CN111868266B - 使用了试样细菌的rna的细菌鉴定方法及用于其的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供能够在不改变用于鉴定的试剂、条件的情况下对并非有限的数种细菌、而是多种细菌进行鉴定的鉴定方法。另外，本发明的目的在于提供仅通过1次PCR来高灵敏度地进行检测·鉴定、能够减轻繁杂的操作及作业人员的负担的鉴定方法。本发明中，细菌的鉴定使用具有以下的工序的方法。工序(1)，使用下述第一反应体系进行逆转录反应，得到含有合成的cDNA及逆转录用引物的反应混合物，所述第一反应体系含有：所述逆转录用引物，其用于制备包含用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的cDNA；从试样中的细菌中提取的RNA；及具有RNA依赖型DNA聚合酶活性的酶；工序(2)，使用下述第二反应体系实施PCR，所述第二反应体系含有：所述反应混合物；引物对，其用于合成包含所述用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA；及具有DNA依赖型DNA聚合酶活性的酶，其中，第二反应体系中，由所述反应混合物供给的所述逆转录用引物的浓度为0.08nM以上且20nM以下；及工序(3)，从PCR后的所述第二反应体系中，检测包含所述用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA的生成。
Description
技术领域
本发明涉及试样中的细菌的迅速的鉴定方法及用于其的试剂盒。
背景技术
败血症是严重的全身感染症，其确定诊断需要检测·鉴定血液中的病原微生物，近年来，败血症的患者数量伴随癌症治疗、器官移植等医疗的高度化而增加。从院内感染的观点考虑，以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA：methicillin-resistant Staphylococcusaureus)为代表的多药耐药性菌成为败血症的病原菌的情况也较多，为了选择合适的抗生素以拯救患者生命，尽可能迅速地检测·鉴定血液中的病原微生物在临床上是重要的(专利文献1)。
基于这样的背景，作为败血症的迅速的检查方法，对使用了PCR(聚合酶链式反应)的检查系统进行了研究。作为这样的检查方法，下述PCR法是已知的：从微生物中提取DNA，将其作为模板，使用特定的引物对通过PCR等进行基因扩增，然后，对微生物特异性的熔解温度(Tm值)的组合、或各Tm值间的差进行分析，从而迅速地进行病原菌的检测·鉴定(专利文献2)。
上述PCR法中，通过将提取的DNA作为模板实施第1次PCR，扩增作为目标的DNA片段的全长，并将扩增后的DNA片段作为模板实施第2次PCR(巢式PCR，nested PCR)，从而高灵敏度地进行检测。然而，其需要两步PCR，这在检查时间、作业性方面成为课题。尤其在作业性方面，两次PCR是繁杂的，为了减轻作业人员的负担、及面向作业的全自动化，需要进行改良。
也进行了检测各种临床、食品、环境或其他实验性样品中的细菌RNA、并鉴定污染物或病原体的操作。已开发了一种特异性探针，其通过以数种重要的细菌菌种作为检测对象，对检测对象细菌菌种中特有的RNA分子进行检测，从而即使在存在检测对象以外的细菌菌种的情况下也能实现对检测对象的检测。在逆转录PCR分析法中，还实施了下述方法：利用将目标RNA作为模板的逆转录反应合成cDNA，然后通过PCR中的cDNA的扩增来检测目标RNA分子(专利文献3)。
关于基于Tm值的细菌鉴定方法，专利文献1中虽然认为也可利用提取RNA来代替DNA并基于得到的RNA制得的cDNA，但并未进行详细的研究。
专利文献3中记载了用于从细菌中直接检测诊断用RNA的方法。
专利文献4中记载了生物学试样中的RNA种类的特异性检测方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2010/082640号
专利文献2：国际公开第2007/097323号
专利文献3：日本特开2012-34705号公报
专利文献4：国际公开第2010/054819号
发明内容
发明所要解决的课题
若基于专利文献2中公开的技术，则能够在短时间内以高灵敏度实施微生物的检测及鉴定。然而，如前文所述，认为上述的方法必须实施两次PCR，不仅操作繁杂且导致作业人员的负担，还存在阻碍作业的全自动化的情况。
另外，专利文献4中记载了使用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA后，对通过PCR扩增的cDNA进行检测的方法。
在细菌中，RNA较之DNA存在更多。从理论上考虑，可以期待下述方案提高细菌的检测灵敏度：从试样中的细菌中提取RNA，代替第一步PCR而通过使用了RNA的逆转录反应来制备cDNA，将制得的cDNA作为模板来实施PCR。
然而，通过本申请的发明人的研究可知，在进行了如专利文献4中所记载的反应的情况下，在PCR中由于逆转录反应而引起了多余的反应，得到了许多目标DNA片段以外的不需要的DNA片段，因此事实上无法进行细菌的鉴定。
本发明的课题为提供细菌鉴定方法及用于其的试剂盒，所述细菌鉴定方法通过将试样中的细菌的RNA作为靶标，从而能够在不改变用于鉴定细菌的试剂、条件的情况下针对并非有限的数种细菌、而是多种细菌进行细菌鉴定。另外，本发明的课题为提供即使通过1次PCR也能高灵敏度地进行检测·鉴定、从而减轻繁杂的操作及作业人员的负担的鉴定方法及用于其的试剂盒。
本申请发明的另一课题在于发现解决上述课题所需要的细菌鉴定方法。
如上所述，由发明人的研究表明，存在仅凭使用试样中的RNA这一以往的构想无法达成细菌的检测、鉴定的情况。本申请的发明人已查明，专利文献4中记载的方法中事实上无法进行细菌的鉴定这一情况的原因是，被引入用于检测靶cDNA的PCR工序中的逆转录用引物的浓度过高。
本申请的发明人以该实验事实作为出发点反复进行研究，进一步地，首次发现了存在本领域技术人员以往并未认识到的新的解决课题。即，发现了在利用逆转录酶基于从试样中提取的RNA来制备cDNA、并将制得的cDNA作为模板实施PCR的情况下，需要抑制在PCR中产生的目标以外的DNA片段的生成。该课题本身即为本领域技术人员以往在现有技术中未认识到的未知课题。
用于解决课题的手段
如上所述，本申请的发明人为了解决全新的课题而反复进行了深入研究。
其结果发现：若调节从逆转录反应引入的、PCR反应时的反应体系内的逆转录用引物的浓度，并且以成为与通常所考虑的浓度相比极低的浓度的方式进行调节，则不需要的DNA片段的生成得到显著抑制，通过适当调节Tm作图(mapping)的条件，能够检测、鉴定试样中的细菌。
此外还发现：在PCR反应时的反应体系内存在的逆转录用引物的浓度存在最适范围，若适当控制逆转录用引物的浓度以使其处于该范围内，则即使试样中的菌数为极低浓度，仍然能够以良好的灵敏度进行检测、鉴定。
本发明是基于如上所述的全新见解而完成的。
即，本发明如下所述。
[1]细菌鉴定方法，其特征在于，具有以下的工序(1)～(3)。
工序(1)，使用下述第一反应体系进行逆转录反应，得到含有合成的cDNA及逆转录用引物的反应混合物，所述第一反应体系含有：所述逆转录用引物，其用于制备包含用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的cDNA；从试样中的细菌中提取的RNA；及具有RNA依赖型DNA聚合酶活性的酶；
工序(2)，使用下述第二反应体系实施PCR，所述第二反应体系含有：所述反应混合物；引物对，其用于合成包含所述用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA；及具有DNA依赖型DNA聚合酶活性的酶，其中，第二反应体系中，由所述反应混合物供给的所述逆转录用引物的浓度为0.08nM以上且20nM以下；及
工序(3)，从PCR后的所述第二反应体系中，检测包含所述用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA的生成。
[2]如上述[1]项所述的细菌鉴定方法，其特征在于，在不同的反应容器内、或者在相同的反应容器内依次实施所述工序(1)及(2)。
[3]如上述[1]项或[2]项所述的细菌鉴定方法，其特征在于，所述用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列为细菌的16S rDNA所包含的碱基序列，所述RNA包含所述试样中的细菌的16S rRNA。
[4]如[3]所述的细菌鉴定方法，其特征在于，所述逆转录用引物包含序列号1的碱基序列。
[5]如上述[1]或[4]所述的细菌鉴定方法，其特征在于，所述引物对为选自由以下的(A组)～(C组)组成的组中的至少1对引物对。
(A组)
·引物对1a：包含序列号2的碱基序列的正向引物和包含序列号3的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对2a：包含序列号4的碱基序列的正向引物和包含序列号5的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对3a：包含序列号6的碱基序列的正向引物和包含序列号7的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对4a：包含序列号8的碱基序列的正向引物和包含序列号9的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对5a：包含序列号10的碱基序列的正向引物和包含序列号11的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对6a：包含序列号12的碱基序列的正向引物和包含序列号13的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对7a：包含序列号14的碱基序列的正向引物和包含序列号15的碱基序列的反向引物的组合。
