 쉘은 시약의 충분한 확산을 허용하면서 동시에 단일 세포 또는 그로부터 추출된 핵산을 보유하는 임의의 기공 크기를 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "기공 크기"는 기공 단면의 직경 또는 유효 직경을 지칭한다. 용어 "기공 크기"는 또한 복수의 기공 측정에 기초하여 기공의 단면의 평균 직경 또는 평균 유효 직경을 지칭할 수 있다. 원형이 아닌 단면의 유효 직경은 비원형 단면의 단면적과 동일한 단면적을 갖는 원형 단면의 직경과 동일하다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 수화될 때 하이드로겔이 팽창될 수 있다. 기공 크기의 크기는 하이드로겔의 수분 함량에 따라 변할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔의 세공은 하이드로겔 내에 캡슐화 된 세포를 보유하지만 시약이 통과할 수 있도록 충분한 크기의 기공을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체 쉘의 내부는 수성 환경이다. 일부 실시형태에서, 중합체 쉘 내에 배치된 단일 세포는 중합체 쉘과의 상호 작용이 없고/또는 중합체 쉘과 접촉하지 않는다. 일부 실시형태에서, 중합체 쉘은 (본 명세서에보다 상세히 기술 된 바와 같이) 세포 주위에 형성되고, 세포는, 중합체 쉘이 수동 흡착에 의해 또는 표적화된 방식으로, 예를 들어 항체 또는 다른 특이적 결합 분자에 부착됨으로써 세포 표면으로 오기 때문에 중합체 쉘과 접촉한다.
일부 실시형태에서, 연속성 입자는 단일 세포를 캡슐화하기에 충분한 크기이다. 일부 실시형태에서, 연속성 입자는 약 20㎛ 내지 약 200㎛의 직경, 예컨대 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200 ㎛, 또는 상기 언급된 값 중 임의의 2 개에 의해 정의된 범위 내의 직경을 갖는다. 연속성 입자의 크기는 환경 요인으로 인해 변경될 수 있다. 일부 실시형태에서, 연속성 입자는 이들이 도 2에 도시된 바와 같이 연속 유상으로부터 분리되고 수성상에 침지될 때 팽창한다. 일부 실시형태에서, 연속성 입자의 팽창은 캡슐화 된 세포 내부의 유전 물질에 대한 에세이를 수행하는 효율을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 연속성 입자의 팽창은, 그렇지 않으면 현재 세포 기반 분석에서 제한될 수 있는, PCR 동안 색인화된 인서트가 증폭될 더 큰 환경을 생성한다.
일부 실시형태에서, 기공 크기는 캡슐화된 세포를 보유하기에 충분히 증가하지만, 도 3에 도시된 바와 같이 추출된 핵산이 상기 중합체 쉘을 통해 확산될 수 있게 한다. 일부 실시형태에서, 연속성 입자의 기공 크기는 가교 화학을 변경함으로써 제어될 수 있다. 최종 가교된 기공 크기는 연속성 입자의 환경을 변화시킴으로써, 예를 들어 염 농도, pH 또는 온도를 변화시킴으로써 고정된 분자가 상기 연속성 입자로부터 방출되게 함으로써 추가로 변경될 수 있다.
일부 실시형태에서, 가교제는 가역성 가교제이다. 일부 실시형태에서, 가역적 가교제는 히드로 겔 중합체를 가역적으로 가교시킬 수 있고, 절단제의 존재 하에서 가교되지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 가교제는 환원제의 존재, 승온 또는 전기장에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시형태에서, 가역적 가교제는 폴리아크릴아마이드 겔을 위한 가역적 가교제인 N, N'-비스(아크릴로일)시스타민일 수 있으며, 이황화 결합은 적합한 환원제의 존재 하에서 파괴될 수 있다. 도 3에 도시된 바와 같이 비드 다공도는 온도 또는 화학적 수단에 의해 증가될 수 있으며, 이에 의해 가교제를 방출, 가교제의 이황화 결합을 절단하는 환원제와의 접촉을 용이하게 하여 중공 비드를 분해시킨다. 중공 비드는 분해되고, 그 안에 보유된 핵산과 같은 내용물을 방출한다. 일부 실시형태에서, 가교제는 온도를 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100℃ 이상으로 증가시킴으로써 절단된다. 일부 실시형태에서, 가교제는 중공 비드를 환원제와 접촉시킴으로써 절단된다. 일부 실시형태에서, 상기 환원제는 포스핀 화합물, 수용성 포스핀, 질소 함유 포스핀 및 이들의 염 및 유도체, 다이티올 에리트리톨(DTE), 다이티올트레이톨(DTT)(각각 2,3-다이하이드록시-1,4-다이티올부탄의 시스 및 트랜스 이성질체), 2-머캅토 에탄올 또는 β-머캅토 에탄올(BME), 2-머캅토 에탄올 또는 아미노에탄티올, 글루타티온, 티오글리콜레이트 또는 티오글리콜산, 2,3-다이머캅토프로판올, 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP), 트리스(히드록시메틸)포스핀(THP) 또는 P-[트리스(하이드록시메틸)포스핀] 프로피온산(THPP)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 확산을 증가시키거나 환원제와의 접촉을 위해 온도를 상승시키는 것은 가교제를 분해시켜서 연속성 입자로부터 캡슐화된 유전 물질을 방출시킨다.
일부 실시형태에서, 가교제의 가교는 연속성 입자 내에 기공을 형성한다. 일부 실시형태에서, 중합체 쉘에서 기공의 크기는 조절 가능하고 세포나 약 300 개 염기쌍 초과의 핵산을 캡슐화하도록 그러나 시약과 같은 더 작은 입자, 또는 프라이머와 같은 약 50개의 염기쌍 미만의 작은 사이즈를 갖는 핵산이 상기 기공을 통과하도록 제제화된다. 일부 실시형태에서, 상기 시약은 세포는 핵산을 세포로부터 단리하기 위한 시약과 같은 유전물질 처리를 위한 시약, 핵산을 증폭 또는 시퀀싱하기 위한 시약 또는 핵산 라이브러리의 제조를 위한 시약을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 시약은 예를 들어 리소자임, 단백질 분해효소 K, 랜덤 헥사머, 폴리머라제(예컨대, Φ29 DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Bsu 폴리머라제), 트랜스포사제(예컨대, Tn5), 프라이머 (예컨대, P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매 효소, 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 버퍼 또는 2가 양이온을 포함한다.
연속성 입자 내에 사용될 수 있는 예시적인 세포 유형은 예를 들어 조직 생검으로부터 단리된 세포(예를 들어, 결장, 유방, 전립선, 폐, 피부암과 같은 질환을 갖는 조직 또는 병원체에 감염된 조직 유래) 및 동일한 조직, 예를 들어 동일한 환자 유래의 정상 세포; 불멸의 조직 배양에서 성장한 세포(예를 들어, 증식성 돌연변이 또는 불멸의 외래유전자를 갖는 세포), 병원체에 감염되거나 또는 처리된 (예를 들어, 펩타이드, 호르몬, 온도 변화, 성장 조건, 물리적 스트레스, 세포 형질 전환 등과 같은 환경적 혹은 화학물질 제제로) 세포, 및 정상 세포(예를 들어, 불멸화, 감염 또는 처리되지 않은 것을 제외하고는 실험 세포와 동일한 세포); 암, 질병을 가진 포유류로부터 단리된 세포, 노인 포유류 또는 어떤 조건에 노출된 포유 동물로부터 단리된 세포 및 예를 들어, 건강하거나 젊은, 동일한 패밀리로부터 유래된, 동일한 종의 포유류 유래 세포; 및 동일한 포유류로부터의 분화된 세포 및 미분화된 세포(예를 들어, 한 세포는 예를 들어 포유류에서 다른 세포의 선조임)를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 상이한 유형의 세포, 예를 들어 뉴런 및 비-뉴런 세포, 또는 상이한 상태의 세포(예를 들어, 세포상의 자극 전후)가 비교될 수 있다. 다른 실시형태에서, 실험 물질은 바이러스, 예를 들어 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 등과 같은 병원체에 의해 감염되기 쉬운 세포이고, 콘트롤 물질은 병원체에 의한 감염에 저항성인 세포이다. 본 발명의 다른 실시형태에서 이러한 샘플 쌍은 미분화된 세포, 예를 들어 줄기 세포 및 분화된 세포로 표시된다. 효모, 식물, 어류, 조류, 파충류, 양서류 및 포유 동물과 같은 동물 유래 세포가 본 방법에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 마우스, 토끼, 영장류 또는 인간 유래 세포와 같은 포유류 세포, 또는 이의 배양된 유도체가 사용될 수 있다.
연속성 입자의 제조방법
본 명세서에서 제공 일부 실시형태는 연속성 입자를 형성하기 위해 중합체 쉘 내에 단일 세포를 캡슐화하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 연속성 입자 내에 캡슐화되는 세포를 함유하는 샘플이 수득된다. 일부 실시형태에서, 세포는 연속성 입자 내에 캡슐화 되기 전에 고정제(fixative)로 고정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 고정제는 일반적으로 세포를 고정할 수 있는 제제를 지칭한다. 예를 들어, 고정 세포는 세포에서 단백질 복합체, 핵산 복합체 또는 단백질-핵산 복합체를 안정화시킬 수 있다. 적절한 고정제 및 가교제는 알코올 또는 알데하이드 기반 고정제, 포름 알데하이드, 글루타르 알데하이드, 에탄올 기반 고정제, 메탄올 기반 고정제, 아세톤, 아세트산, 사산화오스뮴, 이크롬산칼륨, 크롬산, 과망간산 칼륨, 수은, 피크레이트(picrate), 포르말린, 파라포름알데하이드, 비스[설포 숙신이미딜]서브에레이트(BS3), 3,3'-다이티오비스[설포숙신이미딜 프로피오네이트](DTSSP), 에틸렌글리콜 비스[설포숙신이미딜 숙시네이트](설포-EGS), 다이숙신이미딜 글루타레이트(DSG), 다이티오비스[숙신이미딜 프로피오네이트](DSP), 다이숙신 이미딜서브에레이트(DSS), 에틸렌 글리콜 비스[숙신 이미딜숙시네이트](EGS)와 같은 아민-반응성 NHS-에스테르 가교결합제, NHS-다이아지린, NHS-LC-다이아지린, NHS-SS-다이아지린, 설포-NHS-다이아지린, 설포-NHS-LC-다이아지린 및 설포-NHS-SS-다이아지린과 같은 NHS-에스터/다이아지린 가교 결합제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포를 고정시키는 것은 세포의 내부 상태를 보존하여 연속성 입자 내에서 세포의 캡슐화 동안 세포의 변형을 방지한다.
일부 실시형태에서, 연속성 입자는 미세 유체 장치가 필요없는 단일 세포 마이크로 웰/마이크로 어레이 방법 또는 미세 해부 방법과 같은 정적 수단에 의해 제조된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 연속성 입자는 장치가 없는(device-free) 방법에 의해 제조된다. 장치가 없는 방법은 세포를 중합체와 접촉시킴으로써 세포 표면상에서 중합을 개시하고, 세포 주위에 중합체 쉘을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 중합의 개시는 막 단백질, 글리칸 또는 다른 소분자의 특정 모이어티와 모노머 단위의 활성 그룹의 화학 반응에 의해 발생할 수 있다. 단량체 중합의 초기 단계 다음에는 정전기 또는 소수성 힘에 의해 촉진된 1 회 또는 수 회의 단량체 단위 침착이 이어질 수 있다. 일부 모노머 층은 캡슐화된 세포의 특정 포획을 위해 나중에 사용될 수 있는 비오틴 또는 다른 리간드와 같은 작용기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 도 4에 나타난 바와 같이, 내장된 세포는 비오틴을 함유할 수 있고, 내장된 세포를 자성 스트렙타비딘 비드로 코팅하면 이들을 자화시켜 자동화되고 용이한 처리를 가능하게 할 수 있다. 대안적으로, 도 5에 나타난 바와 같이, 개시제 분자가 수동 흡착에 의해 또는 표적화된 방식으로-예를 들어 항체 또는 다른 특이적 결합 분자에의 부착과 같은- 세포 표면에 도입되고 국소화된 중합체 증폭을 촉진할 때, 빛 또는 다른 물리적 또는 화학적 수단에 의해 살아있는 또는 고정된 세포 캡슐화가 개시될 수 있다.
