WO2024048779A1 - 微生物菌種の同定方法 - Google Patents

微生物菌種の同定方法 Download PDF

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WO2024048779A1
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genomic dna
microbial species
dna
identifying
microorganism
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PCT/JP2023/032087
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智志 下津
岡田 彰奈 北澤
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アサヒグループホールディングス株式会社
アサヒビール株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying microbial species.
  • a method using the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene is known as a method for identifying bacterial species.
  • it is sometimes difficult to distinguish and identify closely related bacterial species In this regard, for example, Emerging Microbes & Infections, 2019, VOL. 8, pp.1043-1053. A method has been proposed.
  • One aspect of the present invention aims to provide a method for identifying microbial species based on microbial genome analysis.
  • the first aspect is to directly acquire the base sequence of each genomic DNA sample from a specimen containing a genomic DNA sample derived from the genomic DNA of a microorganism, and to identify each genomic DNA sample based on the acquired base sequence.
  • a method for identifying a microbial species includes: associating the microbial species with a microbial species, and identifying the microbial species based on the number of associated genomic DNA samples.
  • the method for identifying a microbial species may further include extracting genomic DNA from the microorganism, and pretreating the extracted genomic DNA to obtain a specimen containing the genomic DNA sample. Often, the method may further include randomly amplifying the genomic DNA.
  • the microorganism may include at least one species selected from the group consisting of fungi and bacteria. Further, the microorganism may be derived from at least one sample selected from the group consisting of foods, alcoholic beverages, soft drinks, environmental samples, and the like. Also, the microorganism may be derived from a single colony. Furthermore, the base sequence of the genomic DNA sample may be obtained by at least one base sequencing method selected from the group consisting of nanopore sequencing and single molecule real-time sequencing.
  • the term "process” is used not only to refer to an independent process, but also to include a process in which the intended purpose of the process is achieved even if the process cannot be clearly distinguished from other processes.
  • the content of each component in the composition means the total amount of the plurality of substances present in the composition, unless otherwise specified, when a plurality of substances corresponding to each component are present in the composition.
  • the upper and lower limits of the numerical ranges described in this specification can be arbitrarily selected and combined from the numerical values exemplified as the numerical ranges. Embodiments of the present invention will be described in detail below. However, the embodiments shown below are intended to exemplify a method for identifying microbial species to embody the technical idea of the present invention, and the present invention is limited to the method for identifying microbial species shown below. Not done.
  • the method for identifying microbial species consists of a sequence acquisition step in which the base sequence of each genomic DNA sample is directly obtained from a sample containing a genomic DNA sample derived from the genomic DNA of a microorganism, and a sequence acquisition step in which the base sequence of each genomic DNA sample is directly obtained.
  • the method for identifying the microbial species may further include an extraction step of extracting genomic DNA from the microorganism, and a pretreatment step of pretreating the extracted genomic DNA to obtain a specimen containing the genomic DNA sample. Furthermore, the method for identifying the microbial species may include an amplification step of randomly amplifying the extracted genomic DNA before the sequence acquisition step.
  • the method for identifying the species of microorganisms may be a method for identifying the species of microorganisms contained in the specimen.
  • the base sequence of the genomic DNA sample contained in the specimen is directly obtained without amplification using an amplification method such as PCR that amplifies a specific DNA region, and based on the base sequence of the obtained genomic DNA sample.
  • an amplification method such as PCR that amplifies a specific DNA region
  • the method for identifying microbial species based on the base sequence of a genomic DNA sample is highly accurate and highly versatile because the entire genomic DNA is the subject of analysis.
  • the method for identifying the microbial species may include an extraction step of extracting genomic DNA from the microorganism to be identified.
  • the microorganism to be identified may include at least one selected from the group consisting of fungi and bacteria, and may include at least one selected from the group consisting of yeast and bacteria.
  • fungi include filamentous fungi, yeast, dimorphic fungi, and the like.
  • Bacteria include lactic acid bacteria, obligate anaerobic bacteria, spore-forming bacteria, and the like.
  • the microorganism to be identified may be, for example, the microorganism contained in the sample to be tested.
  • Samples to be tested include, for example, samples derived from living organisms; foods, alcoholic beverages, and soft drinks; materials present in the manufacturing process of foods, alcoholic beverages, and soft drinks; and materials discharged during the manufacturing process of foods, alcoholic beverages, and soft drinks. Materials; food intermediate products; environmental samples, etc.
  • living organisms include animals such as mammals (eg, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, cows, pigs, horses, goats, and sheep), birds, insects, mollusks, microorganisms, plants, and the like.
  • the living organism from which the sample is derived is preferably a mammal, and may be a human or a non-human mammal.
  • samples derived from living organisms include blood (eg, whole blood, serum, plasma, etc.), sweat, saliva, urine, hair, breast milk, and the like.
  • Samples containing microorganisms may be subjected to appropriate pretreatment depending on their origin. Examples of the pretreatment include centrifugation treatment, extraction treatment, filtration treatment, concentration treatment, purification treatment, and the like.
  • the sample may contain only one type of microorganism, or may contain two or more types of microorganisms.
  • the microorganisms contained in the sample may be cultured in a culture medium suitable for the microorganism to be identified under conditions appropriate to the microorganism to be identified, and then used as the target for identification.
  • the microorganism to be identified may be a microorganism derived from a single colony separated by culture from a group of microorganisms contained in a sample.
  • a method for extracting genomic DNA from microorganisms can be appropriately selected from commonly used methods. For example, if the microorganism is a bacterium, the bacterium is lysed using lysozyme, N-acetylmuramidase, etc., treated with a proteolytic enzyme if necessary, extracted with chloroform/isoamyl alcohol, and then ethanol, isopropanol, etc. are added to the aqueous phase.
  • genomic DNA can be extracted by centrifugation.
  • extraction of genomic DNA from microorganisms may be performed using a commercially available DNA extraction and purification kit according to the protocol in the package insert.
  • purchasable DNA extraction and purification kits examples include ZymoBIOMICS DNA Mini Kit, QuickDNA-DNA Fungal/Bacterial Microprep Kit (both manufactured by Zymo Research), and DNeasy Blood & Tissue Kit (manufactured by QIAGEN).
  • the number of microorganisms from which genomic DNA is extracted may be, for example, 1 cell or more and 10 11 cells or less, preferably 10 2 cells or more and 10 10 cells or less.
  • the number of microbial cells from which genomic DNA is extracted may be, for example, 10 7 cells or more and 10 11 cells or less, preferably 10 8 cells. It may be more than 10 10 cells or less.
  • the number of microbial cells from which genomic DNA is extracted may be, for example, 1 cell or more and 10 7 cells or less, preferably 100 cells or more and 10 4 cells or less. It may be less than cells.
