JP2005110587A

JP2005110587A - アリサイクロバチラス属菌検出用プライマー

Info

Publication number: JP2005110587A
Application number: JP2003349772A
Authority: JP
Inventors: Yasuichi Nakakita; 保一中北; Masahiro Ogawa; 雅裕小川; Yoichi Tsuchiya; 陽一土屋
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd; Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd; Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2003-10-08
Filing date: 2003-10-08
Publication date: 2005-04-28
Also published as: EP1672081A4; CN1852992A; US20070207458A1; BRPI0415240A; AU2004280430B2; EP1672081A1; WO2005035789A1; AU2004280430A1

Abstract

【課題】アリサイクロバチラス属に属する食品有害菌をより選択的に、迅速かつ簡便に検出する。
【解決手段】アリサイクロバチラス属菌に特異的なプラマーを用いて、該アリサイクロバチラス菌の16SrDNA遺伝子の特定領域をLAMP法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認して、アリサイクロバチラス属菌（特に、アリサイクロバチラス・テレストリス菌）を検出する。
【選択図】なし

Description

本発明は、アリサイクロバチラス（Alicyclobacillus）属菌、もしくはアリサイクロバチラス・アシドテレストリス（Alicyclobacillus acidoterrestris）菌の16SrDNA遺伝子に特異的なプライマーに関する。さらに詳しくは、本発明は、アリサイクロバチラス属菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を増幅可能なアリサイクロバチラス属菌検出用プライマーまたはプライマーセットならびにアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を増幅可能なアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌検出用プライマーセットに関する。さらに、本発明は、前記菌検出用プライマーまたはプライマーセットを等温遺伝子増幅法（以下、LAMP法という）に使用する、アリサイクロバチラス属菌、もしくはアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の検出・菌株の識別方法にも関する。

アリサイクロバチラス属菌は、好気的に高温・酸性下で増殖する芽胞形成細菌であり、土壌や温泉等から分離されている。土壌中に存在するアリサイクロバチラス属が収穫果実に付着し、搾汁工程で果汁に入り込んだような場合、その果汁を使用した飲料水や食品の製造においては、製造工程で加熱殺菌が行われていたとしても、菌の耐熱性胞子が生き残り、製品中で発芽・増殖して変敗事故を引き起こす可能性のあることが知られている。特に、アリサイクロバチラス属菌のうち、グアヤコール臭という悪臭を出すアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌が、汚染事故の原因菌として報告されており、問題視されている。

そこで、汚染事故を未然に防ぐために、アリサイクロバチラス属細菌の検出や識別の為に、微生物検査がなされており、幾つかの方法が提案されてきた。例えば、BAM培地（非特許文献１）やSemi合成培地（非特許文献２）などが検出培地として報告されているが、これらの培地組成は複雑で、また、検査結果を得るまでに数日を必要とするため、日々の微生物検査に使用するには問題がある。

一方、菌種の識別法としては、生理・生化学的性状が菌種間であまり差がないこと、同一種内の菌株間で性状がばらつくことから、これらの性状のみで、種を識別することは難しい（非特許文献３）。

そこで、遺伝子解析的手法を用いた識別法が提案されてきた。例えば、PCR法を用いた方法（特許文献１、非特許文献４）、RAPD法を用いた方法（非特許文献５）、16SrDNA配列の比較による方法（非特許文献６）などであるが、何れの場合も、高価な機器を必要とし、また、煩雑な操作を伴うため、日々の微生物検査に使用するには問題がある。
国際特許公開WO 01/68914号パンフレット G.Deinhard et al., System. Appl. Microbiol., 10, 47-53, 1987 B.Hippchen et al., Arch. Microbiol., 129, 53-55, 1981 後藤, J. Antibact. Antifung. Agents., 28(8), 499-508, 2000 K.Yamazaki et al., Lett. Appl. Microbiol., 23, 350-354, 1996 K.Yamazaki et al., Biosci. Biotech. Biochem., 61(6), 1016-1018, 1997 K.Goto et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 48, 243-250, 2002

上記の問題点に鑑み、従来技術の手法とは別の観点から、簡便で、迅速なアリサイクロバチラス属菌（特に、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌）の検出法および識別法の開発が望まれている。したがって、本発明の目的は、前記の課題を解決し、飲料や果汁などの食品検体中、アリサイクロバチラス属菌の有無について、簡便で、迅速な検出・識別法を提供することである。

