CN111094585A

CN111094585A - 用于核苷酸测序的水凝胶珠

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Publication number: CN111094585A
Application number: CN201880044292.5A
Authority: CN
Inventors: 吴怡萱; 陈锡君; F·戈尔佩-亚萨尔; F·诺埃; C·林; T·K·库拉纳; F·玛莎耶克海; P·达古玛蒂; F·J·斯特梅斯; K·L·冈德森; J·S·费希尔
Original assignee: Illumina Inc
Current assignee: Illumina Inc
Priority date: 2017-08-01
Filing date: 2018-08-01
Publication date: 2020-05-01
Also published as: AU2022203968A1; AU2023208074A1; KR102480894B1; JP2023085483A; AU2018312560B2; EP3662084A1; JP2020533950A; WO2019028166A1; JP2022071023A; KR20210121294A; KR102307473B1; JP7282942B2; AU2018312560A1; JP7032452B2; KR20200026218A; US20220411859A1; SG11201911871TA; KR20230004943A; NZ759924A; CA3067048C

Abstract

本文提供的系统、方法和组合物涉及包封遗传物质的珠的制备。一些实施方案包括在该珠内制备核酸文库，其中该珠包括允许试剂扩散而同时保留遗传物质的孔隙。

Description

用于核苷酸测序的水凝胶珠

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年8月1日提交的题为“HYDROGEL BEADS FOR NUCLEOTIDESEQUENCING”的美国临时申请No.62/539,956的优先权，其通过引用整体并入本文。

技术领域

本文提供的系统、方法和组合物涉及用于空间索引测序和核酸文库制备的水凝胶珠以及将材料包封在水凝胶珠内的方法。

背景技术

下一代测序仪是功能强大的工具，其每次测序运行生成大量的基因组数据。解释和分析这种大量数据可能具有挑战性。单细胞DNA测序正在成为用于研究基因组异质性的一种工具。具体而言，可以通过仅从单细胞获得DNA序列来对携带多个重复基因组区域的微生物组进行测序。这将大大简化下游测序数据比对过程。

发明内容

本文提供的一些实施方案涉及用于进行核酸反应的珠。在一些实施方案中，该珠包括水凝胶聚合物和布置于水凝胶聚合物内的遗传物质。在一些实施方案中，珠包括允许试剂通过珠扩散而同时保留遗传物质的孔隙。在一些实施方案中，珠的直径为约2μm至约120μm，例如直径2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110或120μm，或者在上述任意两个值限定的范围内的直径。在一些实施方案中，水凝胶聚合物包括聚乙二醇(PEG)-硫醇、PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰基)胱胺、PEG、聚环氧丙烷(PPO)、聚丙烯酸、聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)(PHEMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、硫酸藻酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、壳聚糖、纤维素、胶原蛋白、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或其组合。在一些实施方案中，水凝胶聚合物包括聚乙二醇(PEG)-硫醇/PEG-丙烯酸酯。在一些实施方案中，水凝胶聚合物包括丙烯酰胺/N,N’-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)。在一些实施方案中，水凝胶聚合物包括PEG/聚环氧丙烷(PPO)。在一些实施方案中，遗传物质是细胞、核酸或微生物组。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞或细菌细胞。在一些实施方案中，细胞是大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、嗜水气单胞菌细胞或成纤维细胞。在一些实施方案中，核酸是300个碱基对或更大的DNA或RNA。在一些实施方案中，试剂包括酶、化学物质和尺寸小于50个碱基对的引物。在一些实施方案中，试剂包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如，Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如，Tn5)、引物(例如，P5和P7接头(adaptor)序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子。

本文提供的一些实施方案涉及将遗传物质包封在水凝胶珠内的方法。在一些实施方案中，该方法包括将遗传物质与溶液中的水凝胶聚合物混合，并将溶液与不混溶的流体混合以形成包封遗传物质的水凝胶珠。在一些实施方案中，水凝胶珠包括允许试剂通过水凝胶珠扩散而同时保留遗传物质的孔隙。在一些实施方案中，水凝胶珠的直径为约2μm至约120μm，例如直径2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、45、50、60、70、80、90、100、110或120μm，或在上述任意两个值限定的范围内的直径。在一些实施方案中，水凝胶聚合物包括聚乙二醇(PEG)-硫醇、PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰基)胱胺、PEG、聚环氧丙烷(PPO)、聚丙烯酸、聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)(PHEMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、硫酸藻酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、壳聚糖、纤维素、胶原蛋白、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或其组合。在一些实施方案中，水凝胶聚合物包括聚乙二醇(PEG)-硫醇/PEG-丙烯酸酯。在一些实施方案中，水凝胶聚合物包括丙烯酰胺/N,N’-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)。在一些实施方案中，水凝胶聚合物包括PEG/聚环氧丙烷(PPO)。在一些实施方案中，遗传物质是细胞、核酸或微生物组。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞或细菌细胞。在一些实施方案中，细胞是大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、嗜水气单胞菌细胞或成纤维细胞。在一些实施方案中，核酸是300个碱基对或更大的DNA或RNA。在一些实施方案中，试剂包括尺寸小于50个碱基对的酶、化学物质和引物。在一些实施方案中，试剂包含溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如，Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如，Tn5)、引物(例如，P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子。

本文提供的一些实施方案涉及将遗传物质包封在水凝胶珠内的方法。在一些实施方案中，该方法包括将包含水凝胶聚合物和遗传物质的水溶液与不混溶的流体混合，将水溶液输入到液滴发生器中，并产生包封遗传物质的水凝胶珠。在一些实施方案中，水凝胶珠包括允许试剂扩散通过水凝胶珠而同时保留遗传物质的孔隙。在一些实施方案中，水凝胶珠的直径为约2μm至约120μm，例如直径2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、45、50、60、70、80、90、100、110或120μm，或在上述任意两个值限定的范围内的直径。在一些实施方案中，水凝胶聚合物包括聚乙二醇(PEG)-硫醇、PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰基)胱胺、PEG、聚环氧丙烷(PPO)、聚丙烯酸、聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)(PHEMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、硫酸藻酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、壳聚糖、纤维素、胶原蛋白、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或其组合。在一些实施方案中，水凝胶聚合物包括聚乙二醇(PEG)-硫醇/PEG-丙烯酸酯。在一些实施方案中，水凝胶聚合物包括丙烯酰胺/N,N’-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)。在一些实施方案中，水凝胶聚合物包括PEG/聚环氧丙烷(PPO)。在一些实施方案中，遗传物质是细胞、核酸或微生物组。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞或细菌细胞。在一些实施方案中，细胞是大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、嗜水气单胞菌细胞或成纤维细胞。在一些实施方案中，核酸是300个碱基对或更大的DNA或RNA。在一些实施方案中，试剂包括酶、化学物质和尺寸小于50个碱基对的引物。在一些实施方案中，试剂包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如，Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如，Tn5)、引物(例如，P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子。

本文提供的一些实施方案涉及从包封在珠内的遗传物质制备核酸文库的方法。在一些实施方案中，该方法包括获得如本文所述的具有布置在其中的遗传物质的珠，扩增包封在珠内的遗传物质，对包封在珠内的遗传物质进行标签化(tagementation)反应，并对遗传物质进行测序，从而产生包封在珠内的核酸文库。在一些实施方案中，遗传物质是细胞，并且该方法进一步包括裂解细胞和提取核酸。在一些实施方案中，细胞用溶菌酶裂解，并用蛋白酶K处理以提取核酸。在一些实施方案中，标签化反应包括使遗传物质与包括接头序列和转座体的转座酶混合物接触。在一些实施方案中，该方法进一步包括将核酸文库接种在固体支持物上。在一些实施方案中，接种包括降解珠以从珠释放核酸文库。在一些实施方案中，珠通过使珠与切割混合物接触或通过将珠加热至约90℃来降解以释放核酸文库。在一些实施方案中，切割混合物包括(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(3-羟丙基)膦(THP)。在一些实施方案中，固体支持物是流动池装置。

附图说明

图1A是说明通过手动涡旋制备水凝胶珠的实施方案的示意图。图1B是显示通过该方法形成的珠的显微照片，其中发现珠的直径范围为约2μm至约100μm。

图2A是显示使用微流体液滴发生器制备水凝胶珠的实施方案的示意图。图2B是显示通过该方法形成的珠的显微图像，其中基于微流体液滴发生器的尺寸，珠具有均匀的大小。

图3包括说明了使用与图2中描述的相同的微流体液滴生成将各种浓度的异丙醇添加到水凝胶聚合物中的效果的线图。图3还显示了不同尺寸的水凝胶聚合物的几张显微照片。

图4A和4B是捕获在不同尺寸的水凝胶中的荧光染料染色的细菌细胞的显微照片。图4A描绘了直径约100μm的水凝胶珠，其包封了许多细菌细胞。图4B描绘了包封一个或两个细菌细胞的约10μm直径的水凝胶珠。

