CN116656780A - 一种单细胞全基因组测序建库方法 - Google Patents
一种单细胞全基因组测序建库方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种单细胞全基因组测序文库构建方法，包括如下步骤：1)将单细胞捕获于可渗透性微腔室内；2)扩增单细胞全基因组并切割成DNA片段，同时添加接头；3)DNA片段添加标签。本申请还公开了一种用于单细胞全基因组测序的方法，所述方法包括：i)根据上述的测序文库构建方法构建测序文库；ii)对步骤i)所提供的测序文库进行测序。本申请还公开了一种产品，所述产品包括适于进行上述的测序文库构建方法的酶、标签和微腔室制备原料。
Description
技术领域
本说明书涉及生物技术领域，特别涉及一种单细胞全基因组测序建库方法。
背景技术
微生物群落存在于各种不同的生态系统中，包括土壤、海洋等环境微生物以及人类肠道微生物等。其中，人类肠道微生物的组成和功能与人类的健康和疾病有着密切的关系，典型的人类肠道微生物群落由数百种微生物组成，而同一物种的不同菌株(strain)的基因组存在差异，导致它们在功能上也有所不同，使得它们对宿主的影响也明显不同。如果只在物种水平上研究微生物而不确定其菌株，会掩盖菌株间重要的差异，由于基因组异质性是微生物适应不断快速变化的环境的共同特征，因此单独的标准宏基因组和宏转录组分析并不总是很适合获取不同物种的基因组，对于丰度较低的微生物尤其如此，肠道微生物群落菌株水平的基因组图谱尚未完全阐明。
当前，解析微生物群落的物种构成主要依赖于扩增子测序和宏基因组测序，然而，扩增子测序存在扩增偏好、脱靶、分辨率低等问题，宏基因组测序对样本DNA质量要求高，且通常无法解析菌株水平的基因组，基于微孔板的单细胞测序虽然可以产生菌株水平的基因组，但是由于成本等限制导致这种方法只能获得有限数量的微生物菌株，因此很大程度上限制了对来自同一群落的单个细菌分辨率的基因组的分析，从而限制了对微生物组及其基因组的组成和结构的了解。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本申请的目的在于提供一种高通量测序文库的构建方法，用于解决现有技术中的问题。
本申请提供了一种单细胞全基因组测序文库构建方法，包括如下步骤：1)将单细胞捕获于可渗透性微腔室内；2)扩增单细胞全基因组并切割成DNA片段，同时添加接头；3)DNA片段添加标签。
本申请还提供了一种用于单细胞全基因组测序的方法，所述方法包括：i)根据上述的测序文库构建方法构建测序文库；ii)对步骤i)所提供的测序文库进行测序。
本申请还提供了一种产品，所述产品包括适于进行上述的测序文库构建方法的酶、标签和微腔室制备原料。
本说明书提出的实施例带来的有益效果包括但不限于：(1)可以在可渗透性的水凝胶微腔室内，实现单细胞的裂解(DNA/RNA提取)、全基因组扩增、片段化以及PCR或者连接反应，实现基因组DNA的组合索引化等建库步骤；(2)避免复杂的微流控技术，缩短实验周期，降低实验门槛，无需特殊仪器和专业技术人员即可在普通实验室完成。
附图说明
本申请将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，其中：
图1为根据本申请一些实施例所示的包含微生物单细胞的可渗透性微腔室图片；
图2为根据本申请一些实施例所示的可渗透性微腔室内基因组DNA提取扩增流程图；
图3为根据本申请一些实施例所示的可渗透性微腔室内全基因组扩增2h后荧光图；
图4为根据本申请一些实施例所示的可渗透性微腔室内实现三轮PCR反应后荧光图；
图5为根据本申请一些实施例所示的单细胞全基因组建库中使用的碱基序列条形码；
图6为根据本申请一些实施例所示的单细胞全基因组建库测序流程图；
图7为根据本申请一些实施例所示的Tn5转座酶工作原理图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。
如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
本说明书中使用了流程图用来说明根据本说明书的实施例的系统所执行的操作。应当理解的是，前面或后面操作不一定按照顺序来精确地执行。相反，可以按照倒序或同时处理各个步骤。同时，也可以将其他操作添加到这些过程中，或从这些过程移除某一步或数步操作。
解读DNA序列是掌握机体功能的关键,测序技术可以帮助人们认识机体的DNA序列从而识别基因组特征、辨别不同样本间的差异，表征样本基因型与表型之间的联系。自2005年第一个商业化高通量测序平台诞生以来，第二代测序技术(NGS)飞速发展，在测序速度、读长、通量方面都取得了巨大的进步，每碱基的测序成本也逐年下降。与测序平台相适配的针对于不同种类样本的测序文库制备技术也应运而生。
为了简化文库制备流程，节省时间成本以及劳动力，本申请提供一种单细胞全基因组测序文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将单细胞捕获于可渗透性微腔室内；2)扩增单细胞全基因组并切割成DNA片段，同时添加接头；3)DNA片段添加标签。
本申请中术语“片段”是指比衍生该片段的序列更短的任何核酸序列。在一些实施例中，所述DNA片段的长度可以大于500bp。