本発明者らは、かかる課題を解決するべく検討を重ね、等温の遺伝子増幅反応であるLoop-mediated isothermal amplification（LAMP）法（国際特許公開WO 00/28082号パンフレット）を利用することにより、アリサイクロバチラス属菌およびアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の検出、識別を簡便、迅速に行い得ることを見出した。

すなわち、本発明はアリサイクロバチラス属菌、もしくはアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の16SrDNA遺伝子に特異的なプライマーを提供する。

また、本発明によれば、被検アリサイクロバチラス属菌（好ましくは、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌）の検出・識別方法であって、その菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を標的とし、16SrDNA遺伝子に特異的なプライマーで該16SrDNA遺伝子の特定領域を選択的に、LAMP法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、アリサイクロバチラス属菌の検出・識別方法が提供される。

より特定的には、本発明は、下記の（１）〜(13)に記載される、アリサイクロバチラス属菌もしくはアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌検出用プライマーまたはプライマーセットおよびそれらを用いる、アリサイクロバチラス属菌、もしくはアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の検出・識別方法などを提供する。
（１）アリサイクロバチラス属菌の16SrDNA遺伝子配列の81番から934番の核酸配列の一部またはその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、
(a) 第１のセグメントとして、アリサイクロバチラス属菌の16SrDNA遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
(b) 第２のセグメントとして、第１のセグメントの３´側の核酸配列に相補的であり、第１のセグメントの５´側に位置する塩基配列
を含むことを特徴とする、プライマー。
（２）配列番号１〜４で表される核酸配列からなるオリゴヌクレオチドセットからなり、アリサイクロバチラス属菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を増幅可能なアリサイクロバチラス属菌検出用プライマーセット。
（３）配列番号５〜８で表される核酸配列からなるオリゴヌクレオチドセットからなり、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を増幅可能なアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌検出用プライマーセット。
（４）配列番号９〜１３で表される核酸配列からなるオリゴヌクレオチドセットからなり、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を増幅可能なアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌検出用プライマーセット。
（５）検体中に存在するアリサイクロバチラス属菌の検出方法であって、該アリサイクロバチラス属菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を標的とし、上記（１）に記載のプライマーで該16SrDNA遺伝子の特定領域を選択的に、LAMP法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、アリサイクロバチラス属菌の検出方法。
（６）検体中に存在するアリサイクロバチラス属菌の検出方法であって、該アリサイクロバチラス属菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を標的とし、上記（２）に記載のプライマーセットで該16SrDNA遺伝子の特定領域を選択的に、LAMP法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、アリサイクロバチラス属菌の検出方法。
（７）検体中に存在するアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の検出方法であって、該アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を標的とし、上記（３）に記載のプライマーセットで該16SrDNA遺伝子の特定領域を選択的に、LAMP法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の検出方法。
（８）検体中に存在するアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の検出方法であって、該アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を標的とし、上記（４）に記載のプライマーセットで該16SrDNA遺伝子の特定領域を選択的に、LAMP法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の検出方法。
（９）検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、上記（１）に記載のプライマーを用いて、LAMP法により増幅反応を行い、アリサイクロバチラス属菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、アリサイクロバチラス属菌の識別方法。
（10）検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、上記（２）に記載のプライマーセットを用いて、LAMP法により増幅反応を行い、アリサイクロバチラス属菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、アリサイクロバチラス属菌の識別方法。
（11）検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、上記（３）に記載のプライマーセットを用いて、LAMP法により増幅反応を行い、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の識別方法。
（12）検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、上記（４）に記載のプライマーセットを用いて、LAMP法により増幅反応を行い、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の識別方法。
（13）上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のプライマーまたはプライマーセット、鎖置換型DNAポリメラーゼ、dNTPs、反応緩衝液を少なくとも含むことを特徴とする、アリサイクロバチラス属菌もしくはアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌検出用キット。

