KR20190043198A

KR20190043198A - 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스의 신속한 검출방법 및 검출키트

Info

Publication number: KR20190043198A
Application number: KR1020170134935A
Authority: KR
Inventors: 이종서; 이자민; 김현철
Original assignee: 롯데칠성음료주식회사
Priority date: 2017-10-18
Filing date: 2017-10-18
Publication date: 2019-04-26
Also published as: KR101977377B1

Abstract

본 발명은 Real-Time PCR 기법을 이용한 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스의 신속한 검출방법 및 검출키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 서열번호 4 내지 6의 정방향 프라이머 세트, 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 이용한 Real-Time PCR 기법에 관한 것이다. 이는 Real-Time PCR를 이용하여, 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스 균주인 알리사이클로바실러스 액시디필러스(Alicyclobacillus acidiphilus ), 알리사이클로바실러스 허바리우스(Alicyclobacillus herbarius ) 및 알리사이클로바실러스 액시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris )를 동시에 신속하게 검출할 수 있다.

Description

구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스의 신속한 검출방법 및 검출키트{Method for detecting rapidly Alicyclobacillus producing guaiacol and detection kit}

본 발명은 Real-Time PCR 기법을 이용한 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스의 신속한 검출방법 및 검출키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 서열번호 4 내지 6의 정방향 프라이머 세트, 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 이용한 Real-Time PCR 기법에 관한 것이다. 이는 Real-Time PCR를 이용하여, 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스 액시디필러스(Alicyclobacillus acidiphilus ), 알리사이클로바실러스 허바리우스(Alicyclobacillus herbarius ) 및 알리사이클로바실러스 액시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris )와 알리사이클로바실러스 속을 동시에 신속하게 검출할 수 있다.

과일 및 채소를 원료로 사용하는 음료에서는 TAB(Thermophilic Acidophilic Bacteria)라고 불리는 균이 문제가 된다. 이 균은 대부분 토양에서 유래하므로 농산품인 원료 자체에서 균을 없애는 방법은 없다. 상기 균은 내열 호산성 세균으로 열에 강하고 산성조건에서 생장하여 가열공정이 들어가도 완벽히 멸균되지 않으며, 제품의 pH가 낮아도 제품내에서 생장 가능하다. 또한 10개 미만의 세균이 제품내에 있어도 유통 과정에서 생장가능하여 완제품에서 문제를 일으키며 전세계적으로 완벽한 제어 공정이 없어 품질관리에 어려움이 있다.

TAB는 주로 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus ) 속이 포함되며 이중 대표적으로 구아야콜을 생성하는 Alicyclobacillus acidoterrestris종이 제품에서 이취를 발생하여 문제를 일으킨다.

구아야콜은 VOC(Volatile Organic Compounds)로 정로환, 타이어 냄새 등으로 표현되는 이취로 섭취시 인체에 문제를 일으키지는 않으나 제품 섭취에 심한 거부감을 느끼게 한다.

생산공장에서는 입고 원료에서부터 제품까지 많은 수의 샘플을 검사하며 그 검사의 시간은 정성시험의 경우 10일 정도가 소요되어 제품이 출고되고 문제가 발생할 수 있고 노동력이 많이 소요되는 단점이 있다. 현재의 실험 방법은 일본의 공전실험법에 따르는데 YSG 액체 배지 증균 3~5일, YSG 고체 배지 증균 3~5일, 구아야콜 확인 키트(VA-YSG Broth)3시간, 10여일 정도가 소요 되고 구아야콜을 생성하는 주요 균종인 Alicyclobacillus acidoterrestris를 확인하려면 동정 및 온도차법을 활용하여야 하여 더 많은 시간이 소요되어 산업계에서 제품 출고에 어려움이 있다.

또한 현재 나와있는 Alicyclobacillus 신속 검출 PCR법의 경우 Alicyclobacillus 속 혹은 Alicyclobacillus acidoterrestris 만 검출하여 구아야콜을 생성하는 다른 Alicyclobacillus 속에 속하는 균주는 검출 하지 못하는 한계가 있다.

