JP2019107035A - ポリヌクレオチドバーコード生成 - Google Patents

ポリヌクレオチドバーコード生成 Download PDF

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Abstract

【課題】本開示は、ポリヌクレオチドバーコードの生成のための方法、組成物、システム、及びキット並びにそのようなポリヌクレオチドバーコードの使用を提供する。そのようなポリヌクレオチドバーコードを、任意の好適な用途に使用することができる。【解決手段】本開示は、ポリヌクレオチドプロセッシングのための組成物、方法、システム、及び装置を提供する。そのようなポリヌクレオチドプロセッシングは、ポリヌクレオチド配列決定などの様々な用途に有用であり得る。いくつかの場合、本開示は、ポリヌクレオチドバーコードライブラリーの生成のため、及びそのようなポリヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドへの結合のための方法を提供する。【選択図】なし

Description

相互参照
本出願は、2013年2月8日に出願された米国仮特許出願第61/762,435号、2013年3月15日に出願された米国仮特許出願第61/800,223号、2013年6月27日に出願された米国仮特許出願第61/840,403号、及び2013年7月10日に出願された米国仮特許出願第61/844,804号の利益を主張し、前記出願はその全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
ポリヌクレオチドバーコードは、次世代配列決定技術などの多くの用途において有用である。そのようなバーコードは一般に、ユニークな識別子配列を含有し、十分な多様性及び規模で製造するには極端に高価であり得る。単一のポリヌクレオチドバーコードを合成する費用は、合成中の塩基あたりの費用とポリヌクレオチドの長さの関数である。したがって、それぞれ異なる配列を有する複数のバーコードを合成する費用は、塩基あたりの費用に、分子あたりの塩基数を掛け、複数のバーコード内の分子数を掛けたものに等しい。現在、DNA配列を合成するには、1塩基あたり約0.10$かかる。数万から数千万のバーコードのバーコードライブラリーについては、この費用は法外なものである。したがって、バーコードのライブラリーを生成する改善された方法が大いに必要とされている。
米国特許出願公開第2012/0211084号 米国特許出願公開第2012/0132288号
Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV)(Cold Spring Harbor Laboratory Press) Using Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press) Cells: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press) PCR Primer: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press) 「Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach」、1984、IRL Press London Zongら、Science、338(6114)、1622〜1626頁(2012) Merrimanら、Electrophoresis、33(23) 3397〜3417頁(2012) Branskyら、Lab on a Chip、2009、9、516〜520頁 Demirci及びMontesano、Lab on a Chip、2007、7、1139〜1145頁 Weizmannら、Nature Methods、2006、3(7):545〜550頁 Holtzeら、Lab on a Chip、2008、8(10):1632〜1639頁 Garsteckiら、Applied Physics Letters、2004、85(13):2649〜2651頁 Abateら(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、2010、107(45)、19163〜19166頁) Esser-Kahnら(2011) Macromolecules 44: 5539〜5553頁 Wangら(2009) ChemPhysChem 10:2405〜2409頁 Plunkettら、Biomacromolecules、2005、6:632〜637頁
本開示は、ポリヌクレオチドバーコードの生成のための方法、組成物、システム、及びキット並びにそのようなポリヌクレオチドバーコードの使用を提供する。そのようなポリヌクレオチドバーコードを、任意の好適な用途に使用することができる。
本開示の態様は、1つ又は複数のポリヌクレオチドを含むライブラリーであって、ポリヌクレオチドのそれぞれがバーコード配列を含み、ポリヌクレオチドが1つ又は複数のパーティション内に配置され、ライブラリーが少なくとも約1,000個の異なるバーコード配列を含む、ライブラリーを提供する。
いくつかの場合、バーコード配列は、少なくとも約5ヌクレオチド長である。また、バーコード配列は無作為ポリヌクレオチド配列であってもよい。
更に、パーティションは、平均で、約1個のポリヌクレオチド、約0.5個のポリヌクレオチド、又は約0.1個のポリヌクレオチドを含んでもよい。パーティションは、液滴、カプセル、ウェル又はビーズであってもよい。
更に、ライブラリーは、少なくとも約10,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約100,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約500,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約1,000,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約2,500,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約5,000,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約10,000,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約25,000,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約50,000,000個の異なるバーコード配列、又は少なくとも約100,000,000個の異なるバーコード配列を含んでもよい。
いくつかの場合、パーティションは、同じポリヌクレオチドの複数のコピーを含んでもよい。
更に、それぞれのポリヌクレオチドは、固定化配列、配列決定プライマーのためのアニーリング配列、及び標的ポリヌクレオチドとのライゲーションのために適合する配列からなる群から選択される配列を含んでもよい。
いくつかの場合、それぞれのポリヌクレオチドは、MALBACプライマーである。
本開示の別の態様は、バーコード配列を含むポリヌクレオチドのライブラリーを合成する方法であって、a)バーコード配列を含む複数のポリヌクレオチドを合成する工程;b)ポリヌクレオチドを複数のパーティションに分離することによって、区分化されたポリヌクレオチドを生成する工程;c)区分化されたポリヌクレオチドを増幅することによって、増幅されたポリヌクレオチドを生成する工程;及びd)増幅されたポリヌクレオチドを含むパーティションを単離する工程を含む方法を提供する。いくつかの場合、合成する工程は、カップリング反応にアデニン、チミン、グアニン、及びシトシンの混合物を含有させる工程を含む。
更に、分離は、限界希釈を実施することによって、希釈されたポリヌクレオチドを生成する工程を含んでもよい。いくつかの場合、分離は、前記希釈されたポリヌクレオチドを区分化する工程を更に含む。
更に、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応、非対称性ポリメラーゼ連鎖反応、エマルジョンPCR(ePCR)、ビーズの使用を含むePCR、ヒドロゲルの使用を含むePCR、複数のアニーリング及びルーピングに基づく増幅サイクル(MALBAC)、単一プライマー等温増幅、並びにその組合せからなる群から選択される方法により実施することができる。いくつかの場合、増幅は、RNAプライマーを用いて実施され、増幅されたポリヌクレオチドをRNAase Hに曝露する工程を含んでもよい。
いくつかの場合、バーコード配列を含む前記ポリヌクレオチドの各々は、MALBACプライマーである。
いくつかの場合、単離を、フロー支援選別により実施することができる。
また、バーコード配列を含むポリヌクレオチド及び増幅されたポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドから、ヘアピン構造を形成させることができる。いくつかの場合、方法は、ヘアピン構造を非アニーリング領域内で切断する工程を更に含んでもよい。
更に、バーコード配列を含む前記ポリヌクレオチド、前記区分化されたポリヌクレオチド、及び前記増幅されたポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドは、ビーズに結合していてもよい。
前記方法は、増幅されたポリヌクレオチドを部分相補配列とアニーリングさせる工程を更に含んでもよい。部分相補配列は、バーコード配列を含んでもよい。
前記方法は、増幅されたポリヌクレオチドの少なくとも1つを標的配列に結合させる工程を更に含んでもよい。標的配列は断片化されてもよい。いくつかの場合、標的配列は、機械的剪断及び酵素による処理からなる群から選択される方法によって断片化される。機械的剪断は、超音波により誘導することができる。いくつかの場合、酵素は、制限酵素、フラグメンターゼ、及びトランスポザーゼからなる群から選択される。更に、結合は、ライゲーション及び増幅からなる群から選択される方法により実施することができる。
いくつかの場合、増幅は、MALBACプライマーを用いて実施され、それによってMALBAC増幅産物を生成するMALBAC増幅である。いくつかの場合、MALBACプライマーは、増幅されたポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、MALBACプライマーは、前記増幅されたポリヌクレオチドではないポリヌクレオチドを含む。そのような場合、前記方法は、MALBAC増幅産物を増幅されたポリヌクレオチドに結合させる工程を更に含んでもよい。
更に、それぞれのパーティションは、平均で、バーコード配列を含む約1個のポリヌクレオチド、バーコード配列を含む0.5個のポリヌクレオチド、又はバーコード配列を含む0.1個のポリヌクレオチドを含んでもよい。更に、パーティションは、液滴、カプセル、及びウェルからなる群から選択されてもよい。
いくつかの場合、ライブラリーは、少なくとも約1,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約10,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約100,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約500,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約1,000,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約2,500,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約5,000,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約10,000,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約25,000,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約50,000,000個の異なるバーコード配列、又は少なくとも約100,000,000個の異なるバーコード配列を含んでもよい。
いくつかの場合、パーティションは、バーコード配列を含む同じポリヌクレオチドの複数のコピーを含む。
更に、バーコード配列を含むポリヌクレオチドは、固定化配列、配列決定プライマーのためのアニーリング配列、及び標的ポリヌクレオチドとのライゲーションに適合する配列からなる群から選択される配列を含んでもよい。
本開示の更なる態様は、少なくとも約1,000個のビーズを含むライブラリーであって、少なくとも約1,000個のビーズの各ビーズが異なるバーコード配列を含む、ライブラリーを提供する。いくつかの場合、異なるバーコード配列は、固定化配列及び/又は配列決定プライマーのためのアニーリング配列を含むポリヌクレオチド中に含まれていてもよい。いくつかの場合、異なるバーコード配列は、少なくとも約5ヌクレオチド長又は少なくとも約10ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの場合、異なるバーコード配列は、無作為ポリヌクレオチド配列であっても、又は組合せによって生成されてもよい。
更に、1,000個のビーズの各々は、複数のコピーの異なるバーコード配列を含んでもよい。例えば、1,000個のビーズの各々は、少なくとも約100,000コピー、少なくとも約1,000,000コピー、又は少なくとも約10,000,000コピーの異なるバーコード配列を含んでもよい。いくつかの場合、ライブラリーは、同じバーコード配列を含む2個以上のビーズを更に含んでもよい。いくつかの場合、1,000個のビーズの少なくとも2個のビーズは、同じバーコード配列を含んでもよい。更に、少なくとも約1,000個のビーズは、少なくとも約10,000個のビーズ、又は少なくとも約100,000個のビーズを含む。
また、ライブラリーは、少なくとも約1,000個、少なくとも約10,000個、少なくとも約100,000個、少なくとも約1,000,000個、少なくとも約2,500,000個、少なくとも約5,000,000個、少なくとも約10,000,000個、少なくとも約25,000,000個、少なくとも約50,000,000個、又は少なくとも約100,000,000個の異なるバーコード配列を含んでもよい。
いくつかの場合、少なくとも約1,000個のビーズを、複数のパーティションにわたって分配することができる。いくつかの場合、パーティションは乳濁液の液滴であってもよい。いくつかの場合、1,000個のビーズの各ビーズは、異なるパーティション中に含まれていてもよい。いくつかの場合、異なるパーティションは、乳濁液の液滴であってもよい。いくつかの場合、1,000個のビーズの2つ以上のビーズは、異なるパーティション中に含まれていてもよい。いくつかの場合、異なるパーティションは、乳濁液の液滴であってもよい。いくつかの場合、1,000個のビーズはヒドロゲルビーズであってもよい。
本開示の更なる態様は、種の区分化における、オリゴヌクレオチドの区分化における、パーティションからの種の刺激原選択的放出における、パーティション中での反応(例えば、ライゲーション及び増幅反応)の実施における、核酸合成反応の実施における、核酸のバーコード化における、配列決定のためのポリヌクレオチドの調製における、ポリヌクレオチドの配列決定における、突然変異検出における、神経障害診断における、糖尿病診断における、胎児異数性診断における、がん突然変異検出及び法医学における、疾患検出における、医学的診断における、低入力核酸適用における、循環腫瘍細胞(CTC)配列決定における、ポリヌクレオチド位相化における、少数の細胞からのポリヌクレオチドの配列決定における、遺伝子発現の分析における、細胞からのポリヌクレオチドの区分化における、又はその組合せにおける、本明細書に記載のライブラリー、組成物、方法、装置、又はキットの使用を提供する。
参照による組込み
本明細書に記載の全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個々に示されたのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の方法、組成物、システム、及び装置の新規特徴は、特に、添付の特許請求の範囲の詳細と共に説明される。本開示の特徴及び利点のより良好な理解は、本開示の方法、組成物、システム、及び装置の原理が用いられる例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明、並びに添付の図面に対する参照により得られる。
例示的なフォーク型アダプターを概略的に示す図である。 例示的なバーコード領域の配置を概略的に示す図である。 標的ポリヌクレオチドの反対の末端にライゲートされた2つのフォーク型アダプターの例示的配列を示す図である。 実施例1に記載のフォーク型アダプターを生成するために用いられる方法の例を概略的に示す図である。 実施例2に記載のカプセル内カプセルの例を概略的に示す図である。 実施例3に記載のカプセル内カプセルの例を概略的に示す図である。 実施例4に記載の方法に従って生成することができる生成物(又は中間体)の例を概略的に示す図である。 実施例4に記載の配列の例を示す図である。 実施例4に記載の配列の例を示す図である。 実施例4に記載の配列の例を示す図である。 実施例5に記載の配列の例を示す図である。 実施例5に記載の配列の例を示す図である。 実施例5に記載の配列の例を示す図である。 実施例5に記載の配列の例を示す図である。 実施例5に記載の配列の例を示す図である。 実施例5に記載の配列の例を示す図である。 実施例5に記載の配列の例を示す図である。 実施例5に記載の配列の例を示す図である。 実施例5に記載の配列の例を示す図である。 実施例5に記載の配列の例を示す図である。 実施例6に記載の配列の例を示す図である。 実施例6に記載の配列の例を示す図である。 実施例6に記載の配列の例を示す図である。 実施例6に記載の配列の例を示す図である。 実施例6に記載の配列の例を示す図である。 実施例7に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 実施例7に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 実施例7に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 実施例7に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 例示的なフローフォーカシング(flow-focusing)法によるカプセルの生産を概略的に示す図である。 例示的なフローフォーカシング法によるカプセル内カプセルの生産を概略的に示す図である。 実施例8に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 実施例8に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 実施例8に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 実施例8に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 実施例8に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 実施例9に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 実施例9に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 実施例9に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 実施例9に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 実施例9に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 実施例10に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 実施例11に記載のカプセル内カプセルを概略的に示す図である。 実施例12に記載のカプセル内カプセルを概略的に示す図である。 実施例13に記載の配列の例を示す図である。 実施例13に記載の配列の例を示す図である。 実施例13に記載の配列の例を示す図である。 実施例13に記載の配列の例を示す図である。 実施例13に記載の配列の例を示す図である。 実施例13に記載の方法及び構造の例を示す図である。 実施例14に記載のカプセル内カプセルを概略的に示す図である。 実施例15に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 実施例15に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 実施例15に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。 実施例16に記載のカプセル内カプセルを概略的に示す図である。 実施例17に記載のカプセル内カプセルを概略的に示す図である。
本発明の様々な実施形態をここで示し、説明したが、そのような実施形態はほんの一例として提供されるに過ぎないことが当業者には明らかである。当業者であれば、本発明から逸脱することなくいくつかの変動、変化、及び置換を行うことができる。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替物を用いることができることが理解されるべきである。
本開示は、ポリヌクレオチドバーコードの生成及びそのようなポリヌクレオチドバーコードの使用のための方法、組成物、システム、及びキットを提供する。そのようなポリヌクレオチドバーコードを、任意の好適な用途に使用することができる。いくつかの場合、本開示で提供されるポリヌクレオチドバーコードを、次世代配列決定反応において用いることができる。次世代配列決定反応は、全ゲノムの配列決定、単一ヌクレオチド多型(SNP)及び他の突然変異などの特定の配列の検出、核酸(例えば、デオキシリボ核酸)挿入の検出、並びに核酸欠失の検出を含む。
本明細書に記載の方法、組成物、システム、及びキットの使用は、別途指摘しない限り、有機化学、ポリマー技術、マイクロフルイディクス、分子生物学、組換え技術、細胞生物学、生化学、及び免疫学の任意の従来技術を含んでもよい。そのような従来技術は、ウェル及びマイクロウェルの構築、カプセル生成、乳濁液の生成、スポッティング、マイクロ流体装置構築、ポリマー化学、制限消化、ライゲーション、クローニング、ポリヌクレオチド配列決定、及びポリヌクレオチド配列アセンブリを含む。好適な技術の特異的な非限定例は、本開示を通じて記載される。しかしながら、等価な手順を用いることもできる。ある特定の技術の説明を、Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV)、Using Antibodies: A Laboratory Manual、Cells: A Laboratory Manual、PCR Primer: A Laboratory Manual、及びMolecular Cloning: A Laboratory Manual (全てCold Spring Harbor Laboratory Pressから)、並びに「Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach」、1984、IRL Press Londonなどの標準的な実験室マニュアルに見出すことができ、これらは全てその全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
I.定義
本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定を意図するものではない。
本明細書で用いられる場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、本文が別途明確に指摘しない限り、複数形も同様に含むことが意図される。更に、用語「含む(including)」、「含む(includes)」、「有する(having)」、「有する(has)」、「有する(with)」、「など(such as)」又はその変形が明細書及び/又は特許請求の範囲のいずれかで用いられる程度で、そのような用語は限定的ではなく、用語「含む(comprising)」と類似する様式で包括的であることが意図される。
本明細書で用いられる用語「約」とは一般に、特定の使用の文脈内の記述された数値よりも15%高いか、又は低い範囲を指す。例えば、「約10」は8.5〜11.5の範囲を含む。
本明細書で用いられる用語「バーコード」とは一般に、分析物に関する情報を伝達するために分析物に結合させることができる標識を指す。例えば、バーコードは、特定のパーティション内に含まれる標的ポリヌクレオチドの断片に結合したポリヌクレオチド配列であってもよい。次いで、このバーコードを、標的ポリヌクレオチドの断片を用いて配列決定することができる。複数の配列上の同じバーコードの存在は、配列の起源に関する情報を提供することができる。例えば、バーコードは、配列が特定のパーティション及び/又はゲノムの近位領域に由来したことを示してもよい。これは、いくつかのパーティションが配列決定の前にプールされる場合の配列アセンブリに特に有用であり得る。
本明細書で用いられる用語「bp」は一般に、「塩基対」の省略形を指す。
本明細書で用いられる用語「マイクロウェル」は一般に、1mL未満の容量を有するウェルを指す。用途に応じて、マイクロウェルを様々な容量で作製することができる。例えば、マイクロウェルを、本明細書に記載の任意のパーティション容量を収容するのに適切なサイズで作製することができる。
本明細書で用いられる用語「パーティション」は、動詞又は名詞であってもよい。動詞として用いられる場合(例えば、「区分化する」又は「区分化」)、この用語は一般に、1つの画分(又は細分)を別の画分から隔離するために用いることができる容器間での種又は試料(例えば、ポリヌクレオチド)の分画化(例えば、細分化)を指す。そのような容器は、名詞「パーティション」を用いて言及される。区分化を、例えば、マイクロフルイディクス、希釈、分注などを用いて実施することができる。パーティションは、例えば、ウェル、マイクロウェル、穴、液滴(例えば、乳濁液中の液滴)、乳濁液の連続相、試験管、スポット、カプセル、ビーズ、希釈溶液中のビーズ表面、又は試料の1つの画分を別の画分から隔離するための任意の他の好適な容器であってもよい。また、パーティションは、別のパーティションを含んでもよい。
本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は一般に、複数のヌクレオチドを含む分子を指す。例示的なポリヌクレオチドとしては、デオキシリボ核酸、リボ核酸、及びペプチド核酸などのその合成類似体が挙げられる。
本明細書で用いられる用語「種」は一般に、本開示の方法、組成物、システム、装置、及びキットと共に用いることができる任意の物質を指す。種の例としては、試薬、分析物、細胞、染色体、タグ付分子又は分子群、バーコード、及びこれらの種のいずれかを含む任意の試料が挙げられる。本開示の他の場所でより完全に考察される通り、任意の好適な種を用いることができる。
II.ポリヌクレオチドバーコード化
ある特定の用途、例えば、ポリヌクレオチド配列決定は、配列の起源を同定するため、例えば、配列決定された断片からより大きい配列を集合させるためのユニークな識別子(「バーコード」)に依拠してもよい。したがって、配列決定の前にポリヌクレオチド断片にバーコードを付加することが望ましいことがある。バーコードは、ポリヌクレオチドバーコードなどの、様々な異なる形式のものであってもよい。特定の用途に応じて、バーコードを可逆的又は不可逆的な様式でポリヌクレオチド断片に結合させることができる。更に、バーコードは、配列決定中に個々のポリヌクレオチド断片の同定及び/又は定量化を可能にしてもよい。
1つ又は複数のバーコードが特定のパーティション中に導入されるように、バーコードをパーティション中に充填することができる。いくつかの場合、各パーティションは、異なるセットのバーコードを含有してもよい。これは、バーコードをパーティション中に直接分注することにより、又は別のパーティション内に含有されるパーティション内にバーコードを入れることにより達成することができる。
バーコードを、バーコード化しようとする種(例えば、ポリヌクレオチド断片、ポリヌクレオチドの鎖、細胞など)あたりのバーコードの期待又は予測される比でパーティション中に充填することができる。いくつかの場合、バーコードは、種あたり約0.0001、0.001、0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、500、1000、5000、10000、又は200000個のバーコードが充填されるように、パーティション中に充填される。いくつかの場合、バーコードは、種あたり約0.0001、0.001、0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、500、1000、5000、10000、又は200000個を超えるバーコードが充填されるように、パーティション中に充填される。いくつかの場合、バーコードは、種あたり約0.0001、0.001、0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、500、1000、5000、10000、又は200000個未満のバーコードが充填されるように、パーティション中に充填される。
ポリヌクレオチド断片あたり1個を超えるバーコードが存在する場合、そのようなバーコードは同じバーコードのコピーであるか、又は異なるバーコードであってもよい。例えば、複数の同一のバーコードを単一のポリヌクレオチド断片に結合させるか、又は複数の異なるバーコードをポリヌクレオチド断片に結合させるように、結合プロセスを設計することができる。
本明細書に提供される方法は、ポリヌクレオチド断片へのバーコードの結合にとって必要な試薬をパーティションに充填する工程を含んでもよい。ライゲーション反応の場合、制限酵素、リガーゼ酵素、バッファー、アダプター、バーコードなどを含む試薬を、パーティション中に充填することができる。増幅によりバーコード化する場合、プライマー、DNAポリメラーゼ、dNTP、バッファー、バーコードなどを含む試薬をパーティション中に充填することができる。トランスポゾン媒介性バーコード化(例えば、NEXTERA)の場合、トランスポゾーム(すなわち、トランスポザーゼとトランスポゾンの末端複合体)、バッファーなどを含む試薬をパーティション中に充填することができる。MALBAC媒介性バーコード化の場合、MALBACプライマー、バッファーなどを含む試薬をパーティション中に充填することができる。本開示を通して記載されるように、これらの試薬をパーティション中に直接充填するか、又は別のパーティションを介して充填してもよい。
バーコードを、付着末端又は平滑末端を用いてポリヌクレオチド断片にライゲートすることができる。また、バーコード化されたポリヌクレオチド断片を、バーコードを含むプライマーを用いてポリヌクレオチド断片を増幅することにより生成することもできる。いくつかの場合、ポリヌクレオチド断片のMALBAC増幅を用いて、バーコード化されたポリヌクレオチド断片を生成することができる。MALBACのために用いられるプライマーは、バーコードを含んでも、又は含まなくてもよい。MALBACプライマーがバーコードを含まない場合、例えば、PCRなどの他の増幅方法により、バーコードをMALBAC増幅産物に付加することができる。また、バーコード化されたポリヌクレオチド断片を、トランスポゾン媒介性方法を用いて生成することもできる。本開示において考察される任意の他の種と同様、アッセイ又はプロセスの必要に応じて、これらのモジュールを同じか、又は異なるパーティション内に含有させることができる。
いくつかの場合、バーコードを、モジュラー形式で集合するように設計されたより小さい成分から組合せ的に集合させることができる。例えば、3つのモジュール、1A、1B及び1Cを組合せ的に集合させて、バーコード1ABCを生産することができる。そのような組合せアセンブリは、複数のバーコードを合成する費用を有意に低下させることができる。例えば、3Aモジュール、3Bモジュール、及び3Cモジュールからなる組合せシステムは、わずか9つのモジュールから3*3*3=27の可能なバーコード配列を生成することができる。
いくつかの場合、本開示の他の場所に更に記載されるように、2つのオリゴヌクレオチドを混合し、それらをハイブリダイズさせてアニーリングした、又は部分的にアニーリングしたオリゴヌクレオチド(例えば、フォーク型アダプター)を生産することにより、バーコードを組合せ的に集合させることができる。これらのバーコードは、バーコード化されるポリヌクレオチド断片とのライゲーションを容易にするために、1つ又は複数のヌクレオチドの突出部を含んでもよい。いくつかの場合、アンチセンス鎖の5'末端をリン酸化して、二本鎖ライゲーションを確保することができる。この手法を用いて、異なるモジュールを、例えば、オリゴヌクレオチドAとB、AとC、AとD、BとC、BとDなどを混合することにより集合させることができる。本開示の他の場所により詳細に記載されるように、アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、ヘアピンループを有する単一の分子として合成し、バーコード化しようとするポリヌクレオチドへのライゲーション後に切断することができる。
本開示の他の場所により詳細に記載されるように、互いへのポリヌクレオチドの結合は、ハイブリダイゼーション適合性突出部に依拠してもよい。例えば、断片間のライゲーション適合性を確保するために、AとTとのハイブリダイゼーションが用いられることが多い。いくつかの場合、Taqポリメラーゼなどの酵素を用いる処理により、突出部を作出することができる。いくつかの場合、制限酵素を用いて、例えば、A又はTであってもよい単一塩基の3'突出部を有する切断産物を作出することができる。単一塩基の3'突出部を脱離させる制限酵素の例としては、MnII、HphI、Hpy188I、HpyAV、HpyCH4III、MboII、BciVI、BmrI、AhdI、及びXcmIが挙げられる。他の場合、制限酵素により異なる突出部(例えば、5'突出部、単一塩基より大きい突出部)を生成することができる。突出部を生成するために用いることができる更なる制限酵素としては、BfuCl、TaqαI、BbVI、Bccl、BceAl、BcoDI、BsmAI、及びBsmFIが挙げられる。
III.区分化されたバーコードライブラリーの生成
いくつかの場合、本開示は、区分化されたバーコードライブラリーの生成のための方法及びそのような方法に従って生産されたライブラリーを提供する。いくつかの場合、本明細書に提供される方法は、パーティション内に含まれるバーコードのライブラリーを提供するために、DNA配列の無作為合成、パーティションへの分離、分離された配列の増幅、及び増幅された分離された配列の単離を組み合わせる。
a.ポリヌクレオチドバーコードの無作為合成
いくつかの場合、本明細書に記載の方法は、DNA合成の無作為方法などの、ポリヌクレオチド合成の無作為方法を用いる。無作為DNA合成中に、カップリング工程におけるそれぞれの塩基型が産物のサブセットにカップリングされるように、A、C、G及び/又はTの任意の組合せをカップリング工程に添加することができる。A、C、G及びTが等しい濃度で存在する場合、産物の約1/4が各塩基を含む。連続カップリング工程、及びカップリング反応の無作為性により、4n(ここで、nはポリヌクレオチド中の塩基数である)個の可能な配列の生成が可能となる。例えば、長さ6の無作為ポリヌクレオチドのライブラリーは、46=4,096のメンバーの多様性を有するが、長さ10のライブラリーは1,048,576のメンバーの多様性を有する。したがって、非常に大きく複雑なライブラリーを生成することができる。これらの無作為配列は、バーコードとして役立ち得る。
また、任意の好適な合成塩基を、本発明と共に用いてもよい。いくつかの場合、各カップリング工程に含まれる塩基を、好ましい産物を合成するために変化させることができる。例えば、各カップリング工程中に存在する塩基数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上であってもよい。いくつかの場合、各カップリング工程中に存在する塩基数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、、10以上であってもよい。いくつかの場合、各カップリング工程中に存在する塩基数は、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10未満であってもよい。
また、個々の塩基の濃度を、好ましい産物を合成するために変化させてもよい。例えば、任意の塩基が、別の塩基の濃度の約0.1、0.5、1、5又は10倍の濃度で存在してもよい。いくつかの場合、任意の塩基が別の塩基の濃度の少なくとも約0.1、0.5、1、5、又は10倍の濃度で存在してもよい。いくつかの場合、任意の塩基が別の塩基の濃度の約0.1、0.5、1、5、又は10倍未満の濃度で存在してもよい。
無作為ポリヌクレオチド配列の長さは、用途に応じて、任意の好適な長さであってもよい。いくつかの場合、無作為ポリヌクレオチド配列の長さは、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20以上のヌクレオチドであってもよい。いくつかの場合、無作為ポリヌクレオチド配列の長さは、少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20以上のヌクレオチドであってもよい。いくつかの場合、無作為ポリヌクレオチド配列の長さは、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20未満のヌクレオチドであってもよい。
いくつかの場合、ライブラリーは、メンバー数によって定義される。いくつかの場合、ライブラリーは、約256、1024、4096、16384、65536、262144、1048576、4194304、16777216、67108864、268435456、1073741824、4294967296、17179869184、68719476736、2.74878*1011、又は1.09951*1012のメンバーを含んでもよい。いくつかの場合、ライブラリーは、少なくとも約256、1024、4096、16384、65536、262144、1048576、4194304、16777216、67108864、268435456、1073741824、4294967296、17179869184、68719476736、2.74878*1011、又は1.09951*1012のメンバーを含んでもよい。いくつかの場合、ライブラリーは、約256、1024、4096、16384、65536、262144、1048576、4194304、16777216、67108864、268435456、1073741824、4294967296、17179869184、68719476736、2.74878*1011、又は1.09951*1012未満のメンバーを含んでもよい。いくつかの場合、ライブラリーはバーコードライブラリーである。いくつかの場合、バーコードライブラリーは少なくとも約1000、10000、100000、1000000、2500000、5000000、10000000、25000000、50000000、又は100000000の異なるバーコード配列を含んでもよい。
無作為バーコードライブラリーはまた、他のポリヌクレオチド配列を含んでもよい。いくつかの場合、これらの他のポリヌクレオチド配列は、天然で非無作為であり、例えば、プライマー結合部位、フォーク型アダプターの生成のためのアニーリング部位、固定化配列、及び標的ポリヌクレオチド配列とのアニーリングを可能にし、したがってポリヌクレオチド配列のバーコード化を可能にする領域を含む。
b.パーティション中へのポリヌクレオチドの分離
無作為バーコード配列を含むポリヌクレオチドの合成の後、ポリヌクレオチドを別々のコンパートメントに区分化して、バーコード配列を含む区分化されたポリヌクレオチドのライブラリーを生成する。任意の好適な分離方法及び任意の好適なパーティション又はパーティション内パーティションを用いることができる。
いくつかの場合、区分化は、特定の容量の希釈液が、平均で1未満のポリヌクレオチドを含有するように、無作為バーコード配列を含むポリヌクレオチドの混合物を希釈することによって実施される。次いで、特定の容量の希釈液を、パーティションに移すことができる。したがって、任意の複数のパーティション中に、各パーティションは1又は0個のポリヌクレオチド分子を有する可能性がある。
いくつかの場合、各パーティションが約0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2個以上の分子を含むように、希釈を実施することができる。いくつかの場合、各パーティションが少なくとも約0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2個以上の分子を含むように、希釈を実施することができる。いくつかの場合、各パーティションが約0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、又は2個未満の分子を含むように、希釈を実施することができる。
いくつかの場合、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%のパーティションは、特定数の分子を含む。いくつかの場合、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%のパーティションは、特定数の分子を含む。いくつかの場合、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%未満のパーティションは、特定数の分子を含む。
いくつかの場合、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%のパーティションは、1以下のポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%のパーティションは、1以下のポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%未満のパーティションは、1以下のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの場合、パーティションは、ウェル、マイクロウェル、穴、液滴(例えば、乳濁液中の液滴)、乳濁液の連続相、試験管、スポット、カプセル、ビーズの表面、又は試料の1つの画分を別の画分から隔離するための任意の他の好適な容器である。パーティションがビーズを含む場合、増幅のためのプライマーをビーズに結合させることができる。パーティションは、本開示の他の場所により詳細に記載される。
c.区分化されたポリヌクレオチドの増幅
次いで、上記のように区分化されたポリヌクレオチドを増幅して、標的ポリヌクレオチド配列のバーコード化のための十分な材料を生成する。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、ヘリカーゼ依存的増幅、直線後指数的PCR(LATE-PCR)、非対称性増幅、デジタルPCR、縮重オリゴヌクレオチドプライマーPCR(DOP-PCR)、プライマー伸長増幅前PCR(PEP-PCR)、ライゲーション媒介性PCR、ローリングサークル増幅、多置換増幅(MDA)、及び単一プライマー等温増幅(SPIA)、エマルジョンPCR(ePCR)、ビーズの使用を含むePCR、ヒドロゲルの使用を含むePCR、複数のアニーリング及びルーピングに基づく増幅サイクル(MALBAC)、並びにその組合せなどの、任意の好適な増幅方法を用いることができる。MALBAC法は、例えば、Zongら、Science、338(6114)、1622〜1626頁(2012)(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
いくつかの場合、例えば、一本鎖産物を生成する増幅方法(例えば、非対称性増幅、SPIA、及びLATE-PCR)が好ましいことがある。いくつかの場合、二本鎖産物を生成する増幅方法(例えば、標準的なPCR)が好ましいことがある。いくつかの場合、増幅方法は、区分化されたポリヌクレオチドを指数的に増幅する。いくつかの場合、増幅方法は、区分化されたポリヌクレオチドを直線的に増幅する。いくつかの場合、増幅方法は、最初は指数的に、次いで直線的にポリヌクレオチドを増幅する。更に、単一の型の増幅を用いてポリヌクレオチドを増幅するか、又は異なる型の増幅の連続的工程を用いて増幅を完了させることができる。例えば、ePCRを更なる周回のePCRと組み合わせるか、又は異なる型の増幅と組み合わせることができる。