  • the DNA concentration of the DNA extract obtained in the extraction step may be, for example, 10 fg/ ⁇ L or more and 3 ⁇ g/ ⁇ L or less, preferably 20 ng/ ⁇ L or more and 100 ng/ ⁇ L or less.
  • the DNA concentration of the DNA extract obtained in the extraction step may be, for example, 10 ng/ ⁇ L or more and 3 ⁇ g/ ⁇ L or less, preferably 20 ng/ ⁇ L. It may be more than 100 ng/ ⁇ L.
  • the DNA concentration of the DNA extract obtained in the extraction step may be, for example, 10 fg/ ⁇ L or more and 100 ng/ ⁇ L or less, preferably 10 pg/ ⁇ L or more. It may be 10 ng/ ⁇ L or less.
  • the method for identifying microbial species may include an amplification step of randomly amplifying genomic DNA (hereinafter also referred to as genome amplification) to obtain an amplification product containing an amplified genomic DNA fragment.
  • genomic DNA hereinafter also referred to as genome amplification
  • the microbial species can be identified with high accuracy even when the amount of microorganisms contained in the sample to be tested is small.
  • the amplification step may involve replicating DNA fragments from random locations in the genomic DNA. Amplification of genomic DNA may be performed using commercially available kits according to the protocols in their package inserts.
  • Kits that can randomly amplify genomic DNA include illustra TM Ready-To-Go TM GenomiPhi TM DNA Amplification Kit (manufactured by Cytiva), TruePrime Single Cell WGA Kit (manufactured by 4basebio), and GenomePlex (R) Whole Genome Examples include amplification (WGA) kit (manufactured by Sigma-Aldrich), PicoPLEX (R) WGA Kit (manufactured by Clontech), and the like.
  • Random amplification of genomic DNA may be performed on genomic DNA extracted in the extraction step, or may be performed on fragmented genomic DNA after a DNA fragmentation process that randomly fragments genomic DNA. good.
  • the DNA concentration contained in the amplification product obtained in the amplification step may be, for example, 10 ng/ ⁇ L or more and 3 ⁇ g/ ⁇ L or less, preferably 20 ng/ ⁇ L or more and 100 ng/ ⁇ L or less.
  • the method for identifying microbial species may include a pretreatment step of preprocessing the genomic DNA extracted in the extraction step or the genomic DNA amplified in the amplification step to obtain a specimen containing the genomic DNA sample.
  • pretreatment methods for genomic DNA include DNA fragmentation treatments such as mechanical fragmentation methods and enzymatic fragmentation methods, and DNA end treatment that adds additional sequences and the like to the ends of genomic DNA.
  • the pretreatment step may include at least a DNA fragmentation process, and may include a DNA fragmentation process in which genomic DNA is randomly fragmented. Furthermore, the pretreatment step may include both DNA fragmentation treatment and DNA end treatment. Pretreatment of genomic DNA may be performed using commercially available kits according to the protocols in their package inserts.
  • kits capable of DNA fragmentation include Rapid Sequencing Kit (manufactured by Oxford NANOPORE Technologies), Rapid Barcoding Kit (manufactured by Oxford NANOPORE Technologies), and the like.
  • the additional sequence added to the end of the genomic DNA may be appropriately selected depending on the purpose, for example, for identification or sequencing.
  • the genomic DNA to which additional sequences and the like are added may be fragmented genomic DNA or may be genomic DNA extracted from microorganisms. Addition of an additional sequence or the like to the end of the genomic DNA can be carried out using, for example, a commercially available kit according to the protocol in the package insert. Specific examples include Ligation Sequencing Kit (Oxford NANOPORE Technologies), Rapid Sequencing Kit (Oxford NANOPORE Technologies), and the like. Note that some kits can perform both fragmentation of genomic DNA and addition of additional sequences.
  • the size (number of bases) of the genomic DNA sample obtained by DNA fragmentation treatment in the pretreatment step may be, for example, 200 bp or more and 100,000 bp or less, preferably 500 bp or more and 50,000 bp or less. Further, the amount of the genomic DNA sample obtained in the pretreatment step and subjected to the sequence acquisition step may be, for example, 10 ng or more and 1000 ng or less, preferably 100 ng or more and 400 ng or less.
  • the base sequence of each genomic DNA sample contained in the specimen is directly acquired.
  • directly obtaining the base sequence of a genomic DNA sample means amplifying at least one of the genomic DNA of a microorganism and a specimen containing a genomic DNA sample obtained from the genomic DNA using an amplification method such as PCR that amplifies a specific DNA region. This means determining the base sequence of each genomic DNA sample by an appropriate base sequencing method. Since there is no need to amplify genomic DNA or fragments thereof, rapid identification of microbial species is possible.
  • Examples of base sequencing methods for directly obtaining the base sequence of a genomic DNA sample include nanopore sequencing, single molecule real-time sequencing, etc. At least one base sequencing method selected from the group consisting of these is used. It may be included.
  • the base sequence data obtained in the sequence acquisition step may include data corresponding to the base sequence of each genomic DNA sample.
  • Nanopore sequencing is a method of deciphering the base sequence of a DNA sample as it passes through small holes (nanopores) embedded in a membrane. Unlike conventional base sequencing methods, nucleotide sequences can be directly read without relying on DNA synthesis, amplification, etc.
  • a nanopore sequencer that performs nanopore sequencing has a membrane that divides a salt solution into two compartments, and a large number of nanopores are embedded in the membrane. When a voltage is applied to the membrane, a flow of ions occurs, and the current value is measured at each nanopore. When the DNA sample passes through the nanopore, the flow of ions is partially obstructed and the measured current value decreases.
  • Nanopore sequencing can be performed with commercially available equipment. Specifically, it can be carried out using devices such as MinION, Frongle, GridION, and PromethION (Oxford NANOPORE Technologies).
  • Single molecule real-time (SMRT) sequencing is one of the techniques for parallelized single molecule DNA sequencing.
  • SMRT sequencing utilizes a zero-mode waveguide (ZMW), in which DNA polymerases are immobilized one at a time at the bottom of the ZMW. Then, this DNA polymerase incorporates DNA fragments that serve as templates one by one.
  • ZMW has a structure that constitutes a field where extremely small fluorescence can be observed so that DNA fragments incorporated by DNA polymerase can be observed on a nucleotide-by-nucleotide basis.
  • Each of the four types of nucleotides has a different fluorescent dye attached to it, and when the nucleotide is taken up by DNA polymerase, the fluorescent dye is cleaved and fluorescence is emitted, and the fluorescent dye quickly diffuses from the ZMW observation area. As a result, fluorescence will no longer be observed.
  • the detector detects this instantaneous fluorescent signal emitted upon nucleotide incorporation, and associates the fluorescent dye with the corresponding base, thereby determining the base sequence of the DNA fragment.
