CN105567562B - 用于单细胞超声波基因导入的微流体系统及其导入方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于单细胞超声波基因导入的微流体系统及其导入方法，其特征在于：微流体系统是在PMMA基体上通过热压工艺制作有微流体管道，在聚酰亚胺基底上通过MEMS工艺制作有不同频率的超声波换能器；PMMA基体和聚酰亚胺基底键合固定在一起，且使超声波换能器位于微流体管道上方。使用时，同时将待处理细胞液和目的基因溶液注入微流体管道并使二者混合均匀，开启超声波换能器，在待处理细胞表面产生超声微孔，目的基因通过超声微孔导入待处理细胞。本发明的微流体系统可以精准地实现单细胞超声波基因递送，不受细胞大小和种类的限制，不改变细胞生存环境，具有导入成功率高、器件微型化、操作快速简便、精度高、可靠性高等优点。

Description

用于单细胞超声波基因导入的微流体系统及其导入方法
技术领域
本发明涉及对生物细胞基因导入的设备和方法，具体涉及一种用于单细胞超声波精准基因导入的器件和方法。
背景技术
上个世纪90年代至今，随着超声医学的飞速发展以及超声空化的理论研究的深入，超声波基因递送技术逐渐兴起。超声波基因递送是近期发展出来的一种新型细胞膜穿孔技术，已经被应用于DNA和药物的细胞转染。一定强度的超声波在液体中传播时形成气泡，气泡破裂时形成局域高温高压和冲击波，这就是所谓的空化效应。利用空化效应，在液体环境中，可在细胞膜上产生纳米级的微穿孔，细胞周围液体中的基因片段就会在超声波的作用下进入细胞。由于细胞膜的流动性，细胞膜上的微穿孔在十几秒内会自动愈合。目前超声波基因递送技术都是在宏观容积下进行的，并使用了传统的大型超声波设备，例如浸泡液体中的超音波喇叭形辐射体或超声波浴装置。因此，相关的细胞分析和研究只能在105–107个细胞的宏观规模上进行，得到的结果也只能是平均化的。然而，由于各细胞反应的不均匀性及所处的生活或代谢周期不同，这种平均化的结果往往导致细胞分析数据难以解读。解决这个问题需要开发新技术和装置来进行单细胞的操作和精密分析。
发明内容
基于上述细胞基因导入设备的缺点，本发明提出了一种用于单细胞超声波基因导入的微流体系统及其导入方法，旨在可以根据细胞的种类和目的基因的大小实现单细胞精准基因导入。
本发明解决技术问题，采用如下技术方案：
本发明用于单细胞超声波基因导入的微流体系统，其结构特点在于：所述微流体系统是在PMMA基体上通过热压工艺制作有微流体管道，在聚酰亚胺基底上通过MEMS工艺设置有超声波换能器；所述微流体管道为一体化设置的三段式结构，前段呈“Y”型，中间段呈蛇形，后段呈直线型；在“Y”型前段的两端口处分别设置有待处理细胞液入口和目的基因溶液入口，在“Y”型前段的两分支交口处设置有混合腔，在直线型后段的端口处设置有处理后细胞液出口；所述PMMA基体和所述聚酰亚胺基底键合固定在一起，且使超声波换能器位于微流体管道蛇形中间段的上方。所述超声波换能器的结构和制备工艺参见专利201510309834.5。
具体设置时，可尽量扩大混合腔的大小，以保证待处理细胞液和目的基因溶液可以在此处混合均匀。
基于MEMS工艺的微流体管道的尺寸一般是μm级，而动物细胞的尺寸一般也是在μm级。所以微流体技术在尺寸上与细胞大小匹配，适宜用于单细胞操作。所述超声波换能器的功率与所述微流体管道中的流体能量相匹配，使得超声波基因导入在微流体规模进行，从而满足单细胞分析的需要。进一步的，在微流体管道上设置有多个超声波换能器，使细胞沿微流体管道流动时有多次基因导入的机会，从而增加细胞导入的成功率。
利用上述微流体系统的单细胞超声波基因导入方法是：
首先，同时通过注射泵将待处理细胞液从待处理细胞液入口注入微流体管道，将目的基因溶液从目的基因溶液入口注入微流体管道；
然后，待处理细胞液和目的基因溶液在微流体管道的混合腔处汇合，并混合均匀，进入蛇形中间段；开启相应超声波换能器，产生超声波并作用于待处理细胞，在待处理细胞表面产生超声微孔，目的基因通过超声微孔进入待处理细胞，完成目的基因的导入；
最后，处理后细胞进入直线型后段，通过移液枪从处理后细胞液出口处收集处理后细胞液。
进一步的，通过注射泵控制待处理细胞液和目的基因溶液的流速，使目的基因溶液的流速快于待处理细胞液的流速，以保证待处理细胞可以与尽可能多的目的基因接触，增加导入概率；同时，通过注射控制流速，以控制待处理细胞在微流体管道中的时间，从而间接控制超声波换能器对待处理细胞的作用时间，以控制目的基因的导入数量。