图5A显示了用寡核苷酸对水凝胶珠进行功能化的实施方案。图5B显示了具有和不具有叠氮化(azidification)的寡核苷酸功能化水凝胶珠的显微照片。图5C显示捕获SeqB序列的聚T功能化水凝胶珠的显微照片。图5D显示了第二链合成后(右曲线)和标签化后(左曲线)的DNA的电色谱图。

图6A和6B是显示了包封在水凝胶珠内的小鼠成纤维细胞(NIH-3T3)的显微照片。图6A显示了单细胞在快速胶凝条件下包封。图6B显示了在慢速胶凝条件下多个细胞被水凝胶包封。

图7A显示了制备具有二硫键的水凝胶聚合物的方法的实施方案，该二硫键在还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(3-羟丙基)膦(THP)的存在下可裂解。图7B显示了已经化学切割，从而允许释放包封的遗传物质的水凝胶珠的显微照片。图7C是显示包封的遗传物质从水凝胶珠释放的显微照片。

图8A-8C显示了一个实施方案的步骤，该实施方案使用包封的遗传物质进行使用组合索引的凝胶内条码化(图8A)、包封在水凝胶珠内的单个细菌细胞的测序(图8B)以及使用含有组装在其上的条码化转座体复合物或经由聚合酶链反应(PCR)插入到标签化DNA中的条码化寡核苷酸的凝胶内条码化(图8C)。

图9显示了在水凝胶珠内进行DNA扩增的步骤。细菌细胞被包封在水凝胶珠内。捕获的细胞用溶菌酶裂解，且蛋白质用蛋白酶K变性。gDNA在图面a)中，使用多重置换扩增(MDA)扩增包封的珠内的gDNA。在图面b)中，DNA标签化并通过PCR扩增。在图面c)中，标签化DNA通过将水凝胶珠加热至90℃从水凝胶珠洗脱。图像显示了用SYTOX嵌入剂染料染色的DNA的荧光强度。

图10描绘了显示DNA文库在固体表面上释放以用于接种和簇集的显微照片。图面a)描绘了带有标签化细菌基因组的单个水凝胶珠，其被加载具有固定在其上的P5和P7引物的固体表面上。图面b)显示了洗脱、接种和等温桥连扩增的单链DNA。在图面c)中，显示了接种的扩增DNA的梯度簇密度。DNA用SYTOX嵌入剂染料染色。

图11A是描绘含有通过加热至90℃从水凝胶珠释放的遗传物质的上清液的12循环PCR获得的DNA文库的生物分析仪(Bioanalyzer)迹线的线图。在图11B中，水凝胶珠未加热，因此DNA文库不从水凝胶珠释放，且没有看到文库。

图12描绘了DNA测序簇的空间限制。图面(a)显示了源自两个不同水凝胶珠的两个独特索引的DNA文库的第一碱基测序读数。图面(b)显示了两个文库的空间分离。如图面(c)的显微照片图像所示，分离的文库是空间不同的，并且源自不同的水凝胶珠。

图13描绘了来自具有空间分离的三种不同细菌细胞(枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和嗜水气单胞菌)的条码化水凝胶珠文库的第一碱基测序数据的显微照片。

图14A-14B描绘了从水凝胶珠释放到流动池表面上的空间索引的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和嗜水气单胞菌文库的测序矩阵。

图15A-15C描绘了用含有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或嗜水气单胞菌细菌的水凝胶珠接种的流动池的MiSeq测序结果。图15A是描绘来自MiSeq显微分析的原始数据的图像。图15B是显示与特定基因组比对的不同微生物簇的图像。例如，小点是与大肠杆菌基因组比对的簇，其显示了组分布模式。图15C是三种不同细菌物种的通过过滤器的总结表。

具体实施方式

在下面的详细说明中，参考了构成说明书的部分的附图。在附图中，除非上下文另外指出，否则相似的符号通常标识相似的组件。在详细说明、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并不意味着是限制性的。在不脱离本文提出的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以进行其他改变。容易理解的是，可以以广泛多样的不同配置来排列、替换、组合、分离和设计如本文一般地描述的以及在附图中示出的本公开的方面，所有这些在本文中明确地构想。

本文提供的组合物、系统和方法的实施方案涉及包封遗传物质的珠。该珠可以包括水凝胶聚合物和交联剂，其在遗传物质的存在下混合，并且其形成包封遗传物质的水凝胶珠。在一些实施方案中，遗传物质包括核酸、细胞、微生物组或基因组。水凝胶珠可以包括允许试剂通过水凝胶珠扩散而同时将遗传物质保留在珠内的孔隙，从而允许反应在珠内发生。还提供了使用包封遗传物质的珠进行核酸反应的方法。

一些实施方案涉及制备包封整个单细胞的水凝胶珠的方法。在一些实施方案中，包封单细胞的水凝胶珠可用于处理细胞基因组并在珠内进行全DNA文库的制备。在一些实施方案中，包封单细胞的水凝胶珠可用于同时处理细胞基因组DNA和mRNA，并在珠内部进行全DNA文库制备。水凝胶的孔隙大小可以进行工程设计以允许酶、化学物质和较小尺寸的引物(<50bp)扩散，同时保留较大的核酸(>300bp)，使得完整的全基因组DNA、mRNA和产生的DNA文库可以在整个过程中保留在水凝胶珠内部。在一些实施方案中，特异性引物可以在水凝胶珠基质内化学连接以杂交和处理特异性基因组DNA或mRNA。然后来自单细胞的DNA文库可以释放到特定区域，例如在流动池表面上，用于文库接种。随后，这导致源于单个细胞的“DNA簇”在流动池上的空间分布，从而简化后处理过程中的阅读片段比对。

水凝胶包封方法可用于其他复杂的文库制备操作，例如单细胞基因组学/转录组学应用，因为该方法允许核酸分子保留在水凝胶内部，而同时能够实现试剂的交换以对DNA分子进行各种酶促/化学操作。与目前的将微生物FACS分选到微孔中以执行各种裂解和文库制备工作流程且低通量(每平板96或384个细胞)的现有技术相比，发现这种方法增强对微生物物种的单细胞基因组学的效用。本文所述的方法使成千上万的微生物能够以有效的过程转化为条码化文库。

如本文所用，术语“试剂”描述了可用于与样品反应、相互作用、稀释或添加至样品中的试剂或者两种或更多种试剂的混合物，并且可包括用于核酸扩增反应中的试剂，包括例如缓冲剂、化学物质、酶、聚合酶、尺寸小于50个碱基对的引物、模板核酸、核苷酸、标记物、染料或核酸酶。在一些实施方案中，试剂包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如，Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如，Tn5)、引物(例如，P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子。

包封遗传物质的水凝胶珠

一个实施方案包括包含水凝胶聚合物和遗传物质的珠。如本文所用，术语“水凝胶”是指当有机聚合物(天然或合成的)通过共价、离子或氢键交联以产生将水分子截留到其中的三维开放晶格结构而形成凝胶时形成的物质。在一些实施方案中，水凝胶可以是生物相容性水凝胶。如本文所用，术语“生物相容性水凝胶”是指形成对活细胞无毒并且允许氧气和营养物质充分扩散到截留的细胞以保持存活力的凝胶的聚合物。在一些实施方案中，水凝胶聚合物包括60-90％的流体，如水，和10-30％的聚合物。在某些实施方案中，水凝胶的水含量为约70-80％。

可以通过使亲水性生物聚合物或合成聚合物交联来制备水凝胶。因此，在一些实施方案中，水凝胶可包括交联剂。如本文所用，术语“交联剂”是指当与合适的基础单体反应时可以形成三维网络的分子。水凝胶聚合物(其可以包括一种或多种交联剂)的实例包括但不限于透明质酸、壳聚糖、琼脂、肝素、硫酸盐、纤维素、藻酸盐(包括硫酸藻酸盐)、胶原蛋白、葡聚糖(包括硫酸葡聚糖)、果胶、角叉菜胶、聚赖氨酸、明胶(包括A型明胶)、琼脂糖、(甲基)丙烯酸酯-低聚乳酸-PEO-低聚乳酸-(甲基)丙烯酸酯、PEO-PPO-PEO共聚物(Pluronics)、聚(磷腈)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、PL(G)A-PEO-PL(G)A共聚物、聚(乙烯亚胺)、聚乙二醇(PEG)-硫醇、PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰基)胱胺、PEG、聚环氧丙烷(PPO)、聚丙烯酸、聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)(PHEMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或它们的组合。因此，例如，组合可以包括聚合物和交联剂，例如聚乙二醇(PEG)-硫醇/PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺/N,N'-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)或PEG/聚环氧丙烷(PPO)。