(B组)对所述(A组)的各引物对中的一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对；及
(C组)包含与所述(A组)或(B组)的各引物对中的一条或两条引物的碱基序列对应的互补序列的引物对。
[6]如上述[1]至[5]中任一项所述的细菌鉴定方法，其特征在于，所述工序(3)中，测定生成的双链DNA的Tm值，将得到的Tm值与预先测得的包含用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA的Tm值、或者由它们二次得到的数据进行比较，从而鉴定所述试样中的细菌。
[7]如上述[1]至[6]中任一项所述的细菌鉴定方法，其特征在于，在所述工序(1)之后，将所述反应混合物单独地直接用于所述工序(2)，或者将所述反应混合物进行稀释而用于所述工序(2)。
[8]试剂盒，其用于通过PCR来鉴定试样中的细菌，所述PCR将通过从所述试样中的细菌中提取的RNA的逆转录反应得到的反应混合物中含有的cDNA作为模板，所述试剂盒的特征在于，具有下述(a)至(c)：
(a)用于制备用于所述逆转录反应的第一反应体系的逆转录用引物，所述引物用于制备包含用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的cDNA；
(b)用于制备用于所述PCR的第二反应体系的引物对，所述引物对用于合成包含所述用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA；及
(c)具有RNA依赖型DNA聚合酶活性的酶，
所述第二反应体系含有通过所述逆转录反应得到的反应混合物，所述逆转录用引物的量以介由该反应混合物被供给至所述第二反应体系时的逆转录用引物的浓度成为0.08nM以上且20nM以下的方式进行了调节。
[9]如上述[8]所述的试剂盒，其特征在于，还具有记载有所述逆转录反应和所述PCR的步骤的操作说明书。
[10]如上述[9]所述的试剂盒，其特征在于，所述操作说明书中记载了步骤以使得所述第二反应体系中含有的所述逆转录用引物的浓度成为0.08nM以上且20nM以下。
[11]如上述[8]至[10]中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列为细菌的16S rDNA所包含的碱基序列，所述RNA包含所述试样中的细菌的16S rRNA。
[12]如上述[11]所述的试剂盒，其特征在于，所述逆转录用引物包含序列号1的碱基序列。
[13]如上述[11]或[12]所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对为选自由以下的(A组)～(C组)组成的组中的至少1对引物对。
(A组)
·引物对1a：包含序列号2的碱基序列的正向引物和包含序列号3的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对2a：包含序列号4的碱基序列的正向引物和包含序列号5的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对3a：包含序列号6的碱基序列的正向引物和包含序列号7的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对4a：包含序列号8的碱基序列的正向引物和包含序列号9的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对5a：包含序列号10的碱基序列的正向引物和包含序列号11的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对6a：包含序列号12的碱基序列的正向引物和包含序列号13的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对7a：包含序列号14的碱基序列的正向引物和包含序列号15的碱基序列的反向引物的组合。
(B组)对所述(A组)的各引物对中的一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对；及
(C组)包含与所述(A组)或(B组)的各引物对中的一条或两条引物的碱基序列对应的互补序列的引物对。
发明效果
通过本发明，能够在维持检测灵敏度的情况下，通过1次PCR仍可进行细菌的检测及鉴定。因此，能够减轻作业人员的负担、及实现系统的自动化。
对于本发明的鉴定方法而言，通过适当调节第二反应体系中的逆转录用引物的浓度，从而即使对于含有菌数为100CFU/检体左右的稀薄的菌的试样，也能够以良好的灵敏度进行细菌的检测·鉴定。
附图说明
[图1]为示出实施例1中的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。
[图2]为示出实施例2中的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。
[图3]为示出实施例3中的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。
具体实施方式
本发明涉及的细菌鉴定方法具有以下的工序。
工序(I)，使用从试样中的细菌中提取的RNA，通过逆转录反应得到含有cDNA的反应混合物。
工序(II)，使用含有cDNA的反应混合物、和用于鉴定细菌的引物对实施PCR。
工序(III)，检测利用用于鉴定细菌的引物对通过PCR而扩增的双链DNA的生成。
工序(I)中的逆转录反应中，使用下述第一反应体系，所述第一反应体系含有：逆转录用引物，其用于制备包含用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的cDNA；从试样中的细菌中提取的RNA；及具有RNA依赖型DNA聚合酶活性的酶。
本发明中的反应混合物表示下述混合物，其含有：实施基于第一反应体系的逆转录反应而得到的反应混合物；及未参与反应、保持未反应状态而残留的未反应物。
第一反应体系中使用的逆转录用引物在合成cDNA时被消耗，但通常以过量(多于目标cDNA的合成量所需要的量)使用。因此，通过基于第一反应体系的逆转录反应得到的反应混合物中含有作为反应产物的合成cDNA、和作为未反应物的残留的逆转录用引物。
工序(II)中的PCR中，使用下述第二反应体系，所述第二反应体系含有：工序(I)中得到的反应混合物；引物对，其用于合成包含用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA；及具有DNA依赖型DNA聚合酶活性的酶。
如上所述，工序(I)中得到的反应混合物中含有未被逆转录反应消耗的逆转录用引物，通过调节工序(II)中的该逆转录用引物的量，能够实施高灵敏度的检测。为此，制备第二反应体系时的逆转录用引物的浓度选自0.08nM～20nM、更优选0.4nM～20nM、进一步优选0.8nM～20nM、进一步优选2nM～20nM。
向第二反应体系中引入的逆转录用引物的量多时，存在下述情况：基于PCR的扩增产物中含有并非目标的扩增产物，因细菌鉴定中的背景上升而发生鉴定精度的降低。因此，将第二反应体系中的逆转录用引物的浓度设定为上述的范围。
可以在不同的反应容器内、或者在相同的反应容器内依次实施工序(I)及(II)。
本发明涉及的用于鉴定细菌的试剂盒具有以下的构成成分(a)至(c)。
(a)用于制备用于逆转录反应的第一反应体系的逆转录用引物，所述引物用于制备包含用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的cDNA；
(b)用于制备用于PCR的第二反应体系的引物对，所述引物对用于合成包含用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA；及
(c)用于制备第一反应体系的、具有RNA依赖型DNA聚合酶活性的酶。
本发明涉及的用于鉴定细菌的试剂盒可以进一步根据期望而具有：
(d)用于制备第二反应体系的、具有DNA依赖型DNA聚合酶活性的酶。
试剂盒所含的逆转录用引物的量可进行调节以使得介由通过逆转录反应得到的反应混合物而被供给至第二反应体系时的浓度成为0.08nM～20nM、更优选0.4nM～20nM、进一步优选0.8nM～20nM、进一步优选2nM～20nM。
需要说明的是，本发明涉及的细菌鉴定方法及用于其的试剂盒也可以在对试样中的检测对象菌的有无进行检测的检测方法中利用。
以下，对本发明涉及的细菌鉴定方法及用于其的试剂盒的优选方式进行说明。
＜RNA提取＞
作为RNA提取方法，碱裂解法、煮沸法、苯酚提取等是已知的，另外，专用的RNA提取试剂盒也在由各制造商企业销售。
本发明中的从试样中的细菌中提取RNA的方法没有特别限定，可使用已知的方法。根据检体的不同，最合适的方法不同，因此，优选选择与对象检体相应的方法。需要说明的是，在本申请实施例中使用的Roche公司制高纯度RNA分离试剂盒(High Pure RNAIsolation Kit)是可合适地使用的RNA提取方法的一例。
＜逆转录反应＞
需要将从试样中的细菌中得到的RNA利用逆转录反应制成cDNA。本发明中的逆转录反应方法没有特别限定，可使用已知的方法。在后述实施例中使用的Promega公司制M-MLV Reverse Transcriptase,RNase(H-),Point Mutant是可合适地使用的逆转录反应方法的一例。