増幅は、バーコードを含む好適な量のポリヌクレオチドが産生されるまで実施される。いくつかの場合、増幅を、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60サイクル以上実施することができる。いくつかの場合、増幅を、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60サイクル以上実施することができる。いくつかの場合、増幅を、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、又は60サイクル未満実施することができる。
いくつかの場合、増幅を、ある特定の量のポリヌクレオチド生成物が各パーティション中に生産されるまで実施することができる。いくつかの場合、増幅は、ポリヌクレオチド産物の量が約10,000,000,000; 5,000,000,000; 1,000,000,000; 500,000,000; 100,000,000; 50,000,000; 10,000,000; 5,000,000; 1,000,000; 500,000; 400,000; 300,000; 200,000; 又は100,000分子となるまで実施される。いくつかの場合、増幅は、ポリヌクレオチド産物の量が少なくとも約100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 1,000,000; 5,000,000; 10,000,000; 50,000,000; 100,000,000; 500,000,000; 1,000,000,000; 5,000,000,000; 又は10,000,000,000分子となるまで実施される。いくつかの場合、増幅は、ポリヌクレオチド産物の量が約10,000,000,000; 5,000,000,000; 1,000,000,000; 500,000,000; 100,000,000; 50,000,000; 10,000,000; 5,000,000; 1,000,000; 500,000; 400,000; 300,000; 200,000; 又は100,000分子未満となるまで実施される。
d.増幅された配列を含むパーティションの単離
上記のように、いくつかの場合、バーコードを含むポリヌクレオチドは、各パーティションが平均で1未満のポリヌクレオチド配列を含有するように区分化される。したがって、いくつかの場合、パーティションの画分は、ポリヌクレオチドを含有せず、したがって、増幅されたポリヌクレオチドを含有することができない。したがって、ポリヌクレオチドを含まないパーティションからポリヌクレオチドを含むパーティションを分離することが望ましいことがある。
ある場合、ポリヌクレオチドを含むパーティションを同定することができるフローに基づく選別法を用いて、ポリヌクレオチドを含むパーティションを、ポリヌクレオチドを含まないパーティションから分離する。いくつかの場合、ポリヌクレオチドの存在の指標を用いて、ポリヌクレオチドを含まないものからポリヌクレオチドを含むパーティションを区別することができる。
いくつかの場合、核酸染色を用いて、ポリヌクレオチドを含むパーティションを同定することができる。例示的な染色としては、挿入染料、副溝結合剤、主溝結合剤、外部結合剤、及びビス挿入剤が挙げられる。そのような染料の特定例としては、SYBRグリーン、SYBRブルー、DAPI、ヨウ化プロピジウム、SYBRゴールド、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオルクマリン、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンD、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシン、フェナントリジン類及びアクリジン類、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化ヘキシジウム、ジヒドロエチジウム、エチジウムホモダイマー-1及び-2、エチジウムモノアジド、ACMA、インドール類、イミダゾール類(例えば、Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580及びDAPI)、アクリジンオレンジ(これも挿入することができる)、7-AAD、アクチノマイシンD、LDS751、ヒドロキシスチルバミジン、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、POPO-1、POPO-3、YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、JOJO-1、LOLO-1、BOBO-1、BOBO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-1、BO-PRO-3、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、JO-PRO-1、LO-PRO-1、YO-PRO-1、YO-PRO-3、PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR Gold、SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR DX、SYTO-40、-41、-42、-43、-44、-45 (青)、SYTO-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25 (グリーン)、SYTO-81、-80、-82、-83、-84、-85 (オレンジ)、SYTO-64、-17、-59、-61、-62、-60、及び-63 (赤)が挙げられる。
いくつかの場合、粒子の磁気分離又は沈降などの単離方法を用いることができる。そのような方法は、例えば、増幅しようとするポリヌクレオチド、増幅しようとする前記ポリヌクレオチドに対応するプライマー、及び/又は増幅のポリヌクレオチド産物を、ビーズに結合させる工程を含んでもよい。いくつかの場合、増幅しようとするポリヌクレオチド、増幅しようとする前記ポリヌクレオチドに対応するプライマー、及び/又はポリヌクレオチド生成物のビーズへの結合は、例えば、PCアミノC6などの光不安定リンカーを介するものであってもよい。光不安定リンカーを用いる場合、光を用いて、連結されたポリヌクレオチドをビーズから遊離させることができる。ビーズは、例えば、磁気ビーズ又はラテックスビーズであってもよい。次いで、ビーズは、例えば、磁気選別又は沈降による分離を可能にすることができる。ラテックス粒子の沈降を、例えば、グリセロールなどの、ラテックスよりも密度の高い液体中での遠心分離によって実施することができる。いくつかの場合、密度勾配遠心分離を用いることができる。
ビーズは、均一なサイズ又は不均一なサイズのものであってもよい。いくつかの場合、ビーズの直径は、約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mmであってもよい。ビーズは、少なくとも約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mmの直径を有してもよい。いくつかの場合、ビーズは、約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mm未満の直径を有してもよい。いくつかの場合、ビーズは、約0.001μm〜1 mm、0.01μm〜900μm、0.1μm〜600μm、100μm〜200μm、100μm〜300μm、100μm〜400μm、100μm〜500μm、100μm〜600μm、20μm〜50μm、150μm〜200μm、150μm〜300μm、又は150μm〜400μmの直径を有してもよい。
いくつかの場合、ポリヌクレオチドを含むパーティションと、ポリヌクレオチドを含まないパーティションとの示差的電荷を用いて、例えば、パーティション上での電気泳動又は誘電泳動を実施することにより、ポリヌクレオチドを含むパーティションを単離することができる。
いくつかの場合、浸透圧の差異に基づく、パーティションの選択的膨張又は縮小を用いて、ポリヌクレオチドを含む粒子を同定することができる。いくつかの例においては、ポリヌクレオチドを含むパーティションを、フロー分画、溶媒抽出、示差的融解(例えば、核酸プローブを用いる)、又は凍結により単離することができる。
ポリヌクレオチドを含むパーティションの単離は、1回のバルク合成費用のみを負担しながら、有意な多様性を有する区分化されたポリヌクレオチドバーコードのライブラリーを提供する。
IV.バーコードを含むアダプターの生成
本開示に記載のバーコードは、様々な構造を有してもよい。いくつかの場合、本開示のバーコードは、アダプターの一部である。一般に、「アダプター」は、バーコードの標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にするために用いられる構造である。アダプターは、例えば、バーコード、標的ポリヌクレオチドとのライゲーションに適合するポリヌクレオチド配列、並びにプライマー結合部位及び固定化領域などの機能的配列を含んでもよい。
いくつかの場合、アダプターは、フォーク型アダプターである。フォーク型アダプターの例を、図1に概略的に図示する。図1を参照すると、2コピーのフォーク型アダプター構造106は、標的ポリヌクレオチド105の反対側に記載される。それぞれのフォーク型アダプターは、第1の固定化領域101、第2の固定化領域102、第1の配列決定プライマー領域103、第2の配列決定プライマー領域104及び互いにアニーリングする一対の部分相補領域(103及び104内)を含む。配列決定プライマー領域又は固定化領域のいずれかを用いて、バーコード化されたポリヌクレオチドを、例えば、ビーズの表面上に固定することができる。配列決定プライマー領域を、例えば、配列決定プライマーのためのアニーリング部位として用いることができる。いくつかの場合、突出部を、標的配列との互換性を可能にするように設計することができる。図1において、一対のアニーリングしたポリヌクレオチド103及び104は、3'-T突出部を有し、これは標的ポリヌクレオチド105上の3'-A突出部と適合する。バーコードを、フォーク型アダプターの任意の好適な部分に含有させることができる。バーコードを含むフォーク型アダプターの標的配列105への結合後、配列決定プライマー領域103及び104を用いて、標的ポリヌクレオチドを配列決定することができる。フォーク型アダプター構造の別の例としては、New England Biolabs(商標)社から入手可能なIllumina(商標)ライブラリー調製物及びIllumina用NEBNext(登録商標)Multiplex Oligos中で用いられるものが挙げられる。非フォーク型アダプターの例としては、Merrimanら、Electrophoresis、33(23) 3397〜3417頁(2012)(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に開示されたものが挙げられる。
図2は、図1に記載のフォーク型アダプター内のバーコード領域の配置の3つの概略的な図例を示す。一例において、バーコード205(BC1)は、第1の固定化領域201内又は第1の固定化領域201と第1の配列決定プライマー領域203との間に位置する。別の例においては、バーコード206(BC2)は、第1の配列決定プライマー領域203の内部に、又はそれに隣接して位置する。更に別の例においては、バーコード207(BC3)は、第2の固定化領域202内又は第2の固定化領域202と第2の配列決定プライマー領域204との間に位置する。図2は標的配列の両末端上のバーコードを記載するが、いくつかの用途にとっては標的配列あたりにただ1つのバーコードで十分であるため、これは必須ではない。しかしながら、本開示の他の場所に記載のように、標的配列あたり1つを超えるバーコードを用いることもできる。
図3は、標的ポリヌクレオチド(NNN)の反対の末端にライゲートされた2つのフォーク型アダプターの例示的配列(配列番号1及び配列番号22)を提供し、配列レベルでの各フォーク型アダプターのバーコード領域(太字、ヌクレオチド30〜37、71〜77、81〜87、及び122〜129)を示す。図3において、ヌクレオチド1〜29は第1のフォーク型アダプターの固定化領域を表し、ヌクレオチド38〜70は第1のフォーク型アダプターの配列決定プライマー領域を表し、ヌクレオチド78〜80(NNN)は任意の長さの標的ポリヌクレオチドを表し、ヌクレオチド88〜120は第2のフォーク型アダプターの配列決定プライマー領域を表し、ヌクレオチド129〜153は第2のフォーク型アダプターの固定化領域を表す。
V.パーティション
a.パーティションの一般的特徴
本開示を通して記載される通り、本開示のある特定の方法、組成物、システム、装置、及びキットは、ある特定の種の別々のパーティションへの細分化(区分化)を用いることができる。パーティションは、例えば、ウェル、マイクロウェル、穴、液滴(例えば、乳濁液中の液滴)、乳濁液の連続相、試験管、スポット、カプセル、ビーズの表面、又は試料若しくは種の1つの画分を隔離するための任意の他の好適な容器であってもよい。パーティションを用いて、更なるプロセッシングのための種を含有させることができる。例えば、種がポリヌクレオチド分析物である場合、更なるプロセッシングは、試薬である種を用いる切断、ライゲーション、及び/又はバーコード化を含んでもよい。任意数の装置、システム又は容器を用いて、パーティションを保持する、支持する、又は含有させることができる。いくつかの場合、マイクロウェルプレートを用いて、パーティションを保持する、支持する、又は含有させることができる。任意の好適なマイクロウェルプレート、例えば、96、384又は1536個のウェルを有するマイクロウェルプレートを用いることができる。
各パーティションはまた、任意の他の好適なパーティションを含有するか、又はその中に含有されていてもよい。例えば、ウェル、マイクロウェル、穴、ビーズの表面、又はチューブは、液滴(例えば、乳濁液中の液滴)、乳濁液中の連続相、スポット、カプセル、又は任意の他の好適なパーティションを含んでもよい。液滴は、カプセル、ビーズ、又は別の液滴を含んでもよい。カプセルは、液滴、ビーズ、又は別のカプセルを含んでもよい。これらの説明は単に例示的なものに過ぎず、あらゆる好適な組合せ及び複数性も想定される。例えば、任意の好適なパーティションは、複数の同じか、又は異なるパーティションを含んでもよい。一例においては、ウェル又はマイクロウェルは、複数の液滴及び複数のカプセルを含む。別の例においては、カプセルは、複数のカプセル及び複数の液滴を含む。あらゆる組合せのパーティションが想定される。Table 1(表1)は、互いに組み合わせることができるパーティションの非限定例を示す。
Figure 2019107035
本明細書に記載の任意のパーティションは、複数のパーティションを含んでもよい。例えば、パーティションは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、又は50000個のパーティションを含んでもよい。パーティションは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、又は50000個のパーティションを含んでもよい。いくつかの場合、パーティションは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、又は50000個未満のパーティションを含んでもよい。いくつかの場合、各パーティションは、2〜50、2〜20、2〜10、又は2〜5個のパーティションを含んでもよい。
パーティションは、任意の好適な種又は種の混合物を含んでもよい。例えば、いくつかの場合、パーティションは、試薬、分析物、試料、細胞、及びその組合せを含んでもよい。他のパーティションを含むパーティションは、同じパーティション中のある特定の種及び異なるパーティション中のある特定の種を含んでもよい。特定のプロセスの必要性に応じて、種を任意の好適なパーティション間で分配することができる。例えば、Table 1(表1)中の任意のパーティションは、少なくとも1つの第1の種を含有し、Table 1(表1)中の任意のパーティションは少なくとも1つの第2の種を含有してもよい。いくつかの場合、第1の種は試薬であってもよく、第2の種は分析物であってもよい。
いくつかの場合、種は、細胞から単離されたポリヌクレオチドである。例えば、いくつかの場合、ポリヌクレオチド(例えば、ゲノムDNA、RNAなど)は、任意の好適な方法(例えば、市販のキット)を用いて細胞から単離される。このポリヌクレオチドを定量することができる。次いで、定量されたポリヌクレオチドを、本明細書に記載のように複数のパーティションに区分化することができる。ポリヌクレオチドの区分化を、アッセイの定量化及び必要性に応じて、所定の包含量で実施することができる。いくつかの場合、パーティションの全部又は多く(例えば、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、若しくは95%)は、非重複断片の別々の混合物が複数のパーティションにわたって形成されるように、重複するポリヌクレオチドを含まない。次いで、区分化されたポリヌクレオチドを、当業界で公知の、又は本開示に記載の任意の好適な方法に従って処理することができる。例えば、区分化されたポリヌクレオチドを、断片化、増幅、バーコード化などすることができる。
種を、様々な方法を用いて区分化することができる。例えば、種を希釈し、複数のパーティションにわたって分注することができる。種を含む媒体の最終希釈を、パーティションの数が種の数を超えるように実施することができる。また、乳濁液若しくはカプセルを形成する前に、又は基質上に種をスポットする前に希釈液を用いることもできる。種の数とパーティションの数との比は、約0.1、0.5、1、2、4、8、10、20、50、100、又は1000であってもよい。種の数とパーティションの数との比は、少なくとも約0.1、0.5、1、2、4、8、10、20、50、100、又は1000であってもよい。種の数とパーティションの数との比は、約0.1、0.5、1、2、4、8、10、20、50、100、又は1000未満であってもよい。種の数とパーティションの数との比は、約0.1〜10、0.5〜10、1〜10、2〜10、10〜100、100〜1000以上の範囲であってもよい。
また、区分化を、圧電液滴生成(例えば、Branskyら、Lab on a Chip、2009、9、516〜520頁)又は表面音響波(例えば、Demirci及びMontesano、Lab on a Chip、2007、7、1139〜1145頁)を用いて実施することもできる。
用いられるパーティションの数は、用途に応じて変化してもよい。例えば、パーティションの数は、約5、10、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、5000、7500、or 10,000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100,000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1,000,000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000、20000000以上であってもよい。パーティションの数は、少なくとも約5、10、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、5000、7500、10,000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100,000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1,000,000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000、20000000以上であってもよい。パーティションの数は、約5、10、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、5000、7500、10,000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100,000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1,000,000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000、20000000未満であってもよい。パーティションの数は、約5〜10000000、5〜5000000、5〜1,000,000、10〜10,000、10〜5,000、10〜1,000、1,000〜6,000、1,000〜5,000、1,000〜4,000、1,000〜3,000、又は1,000〜2,000であってもよい。
区分化される異なるバーコード又はバーコードの異なるセットの数は、例えば、区分化しようとする特定のバーコード及び/又は用途に応じて変化してもよい。バーコードの異なるセットは、例えば、同一のバーコードが各セット間で異なる同一のバーコードのセットであってもよい。又は、バーコードの異なるセットは、例えば、各セットがその含まれるバーコードにおいて異なる、異なるバーコードのセットであってもよい。例えば、約1、5、10、50、100、1000、10000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、100000000以上の異なるバーコード又はバーコードの異なるセットを区分化することができる。いくつかの例においては、少なくとも約1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、100000000以上の異なるバーコード又はバーコードの異なるセットを区分化することができる。いくつかの例においては、約1、5、10、50、100、1000、10000、 20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、又は100000000未満の異なるバーコード又はバーコードの異なるセットを区分化することができる。いくつかの例においては、約1〜5、5〜10、10〜50、50〜100、100〜1000、1000〜10000、10000〜100000、100000〜1000000、10000〜1000000、10000〜10000000、又は10000〜100000000のバーコードを区分化することができる。
バーコードを、特定の密度で区分化することができる。例えば、バーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1、5、10、50、100、1000、10000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、又は100000000のバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり少なくとも約1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、100000000以上のバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1、5、10、50、100、1000、10000、 20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、又は100000000未満のバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1〜5、5〜10、10〜50、50〜100、100〜1000、1000〜10000、10000〜100000、100000〜1000000、10000〜1000000、10000〜10000000、又は10000〜100000000のバーコードを含有するように区分化することができる。
バーコードを、同一のバーコードが特定の密度で区分化されるように区分化することができる。例えば、同一のバーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1、5、10、50、100、1000、10000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、又は100000000の同一のバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり少なくとも約1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、100000000以上の同一のバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、又は100000000未満の同一のバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1〜5、5〜10、10〜50、50〜100、100〜1000、1000〜10000、10000〜100000、100000〜1000000、10000〜1000000、10000〜10000000、又は10000〜100000000の同一のバーコードを含有するように区分化することができる。
バーコードを、異なるバーコードが特定の密度で区分化されるように区分化することができる。例えば、異なるバーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1、5、10、50、100、1000、10000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、又は100000000の異なるバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり少なくとも約1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、100000000以上の異なるバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、又は100000000未満の異なるバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1〜5、5〜10、10〜50、50〜100、100〜1000、1000〜10000、10000〜100000、100000〜1000000、10000〜1000000、10000〜10000000、又は10000〜100000000の異なるバーコードを含有するように区分化することができる。
バーコードを区分化するために用いられるパーティションの数は、例えば、区分化しようとする異なるバーコードの用途及び/又は数に応じて変化してもよい。例えば、バーコードを区分化するために用いられるパーティションの数は、約5、10、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、5000、7500、又は10,000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100,000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1,000,000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000、20000000以上であってもよい。バーコードを区分化するために用いられるパーティションの数は、少なくとも約5、10、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、5000、7500、10,000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000、20000000以上であってもよい。バーコードを区分化するために用いられるパーティションの数は、約5、10、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、5000、7500、10,000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000、又は20000000未満であってもよい。バーコードを区分化するために用いられるパーティションの数は、約5〜10000000、5〜5000000、5〜1,000,000、10〜10,000、10〜5,000、10〜1,000、1,000〜6,000、1,000〜5,000、1,000〜4,000、1,000〜3,000、又は1,000〜2,000であってもよい。
上記のように、異なるバーコード又はバーコードの異なるセット(例えば、各セットは複数の同一のバーコード又は異なるバーコードを含む)を、各パーティションが異なるバーコード又は異なるバーコードセットを含むように区分化することができる。いくつかの場合、各パーティションは、同一のバーコードの異なるセットを含んでもよい。同一のバーコードの異なるセットを区分化する場合、パーティションあたりの同一のバーコードの数は変化してもよい。例えば、約100,000以上の異なるセットの同一のバーコードを、各パーティションが同一のバーコードの異なるセットを含むように、約100,000以上の異なるパーティションにわたって区分化することができる。各パーティション中、バーコードのセットあたりの同一のバーコードの数は、約1,000,000の同一のバーコードであってもよい。いくつかの場合、バーコードの異なるセットの数は、パーティションの数に等しいか、又は実質的に等しくてもよい。任意の好適な数の異なるバーコード又は異なるバーコードセット(本明細書の他の場所に記載の区分化される異なるバーコード又は異なるバーコードセットの数を含む)、パーティションあたりのバーコードの数(本明細書の他の場所に記載のパーティションあたりのバーコードの数を含む)、及びパーティションの数(本明細書の他の場所に記載のパーティションの数を含む)を組み合わせて、パーティションあたり多数のバーコードを含む区分化されたバーコードの多様なライブラリーを生成することができる。したがって、理解されるように、上記の異なる数のバーコードのいずれかを、パーティションあたり上記のバーコード密度のいずれかと共に、及びパーティションの上記の数のいずれかにおいて提供することができる。
パーティションの容量は、用途に応じて変化してもよい。例えば、本開示に記載の任意のパーティション[例えば、ウェル、スポット、液滴(例えば、乳濁液中)、及びカプセル]の容量は、約1000μl、900μl、800μl、700μl、600μl、500μl、400μl、300μl、200μl、100μl、50μl、25μl、10μl、5μl、1μl、900nL、800nL、700nL、600nL、500nL、400nL、300nL、200nL、100nL、50nL、25nL、10nL、5nL、2.5nL、1nL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、25pL、10pL、5pL、1pL、900fL、800fL、700fL、600fL、500fL、400fL、300fL、200fL、100fL、50fL、25fL、10fL、5fL、1fL、又は0.5fLであってもよい。パーティションの容量は、少なくとも約1000μl、900μl、800μl、700μl、600μl、500μl、400μl、300μl、200μl、100μl、50μl、25μl、10μl、5μl、1μl、900nL、800nL、700nL、600nL、500nL、400nL、300nL、200nL、100nL、50nL、25nL、10nL、5nL、5nL、2.5nL、1nL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、25pL、10pL、5pL、1pL、900fL、800fL、700fL、600fL、500fL、400fL、300fL、200fL、100fL、50fL、25fL、10fL、5fL、1fL、又は0.5fLであってもよい。パーティションの容量は、約1000μl、900μl、800μl、700μl、600μl、500μl、400μl、300μl、200μl、100μl、50μl、25μl、10μl、5μl、1μl、900nL、800nL、700nL、600nL、500nL、400nL、300nL、200nL、100nL、50nL、25nL、10nL、5nL、5nL、2.5nL、1nL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、25pL、10pL、5pL、1pL、900fL、800fL、700fL、600fL、500fL、400fL、300fL、200fL、100fL、50fL、25fL、10fL、5fL、1fL、又は0.5fL未満であってもよい。パーティションの容量は、約0.5fL〜5pL、10pL〜10nL、10nL〜10μl、10μl〜100μl、又は100μl〜1mLであってもよい。
異なるパーティション中の液体の容量における変動性が存在してもよい。より特には、異なるパーティションの容量は、パーティションのセットにわたって少なくとも(又は多くても)±1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、又は1000%変化してもよい。例えば、ウェル(又は他のパーティション)は、第2のウェル(又は他のパーティション)内の液体容量の多くても80%である液体の容量を含んでもよい。
また、特定の種を特定のパーティションに標的化することもできる。例えば、いくつかの場合、捕捉試薬(例えば、オリゴヌクレオチドプローブ)を、特定の種(例えば、ポリヌクレオチド)を捕捉するためにパーティション内に固定又は配置することができる。例えば、捕捉オリゴヌクレオチドをビーズの表面上に固定して、相補配列を有するオリゴヌクレオチドを含む種を捕捉することができる。
また、種を特定の密度で区分化することもできる。例えば、各パーティションがパーティションあたり約1、5、10、50、100、1000、10000、100000、又は1000000の種を含有するように、種を区分化することができる。各パーティションがパーティションあたり少なくとも約1、5、10、50、100、1000、10000、100000、1000000以上の種を含有するように、種を区分化することができる。各パーティションがパーティションあたり約1、5、10、50、100、1000、10000、100000、又は1000000未満の種を含有するように、種を区分化することができる。各パーティションがパーティションあたり約1〜5、5〜10、10〜50、50〜100、100〜1000、1000〜10000、10000〜100000、又は100000〜1000000の種を含有するように、種を区分化することができる。
少なくとも1つのパーティションがそのパーティション内でユニークである種を含むように、種を区分化することができる。これは、約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上のパーティションに当てはまってもよい。これは、少なくとも約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上のパーティションについて当てはまってもよい。これは、約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%未満のパーティションについて当てはまってもよい。
b.パーティションとしてのウェル
いくつかの場合、ウェルがパーティションとして用いられる。ウェルはマイクロウェルであってもよい。ウェルは、1つの種又は複数の種を含む媒体を含んでもよい。種は様々な構成でウェル内に含有されてもよい。一例では、種はウェル中に直接分注される。ウェル中に直接分注された種を、例えば、溶解性、融解性、又は透過性である層で覆ってもよい。この層は、例えば、油、ワックス、膜などであってもよい。ウェルに別の種を導入する前後に、層を溶解又は融解することができる。ウェルを、密封層を用いて、任意の時点で、例えば、任意の種の添加後に密封することができる。
一例では、試料プロセッシングのための試薬をウェル中に直接分注し、溶解性、融解性、又は透過性である層で覆う。プロセッシングしようとする分析物を含む試料を、層の上部に導入する。層を溶解若しくは融解させるか、又は分析物(若しくは試薬)は層を介して拡散する。ウェルを密封し、分析物のプロセッシングのための適切な条件下でインキュベートする。次いで、プロセッシングされた分析物を回収することができる。
いくつかの場合、ウェルは他のパーティションを含む。ウェルは、例えば、別のウェル、スポット、液滴(例えば、乳濁液中の液滴)、カプセル、ビーズなどの任意の好適なパーティションを含んでもよい。各パーティションは、単一のパーティション又は複数のパーティションとして存在してもよく、各パーティションは同じ種又は異なる種を含んでもよい。
一例では、ウェルは試料プロセッシングのための試薬を含むカプセルを含む。カプセルを、液体媒体を用いてウェル中に充填するか、又は液体培地を用いずに(例えば、本質的に乾燥させて)ウェル中に充填することができる。本開示の他の場所に記載のように、カプセルは、1つ若しくは複数のカプセル、又は他のパーティションを含有してもよい。プロセッシングしようとする分析物を含む試料を、ウェル中に導入することができる。ウェルを密封し、刺激を適用してカプセルの内容物のウェル中への放出を引き起こし、試薬と、プロセッシングしようとする分析物との接触をもたらすことができる。ウェルを、分析物のプロセッシングのための適切な条件下でインキュベートすることができる。次いで、プロセッシングされた分析物を回収することができる。この例は試薬がカプセル中にあり、分析物がウェル中にある実施形態を記載するものであるが、反対の構成、すなわち、試薬がウェル中にあり、分析物がカプセル中にあるのも可能である。
別の例では、ウェルは乳濁液を含み、乳濁液の液滴は試料プロセッシングのための試薬を含むカプセルを含む。プロセッシングしようとする分析物を含む試料は、乳濁液の液滴中に含まれる。ウェルを密封し、刺激を適用してカプセルの内容物の液滴中への放出を引き起こし、試薬と、プロセッシングしようとする分析物との接触をもたらす。ウェルを、分析物のプロセッシングのための適切な条件下でインキュベートする。次いで、プロセッシングされた分析物を回収することができる。この例は試薬がカプセル中にあり、分析物が液滴中にある実施形態を記載するものであるが、反対の構成、すなわち、試薬が液滴中にあり、分析物がカプセル中にあるのも可能である。
ウェルを、アレイ、例えば、マイクロウェルアレイとして配置することができる。個々のウェルの寸法及び基質のサイズに基づいて、ウェルアレイは様々なウェル密度を含んでもよい。いくつかの場合、ウェル密度は、10ウェル/cm2、50ウェル/cm2、100ウェル/cm2、500ウェル/cm2、1000ウェル/cm2、5000ウェル/cm2、10000ウェル/cm2、50000ウェル/cm2、又は100000ウェル/cm2であってもよい。いくつかの場合、ウェル密度は、少なくとも10ウェル/cm2、50ウェル/cm2、100ウェル/cm2、500ウェル/cm2、1000ウェル/cm2、5000ウェル/cm2、10000ウェル/cm2、50000ウェル/cm2、又は100000ウェル/cm2であってもよい。いくつかの場合、ウェル密度は、10ウェル/cm2、50ウェル/cm2、100ウェル/cm2、500ウェル/cm2、1000ウェル/cm2、5000ウェル/cm2、10000ウェル/cm2、50000ウェル/cm2、又は100000ウェル/cm2未満であってもよい。
c.パーティションとしてのスポット
いくつかの場合、スポットがパーティションとして用いられる。スポットを、例えば、表面上に物質を分注することにより作製することができる。種は、様々な構成でスポット中に含まれていてもよい。一例では、種は、スポットを形成するために用いられる媒体中に種を含有させることによってスポット中に直接分注される。スポット上に直接分注された種を、例えば、溶解性、融解性、又は透過性である層で覆うことができる。この層は、例えば、油、ワックス、膜などであってもよい。別の種をスポット上に導入する前後に層を溶解又は融解させることができる。スポットを任意の時点で、例えば、任意の種の添加後に、オーバーレイによって密封することができる。
一例では、試料プロセッシングのための試薬を、スポット、例えば、スライドガラス上に直接分注し、溶解性、融解性、又は透過性である層で覆う。プロセッシングしようとする分析物を含む試料を、層の上部に導入する。層を溶解若しくは融解させるか、又は分析物(若しくは試薬)は層を通して拡散する。スポットを密封し、分析物のプロセッシングのための適切な条件下でインキュベートする。次いで、プロセッシングされた分析物を回収することができる。
本開示の他の場所(例えば、Table 1(表1))に記載のように、スポットをウェル内に配置することもできる。いくつかの場合、各スポットの内容物が混ざらないように、複数のスポットをウェル内に配置することができる。そのような構成は、例えば、種が互いに接触しないようにすることが望ましい場合に有用であり得る。いくつかの場合、ウェルは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30以上のスポットを含んでもよい。いくつかの場合、ウェルは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30以上のスポットを含んでもよい。いくつかの場合、ウェルは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30未満のスポットを含んでもよい。いくつかの場合、ウェルは、2〜4、2〜6、2〜8、4〜6、4〜8、5〜10、又は4〜12のスポットを含んでもよい。ウェルに物質(例えば、分析物を含有する媒体)を添加する際に、スポット中の種が混ざってもよい。更に、異なる種(又は種の組合せ)を含有する別々のスポットの使用も、スポットをウェルの内部に入れるために用いられる装置の交差夾雑を防止するのに有用であり得る。
いくつかの場合、スポットは他のパーティションを含む。スポットは、例えば、別のスポット、液滴(例えば、乳濁液中の液滴)、カプセル、ビーズなどを含む任意の好適なパーティションを含んでもよい。各パーティションは、単一のパーティション又は複数のパーティションとして存在してもよく、各パーティションは同じ種又は異なる種を含んでもよい。
一例では、スポットは、試料プロセッシングのための試薬を含むカプセルを含む。本開示の他の場所に記載のように、カプセルは1つ若しくは複数のカプセル、又は他のパーティションを含有してもよい。プロセッシングしようとする分析物を含む試料を、スポットに導入する。スポットを密封し、刺激を適用して、カプセルの内容物のスポット中への放出を引き起こし、試薬と、プロセッシングしようとする分析物との接触をもたらす。スポットを、分析物のプロセッシングのための適切な条件下でインキュベートする。次いで、プロセッシングされた分析物を回収することができる。この例は試薬がカプセル中にあり、分析物がスポット中にある実施形態を記載するものであるが、反対の構成、すなわち、試薬がスポット中にあり、分析物がカプセル中にあるのも可能である。
別の例では、スポットは乳濁液を含み、乳濁液の液滴は試料プロセッシングのための試薬を含むカプセルを含む。プロセッシングしようとする分析物を含む試料は、乳濁液の液滴内に含まれる。スポットを密封し、刺激を適用して、カプセルの内容物の液滴への放出を引き起こし、試薬と、プロセッシングしようとする分析物との接触をもたらす。スポットを、分析物のプロセッシングのための適切な条件下でインキュベートする。次いで、プロセッシングされた分析物を回収することができる。この例は試薬がカプセル中にあり、分析物が液滴中にある実施形態を記載するものであるが、反対の構成、すなわち、試薬が液滴中にあり、分析物がカプセル中にあるのも可能である。
スポットは、均一なサイズ又は不均一なサイズのものであってもよい。いくつかの場合、スポットの直径は、約0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1mm、2mm、5mm、又は1cmであってもよい。スポットは、少なくとも約0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1mm、1mm、2mm、5mm、又は1cmの直径を有してもよい。いくつかの場合、スポットは、約0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1mm、1mm、2mm、5mm、又は1cm未満の直径を有してもよい。いくつかの場合、スポットは、約0.1μm〜1cm、100μm〜1mm、100μm〜500μm、100μm〜600μm、150μm〜300μm、又は150μm〜400μmの直径を有してもよい。
