JP5383105B2

JP5383105B2 - オリゴヌクレオチド及びこれをプライマーとして用いたバチルス・コアグランスの検出法

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Publication number: JP5383105B2
Application number: JP2008171617A
Authority: JP
Inventors: 章武内
Original assignee: QP Corp
Current assignee: Kewpie Corp
Priority date: 2008-06-30
Filing date: 2008-06-30
Publication date: 2014-01-08
Anticipated expiration: 2028-06-30
Also published as: JP2010004855A

Description

本発明は、オリゴヌクレオチド及びこれをプライマーとして用いたバチルス・コアグランスの検出方法に関する。さらに詳しくは、特定の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法を行い、増幅されたプライマーの伸長物を検出することによりバチルス・コアグランスを特異的に検出する方法に関する。

バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）は、耐熱性のグラム陽性細菌の一種であり、なかでも、缶詰、レトルト製品等の１００℃以上の加熱殺菌が施される容器詰め食品において、フラットサワーを引き起こす細菌として知られている。ここで、フラットサワーとは、容器の外観が正常であるにもかかわらず、内容物が細菌により酸敗している状態をいう。

バチルス・コアグランスによる汚染を確認するためには、検査材料が患者の吐瀉物、糞便、又は食品等の抜き取り材料である場合、一般に、増菌培養、分離培養を経て各種確認試験が行われる。この方法でバチルス・コアグランスによる汚染を確認するまでには、通常、１週間程度が必要である。その際に温度、培地等の環境が適切に調整されていないと培養できない。例えば、バチルス・コアグランスのなかでも培養中の増殖が遅いものは、共存する微生物により増殖が阻害されることがある。さらに、缶詰中でフラットサワーが起きた場合、バチルス・コアグランス自体が産生される酸により死滅し、培養法ではバチルス・コアグランスを検出できない場合もある。このため、バチルス・コアグランスによる汚染の確認試験の操作は、煩雑で熟練を要するものとなっている。

このような状況下、１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（以下１６ＳｒＤＮＡと称する）を標的とするポリメラーゼ連鎖反応法（Polymerase
Chain Reaction、以下ＰＣＲ法と省略する）による迅速検出法が知られており、この検出法を用いてラクトバチルス属の特定の菌種の同定や解析が行われている。
そこで、本出願人は、ＰＣＲ法でバチルス・コアグランスを検出するために新規にプライマーを開発し、バチルス・コアグランスの迅速な検出を可能とした（特許文献１）。

しかしながら、このＰＣＲ法を用いた細菌の検出法は反応を行うために特殊な専用機器を必要とし、最終判定方法には電気泳動法と呼ばれる特殊な手法や、発がん性の懸念される溶液中での染色や、紫外線を照射する装置などが必要となる。また、このＰＣＲ法による検査は、開始から判定まで通常４〜５時間を要することから、食品工業などの現場で用いるためには更に簡便かつ迅速に結果が得られる手法が求められていた。

最近では、ＰＣＲ法に代わる遺伝子増幅法としてＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal
Amplification）法による手法が栄研化学（株）より開発された。この手法は必要とする試薬に特定の遺伝子領域を増幅するためのプライマーを混合し、６５℃付近の一定温度にて１時間程度反応させ、その判定は反応液の濁度により確認可能な方法である。また、この手法は、ＰＣＲ法にみられるような特殊な専用機器を用いる必要はなく、また反応時間も短いため簡便であり、迅速な結果を得られると考えられる。

しかしながら、この手法は、検査対象の細菌に対して特異的に反応するプライマーを独自に開発する必要があるが、バチルス・コアグランスについても特異的なプライマーは未だ発見されていない。
特開２００３−３８１８２号公報

本発明は、このような従来の状況に対し、ＬＡＭＰ法でバチルス・コアグランスを検出するために新規にプライマーを開発し、バチルス・コアグランスを迅速に検出できるようにすることを目的とする。