在一些实施例中，所述单细胞可以选自植物细胞、动物细胞或微生物细胞中任意一种。在一些实施例中，所述微生物细胞可以选自细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体或螺旋体中任意一种。在一些实施例中，所述细菌可以选自大肠杆菌。
在一些实施例中，所述微腔室可以为凝胶微球。在一些实施例中，所述微腔室可以为琼脂糖凝胶微球、聚丙烯酰胺(PAM)凝胶微球或甲基丙烯酰化明胶(GelMA)凝胶微球。
在一些实施例中，所述扩增单细胞全基因组前可以裂解单细胞。在一些实施例中，所述裂解的方法可以选自酶裂解法、碱裂解法或热休克法。在一些实施例中，所述裂解可以为原位裂解，例如直接在微腔室内裂解。
具体的，单细胞的裂解操作包括但不局限于以下方法：1)对于类似于PCR之类的反应，可以无需进行裂解步骤，PCR反应的变性温度即可使细胞裂解释放胞内DNA；2)酶裂解法，即利用特定酶进行相应的化学反应裂解细胞，释放胞内DNA；3)碱裂解法，即在特定碱性条件(pH＞7且pH≤14)下，配合适合温度，破裂细胞，释放胞内DNA；4)热休克法，即将细胞反复冻融，引起细胞的溶胀，致使细胞结构破碎，释放胞内DNA。
在一些实施例中，所述微腔室可以包括内层和外层，所述内层为Dextran-rich层，所述外层为PEGDA-rich层。微腔室的这种结构使得微腔室成为具有渗透性的微腔室，即大分子保留在微腔室内，小分子可以进出，使得在该微腔室内能够实现微生物单细胞裂解和DNA释放、扩增、片段化等，以及包括但不限于PCR或者连接方式的DNA索引化。本申请中裂解、PCR或DNA索引化所用试剂均为可以进入可渗透微腔室的试剂。在一些实施例中，所述微腔室可以允许小于120KD的分子进入。在一些实施例中，可以通过将酶失活使其保留在微腔室内。本领域技术人员知晓，PCR反应所用酶以及Tn5转座酶的分子量均小于120KD。
在一些实施例中，所述内层中Dextran的浓度可以为8～11％(w/v)。在一些实施例中，优选的，所述内层中Dextran的浓度可以为9.6％(w/v)。在一些实施例中，所述外层中PEGDA的浓度可以为9～13％(w/v)。在一些实施例中，优选的，所述外层中PEGDA的浓度可以为11％(w/v)。
在一些实施例中，所述微腔室的制备原料包括葡聚糖(MW 500K)和聚乙二醇二丙烯酸酯；优选的，所述聚乙二醇二丙烯酸酯选自聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 8K)。
在一些实施例中，所述葡聚糖(MW 500K)和聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 8K)的溶剂为聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 575)的1xDPBS溶液和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂水溶液的混合液。
在一些实施例中，所述溶剂中，聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 575)的1xDPBS溶液和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂水溶液的体积比可以为60～80:8～12。在一些实施例中，所述溶剂中，聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 575)的1xDPBS溶液和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂水溶液的体积比可以为65～75:9～11。在一些实施例中，优选的，所述溶剂中，聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 575)的1xDPBS溶液和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂水溶液的体积比可以为73:10。
在一些实施例中，所述聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 575)与1xDPBS的体积比可以为2～4:60～80(v/v)。在一些实施例中，优选的，所述聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 575)与1xDPBS的体积比可以为3：70(v/v)。
在一些实施例中，所述苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂在水溶液中的浓度可以为2％～6％(w/v)。在一些实施例中，所述苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂在水溶液中的浓度可以为3％～5％(w/v)。在一些实施例中，优选的，所述苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂在水溶液中的浓度为4％(w/v)。