スポットは、アレイ、例えば、スポットアレイとして配置することができる。個々のスポットの寸法及び基質のサイズに基づいて、スポットアレイは様々なスポット密度を含んでもよい。いくつかの場合、スポット密度は、10スポット/cm2、50スポット/cm2、100スポット/cm2、500スポット/cm2、1000スポット/cm2、5000スポット/cm2、10000スポット/cm2、50000スポット/cm2、又は100000スポット/cm2であってもよい。いくつかの場合、スポット密度は、少なくとも10スポット/cm2、50スポット/cm2、100スポット/cm2、500スポット/cm2、1000スポット/cm2、5000スポット/cm2、10000スポット/cm2、50000スポット/cm2、又は100000スポット/cm2であってもよい。いくつかの場合、スポット密度は、10スポット/cm2、50スポット/cm2、100スポット/cm2、500スポット/cm2、1000スポット/cm2、5000スポット/cm2、10000スポット/cm2、50000スポット/cm2、又は100000スポット/cm2未満であってもよい。
d.パーティションとしての乳濁液
いくつかの場合、乳濁液中の液滴がパーティションとして用いられる。乳濁液を、例えば、当業界で公知の方法(例えば、Weizmannら、Nature Methods、2006、3(7):545〜550頁; Weitzら、米国特許出願公開第2012/0211084号を参照されたい)などの任意の好適な方法により調製することができる。いくつかの場合、フッ化炭素中水乳濁液を用いることができる。これらの乳濁液は、ポリエチレングリコール(PEG)とのオリゴマーパーフルオロポリエーテル(PFPE)などのフッ素系界面活性剤を含んでもよい(Holtzeら、Lab on a Chip、2008、8(10):1632〜1639頁)。いくつかの場合、単分散性乳濁液を、マイクロ流体フローフォーカシング装置中で形成させることができる(Garsteckiら、Applied Physics Letters、2004、85(13):2649〜2651頁)。
種を、例えば、液滴を形成する第1の相(例えば、油又は水)と第2の(連続)相(例えば、水又は油)とを含有する乳濁液中の液滴内に含有させることができる。乳濁液は、単一の乳濁液、例えば、油中水又は水中油乳濁液であってもよい。乳濁液は、二重乳濁液、例えば、水中油中水又は油中水中油乳濁液であってもよい。より高次数の乳濁液も可能である。乳濁液を、本開示に記載の任意の好適なパーティションなどの任意の好適な容器中に保持することができる。
いくつかの場合、乳濁液中の液滴は、他のパーティションを含む。乳濁液中の液滴は、例えば、別の液滴(例えば、乳濁液中の液滴)、カプセル、ビーズなどを含む任意の好適なパーティションを含んでもよい。各パーティションは単一のパーティション又は複数のパーティションとして存在してもよく、各パーティションは同じ種又は異なる種を含んでもよい。
一例においては、乳濁液中の液滴は、試料プロセッシングのための試薬を含むカプセルを含む。本開示の他の場所に記載のように、カプセルは、1つ若しくは複数のカプセル、又は他のパーティションを含有してもよい。プロセッシングしようとする分析物を含む試料を液滴内に含有させる。刺激を適用して、カプセルの内容物の液滴中への放出を引き起こし、試薬と、プロセッシングしようとする分析物との接触をもたらす。液滴を、分析物のプロセッシングのための適切な条件下でインキュベートする。次いで、プロセッシングされた分析物を回収することができる。この例は試薬がカプセル中にあり、分析物が液滴中にある実施形態を記載するものであるが、反対の構成、すなわち、試薬が液滴中にあり、分析物がカプセル中にあるのも可能である。
乳濁液中の液滴は、均一なサイズ又は不均一なサイズのものであってもよい。いくつかの場合、乳濁液中の液滴の直径は、約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mmであってもよい。液滴は、少なくとも約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mmの直径を有してもよい。いくつかの場合、液滴は、約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mm未満の直径を有してもよい。いくつかの場合、液滴は、約0.001μm〜1mm、0.01μm〜900μm、0.1μm〜600μm、100μm〜200μm、100μm〜300μm、100μm〜400μm、100μm〜500μm、100μm〜600μm、150μm〜200μm、150μm〜300μm、又は150μm〜400μmの直径を有してもよい。
乳濁液中の液滴はまた、特定の密度を有してもよい。いくつかの場合、液滴は水性液体(例えば、水)より低密度である;いくつかの場合、液滴は水性液体より高密度である。いくつかの場合、液滴は非水性液体(例えば、油)よりも低密度である;いくつかの場合、液滴は非水性液体よりも高密度である。液滴は、約0.05g/cm3、0.1g/cm3、0.2g/cm3、0.3g/cm3、0.4g/cm3、0.5g/cm3、0.6g/cm3、0.7g/cm3、0.8g/cm3、0.81g/cm3、0.82g/cm3、0.83g/cm3、0.84g/cm3、0.85g/cm3、0.86g/cm3、0.87g/cm3、0.88g/cm3、0.89g/cm3、0.90g/cm3、0.91g/cm3、0.92g/cm3、0.93g/cm3、0.94g/cm3、0.95g/cm3、0.96g/cm3、0.97g/cm3、0.98g/cm3、0.99g/cm3、1.00g/cm3、1.05g/cm3、1.1g/cm3、1.2g/cm3、1.3g/cm3、1.4g/cm3、1.5g/cm3、1.6g/cm3、1.7g/cm3、1.8g/cm3、1.9g/cm3、2.0g/cm3、2.1g/cm3、2.2g/cm3、2.3g/cm3、2.4g/cm3、又は2.5g/cm3の密度を有してもよい。液滴は、少なくとも約0.05g/cm3、0.1g/cm3、0.2g/cm3、0.3g/cm3、0.4g/ cm3、0.5g/cm3、0.6g/cm3、0.7g/cm3、0.8g/cm3、0.81g/cm3、0.82g/cm3、0.83g/cm3、0.84g/cm3、0.85g/cm3、0.86g/cm3、0.87g/cm3、0.88g/cm3、0.89g/cm3、0.90g/cm3、0.91g/cm3、0.92g/cm3、0.93g/cm3、0.94g/cm3、0.95g/cm3、0.96g/cm3、0.97g/cm3、0.98g/cm3、0.99g/cm3、1.00g/cm3、1.05g/cm3、1.1g/cm3、1.2g/cm3、1.3g/cm3、1.4g/cm3、1.5g/cm3、1.6g/cm3、1.7g/cm3、1.8g/cm3、1.9g/cm3、2.0g/cm3、2.1g/cm3、2.2g/cm3、2.3g/cm3、2.4g/cm3、又は2.5g/cm3の密度を有してもよい。他の場合、液滴の密度は、多くても約0.7g/cm3、0.8g/cm3、0.81g/cm3、0.82g/cm3、0.83g/cm3、0.84g/cm3、0.85g/cm3、0.86g/cm3、0.87g/cm3、0.88g/cm3、0.89g/cm3、0.90g/cm3、0.91g/cm3、0.92g/cm3、0.93g/cm3、0.94g/cm3、0.95g/cm3、0.96g/cm3、0.97g/cm3、0.98g/cm3、0.99g/cm3、1.00g/cm3、1.05g/cm3、1.1g/cm3、1.2g/cm3、1.3g/cm3、1.4g/cm3、1.5g/cm3、1.6g/cm3、1.7g/cm3、1.8g/cm3、1.9g/cm3、2.0g/cm3、2.1g/cm3、2.2g/cm3、2.3g/cm3、2.4g/cm3、又は2.5g/cm3であってもよい。そのような密度は、任意の特定の液体(例えば、水性、水、油など)中のカプセルの密度を反映してもよい。
e.パーティションとしてのカプセル
いくつかの場合、カプセルがパーティションとして用いられる。カプセルを、乳化重合(Weitzら、米国特許出願公開第2012/0211084号)、多電解質との層ごとの集合、液滴形成、内部相分離、及びフローフォーカシングなどの、当業界で公知の方法を含む任意の好適な方法によって調製することができる。任意の好適な種をカプセル内に含有させることができる。カプセルを、本開示に記載の任意の好適なパーティションなどの任意の好適な容器中に保持することができる。
いくつかの場合、カプセルは他のパーティションを含む。カプセルは、例えば、別のカプセル、乳濁液中の液滴、ビーズなどの任意の好適なパーティションを含んでもよい。各パーティションは単一のパーティション又は複数のパーティションとして存在してもよく、各パーティションは同じ種又は異なる種を含んでもよい。
一例では、外側カプセルは、内側カプセルを含む。内側カプセルは、試料プロセッシングのための試薬を含む。分析物は、内側カプセルと外側カプセルとの間の媒体中に封入される。刺激を適用して、内側カプセルの内容物の外側カプセル中への放出を引き起こし、試薬と、プロセッシングしようとする分析物との接触をもたらす。外側カプセルを、分析物のプロセッシングのための適切な条件下でインキュベートする。次いで、プロセッシングされた分析物を回収することができる。この例は試薬が内側カプセル中にあり、分析物が内側カプセルと外側カプセルとの間の媒体中にある実施形態を記載するが、反対の構成、すなわち、試薬が内側カプセルと外側カプセルとの間の媒体中にあり、分析物が内側カプセル中にあるのも可能である。
カプセルを予備形成し、注入により試薬を充填することができる。例えば、Abateら(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、2010、107(45)、19163〜19166頁)及びWeitzら(米国特許出願公開第2012/0132288号)に記載のピコインジェクション法を用いて、試薬を本明細書に記載のカプセルの内部に導入することができる。一般に、カプセル外殻の硬化の前に、例えば、カプセル外殻の形成前に、乳濁液の液滴などのカプセル前駆体の内部に種を注入することにより、ピコインジェクションを実施する。
カプセルは、均一なサイズ又は不均一なサイズのものであってもよい。いくつかの場合、カプセルの直径は、約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mmであってもよい。カプセルは、少なくとも約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mmの直径を有してもよい。いくつかの場合、カプセルは、約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mm未満の直径を有してもよい。いくつかの場合、カプセルは、約0.001μm〜1mm、0.01μm〜900μm、0.1μm〜600μm、100μm〜200μm、100μm〜300μm、100μm〜400μm、100μm〜500μm、100μm〜600μm、150μm〜200μm、150μm〜300μm、又は150μm〜400μmの直径を有してもよい。
カプセルはまた、特定の密度を有してもよい。いくつかの場合、カプセルは水性液体(例えば、水)よりも低密度である;いくつかの場合、カプセルは水性液体よりも高密度である。いくつかの場合、カプセルは非水性液体(例えば、油)よりも低密度である;いくつかの場合、カプセルは非水性液体よりも高密度である。カプセルは、約0.05g/cm3、0.1g/cm3、0.2g/cm3、0.3g/cm3、0.4g/ cm3、0.5g/cm3、0.6g/cm3、0.7g/cm3、0.8g/cm3、0.81g/cm3、0.82g/cm3、0.83g/cm3、0.84g/cm3、0.85g/cm3、0.86g/cm3、0.87g/cm3、0.88g/cm3、0.89g/cm3、0.90g/cm3、0.91g/cm3、0.92g/cm3、0.93g/cm3、0.94g/cm3、0.95g/cm3、0.96g/cm3、0.97g/cm3、0.98g/cm3、0.99g/cm3、1.00g/cm3、1.05g/cm3、1.1g/cm3、1.2g/cm3、1.3g/cm3、1.4g/cm3、1.5g/cm3、1.6g/cm3、1.7g/cm3、1.8g/cm3、1.9g/cm3、2.0g/cm3、2.1g/cm3、2.2g/cm3、2.3g/cm3、2.4g/cm3、又は2.5g/cm3の密度を有してもよい。カプセルは、少なくとも約0.05g/cm3、0.1g/cm3、0.2g/cm3、0.3g/cm3、0.4g/cm3、0.5g/cm3、0.6g/cm3、0.7g/cm3、0.8g/cm3、0.81g/cm3、0.82g/cm3、0.83g/cm3、0.84g/cm3、0.85g/cm3、0.86g/cm3、0.87g/cm3、0.88g/cm3、0.89g/cm3、0.90g/cm3、0.91g/cm3、0.92g/cm3、 0.93g/cm3、0.94g/cm3、0.95g/cm3、0.96g/cm3、0.97g/cm3、0.98g/cm3、0.99g/cm3、1.00g/cm3、1.05g/cm3、1.1g/cm3、1.2g/cm3、1.3g/cm3、1.4g/cm3、1.5g/cm3、1.6g/cm3、1.7g/cm3、1.8g/cm3、1.9g/cm3、2.0g/cm3、2.1g/cm3、2.2g/cm3、2.3g/cm3、2.4g/cm3、又は2.5g/cm3の密度を有してもよい。他の場合、カプセル密度は、多くても約0.7g/cm3、0.8g/cm3、0.81g/cm3、0.82g/cm3、0.83g/cm3、0.84g/cm3、0.85g/cm3、0.86g/cm3、0.87g/cm3、0.88g/cm3、0.89g/cm3、0.90g/cm3、0.91g/cm3、0.92g/cm3、 0.93g/cm3、0.94g/cm3、0.95g/cm3、0.96g/cm3、0.97g/cm3、0.98g/cm3、0.99g/cm3、1.00g/cm3、1.05g/cm3、1.1g/cm3、1.2g/cm3、1.3g/cm3、1.4g/cm3、1.5g/cm3、1.6g/cm3、1.7g/cm3、1.8g/cm3、1.9g/cm3、2.0g/cm3、2.1g/cm3、2.2g/cm3、2.3g/cm3、2.4g/cm3、又は2.5g/cm3であってもよい。そのような密度は、任意の特定の液体(例えば、水性、水、油など)中のカプセルの密度を反映してもよい。
1.フローフォーカシングによるカプセルの生産
いくつかの場合、カプセルを、フローフォーカシングにより生産することができる。フローフォーカシングは、第2の液体と混ざらない第1の液体を第2の液体中に流入させる方法である。図12を参照すると、モノマー、架橋剤、開始剤、及び水性界面活性剤を含む第1(例えば、水性)の液体1201を、界面活性剤及び促進剤を含む第2(例えば、油)の液体1202中に流入させる。マイクロ流体装置中のT連結部1203に第2の液体を進入させた後、第1の液体の液滴は第1の液体の流れから離脱し、第1の液体中のモノマー、架橋剤、及び開始剤と、第2の液体中の促進剤との混合のため、カプセル外殻が形成し始める1204。したがって、カプセルが形成される。カプセルが下流に進むにつれて、促進剤への曝露の増加のため、外殻はより厚くなる。また、試薬濃度の変化を用いて、カプセル外殻の厚さ及び透過性を変化させることもできる。
種、又は液滴などの他のパーティションを、例えば、第1の液体中に種を含有させることにより封入することができる。第2の液体中への種の含有は、カプセルの外殻中に種を埋込むことができる。勿論、特定の試料プロセッシング法の必要性に応じて、相を逆転させてもよい、すなわち、第1の相が油性相であってもよく、第2の相が水性相であってもよい。
2.フローフォーカシングによるカプセル内カプセルの生産
いくつかの場合、カプセル内カプセルを、フローフォーカシングにより生産することができる。図13を参照すると、カプセル、モノマー、架橋剤、開始剤、及び水性界面活性剤を含む第1(例えば、水性)の液体1301を、界面活性剤及び促進剤を含む第2(油)の液体1302中に流入させる。マイクロ流体装置中のT連結部1303に第2の液体を侵入させた後、第1の液体の液滴は第1の液体の流れから離脱し、第1の液体中のモノマー、架橋剤、及び開始剤と、第2の液体中の促進剤との混合のため、第2のカプセル外殻がカプセルの周囲で形成し始める1304。したがって、カプセル内カプセルが形成される。カプセルが下流に進行するにつれて、促進剤への曝露の増加のため、外殻はより厚くなる。試薬濃度の変化を用いて、第2のカプセル外殻の厚さ及び透過性を変化させることもできる。
種を、例えば、第1の液体中に種を含有させることにより封入することができる。第2の液体中への種の含有は、カプセルの第2の外殻中に種を埋込むことができる。勿論、特定の試料プロセッシング法の必要性に応じて、相を逆転させてもよい、すなわち、第1の相が油性相であってもよく、第2の相が水性相であってもよい。
3.バッチ式でのカプセルの生産
いくつかの場合、カプセルを、乳濁液中の液滴などのカプセル前駆体を用いて、バッチ式で生産することができる。カプセル前駆体を、任意の好適な方法により、例えば、モノマー、架橋剤、開始剤、及び界面活性剤を含む液滴を用いて乳濁液を生産することにより形成させることができる。次いで、促進剤を媒体に添加し、カプセルの形成を得ることができる。フローフォーカシングの方法に関しては、反応物の濃度、及び促進剤への曝露時間を変化させることにより、外殻の厚さを変化させることができる。次いで、カプセルを洗浄、回収することができる。本明細書に記載の任意の方法に関して、他のパーティションを含む種を、カプセル内に、又は好適な場合、外殻内に封入することができる。
別の例においては、乳濁液の液滴を、乳濁液生成プロセス中に出口ウェルに存在する促進剤に曝露することができる。例えば、カプセル前駆体を、図12に例示されるフローフォーカシング法などの任意の好適な方法により形成させることができる。第2の液体1202中に促進剤を含有させるよりもむしろ、T連結部の出口に位置する媒体(例えば、図12の水平チャネルの右端に位置する媒体)中に促進剤を含有させることができる。乳濁液の液滴(すなわち、カプセル前駆体)がチャネルを出るにつれて、それらは促進剤を含む媒体(すなわち、出口媒体)と接触する。カプセル前駆体が出口媒体の密度よりも低い密度を有する場合、カプセル前駆体は媒体を通って上昇し、促進剤への対流的及び拡散的曝露を確保し、チャネルの出口での重合の可能性を低下させる。
VI.種
本開示の方法、組成物、システム、装置、及びキットを、任意の好適な種と共に用いることができる。種は、例えば、試薬又は分析物などの、試料プロセッシングにおいて用いられる任意の物質であってもよい。種の例としては、全細胞、染色体、ポリヌクレオチド、有機分子、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、サッカリド、糖、脂質、酵素、制限酵素、リガーゼ、ポリメラーゼ、バーコード、アダプター、小分子、抗体、フルオロフォア、デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)、ジデオキシヌクレオチド三リン酸(ddNTP)、バッファー、酸性溶液、塩基性溶液、温度感受性酵素、pH感受性酵素、光感受性酵素、金属、金属イオン、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、マンガン、水性バッファー、軽度のバッファー、イオン性バッファー、阻害剤、サッカリド、油、塩、イオン、洗剤、イオン性洗剤、非イオン性洗剤、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、DNA、RNA、ペプチドポリヌクレオチド、相補的DNA(cDNA)、二本鎖DNA(dsDNA)、一本鎖DNA(ssDNA)、プラスミドDNA、コスミドDNA、染色体DNA、ゲノムDNA、ウイルスDNA、細菌DNA、mtDNA(ミトコンドリアDNA)、mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、マイクロRNA、dsRNA、リボザイム、リボスイッチ及びウイルスRNA、全部又は一部のロックド核酸(LNA)、ロックド核酸ヌクレオチド、他の任意の型の核酸類似体、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、キレート化剤、還元剤、酸化剤、プローブ、発色団、染料、有機物、乳化剤、界面活性剤、安定剤、ポリマー、水、小分子、薬剤、放射性分子、保存剤、抗生物質、アプタマーなどが挙げられる。まとめると、用いられる種は、特定の試料プロセッシングの必要性に応じて変化する。
いくつかの場合、パーティションは、類似する属性を有する種のセット(例えば、酵素のセット、鉱物のセット、オリゴヌクレオチドのセット、異なるバーコードの混合物、同一のバーコードの混合物)を含む。他の場合、パーティションは、種の異種混合物を含む。いくつかの場合、種の異種混合物は、特定の反応を実施するのに必要な全ての成分を含む。いくつかの場合、そのような混合物は、反応を実施するのに必要な1、2、3、4、5以上の成分を除いて、反応を実施するのに必要な全ての成分を含む。いくつかの場合、そのような更なる成分は、異なるパーティション内に、又はパーティションの内部若しくは周囲の溶液内に含まれる。
種は、天然のもの又は合成のものであってもよい。種は、当業界で公知の任意の方法を用いて得られた試料中に存在してもよい。いくつかの場合、試料は、それを分析物について分析する前にプロセッシングしてもよい。
種を、生物、全細胞、細胞調製物及び任意の生物、組織、細胞、又は環境に由来する無細胞組成物などの任意の好適な位置から取得することができる。種を、環境試料、生検、吸引物、ホルマリン固定包埋組織、空気、農業試料、土壌試料、石油試料、水試料、又は粉塵試料から取得することができる。いくつかの例においては、種を、血液、尿、糞便、血清、リンパ液、唾液、粘膜分泌物、汗、中枢神経系液、膣液、又は精液を含んでもよい体液から取得することができる。また、種を、化粧品、食品、パーソナルケア製品などの製造された製品から取得することもできる。種は、組換えクローニング、ポリヌクレオチド増幅、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、精製方法(ゲノムDNA又はRNAの精製など)、及び合成反応を含む実験操作の産物であってもよい。
いくつかの場合、種は質量により定量してもよい。種を、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000ng、1μg、5μg、10μg、15μg、又は20μgの質量で提供することができる。種を、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000ng、1μg、5μg、10μg、15μg、又は20μgの質量で提供することができる。種を、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000ng、1μg、5μg、10μg、15μg、又は20μg未満の質量で提供することができる。種を、約1〜10、10〜50、50〜100、100〜200、200〜1000、1000〜10000ng、1〜5μg、又は1〜20μgの範囲の質量で提供することができる。本開示の他の場所に記載のように、種がポリヌクレオチドである場合、増幅を用いてポリヌクレオチドの量を増加させることができる。
また、ポリヌクレオチドを、「ゲノム等価物」として定量することもできる。ゲノム等価物は、標的ポリヌクレオチドが誘導される生物の1倍体ゲノムと等価なポリヌクレオチドの量である。例えば、単一の2倍体細胞は、DNAの2つのゲノム等価物を含有する。ポリヌクレオチドを、約1〜10、10〜50、50〜100、100〜1000、1000〜10000、10000〜100000、又は100000〜1000000の範囲のゲノム等価物の量で提供することができる。ポリヌクレオチドを、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、又は1000000のゲノム等価物の量で提供することができる。ポリヌクレオチドを、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、又は1000000未満のゲノム等価物の量で提供することができる。
また、ポリヌクレオチドを、提供される配列包括度の量により定量することもできる。配列包括度の量とは、再構築された配列中の所与のヌクレオチドを表す読取りの平均数を指す。一般に、領域が配列決定される回数が多くなるほど、得られる配列情報はより正確になる。ポリヌクレオチドを、約0.1X〜10X、10X〜50X、50X〜100X、100X〜200X、又は200X〜500Xからの配列包括度の範囲を提供する量で提供することができる。ポリヌクレオチドを、少なくとも約0.1X、0.2X、0.3X、0.4X、0.5X、0.6X、0.7X、0.8X、0.9X、1.0X、5X、10X、25X、50X、100X、125X、150X、175X、又は200Xの配列包括度を提供する量で提供することができる。ポリヌクレオチドを、約0.2X、0.3X、0.4X、0.5X、0.6X、0.7X、0.8X、0.9X、1.0X、5X、10X、25X、50X、100X、125X、150X、175X、又は200X未満の配列包括度を提供する量で提供することができる。
いくつかの場合、種を、特定の工程の前又は後にパーティション中に導入する。例えば、溶解バッファー試薬を、細胞試料のパーティション中への区分化の後にパーティション中に導入することができる。いくつかの場合、試薬及び/又は試薬を含むパーティションを、異なる反応又は操作が異なる工程で起こるように連続的に導入する。また、試薬(又は試薬を含むパーティション)を、反応又は操作工程が散在する工程で充填してもよい。例えば、分子(例えば、核酸)を断片化するための試薬を含むカプセルをウェルに充填した後、断片化工程を行い、次いで、バーコード(又は他のユニークな識別子、例えば、抗体)をライゲートするための試薬を含むカプセルを充填し、その後、断片化された分子にバーコードをライゲートすることができる。
VII.分析物及び他の種のプロセッシング
いくつかの場合、本開示の方法、組成物、システム、装置、及びキットを用いて、種、例えば、分析物を含有する試料をプロセッシングすることができる。任意の好適なプロセスを実施することができる。
a.標的ポリヌクレオチドの断片化
いくつかの場合、本開示の方法、組成物、システム、装置、及びキットを、ポリヌクレオチド断片化のために用いることができる。ポリヌクレオチドの断片化は、ポリヌクレオチド配列決定を含む様々な方法における工程として用いられる。典型的には、長さに関して記載される(断片あたりのヌクレオチドの直線数により定量される)、ポリヌクレオチド断片のサイズは、標的ポリヌクレオチドの供給源、断片化に用いられる方法、及び所望の用途に応じて変化してもよい。単一の断片化工程又は複数の断片化工程を用いることができる。
本明細書に記載の方法を用いて生成される断片は、約1〜10、10〜20、20〜50、50〜100、50〜200、100〜200、200〜300、300〜400、400〜500、500〜1000、1000〜5000、5000〜10000、10000〜100000、100000〜250000、又は250000〜500000ヌクレオチド長であってもよい。本明細書に記載の方法を用いて生成される断片は、少なくとも約10、20、100、200、300、400、500、1000、5000、10000、100000、250000、500000以上のヌクレオチド長であってもよい。本明細書に記載の方法を用いて生成される断片は、約10、20、100、200、300、400、500、1000、5000、10000、100000、250000、500000未満のヌクレオチド長であってもよい。
本明細書に記載の方法を用いて生成される断片は、約1〜10、10〜20、20〜50、50〜100、50〜200、100〜200、200〜300、300〜400、400〜500、500〜1000、1000〜5000、5000〜10000、10000〜100000、100000〜250000、又は250000〜500000ヌクレオチドの平均又は中央長さを有してもよい。本明細書に記載の方法を用いて生成される断片は、少なくとも約10、20、100、200、300、400、500、1000、5000、10000、100000、250000、500000以上のヌクレオチドの平均又は中央長さを有してもよい。本明細書に記載の方法を用いて生成される断片は、約10、20、100、200、300、400、500、1000、5000、10000、100000、250000、500000未満のヌクレオチドの平均又は中央長さを有してもよい。
いくつかの断片化方法が当業界で公知である。例えば、断片化を、物理的、機械的又は酵素的方法により実施することができる。物理的断片化は、標的ポリヌクレオチドを熱又はUV光に曝露することを含んでもよい。機械的破壊を用いて、標的ポリヌクレオチドを所望の範囲の断片に機械的に剪断することができる。機械的剪断を、標的ポリヌクレオチドの反復的ピペッティング、超音波処理(例えば、超音波を用いる)、キャビテーション及び噴霧化を含む、当業界で公知のいくつかの方法により達成することができる。また、標的ポリヌクレオチドを、酵素的方法を用いて断片化することもできる。いくつかの場合、酵素的消化を、制限酵素などの酵素を用いて実施することができる。
前記段落及び本開示のいくつかの段落に記載の断片化方法は「標的」ポリヌクレオチドを参照して記載されたが、これは本開示の上記又は他の場所において限定を意味するものではない。本明細書に記載の、又は当業界で公知の任意の断片化方法を、本発明と共に使用される任意のポリヌクレオチドに適用することができる。いくつかの場合、このポリヌクレオチドは、ゲノムなどの、標的ポリヌクレオチドであってもよい。他の場合、このポリヌクレオチドは、当業者が更に断片化することを望む標的ポリヌクレオチドの断片であってもよい。更に他の場合、更なる断片を更に断片化してもよい。任意の好適なポリヌクレオチドを、本明細書に記載の方法に従って断片化することができる。
制限酵素を用いて、標的ポリヌクレオチドの特異的又は非特異的断片化を実施することができる。本開示の方法は、一般にI型酵素、II型酵素、及び/又はIII型酵素として記載される、1つ又は複数の型の制限酵素を用いてもよい。II型及びIII型酵素は一般に、商業的に入手可能であり、当業界で周知である。II型及びIII型酵素は、二本鎖ポリヌクレオチド配列内のヌクレオチド塩基対の特定の配列(「認識配列」又は「認識部位」)を認識する。これらの配列の結合及び認識の際に、II型及びIII型酵素はポリヌクレオチド配列を切断する。いくつかの場合、切断は、「付着末端」と呼ばれる、突出する一本鎖DNAの一部を含むポリヌクレオチド断片をもたらす。他の場合、切断は、突出部を含む断片をもたらさず、「平滑末端」を作出する。本開示の方法は、付着末端又は平滑末端のいずれかを生成する制限酵素の使用を含んでもよい。
制限酵素は、標的ポリヌクレオチド中の様々な認識部位を認識することができる。いくつかの制限酵素(「精密カッター」)は、単一の認識部位(例えば、GAATTC)だけを認識する。他の制限酵素はより雑多であり、1つより多い認識部位、又は様々な認識部位を認識する。いくつかの酵素は、認識部位内の単一の位置で切断するが、他の酵素は複数の位置で切断することができる。いくつかの酵素は認識部位内の同じ位置で切断するが、他の酵素は可変位置で切断する。
本開示は、1つ又は複数の制限酵素を選択して、所望の長さの断片を生産する方法を提供する。ポリヌクレオチド断片化を、in silicoでシミュレートし、断片化を最適化して、望ましくないサイズ範囲内の断片の数又は画分を最小化しながら、特定のサイズ範囲内のポリヌクレオチド断片の最も多い数又は画分を得ることができる。最適化アルゴリズムを適用して、2つ以上の酵素の組合せを選択し、断片量の所望の分布を有する所望の断片サイズをもたらすことができる。
ポリヌクレオチドを、2つ以上の制限酵素に同時的又は連続的に曝露することができる。これを、例えば、1つより多い制限酵素をパーティションに加えるか、又は1つの制限酵素をパーティションに加え、消化を実施し、制限酵素を不活化し(例えば、熱処理による)、次いで、第2の制限酵素を加えることにより達成することができる。任意の好適な制限酵素を、本明細書に提示される方法において、単独で、又は組み合わせて用いることができる。
いくつかの場合、種は、「レアカッター(rare-cutter)」である制限酵素である。本明細書で用いられる用語「レアカッター酵素」とは一般に、ゲノム中に稀にのみ存在する認識部位を有する酵素を指す。制限酵素で仮説的無作為ゲノムを切断することにより生成される制限断片のサイズを、4N(式中、Nは酵素の認識部位中のヌクレオチド数である)で近似することができる。例えば、7個のヌクレオチドからなる認識部位を有する酵素は、47bp毎に1回、ゲノムを切断し、約16,384bpの断片を産生する。一般に、レアカッター酵素は、6個以上のヌクレオチドを含む認識部位を有する。例えば、レアカッター酵素は、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15ヌクレオチドを含むか、又はそれからなる認識部位を有してもよい。レアカッター酵素の例としては、NotI(GCGGCCGC)、XmaIII(CGGCCG)、SstII(CCGCGG)、SalI(GTCGAC)、NruI(TCGCGA)、NheI(GCTAGC)、Nb.BbvCI(CCTCAGC)、BbvCI(CCTCAGC)、AscI(GGCGCGCC)、AsiSI(GCGATCGC)、FseI(GGCCGGCC)、PacI(TTAATTAA)、PmeI(GTTTAAAC)、SbfI(CCTGCAGG)、SgrAI(CRCCGGYG)、SwaI(ATTTAAAT)、BspQI(GCTCTTC)、SapI(GCTCTTC)、SfiI(GGCCNNNNNGGCC)、CspCI(CAANNNNNGTGG)、AbsI(CCTCGAGG)、CciNI(GCGGCCGC)、FspAI(RTGCGCAY)、MauBI(CGCGCGCG)、MreI(CGCCGGCG)、MssI(GTTTAAAC)、PalAI(GGCGCGCC)、RgaI(GCGATCGC)、RigI(GGCCGGCC)、SdaI(CCTGCAGG)、SfaAI(GCGATCGC)、SgfI(GCGATCGC)、SgrDI(CGTCGACG)、SgsI(GGCGCGCC)、SmiI(ATTTAAAT)、SrfI(GCCCGGGC)、Sse2321(CGCCGGCG)、Sse83871(CCTGCAGG)、LguI(GCTCTTC)、PciSI(GCTCTTC)、AarI(CACCTGC)、AjuI(GAANNNNNNNTTGG)、AloI(GAACNNNNNNTCC)、BarI(GAAGNNNNNNTAC)、PpiI(GAACNNNNNCTC)、PsrI(GAACNNNNNNTAC)などが挙げられる。
いくつかの場合、ポリヌクレオチドを、同時に断片化及びバーコード化することができる。例えば、トランスポザーゼ(例えば、NEXTERA)を用いてポリヌクレオチドを断片化し、バーコードをポリヌクレオチドに付加することができる。
VIII.刺激応答性
いくつかの場合、刺激を用いてパーティションからの種の放出を誘発することができる。一般に、刺激は、ウェルの壁、スポットの成分、液滴(例えば、乳濁液中の液滴)の安定性、又はカプセルの外殻などの、パーティションの構造の破壊を引き起こすことができる。これらの刺激は、パーティションがその内容物を放出するのを誘導するのに特に有用である。パーティションは別のパーティション内に含有されてもよく、各パーティションは異なる刺激に対して応答性(又は非応答性)であってもよいため、刺激応答性を用いて、あるパーティション(例えば、刺激に対して応答するパーティション)の内容物を、別のパーティション(例えば、その刺激に対して応答しないか、又はその刺激に対する応答性が低いパーティション)中に放出させることができる。
いくつかの場合、内側カプセルを溶解する刺激を適用し、混合試料を含有するカプセルをもたらすことにより、内側カプセルの内容物を、外側カプセルの内容物中に放出させることができる。勿論、この実施形態は純粋に例示的なものであり、刺激応答性を用いて、任意の好適なパーティションの内容物を、任意の他の好適なパーティション、媒体、又は容器中に放出させることができる(パーティション内パーティションのより特定の例については、例えば、Table 1(表1)を参照されたい)。
用いることができる刺激の例としては、以下により完全に記載されるような、化学的刺激、嵩変化、生物学的刺激、光、温度刺激、磁気刺激、媒体のウェルへの添加、及びその任意の組合せが挙げられる(例えば、Esser-Kahnら(2011) Macromolecules 44: 5539〜5553頁; Wangら(2009) ChemPhysChem 10:2405〜2409頁を参照されたい)。
a.化学的刺激及び嵩変化
いくつかの化学的トリガーを用いて、パーティションの破壊を誘発することができる(例えば、Plunkettら、Biomacromolecules、2005、6:632〜637頁)。これらの化学的変化の例としては、限定されるものではないが、パーティションの成分の完全性に対するpHにより媒介される変化、架橋結合の化学的切断によるパーティションの成分の崩壊、及びパーティションの成分の誘発された脱重合化が挙げられる。嵩変化を用いて、パーティションの破壊を誘発することもできる。
pHの低下などの、溶液のpHの変化は、いくつかの異なる機構によりパーティションの破壊を誘発し得る。酸の添加は、様々な機構によりパーティションの一部の分解又は脱集合を引き起こし得る。プロトンの添加は、パーティションの成分中のポリマーの架橋を脱集合させる、パーティションの成分中のイオン結合若しくは水素結合を破壊する、又はパーティションの成分中のナノ細孔を作出し、内部の内容物を外部に漏出させ得る。pHの変化はまた、乳濁液を脱安定化し、液滴の内容物の放出をもたらすことができる。
いくつかの例においては、パーティションは、ケタールなどの酸分解性化学架橋剤を含む材料から生産される。pHの低下、特に、5未満のpHへの低下は、ケタールのケトン及び2つのアルコールへの変換を誘導し、パーティションの破壊を容易にすることができる。他の例においては、パーティションを、pH感受性である1つ又は複数の多電解質を含む材料から生産することができる。pHの低下は、そのようなパーティションのイオン結合若しくは水素結合相互作用を破壊するか、又はその中にナノ細孔を作出することができる。いくつかの場合、多電解質を含む材料から作製されたパーティションは、pHの変化の際に拡張、収縮する荷電したゲルに基づくコアを含む。
パーティションを含む架橋材料の破壊を、いくつかの機構により達成することができる。いくつかの例においては、パーティションを、酸化、還元又は他の化学的変化を誘導する様々な化学物質と接触させることができる。いくつかの場合、パーティションのジスルフィド結合が破壊されるように、ベータ-メルカプトエタノールなどの還元剤を用いることができる。更に、酵素を添加して、パーティションを形成する材料中のペプチド結合を切断することによって、パーティションの完全性の喪失をもたらすことができる。
脱重合化を用いて、パーティションを破壊することもできる。化学的トリガーを添加して、保護頭部基の除去を容易にすることができる。例えば、トリガーは、ポリマー内の炭酸エステル又はカルバメートの頭部基の除去を引き起こし、次いで、脱重合及びパーティションの内側からの種の放出を引き起こすことができる。
更に別の例においては、化学的トリガーは、浸透圧トリガーを含んでもよく、それにより、溶液中のイオン又は溶質濃度の変化はパーティションを作製するのに用いられる材料の膨張を誘導する。膨張は、パーティションが破裂してその内容物を放出するような内圧の増強を引き起こすことができる。膨張はまた、材料の孔径の増加を引き起こし、パーティション内に含まれる種を拡散させることもでき、その逆もまた可能である。
パーティションはまた、圧力により誘導される破裂、融解、又は多孔率の変化などの、嵩変化又は物理的変化によりその内容物を放出するように作製することもできる。
b.生物学的刺激
生物学的刺激を用いて、パーティションの破壊を誘発することもできる。一般に、生物学的トリガーは化学的トリガーと類似するが、多くの例は生体分子、又は酵素、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、核酸などの生体系に一般的に見出される分子を用いる。例えば、パーティションを、特異的プロテアーゼによる切断に対して感受性であるペプチド架橋を有するポリマーを含む材料から作製することができる。より特には、1つの例は、GFLGKペプチド架橋を含む材料から作製されたパーティションを含んでもよい。プロテアーゼであるカテプシンBなどの生物学的トリガーの添加の際に、外殻ウェルのペプチド架橋が切断され、カプセルの内容物が放出される。他の場合、プロテアーゼを熱活性化することができる。別の例においては、パーティションは、セルロースを含む成分を含む。加水分解酵素であるキトサンの添加は、セルロース結合の切断、キトサンを含むパーティションの成分の脱重合、及びその内部の内容物の放出のための生物学的トリガーとして役立つ。
c.温度刺激
パーティションを、温度刺激の適用の際にその内容物を放出するように誘導することもできる。温度の変化は、パーティションに対する様々な変化を引き起こすことができる。熱の変化は、パーティションの一部が崩壊するようなパーティションの融解、又は乳濁液の破壊を引き起こし得る。他の場合、熱は、パーティションが破裂又は爆発するようにパーティションの内部成分の内圧を増加させ得る。更に他の場合、熱は、パーティションを、収縮した脱水状態に変形させることができる。熱はまた、パーティションを構築するための材料として用いられる熱感受性ポリマーに対して作用することもできる。
一例においては、パーティションは、温度感受性ヒドロゲルを含む材料から作製される。35℃を超える温度などの、熱の適用の際に、ヒドロゲル材料は収縮する。材料の突然の収縮は、圧力を増大させ、パーティションを破裂させる。
いくつかの場合、パーティションを生産するために用いられる材料は、異なる熱感受性を有する、ジブロックポリマー、又は2つのポリマーの混合物を含んでもよい。一方のポリマーは特に、熱の適用後に収縮する可能性があるが、他方はより熱安定性であってもよい。熱がそのような外殻壁に適用された場合、熱感受性ポリマーは収縮するが、他方は無傷のままであり、細孔の形成を引き起こしてもよい。更に他の場合、パーティションを生産するために用いられる材料は、磁気ナノ粒子を含んでもよい。磁界への曝露は、熱の生成を引き起こし、パーティションの破裂をもたらし得る。
d.磁気刺激
パーティションを生産するために用いられる材料中への磁気ナノ粒子の含有は、上記のパーティションの誘発された破裂を可能にし、並びに他のパーティションへのこれらのパーティションの誘導(例えば、カプセルのアレイ中のウェルへの誘導)を可能にし得る。一例においては、パーティションを生産するために用いられる材料中へのFe3O4ナノ粒子の含有は、振動磁界刺激の存在下で破裂を誘発する。
e.電気及び光刺激
パーティションを、電気刺激の結果として破壊することもできる。前記セクションに記載された磁気粒子と同様、電気感受性粒子は、誘発されたパーティションの破裂、並びに電界又は酸化還元反応における整列などの他の機能の両方を可能にし得る。一例では、電気感受性材料を含む材料から作製されたパーティションを、内部試薬の放出を制御することができるような電界中で整列させる。他の例では、電界は、多孔率を増加させ得るパーティション内での酸化還元反応を誘導することができる。
光刺激を用いて、パーティションを破壊することもできる。いくつかの光トリガーが可能であり、特定の範囲の波長の光子を吸収することができるナノ粒子及び発色団などの様々な分子を使用するシステムを含んでもよい。例えば、金属酸化物コーティングを用いて、ある特定のパーティションを生産することができる。SiO2/TiO2で被覆されたパーティションのUV照射は、パーティション壁の崩壊をもたらし得る。更に別の例においては、アゾベンゼン基などの光により切替え可能な材料を、パーティションを生産するために用いられる材料中に組み込むことができる。UV又は可視光の適用の際に、これらのものなどの化学物質は、光子の吸収の際に可逆的cis-trans異性化を受ける。この態様において、光スイッチの組込みは、パーティションの一部の崩壊、又はパーティションの一部の多孔率の増加をもたらす。
f.刺激の適用
本開示の装置、方法、組成物、システム、及びキットを、そのようなトリガー又は刺激を提供する任意の器具又は装置と組み合わせて用いることができる。例えば、刺激が温度刺激である場合、装置を、ウェルの加熱を可能にする熱又は温度制御プレートと組み合わせて用い、カプセルの破裂を誘導することができる。限定されるものではないが、放射熱移動、対流熱移動、又は伝導熱移動による熱の印加などの、熱移動のいくつかの方法のいずれかを、温度刺激のために用いることができる。他の場合、刺激が生物学的酵素である場合、酵素が各ウェル中に配置されるように、酵素を装置中に注入することができる。別の態様においては、刺激が磁界又は電界である場合、装置を磁気又は電気プレートと組み合わせて用いることができる。
