KR20180008493A - 생화학 반응 및 분석에 사용하기 위한 이동성 고체상 조성물 - Google Patents

Abstract

입자 현탁액을 포함하는 조성물로서, 그러한 입자 현탁액은, 예를 들어, 유동 제한, 시약 전달, 및 미세유체 시스템에서의 사용을 포함하는 각종 응용분야에서 사용하기 위한 특징을 갖는다. 제공된 몇몇 조성물에서, 입자 현탁액은 변형 가능한 입자를 포함하고, 특히 조성물에서 변형 가능한 입자는 비드 또는 겔 비드이다.

Description

생화학 반응 및 분석에 사용하기 위한 이동성 고체상 조성물

상호 참조

본 출원은 2015년 5월 18일자로 출원된 미국 가출원 제62/163,238호에 대한 우선권을 주장하며, 이 출원은 모든 목적을 위하여 그의 전문이 참고로 본 명세서에 편입된다.

최근 역사는 유전, 질병 병리학, 전염병학, 농업 및 다양한 기타 분야의 분자 생물학 시스템에 대한 관심과 이의 분석의 폭발적 증가를 보이고 있다. 이와 함께 생화학 및 세포 검정 시스템, 고효율 유전 분석 시스템, 복잡한 생물 정보학 등을 비롯하여 매우 복잡한 생물 시스템을 분석하기 위한 분석 방법 및 시스템이 폭발적으로 증가해왔다.

또한, 다양한 이들 분석 및/또는 처리 시스템은, 주어진 분석을 위한 성분 제시를 위하여 그리고/또는 반응물과 상호 작용하여 정제, 분리, 표지화 또는 그 밖에는 분석 과정의 원조를 위하여, 이동성 고체상 지지체, 예컨대, 입자, 비드(bead), 콜로이드 등을 이용한다. 소정의 응용분야를 위하여, 이러한 이동성 고체상은 이러한 응용분야에서 작용하는 효과를 개선하기 위하여 많은 파라미터 중 하나 이상을 충족시킴으로써 유익할 수 있다. 본 개시내용은 이들 및 기타 요건을 충족시키는 방법, 조성물 및 시스템을 기술한다.

본 명세서에는, 입자 현탁액을 포함하는 개선된 조성물이 기재되어 있으며, 여기서, 이러한 입자 현탁액은, 예를 들어, 시약 전달을 비롯한 각종 용도에서 이용하기 위한 그리고 미세유체 시스템에서 이용하기 위한 신규하고 유용한 특징을 갖는다.

일 양상에 있어서, 본 개시내용은 입자의 현탁액을 포함하는 조성물을 제공한다. 입자의 현탁액은 (i) 현탁액 중 입자의 적어도 95%가 현탁액에 대해서 평균입자크기의 10% 이내인 입자의 분산도; (ii) 약 5㎪ 내지 100㎪의 탄성률(elastic modulus)을 갖는 복수의 입자; (iii) 약 0.1 cP 내지 약 100 cP의 용액 점도; 및 (iv) 약 1㎚ 내지 약 20㎚의 공극 크기를 갖는 현탁액 중의 입자 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

일반적으로, 일 양상에 있어서, 변형 가능한 입자의 현탁액을 포함하는 조성물이 제공되되, 여기서 현탁액은,

(i) 현탁액 중 변형 가능한 입자의 적어도 95%가 현탁액에 대해서 평균입자크기의 10% 이내인 입자의 분산도;

(ii) 약 5㎪ 내지 100㎪의 탄성률을 갖는 복수의 변형 가능한 입자;

(iii) 약 0.1 cP 내지 약 100 cP의 용액 점도; 및

(iv) 약 1㎚ 내지 약 20㎚의 공극 크기를 갖는 변형 가능한 입자 중 하나 이상을 특징으로 한다.

일 실시형태에 있어서, 변형 가능한 입자는 상기 변형 가능한 입자보다 더 좁은 미세유체 물리적 특징부(microfluidic physical feature)를 통과 가능하다.

다른 실시형태에 있어서, 미세유체 물리적 특징부는 필터, 장애물(obstacle), 통로(passage), 채널(channel), 공간 또는 이들의 임의의 조합이다.

일 실시형태에 있어서, 변형 가능한 입자는 비드이다. 관련된 실시형태에 있어서, 비드는 겔 비드(gel bead)이다.

다른 실시형태에 있어서, 변형 가능한 입자는 약 1㎛ 내지 약 1㎜, 약 10㎛ 내지 약 100㎛, 약 20㎛ 내지 약 100㎛, 약 30㎛ 내지 약 80㎛ 및 약 40㎛ 내지 약 60㎛의 직경으로 이루어진 군으로부터 선택된 직경을 갖는다. 일 실시형태에 있어서, 변형 가능한 입자는 약 10㎛ 내지 약 100㎛의 직경을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 변형 가능한 입자는 약 30㎛ 내지 약 100㎛의 직경을 갖는다.

추가의 양상에 있어서, 변형 가능한 입자의 현탁액은 약 5㎪ 내지 약 100㎪의 전단 탄성률(shear modulus)을 특징으로 한다.

또 다른 양상에 있어서, 하기 단계를 포함하는, 변형 가능한 입자의 현탁액으로부터 오염물을 제거하는 방법이 제공된다:

i) 변형 가능한 입자의 직경보다 더 작은 공극 크기를 갖는 메쉬 필터(mesh filter)를 통해서 변형 가능한 입자를 통과시키는 단계; 및

ii) 변형 가능한 입자를 수집하는 단계.

