KR20200026218A - 뉴클레오타이드 서열분석용 하이드로겔 비드 - Google Patents

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Abstract

본 명세서에 제공된 시스템, 방법 및 조성물은 유전 물질을 캡슐화한 비드의 제조에 관한 것이다. 일부 실시형태는 상기 비드 내의 핵산 라이브러리의 제조를 포함하며, 여기서 상기 비드는 유전 물질을 보유하면서 시약의 확산을 허용하는 공극을 포함한다.

Description

뉴클레오타이드 서열분석용 하이드로겔 비드
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 미국 가출원 제62/539,956호(출원일: 2017년 8월 1일, 발명의 명칭: "HYDROGEL BEADS FOR NUCLEOTIDE SEQUENCING")에 대한 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 그 전문이 본 명세서에 참고로 원용된다.
기술분야
본 명세서에 제공된 시스템, 방법 및 조성물은 공간 인덱스 서열분석(spatial index sequencing) 및 핵산 라이브러리(nucleic acid library) 제조에 사용하기 위한, 하이드로겔 비드 및 하이드로겔 비드 내에 물질을 캡슐화하는 방법에 관한 것이다.
차세대 서열분석기는 서열분석 실시당 다량의 게놈 데이터를 생성시키는 강력한 툴이다. 이러한 다량의 데이터를 해석 및 분석하는 것을 도전일 수 있다. 단일 세포 DNA 서열분석이 게놈 불균일성을 연구하기 위한 하나의 툴로서 출현하고 있다. 구체적으로, 다수의 반복되는 게놈 영역을 보유하는 마이크로바이옴(microbiome)은 단지 단일 세포로부터 DNA 서열을 획득함으로써 서열분석될 수 있다. 이것은 하류 서열분석 데이터 정렬 공정을 상당히 단순화할 것이다.
본 명세서에 제공된 일부 실시형태는 핵산 반응을 수행하기 위한 비드에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 비드는 하이드로겔 중합체 및 하이드로겔 중합체 내에 배치된 유전 물질(genetic material)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비드는 유전 물질을 보유하면서 비드를 통한 시약의 확산을 허용하는 공극(pore)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비드는 약 2㎛ 내지 약 120㎛의 직경, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 또는 120㎛의 직경 또는 상기에 언급된 값 중 임의의 2개에 의해서 정의된 범위 내의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-티올, PEG-아크릴레이트, 아크릴아마이드, N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BACy), PEG, 폴리프로필렌 옥사이드(PPO), 폴리아크릴산, 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(N-아이소프로필아크릴아마이드)(PNIPAAm), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(바이닐설폰산)(PVSA), 폴리(L-아스파트산), 폴리(L-글루탐산), 폴리라이신, 한천, 아가로스, 알지네이트, 헤파린, 알지네이트 설페이트, 덱스트란 설페이트, 하이알루로난, 펙틴, 카라기난, 젤라틴, 키토산, 셀룰로스, 콜라겐, 비스아크릴아마이드, 다이아크릴레이트, 다이알릴아민, 트라이알릴아민, 다이바이닐 설폰, 다이에틸렌글리콜 다이알릴 에터, 에틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 폴리메틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 트라이메틸로프로판(trimethylopropoane) 트라이메타크릴레이트, 에톡실화 트라이메틸올 트라이아크릴레이트 또는 에톡실화 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-티올/PEG-아크릴레이트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 아크릴아마이드/N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BACy)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 PEG/폴리프로필렌 옥사이드(PPO)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 물질은 세포, 핵산 또는 마이크로바이옴이다. 일부 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포 또는 박테리아 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포, 에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) 세포 또는 섬유아세포(fibroblast cell)이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 300개 또는 그 초과의 염기쌍의 DNA 또는 RNA이다. 일부 실시형태에서, 시약은 효소, 화학물질 및 50개 미만의 염기쌍의 크기를 갖는 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시약은 라이소자임, 프로테이나제 K, 무작위 육량체(random hexamer), 중합효소(예를 들어, Φ29 DNA 중합효소, Taq 중합효소, Bsu 중합효소), 트랜스포사제(transposase)(예를 들어, Tn5), 프라이머(예를 들어, P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매화 효소, 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 완충제 또는 2가 양이온을 포함한다.
본 명세서에 제공된 일부 실시형태는 하이드로겔 비드 내에 유전 물질을 캡슐화하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 방법은 유전 물질을 용액 중에서 하이드로겔 중합체와 혼합하는 단계 및 용액을 비혼화성 유체와 혼합하여 유전 물질(hydrogel bead encapsulating a genetic material)을 캡슐화한 하이드로겔 비드를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 비드는 유전 물질을 보유하면서 하이드로겔 비드를 통한 시약의 확산을 허용하는 공극을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 비드는 약 2㎛ 내지 약 120㎛의 직경, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 또는 120㎛의 직경 또는 상기에 언급된 값 중 임의의 2개에 의해서 정의된 범위 내의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-티올, PEG-아크릴레이트, 아크릴아마이드, N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BACy), PEG, 폴리프로필렌 옥사이드(PPO), 폴리아크릴산, 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(N-아이소프로필아크릴아마이드)(PNIPAAm), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(바이닐설폰산)(PVSA), 폴리(L-아스파트산), 폴리(L-글루탐산), 폴리라이신, 한천, 아가로스, 알지네이트, 헤파린, 알지네이트 설페이트, 덱스트란 설페이트, 하이알루로난, 펙틴, 카라기난, 젤라틴, 키토산, 셀룰로스, 콜라겐, 비스아크릴아마이드, 다이아크릴레이트, 다이알릴아민, 트라이알릴아민, 다이바이닐 설폰, 다이에틸렌글리콜 다이알릴 에터, 에틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 폴리메틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 트라이메틸로프로판 트라이메타크릴레이트, 에톡실화 트라이메틸올 트라이아크릴레이트 또는 에톡실화 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-티올/PEG-아크릴레이트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 아크릴아마이드/N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BACy)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 PEG/폴리프로필렌 옥사이드(PPO)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 물질은 세포, 핵산 또는 마이크로바이옴이다. 일부 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포 또는 박테리아 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 에쉐리키아 콜라이 세포, 바실러스 서브틸리스 세포, 에로모나스 하이드로필라 세포 또는 섬유아세포이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 300개 또는 그 초과의 염기쌍의 DNA 또는 RNA이다. 일부 실시형태에서, 시약은 효소, 화학물질 및 50개 미만의 염기쌍의 크기를 갖는 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시약은 라이소자임, 프로테이나제 K, 무작위 육량체, 중합효소(예를 들어, Φ29 DNA 중합효소, Taq 중합효소, Bsu 중합효소), 트랜스포사제(예를 들어, Tn5), 프라이머(예를 들어, P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매화 효소, 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 완충제 또는 2가 양이온을 포함한다.
본 명세서에 제공된 일부 실시형태는 하이드로겔 비드 내에 유전 물질을 캡슐화하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 방법은 하이드로겔 중합체 및 유전 물질을 포함하는 수성 용액과 비혼화성 유체를 혼합하는 단계, 수성 용액을 액적 발생기(droplet generator) 내에 투입하는 단계, 및 유전 물질을 캡슐화한 하이드로겔 비드를 생성시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 비드는 유전 물질을 보유하면서 하이드로겔 비드를 통한 시약의 확산을 허용하는 공극을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 비드는 약 2㎛ 내지 약 120㎛의 직경, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 또는 120㎛의 직경 또는 상기에 언급된 값 중 임의의 2개에 의해서 정의된 범위 내의 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-티올, PEG-아크릴레이트, 아크릴아마이드, N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BACy), PEG, 폴리프로필렌 옥사이드(PPO), 폴리아크릴산, 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(N-아이소프로필아크릴아마이드)(PNIPAAm), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(바이닐설폰산)(PVSA), 폴리(L-아스파트산), 폴리(L-글루탐산), 폴리라이신, 한천, 아가로스, 알지네이트, 헤파린, 알지네이트 설페이트, 덱스트란 설페이트, 하이알루로난, 펙틴, 카라기난, 젤라틴, 키토산, 셀룰로스, 콜라겐, 비스아크릴아마이드, 다이아크릴레이트, 다이알릴아민, 트라이알릴아민, 다이바이닐 설폰, 다이에틸렌글리콜 다이알릴 에터, 에틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 폴리메틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 트라이메틸로프로판 트라이메타크릴레이트, 에톡실화 트라이메틸올 트라이아크릴레이트 또는 에톡실화 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-티올/PEG-아크릴레이트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 아크릴아마이드/N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BACy)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 PEG/폴리프로필렌 옥사이드(PPO)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 물질은 세포, 핵산 또는 마이크로바이옴이다. 일부 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포 또는 박테리아 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 에쉐리키아 콜라이 세포, 바실러스 서브틸리스 세포, 에로모나스 하이드로필라 세포 또는 섬유아세포이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 300개 또는 그 초과의 염기쌍의 DNA 또는 RNA이다. 일부 실시형태에서, 시약은 효소, 화학물질 및 50개 미만의 염기쌍의 크기를 갖는 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시약은 라이소자임, 프로테이나제 K, 무작위 육량체, 중합효소(예를 들어, Φ29 DNA 중합효소, Taq 중합효소, Bsu 중합효소), 트랜스포사제(예를 들어, Tn5), 프라이머(예를 들어, P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매화 효소, 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 완충제 또는 2가 양이온을 포함한다.
본 명세서에 제공된 일부 실시형태는 비드 내에 캡슐화된 유전 물질로부터 핵산 라이브러리를 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이 유전 물질이 내부에 배치된 비드를 획득하는 단계, 비드 내에 캡슐화된 유전 물질을 증폭시키는 단계, 비드 내에 캡슐화된 유전 물질에 대해서 태그먼테이션(tagmentation) 반응을 수행하는 단계, 및 유전 물질을 서열분석함으로써 비드 내에 캡슐화된 핵산 라이브러리를 생성시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전 물질은 세포이고, 방법은 세포를 용해시키고, 핵산을 추출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 핵산을 추출하기 위해서 라이소자임으로 용해되고, 프로테이나제 K로 처리된다. 일부 실시형태에서, 태그먼테이션 반응은 유전 물질을, 어댑터 서열 및 트랜스포좀을 포함하는 트랜스포사제 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 핵산 라이브러리를 고체 지지체 상에 시딩(seeding)하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 시딩하는 단계는 비드를 분해(degrading)시켜 비드로부터 핵산 라이브러리를 방출시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비드는 비드를 분열 믹스(cleavage mix)와 접촉시킴으로써 또는 비드를 약 90℃까지 가열시킴으로써 분해되어 핵산 라이브러리를 방출시킨다. 일부 실시형태에서, 분열 믹스는 (DTT), 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP) 또는 트리스(3-하이드록시프로필)포스핀(THP)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 플로우 셀 디바이스(flow cell device)이다.
도 1A는 수동 보텍싱(vortexing)에 의해서 하이드로겔 비드를 제조하는 실시형태를 설명하는 개략도. 도 1B는 이러한 공정에 의해서 형성된 비드를 나타낸 현미경 영상(여기서 비드는 약 2㎛ 내지 약 100㎛의 직경 범위인 것으로 발견되었음).
도 2A는 미세유체 액적 발생기를 사용하여 하이드로겔 비드를 제조하기 위한 실시형태를 설명하는 개략도. 도 2B는 이러한 공정에 의해서 형성된 비드를 나타낸 현미경 영상(여기서 비드는 미세유체 액적 발생기의 치수를 기초로 균일한 크기를 가짐).
도 3은 도 2에 기재된 것과 동일한 미세유체 액적 발생을 사용하여 다양한 농도의 아이소프로필 알코올을 하이드로겔 중합체에 첨가하는 효과를 설명한 선 차트. 도 3은 또한 상이한 크기의 하이드로겔 중합체의 몇몇 현미경사진을 나타낸다.
도 4A 및 도 4B는 상이한 크기의 하이드로겔로 포획된 형광 염료 염색된 박테리아 세포의 현미경사진. 도 4A는 다수의 박테리아 세포를 캡슐화한 약 100㎛ 직경의 하이드로겔 비드를 도시한다. 도 4B는 1개 또는 2개의 박테리아 세포를 캡슐화한 약 10㎛ 직경의 하이드로겔 비드를 도시한다.
도 5a는 하이드로겔 비드를 올리고뉴클레오타이드로 작용화시킨 실시형태를 도시한 도면. 도 5b는 아자이드화(azidification)와 함께 또는 아자이드화 없이 올리고뉴클레오타이드 작용화된 하이드로겔 비드의 현미경사진을 나타낸 도면. 도 5c는 SeqB 서열을 캡처한 폴리T 작용화된 하이드로겔 비드의 현미경사진을 나타낸 도면. 도 5d는 제2 가닥 합성 후(우측 곡선) 및 태그먼테이션 후(좌측 곡선) DNA의 전기크로마토그램(electrochromatogram)을 나타낸 도면.
도 6A 및 도 6B는 하이드로겔 비드 내에 캡슐화된 마우스 섬유아세포(NIH-3T3)를 나타낸 현미경 사진. 도 6A는 단일 세포가 신속한 겔화 조건 하에서 캡슐화된 것을 나타낸 도면. 도 6B는 다수의 세포가 느린 겔화 조건 하에서 하이드로겔에 의해서 캡슐화된 것을 나타낸 도면.
도 7A는 환원제, 예컨대, 다이티오트레이톨(DTT), 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP) 또는 트리스(3-하이드록시프로필)포스핀(THP)의 존재 하에서 절단 가능한 다이설파이드 결합을 갖는 하이드로겔 중합체의 제조 공정의 실시형태를 도시한 도면. 도 7B는 화학적으로 절단되어 캡슐화된 유전 물질의 방출을 허용한 하이드로겔 비드의 현미경사진을 도시한 도면. 도 7C는 하이드로겔 비드로부터의 캡슐화된 유전 물질의 방출을 나타낸 현미경사진.