上記した（１）〜（４）の所定のプライマーまたはプライマーセットをLAMP法に使用すると、アリサイクロバチラス属菌の16SrDNA遺伝子の特定領域にアニールする。これをLAMP法で定める増幅条件のもとで、増幅すると特定の遺伝子領域が増幅される。このような増幅産物の有無は、電気泳動法または、簡易検出法によって確認する。このようにして、アリサイクロバチラス属菌が検出できる。上記した（３）または（４）の２組のプライマーセットは、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌（16SrDNA遺伝子）に特異的であるので、アリサイクロバチラス属菌の中で、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス種の菌株のみを特異的に検出するから、これらのプライマーセットは、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌とその他のアリサイクロバチラス属菌との識別にも使用できる。

また、本発明の検出方法を特定の検体（例えば、飲料試料）に適用するとき、検体から採取した雑菌を培養してＤＮＡ試料を分離し、このＤＮＡ試料に上記した（１）〜（４）の所定のプライマーまたはプライマーセットを作用させ、同様に増幅されたＤＮＡ増幅産物の有無を確認する。このようにして、アリサイクロバチラス属菌もしくはアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌が検出できる。

本発明は、配列番号１〜４、５〜８、または９〜１３で表される核酸配列からなるオリゴヌクレオチドセットからなるプライマーセットをLAMP法に使用して、アリサイクロバチラス属菌（好ましくは、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌）の16SrDNA遺伝子の特定領域を増幅して、アリサイクロバチラス属菌の検出を可能にする。

また、本発明によるアリサイクロバチラス属菌の検出方法は、配列番号１〜４、５〜８、または９〜１３で表される核酸配列からなるオリゴヌクレオチドセットからなるプライマーセットを用いて、検体から得られたＤＮＡ試料にLAMP法（等温遺伝子増幅）を施し、増幅産物の有無を確認することからなるので、アリサイクロバチラス属菌（特に、有害アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌）の検出・識別を簡易、迅速かつ確実に行わしめる。

本発明は、果汁および果汁飲料等（集合的に飲料ともいう）を含む食品に、アリサイクロバチラス属菌や特に、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌が存在するか否かを判定するために、前記細菌に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたLAMP法による等温遺伝子増幅により、菌の16SrDNA遺伝子の特定領域の増幅を行い、増幅産物の有無を確認することを基礎としている。

飲料工場では、果汁受入時や果汁飲料の微生物検査において、アリサイクロバチラス属菌の存在有無のチェックを行っている。一般的には、「耐熱性好酸性菌統一検査法」（果汁協会報、３月号、No.535、4-12、2003）に従って、飲料検体をメンブランフィルターで濾過し、菌を捕捉したメンブランフィルターをアリサイクロバチラス属用培地YSG寒天培地（酵母エキス：0.2%、グルコース：0.1%、可溶性テ゛ンフ゜ン：0.2%、寒天：1.5%、pH4.0）に置き、45℃で３〜５日培養する。出現してきた菌について、温度差法（判定に18〜20時間が必要）やペルオキシダーゼ法（判定に１〜３時間が必要）により、その菌がアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌であるか否かを判定している。

一方、メンブラン濾過が困難な検体の場合は、その検体をYSG液体培地に添加し、45℃で３〜５日間増菌培養後、培養液をYSG寒天培地に塗布し、さらに45℃で３〜５日培養する。出現してきた菌について、上記と同様に、温度差法やペルオキシダーゼ法により、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌であるか否かを判定している。

本発明の検出・識別法には、サンプルとしてYSG寒天培地で出現した菌や、増菌培養液中に存在する菌を供することができる。

なお、本明細書で使用する「検体」とは、有害菌アリサイクロバチラス・アシドテレストリスを含む可能性があり、本発明の検出・識別法の対象となるサンプルであるが、特に限定はない。例えば、果汁（原料）、果汁を含む飲料等を挙げることができる。また、本明細書で使用する「識別」とは、アリサイクロバチラス属菌の１種以上が存在する検体において、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌とその他のアリサイクロバチラス属菌を区別して、検出することを特に指す場合もあるが、一般的には複数の菌種のなかで検出対象であるアリサイクロバチラス属菌もしくはアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌を識別することを指す。また、本明細書で使用する「判定」とは、検出した菌がアリサイクロバチラス属菌であるか否か、或いはアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌か否かを判定することを指し、検出と同義に使用されることもある。