한편, 한국 등록특허 제10-1562491호, 제10-1498768호는 Real-time PCR을 이용한 특정 균주의 검출방법에 관한 것으로, Real-time PCR(Polymerase chain reaction) 은 thermal cycler와 분광 형광 광도계가 일체화된 장치로, 실시간으로 PCR 증폭산물의 생성과정을 모니터링 하여 타겟 DNA(target DNA)의 양을 분석하는 장비이다. Real-time PCR은 PCR 증폭 산물의 확인을 위한 전기 영동이 필요 없으며, 증폭이 지수함수적으로 일어나는 영역에서 증폭 산물량을 비교하여 보다 정확한 정량이 가능한 신속성과 정량성이 뛰어난 방법이다. 실제로, 유전자 발현, gene copy assay, genotyping, 등에서 시료에 있는 타겟 유전자(target gene)에 대한 정확한 양 측정에 이용되는 중요한 수단(tool)이라 할 수 있다.

한국 등록특허 제10-1562491호 한국 등록특허 제10-1498768호

현재 구아야콜을 생성하는 다른 Alicyclobacillus 속에 속하는 균주를 검출하는 신속 PCR이 나오지 않는 이유는 발생 빈도가 Alicyclobacillus acidoterrestris 보다 낮고 균의 생장 속도가 Alicyclobacillus acidoterrestris 보다 현저히 느려 검출이 안될 경우가 빈번이 발생 하는 이유로 사료된다. 하지만 실제 현장에서 구아야콜을 생성하는 A. acidiphilus , A. herbarius , A. acidoterrestis 동시에 검출하여야 제품 품질 관리에 완벽을 기할 수 있기에 이를 연구하여 본 발명에 이르게 되었다. 본 발명에서 개발한 PCR 키트를 사용하면 YGS 배지 증균 2~3일 후 바로 검출 할 수 있어 시간적 이점이 뛰어나다.

또한 본 발명은 구아야콜을 생성하는 모든 Alicyclobacillus를 신속하게 검출함과 동시에 비슷한 생육 조건에서 생장하는 다른 Alicyclobacillus도 검출하여 제품 가공의 적절성을 평가할 수 있는 이점을 가지고 있다.

이에 본 발명자들은 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스를 동시에 검출할 수 있는 새로운 프라이머 세트를 제작하고, 이를 바탕으로 특이적인 프로브를 디자인하여 Real-time PCR을 수행한 결과, 구아야콜을 생성하는 모든 알리사이클로바실러스 균주의 존재 유무를 동시에 정확하게 확인 가능함을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스 균주를 신속 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스 균주의 검출키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 일측면은, 하기 단계를 포함하는 구아야콜(guaiacol)을 생성하는 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus)의 신속한 검출방법을 제공한다 :

(a) 시료(sample)로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계;

(b) 상기 추출된 유전체 DNA, 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나 이상의 프라이머를 포함하는 정방향 프라이머 세트, 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction)액을 제조하는 단계; 및

(c) 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계.