本発明者は、バチルス・コアグランスにおいて、１６ＳｒＤＮＡ配列が種のレベルで保存されており、他種の株の配列とは異なっている領域を探索し、当該領域の中の特定配列を標的とするプライマーを新規に開発し、そのプライマーをＬＡＭＰ法で用いることによりバチルス・コアグランスを良好に検出できること、または、バチルス属の他種から良好に識別できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、
（１）バチルス・コアグランスの１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドからなる、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal
Amplification）法で用いるプライマーセットであって、配列番号１に示される塩基配列ＦＩＰを含むオリゴヌクレオチド、配列番号２に示される塩基配列ＢＩＰを含むオリゴヌクレオチド、配列番号３に示される塩基配列Ｆ３を含むオリゴヌクレオチド、および配列番号４に示される塩基配列Ｂ３を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも４種のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、バチルス・コアグランス検出用プライマーのセット、
（２）（１）記載の少なくとも４種のオリゴヌクレオチドを含むプライマーのセットにおいて、４種のオリゴヌクレオチドに加え、配列番号５に示される塩基配列ＬＦを含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に示される塩基配列ＬＢを含むオリゴヌクレオチドをさらに加えた少なくとも６種のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、バチルス・コアグランス検出用プライマーのセット、
（３）（１）又は（２）に記載のプライマーのセットを添加し、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal
Amplification）法によりプライマーの伸長反応と標的とするヌクレオチド配列の増幅を行い、そのヌクレオチド配列の増幅を検出することを特徴とする、バチルス・コアグランスの検出方法、
である。

本発明によれば、ＬＡＭＰ法でバチルス・コアグランスを検出するにあたり、高い検出感度と選択性を得ることができる。また試料中に存在する異属及び同属異種の細菌の増殖を考慮にいれる必要がなくなり、熟練を必要とすることなく、迅速かつ簡易にバチルス・コアグランスを検出することができる。

以下、本発明の一実施形態に係る、オリゴヌクレオチドおよびこれをプライマーとして用いたバチルス・コアグランスの検出方法について説明する。

本発明がバチルス・コアグランスの検出のために行うＬＡＭＰ法は、栄研化学（株）が開発したLoop-Mediated Isothermal
Amplification法（特許３３１３３５８号）に基づくものである。

本発明において、バチルス・コアグランスの特定は、標準菌株を用いた場合は、その標準菌株の属名及び種名による。また標準菌株でないものを用いた場合は、常法によりバチルス属細菌特有の形態（グラム陽性桿菌）及び性状（芽胞形成）を確認した後、Bergay’s
Manual of Systematic Bacteriology vol.2により種レベルまで同定した。

なお、Bergay’s Manual of Systematic
Bacteriology vol.2を用いて同定した種名と、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を解析し、データベースと相同性を照合して推定した種名が異なる場合は、本発明では、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列より推定した種名を基準とする。

１６ＳｒＤＮＡ解析による種の具体的な推定方法は、まず、単一コロニーの分離と純粋培養を行った後、ＤＮＡの熱水抽出を行うため、滅菌精製水にコロニーを懸濁し、１００℃で１０分間の湯せんで加熱する。次に、１６ＳｒＲＮＡをコードする全領域に対する共通のプライマーである下記に示す２種のオリゴヌクレオチド[Journal
of Bacteriology, 173 (2), p697-703 (1991)]を用い、
(5´) AGAGTTTGATCATGGCTCAG (3´) （配列番号7）
(5´) GGTTACCTTGTTACGACTT (3´) （配列番号8）
前記単一コロニーの熱水抽出物をＤＮＡの鋳型としてＰＣＲを行った後（細菌で保存性が高い配列部分をプライマーとしているので、未知の細菌であっても１６ＳｒＲＮＡをコードする約１４００塩基対のＤＮＡが増幅される。）、ＰＣＲ産物を電気泳動し、１６ＳｒＲＮＡをコードする約１４００塩基対のＤＮＡの増幅を確認する。次に、ＰＣＲ産物の塩基配列を「ABI
PRISM 3100 Genetic Analyzer（アプライドバイオシステムズジャパン（株）」で解読する。日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）の相同性検索ソフト：ブラスト（BLAST）により、当該塩基配列と相同性の高い塩基配列を検索し、種を推定する。

本発明では、ＬＡＭＰ法によりバチルス・コアグランスを検出するに際して使用するプライマーとして、特定の塩基配列を有する本発明のオリゴヌクレオチド、即ち、バチルス・コアグランスの１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号１〜４に示される塩基配列
ＦＩＰ
(5´) GCCCATCTGTAAGTGYCAGCCAGTTTTTTCCTCCGCATGGA (3´) （配列番号1）
ＢＩＰ
(5´) GGCGCATTAGCTAGTTGGCGGGATCACCCTCTCAGGTCGG (3´) （配列番号2）
Ｆ３
(5´) GATAACGCCGGGAAACCG (3´) （配列番号3）
Ｂ３
(5´) GTGTCTCAGTCCCAATGTGG (3´)
（配列番号4）
のいずれかを含むオリゴヌクレオチドを使用する。