특정 실시형태에 있어서, 메쉬 필터는 약 10㎛ 내지 약 50㎛의 공극 크기를 포함한다. 관련된 실시형태에 있어서, 변형 가능한 입자는 약 10㎛ 내지 약 100㎛의 직경을 갖는다. 상이한 실시형태에 있어서, 변형 가능한 입자는 약 30㎛ 내지 약 100㎛의 직경을 갖는다. 구체적인 실시형태에 있어서, 공극 크기는 약 30㎛이다. 더욱 구체적인 실시형태에 있어서, 공극 크기는 약 41㎛이다. 일 실시형태에 있어서, 변형 가능한 입자는 겔 비드이다.

일반적으로, 또 다른 양상에 있어서, 하기 단계들을 포함하는, 올리고뉴클레오타이드 표지된 변형 가능한 겔 비드 조성물을 저장하는 방법이 제공된다:

i) 올리고뉴클레오타이드에 결합된 변형 가능한 겔 비드의 조성물을 제공하는 단계; 및

ii) 조성물을 적어도 12주 동안 약 pH 7.4에서 저장하는 단계로서, 여기서 결합된 올리고뉴클레오타이드의 방출이 최대 0.025%인, 상기 저장하는 단계.

일 실시형태에 있어서, 변형 가능한 겔 비드는 약 10㎛ 내지 약 100㎛의 직경을 갖는다. 구체적인 실시형태에 있어서, 변형 가능한 겔 비드는 약 30㎛ 내지 약 100㎛의 직경을 갖는다.

일반적으로, 또 다른 양상에 있어서, 변형 가능한 입자의 현탁액을 포함하는 조성물을 제공하되, 상기 조성물은,

i) 현탁액이 리게이션 완충액(ligation buffer), 리가제 효소(ligase enzyme), 올리고뉴클레오타이드, 및 임의의 환원제의 부재를 포함하는 용액을 갖되, 상기 용액은 환원제의 부재 시에도 변형 가능한 입자에 대한 올리고뉴클레오타이드의 리게이션을 지원하고;

ii) 변형 가능한 입자가 약 5㎪ 내지 100㎪의 탄성률을 가지며; 그리고

iii) 변형 가능한 입자가 응집에 대해 내성이 있되, 상기 변형 가능한 입자는 그 외에는 환원제의 존재 시에 응집하는 경향이 있는 것을 특징으로 한다.

일 실시형태에 있어서, 현탁액은 하기 중 하나 이상을 더욱 특징으로 한다:

i) 현탁액 중 입자의 적어도 95%가 현탁액에 대해서 평균입자크기의 10% 이내인 입자의 분산도;

ii) 약 0.1 cP 내지 약 100 cP의 용액 점도; 및

iii) 약 1㎚ 내지 약 20㎚의 공극 크기를 갖는 입자.

일반적으로, 추가의 양상에 있어서, 하기 단계들을 포함하는, 위에서 기재된 변형 가능한 입자의 현탁액을 이용해서 여과하는 방법이 제공된다:

i) 변형 가능한 입자의 현탁액을 유동 제한기(flow restrictor)로서 이용하는 단계; 및

ii) 여과될 용액을, 현탁액을 통해서 통과시키는 단계.

일 실시형태에 있어서, 변형 가능한 입자는 약 2㎚ 내지 약 6㎚의 공극 크기를 갖는다. 특정 실시형태에 있어서, 변형 가능한 입자는 약 5㎚의 공극 크기를 갖는다. 구체적인 실시형태에 있어서, 변형 가능한 입자는 4.4㎚ 미만의 크기 컷 오프(size cut off)를 제공한다.

일반적으로 추가의 양상에 있어서, 입자의 현탁액을 포함하는 조성물이 제공되되, 현탁액은 하기 중 하나 이상을 특징으로 한다:

(i) 현탁액 중 입자의 적어도 95%가 현탁액에 대해서 평균입자크기의 10% 이내인 입자의 분산도;

(ii) 약 5㎪ 내지 100㎪의 탄성률을 갖는 복수의 입자;

(iii) 약 0.1 cP 내지 약 100 cP의 용액 점도; 및

(iv) 약 1㎚ 내지 약 20㎚의 공극 크기를 갖는 입자.

참고에 의한 편입

본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 마치 각 개별적인 간행물, 특허 및 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 편입되도록 나타내는 것과 같은 정도로 참고로 본 명세서에 편입된다.

도 1은 미세유체 시스템에 유동 중인 겔 비드 입자의 일련의 사진 이미지.
도 2는 겔 비드 입자 크기에 대한 증가하는 삼투압의 변형 효과를 도시한 도표.
도 3은 시간 경과에 대한 오염률(contamination rate)에 대한 pH의 효과를 도시한 도표.

또한, 본 발명의 다양한 실시형태가 본 명세서에 도시되고 설명되었지만, 당업자에게는 그러한 실시형태들이 단지 예시로서 제공된다는 것이 자명할 것이다. 본 발명으로부터 벗어나는 일 없이 당업자에게는 다양한 변형, 변경 및 대체가 떠오를 수 있다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안이 이용될 수 있음이 이해되어야 한다.

본 개시내용은 일반적으로 보다 넓은 생화학적 및/또는 생물학적 분석 과정의 일부로서 포함하는 생화학적 반응에서 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 때때로 미세유체 맥락에서 관심 대상 반응에 시약을 효과적으로 전달하기 위하여 이동성 고체상 조성물을 이용한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은, 예를 들어 핵산 분석 및 서열분석 용도를 비롯하여 고도로 다중화된 샘플의 분석을 위하여 고도로 병렬로 놓인 반응 시스템을 생성시킴에 있어서의 용도를 지닐 수 있다.