  • SMRT sequencing can be performed by commercially available equipment. Specifically, it can be carried out using a device such as the PacBio (R) Sequel II/IIe system (PacBio).
  • the base sequence data obtained in the sequence acquisition step may be subjected to data processing such as a quality check, if necessary.
  • the base sequence data obtained in the sequence acquisition step may include one or more base sequences of a genomic DNA sample having a base number of 200 bp or more and 100,000 bp or less, preferably 10 or more, or 100 or more. It may contain 1,000 or less, and preferably 1,000 or less.
  • each genomic DNA sample is associated with a specific microbial species based on the acquired base sequence.
  • a genome database in which specific types of microorganisms and their genomic DNA base sequences are associated is used to identify the type of microorganism that corresponds to the acquired base sequence.
  • genome databases include GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), GenomeSync (http://genomesync.org/), and Mifup (https://www.nite.go.jp/). nbrc/mifup/) etc. can be used.
  • the genome database may be an online database or an offline database.
  • the association between the obtained nucleotide sequence and the microbial strain can be achieved by, for example, using a homology search tool to search the obtained nucleotide sequence from a genome database, and selecting the microbial strain that has that nucleotide sequence in its genomic DNA.
  • a homology search tool e.g., NCBI BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
  • microbial identification system ENKI https://www.tecsrg.co.jp/services /products-and-tec/enki/
  • the microbial species of the microorganism from which the genomic DNA sample has been extracted is identified according to the number of associated genomic DNA samples. Identification of the microbial species can be performed, for example, by visualizing the relationship between the genomic DNA sample, its base sequence, and the associated microbial species using Krona Chart. Alternatively, for example, the microbial species associated with the genomic DNA samples contained in the sample can be arranged in descending order of the number of associated genomic DNA samples, and the microbial species located at the top can be identified as the target microorganism. . Furthermore, for example, among the microbial species associated with the genomic DNA samples contained in the specimen, the microbial species with the largest number of associated genomic DNA samples can be identified as the target microorganism.
  • the method for identifying the microbial species according to this embodiment is not limited to the microbial species, whether it is fungi or bacteria, as long as the microorganism has base sequence data listed in the genome database. It is possible to identify at the level. In addition, since it does not require amplification methods such as PCR to amplify specific DNA regions, it is possible to identify bacterial species using a unified protocol, regardless of whether it is a fungus or a bacterium. and has excellent workability. Furthermore, since the object of analysis is not a specific gene but the entire genomic DNA, excellent identification accuracy can be achieved.
  • the method for identifying microbial species according to the present embodiment is effective for identifying closely related bacterial species such as Lactobacillus casei group, Lactobacillus plantarum group, and Bacillus cereus group. That is, the microbial species identification method according to the present embodiment may be a bacterial species identification method for the Lactobacillus casei group, a bacterial species identification method for the Lactobacillus plantarum group, or a bacterial species identification method for the Bacillus cereus group. It's good. Furthermore, the method for identifying microbial species can be applied to determining the risk of beer clouding, determining whether food is a food poisoning bacterium, and the like. That is, the method for identifying the microbial species according to the present embodiment may be a method for determining the risk of beer turbidity, or may be a method for determining food poisoning bacteria.
  • Example 1 Using the Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK109, Oxford NANOPORE Technologies (ONT)) or Rapid Sequencing Kit (SQK-RAD004, ONT) on the DNA extract obtained in Reference Example 1, follow the protocol of each kit.
  • a pretreated DNA sample was obtained by performing pretreatment such as addition of an adapter sequence according to the procedure. After returning the flow cell for MinION (FLO-MIN106D, ONT) to room temperature, it was connected to a PC for MinION. After priming using the Flow Cell Priming Kit (EXP-FLP002, ONT) according to the protocol included with the kit, add the pretreated DNA sample obtained above to the MinION flow cell, and run the analysis software. Nanopore sequencing was performed using MinKNOW to obtain DNA sequence data (FAST5 format).
  • Comparative example 1 PCR was performed under the following conditions with reference to the method of LJH Ward et al. (Letters in Applied Microbiology 1999, 29, 90-92).
  • the three primer sets shown in Table 2 were used for L. casei detection, L. paracasei, and L. rhamonosus, and after performing PCR with each primer set, the presence or absence of bands was confirmed by electrophoresis. .
  • the identification results are shown in Table 1.
  • Comparative example 2 Samples were prepared as follows according to the MALDI biotyper manual. Suspend about 1 platinum loop of colonies obtained by agar culture in 300 ⁇ L of MilliQ water, add 900 ⁇ L of 99.5% ethanol, stir with a vortex, and centrifuge at 15,000 rpm for 2 minutes to completely remove the supernatant. Removed. 5 ⁇ L to 50 ⁇ L of 70% formic acid was added to the obtained pellet, and the mixture was thoroughly stirred by pipetting or vortexing, and an equal amount of acetonitrile to the formic acid was added and thoroughly stirred.
  • Comparative example 3 About 900 bp upstream of 16S ribosomal RNA was amplified from the pretreated DNA obtained above under the same PCR conditions as in Comparative Example 1 using the 16S rRNA universal primer shown in Table 3 as a primer.
  • the PCR product was purified using EXO-SAP IT (manufactured by Thermo Fisher Scientific). After purification, it was fluorescently labeled using the cycle sequence method and purified again. After obtaining the base sequence using a capillary DNA sequencer, a homology search was performed using BLAST to identify the bacterial species. The identification results are shown in Table 1.
  • Example 1 As shown in Table 1, it can be seen that the identification method of Example 1 can identify five bacterial species belonging to the genus Lactobacillus with high accuracy.
  • Example 2 The DNA extract obtained in Reference Example 2 was diluted so that the DNA concentrations were 12 ng/ ⁇ L, 1.2 ng/ ⁇ L, 0.12 ng/ ⁇ L, and 0.012 ng/ ⁇ L, respectively, and diluted solutions 1 to 4 were prepared. Created. 2.5 ⁇ L of Barcode 02 to 06 of Rapid Barcoding Kit (NANOPORE) were added to 7.5 ⁇ L of each diluted solution to fragment the DNA. 2 ⁇ L of each of the obtained solutions was placed in a tube, and 1 ⁇ L of Rapid Adapter (RAP) was added.
  • NANOPORE Rapid Barcoding Kit
  • RAP Rapid Adapter
  • Genome amplification was performed on 1 ⁇ L of the above DNA dilution using the illustra TM Ready-To-Go TM GenomiPhi TM DNA Amplification Kit (Cytiva) according to the kit's protocol.