本発明で使用されるプライマーとして、さらに配列番号５、６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを使用することができる。配列番号１〜４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドに加え、配列番号５、６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することにより、ＬＡＭＰ法によるバチルス・コアグランスの検出時間を短縮することができ、検出感度を高めることから、好ましい。
ＬＦ
(5´) AAGCCGCCTTTCCTTTTTCC (3´) （配列番号5）
ＬＢ
(5´) CACCAAGGCAACGATGCG (3´) （配列番号6）

これら配列番号１〜６で示されるオリゴヌクレオチドの配列は、バチルス・コアグランス、及び異属並びに異種の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を詳細に解析した結果、バチルス・コアグランスの異株間に保存され、異属並びに異種と完全に識別される領域を見出すことにより決定されたものである。

本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、ＬＡＭＰ法でバチルス・コアグランスを検出する場合、サンプルヌクレオチド、プライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質等を一緒に一定温度（約６０〜６５℃）で保温することにより、検出まで１ステップの工程で行うことができる。

この反応では鎖置換型ＤＮＡ合成酵素が使用されるが、この酵素は、鎖型ＤＮＡの二本鎖をほどきながらＤＮＡ合成を行うことができる。このため、ＬＡＭＰ法では、ＰＣＲ法のようにあらかじめ二本鎖ＤＮＡを一本鎖に熱変性する必要がない。

本発明のプライマーセットは、約６０〜６５℃においてアニーリングと同時にＤＮＡ鎖の合成も起こす。アニーリング反応およびＤＮＡ鎖合成により約１時間反応を行うことにより、ヌクレオチドを１０^９〜１０^１０倍に増幅させることが可能である。

そのほか、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸がマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、肉眼でも観察できるほど白濁する。この白濁を反応終了後の観察、もしくは反応中の濁度の上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば６６０ｎｍの吸光度の変化を通常の分光光度計を用いて増幅の確認が可能である。

なお、このＬＡＭＰ法を適用する検体としては、缶詰、瓶詰、レトルト製品等やこれらの食品の材料等をあげることができる。

以下、本発明のオリゴヌクレオチドおよびこれをプライマーとして用いたバチルス・コアグランスの検出方法について、実施例等に基づき具体的に説明する。なお、本発明は、これらに限定するものではない。

〔実施例１〕（特異性試験）
（１）検体の調製
本発明のプライマーがバチルス・コアグランスに対して特異的であることを確認するために、表１中の縦の見出し欄に示した種々の細菌をそれぞれ増菌用の平板培地に接種し、培養した。菌体を掻き取り、生理的食塩水に懸濁し、沸騰水中で１０分間加熱することによりＤＮＡを抽出し、遠心分離した上澄液を検体とした。なお、この懸濁液中の菌濃度は１０^８ｃｆｕ／ｍＬ程度であった。

（２）プライマーの合成
バチルス・コアグランスの１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とするプライマーとして、配列番号１〜６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをホスホアミダイト法により合成した。

（３）反応液の調製とＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ反応試薬は、栄研化学（株）製のLoopamp DNA増幅試薬キットを用いた。ＬＡＭＰ反応液は、２倍濃度反応用緩衝液１２．５μＬ、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＦＩＰ）４０ｐｍｏｌ、配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＢＩＰ）４０ｐｍｏｌ、配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｆ３）５ｐｍｏｌ、配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｂ３）５ｐｍｏｌ、ＤＮＡポリメラーゼ１．０μＬを加え、滅菌蒸留水で２２．５μＬとした。

２２．５μＬの反応液に、検体２．５μＬを添加し、合計２５μＬとした。また、陰性対照としては、検体の代わりに滅菌蒸留水２．５μＬを、陽性対照としては、検体の代わりに対照ＤＮＡ２．５μＬを添加した。これを６５℃で１時間加熱し、ＬＡＭＰ反応を行った。反応終了後、８０℃で２分間加熱し、酵素を失活させ反応を停止させた。

増幅反応が進むにつれ、遊離してくるピロリン酸と、反応液中に存在するマグネシウムイオンとがピロリン酸マグネシウムを形成する。増幅が起こっている場合のみ反応液が白濁する。この白濁を観察することで、増幅産物の有無を判断した。