I. 일반적 특징

생물학적, 생화학적, 및/또는 화학적 처리 및/또는 반응을 위한 처리 및/또는 분석 반응에서 사용하기 위한 이동성 고체상 조성물이 본 명세서에 기재되어 있다. 몇몇 경우에, 미세유체 시스템 내에 시약을 운반하고 제공하고/하거나 전달하는데 사용되는 이동성 고체상 시스템이 제공된다. 몇몇 경우에, 본 명세서에 기재된 조성물 및 시스템은 미세유체 시스템에서의 시약 전달 비히클 또는 기타 용도로서 이러한 조성물의 사용에 유익한 많은 상이한 파라미터 중 하나 이상을 충족시키도록 구성된다.

일반적으로, 조성물의 특징은 미세유체 시스템 내 유동 특징, 미세유체 시스템에서의 사용에 관련된 조성물의 기계적 강건성(robustness), 및 조성물 내 시약의 반복 분석 처리의 취급, 시약 장입, 이용 가능성 및 방출 가능성, 화학적 조성 및 안정성, 반응 조건과의 호환성, 및 조성물의 조정 가능성을 위한 등의 측면에 관한 것일 수 있다.

본 명세서에 기재된 조성물은 일반적으로 목적하는 용도에 따라서 본 명세서에 기재된 파라미터 중 하나, 수개 또는 대부분을 충족시킬 수 있다. 일반적으로, 입자 조성물은 목적하는 파라미터를 충족시키기 위하여 다양한 상이한 물질로 제조될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 경우에, 중합체성 물질이 본 명세서에서 입자 조성물을 형성하는 매트릭스로서 이용된다. 몇몇 경우에, 중합체 메쉬, 엉킨 중합체 등은, 이들이 시약 조성물과의 회합 또는 부착을 위하여 높은 표면적을 제공하므로 이용된다. 소정의 양상에 있어서, 하이드로겔 중합체가 입자 조성물을 위한 하지 매트릭스로서 이용된다. 예를 들어, 선형 폴리아크릴아마이드, 가교결합된 선형 폴리아크릴아마이드 등을 비롯한 폴리아크릴아마이드 중합체가 비드 조성물에 이용되는 중합체 물질로서 유용하다. 이러한 폴리아크릴아마이드의 예는, 예를 들어, 가교결합기를 제공하기 위하여 N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BAC) 단량체를 혼입하고 있는 선형 폴리아크릴아마이드를 포함한다. 다른 경우에, 예컨대, 실리카계 입자와 같은 무기 입자 물질이 이용될 수 있다.

본 명세서에 기재된 조성물의 입자, 예를 들어, 겔 비드는, 일정 범위의 크기로 본 명세서에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 겔 비드의 크기는 1㎛ 내지 1㎜, 10㎛ 내지 100㎛, 20㎛ 내지 100㎛, 30㎛ 내지 80㎛ 또는 40㎛ 내지 60㎛의 직경일 수 있는 것이 상정된다. 비드의 예시적인 직경 크기는 30㎛, 40㎛, 50㎛, 55㎛, 57㎛, 60㎛, 64㎛, 70㎛, 72㎛, 75㎛, 100㎛, 125㎛, 150㎛, 200㎛, 250㎛, 500㎛, 750㎛ 및 1㎜를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

II. 유동 특징

미세유체 시스템 내의 이동성 고체상 성분의 사용은 미세유체 채널 및 채널 네트워크 내의 이들 고체상 성분의 유동 특징에 의존한다. 몇몇 경우에, 입자의 유동 신뢰성, 유량, 간격 및 패킹성은 모두 이들 고체 성분이 미세유체 채널을 통해 어떻게 이동하는지 영향을 미칠 수 있다. 일반적으로, 입자가 미세유체 시스템을 통과하는 경우에, 미세유체 채널은, 미세유체 맥락 내에서 더 양호하게 작동하도록 입자를 구성하기보다는 오히려, 이용되는 입자의 기존의 파라미터 내에서 작동하도록 적용될 수 있다, 다른 한편으로, 본 개시내용은, 입자 조성물의 파라미터에 관한 것으로, 이는 미세유체 맥락에서 더 양호한 성능을 수득하도록 제공될 수 있다.

A. 분산도

소정의 응용분야에 있어서, 이러한 물질이 미세유체 채널 및 채널 네트워크를 통해 이동할 예측 가능성, 예컨대, 이들 비드가 그 시스템을 통해서 흐르는 속도, 이들이 그들의 목적지에 도달하는 규칙성 및 채널 막힘 및 기타 고장과 같은 고장 사건을 회피하는 능력이 전체 시스템의 성능에 극적으로 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 미세유체 시스템에 형성 중인 상이한 액적에 개별의 비드 또는 입자를 할당하길 원할 경우(예컨대, 미국 특허 공개 제2015/0005199호, 전체 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨), 목적하는 개수의 비드를 구획실에 예컨대 오로지 하나씩 정확하게 전달하는 능력은 미세유체 시스템을 통한 이들 비드의 유동 특징에 의해 좌우된다.