添加至第一反应体系的RNA及RNA依赖型DNA聚合酶的量没有特别限定，选择能合成目标cDNA的量即可。
＜逆转录用引物＞
逆转录用引物被用于通过逆转录反应合成包含用于鉴定细菌的碱基序列的cDNA的用途。逆转录用引物没有特别限制，只要是能合成下述cDNA(片段)的引物即可，所述cDNA(片段)包含与从试样中的细菌中提取的RNA中的细菌鉴定所需要的碱基序列互补的碱基序列。可以使用认为能合成包含用于鉴定细菌的碱基序列的DNA的、已知或者新制备的引物。另外，也可以利用市售的引物。
作为用于鉴定细菌的碱基序列，16S rDNA中有许多碱基序列是已知的，优选利用与16S rDNA对应的16S rRNA作为用于鉴定细菌的RNA。
将细菌的16S rRNA作为靶标的情况下，作为逆转录用引物，可以使用与16S rRNA的cDNA的合成的起始位置互补的已知的引物、新制备的引物，所述cDNA包含能用于鉴定细菌的区域。另外，也可以利用市售的引物。
需要说明的是，以利用逆转录用引物合成的cDNA具有能利用后述的用于鉴定细菌的引物对进行扩增的区域的方式来选择逆转录用引物是优选的。
作为特别优选的逆转录用引物的例子，可举出包含以下的序列号1的碱基序列的引物。
序列号1：AGACCCGGGA ACGTATTC
添加至第一反应体系的逆转录用引物的量可进行调节，以使得其为作为目标的逆转录反应中所需要的量、并且添加使用了第一反应体系的逆转录反应的反应混合物的第二反应体系中的逆转录用引物的浓度成为20nM以下。另外，第二反应体系中的逆转录用引物的浓度的下限值为能从RNA以能够检测、鉴定试样中存在的细菌的程度合成cDNA的程度的浓度。从上述观点考虑，第二反应体系的逆转录用引物的浓度可以以使其成为优选0.08nM～20nM、更优选0.4nM～20nM、进一步优选0.8nM～20nM、更进一步优选2nM～20nM的范围的方式进行调节。
该逆转录用引物的量的调节可利用以下的方法。
(A)将通过基于第一反应体系的逆转录反应得到的反应混合物直接单独用于基于第二反应体系的PCR的情况
算出相对于第一反应体系中得到的反应混合物的量与含有该反应混合物的第二反应体系的量的总量而言的、来自反应混合物的逆转录用引物的引入浓度。但是，在该浓度的计算中不考虑在逆转录反应中被消耗的逆转录用引物的量。因此，在该浓度的计算中使用的逆转录用引物的量基于添加至第一反应体系的逆转录引物的量而求出。以如此算出的被引入至第二反应体系的逆转录用引物的浓度成为上述的范围的方式，设定添加至第一反应体系的逆转录用引物的浓度。
优选基于如上所述地设定的第一反应体系的逆转录用引物的浓度，以能进行作为目标的逆转录反应的方式设定第一反应体系的组成、逆转录反应的条件。
例如，相对于由第一反应体系得到的反应混合物的量而言，第二反应体系的量为10倍量的情况下，将添加至第一反应体系的逆转录用引物的浓度设定为第二反应体系中含有的逆转录用引物的浓度的10倍即可。将第二反应体系中的逆转录用引物的浓度设定为作为上述优选范围的0.08nM～20nM的情况下，将第一反应体系中的逆转录用引物的浓度设定为0.8nM～200nM的范围。
需要说明的是，通过将逆转录用引物浓度设为较之逆转录反应所需要的量而言充分过量，从而即使在上述的逆转录用引物向第二反应体系的引入量的计算中不考虑在逆转录反应中被消耗的引物的量，仍然能够近似地算出该引入量。
另外，本发明的特征在于，将被引入第二反应体系的逆转录用引物的量的上限值设为用于得到本发明的效果的阈值。通过预先如上述那样在不考虑逆转录反应中被消耗的引物的量的情况下设定添加至第一反应体系的逆转录用引物的浓度，减去逆转录反应中的消耗份量后的逆转录用引物向第二反应体系的引入量自动成为上述阈值以下。
上述的调节方法(A)中，通过逆转录反应得到的反应混合物直接单独、即在不添加任何物质并且不从反应混合物中分离任何物质的情况下保持原样而直接用于第二反应体系的制备。
(B)将通过基于第一反应体系的逆转录反应得到的反应混合物进行稀释而用于基于第二反应体系的PCR的情况
使用了进行作为目标的逆转录反应所需要的逆转录用引物的浓度时，按照上述的调节方法(A)将通过逆转录反应得到的反应混合物用于第二反应液的制备后、逆转录用引物在第二反应体系中的浓度大于20nM的情况下，以成为上述的第二反应体系中的逆转录用引物的浓度的方式将由第一反应体系得到的反应产物稀释。该稀释中的稀释率可基于第一反应体系中的逆转录用引物的浓度、由第一反应体系得到的反应混合物的量、第二反应体系的量来设定。
需要说明的是，在该调节方法(B)中的逆转录用引物的浓度的计算中，也可忽视在基于第一反应体系的逆转录反应中被消耗的引物的量。
另外，在反应混合物的稀释中，可以利用用于稀释引物溶液的缓冲液等液体介质、用于PCR的第二反应体系的制备中所用的缓冲液等液体介质。
＜用于PCR的引物＞
作为用于PCR的引物对、即正向引物和反向引物的组合，只要是能扩增包含用于鉴定细菌的碱基序列的双链DNA的引物对即可，没有限定。引物对可根据鉴定对象细菌的菌种而选择。
将细菌的16S rDNA作为靶标的情况下，作为细菌鉴定用途而言，可以利用能扩增存在于16S rDNA中的用于鉴定细菌的碱基序列的引物对。16S rDNA中各种用于鉴定细菌的碱基序列是已知的，作为引物对，可以使用能扩增包含已知的用于鉴定细菌的碱基序列的双链DNA的引物对。
如后文所述，通过PCR从cDNA扩增多个DNA片段、基于这些DNA片段的Tm值鉴定细菌的情况下，优选使用扩增各自包含存在于16S rDNA上的可变区(参见S.Chakravorty等，Journal of Microbiological Methods 2007,69,330-339)的双链DNA的引物对。
用于PCR的引物对可使用1种或多种的组合。使用多种的引物组的情况下，基于增加鉴定菌种的数量、或者基于实现鉴定精度提高的目的，优选分别各自使用4～7种引物对。
作为优选的引物对，可举出选自由以下的(A组)～(C组)组成的组中的至少1对引物对。
(A组)
·引物对1a：包含序列号2的碱基序列的正向引物和包含序列号3的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对2a：包含序列号4的碱基序列的正向引物和包含序列号5的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对3a：包含序列号6的碱基序列的正向引物和包含序列号7的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对4a：包含序列号8的碱基序列的正向引物和包含序列号9的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对5a：包含序列号10的碱基序列的正向引物和包含序列号11的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对6a：包含序列号12的碱基序列的正向引物和包含序列号13的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对7a：包含序列号14的碱基序列的正向引物和包含序列号15的碱基序列的反向引物的组合。
(B组)对前述(A组)的各引物对中的一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的包含修饰正向引物和/或修饰反向引物的引物对；及
(C组)包含与前述(A组)或(B组)的各引物对中的一条或两条引物的碱基序列对应的互补序列的引物对。
作为上述的PCR用引物的具体例，可举出以下的第1组～第7组中记载的引物对。更优选分别各自使用从这7个组中的各组中选择的7个引物对之中的4～7个引物对。
(1)引物对第1组：
(1a)包含序列号2的碱基序列的正向引物和包含序列号3的碱基序列的反向引物的组合；
(1b-1)引物对，其包含下述修饰正向引物和反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号2的修饰碱基序列，所述反向引物包含序列号3。
(1b-2)引物对，其包含下述正向引物和修饰反向引物的组合，所述正向引物包含序列号2，所述修饰反向引物包含序列号3的修饰碱基序列。
(1b-3)引物对，其包含下述修饰正向引物和修饰反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号2的修饰碱基序列，所述修饰反向引物包含序列号3的修饰碱基序列。
(1c-1)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号2的互补序列，所述反向引物包含序列号3的互补序列。
(1c-2)引物对，其包含下述修饰正向引物和反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号2的修饰碱基序列的互补序列，所述反向引物包含序列号3的互补序列。
(1c-3)引物对，其包含下述正向引物和修饰反向引物的组合，所述正向引物包含序列号2的互补序列，所述修饰反向引物包含序列号3的修饰碱基序列的互补序列。
(1c-4)引物对，其包含下述修饰正向引物和修饰反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号2的修饰碱基序列的互补序列，所述修饰反向引物包含序列号3的修饰碱基序列的互补序列。
(2)引物对第2组：
(2a)包含序列号4的碱基序列的正向引物和包含序列号5的碱基序列的反向引物的组合；
(2b-1)引物对，其包含下述修饰正向引物和反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号4的修饰碱基序列，所述反向引物包含序列号5。