표적화된 표면-개시 중합법으로 세포를 캡슐화함으로써, 사용자는 관심 대상 세포를 구체적으로 선택하고 동시에 후속 다운스트림 분석을 위해 세포를 준비함으로써 플로우-소팅을 단일 세포 분석과 조합할 수 있다. 특정 세포 유형의 농축은 농축 표면에 접합된 특정 세포막 단백질에 특이적인 자기적으로 표지된 비드 또는 커스텀 결합 분자를 이용하는 세포 분리 키트를 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 연속성 입자는 볼텍스 보조 에멀션, 미세 유체 액적 생성 또는 밸브 기반 미세 유체와 같은 동적 수단에 의해 제조된다. 본 명세서에서 사용되는 볼텍스 보조 에멀션은 튜브, 바이알 또는 반응 용기와 같은 용기에서 본 명세서에 기재된 고정 세포를 포함하여, 세포와 하이드로겔 중합체를 와류(볼텍싱)시키는 것을 의미한다. 상기 성분은 예를 들어 수동 또는 기계적 볼텍스 또는 쉐이킹에 의해 혼합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 수동 혼합은 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200㎛ 직경 크기 또는 전술한 값 중 임의의 2 개에 의해 정의된 범위 내의 크기를 갖는 유전 물질을 캡슐화하는 중공 비드를 유도한다. 일부 실시형태에서, 비드의 크기는 불균일하므로, 비드의 크기는 다양한 직경의 비드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 연속성 입자는 미세 유체 흐름 기술에 의해 제조된다. 미세 유체 흐름은 도 1에 도시된 바와 같이 보조 겔 에멀션 생성을 위한 미세 유체 장치의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 미세 유체 장치는 원하는 크기의 연속성 입자를 생성하도록 구성되고 연속성 입자 당 단일 세포를 캡슐화하도록 구성된 미세 채널을 포함한다. 일부 실시형태에서, 미세 유체 장치의 높이는 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200㎛, 또는 상기 언급된 값 중 임의의 2 개에 의해 정의된 범위 내의 값을 갖는다. 일부 실시형태에서, 미세 유체 장치는 하나 이상의 채널을 포함한다. 일부 실시형태에서, 미세 유체 장치는 중합체에 도입되는 고정 세포를 포함하여, 세포를 도입하기 위한 채널, 가교제를 도입하기 위한 채널 및 비혼화성 유체를 위한 채널을 포함한다. 일부 실시 예에서, 하나 이상의 채널의 폭은 동일하다. 일부 실시 예에서, 하나 이상의 채널의 폭은 상이하다. 일부 실시 예에서, 하나 이상의 채널의 폭은 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 또는 150㎛, 또는 전술 한 값 중 임의의 2 개에 의해 정의 된 범위 내의 폭을 갖는다. 채널의 폭 및 높이는 본 명세서에 기술된 값으로 반드시 제한되는 것은 아니며, 당업자는 연속성 입자의 크기가 미세 유체 장치의 채널의 크기에 부분적으로 의존할 것임을 인식할 것이다. 따라서, 연속성 입자의 크기는 채널의 크기를 수정함으로써 부분적으로 조정될 수 있다. 미세 유체 장치의 크기 및 채널의 폭에 더하여, 채널의 유속은 또한 연속성 입자의 크기에 영향을 미칠 수 있고, 또한 각 연속성 입자 내에 캡슐화된 세포의 수에 영향을 미칠 수 있다.
일부 실시형태에서, 미세 유체 채널을 통한 중합체와 혼합된 고정 세포를 포함하여 중합체 내의 세포의 유속은 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150㎕/min, 또는 전술한 값 중 임의의 2 개에 의해 정의된 범위 내의 값일 수 있다. 일부 실시형태에서, 미세 유체 채널에서 가교제의 유속은 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150㎕/min, 또는 위에서 언급한 임의의 두 값에 의해 정의된 범위 내의 값이다. 일부 실시형태에서, 미세 유체 채널에서 비혼화성 유체의 유속은 20, 30, 50, 80, 100, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375 또는 400㎕/min 또는 위에서 언급한 임의의 두 값에 의해 정의된 범위 내의 속도이다. 일부 실시형태에서, 중합체와 혼합된 고정 세포를 포함하여, 중합체와 혼합된 세포, 및 가교제는 비혼화성 유체의 상류 미세 유체 액적 발생기에서 서로 접촉한다. 연속성 입자는 가교제와의 접촉시 중합체 쉘 내에 세포를 캡슐화하여 형성되기 시작한다. 상기 형성되는 연속성 입자는 미세 유체 액적 발생기를 통해 스페이서 오일 및/또는 가교제 오일과 같은 비혼화성 유체 내로 비혼화성 유체의 유속보다 작은 유속으로 계속 유동하여 액적을 형성한다. 일부 실시형태에서, 비혼화성 유체는 스페이서 오일 및 가교제 오일을 포함하여 도 1에 도시된 바와 같이 두 단계로 도입된다. 일부 실시형태에서, 스페이서 오일은 미네랄 오일, 탄화수소 오일, 실리콘 오일, 플루오로 카본 오일 또는 폴리 다이메틸 실록산 오일, 또는 이들의 혼합물이다. 본 명세서에서 사용된 스페이서 오일은 채널 수성-오일 인터페이즈에서 중합체의 가교를 피하기 위해 사용된다.
일부 실시형태에서, 연속성 입자는 순간 가교제와의 가교에 의해 순간적으로 형성된다. 예를 들어, 미세 유체 액적 발생기를 사용하여 4-암(arm) PEG 말레이미드 또는 에폭사이드와 같은 중합체로 캡슐화된 세포는 미네랄 오일 또는 HFE-7500과 같은 플루오로카본 오일과 같은 오일에 용해될 수 있고 가교 오일을 형성하는 가교제를 이용하여 즉시 가교될 수 있다. 일부 실시형태에서, 가교 오일은, 톨루엔-3,4-다이티올, 2,4-다이아미노톨루엔, 헥산다이티올의 경우에서와 같이, 다이티올, 아민 작용기를 가진, 톨루엔, 아세톤, 테트라하이드로퓨란을 포함하며, 이들은 형성되는 액적 내로 쉽게 확산되어 연속성 입자를 즉시 가교시킨다.
일부 실시형태에서, 연속성 입자는 균일한 크기 분포로 제제화된다. 일부 실시형태에서, 연속성 입자의 크기는 미세 유체 장치의 크기, 하나 이상의 채널의 크기, 또는 미세 유체 채널을 통한 유속을 조정함으로써 미세하게 조정된다. 일부 실시형태에서, 생성된 연속성 입자는 20 내지 200㎛, 예를 들어 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200㎛ 또는 전술한 값 중 임의의 2 개에 의해 정의된 범위 내의 직경을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 연속성 입자의 크기 및 균일성은 입자 형성 전에 하이드로겔 중합체를 유동성 개질제, 예컨대 아이소프로필 알코올을 포함하는 알코올과 같은 유체 개질제와 하이드로겔 중합체를 접촉시킴으로써 추가로 제어될 수 있다. 아이소프로필 알코올이 없는 경우, 연속성 입자는 아이소프로필 알코올의 존재하에 형성되는 연속성 입자보다 큰 직경으로 형성된다. 아이소프로필 알코올은 하이드로겔 중합체의 유동 특성에 영향을 미쳐 연속성 입자의 크기를 조절할 수 있다.
당업자에게 인식되는 바와 같이, 도 1에 도시된 미세 유체 장치는 3 채널 미세 유체 장치의 예이지만, 미세 유체 장치는 특정 크기의 연속성 입자를 생성하거나 다양한 하이드로겔 물질 또는 가교제로부터 형성된 연속성 입자를 생성하도록 개질, 변화 또는 변경될 수 있다.
일부 실시형태에서, 볼텍스 보조 에멀션 또는 미세 유체 관류 유동 보조 에멀션에 의해 제조된 연속성 입자는 본 명세서에 기재된 단일 고정 세포를 포함하는 단일 세포를 캡슐화한다. 일부 실시형태에서, 연속성 입자 내의 세포의 수는 입력된 샘플 내에서 세포를 함유하는 용액을 희석 또는 농축시킴으로써 제어될 수 있다. 세포를 포함하는 샘플을 하이드로겔 중합체와 혼합하고, 세포를 함유하는 하이드로겔 중합체를 본 명세서에 기술된 바와 같이 볼텍스 보조 에멀션 또는 미세유체 유동 보조 에멀션에 제공한다.
일부 실시형태에서, 연속성 입자는 뉴클레오타이드로 기능화된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오타이드는 올리고 뉴클레오타이드 또는 폴리T 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오타이드는 연속성 입자에 결합되고, 기능화된 연속성 입자는 관심 뉴클레오타이드의 표적화된 포획을 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단일 세포를 캡슐화하는 연속성 입자는 다중 완충액 세척, 다중 시약 교환 및 수행되는 분석에 기초한 다중 분석을 포함하는 단일 연속성 입자에 대해 다중 공동-분석을 수행하도록 경화된다. 표면 개시 중합 기법, 볼텍싱 또는 미세 유체 기법을 포함하여 본 명세서에 기술된 임의의 방법에 의해 제조된 제제화된 연속성 입자는 패터닝된 플로우 셀, 마이크로어레이, 웰이 있는 플레이트, 에칭된 표면, 미세 유체 채널, 비드, 칼럼 또는 캡슐화된 셀에 대해 다중 공동-분석을 수행하기 위한 다른 표면상에 로딩 또는 시딩될 수 있다.
연속성 입자 내에 캡슐화된 세포에 대해 다중의 공동-분석(mutiple co-assay)을 수행하는 방법
본 명세서에서 제공 일부 실시형태는 연속성 입자 내에 캡슐화 된 단일 세포상에서 다중의 순차적 공동-분석(multiple sequential co-assay)을 수행하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 연속성 입자를 수득하고, 연속성 입자 내에 캡슐화 된 단일 세포를 시약과 순차적으로 접촉시켜 다중의 순차적 공동-분석을 수행하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 연속성 입자는 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조되고, 연속성 입자는 플로우 셀 장치, 플레이트의 웰, 슬라이드 또는 패턴화 된 표면과 같은 표면 상에 로딩된다. 일부 실시형태에서, 상기 표면은 플로우 셀 장치이고, 플로우 셀 장치에서 공간 인덱싱을 위한 연속성 입자의 분포를 위한 어레이 내에 마이크로 웰 또는 마이크로필러를 갖는 인서트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 연속성 입자는 각각의 웰에 단일 연속성 입자를 갖는 웰 플레이트 상에 로딩된다. 웰 플레이트는 단일 연속성 입자-그러므로 단일 세포가 각 웰에 침착된-를 갖는, 예를 들어 웰 플레이트 내 12 웰 플레이트, 24 웰 플레이트, 48 웰 플레이트, 96 웰 플레이트, 384 웰 플레이트, 1536 웰 플레이트, 3456 웰 플레이트, 또는 9600 웰 플레이트, 또는 임의의 웰 수를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 연속성 입자는 투과제로 투과(permeablized)된다. 일부 실시형태에서, 투과제는 트리톤 X-100과 같은 중성 세제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 투과제는 연속성 입자 내에서 세포의 세포막을 투과화시켜 게놈 DNA 및 RNA와 같은 세포 핵산에 대한 접근성을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 각각의 웰 내에 침착된 단일 연속성 입자를 갖는 웰 플레이트는 예를 들어 완충액 세척, 용해, DNA 분석, RNA 분석, 단백질 분석, 태깅, 핵산 증폭, 핵산 시퀀싱, DNA 라이브러리 제조, 시퀀싱을 이용한 트랜스포사제 접근성 크로마틱 분석(ATAC-seq), 연속성 보존 전치 시퀀싱(CPT-seq), 단일 세포 조합 인덱스 시퀀싱(SCI-seq), 단일 세포 게놈 증폭, 또는 순차적으로 수행되는 이들의 임의의 조합을 포함하여 시퀀스의 다중 공동-분석에 처해진다.