在一些实施方案中，交联剂在水凝胶聚合物中形成二硫键。如图7A所示，交联剂可形成二硫键，从而连接水凝胶聚合物。在一些实施方案中，水凝胶聚合物形成具有孔隙的水凝胶基质(例如，多孔水凝胶基质)。这些孔隙能够在水凝胶珠内保留足够大的遗传物质，但允许小的物质(如试剂)穿过孔隙，从而进出水凝胶珠。在一些实施方案中，通过改变聚合物的浓度与交联剂的浓度的比率来精细调节孔隙大小。在一些实施方案中，聚合物与交联剂的比率为30：1、25：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：15、1：20或1:30，或在由上述比率中的任何两个限定的范围内的比率。在一些实施方案中，可以将如DNA引物或带电化学基团的附加功能接枝到聚合物基质上以满足不同应用的要求。

如本文所用，术语“孔隙率”是指由开放空间(例如，孔隙或其他开口)组成的水凝胶的分数体积(无量纲)。因此，孔隙率测量材料中的空白空间，并且是空白体积相对于总体积的分数，为0到100％(或0到1)之间的百分比。水凝胶的孔隙率可在0.5至0.99，约0.75至约0.99或约0.8至约0.95的范围内。

水凝胶可以具有任何孔隙大小。如本文所用，术语“孔隙大小”是指孔隙的横截面的直径或有效直径。术语“孔隙大小”还可以指基于多个孔隙的测量值的孔隙横截面的平均直径或平均有效直径。非圆形的横截面的有效直径等于具有与该非圆形横截面相同的横截面积的圆形横截面的直径。在一些实施方案中，当水凝胶水化时，水凝胶可溶胀。孔隙大小的尺寸然后可以根据水凝胶中的水含量而改变。在一些实施方案中，水凝胶的孔隙可具有足够大小的孔以将遗传物质保留在水凝胶内但允许试剂通过。

在一些实施方案中，交联剂是可逆交联剂。在一些实施方案中，可逆交联剂能够使水凝胶聚合物可逆地交联，并且能够在切割剂(cleaver)存在下解交联。在一些实施方案中，交联剂可以通过还原剂的存在、通过升高的温度或通过电场来切割。在一些实施方案中，可逆交联剂可以是N,N’-双(丙烯酰基)胱胺，一种聚丙烯酰胺凝胶的可逆交联剂，其中二硫键可以在合适的还原剂存在下断裂。如图6A和6B所示，使交联剂与还原剂接触切割交联剂的二硫键，从而破坏水凝胶珠。如图7C所示，水凝胶珠降解并释放内容物，例如保留在其中的核酸。在一些实施方案中，交联剂通过将温度升高至大于50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100℃来裂解。在一些实施方案中，交联剂通过使水凝胶珠与还原剂接触来裂解。在一些实施方案中，还原剂包括膦化合物、水溶性膦、含氮膦及其盐和衍生物、二硫赤藓糖醇(DTE)、二硫苏糖醇(DTT)(分别2,3-二羟基-1,4-二硫代丁烷的顺式和反式异构体)、2-巯基乙醇或β-巯基乙醇(BME)、2-巯基乙醇或氨基乙硫醇、谷胱甘肽、巯基乙醇酸盐或巯基乙醇酸、2,3-二巯基丙醇、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、三(羟甲基)膦(THP)或对-[三(羟甲基)膦]丙酸(THPP)。

在一些实施方案中，升高温度以增加扩散或与还原剂的接触使交联剂降解，从而包封的遗传物质从水凝胶珠释放。

在一些实施方案中，交联剂的交联在水凝胶珠内建立孔隙。在一些实施方案中，水凝胶珠中孔隙的大小是可调节的，并且被配制为包封遗传物质，例如细胞或大于约300个碱基对的核酸，但是允许较小的颗粒(如试剂)或少于约50个碱基对的较小尺寸的核酸(例如引物)通过孔隙。在一些实施方案中，试剂包括用于处理遗传物质的试剂，例如用于从细胞分离核酸、用于扩增或测序核酸或用于制备核酸文库的试剂。在一些实施方案中，试剂包括例如溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如，Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如，Tn5)、引物(例如，P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、三磷酸脱氧核苷酸、缓冲剂或二价阳离子。

在一些实施方案中，水凝胶珠包括遗传物质。如本文所用，遗传物质是指细胞、微生物组或核酸。在一些实施方案中，细胞是单细胞，包括原核或真核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，遗传物质是病毒颗粒。在一些实施方案中，核酸是长DNA分子、基因组DNA、病毒核酸、细菌核酸或哺乳动物核酸。任何遗传物质可以包封在水凝胶珠内。

制备珠的方法

本文提供的一些实施方案涉及制备包封遗传物质的珠的方法。在一些实施方案中，水凝胶珠通过涡旋辅助乳化制备。如本文所用，涡旋辅助乳化是指水凝胶聚合物与遗传物质在容器中(例如在管、小瓶或反应容器中)的涡旋，如图1A和1B所示。组分可以例如通过手动或机械涡旋或摇动来混合。在一些实施方案中，手动混合导致大小为2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或150μm直径大小，或者在上述任意两个值定义的范围内的大小的包封遗传物质的水凝胶珠。在一些实施方案中，珠的尺寸是不均匀的，因此珠的尺寸包括各种直径的珠。

在一些实施方案中，珠通过微流体流技术制备。微流体流包括使用用于辅助凝胶乳液生成的微流体装置200，如图2A所示。在一些实施方案中，微流体装置200包括微通道，其配置成产生期望大小的水凝胶珠210，并配置成每个珠包封选择量的遗传物质。在一些实施方案中，微流体装置200具有50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μm的高度，或由上述任意两个值定义的范围内的高度。在一些实施方案中，微流体装置200包括一个或多个通道。在一些实施方案中，微流体装置200包括用于水性流的通道215和用于不混溶流体的通道220。在一些实施方案中，一个或多个通道的宽度是相同的。在一些实施方案中，一个或多个通道的宽度是不同的。在一些实施方案中，一个或多个通道的宽度是20、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、135、140、145或150μm，或者在上述任意两个值定义的范围内的宽度。在一些实施方式中，水相通道的宽度为75μm。在一些实施方案中，不混溶流体通道的宽度是78μm。本领域技术人员将认识到，宽度可以变化以精细地调节珠210的尺寸。除了微流体装置200的尺寸和通道的宽度之外，水相通道和不混溶流体通道的流速也可能影响水凝胶珠的大小。

在一些实施方案中，在水相通道中溶液的流速为1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150μL/min，或在上述任意两个值定义的范围内的速率。在一些实施方案中，不混溶流体通道中不混溶流体的流速为20、30、50、80、100、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、350、375或400μL/min，或在上述任意两个值定义的范围内的速率。在一些实施方案中，水相中的溶液包括水凝胶聚合物、交联剂和遗传物质，其以小于不混溶流体的流速通过水相通道215流入不混溶流体如载体油中，从而形成小滴。在一些实施方案中，不混溶流体是油，例如矿物油、烃油、硅油或聚二甲基硅氧烷油，或其混合物。在一些实施方案中，将含有遗传物质的水凝胶小滴配制成均匀的尺寸分布。在一些实施方案中，通过调节微流体装置的尺寸、一个或多个通道的尺寸或者水溶液或不混溶流体中任一个或两者的流速来精细调节水凝胶珠的尺寸。在一些实施方案中，所得水凝胶珠的直径范围为2-150μm，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或150μm，或者在上述任意两个定义的范围内的直径。

在一些实施方案中，包封遗传物质的水凝胶珠的大小和均匀性可以通过在珠形成之前使水凝胶聚合物与流体改性剂例如与醇(包括异丙醇)接触来进一步控制。如图3所示，在不存在异丙醇的情况下，形成的珠的直径大于在异丙醇存在的情况下形成的珠的直径。异丙醇影响水凝胶聚合物的流体性质，从而允许调节水凝胶珠。

在一些实施方案中，无论是通过涡旋辅助乳化还是微流体惯性流辅助乳化制备，水凝胶珠包封单一或不同的遗传物质。例如，在一些实施方案中，珠包封单细胞。在一些实施方案中，可通过稀释或浓缩输入样品中的遗传物质来控制珠内遗传物质的量。如本文所述，包括遗传物质的样品与水凝胶聚合物混合，并且包含遗传物质的水凝胶聚合物进行涡旋辅助乳化或微流体流辅助乳化。

在一些实施方案中，水凝胶珠用核苷酸功能化。在一些实施方案中，核苷酸是寡核苷酸或聚T核苷酸。在一些实施方案中，核苷酸与水凝胶珠结合，并且功能化的珠可用于目的核苷酸的靶向捕获。