(2b-2)引物对，其包含下述正向引物和修饰反向引物的组合，所述正向引物包含序列号4，所述修饰反向引物包含序列号5的修饰碱基序列。
(2b-3)引物对，其包含下述修饰正向引物和修饰反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号4的修饰碱基序列，所述修饰反向引物包含序列号5的修饰碱基序列。
(2c-1)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号4的互补序列，所述反向引物包含序列号5的互补序列。
(2c-2)引物对，其包含下述修饰正向引物和反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号4的修饰碱基序列的互补序列，所述反向引物包含序列号5的互补序列。
(2c-3)引物对，其包含下述正向引物和修饰反向引物的组合，所述正向引物包含序列号4的互补序列，所述修饰反向引物包含序列号5的修饰碱基序列的互补序列。
(2c-4)引物对，其包含下述修饰正向引物和修饰反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号4的修饰碱基序列的互补序列，所述修饰反向引物包含序列号5的修饰碱基序列的互补序列。
(3)引物对第3组：
(3a)包含序列号6的碱基序列的正向引物和包含序列号7的碱基序列的反向引物的组合；
(3b-1)引物对，其包含下述修饰正向引物和反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号6的修饰碱基序列，所述反向引物包含序列号7。
(3b-2)引物对，其包含下述正向引物和修饰反向引物的组合，所述正向引物包含序列号6，所述修饰反向引物包含序列号7的修饰碱基序列。
(3b-3)引物对，其包含下述修饰正向引物和修饰反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号6的修饰碱基序列，所述修饰反向引物包含序列号7的修饰碱基序列。
(3c-1)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号6的互补序列，所述反向引物包含序列号7的互补序列。
(3c-2)引物对，其包含下述修饰正向引物和反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号6的修饰碱基序列的互补序列，所述反向引物包含序列号7的互补序列。
(3c-3)引物对，其包含下述正向引物和修饰反向引物的组合，所述正向引物包含序列号6的互补序列，所述修饰反向引物包含序列号7的修饰碱基序列的互补序列。
(3c-4)引物对，其包含下述修饰正向引物和修饰反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号6的修饰碱基序列的互补序列，所述修饰反向引物包含序列号7的修饰碱基序列的互补序列。
(4)引物对第4组：
(4a)包含序列号8的碱基序列的正向引物和包含序列号9的碱基序列的反向引物的组合；
(4b-1)引物对，其包含下述修饰正向引物和反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号8的修饰碱基序列，所述反向引物包含序列号9。
(4b-2)引物对，其包含下述正向引物和修饰反向引物的组合，所述正向引物包含序列号8，所述修饰反向引物包含序列号9的修饰碱基序列。
(4b-3)引物对，其包含下述修饰正向引物和修饰反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号8的修饰碱基序列，所述修饰反向引物包含序列号9的修饰碱基序列。
(4c-1)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号8的互补序列，所述反向引物包含序列号9的互补序列。
(4c-2)引物对，其包含下述修饰正向引物和反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号8的修饰碱基序列的互补序列，所述反向引物包含序列号9的互补序列。
(4c-3)引物对，其包含下述正向引物和修饰反向引物的组合，所述正向引物包含序列号8的互补序列，所述修饰反向引物包含序列号9的修饰碱基序列的互补序列。
(4c-4)引物对，其包含下述修饰正向引物和修饰反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号8的修饰碱基序列的互补序列，所述修饰反向引物包含序列号9的修饰碱基序列的互补序列。
(5)引物对第5组：
(5a)包含序列号10的碱基序列的正向引物和包含序列号11的碱基序列的反向引物的组合；
(5b-1)引物对，其包含下述修饰正向引物和反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号10的修饰碱基序列，所述反向引物包含序列号11。
(5b-2)引物对，其包含下述正向引物和修饰反向引物的组合，所述正向引物包含序列号10，所述修饰反向引物包含序列号11的修饰碱基序列。
(5b-3)引物对，其包含下述修饰正向引物和修饰反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号10的修饰碱基序列，所述修饰反向引物包含序列号11的修饰碱基序列。
(5c-1)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号10的互补序列，所述反向引物包含序列号11的互补序列。
(5c-2)引物对，其包含下述修饰正向引物和反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号10的修饰碱基序列的互补序列，所述反向引物包含序列号11的互补序列。
(5c-3)引物对，其包含下述正向引物和修饰反向引物的组合，所述正向引物包含序列号10的互补序列，所述修饰反向引物包含序列号11的修饰碱基序列的互补序列。
(5c-4)引物对，其包含下述修饰正向引物和修饰反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号10的修饰碱基序列的互补序列，所述修饰反向引物包含序列号11的修饰碱基序列的互补序列。
(6)引物对第6组：
(6a)包含序列号12的碱基序列的正向引物和包含序列号13的碱基序列的反向引物的组合；
(6b-1)引物对，其包含下述修饰正向引物和反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号12的修饰碱基序列，所述反向引物包含序列号13。
(6b-2)引物对，其包含下述正向引物和修饰反向引物的组合，所述正向引物包含序列号12，所述修饰反向引物包含序列号13的修饰碱基序列。
(6b-3)引物对，其包含下述修饰正向引物和修饰反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号12的修饰碱基序列，所述修饰反向引物包含序列号13的修饰碱基序列。
(6c-1)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号12的互补序列，所述反向引物包含序列号13的互补序列。
(6c-2)引物对，其包含下述修饰正向引物和反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号12的修饰碱基序列的互补序列，所述反向引物包含序列号13的互补序列。
(6c-3)引物对，其包含下述正向引物和修饰反向引物的组合，所述正向引物包含序列号12的互补序列，所述修饰反向引物包含序列号13的修饰碱基序列的互补序列。
(6c-4)引物对，其包含下述修饰正向引物和修饰反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号12的修饰碱基序列的互补序列，所述修饰反向引物包含序列号13的修饰碱基序列的互补序列。
(7)引物对第7组：
(7a)包含序列号14的碱基序列的正向引物和包含序列号15的碱基序列的反向引物的组合；
(7b-1)引物对，其包含下述修饰正向引物和反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号14的修饰碱基序列，所述反向引物包含序列号15。
(7b-2)引物对，其包含下述正向引物和修饰反向引物的组合，所述正向引物包含序列号14，所述修饰反向引物包含序列号15的修饰碱基序列。
(7b-3)引物对，其包含下述修饰正向引物和修饰反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号14的修饰碱基序列，所述修饰反向引物包含序列号15的修饰碱基序列。
(7c-1)引物对，其包含下述正向引物和反向引物的组合，所述正向引物包含序列号14的互补序列，所述反向引物包含序列号15的互补序列。
(7c-2)引物对，其包含下述修饰正向引物和反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号14的修饰碱基序列的互补序列，所述反向引物包含序列号15的互补序列。
(7c-3)引物对，其包含下述正向引物和修饰反向引物的组合，所述正向引物包含序列号14的互补序列，所述修饰反向引物包含序列号15的修饰碱基序列的互补序列。
(7c-4)引物对，其包含下述修饰正向引物和修饰反向引物的组合，所述修饰正向引物包含序列号14的修饰碱基序列的互补序列，所述修饰反向引物包含序列号15的修饰碱基序列的互补序列。
序列号2～15的碱基序列如下所示。
序列号2：GCAGGCTTAA CACATGCAAG TCG