다양한 구체적인 특징이 본 명세서에 기재된 입자의 유동 특징에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 분산도라고도 지칭되는, 입자 조성물 내 입자 크기의 이질성(heterogeneity)은, 상이한 입자 크기가 상이한 유동 특성을 지닐 수 있으므로, 미세유체 채널을 통한 입자 현탁액의 유동 특성에 영향을 미칠 수 있고, 상이한 전위 고장 모드를 유발할 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물에 따르면, 입자 현탁액은 실질적으로 단분산 모집단 크기를 지닐 수 있고, 이는, 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 현탁액 내 입자의 적어도 80%가 모집단에 대한 평균입자크기의 +/- 10%일 것임을 의미한다. 몇몇 경우에, 현탁액 내 입자의 적어도 90%는 모집단에 대한 평균입자크기의 +/- 10%일 것이다. 또 다른 경우에, 현탁액 내 입자의 적어도 95%는 모집단에 대한 평균입자크기의 +/- 10%일 것이고, 또 다른 경우에, 현탁액 내 입자의 적어도 98% 또는 심지어 99%가 모집단에 대한 평균입자크기의 +/- 10%일 것이다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 입자크기는 일반적으로 입자의 평균 직경으로서 측정될 수 있다.

입자 분산도 측정은 일반적으로 다양한 공지된 방법 중 어느 것인가에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 높은 처리량 측정, 예컨대, 1000개 이상의 측정을 위하여, 자동화 현미경(예컨대, 모폴로지(Morphologi) G3 시스템을 이용), 동적 영상 분석(예컨대, 유동 모니터링 카메라 시스템을 이용), 및 광 산란(예컨대, 마스터사이저(Mastersizer) 3000 시스템을 이용)이 이용될 수 있다. 몇몇 경우에, the level of 분산도의 수준은, %CV로서 기재되는, 평균으로부터 표준 편차의 관점에서 측정될 수 있다.

몇몇 경우에, 목적하는 입자크기를 달성하는 것은, 하나 이상의 엄격하게 제어된 제조 수법뿐만 아니라, 포스트 제조 선별 크기 조절 수법, 예컨대, 여과 또는 체거름(sieving) 수법을 통해서 달성될 수 있다. 그러나, 소정의 경우에, 입자의 속성이 입자 모집단에 대한 분리 수법에 기초하여 단순한 크기 배제의 사용을 방지할 수 있다. 예를 들어, 고도로 탄성 또는 변형 가능한 입자의 경우에, 예컨대, 본 명세서에서 보다 상세히 기술되는 바와 같이, 체거름 또는 여과 수법은, 이들이 막힘 또는 오염에 더 민감하게 되기 때문에 비효율적일 수 있다. 또한, 탄성 입자에 의해, 변형되어 더 작은 개구부를 통과하는 능력은 훨씬 더 넓은 크기 분포를 초래한다. 따라서, 몇몇 경우에, 입자 모집단에는 크기 분리/선택의 대안적인 방법이 시행될 수 있다. 예를 들어, 제1 경우에, 입자의 모집단에는 입자크기 선택에 대한 부우 여과 접근법이 시행될 수 있다. 이러한 경우에, 입자의 용액 또는 현탁액은 부유실을 통해 적용된 상향 유량으로 부유실에 제공될 수 있다. 유량은, 보다 무겁고 큰 입자 또는 응집체의 중력침강이 상향 흐름을 극복하고 이러한 입자가 가라앉거나 적어도 부유실의 상부 부분에서 용리 포트에 도달하는데 실패함으로써 적절한 크기의 입자가 제거될 수 있도록 선택될 수 있다.

대안적이지만 관련된 접근법에서, 크기 선택은 벡터 크로마토그래피 방법 및 시스템을 이용해서 수행될 수 있다. 이러한 시스템에서, 입자의 현탁액이 통과하는 보다 긴 채널 또는 도관이 제공될 수 있다. 크기 및 유동 스트림을 가로지르는 확산의 용이함으로 인해, 보다 작은 입자가 유량이 가장 큰 유동 채널의 중심에서 더 큰 시간량을 소비할 수 있다. 보다 큰 입자는 더 느리게 확산되는 경향이 있을 수 있고, 그 결과로서, 더 느리게 이동하는 유동 부분에서 더 큰 시간량을 소비할 수 있다. 긴 충분한 채널이 제공되면, 보다 작은 입자가 시스템으로부터 처음에 나가는 경향이 있을 수 있다.

B. 탄성

미세유체 시스템을 통한 조성물의 유동 특징에 관한 본 개시내용의 조성물의 부가적인 특성은 이의 탄성 또는 변형 가능성이다. 몇몇 경우에, 입자 조성물이 미세유체 채널(또는 이의 일부)의 단면 치수의 하나 이상에 접근하거나 훨씬 초과하는 응용분야에서, 조성물이 실질적으로 막힘 없이 직접 통과하는 능력은 유체 네트워크를 통한 현탁액의 유동에 영향을 미친다. 따라서, 본 명세서에 기재된 입자 조성물은 비교적 탄성 및/또는 변형 가능할 수 있다. 몇몇 경우에, 본 명세서에 기재된 입자 조성물은 약 5 내지 약 100㎪의 탄성률을 지닐 것이다. 몇몇 경우에, 조성물은 약 5 내지 약 50㎪, 또는 50 내지 약 100㎪의 탄성률을 포함할 것이다. 또 다른 경우에, 입자 조성물은 약 5내지 약 10㎪, 약 10 내지 약 20㎪, 약 20 내지 약 30㎪, 약 30 내지 약 40㎪, 약 40 내지 약 50㎪, 약 50 내지 약 60㎪, 약 60 내지 약 70㎪, 약 70 내지 약 80㎪, 약 80 내지 약 90㎪, 약 90 내지 약 100㎪의 탄성률을 지닐 것이다. 입자 조성물의 탄성률은, 예컨대, 삼투압 압축 방법, 미세기계적 변형 수법 및 원심분리 압축 방법을 비롯한 각종 공지의 방법의 어느 것인가를 사용해서 특성규명될 수 있다.