본 발명의 일측면에서, 상기 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스는

알리사이클로바실러스 액시디필러스(Alicyclobacillus acidiphilus ), 알리사이클로바실러스 허바리우스(Alicyclobacillus herbarius ) 및 알리사이클로바실러스 액시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris )로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주인, 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스의 신속한 검출방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 서열번호 4는 알리사이클로바실러스 액시디필러스(Alicyclobacillus acidiphilus )를 증폭하기 위한 프라이머이고, 상기 서열번호 5는 알리사이클로바실러스 허바리우스(Alicyclobacillus herbarius )를 증폭하기 위한 프라이머이고, 상기 서열번호 6은 알리사이클로바실러스 액시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris )를 증폭하기 위한 프라이머인 것을 특징으로 하는, 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스의 신속한 검출방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 정방향 프라이머 세트는 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6을 포함하는, 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스의 신속한 검출방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 프로브는 5` 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 3` 말단에는 소광제(quencher)가 표지된 것을 특징으로 하는 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스의 신속한 검출방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 형광발색제는 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5(Cy5)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스의 신속한 검출방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 소광제는 Black Hole Quencher 1(BHQ-1), Black Hole Quencher 2 (BHQ-2), Black Hole Quencher 3(BHQ-3), 5-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), deep dark Quencher 1 (DDQ1), EBQ 및 deep dark Quencher 2(DDQ2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스의 신속한 검출방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에서, 상기 방법은 (b)단계에서 정방향 프라이머 세트에 서열번호 1의 프라이머를 더 포함하여 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스의 검출 및 알리사이클로바실러스 속을 동시에 신속하게 검출할 수 있는, 검출방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 서열번호 4의 프라이머, 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프라이머 중 어느 하나이상을 포함하는 정방향 프라이머 세트; 서열번호 2의 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 프로브를 포함하는, 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스의 검출키트를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에서, 상기 키트는 반응용 완충용액, dNTPs, Mg2+이온, 및 DNA 중합효소를 포함하는 검출키트를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에서, 상기 정방향 프라이머 세트는 서열번호 4의 프라이머, 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프라이머를 포함하는, 검출키트를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에서, 상기 프로브는 5` 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 3` 말단에는 소광제(quencher)가 표지된 것이며, 상기 형광발색제는 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5(Cy5)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이며, 상기 소광제는 Black Hole Quencher 1(BHQ-1), Black Hole Quencher 2 (BHQ-2), Black Hole Quencher 3(BHQ-3), 5-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), deep dark Quencher 1 (DDQ1), EBQ 및 deep dark Quencher 2(DDQ2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 검출키트를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에서, 상기 정방향 프라이머 세트에 서열번호 1의 프라이머를 더 포함하는, 검출키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 과일 및 채소 중 어느 하나 이상을 원료로 제조된 음료의 품질관리 방법에 있어서, 상기 중 어느 하나의 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스의 검출키트를 이용하는, 음료의 품질관리 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 음료는 농축과채즙, 과채음료, 과채주스 및 혼합음료인, 음료의 품질관리 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면은 구아야콜을 생성하는 모든 Alicyclobacillus를 신속하게 검출함 검출하여 제품 가공의 적절성을 평가할 수 있는 이점을 가지고 있다.

또한, 본 발명의 일측면은 구아야콜을 생성하는 모든 알리사이클로바실러스 균주 이외에 알리사이클로바실러스 속의 균주를 동시에 검출하여 제품 가공의 적절성을 평가할 수 있는 이점을 가지고 있다.

도 1은 본원발명 실시예 1에서 알리사이클로바실러스 균주들의 서열 상동성 분석 결과이다.
도 2는 본원발명 실시예 2에서 16S rRNA 유전자를 이용한 Alicyclobacillus 검출결과이다.
도 3은 본원발명 실시예 3에 따른 A. acidiphilus , A. herbarius , A. acidoterrestris 검출을 위한 real-time PCR 실험결과이다.
도 4는 본원발명 실시예 4에 따른 SHC 유전자 증폭을 통한 Alicyclobacillus 검출방법 결과이다.

이하, 본 발명을 하나의 구현 예로서 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

(a) 시료(sample)로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계;

(c) 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계.

본 발명에서 사용하는 용어인 “프라이머”란 짧은 자유 3'말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재 하에서 DNA합성을 개시할 수 있다.

프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

본 발명에서 상기 서열번호 4 내지 6의 염기서열을 포함하는 프라이머는 각각 서열 상동성이 95% 이상인 염기서열을 포함하는 개념이다. 예를 들어, 프라이머가 20bp인 경우, 20bp 중 2개 이상 틀리면 용융 온도(melting temperature)의 감소가 5도 이상이 되므로 결과가 좋지 않게 나타나지만, 1개만 틀릴 경우에는 PCR 과정에서 열처리(annealing) 온도를 약간 내려 실험할 경우 동등한 결과를 얻을 수 있기 때문이다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전 되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.

본 발명에서“프로브”란 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 핵산단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 핵산 존재여부를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.

본 발명의 프로브는 5` 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 3` 말단에는 소광제(quencher)가 표지될 수 있다.