处理水凝胶珠内的遗传物质的方法

本文提供的一些实施方案涉及处理珠内的遗传物质的方法。在一些实施方案中，包封在水凝胶珠内的遗传物质与一种或多种试剂接触用于核酸处理。在一些实施方案中，遗传物质保留在水凝胶珠内，并且试剂能够穿过水凝胶珠的孔隙。在一些实施方案中，试剂可包括裂解剂、核酸纯化剂、DNA扩增剂、标签化剂、PCR剂或用于遗传物质处理的其他试剂。因此，水凝胶珠通过允许试剂进入和流出水凝胶珠的屏障而同时将遗传物质本身保留在珠内提供了水凝胶珠内遗传物质的受控反应的微环境。

如本文所用，术语“标签化”是指通过包含与含有转座子末端序列的接头复合的转座酶的转座体复合物对DNA的修饰。标签化同时导致DNA的片段化和接头与双链体片段的两条链的5'末端的连接。在去除转座酶的纯化步骤之后，另外的序列可以添加至衔接的片段的末端，例如通过PCR、连接或本领域技术人员已知的任何其他合适的方法。

在一些实施方案中，整个DNA文库的制备可以通过穿过多孔水凝胶的多个试剂交换而同时将gDNA及其文库产物保留在水凝胶基质中在水凝胶珠内部无缝地完成。水凝胶可耐受高达95℃的高温达数小时，以支持不同的生化反应。

在一些实施方案中，处理包封细胞或病毒颗粒的水凝胶珠以从细胞或颗粒纯化和分离核酸。因此，例如，水凝胶珠与裂解缓冲液接触。如本文所用，“裂解”是指对细胞壁或病毒颗粒的扰动或改变，从而有助于接近或释放细胞RNA或DNA。细胞壁的完全破坏或破裂都不是裂解的基本要求。术语“裂解缓冲液”是指包含至少一种裂解剂的缓冲液。典型的酶促裂解剂包括但不限于溶菌酶、葡萄糖酶、消解糖、溶细胞酶、蛋白酶K、蛋白酶E及病毒内溶素和外溶素。因此，例如，可通过将裂解剂如溶菌酶和蛋白酶K引入水凝胶珠中来进行珠中细胞的裂解。来自细胞的gDNA现在包含在珠内。在一些实施方案中，在裂解处理后，分离的核酸保留在水凝胶珠内，并且可以用于进一步处理。

如本文所用，除非另有说明，本文所用的术语“分离的”、“待分离”、“分离”、“纯化的”、“待纯化”、“纯化”及其语法等同术语是指减少来自样品或来自材料从其分离的来源(例如，细胞)的至少一种污染物(例如蛋白质和/或核酸序列)的量。因此，纯化导致“富集”，例如，样品中所需蛋白质和/或核酸序列的量增加。

在裂解和核酸分离后，可以进行扩增，例如多重置换扩增(MDA)，其是广泛用于扩增少量的DNA(尤其是来自单细胞)的技术。在一些实施方案中，包封的核酸进行扩增、测序或用于制备核酸文库。如本文所用，如用于提及核酸或核酸反应的术语“扩增”或“扩增的”、“扩大”是指制备特定核酸如靶核酸或包封(例如，通过本发明的实施方案)在珠内的核酸的拷贝的体外方法。扩增核酸的许多方法是本领域已知的，并且扩增反应包括聚合酶链反应、连接酶链反应、链置换扩增反应、滚环扩增反应、基于多重退火和循环的扩增循环(MALBAC)、转录介导的扩增方法如NASBA、环介导的扩增方法(例如，使用环形成序列的“LAMP”扩增)。被扩增的核酸可以是包含DNA或RNA或DNA和RNA的混合物、由其组成或由其衍生的DNA，包括修饰的DNA和/或RNA。由一个或多个核酸分子的扩增产生的产物(例如“扩增产物”)(无论起始核酸是DNA、RNA还是两者)可以是DNA或RNA，或者DNA和RNA核苷或核苷酸的混合物，或者它们可以包含修饰的DNA或RNA核苷或核苷酸。“拷贝”不必然意味着与靶序列的完美序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包括核苷酸类似物，如脱氧肌苷或脱氧尿苷、有意的序列改变(如通过包含与靶序列可杂交但不互补的序列的引物引入的序列改变)和/或在扩增过程中发生的序列错误。

可以根据本领域已知的任何合适的扩增方法来扩增在水凝胶珠内分离的包封的核酸。在一些实施方案中，包封的核酸在珠内扩增。在一些实施方案中，珠捕获在固体支持物上并降解，其中包封的核酸释放到固体支持物上，并且核酸在固体支持物上扩增。

在一些实施方案中，包封的核酸在水凝胶珠内扩增。例如，在一些实施方案中，扩增引物和酶穿过水凝胶珠的孔隙并与包封的核酸杂交。

应当理解，本文所述或本领域通常已知的任何扩增方法可与通用或靶标特异性引物一起用于扩增包封的核酸。合适的扩增方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)，如美国专利号8,003,354中所述的，其全部内容通过引用合并于此。上述扩增方法可用于扩增一种或多种目的核酸。例如，可以利用包括多重PCR、SDA、TMA、NASBA等的PCR来扩增包封的核酸。在一些实施方案中，特异性针对目的核酸的引物包括在扩增反应中。

其他合适的用于核酸扩增的方法可包括寡核苷酸延伸和连接、滚环扩增(RCA)(Lizardi等人，Nat.Genet.19：225-232(1998)，其通过引用并入本文)和寡核苷酸连接测定(OLA)技术(一般参见美国专利号7,582,420、5,185,243、5,679,524和5,573,907；EP 0 320308 B1；EP 0 336 731 B1；EP 0 439 182 B1；WO 90/01069；WO 89/12696和WO 89/09835，其全部通过引用并入)。应当理解，可以将这些扩增方法设计为扩增包封的核酸。例如，在一些实施方案中，扩增方法可以包括连接探针扩增或寡核苷酸连接测定(OLA)反应，其包含特异性地针对目的核酸的引物。在一些实施方案中，扩增方法可以包括引物延伸-连接反应，其包含特异性地针对目的核酸的引物，并且其能够通过水凝胶孔隙。作为可以专门设计来扩增目的核酸的引物延伸和连接引物的非限制性实例，扩增可以包括用于GoldenGate分析的引物(Illumina，Inc.，San Diego，CA)，例如由美国专利号7,582,420和7,611,869示例的，其各自全部通过引用整体并入本文。在所描述的每种方法中，核酸反应中涉及的试剂和组分能够穿过水凝胶珠的孔隙而同时将核酸本身保留在珠内。

在一些实施方案中，使用簇扩增方法来扩增包封的核酸，如美国专利号7,985,565和7,115,400的公开所示例的，其各自的内容通过引用整体并入本文。美国专利号7,985,565和7,115,400的并入材料描述了核酸扩增的方法，其允许将扩增产物固定在固体支持物上以形成由固定的核酸分子的簇或“集落”构成的阵列。这样的阵列上的每个簇或集落由多个相同的固定多核苷酸链和多个相同的固定互补多核苷酸链形成。如此形成的阵列在本文中通常称为“簇集阵列”。固相扩增反应的产物，例如美国专利号7,985,565和7,115,400中描述的那些，是通过使固定的多核苷酸链和固定的互补链的对退火而形成的所谓的“桥连”结构，两条链优选地通过共价连接以5'端固定在固体支持物上。簇扩增方法是其中固定的核酸模板用于产生固定的扩增子的方法的实例。其他合适的方法也可以用于从根据本文提供的方法产生的固定DNA片段产生固定的扩增子。例如，无论每对扩增引物中的一个或两个引物是否固定，一个或多个簇或集落可以通过固相PCR形成。在一些实施方案中，包封的核酸在珠内扩增，和然后以簇沉积在阵列中或在固体支持物上。例如，如图12所示，对包封核酸的水凝胶珠进行处理，且其中包含的核酸用于建立两个不同的索引的DNA文库。制备了两种类型的包含PhiX文库的水凝胶珠，一种具有索引2(CGATGT)，和另一种具有索引4(TGACCA)。具有索引2和索引4的水凝胶珠混合并加载到流动池中。珠与表面接触和降解，并且文库沉积在表面上。显微照片描绘了核酸成像，其显示了基于单独的立珠内的独立环境形成的簇。该图像显示了索引2和索引4文库之间的空间分离，表明文库源自不同的水凝胶珠。比例尺＝50μm。