結果を表１に示す。表１中の判定欄の＋は、反応液の目視判定で白濁が認められたことを表す。

表１の結果から、本発明の配列番号１〜４のオリゴヌクレオチドによれば、バチルス・コアグランスを種特異的に検出できることがわかる。

〔実施例２〕（増幅速度の評価）
配列番号１〜４の４種類のオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、および配列番号１〜６の６種類のオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットについて、バチルス・コアグランスの増幅速度について比較を行った。
実施例１のＬＡＭＰ反応液（プライマー４種類を含有）に加え、配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＬＦ）２０ｐｍｏｌ、配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＬＢ）２０ｐｍｏｌをさらに含むＬＡＭＰ反応液（プライマー６種類を含有）を調製した。このＬＡＭＰ反応液（プライマー６種類を含有）と、実施例１のＬＡＭＰ反応液（プライマー４種類を含有）との反応速度の違いを調べるために、バチルス・コアグランス（食品由来）を実施例１と同様に検体として調製したものを使用し、Ｌｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置ＲＴ−１６０Ｃ（(株)モリテックス製）でのＬＡＭＰ法反応を行い、濁度を経時的に測定した。また、ＬＡＭＰ反応液（プライマー６種類を含有）が、バチルス・コアグランス以外の細菌を検出しないことを確認するため、バチルス・セレウス（IFO3001）を検体として使用し、上記ＬＡＭＰ法反応により同様に濁度を経時的に測定した。図１は、増幅時間に対する濁度の変化を表した図である。

ＬＡＭＰ反応液（プライマー４種類を含有）は約４３分でＤＮＡの増幅が確認されているのに対し、ＬＡＭＰ反応液（プライマー６種類を含有）は、約２３分でＤＮＡの増幅が確認された。この結果より、配列番号１〜４の４種類のオリゴヌクレオチドに加え、配列番号５、６のオリゴヌクレオチドをさらに含む６種類のオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを使用することによって、より短時間でバチルス・コアグランスの増幅を確認することができることがわかる。

〔実施例３〕（検出感度の評価）
実施例２のＬＡＭＰ反応液（プライマー６種類を含有）について、バチルス・コアグランスの検出感度について評価した。
実施例１と同様に、バチルス・コアグランスを検体として調製した。菌濃度は、２．５×１０〜２．５×１０^４ｃｆｕ／ｍＬとなるように滅菌蒸留水で希釈した。これらを実施例１と同様にＬＡＭＰ法反応を行い、６０分後に目視で判定を行った。この結果を表２に示す。

上記の結果から、配列番号１〜６の６種類のプライマーからなるプライマーセットは、バチルス・コアグランス１０^２ｃｆｕ／ｍＬまで検出可能なことがわかる。

本発明のオリゴヌクレオチド、プライマー、プライマーのセット、及びこのプライマーを用いたＬＡＭＰ法による検出方法は、缶詰、瓶詰、レトルト製品等の食品又は食品材料をはじめとする種々の検体において、バチルス・コアグランスを迅速かつ簡便に、高感度に検出するために有用となる。

リアルタイム濁度法によるＬＡＭＰ法の検出感度を示す。

Claims

バチルス・コアグランスの１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドからなる、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal
Amplification）法で用いるプライマーセットであって、配列番号１に示される塩基配列ＦＩＰを含むオリゴヌクレオチド、配列番号２に示される塩基配列ＢＩＰを含むオリゴヌクレオチド、配列番号３に示される塩基配列Ｆ３を含むオリゴヌクレオチド、および配列番号４に示される塩基配列Ｂ３を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも４種のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、バチルス・コアグランス検出用プライマーのセット。
請求項１記載の少なくとも４種のオリゴヌクレオチドを含むプライマーのセットにおいて、４種のオリゴヌクレオチドに加え、配列番号５に示される塩基配列ＬＦを含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に示される塩基配列ＬＢを含むオリゴヌクレオチドをさらに加えた少なくとも６種のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、バチルス・コアグランス検出用プライマーのセット。
請求項１又は２に記載のプライマーのセットを添加し、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal
Amplification）法によりプライマーの伸長反応と標的とするヌクレオチド配列の増幅を行い、そのヌクレオチド配列の増幅を検出することを特徴とする、バチルス・コアグランスの検出方法。