더욱 바람직하게는 상기 5'-말단에 표지되는 형광발색체는 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5 (Cy5)으로 이루어진 군에서 선택된다.

상기 3'-말단에 표지되는 소광제는 Black Hole Quencher 1 (BHQ-1), Black Hole Quencher 2 (BHQ-2), Black Hole Quencher 3(BHQ-3), 5-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), deep dark Quencher 1 (DDQ1), EBQ 및 deep dark Quencher 2(DDQ2)로 이루어진 군에서 선택된다.

프로브의 5'-말단 및 3'-말단에 표지된 각각의 형광물질은 상호 간섭 현상을 나타내는 것 일 수 있다. 이에 따라, 프로브가 시료에 존재하는 표적 염기서열에 결합된 상태에서는 3'-말단의 형광물질 에너지에 의해 5'-말단의 형광물질이 억제되어 발색이 제한되고, 중합효소 연쇄반응의 수행시 프로브가 분해되면서 5'-말단의 형광물질이 유리되면서 3'-말단의 형광물질에 의한 억제가 해제되어 형광물질이 발색 반응을 하게 된다.

본 발명의 상기 키트는 상기 프라이머 및 상기 프로브 이외에 PCR 조성물에 사용되는 성분을 사용할 수 있으며, 이러한 조성물의 성분의 비제한적인 예로는 반응용 완충용액, dNTPs, Mg2+이온, DNA 중합효소가 포함될 수 있다.

상기 반응용 완충용액은 1∼10mM TrisHCl, 10∼40mM KCl(pH 9.0)을 사용할 수 있으며, 상기 dNTPs는 dATP, dTTP, dGTP, dCTP 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기 키트에는 실험상의 편의, 안정화 및 반응성 향상을 위해 안정화제 및/또는 비반응성 염료 등를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 과일 및 채소를 원료로 제조된 음료는 농축과채즙, 과채음료, 과채주스 및 혼합음료 중 어느 하나 이상인, 음료의 품질관리 방법을 제공한다. 구체적으로 상기 음료는 식품공전상에 기재된 농축과채즙, 과채음료, 과채주스 및 혼합음료일 수 있다.

이하, 실시예, 실험예 및 비교예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 예에 의해 제한되지 않는다.

실시예 1: guaiacol 생성 알리사이클로바실러스 검출을 위한 상동성 분석

Alicyclobacillus 속 미생물과 guaiacol 생성 Alicyclobacillus 종을 확인하기 위한 real-time PCR 실험을 위해 Genbank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)를 통하여 확인된 다수의 Alicyclobacillus 미생물 종의 16S ribosomal RNA 유전자 서열(표1) 상동성 분석을 MEGA 7.0 프로그램(http://www.megasoftware.net/)을 이용하여 분석하였으며(도면1), 상동성 분석과정에서 다른 미생물과의 교차반응 가능성 정도를 확인하기 위해 8종의 다른 미생물 종도 포함하여 확인하였다.

미생물 종	Accession number	미생물 종	Accession number
Alicyclobacillus herbarius	AB042055	Alicyclobacillus macrosporangiidus	AB264025
Alicyclobacillus herbarius	NR_113949	Alicyclobacillus pomorum	AB089840
Alicyclobacillus herbarius	KC354691	Alicyclobacillus sacchari	AB264020
Alicyclobacillus acidocaldarius	AB059674	Alicyclobacillus shizuokensis	AB264024
Alicyclobacillus acidocaldarius	NR_112115	Alicyclobacillus acidiphilus	NR_113948
Alicyclobacillus acidocaldarius	CP001727	Alicyclobacillus acidiphilus	NR_028637
Alicyclobacillus acidocaldarius	AB060166	Alicyclobacillus acidoterrestris	KY045831
Alicyclobacillus sendaiensis	AB084128	Alicyclobacillus acidoterrestris	KX708912
Alicyclobacillus vulcanis	AY425985	Alicyclobacillus acidoterrestris	KX687801
Alicyclobacillus hesperidensis	AJ133633	Alicyclobacillus acidoterrestris	AB042057
Alicyclobacillus aeris	FM179383	Effusibacillus consociatus	HE613268
Alicyclobacillus contaminans	AB264026	Bacillus cereus	KX024730
Alicyclobacillus dauci	AB916540	Propionibacterium acnes	KF933802
Alicyclobacillus disulfidooxidans	AB089843	Propionibacterium avidum	NR_102833
Alicyclobacillus fastidiosus	AB264021	Propionimicrobium lymphophilum	NR_114337
Alicyclobacillus ferrooxydans	EU137838	Staphylococcus aureus	KU377336
Alicyclobacillus hesperidensis	AJ133633	Streptococcus cristatus	KF933797
Alicyclobacillus kakegawensis	AB264022	Streptococcus mutans	KM225740