도 8a 내지 도 8c는 조합 인덱싱(combinatorial indexing)을 사용한 겔내 바코딩(in-gel barcoding)을 위해서 캡슐화된 유전 물질을 사용한 일 실시형태에 대한 단계를 도시한 도면(도 8a), 하이드로겔 비드 내에 캡슐화된 단일 박테리아 세포를 서열분석하는 일 실시형태에 대한 단계를 도시한 도면(도 8b), 및 상부에 조립된 바코딩된 트랜스포좀 복합체를 함유하는 비드를 사용한 겔내 바코딩 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 태그먼트된(tagmented) DNA에 삽입된 바코딩된 올리고뉴클레오타이드의 일 실시형태에 대한 단계를 도시한 도면(도 8c).
도 9는 하이드로겔 비드 내에서의 DNA 증폭을 위한 단계를 도시한 도면. 박테리아 세포를 하이드로겔 비드에 캡슐화한다. 캡처된 세포를 라이소자임으로 용해시키고, 단백질을 프로테이나제 K를 사용하여 변성시킨다. gDNA 패널 a)에서 캡슐화된 비드 내의 gDNA를 다중 치환 증폭(multiple displacement amplification: MDA)을 사용하여 증폭시킨다. 패널 b)에서, DNA를 PCR에 의해서 태그먼트 및 증폭시킨다. 패널 c)에서, 하이드로겔 비드를 90℃까지 가열시킴으로써 태그먼트된 DNA를 하이드로겔 비드로부터 용리시킨다. 영상은 SYTOX 인터칼레이터 염료(intercalator dye)로 염색된 DNA의 형광 강도를 나타낸다.
도 10은 시딩 및 클러스터링을 위한 고체 표면 상의 DNA 라이브러리의 방출을 나타낸 현미경사진을 도시한 도면. 패널 a)는 P5 프라이머 및 P7 프라이머가 상부에 고정된 고체 표면 상에 로딩된 태그먼트된 박테리아 게놈을 갖는 단일 하이드로겔 비드를 도시한다. 패널 b)는 용리, 시딩 및 등온 브리지 증폭된(isothermally bridge amplified) 단일 가닥 DNA를 나타낸다. 패널 c)에서, 시딩되고 증폭된 DNA의 구배 클러스터 밀도를 나타낸다. DNA는 SYTOX 인터칼레이터 염료로 염색된다.
도 11A는 90℃까지 가열시킴으로써 하이드로겔 비드로부터 방출된 유전 물질을 함유하는 상청액의 12 사이클 PCR로부터 획득된 DNA 라이브러리의 생물분석기(bioanalyzer) 트레이스(trace)를 도시한 선 그래프. 도 11B에서, 하이드로겔 비드는 가열되지 않았고, 따라서 DNA 라이브러리는 하이드로겔 비드로부터 방출되지 않고, 라이브러리가 인지되지 않는다.
도 12는 DNA 서열분석 클러스터의 공간 제한을 도시한 도면. 패널 (a)는 2개의 구별되는 하이드로겔 비드로부터 기원한 2개의 고유하게 인덱싱된 DNA 라이브러리의 제1-염기 서열분석(first-base sequencing) 판독을 나타낸다. 패널 (b)는 2개의 라이브러리의 공간적 분리를 도시한다. 패널 (c)의 현미경사진 영상에 나타난 바와 같이, 분리된 라이브러리는 공간적으로 구별되고, 상이한 하이드로겔 비드로부터 기원된다.
도 13은 공간적 분리를 갖는 3종의 상이한 박테리아 세포(비. 서브틸리스(B. subtilis), 이. 콜라이, 및 에이. 하이드로필라(A. hydrophila)로부터의 바코딩된 하이드로겔 비드 라이브러리의 제1 염기 서열분석 데이터의 현미경 사진을 도시한 도면.
도 14A 및 도 14B는 플로우 셀 표면 상의 하이드로겔 비드로부터 방출된 공간 인덱싱된 비. 서브틸리스, 이. 콜라이 및 에이. 하이드로필라 라이브러리에 대한 서열분석 메트릭스를 도시한 도면.
도 15a 내지 도 15c는 이. 콜라이, 비. 서브틸리스 또는 에이. 하이드로필라 박테리아를 함유한 하이드로겔 비드를 사용한 플로우 셀 시딩의 MiSeq 서열분석 결과를 도시한 도면. 도 15a는 MiSeq 현미경관찰로부터의 원시 데이터를 도시한 영상이다. 도 15b는 특정 게놈에 정렬된 상이한 미생물 클러스터를 나타낸 영상이다. 예를 들어, 점은 군 분포 패턴을 나타내는 이. 콜라이 게놈에 정렬된 클러스터이다. 도 15c는 3종의 상이한 박테리아 종의 패스 필터(pass filter)의 요약 표이다.
하기 상세한 설명에서, 이의 일부를 형성하는 첨부 도면을 참고한다. 도면에서, 문맥이 달리 나타내지 않는 한, 유사한 상징은 전형적으로 유사한 성분을 식별한다. 상세한 설명, 도면 및 청구범위에 기재된 예시적인 실시형태는 제한을 의미하지 않는다. 본 명세서에 제시된 발명 주제의 사상 또는 범주를 벗어나지 않으면서, 다른 실시형태가 활용될 수 있고, 다른 변경이 수행될 수 있다. 본 개시내용의 양상은 본 명세서에 일반적으로 기재되고 도면에 도시된 바와 같이 광범위한 상이한 구성으로 배열, 치환, 조합, 분리 및 설계될 수 있다는 것이 쉽게 이해될 것이고, 이의 모두는 본 명세서에 명백하게 고려된다.
본 명세서에 제공된 조성물, 시스템 및 방법의 실시형태는 유전 물질을 캡슐화한 비드에 관한 것이다. 비드는 유전 물질의 존재 하에서 혼합되는 하이드로겔 중합체 및 가교제를 포함할 수 있고, 이것은 유전 물질을 캡슐화한 하이드로겔 비드를 형성한다. 일부 실시형태에서, 유전 물질은 핵산, 세포, 마이크로바이옴 또는 게놈을 포함한다. 하이드로겔 비드는 비드 내에 유전 물질을 보유하면서 하이드로겔 비드를 통한 시약의 확산을 허용하는 공극을 포함함으로써, 비드 내에서 반응이 일어나게 할 수 있다. 유전 물질을 캡슐화한 비드를 사용하여 핵산 반응을 수행하는 방법이 또한 제공된다.
일부 실시형태는 전체 단일 세포를 캡슐화하는 하이드로겔 비드의 제조 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 단일 세포를 캡슐화한 하이드로겔 비드를 사용하여 세포 게놈을 가공하고 비드 내부에서 전체 DNA 라이브러리 제조를 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 세포를 캡슐화한 하이드로겔 비드를 사용하여 세포 게놈 DNA 및 mRNA을 동시에 가공하고 비드 내부에서 전체 DNA 라이브러리 제조를 수행할 수 있다. 하이드로겔의 공극 크기는 더 큰 핵산(300bp 초과)을 보유하여 무손상 전체 게놈 DNA, mRNA, 및 생산된 DNA 라이브러리가 전체 공정 동안 하이드로겔 비드 내부에 보유될 수 있도록 하면서, 효소, 화학물질, 및 더 작은 크기의 프라이머(50bp 미만)의 확산을 허용하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 특정 프라이머가 하이드로겔 비드 매트릭스 내부에 화학적으로 연결되어 특정 게놈 DNA 또는 mRNA를 혼성화 및 가공할 수 있다. 이어서 단일 세포로부터의 DNA 라이브러리는 라이브러리 시딩을 위해서 특정 면적에, 예를 들어, 플로우 셀 표면 상에 방출될 수 있다. 그 다음, 이것은 개별 세포로부터 기원하는 플로우 셀 상의 "DNA 클러스터"의 공간 분포를 초래함으로써, 후가공 동안 판독물 정렬을 단순화한다.
하이드로겔 캡슐화 접근법은 다른 복잡한 라이브러리 제조 작업, 예컨대, 예를 들어, 단일 세포 게놈/전사체학(transcriptomics) 응용을 위해서 사용될 수 있는데, 그 이유는 이러한 접근법이 DNA 분자 상에서 다양한 효소적/화학적 작업을 수행하기 위한 시약의 교환을 가능하게 하면서, 하이드로겔 내부에서 핵산 분자의 보유를 허용하기 때문이다. 이러한 접근법은, 다양한 용해 및 라이브러리 제조 작업흐름을 수행하기 위해서 미생물을 마이크로웰에 FACS 분류하고, 낮은 처리율(플레이트당 96 또는 384개 세포)인 현재 기술에 비해서 미생물 종을 위한 단일 세포 게놈의 유용성을 개선시키는 것을 발견하였다. 본 명세서에 기재된 접근법은 수 십만 개의 미생물이 효율적인 공정으로 바코딩된 라이브러리로 전환되는 것을 가능하게 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "시약"은 샘플과 반응하거나, 샘플과 상호작용하거나, 샘플에 용해시키거나, 샘플에 첨가하기에 유용한 작용제 또는 2종 이상의 작용제의 혼합물을 기재하고, 예를 들어 완충제, 화학물질, 효소, 중합효소, 50개 미만의 염기쌍을 갖는 프라이머, 주형 핵산, 뉴클레오타이드, 라벨, 염료 또는 뉴클레아제를 비롯한 핵산 증폭 반응에 사용되는 작용제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시약은 라이소자임, 프로테이나제 K, 무작위 육량체, 중합효소(예를 들어, Φ29 DNA 중합효소, Taq 중합효소, Bsu 중합효소), 트랜스포사제(예를 들어, Tn5), 프라이머(예를 들어, P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매화 효소, 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 완충제 또는 2가 양이온을 포함한다.
유전 물질을 캡슐화한 하이드로겔 비드
일 실시형태는 하이드로겔 중합체 및 유전 물질을 포함하는 비드를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "하이드로겔"은, 유기 중합체(천연 또는 합성)가 공유, 이온 또는 수소 결합을 통해서 가교되어 물 분자를 포획하여 겔을 형성하는 3차원 개방 격자 구조를 생성할 때 형성되는 물질을 지칭한다.　일부 실시형태에서, 하이드로겔은 생체적합성 하이드로겔일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체적합성　하이드로겔"은 살아있는 세포에 독성이 없고, 생존을 유지하기 위해서 산소 및 영양소가 포획된 세포에 충분히 확산되는 것을 허용하는 겔을 형성하는 중합체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 60 내지 90%의 유체, 예컨대, 물 및 10 내지 30%의 중합체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 하이드로겔의 물 함량은 약 70 내지 80%이다.
하이드로겔은 친수성 생체중합체 또는 합성 중합체를 가교시킴으로써 제조될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 가교제를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가교제"는 적절한 염기 단량체와 반응하는 경우 3차원 네트워크를 형성할 수 있는 분자를 지칭한다. 1종 이상의 가교제를 포함할 수 있는 하이드로겔 중합체의 예는 하이알루로난, 키토산, 한천, 헤파린, 설페이트, 셀룰로스, 알지네이트(알지네이트 설페이트 포함),　콜라겐, 덱스트란(덱스트란 설페이트 포함), 펙틴, 카라기난, 폴리라이신, 젤라틴(젤라틴 타입 A 포함), 아가로스, (메트)아크릴레이트-올리고락타이드-PEO-올리고락타이드-(메트)아크릴레이트, PEO-PPO-PEO 공중합체(Pluronics), 폴리(포스파젠), 폴리(메타크릴레이트), 폴리(N-바이닐피롤리돈), PL(G)A-PEO-PL(G)A 공중합체, 폴리(에틸렌 이민), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-티올, PEG-아크릴레이트, 아크릴아마이드, N,N'-비스(아크릴로일)시스타민, PEG, 폴리프로필렌 옥사이드(PPO), 폴리아크릴산, 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(N-아이소프로필아크릴아마이드)(PNIPAAm), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(바이닐설폰산)(PVSA), 폴리(L-아스파트산), 폴리(L-글루탐산), 비스아크릴아마이드, 다이아크릴레이트, 다이알릴아민, 트라이알릴아민, 다이바이닐 설폰, 다이에틸렌글리콜 다이알릴 에터, 에틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 폴리메틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 트라이메틸로프로판 트라이메타크릴레이트, 에톡실화 트라이메틸올 트라이아크릴레이트 또는 에톡실화 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트 또는 이들의 조합물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 예를 들어, 조합물은 중합체 및 가교제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-티올/PEG-아크릴레이트, 아크릴아마이드/N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BACy) 또는PEG/폴리프로필렌 옥사이드(PPO)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 가교제는 하이드로겔 중합체 내에 다이설파이드 결합을 형성한다. 도 7A에 나타낸 바와 같이, 가교제는 다이설파이드 결합을 형성함으로써, 하이드로겔 중합체를 연결할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 중합체는 공극을 갖는 하이드로겔 매트릭스(예를 들어, 다공성 하이드로겔 매트릭스)를 형성한다. 이러한 공극은 충분하게 큰 유전 물질을 하이드로겔 비드 내에 보유할 수 있지만, 작은 물질, 예컨대, 시약이 공극을 통해서 통과함으로써, 하이드로겔 비드 내부 및 외부로 통과하는 것을 허용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 공극 크기는 중합체의 농도 대 가교제의 농도의 비를 변경시킴으로써 미세하게 조정된다. 일부 실시형태에서, 중합체 대 가교제의 비는 30:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20 또는 1:30 또는 상기에 언급된 비 중 임의의 2개에 의해서 정의된 범위 내의 비이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 기능, 예컨대, DNA 프라이머 또는 하전된 화학기가 중합체 매트릭스에 그래프팅되어 상이한 응용의 요건을 충족시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "공극률"은 개방 공간, 예를 들어, 공극 또는 다른 개구부로 구성된 하이드로겔의 분율 부피(fractional volume)(무차원(dimension-less))를 의미한다. 따라서,　공극률은 물질 내의 공동(void) 공간을 측정하고, 0 내지 100%의 백분율(또는 0 내지 1)로서의, 전체 부피에 걸친 공동의 부피의 분율이다. 하이드로겔의 공극률은 0.5 내지 0.99, 약 0.75 내지 약 0.99 또는 약 0.8 내지 약 0.95 범위일 수 있다.