일부 실시형태에서, 세포 또는 바이러스 입자를 캡슐화하는 연속성 입자는 세포로부터 핵산을 정제하고 분리하기 위해 처리된다. 따라서, 예를 들어 연속성 입자는 용해 완충제와 접촉된다. 본 명세서에서 사용되는 "용해(lysis)"는 세포 RNA 또는 DNA의 접근 또는 방출을 용이하게 하는 세포벽 또는 바이러스 입자에 대한 동요(perturbation) 또는 변경(alteration)을 의미한다. 세포벽의 완전한 파괴 또는 파열은 용해에 필수적인 요건이 아니다. 용어 "용해 완충액(lysis buffer)"은 하나 이상의 용해제를 함유하는 버퍼를 의미한다. 전형적인 효소적 용해제는 리소자임, 글루코라제, 지몰로스(zymolose), 리티카제(lyticase), 단백질 분해효소 K, 단백질 분해효소 E, 및 바이러스 엔도리신 및 엑소리신을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 예를 들어, 연속성 입자에서 세포의 용해는 라아이소자임 및 단백질 분해효소 K와 같은 용해제를 연속성 입자에 도입함으로써 수행될 수 있다. 세포로부터의 gDNA는 이제 연속성 입자 내에 함유된다. 일부 실시형태에서, 용해 처리 후, 단리된 핵산은 연속성 입자 내에 보유되고 추가 처리에 사용될 수 있다.
DNA 분석은 캡슐화된 세포 내에 함유된 DNA를 증폭, 서열 분석 또는 달리 분석하는데 사용되는 임의의 기술을 지칭한다. DNA 증폭은 PCR 기술 또는 파이로시퀀싱을 사용하여 달성될 수 있다. DNA 분석은 또한 비표적화된 비-PCR 기반 DNA 시퀀싱 (예를 들어, Metagenomics) 기술을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, DNA 분석은 16S rDNA의 초가변(hyper-variable) 영역 (리보솜 DNA)을 시퀀싱하고 DNA를 통한 종 식별을 위해 시퀀싱을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
RNA 분석은 캡슐화된 세포 내에 함유된 RNA를 증폭, 서열 분석 또는 달리 분석하는데 사용되는 임의의 기술을 지칭한다. DNA를 분석하는 데 사용된 것과 동일한 기술을 사용하여 RNA를 증폭하고 시퀀싱할 수 있다. DNA보다 덜 안정적인 RNA는 자극에 반응하는 DNA의 번역물이다. 따라서, RNA 분석은 커뮤니티의 대사적으로 활성인 구성원의 보다 정확한 그림을 제공할 수 있고 샘플에서 유기체의 커뮤니티 기능에 관한 정보를 제공하는데 사용될 수 있다. 핵산 시퀀싱은 DNA 또는 RNA와 같은 핵산 분자의 서열에서 뉴클레오타이드의 순서를 결정하기 위한 시퀀싱의 사용을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "시퀀싱"은 이에 의해 폴리뉴클레오타이드의 10 개 이상의 연속 뉴클레오타이드(예를 들어, 20 개 이상, 50 개 이상, 100 개 이상 또는 200 개 이상의 연속 뉴클레오타이드의 확인)의 확인이 얻어지는 방법을 지칭한다.
"차세대 시퀀싱" 또는 "고-처리량 시퀀싱" 또는 "NGS"라는 용어는 일반적으로 대규모 병렬 시그니처 시퀀싱, 고처리량 시퀀싱, 결찰에 의한 시퀀싱 (예컨대, SOLiD 시퀀싱), 양성자 이온 반도체 시퀀싱, DNA 나노볼 시퀀싱, 단일 분자 시퀀싱 및 나노 포어 시퀀싱을 포함하지만 이에 제한되지 않는 고처리량 시퀀싱 기술을 지칭하며, 현재 Illumina, Life Technologies 또는 Roche 등에 의해 사용되는 병렬화 된 합성에 의한 시퀀싱(parallelized sequencing-by-synthesis) 또는 시퀀싱-바이-라이게이션 플랫폼을 지칭할 수 있다. 차세대 시퀀싱 방법은 또한 나노 포어 시퀀싱 방법 또는 Life Technologies에 의해 상업화된 이온 토렌트(Ion Torrent) 기술 또는 Pacific Biosciences에 의해 상업화된 단일 분자 형광-기반 방법과 같은 전자 검출 기반 방법을 포함할 수 있다.
단백질 분석은 캡슐화된 세포에서 단백질의 연구를 말하며, 단백질 분석, 관심 단백질의 번역 후 변형 결정, 단백질 발현 수준의 결정, 또는 다른 단백질 또는 핵산을 포함한 다른 분자와의 단백질 상호 작용의 결정을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "태그화(태깅, tagmentation)"는 트랜스포손 말단 서열을 포함하는 어댑터와 복합체화된 트랜스포사제 효소를 포함하는 트랜스포솜 복합체에 의한 DNA의 변형을 지칭한다. 태그화는 DNA의 동시적인 단편화 및 듀플렉스 단편의 양 가닥의 5 '말단에 대한 어댑터의 결찰(ligation)을 초래한다. 트랜스포사제 효소를 제거하기 위한 정제 단계 후에, 추가적인 서열이 예를 들어 PCR, 결찰 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 적합한 방법에 의해, 어댑팅된 단편의 말단에 첨가될 수 있다.
시퀀싱을 이용한 트랜스포사제 접근성 크로마틱 분석(ATAC-seq)은 통합 에피게놈 분석의 빠르고 민감한 방법을 지칭한다. ATAC-seq는 개방 염색질 부위를 포착하고 개방 염색질의 게놈 위치, DNA 결합 단백질, 개별 뉴클레오솜 및 뉴클레오타이드 레졸루션을 갖는 조절 영역에서의 고차 압축(higher-order compaction) 간의 상호 작용을 드러낸다. 뉴클레오솜을 엄격하게 회피하거나, 견딜 수 있거나, 이것과 중첩되는 경향이 있는 DNA 결합 인자의 클래스가 발견되었다. ATAC-seq를 사용하여, 휴지 인간 T 세포의 일련의 일일 에피게놈을 표준 혈액 채취를 통해 프로 밴드로부터 측정하고 평가하여, 건강 및 질병을 모니터링하기 위해 임상 시간 척도에서 개인 에피게놈을 읽을 수 있는 가능성을 입증하였다. 보다 구체적으로, ATAC-seq는 삽입 효소 복합체로 연속성 입자 내의 단일 캡슐화된 세포로부터의 염색질을 처리하여 게놈 DNA의 태그된 단편을 생성함으로써 수행될 수 있다. 이 단계에서, 염색질의 열린 영역에서 게놈 DNA를 절단하고 단편의 양쪽 말단에 어댑터를 추가하는 Tn5 또는 MuA와 같은 삽입 효소를 사용하여 염색질을 태그화(예를 들어, 동일한 반응에서 단편화 및 태깅)시킨다.
일부 경우에, 염색질에서 바람직한 수준의 삽입 (예를 들어, 열린 영역에서평균적으로 50 내지 200개의 염기 쌍마다 발생하는 삽입)을 얻도록 조건이 조정될 수 있다. 상기 방법에 사용된 염색질은 임의의 적합한 방법으로 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵은 단리되고, 용해될 수 있고, 염색질은 예를 들어 핵 외피로부터 추가로 정제될 수 있다. 다른 실시형태에서, 염색질은 단리된 핵을 반응 완충액과 접촉시킴으로써 단리될 수 있다. 이들 실시형태에서, 단리된 핵은 반응 완충액(삽입 효소 복합체 및 다른 필요한 시약을 포함함)과 접촉할 때 용해되어 삽입 효소 복합체(insertional enzyme complex)가 염색질에 접근할 수 있게 한다. 이들 실시형태에서, 상기 방법은 세포 집단으로부터 핵을 분리하는 단계; 및 단리된 핵을 트랜스포사제 및 어댑터와 조합하는 단계로서, 상기 조합은 핵을 용해시켜 상기 염색질을 방출하고, 게놈 DNA의 어댑터-태그된 단편의 생성을 초래한다. 염색질은 다른 방법(예컨대, ChIP-SEQ 방법)에서와 같이 가교가 필요하지 않다.
염색질이 게놈 DNA의 태깅된 단편을 생성하기 위해 단편화되고 태깅된 후, 어댑터 태깅된 단편 중 적어도 일부가 시퀀싱되어 복수의 서열 리드를 생성한다. 상기 단편은 임의의 적합한 방법을 사용하여 서열 분석될 수 있다. 예를 들어, Illumina의 가역적 종결자 방법, Roche의 파이로시퀀싱 방법(454), 결찰에 의한 Life Technologies의 시퀀싱(SOLiD 플랫폼) 또는 Life Technologies의 Ion Torrent 플랫폼을 사용하여 상기 단편을 시퀀싱할 수 있다. 이러한 방법의 예는 하기 문헌에 설명되어 있으며, 이들은 각 단계의 모든 출발 생성물, 라이브러리 제조 방법, 시약 및 각각의 최종 생성물을 포함하는, 상기 방법 및 상기 방법의 특정 단계에 대한 일반적인 설명을 위해 본 명세서에 참고로 포함된다: 문헌[Margulies et al. (Nature 2005 437 : 376-80); Ronaghi et al. (Analytical Biochemistry 1996 242 : 84-9); Shendure et al. (Science 2005 309 : 1728-32); Imelfort et al. (Brief Bioinform 2009 10 : 609-18); Fox et al. (Methods Mol Biol. 2009; 553 : 79-108); Appleby et al.(Methods Mol Biol. 2009; 513:19-39) 및 Morozova et al.(Genomics. 2008 92 : 255-64)]. 명백한 바와 같이, 선택된 차세대 서열 분석 플랫폼과 호환되는 정방향 및 역방향 시퀀싱 프라이머 부위는 증폭 단계 동안 상기 단편의 말단에 첨가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 단편은 단편에 첨가된 태그에 혼성화되는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있으며, 여기서 PCR에 사용된 프라이머는 특정 시퀀싱 플랫폼과 상용인 5' 테일을 갖는다. ATAC-seq를 수행하는 방법은 PCT 출원번호 PCT/US2014/038825에 기술되어 있으며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "염색질(chromatin)"은 진핵 세포의 핵에서 발견되는 단백질 및 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, DNA, RNA)를 포함하는 분자의 복합체를 지칭한다. 염색질은 뉴클레오솜을 형성하는 히스톤 단백질, 게놈 DNA 및 게놈 DNA에 일반적으로 결합된 다른 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 전사 인자)의 일부로 구성된다.
연속성-보존 전치 시퀀싱(CPT-seq)은 표적 핵산에 인접한 주형 핵산 단편의 연관성을 유지하기 위해 트랜스포사제를 사용하여 인접성 정보를 보존하면서 시퀀싱하는 방법을 말한다. 예를 들어, CPT는 DNA 또는 RNA와 같은 핵산 상에서 수행될 수 있다. CPT-핵산은 고유한 인덱스 또는 바코드를 갖는 상보적 올리고뉴클레오타이드의 혼성화에 의해 포획될 수 있고 고체 지지체 상에 고정화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체 지지체 상에 고정된 올리고 뉴클레오타이드는 바코드 외에 프라이머 결합 부위, 고유 분자 인덱스를 추가로 포함할 수 있다. 유리하게도, 단편화된 핵산의 물리적 근접성을 유지하기 위한 트랜스포좀의 그러한 사용은 동일한 원래의 분자, 예를 들어 염색체로부터 단편화된 핵산이 고체 지지체 상에 고정된 올리고뉴클레오타이드로부터 동일한 고유 바코드 및 인덱스 정보를 받을 가능성을 증가시킨다. 이로 인해 고유 바코드가 있는 연속적으로 연결된 시퀀싱 라이브러리가 생성된다. 상기 연속적으로 연결된 시퀀싱 라이브러리는 연속적인 서열 정보를 유도하기 위해 시퀀싱될 수 있다. 본 명세서에 기재된 연속성 입자는 캡슐화된 세포로부터 추출된 핵산상에서 CPT-seq의 수행을 위해 CPT-seq 시약과 접촉될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "연속성 정보"는 공유 정보에 기초한 둘 이상의 DNA 단편 사이의 공간적 관계를 지칭한다. 상기 정보의 공유 측면은 인접, 구획 및 거리 공간 관계에 관한 것일 수 있다. tum에서의 이들 관계에 관한 정보는 DNA 단편으로부터 유래된 서열 리드의 계층적 조립 또는 맵핑을 용이하게 한다. 이러한 연속성 정보는, 종래의 샷건 시퀀싱과 관련하여 사용되는 전통적인 어셈블리 또는 매핑 방법이 개별 서열 리드의 상대적인 게놈 기원 또는 좌표를 고려하지 않기 때문에, 개별 서열 리드가 유래된 2 개 이상의 DNA 단편 간 공간적 관계와 관련되어 있으므로 이러한 어셈블리 또는 매핑의 효율 및 정확성을 향상시킨다.