IX.用途
a.ポリヌクレオチド配列決定
一般に、本明細書に提供される方法及び組成物は、配列決定などの下流の用途のためのポリヌクレオチド断片の調製に有用である。配列決定を、任意の好適な技術により実施することができる。例えば、配列決定を、古典的なSangerの配列決定法により実施することができる。配列決定法としては、高効率配列決定、ピロシーケンシング、合成による配列決定、単一分子配列決定、ナノ細孔配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、RNA-Seq (Illumina社)、Digital Gene Expression (Helicos社)、次世代配列決定、合成による単一分子配列決定(SMSS) (Helicos社)、大規模平行配列決定、クローン単一分子アレイ(Solexa社)、ショットガン配列決定、Maxim-Gilbert配列決定、プライマーウォーキング、及び当業界で公知の任意の他の配列決定法も挙げられる。
いくつかの場合、変化する数の断片を配列決定する。例えば、いくつかの場合、約30%〜90%の断片を配列決定する。いくつかの場合、約35%〜85%、40%〜80%、45%〜75%、50%〜70%、55%〜65%、又は50%〜60%の断片を配列決定する。いくつかの場合、少なくとも約30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%の断片を配列決定する。いくつかの場合、約30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%未満の断片を配列決定する。
いくつかの場合、断片に由来する配列を集合させて、個々の配列読取り物よりも長い元の標的ポリヌクレオチドの連続する領域に関する配列情報を提供する。個々の配列読取り物は、約10〜50、50〜100、100〜200、200〜300、300〜400以上のヌクレオチド長であってもよい。
バーコードタグの同一性は、個々の断片に由来する配列読取り物を順序付ける、並びにハプロタイプ間を区別するのに役立ち得る。例えば、個々の断片の区分化の間に、親ポリヌクレオチド断片を異なるパーティションに分離することができる。パーティション数の増加と共に、同じパーティション中に含まれる母型ハプロタイプと親ハプロタイプの両方に由来する断片の可能性は無視できるほど小さくなる。したがって、同じパーティション中の断片に由来する配列読取り物を集合させ、順序付けることができる。
b.ポリヌクレオチド位相化
本開示はまた、位相化又は連結情報を生成させることができるような様式でポリヌクレオチド断片を調製するための方法及び組成物も提供する。そのような情報は、ポリヌクレオチドの長いストレッチにより分離される遺伝子変化(例えば、SNP、突然変異、インデル、コピー数変化、トランスバージョン、転座、逆位など)などの、配列における関連する遺伝子変化の検出を可能にし得る。用語「インデル」とは、同時局在化した挿入及び欠失並びにヌクレオチドの正味の増加又は減少をもたらす突然変異を指す。「マイクロインデル」は、1〜50ヌクレオチドの正味の増加又は減少をもたらすインデルである。これらの変化は、cis又はtransの関係で存在してもよい。cis関係においては、2つ以上の遺伝子変化が同じポリヌクレオチド又は鎖中に存在する。trans関係においては、2つ以上の遺伝子変化が複数のポリヌクレオチド分子又は鎖上に存在する。
本明細書で提供される方法を用いて、ポリヌクレオチド位相化を決定することができる。例えば、ポリヌクレオチド試料(例えば、所与の遺伝子座又は複数の遺伝子座に広がるポリヌクレオチド)を、パーティションあたり多くても1分子のポリヌクレオチドが存在するように区分化することができる。次いで、ポリヌクレオチドを断片化、バーコード化、及び配列決定することができる。配列を、遺伝子変化について検査することができる。2つの異なるバーコードでタグ付けされた同じ配列中の遺伝子変化の検出は、2つの遺伝子変化がDNAの2つの別の鎖から誘導され、transの関係を反映することを示してもよい。逆に、同じバーコードでタグ付けされた2つの異なる遺伝子変化の検出は、2つの遺伝子変化がDNAの同じ鎖に由来し、cisの関係を反映することを示してもよい。
位相情報は、特に、ポリヌクレオチド断片が特定の疾患又は障害(例えば、嚢胞性線維症などの劣性遺伝病、がんなど)を有するか、又は有することが疑われるリスクのある対象に由来する場合、ポリヌクレオチド断片の特性評価にとって重要となり得る。この情報は、以下の可能性:(1)DNAの同じ鎖上の同じ遺伝子内の2つの遺伝子変化及び(2)DNAの別々の鎖上に位置するが同じ遺伝子内の2つの遺伝子変化の間を識別することができる。可能性(1)は、1コピーの遺伝子が正常であり、個体が疾患を含まないことを示してもよいが、可能性(2)は、特に、2つの遺伝子変化が同じ遺伝子コピー内に存在する場合に遺伝子の機能を損傷する場合、個体が疾患を有するか、又は疾患を発症することを示してもよい。同様に、位相化情報はまた、以下の可能性:(1)それぞれ、DNAの同じ鎖上の異なる遺伝子内の2つの遺伝子変化及び(2)それぞれ、DNAの別々の鎖上に位置するが異なる遺伝子内の2つの遺伝子変化の間を識別することもできる。
c.少数の細胞に由来するポリヌクレオチドの配列決定
本明細書に提供される方法を用いて、細胞特異的情報を取得することができる様式で細胞内に含まれるポリヌクレオチドを調製することもできる。この方法は、約10〜100個の細胞を含む試料からなど、非常に小さい試料からの遺伝子変化(例えば、SNP、突然変異、インデル、コピー数変化、トランスバージョン、転座、逆位など)の検出を可能にする。いくつかの場合、少なくとも約1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100個の細胞を、本明細書に記載の方法において用いることができる。他の場合、多くても約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100個の細胞を、本明細書に記載の方法において用いることができる。
ある例において、方法は、パーティションあたり多くても1個の細胞(又は1個の細胞の抽出物)が存在するような細胞試料(又は粗細胞抽出物)を区分化すること、細胞を溶解すること、本明細書に記載の任意の方法により細胞内に含まれるポリヌクレオチドを断片化すること、断片化したポリヌクレオチドをバーコードに結合させること、プールすること、及び配列決定することを含む。
本明細書の他の場所に記載のように、バーコード及び他の試薬を、パーティション(例えば、カプセル)内に含有させることができる。各細胞が異なるカプセルと接触するように、細胞の充填の前、後、又はそれと同時に、これらのカプセルを別のパーティション(例えば、ウェル)中に充填することができる。この技術を用いて、ユニークなバーコードを、各細胞から得られるポリヌクレオチドに結合させることができる。次いで、得られるタグ付けされたポリヌクレオチドをプールし、配列決定し、バーコードを用いてポリヌクレオチドの起源を追跡することができる。例えば、同一のバーコードを有するポリヌクレオチドを同じ細胞が起源であると決定することができるが、異なるバーコードを有するポリヌクレオチドを異なる細胞が起源であると決定することができる。
本明細書に記載の方法を用いて、がん腫瘍細胞の集団にわたるがん突然変異の分布を検出することができる。例えば、いくつかの腫瘍細胞は、両方の対立遺伝子中にがん遺伝子(例えば、HER2、BRAF、EGFR、KRAS)の突然変異、又は増幅を有してもよく(ホモ接合性)、その他は1つの対立遺伝子中に突然変異を有してもよく(ヘテロ接合性)、更にその他は突然変異を有さなくてもよい(野生型)。本明細書に記載の方法を用いて、これらの差異を検出し、また、ホモ接合性、ヘテロ接合性、及び野生型細胞の相対数を定量することができる。そのような情報を用いて、例えば、特定のがんを段階評価する、並びに/又はがんの進行及び経時的なその処置をモニタリングすることができる。
いくつかの例においては、本開示は、2つの異なるがん遺伝子(例えば、KRAS及びEGFR)中の突然変異を同定する方法を提供する。同じ細胞が両方の突然変異を有する遺伝子を含む場合、これはより侵攻的な形態のがんを示してもよい。対照的に、突然変異が2つの異なる細胞中に位置する場合、これは、がんがより良性であるか、又はあまり進行していないことを示してもよい。
d.遺伝子発現の分析
本開示の方法は、遺伝子発現の変化の検出のための試料のプロセッシングに適用可能であってもよい。試料は、細胞、mRNA、又はmRNAから逆転写されたcDNAを含んでもよい。試料は、いくつかの異なる細胞若しくは組織からの抽出物を含むプールされた試料、又は単一の細胞若しくは組織からの抽出物を含む試料であってもよい。
細胞を、パーティション(例えば、マイクロウェル)中に直接入れ、溶解することができる。溶解後、本発明の方法を用いて、配列決定のために細胞のポリヌクレオチドを断片化し、バーコード化することができる。ポリヌクレオチドを細胞から抽出した後、それらを、本発明の方法において用いられるパーティション中に導入することもできる。mRNAの逆転写を、本明細書に記載のパーティション中で、又はそのようなパーティションの外部で実施することができる。cDNAの配列決定は、経時的な、又は特定の条件への曝露後の特定の細胞中の特定の転写物の存在量の指示を提供することができる。
上記に提示された方法は、現在のポリヌクレオチドプロセッシング法を超えるいくつかの利点を提供する。第1に、操作者間変動性が大きく低下する。第2に、前記方法を、低コストであり、容易に組立てることができるマイクロ流体装置中で実行することができる。第3に、標的ポリヌクレオチドの制御された断片化により、ユーザは規定の適切な長さを有するポリヌクレオチド断片を生産することができる。これは、ポリヌクレオチドを区分化するのに役立ち、また、過剰に大きい断片の存在に起因する配列情報損失量も減少させる。前記方法及びシステムはまた、プロセッシングされたポリヌクレオチドの完全性を維持する容易なワークフローを提供する。更に、制限酵素の使用により、ユーザはアダプター及び/又はバーコードとの適合性のために設計することができるDNA突出部(「付着末端」)を作出することができる。
e.細胞からの、染色体などのポリヌクレオチドの区分化
一例において、本開示で提供される方法、組成物、システム、装置、及びキットを用いて、細胞から、全染色体などのポリヌクレオチドを区分化することができる。一例では、単一の細胞又は複数の細胞(例えば、2、10、50、100、1000、10000、25000、50000、100000、500000、1000000個以上の細胞)を、溶解バッファー及びプロテイナーゼKを含む容器中に充填し、特定の期間にわたってインキュベートする。複数の細胞の使用により、例えば、各ポリヌクレオチドを区分化し、それ自身のパーティション中で分析することにより、ポリヌクレオチド位相化が可能になる。
インキュベーション後、例えば、細胞溶解物をカプセル中にフローフォーカシングすることにより、細胞溶解物を区分化する。位相化を実施しようとする場合、各カプセルが単一の分析物(例えば、単一の染色体)のみ、又は単一コピーの任意の特定の染色体(例えば、1コピーの第1の染色体と1コピーの第2の染色体)のみを含むように、フローフォーカシングを実施する。いくつかの場合、染色体が同じ染色体ではない限り、複数の染色体を同じカプセル内に封入することができる。封入は、ポリヌクレオチドの剪断を最小化するために、穏やかな流動の下で行われる。カプセル内にポリヌクレオチド(例えば、染色体)を維持しながら、カプセルの内容物の洗浄、及びカプセル中への試薬の導入を可能にするために、カプセルは多孔性であってもよい。次いで、封入されたポリヌクレオチド(例えば、染色体)を、本開示に提供されるか、又は当業界で公知の任意の方法に従ってプロセッシングすることができる。カプセル外殻は、剪断及び更なる分解から、封入されたポリヌクレオチド(例えば、染色体)を保護する。勿論、この方法を、任意の他の細胞成分に適用することもできる。
上記のように、カプセル外殻を用いて、剪断からポリヌクレオチドを保護することができる。しかしながら、カプセルを、ポリヌクレオチド又は他の分析物の区画化された剪断を可能にするためのパーティションとして用いることもできる。例えば、いくつかの場合、ポリヌクレオチドをカプセル内に封入した後、超音波剪断、又は任意の他の好適な剪断にかけることができる。カプセル外殻を、剪断下で無傷のままとなるように構成させることができる一方、封入されたポリヌクレオチドを剪断するが、カプセル内に保持することができる。いくつかの場合、ヒドロゲル液滴を用いて、同じ目的を達成することができる。
f.がん突然変異の検出及び法医学
本明細書に記載のパーティション中での増幅に基づくバーコード化スキームによるバーコード化方法は、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片などの、分解した試料からバーコードライブラリーを生成するのに有用であり得る。本明細書に記載の方法は、パーティション内の全てのアンプリコンが同じ初期分子を起源とすることを同定することができる。実際、パーティションバーコード化を用いて、ユニークな開始ポリヌクレオチドに関する情報を保持することができる。そのような同定は、異なる起源分子に由来するアンプリコンを識別することができるため、ライブラリーの複雑性の決定に役立ち得る。更に、本明細書に記載の方法は、ユニークな包括度の評価を許容し、バリアントコーリング(variant calling)感受性の決定に役立ち得る。これらの利点は、がん突然変異の検出及び法医学において特に有用であり得る。
g.低入力DNA適用(循環腫瘍細胞(CTC)配列決定)
本明細書に記載のバーコード化方法は、例えば、循環腫瘍細胞(CTC)の核酸の配列決定などの、低ポリヌクレオチド入力適用において有用であり得る。例えば、パーティション内での本明細書に記載のMALBAC法は、低ポリヌクレオチド入力適用において良好なデータ品質を取得するのに役立つ、及び/又は増幅誤差を濾過除去するのに役立ち得る。
X.キット
いくつかの場合、本開示は、パーティションの生成のための試薬を含むキットを提供する。キットは、任意の好適な試薬並びにパーティション及びパーティション内パーティションの生成のための説明書を含んでもよい。
一例では、キットは、乳濁液中の液滴内でカプセルを生成するための試薬を含む。例えば、キットは、カプセルを生成するための試薬、乳濁液を生成するための試薬、及び乳濁液の液滴中にカプセルを導入するための説明書を含んでもよい。本開示を通じて特定されるように、任意の好適な種を、液滴中及び/又はカプセル中に組み込むことができる。本開示のキットはまた、予め区分化されたバーコードを含むポリヌクレオチドなどの、任意のこれらの種を提供することもできる。同様に、本開示を通じて記載されるように、カプセルを、刺激の適用の際に乳濁液の液滴中にその内容物を放出するように設計することができる。
別の例においては、キットは、カプセル内カプセルを生成するための試薬を含む。例えば、キットは、内側カプセルを生成するための試薬、外側カプセルを生成するための試薬、及びカプセル内カプセルを生成するための説明書を含んでもよい。本開示を通じて特定されるように、任意の好適な種を、内側及び/又は外側カプセル中に組み込むことができる。本開示のキットはまた、予め区分化されたバーコードを含むポリヌクレオチドなどの、任意のこれらの種を提供することもできる。同様に、本開示を通じて記載されるように、内側カプセルを、刺激の適用の際に外側カプセル中にその内容物を放出するように設計することができる。
XI.装置
いくつかの場合、本開示は、分析物のプロセッシングのためのパーティションを含む装置を提供する。装置は、本開示の他の場所に記載のような、マイクロウェルアレイ、又はマイクロスポットアレイであってもよい。装置を、それが任意の好適なパーティションを含む様式で形成させることができる。いくつかの場合、装置は、複数のウェル、又は複数のスポットを含む。勿論、装置中の任意のパーティションは、カプセル、乳濁液中の液滴などの他のパーティションを保持することもできる。
装置を、任意の好適な材料から形成させることができる。いくつかの例においては、装置は、石英ガラス、ソーダ石灰ガラス、ホウケイ酸ガラス、ポリ(メチルメタクリレート)、サファイア、シリコン、ゲルマニウム、環状オレフィンコポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリカーボネート、プラスチック、及びその組合せからなる群から選択される材料から形成される。
いくつかの場合、装置は、パーティション中への、及びパーティション間での液体の流動のためのチャネルを含む。任意の好適なチャネルを用いることができる。装置は、液体注入口及び液体排出口を含んでもよい。注入口及び排出口を、液体操作装置に結合して、種を装置中に導入することができる。装置を、任意の種の導入の前又は後に密閉することができる。
親水性及び/又は疎水性である材料を、装置の異なる部分において用いることができる。例えば、いくつかの場合、本開示の装置は、親水性材料を含む内部表面を有するパーティションを含む。いくつかの場合、パーティションにとって外部である表面は、疎水性材料を含む。いくつかの場合、液体流動路は、疎水性又は親水性材料で被覆される。
理解される通り、本開示は、本明細書に記載の様々な用途、使用、及び目的を含む、特定の使用又は目的のための本明細書に記載の任意の組成物、ライブラリー、方法、装置、及びキットの使用を提供する。例えば、本開示は、種の区分化における、オリゴヌクレオチドの区分化における、パーティションからの種の刺激選択的放出における、パーティション中での反応(例えば、ライゲーション及び増幅反応)の実施における、核酸合成反応の実施における、核酸のバーコード化における、配列決定のためのポリヌクレオチドの調製における、ポリヌクレオチドの配列決定における、ポリヌクレオチド位相化における、少数の細胞からのポリヌクレオチドの配列決定における、遺伝子発現の分析における、細胞からのポリヌクレオチドの区分化における、突然変異検出における、神経障害診断における、糖尿病診断における、胎児異数性診断における、がん突然変異検出及び法医学における、疾患検出における、医学的診断における、循環腫瘍細胞(CTC)配列決定などの低入力核酸適用における、その組合せにおける、並びに本明細書に記載の任意の他の用途、方法、プロセス又は使用における、本明細書に記載の組成物、方法、ライブラリー、装置、及びキットの使用を提供する。
(実施例1)
非対称性PCR及び部分相補ユニバーサル配列の付加によるバーコード配列を含むフォーク型アダプターのライブラリーの生産
本実施例は、次世代配列決定技術(例えば、ILLUMINA)と適合するバーコード配列を含むフォーク型アダプターの製造のための方法を提供する。本実施例において、バーコードは、図2に記載のように、位置207に配置される。
図4を参照すると、第1の固定化領域402、バーコード領域403、及び第1の配列決定プライマー領域404を含む一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列401を合成する。バーコード領域403は、各カップリング工程中に等モル濃度のA、G、T及びCを含有させることにより合成される7ヌクレオチドの無作為配列である。
合成後、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド401を、各液滴が平均で0.1のポリヌクレオチドを含むように、油中水乳濁液中の水性液滴中に希釈する。液滴はまた、非対称性PCRによる、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド401の増幅のための試薬(例えば、ポリメラーゼ、プライマー、dNTP、バッファー、塩)及びDNA挿入染料(例えば、臭化エチジウム)も含む。リバースプライマーは、過剰のフォワードプライマー中に存在するか、又はその逆であり、非対称性増幅を可能にする。ポリヌクレオチドは増幅され、反応は増幅の指数期410を通って進行し、二本鎖産物405を産生し、増幅の直線期411を通って進行し、一本鎖産物406を産生する。
液滴を、増幅されたポリヌクレオチドを含む液滴を収集するための蛍光支援細胞選別装置(FACS)412上で選別する。部分相補ユニバーサル配列407をパーティションに添加し、部分的にアニーリングしたフォーク型構造413を生成する。部分相補ユニバーサル配列407は、第2の固定化領域408及び第2の配列決定プライマー領域409を含み、後者は配列決定しようとするポリヌクレオチド標的上のA突出部と適合するT突出部を含む(示さない)。
(実施例2)
フラグメンターゼを用いる断片化及びバーコード化
第1の固定化領域402、バーコード領域403、及び第1の配列決定プライマー領域404を含む一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列(例えば、図4の401)を、実施例1、又は本開示に記載される任意の他の方法に記載のように合成、区分化、増幅、及び選別する。界面重合を一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列を含む液滴上で実施して、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列406のライブラリーを含む複数のカプセルを生成し、ここで、ライブラリー中のそれぞれ(又は多く)の配列はその対応するバーコード領域403の配列において異なる。したがって、封入された一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチドのライブラリーが生成される。
2つの混合物を調製する。混合物Z1は、標的ポリヌクレオチド(すなわち、断片化及びバーコード化しようとするポリヌクレオチド)、フラグメンターゼ酵素(例えば、NEBNEXT DSDNA FRAGMENTASE)、及び部分相補ユニバーサル配列(例えば、図4の407)を含む。第2の混合物Z2は、上記のように生成された、封入された一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチドのライブラリーと、フラグメンターゼ酵素を活性化するのに十分な濃度の塩化マグネシウムとを含む。混合物Z1、Z2、又はZ1とZ2の両方はまた、T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、及び熱安定性リガーゼも含む。
混合物Z1及びZ2を混合し、カプセル内カプセルを、フローフォーカシングなどの、本開示の他の場所に記載の方法に従って形成させる。図5は、上記の方法に従って生産されるカプセル内カプセルを例示するものである。外側カプセル501は、内側カプセル502と媒体504とを含む。内側カプセル502は、封入された一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチドのライブラリーの1メンバーである。したがって、内側カプセル502は、複数のコピーの一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド503を含み、外側カプセル501などのパーティション内のポリヌクレオチドに同じバーコードを結合させるために用いることができる。
媒体504は、上記の混合物Z1及びZ2の内容物を含有する。より特には、媒体504は、標的ポリヌクレオチド505、部分相補ユニバーサル配列506、並びにフラグメンターゼ、T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、熱安定性リガーゼ、塩化マグネシウム、及び適切なバッファーを含む酵素ミックス507を含む。
カプセル内カプセルの生成、及び適切な条件へのカプセル内カプセルの曝露の際に、酵素は標的ポリヌクレオチドをプロセッシングする。より特には、フラグメンターゼは標的ポリヌクレオチドを断片化し、T4ポリメラーゼは断片化された標的ポリヌクレオチドの末端を平滑化する。次いで、フラグメンターゼ及びT4ポリメラーゼを熱不活化し、刺激を用いて内側カプセル502を破裂させ、その内容物を外側カプセル501中に放出させる。Taqポリメラーゼは断片化され、平滑末端化された標的ポリヌクレオチドに3'-A突出部を付加する。一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド503は、部分相補ユニバーサル配列506とハイブリダイズし、断片化された標的ポリヌクレオチド上の3'-A突出部と適合する3'-T突出部を有するフォーク型アダプターを形成する。熱安定性リガーゼは、フォーク型アダプターを断片化された標的ポリヌクレオチドにライゲートし、バーコード化された標的ポリヌクレオチドを生成する。次いで、外側カプセル501を破裂させ、全ての外側カプセルに由来する試料をプールし、標的ポリヌクレオチドを配列決定する。次いで、配列決定の前に、必要に応じて追加の調製工程(例えば、バルク増幅、サイズ選択など)を実施してもよい。
いくつかの場合、混合物Z1は、複数のバージョンの部分相補ユニバーサル配列506を含み、ここで各バージョンはそれ自身、試料特異的バーコードを有する。
更に、上記の例はバーコード配列を含むフォーク型アダプターを標的ポリヌクレオチドに結合させるために熱安定性リガーゼを用いるが、本開示の他の場所に記載のように、PCRを用いてこの工程を達成することもできる。
(実施例3)
超音波処理による断片化及びバーコード化
封入された一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチドのライブラリーを、実施例2に記載のように、又は本開示に記載の任意の他の好適な方法により生成する。標的ポリヌクレオチド(すなわち、断片化しようとするポリヌクレオチド)を、カプセル中に区分化する。標的ポリヌクレオチドを含むカプセルを、超音波ストレスに耐えるように構成する。標的ポリヌクレオチドを含むカプセルを、超音波ストレス(例えば、COVARIS Focused-Ultrasonicator)に曝露し、標的ポリヌクレオチドを断片化し、断片化された標的ポリヌクレオチドカプセルを生成する。
封入された一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチドのライブラリー(例えば、図4:406)、断片化された標的ポリヌクレオチドカプセル、部分相補ユニバーサル配列(例えば、図4:407)、酵素混合物(T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、及び熱安定性リガーゼ)、並びに適切なバッファーを含む混合物Z1を調製する。カプセル内カプセルを、フローフォーカシングなどの、本開示の他の場所に記載の方法に従って生成する。
図6は、上記の方法に従って生産されるカプセル内カプセルを例示するものである。外側カプセル601は、複数の内側カプセル602及び605並びに媒体604を含む。内側カプセル602及び605は、それぞれ、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド603を含むカプセルと、断片化された標的ポリヌクレオチド606を含むカプセルとを含む。内側カプセル602は、複数のコピーの一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド603を含み、これを用いて、内側カプセル605内に含有される断片化された標的ポリヌクレオチド606などの、パーティション内のポリヌクレオチドに同じバーコードを結合させることができる。
媒体604は、上記の混合物Z1の内容物を含有する。より特には、媒体604は、部分相補ユニバーサル配列607、酵素混合物(T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、及び熱安定性リガーゼ)608、並びに適切なバッファーを含む。
断片化された標的ポリヌクレオチド606を含む内側カプセル605を刺激に曝露してそれらを破裂させ、その内容物を外側カプセル601の内容物中に放出させる。T4ポリメラーゼは断片化された標的ポリヌクレオチドの末端を平滑化する;Taqポリメラーゼは断片化された、平滑末端化された標的ポリヌクレオチドに3'-A突出部を付加する。次いで、T4ポリメラーゼ及びTaqポリメラーゼを熱不活化し、刺激を印加して内側カプセル602の内容物を外側カプセル601中に放出させる。一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド603は、部分相補ユニバーサル配列607とハイブリダイズし、断片化された標的ポリヌクレオチド上の3'-A突出部と適合する3'-T突出部を有するフォーク型アダプターを形成する。熱安定性リガーゼは、フォーク型アダプターを断片化された標的ポリヌクレオチドにライゲートし、バーコード化された標的ポリヌクレオチドを生成する。次いで、外側カプセル601を破裂させ、全ての外側カプセルからの試料をプールし、標的ポリヌクレオチドを配列決定する。
実施例2に記載のように、いくつかの場合、Z1は複数のバージョンの部分相補ユニバーサル配列607を含んでもよい。更に、本実施例は熱安定性リガーゼを用いることによって標的ポリヌクレオチドのバーコード化を証明するものであるが、PCRを用いてこの工程を達成することもできる。
(実施例4)
単一プライマー等温増幅(SPIA)及び制限消化によるフォーク型アダプターの生成
本実施例は、SPIA及び制限消化によるフォーク型アダプターの合成を証明するものである。図7は、本実施例の方法に従って生成することができる産物(又は中間体)の例を提供する。図7を参照すれば、本開示の他の場所に記載のフォーク型アダプターの前駆体として用いることができるヘアピンアダプター701(配列番号2)が示される。本実施例において、ヘアピンアダプターを、SPIAを用いて一本鎖増幅産物として合成する。ヘアピンアダプター701は、二本鎖領域702、ATライゲーションのための3'-T突出部703、及び制限酵素により切断することができる領域704(すなわち、位置33と34の間)を含む。ヘアピンアダプターは、バーコード領域と、固定化領域及び配列決定プライマーのアニーリングのための領域などの機能的領域とを含んでもよい。
アダプターの切断(例えば、位置33と34の間)は、図8aに記載のフォーク型アダプターを生成する(配列番号3〜4)。切断しようとする領域と相補的なオリゴヌクレオチド配列を導入し、アニーリングしたアダプターを制限酵素に曝露することにより、このアダプターを切断する。図8aに記載のフォーク型アダプター領域の、標的ポリヌクレオチドへのライゲーションは、図8bに記載の構造をもたらす(配列番号5〜6)。図8を参照すれば、図8b中の配列の下線部分は、図8aに記載のフォーク型アダプターとのライゲーションに適合する3'-A突出部を有する標的ポリヌクレオチドを含む。
次いで、図8bに示される配列(配列番号5〜6)を、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、図8cに示される、配列番号7(配列番号5の増幅産物)及び配列番号8(配列番号6の増幅産物)を産生させる。図8cにおいて、配列番号7は、第1の固定化配列(下線付き5'部分)及び第2の固定化配列(下線付き3'部分)を配列番号5に付加する、配列番号5の増幅産物である。配列番号8は、配列番号6の非ハイブリダイズ部分を異なる配列(下線付き3'部分及び下線付き5'部分)で置き換える配列番号6の増幅産物である。更に、配列番号8は、ポリヌクレオチドの5'非ハイブリダイズ領域内に6つのヌクレオチドバーコード(TAGTGC;太字)を含む。したがって、増幅産物は、バーコード化された標的ポリヌクレオチド配列(111で表される)、固定化配列、及びバーコードを含む。
(実施例5)
単一プライマー等温増幅(SPIA)及び制限消化による更なるフォーク型アダプター
本実施例は、NがA、T、G又はCを表す、SPIA及び制限消化による図9aに記載のフォーク型アダプター(配列番号9〜10)の合成を証明するものである。図9bは、一本鎖形式のフォーク型アダプター(配列番号11)を示し、ここで一本鎖形式はヘアピン構造を形成することができる。星印で示される位置でのヘアピン構造の切断により、図9aに示されるフォーク型アダプターが得られる。
SPIAのための鋳型は、図9cに示される配列である(配列番号12)。図9cにおいて、「R」はRNAの領域を表す。図9dは、図9c中の配列により形成されるヘアピン構造を示す。図9d中の配列(配列番号12)をポリメラーゼで処理して、ヌクレオチドを3'末端に付加し、図9eに示される配列を生成する(配列番号13)。次いで、図9e中の配列(配列番号13)を、DNAにハイブリダイズしたRNAを分解するRNase Hで処理して、図9f中の配列(配列番号14)を得る。
次いで、鎖置換SPIAを、配列番号14に対して実施する。鎖置換増幅におけるプライマーは、RRRRRRRRRRRRR(すなわち、R13)の形態のものである。このプライマーは、配列番号14のハイブリダイズしない3'末端よりも1塩基長いRNAプライマーである(すなわち、N12)(図9f)。より特には、図9fに示されるように、配列番号14の3'末端は、12個のNヌクレオチドを含有する。RNAプライマーは13個のヌクレオチドを含有する。RNAプライマーのヌクレオチド2〜13は、配列番号14の12個のハイブリダイズしないNヌクレオチドと相補的である。RNAプライマーのヌクレオチド1は、第1のハイブリダイズした塩基(3'から5'に向かう)、この場合、Tと相補的である。RNAプライマーはAを置換し、図9gに示される二本鎖伸長産物を生成する(配列番号15〜16)。ただ1つのプライマーが存在するため、反応は複数のコピーの一本鎖産物を産生する。一本鎖増幅産物をRNase Hで処理して、図9hに示される一本鎖増幅産物を生成する(配列番号17)。図9iは、5'-3'形式でのこの配列(配列番号17)を示す。図9jは、ヘアピン形式でのこの配列(配列番号17)を示す。
次いで、図9jに示されるヘアピンアダプターを、3'-A突出部を有する断片化されたポリヌクレオチドにライゲートする。ヘアピンを、その領域と相補的なオリゴヌクレオチドを付加し、制限酵素で切断することにより、図9j中の曲線で隔てられたAとC残基の間で切断する。これにより、フォーク型アダプターが生成される。次いで、実施例4に記載のようにPCR増幅を行って、固定化領域及びバーコードを、標的ポリヌクレオチドに結合されるフォーク型アダプターに付加する。
(実施例6)
指数的PCR及びハイブリダイゼーションによるバーコードを含むフォーク型アダプターの生成
本実施例は、ハイブリダイゼーションによるバーコードを含むフォーク型アダプターの生産を証明する。図10aは、図8aに提供される例示的フォーク型アダプターを示す。実施例4に記載されたように、このアダプターを標的ポリヌクレオチドにライゲートした後、増幅反応を実施して、バーコードを含む更なる機能的配列を付加することができる。しかしながら、バーコード(及び他の機能的配列)をフォーク型アダプター中に直接組み込んだ後、フォーク型アダプターを標的ポリヌクレオチドに結合することもできる。例えば、図10bは、第1の固定化領域(下線付き)及び7ヌクレオチドのバーコード領域(太字/下線付き;「N」)の付加と共に、図10aのフォーク型アダプターを示す。
図10bのバーコード化されたフォーク型アダプターを、最初に一本鎖として配列番号18を合成することにより生産する。バーコード領域における多様性を、本開示を通して記載されるように、A、G、T及びCの等モル混合物を用いて生成する。実施例1に記載のように、液滴に基づくPCRを実施する。しかしながら、1つのDNAプライマーと1つのRNAプライマーとを用いて、液滴中の配列番号18を増幅する。増幅を、挿入染料の存在下で行い、増幅された配列番号18を含む液滴を、実施例1に記載のように単離する。図10cは、二本鎖増幅産物を示す。配列番号19の下線部分は、RNAプライマーから誘導されるRNA鎖である。次いで、図10cに示される配列を、下線付きのRNA領域を消化するRNase Hで処理し、図10dに示される構築物を得る。フォーク型構築物を生成するために、部分相補ユニバーサル配列(配列番号21)を図10dに示される構築物に付加して、図10eに示される産物を生産する。このプロセスを用いる利点は、それがSPIAにより提供されるポリヌクレオチドの線形増幅に対して指数的PCRにより提供されるポリヌクレオチドの有意により高い増幅を用いる点である。
(実施例7)
二重指標化手法
本実施例は二重指標読取りのためのバーコードの合成のための手法を証明する。二重指標読取りは、それぞれの鎖に結合したバーコードを用いる、二本鎖断片の両方の鎖の読取りである。図11は、二重指標化種法のためのバーコードの合成の一例及びカプセル構成におけるカプセル中のバーコードの使用例を示す。
図11aに示されるように、第1の固定化領域1102、第1のバーコード領域1103、及び第1の配列決定プライマー領域1104を含む第1の一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列1101を合成する。平行して、図11bに示されるように、第2の固定化領域1132、第2のバーコード領域1133、及び第2の配列決定プライマー領域1134を含む第2の一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列1131を合成する。いくつかの場合、バーコード領域1103及び1133は同じ配列のものである。他の場合、バーコード領域1103及び1133は、異なる配列のものであるか、又は部分的に異なる配列のものである。
合成後、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド1101(図11a)及び1131(図11b)を、平行して、油中水乳濁液中の水性液滴中に希釈する。液滴はまた、非対称性PCRによる、それぞれ、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド1101(図11a)及び1131(図11b)の増幅のための試薬(例えば、ポリメラーゼ、プライマー、dNTP、バッファー、塩)並びにDNA挿入染料(例えば、臭化エチジウム)も含む。リバースプライマーは過剰のフォワードプライマー中に存在するか、又はその逆であり、非対称性増幅を可能にする。ポリヌクレオチド1101(図11a)及び1131(図11b)が増幅され、反応は増幅の指数期1110を通って進行し、二本鎖産物1105(図11a)及び1135(図11b)を産生し、増幅の直線期1111を通って進行し、それぞれ、一本鎖産物1106(図11a)及び1136(図11b)を産生する。
液滴を、蛍光支援細胞選別装置(FACS)1112上で選別して、増幅されたポリヌクレオチドを含む液滴を収集する。
次いで、界面重合を、それぞれ、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列1106及び1136の液滴を含む液滴上で実施して、それぞれ、一本鎖アダプターバーコードポリヌクレオチド配列1106又は1136の1つをそれぞれ含む、2つの型のカプセル1120(図11a)及び1150(図11b)を生成する。
2つの混合物を調製する。混合物Z1は、標的ポリヌクレオチド(すなわち、断片化及びバーコード化しようとするポリヌクレオチド)1170と、フラグメンターゼ酵素(例えば、NEBNEXT DSDNA FRAGMENTASE)とを含む。第2の混合物Z2は、上記のように生成されたカプセル1120及び1180と、フラグメンターゼ酵素を活性化するのに十分な濃度の塩化マグネシウムとを含む。混合物Z1、Z2、又はZ1とZ2の両方はまた、T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、及び熱安定性リガーゼも含む。
混合物Z1及びZ2を混合し、フローフォーカシングなどの本開示の他の場所に記載の方法に従ってカプセル内カプセルを形成させる。図11cは、上記の方法に従って生産されるカプセル内カプセルを例示する。外側カプセル1160は、カプセル1120及び1150並びに媒体1190を含む。したがって、カプセル1120及び1150はそれぞれ、複数コピーの一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド1106及び1136をそれぞれ含み、これを用いてバーコード1103及び1133を、外側カプセル1160の媒体1190中の標的ポリヌクレオチド1170などの、パーティション内のポリヌクレオチドに結合させることができる。
媒体1190は、上記の混合物Z1及びZ2の内容物を含有する。より特には、媒体1190は、標的ポリヌクレオチド1170と、フラグメンターゼ、T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、熱安定性リガーゼ、塩化マグネシウム、及び適切なバッファーを含む酵素ミックス1180とを含む。
カプセル内カプセルの生成、及び適切な条件へのカプセル内カプセルの曝露の際に、酵素は標的ポリヌクレオチドをプロセッシングする。より特には、フラグメンターゼは標的ポリヌクレオチドを断片化し、T4ポリメラーゼは断片化された標的ポリヌクレオチドの末端を平滑化する。次いで、フラグメンターゼ及びT4ポリメラーゼを熱不活化し、刺激を用いてカプセル1120及び1150を破裂させ、その内容物を外側カプセル1160の媒体1190中に放出させる。Taqポリメラーゼは、断片化された平滑末端化された標的ポリヌクレオチドに3'-A突出部を付加する。一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド1106は、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド1136とハイブリダイズし、断片化された標的ポリヌクレオチド上の3'-A突出部(示さない)と適合する3'-T突出部を有する、バーコード領域1103及び1133を含むフォーク型アダプターを形成する。熱安定性リガーゼは、フォーク型アダプターを、断片化された標的ポリヌクレオチドにライゲートし、バーコード化された標的ポリヌクレオチドを生成する。次いで、外側カプセル1160を破裂させ、全ての外側カプセルからの試料をプールし、標的ポリヌクレオチドを配列決定する。
更に、上記の例はバーコード配列を含むフォーク型アダプターを標的ポリヌクレオチドに結合させるために熱安定性リガーゼを用いるが、本開示の他の場所に記載のように、PCRを用いてこの工程を達成することもできる。
(実施例8)
ビーズエマルジョンPCR及び部分相補ユニバーサル配列の付加によるバーコード配列を含むフォーク型アダプターの生産
図14aに示されるように、第1の固定化領域1402、バーコード領域1403、及び第1の配列決定プライマー領域1404を含む一本鎖アダプター-バーコード配列1401を合成する。合成後、一本鎖アダプター-バーコード配列1401を、各液滴が平均で1個のポリヌクレオチドを含むように、油中水乳濁液中の水性液滴中に希釈する。液滴はまた、光不安定リンカーにより、第1の配列決定プライマー領域1404中に含まれる配列と相補的な、1つ又は複数のコピーのRNAプライマー1406に連結される第1のビーズ1405;第1の固定化領域1402中に含まれる配列(示さない)と相補的なDNAプライマー;及び一本鎖アダプター-バーコード配列1401の増幅にとって必要な試薬(例えば、ポリメラーゼ、dNTP、バッファー、塩)も含む。両方とも第1のビーズ1405に結合して構造1420を形成し、溶液中(示さない)にある、二本鎖産物1408を産生するポリヌクレオチドを増幅する1407。
次いで、乳濁液を破壊し、乳濁液成分をプールして産物混合物を形成させる。図14bに示されるように、次いで、遊離したビーズを適切な媒体で数回洗浄1409(遠心分離による)し、水酸化ナトリウム(NaOH)1410で処理して、第1のビーズ1405に結合した二本鎖産物を変性させた後、更に洗浄する1411。構造1420の変性1410及び洗浄1411の後、得られる構造1430は、相補的固定化領域1413、相補的バーコード領域1414、及び相補的配列決定プライマー領域1415を含む、一本鎖アダプター-バーコード配列1401に対する一本鎖相補体1412を含む。示されるように、相補的配列決定プライマー領域1415は、RNAプライマー1406を含む。次いで、構造1430を適切な媒体中に再懸濁する。
次に、図14cに示されるように、相補的固定化領域1413と相補的な1又は複数のコピーのDNAポリヌクレオチド1417を含む第2のビーズ1416を、媒体に添加する。相補的DNAポリヌクレオチド1417及び一本鎖相補体1412の相補的固定化領域1413を介して、第2のビーズ1416は一本鎖相補体1412に結合する。ここで、一本鎖相補体は、第1のビーズ1405の一方の末端で結合し、他方の末端で第2のビーズ1416は構造1440を形成する。
図14dに示されるように、次いで、構造1440を、グリセロール勾配を用いて遠心分離1418し、構造1440中に含まれない構造1430から構造1440を分離する。第2のビーズ1416が磁気ビーズである場合、磁気分離を代替手段として用いることができる。次いで、産物をNaOH 1419で処理して、第2のビーズ1416に由来する一本鎖相補体1412を変性させ、構造1430の再生を得る。次いで、構造1430を数回の洗浄(遠心分離による)にかけ、第2のビーズ1416を除去する。構造1430に結合した一本鎖相補体1412は、一本鎖バーコードアダプターである。