序列号3：CGTAGGAGTC TGGACCGT
序列号4：GTCCAGACTC CTACGGGAG
序列号5：CCTACGTATT ACCGCGG
序列号6：AGCAGCCGCG GTAATA
序列号7：GGACTACCAG GGTATCTAAT CCT
序列号8：AACAGGATTA GATACCCTGG TAG
序列号9：AATTAAACCA CATGCTCCAC C
序列号10：TGGTTTAATT CGATGCAACG C
序列号11：GAGCTGACGA CAGCCAT
序列号12：GTTAAGTCCC GCAACGAG
序列号13：CCATTGTAGC ACGTGTGTAG CC
序列号14：GGCTACACAC GTGCTACAAT GG
序列号15：AGACCCGGGA ACGTATTC
＜用于PCR的试剂＞
对于本发明中为了进行PCR分析而使用的引物对以外的试剂而言，可通过已知的组合使用已知的试剂。作为测定中所需要的试剂，可举出用于PCR的酶、pH缓冲液、dNTP、Mg2+源、通过过滤处理等而进行了纯化的无菌水。另外，在实时PCR分析中，除了上述之外，还需要荧光色素。
＜用于PCR的酶＞
本发明中可使用的用于PCR的酶为DNA依赖型DNA聚合酶，可使用市售的各种酶，尤其在呈阴性的检体成为对象的试验中，优选使用已将成为假阳性的原因的细菌来源的DNA混入量限定为最小限度的DNA依赖型耐热性DNA聚合酶。具体而言，可举出利用真核生物生产的酶、经高度纯化处理的酶、或利用作为选择性的膜透过性色素的EMA(叠氮溴化乙锭，ethidium monoazide)、PMA(叠氮溴化丙锭，propidium monoazide)处理过的酶，但不限于此。
＜PCR分析＞
作为通过逆转录反应得到的反应产物的cDNA及引物对可在PCR法中使用。作为PCR法，只要是用于扩增包含用于鉴定细菌的碱基序列的双链DNA的PCR法即可，可利用各种PCR法。作为优选的分析法，为实时PCR，更优选为实时PCR与用于测定Tm值的熔解曲线分析的组合。
PCR中的温度循环的条件没有特别限定，后述实施例中实施的条件“95℃,5分钟→94℃,10秒·60℃,20秒·72℃,10秒·85℃,2秒实施40个循环→95℃,10秒”为一例。
在实时PCR中，在DNA扩增工序结束后，通过熔解曲线分析，可测定扩增的DNA的Tm值。这样的测定可利用实时PCR装置的多种机型进行，可按照仪器的使用方法实施。
＜鉴定方法＞
为了鉴定试样中的细菌，可利用使用本发明涉及的引物对从含有cDNA的反应混合物得到的扩增产物中所含的双链DNA片段的Tm值。
作为优选的鉴定方法，可举出以下的方法。
首先，使用认为试样中可能含有的复数种、优选多种细菌的16S rRNA或16S rDNA，通过本发明涉及的鉴定方法、或者通过利用了本发明涉及的方法的一部分的方法，预先获得双链DNA片段和其Tm值，获得并保存这些Tm值(测定值本身)、或由测得的Tm值二次得到的数据。例如，将后述的“Tm值的相对值”以比较数据或者数据库的形式保存。该比较数据是预先获得从已知细菌得到的双链DNA片段的“Tm值的相对值”而得到的数据。另外，该比较数据的数据库存放了针对来自多种细菌的双链DNA片段的上述比较数据综合地获得的数据。
然后，将从试样中的细菌得到的Tm值或者“Tm值的相对值”、与该被保存的比较数据或者数据库进行比较，从而能够鉴定试样中的菌种不明的细菌。
作为用于进行鉴定的算法(algorithm)，可添加以下工序：不仅利用上述的Tm值本身的组合，而且还利用各Tm值间的差的组合而进行鉴定，由此，例如可使每次试运行仪器而导致的测定误差这样的测定误差的影响成为最低限度。
作为修正上述的每次试运行仪器而导致的测定误差的方法，可算出针对多个引物对中每一对得到的“Tm值的组合的平均值”，利用由该平均值得到的各Tm值的“相对值的组合”。作为该相对值，可以使用获取各Tm值与平均值之差而得到的值，该相对值为前述的“Tm值的相对值”。即，将Tm值的组合的配置作为“形”而进行鉴定的方法。以二维示出Tm值的组合的配置的“形”不受测定误差影响。例如，将检测细菌特异性的Tm值的组合(n个(n为4以上且7以下的整数))记为T1db～Tndb(db为database)，将由其平均值得到的相对值分别记为d1db～dndb。同样地，将从检体得到的未知的检测对象生物的Tm值的组合(n个(n为4以上且7以下的整数))记为T1ref～Tnref(ref为reference)，将由其平均值得到的相对值分别记为d1ref～dnref。这样，与database进行比较，将“相对值的组合近似的＝Tm值的组合的配置的“形”接近的”作为鉴定算法进行利用。
作为具体的计算方法，例如，可举出算出欧几里得空间上的2点间距离的方法(式1)，但不限于此。
[式1]
若为基于式1的计算方法，则将通过该计算式得到的Dist.值最接近0的菌种鉴定为所寻找的检测细菌菌种。但是，考虑到使用的PCR仪器的测定误差，虽然也取决于仪器的温度控制规格、引物的数目，但作为Dist.值的容许范围，为0～0.37，优选为0～0.30。
以上的算法可在计算机上以数据库型鉴定软件的形式利用。
使用了上述的Tm值的相对值的细菌菌种的鉴定、即基于Tm作图法的细菌菌种的鉴定可以按照例如专利文献2、国际公开2010/082640号的[0237]段或国际公开2015/053293号的[0111]～[0116]段中公开的方法、或者将它们所公开的方法适当变更而实施。在基于Tm作图法的细菌菌种的鉴定的一例中，可利用与使用从菌种已知的细菌得到的多个特定的引物对扩增的多个扩增产物的Tm值的组合、或者多个Tm值间的差的组合相关的鉴定用数据。将从自检体收集的未知的菌体试样利用相同的多个引物对得到的扩增产物的Tm值的组合、或者Tm值间的差的组合与鉴定用数据库进行比对，判断其一致性，鉴定检体中的未知的细菌。
＜用于鉴定细菌的试剂盒＞
本发明涉及的用于鉴定细菌的试剂盒具有前述的以下(a)至(c)的各构成成分。
(a)用于制备用于逆转录反应的第一反应体系的逆转录用引物，所述引物用于制备包含用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的cDNA。
(b)用于制备用于PCR的第二反应体系的引物对，所述引物对用于合成包含用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA。
(c)用于制备第一反应体系的、具有RNA依赖型DNA聚合酶活性的酶。
除了这些构成成分以外，可还具有以下的(d)。
(d)用于制备第二反应体系的、具有DNA依赖型DNA聚合酶活性的酶。
此外，可以在试剂盒中附有记载有逆转录反应和PCR的步骤、例如关于前文中列举的工序(I)～(III)的步骤的操作说明书。
另外，该操作说明书中优选记载了步骤(例如，前文中列举的调节方法(A)及(B))以使得第二反应体系中含有的逆转录用引物的浓度成为20nM以下、优选0.08nM～20nM、更优选0.4nM～20nM、进一步优选0.8nM～20nM、进一步优选2nM～20nM。
操作说明书中可以包含可在不同的反应容器内、或者在相同的反应容器内依次实施使用了第一反应体系的反应和使用了第二反应体系的反应的内容的说明。
用于鉴定细菌的试剂盒可具有前文＜用于PCR的试剂＞一项中列举的各试剂、例如用于PCR的酶、pH缓冲液、dNTP、Mg2+源、通过过滤处理等而进行了纯化的无菌水、以及用于实时PCR分析的萤光色素等中的至少1种。此外，使用前文中列举的Tm值鉴定细菌菌种的情况下，可向试剂盒中添加存放有从已知的细菌菌种得到的Tm值、或者比较数据或数据库的介质。另外，可经由因特网向使用者提供这些存放数据，操作说明书也可包括这一内容的说明、关于前文中列举的可在计算机上利用的数据库型鉴定软件的说明。
另外，试剂盒可还包含用于鉴定的阳性对照、阴性对照。
＜可鉴定的细菌菌种＞
对于可鉴定的微生物而言，只要是在分类上属于细菌的微生物，在原理上就可以进行检测及细菌菌种的鉴定。作为具体的细菌菌种，可举出脱硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、衣氏放线菌(Actinomyces israelii)、Aerococcus christensenii、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、伴放线菌聚集菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、Alistipes onderdonkii、Anaerococcus vaginalis、Anaeroglobus geminatus、溶血隐秘杆菌(Arcanobacterium haemolyticum)、化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)、卡氏节杆菌(Arthrobacter cumminsii)、阴道阿托波氏菌(Atopobium vaginae)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Bacteroides dorei、Bacteroides finegoldii、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、Bacteroides nordii、Bacteroides salyersiae、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)、汉塞巴尔通体(Bartonella henselae)、五日热巴尔通体(Bartonella quintana)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)、沃氏嗜胆菌(Bilophila