在一些实施例中，所述微腔室的制备原料中，葡聚糖(MW 500K)4％～7％(w/v)、聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 8K)2％～5％(w/v)、聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 575)2％～5％(v/v)和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂0.05％～0.15％(w/v)；
在一些实施例中，所述微腔室的制备原料中，葡聚糖(MW 500K)5％～6％(w/v)、聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 8K)2.5％～4.5％(w/v)、聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 575)2.5％～4.5％(v/v)和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂0.08％～0.12％(w/v)；
在一些实施例中，优选的，所述微腔室的制备原料中，葡聚糖(MW 500K)5.5％(w/v)、聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 8K)3％(w/v)、聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 575)3％(v/v)和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂0.1％(w/v)。
在一些实施例中，所述扩增方法可以选自PCR、MDA、MALBAC或LIANTI。
具体的，单细胞全基因组扩增方法包括但不局限于以下扩增方法：1)PCR(Polymerase chain reaction)，利用聚合酶链反应进行单细胞的全基因组扩增；2)RCA(rolling circle amplification)，以一小段环状DNA单链为模板的滚还扩增；3)MALBAC(Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles)，对单细胞基因组进行多次退火环状循环扩增；MDA(Multiple displacement amplification)，利用随机引物和聚合酶(包括但不局限于phi29 DNA聚合酶)与DNA模板结合并进行全基因组扩增；5)LIANTI(Linear amplification via transposon insertion)，通过插入转座子对单细胞基因组进行线性扩增。
在一些实施例中，所述单细胞全基因组可以使用酶切法切割。在一些实施例中，优选的，所述单细胞全基因组可以使用dsDNA Fragmentase或转座酶切割。在一些实施例中，更优选的，所述单细胞全基因组可以使用Tn5转座酶切割。
Tn5转座酶由一个蛋白质和ME序列组成，它们结合在一起，形成一个活性转座复合物。该复合物具有特殊的立体结构和活性，使它能够打断靶DNA序列，并在片段化的DNA两端添加一段DNA序列。
在一些实施例中，所述接头可以为测序接头。在一些实施例中，优选的，所述接头序列可以为5’-TCGTCGGCAGCGTC-3’(SEQ ID NO.1)和/或5’-GTCTCGTGGGCTCGG-3’(SEQ IDNO.2)。在一些实施例中，所述测序接头可以为二代测序接头或三代测序接头。
在一些实施例中，所述标签可以选自荧光基团或碱基序列条形码。在一些实施例中，优选的，所述标签可以选自碱基序列条形码。在一些实施例中，更优选的，所述标签可以包括至少一条碱基序列条形码。在一些实施例中，进一步优选的，所述标签可以包括3条碱基序列条形码。在一些实施例中，所述碱基序列条形码可以通过PCR的方法与DNA片段结合。
本申请还提供一种用于单细胞全基因组测序的方法，所述方法包括：i)根据上述的测序文库构建方法构建测序文库；ii)对步骤i)所提供的测序文库进行测序。在一些实施例中，所述测序的方法可以为二代测序或三代测序。
本申请还提供一种产品，所述产品包括适于进行上述的测序文库构建方法的酶、标签和微腔室制备原料。在一些实施例中，所述产品可以为试剂盒、芯片或检测系统之一。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1
首先配置制备可渗透性微腔室所需溶液，向1.5ml离心管中加入700μl DPBS，0.055g Dextran,0.03g PEGDA(8K),30μl PEGDA(575),100μl 4％LAP(苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐),溶解混匀后，于常温离心：16000g，30min后出现相分离，分别吸取上层的PEGDA-rich，下层的Dextran-rich至两个新的1.5ml离心管。