本発明で使用されるLAMP法は、PCR法と異なり、増幅工程での温度調節（サイクル）を不要とし、一種類のDNA合成酵素を用いて、一定温度（等温）で増幅する遺伝子増幅法である（国際特許公開WO 00/28082号パンフレット、前掲）。

本発明のアリサイクロバチラス属菌の16SrDNA遺伝子に特異的なプライマーは、その特定領域を標的として、ループを形成する２種類の内部プライマーと２種類の外部プライマーの計４種類のセット（FIP、F3、BIP、B3）として、設計する。増幅する遺伝子の特定領域は、100〜500bp程度である。プライマーのオリゴヌクレオチドの核酸配列が決定されると、オリゴヌクレオチド自身の合成は、公知の手段、例えば、パーキンエルマー社製の自動DNA合成装置を用いて実施できる。

本発明において、アリサイクロバチラス属菌に特異的なプライマーセットとして、例えば下記の１組のプライマーセット（Alプライマーセットという）を挙げることができる。ここで、アリサイクロバチラス属菌に特異的なプライマーとは、その菌の16SrDNA遺伝子の特定領域（141bp）を特異的に増幅可能なプライマーである。なお、16SrDNA遺伝子の全核酸配列を配列表の配列番号14に示す。

Al-FIP
5’-TTGGGTTTCCTTCGGCACTGAGATACCCTGGTAGTCCACG-3’ （配列番号１）

Al-BIP
5’-ATAAGCACTCCGCCTGGGGAGCCCCCGTCAATTCCTTTG-3’ （配列番号２）

Al-F3
5’-GTGGGGAGCAAACAGGATT-3’ （配列番号３）

Al-B3
5’-ACATGCTCCACTGCTTGTG-3’ （配列番号４）
本発明において、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌のみに特異的なプライマーセットとして、例えば下記の２組のプライマーセット（Alatプライマーセット、rAlatプライマーセット）を挙げることができる。ここで、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌のみに特異的なプライマーとは、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の16SrDNA遺伝子の特定領域（139bpもしくは146bp）を増幅可能であるが、他のアリサイクロバチラス属菌の遺伝子を増幅しないプライマーである。