표 1은 Alicyclobacillus 상동성 분석을 위한 미생물 서열정보이다.

실시예 2: Alicyclobacillus 속 검출을 위한 real-time PCR 조건 확립

Alicyclobacillus 속 검출을 위한 real-time PCR 실험을 위해 상동성 분석결과를 기반으로 다른 종의 미생물를 제외하고 Alicyclobacillus 속 미생물만 검출하기 위한 프라이머, 프로브 세트를 구성하였다.

(1) 프라이머 및 프로브의 제작

실험을 위해 선택된 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 합성을 ㈜바이오니아 사로부터 진행하였으며, 형광표지자 검출을 통하여 정량적으로 확인하기 위한 프로브 서열의 경우 5' 방향 말단에 FAM으로 표지하고 3' 말단에는 BHQ1을 표지하였다.

		5'수식	서열정보(5'~3')	3'수식
프라이머	서열번호1		AGCGTTGTCCGGAATSACTG
프라이머	서열번호2		TCAGTCACTGTCCAGCAAGG
프로브	서열번호3	FAM	TGGAATTCCCCTTGCCTCTCC	BHQ1

표 2는 Alicyclobacillus 속 검출을 위한 프라이머 및 프로브 서열정보이다.

(2) Real-Time PCR 수행( 프라이머 및 프로브의 성능평가)

Real-time 실험은 95도 온도조건에서 5분간 변성과정을 거치고 95도 15초, 50도 45초의 온도조건에서 40회 반복한 후 각 반복과정에서 FAM 형광 파장을 검출하여 정략적으로 증폭여부를 확인하였다. 실험의 과정은 Thermo scientific 사의 ABI 750 fast 장비에서 진행하였으며, 정방향 프라이머는 서열번호 1로 서열번호 2와의 조합으로 16S ribosomal RNA 유전자의 일부를 선택적으로 증폭한 후 증폭산물은 서열번호 3으로 구성된 형광표지 프로브로 확인하였다. 상세한 증폭조성물의 구성은 표 3과 같다.

구성물	첨가량
2X Real-time PCR Master Mix	10 uL
Forward Primer(100uM)	0.1 uL
Revers Primer(100uM)	0.1 uL
Probe (100uM)	0.05 uL
Template DNA	1 uL
Nucelase Free Water	8.75 uL
Total Volume	20 uL

표 3은 Real-time PCR 실험을 위한 반응당 구성물이다.

실험에 적용된 미생물 종은 표 4와 같고 이 중 Alicyclobacillus 속에 포함된 미생물 종은 상기 기술한 실험조건에서 모두 검출됨을 실험적으로 확인하였다. 실험결과는 도 2와 같았다.

미생물 종	균주번호	미생물 종	균주번호
Alicyclobacillus tengchongensis	33022	Aspergillus flavus	16682
Alicyclobacillus cellulosilyticus	33007	Candida parapsilosis	7214
Alicyclobacillus pomorum	3897	Issatchenkia orientalis	7277
Alicyclobacillus acidoterrestris	3457	Candida glabrata	7219
Alicyclobacillus acidiphilus	3799	Pichia guilliermondii	7144
Alicyclobacillus herbarius	3896	Candida dubliniensis	17427
Alicyclobacillus acidocaldarius	1825	Candida tropicalis	7212
Aspergillus flavus var. flavus	6143	Cellulomonas cellasea	3410
Aspergillus oryzae var. oryzae	6596	Cellulomonas flavigena	1038
Lactobacillus gasseri	3173	Bacillus amyloliquefaciens	3002
Aspergillus flavus	6984	Lactobacillus crispatus	3178

표 4는 Alicyclobacillus 종 검출을 위한 적용 미생물 종이다.