입자 조성물의 탄성률을 제어하는 것은 조성물의 고체상 또는 입자 성분의 조성물의 제조 방법의 제어를 통해서 달성될 수 있다. 예를 들어, 중합체성 입자에 대해서, 탄성률은 입자 내의 중합체의 패킹 수준을 증감시킴으로써, 예컨대, 중합체 매트릭스의 2차 구조를 제어하거나 분자내 및 분자간 정전기 상호작용을 제어함으로써, 또는 입자에 대한 증가된 강성을 제공하는 기타 구조 또는 가교결합의 수준을 제어함으로써 조정될 수 있다. 예를 들어, 선형 폴리아크릴아마이드 중합체 입자의 경우에, 예컨대, 중합체, 예컨대, 비스-아크릴아마이드 공중합체 및 가교결합 개시 반응물, 예컨대, TEMED 내 가교결합제 성분의 수준의 증감을 통해서, 입자의 가교결합 수준을 증감시킬 수 있다.

C. 응집/부착

위에서 기재된 것 이외에도, 입자 조성물의 다른 중요한 파라미터는 예컨대, 조성물 내 다른 입자를 포함하는 시스템 내 다른 표면뿐만 아니라 미세유체 채널, 웰, 튜브 또는 다른 컨테이너의 표면에의 부착을 회피하는 능력이다. 다른 입자에의 부착의 관점에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 비응집일 수 있고, 이것은 조성물 내 입자의 10% 미만이 수용액 중에 현탁될 경우 또는 예컨대, 제한 없이 비수성 캐리어 유체 내 수성 액적 내를 비롯하여 수성 환경에서 미세유체 시스템을 통해서 이동될 경우 둘 이상의 입자의 응집물의 형태일 것임을 의미한다. 몇몇 경우에, 입자의 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 심지어 1% 미만이 응집된 입자로서 존재할 것이다.

몇몇 경우에, 더 많은 특정 기구를 이용해서 비드-비드 상호작용력을 측정하기를 원할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 경우에, 비드-비드 인력은, 잘 제어된 유동 조절제가 상호작용력을 결정하기 위하여 직접 잘 이용될 수 있는 경우에 응집된 입자에 적용된 확대 유동 시스템을 이용해서 측정될 수 있다.

입자간 상호작용, 예컨대, 부착 및 상호작용을 제어하는 것은, 예를 들어, 표면 전하, 소수성/친수성, 표면 상의 반응성 작용기의 존재의 제어를 비롯하여 많은 상이한 접근법을 이용해서 수행될 수 있다.

D. 다른 표면과의 상호작용

입자 조성물은 또한 예컨대, 이들이 부착되는 시스템, 미세유체 또는 다른 도관, 반응 용기, 웰, 튜브 등의 표면에 부착되는 저감된 성향을 가질 수 있다. 위에서 논의된 바와 같이, 입자간 응집에 따라서, 소정의 경우에, 중요한 입자 특성은, 예컨대, 표면 부착을 회피하기 위하여, 상이한 표면에 대한 관성에 관한 것이다. 표면의 오염, 채널의 막힘 등을 방지하는 능력은 미세유체 시스템에 관한 것일 수 있다. 마찬가지로, 반응물 및/또는 생성물이 비교적 낮은 수준에서 존재하는 반응 시스템에서, 용기 표면에 대한 반응물 또는 생성물의 비특이적 흡착이, 예컨대, 반응물 또는 생성물을 은폐함으로써 이러한 반응의 분석 결과를 왜곡할 수 있다. 그와 같이, 입자를 비활성이 되도록 구성하거나 또는 몇몇 경우에 반응 용기의 표면에 활성적으로 반발하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은, 예를 들어, 반응 용기 표면의 순 전하와는 반대인 순 전하를 가진 입자를 선택하는 것을 포함하는 많은 수단에 의해 달성될 수 있다. 소정의 경우에, 입자 조성물은 일반적으로 친수성이고 일반적으로 비대전되도록 제공된다. 몇몇 경우에, 이것은 비대전 및 친수성 중합체로부터 입자 조성물을 생성함으로써 달성될 수 있다. 중합체의 비제한적인 예는, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG), 폴리아크릴아마이드 중합체, 예컨대, 선형 폴리아크릴아마이드, 셀룰로스 중합체, 덱스트란 등을 포함한다.

E. 용액 점도

입자의 모집단 내의 개별적인 입자의 특성에 부가해서, 본 명세서에 기재된 입자 조성물은 소정의 유용한 파라미터를 충족시키는 벌크 특성을 지닐 수 있다. 몇몇 경우에, 이해되는 바와 같이, 미세유체 시스템을 통해서 유동하는 개별의 입자의 유동 특징과는 별개로, 입자 현탁액의 벌크 점도는 또한 본 명세서에 기재된 입자 현탁액 조성물의 중요한 유동 특징일 수 있다. 몇몇 경우에, 입자 함유 조성물의 점도는 다양한 상이한 대상체 중 어느 것인가를 달성하기 위하여 목적하는 파라미터 내로 제어될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 경우에, 더욱 일관된 유체 혼합을 허용할 뿐만 아니라, 상이한 유체 간의 일관된 유량을 촉진시키기 위하여, 입자 함유 조성물이 미세유체 시스템 내에서 조합되고 있는 다른 유체의 것과 유사한 벌크 점도를 갖도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 역으로, 몇몇 경우에, 벌크 점도는, 차동 유량 등을 제공하기 위하여 신속한 혼합을 방지하기 위하여, 입자 함유 조성물의 실질적으로 상이한 유체 특성을 제공하도록 제어될 수 있다.