따라서, 본 명세서에 기술된 실시예에 따르면, 연속성 정보를 캡처하는 방법은 인접 공간 관계를 결정하기 위한 단범위 연속성 방법, 구획 공간 관계를 결정하기 위한 중간 범위 연속성 방법, 또는 거리 공간 관계를 결정하기 위한 장범위 연속성 방법에 의해 달성될 수 있다. 이들 방법은 DNA 서열 어셈블리 또는 맵핑의 정확성 및 품질을 용이하게 하고, 본 명세서에 기재된 것과 같은 임의의 서열 분석 방법과 함께 사용될 수 있다.
연속성 정보는 개별 서열 리드가 유래 된 둘 이상의 DNA 단편 사이의 공간적 관계와 관련되기 때문에 개별 서열 리드의 상대적인 게놈 기원 또는 좌표를 포함한다. 일부 실시예들에서, 연속성 정보는 비중첩 서열 리드들로부터의 시퀀스 정보를 포함한다.
일부 실시형태에서 표적 핵산 서열의 인접성 정보는 하플로타입 정보를 나타낸다. 일부 실시형태에서 표적 핵산 서열의 인접성 정보는 게놈 변이체를 나타낸다.
단일 세포 조합 인덱스 시퀀싱(SCI-seq)은 체세포 카피 수 변이 검출을 위해 수천 개의 저역 통과(low-pass) 단일 세포 라이브러리를 동시에 생성하기 위한 시퀀싱 기술이다.
따라서, 단독으로 또는 임의의 다른 분석과 조합하여 본 명세서에 기재된 분석을 포함하여, 세포 또는 세포의 핵산을 분석하기 위해 단일 세포에 대해 다중의 공동-분석이 수행될 수 있다.
인덱싱된 연속성 입자는 또한 포스트/마이크로웰의 어레이를 통해 유지되는 플로우 셀에 직접 로딩될 수 있다. 인덱싱된 라이브러리는 연속성 입자 (화학물질/온도 방출)에서 방출되어 플로우 셀에 바인딩된다. 이를 통해 첫 번째 수준의 인덱싱이 공간 위치에서 나온 후 다음 수준이 단일 연속성 입자의 인덱싱된 라이브러리로부터 나오는 강력한 인덱싱 방식을 사용할 수 있다. 대안적으로, 연속성 입자로부터 추출된 인덱싱된 라이브러리는 플로우 셀에 집합적으로 로딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, 연속성 입자 내에 캡슐화된 세포는 핵산 프로세싱을 위해 하나 이상의 시약과 접촉된다. 일부 실시형태에서, 세포는 연속성 입자 내에 보유되고, 시약은 연속성 입자의 기공을 통과할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시약은 용해제, 핵산 정제제, DNA 증폭제, 태깅화제, PCR 작용에멀션또는 유전자 물질의 프로세싱에 사용되는 다른 제제를 포함할 수 있다. 따라서, 연속성 입자는 상기 연속성 입자 내에 세포 자체를 유지시키면서 시약에 대한 장벽이 중합체 쉘 내외로 통과하도록 하여 연속성 입자 내에서 세포로부터 추출된 핵산을 포함하는 세포의 제어된 반응을 위한 미세 환경을 제공한다. 일부 실시형태에서, 중합체 쉘의 기공은 시약의 흐름 및 중합체 쉘을 통해 세포로부터 추출된 DNA 및 RNA와 같은 핵산의 흐름 또한 허용하도록 조절된다.
일부 실시형태에서, 전체 DNA 라이브러리 제조는 중합체 쉘 내에 gDNA 및 그 라이브러리 산물을 유지하면서 다공성 하이드로겔을 통과시킴으로써 다수의 시약 교환으로 연속성 입자 내부에서 원활하게 달성될 수 있다. 하이드로겔은 상이한 생화학적 반응을 지지하기 위해 수 시간 동안 최대 95 ℃의 고온에 견딜 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단리(분리)된", "분리하는", "분리", "정제된", "정제하는", "정제" 및 그와 동등한 문법적 용어는 달리 명시되지 않는 한, 샘플 또는 물질이 분리되는 공급원(예를 들어, 세포)으로부터의 적어도 하나의 오염물(예컨대, 단백질 및/또는 핵산 서열)의 양의 감소를 가리킨다. 따라서, 정제는 "농축", 예를 들어 샘플에서 바람직한 단백질 및/또는 핵산 서열의 양의 증가를 초래한다.
핵산의 용해 및 단리 후에, 특히 단일 세포로부터 소량의 DNA를 증폭시키기 위해 널리 사용되는 기술인 다중 변위 증폭(MDA, multiple displacement amplification)과 같은 증폭이 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 캡슐화된 핵산은 증폭, 시퀀싱 또는 핵산 라이브러리의 제조에 사용된다. 핵산 또는 핵산 반응과 관련하여 사용되며 본 명세서에서 사용되는 용어 "증폭하다", "증폭된", "증폭함"은 예를 들어, 본 명세서 실시형태에 의하여 표적 핵산 또는 연속성 입자 내에 캡슐화된 핵산과 같이 특정 핵산의 카피를 만드는 인비트로 방법을 가리킨다. 핵산 증폭의 다수의 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 증폭 반응은 중합 효소 연쇄 반응, 리가제 연쇄 반응, 가닥 대체 증폭 반응(strand displacement amplification reaction), 롤링 서클 증폭 반응, 다중 어닐링 및 루핑 기반 증폭 사이클(MALBAC), NASBA와 같은 전사 매개 증폭 방법, 루프 매개 증폭 방법 (예를 들어, 루프 형성 서열을 사용한 "LAMP" 증폭과 같은)을 포함한다. 증폭되는 핵산은 변형된 DNA 및/또는 RNA를 포함하여, DNA 또는 RNA 또는 DNA 및 RNA의 혼합물을 포함하거나, 이로 이루어지거나 이로부터 유도된 DNA일 수 있다. 출발 핵산이 DNA, RNA 또는 양자이든, 핵산 분자 또는 분자들의 증폭으로부터 생성된 산물 (예를 들어, "증폭 생성물")은 DNA 또는 RNA이거나 DNA와 RNA 뉴클레오시드 또는 뉴클레오타이드의 혼합물일 수 있고, 이들은 변형된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드 또는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. "카피"는 표적 서열에 대하여 반드시 완전한 서열 상보성 또는 동일성을 의미하는 것은 아니다. 예를 들어, 카피는 데옥시이노신 또는 데옥시우리딘과 같은 뉴클레오타이드 유사체, 의도적 서열 변경 (예를 들어, 표적 서열과 혼성화 가능하지만 상보적이지 않은 서열을 포함하는 프라이머를 통해 도입된 서열 변경) 및/또는 증폭 동안 발생하는 서열 오류를 포함할 수 있다.
연속성 입자 내에서 분리된 캡슐화된 핵산은 당업계에 공지된 임의의 적합한 증폭 방법에 따라 증폭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 캡슐화된 핵산은 연속성 입자 내에서 증폭된다. 일부 실시형태에서, 연속성 입자는 고체 지지체 상에 포획되고 분해되며, 여기서 캡슐화된 핵산은 고체 지지체 상으로 방출되고 핵산은 고체 지지체 상에서 증폭된다.
일부 실시형태에서, 캡슐화된 핵산은 연속성 입자 내에서 증폭된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 증폭 프라이머 및 효소는 연속성 입자의 기공을 통과하고 캡슐화된 핵산에 혼성화된다.
*본 명세서에 기술되거나 당업계에 일반적으로 알려진 임의의 증폭 방법은 캡슐화 된 핵산을 증폭시키기 위해 범용 또는 표적-특이적 프라이머와 함께 이용될 수 있음을 이해할 것이다. 미국 특허 제8,003,354호에 기술된 바와 같이 증폭에 적합한 방법은 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 가닥 치환 증폭(SDA), 전사 매개 증폭(TMA) 및 핵산 서열 기반 증폭(NASBA)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않으며, 이는 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 상기 증폭 방법은 하나 이상의 관심 대상 핵산을 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 멀티 플렉스 PCR, SDA, TMA, NASBA 등을 포함하여, PCR은 캡슐화된 핵산을 증폭시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심 핵산에 특이적으로 지향된(directed) 프라이머가 증폭 반응에 포함된다.
핵산 증폭을 위한 다른 적합한 방법은 올리고뉴클레오타이드 연장 및 결찰, 롤링 서클 증폭(RCA)(Lizardi et al., Nat. Genet. 19 : 225-232 (1998), 본 명세서에 참고로 포함됨) 및 올리고뉴클레오타이드 결찰 분석 기술(oligonucleotide ligation assay (OLA) technologies)을 포함할 수 있다(미국 특허 제7,582,420호, 제5,185,243호, 제5,679,524호 및 제5,573,907호; EP 0 320308 B1; EP 0 336 731 B1; EP 0 439182 B1; WO 90/01069; WO 89/12696; 및 WO 89/09835, 이들 모두는 참고로 포함됨). 이들 증폭 방법론은 캡슐화된 핵산을 증폭시키도록 설계될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 상기 증폭 방법은 관심 핵산에 특이적으로 지향된 프라이머를 함유하는, 결찰 프로브 증폭 또는 올리고뉴클레오타이드 결찰 분석(OLA) 반응을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 증폭 방법은 관심 핵산에 특이적으로 지향되는 프라이머를 포함하는 프라이머 연장-결합 반응을 포함할 수 있고, 상기 핵산은 하이드로겔 기공을 통과할 수 있다. 관심 핵산을 증폭하도록 특이적으로 설계될 수 있는 프라이머 연장 및 결찰 프라이머의 비제한적 예로서, 증폭은 미국 특허 제7,582,420호 및 제7,611,869호에 예시된 바와 같이 GoldenGate 분석(Illumina, Inc., 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 사용되는 프라이머를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 기술된 각각의 방법에서, 핵산 반응에 관여하는 시약 및 성분은 연속성 입자 내에 핵산 자체를 유지하면서 연속성 입자의 기공을 통과할 수 있다.
일부 실시형태에서, 캡슐화된 핵산은 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호의 개시내용에 의해 예시된 클러스터 증폭 방법을 사용하여 증폭되며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호의 통합된 내용은 고정된 핵산 분자의 클러스터 또는 "콜로니"로 구성된 어레이를 형성하기 위해 증폭 생성물이 고체 지지체 상에 고정될 수 있게 하는 핵산 증폭 방법이 기술되어 있다. 이러한 어레이상의 각각의 클러스터 또는 콜로니는 복수의 동일한 고정화된 폴리뉴클레오타이드 가닥 및 복수의 동일한 고정된 상보성 폴리뉴클레오타이드 가닥으로부터 형성된다. 이렇게 형성된 어레이는 본 명세서에서 일반적으로 "클러스터된 어레이"로 지칭된다. 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호에 기술된 것과 같은 고체상 증폭의 생성물은 고정된 폴리 뉴클레오타이드 가닥 및 고정된 상보적 가닥 쌍을 어닐링함으로써 형성된 소위 "브리지" 구조이며, 두 가닥은 바람직하게는 공유 부착을 통해 5' 말단에서 고체 지지체 상에 고정되어 있다. 클러스터 증폭 방법론은 고정된 핵산 주형을 사용하여 고정된 앰플리콘을 생성하는 방법의 예이다. 본 명세서에서 제공 방법에 따라 생성 된 고정화된 DNA 단편으로부터 고정화된 앰플리콘을 생성하기 위해 다른 적합한 방법이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 각각의 증폭 프라이머 쌍 중 하나 또는 둘 모두의 프라이머가 고정화되어 있는지 여부에 상관없이 하나 이상의 클러스터 또는 콜로니는 고상 PCR을 통해 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 캡슐화 된 핵산은 연속성 입자 내에서 증폭된 후, 클러스터에 어레이 또는 고체 지지체 상에 침착된다.