図14eに示されるように、一本鎖相補体1412を用いて、フォーク型アダプターを生成することができる。次いで、フォーク型アダプター1450を生成するために、一本鎖相補体1412を、光を用いて構造1430から放出1424させた後、ユニバーサル相補配列1426と混合1425するか、又は最初にユニバーサル相補配列1426と混合1425した後、構造1430から放出1424させる。ライゲーション可能な末端を生成するために、RNAase Hを用いて、一本鎖相補体1412のRNAプライマー1406を消化し、II型制限酵素を用いてユニバーサル相補配列1426上の単一塩基T突出部を生成する。T突出部は、配列決定しようとするポリヌクレオチド標的上のA突出部と適合する(示さない)。
(実施例9)
ビーズエマルジョンPCR及び部分相補ユニバーサル配列の付加によるバーコード配列を含むフォーク型アダプターの生産
図15aに示されるように、第1の固定化領域1502、バーコード領域1503、及び第1の配列決定プライマー領域1504を含む一本鎖アダプター-バーコード配列1501を合成する。合成後、一本鎖アダプター-バーコード配列1501を、各液滴が平均で1個のポリヌクレオチドを含むように、油中水乳濁液中の水性液滴中に希釈する。液滴はまた、光不安定リンカーにより、第1の固定化領域1502中に含まれる配列と相補的な、1つ又は複数のコピーのRNAプライマー1506に連結される第1のビーズ1505;第1の配列決定プライマー領域1502中に含まれる配列(示さない)と相補的なDNAプライマー;及び一本鎖アダプター-バーコード配列1501の増幅にとって必要な試薬(例えば、ポリメラーゼ、dNTP、バッファー、塩)も含む。両方とも第1のビーズ1505に結合して構造1520を形成し、溶液中(示さない)にある、二本鎖産物1508を産生するポリヌクレオチドを増幅する1507。
次いで、乳濁液を破壊し、乳濁液成分をプールして産物混合物を形成させる。図15bに示されるように、次いで、遊離したビーズを適切な媒体で数回洗浄1509(遠心分離による)し、水酸化ナトリウム(NaOH)1510で処理して、第1のビーズ1505に結合した二本鎖産物を変性させた後、更に洗浄する1511。構造1520の変性1510及び洗浄1511の後、得られる構造1530は、相補的固定化領域1513、相補的バーコード領域1514、及び相補的配列決定プライマー領域1515を含む、一本鎖アダプター-バーコード配列1501に対する一本鎖相補体1512を含む。示されるように、相補的配列決定プライマー領域1515は、RNAプライマー1506を含む。次いで、構造1530を適切な媒体中に再懸濁する。
次に、図15cに示されるように、相補的配列決定プライマー領域1515と相補的な1又は複数のコピーのDNAポリヌクレオチド1517を含む第2のビーズ1516を、媒体に添加する。相補的DNAポリヌクレオチド1517及び一本鎖相補体1512の相補的配列決定プライマー領域1515を介して、第2のビーズ1516は一本鎖相補体1512に結合する。ここで、一本鎖相補体は、第1のビーズ1505の一方の末端で結合し、他方の末端で第2のビーズ1516は構造1540を形成する。
図15dに示されるように、次いで、構造1540を、グリセロール勾配を用いて遠心分離1518し、構造1540中に含まれない構造1530から構造1540を分離する。第2のビーズ1516が磁気ビーズである場合、磁気分離を代替手段として用いることができる。次いで、産物をNaOH 1519で処理して、第2のビーズ1516に由来する一本鎖相補体1512を変性させ、構造1530の再生を得る。次いで、構造1530を数回の洗浄(遠心分離による)にかけ、第2のビーズ1516を除去する。構造1530に結合した一本鎖相補体1512は、一本鎖バーコードアダプターである。
図15eに示されるように、一本鎖相補体1512を用いて、フォーク型アダプターを生成することができる。次いで、フォーク型アダプター1550を生成するために、一本鎖相補体1512を、場合により光を用いて構造1530から放出1524させた後、ユニバーサル相補配列1526と混合1525する。ライゲーション可能な末端を生成するために、II型制限酵素を用いてユニバーサル相補配列1526上の単一塩基T突出部を生成する。T突出部は、配列決定しようとするポリヌクレオチド標的上のA突出部と適合する(示さない)。
(実施例10)
ビーズエマルジョンPCRによるフォーク型アダプター鋳型バーコード配列及びそれから誘導されるアダプターの生産
図16に示されるように、一本鎖アダプター-バーコード配列1602に結合した磁気ビーズ(1601)を含む構造1600を、実施例8、実施例9に記載の方法、又は本明細書に記載の任意の他の方法に従って生産する。次に、構造1600を、本明細書に記載の方法、例えば、界面重合によりカプセル(又は或いは、別の乳濁液)1620中に区分化する。カプセル1620はまた、非対称性PCRによる、一本鎖アダプター-バーコード配列1602の増幅のための試薬(例えば、ポリメラーゼ、プライマー、dNTP、バッファー、塩)も含む。リバースプライマーは、過剰のフォワードプライマー中に存在するか、又はその逆であり、非対称性増幅を可能にする。一本鎖アダプター-バーコード配列1602は増幅1603され、反応は増幅の直線期1604を通って進行し、一本鎖バーコードアダプター-鋳型1602と相補的な、一本鎖アダプター産物1605を産生する。この時点で、カプセル1620は溶液中の一本鎖アダプター1605と、磁気ビーズ(1601)に結合した一本鎖アダプター-バーコード配列1602との両方を含む。次いで、カプセル1620を、磁気分離1606により、ビーズ(したがって、鋳型1602と一本鎖アダプター1605)を含まないものから分離する。カプセル1620を破裂させ、実施例9に記載のようにフォーク型アダプターを生成することができる。
(実施例11)
ビーズエマルジョンPCRを用いるバーコード化及びフラグメンターゼを用いる断片化
図17に示されるように、磁気ビーズ(1701)に結合した一本鎖アダプター-バーコード配列1702を含む構造1700を、実施例8、実施例9に記載の方法、又は本明細書に記載の任意の他の方法に従って生産する。界面重合を、構造1700を含む液滴上で実施し、光不安定リンカーを介して、ビーズ1701に結合した一本鎖アダプター-バーコード配列1702を含むカプセル1704を生成する。
2つの混合物を調製する。混合物Z1は、標的ポリヌクレオチド(すなわち、断片化及びバーコード化しようとするポリヌクレオチド)、フラグメンターゼ酵素(例えば、NEBNEXT DSDNA FRAGMENTASE)、及び部分相補ユニバーサル配列を含む。第2の混合物Z2は、上記のように生成されるカプセル1704と、フラグメンターゼ酵素を活性化するのに十分な濃度の塩化マグネシウムとを含む。混合物Z1、Z2、又はZ1とZ2の両方はまた、T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、及び熱安定性リガーゼも含む。
混合物Z1及びZ2を混合し、フローフォーカシングなどの、本開示の他の場所に記載の方法に従って、カプセル内カプセルを形成させる。図17は、上記の方法に従って生産されるカプセル内カプセルを例示する。外側カプセル1703は、内側カプセル1704と媒体1705とを含む。内側カプセル1704は、封入されたビーズ結合一本鎖バーコードアダプターのライブラリーの1メンバーである。したがって、内側カプセル1704は、複数コピーの構造1700を含み、これを用いて遊離一本鎖アダプター-バーコード配列1702を生成し、同じバーコードアダプターを、外側カプセル1703などのパーティション内ポリヌクレオチドに結合させることができる。
媒体1705は、上記の混合物Z1及びZ2の内容物を含有する。より特には、媒体1705は、標的ポリヌクレオチド1706、部分相補ユニバーサル配列1707、並びにフラグメンターゼ、T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、熱不安定性リガーゼ、塩化マグネシウム、及び適切なバッファーを含む酵素ミックス1708を含む。
カプセル内カプセルの生成、及び適切な条件へのカプセル内カプセルの曝露の際に、酵素は標的ポリヌクレオチドをプロセッシングする。より特には、フラグメンターゼは標的ポリヌクレオチドを断片化し、T4ポリメラーゼは断片化された標的ポリヌクレオチドの末端を平滑化する。次いで、フラグメンターゼ及びT4ポリメラーゼを熱不活化し、刺激を用いて内側カプセル1704を破裂させ、その内容物を外側カプセル1703中に放出させる。Taqポリメラーゼは、断片化された平滑末端化された標的ポリヌクレオチドに3'-A突出部を付加する。一本鎖アダプター-バーコード配列1702は、部分相補ユニバーサル配列1707とハイブリダイズし、光によりビーズから放出され、断片化された標的ポリヌクレオチド上の3'-A突出部と適合する3'-T突出部を有するフォーク型アダプターを形成する。熱安定性リガーゼは、フォーク型アダプターを断片化された標的ポリヌクレオチドにライゲートし、バーコード化された標的ポリヌクレオチドを生成する。次いで、外側カプセル1703を破裂させ、全ての外側カプセルからの試料をプールし、標的ポリヌクレオチドを配列決定する。必要に応じて、配列決定の前に、追加の調製工程(例えば、バルク増幅、サイズ選択など)を実施してもよい。
いくつかの場合、Z1は、複数のバージョンの部分相補ユニバーサル配列1707を含んでもよい。更に、本実施例は熱安定性リガーゼを用いることによる標的ポリヌクレオチドのバーコード化を証明するものであるが、PCRを用いてこの工程を達成することもできる。
(実施例12)
ビーズエマルジョンPCRを用いるバーコード化及び超音波処理による断片化
図18に示されるように、磁気ビーズ(1801)に結合した一本鎖アダプター-バーコード配列1802を含む構造1800を、実施例8、実施例9に記載の方法、又は本明細書に記載の任意の他の方法に従って生産する。界面重合を、構造1800を含む液滴上で実施して、光不安定リンカーを介して、ビーズ1801に結合した一本鎖アダプター-バーコード配列1802を含むカプセル1803を生成する。標的ポリヌクレオチド(すなわち、断片化しようとするポリヌクレオチド)を、カプセル1804中に区分化する。標的ポリヌクレオチドを含むカプセル1804を、超音波ストレスに耐えるように構成する。標的ポリヌクレオチドを含むカプセル1804を超音波ストレス(例えば、COVARIS Focused-Ultrasonicator)に曝露し、標的ポリヌクレオチドを断片化し、断片化された標的ポリヌクレオチドカプセルを生成する。
カプセル1803、断片化された標的ポリヌクレオチドカプセル1804、部分相補ユニバーサル配列1805、酵素混合物(T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、及び熱安定性リガーゼ)1806、並びに適切なバッファーを含む混合物Z1を調製する。フローフォーカシングなどの本開示の他の場所に記載の方法に従って、カプセル内カプセルを生成する。
図18は、上記の方法に従って生産されるカプセル内カプセルを例示する。外側カプセル1807は、カプセル1803及び1804と、媒体1808とを含む。内側カプセル1803及び1804は、それぞれ、構造1800を含むカプセルと、断片化された標的ポリヌクレオチド1809を含むカプセルとを含む。内側カプセル1803は複数コピーの構造1800を含み、これを用いて遊離一本鎖バーコードアダプター1802を生成し、同じバーコードアダプターを、内側カプセル1804内に含有される断片化されたポリヌクレオチド1809などの、パーティション内のポリヌクレオチドに結合することができる。
媒体1808は、上記の混合物Z1の内容物を含有する。より特には、媒体1808は、部分相補ユニバーサル配列1805、酵素混合物(T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、及び熱安定性リガーゼ)1806、並びに適切なバッファーを含む。
断片化された標的ポリヌクレオチド1809を含む内側カプセル1804を刺激に曝露して、それらを破裂させ、その内容物を外側カプセル1807の内容物中に放出させる。T4ポリメラーゼは断片化された標的ポリヌクレオチドの末端を平滑化する;Taqポリメラーゼは断片化された平滑末端化された標的ポリヌクレオチドに3'-A突出部を付加する。次いで、T4ポリメラーゼ及びTaqポリメラーゼを熱不活化し、刺激を印加して内側カプセル1803の内容物を外側カプセル1807中に放出させる。一本鎖アダプター-バーコード配列1802は部分相補ユニバーサル配列1805とハイブリダイズし、アダプターは光によりビーズから放出され、断片化された標的ポリヌクレオチド上の3'-A突出部と適合する3'-T突出部を有するフォーク型アダプターを形成する。熱安定性リガーゼは、フォーク型アダプターを断片化された標的ポリヌクレオチドにライゲートし、バーコード化された標的ポリヌクレオチドを生成する。次いで、外側カプセル1807を破裂させ、全ての外側カプセルからの試料をプールし、標的ポリヌクレオチドを配列決定する。
いくつかの場合、Z1は複数のバージョンの部分相補ユニバーサル配列1807を含んでもよい。更に、本実施例は熱安定性リガーゼを用いることによる標的ポリヌクレオチドのバーコード化を証明するものであるが、PCRを用いてこの工程を達成することもできる。
(実施例13)
複数のアニーリング及びルーピングに基づく増幅(MALBAC)を用いるバーコード化
図19aに示されるように、配列番号22を含むプライマーを調製する。このプライマーは、バーコード領域(「Barcode」と命名される)、プライマー配列決定領域(「PrimingSeq」と命名される)、及びA、T、C、又はGの任意の組合せを含んでもよい8ヌクレオチド可変領域(「NNNNNNNN」と命名される)を含む。図19に示されるプライマーを、パーティション(例えば、カプセル、乳濁液の液滴など)中に鎖置換活性を有するポリメラーゼ(例えば、Vent、exo + DeepVent、exo-DeepVent)と共に、標的ポリヌクレオチド(図19においてループで示される)と混合する。いくつかの場合、非鎖置換ポリメラーゼ(例えば、Taq、PfuUltra)を用いる。次いで、パーティションをMALBAC増幅にかける。適切なMALBACサイクリング条件は公知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるZongら、Science、338(6114)、1622〜1626頁(2012)に記載されている。
ループしたMALBAC産物を、配列番号23として図19bに示されるように生産する。ループしたMALBAC産物は図19aに示される元のプライマー、ループに向かうバーコード化しようとする標的ポリヌクレオチド、及び元のプライマー配列と相補的であり、それにハイブリダイズした領域を含む。パーティションを破壊し、内容物を回収する。いくつかの場合、複数のパーティションを生成する。パーティションを集合的に破壊し、それぞれの内容物を回収した後、プールする。
次に、図19bに示される生成されたMALBAC産物を、制限酵素(例えば、BfuCl又は同様のもの)で処理して、MALBAC産物上で4塩基対の突出部(この場合、斜体で示されるGATC)を生成する。この構造は配列番号24により表され、図19cに示される。図19d中に配列番号25として示されるフォーク型アダプターは、MALBAC産物上で生成される突出部と相補的な突出部(この場合、太字で示されるCTAG)を含む。フォーク型アダプターを図19c中のMALBAC産物と混合し、相補的領域がハイブリダイズする。熱安定性リガーゼを用いてフォーク型アダプターとMALBAC産物を一緒にライゲートして、所望の構造である図19eを配列番号26として形成させる。更なる増幅方法(例えば、PCR)を用いて、更なる領域(例えば、固定化領域、更なるバーコードなど)をフォーク型アダプターに付加することができる。
いくつかの場合、他の塩基対突出部(例えば、1塩基対突出部〜10塩基対突出部)が望ましいことがある。制限酵素を用いてこれらの突出部を生成し、必要に応じて、本明細書に記載のものなどの代替物として用いることができる。一例では、2塩基対突出部を、TaqαIを用いてMALBAC産物上で生成する。
代替手段として、RNAプライマー配列がバーコード領域の5'側に置かれ、RNAaseを用いて突出部を生成するように、図19aに示されるプライマーを設計することができる。図19fに示されるように、MALBAC産物1900は、バーコード領域1902の5'側に置かれたRNAプライマー配列1901を含む。MALBAC産物1900はまた、配列決定プライマー領域1903、標的ポリヌクレオチド1904、相補的配列決定プライマー領域1905、相補的バーコード領域1906、及びRNAプライマー配列1901と相補的な領域1907も含む。MALBAC産物1900をRNAse H 1908で処理し、RNAプライマー領域配列1901を消化して、MALBAC産物1900上で2〜6塩基対突出部1909を得て、構造1920を得る。次いで、構造1910上の突出部と相補的な領域を含むユニバーサル相補領域1910を構造1910に付加する。次いで、ユニバーサル相補領域1910は構造1920とハイブリダイズし、熱安定性リガーゼを用いてユニバーサル相補領域1910を構造1920にライゲートする。
(実施例14)
複数のアニーリング及びルーピングに基づく増幅(MALBAC)を用いるバーコード化
図20に示されるように、バーコード領域を含む鋳型2000を、例えば、界面重合又は本明細書に記載の任意の他の方法を用いて、カプセル2002中でのPCRにとって必要な薬剤2001と混合する。PCRを用いて、鋳型2000からMALBACプライマーを生成する。次に、カプセル2000を、バーコード化しようとする標的ポリヌクレオチド2005及びMALBAC増幅にとって必要な試薬2006(例えば、DeepVentポリメラーゼ、dNTP、バッファー)を含む混合物2004をも含む外側カプセル2003中に封入する。カプセル2002は、カプセル2002を破裂させるように設計された刺激へのカプセル2002の適切な曝露の際に破壊され、カプセル2002の内容物は混合物2004のものと混合する。標的ポリヌクレオチド2005のMALBAC増幅が開始し、図19fに1900として示されたものとして記載されたものと類似するMALBAC産物を産生する。
次いで、外側カプセル2003を適切な刺激を用いて破壊し、内容物を回収する。次いで、MALBAC産物を適切な制限酵素で処理し、実施例13に記載の物質中のフォーク型アダプターにカップリングさせる。次いで、更なる下流の調製工程(例えば、バルク増幅、サイズ選択など)を必要に応じて実施する。
(実施例15)
複数のアニーリング及びルーピングに基づく増幅(MALBAC)を用いるバーコード化
図21aに示されるように、MALBACプライマー2100を調製する。MALBACプライマー2100は、配列プライミング領域2101及び8ヌクレオチド可変領域2102を含む。プライマー2100を、パーティション(例えば、カプセル、乳濁液など)中に鎖置換活性を有するポリメラーゼ(例えば、Vent、exo + DeepVent、exo - DeepVent)と共に、標的ポリヌクレオチド2103と混合する。いくつかの場合、非鎖置換ポリメラーゼ(例えば、Taq、PfuUltra)を用いる。次いで、パーティションをMALBAC増幅2104にかける。
配列決定プライミング領域2101、標的ポリヌクレオチド2103、及び相補的配列プライミング領域2105を含む、ループしたMALBAC産物2110を生産する。次いで、図21b中に線形形態2120で示される、MALBAC産物2110を、配列決定プライマー領域2106、バーコード領域2107、及び固定化領域2108を含む別のプライマー2130と接触させる。プライマー2130を、非対称性デジタルPCRを用いて生産する。単一サイクルのPCRを用いて、プライマーを用いて、プライマー2130、及びしたがって、バーコード領域2107を含む二本鎖産物2140を生成する。
次いで、二本鎖産物2140を変性させた後、図21cに示される別のプライマー2150と接触させる。プライマー2150は、バーコード領域2109、配列決定プライマー領域2111、及び固定化領域2112を含む。プライマー2113及び2114の存在下で、更なるラウンドのPCRはバーコード領域2109を、バーコード領域2107に結合した標的ポリヌクレオチドの末端に付加することができる。次いで、更なる下流の調製工程(例えば、バルク増幅、サイズ選択など)を必要に応じて実施する。
(実施例16)
複数のアニーリング及びルーピングに基づく増幅(MALBAC)を用いるバーコード化
図22に示されるように、バーコード領域を含むプライマー鋳型2200を、例えば、界面重合又は本明細書に記載の任意の他の方法を用いて、カプセル2202中でのPCRにとって必要な試薬2201と混合する。次いで、PCRを用いて、鋳型2200からプライマーを生成する。次に、カプセル2202を、バーコード化しようとする標的ポリヌクレオチド2205、MALBAC増幅にとって必要な試薬2206(例えば、DeepVentポリメラーゼ、dNTP、バッファー)、及びバーコードを含まないMALBACプライマー2207(実施例15に記載のMALBACプライマー2100と類似する)を含む混合物2204をも含む外側カプセル2203中に封入する。標的ポリヌクレオチド2205のMALBAC増幅が開始し、図21a中に2110として示されるものとして記載されるものと類似するMALBAC産物を産生する。次いで、カプセル2202は、カプセル2202を破裂させるように設計された刺激へのカプセル2202の適切な曝露の際に破壊され、カプセル2202の内容物は混合物2204のものと混合する。単一サイクルのPCRを鋳型2200から生成されたプライマーを用いて開始させ、実施例15に記載のものと類似する、バーコード化産物を生成する。
次いで、外側カプセル2203を適切な刺激を用いて破壊し、内容物を回収する。次いで、更なる下流の調製工程(例えば、バルク増幅、サイズ選択、更なるバーコードの付加など)を必要に応じて実施する。
(実施例17)
トランスポザーゼ及びタグメンテーション(Tagmentation)を用いるバーコード化
図23に示されるように、実施例1に記載のように、又は本開示に記載の任意の他の方法により、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列2300を合成、区分化、増幅、及び選別する。界面重合を、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列を含む液滴上で実施して、カプセル2301を生成する。
2つの混合物を調製する。混合物Z1は、標的ポリヌクレオチド2302(すなわち、断片化及びバーコード化しようとするポリヌクレオチド)、トランスポゾーム2303、及び部分相補ユニバーサル配列2304を含む。第2の混合物Z2は、上記のように生成されたカプセル2301と、本明細書の他の場所に記載のようなPCRにとって必要な試薬2305とを含む。
混合物Z1及びZ2を混合し、フローフォーカシングなどの本開示の他の場所に記載される方法に従ってカプセル内カプセルを形成させる。図23は、上記の方法に従って生産されるカプセル内カプセルを例示する。外側カプセル2306は、カプセル2301と媒体2307とを含む。カプセル2301は、封入された一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチドのライブラリーの1メンバーである。したがって、カプセル2301は、複数コピーの一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列2300を含み、これを用いて同じバーコードを、外側カプセル2306などのパーティション内のポリヌクレオチドに結合させることができる。
媒体2307は、上記の混合物Z1及びZ2の内容物を含有する。より特には、媒体2307は、標的ポリヌクレオチド2302、部分相補ユニバーサル配列2304、及びホットスタートTaqなどの、PCRにとって必要な試薬2305を含む。
カプセル内カプセルの生成、及び適切な条件へのカプセル内カプセルの曝露の際に、トランスポゾームは標的ポリヌクレオチドをプロセッシングする。より特には、トランスポザーゼは、タグメンテーションを介して標的ポリヌクレオチドを断片化し、それを共通のプライミング配列でタグ付けする。次いで、タグ付けされた標的ポリヌクレオチドを加熱して、トランスポザーゼにより生成される標的ヌクレオチド中の任意のギャップを埋める。次いで、トランスポザーゼを熱不活化し、刺激を用いて内側カプセル2301を破裂させ、その内容物を外側カプセル2306中に放出させる。外側カプセル2306を95℃に加熱することにより、ホットスタートTaqを活性化する。反応を限定サイクルのPCRを用いて進行させ、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列2300を標的ポリヌクレオチド2302に付加する。次いで、外側カプセル2306を破裂させ、標的ポリヌクレオチドを配列決定する。
特定の実施を例示及び記載してきたが、それに対して様々な改変を加えることができ、それは本明細書で企図されることが上記から理解されるべきである。また、本発明は明細書内に提供される特定例によって限定されることを意図していない。本発明を上記の明細書を参照して記載してきたが、本明細書の好ましい実施形態の記載及び例示は、限定的な意味で解釈されることを意味しない。更に、本発明の全ての態様は、様々な条件及び変数に依存する本明細書に記載の特定の表現、構成又は相対的比率に限定されないことが理解されるべきである。本発明の実施形態の形態及び詳細における様々な改変は、当業者には明らかである。したがって、本発明は任意のそのような改変、変更及び等価物も包含することが企図される。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲及びその等価物内の方法及び構造がそれによって包含されることが意図される。
101 第1の固定化領域
102 第2の固定化領域
103 第1の配列決定プライマー領域
104 第2の配列決定プライマー領域
105 標的ポリヌクレオチド
106 フォーク型アダプター構造
201 第1の固定化領域
202 第2の固定化領域
203 第1の配列決定プライマー領域
204 第2の配列決定プライマー領域
205 バーコード(BC1)
206 バーコード(BC2)
207 バーコード(BC3)
401 一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列
402 第1の固定化領域
403 バーコード領域
404 第1の配列決定プライマー領域
405 二本鎖産物
406 一本鎖産物
407 部分相補ユニバーサル配列
408 第2の固定化領域
409 第2の配列決定プライマー領域
410 増幅の指数期
411 増幅の直線期
412 蛍光支援細胞選別装置(FACS)
413 部分的にアニーリングしたフォーク型構造
501 外側カプセル
502 内側カプセル
503 複数のコピーの一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド
504 媒体
505 標的ポリヌクレオチド
506 部分相補ユニバーサル配列
507 酵素ミックス
601 外側カプセル
602 内側カプセル
603 一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド
604 媒体
605 内側カプセル
606 断片化された標的ポリヌクレオチド
607 部分相補ユニバーサル配列
608 酵素混合物
701 ヘアピンアダプター
702 二本鎖領域
703 ATライゲーションのための3'-T突出部
704 制限酵素により切断することができる領域
1101 第1の一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列
1102 第1の固定化領域
1103 第1のバーコード領域
1104 第1の配列決定プライマー領域
1105 二本鎖産物
1106 一本鎖産物
1106 複数コピーの一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド
1110 増幅の指数期
1111 増幅の直線期
1112 蛍光支援細胞選別装置(FACS)
1120 カプセル
1131 第2の一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列
1132 第2の固定化領域
1133 第2のバーコード領域
1134 第2の配列決定プライマー領域
1135 二本鎖産物
1136 一本鎖産物
1136 複数コピーの一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド
1150 カプセル
1160 外側カプセル
1170 標的ポリヌクレオチド
1180 カプセル
1180 酵素ミックス
1190 媒体
1201 第1の液体
1202 第2の液体
1203 T連結部
1204 カプセル外殻が形成し始める
1301 第1の液体
1302 第2の液体
1303 T連結部
1304 第2のカプセル外殻が形成し始める
1401 一本鎖アダプター-バーコード配列
1402 第1の固定化領域
1403 バーコード領域
1404 第1の配列決定プライマー領域
1405 第1のビーズ
1406 RNAプライマー
1407 ポリヌクレオチドを増幅する
1408 二本鎖産物
1409 洗浄
1410 変性
1411 洗浄
1412 一本鎖相補体
1413 相補的固定化領域
1414 相補的バーコード領域
1415 相補的配列決定プライマー領域
1416 第2のビーズ
1417 DNAポリヌクレオチド
1418 遠心分離
1419 NaOH
1420 構造
1424 放出
1425 混合
1426 ユニバーサル相補配列
1430 構造
1440 構造
1450 フォーク型アダプター
1501 一本鎖アダプター-バーコード配列
1502 第1の固定化領域
1503 バーコード領域
1504 第1の配列決定プライマー領域
1505 第1のビーズ
1506 RNAプライマー
1507 ポリヌクレオチドを増幅する
1508 二本鎖産物
1509 洗浄
1510 水酸化ナトリウム(NaOH)
1511 洗浄
1512 一本鎖相補体
1513 相補的固定化領域
1514 相補的バーコード領域
1515 相補的配列決定プライマー領域
1516 第2のビーズ
1517 相補的DNAポリヌクレオチド
1518 遠心分離
1519 NaOH
1520 構造
1524 放出
1525 混合
1526 ユニバーサル相補配列
1530 構造
1540 構造
1550 フォーク型アダプター
1600 構造
1601 磁気ビーズ
1602 一本鎖アダプター-バーコード配列
1603 増幅
1604 増幅の直線期
1605 一本鎖アダプター、一本鎖アダプター産物
1606 磁気分離
1620 カプセル
1700 構造
1701 磁気ビーズ
1702 一本鎖アダプター-バーコード配列
1703 外側カプセル
1704 内側カプセル
1705 媒体
1706 標的ポリヌクレオチド
1707 部分相補ユニバーサル配列
1708 酵素ミックス
1800 構造
1801 磁気ビーズ
1802 一本鎖アダプター-バーコード配列
1803 内側カプセル
1804 内側カプセル、標的ポリヌクレオチドカプセル
1805 部分相補ユニバーサル配列
1806 酵素混合物
1807 外側カプセル
1808 媒体
1809 断片化された標的ポリヌクレオチド
1900 MALBAC産物
1901 RNAプライマー配列
1902 バーコード領域
1903 配列決定プライマー領域
1904 標的ポリヌクレオチド
1905 相補的配列決定プライマー領域
1906 相補的バーコード領域
1907 RNAプライマー配列と相補的な領域
1908 RNAse H
1909 塩基対突出部
1910 構造
1910 ユニバーサル相補領域
1920 構造
2000 鋳型
2001 薬剤
2002 カプセル
2003 外側カプセル
2004 混合物
2005 標的ポリヌクレオチド
2006 試薬
2100 MALBACプライマー
2101 配列プライミング領域
2102 8ヌクレオチド可変領域
2103 標的ポリヌクレオチド
2104 MALBAC増幅
2105 相補的配列プライミング領域
2106 配列決定プライマー領域
2107 バーコード領域
2108 固定化領域
2109 バーコード領域
2110 MALBAC産物
2111 配列決定プライマー領域
2112 固定化領域
2113 プライマー
2114 プライマー
2120 線形形態
2130 プライマー
2140 二本鎖産物
2150 プライマー
2200 鋳型
2201 試薬
2202 カプセル
2203 外側カプセル
2204 混合物
2205 標的ポリヌクレオチド
2206 試薬
2207 MALBACプライマー
2300 一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列
2301 カプセル、内側カプセル
2302 標的ポリヌクレオチド
2303 トランスポゾーム
2304 部分相補ユニバーサル配列
2305 試薬
2306 外側カプセル
2307 媒体

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  1. 明細書の記載のライブラリー。
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US61/840,403 2013-06-27
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Families Citing this family (230)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008109176A2 (en) 2007-03-07 2008-09-12 President And Fellows Of Harvard College Assays and other reactions involving droplets
CN101946010B (zh) 2007-12-21 2014-08-20 哈佛大学 用于核酸测序的系统和方法
US20110218123A1 (en) 2008-09-19 2011-09-08 President And Fellows Of Harvard College Creation of libraries of droplets and related species
EP3150724A1 (en) 2008-12-19 2017-04-05 President and Fellows of Harvard College Particle-assisted nucleic acid sequencing
WO2010104597A2 (en) 2009-03-13 2010-09-16 President And Fellows Of Harvard College Scale-up of microfluidic devices
US20120211084A1 (en) 2009-09-02 2012-08-23 President And Fellows Of Harvard College Multiple emulsions created using jetting and other techniques
CA2778816C (en) 2009-10-27 2018-07-31 President And Fellows Of Harvard College Droplet creation techniques
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
US20140057799A1 (en) 2010-12-16 2014-02-27 Gigagen System and Methods for Massively Parallel Analysis of Nucleic Acids in Single Cells
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
AU2012249759A1 (en) 2011-04-25 2013-11-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
JP6122843B2 (ja) 2011-05-23 2017-04-26 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 多重エマルジョンを含むエマルジョンの制御
US11177020B2 (en) 2012-02-27 2021-11-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and uses for molecular tags
AU2013226081B2 (en) 2012-02-27 2018-06-14 Becton, Dickinson And Company Compositions and kits for molecular counting
WO2013134261A1 (en) 2012-03-05 2013-09-12 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for epigenetic sequencing
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9388465B2 (en) 2013-02-08 2016-07-12 10X Genomics, Inc. Polynucleotide barcode generation
US10584381B2 (en) 2012-08-14 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
CN114891871A (zh) 2012-08-14 2022-08-12 10X基因组学有限公司 微胶囊组合物及方法
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP3567116A1 (en) 2012-12-14 2019-11-13 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
DK3553175T3 (da) 2013-03-13 2021-08-23 Illumina Inc Fremgangsmåde til fremstilling af et nukleinsyresekvenseringsbibliotek
DK3013983T3 (da) 2013-06-25 2023-03-06 Prognosys Biosciences Inc Spatialt kodede biologiske assays ved brug af en mikrofluidisk anordning
KR102402446B1 (ko) 2013-08-28 2022-05-30 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 대량의 동시 단일 세포 분석
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
US9582877B2 (en) 2013-10-07 2017-02-28 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
WO2015069634A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 President And Fellows Of Harvard College Microparticles, methods for their preparation and use
US9824068B2 (en) 2013-12-16 2017-11-21 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
US9694361B2 (en) 2014-04-10 2017-07-04 10X Genomics, Inc. Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same
US20150298091A1 (en) 2014-04-21 2015-10-22 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for barcoding nucleic acids
CN114214314A (zh) 2014-06-24 2022-03-22 生物辐射实验室股份有限公司 数字式pcr条码化
WO2015200891A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 10X Technologies, Inc. Processes and systems for nucleic acid sequence assembly
US10017759B2 (en) 2014-06-26 2018-07-10 Illumina, Inc. Library preparation of tagged nucleic acid
CN113249435A (zh) 2014-06-26 2021-08-13 10X基因组学有限公司 分析来自单个细胞或细胞群体的核酸的方法
CA2997906A1 (en) 2014-09-09 2016-03-17 The Broad Institute, Inc. A droplet-based method and apparatus for composite single-cell nucleic acid analysis
ES2925014T3 (es) * 2014-09-12 2022-10-13 Univ Leland Stanford Junior Identificación y uso de ácidos nucleicos circulantes
WO2016061517A2 (en) * 2014-10-17 2016-04-21 Illumina Cambridge Limited Contiguity preserving transposition
BR112017008877A2 (pt) 2014-10-29 2018-07-03 10X Genomics Inc métodos e composições para sequenciamento de ácido nucleico-alvo
US10060913B2 (en) 2016-09-19 2018-08-28 Massachusetts Institute Of Technology Systems including janus droplets capable of binding an analyte and changing orientation to provide a detectable change
US10005058B2 (en) * 2014-10-31 2018-06-26 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for arranging colloid phases
US11119098B2 (en) 2014-10-31 2021-09-14 Massachusetts Institute Of Technology Systems including Janus droplets
JP6914192B2 (ja) 2014-10-31 2021-08-04 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 乳剤形成のための組成および方法
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
US10900065B2 (en) 2014-11-14 2021-01-26 University Of Washington Methods and kits for labeling cellular molecules
AU2016207023B2 (en) 2015-01-12 2019-12-05 10X Genomics, Inc. Processes and systems for preparing nucleic acid sequencing libraries and libraries prepared using same
CN107209814B (zh) 2015-01-13 2021-10-15 10X基因组学有限公司 用于使结构变异和相位信息可视化的系统和方法
MX2017010142A (es) 2015-02-09 2017-12-11 10X Genomics Inc Sistemas y metodos para determinar variacion estructural y ajuste de fases con datos de recuperacion de variantes.