更进一步的，根据待处理细胞种类和目的基因片段的大小，确定所选用超声波换能器的超声波频率。再通过调节具有特定超声波频率的超声波换能器的驱动电压的大小，调控超声波对待处理细胞的处理强度，得到对待处理细胞损害小、目的基因导入率高的最适驱动电压。一般情况下，所选用超声波换能器的超声波频率在1MHz～3MHz范围内，电压在50V～200V范围内。最后，在所确定的超声波频率、最适驱动电压条件下，使超声波换能器作用于待处理细胞，实现对多种细胞进行多种目的基因片段的导入。
此外，在所述目的基因溶液中可加入超声波造影剂，以增强超声空化的效果，进而增加细胞的转染率。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1、本发明提供的微流体系统可以精准的实现单细胞超声波基因导入，不受细胞大小和种类的限制，通过调整器件中微流体管道的尺寸，可以实现包括动物、植物、微生物在内的各种类型细胞外援基因的导入，具有微型化、高精度、高可靠性、操作快速简便等优点。
2、本发明提供的微流体系统在微流体管道上设置了多个超声波换能器，细胞沿微流体管道流动时有多次基因导入的机会，细胞导入的成功率大大提高。
3、本发明提供的微流体系统中的基底是透明材质且厚度薄，可以直接在显微镜下实时观察并用显微镜记录转染结果。
4、本发明提供的微流体系统中所用微流体管道是μm级，能精准控制待处理细胞和目的基因，节约原材料。
5、本发明提供的微流体系统中可以同时集成多个微流体管道，不同管道可以对不同待处理细胞进行基因导入，实现同时对多种细胞进行基因导入，增加工作效率。
6、本发明提供的微流体系统在使用时可供操作人员根据各种细胞种类，设置各种参数，摸索最适的导入参数，操作简单，可重复性高。
7、本发明提供的微流体系统在使用时可以联合传统的超声造影剂转导，实现高效率的转染。
8、本发明提供的微流体系统是高度集成的靶细胞基因导入装置，具有高度集成化的特点，总体积仅60mm×40mm×5mm左右，具有明显的体积小、重量轻，便于携带优势。
9、相对宏观大容积的细胞导入技术，本发明还具有试剂用量小、残留少、操作精确快捷等优点，可为重大疾病的精准化治疗和个体化医疗提供强有力的技术支持。
附图说明
图1为本发明用于单细胞超声波基因导入的微流体系统的平面示意图；
图2为本发明用于单细胞超声波基因导入的微流体系统中的超声波换能器的剖面示意图；
图3为本发明微流体管道的制作工艺示意图；
图中标号：1为待处理细胞液入口；2为目的基因溶液入口；3为混合腔；4为超声波换能器；5为处理后细胞液出口；6为PMMA基体；7为微流体管道；8为聚酰亚胺基底；9为PMMA盖板；10为待处理细胞；11为目的基因；12为金属模具。
具体实施方式
实施例1
如图1、图2所示，用于单细胞超声波基因递送的微流体系统是在PMMA基体6上通过热压工艺制作有微流体管道7，在聚酰亚胺基底8上通过MEMS工艺设置有超声波换能器4；
微流体管道为一体化设置的三段式结构，前段呈“Y”型，中间段呈蛇形，后段呈直线型；在“Y”型前段的两端口处分别设置有待处理细胞液入口1和目的基因溶液入口2，在“Y”型前段的两分支交口处设置有混合腔3，在直线型后段的端口处设置有处理后细胞液出口5；PMMA基体6和聚酰亚胺基底8键合固定在一起，且使超声波换能器4位于微流体管道蛇形中间段的上方。
具体实施时，在微流体管道上可设置多个超声波换能器，细胞沿微流体管道流动时有多次基因导入的机会，增加细胞导入的成功率。
本发明微流体系统的制备工艺为：
(1)热压工艺制作微流体管道
如图3所示，首先用数控铣床加工金属模具12；然后在90-100℃下、以1MPa压对PMMA基体6进行热压；最后脱模，即在PMMA基体6上形成微流体管道7。
(2)通过MEMS工艺制作超声波换能器(参见专利201510309834.5)
首先在柔性聚酰亚胺基底8上制备呈阵列排布碗状凹形结构；然后在上述聚酰亚胺基底8的碗形凹形表面依次形成下电极、压电薄膜和上电极；最后用旋涂的方法在上述上电极的上表面旋涂一层保护层并烘干，即制成超声波换能器4。
(3)微流体管道与超声波换能器的键合
将带有超声换能器的聚酰亚胺基底和带有微流体管道的PMMA基体对准，然后在聚酰亚胺基底上加一层PMMA盖板9，最后固定嵌合，即完成用于单细胞超声波基因导入的微流体系统的制作。
实施例2
本实施例用于说明如何利用上述微流体系统实现单细胞超声波基因导入：