하이드로겔은 임의의 공극 크기를 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "공극 크기"는 공극의 단면의 직경 또는 유효 직경을 지칭한다. 용어 "공극 크기"는 또한 복수의 공극의 측정치를 기초로 하는 공극의 평균 직경 또는 평균 유효 직경을 지칭할 수 있다. 원형이 아닌 단면의 유효 직경은 비원형 단면의 단면적과 동일한 단면적을 갖는 원형 단면의 직경과 동일하다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔은 하이드로겔이 수화될 때 팽윤될 수 있다. 이어서 공극 크기의 크기는 하이드로겔 중의 물 함량에 따라서 변경될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔의 공극은 하이드로겔 내에 유전 물질을 보유하기에 충분한 크기의 공극을 갖지만, 시약이 통과하는 것을 허용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 가교제는 가역적 가교제이다. 일부 실시형태에서, 가역적 가교제는 하이드로겔 중합체를 가역적으로 가교시킬 수 있고, 절단제의 존재 하에서 비가교될 수 있다. 일부 실시형태에서, 가교제는 환원제의 존재 하에서, 승온에 의해서 또는 전기장에 의해서 절단될 수 있다. 일부 실시형태에서, 가역적 가교제는 N,N'-비스(아크릴로일)시스타민, 폴리아크릴아마이드 겔용 가역적 가교제일 수 있고, 여기서 다이설파이드 링키지는 적합한 환원제의 존재 하에서 파괴될 수 있다. 도 6A 및 도 6B에 나타낸 바와 같이, 가교제와 환원제의 접촉은 가교제의 다이설파이드 결합을 절단하여, 하이드로겔 비드를 파괴한다. 도 7C에 나타낸 바와 같이, 하이드로겔 비드가 분해되어, 내용물, 예컨대, 내부에 보유된 핵산을 방출한다. 일부 실시형태에서, 가교제는 온도를 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100℃ 초과까지 증가시킴으로써 절단된다. 일부 실시형태에서, 가교제는 하이드로겔 비드를 환원제와 접촉시킴으로서 절단된다. 일부 실시형태에서, 환원제는 포스핀 화합물, 수용성 포스핀, 질소 함유 포스핀 및 이의 염 및 유도체, 다이티오에리트리톨(DTE),　다이티오트레이톨(DTT)(각각 2,3-다이하이드록시-1,4-다이티올부탄의 시스 및 트랜스 이성질체), 2-머캅토에탄올 또는 β-머캅토에탄올(BME), 2-머캅토에탄올 또는 아미노에탄티올, 글루타티온, 티오글리콜레이트 또는 티오글리콜산, 2,3-다이머캅토프로판올, 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP), 트리스(하이드록시메틸)포스핀(THP) 또는 P-[트리스(하이드록시메틸)포스핀] 프로피온산(THPP)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 온도를 증가시켜 확산을 증가시키거나 또는 환원제와 접촉시키는 것은 가교제를 분해시킴으로써, 캡슐화된 유전 물질을 하이드로겔 비드로부터 방출시킨다.
일부 실시형태에서, 가교제의 가교는 하이드로겔 비드 내에 공극을 확립한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 비드 내의 공극의 크기는 조절 가능하고, 유전 물질, 예컨대, 세포 또는 약 300개 초과의 염기쌍의 핵산을 캡슐화하지만, 더 작은 입자, 예컨대, 시약 또는 약 50개 미만의 염기쌍의 더 작은 크기의 핵산, 예컨대, 프라이머가 공극을 통해서 통과하는 것을 허용하도록 제형화된다. 일부 실시형태에서, 시약은 유전 물질을 가공하기 위한 시약, 예컨대, 핵산을 세포로부터 단리시키기 위한 시약, 핵산을 서열분석 또는 증폭시키기 위한 시약 또는 핵산 라이브러리의 제조를 위한 시약을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시약은 예를 들어, 라이소자임, 프로테이나제 K, 무작위 육량체, 중합효소(예를 들어, Φ29 DNA 중합효소, Taq 중합효소, Bsu 중합효소), 트랜스포사제(예를 들어, Tn5), 프라이머(예를 들어, P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매화 효소, 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 완충제 또는 2가 양이온을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하이드로겔 비드는 유전 물질을 포함한다. 유전 물질은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 세포, 마이크로바이옴 또는 핵산을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포를 비롯한 단일 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 박테리아 세포이다. 일부 실시형태에서, 유전 물질은 바이러스 입자이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 긴 DNA 분자, 게놈 DNA, 바이러스 핵산, 박테리아 핵산 또는 포유동물 핵산이다. 임의의 유전 물질이 하이드로겔 비드 내에 캡슐화될 수 있다.
비드의 제조 방법
본 명세서에 제공된 일부 실시형태는 유전 물질을 캡슐화하는 비드의 제조 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 비드는 보텍스 보조 에멀션(vortex assisted emulsion)에 의해서 제조된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 보텍스 보조 에멀션은 도 1A 및 도 1B에 나타낸 바와 같이 하이드로겔 중합체와 유전 물질을 용기 내에서, 예컨대, 튜브, 바이알 또는 반응 용기 내에서 보텍싱하는 것을 지칭한다. 성분은 예를 들어 수동 또는 기계적 보텍싱 또는 진탕에 의해서 혼합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 수동 혼합은 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150㎛의 직경의 크기 또는 상기에 언급된 값 중 임의의 2개에 의해서 정의된 범위 내의 크기를 갖는 유전 물질을 캡슐화하는 하이드로겔 비드를 초래한다. 일부 실시형태에서, 비드의 크기는 불균일하고, 따라서, 비드의 크기는 다양한 직경의 비드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 비드는 미세유체 유동 기술에 의해서 제조된다. 미세유체 유동은 도 2A에 나타낸 바와 같은, 보조 겔 에멜션 생성을 위한 미세유체 디바이스(200)의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 미세유체 디바이스(200)는 목적하는 크기의 하이드로겔 비드(210)를 생성시키도록 구성되고, 비드당 선택된 양의 유전 물질을 캡슐화하도록 구성된 미세채널을 포함한다. 일부 실시형태에서, 미세유체 디바이스(200)는 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200㎛의 높이 또는 상기에 언급된 값 중 임의의 2개에 의해서 정의된 범위 내의 높이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 미세유체 디바이스(200)는 하나 이상의 채널을 포함한다. 일부 실시형태에서, 미세유체 디바이스(200)는 수성 스트림용 채널(215) 및 비혼화성 유체용 채널(220)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 채널의 폭은 동일하다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 채널의 폭은 상이하다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 채널의 폭은 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 또는 150㎛ 또는 상기에 언급된 값 중 임의의 2개에 의해서 정의된 범위 내의 폭이다. 일부 실시형태에서, 수성 채널의 폭은 75㎛이다. 일부 실시형태에서, 비혼화성 유체 채널의 폭은 78㎛이다. 당업자는 폭이 비드(210)의 크기를 미세하게 조정하도록 달라질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 미세유체 디바이스(200) 및 채널의 폭에 더하여, 수성 채널 및 비혼화성 유체 채널의 유량이 또한 하이드로겔 비드의 크기에 영향을 미칠 수 있다.
일부 실시형태에서, 수성상 채널 내에서의 용액의 유량은 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150㎕/분 또는 상기에 언급된 값 중 임의의 2개에 의해서 정의된 범위 내의 유량이다. 일부 실시형태에서, 비혼화성 유체 채널 내에서의 비혼화성 유체의 유량은 20, 30, 50, 80, 100, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375 또는 400㎕/분 또는 상기에 언급된 값 중 임의의 2개에 의해서 정의된 범위 내의 유량이다. 일부 실시형태에서, 수성상 중의 용액은 하이드로겔 중합체, 가교제 및 유전 물질을 포함하고, 이것은 수성 채널(215)을 통해서 비혼화성 유체의 유량보다 낮은 유량으로 비혼화성 유체, 예컨대, 담체 오일 내로 유동함으로써, 액적을 형성한다. 일부 실시형태에서, 비혼화성 유체는 오일, 예컨대, 미네랄 오일, 탄화수소 오일, 실리콘 오일(silicon oil) 또는 폴리다이메틸실록산 오일 또는 이들의 혼합물이다. 일부 실시형태에서, 유전 물질을 함유하는 하이드로겔 액적은 균일한 크기 분포로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 비드의 크기는 미세유체 디바이스의 크기, 하나 이상의 채널의 크기 또는 수성 용액 또는 비혼화성 유체 중 하나 또는 둘 모두의 유량을 조정함으로써 미세하게 조정된다. 일부 실시형태에서, 생성된 하이드로겔 비드는 2 내지 150㎛의 범위, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150㎛의 직경 또는 상기에 언급된 값 중 임의의 2개에 의해서 정의된 범위 내의 직경을 갖는다.
일부 실시형태에서, 유전 물질을 캡슐화한 하이드로겔 비드의 크기 및 균일성은 비드 형성 전에 하이드로겔 중합체를 유체 개질제, 예컨대, 아이소프로필 알코올을 비롯한 알코올과 접촉시킴으로써 추가로 제어될 수 있다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 아이소프로필 알코올의 부재 하에서, 비드는 아이소프로필 알코올의 존재 하에서 형성된 비드보다 더 큰 직경을 형성한다. 아이소프로필 알코올은 하이드로겔 중합체의 유체 특성에 영향을 미쳐서, 하이드로겔 비드의 조절을 허용한다.
일부 실시형태에서, 하이드로겔 비드는, 보텍스 보조 에멀션에 의해서 제조되든 미세유체 관성 유동 보조 에멀션(microfluidic inertial flow assisted emulsion)에 의해서 제조되든, 단일 또는 구별되는 유전 물질을 캡슐화한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 비드는 단일 세포를 캡슐화한다. 일부 실시형태에서, 비드 내의 유전 물질의 양은 투입된 샘플 내의 유전 물질을 희석 또는 농축시킴으로써 제어될 수 있다. 유전 물질을 포함하는 샘플은 하이드로겔 중합체와 혼합되고, 유전 물질을 함유하는 하이드로겔 중합체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 보텍스 보조 에멀션 또는 미세유체 유동 보조 에멀션에 적용된다.
일부 실시형태에서, 하이드로겔 비드는 뉴클레오타이드로 작용화된다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리T 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오타이드는 하이드로겔 비드에 결합되고, 작용화된 비드는 관심대상 뉴클레오타이드의 표적화된 캡처를 위해서 사용될 수 있다.
하이드로겔 비드 내에서 유전 물질을 가공하는 방법
본 명세서에 제공된 일부 실시형태는 비드 내에서 유전 물질을 가공하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 비드 내에 캡슐화된 유전 물질은 핵산 가공을 위해서 1종 이상의 시약과 접촉된다. 일부 실시형태에서, 유전 물질은 하이드로겔 비드 내에 보유되고, 시약은 하이드로겔 비드의 공극을 통해서 통과될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시약은 용해제, 핵산 정제제, DNA 증폭제, 태그먼테이션제, PCR제 또는 유전 물질의 가공에 사용되는 다른 작용제를 포함할 수 있다. 따라서, 하이드로겔 비드는, 비드 내에 유전 물질 자체를 보유하면서, 시약이 하이드로겔 비드 내부 및 외부로 통과하는 장벽을 허용함으로써 하이드로겔 비드 내에서 유전 물질의 제어된 반응을 위한 미세환경을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "태그먼테이션"은 트랜스포존 단부 서열을 포함하는 어댑터와 복합체화된 트랜스포사제 효소를 포함하는 트랜스포좀 복합체에 의한 DNA의 변형을 지칭한다. 태그먼테이션은 DNA의 동시 단편화(fragmentation) 및 듀플렉스 단편의 두 가닥의 5' 단부에 대한 어댑터의 결찰을 초래한다. 트랜스포사제 효소를 제거하기 위한 정제 단계 이후에, PCR, 결찰 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 적합한 방법에 의해서 추가 서열이 어댑팅된 단편의 단부에 첨가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 전체 DNA 라이브러리 제조는, gDNA 및 이의 라이브러리 생성물을 하이드로겔 매트릭스 내에 보유하면서, 다공성 하이드로겔을 통해 통과시킴으로써 다수의 시약을 교환하면서 하이드로겔 비드 내부에서 매끄럽게 달성될 수 있다. 하이드로겔은 95℃까지의 고온에서 수 시간 동안 저항성이어서 상이한 생화학적 반응을 지지할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포 또는 바이러스 입자를 캡슐화한 하이드로겔 비드를 처리하여 세포 또는 입자로부터 핵산을 분리 및 단리시킨다. 따라서, 예를 들어, 하이드로겔 비드는 용해 완충제와 접촉된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "용해"는 세포 RNA 또는 DNA에 대한 접근 또는 이의 방출을 용이하게 하는 세포벽 또는 바이러스 입자에 대한 관통 또는 변경을 의미한다. 세포벽의 완전한 붕괴 또는 파괴 중 어느 것도 용해를 위한 필수 요건이 아니다. 용어 "용해 완충제"는 적어도 1종의 용해제를 함유하는 완충제를 의미한다. 전형적인 효소 용해제는 라이소자임, 글루콜라제, 자이몰로스(zymolose), 라이티카제(lyticase), 프로테이나제 K, 프로테이나제 E, 및 바이러스 엔도라이신 및 엑소라이신을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 예를 들어, 비드 내에서의 세포의 용해는 용해제, 예컨대, 라이소자임 및 프로테이나제 K를 하이드로겔 비드 내에 도입함으로써 수행될 수 있다. 세포로부터의 gDNA가 이제 비드 내에 함유된다. 일부 실시형태에서, 용해 처리 이후에, 단리된 핵산은 하이드로겔 비드 내에 보유되고, 추가 가공을 위해서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된", "단리시키기 위해서", "단리", "정제된", "정제시키기 위해서", "정제", 및 이의 문법적 등가물은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 물질이 단리되는 샘플 또는 공급원(예를 들어, 세포)으로부터 적어도 하나의 오염물(예컨대, 단백질 및/또는 핵산 서열)의 양을 감소시키는 것을 지칭한다. 따라서 정제는 "풍부화", 예를 들어, 샘플 중의 목적하는 단백질 및/또는 핵산 서열의 양의 증가를 초래한다.