wadsworthia)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)、流产布鲁氏杆菌(Brucella abortus)、马尔他布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏杆菌(Brucella suis)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、曲形弯曲杆菌(Campylobacter curvus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、直肠弯曲杆菌(Campylobacter rectus)、牙龈二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga gingivalis)、颗粒二氧化碳噬纤维菌(Capnocytophaga granulosa)、溶血二氧化碳噬纤维菌(Capnocytophaga haemolytica)、生痰二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga sputigena)、人心杆菌(Cardiobacterium hominis)、脑膜脓毒性金黄杆菌(Chryseobacterium meningosepticum)、非丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacteramalonaticus)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri)、酪酸梭状芽胞杆菌(Clostridium butyricum)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridiumdifficile)、溶组织棱状芽胞杆菌(Clostridium histolyticum)、Clostridiumhylemonae、副腐化梭状芽胞杆菌(Clostridium paraputrificum)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)、败血梭状芽胞杆菌(Clostridium septicum)、产芽胞梭状芽胞杆菌(Clostridium sporogenes)、偏端梭状芽胞杆菌(Clostridium subterminale)、第三梭状芽胞杆菌(Clostridium tertium)、破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)、无枝菌酸棒杆菌(Corynebacterium amycolatum)、混乱棒状杆菌(Corynebacteriumconfusum)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、解葡萄糖苷棒杆菌(Corynebacterium glucuronolyticum)、(Corynebacterium jeikeium)、杰氏棒状杆菌(Corynebacterium kroppenstedtii)、麦氏棒杆菌(Corynebacterium macginleyi)、微小棒状杆菌(Corynebacterium minutissimum)、假白喉棒状杆菌(Corynebacteriumpseudodiphtheriticum)、假结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)、Corynebacterium riegelii、结核硬脂酸棒状杆菌(Corynebacteriumtuberculostearicum)、溃疡棒状杆菌(Corynebacterium ulcerans)、结膜干燥棒状杆菌(Corynebacterium xerosis)、迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)、迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)、啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)、脑膜炎败血伊丽莎白金菌(Elizabethkingia meningoseptica)、短稳杆菌(Empedobacter brevis)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、牛肠球菌(Enterococcus bovis)、铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)、盲肠肠球菌(Enterococcus cecorum)、殊异肠球菌(Enterococcusdispar)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、黄色肠球菌(Enterococcus flavescens)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)、Enterococcus gilvus、海氏肠球菌(Enterococcus hirae)、意大利肠球菌(Enterococcusitalicus)、病臭肠球菌(Enterococcus malodoratus)、蒙氏肠球菌(Enterococcusmundtii)、苍白肠球菌(Enterococcus pallens)、假鸟肠球菌(Enterococcuspseudoavium)、棉子糖肠球菌(Enterococcus raffinosus)、Enterococcus sanguinicola、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、艾伯特埃希菌(Escherichiaalbertii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、迟缓真杆菌(Eubacterium lentum)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、牙周梭杆菌(Fusobacterium periodonticum)、变形梭杆菌(Fusobacterium varium)、阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)、麻疹孪生球菌(Gemella morbillorum)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、毗邻颗粒链菌(Granulicatella adiacens)、杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、中度嗜盐菌(Halomonas venusta)、同性恋螺杆菌(Helicobactercinaedi)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、金氏金菌(Kingella kingae)、肉芽肿杆菌(Klebsiella granulomatis)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)、侵肺军团菌(Legionella pneumophila)、肾脏钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、滕黄微球菌(Micrococcus luteus)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、生殖器支原体(Mycoplasma genitalium)、人支原体(Mycoplasma hominis)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、Nocardiacyriacigeorgica、内脏臭气杆菌(Odoribacter splanchnicus)、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)、吉氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)、Parvimonas micra、出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、有害片球菌(Pediococcus damnosus)、不解糖嗜胨菌(Peptoniphilus asaccharolyticus)、Peptoniphilus gorbachii、厌氧消化链球菌(Peptostreptococcus anaerobius)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonas asaccharolytica)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、二路普雷沃氏菌(Prevotella bivia)、二路普雷沃氏菌(Prevotellabivia)、人体普氏菌(Prevotella corporis)、中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)、产黑色素类杆菌(Prevotella