Alat-FIP
5’-ACAAGGAGCTTTCCACTCTCCAAGAAGGCCTTCGGGTTGT-3’ （配列番号５）

Alat-BIP
5’-TGAGACGGTACCGAGTGAGGACGCTTGCCCCCTACGTATT-3’ （配列番号６）

Alat-F3
5’-CAAGCCTGACGGAGCAA-3’ （配列番号７）

Alat-B3
5’-CCCAGTGATTCCGGACAA-3’ （配列番号８）

rAlat-FIP
5’-AACACAAGTAGATGCCTACCCGCAATCTGCCTTTCAGACTGGA-3’ （配列番号９）

rAlat-BIP
5’-TTGAAAGATGCAACTGCATCGCTCCGTTACCTCACCAACTAGC-3’ （配列番号10）

rAlat-F3
5’-CGGACGGGTGAGTAACACG-3’ （配列番号11）

rAlat-B3
5’-TACGCATCGTCGCCTTGG-3’ （配列番号12）

rAlat-LoopF
5’-ATTAGCACCCGTTTCCGAGT-3’ （配列番号13）

検体中に存在するアリサイクロバチラス属菌および／またはアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の検出は、上記した３組のプライマーセットの少なくとも、１組のセットを用いて、LAMP法に従い、等温遺伝子増幅（通常60〜65℃で15分〜1時間）を行う。すなわち、検体から採取した菌株または飲料検体そのものを、適当な培地中で培養し、遠心分離等で集菌した後、公知の方法によって菌株のDNAを分離して、このDNAに対して、前記プライマーセットを用いて、増幅反応を行う。増幅したDNA増幅産物の有無は、LAMP法での簡易検出、或いは通常の電気泳動によって検出できる。前者の簡易検出には、1)増幅反応液の白濁による目視確認（国際特許公開 WO 01/83817号パンフレット）および2)蛍光インターカレーターの目視確認がある。いずれも、目視により増幅産物（標的遺伝子の存在）の有無を確認することができる。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）既知菌株の16SrDNA遺伝子の増幅
（使用したプライマーセット）
アリサイクロバチラス属菌用プライマーセット［Alプライマーセット：Al-FIP（配列番号１）、Al-BIP（配列番号２）、Al-F3（配列番号３）、Al-B3（配列番号４）］は、16SrDNA遺伝子の一部141bpを増幅する。アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌用プライマーセット１［Alatプライマーセット：Alat-FIP（配列番号５）、Alat-BIP（配列番号６）、Alat-F3（配列番号７）、Alat-B3（配列番号８）］は、16SrDNA遺伝子の一部139bpを増幅する。また、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌用プライマーセット２［rAlatプライマーセット：rAlat-FIP（配列番号９）、rAlat-BIP（配列番号10）、rAlat-F3（配列番号11）、rAlat-B3（配列番号12）、rAlat-LoopF（配列番号13）］は、16SrDNA遺伝子の一部146bpを増幅する。これらのプライマーセットによるアリサイクロバチラス属菌、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の16SrDNA遺伝子の増幅、および近縁菌の16SrDNA遺伝子の増幅について検討した。供試菌株は、まとめて、各菌株に対する結果と共に表１に示した。

（ゲノムDNAの調製）
アリサイクロバチラス属菌は、YSG寒天培地（酵母エキス：0.2%、グルコース：0.1%、可溶性テ゛ンフ゜ン：0.2%、寒天：1.5%、pH4.0）に植菌し、45℃で、２〜５日間培養を行い、試験に供した。その他の供試菌は、ハートインフージョン寒天培地（栄研化学社製）に植菌し、37℃で、２〜５日間培養を行い、試験に供した。DNA抽出液PrepMan（商標）Ultra（アプライド・バイオシステム社製）を用いて菌体からゲノムDNAを抽出した。

（LAMP法による遺伝子増幅）
LAMP法による遺伝子増幅はLoopamp DNA増幅試薬キット（栄研化学社製）を用いて行った。試薬反応液に上記DNA溶液、および各プライマーセットを加え、遺伝子の増幅反応を行った。増幅反応は62℃で、60分間行った。

（増幅産物の検出）
増幅反応が進むにつれ、遊離してくるピロリン酸と、反応液中に存在するマグネシウムイオンとがピロリン酸マグネシウムを形成する。増幅が起こっている場合のみ反応液が白濁する。この白濁を観察することで、増幅産物の有無を判断した。また、一部の菌株については、反応液１μlをポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。DNAのバンドは、エチジウムブロマイド溶液で10分間染色後、紫外線照射して観察し、確認した（図１〜３に結果を示した）。

AlプライマーおよびAlatプライマーについての増幅結果をまとめたものが表１である。

表１に示したように、Alプライマーセットを用いたとき、増幅産物は、アリサイクロバチラス属に属する全ての供試菌株に確認することができた。一方、Alatプライマーセットを用いたとき、増幅産物は、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス種に属する供試菌株のみに確認することができた。しかし、両プライマーセットとも、アリサイクロバチラス属以外の近縁菌の16SrDNA遺伝子増幅に由来する増幅産物は、確認されなかった。

（実施例２）果汁から分離した菌株の識別
オレンジ、リンゴ、パイン、梅などの果汁をYSG寒天培地（酵母エキス：0.2%、グルコース：0.1%、可溶性テ゛ンフ゜ン：0.2%、寒天：1.5%、pH4.0）中、45℃で、２〜５日間培養して、分離した菌株を試験に供した。LAMP法による遺伝子増幅および、増幅産物の検出は実施例１と同様にして行った。結果を表２に示した。

（遺伝子解析による同定）
分離株の同定は16SrDNAの遺伝子解析により行った。実施例１に示した方法で、ゲノムDNAを調製した後、MicroSeq 500 16SrDNA キット（アプライド・バイオシステム社製）を用いて、分離株の同定を行った。

表２に示したように、遺伝子解析の結果、分離した菌株は全てアリサイクロバチラス属に属する菌株であった。遺伝子解析による同定結果とAlプライマーを用いた識別結果とは良く一致しており、さらに、アリサイクロバチラス・テレストリス種と同定されたNo.1株、No.2株およびNo.5株のみにおいて、Alatプライマーによる増幅が観察された。