핵산의 용해 및 단리 이후에, 증폭, 예컨대, 특히 단일 세포로부터, 적은 양의 DNA를 증폭시키기 위해서 널리 사용되는 기술인 다중 치환 증폭(MDA)이 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 캡슐화된 핵산은 증폭되거나, 서열분석되거나 또는 핵산 라이브러리의 제조를 위해서 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 핵산 또는 핵산 반응에 대한 언급에서 사용되는 바와 같은 용어 "증폭시키다" 또는 "증폭된", "증폭시킨"은, 특정 핵산, 예컨대, 표적 핵산 또는 예를 들어, 본 발명의 실시형태에 의해서, 비드 내에 캡슐화된 핵산의 카피를 제조하는 시험관내 방법을 지칭한다. 핵산을 증폭시키는 다수의 방법이 당업계에 공지되어 있고, 증폭 반응은 중합효소 연쇄 반응, 리가제 연쇄 반응, 가닥 치환 증폭 반응(strand displacement amplification reaction), 롤링 서클 증폭 반응(rolling circle amplification reaction), 다중 어닐링 및 루핑 기반 증폭 사이클(multiple annealing and looping based amplification cycle: MALBAC), 전사-매개 증폭 방법, 예컨대, NASBA, 루프 매개 증폭 방법(예를 들어, 루프-형성 서열을 사용한 "LAMP" 증폭)을 포함한다. 증폭되는 핵산은 DNA 또는 RNA 또는 DNA와 RNA의 혼합물, 예컨대, 변형된 DNA 및/또는 RNA를 포함하거나, 이들로 이루어지거나 또는 이들로부터 유래된 DNA일 수 있다. 핵산 분자 또는 분자들의 증폭으로부터 생성된 생성물(예를 들어, "증폭 생성물")은, 출발 핵산이 DNA이든, RNA이든 또는 둘 다이든, DNA 또는 RNA 또는 DNA와 RNA 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 둘 다의 혼합물일 수 있거나 또는 이것은 변형된 DNA 또는 RNA 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. "카피"는 표적 서열과 완벽한 서열 상보성 또는 동일성을 반드시 의미하는 것은 아니다. 예를 들어, 카피는 뉴클레오타이드 유사체, 예컨대, 데옥시이노신 또는 데옥시우리딘, 표적 서열에 대한 의도적인 서열 변경(예컨대, 혼성화 가능하지만 상보적이지 않은 서열을 포함하는 프라이머를 통해서 도입된 서열 변경) 및/또는 증폭 동안 발생한 서열 오류를 포함할 수 있다.
하이드로겔 비드 내의 단리된 캡슐화된 핵산은 당업계에 공지된 임의의 적합한 증폭 방법에 따라서 증폭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 캡슐화된 핵산은 비드 내에서 증폭된다. 일부 실시형태에서, 비드는 고체 지지체 상에 캡처되고, 분해되며, 여기서 캡슐화된 핵산은 고체 지지체 상에 방출되고, 핵산은 고제 지지체 상에서 증폭된다.
일부 실시형태에서, 캡슐화된 핵산은 하이드로겔 비드 내에서 증폭된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 증폭 프라이머 및 효소는 하이드로겔 비드의 공극을 통해서 통과하고, 캡슐화된 핵산에 혼성화된다.
본 명세서에 기술되거나 관련 기술 분야에 일반적으로 공지된 증폭 방법 중 임의의 것을 범용 또는 표적-특이적 프라이머와 함께 사용하여 캡슐화된 핵산을 증폭시킬 수 있다는 것이 인지될 것이다. 증폭에 적합한 방법은 전문이 참고로 본 명세서에 포함된 미국 특허 제8,003,354호에 기술된 바와 같은, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 가닥 치환 증폭(SDA), 전사 매개 증폭(TMA) 및 핵산 서열 기반 증폭(NASBA)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 상기 증폭 방법을 사용하여 1종 이상의 관심 핵산을 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, 멀티플렉스 PCR을 비롯한 PCR, SDA, TMA, NASBA 등을 사용하여 캡슐화된 핵산을 증폭시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심대상 핵산에 특이적으로 안내된 프라이머가 증폭 반응에 포함된다.
핵산의 증폭을 위한 다른 적합한 방법은 올리고뉴클레오타이드 연장 및 결찰, 롤링 서클 증폭(RCA)(본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)]) 및 올리고뉴클레오타이드 결찰 검정(OLA) 기술(일반적으로 미국 특허 제7,582,420호, 제5,185,243호, 제5,679,524호, 및 제 5,573,907호, 특허 제EP 0 320 308 B1호; 제EP 0 336 731 B1호; 제EP 0 439 182 B1호; 제WO 90/01069호; 제WO 89/12696호; 및 제WO 89/09835호 참고, 모두 참고로 포함됨)을 포함할 수 있다. 이러한 증폭 방법은 캡슐화된 핵산을 증폭시키도록 설계될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 증폭 방법은 결찰 프로브 증폭 또는 관심대상 핵산에 특이적으로 안내되는 프라이머를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 결찰 검정(OLA) 반응을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 증폭 방법은 관심대상 핵산에 특이적으로 안내되고 하이드로겔 공극을 통해서 통과할 수 있는 프라이머를 함유하는 프라이머 연장-결찰 반응을 포함할 수 있다. 관심대상 핵산을 증폭시키도록 특이적으로 설계될 수 있는 프라이머 연장 및 결찰 프라이머의 비제한적인 예로서, 증폭은 각각 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,582,420호 및 제7,611,869호에 예시된 바와 같은 골든게이트(GoldenGate) 검정(일루미나사(Illumina, Inc.), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)을 위해서 사용된 프라이머를 포함할 수 있다. 기재된 방법 각각에서, 핵산 반응에 관여되는 시약 및 성분은 하이드로겔 비드의 공극을 통해서 통과할 수 있고, 핵산 자체는 비드 내에 보유된다.
일부 실시형태에서, 캡슐화된 핵산은 각각의 내용이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호의 개시내용에 의해서 예시된 바와 같은 클러스터 증폭 방법을 사용하여 증폭된다. 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호에 포함된 문헌은 고정된 핵산 분자의 클러스터 또는 "집락"을 구성하는 어레이를 형성하기 위해서 증폭 생성물이 고체 지지체 상에 고정되는 것을 가능하게 하는 핵산 증폭 방법을 기술한다. 이러한 어레이 상의 각각의 클러스터 또는 집락은 복수의 동일한 고정된 폴리뉴클레오타이드 가닥 및 복수의 동일한 고정된 상보성 폴리뉴클레오타이드 가닥으로부터 형성된다. 이렇게 형성된 어레이는 일반적으로 본 명세서에서 "클러스터된 어레이"라고 지칭된다. 고체상 증폭 반응의 생성물, 예컨대, 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호에 기재된 것은, 고정된 폴리뉴클레오타이드 가닥 및 고정된 상보성 가닥의 쌍의 어닐링에 의해서 형성된 소위 "브리징된" 구조이며, 두 가닥 다는 바람직하게는 공유 부착을 통해서, 5' 단부에서 고제 지지체 상에 고정된다. 클러스터 증폭 방법은 고정된 핵산 주형을 사용하여 고정된 앰플리콘을 생산하는 방법의 예이다. 다른 적합한 방법을 또한 사용하여 본 명세서에 제공된 방법에 따라서 생산된 고정된 DNA 단편으로부터 고정된 앰플리콘을 생산할 수 있다. 예를 들어, 증폭 프라이머의 각각의 쌍의 프라이머 중 하나 또는 둘 다가 고정되든 고정되지 않든, 하나 이상의 클러스터 또는 집락이 고체상 PCR을 통해서 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 캡슐화된 핵산은 비드 내에서 증폭되고, 이어서 어레이 내에 또는 클러스터 내의 고체 지지체 상에 침착된다. 예를 들어, 도 12에 나타낸 바와 같이, 핵산을 캡슐화한 하이드로겔 비드를 가공하고, 그 내에 함유된 핵산을 사용하여 2개의 상이한 인덱싱된 DNA 라이브러리를 확립할 수 있다. PhiX 라이브러리를 함유하는 하이드로겔 비드의 두 유형이 제조되었는데, 하나는 인덱스 2(CGATGT)를 갖고, 나머지는 인덱스 4(TGACCA)를 갖는다. 인덱스 2를 갖는 하이드로겔 비드 및 인덱스 4를 갖는 하이드로겔 비드를 혼합하고, 플로우 셀 내에 로딩한다. 비드를 표면과 접촉시키고, 분해시키고, 라이브러리를 표면 상에 침착시켰다. 현미경사진은 개별 비드 내의 개별 환경을 기초로 형성된 클러스터를 나타낸, 핵산 영상화를 도시한다. 영상은 인덱스 2 라이브러리와 인덱스 4 라이브러리 사이의 공간적 분리를 나타내는데, 이는 라이브러리가 상이한 하이드로겔 비드로부터 기원하였음을 나타낸다. 축적 막대 = 50㎛.
추가 증폭 방법은 등온 증폭을 포함한다. 사용될 수 있는 예시적인 등온 증폭 방법은 예를 들어, 문헌[Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002)]에 예시된 바와 같은 다중 치환 증폭(MDA), 또는 예를 들어, 미국 특허 제6,214,587호에 의해서 예시된 바와 같은 등온 가닥 이동 핵산 증폭을 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 상기 문헌 각각은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 개시내용에서 사용될 수 있는 다른 비-PCR-기반 방법은 예를 들어, 문헌[Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995]; 미국 특허 제5,455,166호, 및 제5,130,238호, 및 문헌[Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992)]에 기술된 가닥 치환 증폭(SDA) 또는 예를 들어, 문헌[Lage et al., Genome Research 13:294-307 (2003)]에 기술된 과분지화 가닥 치환 증폭(hyperbranched strand displacement amplification)을 포함한다. 게놈 DNA의 무작위 프라이머 증폭을 위해서 가닥-치환 Phi 29 중합효소 또는 Bst DNA 중합효소 큰 단편인, 5'->3' 엑소-와 함께 등온 증폭 방법이 사용될 수 있다. 이러한 중합효소의 사용은 이의 높은 진행도 및 가닥 치환 활성을 이용한다. 높은 진행도는 중합효소가 10 내지 20kb 길이인 단편을 생성시킬 수 있게 한다. 상기에 언급된 바와 같이, 낮은 진행도 및 가닥-치환 활성을 갖는 중합효소, 예컨대, 클레노브 중합효소를 사용하여 등온 조건 하에서 더 작은 단편이 생산될 수 있다. 증폭 반응, 조건 및 성분의 추가적인 설명은 미국 특허 제7,670,810호의 개시내용에 상세하게 언급되어 있고, 이것은 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다. 일부 실시형태에서, 이러한 증폭 반응을 수행하는 데 필요한 중합효소, 시약 및 성분은 하이드로겔 비드의 공극을 통해서 통과하여 캡슐화된 핵산과 상호작용함으로써, 하이드로겔 비드 내에서 핵산을 증폭시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 무작위 육량체가 변성 DNA에 어닐링되고, 그 다음 촉매화 효소, Phi 29의 존재 하에서 일정한 온도에서 가닥 치환 합성된다. 이것은, MDA 이후에 형광 강도의 증가에 의해서 확인되는 바와 같이 비드 내에서 DNA 증폭을 초래한다(DNA는 SYTOX로 염색됨)(도 9, 패널 a). 독립적으로, Nextera 태그먼테이션 및 PCR 후에 비드 내에서의 형광 강도의 실질적인 증가에 의해서 나타나는 바와 같이, 용해 및 세정 후 Nextera 기반 태그먼테이션 및 PCR을 통한 후속 gDNA 증폭이 또한 수행될 수 있다(도 9, 패널 b). 이러한 Nextera 라이브러리 제조 후에, 겔 비드를 3분 동안 80℃까지 가열시켜 비드의 내용물, 즉, 도 9, 패널 c에 나타낸 바와 같이 단일 세포로부터의 서열분석 준비된 라이브러리 생성물을 방출시킬 수 있다.