  • the above DNA dilution solution and each genome amplification reaction solution were pretreated using Rapid Sequencing Kit (SQK-RAD004, ONT) according to the protocol of the kit. DNA samples were obtained. After returning the flow cell for MinION (FLO-MIN106D, ONT) to room temperature, it was connected to a PC for MinION. After priming using the Flow Cell Priming Kit (EXP-FLP002, ONT) according to the protocol included with the kit, add the pretreated DNA sample obtained above to the MinION flow cell, and run the analysis software. Nanopore sequencing was performed using MinKNOW to obtain DNA sequence data (FAST5 format).
  • Rapid Sequencing Kit SQK-RAD004, ONT
  • Reference Example 3 DNA Extraction Bacillus anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, B. pacificus, B. mycoides, B. paranthracis, B. tropicus, B. mobilis, and B. luti were selected as test bacteria. Contributed DNA was used for B. anthracis and B. cereus, and for other bacterial species of the Bacillus cereus group, DNA was extracted and the DNA concentration was measured in the same manner as in Reference Example 1 after culturing in STA medium at 37°C for several days. The DNA concentration of the obtained DNA sample was 20 ng/ ⁇ L to 300 ng/ ⁇ L.
  • Example 3 Using the DNA samples of Reference Example 3, the bacterial species of each DNA sample was identified in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 5. In Table 5, the case where the bacterial species was correctly identified is shown as OK, the case where it was incorrectly identified is shown as NG, and the case where it is not identified is shown as -.
  • Comparative examples 4 and 5 The bacterial species of each DNA sample was identified in the same manner as in Comparative Example 2 or Comparative Example 3, except that the DNA sample of Reference Example 3 was used. The results are shown in Table 5.
  • Example 5 As shown in Table 5, it can be seen that by the identification method of Example 1, nine bacterial species belonging to the genus Bacillus can be identified with high accuracy. In particular, Bacillus cereus, which is the causative agent of food poisoning, can be identified quickly and with high precision.

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Abstract

微生物のゲノム解析に基づく微生物菌種の同定方法が提供される。微生物菌種の同定方法は、微生物のゲノムＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ試料を含む検体から、それぞれのゲノムＤＮＡ試料の塩基配列を直接取得することと、取得した塩基配列に基づいて、それぞれのゲノムＤＮＡ試料を特定の微生物菌種に関連付けることと、関連づけられたゲノムＤＮＡ試料の数に基づいて、微生物菌種を同定することと、を含む。

Description

微生物菌種の同定方法
　本発明は、微生物菌種の同定方法に関する。
　細菌の菌種を同定する方法として、１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いる方法が知られている。１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いる方法では、近縁菌種の識別、同定が困難な場合があった。これに関連して、例えば、Emerging Microbes & Infections, 2019, VOL. 8, pp.1043-1053.には、ゲノム解析におけるロングリードとショートリードの解析結果を組み合わせて、結核菌の亜種を同定する方法が提案されている。
　本発明の一態様は、微生物のゲノム解析に基づく微生物菌種の同定方法を提供することを目的とする。
　第一態様は、微生物のゲノムＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ試料を含む検体から、それぞれのゲノムＤＮＡ試料の塩基配列を直接取得することと、取得した塩基配列に基づいて、それぞれのゲノムＤＮＡ試料を特定の微生物菌種に関連付けることと、関連づけられたゲノムＤＮＡ試料の数に基づいて、微生物菌種を同定することと、を含む微生物菌種の同定方法である。
　一態様において、微生物菌種の同定方法は、微生物からゲノムＤＮＡを抽出することと、抽出されるゲノムＤＮＡを前処理して前記ゲノムＤＮＡ試料を含む検体を得ることと、を更に含んでいてもよく、ゲノムＤＮＡを無作為に増幅することを更に含んでいてもよい。
　一態様において、微生物は、真菌及び細菌からなる群から選択される少なくとも１種を含んでいてよい。また、微生物は、食品、酒類、清涼飲料、環境試料等からなる群から選択される少なくとも１種の試料に由来してよい。また、微生物は、シングルコロニーに由来してよい。更に、ゲノムＤＮＡ試料の塩基配列は、ナノポアシーケンシング及び一分子リアルタイムシーケンシングからなる群から選択される少なくとも１種の塩基配列決定法によって取得されてよい。