另外的扩增方法包括等温扩增。可以使用的示例性等温扩增方法包括但不限于，例如由Dean等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：5261-66(2002)所例示的多重置换扩增(MDA)，或例如由美国专利号6,214,587所例示的等温链置换核酸扩增，其各自通过引用整体并入本文。可以在本公开中使用的其他非基于PCR的方法包括例如链置换扩增(SDA)，其在例如Walker等人，Molecular Methods for Virus Detection，Academic Press，Inc.，1995；美国专利号5,455,166和5,130,238以及Walker等人，Nucl.Natl.Acad.Sci.USA，20：1691-96(1992)中描述，或超支化链置换扩增，其在例如Lage等人，Genome Research 13：294-307(2003)中描述，其每一个通过引用整体并入本文。等温扩增方法可与链置换Phi 29聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段5'->3'exo-一起使用以用于基因组DNA的随机引物扩增。这些聚合酶的使用利用了它们的高持续合成性(processivity)和链置换活性。高持续合成性允许聚合酶产生长度为10-20kb的片段。如上所述，使用具有低持续合成性和链置换活性的聚合酶，例如Klenow聚合酶，可以在等温条件下产生较小的片段。扩增反应、条件和组分的其他描述在美国专利号7,670,810的公开中详细给出，其全部内容通过引用合并于此。在一些实施方案中，进行这些扩增反应所需的聚合酶、试剂和组分能够穿过水凝胶珠的孔隙以与包封的核酸相互作用，从而扩增水凝胶珠内的核酸。在一些实施方案中，随机六聚体与变性的DNA退火，然后在催化酶Phi 29存在的情况下在恒定温度下进行链置换合成。这导致了珠内的DNA扩增，如通过在MDA之后荧光强度的增加(DNA用SYTOX染色)证实的(图9，图面a)。独立地，也可以进行裂解和清理后的基于Nextera的标签化，以及随后通过PCR的gDNA扩增，如Nextera标签化和PCR后珠内荧光强度的显著增加所指示的(图9，图面b)。在这种Nextera文库制备后，凝胶珠可加热至80℃3分钟以释放珠的内容物，即，如图9，图面c所示，来自单细胞的待测序文库产物。

在本公开中有用的另一种核酸扩增方法是标记PCR，其使用具有恒定5'区和随后的随机3'区的两结构域引物群体，例如，如在Grothues等人，Nucleic Acids Res.21(5):1321-2(1993)中所述的，其在此全文通过引用引入。进行第一轮扩增以允许在基于来自随机合成的3'区的个体杂交热变性DNA上的大量启动。由于3'区的性质，设想起始位点在整个基因组中是随机的。此后，可以去除未结合的引物，并且可以使用与恒定5'区互补的引物进行进一步的重复。

在一些实施方案中，包封的核酸在水凝胶珠内全部或部分测序。可以根据任何合适的测序方法，如直接测序，包括合成测序、连接测序、杂交测序、纳米孔测序等，对包封的核酸进行测序。如图8B中示意性地示出的，包封在水凝胶珠内的单细胞可以被处理用于单细胞测序。

一种测序方法是合成测序(SBS)。在SBS中，监测核酸引物沿核酸模板(例如靶核酸或其扩增子)的延伸以确定模板中核苷酸的序列。基础的化学过程可以是聚合反应(例如，通过聚合酶催化的)。在特定的基于聚合酶的SBS实施方案中，将荧光标记的核苷酸以模板依赖的方式添加到引物上(从而延伸引物)，使得添加到引物上的核苷酸的顺序和类型的检测可以用于确定模板的序列。

一种或多种扩增的包封核酸可以进行SBS或其他检测技术(其涉及试剂在循环中的重复递送)。例如，为了启动第一SBS循环，一个或多个标记的核苷酸、DNA聚合酶等可以流入/通过容纳一个或多个扩增的核酸分子的水凝胶珠。可以检测引物延伸导致标记的核苷酸掺入的那些位点。任选地，核苷酸可以进一步包括可逆的终止性质，其在核苷酸添加到引物中时，终止进一步的引物延伸。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加至引物，使得随后的延伸不能发生直到解封闭剂(deblocking agent)被递送以除去该部分。因此，对于使用可逆终止的实施方案，解封闭剂可以递送至流动池(在检测发生之前或之后)。可以在各个递送步骤之间进行洗涤。然后该循环可以重复n次以将引物延伸n个核苷酸，从而检测长度n的序列。可以容易地适应于与通过本公开的方法产生的扩增子一起使用的示例性SBS程序、流体系统和检测平台描述于例如Bentley等人，Nature 456：53-59(2008)，WO 04/018497；美国专利号7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；美国专利号7,329,492；美国专利号7,211,414；美国专利号7,315,019；美国专利号7,405,281和US 2008/0108082中，其各自通过引用并入本文。

可以使用利用循环反应的其他测序程序，例如焦磷酸测序。焦磷酸测序检测无机焦磷酸(PPi)的释放，因为特定的核苷酸被掺入了新生的核酸链中(Ronaghi等人，Analytical Biochemistry 242(1)，84-9(1996)；Ronaghi，Genome Res.11(1)，3-11(2001)；Ronaghi等人Science 281(5375)，363(1998)；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568和美国专利号6,274,320，其各自通过引用引入本文)。在焦磷酸测序中，释放的PPi可以通过被ATP硫化酶立即转化为三磷酸腺苷(ATP)而进行检测，并且可以通过荧光素酶产生的光子来检测所产生的ATP的水平。因此，可以通过发光检测系统监测测序反应。用于基于荧光的检测系统的激发辐射源对于焦测序过程不是必需的。可以适用于将焦磷酸测序应用于根据本公开产生的扩增子的有用的流体系统、检测器和程序在例如WIPO专利申请序列号PCT/US11/57111，US 2005/0191698 A1，美国专利号7,595,883和美国专利号7,244,559中描述，其每个通过引用并入本文。

一些实施方案可以利用涉及实时监测DNA聚合酶活性的方法。例如，可以通过带有荧光团的聚合酶和γ-磷酸酯标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用，或利用零模波导(ZMW)来检测核苷酸掺入。用于基于FRET的测序的技术和试剂描述于例如Levene等人Science 299,682-686(2003)；Lundquist等人Opt.Lett.33,1026-1028(2008)；Korlach等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176-1181(2008)中，其公开内容通过引用并入本文。

一些SBS实施方案包括检测在核苷酸掺入延伸产物中时释放的质子。例如，基于释放质子的检测的测序可以使用可商购的电检测器和相关技术。这样的测序系统的实例是焦磷酸测序(例如，Roche子公司454Life Sciences的可商购平台)、使用γ-磷酸酯标记的核苷酸的测序(例如，Pacific Biosciences的可商购平台)和使用质子检测的测序(例如，来自Life Technologies的子公司Ion Torrent的可商购平台)或者US 2009/0026082 A1；US2009/0127589 A1；US 2010/0137143 A1；或US 2010/0282617 A1中描述的测序方法和系统，其每一个通过引用并入本文。本文阐述的使用动力学排除来扩增靶核酸的方法可以容易地应用于用于检测质子的基质。更具体地，本文阐述的方法可以用于产生用于检测质子的扩增子的克隆群体。

另一种测序技术是纳米孔测序(参见，例如，Deamer等人Trends Biotechnol.18，147-151(2000)；Deamer等人Acc.Chem.Res.35：817-825(2002)；Li等人.Nat.Mater.2：611-615(2003)，其公开内容通过引用并入本文)。在一些纳米孔实施方案中，靶核酸或从靶核酸去除的单个核苷酸穿过纳米孔。随着核酸或核苷酸穿过纳米孔，每种核苷酸类型可以通过测量孔的电导率的波动来识别。(美国专利号7,001,792；Soni等人，Clin.Chem.53,1996-2001(2007)；Healy，Nanomed.2，459-481(2007)；Cockroft等人，J.Am.Chem.Soc.130，818-820(2008)，其公开内容通过引用并入本文)。

根据本公开可应用于检测的基于阵列的表达和基因型分析的示例性方法描述于美国专利号7,582,420；6,890,741；6,913,884或6,355,431或者美国专利公开号2005/0053980 A1；2009/0186349 A1或US 2005/0181440 A1中，其各自通过引用合并在此。

在本文所述的分离核酸、扩增和测序的方法中，各种试剂用于核酸分离和制备。这样的试剂可以包括例如溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如，Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如，Tn5)、引物(例如，P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子。这些试剂穿过水凝胶珠的孔隙，而遗传物质保留在水凝胶珠内。本文阐述的方法的优点在于它们提供了用于水凝胶珠内核酸的处理的包封微环境。这使得能够进行单细胞处理以快速和有效地处理靶核酸。