（実施例３）果汁飲料からのアリサイクロバチラス属菌の検出
Alicyclobacillus acidoterrestris DSM2498を添加した市販濃縮リンゴ果汁飲料１ml（10cfu/ml）を、30mlのYSG液体培地と混合し、45℃で４〜24時間静置培養した（増菌培養）。

各培養時間におけるYSG培養液1.0mlを12,000rpmで５分間遠心し、菌体を回収した。菌体を200μlのTEバッファー（10mM トリス塩酸、0.1mM EDTA、pH8.0）に懸濁した後、遠心分離して菌体を洗浄した。洗浄した菌体を100μlのDNA抽出液PrepMan（商標）Ultra（アプライド・バイオシステム社製）に懸濁し、99℃で15分間加熱処理した後、12,000rpmで５分間遠心し、その上清をLAMP法用DNA試料溶液とした。

上記の方法に従って調製したDNA溶液の１μlを、Alatプライマーを用いて遺伝子増幅を行った。LAMP法による遺伝子増幅および、増幅産物の検出は実施例１と同様にして行った。

一方、各培養時間において、培養液の一部をYSG寒天培地の播種し、生菌数を測定した。増幅の結果と生菌数の測定値を表３に示した。

表３に示したように、一晩程度の増菌培養を行うだけで、初発菌数１cfu/ml以下（YSG液体培地における）のアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌を、Alatプライマーを用いたLAMP法によって検出することができた。このように、短時間の増菌培養を行った後（本実施例では16時間）、LAMP法により、目的遺伝子検出を行うことで、死菌の遺伝子を検出することなく、生菌を選択的に検出することができる。

「耐熱性好酸性菌統一検査法」（果汁協会報、３月号、No.535、4-12、2003）によれば、この増菌培養に３〜５日、アリサイクロバチラス・アシドテレストリスか否かを判定するのに、さらに３〜５日必要なことから、本発明の検出方法を用いることで、検出・識別までの時間を大幅に短縮することが可能となった。

（実施例４）迅速微生物検査装置（RMDS-SPS）で出現した菌の識別
細胞内に存在するATPを利用して、微生物を迅速に検出するための装置としてRMDS-SPS（商標：ミリポア社−サッポロビール社製）がある。その装置で検出したコロニー（目視で見えない極微小コロニー）が、アリサイクロバチラス属菌か否かの識別の可能性を検討した。

Alicyclobacillus acidoterrestris DSM2498を添加した市販濃縮リンゴ果汁飲料１ml（10cfu/ml）をメンブランフィルターで濾過した。菌を捕捉したメンブランフィルターをYSG寒天培地に載せ、45℃で、５〜８時間培養した（増菌培養）。培養後、RMDS-SPS装置を用いて検出した菌が存在するフィルター部位を切出し、２μlのDNA抽出液PrepMan（商標）Ultra（アプライド・バイオシステム社製）をフィルターに載せ、99℃で15分間加熱処理し、DNA抽出を行った。そのフィルターにAlatプライマーを用いたLAMP法で、遺伝子増幅を行った。LAMP法による遺伝子増幅および、増幅産物の検出は実施例１と同様にして行った。結果を表４に示した。

表４に示したように、迅速微生物検査装置（RMDS-SPS）と組合せることにより、数時間の増菌培養を行うだけで、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌を、Alatプライマーを用いたLAMP法によって識別することができた。

果汁飲料等の変敗事故の原因菌であるアリサイクロバチラス属菌（特に、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌）を選択的、迅速、簡便に、識別、検出することが可能となった。