　本発明の一態様によれば、微生物のゲノム解析に基づく微生物菌種の同定方法を提供することができる。
　本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。さらに本明細書に記載される数値範囲の上限及び下限は、数値範囲として例示された数値をそれぞれ任意に選択して組み合わせることが可能である。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、微生物菌種の同定方法を例示するものであって、本発明は、以下に示す微生物菌種の同定方法に限定されない。
微生物菌種の同定方法
　微生物菌種の同定方法は、微生物のゲノムＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ試料を含む検体から、それぞれのゲノムＤＮＡ試料の塩基配列を直接取得する配列取得工程と、取得した塩基配列に基づいて、それぞれのゲノムＤＮＡ試料を特定の微生物菌種に関連付ける関連付け工程と、関連づけられたゲノムＤＮＡ試料の数に基づいて、検体に含まれる微生物の微生物菌種を同定する同定工程と、を含んでいてよい。微生物菌種の同定方法は、微生物からゲノムＤＮＡを抽出する抽出工程と、抽出されるゲノムＤＮＡを前処理してゲノムＤＮＡ試料を含む検体を得る前処理工程とを更に含んでいてもよい。更に、微生物菌種の同定方法は、配列取得工程の前に抽出されるゲノムＤＮＡを無作為に増幅する増幅工程を含んでいてもよい。ここで、微生物菌種の同定方法は、検体に含まれる微生物についての菌種の同定方法であってよい。
　微生物に由来する検体について、ＰＣＲ等の特定のＤＮＡ領域を増幅する増幅手法で増幅することなく、検体に含まれるゲノムＤＮＡ試料の塩基配列を直接取得し、取得したゲノムＤＮＡ試料の塩基配列に基づいて微生物の菌種を同定することで、迅速に且つ高精度に微生物の菌種を同定することが可能になる。またゲノムＤＮＡ試料の塩基配列に基づく微生物菌種の同定方法は、ゲノムＤＮＡ全体を解析対象とするため、高精度で汎用性が高い。
　微生物菌種の同定方法は、同定対象となる微生物からゲノムＤＮＡを抽出する抽出工程を含んでいてもよい。同定対象となる微生物は、真菌及び細菌からなる群から選択される少なくとも１種を含んでいてよく、酵母及び細菌からなる群から選択される少なくとも１種を含んでいてよい。ここで真菌には、糸状菌、酵母、二形成真菌等が含まれる。また細菌には、乳酸菌、偏性嫌気性細菌、芽胞形成細菌等が含まれる。
　同定対象となる微生物は、例えば検査対象となる試料に含まれる微生物であってよい。検査対象となる試料としては、例えば、生体に由来する試料；食品、酒類、清涼飲料、食品、酒類及び清涼飲料の製造工程において存在する材料；食品、酒類及び清涼飲料の製造工程において排出される材料；食品の中間産物；環境試料等が挙げられる。生体としては例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類等の動物、昆虫、軟体動物、微生物、植物等が挙げられる。試料が由来する生体は、好ましくは哺乳動物であり、ヒトであっても非ヒト哺乳動物であってもよい。生体に由来する試料としては、例えば血液（例えば、全血、血清、血漿等）、汗、唾液、尿、毛髪、母乳等を挙げることができる。
　微生物を含む試料はその由来に応じて適当な前処理を施したものであってもよい。前処理としては、例えば遠心分離処理、抽出処理、ろ過処理、濃縮処理、精製処理等を挙げることができる。試料に含まれる微生物は１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。また、試料に含まれる微生物を、同定対象の微生物に応じた適切な培地を用い、同定対象の微生物に応じた適切な条件で培養してから、同定対象としてもよい。さらに同定対象となる微生物は、試料に含まれる微生物群から培養によって分離したシングルコロニーに由来する微生物であってよい。
　微生物からゲノムＤＮＡを抽出する方法は、通常用いられる方法から適宜選択することができる。例えば、微生物が細菌の場合、リゾチーム、Ｎ－アセチルムラミダーゼ等により、細菌を溶解し、必要に応じてタンパク質分解酵素で処理し、クロロホルム／イソアミルアルコール抽出した後、水相にエタノール、イソプロパノール等を加えて遠心分離することでゲノムＤＮＡを抽出することができる。また、微生物からのゲノムＤＮＡの抽出は、購入可能なＤＮＡ抽出精製キットを使用して、その添付文書のプロトコルに準じて行ってもよい。購入可能なＤＮＡ抽出精製キットとしては、例えば、ZymoBIOMICS DNA Mini Kit、QuickDNA-DNA Fungal/Bacterial Microprep Kit（共にZymo Research社製）、DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN社製）等が挙げられる。
　ゲノムＤＮＡが抽出される微生物の菌体数としては、例えば１ｃｅｌｌ以上１０１１ｃｅｌｌｓ以下であってよく、好ましくは１０２ｃｅｌｌｓ以上１０１０ｃｅｌｌｓ以下であってよい。一態様において、微生物菌種の同定方法が増幅工程を含まない場合、ゲノムＤＮＡが抽出される微生物の菌体数は、例えば１０７ｃｅｌｌｓ以上１０１１ｃｅｌｌｓ以下であってよく、好ましくは１０８ｃｅｌｌｓ以上１０１０ｃｅｌｌｓ以下であってよい。また一態様において、微生物菌種の同定方法が増幅工程を含む場合、ゲノムＤＮＡが抽出される微生物の菌体数は、例えば１ｃｅｌｌｓ以上１０７ｃｅｌｌｓ以下であってよく、好ましくは、１００ｃｅｌｌｓ以上１０４ｃｅｌｌｓ以下であってよい。
　抽出工程において得られるＤＮＡ抽出物のＤＮＡ濃度は、例えば１０ｆｇ／μＬ以上３μｇ／μＬ以下であってよく、好ましくは２０ｎｇ／μＬ以上１００ｎｇ／μＬ以下であってよい。一態様において、微生物菌種の同定方法が増幅工程を含まない場合、抽出工程において得られるＤＮＡ抽出物のＤＮＡ濃度は、例えば１０ｎｇ／μＬ以上３μｇ／μＬ以下であってよく、好ましくは２０ｎｇ／μＬ以上１００ｎｇ／μＬ以下であってよい。一態様において、微生物菌種の同定方法が増幅工程を含む場合、抽出工程において得られるＤＮＡ抽出物のＤＮＡ濃度は、例えば１０ｆｇ／μＬ以上１００ｎｇ／μＬ以下であってよく、好ましくは１０ｐｇ／μＬ以上１０ｎｇ／μＬ以下であってよい。
　微生物菌種の同定方法は、ゲノムＤＮＡを無作為に増幅（以下、ゲノム増幅ともいう）して、増幅されたゲノムＤＮＡ断片を含む増幅産物を得る増幅工程を含んでいてもよい。増幅工程を含むことで、検査対象となる試料に含まれる微生物量が少ない場合であっても、高い精度で微生物菌種を同定することができる。またゲノムＤＮＡを無作為に増幅することで、増幅に要する時間を短縮することができる。増幅工程は、ゲノムＤＮＡのランダムな位置からのＤＮＡ断片の複製を含んでいてよい。ゲノムＤＮＡの増幅は、購入可能なキットを使用して、その添付文書のプロトコルに準じて行ってよい。
　ゲノムＤＮＡの無作為な増幅が可能なキットとしては、illustraTM Ready-To-GoTM GenomiPhiTM DNA Amplification Kit（cytiva社製）、TruePrime Single Cell WGA Kit（4basebio社製）、GenomePlex(R) 全ゲノム増幅(WGA)キット（Sigma-Aldrich社製）、PicoPLEX(R) WGA Kit（Clontech社製）等が挙げられる。