본 개시내용에서 유용한 또 다른 핵산 증폭 방법은 예를 들어, 전문이 참고로 본 명세서에 포함된 문헌[Grothues et al. Nucleic Acids Res. 21(5):1321-2 (1993)]에 기술된 바와 같은, 불변 5' 영역 그 다음 무작위 3' 영역을 갖는 2-도메인 프라이머의 집단을 사용하는 태깅된 PCR(Tagged PCR)이다. 제1 라운드의 증폭이 수행되어 무작위로 합성된 3' 영역으로부터의 개별 혼성화를 기초로 열 변성된 DNA 상에서 다수의 개시를 가능하게 한다. 3' 영역의 본성으로 인해서, 개시 부위는 게놈 전체에서 무작위적인 것으로 고려된다. 그 후, 비결합된 프라이머가 제거될 수 있고, 불변 5' 영역에 상보성인 프라이머를 사용하여 추가 복제가 일어날 수 있다.
일부 실시형태에서, 캡슐화된 핵산은 하이드로겔 비드 내에서 완전히 또는 부분적으로 서열분석된다. 캡슐화된 핵산은 임의의 적합한 서열분석 방법, 예컨대, 직접 서열분석, 예컨대, 합성에 의한 서열분석, 결찰에 의한 서열분석, 혼성화에 의한 서열분석, 나노공극 서열분석 등에 따라서 서열분석될 수 있다. 도 8b에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 하이드로겔 비드 내에 캡슐화된 단일 세포는 단일 세포 서열분석을 위해서 가공될 수 있다.
하나의 서열분석 방법은 합성에 의한 서열분석(sequencing-by-synthesis: SBS)이다. SBS에서, 핵산 주형(예를 들어, 표적 핵산 또는 이의 앰플리콘)을 따르는 핵산 프라이머의 확장을 모니터링하여 주형에서 뉴클레오타이드의 서열을 결정한다. 근본적인 화학적 공정은 중합(예를 들어, 폴리머라제 효소에 의해서 촉매됨)일 수 있다. 특정 폴리머라제-기반 SBS 실시형태에서, 프라이머에 첨가된 뉴클레오타이드의 순서 및 유형의 검출을 사용하여 주형의 서열을 결정할 수 있도록 주형 의존적인 방식으로 형광 표지된 뉴클레오타이드가 프라이머에 첨가된다(이에 의해서 프라이머를 확장시킴).
하나 이상의 증폭된 캡슐화된 핵산이 주기에서 시약의 반복적인 전달을 포함하는 다른 검출 기술 또는 SBS에 적용될 수 있다. 예를 들어, 제1 SBS 주기를 개시하기 위해서, 하나 이상의 표지된 뉴클레오타이드, DNA 중합효소 등이 하나 이상의 증폭된 핵산 분자를 수용하는 하이드로겔 비드 내로/하이드로겔 비드를 통해서 유동될 수 있다. 프라이머 확장이 표지된 뉴클레오타이드가 혼입되도록 하는 이러한 부위가 검출될 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드는, 뉴클레오타이드가 프라이머에 첨가되었을 때 프라이머 확장을 추가로 종결시키는 가역적인 종결 특성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 탈블로킹제가 전달되어 모이어티를 제거할 때까지 후속 확장이 일어날 수 없도록 가역적인 종결인자 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드 유사체가 프라이머에 첨가될 수 있다. 따라서, 가역적인 종결을 사용하는 실시형태의 경우, 탈블로킹 시약이 (검출이 일어나기 이전에 또는 이후에) 플로우 셀에 전달될 수 있다. 다양한 전달 단계 사이에 세척이 수행될 수 있다. 이어서 주기가 n회 반복되어 n개 뉴클레오타이드에 의해서 프라이머를 확장시켜, 길이 n의 서열을 검출할 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해서 생산된 앰플리콘과 함께 사용하기 위해서 쉽게 개작될 수 있는 예시적인 SBS 절차, 유체 시스템 및 검출 플랫폼은 예를 들어, 문헌[Bentley et al.,　Nature　456:53-59 (2008)], 특허 제WO 04/018497호; 미국 특허 제7,057,026호; 특허 제WO 91/06678호; 제WO 07/123744호; 미국 특허 제7,329,492호; 미국 특허 제7,211,414호; 미국 특허 제7,315,019호; 미국 특허 제7,405,281호, 및 제US 2008/0108082호에 기재되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
사이클릭 반응을 사용하는 다른 서열분석 절차, 예컨대, 파이로서열분석(pyrosequencing)이 사용될 수 있다. 파이로서열분석은 특정 뉴클레오타이드가 초기(nascent) 핵산 가닥에 혼입될 때 무기 파이로포스페이트(PPi)의 방출을 검출한다(문헌[Ronaghi, et al.,　Analytical Biochemistry　242(1), 84-9 (1996); Ronaghi,　Genome Res.　11(1), 3-11 (2001); Ronaghi et al.　Science　281(5375), 363 (1998)]; 미국 특허 제6,210,891호; 미국 특허 제6,258,568호 및 미국 특허 제6,274,320호, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함됨). 파이로서열분석에서, 방출된 PPi는 ATP 설퍼릴라제에 의해서 아데노신 트라이포스페이트(ATP)로 즉시 전환됨으로써 검출될 수 있고, 생성된 ATP의 수준은 루시퍼라제-생산된 광자를 통해서 검출될 수 있다. 따라서, 서열분석 반응은 발광 검출 시스템을 통해서 모니터링될 수 있다. 형광 기반 검출 시스템을 위해서 사용되는 여기 방사선원은 파이로서열분석 절차에 필요하지 않다. 본 개시내용에 따라서 생산되는 앰플리콘에 대한 파이로서열분석의 응용을 위해서 개작될 수 있는 유용한 유체 시스템, 검출기 및 절차는 예를 들어, 국제 특허 제PCT/US11/57111호, 미국 특허 제US 2005/0191698 A1호, 미국 특허 제7,595,883호 및 미국 특허 제7,244,559호에 기재되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 실시형태는 DNA 중합효소 활성의 실시간 모니터링을 포함하는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드는 형광단-보유 중합효소와 γ-포스페이트-표지된 뉴클레오타이드 간의 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer: FRET) 상호작용을 통해서 또는 제로 모드 도파관(zero mode waveguide: ZMW)을 사용하여 검출될 수 있다. FRET-기반 서열분석에 대한 기술 및 시약은 예를 들어, 문헌[Levene et al.　Science　299, 682-686 (2003); Lundquist et al.　Opt. Lett.　33, 1026-1028 (2008); Korlach et al.　Proc. Natl. Acad. Sci. USA　105, 1176-1181 (2008)]에 기재되어 있고, 이들의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 SBS 실시형태는 연장 생성물 내로의 뉴클레오타이드의 혼입 시에 방출되는 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 양성자의 검출을 기반으로 하는 서열분석은 상업적으로 입수 가능한 전기 검출기 및 관련 기술을 사용할 수 있다. 이러한 서열분석 시스템의 예는 파이로서열분석(예를 들어, 로슈사(Roche)의 자회사인 454 라이프 사이언시스사(454 Life Sciences)로부터 상업적으로 입수 가능한 플랫폼), γ-포스페이트-표지된 뉴클레오타이드를 사용한 서열분석(예를 들어, 퍼시픽 바이오사이언시스사(Pacific Biosciences)로부터의 상업적으로 입수 가능한 플랫폼) 및 양성자 검출을 사용한 서열분석(예를 들어, 라이프 테크놀로지즈사(Life Technologies)의 자회사인 이온 토렌트사(Ion Torrent)로부터 상업적으로 입수 가능한 플랫폼) 또는 특허 제US 2009/0026082 A1호; 제US 2009/0127589 A1호; 제US 2010/0137143 A1호; 또는 제US 2010/0282617 A1호에 기재된 서열분석 방법 및 시스템이고, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다. 표적 핵산을 운동력학적 배제를 사용하여 증폭시키기 위한 본 명세서에 언급된 방법이 양성자를 검출하는 데 사용되는 기질에 쉽게 적용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 명세서에 언급된 방법을 사용하여 양성자를 검출하는 데 사용되는 앰플리콘의 클론성 집단을 생성시킬 수 있다.
또 다른 서열분석 기술은 나노공극 서열분석이다(예를 들어, 문헌[Deamer et al. Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000); Deamer et al. Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002); Li et al. Nat. Mater. 2:611-615 (2003)] 참고, 이들의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함됨). 일부 나노공극 실시형태에서, 표적 핵산 또는 표적 핵산으로부터 제거된 개별 뉴클레오타이드가 나노공극을 통해서 통과한다. 핵산 또는 뉴클레오타이드가 나노공극을 통해서 통과할 때, 공극의 전기 전도도에서의 변동을 측정함으로써 각각의 뉴클레오타이드 유형이 식별될 수 있다(미국 특허 제7,001,792호; 문헌[Soni et al. Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007); Healy, Nanomed. 2, 459-481 (2007); Cockroft et al. J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008)], 이들 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함됨).
본 개시내용에 따른 검출에 적용될 수 있는 어레이-기반 발현 및 유전형 분석을 위한 예시적인 방법은 미국 특허 제7,582,420호; 제6,890,741호; 제6,913,884호 또는 제6,355,431호 또는 미국 특허 공개 제2005/0053980 A1호; 제2009/0186349 A1호 제US 2005/0181440 A1호에 기재되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산의 단리, 증폭 및 서열분석 방법에서, 다양한 시약이 핵산 단리 및 제조를 위해서 사용된다. 이러한 시약은 예를 들어, 라이소자임, 프로테이나제 K, 무작위 육량체, 중합효소(예를 들어, Φ29 DNA 중합효소, Taq 중합효소, Bsu 중합효소), 트랜스포사제(예를 들어, Tn5), 프라이머(예를 들어, P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매화 효소, 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 완충제 또는 2가 양이온을 포함할 수 있다. 이러한 시약은 하이드로겔 비드의 공극을 통해서 통과되는 반면, 유전 물질은 하이드로겔 비드 내에 보유된다. 본 명세서에 언급된 방법의 이점은 그것이 하이드로겔 비드 내에서의 핵산의 가공을 위한 캡슐화된 미세환경을 제공한다는 것이다. 이것은 표적 핵산의 신속하고 효율적인 가공을 위한 단일 세포 가공을 가능하게 한다.
어댑터는 서열분석 프라이머 부위, 증폭 프라이머 부위 및 인덱스를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "인덱스"는 분자 식별자로서 사용될 수 있는 뉴클레오타이드의 서열 및/또는 핵산을 태깅하고/하거나 핵산의 공급원을 식별하기 위한 바코드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인덱스는 단일 핵산 또는 핵산의 하위집단을 식별하기 위해서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 라이브러리는 하이드로겔 비드 내에서 제조될 수 있다. 도 8a에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 하이드로겔 비드 내에 캡슐화된 단일 세포가, 예를 들어, 접근 보존 전위(contiguity preserving transposition: CPTSeq) 접근법을 사용하여, 단일 세포의 조합 인덱싱을 위해서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 도 8C에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 단일 세포로부터의 DNA는, 단일 세포를 WGA 증폭 이후에 바코딩된 트랜스포존을 보유하는 또 다른 비드를 사용하여 캡슐화하고, 겔 매트릭스를 예를 들어, 환원제와 접촉시킴으로써 겔 매트릭스를 용해시켜, 바코딩을 위한 게놈 DNA를 방출함으로써 바코딩될 수 있다.
"공간 인덱싱" 방법 및 본 명세서에 기재된 기술의 실시형태는 데이터 분석을 단축시키고, 단일 세포 및 긴 DNA 분자로부터의 라이브러리 제조 공정을 단순화한다. 단일 세포 서열분석을 위한 기존의 프로토콜은 세포의 효율적으로 물리적으로 분리하고, 각각의 단리된 세포를 고유하게 바코딩하고, 서열분석을 위해서 모든 것을 함께 다시 풀링(pooling)시키는 것이 필요하다. 합성의 긴 판독물을 위한 현재 프로토콜은 또한 번거로운 바코딩 단계, 및 서열분석을 위해서 각각의 바코딩된 단편을 풀링시키는 것 및 데이터 분석이 각각의 바코딩된 세포로부터 유래된 유전자 정보를 구별하게 하는 것을 필요로 한다. 이러한 긴 공정 동안 서열에서 낙오를 유발하는 유전 물질의 손실이 또한 존재한다. 본 명세서에 기재된 실시형태는 공정을 단축시킬 뿐만 아니라 단일 세포에 대한 데이터 분해능을 증가시킨다. 추가로, 본 명세서에 제공된 실시형태는 새로운 유기체의 게놈의 조립을 단순화한다. 본 명세서에 기재된 실시형태는 희귀 유전자 변형 및 돌연변이의 공동 발생을 드러나게 하기 위해서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 비드 내에 갇힌 DNA 라이브러리는 방출될 때까지 방출 공정 및 하이드로겔 제형을 제어함으로써 표면 상에 방출되는 단편의 크기를 제어하는 기회를 제공한다.
일부 실시형태에서, 라이브러리는 어댑터 서열 내의 프라이머 부위를 사용하여 증폭될 수 있고, 어댑터 서열 내의 서열분석 프라이머 부위를 사용하여 서열분석될 수 있다. 일부 실시형태에서 어댑터 서열은 핵산의 공급원을 식별하기 위한 인덱스를 포함할 수 있다. 후속 증폭 단계의 효율은 프라이머-이량체의 형성에 의해서 감소될 수 있다. 후속 증폭 단계의 효율을 증가시키기 위해서, 비-결찰된 단일-가닥 어댑터가 결찰 생성물로부터 제거될 수 있다.