したがって、本発明のプライマーセットおよびそれを用いるアリサイクロバチラス属菌などの検出方法は、食品、果汁入り飲料等の製造現場で製品の品質管理に役に立つ。

Alプライマーによる等温遺伝子増幅を行った結果を示す電気泳動図レーンＭ：マーカーレーンBc：Bacillus coagulans ID237レーンPp：Paenibacillus polymyxa ID322-1レーンBl：Bacillus licheniformis ID354-1レーンAat：Alicyclobacillus acidoterrestris DSM2498レーンAc：Alicyclobacillus cycloheptanicus NBRC15310レーンAac：Alicyclobacillus acidocaldarius JCM5260 Alatプライマーによる等温遺伝子増幅を行った結果を示す電気泳動図レーンＭ：マーカーレーンAc：Alicyclobacillus cycloheptanicus NBRC15310レーンAac1：Alicyclobacillus acidocaldarius JCM5260レーンAac2：Alicyclobacillus acidocaldarius ID313-1レーンAac3：Alicyclobacillus acidocaldarius ID313-3レーンAat1：Alicyclobacillus cycloheptanicus NBRC15310レーンAat2：Alicyclobacillus acidocaldarius JCM5260レーンAat3：Alicyclobacillus acidoterrestris ID313-4レーンAat4：Alicyclobacillus acidoterrestris ID331-1 rAlatプライマーによる増幅等温遺伝子増幅を行った結果を示す電気泳動図レーンAm：Alicyclobacillus mali IAM14936レーンAp：Alicyclobacillus pomorum IAM14988レーンAap：Alicyclobacillus acidiphilus IAM14883レーンAat：Alicyclobacillus acidoterrestris DSM2498レーンAc：Alicyclobacillus cycloheptanicus NBRC15310レーンAac：Alicyclobacillus acidocaldarius JCM5260レーンAac：Alicyclobacillus acidocaldarius JCM5260

Claims

アリサイクロバチラス属菌の16SrDNA遺伝子配列の81番から934番の核酸配列の一部またはその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、
(a) 第１のセグメントとして、アリサイクロバチラス属菌の16SrDNA遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、
(b) 第２のセグメントとして、第１のセグメントの３´側の核酸配列に相補的であり、第１のセグメントの５´側に位置する塩基配列
を含むことを特徴とする、プライマー。
配列番号１〜４で表される核酸配列からなるオリゴヌクレオチドセットからなり、アリサイクロバチラス属菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を増幅可能なアリサイクロバチラス属菌検出用プライマーセット。
配列番号５〜８で表される核酸配列からなるオリゴヌクレオチドセットからなり、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を増幅可能なアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌検出用プライマーセット。
配列番号９〜13で表される核酸配列からなるオリゴヌクレオチドセットからなり、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を増幅可能なアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌検出用プライマーセット。
検体中に存在するアリサイクロバチラス属菌の検出方法であって、該アリサイクロバチラス属菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を標的とし、請求項１に記載のプライマーで該16SrDNA遺伝子の特定領域を選択的に、LAMP法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、アリサイクロバチラス属菌の検出方法。
検体中に存在するアリサイクロバチラス属菌の検出方法であって、該アリサイクロバチラス属菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を標的とし、請求項２に記載のプライマーセットで該16SrDNA遺伝子の特定領域を選択的に、LAMP法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、アリサイクロバチラス属菌の検出方法。
検体中に存在するアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の検出方法であって、該アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を標的とし、請求項３に記載のプライマーセットで該16SrDNA遺伝子の特定領域を選択的に、LAMP法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の検出方法。
検体中に存在するアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の検出方法であって、該アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を標的とし、請求項４に記載のプライマーセットで該16SrDNA遺伝子の特定領域を選択的に、LAMP法により増幅させ、該増幅産物の有無を確認することを特徴とする、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の検出方法。
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項１に記載のプライマーを用いて、LAMP法により増幅反応を行い、アリサイクロバチラス属菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、アリサイクロバチラス属菌の識別方法。
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項２に記載のプライマーセットを用いて、LAMP法により増幅反応を行い、アリサイクロバチラス属菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、アリサイクロバチラス属菌の識別方法。
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項３に記載のプライマーセットを用いて、LAMP法により増幅反応を行い、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の識別方法。
検体を増菌培養し、出現菌からＤＮＡ試料を分離し、該ＤＮＡ試料に対して、請求項４に記載のプライマーセットを用いて、LAMP法により増幅反応を行い、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の16SrDNA遺伝子の特定領域を増幅させ、この増幅産物の有無を確認することを特徴とする、アリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌の識別方法。
請求項１〜４のいずれか１つに記載のプライマーまたはプライマーセット、鎖置換型DNAポリメラーゼ、dNTPs、反応緩衝液を少なくとも含むことを特徴とする、アリサイクロバチラス属菌もしくはアリサイクロバチラス・アシドテレストリス菌検出用キット。