　ゲノムＤＮＡの無作為な増幅は、抽出工程で抽出されたゲノムＤＮＡに対して行ってもよく、ゲノムＤＮＡを無作為に断片化するＤＮＡ断片化処理後の断片化ゲノムＤＮＡに対して行ってもよい。
　増幅工程で得られる増幅産物に含まれるＤＮＡ濃度は、例えば１０ｎｇ／μＬ以上３μｇ／μＬ以下であってよく、好ましくは２０ｎｇ／μＬ以上１００ｎｇ／μＬ以下であってよい。
　微生物菌種の同定方法は、抽出工程で抽出されるゲノムＤＮＡ、または増幅工程で増幅されたゲノムＤＮＡを、前処理してゲノムＤＮＡ試料を含む検体を得る前処理工程を含んでいてもよい。ゲノムＤＮＡの前処理方法としては、例えば、機械的断片化方法、酵素的断片化方法等のＤＮＡ断片化処理、ゲノムＤＮＡ末端へ付加配列等を付加するＤＮＡ末端処理などが挙げられる。前処理工程は、少なくともＤＮＡ断片化処理を含んでいてよく、ゲノムＤＮＡを無作為に断片化するＤＮＡ断片化処理を含んでいてよい。さらに前処理工程はＤＮＡ断片化処理とＤＮＡ末端処理の両方を含んでいてもよい。ゲノムＤＮＡの前処理は、購入可能なキットを使用して、その添付文書のプロトコルに準じて行ってよい。
　ＤＮＡ断片化処理が可能なキットとしては、例えば、Rapid Sequencing Kit（Oxford NANOPORE Technologies社製）、Rapid Barcoding Kit（Oxford NANOPORE Technologies社製）等が挙げられる。
　ゲノムＤＮＡ末端へ付加される付加配列等は、例えば、識別用、シーケンシング用等の目的に応じて適宜選択されてよい。付加配列等が付加されるゲノムＤＮＡは、断片化処理されたゲノムＤＮＡであってもよいし、微生物から抽出されたゲノムＤＮＡであってもよい。ゲノムＤＮＡ末端への付加配列等の付加は、例えば購入可能なキットを使用して、その添付文書のプロトコルに準じて導入行うことができる。具体的には例えば、Ligation Sequencing Kit（Oxford NANOPORE Technologies社）、Rapid Sequencing Kit（Oxford NANOPORE Technologies社）等を挙げることができる。なお、キットによっては、ゲノムＤＮＡの断片化と付加配列等の付加の両方を行うことができるものある。
　前処理工程でＤＮＡ断片化処理されて得られるゲノムＤＮＡ試料のサイズ（塩基数）は、例えば２００ｂｐ以上１０００００ｂｐ以下であってよく、好ましくは５００ｂｐ以上５００００ｂｐ以下であってよい。また前処理工程で得られ、配列取得工程に供されるゲノムＤＮＡ試料の量は、例えば１０ｎｇ以上１０００ｎｇ以下であってよく、好ましくは１００ｎｇ以上４００ｎｇ以下であってよい。
　配列取得工程では、検体に含まれるそれぞれのゲノムＤＮＡ試料の塩基配列を直接取得する。ここで、ゲノムＤＮＡ試料の塩基配列を直接取得するとは、微生物のゲノムＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから得られるゲノムＤＮＡ試料を含む検体の少なくとも一方をＰＣＲ等の特定のＤＮＡ領域を増幅する増幅手法によって増幅することなく、適当な塩基配列決定方法により、それぞれのゲノムＤＮＡ試料の塩基配列を決定することを意味する。ゲノムＤＮＡ又はその断片を増幅する必要がないことから、迅速な微生物菌種の同定が可能になる。
　ゲノムＤＮＡ試料の塩基配列を直接取得する塩基配列決定方法としては、例えば、ナノポアシーケンシング、一分子リアルタイムシーケンシング等が挙げられ、これらからなる群から選択される少なくとも１種の塩基配列決定方法を含んでいてよい。配列取得工程で得られる塩基配列データは、それぞれのゲノムＤＮＡ試料の塩基配列に対応するデータを含んでいてよい。
　ナノポアシーケンシングとは、膜に埋め込まれた小さな穴（ナノポア）をＤＮＡ試料が通り抜けるときに塩基配列を解読する手法である。従来の塩基配列決定法とは異なり、ＤＮＡの合成、増幅等に依存せずにヌクレオチド配列を直接読み取ることができる。ナノポアシーケンシングを実施するナノポアシーケンサーには、塩溶液を２つの区画に区切る膜があり、その膜に多数のナノポアが埋め込まれている。膜に電圧をかけるとイオンの流れが発生し、それぞれのナノポアにおいて電流値が測定される。ＤＮＡ試料がナノポアを通るとき、イオンの流れが部分的に妨げられ、測定される電流値が低下する。４種類の核酸塩基に対応するイオン流の変化量はそれぞれ違うので、電流値の変化量によって核酸塩基を識別することができる。ナノポアシーケンシングは、購入可能な装置によって実施することができる。具体的には、例えば、MinION、Frongle、GridION、PromethION（Oxford NANOPORE Technologies社）等の装置を用いて実施することができる。
　一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシングとは、並列化された単一分子ＤＮＡシーケンスの手法の１つである。ＳＭＲＴシーケンシングでは、ゼロモード導波路（ＺＭＷ）を利用しており、ＤＮＡポリメラーゼが１つずつＺＭＷの底部に固定されている。そして、このＤＮＡポリメラーゼがテンプレートとなるＤＮＡ断片を１つずつ取り込む。ＺＭＷは、ＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれるＤＮＡ断片を１ヌクレオチド単位で観察することができるような、極小の蛍光観察を行える場を構成する構造をとっている。４種類のヌクレオチドには各々異なる蛍光色素が付着しており、ヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれることで、蛍光色素が切断されて蛍光が発せられ、またその蛍光色素は迅速にＺＭＷの観察領域から拡散することで蛍光が観察されなくなる。検出器は、ヌクレオチド取り込み時に発せられるこの一瞬の蛍光シグナルを検出し、その蛍光色素に対応する塩基に関連付けることでＤＮＡ断片の塩基配列が決定される。ＳＭＲＴシーケンシングは、購入可能な装置によって実施することができる。具体的には、例えばPacBio(R) Sequel II/ IIe システム（PacBio社）等の装置を用いて実施することができる。
　配列取得工程で得られる塩基配列データには、必要に応じて品質チェック等のデータ処理を実施してもよい。配列取得工程で得られる塩基配列データは、塩基数が２００ｂｐ以上１０００００ｂｐ以下であるゲノムＤＮＡ試料の塩基配列を、１以上含むものであってよく、好ましくは１０以上、または１００以上含むものであってよく、また好ましくは１０００本以下含むものであってよい。
　関連付け工程では、取得した塩基配列に基づいて、それぞれのゲノムＤＮＡ試料を特定の微生物菌種に関連付ける。関連付け工程では、例えば、微生物の特定の菌種とそのゲノムＤＮＡ塩基配列とが関連付けられたゲノムデータベースを用いて、取得された塩基配列と対応する微生物菌種を特定する。ゲノムデータベースとしては、例えばGenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、GenomeSync（http://genomesync.org/）、Mifup（https://www.nite.go.jp/nbrc/mifup/）等を用いることができる。ゲノムデータベースはオンラインデータベースであっても、オフラインデータベースであってもよい。取得された塩基配列と微生物菌種との関連付けは、例えば、相同性検索ツールを用いて、取得された塩基配列をゲノムデータベースから検索し、その塩基配列をゲノムＤＮＡに有する微生物菌種を選択することで実施することができる。相同性検索ツールとしては例えば、BLAST（例えば、NCBI BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）、微生物同定システムENKI（https://www.tecsrg.co.jp/services/products-and-tec/enki/）等を用いることができる。