일반적으로, 입자 함유 조성물의 유변량(rheology) 또는 점도는 약 0.5 센티푸아즈(cP) 내지 약 5000 cP일 수 있다. 몇몇 경우에, 용액 점도는 0.5 내지 100, 0.5 내지 50 cP, 1 내지 50 cP, 몇몇 경우에 1 내지 10 cp일 수 있다. 다른 경우에, 용액 점도가 더 높은, 예컨대, 100 내지 1000 cP, 100 내지 500 cP 등일 수 있다. 소정의 경우에, 점도는 통상의 미세유체 시스템 내에서 처리된 다른 유체의 것과 유사하게 되는 것을 목적으로 할 수 있다. 일반적으로, 이러한 유체는 분할 유체, 예컨대, 플루오르화 오일 및 계면활성제뿐만 아니라 수성 유체, 시약 등을 포함한다. 일반적으로, 이들 유체는 약 0.5 cP 내지 약 20 cP의 범위의 벌크 점도를 지닐 수 있다. 그와 같이, 몇몇 경우에, 미세유체 시스템에 침착된 경우, 약 0.5 cP 내지 약 20 cP, 약 1.0 내지 약 10.0 cP, 또는 심지어 약 1.0 cP 내지 5.0 cP의 점도를 가진 입자 함유 조성물을 제공하는 것이 바람직할 수 있다.

일반적으로, 입자 탄성, 입자-입자 상호활성, 입자크기 분포, 입자 농도, 온도의 조정, 또는 점도 조절 첨가제의 사용을 통하는 것을 비롯한 많은 상이한 파라미터 중 하나 이상을 조절함으로써 입자 함유 조성물의 유변량을 조절할 수 있다.

III. 기계적 강건성 및 조작 능력:

이동성 입자상이 미세유체 시스템을 통해 어떻게 이동하는지를 이해하는 것에 부가해서, 본 명세서에 기재된 입자 시스템에 대한 다른 중요한 파라미터는 전형적인 사용 하의 이의 강건성에 관한 것이다. 몇몇 경우에, 미세유체 시스템을 통해서, 또는 통상적인 조작, 예컨대, 피펫팅, 원심분리 재현탁 및 교반, 동결 및 해동을 통한 이러한 입자 현탁액을 유동시키는 맥락이야 어떻든지 간에, 본 명세서에 기재된 입자 조성물은, 필요한 경우 입자를 교란시키기 위하여 적절한 자극이 적용되지 않는 한 그리고 적용될 때까지 실질적으로 그대로 유지될 수 있다. 일반적으로, 입자 조성물의 강건성은 일반적으로 기계적 취급 공정 후의 얻어지는 분산도의 수준에 의해서 측정된다. 예를 들어, 입자 조성물은, 하나 이상의 피펫팅 단계, 미세유체 주입/이동 단계, 원심분리 단계, 소용돌이 혼합 단계 또는 기타 기계적 조작 단계 후에도, 위에서 기재된 분산도 메트릭을 유지할 수 있다.

또한, 입자 조성물은 일반적으로 취급을 용이하게 하도록 하는 이러한 특징, 예컨대, 적절한 유동 특징을 유지하는 한편 또한 원심분리 기반 분리 수법을 허용하는 적절한 밀도를 지닐 수 있다. 일반적으로, 입자 조성물은 실질적으로 수성 매질 중에서 수화된 입자에 대해서 약 1.001 내지 1.2의 밀도, 예컨대, 1.00 내지 1.10의 밀도를 지닐 수 있다.

IV. 시약 장입 및 이용 가능성:

몇몇 경우에, 본 명세서에 기재된 입자 조성물은 미세유체 시스템 내의 목적하는 개소에 페이로드된 시약을 정확하게 전달하기 위하여 시약 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 이해되는 바와 같이, 이것은 이들 입자 내로 시약을 장입하는 능력 및 일단 전달되면 이들 시약을 접근 및/또는 방출하는 능력에 관한 중요한 입자 파라미터에 연루되었음을 시사한다. 많은 응용분야를 위하여, 본 명세서에서 이용되는 입자는 시약 장입과 검정 시스템 내의 시약에의 접근 둘 다를 용이하게 하는 다공성 구조를 포함한다. 이러한 다공성 입자는, 예컨대, 다공성 고체 또는 반고체 구조, 거대분자 매트릭스-유사 구조(예컨대, 엉킨 중합체 매트릭스, 가교결합된 중합체 망상 구조 등)를 비롯하여 다양한 다공성 구조의 어느 것이라도 포함할 수 있다.

A. 메쉬 크기

이해되는 바와 같이, 다공성 입자에 대해서, 이러한 입자를 내로 그리고 밖으로 이동하는 물질의 능력이 입자의 상대적 다공도 및 메쉬 크기에 의해 부분적으로 통제될 수 있다. 몇몇 경우에, 더 큰 화합물 또는 물질은 더 작은 기공 입자에 대해서보다 더 큰 기공 입자 내로 또는 밖으로 더욱 용이하게 확산될 것이고, 이는 입자로부터의 더욱 신속한 분산 또는 입자 내로의 침투를 허용한다. 몇몇 경우에, 비교적 커다란 거대분자가 입자 내로 또는 입자 밖으로 효과적으로 통과할 수 있는 것이 바람직할 수 있다.

예로서, 몇몇 경우에, 입자 조성물에는 이의 내부 매트릭스에 결합된 시약이 제공될 수 있다. 입자로부터 시약의 방출을 일으키기 위하여 화학적 자극이 사용될 경우에, 입자 밖으로 반응물 그리고 입자 내로 자극의 효과적인 확산을 허용하는 것이 바람직할 수 있다.