실시예 3: A. acidiphilus , A. herbarius , A. acidoterrestris 검출을 위한 real-time PCR 조건 확립

(1) 프라이머 및 프로브의 제작

대표적인 guaiacol 생성 Alicyclobacillus로 알려진 A. acidiphilus , A. herbarius, A. acidoterrestris를 특이적으로 검출하기 위한 특이적인 정방향 프라이머 서열정보는 표 5와 같고 역방향 프라이머는 서열번호 2와 이를 실시간으로 확인하기 위한 프로브 서열은 서열번호 3을 적용하였다. 실험을 위해 선택된 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 합성을 ㈜바이오니아 사로부터 진행하였다.

	서열정보(5'~3')	검출 미생물 종
서열번호4	CTTGGTTTGTCTTTGGAAACTGCATA	A. acidiphilus
서열번호5	CCTTACGCGTCTGAGGTTTA	A. herbarius
서열번호6	ATTGCTTTGGAAACTGCATG	A. acidoterrestris

표 5는 guaiacol 생성 Alicyclobacillus 검출을 위한 정방향 프라이머 서열정보이다.

A. acidiphilus 만을 선택적으로 증폭하기 위해서 서열번호 4와 서열번호 2 그리고 서열번호 3의 조합으로 실험을 진행하며, 서열번호 4가 A. acidiphilus 만에 선택적으로 결합하여 다양한 Alicyclobacillus 종 중에서 A. acidiphilus 증폭할 수 있게 하였다(도 3a).

A. herbarius의 경우는 서열번호 5와 서열번호 2, 서열번호 3의 조합으로 구성하였다(도 3b).

마지막으로 A. acidoterrestris는 서열번호 6과 서열번호 2, 서열번호 3의 조합으로 선택적으로 증폭하여 실시간으로 확인할 수 있도록 하였다(도 3c).

각각의 조성물의 구성은 상기 실시예2 의 (2)와 동일하게 표 3과 같이 구성하고 온도조건도 실시예 2와 동일하게 진행하였다.

Real-Time PCR 수행결과는 도 3과 같았다.

실시예 4: 특이도 비교평가 ( SHC 유전자를 이용한 A. acidoterrestris 및 A. acidocaldarius 검출실험)

Alicyclobacillus 검출을 위한 실험법은 H. Luo, et. al (Letters in Applied Microbiology 2004, 39, 376-382) 게재되었으며, SHC 유전자를 real-time PCR 법으로 정량적으로 증폭하여 검출하는 방법을 개발하여 적용하였다. 하지만 본 실험법은 다양한 Alicyclobacillus 중 A. acidoterrestris , A. acidocaldarius 만을 선택하여 증폭이 가능하고 BLAST 분석결과 다른 Alicyclobacillus의 검출은 어려운 것으로 확인되었다(도 4).

일반적으로 A. acidoterrestris 뿐만 아니라 A. acidiphilus와 A. herbarius 도 guaiacol 생성 Alicyclobacillus 오염의 여부를 확인하기 위해서는 선택적 또는 속 전체를 확인 가능하도록 검사법이 구성되어야 하며, 또한, 지속적으로 새로운 Alicyclobacillus 종이 guaiacol 생성하는 것으로 확인되어 대표적인 guaiacol 생성 Alicyclobacillus 뿐만 아니라 다른 종의 Alicyclobacillus 도 같이 확인하여 오염여부를 확인해야 한다.

실시예 3의 실험에서는 적용된 Alicyclobacillus 가 모두 검출되었지만 실시 예4에서는 2종의 Alicyclobacillus 를 제외하고는 증폭되지 않았다.