하이드로겔 비드를 사용한 핵산 라이브러리의 제조
본 명세서에 제공된 시스템, 방법 및 조성물의 일부 실시형태는 어댑터가 표적 핵산에 결찰되는 방법을 포함한다. 어댑터는 서열분석 프라이머 결합 부위, 증폭 프라이머 결합 부위 및 인덱스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 어댑터는 P5 서열, P7 서열 또는 이의 보체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 P5 서열은 서열번호 1(AATGATACGGCGACCACCGA)에 의해서 정의되는 서열을 포함하고, P7 서열은 서열번호 2(CAAGCAGAAGACGGCATACGA)에 의해서 정의되는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, P5 또는 P7 서열은 스페이서 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있는데, 이것은 1 내지 20개, 예컨대, 1 내지 15개 또는 1 내지 10개의 뉴클레오타이드, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 10개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 폴리T 스페이서, 예컨대, 10T 스페이서이다. 스페이서 뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드의 5' 단부에 포함될 수 있는데, 이것은 폴리뉴클레오타이드의 5' 단부와 함께 링키지를 통해서 적합한 지지체에 부착될 수 있다. 부착은 황-함유 친핵체, 폴리뉴클레오타이드의 5' 단부에 존재하는 포스포로티오에이트를 통해서 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리T 스페이서 및 5' 포스포로티오에이트 기를 포함할 것이다. 따라서, 일부 실시형태에서, P5 서열은 5'포스포로티오에이트-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3', 서열번호 3이고, 일부 실시형태에서, P7 서열은 5'포스포로티오에이트-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGA-3', 서열번호 4이다.
인덱스는 핵산 분자의 공급원을 식별하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 어댑터는 예를 들어, 하나 또는 두 단부에서 어댑터의 연장을 예방하는 블로킹기의 첨가에 의해서, 콘카테머(concatemer)의 형성을 예방하도록 변형될 수 있다. 3' 블로킹기의 예는 3'-스페이서 C3, 다이데옥시뉴클레오타이드, 및 기질에 대한 부착을 포함한다. 5' 블로킹기의 예는 탈포스포릴화된(dephosphorylated) 5' 뉴클레오타이드, 및 기질에 대한 부착을 포함한다.
어댑터는 핵산, 예컨대, 단일-가닥 핵산을 포함한다. 어댑터는 약 5개 뉴클레오타이드, 10개 뉴클레오타이드, 20개 뉴클레오타이드, 30개 뉴클레오타이드, 40개 뉴클레오타이드, 50개 뉴클레오타이드, 60개 뉴클레오타이드, 70개 뉴클레오타이드, 80개 뉴클레오타이드, 90개 뉴클레오타이드, 100개 뉴클레오타이드보다 적거나, 많거나, 이와 동일하거나, 또는 상기 크기 중 임의의 2개 사이의 범위의 길이를 갖는 짧은 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 어댑터는 하이드로겔 비드의 공극을 통해서 통과하기에 충분한 크기를 갖는다. 표적 핵산은 DNA, 예컨대, 게놈 또는 cDNA; RNA, 예컨대, mRNA, sRNA 또는 rRNA; 또는 DNA와 RNA의 혼성체를 포함한다. 핵산은 하이드로겔 비드 내에 캡슐화된 단일 세포로부터 단리될 수 있다. 핵산은 포스포다이에스터 결합을 함유할 수 있고, 예를 들어, 포스포르아마이드, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, O-메틸포스포로아미다이트 및 펩타이드 핵산 골격 및 링키지를 포함하는, 다른 유형의 골격을 포함할 수 있다. 핵산은 데옥시리보- 및 리보뉴클레오타이드의 임의의 조합물, 및 우라실, 아데닌, 티민, 사이토신, 구아닌, 이노신, 잔타닌, 하이포잔타닌, 아이소사이토신, 아이소구아닌, 및 염기 유사체, 예컨대, 나이트로파이롤(3-나이트로파이롤 포함) 및 나이트로인돌(5-나이트로인돌 포함)을 비롯한 염기의 임의의 조합물을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 적어도 하나의 다양한 염기를 포함할 수 있다. 다양한 염기는 하나 초과의 상이한 유형의 염기와 염기쌍을 이룰 수 있고, 예를 들어, 복합체 핵산 샘플, 예컨대, 게놈 DNA 샘플에서 무작위 혼성화를 위해서 사용되는 삽입물 또는 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 포함되는 경우 유용할 수 있다. 다양한 염기의 예는 아데닌, 티민 또는 사이토신과 쌍을 이룰 수 있는 이노신을 포함한다. 다른 예는 하이포잔틴, 5-나이트로인돌, 아크릴 5-나이트로인돌, 4-나이트로피라졸, 4-나이트로이미다졸 및 3-나이트로파이롤을 포함한다. 적어도 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 유형의 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 다양한 염기가 사용될 수 있다.
표적 핵산은, 샘플 중의 핵산의 평균 크기가 약 2kb, 1kb, 500bp, 400bp, 200bp, 100bp, 50bp보다 적거나, 많거나, 이와 동일하거나, 또는 상기 크기 중 임의의 2개 사이의 범위인 샘플을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플 중의 핵산의 평균 크기는 약 2000개 뉴클레오타이드, 1000개 뉴클레오타이드, 500개 뉴클레오타이드, 400개 뉴클레오타이드, 200개 뉴클레오타이드, 100개 뉴클레오타이드, 50개 뉴클레오타이드보다 적거나, 많거나, 이와 동일하거나, 또는 상기 크기 중 임의의 2개 사이의 범위이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 핵산이 하이드로겔 비드 내에 포획되어 그것이 하이드로겔 비드의 공극을 통해서 통과할 수 없는 충분한 크기를 갖는다.
예시적인 방법은 후속 결찰 단계에서 콘카테머의 형성을 예방하기 위해서 표적 핵산의 5' 단부를 탈포스포릴화시키는 단계; 리가제를 사용하여 제1 어댑터를 탈포스포릴화된 표적의 3' 단부에 결찰시키는 단계(여기서 제1 어댑터의 3' 단부는 블로킹됨); 결찰된 표적의 5' 단부를 재포스포릴화시키는 단계; 단일 가닥 리가제를 사용하여 제2 어댑터를 탈포스포릴화된 표적의 5' 단부에 결찰시키는 단계(여기서 제2 어댑터의 5' 단부는 비포스포릴화됨)를 포함한다.
또 다른 예는 5' 엑소뉴클레아제를 사용하여 핵산을 부분적으로 소화시켜 단일 가닥 3' 오버행을 갖는 이중 가닥 핵산을 형성하는 것을 포함한다. 3' 블로킹기를 함유하는 어댑터는 3' 오버행을 갖는 이중 가닥 핵산의 3' 단부에 결찰될 수 있다. 결찰된 어댑터를 갖는 3' 오버행을 갖는 이중 가닥 핵산은 탈혼성화되어 단일 가닥 핵산을 형성할 수 있다. 비포스포릴화된 5' 단부를 함유하는 어댑터는 단일 가닥 핵산의 5' 단부에 결찰될 수 있다.
핵산, 예컨대, 핵산의 5' 뉴클레오타이드를 탈포스포릴화시키는 방법은 핵산을 포스파타제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 포스파타제의 예는 송아지 장(calf intestinal) 포스파타제, 새우 알칼리성 포스파타제, 안타틱(antarctic) 포스파타제 및 APEX 알칼리성 포스파타제(Epicentre)를 포함한다.
핵산을 결찰시키는 방법은 핵산을 리가제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 리가제의 예는 T4 RNA 리가제 1, T4 RNA 리가제 2, RtcB 리가제, 메타노박테리움(Methanobacterium) RNA 리가제, 및 TS2126 RNA 리가제(CIRCLIGASE)를 포함한다.
핵산, 예컨대, 핵산의 5' 뉴클레오타이드를 포스포릴화시키는 방법은 핵산을 키나제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 키나제의 예는 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 포함한다.
본 명세서에 제공된 실시형태는 핵산 라이브러리를 하이드로겔 비드 내에서 제조하여, 핵산 라이브러리가 단일 반응 부피로 제조되는 것에 관한 것이다.
본 명세서에 제공된 시스템 및 방법의 실시형태는 하이드로겔 중합체, 가교제 또는 유전 물질을 캡슐화하는 하이드로겔 비드를 제조하기 위한 미세유체 디바이스 중 임의의 하나 이상을 함유하고, 세포 용해용 시약, 핵산 증폭용 시약 및 서열분석용 시약, 또는 핵산 라이브러리 제조용 시약, 예컨대 본 명세서에 기재된 바와 같고, 유전 물질의 각각의 가공을 위해서 사용되는 바와 같은 라이소자임, 프로테이나제 K, 무작위 육량체, 중합효소(예를 들어, Φ29 DNA 중합효소, Taq 중합효소, Bsu 중합효소), 트랜스포사제(예를 들어, Tn5), 프라이머(예를 들어, P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매화 효소, 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 완충제 또는 2가 양이온을 비롯한 유전 물질의 가공에 유용한 성분을 추가로 포함하는 키트를 포함한다.
실시예
실시예 1―하이드로겔 비드의 제조
하기 실시예는 수동 보텍싱 및 미세유체 액적 발생기를 사용하여 미생물 세포를 캡슐화한 하이드로겔의 제조의 실시형태를 나타낸다.
-80℃에서 저장된 이. 콜라이, 비. 서브틸리스 및 에이. 하이드로필라 중 하나 이상을 함유한 샘플을 실온에서 해동시켰다. 100㎕의 각각의 박테리아 용액을 멸균 1.7㎖ 튜브로 옮기고, 샘플을 1㎖의 0.85% NaCl로 1회 세척하였다. 샘플을 펠릿화시키고, 세척 용액을 제거하였다. 박테리아 펠릿을 하기와 같이 기재된 하이드로겔 용액과의 혼합물로 저장하였다.
탈이온수로 희석된 40% 아크릴아마이드/비스 19:1(바이로래드사(BioRad) #161-0144)로부터 12%의 하이드로겔 용액을 제조하였다. 40%(w/v)의 아크릴아마이드/N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BACy)(19:1) 단량체 스톡 용액(3.8g의 아크릴아마이드, 0.2g의 BACy 및 6㎖의 2차 증류(double distilled: dd) H2O)을 제조하였다. 혼합물을 10㎖의 최종 부피로 만들었다. 용액을 제조하기 위해서, 아크릴아마이드를 6㎖의 ddH2O 중에 용해시키고, 생성된 용액을 사용하여 BACy를 용해시켰다. 단량체의 용해는 흡열성이기 때문에, 혼합물을 약간 가열시키는 것이 단량체의 완전한 용해를 도울 것이다. 하이드로겔 용액을 사용 시까지 4℃에서 유지시켰다. 35㎕의 포화 과황산칼륨 용액(KPS; 시그마사(Sigma))을 200㎕의 12% 하이드로겔 용액에 첨가하고, 잘 혼합하였다. 235㎕의 하이드로겔-KPS 용액을 박테리아 세포 펠릿을 함유하는 각각의 튜브에 첨가하여 세포를 재현탁시켰다. 이어서, 하이드로겔-박테리아 용액을 계면활성제(4.5% Span 80, 0.4% Tween 20 및 0.05% Triton X-100)를 함유하는 600㎕의 미네랄 오일 중에 로딩하였다. 용액을 30초 동안 보텍싱시켜 액적 에멀션을 생성시켰고, 25㎕의 테트라메틸에틸렌다이아민(TEMED; 시그마사)을 즉시 첨가하고, 그 다음 추가로 30초 동안 보텍싱시켰다.
19:1의 아크릴아마이드/BACy 비를 갖는 10%의 겔(2㎖)을 제조하기 위해서, 0.96㎖의 ddH2O, 0.5㎖의 40%의 아크릴아마이드/BACy(19:1), 0.5㎖의 10× tris/보레이트/EDTA 완충제(TBE), 20㎕의 TEMED 및 20㎕의 KPS(포화됨)를 혼합하였다.
19:1의 아크릴아마이드/BACy 비를 갖는 5%의 겔(2㎖)을 제조하기 위해서, 1.21㎖의 ddH2O, 0.25㎖의 40%의 아크릴아마이드/BACy(19:1), 0.5㎖의 10× TBE, 20㎕의 TEMED 및 20㎕의 KPS(포화됨)를 혼합하였다. 겔화될 때까지(약 3 내지 6분) 반응을 중합시켰다.
이어서 박테리아 세포를 캡슐화한 하이드로겔 비드를 생성시켰다. 15분 동안 인큐베이션시켜 하이드로겔 비드를 완전히 가교시킨 후, 약 900㎕의 석유 에터를 각각의 튜브에 첨가하였다. 튜브를 보텍싱시켜 오일을 세척하고, 상청액을 제거하였다. 1㎖의 PR2를 각각의 튜브에 첨가하고, 그 다음 보텍싱시키고, 비드를 스피닝 다운시킴으로써 하이드로겔 비드를 세척하였다. 상청액을 제거하고, 1㎖의 PR2로 비드를 3회 세척하였다. 비드를 1㎖의 PR2 중에 재현탁시켰다. PR2 중의 하이드로겔 비드를 적어도 3주 동안 4℃에서 저장할 수 있다.
수동 에멀션을 사용하는 상기에 기재된 방법을 사용하여 약 2㎛ 내지 약 100㎛의 직경의 크기 분포를 갖는 하이드로겔 비드를 생성시킬 수 있다.
균일한 크기 분포의 하이드로겔 비드를 생성시키기 위해서, 미세유체 액적 발생기, 예컨대, 도 2에 도시된 발생기를 사용할 수 있다. 균일한 크기 분포의 하이드로겔 비드를 형성하기 위해서, 하이드로겔 중합체 및 박테리아 세포를 함유하는 수성 용액을 미세유체 액적 발생기에서 미네랄 오일 중에 도입하였다. 미세유체 디바이스는 120㎛의 높이, 75㎛의 수성 채널 폭 및 78㎛의 담체 오일 채널 폭을 가졌다. 이러한 칩과 함께, 수성 채널의 경우 60㎕/분의 유량 및 담체 오일 채널의 경우 300㎕/분의 유량을 사용하였다. 이러한 디바이스를 사용하여, 대략 90㎛ 직경의 하이드로겔 비드를 생성시켰다. 채널 폭, 미세유체 디바이스 크기 및 유량을 조정함으로써 비드의 크기를 미세하게 조정할 수 있다.