KR20170135834A (ko) * 2015-02-10 2017-12-08 일루미나, 인코포레이티드 세포 성분을 분석하기 위한 방법 및 조성물
US20180010176A1 (en) * 2015-02-13 2018-01-11 Abhijit Ajit Patel Methods for highly parallel and accurate measurement of nucleic acids
WO2016134078A1 (en) 2015-02-19 2016-08-25 Becton, Dickinson And Company High-throughput single-cell analysis combining proteomic and genomic information
WO2016137973A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 10X Genomics Inc Partition processing methods and systems
CN115651972A (zh) 2015-02-24 2023-01-31 10X 基因组学有限公司 用于靶向核酸序列覆盖的方法
EP3262192B1 (en) 2015-02-27 2020-09-16 Becton, Dickinson and Company Spatially addressable molecular barcoding
WO2016145416A2 (en) * 2015-03-11 2016-09-15 The Broad Institute, Inc. Proteomic analysis with nucleic acid identifiers
WO2016145409A1 (en) 2015-03-11 2016-09-15 The Broad Institute, Inc. Genotype and phenotype coupling
WO2016149096A1 (en) 2015-03-13 2016-09-22 President And Fellows Of Harvard College Determination of cells using amplification
CN113846144B (zh) 2015-03-17 2023-09-26 生物辐射实验室股份有限公司 检测基因组编辑
US20180073073A1 (en) * 2015-03-18 2018-03-15 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for labeling targets and haplotype phasing
WO2016160844A2 (en) 2015-03-30 2016-10-06 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for combinatorial barcoding
JP6828007B2 (ja) 2015-04-10 2021-02-10 スペーシャル トランスクリプトミクス アクチボラグ 生物学的試料の空間識別されるマルチプレックスな核酸分析
WO2016168351A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Robust quantification of single molecules in next-generation sequencing using non-random combinatorial oligonucleotide barcodes
JP2018511341A (ja) 2015-04-17 2018-04-26 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 遺伝子配列決定および他の適用のためのバーコード化システムおよび方法
CN114015569A (zh) 2015-04-21 2022-02-08 通用自动化实验技术公司 用于高通量微生物学应用的高分辨率系统、试剂盒、设备和方法
EP3286326A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for whole transcriptome amplification
JP2018518157A (ja) 2015-05-11 2018-07-12 イラミーナ インコーポレーテッド 治療薬剤の発見および分析のためのプラットフォーム
US11124823B2 (en) 2015-06-01 2021-09-21 Becton, Dickinson And Company Methods for RNA quantification
US9771575B2 (en) 2015-06-19 2017-09-26 Agilent Technologies, Inc. Methods for on-array fragmentation and barcoding of DNA samples
CN114350752A (zh) 2015-07-17 2022-04-15 纳米线科技公司 在横切面组织的用户定义区域中的基因表达的同时定量
EP3347465B1 (en) 2015-09-11 2019-06-26 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for nucleic acid library normalization
JP2018537414A (ja) 2015-10-13 2018-12-20 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ゲルマイクロスフェアの作製及び使用のためのシステム及び方法
CN108368522A (zh) 2015-10-20 2018-08-03 10X 基因组学有限公司 用于高通量单细胞遗传操作的方法和系统
US11111487B2 (en) * 2015-10-28 2021-09-07 Silicon Valley Scientific, Inc. Method and apparatus for encoding cellular spatial position information
WO2017075297A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. High-throughput dynamic reagent delivery system
WO2017075265A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute, Inc. Multiplex analysis of single cell constituents
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
SG11201803983UA (en) * 2015-11-19 2018-06-28 10X Genomics Inc Transformable tagging compositions, methods, and processes incorporating same
EP3384048B1 (en) 2015-12-04 2021-03-24 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
EP3387128A4 (en) * 2015-12-07 2019-12-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. MULTIPLEXING IN PARTITIONS USING MICROPARTICLES
CN105567562B (zh) * 2015-12-30 2017-10-03 中国科学院合肥物质科学研究院 用于单细胞超声波基因导入的微流体系统及其导入方法
JP6735348B2 (ja) 2016-02-11 2020-08-05 １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド 全ゲノム配列データのデノボアセンブリのためのシステム、方法及び媒体
US10633648B2 (en) 2016-02-12 2020-04-28 University Of Washington Combinatorial photo-controlled spatial sequencing and labeling
US20170283864A1 (en) * 2016-03-31 2017-10-05 Agilent Technologies, Inc. Use of transposase and y adapters to fragment and tag dna
US11162134B2 (en) * 2016-04-01 2021-11-02 Baylor College Of Medicine Methods of whole transcriptome amplification
US20190127789A1 (en) * 2016-04-19 2019-05-02 President And Fellows Of Harvard College Immobilization-based systems and methods for genetic analysis and other applications
ES2956757T3 (es) 2016-05-02 2023-12-27 Becton Dickinson Co Codificación con códigos de barras moleculares precisa
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
WO2017204294A1 (ja) * 2016-05-25 2017-11-30 株式会社ニコン 標的生体分子の特定方法、標的生体分子特定用ビーズ、ビーズのセット、及び標的生体分子特定装置
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
WO2017205691A1 (en) 2016-05-26 2017-11-30 Cellular Research, Inc. Molecular label counting adjustment methods
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
CN113151423A (zh) 2016-08-05 2021-07-23 生物辐射实验室股份有限公司 第二链引导
WO2018031631A1 (en) * 2016-08-10 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Methods of de novo assembly of barcoded genomic dna fragments
WO2018039338A1 (en) 2016-08-23 2018-03-01 10X Genomics, Inc. Microfluidic surface-mediated emulsion stability control
CA3034924A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Cellular Research, Inc. Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
ES2870639T3 (es) 2016-10-24 2021-10-27 Geneinfosec Inc Ocultación de información presente en los ácidos nucleicos
EP3538672A1 (en) 2016-11-08 2019-09-18 Cellular Research, Inc. Methods for cell label classification
EP3539035B1 (en) 2016-11-08 2024-04-17 Becton, Dickinson and Company Methods for expression profile classification
WO2018089641A2 (en) * 2016-11-10 2018-05-17 The Scripps Research Institute Encode solid phase compound library with polynucleotide based barcoding
EP3555290B1 (en) 2016-12-19 2022-11-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet tagging contiguity preserved tagmented dna
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP3568234B1 (en) 2017-01-13 2023-09-06 Cellular Research, Inc. Hydrophilic coating of fluidic channels
JP7033602B2 (ja) 2017-01-27 2022-03-10 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー ロングレンジ配列決定のためのバーコードを付けられたｄｎａ
CN117512066A (zh) 2017-01-30 2024-02-06 10X基因组学有限公司 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和系统
WO2018144240A1 (en) 2017-02-01 2018-08-09 Cellular Research, Inc. Selective amplification using blocking oligonucleotides
US10995333B2 (en) 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
EP3391958B1 (en) 2017-04-19 2020-08-12 The Procter & Gamble Company Method of making surface-coated water-absorbing polymer particles in a microfluidic device
US11072816B2 (en) 2017-05-03 2021-07-27 The Broad Institute, Inc. Single-cell proteomic assay using aptamers
JP7197567B2 (ja) 2017-05-05 2022-12-27 スキピオ バイオサイエンス ハイドロゲル中の個別の生物学的単位を捕捉およびバーコード付与するための方法
US10544413B2 (en) 2017-05-18 2020-01-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for sorting droplets and beads
EP4215616A1 (en) 2017-05-18 2023-07-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for sorting droplets and beads
CN110870018A (zh) 2017-05-19 2020-03-06 10X基因组学有限公司 用于分析数据集的系统和方法
CN109526228B (zh) 2017-05-26 2022-11-25 10X基因组学有限公司 转座酶可接近性染色质的单细胞分析
US10400235B2 (en) 2017-05-26 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
WO2018226546A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 10X Genomics, Inc. Gaskets for the distribution of pressures in a microfluidic system
US10676779B2 (en) 2017-06-05 2020-06-09 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
SG11201912824YA (en) 2017-06-20 2020-01-30 10X Genomics Inc Methods and systems for improved droplet stabilization
CN111094585A (zh) * 2017-08-01 2020-05-01 伊鲁米纳公司 用于核苷酸测序的水凝胶珠
US20210032693A1 (en) 2017-08-10 2021-02-04 Rootpath Genomics, Inc. Improved Method to Analyze Nucleic Acid Contents from Multiple Biological Particles
US10357771B2 (en) 2017-08-22 2019-07-23 10X Genomics, Inc. Method of producing emulsions
WO2019040546A1 (en) * 2017-08-23 2019-02-28 Roche Sequencing Solutions, Inc ENZYME SCREENING METHODS
US10636761B2 (en) * 2017-08-29 2020-04-28 Electronics And Telecommunications Reearch Institute Method of fabricating a semiconductor package
US10748643B2 (en) 2017-08-31 2020-08-18 10X Genomics, Inc. Systems and methods for determining the integrity of test strings with respect to a ground truth string
CN109486923B (zh) * 2017-09-11 2022-02-18 广州永诺生物科技有限公司 多重扩增子测序用引物系统、其应用以及测序文库的构建方法
US10837047B2 (en) 2017-10-04 2020-11-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
US10590244B2 (en) 2017-10-04 2020-03-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
US11402400B2 (en) 2017-10-13 2022-08-02 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Partition liquid into samples
WO2019083852A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. MICROFLUIDIC CHANNEL NETWORKS FOR PARTITIONING
WO2019084043A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS
WO2019084165A1 (en) 2017-10-27 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR SAMPLE PREPARATION AND ANALYSIS
EP3704247B1 (en) 2017-11-02 2023-01-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Transposase-based genomic analysis
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
WO2019108851A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis
JP7049103B2 (ja) * 2017-12-11 2022-04-06 株式会社日立製作所 単一細胞の網羅的３’末端遺伝子発現解析法
WO2019126209A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Cellular Research, Inc. Particles associated with oligonucleotides
WO2019148042A1 (en) * 2018-01-26 2019-08-01 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
EP4324962A2 (en) 2018-01-31 2024-02-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for deconvoluting partition barcodes
KR20200121329A (ko) 2018-02-12 2020-10-23 나노스트링 테크놀로지스, 인크. 유전자 및 단백질 발현을 검출하는 생체 분자 프로브 및 방법
CN112005115A (zh) 2018-02-12 2020-11-27 10X基因组学有限公司 表征来自单个细胞或细胞群体的多种分析物的方法
US11639928B2 (en) 2018-02-22 2023-05-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
WO2019191900A1 (en) * 2018-04-03 2019-10-10 Burning Rock Biotech Compositions and methods for preparing nucleic acid libraries
EP3775271A1 (en) 2018-04-06 2021-02-17 10X Genomics, Inc. Systems and methods for quality control in single cell processing
ES2945191T3 (es) 2018-05-03 2023-06-29 Becton Dickinson Co Análisis de muestras multiómicas de alto rendimiento
EP3788170A1 (en) 2018-05-03 2021-03-10 Becton, Dickinson and Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
DE102018207098A1 (de) * 2018-05-08 2019-11-14 Robert Bosch Gmbh Mikrofluidische Vorrichtung und Verfahren zur Nanostruktur-Sequenzierung von Nukleotidsträngen
US11654404B2 (en) 2018-05-18 2023-05-23 Massachusetts Institute Of Technology Light emitting droplets and related methods
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
EP3841202B1 (en) 2018-08-20 2023-10-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleotide sequence generation by barcode bead-colocalization in partitions
CN112805389A (zh) 2018-10-01 2021-05-14 贝克顿迪金森公司 确定5’转录物序列
EP3877520A1 (en) 2018-11-08 2021-09-15 Becton Dickinson and Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
US11459607B1 (en) 2018-12-10 2022-10-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes
US11492660B2 (en) 2018-12-13 2022-11-08 Becton, Dickinson And Company Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
TWI725686B (zh) 2018-12-26 2021-04-21 財團法人工業技術研究院 用於產生液珠的管狀結構及液珠產生方法
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
WO2020150356A1 (en) 2019-01-16 2020-07-23 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
EP4242322A3 (en) 2019-01-23 2023-09-20 Becton, Dickinson and Company Oligonucleotides associated with antibodies
US11467153B2 (en) 2019-02-12 2022-10-11 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
SG11202108788TA (en) 2019-02-12 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for processing nucleic acid molecules
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
EP3923977A1 (en) 2019-02-12 2021-12-22 TheryCell GmbH Reverse immunosuppression
US11655499B1 (en) 2019-02-25 2023-05-23 10X Genomics, Inc. Detection of sequence elements in nucleic acid molecules
WO2020185791A1 (en) 2019-03-11 2020-09-17 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing optically tagged beads
EP3953489A1 (en) 2019-04-12 2022-02-16 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Conjugates having an enzymatically releasable detection moiety and a barcode moiety
CN113454018A (zh) * 2019-04-30 2021-09-28 惠普发展公司，有限责任合伙企业 微流体装置
US11939622B2 (en) 2019-07-22 2024-03-26 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
EP4018001A4 (en) * 2019-08-19 2023-09-13 Universal Sequencing Technology Corporation METHODS AND COMPOSITIONS FOR TRACKING THE ORIGIN OF NUCLEIC ACID FRAGMENTS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING
US11919000B2 (en) 2019-10-10 2024-03-05 1859, Inc. Methods and systems for microfluidic screening
EP4025711A2 (en) 2019-11-08 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
EP4055185A1 (en) 2019-11-08 2022-09-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
US11773436B2 (en) 2019-11-08 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company Using random priming to obtain full-length V(D)J information for immune repertoire sequencing
CN114729393A (zh) 2019-11-15 2022-07-08 美天施生物科技有限两合公司 用于单细胞索引的颜色和条码化珠
US11857981B2 (en) 2019-12-23 2024-01-02 10X Genomics, Inc. Magnetic separator for an automated single cell sequencing system
CN114885610A (zh) 2019-12-23 2022-08-09 10X基因组学有限公司 使用rna模板化连接进行空间分析的方法
AU2021208466A1 (en) 2020-01-13 2022-08-11 Fluent Biosciences Inc. Single cell sequencing
US11649497B2 (en) 2020-01-13 2023-05-16 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and RNA
US11512337B2 (en) 2020-01-13 2022-11-29 Fluent Biosciences Inc. Emulsion based drug screening
US11827936B2 (en) 2020-01-13 2023-11-28 Fluent Biosciences Inc. Methods and systems for single cell gene profiling
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
EP3859012A1 (en) * 2020-02-03 2021-08-04 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Methods for amplification of genomic dna and preparation of sequencing libraries
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
CN115461470A (zh) 2020-02-28 2022-12-09 10X基因组学有限公司 用于从组织中分离核和细胞的方法
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
EP4121016A1 (en) 2020-03-16 2023-01-25 Fluent Biosciences Inc. Multi-omic analysis in monodisperse droplets
CN115916972A (zh) 2020-04-16 2023-04-04 10X基因组学有限公司 用于被固定样品的组合物和方法
CN115916999A (zh) 2020-04-22 2023-04-04 10X基因组学有限公司 用于使用靶向rna耗竭进行空间分析的方法
US11701668B1 (en) 2020-05-08 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and devices for magnetic separation
US11851700B1 (en) 2020-05-13 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules
US11661625B2 (en) 2020-05-14 2023-05-30 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
EP4153775A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
AU2021275906A1 (en) 2020-05-22 2022-12-22 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
US11946038B1 (en) 2020-05-29 2024-04-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems including flow and magnetic modules
AU2021283174A1 (en) 2020-06-02 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
CN116249785A (zh) 2020-06-02 2023-06-09 10X基因组学有限公司 用于抗原-受体的空间转录组学
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
CN116034166A (zh) 2020-06-25 2023-04-28 10X基因组学有限公司 Dna甲基化的空间分析
EP4176437A1 (en) 2020-07-02 2023-05-10 10X Genomics, Inc. Systems and methods for detection of low-abundance molecular barcodes from a sequencing library
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
US20220017892A1 (en) * 2020-07-15 2022-01-20 Fluent Biosciences Inc. Tiered ligation oligos
CN115997126A (zh) 2020-09-07 2023-04-21 美天施生物科技有限两合公司 具有可酶促释放的检测部分和条形码部分的缀合物
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
US11739443B2 (en) 2020-11-20 2023-08-29 Becton, Dickinson And Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
AU2021409136A1 (en) 2020-12-21 2023-06-29 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
EP4298244A1 (en) 2021-02-23 2024-01-03 10X Genomics, Inc. Probe-based analysis of nucleic acids and proteins
EP4301870A1 (en) 2021-03-18 2024-01-10 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
WO2023014303A2 (en) * 2021-08-05 2023-02-09 Agency For Science, Technology And Research A method of amplification of a nucleic acid
EP4196605A1 (en) 2021-09-01 2023-06-21 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
EP4272764A1 (en) 2022-05-03 2023-11-08 Scipio Bioscience Method of complexing biological units with particles
KR102578493B1 (ko) 2023-04-26 2023-09-14 대한민국 적재용 선반

Family Cites Families (778)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1007137A (en) 1908-06-08 1911-10-31 Theodore D Palmer Cloth-pressing machine.
US1004111A (en) 1908-10-17 1911-09-26 Westinghouse Air Brake Co Fluid-pressure brake.
US1003026A (en) 1911-04-12 1911-09-12 Bernard Bartmann Bobbin-holder.
US1005998A (en) 1911-07-10 1911-10-17 Arthur Munchausen Berry-carrier.
US1005372A (en) 1911-08-11 1911-10-10 Albert Gay Plow-fender.
US2797149A (en) 1953-01-08 1957-06-25 Technicon International Ltd Methods of and apparatus for analyzing liquids containing crystalloid and non-crystalloid constituents
US3047367A (en) 1959-12-01 1962-07-31 Technicon Instr Automatic analysis with fluid segmentation
US3479141A (en) 1967-05-17 1969-11-18 Technicon Corp Method and apparatus for analysis
US4124638A (en) 1977-09-12 1978-11-07 Hansen John N Solubilizable polyacrylamide gels containing disulfide cross-linkages
US4253846A (en) 1979-11-21 1981-03-03 Technicon Instruments Corporation Method and apparatus for automated analysis of fluid samples
GB2097692B (en) 1981-01-10 1985-05-22 Shaw Stewart P D Combining chemical reagents
DE3230289A1 (de) 1982-08-14 1984-02-16 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Herstellung von pharmazeutischen oder kosmetischen dispersionen
US4582802A (en) 1983-09-30 1986-04-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Stimulation of enzymatic ligation of DNA by high concentrations of nonspecific polymers
JPS60227826A (ja) 1984-04-27 1985-11-13 Sogo Yatsukou Kk ｐＨに応答するグラフトカプセル
KR890003947B1 (ko) * 1985-12-11 1989-10-13 가부시기가이샤 시마즈세이사구쇼 세포융합장치
US4916070A (en) 1986-04-14 1990-04-10 The General Hospital Corporation Fibrin-specific antibodies and method of screening for the antibodies
US5418149A (en) 1990-07-24 1995-05-23 Hoffmann-La Roche Inc. Reduction of non-specific amplification glycosylase using DUTP and DNA uracil
US5618711A (en) 1986-08-22 1997-04-08 Hoffmann-La Roche Inc. Recombinant expression vectors and purification methods for Thermus thermophilus DNA polymerase
US4872895A (en) 1986-12-11 1989-10-10 American Telephone And Telegraph Company, At&T Bell Laboratories Method for fabricating articles which include high silica glass bodies
US5202231A (en) 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US5525464A (en) 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
US5149625A (en) 1987-08-11 1992-09-22 President And Fellows Of Harvard College Multiplex analysis of DNA
US5137829A (en) 1987-10-05 1992-08-11 Washington University DNA transposon TN5SEQ1
US5185099A (en) 1988-04-20 1993-02-09 Institut National De Recherche Chimique Appliquee Visco-elastic, isotropic materials based on water, fluorinate sufactants and fluorinated oils, process for their preparation, and their use in various fields, such as optics, pharmacology and electrodynamics
US5237016A (en) 1989-01-05 1993-08-17 Siska Diagnostics, Inc. End-attachment of oligonucleotides to polyacrylamide solid supports for capture and detection of nucleic acids
US6176962B1 (en) 1990-02-28 2001-01-23 Aclara Biosciences, Inc. Methods for fabricating enclosed microchannel structures
US5756334A (en) 1990-04-26 1998-05-26 New England Biolabs, Inc. Thermostable DNA polymerase from 9°N-7 and methods for producing the same
US5489523A (en) 1990-12-03 1996-02-06 Stratagene Exonuclease-deficient thermostable Pyrococcus furiosus DNA polymerase I
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
US5270183A (en) 1991-02-08 1993-12-14 Beckman Research Institute Of The City Of Hope Device and method for the automated cycling of solutions between two or more temperatures
US5994056A (en) 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
DE69213240T2 (de) 1991-07-04 1997-04-24 Immunodex K S Wasserlösliche reagenzien und konjugate auf polymerbasis, die vom divinylsulfon abgeleitete reste enthalten
DK0597960T3 (da) 1991-08-10 1999-09-13 Medical Res Council Behandling af cellepopulationer
EP0604552B1 (en) 1991-09-18 1997-02-12 Affymax Technologies N.V. Method of synthesizing diverse collections of oligomers
US5413924A (en) 1992-02-13 1995-05-09 Kosak; Kenneth M. Preparation of wax beads containing a reagent for release by heating
AU3816993A (en) 1992-03-19 1993-10-21 Regents Of The University Of California, The Multiple tag labeling method for DNA sequencing
US5587128A (en) 1992-05-01 1996-12-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification devices
CA2134475C (en) 1992-05-01 1999-07-06 Peter Wilding Polynucleotide amplification analysis using a microfabricated device
US5840865A (en) 1992-09-14 1998-11-24 Institute Of Molecular Biology And Biotechnology/Forth Eukaryotic transposable element
US5897783A (en) 1992-09-24 1999-04-27 Amersham International Plc Magnetic separation method
US5569364A (en) 1992-11-05 1996-10-29 Soane Biosciences, Inc. Separation media for electrophoresis
WO1994018218A1 (en) 1993-02-01 1994-08-18 Seq, Ltd. Methods and apparatus for dna sequencing
WO1994019101A1 (en) 1993-02-16 1994-09-01 Alliance Pharmaceutical Corp. Method of microemulsifying fluorinated oils
WO1994023699A1 (en) 1993-04-19 1994-10-27 Medisorb Technologies International L.P. Long-acting treatment by slow-release delivery of antisense oligodeoxyribonucleotides from biodegradable microparticles
US5456986A (en) * 1993-06-30 1995-10-10 Carnegie Mellon University Magnetic metal or metal carbide nanoparticles and a process for forming same
DE69429038T2 (de) 1993-07-28 2002-03-21 Pe Corp Ny Norwalk Vorrichtung und Verfahren zur Nukleinsäurevervielfältigung
EP0711303B2 (en) 1993-07-30 2009-06-10 Affymax, Inc. Biotinylation of proteins
EP0723549B1 (en) 1993-08-30 2003-12-17 Promega Corporation Nucleic acid purification compositions and methods
US5512131A (en) 1993-10-04 1996-04-30 President And Fellows Of Harvard College Formation of microstamped patterns on surfaces and derivative articles
US20030044777A1 (en) 1993-10-28 2003-03-06 Kenneth L. Beattie Flowthrough devices for multiple discrete binding reactions
US5605793A (en) * 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5558071A (en) 1994-03-07 1996-09-24 Combustion Electromagnetics, Inc. Ignition system power converter and controller
US5648211A (en) 1994-04-18 1997-07-15 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
WO1995031726A1 (en) 1994-05-11 1995-11-23 Genera Technologies Limited Methods of capturing species from liquids and assay procedures
US5705628A (en) 1994-09-20 1998-01-06 Whitehead Institute For Biomedical Research DNA purification and isolation using magnetic particles
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
US5585069A (en) 1994-11-10 1996-12-17 David Sarnoff Research Center, Inc. Partitioned microelectronic and fluidic device array for clinical diagnostics and chemical synthesis
WO1996029629A2 (en) 1995-03-01 1996-09-26 President And Fellows Of Harvard College Microcontact printing on surfaces and derivative articles
US5700642A (en) 1995-05-22 1997-12-23 Sri International Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers
HUP9900910A2 (hu) 1995-06-07 1999-07-28 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonukleotid jelzések osztályozáshoz és azonosításhoz
ATE375402T1 (de) 1995-06-07 2007-10-15 Solexa Inc Oligonukleotid-tags zur sortierung und identifizierung
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
US6866760B2 (en) 1998-08-27 2005-03-15 E Ink Corporation Electrophoretic medium and process for the production thereof
US5872010A (en) 1995-07-21 1999-02-16 Northeastern University Microscale fluid handling system
US6057149A (en) 1995-09-15 2000-05-02 The University Of Michigan Microscale devices and reactions in microscale devices
US5851769A (en) 1995-09-27 1998-12-22 The Regents Of The University Of California Quantitative DNA fiber mapping
US5736330A (en) 1995-10-11 1998-04-07 Luminex Corporation Method and compositions for flow cytometric determination of DNA sequences
US6051377A (en) 1995-11-30 2000-04-18 Pharmaseq, Inc. Multiplex assay for nucleic acids employing transponders
US5736332A (en) 1995-11-30 1998-04-07 Mandecki; Wlodek Method of determining the sequence of nucleic acids employing solid-phase particles carrying transponders
US6001571A (en) 1995-11-30 1999-12-14 Mandecki; Wlodek Multiplex assay for nucleic acids employing transponders
US6355198B1 (en) 1996-03-15 2002-03-12 President And Fellows Of Harvard College Method of forming articles including waveguides via capillary micromolding and microtransfer molding
WO1997039359A1 (en) 1996-04-15 1997-10-23 Dade International Inc. Apparatus and method for analysis
JP4468488B2 (ja) 1996-05-29 2010-05-26 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド 組み合せたリガーゼ検出およびポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸配列相違の検出
US5846727A (en) 1996-06-06 1998-12-08 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural & Mechanical College Microsystem for rapid DNA sequencing
ATE206633T1 (de) 1996-07-15 2001-10-15 Calcitech Ltd Herstellung von pulvern
US5965443A (en) 1996-09-09 1999-10-12 Wisconsin Alumni Research Foundation System for in vitro transposition
US5900481A (en) 1996-11-06 1999-05-04 Sequenom, Inc. Bead linkers for immobilizing nucleic acids to solid supports
US6133436A (en) 1996-11-06 2000-10-17 Sequenom, Inc. Beads bound to a solid support and to nucleic acids
US6379929B1 (en) 1996-11-20 2002-04-30 The Regents Of The University Of Michigan Chip-based isothermal amplification devices and methods
US5958703A (en) 1996-12-03 1999-09-28 Glaxo Group Limited Use of modified tethers in screening compound libraries
US20020172965A1 (en) 1996-12-13 2002-11-21 Arcaris, Inc. Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom
US20050042625A1 (en) 1997-01-15 2005-02-24 Xzillion Gmbh & Co. Mass label linked hybridisation probes
US6297006B1 (en) 1997-01-16 2001-10-02 Hyseq, Inc. Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments
US20020034737A1 (en) 1997-03-04 2002-03-21 Hyseq, Inc. Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
CN1251609A (zh) 1997-02-12 2000-04-26 尤金·Y·查恩 分析聚合物的方法和产品
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US6327410B1 (en) 1997-03-14 2001-12-04 The Trustees Of Tufts College Target analyte sensors utilizing Microspheres
US20030027203A1 (en) 1997-03-24 2003-02-06 Fields Robert E. Biomolecular processor
US6391622B1 (en) 1997-04-04 2002-05-21 Caliper Technologies Corp. Closed-loop biochemical analyzers
US6143496A (en) 1997-04-17 2000-11-07 Cytonix Corporation Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly
WO1998050583A1 (en) 1997-05-02 1998-11-12 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
CA2286601A1 (en) 1997-05-16 1998-11-26 Alberta Research Council Microfluidic system and methods of use
US6969488B2 (en) 1998-05-22 2005-11-29 Solexa, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
JP4294740B2 (ja) 1997-05-23 2009-07-15 ソレクサ・インコーポレイテッド 分析物の系列的プロセシングのためのシステムおよび装置
US20040241759A1 (en) 1997-06-16 2004-12-02 Eileen Tozer High throughput screening of libraries
DK1496120T3 (da) 1997-07-07 2007-07-30 Medical Res Council In vitro-sorteringsmetode
GB9714716D0 (en) 1997-07-11 1997-09-17 Brax Genomics Ltd Characterising nucleic acids
FI103809B1 (fi) 1997-07-14 1999-09-30 Finnzymes Oy In vitro -menetelmä templaattien tuottamiseksi DNA-sekventointia varten
US6974669B2 (en) 2000-03-28 2005-12-13 Nanosphere, Inc. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles
US20050037397A1 (en) 2001-03-28 2005-02-17 Nanosphere, Inc. Bio-barcode based detection of target analytes
US6368871B1 (en) 1997-08-13 2002-04-09 Cepheid Non-planar microstructures for manipulation of fluid samples
JP2001514906A (ja) 1997-08-15 2001-09-18 ハイセック，インコーポレーテッド 核酸種を検出または定量するための方法および組成物
WO1999014368A2 (en) 1997-09-15 1999-03-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods and apparatus for processing a sample of biomolecular analyte using a microfabricated device
US20020092767A1 (en) 1997-09-19 2002-07-18 Aclara Biosciences, Inc. Multiple array microfluidic device units
US7214298B2 (en) 1997-09-23 2007-05-08 California Institute Of Technology Microfabricated cell sorter
US6103537A (en) 1997-10-02 2000-08-15 Aclara Biosciences, Inc. Capillary assays involving separation of free and bound species
US5842787A (en) 1997-10-09 1998-12-01 Caliper Technologies Corporation Microfluidic systems incorporating varied channel dimensions
US6485944B1 (en) 1997-10-10 2002-11-26 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
EP1028970A1 (en) 1997-10-10 2000-08-23 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6511803B1 (en) 1997-10-10 2003-01-28 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
EP1023464B1 (en) 1997-10-14 2017-07-26 Luminex Corporation Precision fluorescently dyed particles and methods of making and using same
EP1025434A4 (en) 1997-10-24 2006-10-18 Univ Northeastern MINIATURIZED MULTICHANNEL DEVICE FOR PREPARATORY SEPARATION WITH HIGH THROUGHPUT AND COMPREHENSIVE COLLECTION AND ANALYSIS
EP1036332B1 (en) 1997-12-04 2005-07-13 Amersham Biosciences UK Limited Multiple assay method
WO1999033963A1 (en) 1997-12-31 1999-07-08 Chiron Corporation Metastatic cancer regulated gene
AU765378B2 (en) 1998-02-19 2003-09-18 President And Fellows Of Harvard College Monovalent, multivalent, and multimeric MHC binding domain fusion proteins and conjugates, and uses therefor
AU3196099A (en) 1998-03-27 1999-10-18 President And Fellows Of Harvard College Systematic identification of essential genes by (in vitro) transposon mutagenesis
US6022716A (en) 1998-04-10 2000-02-08 Genset Sa High throughput DNA sequencing vector
WO1999052708A1 (en) 1998-04-13 1999-10-21 Luminex Corporation Liquid labeling with fluorescent microparticles
US5997636A (en) 1998-05-01 1999-12-07 Instrumentation Technology Associates, Inc. Method and apparatus for growing crystals
US6780591B2 (en) 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6123798A (en) 1998-05-06 2000-09-26 Caliper Technologies Corp. Methods of fabricating polymeric structures incorporating microscale fluidic elements
US6534262B1 (en) 1998-05-14 2003-03-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Solid phase technique for selectively isolating nucleic acids
US6306590B1 (en) 1998-06-08 2001-10-23 Caliper Technologies Corp. Microfluidic matrix localization apparatus and methods
EP2360271A1 (en) 1998-06-24 2011-08-24 Illumina, Inc. Decoding of array sensors with microspheres
WO2000008212A1 (en) 1998-08-07 2000-02-17 Cellay, Llc Gel microdrops in genetic analysis
US6159736A (en) 1998-09-23 2000-12-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for making insertional mutations using a Tn5 synaptic complex
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
CA2347182C (en) 1998-10-13 2004-06-15 Biomicro Systems, Inc. Fluid circuit components based upon passive fluid dynamics
US6489096B1 (en) 1998-10-15 2002-12-03 Princeton University Quantitative analysis of hybridization patterns and intensities in oligonucleotide arrays
SE9803614L (sv) 1998-10-19 2000-04-20 Muhammed Mamoun Förfarande och anordning för framställning av nanopartiklar
WO2000026412A1 (en) 1998-11-02 2000-05-11 Kenneth Loren Beattie Nucleic acid analysis using sequence-targeted tandem hybridization
US6569631B1 (en) 1998-11-12 2003-05-27 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Microplate thermal shift assay for ligand development using 5-(4″dimethylaminophenyl)-2-(4′-phenyl)oxazole derivative fluorescent dyes
US5942609A (en) 1998-11-12 1999-08-24 The Porkin-Elmer Corporation Ligation assembly and detection of polynucleotides on solid-support
WO2000034527A2 (en) 1998-12-11 2000-06-15 The Regents Of The University Of California Targeted molecular bar codes
NO986133D0 (no) 1998-12-23 1998-12-23 Preben Lexow FremgangsmÕte for DNA-sekvensering
GB9900298D0 (en) 1999-01-07 1999-02-24 Medical Res Council Optical sorting method
US6416642B1 (en) 1999-01-21 2002-07-09 Caliper Technologies Corp. Method and apparatus for continuous liquid flow in microscale channels using pressure injection, wicking, and electrokinetic injection
US6635419B1 (en) 1999-02-16 2003-10-21 Applera Corporation Polynucleotide sequencing method
US20030027214A1 (en) 1999-02-17 2003-02-06 Kamb Carl Alexander Methods for substrate-ligand interaction screening
ATE556149T1 (de) 1999-02-23 2012-05-15 Caliper Life Sciences Inc Manipulation von mikropartikeln in mikrofluidischen systemen
US7615373B2 (en) 1999-02-25 2009-11-10 Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation Electroprocessed collagen and tissue engineering
US6171850B1 (en) 1999-03-08 2001-01-09 Caliper Technologies Corp. Integrated devices and systems for performing temperature controlled reactions and analyses
US6303343B1 (en) 1999-04-06 2001-10-16 Caliper Technologies Corp. Inefficient fast PCR
US6908737B2 (en) 1999-04-15 2005-06-21 Vitra Bioscience, Inc. Systems and methods of conducting multiplexed experiments
EP1923472B1 (en) 1999-04-20 2012-04-11 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
JP2002542781A (ja) 1999-04-28 2002-12-17 ザ、ボード、オブ、トラスティーズ、オブ、ザ、リーランド、スタンフォード、ジュニア、ユニバーシティ Ｐ因子由来ベクター及びその使用法
CA2373537A1 (en) 1999-05-12 2000-11-16 Aclara Biosciences, Inc. Multiplexed fluorescent detection in microfluidic devices
WO2000070095A2 (en) 1999-05-17 2000-11-23 Dade Behring Inc. Homogeneous isothermal amplification and detection of nucleic acids using a template switch oligonucleotide
US20020051971A1 (en) 1999-05-21 2002-05-02 John R. Stuelpnagel Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US6846622B1 (en) 1999-05-26 2005-01-25 Oregon Health & Science University Tagged epitope protein transposable element
US20030124509A1 (en) 1999-06-03 2003-07-03 Kenis Paul J.A. Laminar flow patterning and articles made thereby
US6372813B1 (en) 1999-06-25 2002-04-16 Motorola Methods and compositions for attachment of biomolecules to solid supports, hydrogels, and hydrogel arrays
AU6068300A (en) 1999-07-06 2001-01-22 Caliper Technologies Corporation Microfluidic systems and methods for determining modulator kinetics
US6977145B2 (en) 1999-07-28 2005-12-20 Serono Genetics Institute S.A. Method for carrying out a biochemical protocol in continuous flow in a microreactor
US6524456B1 (en) 1999-08-12 2003-02-25 Ut-Battelle, Llc Microfluidic devices for the controlled manipulation of small volumes
WO2001013086A2 (en) 1999-08-13 2001-02-22 Brandeis University Detection of nucleic acids
AU6788100A (en) 1999-08-20 2001-03-19 Luminex Corporation Liquid array technology
EP1208238B1 (en) 1999-08-27 2008-11-12 Matrix Technologies Corporation Methods of immobilizing ligands on solid supports
US6982146B1 (en) 1999-08-30 2006-01-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services High speed parallel molecular nucleic acid sequencing
IL149001A0 (en) 1999-10-13 2002-11-10 Signature Bioscience Inc System and method for detecting and identifying molecular events in test sample
US6958225B2 (en) 1999-10-27 2005-10-25 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
WO2001030965A2 (en) 1999-10-28 2001-05-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of in vivo gene transfer using a sleeping beauty transposon system
JP4721603B2 (ja) 1999-11-08 2011-07-13 栄研化学株式会社 変異および／または多型の検出方法
US6432290B1 (en) 1999-11-26 2002-08-13 The Governors Of The University Of Alberta Apparatus and method for trapping bead based reagents within microfluidic analysis systems
US20010051348A1 (en) 2000-01-28 2001-12-13 Lee Chee Wee Novel ligands and methods for preparing same
ATE382858T1 (de) 2000-02-23 2008-01-15 Caliper Life Sciences Inc Mehrfach-reservoir-drucksteuersystem
EP1261689A4 (en) 2000-02-23 2005-06-29 Zyomyx Inc CHIPS WITH INCREASED SAMPLE SURFACE
IL134830A0 (en) 2000-03-01 2001-05-20 Chay 13 Medical Res Group N V Peptides and immunostimulatory and anti-bacterial pharmaceutical compositions containing them
AU2001252201A1 (en) 2000-03-14 2001-09-24 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Effects of glucagon-like peptide-1 (7-36) on antro-pyloro-duodenal motility
JP4927287B2 (ja) 2000-03-31 2012-05-09 マイクロニックス、インコーポレーテッド タンパク質の結晶化のマイクロ流動体装置
US20020001856A1 (en) 2000-04-06 2002-01-03 Chow Andrea W. Methods and devices for achieving long incubation times in high-throughput systems
EP2278030B1 (en) 2000-04-10 2017-05-24 Taxon Biosciences, Inc. Methods for the survey and genetic analysis of populations
US6481453B1 (en) 2000-04-14 2002-11-19 Nanostream, Inc. Microfluidic branch metering systems and methods
US6800298B1 (en) 2000-05-11 2004-10-05 Clemson University Biological lubricant composition and method of applying lubricant composition
US20060008799A1 (en) 2000-05-22 2006-01-12 Hong Cai Rapid haplotyping by single molecule detection
US20020003001A1 (en) 2000-05-24 2002-01-10 Weigl Bernhard H. Surface tension valves for microfluidic applications
US6645432B1 (en) 2000-05-25 2003-11-11 President & Fellows Of Harvard College Microfluidic systems including three-dimensionally arrayed channel networks
US20060263888A1 (en) 2000-06-02 2006-11-23 Honeywell International Inc. Differential white blood count on a disposable card
US6632606B1 (en) 2000-06-12 2003-10-14 Aclara Biosciences, Inc. Methods for single nucleotide polymorphism detection
ES2259666T3 (es) 2000-06-21 2006-10-16 Bioarray Solutions Ltd Analisis molecular de multiples analitos usando series de particulas aleatorias con especificidad de aplicacion.