결국, 상기 실시예 3 및 실시예 4의 실험 결과를 통해, 본 발명에 따른 검출방법에서 고안된 프라이머, 프로브 조건의 특이도가 더 우수함을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 구아야콜을 생성하는 Alicyclobacillus 으로서, 대표적으로 A. acidiphilus , A. herbarius 및 A. acidoterrestris 의 존재 유무를 신속하게 확인할 수 있어, 음료 품질관리에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 구아야콜을 생성하는 균주 이외에 일반적인 Alicyclobacillus 속에 속하는 균주도 동시에 검출할 수 있어 제품 품질관리에 이점을 제공할 수 있다.

<110> LOTTE CHILSUNG BEVERAGE CO., LTD. <120> Method for detecting rapidly Alicyclobacillus producing guaiacol and detection kit <130> DP-2017-00351 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for detecting Alicyclobacillus <400> 1 agcgttgtcc ggaatsactg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 tcagtcactg tccagcaagg 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 tggaattccc cttgcctctc c 21 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for detecting Alicyclobacillus acidiphilus <400> 4 cttggtttgt ctttggaaac tgcata 26 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for detecting Alicyclobacillus herbarius <400> 5 ccttacgcgt ctgaggttta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for detecting Alicyclobacillus acidoterrestris <400> 6 attgctttgg aaactgcatg 20

Claims

하기 단계를 포함하는 구아야콜(guaiacol)을 생성하는 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus)의 신속한 검출방법 :
(a) 시료(sample)로부터 유전체 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출된 유전체 DNA, 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나 이상의 프라이머를 포함하는 정방향 프라이머 세트, 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction)액을 제조하는 단계; 및
(c) 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계.
제 1 항에 있어서,
상기 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스는
알리사이클로바실러스 액시디필러스(Alicyclobacillus acidiphilus ), 알리사이클로바실러스 허바리우스(Alicyclobacillus herbarius ) 및 알리사이클로바실러스 액시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris )로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주이며,
상기 서열번호 4는 알리사이클로바실러스 액시디필러스(Alicyclobacillus acidiphilus)를 증폭하기 위한 프라이머이고,
상기 서열번호 5는 알리사이클로바실러스 허바리우스(Alicyclobacillus herbarius)를 증폭하기 위한 프라이머이고,
상기 서열번호 6은 알리사이클로바실러스 액시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris )를 증폭하기 위한 프라이머인,
구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스의 신속한 검출방법
제 1 항에 있어서,
상기 프로브는 5` 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 3` 말단에는 소광제(quencher)가 표지된 것이며,
상기 형광발색제는 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 및 Cyanine-5(Cy5)으로 이루어진 군에서 선택된 것이며,
상기 소광제는 Black Hole Quencher 1(BHQ-1), Black Hole Quencher 2 (BHQ-2), Black Hole Quencher 3(BHQ-3), 5-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), deep dark Quencher 1 (DDQ1), EBQ 및 deep dark Quencher 2(DDQ2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스의 신속한 검출방법.
제 1항에 있어서,
상기 방법은 (b)단계에서 정방향 프라이머 세트에 서열번호 1의 프라이머를 더 포함하여 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스의 검출 및 알리사이클로바실러스 속을 동시에 신속하게 검출할 수 있는, 검출방법.
서열번호 4의 프라이머, 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프라이머 중 어느 하나 이상을 포함하는 정방향 프라이머 세트;
서열번호 2의 역방향 프라이머; 및
서열번호 3의 프로브를 포함하는, 구아야콜을 생성하는 알리사이클로바실러스의 검출키트.
제 5 항에 있어서,
상기 정방향 프라이머 세트에 서열번호 1의 프라이머를 더 포함하는, 검출키트.
과일 및 채소 중 어느 하나 이상을 원료로 제조된 음료의 품질관리 방법에 있어서,
상기 5항 또는 6항의 검출키트를 이용하는, 음료의 품질관리 방법.
제 7항에 있어서,
상기 음료는 농축과채즙, 과채음료, 과채주스 및 혼합음료 중 어느 하나 이상인, 음료의 품질관리 방법.