또한, 아이소프로필 알코올을 첨가하여 비드 직경을 미세하게 조정할 수 있다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 아이소프로필 알코올을 하이드로겔 용액에 명시된 양(0% 내지 약 30% v/v 범위)으로 첨가하여, 특정 직경의 하이드로겔 비드를 형성할 수 있다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 아이소프로필 알코올의 양을 증가시켜 하이드로겔 비드 직경을, 130㎛(0% 아이소프로필 알코올 사용)에서 약 75㎛의 직경(28% 아이소프로필 알코올 사용)으로 감소시킨다.
하이드로겔 비드는 또한 목적하는 양의 세포를 캡슐화하도록 미세하게 조정될 수 있다. 도 4A 및 도 4B에 나타낸 바와 같이, 다수의 염색된 박테리아 세포가 약 100㎛의 각각의 하이드로겔 비드에 존재하는 것을 발견하였고(도 4A), 약 10㎛의 각각의 하이드로겔 비드에는 단지 단일 세포 또는 몇몇 세포가 로딩되었다(도 4B).
또한, 하이드로겔 비드의 겔화 속도가 또한 각각의 하이드겔 비드 중의 세포의 양을 결정할 수 있다. NIH-3T3 마우스 섬유아세포의 존재 하에서 하이드로겔 비드를 제조하였다. 도 6A 및 도 6B에 나타낸 바와 같이, 하이드로겔 비드의 신속한 겔화는 비드당 단일 세포를 초래한 반면(도 6A), 느린 겔화는 비드 당 몇몇 세포를 초래하였다(도 6B).
실시예 2―뉴클레오타이드 작용화된 하이드로겔 비드
하기 실시예는 실시예 1로부터의 하이드로겔 비드를 뉴클레오타이드로 작용화시키는 방법을 나타낸다.
아자이드 작용화된 하이드로겔 비드를 알킨 작용화된 DNA와 반응시킴으로써, 구리-촉매화 아자이드-알킨 고리화첨가(CuAAC) 화학을 사용하여 DNA 작용화된 하이드로겔 비드를 획득하였다(도 5a). 아자이드 작용화된 하이드로겔 비드의 합성을 위해서, 단량체, 가교제 및 라디칼 발생제를 포함하는 하이드로겔 전구체 믹스를 혼합하고, 단분산성 하이드로겔 비드를 미세유체를 사용하여 생성시켰다. 하이드로겔 비드를 0% 내지 8%의 범위의 농도의 BrAPA로 도핑하였다. 그 다음 브로마이드를 아자이드화시켜 Br기를 아자이드기(N3)로 전환시켰다. 이어서, 아자이드화된 하이드로겔을 CuAAC 화학을 사용하여 알킨-변형된 올리고뉴클레오타이드와 반응시켰다. 아자이드화가 일어나지 않은 하이드로겔 비드는 비드 상에 그래프팅된 어떠한 올리고뉴클레오타이드도 갖지 않았다(도 5b, "본래"). 다른 한편, 아자이드화된 하이드로겔 비드는 하이드로겔 비드 상에 그래프팅된 올리고뉴클레오타이드를 가졌다(도 5b, "아자이드화된(N3)"). 그래프팅된 올리고뉴클레오타이드의 밀도는 하이드로겔 전구체 믹스에 첨가된 BrAPA의 백분율과 직접 상관관계가 있었다.
이러한 올리고뉴클레오타이드 작용화된 비드를 사용하여 세포로부터 mRNA를 캡처하였다. 하이드로겔 비드를 폴리T 올리고뉴클레오타이드로 작용화시켰다(도 5c). 폴리T 작용화된 하이드로겔 비드를 세포와 혼합하였다. 그 다음, 세포를 용해시키고, 비드를 수집하고, 세척하였다. 제2 가닥 합성을 수행하여 캡처된 mRNA로부터 cDNA를 제조하였다. 도 5d에 나타낸 바와 같이, 전기크로마토그램은 보체를 갖는 cDNA의 트레이스(우측 곡선)를 나타내었으며, 이어서, cDNA 듀플렉스를 Nextera로 태그먼트시켰다. 태그먼트된 DNA(좌측 곡선)는 태그먼테이션으로 인해서 예측된 바와 같은 더 낮은 분자량으로 이동하였다.
실시예 3―하이드로겔 비드로부터의 유전 물질의 방출
하기 실시예는 가교제의 가역적인 분열 시에 내용물을 방출하는, 내부에 유전 물질이 캡슐화된 하이드로겔 비드의 능력을 나타낸다.
박테리아 세포를 캡슐화한 하이드로겔 비드를 실시예 1에 따라서 제조하였다. 하이드로겔 비드는 다이설파이드 결합을 함유하는 비스아크릴아마이드 가교제를 포함한다. 비드를 박테리아 세포의 가시화를 위해서 염료 염색하였다. 도 6C에 나타낸 바와 같이, 환원제의 부재 하에서 하이드로겔 비드는 박테리아 세포를 보유할 수 있다. 그러나, 환원제와의 접촉 시, THP의 경우에는, 박테리아가 하이드로겔 비드로부터 방출되었다.
실시예 4―하이드로겔 비드 중의 핵산 라이브러리 제조
하기 실시예는 하이드로겔 비드 내에 캡슐화된 유전 물질로부터의 핵산을 서열분석하는 공정을 나타낸다.
실시예 1에 제조된 바와 같은 하이드로겔 비드를 획득하고, 핵산을 하기와 같이 단리시켰다. 이. 콜라이를 캡슐화한 하이드로겔 비드 50㎕의 용액을 200㎕의 튜브(대략 50개의 비드/㎕를 가짐)로 옮겼다. 비드를 스핀 다운시키고, 상청액을 제거하였다. 100㎕의 박테리아 용해 시약(써모 피셔 사이언티픽사, Charge Switch 키트로부터의 100㎕ 재현탁 완충제 중의 0.5mg 라이소자임)을 튜브에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 500㎕의 프로테이나제 K 시약을 첨가하고, 55℃에서 20분 동안 인큐베이션시켜 단백질을 완전히 소화시켰다. 이러한 단계에서, 이. 콜라이 gDNA를 노출시켰지만, 하이드로겔 매트릭스 내부에 고정되었다. 박테리아 gDNA를 보유하는 비드를 PR2로 세척하고, 하이드로겔 비드를 재수집하였다. 이어서, Tn5 트랜스포좀 시약(Nextera, 일루미나사)을 튜브에 첨가하고, 55℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. p5 및 p7 단부를 함유하는 어댑터를 이 단계 이후에 DNA에 삽입하였다. 이어서, 50㎕의 정지 완충제를 로딩하여 Tn5 효소를 넉 아웃(knock out)시켰다. 갭 충전을 위해서 Bsu 중합효소 및 뉴클레오타이드를 갖는 연장 믹스를 첨가하였다. 이러한 단계 이후에, 핵산 라이브러리는 준비가 되었고, 하이드로겔 비드 매트릭스 내부에 고정되었다. 이러한 동일한 단계를 비. 서브틸리스 하이드로겔 비드 및 에이. 하이드로필라 각각에 대해서 반복하여 박테리아 세포를 용해시키고, 각각의 하이드로겔 비드를 위한 라이브러리 제조를 마무리하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 내부에 제조된 DNA 라이브러리를 갖는 하이드로겔 비드를 표면에 시딩하고, DNA 라이브러리를 방출시켰다. 도 10, 패널 a)는 P5/P7 그래프팅된 표면 상에 로딩된 태그먼트된 게놈을 갖는 하이드로겔을 나타낸다. 도 10, 패널 b)는 용리, 시딩 및 등온 브리지 증폭 및 염색된 단일 가닥 DNA를 나타낸다. 도 10, 패널 c)는 고 밀도에서 더 낮은 밀도(좌측에서 우측으로)로의 클러스터 밀도의 구배를 도시하며, 더 높은 밀도는 하이드로겔이 처음에 배치된 표면 상의 위치를 나타낸다.
본 실시예는, 하이드로겔 비드 내부에 단일 박테리아 세포를 캡슐화한 하이드로겔 비드의 제조를 나타내며, 이것은 박테리아 게놈을 가공하고, 비드 내부에서 전체 DNA 라이브러리 제조를 수행하는 데 사용될 수 있다. 하이드로겔의 공극 크기는 효소, 화학물질 및 더 작은 크기의 프라이머(50bp 미만)의 확산을 허용하지만, 더 큰 크기의 DNA(300bp 초과)를 보유하여 무손상 전체 게놈 DNA 및 생산된 DNA 라이브러리가 전체 공정 동안 겔 마이크로비드 내부에 보유되도록 조작되었다. 이어서 단일 박테리아로부터의 DNA 라이브러리는 라이브러리 시딩을 위해서 특정 면적에, 예를 들어, 플로우 셀 표면 상에 방출될 수 있다. 그 다음, 이것은 개별 박테리아 세포로부터 기원한 플로우 셀 상에 "DNA 클러스터"의 공간 분포를 초래함으로써, 후가공 동안 판독물 정렬을 단순화한다.
실시예 5―하이드로겔 비드로부터의 핵산의 서열분석
하기 실시예는 유전 물질을 캡슐화한 하이드로겔 비드로부터의 DNA 라이브러리의 서열분석을 나타낸다.
실시예 4로부터 제조된 DNA 라이브러리를 하이드로겔로부터 방출시키고, 표면 상에 침착시켰다. 단편화된 DNA를 하이드로겔로부터 용리시켰다. 대조군 샘플을 열 처리 없이 저장하였다. 두 샘플 모두를 12-주기 PCR 반응에 의해서 풍부화시키고, 생물분석기 상에서 검정하여 단편 분포를 결정하였다. 이중 앰퓨어 세정(double Ampure clean-up) 이후에, 이. 콜라이 단편을 MiSeq 플랫폼(일루미나사, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재) 상에서 서열분석하였다. 도 11A에 나타낸 바와 같이, 하이드로겔로부터 용리된 DNA 단편은 대략 350bp의 평균 크기를 갖는 단편 크기 분포를 가졌다. 이에 반해서, 열 처리되지 않은 도 11B에 나타낸 샘플은 12-주기 PCR 반응 이후에도 어떠한 단편도 나타내지 않았는데, 이는 그 단편이 하이드로겔 비드로부터 방출되지 않았음을 나타낸다. 단편을 서열분석하였고, 서열 중 98%가 장내세균과(enterbacteriaceae)에 정렬되었고, 이것 중 39%가 이. 콜라이에 정렬되었다.
실시예 6―공간 인덱싱
하기 실시예는 하이드로겔 비드 내에 제조된 DNA 라이브러리의 공간 인덱싱을 나타낸다.
상이한 박테리아 유형 간의 공간적 분리를 입증하기 위해서, 이. 콜라이, 비. 서브틸리스 및 에이. 하이드로필라를 모델 유기체로서 선택하였다. 각각의 유기체를 하이드로겔 비드의 그 자신의 군 내에 내장시켰다. 단일 유형의 유기체를 함유하는 각각의 비드 유형을 용해 처리를 통해서 별도로 가공하였고, 각각의 종은 라이브러리 제조 프로토콜 동안 첨가된 그 자신의 고유한 인덱스를 가졌다. 이어서, 이. 콜라이, 비. 서브틸리스 및 에이. 하이드로필라로부터의 DNA 라이브러리를 보유하는 3종의 상이한 하이드로겔 비드를 동일한 튜브에 혼합하였다. 하이드로겔 비드를 스핀 다운시키고, 상청액을 제거하였다. 계면활성제(4.5% Span 80, 0.4% Tween 20 및 0.05% Triton X-100)를 갖는 100㎕의 미네랄 오일을 비드에 첨가하고, 30초 동안 보텍싱시켜 오일 중에 비드를 재현탁시켰다. 이어서, 25㎕의 오일 재에멀션 비드 용액을 MiSeq 플로우 셀에 로딩하였다. MiSeq 플로우 셀의 온도를 3분 동안 90℃까지 상승시켜 DNA 라이브러리를 변성시키고, 변성된 라이브러리를 하이드로겔 비드로부터 확산시키고, 그 다음 6분 동안 60℃, 2분 동안 40℃, 그리고 2분 동안 20℃로 유지시켜 단일 가닥 DNA 라이브러리를 클러스터 증폭 동안 표면 P5/P7 프라이머에 혼성화시켰다. 시딩된 라이브러리를 클러스터링하고, 선형화하고, 제1 염기 서열분석하였고, 결과를 도 13에 나타낸다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 하이드로겔 비드 내의 DNA 라이브러리는 비드 외부로 확산되어 MiSeq 플로우 셀에 결합할 수 있는데, 여기서 플로우 셀 상에서 각각의 유기체에 대해서 구별되는 클러스터로 증폭이 일어났다.