首先，同时通过注射泵将待处理细胞液从待处理细胞液入口注入微流体管道，将目的基因溶液从目的基因溶液入口注入微流体管道；
然后，待处理细胞液和目的基因溶液在微流体管道的混合腔处汇合，并混合均匀，进入蛇形中间段；开启相应超声波换能器，产生超声波并作用于待处理细胞10，在待处理细胞表面产生超声微孔，目的基因通过超声微孔进入待处理细胞，完成目的基因11的导入；
最后，处理后细胞进入直线型后段，通过吸液枪从处理后细胞液出口处收集处理后细胞液。
具体操作时，通过注射泵控制待处理细胞液和目的基因溶液的流速，使目的基因溶液的流速快于待处理细胞液的流速，以保证待处理细胞可以与尽可能多的目的基因接触，增加导入概率；同时，通过注射控制流速，以控制待处理细胞在微流体管道中的时间，从而间接控制超声波换能器对待处理细胞的作用时间，以控制目的基因的导入数量。
操作人员应根据待处理细胞和目的基因片段的大小，确定所选用超声波换能器的超声波频率。再通过调节具有特定超声波频率的超声波换能器的驱动电压的大小，调控超声波对待处理细胞的处理强度，得到对待处理细胞损害小、目的基因导入率高的最适驱动电压。一般情况下，所选用超声波换能器的超声波频率在1MHz～3MHz范围内，电压在50V～200V范围内。最后，在所确定的超声波频率、最适驱动电压条件下，使超声波换能器作用于待处理细胞，实现对多种细胞进行多种目的基因片段的导入。
具体操作时，在所述目的基因溶液中可加入超声波造影剂，以增强超声空化的效果，进而增加细胞的转染率。

Claims (7)

1.用于单细胞超声波基因导入的微流体系统，其特征在于：所述微流体系统是在PMMA基体上通过热压工艺制作有微流体管道，在聚酰亚胺基底上通过MEMS工艺设置有超声波换能器；所述微流体管道为一体化设置的三段式结构，前段呈“Y”型，中间段呈蛇形，后段呈直线型；在“Y”型前段的两端口处分别设置有待处理细胞液入口和目的基因溶液入口，在“Y”型前段的两分支交口处设置有混合腔，在直线型后段的端口处设置有处理后细胞液出口；所述PMMA基体和所述聚酰亚胺基底键合固定在一起，且使超声波换能器位于微流体管道蛇形中间段的上方；
在微流体管道上设置有多个超声波换能器，使细胞沿微流体管道流动时有多次基因导入的机会，从而增加细胞导入的成功率。
2.根据权利要求1所述的用于单细胞超声波基因导入的微流体系统，其特征在于：所述超声波换能器的功率与所述微流体管道中的流体能量相匹配，使得超声波基因导入在微流体规模进行，从而满足单细胞分析的需要。
3.一种利用权利要求1所述微流体系统的单细胞超声波基因导入方法，其特征在于：
首先，同时通过注射泵将待处理细胞液从待处理细胞液入口注入微流体管道，将目的基因溶液从目的基因溶液入口注入微流体管道；
然后，待处理细胞液和目的基因溶液在微流体管道的混合腔处汇合，并混合均匀，进入蛇形中间段；开启相应超声波换能器，产生超声波并作用于待处理细胞，在待处理细胞表面产生超声微孔，目的基因通过超声微孔进入待处理细胞，完成目的基因的导入；
最后，处理后细胞液进入直线型后段，通过移液枪从处理后细胞液出口处收集处理后细胞液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：通过注射泵控制待处理细胞液和目的基因溶液的流速，使目的基因溶液的流速快于待处理细胞液的流速，以保证待处理细胞可以与尽可能多的目的基因接触，增加导入概率；同时，通过注射泵控制流速，以控制待处理细胞在微流体管道中的时间，从而间接控制超声波换能器对待处理细胞的作用时间，以控制目的基因的导入数量。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
根据待处理细胞的不同种类和目的基因片段的大小，选择开启合适超声波频率的超声波换能器，实现对多种细胞进行多种目的基因片段的导入；
通过调节具有特定超声波频率的超声波换能器的驱动电压的大小，可调控超声波对待处理细胞的处理强度，从而可通过调节驱动电压实现高导入率、低伤害的细胞导入。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于：所选用超声波换能器的超声波频率在1MHz～3MHz范围内，电压在50V～200V范围内。
7.根据权利要求3所述方法，其特征在于：在所述目的基因溶液中可加入有超声造影剂，以增强超声空化的效果，进而增加细胞的转染率。
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