将大肠杆菌(Escherichia coli)置于LB(Luria-Bertani)培养液中，恒温37℃培养，18h后收集1ml大肠杆菌菌液至1.5ml离心管，经5000rpm离心2min去除上清液，加入DPBS缓冲液清洗后再次离心去除上清液，以DPBS溶液回溶，取200μl溶液至96孔板中，用酶标仪测量600nm的吸光值，利用细菌浓度与吸光值的关系分别推算出大肠杆菌的数目(OD600＝0.93，对应菌量为9.3X108CFU/ml)，取1μl菌液至200μl Dextran-rich并混匀。定制微流控液滴生成芯片，将包含大肠杆菌的Dextran-rich和PEGDA-rich输入至芯片上相应通道中，利用高通量微液滴技术，生成包裹有单个大肠杆菌的微液滴，并将微液滴收集至1.5ml无菌离心管内，在波长为365-370nm的紫外光下照射2min，利用PFO将液滴破乳，0.1％tween-20清洗三次后收集包含微生物单细胞的可渗透性微腔室(如图1所示)。
将酶裂解反应试剂加入到包含微生物单细胞的可渗透性微腔室，37℃过夜反应后，离心去上清，将含蛋白酶K的裂解液加入其中，55℃反应1h，结束后用无水乙醇洗一次，0.1％tween-20洗3次，即完成微生物基因组DNA提取。
将MDA恒温扩增试剂加入包含微生物单细胞基因组DNA的可渗透性微腔室，30℃反应2h(图2-图3)，随后65℃，10min使Phi29 DNA聚合酶失活，0.1％tween-20清洗三次除去多余的试剂。将Tn5转座酶反应试剂加入包含微生物单细胞基因组DNA扩增产物的可渗透性微腔室，55℃反应30min，用0.1％tween-20洗3次去除未反应的Tn5转座酶，实现基因组DNA片段化并在两端标记测序接头(图7)。
对可渗透性微腔室内微生物单细胞基因组DNA片段化产物进行索引化，即在可渗透性微腔室内利用PCR反应，进行三轮的平均随机分配-混合(split-pool)，每轮连接或PCR反应中片段化的微生物单细胞的基因组DNA都会被添加一段条形码序列用作核酸标记，最终三轮平均随机分配-混合后共同形成的单一组合型条形码序列用于实现对微生物单细胞的基因组的索引化。
在对可渗透性微腔室内微生物单细胞基因组扩增产物进行索引化之前，需要首先设计出96*96*96种7nt的寡核苷酸链作为条形码标签库(如图5所示)，并将三组96种寡核苷酸序列合成于三组96孔板中，在第一轮核酸标记的过程中，含有打断后微生物单细胞基因组扩增产物的可渗透性微腔室被平均随机分配到96孔板中，96孔板中含有PCR反应所需的试剂。利用PCR反应，实现对微生物单细胞基因组的第一轮条形码序列添加，待反应结束后，将可渗透性微腔室从96孔板取出并混合，利用0.1％tween-20清洗3-5次，去除未通过连接或者未通过PCR加在基因组上的多余的寡核苷酸链以及反应过程中引入的酶或金属离子。在第一轮核酸标记后，清洗后的可渗透性微腔室再次被平均随机分配到96孔板中，进行PCR反应实现第二轮的条形码序列的添加，待反应结束后，可将渗透性微腔室从96孔板取出并混合，利用0.1％tween-20清洗3-5次，然后进行第三轮的核酸标记，重复上述平均随机分配、PCR反应、混合、清洗步骤后得到的可渗透性微腔室内的微生物全基因组DNA均带有单一的经过三轮自由组合形成的条形码标签。
选择一组barcode(ACGCCGA)验证PCR是否有效，设计一个FAM探针(CACACGTCTGACGCCGATCGTCGGCAGCGTC-FAM(SEQ ID NO.3))进行荧光原位杂交实验，用清洗buffer洗三次后在荧光共聚焦显微镜下拍照(图4)。
至此，可渗透性微腔室内中已经实现对微生物单细胞的裂解、全基因组扩增、扩增后基因组的片段化、基因组的索引化等一系列的测序文库构建步骤，最后将可渗透性微腔室合并至1.5ml离心管，用两倍体积的1M NaOH溶解，再用1M醋酸中和PH至中性，加入0.5X的VAHTS clean beads对索引化后的基因组DNA纯化，利用Bioanalyzer对上机前的文库片段分布进行质控。使用Nanopore ligation kit(SQK-LSK114)，根据供应商所提供的实验步骤给索引化基因组DNA加上三代测序所需接头，反应完成后，使用Nanopore MinIon平台进行三代测序(图6)。
上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。
同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20％的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
最后，应当理解的是，本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此，作为示例而非限制，本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地，本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。
Claims (10)
1.一种单细胞全基因组测序文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将单细胞捕获于可渗透性微腔室内；
2)扩增单细胞全基因组并切割成DNA片段，同时添加接头；
3)DNA片段添加标签。
2.如权利要求1所述的测序文库构建方法，其特征在于，所述步骤1)和步骤2)在所述可渗透性微腔室内进行；
和/或，所述扩增单细胞全基因组前裂解单细胞，所述裂解的方法选自酶裂解法、碱裂解法或热休克法。