melaninogenica)、变黑普雷沃氏菌(Prevotellanigrescens)、Prevotella timonensis、真口普氏菌(Prevotella veroralis)、疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、贪婪丙酸杆菌(Propionibacterium avidum)、颗粒丙酸杆菌(Propionibacterium granulosum)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、龋齿罗氏菌(Rothiadentocariosa)、黏液罗氏菌(Rothia mucilaginosa)、肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、普城沙雷菌(Serratia plymuthica)、鲍氏志贺菌(Shigella boydii)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、鼠咬热螺旋体(Spirillumminus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耳葡萄球菌(Staphylococcusauricularis)、头葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、山羊葡萄球菌(Staphylococcuscaprae)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、科氏葡萄球菌(Staphylococcuscohnii)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、路邓葡萄球菌(Staphylococcuslugdunensis)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)、Staphylococcuspettenkoferi、普氏葡萄球菌(Staphylococcus pulvereri)、解糖葡萄球菌(Staphylococcus saccharolyticus)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、施氏葡萄球菌(Staphylococcus schleiferi)、模仿葡萄球菌(Staphylococcussimulans)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、狗链球菌(Streptococcus canis)、星座链球菌(Streptococcus constellatus)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、马链球菌(Streptococcus equi)、解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)、婴儿链球菌(Streptococcus infantarius)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、巴黎链球菌(Streptococcus lutetiensis)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、猪链球菌(Streptococcus porcinus)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、猪链球菌(Streptococcus suis)、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)、微小脲原体(Ureaplasma parvum)、河流漫游球菌(Vagococcusfluvialis)、非典型韦荣氏球菌(Veillonella atypica)、(Veillonella parvula)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、河流孤菌(Vibriofluvialis)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)等，但不限于这些。
实施例
(制造例1)
本发明中使用的DNA聚合酶是使用专利文献1的0195～0205段中记载的方法生产的。
(制造例2)
本发明中使用的三井化学制数据库是使用专利文献2的0022～0030段中记载的方法制成的。
(微生物株)
以下的实施例中使用的MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)：JMC16555株(商品目录编号)、大肠杆菌(Escherichia coli)：JCM1649T(商品目录编号)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)：JCM5962T株(商品目录编号)均可通过公共渠道自理化学研究所生物资源中心微生物材料开发室(JCM)(地址：〒305-0074茨城县筑波市高野台3-1-1)获得。
(实施例1)
将MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，Methicillin-resistant Staphylococcusaureus)接种于LB琼脂培养基，于30℃培养一夜，菌落形成后于4℃保存。将菌落接种于2ml的LB液体培养基，于30℃以180rpm振荡培养16小时。关于培养液，使用CytoFLEX(BeckmanCoulter)测量细菌数量，确定原液的细菌浓度。
使用1×PBS，将上述中得到的MRSA培养液的原液以每200μl的细菌数量成为100CFU、500CFU、1,000CFU、5,000CFU、10,000CFU的方式稀释。将各稀释培养液200μl加入至病原体裂解管(Pathogen Lysis Tubes)(Qiagen)。进一步加入制品附带的Reagent DX 100μl、及高纯度RNA分离试剂盒(Roche)附带的Lysis/-Binding Buffer 400μl，安装于DELTAMIXER Se-08(Titec)，涡旋10分钟。
将高纯度RNA分离试剂盒(Roche)附带的柱安装于储液筒(reservoir)，将上述细菌破碎液的上清液550μl移至柱中，使用台式微量高速离心机CT15E(日立工机)以8,000×g离心1分钟。将柱安装于新的储液筒后，加入高纯度RNA分离试剂盒(Roche)附带的洗涤缓冲液(Wash Buffer)I 500μl，以8,000×g离心1分钟。再次将柱安装于新的储液筒，加入高纯度RNA分离试剂盒(Roche)附带的洗涤缓冲液(Wash Buffer)II 500μl，以8,000×g离心1分钟。将柱安装于新的储液筒，加入高纯度RNA分离试剂盒(Roche)附带的洗涤缓冲液(WashBuffer)II 200μl，以13,000×g离心2分钟。将柱安装于新的1.5ml的Eppendorf管，加入高纯度RNA分离试剂盒(Roche)附带的洗脱缓冲液(Elution Buffer)50μl，以8,000×g离心1分钟，回收RNA溶液。
将回收的RNA溶液10.75μl、和0.005μM～100μM的各浓度的逆转录用引物(包含序列号1的碱基序列)(invitrogen)1μl混合，于70℃孵育5分钟，然后于4℃孵育5分钟。用于逆转录反应的第一反应体系中的逆转录用引物的最终浓度为0.2nM～4000nM。孵育后，向RNA和逆转录用引物的混合物中加入M-MLV Reverse Transcriptase,RNase(H-),PointMutant(Promega)附带的M-MLV RT(H-)Point Mutant 1μl及M-MLV RT 5×ReactionBuffer 5μl、dNTP(NIPPON GENE)6.25μl、RNase Inhibitor Recombinant type(ToYoBo)0.2μl、1×PBS 0.8μl，得到第一反应体系(溶液)。将得到的第一反应体系于50℃孵育20分钟，由此得到含有合成的cDNA的液状的反应混合物。
将如此得到的反应混合物中的cDNA(2μl)作为模板实施PCR。逆转录反应时为0.2nM～4000nM的逆转录用引物在用于PCR的第二反应体系(溶液)中的最终浓度为0.02nM～400nM。作为用于PCR的第二反应体系的PCR溶液包含：10×Buffer(NIPPON GENE)2μl、2.0mM CleanAMP TMHot Start PCR(TriLink)2μl、25mM MgCl2(NIPPON GENE)2μl、5μM用于PCR的引物对(invitrogen)1.2μl、1U/μl DNA聚合酶(使用专利文献1的0195～0205段中记载的方法生产)1μl、Evagreen(Biotium)1μl、DW(Nacalai Tesque)8.8μl。
需要说明的是，作为用于PCR的引物对，分别各自使用以下的引物对。