接头可以包括测序引物位点、扩增引物位点和索引。如本文所用，“索引”可以包括可用作分子标识和/或条码以标记核酸和/或鉴别核酸来源的核苷酸序列。在一些实施方案中，索引可用于鉴定单个核酸或核酸的亚群。在一些实施方案中，可以在水凝胶珠粒内制备核酸文库。如图8A中示意性地示出的，包封在水凝胶珠粒内的单细胞可用于单细胞的组合索引，例如使用邻近性保留转座(CPTSeq)方法。在一些实施方案中，如图8C中示意性地示出的，来自单细胞的DNA可以通过在WGA扩增后用带有条码化转座子的另一珠包封单细胞，并通过使其与还原剂接触来溶解凝胶基质(例如)以释放用于条码化的基因组DNA而进行条码化。

本文所述的“空间索引”方法和技术的实施方案缩短了数据分析，并简化了从单细胞和长DNA分子制备文库的过程。现有的单细胞测序的方案要求细胞的有效物理分离，并对每个分离的细胞唯一地条码化和然后将其所有汇集在一起进行测序。当前的用于合成长阅读片段的方案也需要繁琐的条码化步骤，和将每个条码化片段合并在一起进行测序并进行数据分析以区分来自每个条码化细胞的遗传信息。在这些长的过程中，还存在遗传物质的损失，其导致序列的放弃。本文描述的实施方案不仅缩短了该过程，而且提高了单细胞的数据分辨率。此外，本文提供的实施方案简化了新生物体的基因组的组装。本文所述的实施方案可用于揭示罕见的遗传变异和突变的共现。在一些实施方案中，局限在水凝胶珠粒中直至释放的DNA文库提供了通过控制释放过程和水凝胶制剂来控制在表面上释放的片段大小的机会。

在一些实施方案中，文库可使用接头序列中的引物位点扩增，并使用接头序列中的测序引物位点进行测序。在一些实施方案中，接头序列可以包括索引以鉴别核酸的来源。后续扩增步骤的效率可以通过形成引物二聚体降低。为了提高后续扩增步骤的效率，可以从连接产物除去非连接的单链接头。

用水凝胶珠制备核酸文库

本文提供的系统、方法和组合物的一些实施方案包括其中接头与靶核酸连接的方法。接头可包括测序引物结合位点、扩增引物结合位点和索引。例如，接头可以包括P5序列、P7序列或其互补序列。如本文所用，P5序列包含由SEQ ID NO：1(AATGATACGGCGACCACCGA)定义的序列，和P7序列包含由SEQ ID NO：2(CAAGCAGAAGACGGCATACGA)定义的序列。在一些实施方案中，P5或P7序列可以进一步包括间隔区多核苷酸，其可以是1至20个核苷酸，例如1至15个核苷酸，或1至10个核苷酸，例如长度2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，间隔区包含10个核苷酸。在一些实施方案中，间隔区是聚T间隔子，例如10T间隔子。间隔区核苷酸可被包括在多核苷酸的5'端，其可通过与多核苷酸的5'端的键附接至合适的支持物。可以通过存在于多核苷酸5'端的含硫亲核试剂如硫代磷酸酯来实现附接。在一些实施方案中，多核苷酸包括聚T间隔子和5'硫代磷酸酯基团。因此，在一些实施方案中，P5序列是5′硫代磷酸酯-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3′，SEQ ID NO：3，并且在一些实施方案中，P7序列是5′硫代磷酸酯-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3′,SEQ ID NO.4。

索引可用于鉴别核酸分子的来源。在一些实施方案中，可以修饰接头以防止形成串接体，例如通过添加防止接头在一端或两端延伸的封闭基团。3'封闭基团的实例包括3'-间隔区C3、双脱氧核苷酸和与基质的附接。5'封闭基团的实例包括去磷酸化的5'核苷酸和与基质的附接。

接头包括核酸，例如单链核酸。接头可包括长度小于、大于或等于约5个核苷酸、10个核苷酸、20个核苷酸、30个核苷酸、40个核苷酸、50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸、100个核苷酸，或前述大小中任何两个之间的范围的短核酸。在一些实施方案中，接头具有足够的大小以穿过水凝胶珠的孔隙。靶核酸包括DNA，如基因组或cDNA；RNA，如mRNA、sRNA或rRNA；或者DNA和RNA的杂合体。可以从包封在水凝胶珠粒内的单细胞分离核酸。核酸可以包含磷酸二酯键，并且可以包括其他类型的骨架，包括例如磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基亚磷酰胺和肽核酸骨架和键。核酸可包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合，以及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤和碱基类似物，如硝基吡咯(包括3-硝基吡咯)和硝基吲哚(包括5-硝基吲哚))的任何组合。在一些实施方案中，核酸可包含至少一个混杂碱基。混杂碱基可以与一种以上不同类型的碱基进行碱基配对，并且例如当包含在寡核苷酸引物或用于在复杂核酸样品(例如基因组DNA样品)中的随机杂交的插入序列中时，可以是有用的。混杂碱基的一个例子包括可与腺嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶配对的肌苷。其他实例包括次黄嘌呤、5-硝基吲哚、无环的5-硝基吲哚、4-硝基吡唑、4-硝基咪唑和3-硝基吡咯。可以使用可以与至少两种、三种、四种或更多种类型的碱基配对的混杂碱基。

靶核酸可包括其中样品中核酸的平均大小小于、大于或等于约2kb、1kb、500bp、400bp、200bp、100bp、50bp或上述任意两个大小之间的范围的样品。在一些实施方案中，样品中核酸的平均大小小于、大于或等于约2000个核苷酸、1000个核苷酸、500个核苷酸、400个核苷酸、200个核苷酸、100个核苷酸、50个核苷酸，或在前述大小中的任何两个之间的范围。在一些实施方案中，核酸具有使得核酸被截留在水凝胶珠内的足够大小，从而其不能穿过水凝胶珠的孔隙。

一种示例方法包括使靶核酸的5'端脱磷酸以防止在随后的连接步骤中形成串接体；使用连接酶将第一接头连接至去磷酸化靶标的3'端，其中第一接头的3'端被封闭；使连接的靶标的5'端重新磷酸化；使用单链连接酶将第二接头连接至脱磷酸靶标的5'端，其中第二接头的5'端是非磷酸化的。

另一个例子包括用5'核酸外切酶部分消化核酸以形成具有单链3'突出端的双链核酸。可以将含有3'封闭基团的接头连接到具有3'突出端的双链核酸的3'端。具有3'突出端与连接的接头的双链核酸可以去杂交以形成单链核酸。可以将含有非磷酸化5'端的接头连接至单链核酸的5'端。

使核酸例如核酸的5'核苷酸脱磷酸的方法包括使核酸与磷酸酶接触。磷酸酶的例子包括小牛肠磷酸酶、虾碱性磷酸酶、南极磷酸酶和APEX碱性磷酸酶(Epicentre)。

连接核酸的方法包括使核酸与连接酶接触。连接酶的实例包括T4 RNA连接酶1、T4RNA连接酶2、RtcB连接酶、甲烷杆菌RNA连接酶和TS2126 RNA连接酶(CIRCLIGASE)。

使核酸例如核酸的5'核苷酸磷酸化的方法包括使核酸与激酶接触。激酶的实例包括T4多核苷酸激酶。

本文提供的实施方案涉及在水凝胶珠中制备核酸文库，使得核酸文库在单个反应体积中制备。

本文提供的系统和方法的实施方案包括试剂盒，其包含用于制备包封遗传物质的水凝胶珠的水凝胶聚合物、交联剂或微流体装置中的任何一种或多种，并且还包括用于遗传物质处理的组分，包括用于细胞裂解、核酸扩增和测序或用于核酸文库制备的试剂，包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如，Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如，Tn5)、引物(例如P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子，如本文所述且用于遗传物质的相应处理。

实施例

实施例1—水凝胶珠的制备

以下实施例说明了使用手动涡旋和微流体液滴发生器制备包封微生物细胞的水凝胶珠的实施方案。

在室温下解冻在-80℃下储存的包含大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和嗜水气单胞菌中的一种或多种的样品。将100μL的每种细菌溶液转移至无菌的1.7mL管中，并用1mL 0.85％NaCl洗涤样品一次。将样品沉淀并除去洗涤溶液。保存细菌沉淀用于如下所述与水凝胶溶液混合。

12％的水凝胶溶液由用去离子水稀释的40％丙烯酰胺/bis 19：1(BioRad#161-0144)制备。制备40％(w/v)丙烯酰胺/N,N'-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)(19：1)单体原液(3.8g丙烯酰胺，0.2g BACy和6mL双蒸(dd)水)。使混合物达到10mL的最终体积。为了制备溶液，将丙烯酰胺溶解在6mL的ddH₂O中，并将所得溶液用于溶解BACy。单体的溶解是吸热的，因此稍微加热混合物将有助于完全溶解单体。水凝胶溶液保持在4℃下直至使用。35μL的饱和过硫酸钾溶液(KPS；Sigma)添加到200μL的12％水凝胶溶液中并充分混合。将235μL水凝胶-KPS溶液添加到含有细菌细胞沉淀的每个管中以重悬细胞。然后将水凝胶-细菌溶液加载到含有表面活性剂(4.5％Span 80、0.4％Tween 20和0.05％Triton X-100)的600μL矿物油中。将溶液涡旋30秒以产生小滴乳液，并立即添加25μL的四甲基乙二胺(TEMED；Sigma)，然后再涡旋30秒。