　同定工程では、関連づけられたゲノムＤＮＡ試料の数に応じて、ゲノムＤＮＡ試料が抽出された微生物について、その微生物菌種を同定する。微生物菌種の同定は、例えば、ゲノムＤＮＡ試料とその塩基配列と関連付けられた微生物菌種との関係をKrona Chartで視覚化することで行うことができる。また、例えば、検体に含まれるゲノムＤＮＡ試料が関連付けられた微生物菌種を、関連付けられたゲノムＤＮＡ試料数が多い順に並べ、上位に位置する微生物菌種を同定対象の微生物と同定することもできる。さらにまた、例えば、検体に含まれるゲノムＤＮＡ試料が関連付けられた微生物菌種のうち、関連付けられたゲノムＤＮＡ試料数が最も多い微生物菌種を同定対象の微生物と同定することができる。
　本実施形態にかかる微生物菌種の同定方法は、ゲノムデータベースに塩基配列データが収載されている微生物であれば、真菌類であっても細菌類であっても微生物種に限定されずに菌種レベルで同定することが可能である。またＰＣＲ等の特定のＤＮＡ領域を増幅する増幅手法を必要としないことから、真菌類であっても細菌類であっても微生物種に限定されず、統一的なプロトコルで菌種の同定が可能であり、作業性に優れる。さらに解析対象が特定の遺伝子ではなく、ゲノムＤＮＡ全体であることから、優れた同定精度を達成することができる。
　従って、本実施形態にかかる微生物菌種の同定方法は、Lactobacillus casei group、Lactobacillus plantarum group、Bacillus cereus group等の近縁関係にある菌種の識別同定に有効である。すなわち、本実施形態にかかる微生物菌種の同定方法は、Lactobacillus casei groupにおける菌種同定方法であってよく、Lactobacillus plantarum groupにおける菌種同定方法であってよく、Bacillus cereus groupにおける菌種同定方法であってよい。またさらに、微生物菌種の同定方法は、ビール混濁リスクの判定、食中毒細菌か否かの判定等に応用することができる。すなわち、本実施形態にかかる微生物菌種の同定方法は、ビール混濁リスクの判定方法であってよく、食中毒細菌の判定方法であってもよい。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
参考例１　ＤＮＡ抽出
　供試菌として、Lactobacillus casei、L. paracasei、L. rhamnosus、L. zeae、およびL. chiayiensisを選択した。これら菌株をそれぞれメルク社製ＭＲＳ寒天培地にて嫌気条件下２５℃で３日間培養した。寒天培養にて得られた各シングルコロニーを十分に白濁する程度（１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上）まで滅菌水にそれぞれ懸濁した。ＤＮＡ抽出キットとして、ZymoBIOMICS DNA Mini Kit、又はQuickDNA-DNA Fungal/Bacterial Microprep Kit（共にZymo Research社）を用いて、各キットのプロトコルに従い、菌懸濁液からＤＮＡを抽出、精製した。得られたＤＮＡ抽出液について、NanoDrop（Thermo Fisher Scientific社）を用いてＤＮＡ濃度を測定した。ＤＮＡ濃度は、７５ｎｇ／μＬから２２５ｎｇ／μＬであった。
実施例１
　参考例１で得られたＤＮＡ抽出液に対し、Ligation Sequencing Kit（SQK-LSK109、Oxford NANOPORE Technologies（ＯＮＴ）社）、又はRapid Sequencing Kit（SQK-RAD004、ＯＮＴ社）を用いて、各キットのプロトコルに従ってアダプター配列付加等の前処理を行い、前処理済のＤＮＡ試料を得た。MinION用フローセル（FLO-MIN106D、ＯＮＴ社）を室温に戻した後、MinION用ＰＣに接続した。Flow Cell Priming Kit（EXP-FLP002、ＯＮＴ社）を用いて、キットに付属のプロトコルに従ってプライミング処理を行った後、上記で得られた前処理済のＤＮＡ試料をMinION用フローセルに添加し、解析ソフトMinKNOWによりナノポアシーケンシングを行い、ＤＮＡ配列データ（ＦＡＳＴ５形式）を取得した。
　ゲノムデータベースGenomeSync（http://genomesync.org/）、およびGenome Search Tool Kit（ＧＳＴＫ）関連のソフトウェアを格納した外付けＳＳＤをＧＳＴＫ用ＰＣに接続し、上記で得られたＤＮＡ配列データ（ＦＡＳＴ５形式）を同ＰＣの所定のフォルダに格納した。所定のコマンド入力により、Guppy-GPUソフトウェア（ＯＮＴ社）を起動させ、ベースコールにより各ＤＮＡ試料の塩基配列（ＦＡＳＴＱ形式）を決定した。得られた各々のＤＮＡ試料の塩基配列データ（ＦＡＳＴＡ形式）をMinimap2によりデータベース内の塩基配列と照合し、Krona chartとして表示させることで視覚化した。チャートにより割り当てられた塩基配列数が最も多い菌種を同定結果として採用した。同定結果を表１に示す。
比較例１
　L.J.H. Wardらの手法（Letters in Applied Microbiology 1999, 29, 90-92）を参考に、以下の条件でＰＣＲを行った。プライマーセットとしては表２に示す、L. casei検出用、L. paracasei用、L. rhamonosus用の３種を用い、各プライマーセットでＰＣＲを行った後、電気泳動にてバンドの有無を確認した。同定結果を表１に示す。
反応液組成
　SapphireAmp Fast PCR Master Mix　　２５μＬ
　Forwardプライマー（１００μｍｏｌ／Ｌ）　　０．２μＬ
　Reverseプライマー（１００μｍｏｌ／Ｌ）　　０．２μＬ
　滅菌水　　１９．６μＬ
　前処理済みＤＮＡ　　５μＬ
ＰＣＲ条件
　（１）９４℃、１分
　（２）９８℃、５秒；５５℃、５秒；７２℃、１０秒を３０サイクル
　（３）４℃、停止
比較例２
　ＭＡＬＤＩ　ｂｉｏｔｙｐｅｒマニュアルに従って、以下のようにして試料を調製した。寒天培養にて得られたコロニーの１白金耳程度を３００μＬのＭｉｌｌｉＱ水に懸濁し、９００μｌの９９．５％エタノールを加え、ボルテックスにて攪拌後、１５０００ｒｐｍで２分間遠心し、上清を完全に除去した。得られたペレットに５μＬから５０μＬの７０％ギ酸を加え、ピペッティング、またはボルテックスにてよく攪拌し、ギ酸と等量のアセトニトリルを加えよく攪拌した。１５０００ｒｐｍで２分遠心し、上清を４μＬ採取し、ターゲットプレートのスポット３箇所に均等に乗せ（約１μＬ／スポット）、十分に乾燥後、マトリックス溶液４μＬを、乾燥後のスポット３箇所の上に重層した（約１μＬ／スポット）。キャリブレーションスタンダードをサンプルと同様にスポットし、ｆｌｅｘ　ｃｏｎｔｒｏｌにてキャリブレーションを行ったのち、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析を実施した。同定精度を示すスコア値については、２．０以上を種レベル、１．７以上２．０未満を属レベル、１．７未満は同定不能と判定した。同定結果を表１に示す。