WO2002011888A2 (en) 2000-08-07 2002-02-14 Nanostream, Inc. Fluidic mixer in microfluidic system
US6610499B1 (en) 2000-08-31 2003-08-26 The Regents Of The University Of California Capillary array and related methods
US6773566B2 (en) 2000-08-31 2004-08-10 Nanolytics, Inc. Electrostatic actuators for microfluidics and methods for using same
ATE448875T1 (de) 2000-09-14 2009-12-15 Caliper Life Sciences Inc Mikrofluidische vorrichtungen und methoden um temperatur-vermittelte reaktionen durchzuführen
AU2001290879A1 (en) 2000-09-15 2002-03-26 California Institute Of Technology Microfabricated crossflow devices and methods
EP1322936A2 (en) 2000-10-03 2003-07-02 California Institute Of Technology Microfluidic devices and methods of use
CA2393374A1 (en) 2000-10-10 2002-04-18 Diversa Corporation High throughput or capillary-based screening for a bioactivity or biomolecule
JP2002155305A (ja) 2000-11-14 2002-05-31 Akira Kawasaki 単分散粒子の製造装置及び単分散粒子の製造方法及びその製造方法で製造された単分散粒子
US6492154B2 (en) 2001-01-31 2002-12-10 Applera Corporation Isolated human kinase proteins, nucleic acid molecules encoding human kinase proteins, and uses thereof
CA2332186A1 (en) 2001-02-08 2002-08-08 Her Majesty In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agricul Ture And Agri-Food Canada Replicative in vivo gene targeting
US7670559B2 (en) 2001-02-15 2010-03-02 Caliper Life Sciences, Inc. Microfluidic systems with enhanced detection systems
ATE312076T1 (de) 2001-02-22 2005-12-15 Anika Therapeutics Inc Thiol-modifizierte hyaluronan-derivate
DE60211857T2 (de) 2001-02-23 2006-12-21 Japan Science And Technology Agency, Kawaguchi Verfahren zur herstellung einer emulsion und vorrichtung dafür
US7211654B2 (en) 2001-03-14 2007-05-01 Regents Of The University Of Michigan Linkers and co-coupling agents for optimization of oligonucleotide synthesis and purification on solid supports
US20150329617A1 (en) 2001-03-14 2015-11-19 Dynal Biotech Asa Novel MHC molecule constructs, and methods of employing these constructs for diagnosis and therapy, and uses of MHC molecules
JP3949056B2 (ja) 2001-04-03 2007-07-25 マイクロニクス， インコーポレイテッド スプリット集中サイトメーター
US7138267B1 (en) 2001-04-04 2006-11-21 Epicentre Technologies Corporation Methods and compositions for amplifying DNA clone copy number
US20030027221A1 (en) * 2001-04-06 2003-02-06 Scott Melissa E. High-throughput screening assays by encapsulation
US7572642B2 (en) 2001-04-18 2009-08-11 Ambrigen, Llc Assay based on particles, which specifically bind with targets in spatially distributed characteristic patterns
JP4194934B2 (ja) 2001-05-26 2008-12-10 ワン セル システムズ インコーポレイテッド カプセル化細胞によるタンパク質の分泌法
US6880576B2 (en) 2001-06-07 2005-04-19 Nanostream, Inc. Microfluidic devices for methods development
US7179423B2 (en) 2001-06-20 2007-02-20 Cytonome, Inc. Microfluidic system including a virtual wall fluid interface port for interfacing fluids with the microfluidic system
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
US6613523B2 (en) 2001-06-29 2003-09-02 Agilent Technologies, Inc. Method of DNA sequencing using cleavable tags
US7682353B2 (en) 2001-06-29 2010-03-23 Coloplast A/S Catheter device
US7077152B2 (en) 2001-07-07 2006-07-18 Nanostream, Inc. Microfluidic metering systems and methods
EP1427746A4 (en) 2001-07-20 2005-09-28 California Inst Of Techn SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF PROTEINS AND NUCLEIC ACIDS
US6767731B2 (en) 2001-08-27 2004-07-27 Intel Corporation Electron induced fluorescent method for nucleic acid sequencing
WO2003031591A2 (en) 2001-10-10 2003-04-17 Superarray Bioscience Corporation Detecting targets by unique identifier nucleotide tags
US7297485B2 (en) 2001-10-15 2007-11-20 Qiagen Gmbh Method for nucleic acid amplification that results in low amplification bias
US6783647B2 (en) 2001-10-19 2004-08-31 Ut-Battelle, Llc Microfluidic systems and methods of transport and lysis of cells and analysis of cell lysate
WO2003044221A1 (en) 2001-10-19 2003-05-30 West Virginia University Research Corporation Microfluidic system for proteome analysis
US20030149307A1 (en) 2001-10-24 2003-08-07 Baxter International Inc. Process for the preparation of polyethylene glycol bis amine
AU2002365140A1 (en) 2001-10-26 2003-07-15 Aclara Biosciences Inc. System and method for injection molded micro-replication of micro-fluidic substrates
US20030182068A1 (en) 2001-10-30 2003-09-25 Battersby Bronwyn J. Device and methods for directed synthesis of chemical libraries
US7262056B2 (en) 2001-11-08 2007-08-28 Mirus Bio Corporation Enhancing intermolecular integration of nucleic acids using integrator complexes
GB0127564D0 (en) 2001-11-16 2002-01-09 Medical Res Council Emulsion compositions
EP1456409B1 (en) 2001-11-28 2010-02-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Parallel polymorphism scoring by amplification and error correction
US7335153B2 (en) 2001-12-28 2008-02-26 Bio Array Solutions Ltd. Arrays of microparticles and methods of preparation thereof
AU2003210438A1 (en) 2002-01-04 2003-07-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Droplet-based microfluidic oligonucleotide synthesis engine
AU2003202026A1 (en) 2002-01-16 2003-09-02 Dynal Biotech Asa Method for isolating nucleic acids and protein from a single sample
KR100459870B1 (ko) 2002-02-22 2004-12-04 한국과학기술원 트랜스포존과 Cre/loxP 부위 특이적 재조합 방법을 이용하는 염색체의 특정부위가 제거된 미생물 변이주 제조방법
CN1656234B (zh) * 2002-03-20 2012-02-01 创新生物公司 包囊化核酸扩增反应混合物的微胶囊及其作为反应隔间进行平行反应的用途
US7901939B2 (en) 2002-05-09 2011-03-08 University Of Chicago Method for performing crystallization and reactions in pressure-driven fluid plugs
EP2282214B1 (en) 2002-05-09 2022-10-05 The University of Chicago Device and method for pressure-driven plug transport and reaction
US7527966B2 (en) 2002-06-26 2009-05-05 Transgenrx, Inc. Gene regulation in transgenic animals using a transposon-based vector
JP2006507921A (ja) 2002-06-28 2006-03-09 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 流体分散のための方法および装置
US7927791B2 (en) 2002-07-24 2011-04-19 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for identifying small molecules that modulate premature translation termination and nonsense mediated mRNA decay
IL151660A0 (en) 2002-09-09 2003-04-10 Univ Ben Gurion Method for isolating and culturing unculturable microorganisms
ES2315397T3 (es) 2002-09-30 2009-04-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotidos para obtener el genotipo del gen de timidilato sintasa.
US20040081962A1 (en) 2002-10-23 2004-04-29 Caifu Chen Methods for synthesizing complementary DNA
US6979713B2 (en) 2002-11-25 2005-12-27 3M Innovative Properties Company Curable compositions and abrasive articles therefrom
US20050266582A1 (en) 2002-12-16 2005-12-01 Modlin Douglas N Microfluidic system with integrated permeable membrane
US20040248299A1 (en) 2002-12-27 2004-12-09 Sumedha Jayasena RNA interference
DE602004021902D1 (de) 2003-01-17 2009-08-20 Univ Boston Haplotypanalyse
US7244567B2 (en) 2003-01-29 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Double ended sequencing
DK1594973T3 (da) 2003-02-10 2012-02-13 Max Delbrueck Centrum Transposonbaseret målretningssystem
US20100022414A1 (en) 2008-07-18 2010-01-28 Raindance Technologies, Inc. Droplet Libraries
US7041481B2 (en) 2003-03-14 2006-05-09 The Regents Of The University Of California Chemical amplification based on fluid partitioning
US7316903B2 (en) 2003-03-28 2008-01-08 United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Detection of nucleic acid sequence variations using phase Mu transposase
GB0307428D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
US20060078893A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
GB0307403D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
DK1613346T3 (da) * 2003-04-04 2013-01-07 Pah Usa 15 Llc Mikrofluidiske olie-i-vand-emulsioner og vaccinesammensætninger
US20100035254A1 (en) 2003-04-08 2010-02-11 Pacific Biosciences Of California, Inc. Composition and method for nucleic acid sequencing
CA2784762A1 (en) 2003-04-10 2004-10-28 President And Fellows Of Harvard College Formation and control of fluidic species
EP1629286A1 (en) 2003-05-16 2006-03-01 Global Technologies (NZ) Ltd. Method and apparatus for mixing sample and reagent in a suspension fluid
DE112004001376D2 (de) 2003-05-19 2006-04-13 Knoell Hans Forschung Ev Vorrichtung und Verfahren zur Strukturierung von Flüssigkeiten und zum zudosieren von Reaktionsflüssigkeiten zu in Separationsmedium eingebetteten Flüssigkeitskompartimenten
WO2004105734A1 (en) 2003-05-28 2004-12-09 Valorisation Recherche, Societe En Commandite Method of preparing microcapsules
GB0313170D0 (en) 2003-06-09 2003-07-16 Qinetiq Ltd Method and apparatus for spore disruption and/or detection
JP2007503597A (ja) 2003-06-13 2007-02-22 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション 血液から赤血球および血小板をサイズに基づいて除去するための微少流体システム
GB2403475B (en) 2003-07-01 2008-02-06 Oxitec Ltd Stable integrands
GB0315438D0 (en) 2003-07-02 2003-08-06 Univ Manchester Analysis of mixed cell populations
EP1641809B2 (en) 2003-07-05 2018-10-03 The Johns Hopkins University Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations
EP2662135A3 (en) 2003-08-27 2013-12-25 President and Fellows of Harvard College Method for mixing droplets in a microchannel
JP4988345B2 (ja) 2003-09-04 2012-08-01 ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ・アズ・リプレゼンティッド・バイ・ザ・デパートメント・オブ・ヴェテランズ・アフェアーズ 眼用ハイドロゲルナノコンポジット
WO2005023427A1 (en) 2003-09-05 2005-03-17 Stokes Bio Limited A microfluidic analysis system
US7354706B2 (en) 2003-09-09 2008-04-08 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event
WO2005028646A1 (ja) 2003-09-22 2005-03-31 Riken 効率的なdna逆位反復構造の調製方法
KR101111231B1 (ko) 2003-09-25 2012-02-17 비바리스 마이크로 웰 어레이 칩 및 그 제조방법
JP2007512811A (ja) 2003-11-10 2007-05-24 インベスチゲン， インコーポレイテッド 検出のための核酸を調製する方法
WO2005049787A2 (en) 2003-11-24 2005-06-02 Yeda Research And Development Co.Ltd. Compositions and methods for in vitro sorting of molecular and cellular libraries
US20050136417A1 (en) 2003-12-19 2005-06-23 Affymetrix, Inc. Amplification of nucleic acids
US8071364B2 (en) 2003-12-24 2011-12-06 Transgenrx, Inc. Gene therapy using transposon-based vectors
ES2432040T3 (es) 2004-01-28 2013-11-29 454 Life Sciences Corporation Amplificación de ácido nucleico con emulsión de flujo continuo
US20050181379A1 (en) 2004-02-18 2005-08-18 Intel Corporation Method and device for isolating and positioning single nucleic acid molecules
AU2005216549A1 (en) 2004-02-27 2005-09-09 President And Fellows Of Harvard College Polony fluorescent in situ sequencing beads
US20100216153A1 (en) 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
KR100552706B1 (ko) 2004-03-12 2006-02-20 삼성전자주식회사 핵산 증폭 방법 및 장치
US8741192B2 (en) 2004-03-23 2014-06-03 Japan Science And Technology Agency Method and device for producing micro-droplets
US20050221339A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
WO2005099419A2 (en) 2004-04-13 2005-10-27 President And Fellows Of Harvard College Manipulation and/or detection of biological samples or other objects
US20050250147A1 (en) 2004-05-10 2005-11-10 Macevicz Stephen C Digital profiling of polynucleotide populations
US20080268507A1 (en) 2004-05-25 2008-10-30 Airbus Deutschland Gmbh Recombinant Dna Nicking Endonuclease and Uses Thereof
US7799553B2 (en) 2004-06-01 2010-09-21 The Regents Of The University Of California Microfabricated integrated DNA analysis system
US7700281B2 (en) 2004-06-30 2010-04-20 Usb Corporation Hot start nucleic acid amplification
US7968085B2 (en) 2004-07-05 2011-06-28 Ascendis Pharma A/S Hydrogel formulations
CN1648671B (zh) * 2005-02-06 2012-09-26 成都夸常医学工业有限公司 多反应器分析芯片检测方法和分析芯片及检测装置
US7608434B2 (en) 2004-08-04 2009-10-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Mutated Tn5 transposase proteins and the use thereof
US20080268431A1 (en) 2004-09-14 2008-10-30 Jin-Ho Choy Information Code System Using Dna Sequences
US7892731B2 (en) 2004-10-01 2011-02-22 Radix Biosolutions, Ltd. System and method for inhibiting the decryption of a nucleic acid probe sequence used for the detection of a specific nucleic acid
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
US9492400B2 (en) 2004-11-04 2016-11-15 Massachusetts Institute Of Technology Coated controlled release polymer particles as efficient oral delivery vehicles for biopharmaceuticals
WO2006051552A2 (en) 2004-11-15 2006-05-18 Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science Directed evolution and selection using in vitro compartmentalization
US7329493B2 (en) 2004-12-22 2008-02-12 Asiagen Corporation One-tube nested PCR for detecting Mycobacterium tuberculosis
EP2418018B1 (en) 2004-12-23 2013-05-22 Abbott Point of Care Inc. Methods for the separation nucleic acids
US20080213593A1 (en) 2005-01-21 2008-09-04 President And Fellows Of Harvard College Systems And Methods For Forming Fluidic Droplets Encapsulated In Particles Such As Colloidal Particles
US7579153B2 (en) 2005-01-25 2009-08-25 Population Genetics Technologies, Ltd. Isothermal DNA amplification
US7407757B2 (en) 2005-02-10 2008-08-05 Population Genetics Technologies Genetic analysis by sequence-specific sorting
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
AU2006214085A1 (en) 2005-02-18 2006-08-24 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Devices and methods for identifying genomic DNA of organisms
EP1867702B1 (en) * 2005-02-21 2011-09-28 Kagoshima University Method for purifying biodiesel fuel
EP2248578B1 (en) 2005-03-04 2012-06-06 President and Fellows of Harvard College Method for forming multiple emulsions
US20070054119A1 (en) 2005-03-04 2007-03-08 Piotr Garstecki Systems and methods of forming particles
US9040237B2 (en) 2005-03-04 2015-05-26 Intel Corporation Sensor arrays and nucleic acid sequencing applications
JP2006289250A (ja) 2005-04-08 2006-10-26 Kao Corp マイクロミキサー及びそれを用いた流体混合方法
US8407013B2 (en) 2005-06-07 2013-03-26 Peter K. Rogan AB initio generation of single copy genomic probes
US8445194B2 (en) 2005-06-15 2013-05-21 Callida Genomics, Inc. Single molecule arrays for genetic and chemical analysis
JP2006349060A (ja) 2005-06-16 2006-12-28 Ntn Corp ボールねじ
US8828209B2 (en) 2005-06-22 2014-09-09 The Research Foundation For The State University Of New York Massively parallel 2-dimensional capillary electrophoresis
WO2007002567A2 (en) 2005-06-23 2007-01-04 Nanosphere, Inc. Selective isolation and concentration of nucleic acids from complex samples
ATE537254T1 (de) 2005-07-05 2011-12-15 Chemo Sero Therapeut Res Inst Mutanter transposonvektor und verwendung davon
JP5051490B2 (ja) 2005-07-08 2012-10-17 独立行政法人産業技術総合研究所 マクロ生体材料を内包する無機マイクロカプセルおよびその製造方法
US20070020640A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Mccloskey Megan L Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis
FR2888912B1 (fr) 2005-07-25 2007-08-24 Commissariat Energie Atomique Procede de commande d'une communication entre deux zones par electromouillage, dispositif comportant des zones isolables les unes des autres et procede de realisation d'un tel dispositif
ATE510930T1 (de) 2005-08-02 2011-06-15 Rubicon Genomics Inc Zusammensetzungen und verfahren zur bearbeitung und amplifikation von dna mit verwendung mehrerer enzyme in einer einzigen reaktion
DE102005037401B4 (de) 2005-08-08 2007-09-27 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Bildung einer Emulsion in einem fluidischen Mikrosystem
WO2007024840A2 (en) 2005-08-22 2007-03-01 Critical Therapeutics, Inc. Method of quantitating nucleic acids by flow cytometry microparticle-based array
US7556776B2 (en) 2005-09-08 2009-07-07 President And Fellows Of Harvard College Microfluidic manipulation of fluids and reactions
JP2007074967A (ja) 2005-09-13 2007-03-29 Canon Inc 識別子プローブ及びそれを用いた核酸増幅方法
CN101523156A (zh) 2005-09-16 2009-09-02 加利福尼亚大学董事会 用于分析物检测的比色生物条形码扩增测定
US7960104B2 (en) 2005-10-07 2011-06-14 Callida Genomics, Inc. Self-assembled single molecule arrays and uses thereof
WO2007133831A2 (en) 2006-02-24 2007-11-22 Callida Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on dna arrays
US20070111241A1 (en) 2005-10-14 2007-05-17 Nezih Cereb System and method for accessing, tracking, and editing sequence analysis and software to accomplish the same
US7709544B2 (en) 2005-10-25 2010-05-04 Massachusetts Institute Of Technology Microstructure synthesis by flow lithography and polymerization
US20070190543A1 (en) * 2005-11-14 2007-08-16 Applera Corporation Coded Molecules for Detecting Target Analytes
US20070134277A1 (en) 2005-12-09 2007-06-14 Children's Medical Center Corporation Pharmaceutical formulation for sulfur-containing drugs in liquid dosage forms
US20070141584A1 (en) 2005-12-20 2007-06-21 Roberts Douglas N Methods for assessment of native chromatin on microarrays
US7932037B2 (en) 2007-12-05 2011-04-26 Perkinelmer Health Sciences, Inc. DNA assays using amplicon probes on encoded particles
WO2007081386A2 (en) 2006-01-11 2007-07-19 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices and methods of use
EP1987162A4 (en) 2006-01-23 2009-11-25 Population Genetics Technologi NUCLEIC ACID ANALYSIS ABOUT SEQUENCE TOKENS
WO2007087312A2 (en) 2006-01-23 2007-08-02 Population Genetics Technologies Ltd. Molecular counting
EP2263787A3 (en) 2006-01-27 2012-02-22 President and Fellows of Harvard College Fluidic droplet coalescence
ES2595373T3 (es) 2006-02-02 2016-12-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Prueba genética no invasiva mediante análisis digital
WO2007092538A2 (en) 2006-02-07 2007-08-16 President And Fellows Of Harvard College Methods for making nucleotide probes for sequencing and synthesis
GB0603251D0 (en) 2006-02-17 2006-03-29 Isis Innovation DNA conformation
SG10201405158QA (en) 2006-02-24 2014-10-30 Callida Genomics Inc High throughput genome sequencing on dna arrays
US20070231823A1 (en) 2006-03-23 2007-10-04 Mckernan Kevin J Directed enrichment of genomic DNA for high-throughput sequencing
JP4921829B2 (ja) 2006-03-30 2012-04-25 株式会社東芝 微粒子の製造装置、乳化剤保持部、微粒子の製造方法および分子膜の製造方法
US20090181864A1 (en) 2006-03-31 2009-07-16 Nam Trung Nguyen Active control for droplet-based microfluidics
JP2009538123A (ja) 2006-04-19 2009-11-05 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー ゲル非含有ビーズベースの配列決定のための試薬、方法およびライブラリー
US7811603B2 (en) 2006-05-09 2010-10-12 The Regents Of The University Of California Microfluidic device for forming monodisperse lipoplexes
JP2010506136A (ja) 2006-05-11 2010-02-25 レインダンス テクノロジーズ， インコーポレイテッド 微小流体デバイス
ES2620398T3 (es) 2006-05-22 2017-06-28 Nanostring Technologies, Inc. Sistemas y métodos para analizar nanoindicadores
RU2321638C2 (ru) 2006-05-23 2008-04-10 Закрытое акционерное общество "Молекулярно-медицинские технологии" Способ изготовления многофункционального мультичипа, мультичип для последовательного или параллельного скрининга биополимеров, способ анализа биополимеров и набор для осуществления способа
EP2029781A4 (en) 2006-05-26 2010-06-30 Althea Technologies Inc BIOCHEMICAL ANALYSIS OF PARTITIONED CELLS
FR2901717A1 (fr) 2006-05-30 2007-12-07 Centre Nat Rech Scient Procede de traitement de gouttes dans un circuit microfluidique.
AU2007260676A1 (en) 2006-06-14 2007-12-21 Artemis Health, Inc. Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
WO2007149432A2 (en) 2006-06-19 2007-12-27 The Johns Hopkins University Single-molecule pcr on microparticles in water-in-oil emulsions
US20080076909A1 (en) 2006-06-30 2008-03-27 Applera Corporation Emulsion pcr and amplicon capture
EP1878501A1 (en) 2006-07-14 2008-01-16 Roche Diagnostics GmbH Instrument for heating and cooling
US8394590B2 (en) 2006-08-02 2013-03-12 California Institute Of Technology Capture agents and related methods and systems for detecting and/or sorting targets
EP3536396B1 (en) 2006-08-07 2022-03-30 The President and Fellows of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
US9278321B2 (en) 2006-09-06 2016-03-08 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Chip and cartridge design configuration for performing micro-fluidic assays
WO2008037082A1 (en) 2006-09-25 2008-04-03 Archer-Daniels-Midland Company Superabsorbent surface-treated carboxyalkylated polysaccharides and process for producing same
US7935518B2 (en) 2006-09-27 2011-05-03 Alessandra Luchini Smart hydrogel particles for biomarker harvesting
US20080166720A1 (en) 2006-10-06 2008-07-10 The Regents Of The University Of California Method and apparatus for rapid nucleic acid analysis
US8841116B2 (en) 2006-10-25 2014-09-23 The Regents Of The University Of California Inline-injection microdevice and microfabricated integrated DNA analysis system using same
US7910302B2 (en) 2006-10-27 2011-03-22 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US8765076B2 (en) 2006-11-14 2014-07-01 Handylab, Inc. Microfluidic valve and method of making same
ES2679996T3 (es) 2006-11-15 2018-09-03 Biospherex Llc Secuenciación multi-etiqueta y análisis ecogenómico
CN101583879A (zh) * 2006-11-20 2009-11-18 纳提维斯公司 利用低频信号转导体外系统或者哺乳动物系统的设备和方法
US20080242560A1 (en) 2006-11-21 2008-10-02 Gunderson Kevin L Methods for generating amplified nucleic acid arrays
WO2008072540A1 (ja) 2006-12-13 2008-06-19 National University Corporation Nagoya University Ｔｏｌ１因子のトランスポザーゼ及びそれを用いたＤＮＡ導入システム
CA2672315A1 (en) 2006-12-14 2008-06-26 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays
US8338166B2 (en) * 2007-01-04 2012-12-25 Lawrence Livermore National Security, Llc Sorting, amplification, detection, and identification of nucleic acid subsequences in a complex mixture
JP2008167722A (ja) 2007-01-15 2008-07-24 Konica Minolta Medical & Graphic Inc 磁性支持体上での加熱による核酸単離方法
US7844658B2 (en) 2007-01-22 2010-11-30 Comcast Cable Holdings, Llc System and method for providing an application to a device
US20080176768A1 (en) 2007-01-23 2008-07-24 Honeywell Honeywell International Hydrogel microarray with embedded metal nanoparticles
EP2121983A2 (en) 2007-02-02 2009-11-25 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
US8003312B2 (en) 2007-02-16 2011-08-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Multiplex cellular assays using detectable cell barcodes
FI20075124A0 (fi) 2007-02-21 2007-02-21 Valtion Teknillinen Menetelmä ja testikitti nukleotidivariaatioiden toteamiseksi
WO2008109176A2 (en) 2007-03-07 2008-09-12 President And Fellows Of Harvard College Assays and other reactions involving droplets
US20080228268A1 (en) 2007-03-15 2008-09-18 Uluru, Inc. Method of Formation of Viscous, Shape Conforming Gels and Their Uses as Medical Prosthesis
US7943330B2 (en) 2007-03-23 2011-05-17 Academia Sinica Tailored glycoproteomic methods for the sequencing, mapping and identification of cellular glycoproteins
EP2136786B8 (en) 2007-03-28 2012-11-14 President and Fellows of Harvard College Apparatus for forming droplets
US9222936B2 (en) 2007-04-18 2015-12-29 Solulink, Inc. Methods and/or use of oligonucleotide conjugates for suppressing background due to cross-hybridization
US20100130369A1 (en) 2007-04-23 2010-05-27 Advanced Liquid Logic, Inc. Bead-Based Multiplexed Analytical Methods and Instrumentation
CN101293191B (zh) 2007-04-25 2011-11-09 中国科学院过程工程研究所 一种琼脂糖凝胶微球的制备方法
WO2008135512A2 (en) 2007-05-02 2008-11-13 Jerzy Paszkowski Dna amplification method
US20080295909A1 (en) 2007-05-24 2008-12-04 Locascio Laurie E Microfluidic Device for Passive Sorting and Storage of Liquid Plugs Using Capillary Force
WO2008150432A1 (en) 2007-06-01 2008-12-11 454 Life Sciences Corporation System and meth0d for identification of individual samples from a multiplex mixture
US8476382B2 (en) 2007-06-05 2013-07-02 Eugenia Kumacheva Multiple continuous microfluidic reactors for the scaled up synthesis of gel or polymer particles
WO2009005680A1 (en) 2007-06-29 2009-01-08 President And Fellows Of Harvard College Methods and apparatus for manipulation of fluidic species
WO2009011808A1 (en) 2007-07-13 2009-01-22 President And Fellows Of Harvard College Droplet-based selection
WO2009015296A1 (en) 2007-07-24 2009-01-29 The Regents Of The University Of California Microfabricated dropley generator
US20130084243A1 (en) 2010-01-27 2013-04-04 Liliane Goetsch Igf-1r specific antibodies useful in the detection and diagnosis of cellular proliferative disorders
EP2179285A4 (en) 2007-08-15 2010-08-18 Opgen Inc METHOD, SYSTEM AND SOFTWARE ARRANGEMENT FOR COMPARATIVE ANALYSIS AND PHYLOGENIA WITH OPTICAL TOTAL GENERIC CARD
US8563527B2 (en) 2007-08-20 2013-10-22 Pharmain Corporation Oligonucleotide core carrier compositions for delivery of nucleic acid-containing therapeutic agents, methods of making and using the same
US8268564B2 (en) 2007-09-26 2012-09-18 President And Fellows Of Harvard College Methods and applications for stitched DNA barcodes
WO2009048532A2 (en) 2007-10-05 2009-04-16 President And Fellows Of Harvard College Formation of particles for ultrasound application, drug release, and other uses, and microfluidic methods of preparation
US20090099040A1 (en) 2007-10-15 2009-04-16 Sigma Aldrich Company Degenerate oligonucleotides and their uses
US20100086914A1 (en) 2008-10-03 2010-04-08 Roche Molecular Systems, Inc. High resolution, high throughput hla genotyping by clonal sequencing
US8334013B2 (en) 2007-11-02 2012-12-18 Stc.Unm Mesoporous metal oxide microspheres and method for forming same
WO2009061372A1 (en) 2007-11-02 2009-05-14 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for creating multi-phase entities, including particles and/or fluids
US8592150B2 (en) 2007-12-05 2013-11-26 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
US20110008775A1 (en) 2007-12-10 2011-01-13 Xiaolian Gao Sequencing of nucleic acids
US7771944B2 (en) 2007-12-14 2010-08-10 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Methods for determining genetic haplotypes and DNA mapping
CN101946010B (zh) 2007-12-21 2014-08-20 哈佛大学 用于核酸测序的系统和方法
EP3699291A1 (en) 2008-01-17 2020-08-26 Sequenom, Inc. Single molecule nucleic acid sequence analysis processes and compositions
KR20090081260A (ko) 2008-01-23 2009-07-28 삼성전자주식회사 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법
CA2714630A1 (en) 2008-02-07 2009-08-13 Pacific Biosciences Of California, Inc. Cis reactive oxygen quenchers integrated into linkers
JP5468271B2 (ja) 2008-02-08 2014-04-09 花王株式会社 微粒子分散液の製造方法
US8034568B2 (en) 2008-02-12 2011-10-11 Nugen Technologies, Inc. Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions
CN101918597B (zh) 2008-03-11 2013-09-18 国立癌中心 应用snp阵列测量染色体、基因或特定核苷酸序列拷贝数的方法
US9011777B2 (en) 2008-03-21 2015-04-21 Lawrence Livermore National Security, Llc Monodisperse microdroplet generation and stopping without coalescence
US8961902B2 (en) 2008-04-23 2015-02-24 Bioscale, Inc. Method and apparatus for analyte processing
US9068181B2 (en) 2008-05-23 2015-06-30 The General Hospital Corporation Microfluidic droplet encapsulation
DE102008025656B4 (de) 2008-05-28 2016-07-28 Genxpro Gmbh Verfahren zur quantitativen Analyse von Nukleinsäuren, Marker dafür und deren Verwendung
GB0810051D0 (en) 2008-06-02 2008-07-09 Oxford Biodynamics Ltd Method of diagnosis
EP2303246A1 (en) 2008-06-05 2011-04-06 President and Fellows of Harvard College Polymersomes, colloidosomes, liposomes, and other species associated with fluidic droplets
US8198028B2 (en) 2008-07-02 2012-06-12 Illumina Cambridge Limited Using populations of beads for the fabrication of arrays on surfaces
WO2010004018A2 (en) 2008-07-11 2010-01-14 Eth Zurich Degradable microcapsules
US10722562B2 (en) 2008-07-23 2020-07-28 Immudex Aps Combinatorial analysis and repair
US20100062494A1 (en) 2008-08-08 2010-03-11 President And Fellows Of Harvard College Enzymatic oligonucleotide pre-adenylation
US8383345B2 (en) 2008-09-12 2013-02-26 University Of Washington Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
US20110218123A1 (en) 2008-09-19 2011-09-08 President And Fellows Of Harvard College Creation of libraries of droplets and related species
US9417190B2 (en) 2008-09-23 2016-08-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Calibrations and controls for droplet-based assays
US8709762B2 (en) 2010-03-02 2014-04-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for hot-start amplification via a multiple emulsion
US20120252015A1 (en) 2011-02-18 2012-10-04 Bio-Rad Laboratories Methods and compositions for detecting genetic material
US20110159499A1 (en) 2009-11-25 2011-06-30 Quantalife, Inc. Methods and compositions for detecting genetic material
US9156010B2 (en) 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
US8663920B2 (en) 2011-07-29 2014-03-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Library characterization by digital assay
US9764322B2 (en) 2008-09-23 2017-09-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for generating droplets with pressure monitoring
AU2009296734B2 (en) 2008-09-25 2016-02-18 Cephalon Llc Liquid formulations of bendamustine
US8361299B2 (en) 2008-10-08 2013-01-29 Sage Science, Inc. Multichannel preparative electrophoresis system
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
DK2376517T3 (da) 2008-10-24 2013-02-11 Epict Technologies Corp Transposon-ende-sammensætninger og fremgangsmåder til at modificere nukleinsyrer
US20100113296A1 (en) 2008-11-05 2010-05-06 Joel Myerson Methods And Kits For Nucleic Acid Analysis
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US20100203647A1 (en) 2008-11-21 2010-08-12 The Rockefeller University Chemical Reporters of Protein Acylation
SG171916A1 (en) 2008-12-02 2011-07-28 Bio Rad Laboratories Chromatin structure detection
EP3150724A1 (en) 2008-12-19 2017-04-05 President and Fellows of Harvard College Particle-assisted nucleic acid sequencing
WO2010075570A2 (en) 2008-12-24 2010-07-01 New York University Methods, computer-accessible medium, and systems for score-driven whole-genome shotgun sequence assemble
KR101065807B1 (ko) 2009-01-23 2011-09-19 충남대학교산학협력단 액적 기반의 미세유체 칩을 이용한 마이크로 캡슐 제조방법
JP5457222B2 (ja) * 2009-02-25 2014-04-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 小型化ハイスループット核酸分析
US9347092B2 (en) 2009-02-25 2016-05-24 Roche Molecular System, Inc. Solid support for high-throughput nucleic acid analysis
WO2010104597A2 (en) 2009-03-13 2010-09-16 President And Fellows Of Harvard College Scale-up of microfluidic devices
WO2010104604A1 (en) 2009-03-13 2010-09-16 President And Fellows Of Harvard College Method for the controlled creation of emulsions, including multiple emulsions
EP2230312A1 (en) 2009-03-19 2010-09-22 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Probe compound for detecting and isolating enzymes and means and methods using the same
US8528589B2 (en) 2009-03-23 2013-09-10 Raindance Technologies, Inc. Manipulation of microfluidic droplets
DK2414548T3 (en) 2009-03-30 2015-12-21 Illumina Inc Gene expression in single cells
EP2789694A1 (en) 2009-04-02 2014-10-15 Fluidigm Corporation Microfluidic device with reaction product recovery system
US9085798B2 (en) 2009-04-30 2015-07-21 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
EP2427572B1 (en) 2009-05-01 2013-08-28 Illumina, Inc. Sequencing methods
US9334531B2 (en) 2010-12-17 2016-05-10 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
FR2945545B1 (fr) 2009-05-14 2011-08-05 Univ Aix Marseille Ii Methode de detection d'adn procaryote extrait d'un echantillon de selles
FR2945819B1 (fr) 2009-05-19 2011-06-17 Commissariat Energie Atomique Dispositif et procede d'isolement de cibles biologiques ou chimiques
US8574835B2 (en) 2009-05-29 2013-11-05 Life Technologies Corporation Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using
CN102459592B (zh) 2009-06-15 2017-04-05 考利达基因组股份有限公司 用于长片段阅读测序的方法和组合物
US9524369B2 (en) 2009-06-15 2016-12-20 Complete Genomics, Inc. Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data
AU2010266010B2 (en) 2009-06-26 2015-08-20 President And Fellows Of Harvard College Fluid injection
US20110028412A1 (en) 2009-08-03 2011-02-03 Cappellos, Inc. Herbal enhanced analgesic formulations
US20110033548A1 (en) 2009-08-05 2011-02-10 E.I. Du Pont De Nemours And Company Degradable crosslinked aminated dextran microspheres and methods of use
EP2467479B1 (en) 2009-08-20 2016-01-06 Population Genetics Technologies Ltd Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement
RU2552215C2 (ru) 2009-09-01 2015-06-10 Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. Устройство и способ отбора нуклеиновых кислот с помощью микроматриц
JP6155418B2 (ja) 2009-09-02 2017-07-05 バイオ−ラッド・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド 多重エマルジョンの合体による、流体を混合するためのシステム
US20120211084A1 (en) 2009-09-02 2012-08-23 President And Fellows Of Harvard College Multiple emulsions created using jetting and other techniques
US9625454B2 (en) 2009-09-04 2017-04-18 The Research Foundation For The State University Of New York Rapid and continuous analyte processing in droplet microfluidic devices
GB0918564D0 (en) 2009-10-22 2009-12-09 Plasticell Ltd Nested cell encapsulation
CA2778816C (en) 2009-10-27 2018-07-31 President And Fellows Of Harvard College Droplet creation techniques
US10207240B2 (en) 2009-11-03 2019-02-19 Gen9, Inc. Methods and microfluidic devices for the manipulation of droplets in high fidelity polynucleotide assembly
JP5823405B2 (ja) 2009-11-04 2015-11-25 ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア 核酸含有脂質粒子および関連方法
CN102985552B (zh) * 2009-11-25 2016-02-17 伯乐生命医学产品有限公司 用于检测遗传物质的方法和组合物
US9023769B2 (en) 2009-11-30 2015-05-05 Complete Genomics, Inc. cDNA library for nucleic acid sequencing
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
EP2513333B1 (en) 2009-12-17 2013-10-02 Keygene N.V. Restriction enzyme based whole genome sequencing
US10837883B2 (en) 2009-12-23 2020-11-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets
EP3392349A1 (en) 2010-02-12 2018-10-24 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
JP5901046B2 (ja) 2010-02-19 2016-04-06 国立大学法人 千葉大学 ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント
US20110257889A1 (en) 2010-02-24 2011-10-20 Pacific Biosciences Of California, Inc. Sequence assembly and consensus sequence determination
EP2539450B1 (en) 2010-02-25 2016-02-17 Advanced Liquid Logic, Inc. Method of making nucleic acid libraries
US8236574B2 (en) 2010-03-01 2012-08-07 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules or particles using beads or other capture objects
US10500156B2 (en) 2010-03-24 2019-12-10 Northeastern University Multi-compartmental macrophage delivery
JP2013524171A (ja) 2010-03-25 2013-06-17 クァンタライフ・インコーポレーテッド 液滴ベースのアッセイのための液滴の発生
FR2958186A1 (fr) 2010-03-30 2011-10-07 Ecole Polytech Dispositif de formation de gouttes dans un circuit microfluide.