·引物对1a：包含序列号2的碱基序列的正向引物和包含序列号3的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对2a：包含序列号4的碱基序列的正向引物和包含序列号5的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对3a：包含序列号6的碱基序列的正向引物和包含序列号7的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对4a：包含序列号8的碱基序列的正向引物和包含序列号9的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对5a：包含序列号10的碱基序列的正向引物和包含序列号11的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对6a：包含序列号12的碱基序列的正向引物和包含序列号13的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对7a：包含序列号14的碱基序列的正向引物和包含序列号15的碱基序列的反向引物的组合。
制备PCR溶液后，将PCR管安装于Rotor-Gene Q(Qiagen)，实施实时PCR。PCR的反应条件设为：95℃,5分钟→94℃,10秒·60℃,20秒·72℃,10秒·85℃,2秒实施40个循环→95℃,10秒。根据由分析数据得到的各PCR产物的Tm值(熔解温度)，与三井化学制数据库(使用专利文献2的0022～0030段中记载的方法制备)进行比对，由此鉴定细菌。
通过上述记载的方法鉴定的结果示于表1。需要说明的是，表1中的评价如下所述地实施。
〇：能鉴定
△：能鉴定，但峰不清晰
×：无法鉴定
―：未实施试验
另外，针对添加的引物浓度为2、5、10μM的100CFU的PCR产物实施了琼脂糖凝胶电泳，并将结果示于图1。图1(A)为针对添加的逆转录用引物浓度为2μM时的PCR产物实施琼脂糖凝胶电泳的结果。图1(B)为针对添加的逆转录用引物浓度为5μM时的PCR产物实施琼脂糖凝胶电泳的结果。图1(C)为针对添加的逆转录用引物浓度为10μM时的PCR产物实施琼脂糖凝胶电泳的结果。需要说明的是，图1(A)～(C)的编号表示的各泳道示出以下的产物及化合物的电泳的结果。
(1)引物对1a的PCR产物
(2)引物对2a的PCR产物
(3)引物对3a的PCR产物
(4)引物对4a的PCR产物
(5)引物对5a的PCR产物
(6)引物对6a的PCR产物
(7)引物对7a的PCR产物
(8)标记(marker)
[表1]
如表1所示，可知在各菌数的情况下，是否能够鉴定细菌均依赖于逆转录用引物浓度。
另外还可知，通过适当调节反应条件，即使菌数少也能够充分地以良好的灵敏度进行鉴定。
(实施例2)
使用大肠杆菌(E.coli)，针对引物浓度和菌数进行了研究。除了将大肠杆菌作为细菌以外，与实施例1相同。鉴定结果示于表2。另外，琼脂糖凝胶电泳的结果示于图2。图2(A)～(C)与图1同样地分别示出添加的逆转录用引物溶液的引物浓度为2μM、5μM、10μM的情况下的琼脂糖凝胶电泳的结果。需要说明的是，图2(A)～(C)的编号表示的各泳道示出以下的产物及化合物的电泳的结果。
·图2(A)
(1)标记
(2)引物对1a的PCR产物
(3)引物对2a的PCR产物
(4)引物对3a的PCR产物
(5)引物对4a的PCR产物
(6)引物对5a的PCR产物
(7)引物对6a的PCR产物
(8)引物对7a的PCR产物
·图2(B)
(1)标记
(2)引物对1a的PCR产物
(3)引物对2a的PCR产物
(4)引物对3a的PCR产物
(5)引物对4a的PCR产物
(6)引物对5a的PCR产物
(7)引物对6a的PCR产物
(8)引物对7a的PCR产物
(9)标记
·图2(C)
(1)引物对1a的PCR产物
(2)引物对2a的PCR产物
(3)引物对3a的PCR产物
(4)引物对4a的PCR产物
(5)引物对5a的PCR产物
(6)引物对6a的PCR产物
(7)引物对7a的PCR产物
(8)标记
[表2]
如表2所示，可知在各菌数的情况下，是否能够鉴定细菌均依赖于逆转录用引物浓度。
另外还可知，通过适当调节反应条件，即使菌数少也能够充分地以良好的灵敏度进行鉴定。
(实施例3)
使用绿脓杆菌(P.aeruginosa)，针对引物浓度和菌数进行了研究。除了将绿脓杆菌作为细菌以外，与实施例1相同。鉴定结果示于表3。另外，琼脂糖凝胶电泳的结果示于图3。图3(A)～(C)与图1同样地分别示出添加的逆转录用引物溶液的引物浓度为2μM、5μM、10μM的情况下的琼脂糖凝胶电泳的结果。需要说明的是，图3(A)～(C)的编号表示的各泳道示出以下的产物及化合物的电泳的结果。
·图3(A)
(1)标记
(2)引物对1a的PCR产物
(3)引物对2a的PCR产物
(4)引物对3a的PCR产物
(5)引物对4a的PCR产物
(6)引物对5a的PCR产物
(7)引物对6a的PCR产物
(8)引物对7a的PCR产物
(9)标记
·图3(B)及(C)
(1)引物对1a的PCR产物
(2)引物对2a的PCR产物
(3)引物对3a的PCR产物
(4)引物对4a的PCR产物
(5)引物对5a的PCR产物
(6)引物对6a的PCR产物
(7)引物对7a的PCR产物
(8)标记
[表3]
如表3所示，可知在各菌数的情况下，是否能够鉴定细菌均依赖于逆转录用引物浓度。
另外还可知，通过适当调节反应条件，即使菌数少也能够充分地以良好的灵敏度进行鉴定。
(实施例4)
使用实施例1中所用的MRSA，确认本方法中的检测灵敏度。将每1个检体的菌数设为20CFU、40CFU，使用1μM的引物浓度的逆转录用引物溶液，将第二反应体系中的逆转录用引物的最终浓度设为4nM，除此以外，与实施例1同样地实施鉴定试验。针对引物对1a～7a，得到的Tm值及鉴定结果示于表4。
[表4]
表4:检测灵敏度试验结果
产业上的可利用性
利用本发明的方法，能够迅速地检测·鉴定感染症病原菌、尤其是败血症的病原菌，实现败血症的迅速诊断方法。
即，通过本发明，能够构建通过1次PCR来鉴定病原菌的系统，因此能够减轻作业负担，实现检查的全自动化。
Claims (7)
1.细菌鉴定方法，其不是诊断方法或治疗方法，其特征在于，具有以下的工序(1)～(3)：
工序(1)，使用下述第一反应体系进行逆转录反应，得到含有合成的cDNA及逆转录用引物的反应混合物，所述第一反应体系含有：所述逆转录用引物，其用于制备包含用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的cDNA；从试样中的细菌中提取的RNA；及具有RNA依赖型DNA聚合酶活性的酶；
工序(2)，使用下述第二反应体系实施PCR，所述第二反应体系含有：所述反应混合物；引物对，其用于合成包含所述用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA；及具有DNA依赖型DNA聚合酶活性的酶，其中，第二反应体系中，由所述反应混合物供给的所述逆转录用引物的浓度为0.08nM以上且20nM以下；及
工序(3)，从PCR后的所述第二反应体系中，检测包含所述用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA的生成。
2.如权利要求1所述的细菌鉴定方法，其特征在于，在不同的反应容器内、或者在相同的反应容器内依次实施所述工序(1)及(2)。
3.如权利要求1或2所述的细菌鉴定方法，其特征在于，所述用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列为细菌的16S rDNA所包含的碱基序列，所述RNA包含所述试样中的细菌的16S rRNA。
4.如权利要求3所述的细菌鉴定方法，其特征在于，所述逆转录用引物包含序列号1的碱基序列。
5.如权利要求3所述的细菌鉴定方法，其特征在于，所述引物对为选自由以下的A组～C组组成的组中的至少1对引物对，
A组：
·引物对1a：包含序列号2的碱基序列的正向引物和包含序列号3的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对2a：包含序列号4的碱基序列的正向引物和包含序列号5的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对3a：包含序列号6的碱基序列的正向引物和包含序列号7的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对4a：包含序列号8的碱基序列的正向引物和包含序列号9的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对5a：包含序列号10的碱基序列的正向引物和包含序列号11的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对6a：包含序列号12的碱基序列的正向引物和包含序列号13的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对7a：包含序列号14的碱基序列的正向引物和包含序列号15的碱基序列的反向引物的组合；
B组：对所述A组的各引物对中的一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对；及
C组：包含与所述A组或B组的各引物对中的一条或两条引物的碱基序列对应的互补序列的引物对。
6.如权利要求1或2所述的细菌鉴定方法，其特征在于，所述工序(3)中，测定生成的双链DNA的Tm值，将得到的Tm值与预先测得的包含用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA的Tm值、或者由它们二次得到的数据进行比较，从而鉴定所述试样中的细菌。
7.如权利要求1或2所述的细菌鉴定方法，其特征在于，在所述工序(1)之后，将所述反应混合物单独地直接用于所述工序(2)，或者将所述反应混合物进行稀释而用于所述工序(2)。
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