为用丙烯酰胺/BACy 19：1比率(2mL)制备10％的凝胶，混合0.96mL ddH₂O、0.5mL的40％丙烯酰胺/BACy(19：1)、0.5mL 10x tris/硼酸盐/EDTA缓冲液(TBE)、20μL TEMED和20μL KPS(饱和的)。

为用丙烯酰胺/BACy 19：1比率(2mL)制备5％凝胶，混合1.21mL的ddH₂O、0.25mL的40％丙烯酰胺/BACy(19:1)、0.5mL的10x TBE、20μL TEMED和20μL KPS(饱和的)。使反应聚合直至胶凝(约3-6分钟)。

然后产生包封细菌细胞的水凝胶珠。孵育15分钟以使水凝胶珠完全交联后，向每个管中加入约900μL石油醚。将试管涡旋以洗去油，并除去上清液。通过向每个管中加入1mLPR2洗涤水凝胶珠，然后涡旋，并旋转使珠沉淀。除去上清液，并将珠用1mL PR2洗涤3次。将珠重悬于1mL PR2中。PR2中的水凝胶珠可以在4℃下储存至少3周。

上述使用手动乳化的方法可用于产生尺寸分布为直径约2μm至约100μm的水凝胶珠。

为了产生具有均匀尺寸分布的水凝胶珠，可以使用微流体液滴发生器，例如图2所示的发生器。为了形成均匀尺寸分布的水凝胶珠，将包含水凝胶聚合物和细菌细胞的水性溶液引入微流体液滴发生器中的矿物油中。该微流体装置的高度为120μm，水上通道宽度为75μm，和载体油通道宽度为78μm。利用这一芯片，使用60μL/min的水相通道流速和300μL/min的载体油通道流速。使用该装置，产生了直径约90μm的水凝胶珠。珠的尺寸可以通过调节通道宽度、微流体装置尺寸和流速来精细调节。

另外，可以通过添加异丙醇来精细调节珠的直径。如图3所示，可以以规定的量(0％至约30％v/v范围)将异丙醇加入水凝胶溶液中以形成特定直径的水凝胶珠。如图3所示，增加异丙醇的量使水凝胶珠的直径从130μm(含0％异丙醇)减小到约75μm(具有28％异丙醇)。

水凝胶珠也可以进行精细调节以包封所需量的细胞。如图4A和4B所示，发现在约100μm的每个水凝胶珠中存在许多染色的细菌细胞(图4A)，而在约10μm的每个水凝胶珠中仅加载单个细胞或几个细胞(图4B)。

另外，水凝胶珠的胶凝速率也可以决定每个水凝胶珠中的细胞量。水凝胶珠在NIH-3T3小鼠成纤维细胞存在下制备。如图6A和6B中所示，水凝胶珠的快速胶凝导致每个珠单个细胞(图6A)，而慢速胶凝导致每个珠几个细胞(图6B)。

实施例2—核苷酸功能化的水凝胶珠

以下实施例说明了用核苷酸功能化实施例1的水凝胶珠的方法。

通过使叠氮化物功能化的水凝胶珠与炔烃功能化的DNA反应，使用铜催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)化学作用获得DNA功能化的水凝胶珠(图5A)。对于叠氮化物功能化的水凝胶珠的合成，将包括单体、交联剂和自由基发生剂的水凝胶前体混合物混合，并用微流体装置产生单分散水凝胶珠。水凝胶珠掺杂有浓度范围为0％至8％的BrAPA。随后将溴化物叠氮化以将Br基团转换为叠氮化物基团(N3)。然后使用CuAAC化学作用使叠氮化的水凝胶与炔烃修饰的寡核苷酸反应。没有叠氮化的水凝胶珠没有接枝到珠上的任何寡核苷酸(图5B，“原始”)。另一方面，叠氮化的水凝胶珠具有接枝到水凝胶珠上的寡核苷酸(图5B，“叠氮化的(N3)”)。接枝的寡核苷酸的密度与在水凝胶前体混合物中添加的BrAPA的百分比直接相关。

这些寡核苷酸功能化的珠用于捕获来自细胞的mRNA。将水凝胶珠用聚T寡核苷酸功能化(图5C)。将聚T功能化的水凝胶珠与细胞混合。细胞随后裂解，并收集珠和洗涤。进行第二链合成以从捕获的mRNA制备cDNA。如图5D所示，电色谱图显示了cDNA与其互补序列的迹线(右曲线)，然后cDNA双链体用Nextera标签化。标签化的DNA(左曲线)如预期的由于标签化而向较低的分子量转移。

实施例3—遗传物质从水凝胶珠的释放

以下实施例说明了其中具有包封的遗传物质的水凝胶珠在交联剂的可逆切割时释放内容物的能力。

根据实施例1制备包封细菌细胞的水凝胶珠。该水凝胶珠包括含有二硫键的双丙烯酰胺交联剂。珠被染料染色以可视化细菌细胞。如图6C所示，不存在还原剂的情况下的水凝胶珠能够保留细菌细胞。但是，在与还原剂(在这种情况下为THP)接触后，细菌从水凝胶珠释放。

实施例4—水凝胶珠中核酸文库的制备

以下实施例说明了用于从包封在水凝胶珠内的遗传物质进行核酸测序的方法。

获得实施例1中制备的水凝胶珠，并如下分离核酸。50μL包封大肠杆菌的水凝胶珠的溶液转移到200μL管中(大约50个珠/μL)。旋转珠并除去上清液。将100μL细菌裂解试剂(Thermo Fisher Scientific，来自Charge Switch试剂盒的100μL重悬缓冲液中的0.5mg溶菌酶)加入管中，并在37℃下孵育10分钟。然后加入500μL蛋白酶K试剂，并在55℃下孵育20分钟以完全消化蛋白质。在此步骤中，大肠杆菌gDNA暴露但钉在水凝胶基质内部。用PR2洗涤保留细菌gDNA的珠，并重新收集水凝胶珠。然后将Tn5转座体试剂(Nextera，Illumina，Inc.)加入管中，并在55℃下孵育5分钟。在此步骤之后，将包含p5和p7末端的接头插入到DNA。然后加载50μL终止缓冲液以敲除Tn5酶。添加具有Bsu聚合酶和核苷酸的延伸混合物以用于缺口填充。在该步骤之后，核酸文库备用并钉在水凝胶珠粒基质内部。对枯草芽孢杆菌和嗜水气单胞菌水凝胶珠重复这些相同步骤以裂解细菌细胞和完成相应水凝胶珠的文库制备。如图10所示，具有其中产生的DNA文库的水凝胶珠接种到表面上，并释放DNA文库。图10，图面a)显示了具有标签化的基因组的水凝胶，其加载到P5/P7接枝的表面上。图10，图面b)显示了洗脱、接种及等温桥接连扩增和染色的单链DNA。图10，图面c)描绘了从高密度到低密度(从左到右)的簇密度的梯度，其中较高的密度指示表面上其中水凝胶最初降落的位置。

该实施例说明了在水凝胶珠内包封单个细菌细胞的水凝胶珠的制备，其可用于在珠内部处理细菌基因组和进行全DNA文库的制备。对水凝胶的孔隙大小进行了工程化以允许酶、化学物质和较小尺寸的引物(<50bp)的扩散，但保留较大尺寸的DNA(>300bp)，使得完整的全基因组DNA和产生的DNA文库在整个过程中保留在凝胶微珠内部。然后可以将来自单个细菌的DNA文库释放到特定区域，例如流动池表面上，用于文库接种。随后，这导致在流动池上源于单个细菌细胞的“DNA簇”的空间分布，从而简化了后处理过程中的阅读片段比对。

实施例5—来自水凝胶珠的核酸的测序

以下实施例说明了来自包封遗传物质的水凝胶珠的DNA文库的测序。

实施例4制备的DNA文库从水凝胶释放并沉积在表面上。片段化的DNA从水凝胶洗脱。对照样品未经热处理而保存。两种样品通过12循环的PCR反应富集，并在Bioanalyzer上进行分析以确定片段分布。双重Ampure清理后，在MiSeq平台(Illumina，Inc.，San Diego,CA)上对大肠杆菌片段进行测序。如图11A所示，从水凝胶洗脱的DNA片段具有平均大小约350bp的片段大小分布。相反，图11B中所示的未热处理的样品甚至在12循环PCR反应后也未显示任何片段，表明片段未从水凝胶珠释放。对片段进行测序，并且98％的序列与肠杆菌科比对，和39％的序列与大肠杆菌比对。