US9255291B2 (en) 2010-05-06 2016-02-09 Bioo Scientific Corporation Oligonucleotide ligation methods for improving data quality and throughput using massively parallel sequencing
US20110287947A1 (en) 2010-05-18 2011-11-24 University Of Southern California Tethered Conformation Capture
CN105194665A (zh) 2010-05-26 2015-12-30 西莱克塔生物科技公司 具有不偶合的佐剂的纳米载体组合物
US20120000777A1 (en) 2010-06-04 2012-01-05 The Regents Of The University Of California Devices and methods for forming double emulsion droplet compositions and polymer particles
EP2580378A4 (en) 2010-06-08 2014-01-01 Nugen Technologies Inc MULTIPLEX SEQUENCING METHODS AND COMPOSITION
US8703493B2 (en) 2010-06-15 2014-04-22 Src, Inc. Location analysis using fire retardant-protected nucleic acid-labeled tags
US20120003657A1 (en) 2010-07-02 2012-01-05 Samuel Myllykangas Targeted sequencing library preparation by genomic dna circularization
WO2012012037A1 (en) * 2010-07-19 2012-01-26 New England Biolabs, Inc. Oligonucleotide adaptors: compositions and methods of use
US20120034603A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants
CN103202812B (zh) 2010-08-09 2015-10-28 南京大学 一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法
WO2012019765A1 (en) 2010-08-10 2012-02-16 European Molecular Biology Laboratory (Embl) Methods and systems for tracking samples and sample combinations
US20130203675A1 (en) 2010-09-16 2013-08-08 Joseph M. DeSimone Asymmetric biofunctional silyl monomers and particles thereof as prodrugs and delivery vehicles for pharmaceutical, chemical and biological agents
CN102409048B (zh) * 2010-09-21 2013-10-23 深圳华大基因科技服务有限公司 一种基于高通量测序的dna标签文库构建方法
WO2012038839A2 (en) 2010-09-21 2012-03-29 Population Genetics Technologies Ltd. Increasing confidence of allele calls with molecular counting
US9187783B2 (en) 2010-10-04 2015-11-17 Genapsys, Inc. Systems and methods for automated reusable parallel biological reactions
US9999886B2 (en) 2010-10-07 2018-06-19 The Regents Of The University Of California Methods and systems for on demand droplet generation and impedance based detection
EP2625320B1 (en) 2010-10-08 2019-03-27 President and Fellows of Harvard College High-throughput single cell barcoding
EP2625295B1 (en) 2010-10-08 2019-03-13 President and Fellows of Harvard College High-throughput immune sequencing
CN102050953B (zh) 2010-10-18 2012-11-07 武汉理工大学 一种可还原降解超分子水凝胶的制备方法
WO2012055929A1 (en) 2010-10-26 2012-05-03 Illumina, Inc. Sequencing methods
US20130225623A1 (en) 2010-10-27 2013-08-29 Mount Sinai School Of Medicine Methods of Treating Psychiatric or Neurological Disorders with MGLUR Antagonists
DE202011110979U1 (de) 2010-11-01 2017-12-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. System zum Bilden von Emulsionen
US9074251B2 (en) 2011-02-10 2015-07-07 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
EP2635679B1 (en) 2010-11-05 2017-04-19 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
US8829171B2 (en) 2011-02-10 2014-09-09 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
CN102115789B (zh) * 2010-12-15 2013-03-13 厦门大学 用于第二代高通量测序的核酸标签及其设计方法
US20140057799A1 (en) 2010-12-16 2014-02-27 Gigagen System and Methods for Massively Parallel Analysis of Nucleic Acids in Single Cells
US9163281B2 (en) 2010-12-23 2015-10-20 Good Start Genetics, Inc. Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
WO2012088348A2 (en) 2010-12-23 2012-06-28 Sequenom, Inc. Fetal genetic variation detection
WO2012100216A2 (en) 2011-01-20 2012-07-26 Knome, Inc. Methods and apparatus for assigning a meaningful numeric value to genomic variants, and searching and assessing same
GB201101429D0 (en) 2011-01-27 2011-03-16 Biocompatibles Uk Ltd Drug delivery system
US8765455B2 (en) * 2011-01-27 2014-07-01 Lawrence Livermore National Security, Llc Chip-based droplet sorting
DK3037536T3 (da) 2011-01-28 2020-01-13 Illumina Inc Oligonukleotiderstatning for di-taggede og retnings biblioteker
WO2012106385A2 (en) 2011-01-31 2012-08-09 Apprise Bio, Inc. Methods of identifying multiple epitopes in cells
AU2012212148B8 (en) * 2011-02-02 2017-07-06 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Massively parallel contiguity mapping
JP2014506465A (ja) * 2011-02-09 2014-03-17 バイオ−ラド ラボラトリーズ，インコーポレイティド 核酸の分析
WO2012109604A1 (en) 2011-02-11 2012-08-16 Raindance Technologies, Inc. Thermocycling device for nucleic acid amplification and methods of use
EP3412778A1 (en) 2011-02-11 2018-12-12 Raindance Technologies, Inc. Methods for forming mixed droplets
WO2012112804A1 (en) 2011-02-18 2012-08-23 Raindance Technoligies, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
CA2824431A1 (en) 2011-02-25 2012-08-30 Illumina, Inc. Methods and systems for haplotype determination
WO2012116250A1 (en) 2011-02-25 2012-08-30 University Of Massachusetts Medical School Monomers and polymers for functional polycarbonates and poly (ester-carbonates) and peg-co-polycarbonate hydrogels
EP2681196B1 (en) 2011-03-04 2015-09-09 Life Technologies Corporation Compounds and methods for conjugation of biomolecules
WO2012122555A2 (en) 2011-03-09 2012-09-13 Lawrence Ganeshalingam Biological data networks and methods therefor
WO2012129187A1 (en) * 2011-03-18 2012-09-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiplexed digital assays with combinatorial use of signals
WO2012129363A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
GB2489714B (en) 2011-04-05 2013-11-06 Tracesa Ltd Fluid Identification Method
CN107368705B (zh) 2011-04-14 2021-07-13 完整基因有限公司 分析生物体的基因组dna的方法和计算机系统
AU2012249759A1 (en) 2011-04-25 2013-11-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
EP2702170B1 (en) 2011-04-28 2015-12-16 Life Technologies Corporation Methods and compositions for multiplex pcr
SI3415619T1 (sl) 2011-04-28 2021-04-30 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Office of the General Counsel Building 170, Third Floor, Main Quad Identifikacija polinukleotidov, povezanih z vzorcem
EP2705156B1 (en) 2011-05-05 2015-08-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Linear dna amplification
US20140227706A1 (en) * 2011-05-16 2014-08-14 Dna Chip Research Inc. Method for assessing progression of clinical state of malignant neoplasm by quantitative detection of DNA in blood
JP5993940B2 (ja) 2011-05-16 2016-09-21 コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェＫｏｎｉｎｋｌｉｊｋｅ Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｎ．Ｖ． 生体直交型薬物活性化
US9005935B2 (en) 2011-05-23 2015-04-14 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for DNA fragmentation and tagging by transposases
JP6122843B2 (ja) 2011-05-23 2017-04-26 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 多重エマルジョンを含むエマルジョンの制御
WO2012166425A2 (en) 2011-05-27 2012-12-06 President And Fellows Of Harvard College Methods of amplifying whole genome of a single cell
EP3709018A1 (en) 2011-06-02 2020-09-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic apparatus for identifying components of a chemical reaction
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
US9150916B2 (en) 2011-06-24 2015-10-06 Beat Christen Compositions and methods for identifying the essential genome of an organism
US8927218B2 (en) 2011-06-27 2015-01-06 Flir Systems, Inc. Methods and compositions for segregating target nucleic acid from mixed nucleic acid samples
US8975302B2 (en) 2011-07-07 2015-03-10 Life Technologies Corporation Polymer particles, nucleic acid polymer particles and methods of making and using the same
US20130017978A1 (en) 2011-07-11 2013-01-17 Finnzymes Oy Methods and transposon nucleic acids for generating a dna library
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
US9605304B2 (en) 2011-07-20 2017-03-28 The Hong Kong Polytechnic University Ultra-stable oligonucleotide-gold and-silver nanoparticle conjugates and method of their preparation
US20130189700A1 (en) * 2011-07-25 2013-07-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. Breakage of an emulsion containing nucleic acid
WO2013020089A2 (en) 2011-08-04 2013-02-07 Sage Science, Inc. Systems and methods for processing fluids
US10364464B2 (en) 2011-08-08 2019-07-30 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for co-amplifying subsequences of a nucleic acid fragment sequence
US8846883B2 (en) 2011-08-16 2014-09-30 University Of Southhampton Oligonucleotide ligation
WO2013035114A1 (en) 2011-09-08 2013-03-14 Decode Genetics Ehf Tp53 genetic variants predictive of cancer
GB2496016B (en) 2011-09-09 2016-03-16 Univ Leland Stanford Junior Methods for obtaining a sequence
CN103945931B (zh) 2011-09-26 2017-03-22 基因技术股份公司 高效的小体积核酸合成
WO2013095737A2 (en) 2011-09-28 2013-06-27 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for droplet production and/or fluidic manipulation
WO2013055955A1 (en) 2011-10-12 2013-04-18 Complete Genomics, Inc. Identification of dna fragments and structural variations
US9469874B2 (en) 2011-10-18 2016-10-18 The Regents Of The University Of California Long-range barcode labeling-sequencing
US20130109576A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Anthony P. Shuber Methods for detecting mutations
JP2014534771A (ja) 2011-11-04 2014-12-18 インテル コーポレイション 下りリンク協調マルチポイント通信の構成のためのシグナリング
WO2013072790A1 (en) 2011-11-16 2013-05-23 International Business Machines Corporation Microfluidic device with deformable valve
US10689643B2 (en) 2011-11-22 2020-06-23 Active Motif, Inc. Targeted transposition for use in epigenetic studies
US9938524B2 (en) 2011-11-22 2018-04-10 Active Motif, Inc. Multiplex isolation of protein-associated nucleic acids
CN104245917B (zh) 2011-12-03 2017-07-21 Emd密理博公司 用于微流体细胞培养的微型培育系统和方法
US10227639B2 (en) 2011-12-22 2019-03-12 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
WO2013096643A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Gigagen Methods and apparatuses for droplet mixing
RU2643034C2 (ru) 2012-02-09 2018-01-30 Лайф Текнолоджис Корпорейшн Гидрофильные полимерные частицы и способы их получения
CN104271768A (zh) 2012-02-14 2015-01-07 约翰霍普金斯大学 miRNA分析方法
CA2864287C (en) 2012-02-15 2021-01-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Dithioamine reducing agents
EP3854873A1 (en) 2012-02-17 2021-07-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for accurately identifying mutations
US10202628B2 (en) 2012-02-17 2019-02-12 President And Fellows Of Harvard College Assembly of nucleic acid sequences in emulsions
US9176031B2 (en) 2012-02-24 2015-11-03 Raindance Technologies, Inc. Labeling and sample preparation for sequencing
WO2013134261A1 (en) 2012-03-05 2013-09-12 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for epigenetic sequencing
NO2694769T3 (ja) 2012-03-06 2018-03-03
US9552458B2 (en) 2012-03-16 2017-01-24 The Research Institute At Nationwide Children's Hospital Comprehensive analysis pipeline for discovery of human genetic variation
US20150125904A1 (en) 2012-03-30 2015-05-07 Massachusetts Institute Of Technology Probe incorporation mediated by enzymes
EP2647426A1 (en) 2012-04-03 2013-10-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Replication of distributed nucleic acid molecules with preservation of their relative distribution through hybridization-based binding
US8209130B1 (en) 2012-04-04 2012-06-26 Good Start Genetics, Inc. Sequence assembly
CA2870160C (en) 2012-04-16 2021-08-24 Biological Dynamics, Inc. Nucleic acid sample preparation
US20130296173A1 (en) 2012-04-23 2013-11-07 Complete Genomics, Inc. Pre-anchor wash
EP3514243B1 (en) 2012-05-21 2022-08-17 The Scripps Research Institute Methods of sample preparation
ES2774165T3 (es) 2012-06-15 2020-07-17 Univ Texas Secuenciación de alto rendimiento de múltiples transcritos de una única célula
SG11201500313YA (en) 2012-07-24 2015-02-27 Sequenta Inc Single cell analysis using sequence tags
JP6525872B2 (ja) 2012-08-08 2019-06-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 細胞中の複数のエピトープを同定するためのダイナミックレンジを高めること
CN110643681A (zh) 2012-08-13 2020-01-03 加利福尼亚大学董事会 用于检测生物组分的方法和系统
US9388465B2 (en) 2013-02-08 2016-07-12 10X Genomics, Inc. Polynucleotide barcode generation
CN114891871A (zh) 2012-08-14 2022-08-12 10X基因组学有限公司 微胶囊组合物及方法
US20140378345A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20150005200A1 (en) 2012-08-14 2015-01-01 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10584381B2 (en) 2012-08-14 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20140378349A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20140378322A1 (en) * 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20150005199A1 (en) 2012-08-14 2015-01-01 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014047561A1 (en) * 2012-09-21 2014-03-27 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for labeling of agents
US9644199B2 (en) * 2012-10-01 2017-05-09 Agilent Technologies, Inc. Immobilized transposase complexes for DNA fragmentation and tagging
GB201217772D0 (en) 2012-10-04 2012-11-14 Base4 Innovation Ltd Sequencing method
FR2996545B1 (fr) 2012-10-08 2016-03-25 Ecole Polytech Procede microfluidique de traitement et d'analyse d'une solution contenant un materiel biologique, et circuit microfluidique correspondant.
FR2996544B1 (fr) 2012-10-08 2015-03-13 Ecole Polytech Circuit microfluidique permettant la mise en contact de gouttes de plusieurs fluides, et procede microfluidique correspondant.
CN104838014B (zh) 2012-10-15 2017-06-30 生命技术公司 用于标靶核酸富集的组合物、方法、系统和试剂盒
EP2914745B1 (en) 2012-11-05 2017-09-06 Rubicon Genomics, Inc. Barcoding nucleic acids
EP2917366B1 (en) 2012-11-06 2017-08-02 Oxford Nanopore Technologies Limited Quadruplex method
US20140127688A1 (en) 2012-11-07 2014-05-08 Good Start Genetics, Inc. Methods and systems for identifying contamination in samples
US20150299772A1 (en) 2012-12-03 2015-10-22 Elim Biopharmaceuticals, Inc. Single-stranded polynucleotide amplification methods
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
PT2921557T (pt) 2012-12-12 2016-10-19 Massachusetts Inst Technology Engenharia de sistemas, métodos e composições guia otimizadas para a manipulação de sequências
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP3567116A1 (en) 2012-12-14 2019-11-13 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP2749653A1 (en) 2012-12-28 2014-07-02 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Molecular coding for analysis of composition of macromolecules and molecular complexes
EP2752664A1 (en) 2013-01-07 2014-07-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Label-free method for the detection of analytes
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
EP2994749A4 (en) 2013-01-17 2017-07-19 Edico Genome Corp. Bioinformatics systems, apparatuses, and methods executed on an integrated circuit processing platform
KR101984699B1 (ko) 2013-01-24 2019-05-31 삼성전자주식회사 핵산 분석용 미세 유체 시스템
EP3473905B1 (en) 2013-01-25 2020-07-29 Bio-rad Laboratories, Inc. System and method for performing droplet inflation
US10381106B2 (en) 2013-01-28 2019-08-13 Hasso-Plattner-Institut Fuer Softwaresystemtechnik Gmbh Efficient genomic read alignment in an in-memory database
WO2014121241A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
JP2016514047A (ja) 2013-03-06 2016-05-19 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 比較的単分散の液滴を形成するためのデバイスおよび方法
WO2014138711A1 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions, methods and systems for polymerase chain reaction assays
DK3553175T3 (da) 2013-03-13 2021-08-23 Illumina Inc Fremgangsmåde til fremstilling af et nukleinsyresekvenseringsbibliotek
US10612088B2 (en) 2013-03-14 2020-04-07 The Broad Institute, Inc. Massively multiplexed RNA sequencing
US9273349B2 (en) 2013-03-14 2016-03-01 Affymetrix, Inc. Detection of nucleic acids
JP6587544B2 (ja) 2013-03-15 2019-10-09 シグニス バイオテク エセ．エレ．ウ．Ｓｙｇｎｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．Ｌ．Ｕ． 熱安定なＴｔｈＰｒｉｍＰｏｌを用いた増幅及び配列決定方法
US20140274729A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Nugen Technologies, Inc. Methods, compositions and kits for generation of stranded rna or dna libraries
US9328382B2 (en) 2013-03-15 2016-05-03 Complete Genomics, Inc. Multiple tagging of individual long DNA fragments
US11231419B2 (en) 2013-03-15 2022-01-25 Prognosys Biosciences, Inc. Methods for detecting peptide/MHC/TCR binding
WO2014145760A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet generator with collection tube
CA2906818C (en) 2013-03-15 2022-08-16 Verinata Health, Inc. Generating cell-free dna libraries directly from blood
WO2014144495A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abvitro, Inc. Single cell bar-coding for antibody discovery
EP2981349A4 (en) 2013-04-02 2016-11-16 Raindance Technologies Inc SYSTEMS AND METHODS FOR HANDLING MICROFLUIDIC DROPLETS
EP2994559B1 (en) 2013-05-09 2020-07-08 Bio-rad Laboratories, Inc. Magnetic immuno digital pcr assay
EP4321628A2 (en) 2013-05-23 2024-02-14 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Transposition into native chromatin for personal epigenomics
US20160122753A1 (en) 2013-06-12 2016-05-05 Tarjei Mikkelsen High-throughput rna-seq
EP3587585B1 (en) 2013-06-12 2021-03-24 The General Hospital Corporation Methods, kits, and systems for multiplexed detection of target molecules and uses thereof
DK3011031T3 (da) 2013-06-17 2020-12-21 Broad Inst Inc Fremføring og anvendelse af crispr-cas-systemerne, vektorer og sammensætninger til levermålretning og -terapi
US20160208323A1 (en) 2013-06-21 2016-07-21 The Broad Institute, Inc. Methods for Shearing and Tagging DNA for Chromatin Immunoprecipitation and Sequencing
CA2915499A1 (en) 2013-06-27 2014-12-31 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
EP3019618B1 (en) 2013-07-12 2018-10-31 University of South Alabama Minimal piggybac vectors for genome integration
CN103394410B (zh) 2013-07-25 2016-04-20 博奥生物集团有限公司 一种位置可调节的智能磁力架
GB2516684A (en) 2013-07-30 2015-02-04 Sphere Fluidics Ltd Microfluidic devices and systems
KR102402446B1 (ko) 2013-08-28 2022-05-30 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 대량의 동시 단일 세포 분석
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
CA2959978A1 (en) 2013-09-24 2015-04-02 The Regents Of The University Of California Encapsulated sensors and sensing systems for bioassays and diagnostics and methods for making and using them
GB201317301D0 (en) 2013-09-30 2013-11-13 Linnarsson Sten Method for capturing and encoding nucleic acid from a plurality of single cells
EP3055431B1 (en) 2013-10-09 2020-06-24 Stc.Unm Synthetic long read dna sequencing
WO2015065924A2 (en) 2013-10-28 2015-05-07 Massachusetts Institute Of Technology Hydrogel microstructures with immiscible fluid isolation for small reaction volumes
US9824068B2 (en) 2013-12-16 2017-11-21 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
US20140315755A1 (en) 2013-12-26 2014-10-23 Tao Chen Genome-wide Antisense Oligonucleotide and RNAi
AU2014373757B2 (en) 2013-12-30 2019-12-12 Atreca, Inc. Analysis of nucleic acids associated with single cells using nucleic acid barcodes
KR101464100B1 (ko) 2014-01-29 2014-11-21 성균관대학교산학협력단 생체 적용 가능한 리포솜-핵산형광 나노 융합체, 이의 응용, 및 이의 제조방법
EP3102691B1 (en) 2014-02-03 2019-09-11 Thermo Fisher Scientific Baltics UAB Method for controlled dna fragmentation
EP2986761B1 (en) 2014-02-13 2018-08-15 Bio-rad Laboratories, Inc. Chromosome conformation capture in droplet partitions
CA2940669C (en) 2014-02-27 2023-10-03 Igenomx International Genomics Corporation Methods for analysis of somatic mobile elements, and uses thereof
US9694361B2 (en) 2014-04-10 2017-07-04 10X Genomics, Inc. Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same
CN113005108A (zh) 2014-04-15 2021-06-22 伊鲁米那股份有限公司 用于改进插入序列偏倚和增加dna输入耐受性的修饰的转座酶
US20150298091A1 (en) 2014-04-21 2015-10-22 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for barcoding nucleic acids
LT3456846T (lt) 2014-04-21 2022-09-12 President And Fellows Of Harvard College Nukleorūgšties unikalios sekos įvedimo sistemos ir būdai
US10975371B2 (en) 2014-04-29 2021-04-13 Illumina, Inc. Nucleic acid sequence analysis from single cells
US10526601B2 (en) 2014-05-23 2020-01-07 Digenomix Corporation Haploidome determination by digitized transposons
EP3628684A1 (en) 2014-06-06 2020-04-01 Herlev Hospital Determining antigen recognition through barcoding of mhc multimers
WO2015191877A1 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Life Technologies Corporation Systems and methods for substrate enrichment
US10704080B2 (en) 2014-06-11 2020-07-07 Samplix Aps Nucleotide sequence exclusion enrichment by droplet sorting (NEEDLS)
EP3155426B1 (en) 2014-06-13 2023-07-19 Immudex ApS General detection and isolation of specific cells by binding of labeled molecules
US10480021B2 (en) 2014-06-23 2019-11-19 Yale University Methods for closed chromatin mapping and DNA methylation analysis for single cells
CN114214314A (zh) 2014-06-24 2022-03-22 生物辐射实验室股份有限公司 数字式pcr条码化
EP3161162A4 (en) 2014-06-26 2018-01-10 10X Genomics, Inc. Analysis of nucleic acid sequences
US10017759B2 (en) 2014-06-26 2018-07-10 Illumina, Inc. Library preparation of tagged nucleic acid
WO2015200871A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for sample analysis
CN113249435A (zh) 2014-06-26 2021-08-13 10X基因组学有限公司 分析来自单个细胞或细胞群体的核酸的方法
WO2015200891A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 10X Technologies, Inc. Processes and systems for nucleic acid sequence assembly
EP3940703A1 (en) 2014-07-18 2022-01-19 Illumina, Inc. Non-invasive prenatal diagnosis of fetal genetic conditions using cellular dna and cell free dna
US20160024558A1 (en) 2014-07-23 2016-01-28 10X Genomics, Inc. Nucleic acid binding proteins and uses thereof
CN105335116B (zh) 2014-07-30 2018-11-09 联想(北京)有限公司 一种显示控制方法及电子设备
WO2016033251A2 (en) 2014-08-26 2016-03-03 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation
CA2997906A1 (en) 2014-09-09 2016-03-17 The Broad Institute, Inc. A droplet-based method and apparatus for composite single-cell nucleic acid analysis
MX2017003382A (es) 2014-09-15 2017-11-20 Abvitro Llc Secuenciacion de bibliotecas de nucleotidos de alto rendimiento.
WO2016061517A2 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Illumina Cambridge Limited Contiguity preserving transposition
BR112017008877A2 (pt) * 2014-10-29 2018-07-03 10X Genomics Inc métodos e composições para sequenciamento de ácido nucleico-alvo
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
US20180320241A1 (en) 2014-12-19 2018-11-08 Roche Sequencing Solutions, Inc. Methods for identifying multiple epitopes in selected sub-populations of cells
AU2016207023B2 (en) 2015-01-12 2019-12-05 10X Genomics, Inc. Processes and systems for preparing nucleic acid sequencing libraries and libraries prepared using same
CN107209814B (zh) 2015-01-13 2021-10-15 10X基因组学有限公司 用于使结构变异和相位信息可视化的系统和方法
WO2016126882A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
CN107530654A (zh) 2015-02-04 2018-01-02 加利福尼亚大学董事会 通过在离散实体中条形码化对核酸进行测序
MX2017010142A (es) 2015-02-09 2017-12-11 10X Genomics Inc Sistemas y metodos para determinar variacion estructural y ajuste de fases con datos de recuperacion de variantes.
KR20170135834A (ko) 2015-02-10 2017-12-08 일루미나, 인코포레이티드 세포 성분을 분석하기 위한 방법 및 조성물
CN115651972A (zh) 2015-02-24 2023-01-31 10X 基因组学有限公司 用于靶向核酸序列覆盖的方法
WO2016137973A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 10X Genomics Inc Partition processing methods and systems
EP3262192B1 (en) 2015-02-27 2020-09-16 Becton, Dickinson and Company Spatially addressable molecular barcoding
WO2016145409A1 (en) 2015-03-11 2016-09-15 The Broad Institute, Inc. Genotype and phenotype coupling
WO2016149661A1 (en) 2015-03-18 2016-09-22 The Broad Institute, Inc. Massively parallel on-chip coalescence of microemulsions
WO2016160908A1 (en) 2015-03-30 2016-10-06 Verily Life Sciences Llc Methods for combining single cell profiling with combinatorial nanoparticle conjugate library screening
JP2018511341A (ja) 2015-04-17 2018-04-26 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 遺伝子配列決定および他の適用のためのバーコード化システムおよび方法
CN107250447B (zh) 2015-04-20 2020-05-05 深圳华大生命科学研究院 一种长片段dna文库构建方法
EP3708256B1 (en) 2015-04-22 2022-11-30 Stilla Technologies Contact-less priming method for loading a solution in a microfluidic device and associated system
US20160314242A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 10X Genomics, Inc. Sample indexing methods and compositions for sequencing applications
WO2016187256A2 (en) 2015-05-18 2016-11-24 10X Genomics, Inc. Mobile solid phase compositions for use in biochemical reactions and analyses
WO2016187179A1 (en) 2015-05-18 2016-11-24 10X Genomics, Inc. Stabilized reducing agents and methods using same
WO2016191380A1 (en) 2015-05-26 2016-12-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. De novo diploid genome assembly and haplotype sequence reconstruction
WO2016187717A1 (en) 2015-05-26 2016-12-01 Exerkine Corporation Exosomes useful for genome editing
WO2016191618A1 (en) 2015-05-27 2016-12-01 Jianbiao Zheng Methods of inserting molecular barcodes
AU2016281766B2 (en) 2015-06-24 2019-05-09 Oxford BioDynamics PLC Epigenetic chromosome interactions
MX2018000729A (es) 2015-07-17 2018-09-06 Harvard College Métodos para amplificar las secuencias de ácido nucleico.
US10934636B2 (en) 2015-08-12 2021-03-02 CeMM—FORSCHUNGSZENTRUM FÜR MOLEKULARE MEDIZIN GmbH Methods for studying nucleic acids
US11479805B2 (en) 2015-08-21 2022-10-25 The General Hospital Corporation Combinatorial single molecule analysis of chromatin
AU2016326737B2 (en) 2015-09-24 2023-01-12 Abvitro Llc Affinity-oligonucleotide conjugates and uses thereof
US10900031B2 (en) 2015-10-19 2021-01-26 Zhejiang Annoroad Bio-Technology Co. Ltd. Method for constructing high-resolution single cell Hi-C library with a lot of information
CN108368522A (zh) 2015-10-20 2018-08-03 10X 基因组学有限公司 用于高通量单细胞遗传操作的方法和系统
WO2017075265A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute, Inc. Multiplex analysis of single cell constituents
WO2017075294A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Board Institute Inc. Assays for massively combinatorial perturbation profiling and cellular circuit reconstruction
CA3004310A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 Atreca, Inc. Combinatorial sets of nucleic acid barcodes for analysis of nucleic acids associated with single cells
SG11201803983UA (en) 2015-11-19 2018-06-28 10X Genomics Inc Transformable tagging compositions, methods, and processes incorporating same
EP3384048B1 (en) 2015-12-04 2021-03-24 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
WO2017117358A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital protein quantification
US20170260584A1 (en) 2016-02-11 2017-09-14 10X Genomics, Inc. Cell population analysis using single nucleotide polymorphisms from single cell transcriptomes
JP6735348B2 (ja) 2016-02-11 2020-08-05 １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド 全ゲノム配列データのデノボアセンブリのためのシステム、方法及び媒体
US20190078150A1 (en) 2016-03-01 2019-03-14 Universal Sequencing Technology Corporation Methods and Kits for Tracking Nucleic Acid Target Origin for Nucleic Acid Sequencing
US11680253B2 (en) 2016-03-10 2023-06-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Transposase-mediated imaging of the accessible genome
WO2017180420A1 (en) 2016-04-11 2017-10-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for detecting single t cell receptor affinity and sequence
WO2017197343A2 (en) 2016-05-12 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic on-chip filters
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
WO2018031631A1 (en) 2016-08-10 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Methods of de novo assembly of barcoded genomic dna fragments
WO2018039338A1 (en) 2016-08-23 2018-03-01 10X Genomics, Inc. Microfluidic surface-mediated emulsion stability control
WO2018044831A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 Integrated Dna Technologies, Inc. Cleavable hairpin primers
GB2569252A (en) 2016-08-31 2019-06-12 Harvard College Methods of combining the detection of biomolecules into a single assay using fluorescent in situ sequencing
WO2018039969A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 President And Fellows Of Harvard College Methods of whole genome digital amplification
US20180080021A1 (en) 2016-09-17 2018-03-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Simultaneous sequencing of rna and dna from the same sample
CA3034924A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Cellular Research, Inc. Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
EP4026905B1 (en) 2016-10-19 2024-04-17 10X Genomics, Inc. Methods for barcoding nucleic acid molecules from individual cells or cell populations
DK3553180T3 (da) 2016-12-07 2022-07-25 Mgi Tech Co Ltd Fremgangsmåde til konstruktion af enkeltcellesekventeringsbibliotek og anvendelse deraf
EP3555290B1 (en) 2016-12-19 2022-11-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet tagging contiguity preserved tagmented dna
AU2017382905A1 (en) 2016-12-21 2019-07-04 The Regents Of The University Of California Single cell genomic sequencing using hydrogel based droplets
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20190177800A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for labeling cells
EP3565904A1 (en) 2016-12-29 2019-11-13 Illumina, Inc. Analysis system for orthogonal access to and tagging of biomolecules in cellular compartments
WO2018129368A2 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Editas Medicine, Inc. Methods of assessing nuclease cleavage
EP3568508A4 (en) 2017-01-12 2020-12-16 Massachusetts Institute Of Technology METHODS FOR T-LYMPHOCYTE RECEPTOR AND B-LYMPHOCYTE RECEPTOR ANALYSIS
CN117512066A (zh) 2017-01-30 2024-02-06 10X基因组学有限公司 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和系统
US10347365B2 (en) 2017-02-08 2019-07-09 10X Genomics, Inc. Systems and methods for visualizing a pattern in a dataset
GB201704402D0 (en) 2017-03-20 2017-05-03 Blacktrace Holdings Ltd Single cell DNA sequencing
CN110462058A (zh) 2017-03-24 2019-11-15 新加坡国立大学 用于多重检测分子的方法
CA3059370C (en) 2017-04-12 2022-05-10 Karius, Inc. Methods for concurrent analysis of dna and rna in mixed samples
WO2018191701A1 (en) 2017-04-14 2018-10-18 The Broad Institute, Inc. High-throughput screens for exploring biological functions of microscale biological systems
US20180312822A1 (en) 2017-04-26 2018-11-01 10X Genomics, Inc. Mmlv reverse transcriptase variants
US10544413B2 (en) 2017-05-18 2020-01-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for sorting droplets and beads
EP4215616A1 (en) 2017-05-18 2023-07-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for sorting droplets and beads
CN110870018A (zh) 2017-05-19 2020-03-06 10X基因组学有限公司 用于分析数据集的系统和方法
US10914729B2 (en) 2017-05-22 2021-02-09 The Trustees Of Princeton University Methods for detecting protein binding sequences and tagging nucleic acids
US10400235B2 (en) 2017-05-26 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
US10676779B2 (en) 2017-06-05 2020-06-09 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
WO2018226546A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 10X Genomics, Inc. Gaskets for the distribution of pressures in a microfluidic system
SG11201912824YA (en) 2017-06-20 2020-01-30 10X Genomics Inc Methods and systems for improved droplet stabilization
EP3642358A1 (en) 2017-06-21 2020-04-29 Bluedot LLC Systems and methods for identification of nucleic acids in a sample
CN108336542B (zh) 2017-06-23 2020-02-21 番禺得意精密电子工业有限公司 电连接器
CN111094585A (zh) 2017-08-01 2020-05-01 伊鲁米纳公司 用于核苷酸测序的水凝胶珠
US9946577B1 (en) 2017-08-14 2018-04-17 10X Genomics, Inc. Systems and methods for distributed resource management
US10357771B2 (en) 2017-08-22 2019-07-23 10X Genomics, Inc. Method of producing emulsions
CN111386134B (zh) 2017-10-04 2023-11-03 10X基因组学有限公司 使用改进的聚合物形成珠的组合物、方法和系统
US10590244B2 (en) 2017-10-04 2020-03-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
US20190127731A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. Methods for preparing nucleic acid molecules
WO2019083852A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. MICROFLUIDIC CHANNEL NETWORKS FOR PARTITIONING
WO2019084043A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS
WO2019084328A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS FOR PREPARING NUCLEIC ACID MOLECULES
WO2019084165A1 (en) 2017-10-27 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR SAMPLE PREPARATION AND ANALYSIS
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
WO2019108851A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis
WO2019113235A1 (en) 2017-12-06 2019-06-13 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing nucleic acid molecules
EP3724658A1 (en) 2017-12-12 2020-10-21 10X Genomics, Inc. Systems and methods for single cell processing
EP3728631A1 (en) 2017-12-22 2020-10-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing nucleic acid molecules from one or more cells
WO2019148042A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
CN112004920A (zh) 2018-02-05 2020-11-27 斯坦福大学托管董事会 用于单细胞和集合细胞的多重测量的系统和方法
CN112005115A (zh) 2018-02-12 2020-11-27 10X基因组学有限公司 表征来自单个细胞或细胞群体的多种分析物的方法
SG11202008080RA (en) 2018-02-22 2020-09-29 10X Genomics Inc Ligation mediated analysis of nucleic acids
WO2019169028A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 10X Genomics, Inc. Transcriptome sequencing through random ligation
WO2019169347A1 (en) 2018-03-02 2019-09-06 10X Genomics, Inc. Systems and apparatus for holding plates
WO2019191321A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 10X Genomics, Inc. Nucleic acid enrichment within partitions
EP3775271A1 (en) 2018-04-06 2021-02-17 10X Genomics, Inc. Systems and methods for quality control in single cell processing
US20190345636A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for molecular library generation
WO2019217758A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for molecular library generation
US20190352717A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 10X Genomics, Inc. Targeted non-invasive prenatal testing
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
US11574706B2 (en) 2018-06-28 2023-02-07 10X Genomics, Inc. Systems and methods for visualization of single-cell resolution characteristics
US20200033366A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
CN112703252A (zh) 2018-08-03 2021-04-23 10X基因组学有限公司 用于最小化条形码交换的方法和系统
US20200056223A1 (en) 2018-08-20 2020-02-20 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for cellular processing
WO2020142779A1 (en) 2019-01-06 2020-07-09 10X Genomics, Inc. Methods and systems for enrichment of barcodes

Also Published As

Publication number Publication date
DK2954065T3 (da) 2021-09-06
CN108753766A (zh) 2018-11-06
AU2014214682B2 (en) 2018-07-26
EP2954104A1 (en) 2015-12-16
EP2954104B1 (en) 2020-09-16
AU2014214682A1 (en) 2015-08-13
WO2014124336A2 (en) 2014-08-14
KR20150119047A (ko) 2015-10-23
US11193121B2 (en) 2021-12-07
EP2954065B1 (en) 2021-07-28
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