추가 증폭 방법은 등온 증폭을 포함한다. 사용될 수 있는 예시적인 등온 증폭 방법은, 예를 들어 문헌[Dean et al., PNAS USA 99 : 5261-66 (2002)]에 예시된 다중 치환 증폭(MDA) 또는 예를 들어, 미국 특허 6,214,587에 예시된 등온 가닥 치환 핵산 증폭을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 이들 각각은 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 개시에 사용될 수 있는 다른 비-PCR-기반 방법은, 예를 들어 문헌[Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995; 미국 특허 제5,455,166호 및 제5,130,238호 및 Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992)]에 기재된 가닥 치환 증폭(SDA) 또는 예를 들어, 문헌[Lage et al., Genome Research 13 : 294-307 (2003)]에 기술된 하이퍼-분지화(hyperbranched) 가닥 치환 증폭을 포함하며, 이들 각각은 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 등온 증폭 방법은 게놈 DNA의 무작위 프라이머 증폭을 위한 가닥 치환 Phi 29 폴리머라제 또는 Bst DNA 폴리머라제 큰 단편, 5 '-> 3'엑소-와 함께 사용될 수 있다. 이들 폴리머라제의 사용은 높은 처리성(processivity) 및 가닥 치환 활성을 이용한다. 높은 처리성은 폴리머라제가 10-20 kb 길이의 단편을 생성할 수 있게 한다. 전술한 바와 같이, 더 작은 단편은 Klenow 폴리머라제와 같은 낮은 처리성 및 가닥 치환 활성을 갖는 폴리머라제를 사용하여 등온 조건 하에서 생성될 수 있다. 증폭 반응, 조건 및 성분에 대한 추가의 설명은 미국 특허 제7,670,810호의 개시에 상세하게 설명되어 있으며, 이는 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 일부 실시형태에서, 이들 증폭 반응을 수행하는데 필요한 폴리머라제, 시약 및 성분은 캡슐화 핵산과 상호 작용하기 위해 연속성 입자의 기공을 통과하여 연속성 입자 내의 핵산을 증폭시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 랜덤 헥사머는 변성된 DNA에 어닐링되고 이어서 촉매 효소 Phi 29의 존재 하에서 일정한 온도에서 가닥 치환 합성이 이어진다. 이는 MDA 후 형광 강도의 증가 (DNA는 SYTOX로 염색 됨)에 의해 확인된 바와 같이 연속성 입자 내에서 DNA 증폭을 초래한다. 독립적으로, Nextera 기반 태깅 및 PCR 후 연속성 입자 내에서 실질적으로 형광 강도의 증가에 의해 지시된 바와 같이, 용해 및 세정 후 Nextera 기반 태깅 및 PCR을 통한 후속 gDNA 증폭이 수행될 수 있다. 이 Nextera 라이브러리 제조 후, 연속성 입자는 연속성 입자의 내용물, 즉 시퀀싱 준비 라이브러리 산물을 세포로부터 방출하기 위해 3 분 동안 80 ℃로 가열될 수 있다.
본 개시에 유용한 또 다른 핵산 증폭 방법은, 예를 들어 Grothues et al., Nucleic Acids Res. 21(5):1321-2 (1993)에 기술된 바와 같이, 랜덤한 3' 영역이 뒤따르는 일정한 5' 영역을 갖는 2-도메인 프라이머 집단을 사용하는 Tagged PCR이며, 이 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 1 차 증폭 라운드는 무작위 합성된 3' 영역으로부터의 개별 혼성화에 기초하여 열 변성 DNA상에서 다수의 개시를 허용하도록 수행된다. 3' 영역의 특성으로 인해, 개시 부위는 게놈 전체에 걸쳐 무작위인 것으로 고려된다. 그 후, 결합되지 않은 프라이머가 제거될 수 있고, 일정한 5' 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 추가의 복제가 일어날 수 있다.
일부 실시형태에서, 캡슐화된 핵산은 연속성 입자 내에서 전체적으로 또는 부분적으로 서열 분석된다. 캡슐화된 핵산은 합성에 의한 시퀀싱, 결찰에 의한 시퀀싱, 혼성화에 의한 시퀀싱, 나노 포어 시퀀싱 등을 포함하는 직접 시퀀싱과 같은 임의의 적합한 시퀀싱 방법에 따라 시퀀싱될 수 있다.
하나의 시퀀싱 방법론은 합성에 의한 시퀀싱(SBS)이다. SBS에서 핵산 주형(예를 들어, 표적 핵산 또는 이의 앰플리콘)을 따라 핵산 프라이머의 연장이 모니터링되어 주형 내의 뉴클레오타이드의 서열을 결정한다. 기본 화학 공정은 중합일 수 있다(예를 들어, 폴리머라제 효소에 의해 촉매되는 것과 같은). 특정 폴리머라제-기반 SBS 실시형태에서, 형광 표지된 뉴클레오타이드는 주형 의존성 방식으로 프라이머에 첨가되어(이에 의해 프라이머를 연장하며) 프라이머에 첨가되는 뉴클레오타이드의 순서와 유형의 검출이 상기 주형의 서열을 결정하는데 사용될 수 있다.
하나 이상의 증폭된 캡슐화된 핵산은 사이클에서 시약의 반복 전달을 포함하는 SBS 또는 다른 검출 기술에 적용될 수 있다. 예를 들어, 제 1 SBS 사이클을 개시하기 위해, 하나 이상의 표지된 뉴클레오타이드, DNA 폴리머라제 등이 하나 이상의 증폭된 핵산 분자를 수용하는 연속성 입자 내부로/를 통하여 흐를 수 있다. 프라이머 연장으로 인해 표지된 뉴클레오타이드가 혼입되는 부위가 검출될 수 있다. 선택적으로, 상기 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드가 프라이머에 첨가되면 추가의 프라이머 연장을 종결시키는 가역적 종결 특성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 가역적 종결자 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드 유사체가 프라이머에 첨가되어 디블로킹제(deblocking agent)가 전달되어 모이어티를 제거할 때까지 후속 연장이 일어날 수 없도록 한다. 따라서, 가역적 종결을 사용하는 실시형태에서, 디블로킹 시약은 (검출이 발생하기 전 또는 후에) 플로우 셀로 전달될 수 있다. 다양한 전달 단계 사이에서 세척이 수행될 수있다. 이어서, 사이클을 n 번 반복하여 프라이머를 n개의 뉴클레오타이드만큼 연장시켜 길이 n의 서열을 검출할 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 앰플 리콘과 함께 사용하기에 쉽게 개조될 수 있는 예시적인 SBS 절차, 유체 시스템 및 검출 플랫폼은 예를 들어 문헌[Bentley et al., Nature 456 : 53-59 (2008)], WO 04/018497; 미국 특허 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; 미국 특허 7,329,492; 미국 특허 7,211,414; 미국 특허 7,315,019; 미국 특허 미국 특허 제7,405,281호 및 US 2008/0108082에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
파이로시퀀싱과 같은 사이클릭 반응을 사용하는 다른 시퀀싱 절차가 사용될 수 있다. 파이로시퀀싱은 특정 뉴클레오타이드가 신생 핵산 가닥에 혼입됨에 따라 무기 파이로포스페이트(PPi)의 방출을 검출한다(Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242 (1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11 (1), 3-11 (2001); Ronaghi et al. Science 281 (5375), 363 (1998); 미국 특허 제6,210,891호; 미국 특허 제6,258,568호 및 미국 특허 제6,274,320호, 이들 각각은 본 명세서에서 참고로 포함됨). 파이로시퀀싱에서, 방출된 PPi는 ATP 설퍼릴라제에 의해 즉시 아데노신 트라이포스페이트(ATP)로 전환됨으로써 검출될 수 있고, 생성된 ATP의 수준은 루시퍼라제-생산된 광자(photon)를 통해 검출될 수 있다. 따라서, 시퀀싱 반응은 발광 검출 시스템을 통해 모니터링될 수 있다. 파이로시퀀싱 절차에는 형광 기반 검출 시스템에 사용되는 여기 방사선 소스가 필요하지 않다. 본 개시에 따라 생성된 앰플리콘에 파이로시퀀싱의 적용에 적합할 수 있는 유용한 유체 시스템, 검출기 및 절차는 예를 들어, WIPO 특허 출원 제PCT/US11/57111, US 2005/0191698 A1, 미국 특허 제7,595,883호 및 미국 특허 제7,244,559호에 개시되어 있으며 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 실시형태는 DNA 폴리머라제 활성의 실시간 모니터링을 수반하는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 도입은 형광단-함유 폴리머라제와 γ- 포스페이트-표지된 뉴클레오타이드 사이의 형광 공명 에너지 전달(FRET, fluorescence resonance energy transfer) 상호 작용을 통해 또는 제로 모드 도파관 (ZMW, zero mode waveguides)과 함께 검출될 수 있다. FRET-기반 시퀀싱을 위한 기술 및 시약은 예를 들어 Levene et al. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist et al. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)에 개시되어 있으며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 SBS 실시형태는 연장 생성물 내로 뉴클레오타이드의 혼입 시 방출된 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 양성자의 검출에 기초한 시퀀싱은 상업적으로 이용 가능한 전기 검출기 및 관련 기술을 사용할 수 있다. 이러한 시퀀싱 시스템의 예는 파이로시퀀싱(예컨대, Roche의 자회사인 454 Life Sciences의 상업적으로 이용가능한 플랫폼), γ-포스페이트-표지된 뉴클레오타이드를 사용한 시퀀싱(예컨대, Pacific Biosciences의 상업적으로 이용가능한 플랫폼) 및 양성자 검출을 사용한 시퀀싱(Life Technologies의 Ion Torrent 자회사로부터의 상업적으로 이용가능한 플랫폼) 또는 US 2009/0026082 A1, US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1; 또는 US 2010/0282617 A1에 설명된 시퀀싱 방법 및 시스템 등이 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다. 동역학 배제(kinetic exclusion)를 사용하여 표적 핵산을 증폭시키기 위한 본 명세서에 제시된 방법은 양성자를 검출하는데 사용된 기질에 쉽게 적용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 명세서에 제시된 방법은 양성자를 검출하는데 사용되는 앰플리콘의 클론 집단을 생성하는데 사용될 수 있다.
또 다른 시퀀싱 기술은 나노 포어 시퀀싱이다(예를 들어, Deamer et al., Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000); Deamer et al., Acc. Chem. Res. 35 : 817-825 (2002); Li et al. Nat. Mater. 2 : 611-615 (2003))에 개시되어 있으며, 이들의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다). 일부 나노 포어 실시형태에서, 타깃 핵산 또는 타깃 핵산으로부터 제거된 개별 뉴클레오타이드는 나노 포어를 통과한다. 상기 핵산 또는 뉴클레오타이드는 상기 기공을 통과하기 때문에 각 뉴클레오타이드 유형이 상기 기공의 전기 전도도의 변동을 측정함으로써 식별될 수 있다 (미국 특허 제7,001,792호; 문헌[Soni et al., Clin. Chem. 53, 1996-2001(2007); Healy, Nanomed. 2, 459-481(2007); Cockroft et al., J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008)] 참조, 이들의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다).