3.如权利要求1所述的测序文库构建方法，其特征在于，所述微腔室为凝胶微球；
和/或，所述裂解为原位裂解；
和/或，所述扩增方法选自PCR、MDA、MALBAC或LIANTI；
和/或，所述单细胞全基因组切割的方法选自酶切法、超声处理、酸孵育或碱孵育中任意一种；优选的，所述单细胞全基因组切割的方法选自酶切法；更优选的，所述单细胞全基因组切割的方法选自dsDNA Fragmentase或转座酶；进一步优选的，所述单细胞全基因组切割的方法选自Tn5转座酶；
和/或，所述接头为测序接头；优选的，所述接头序列为5’-TCGTCGGCAGCGTC-3’(SEQIDNO.1)和/或5’-GTCTCGTGGGCTCGG-3’(SEQ ID NO.2)；
和/或，所述标签选自荧光基团或碱基序列条形码；优选的，所述标签选自碱基序列条形码；更优选的，所述标签包括至少一条碱基序列条形码；进一步优选的，所述标签包括3条碱基序列条形码。
4.如权利要求1所述的测序文库构建方法，其特征在于，所述微腔室包括内层和外层，所述内层为Dextran-rich层，所述外层为PEGDA-rich层；所述内层中Dextran的浓度为8～11％(w/v)；优选的，所述内层中Dextran的浓度为9.6％(w/v)；所述外层中PEGDA的浓度为9～13％(w/v)；优选的，所述外层中PEGDA的浓度为11％(w/v)。
5.如权利要求1所述的测序文库构建方法，其特征在于，所述微腔室的制备原料包括葡聚糖(MW 500K)和聚乙二醇二丙烯酸酯；优选的，所述聚乙二醇二丙烯酸酯选自聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 8K)。
6.如权利要求5所述的测序文库构建方法，其特征在于，所述葡聚糖(MW 500K)和聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 8K)的溶剂为聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 575)的1xDPBS溶液和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂水溶液的混合液。
7.如权利要求6所述的测序文库构建方法，其特征在于，
所述溶剂中，聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 575)的1xDPBS溶液和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂水溶液的体积比为60～80:8～12；优选的，所述溶剂中，聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 575)的1xDPBS溶液和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂水溶液的体积比为73:10；
和/或，所述聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 575)与1xDPBS的体积比为2～4:60～80(v/v)；优选的，所述聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 575)与1xDPBS的体积比为3：70(v/v)。
和/或，所述苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂在水溶液中的浓度为2％～6％(w/v)；优选的，所述苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂在水溶液中的浓度为4％(w/v)。
8.如权利要求1所述的测序文库构建方法，其特征在于，所述微腔室的制备原料中，葡聚糖(MW 500K)4％～7％(w/v)、聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 8K)2％～5％(w/v)、聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 575)2％～5％(v/v)和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂0.05％～0.15％(w/v)；
优选的，所述微腔室的制备原料中，葡聚糖(MW 500K)5.5％(w/v)、聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 8K)3％(w/v)、聚乙二醇二丙烯酸酯(MW 575)3％(v/v)和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂0.1％(w/v)。
9.一种用于单细胞全基因组测序的方法，所述方法包括：
i)根据权利要求1～8任一权利要求所述的测序文库构建方法构建测序文库；
ii)对步骤i)所提供的测序文库进行测序。
10.一种产品，所述产品包括适于进行权利要求1-8任一权利要求所述的测序文库构建方法的酶、标签和微腔室制备原料。
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