实施例6—空间索引

以下实施例说明了在水凝胶珠内制备的DNA文库的空间索引。

为了证明不同细菌类型之间的空间分离，选择了大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和嗜水气单胞菌作为模型生物体。每种微生物都嵌入其自己的水凝胶珠组中。通过裂解处理分别处理包含单一类型的微生物的每种珠类型，并且每种物种具有在文库制备方案过程中添加的自己的独特索引。然后将携带来自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和嗜水气单胞菌的DNA文库的三种不同的水凝胶珠混合到同一管中。旋转水凝胶珠，并除去上清液。将100μL具有表面活性剂(4.5％Span 80、0.4％Tween 20和0.05％Triton X-100)的矿物油添加到珠中，涡旋30秒以将珠重悬在油中。然后将25μL的油再乳化珠溶液加载到MiSeq流动池中。将MiSeq流动池的温度升至90℃ 3分钟以使DNA文库变性，然后使变性的文库从水凝胶珠扩散，然后60℃6分钟、40℃ 2分钟和20℃ 2分钟以使单链DNA文库与表面P5/P7引物杂交以进行簇扩增。接种的文库进行簇集、线性化和第一碱基测序，结果显示在图13中。如图13所示，水凝胶珠内的DNA文库能够扩散到珠外并与MiSeq流动池结合，在其中扩增在流动池上在对于每个生物体的不同簇中发生。

在用具有这三种不同微生物的水凝胶珠中产生的文库接种的MiSeq流动池进一步在MiSeq上测序(2×150循环运行)。如图14A-14B所示，测序分析表明运行以合理的质量完成。检测三种不同物种的每一种。从水凝胶释放的文库产生的阅读片段长度具有非常相似的大小范围，这表明从水凝胶释放的文库片段的大小可以通过水凝胶组成和DNA释放方案控制。还掺入PhiX对照文库以检验运行质量。图15A-15C示出了用含有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或嗜水气单胞菌的水凝胶珠接种的流动池的MiSeq测序结果(包括来自MiSeq图像的原始数据)(图15A)、与特定基因组比对的簇(图15C)和三种不同细菌物种的通过过滤器的总结表格(图15C)。

本文所述的实施方案、实施例和附图提供了在从裂解到文库生成的过程中用于将遗传物质保留在物理限制的空间中的组合物、方法和系统。一些实施方案提供了在限制空间中用于在流动池的表面上释放的源自单一长DNA分子或单个细胞的文库。一旦来自单个隔室中的单DNA分子或单细胞的文库释放到流动池的表面，每个隔室中的文库彼此紧密接近地接种。

如本文所用，术语“包含”与“包括”、“含有”或“以……为特征”同义，并且是包括性的或开放性的，且不排除另外的未叙述的要素或方法步骤。

上面的描述公开了本发明的几种方法和材料。本发明易于进行方法和材料的改变，以及制造方法和设备的变化。通过考虑本公开或本文公开的本发明的实践，这样的修改对于本领域技术人员将变得显而易见。因此，无意将本发明限制于本文公开的特定实施方案，而是其涵盖了落入本发明的真实范围和精神内的所有修改和替代方式。

本文引用的所有参考文献，包括但不限于公开和未公开的申请、专利和参考文献，均通过引用全文并入本文，并因此成为本说明书的一部分。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中所包含的公开内容相抵触的情况下，本说明书取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。

Claims

1.一种用于进行核酸反应的珠，其包括：

水凝胶聚合物；和

设置在所述水凝胶中的遗传物质，其中所述珠包含允许试剂扩散通过所述珠而同时保留所述遗传物质的孔隙。

2.根据权利要求1所述的珠，其中所述珠的直径为约2μm至约120μm。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的珠，其中所述水凝胶聚合物包含聚乙二醇(PEG)-硫醇、PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰基)胱胺、PEG、聚环氧丙烷(PPO)、聚丙烯酸、聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)(PHEMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、硫酸藻酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、壳聚糖、纤维素、胶原蛋白、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或其组合或混合物。

4.根据权利要求3所述的珠，其中所述水凝胶聚合物包含PEG-硫醇/PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺/N,N′-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)或PEG/PPO。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的珠，其中所述遗传物质是细胞、核酸或微生物组。

6.根据权利要求5所述的珠，其中所述细胞是哺乳动物细胞或细菌细胞。

7.权利要求5-6中任一项所述的珠，其中所述细胞是大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、嗜水气单胞菌细胞或成纤维细胞。

8.根据权利要求5所述的珠，其中所述核酸是300个碱基对或更大的DNA或RNA。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的珠，其中所述试剂包括酶、化学物质和尺寸小于50个碱基对的引物。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的珠、其中所述试剂包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(Tn5)、引物(P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子。

11.一种将遗传物质包封在水凝胶珠内的方法，包括：

将遗传物质在溶液中与水凝胶聚合物混合；

将所述溶液与不混溶的流体混合以形成包封所述遗传物质的水凝胶珠，其中所述水凝胶珠包含允许试剂通过所述水凝胶珠扩散而保留所述遗传物质的孔隙。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述水凝胶珠的直径为约2μm至约120μm。

13.根据权利要求11-12中任一项所述的方法，其中所述水凝胶聚合物包含聚乙二醇(PEG)-硫醇、PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰基)胱胺、PEG、聚环氧丙烷(PPO)、聚丙烯酸、聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)(PHEMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、硫酸藻酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、壳聚糖、纤维素、胶原蛋白、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或其组合或混合物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述水凝胶聚合物包含PEG-硫醇/PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺/N,N′-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)或PEG/PPO。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述遗传物质是细胞、核酸或微生物组。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞或细菌细胞。

17.根据权利要求15-16中任一项所述的方法，其中所述细胞是大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、嗜水气单胞菌细胞或成纤维细胞。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述核酸是300个碱基对或更大的DNA或RNA。

19.根据权利要求11至18中任一项所述的方法，其中，所述试剂包括酶、化学物质和尺寸小于50个碱基对的引物。

20.根据权利要求11-19中任一项所述的方法，其中所述试剂包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(Tn5)、引物(P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子。

21.一种将遗传物质包封在水凝胶珠内的方法，包括：

将包含水凝胶聚合物和遗传物质的水溶液与不混溶的流体混合；

将所述水溶液输入到液滴发生器中；和

产生包封所述遗传物质的水凝胶珠，其中所述水凝胶粒包含允许试剂通过所述水凝胶珠扩散而同时保留所述遗传物质的孔隙。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述水凝胶珠的直径为约2μm至约150μm。

23.根据权利要求21至22中任一项所述的方法，其中所述水凝胶聚合物包含聚乙二醇(PEG)-硫醇、PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰基)胱胺、PEG、聚环氧丙烷(PPO)、聚丙烯酸、聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)(PHEMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、硫酸藻酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、壳聚糖、纤维素、胶原蛋白、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或其组合或混合物。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述水凝胶聚合物包含括PEG-硫醇/PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺/N,N’-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)或PEG/PPO。

25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述遗传物质是细胞、核酸或微生物组。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞或细菌细胞。

27.权利要求25-26中任一项所述的方法，其中所述细胞是大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、嗜水气单胞菌细胞或成纤维细胞。

28.根据权利要求25所述的方法，其中所述核酸是300个碱基对或更大的DNA或RNA。

29.根据权利要求21-28中任一项所述的方法，其中所述试剂包括酶、化学物质和尺寸小于50个碱基对的引物。

30.根据权利要求21-29中任一项所述的方法，其中所述试剂包括溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(Tn5)、引物(P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子。

31.一种从包封在珠内的遗传物质制备核酸文库的方法，其包括：

获得权利要求1-10中任一项所述的珠；

扩增包封在所述珠内的遗传物质；

对包封在所述珠内的遗传物质进行标签化反应；和

对所述遗传物质进行测序，从而产生包封在所述珠内的核酸文库。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述遗传物质是细胞，并且进一步包括裂解所述细胞和提取核酸。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞用溶菌酶裂解并用蛋白酶K处理以提取核酸。

34.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述标签化反应包括使遗传物质与包含接头序列和转座体的转座酶混合物接触。

35.根据权利要求31-34中任一项所述的方法，其进一步包括将所述核酸文库接种在固体支持物上。

36.根据权利要求35所述的方法，其中接种包括降解所述珠以从所述珠释放所述核酸文库。

37.根据权利要求36所述的方法，其中通过使所述珠与切割混合物接触或通过将所述珠加热至约90℃来降解所述珠以释放所述核酸文库。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述切割混合物包含二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三(3-羟丙基)膦(THP)。

39.根据权利要求35-38中任一项所述的方法，其中所述固体支持物是流动池装置。