이러한 3종의 상이한 유기체를 갖는 하이드로겔 비드 중에 생성된 라이브러리가 시딩된 MiSeq 플로우 셀을 MiSeq(2×150 주기 실시) 상에서 추가로 서열분석하였다. 서열분석 분석은, 도 14A 및 도 14B에 나타낸 바와 같이, 그러한 실시가 타당한 품질로 완결되었음을 나타낸다. 3종의 상이한 종 각각을 검출하였다. 하이드로겔 방출된 라이브러리로부터 생성된 판독물 길이는 매우 유사한 크기 범위를 가졌는데, 이는 하이드로겔로부터 방출된 라이브러리 단편의 크기가 하이드로겔 조성물 및 DNA 방출 프로토콜에 의해서 제어될 수 있음을 나타낸다. PhiX 제어 라이브러리를 또한 스파이킹(spiking)하여 실시 품질을 확인하였다. 도 15a 내지 도 15c는 이. 콜라이, 비. 서브틸리스 또는 에이. 하이드로필라 박테리아를 함유하는 하이드로겔 비드가 시딩된 플로우 셀의 MiSeq 서열분석 결과를 나타내고, MiSeq 영상으로터의 원시 데이터(도 15a), 특정 게놈에 정렬된 클러스터(도 15c), 및 3종의 상이한 박테리아 종의 패스 필터의 요약 표(도 15c)를 포함한다.
본 명세서에 기재된 실시형태, 실시예 및 도면은 용해부터 라이브러리 생성까지 동안 물리적으로 제한된 공간 내에 유전 물질을 보유하기 위한 조성물, 방법 및 시스템을 제공한다. 일부 실시형태는 제한된 공간 내의 플로우 셀의 표면 상에 방출될 단일의 긴 DNA 분자 또는 단일 세포로부터 기원한 라이브러리를 제공한다. 개별 구획 내의 단일 DNA 분자 또는 단일 세포로부터의 라이브러리가 플로우 셀의 표면에 방출되면, 각각의 구획으로부터의 라이브러리는 서로에 인접하게 시딩된다.
용어 "포함하는"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "포함한", "함유하는", 또는 "특징으로 하는"과 동의어이고, 포괄형 또는 개방형이고, 추가적인 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 제외하지 않는다.
상기 설명은 본 발명의 몇몇 방법 및 물질을 개시한다. 본 발명은 방법 및 물질의 변형뿐만 아니라 제조 방법 및 장비의 변경이 가능하다. 이러한 변형은 본 명세서에 개시된 본 발명의 실시 또는 본 개시내용을 고려할 때 당업자에게 자명할 것이다. 결론적으로, 본 발명은 본 명세서에 개시된 구체적인 실시형태로 제한되는 것을 의도하지 않지만, 본 발명의 범주 및 사상에 포함되는 모든 변형 및 대안을 포괄한다.
공개 및 비공개 출원, 특허 및 문헌을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 이들의 전문이 참고로 본 명세서에 포함되고, 본 명세서의 일부를 구성한다. 참고문헌으로 포함된 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 포함된 개시내용과 모순되는 경우, 본 명세서가 임의의 이러한 모순적 자료를 대체하고/하거나 우선하도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Illumina, Inc. <120> HYDROGEL BEADS FOR NUCLEOTIDE SEQUENCING <130> WO/2019/028166 <140> PCT/US2018/044855 <141> 2018-08-01 <150> US 62/539,956 <151> 2017-08-01 <160> 4 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P5 Sequence <400> 1 aatgatacgg cgaccaccga 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P7 Sequence <400> 2 caagcagaag acggcatacg a 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P5 Poly T Sequence <400> 3 tttttttttt aatgatacgg cgaccaccga 30 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P7 Poly T Sequence <400> 4 tttttttttt caagcagaag acggcatacg a 31

Claims (39)

  1. 핵산 반응을 수행하기 위한 비드로서,
    하이드로겔 중합체; 및
    상기 하이드로겔 내에 배치된 유전 물질(genetic material)을 포함하되, 상기 비드는 상기 유전 물질을 보유하면서 상기 비드를 통한 시약의 확산을 허용하는 공극(pore)을 포함하는, 핵산 반응을 수행하기 위한 비드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비드는 약 2㎛ 내지 약 120㎛의 직경을 갖는, 핵산 반응을 수행하기 위한 비드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하이드로겔 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-티올, PEG-아크릴레이트, 아크릴아마이드, N,N'-비스(아크릴로일)시스타민, PEG, 폴리프로필렌 옥사이드(PPO), 폴리아크릴산, 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(N-아이소프로필아크릴아마이드)(PNIPAAm), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(바이닐설폰산)(PVSA), 폴리(L-아스파트산), 폴리(L-글루탐산), 폴리라이신, 한천, 아가로스, 알지네이트, 헤파린, 알지네이트 설페이트, 덱스트란 설페이트, 하이알루로난, 펙틴, 카라기난, 젤라틴, 키토산, 셀룰로스, 콜라겐, 비스아크릴아마이드, 다이아크릴레이트, 다이알릴아민, 트라이알릴아민, 다이바이닐 설폰, 다이에틸렌글리콜 다이알릴 에터, 에틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 폴리메틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 트라이메틸로프로판(trimethylopropoane) 트라이메타크릴레이트, 에톡실화 트라이메틸올 트라이아크릴레이트, 또는 에톡실화 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트, 또는 이들의 조합물 또는 혼합물을 포함하는, 핵산 반응을 수행하기 위한 비드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 하이드로겔 중합체는 PEG-티올/PEG-아크릴레이트, 아크릴아마이드/N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BACy) 또는 PEG/PPO를 포함하는, 핵산 반응을 수행하기 위한 비드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 물질은 세포, 핵산 또는 마이크로바이옴(microbiome)인, 핵산 반응을 수행하기 위한 비드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포 또는 박테리아 세포인, 핵산 반응을 수행하기 위한 비드.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 세포는 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포, 에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) 세포 또는 섬유아세포(fibroblast cell)인, 핵산 반응을 수행하기 위한 비드.
  8. 제5항에 있어서, 상기 핵산은 300개 또는 그 초과의 염기쌍의 DNA 또는 RNA인, 핵산 반응을 수행하기 위한 비드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시약은 효소, 화학물질 및 50개 미만의 염기쌍의 크기를 갖는 프라이머를 포함하는, 핵산 반응을 수행하기 위한 비드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시약은 라이소자임, 프로테이나제 K, 무작위 육량체(random hexamer), 중합효소(Φ29 DNA 중합효소, Taq 중합효소, Bsu 중합효소), 트랜스포사제(transposase)(Tn5), 프라이머(P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매화 효소, 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 완충제 또는 2가 양이온을 포함하는, 핵산 반응을 수행하기 위한 비드.
  11. 하이드로겔 비드 내에 유전 물질을 캡슐화하는 방법으로서,
    유전 물질을 용액 중에서 하이드로겔 중합체와 혼합하는 단계;
    상기 용액을 비혼화성 유체와 혼합하여 상기 유전 물질을 캡슐화한 하이드로겔 비드(hydrogel bead encapsulating a genetic material)를 형성하는 단계로서, 상기 하이드로겔 비드는 상기 유전 물질을 보유하면서 상기 하이드로겔 비드를 통한 시약의 확산을 허용하는 공극을 포함하는, 상기 하이드로겔 비드를 형성하는 단계를 포함하는, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 하이드로겔 비드는 약 2㎛ 내지 약 120㎛의 직경을 갖는, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 하이드로겔 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-티올, PEG-아크릴레이트, 아크릴아마이드, N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BACy), PEG, 폴리프로필렌 옥사이드(PPO), 폴리아크릴산, 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(N-아이소프로필아크릴아마이드)(PNIPAAm), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(바이닐설폰산)(PVSA), 폴리(L-아스파트산), 폴리(L-글루탐산), 폴리라이신, 한천, 아가로스, 알지네이트, 헤파린, 알지네이트 설페이트, 덱스트란 설페이트, 하이알루로난, 펙틴, 카라기난, 젤라틴, 키토산, 셀룰로스, 콜라겐, 비스아크릴아마이드, 다이아크릴레이트, 다이알릴아민, 트라이알릴아민, 다이바이닐 설폰, 다이에틸렌글리콜 다이알릴 에터, 에틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 폴리메틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 트라이메틸로프로판 트라이메타크릴레이트, 에톡실화 트라이메틸올 트라이아크릴레이트, 또는 에톡실화 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트, 또는 이들의 조합물 또는 혼합물을 포함하는, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 하이드로겔 중합체는 PEG-티올/PEG-아크릴레이트, 아크릴아마이드/N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BACy) 또는 PEG/PPO를 포함하는, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 물질은 세포, 핵산 또는 마이크로바이옴인, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포 또는 박테리아 세포인, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 세포는 에쉐리키아 콜라이 세포, 바실러스 서브틸리스 세포, 에로모나스 하이드로필라 세포 또는 섬유아세포인, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 핵산은 300개 또는 그 초과의 염기쌍의 DNA 또는 RNA인, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시약은 효소, 화학물질 및 50개 미만의 염기쌍의 크기를 갖는 프라이머를 포함하는, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시약은 라이소자임, 프로테이나제 K, 무작위 육량체, 중합효소(Φ29 DNA 중합효소, Taq 중합효소, Bsu 중합효소), 트랜스포사제(Tn5), 프라이머(P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매화 효소, 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 완충제 또는 2가 양이온을 포함하는, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  21. 하이드로겔 비드 내에 유전 물질을 캡슐화하는 방법으로서,
    하이드로겔 중합체 및 유전 물질을 포함하는 수성 용액을 비혼화성 유체와 혼합하는 단계;
    상기 수성 용액을 액적 발생기(droplet generator)에 투입하는 단계; 및
    상기 유전 물질을 캡슐화한 하이드로겔 비드를 생성시키는 단계로서, 상기 하이드로겔 비드는 상기 유전 물질을 보유하면서 상기 하이드로겔 비드를 통한 시약의 확산을 허용하는 공극을 포함하는, 상기 하이드로겔 비드를 생성시키는 단계를 포함하는, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 하이드로겔 비드는 약 2㎛ 내지 약 150㎛의 직경을 갖는, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 하이드로겔 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-티올/PEG-아크릴레이트, 아크릴아마이드/N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BACy), PEG/폴리프로필렌 옥사이드(PPO), 폴리아크릴산, 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(PHEMA), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(N-아이소프로필아크릴아마이드)(PNIPAAm), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(바이닐설폰산)(PVSA), 폴리(L-아스파트산), 폴리(L-글루탐산), 폴리라이신, 한천, 아가로스, 알지네이트, 헤파린, 알지네이트 설페이트, 덱스트란 설페이트, 하이알루로난, 펙틴, 카라기난, 젤라틴, 키토산, 셀룰로스, 콜라겐, 비스아크릴아마이드, 다이아크릴레이트, 다이알릴아민, 트라이알릴아민, 다이바이닐 설폰, 다이에틸렌글리콜 다이알릴 에터, 에틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 폴리메틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 다이아크릴레이트, 트라이메틸로프로판 트라이메타크릴레이트, 에톡실화 트라이메틸올 트라이아크릴레이트 또는 에톡실화 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트, 또는 이들의 조합물 또는 혼합물을 포함하는, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 하이드로겔 중합체는 PEG-티올/PEG-아크릴레이트, 아크릴아마이드/N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BACy) 또는 PEG/PPO를 포함하는, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 물질은 세포, 핵산 또는 마이크로바이옴인, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포 또는 박테리아 세포인, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 세포는 에쉐리키아 콜라이 세포, 바실러스 서브틸리스 세포, 에로모나스 하이드로필라 세포 또는 섬유아세포인, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 핵산은 300개 또는 그 초과의 염기쌍의 DNA 또는 RNA인, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시약은 효소, 화학물질 및 50개 미만의 염기쌍의 크기를 갖는 프라이머를 포함하는, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  30. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시약은 라이소자임, 프로테이나제 K, 무작위 육량체, 중합효소(Φ29 DNA 중합효소, Taq 중합효소, Bsu 중합효소), 트랜스포사제(Tn5), 프라이머(P5 및 P7 어댑터 서열), 리가제, 촉매화 효소, 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 완충제 또는 2가 양이온을 포함하는, 유전 물질을 캡슐화하는 방법.
  31. 비드 내에 캡슐화된 유전 물질로부터 핵산 라이브러리(nucleic acid library)를 제조하는 방법으로서,
    제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비드를 획득하는 단계;
    상기 비드 내에 캡슐화된 유전 물질을 증폭시키는 단계;
    상기 비드 내에 캡슐화된 상기 유전 물질에 대해서 태그먼테이션(tagmentation) 반응을 수행하는 단계; 및
    상기 유전 물질을 서열분석(sequencing)함으로써, 상기 비드 내에 캡슐화된 핵산 라이브러리를 생성시키는 단계를 포함하는, 핵산 라이브러리를 제조하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 유전 물질은 세포이고, 상기 세포를 용해시키고 핵산을 추출하는 단계를 더 포함하는, 핵산 라이브러리를 제조하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 세포는 핵산을 추출하기 위해서 라이소자임으로 용해되고, 프로테이나제 K로 처리되는, 핵산 라이브러리를 제조하는 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 태그먼테이션 반응은 유전 물질을, 어댑터 서열 및 트랜스포좀을 포함하는 트랜스포사제 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 핵산 라이브러리를 제조하는 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 라이브러리를 고체 지지체 상에 시딩(seeding)하는 단계를 더 포함하는, 핵산 라이브러리를 제조하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 시딩하는 단계는 상기 비드를 분해(degrading)시켜 상기 비드로부터 상기 핵산 라이브러리를 방출시키는 것을 포함하는, 핵산 라이브러리를 제조하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 비드는 상기 비드를 분열 믹스(cleavage mix)와 접촉시키거나 또는 상기 비드를 약 90℃까지 가열시킴으로써 분해되어 상기 핵산 라이브러리를 방출시키는, 핵산 라이브러리를 제조하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 분열 믹스는 다이티오트레이톨(DTT), 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP) 또는 트리스(3-하이드록시프로필)포스핀(THP)을 포함하는, 핵산 라이브러리를 제조하는 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 플로우 셀 디바이스(flow cell device)인, 핵산 라이브러리를 제조하는 방법.
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