比較例３
　上記で得られた前処理済ＤＮＡに対して、プライマーとして表３に示す１６Ｓ　ｒＲＮＡ用ユニバーサルプライマーを用いて、比較例１と同様のＰＣＲ条件で、１６ＳリボゾームＲＮＡの上流約９００ｂｐを増幅させた後、ＥＸＯ－ＳＡＰ　ＩＴ（Thermo Fisher Scientific社製）を用いてＰＣＲ産物を精製した。精製後、サイクルシーケンス法にて蛍光標識し、再度精製を行った。キャピラリーＤＮＡシーケンサーにて塩基配列を取得した後、ＢＬＡＳＴにて相同性検索を行い、菌種を同定した。同定結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、実施例１の同定方法により、Lactobacillus属に属する５種の菌種を高精度に同定できることが分かる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
参考例２　ＤＮＡ抽出
　供試菌として、Lactobacillus caseiを選択した。菌株をメルク社製ＭＲＳ寒天培地にて嫌気条件下２５℃で３日間培養した。寒天培養にて得られた各シングルコロニーを十分に白濁する程度（１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上）まで滅菌水にそれぞれ懸濁した。ＤＮＡ抽出キットとして、ZymoBIOMICS DNA Mini Kit、又はQuickDNA-DNA Fungal/Bacterial Microprep Kit（共にZymo Research社）を用いて、各キットのプロトコルに従い、菌懸濁液からＤＮＡを抽出、精製した。得られたＤＮＡ抽出液について、NanoDrop（Thermo Fisher Scientific社）を用いてＤＮＡ濃度を測定した。
実施例２
　参考例２で得られたＤＮＡ抽出液をＤＮＡ濃度がそれぞれ１２ｎｇ／μＬ、１．２ｎｇ／μＬ、０．１２ｎｇ／μＬ、０．０１２ｎｇ／μＬとなるように希釈して、希釈液１から４を作製した。各希釈液７．５μＬにRapid Barcoding Kit（NANOPORE社）のBarcode02から06をそれぞれ２．５μＬ加えて、ＤＮＡを断片化した。得られた溶液をそれぞれ２μＬずつチューブに入れ、１μＬのRapid Adapter(RAP)を添加した。
　上記ＤＮＡ希釈液１μＬについて、illustraTM Ready-To-GoTM GenomiPhiTM DNA Amplification Kit（cytiva社）を用いて、キットのプロトコルを用いてゲノム増幅を行った。
　上記ＤＮＡ希釈液および各々のゲノム増幅反応液に対し、Rapid Sequencing Kit（SQK-RAD004、ＯＮＴ社）を用いて、キットのプロトコルに従ってアダプター配列付加（ＲＡＰ添加）以降の前処理を行い、前処理済のＤＮＡ試料を得た。MinION用フローセル（FLO-MIN106D、ＯＮＴ社）を室温に戻した後、MinION用ＰＣに接続した。Flow Cell Priming Kit（EXP-FLP002、ＯＮＴ社）を用いて、キットに付属のプロトコルに従ってプライミング処理を行った後、上記で得られた前処理済のＤＮＡ試料をMinION用フローセルに添加し、解析ソフトMinKNOWによりナノポアシーケンシングを行い、ＤＮＡ配列データ（ＦＡＳＴ５形式）を取得した。
　ゲノムデータベースGenomeSync（http://genomesync.org/）、およびGenome Search Tool Kit（ＧＳＴＫ）関連のソフトウェアを格納した外付けＳＳＤをＧＳＴＫ用ＰＣに接続し、上記で得られたＤＮＡ配列データ（ＦＡＳＴ５形式）を同ＰＣの所定のフォルダに格納した。所定のコマンド入力により、Guppy-GPUソフトウェア（ＯＮＴ社）を起動させ、ベースコールにより各ＤＮＡ試料の塩基配列（ＦＡＳＴＱ形式）を決定した。得られた各々のＤＮＡ試料の塩基配列データ（ＦＡＳＴＡ形式）をMinimap2によりデータベース内の塩基配列と照合し、Krona chartとして表示させることで視覚化した。チャートにより、L. caseiに割り当てられたリード数および全体のリード数に対する比率を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
参考例３　ＤＮＡ抽出
　供試菌として、Bacillus anthracis、B. cereus、B. thuringiensis、B. pacificus、B. mycoides、B. paranthracis、B. tropicus、B. mobilis、B. lutiを選択した。B. anthracisおよびB. cereusは分譲ＤＮＡを使用し、その他Bacillus cereus groupの菌種は、ＳＴＡ培地で３７℃数日間培養後、参考例１と同様にＤＮＡ抽出およびＤＮＡ濃度の測定を行った。得られたＤＮＡ試料のＤＮＡ濃度は２０ｎｇ／μＬから３００ｎｇ／μＬであった。
実施例３
　参考例３のＤＮＡ試料を用いて、実施例１と同様の方法で、それぞれのＤＮＡ試料について菌種の同定を行った。結果を表５に示す。表５中、菌種を正しく同定できた場合をＯＫ、誤って同定した場合をＮＧ、未同定の場合を－として示す。
比較例４、５
　参考例３のＤＮＡ試料を用いたこと以外は、比較例２又は比較例３と同様の方法で、それぞれのＤＮＡ試料について菌種の同定を行った。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示すように、実施例１の同定方法により、Bacillus属に属する９種の菌種を高精度に同定できることが分かる。特に食中毒の起因菌であるセレウス菌を迅速且つ高精度に同定することができる。

Claims (7)

  1. 　微生物のゲノムＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ試料を含む検体から、それぞれのゲノムＤＮＡ試料の塩基配列を直接取得することと、
    　取得した塩基配列に基づいて、それぞれのゲノムＤＮＡ試料を特定の微生物菌種に関連付けることと、
    　関連づけられたゲノムＤＮＡ試料の数に基づいて、微生物菌種を同定することと、を含む微生物菌種の同定方法。
  2. 　微生物からゲノムＤＮＡを抽出することと、
    　抽出されるゲノムＤＮＡを前処理して前記ゲノムＤＮＡ試料を含む検体を得ることと、を更に含む請求項１に記載の微生物菌種の同定方法。
  3. 　ゲノムＤＮＡを無作為に増幅することを更に含む請求項２に記載の微生物菌種の同定方法。
  4. 　前記微生物は、真菌及び細菌からなる群から選択される少なくとも１種を含む請求項１から３のいずれか１項に記載の微生物菌種の同定方法。
  5. 　前記微生物は、食品、酒類、清涼飲料及び環境試料からなる群から選択される少なくとも１種の試料に由来する請求項１から４のいずれか１項に記載の微生物菌種の同定方法。
  6. 　前記微生物は、シングルコロニーに由来する請求項１から５のいずれか１項に記載の微生物菌種の同定方法。
  7. 　前記ゲノムＤＮＡ試料の塩基配列は、ナノポアシーケンシング及び一分子リアルタイムシーケンシングからなる群から選択される少なくとも１種の塩基配列決定法によって取得される請求項１から６のいずれか１項に記載の微生物菌種の同定方法。
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