위에서와 대조적으로, 다른 양상에 있어서, 보다 큰 분자, 예컨대, 올리고뉴클레오타이드, 단백질 등과 같은 거대분자의 확산을 방지하는 한편, 보다 작은 분자가 입자 내로 그리고 입자 밖으로 효과적으로 이동하는 것을 허용하는 메쉬 크기를 가진 입자를 제공하는 것이 바람직할 수 있다.

그와 같이, 입자는 1 내지 20㎚, 몇몇 경우에 1 내지 10㎚, 몇몇 경우에 1 내지 5㎚, 몇몇 경우에, 1 내지 4㎚, 몇몇 경우에 1 내지 3㎚, 몇몇 경우에 1 내지 2㎚의 메쉬 또는 공극 크기를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 다른 경우에, 공극 크기는 5 내지 20㎚, 5 내지 10㎚, 또는 심지어 7 내지 10㎚일 수 있다. 보다 작은 분자가 기공 내로 그리고/또는 기공 밖으로 확산되는 것을 방지하는 것이 바람직한 경우에, 1㎚ 미만, 예컨대, 0.01 내지 1㎚의 공극 크기가 바람직할 수 있다. 공극 크기의 조절은, 중합체 매트릭스의 수축을 일으켜 공극 크기를 저감시키기 위하여, 예를 들어, 중합체 매트릭스 내에 존재하는 중합체의 농도를 증가시킴으로서, 중합체 매트릭스 내의 가교결합 수준을 조절함으로써 그리고/또는 중합체성 중합체에 대한 삼투력을 변화시킴으로써를 비롯하여 많은 방법에 의해 달성될 수 있다.

B. 표면적

앞서 언급된 바와 같이, 많은 응용분야를 위하여, 본 명세서에 기재된 입자 조성물은 시약 전달 시스템으로서 유용할 수 있다. 몇몇 경우에, 시약 전달 양상은 전달될 시약에 입자를 함침시킴으로써 제공될 수 있지만, 이때 이러한 시약은 물리적 장벽에 의해 또는 그들의 환경과의 용매 비상용성으로 인해 유지될 수 있다. 그러나, 몇몇 경우에, 시약은, 예컨대, 공유 또는 비공유 분자 상호작용을 통해서 입자를 구성하는 매트릭스에 화학적으로 결합할 것이다. 그와 같이, 몇몇 경우에, 입자 조성물은 각 입자 기준으로 목적하는 장입 용량을 달성하기 위하여 충분한 수의 결합 부위 또는 충분히 큰 표면적일 것이다.

D. 분자 과밀(Crowding)/구속(Confined) 반응물 공간

다공성 입자를 사용하는 또 다른 이점은 주위 케리어 유체에 대해서 입자의 구속부 내에 국부적 농도를 증대시키는 능력을 제공한다. 몇몇 경우에, 전체적인 매체 내 반응물의 상대적 희석에도 불구하고, 내부에 함유된 반응물 간의 밀접한 상호작용을 강제시키는 다공성 입자를 제공하는 것이 바람직할 것이다.

E. 자극, 용해성에 대한 반응성

앞서 기재된 바와 같이, 몇몇 경우에, 입자는 특정 자극의 인가 시에 시약 페이로드를 방출하도록 구성될 수 있다. 몇몇 경우에, 시약 방출에 대한 대안으로서 또는 이에 부가해서, 입자는, 예컨대, 동반물로부터의 방출에 의해서건 또는 입자 매트릭스로부터의 화학적 해리에 의해서건 간에, 시약 방출을 용이하게 하기 위하여, 자극의 인가 시 용해 가능하거나 분해 가능하도록 구성될 수 있다.

몇몇 경우에, 본 명세서에 기재된 입자 조성물은 실질적으로 목적하는 시간 프레임 내에 그들의 시약 페이로드를 방출시키고/시키거나 용해시키도록 구성될 것이다. 몇몇 경우에, 입자 조성물은 적절한 자극, 예컨대, 선택적으로 상승된 온도, 예컨대, 95℃를 비롯하여, 환원제와 같은 화학적 자극에 노출된 때로부터 목적하는 시간 프레임 내에 그들의 시약의 적어도 90%를 방출할 것이다. 몇몇 경우에, 시약 페이로드의 적어도 95%가 방출될 것이거나, 심지어 페이로드의 적어도 98% 또는 적어도 99%가 방출될 것이다. 몇몇 경우에, 자극에 대한 노출로부터 방출까지의 목적하는 시간 프레임은 20분 미만, 10분 미만, 5분 미만, 3분 미만, 2분 미만, 1분 미만일 것이다. 몇몇 경우에, 목적하는 시간 프레임은 위에서 기재된 바와 같을 것이지만, 1초 초과, 10초 초과, 20초 초과, 30초 초과, 40초 초과, 50초 초과일 것이다.

올리고뉴클레오타이드의 겔 비드에의 부착은, 다이설파이드 결합, 에스터 결합, 실릴 에스터 링커(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US 20130203675호 참조), 생물학적 링커, UV 분해성 링커 등을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 많은 접근법을 통해서 이루어질 수 있다.

자극은 겔 비드로부터 올리고뉴클레오타이드의 방출을 제어하는데 사용될 수 있다. 방출을 제어하기 위한 하나의 접근법은 pH 조건을 변경하는 것이다. 다른 접근법은 (예컨대, 다이설파이드 결합을 유리시키기 위하여) 1종 이상의 환원제의 작용을 통하는 것이다.