본 개시에 따른 검출에 적용될 수 있는 어레이-기반 발현 및 유전자형 분석을 위한 예시적인 방법은 미국 특허 7,582,420; 6,890,741; 6,913,884 또는 6,355,431 또는 미국 특허 공개 제2005/0053980 A1호; 제2009/0186349 A1호 또는 제2005/0181440 A1호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 분리, 증폭 및 시퀀싱 방법에서, 다양한 시약이 핵산 단리 및 제조에 사용된다. 이러한 시약은 예를 들어 리소자임, 단백질 분해 효소 K, 랜덤 헥사머, 폴리머라제(예컨대, Φ29 DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Bsu 폴리머라제), 트랜스포사제(예컨대, Tn5), 프라이머 (예컨대, P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매 효소, 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 버퍼 또는 2가 양이온을 포함할 수 있다. 이들 시약은 연속성 입자의 공극을 통과하는 반면, 유전 물질은 연속성 입자 내에 유지된다. 본 명세서에 제시된 방법의 이점은 이들이 연속성 입자 내에서 핵산의 프로세싱을 위한 캡슐화된 미세 환경을 제공한다는 것이다. 이는 표적 핵산의 빠르고 효율적인 처리를 위해 단일 세포 처리를 가능하게 한다.
어댑터는 시퀀싱 프라이머 부위, 증폭 프라이머 부위 및 인덱스를 포함할 수있다. 본 명세서에서 사용되는 "인덱스"는 핵산을 태그하기 위해 및/또는 핵산의 소스를 식별하기 위해 분자 식별자 및/또는 바코드로서 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 핵산 또는 핵산의 소집단을 식별하기 위해 인덱스가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 라이브러리는 연속성 입자 내에서 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 연속성 입자 내에 캡슐화된 단일 세포는 예를 들어 인접성 보존 전위(CPT-seq, Contiguity preserving transposition) 접근법을 사용하여 단일 세포의 조합 인덱싱을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 세포로부터의 DNA는 바코딩된 트랜스포손을 보유하는 또 다른 연속성 입자와 함께 WGA 증폭 후 단일 세포의 캡슐화하고 예를 들어, 바코딩을 위한 게놈 DNA를 방출하기 위해 그것을 환원제와 접촉시킴으로써 겔 매트릭스를 용해함으로써 바코딩될 수 있다.
본 명세서에 기술된 "공간 인덱싱 (spatial indexing)" 방법 및 기술의 실시예는 데이터 분석을 단축시키고 단일 세포 및 긴 DNA 분자로부터 라이브러리 제조 과정을 단순화시킨다. 단일 세포 시퀀싱을 위한 기존의 프로토콜은 세포를 효율적으로 물리적으로 분리하고, 각각의 분리된 세포를 고유하게 바코딩하고, 시퀀싱을 위해 모두를 다시 모으는 것(pooling)을 필요로 한다. 합성의 긴 리드를 위한 현재의 프로토콜은 또한 번거로운 바코딩 단계와 시퀀싱을 위해 각 바코딩된 단편을 풀링하고 각 바코딩된 세포로부터 오는 유전자 정보를 구별하기 위하여 데이터 분석을 하는 것을 필요로 한다. 이러한 긴 과정 동안 유전자 물질의 손실이 발생하여 서열의 탈루가 발생한다. 본 명세서에 기술된 실시예는 프로세스를 단축시킬 뿐만 아니라 단일 세포에 대한 데이터 레졸루션을 증가시킨다. 또한, 본 명세서에서 제공 실시형태는 새로운 유기체의 게놈의 조립을 단순화시킨다. 본 명세서에 기술된 실시형태는 희귀한 유전적 변이 및 돌연변이의 동시 발생을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 방출될 때까지 연속성 입자에 한정된 DNA 라이브러리는 방출 과정 및 하이드로겔 제형을 제어함으로써 표면에서 방출되는 단편의 크기를 제어할 기회를 제공한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는 어댑터 서열에서 프라이머 부위를 사용하여 증폭될 수 있고, 어댑터 서열에서 시퀀싱 프라이머 부위를 사용하여 시퀀싱될 수 있다. 일부 실시형태에서, 어댑터 서열은 핵산의 소스를 식별하기 위한 인덱스를 포함할 수 있다. 후속 증폭 단계의 효율은 프라이머-다이머의 형성에 의해 감소될 수 있다. 후속 증폭 단계의 효율을 높이기 위해 라이게이션되지 않은 단일 가닥 어댑터를 라이게이션 산물에서 제거할 수 있다.
인접성 인자와 핵산 라이브러리 제조
본 명세서에서 제공 시스템, 방법 및 조성물의 일부 실시형태는 어댑터가 표적 핵산에 라이게이션되는 방법을 포함한다. 어댑터는 시퀀싱 프라이머 결합 부위, 증폭 프라이머 결합 부위 및 인덱스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 어댑터는 P5 서열, P7 서열 또는 이의 상보체를 포함 할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 P5 서열은 서열번호 1에 의해 정의된 서열(AATGATACGGCGACCACCGA)을 포함하고, P7 서열은 서열번호 2에 의해 정의된 서열(CAAGCAGAAGACGGCATACGA)을 포함한다. 일부 실시형태에서, P5 또는 P7 서열은 길이가 1 내지 10개, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 뉴클레오타이드, 또는 1 내지 20개, 예컨대, 1 내지 15개 뉴클레오타이드 등의 스페이서 폴리뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 10개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 10T 스페이서와 같은 폴리 T 스페이서이다. 스페이서 뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에 포함될 수 있으며, 이는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단과의 연결을 통해 적합한 지지체에 부착될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에 존재하는 포스포로티오에이트와 같은 황-함유 친핵체를 통해 부착이 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리 T 스페이서 및 5' 포스포로티오에이트기를 포함할 것이다. 따라서, 일부 실시형태에서, P5 서열은 5'포스포로티오에이트 -TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3'(서열번호 3)이고, 일부 실시형태에서, P7 서열은 5' 포스포로티오에이트-TTTTTTTTTT CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'(서열번호 4)이다.
인덱스는 핵산 분자의 소스를 식별하는데 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 어댑터는 예를 들어 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에서 어댑터의 연장을 방지하는 블로킹 그룹의 첨가에 의해 컨카테머(concatemer)의 형성을 방지하도록 변형될 수 있다. 3' 블로킹 그룹의 예는 3'-스페이서 C3, 다이데옥시뉴클레오타이드 및 기질에 대한 부착을 포함한다. 5' 블로킹 그룹의 예는 탈인산화된 5' 뉴클레오타이드 및 기질에 대한 부착을 포함한다.
어댑터는 단일 가닥 핵산과 같은 핵산을 포함한다. 어댑터는 약 5개 뉴클레오타이드, 10개 뉴클레오타이드, 20개 뉴클레오타이드, 30개 뉴클레오타이드, 40개 뉴클레오타이드, 50개 뉴클레오타이드, 60개 뉴클레오타이드, 70개 뉴클레오타이드, 80개 뉴클레오타이드, 90개 뉴클레오타이드, 100개 미만, 초과 혹은 그와 같은 길이를 갖거나 전술한 크기 중 임의의 2 사이의 범위를 갖는 짧은 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 어댑터는 연속성 입자의 공극을 통과하기에 충분한 크기이다. 표적 핵산은 게놈 또는 cDNA와 같은 DNA; mRNA, sRNA 또는 rRNA와 같은 RNA; 또는 DNA와 RNA의 하이브리드를 포함한다. 핵산은 연속성 입자 내에 캡슐화된 단일 세포로부터 단리될 수 있다. 핵산은 포스포다이에스테르 결합을 함유할 수 있으며, 예를 들어 포스포아마이드, 포스포로 티오에이트, 포스포로다이티올에이트, O-메틸포스포로아미다이트 및 펩타이드 핵산 백본 및 연결을 포함하는 다른 유형의 백본을 포함할 수 있다. 핵산은 데옥시리보- 및 리보뉴클레오타이드의 임의의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 사이토신, 구아닌, 이노신, 크산타닌, 하이포크산타닌, 아이소사이토신, 아이소구아닌을 포함하는 염기, 나이트로피롤(3-나이트로피롤를 포함) 및 나이트로인돌(5-나이트로인돌 포함)과 같은 염기 유사체의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 무차별성(promiscuous) 염기를 포함할 수 있다. 무차별성 염기는 하나 이상의 상이한 유형의 염기와 염기쌍을 형성할 수 있으며, 예를 들어, 게놈 DNA 샘플과 같은 복잡한 핵산 샘플에서 랜덤 혼성화에 사용되는 올리고 뉴클레오타이드 프라이머 또는 인서트에 포함될 때 유용할 수 있다. 무차별성 염기의 예는 아데닌, 티민 또는 사이토신과 쌍을 이룰 수 있는 이노신을 포함한다. 다른 예는 하이포잔틴, 5- 나이트로인돌, 아실릭 5-나이트로인돌, 4-나이트로피라졸, 4- 나이트로이미다졸 및 3-나이트로피롤을 포함한다. 적어도 2, 3, 4개 이상의 유형의 염기와 염기쌍을 형성할 수 있는 무차별 염기가 사용될 수 있다.
표적 핵산은 샘플 내에서 핵산의 평균 크기가 약 2kb, 1kb, 500bp, 400bp, 200bp, 100bp, 50bp보다 작거나 크거나 같거나, 전술한 크기 중 임의의 2개 사이의 범위인 샘플을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플에서 핵산의 평균 크기는 약 2000개 뉴클레오타이드, 1000개 뉴클레오타이드, 500개 뉴클레오타이드, 400개 뉴클레오타이드, 200개 뉴클레오타이드, 100개 뉴클레오타이드, 50개 뉴클레오타이드 보다 작거나 크거나 같거나, 또는 상기 크기 중 임의의 둘 사이의 범위이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 연속성 입자 내에 포획되어 상기 연속성 입자의 기공을 통과할 수 없을 정도로 충분한 크기이다.
예시적인 방법은 후속 결찰(ligation) 단계에서 컨카테머의 형성을 방지하기 위해 표적 핵산의 5' 말단을 탈인산화하는 단계; 리가제를 사용하여 탈인산화된 표적의 3' 말단에, 3' 말단이 블로킹된 제 1 어댑터를 결찰하고; 상기 결찰된 표적의 5' 말단을 재인산화하고; 단일 가닥 리가제를 사용하여 상기 탈인산화된 표적의 5' 말단에, 5' 말단이 비인산화된 제 2 어댑터를 결찰시키는 단계를 포함한다.
또 다른 예는 단일 가닥 3' 돌출부(오버행)를 갖는 이중 가닥 핵산을 형성하기 위해 5' 엑소뉴클레아제에 의한 핵산의 부분 소화를 포함한다. 3' 블로킹 그룹을 함유하는 어댑터는 3' 돌출부에 의해 이중 가닥 핵산의 3' 말단에 결찰될 수 있다. 결찰된 어댑터를 갖는 3' 오버행을 가진 이중 가닥 핵산은 탈혼성화하여 단일 가닥 핵산을 형성할 수 있다. 비인산화된 5' 말단을 함유하는 어댑터는 단일 가닥 핵산의 5' 말단에 결찰될 수 있다.
핵산, 예를 들어 핵산의 5' 뉴클레오타이드와 같은 핵산을 탈인산화시키는 방법은 핵산을 포스파타제와 접촉시키는 것을 포함한다. 포스파타제의 예는 송아지장 포스파타제(CIP), 새우 알칼리 포스파타제, 남극 포스파타제 및 APEX 알칼리 포스파타제(Epicentre)를 포함한다.
핵산을 결찰시키는 방법은 핵산을 리가제와 접촉시키는 것을 포함한다. 리가제의 예는 T4 RNA 리가제 1, T4 RNA 리가제 2, RtcB 리가제, 메타노박테리움 RNA 리가제 및 TS2126 RNA 리가제(CIRCLIGASE)를 포함한다.
핵산, 예를 들어 핵산의 5' 뉴클레오타이드와 같은 핵산을 인산화시키는 방법은 핵산을 키나제와 접촉시키는 것을 포함한다. 키나제의 예는 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 포함한다.
본 명세서에서 제공 실시형태는 핵산 라이브러리가 단일 반응 부피로 제조되도록 연속성 입자에서 핵산 라이브러리를 제조하는 것에 관한 것이다.
본 명세서에서 제공 시스템 및 방법의 실시형태는, 세포를 캡슐화하는 연속성 입자를 제조하기 위하여 히드로 겔 중합체, 가교제 또는 미세 유체 장치의 어느 하나 이상을 포함하는 키트를 포함하고, 본 명세서에 기술되고 유전성 물질의 각 프로세싱에 이용되는, 리소자임, 프로테이나제 K, 랜덤 헥사머, 폴리머라제(예컨대, Φ29 DNA 폴리머 라제, Taq 폴리머라제, Bsu 폴리머라제), 트랜스포사제(예컨대, Tn5), 프라이머(예를 들어, P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매 효소, 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 버퍼 또는 2가 양이온을 포함하는, 세포 용해, 핵산 증폭 및 시퀀싱 또는 핵산 라이브러리 제조용 시약을 포함하여, 유전성 물질의 프로세싱에 유용한 성분을 더 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1: 연속성 입자의 제조
하기 실시예는 미세 유체 액적 발생기를 사용하여 단일 세포를 캡슐화하는 연속성 입자를 제조하는 실시형태를 보여준다.
-80℃에 저장된 세포를 함유하는 샘플을 실온에서 해동시켰다. 각 샘플 100㎕를 멸균 1.7㎖ 튜브로 옮기고, 이 샘플을 1㎖ 0.85% NaCl로 1회 세척하였다. 상기 샘플을 펠릿화하고 세척액을 제거하였다. 상기 세포 펠릿을 하이드로겔 용액과 혼합하여 하이드로겔 용액에 세포를 재현탁시켰다.
균일한 크기 분포의 연속성 입자를 생성하기 위해 도 1에 도시된 발생기와 같은 미세 유체 액적 발생기가 사용되었다. 하이드로겔 중합체 및 세포를 함유하는 용액을 상기 미세 유체 액적 발생기의 제 1 채널에 도입하였다. 스페이서 오일로서 사용된 미네랄 오일을 제 2 채널에 첨가하고, 가교제를 제 3 채널에 첨가하였다. 제 3 채널에서 가교제와 접촉시 하이드로겔은 단일 세포를 캡슐화하는 연속성 입자를 순간적으로 형성하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 연속성 입자는 연속성 입자의 중합체 쉘의 -SH기를 표적으로 하는 형광 염료로 염색되었다. 도 6의 우측 패널은 연속성 입자 내의 단일 세포의 염색을 나타내며, 중합체 쉘 기공을 통해 연속성 입자 내로 확산되는 Hoechst(청색-핵 염색) 및 AF-647 BSA로 염색된 연속성 입자의 60x 대상물 이미지를 보여준다. 가교 오일의 유형은 표 1에 나타낸 바와 같이 느린 가교제 또는 순간 가교제를 포함하여 가교의 신속성을 조정하기 위해 선택되었다:
가교 화학
인접성
입자타입		 가교제 가교 시간 크기 동종(homogeneity) 비드 경화(curing)
느린 가교제 PEG-에폭사이드+Peg아민 > 12 시간 좋음 완전
PEG-다이티올+PEG-아크릴레이트 4 시간 평균 불완전
순간 가교제 다이티올 오일+PEG-말레이미드 순간적 좋음 완전
PEG 에폭사이드+아민 오일 순간적 좋음 완전
실시예 2: 연속성 입자에서 수행되는 공동-분석하기 실시예는 SCI-seq, ATAC-seq, 조합 인덱싱 및 단일 세포 전체 게놈 증폭을 포함하여 실시예 1로부터의 연속성 입자에 대해 수행된 예시적인 분석을 증명한다.
실시예 1의 연속성 입자를 수득하고 웰을 갖는 플레이트 상에 침착(deposition)시켜 단일 연속성 입자를 단일 웰에 침착시켰다. 용해 완충액을 도입하여 세포를 용해하고 세척한 후 세포로부터 핵산을 추출하였다. 이어서 용해된 세포를 갖는 연속성 입자를 하기 기재된 바와 같이 일련의 분석에 노출시켰다.
도 7에 요약된 바와 같이, 인덱싱된 트랜스포솜 (TSM)을 이용하여 게놈 DNA를 태깅하여 ATAC-seq 단편을 생성하였다. 프로테이나제/SDS 처리 후, TSM과 동일한 인덱스를 갖는 올리고 T를 각 웰에 첨가하여 역전사 (RT)에 의해 cDNA 합성을 개시하였다. 다른 말단에 있는 PCR 어댑터는 랜더머 연장에 의해 도입되었다. 이것은 인덱스 1을 생성하였다. 각각의 웰로부터의 연속성 입자를 함께 모은 다음 인덱싱 된 PCR 플레이트로 스플릿하여 인덱스 2를 생성하였다. 이 2-계층 인덱싱은 150,000(384×384)개 세포까지 스케일-업 될 수 있다. 생성된 최종 라이브러리는 ATAC-seq 및 RNA-seq의 혼합물로, 동일한 세포로부터의 gDNA 및 cDNA는 동일한 인덱스로 그룹화되었고, oligoT-UMI 패턴은 ATAC 신호와 RNA 신호를 구별하기 위한 내부 마커로서 작용하였다.
또한, 무작위 연장은 도 8에 도시된 바와 같이 전장 RNA-seq에도 사용되었다. 이 경우, TSM의 인덱스는 랜더머의 인덱스와 달랐다. 이 두 인덱스 세트 사이의 일대일 매칭은 단일 세포로부터의 리드 및 차별화된 DNA 및 RNA 신호를 확인하는데 도움이 되었다. 리드 분석의 정확도를 향상시키기 위해 이 방법에도 UMI를 적용하였다.
도 9의 개략도에 요약된 바와 같이, 2 라운드의 인덱싱된 스플린트 결찰 및 1 라운드의 인덱싱된 PCR을 사용하여 3-계층 조합 인덱싱 분석을 수행하였다. 이 방법에서, TSM 및 올리고T는 보편적이며, 둘 다 스플린트1 단편을 함유하며, 이는 스플린트-결찰에 의한 인덱스 추가를 가능하게 하였다. 3 계층 인덱싱은 최대 백만 셀 처리량(96×96×96)을 달성했다. ATAC-seq에 대한 또 다른 3 계층 조합 인덱싱은 도 10에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 세포 처리량(cell throughput)을 증가시키기 위해 인덱싱된 TSM을 사용하여 수행되었다. TSM은 범용 TSM을 사용하지 않고 B7G 및 A7G 측에 고유 색인을 포함하였다. 인덱싱된 PCR에 필요한 인덱싱된 어댑터를 부착하기 위해 두 개의 다른 스플린트가 사용되었다. 도 10에서, 인덱싱은 다음의 구성 요소를 포함하였다: B15 어댑터 시퀀스(서열번호 5), 함께 B15_N6_Link1 시퀀스(서열번호 11)를 형성하는 N6 및 Link1; Phos_Link2_A7G_ME 서열(서열번호 12)을 함께 형성하는 Phos_Link2, A7G 서열(서열번호 9) 및 ME 서열(서열번호 7); A14_N6_Link1 서열(서열번호 13)을 함께 형성하는 A14 어댑터 서열(서열번호 6), N6 및 Link1; 및 Phos_Link2_B7G_ME 서열(서열번호 14)을 함께 형성하는 Phos_Link2, B7G(서열번호 10) 및 ME 서열(서열번호 7). 도 10은 또한 ME 상보성 서열(서열번호 8), 스플린트 1 서열(서열번호 15) 및 스플린트 2 서열(서열번호 16)을 제공한다.
도 11에 도시된 바와 같이 단일 세포 전체 게놈 증폭이 또한 연속성 입자를 사용하여 수행되었다. 이것은 개별 웰에서 연속성 입자의 인덱싱된 T7 전치(transposition)를 사용하고, 풀링 후 T7 시험관내 전사 (IVT) 선형 증폭을 통하여 연장하여 수행하였다. 인덱싱된 무작위 연장을 위해 비드를 다시 분리하고, 풀링하고, 최종 인덱싱된 PCR을 위해 다시 스플릿하였다.
연속성 입자는 이들이 FAM 표지된 트랜스포솜에 의해 표적화될 때 효율적인 태깅을 나타냈다. 핵은 Hoechst (청색 방출의 DNA 염색)로 염색된 반면, 전치된 핵은 FAM (형광 염료)으로 형광 그린으로 염색되었다. SDS로 세포를 용해시키는 것은 연속성 입자의 배경 형광을 증가시켰으며, 세포가 없는 연속성 입자로부터는 신호가 없었다. 이 결과는 ATAC-seq 라이브러리가, 태깅으로부터 짧은 단편 누출의 작은 부분만으로 연속성 입자 내부에 캡슐화된 세포에 대해 생성될 수 있음을 입증한다.
실시예 3: 연속성 입자 내 핵산 라이브러리 제조
하기 실시예는 연속성 입자 내에 캡슐화된 세포로부터 전체 게놈 라이브러리 제조를 위한 방법을 입증한다.
도 12는 연속성 입자 내에 캡슐화된 단일 세포상에서 전체 게놈 라이브러리를 수행하기 위한 개략도를 개략적으로 도시한다. 도 12의 개략도에 요약된 바와 같이 연속성 입자는 Nextera 전체 게놈 라이브러리를 생성하기 위해 사용되었다. 실시예 1에서 제조된 연속성 입자를 수득하였다. 연속성 입자(CP)를 45㎛ 세포 스트레이너에 로딩하고, 캡슐화되지 않은 세포를 제거하기 위해 PBS 또는 Tris-Cl로 다중 세척을 수행하였다. 연속성 입자 내에 세포를 캡슐화하는 것의 하나의 이점은 이들을 취급하고 처리하는 능력이 개선된다는 것이다. 이를 수행하는 간단한 방법 중 하나는 스핀 칼럼 또는 필터 플레이트를 사용하는 것이다. 필터의 기공 크기는 비드 직경보다 작을 수 있다. 필터 플레이트의 예로는 20, 40 및 60㎛의 기공 크기를 가진 Millipore의 MultiScreen-Mesh 필터 플레이트, 8.0㎛ 기공을 가진 Millipore의 MultiScreen Migration Invasion 및 Chemotaxis 필터 플레이트 또는 30-40㎛ 기공을 가진 Aqueous Filtration을 위한 Pall의 AcroPrep Advance 96-Well 필터 플레이트를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 이 필터 플레이트를 사용하면 비드 캡슐화된 세포를 용액으로부터 쉽게 분리하여 다중 버퍼 교환이 가능하다.
세척된 비드를 완충액에 현탁시키고 필터로부터 제거하였다. 비드의 최종 농도, 세포 로딩 효율을 평가하고, 캡슐화되지 않은 세포가 남아 있지 않도록 하기 위해, 비드의 분취량(aliquot)을 현미경으로 시각화하였다.
Nextera 태깅을 수행하기 위해 Millipore의 20㎛ Nylon MultiScreen-Mesh 필터 플레이트를 사용하였다. 필터에 대한 비드의 접착을 제한하기 위해, 이들은 Pluronic F-127로 미리 습윤되었다. 500g에서 30초 동안 플레이트를 원심분리한 후, 필터를 통해 흐르는 완충액은 비드를 유지시킬 것이다. 비드를 200㎕의 Tris-Cl 완충액으로 2회 세척한 다음 용해 버퍼(0.1% SDS)에 현탁시켰다. 원심 분리에 의해 제거하기 전에 비드를 용해 버퍼에서 1분 동안 인큐베이션 하였다. 잔류 용해 버퍼를 제거하기 위해, 2회의 추가적인 200㎕ Tris-Cl 세척을 수행하였다. 다음으로, 세포를 위 아래로 피펫팅하여 45㎕의 1x 태깅 버퍼에 현탁시킨 다음 스트립 튜브로 옮겼다. 45㎕의 비드에, 5㎕의 Tagmentation DNA Enzyme(TDE, Illumina Inc.)을 첨가하고 열 순환기에서 인큐베이션을 55℃에서 30분 동안 그리고 RT에서 1시간 동안 수행하였다. 대안적으로, 태깅화 마스터 믹스에서 비드 캡슐화된 세포를 현탁시키고 열 블록상에서 인큐베이션함으로써 필터 플레이트상에서 태깅이 수행될 수 있다. 태깅 후, 분취량의 비드를 Hoechst 염료로 염색하고 현미경으로 시각화하였다. 시각화로 DNA가 비드에 남아 있음을 확인했다. 대안적으로, 태깅화 마스터 믹스에서 비드 캡슐화된 세포를 현탁시키고 열 블록상에 인큐베이션함으로써 필터 플레이트상에서 태깅이 수행될 수 있다.
태깅된 비드(25㎕)를 Illumina의 Nextera PCR MM(NPM, Illumina) 및 PCR 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 상기 마스터 PCR 믹스에, 0.1% SDS를 첨가하여 DNA에 결합된 Tn5를 제거하였다. SDS 존재 하에서 Tn5 제거를 돕기 위해 75 ℃에서 예비 배양을 수행하였다. 11개의 PCR 사이클을 수행하여 최종 라이브러리를 생성하였다. PCR 후, 라이브러리를 0.9x SPRI를 사용하여 정제하고, dsDNA qubit 및/또는 BioAnalyzer를 사용하여 정량화하고, MiSeq 및/또는 NextSeq에서 시퀀싱하였다.
이 예에서 설명된 방법은 sciSEQ와 유사한 접근법을 사용하여 단일 세포 시퀀싱을 수행하도록 스케일업 될 수 있다(Vitak et al. Nat Meth. 2017; 14 : 302-308). 예를 들어, 96개의 인덱싱된-태깅 반응을 동시에 수행하기 위해 96-웰 필터 플레이트를 사용하는 것은 스케일 업 프로세스에서 수행될 수 있다. 비드를 플레이트에 첨가한 후, 연속적인 완충액을 첨가한 다음 원심 분리 또는 진공에 의해 제거한다. 태깅 후, 비드는 필터로부터 수집되어 풀링된다. 풀링된 비드는 멀티플렉스된 PCR을 위해 두 번째 96-웰 PCR 플레이트에 재분배된다. 이 이중 수준 인덱싱 체계(태그화 및 PCR 인덱싱)에서 단일 비드 캡슐화 세포 유래 모든 DNA 단편은 세포 게놈을 재구성하기 위해 분해(deconvoluted)될 수 있는 동일한 바코드를 받는다.
이러한 예에 요약된 단계는 Millipore의 MultiScreen HTS Vacuum Manifold 또는 Orochem의 96-well Plate Vacuum Manifold와 같은 진공 매니폴드를 추가하여 액체 취급 플랫폼에서 자동화할 수 있다. 이 진공 매니폴드는 Biomek FX, Microlab Star, Tecan Genesis 등을 포함하는 많은 액체 처리 플랫폼에 추가할 수 있다. 필터 플레이트를 열 블록으로 옮기면 태깅이 자동화 될 수 있다. 그 후, 상기 플레이트는 태깅 후 세척을 위해 진공 매니폴드로 다시 이송된다.
본 명세서에 기술된 실시형태, 실시예 및 도면은 용해(lysis)에서 라이브러리 생성까지의 과정 동안 물리적으로 한정된 공간에 유전자 물질을 보유하기 위한 조성물, 방법 및 시스템을 제공한다. 일부 실시형태는 한정된 공간에서 플로우 세포의 표면 상에 방출되는 단일 긴 DNA 분자 또는 단일 세포로부터 유래된 라이브러리를 제공한다. 개별 구획 내의 단일 DNA 분자 또는 단일 세포로부터의 라이브러리가 플로우 셀의 표면으로 방출되면, 각 구획으로부터의 라이브러리가 서로 근접하게 시딩된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는"은 "포함하는", "함유하는" 또는 "~로 특징화된"과 동의어이며, 포괄적이거나 개방형이며 추가적인 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
상기 설명은 본 발명의 여러 방법 및 재료를 개시한다. 본 발명은 방법 및 재료의 변형뿐만 아니라 제조 방법 및 장비의 변형에도 영향을 받기 쉽다. 이러한 변형은 본 명세서 또는 본 명세서에 개시된 본 발명의 실시를 고려하여 당업자에게 명백해질 것이다. 결과적으로, 본 발명은 여기에 개시된 특정 실시예로 제한되는 것이 아니라 본 발명의 진정한 범위 및 사상 내에 있는 모든 수정 및 대안을 포함하는 것으로 의도된다.
공개 및 미공개 출원, 특허 및 문헌 참고를 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함되고 본 명세서의 일부로 구성된다. 참고 문헌으로 포함된 공보 및 특허 또는 특허출원이 명세서에 포함된 개시내용과 모순되는 한, 명세서는 임의의 이러한 모순적 자료를 대체하고/하거나 우선하도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Illumina, Inc. <120> METHODS OF ENCAPSULATING SINGLE CELLS, THE ENCAPSULATED CELLS AND USES THEREOF <130> WO/2019/204229 <140> PCT/US2019/027540 <141> 2019-04-15 <150> US 62/660,452 <151> 2018-04-20 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 1 aatgatacgg cgaccaccga 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 2 caagcagaag acggcatacg a 21 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 3 tttttttttt aatgatacgg cgaccaccga 30 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 4 tttttttttt caagcagaag acggcatacg a 31 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B15 adaptor sequence <400> 5 gtctcgtggg ctcgg 15 <210> 6 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A14 adaptor sequence <400> 6 tcgtcggcag cgtc 14 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ME adaptor sequence <400> 7 agatgtgtat aagagacag 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ME complement <400> 8 tctacacaca ttctctgtc 19 <210> 9 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A7G <400> 9 tggtagagag ggtg 14 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B7G <400> 10 tactactcac ctccc 15 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 16-21 <223> n = a, c, t, or g <223> B15_N6_Link1 <400> 11 gtctcgtggg ctcggnnnnn ngacttgtc 29 <210> 12 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 9-14 <223> n = a, c, t, or g <223> Phos_Link2_A7G_ME <400> 12 tagagcatnn nnnntggtag agagggtgag atgtgtataa gagacag 47 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 15-20 <223> n = a, c, t, or g <223> A14_N6_Link1 <400> 13 tcgtcggcag cgtcnnnnnn gtaatcac 28 <210> 14 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 9-14 <223> n = a, c, t, or g <223> Phos_Link2_B7G_ME <400> 14 catcatccnn nnnntactac tcacctccca gatgtgtataa gagacag 47 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Splint 1 <400> 15 atgctctaga caagt 15 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Splint 2 <400> 16 ggatgatggt gatta 15

Claims (17)

  1. 단일 세포를 캡슐화하는 중공 비드로서,
    PEG-말레이미드과 다이티올 오일, PEG-에폭사이드와 아민 오일 또는 PEG-에폭사이드와 PEG-아민을 포함하는 중합체 쉘 및 상기 중합체 쉘 내에 배치된 단일 세포를 포함하되,
    상기 중합체 쉘은 상기 단일 세포를 유지하면서 상기 중합체 쉘을 통한 시약의 확산을 허용하는 기공을 포함하는, 중공 비드.

  2. 제1항에 있어서, 상기 중합체 쉘의 내부가 수성 환경을 포함하는, 중공 비드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 중합체 쉘 내에 배치된 상기 단일 세포는 상기 중합체 쉘과 상호 작용이 없고/없거나 상기 중합체 쉘과 접촉하지 않는, 중공 비드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 중공 비드는 직경이 20㎛ 내지 200㎛인, 중공 비드.
  5. 제1항에 있어서,
    하기 a) 내지 b) 중 적어도 하나를 포함하는, 중공비드:
    a) 상기 단일 세포가 포유동물 세포임,
    b) 상기 시약이 효소, 케미칼 및 50 염기쌍 미만의 크기를 갖는 프라이머.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 시약은 리소자임, 단백질 분해효소 K, 랜덤 헥사머, 폴리머라제, Φ29 DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Bsu 폴리머라제, 트랜스포사제, Tn5 트랜스포사제, P5 어댑터 서열, P7 어댑터 서열, 리가아제, 촉매 효소(caltalyzing enzyme), 데옥시뉴클레오티드 트라이포스페이트, 버퍼 또는 2가 양이온을 포함하는, 중공비드.
  7. 중공 비드 내에 단일 세포를 캡슐화하는 방법으로서,
    스페이서 오일 내에서 단일 세포를 중합체와 혼합하여 혼합물 (a)를 형성하는 단계; 및
    혼합물 (a)를 가교 오일과 혼합하여 상기 단일 세포를 캡슐화하는 중합체 쉘을 형성하는 단계
    를 포함하되,
    상기 중합체 쉘은 상기 단일 세포를 유지하면서 상기 중합체 쉘을 통해 시약의 확산을 허용하는 기공을 포함하고, 상기 중합체 쉘은 PEG-말레이미드과 다이티올 오일, PEG-에폭사이드와 아민 오일 또는 PEG-에폭사이드와 PEG-아민을 포함하는, 중공 비드 내에 단일 세포를 캡슐화하는, 중공 비드 내에 단일 세포를 캡슐화하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 중공 비드의 직경이 20㎛ 내지 200㎛인, 중공 비드 내에 단일 세포를 캡슐화하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    i) 상기 스페이서 오일이 미네랄 오일 또는 플루오로카본 오일을 포함하고,
    ii) 상기 가교 오일이 오일에 용해된 다이티올 또는 아민을 포함하고,
    iii) 상기 단일 세포가 포유동물 세포이고,
    iv) 상기 시약이 효소, 화학물질(chemical) 및 50 염기쌍 미만의 크기를 갖는 프라이머를 포함하고,
    v) 상기 시약이 리소자임, 단백질 분해효소 K, 랜덤 헥사머, 폴리머라제, Φ29 DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Bsu 폴리머라제, 트랜스포사제, Tn5 트랜스포사제, P5 어댑터 서열, P7 어댑터 서열, 리가아제, 촉매화 효소, 데옥시뉴클레오티드 트라이포스페이트, 버퍼, 세제또는 2가 양이온을 포함하는, 중공 비드 내에 단일 세포를 캡슐화하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 혼합은 상기 단일 세포, 상기 중합체, 상기 스페이서 오일 및 상기 가교 오일을 액적 발생기에 투입하는 것을 포함하는, 중공 비드 내에 단일 세포를 캡슐화하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 액적 발생기는 미세유체 칩(microfluidic chip)인, 중공 비드 내에 단일 세포를 캡슐화하는 방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 단일 세포는 고정제와의 접촉에 의해 혼합 전에 고정되는, 중공 비드 내에 단일 세포를 캡슐화하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 고정제가 메탄올 또는 에탄올과 같은 알코올 또는 파라-포름알데하이드와 같은 알데하이드를 포함하는, 중공 비드 내에 단일 세포를 캡슐화하는 방법.
  14. 중공 비드 내에 캡슐화된 단일 세포에 대해 다중의 순차적 공동-분석(multiple sequential co-assay)을 수행하는 방법으로서,
    제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 단일 세포를 캡슐화하는 중공 비드를 수득하는 단계; 및
    상기 단일 세포를 시약과 순차적으로 접촉시켜 다중의 순차적 공동-분석을 수행하는 단계
    를 포함하는, 중공 비드 내에 캡슐화된 단일 세포에 대해 다중의 순차적 공동-분석을 수행하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 다중의 순차적 공동-분석은 용해, DNA 분석, RNA 분석, 단백질 분석, 태깅(tagmentation), 핵산 증폭, 핵산 시퀀싱, DNA 라이브러리 제조, 시퀀싱을 이용한 트랜스포사제 접근성 크로마틱 분석(transposase accessible chromatic using sequencing: ATAC-seq), 연속성 보존 전치 시퀀싱(contiguity-preserving transposition sequencing: CPT-seq), 단일 세포 조합 인덱스 시퀀싱(single cell combinatorial indexed sequencing: SCI-seq), 또는 단일 세포 게놈 증폭, 또는 순차적으로 수행되는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 중공 비드 내에 캡슐화된 단일 세포에 대해 다중의 순차적 공동-분석을 수행하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 단일 세포를 캡슐화하는 중공 비드가 고체 지지체 상에 시딩되는, 중공 비드 내에 캡슐화된 단일 세포에 대해 다중의 순차적 공동-분석을 수행하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 고체 지지체는 에칭된 표면, 웰, 플로우-셀 장치, 미세유체 채널, 비드 또는 칼럼인, 중공 비드 내에 캡슐화된 단일 세포에 대해 다중의 순차적 공동-분석을 수행하는 방법.

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