V. 화학적 조성.

많은 응용분야에 있어서, 입자 조성물들의 중요한 특징은 이들 입자 조성물이 이들의 화학적 환경과 어떻게 상호작용하는가에 관한 것이다. 몇몇 경우에, 이들 조성물은 광범위한 화학적 조건, 예컨대, pH의 극단점, 이온 강도, 극성 시약 등에 노출될 수 있다. 몇몇 경우에, 이들 조성물은 그들의 특징에 대해서 상대적으로 정적으로 유지되는 것이 바람직할 것이지만, 다른 경우에는, 변화된 환경이 예컨대 결합된 시약을 유리시키기 위하여, 입자의 특징의 변화를 자극시키는 것이 바람직할 것이다.

몇몇 경우에, 본 명세서에 기재된 조성물의 다수의 용도에는 광범위하게 다양한 환경적 및/또는 기계적 조건에 입자를 적용시키고, 이러한 환경과의 이들 입자의 양립성은 중요한 특징이다.

A. 에멀전 화학과의 양립성

본 명세서에 기재된 입자 조성물은 관심 대상 반응에 대한 시약 전달 시스템으로서 유용할 수 있기 때문에, 이들 입자가 일반적으로 관련된 반응 조건과 양립 가능할 수 있는 것을 수반한다. 많은 응용분야를 위하여, 이러한 양립성은 기저 반응에 부정적으로 영향을 미치는 방식으로 시약과 상호작용하지 않는 입자 조성물을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 양립성은, 주어진 반응 시스템에 의해 허용되는 바와 같은 것 이외에, 과도한 전하, 소수성, 친수성 또는 극성을 지니지 않는 입자 조성물의 사용을 통해서 달성될 수 있다. 몇몇 경우에, 입자 조성물은 실질적으로 중성 pH 환경, 예컨대, 약 pH 6 내지 약 pH 8에서 사용될 경우 실질적으로 비이온성 매트릭스를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 입자 조성물 내의 입자의 제타 전위는, 위에서 기재된 pH 범위에 있을 경우, +/- 0-5㎷일 것이다.

그러나, 몇몇 경우에, 입자 조성물은 상대적으로 분명하지 않은 환경적 조건에 적용될 것이다. 몇몇 경우에, 입자 조성물은 전달될 시약을 비수성 캐리어 유체 내의 수성 액적으로 공-분할(co-partition)하는데 사용될 것이다. 이러한 경우에, 플루오르화 오일이 액적이 형성되는 캐리어 유체로서 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 수성 상 또는 액적은 종종 비수성 캐리어 유체 내 액적을 안정화시키기 위하여, 즉, 다른 액적과 유착되는 민감성을 저감시키기 위하여 작용하는 비교적 고농도의 극성 성분 또는 계면활성제를 함유할 수 있다. 이해되는 바와 같이, 이들 보다 큰 극성 계면활성제 화합물은 물질, 예컨대, 입자의 표면에 이들을 오염시켜서 이들을 다른 물질에 접근 가능하게 않게 하는 등에 의해 상당한 부정적인 영향을 가질 수 있다.

입자 조성물(예컨대, 겔 비드)은 적어도 하나의 구획이 입자를 포함하도록 액적으로 분할될 수 있다. 이것은 약 1%, 5%, 10%, 20%>, 30%>, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 구획에 대해서도 마찬가지일 수 있다. 이것은 적어도 약 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 구획에 대해서도 마찬가지일 수 있다. 이것은 약 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 미만의 구획에 대해서도 마찬가지일 수 있다.

입자, 예컨대, 비드 또는 겔 비드의 말단 희석은 하나의 액적당 하나의 입자, 또는 액적당 임의의 원하는 수의 입자의 장입을 달성할 수 있다. 몇몇 경우에, 푸아송 분포(Poisson distribution)가 액적당 입자 또는 비드의 최종 농도를 지시 또는 예측하는데 사용된다.

본 명세서에 기재된 입자 조성물의 이점은 푸아송 분포를 달성하는 것을 선호하는 입자의 변형 가능성에 관한 것이다. 구체적으로는, 입자의 변형 가능성의 물리적 특징부가 하나 이상의 입자를 보유하는 액적의 형성에 비해서 더 양호한 제어를 허용한다. 본 명세서에 기재된 입자 조성물 내 입자의 변형 가능성에 관한 또 다른 이점은 액적 내의 개선된 공-분할 능력이다. 이러한 이점은 속성상 세포 또는 분자인 세포, 세포 성분 또는 기타 입자를 지닌 입자의 개선된 공-분할을 뒷받침하는 것이 상정된다. 일 실시형태에 있어서, 단일 입자 및 단일 세포의 개선된 공-분할이 제공된다.

B. 이온 강도 및 pH 허용도

위에서 논의된 극성 계면활성제에 관하여, 입자 조성물은, 몇몇 경우에 광범위하게 다양한 이온 강도 및 pH를 가진 환경에 적용될 수 있다. 이러한 경우에, 입자 조성물이 그의 하지 구조, 예컨대, 비해리 및 비용해 구조를 유지할 뿐만 아니라 그의 부피를 실질적으로 유지하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 허용도는 위에서 언급된 바와 같은 가교결합의 수준을 조정하는 방법, 중합체 내에서 하전된 단량체의 수준을 조정하는 방법 등을 비롯한 많은 방법에 의해 부여될 수 있다.

C. 자극에 대한 반응성

이상의 내용과 대조적으로, 몇몇 경우에, 본 명세서에 기재된 입자 조성물은 특정 화학적 또는 물리적 자극의 인가 시 시약 페이로드르 방출하는데 사용될 것이고, 이것을 효과적으로 그리고 균일하게 일으키는 능력은 중요한 특징일 수 있다. 위에서 기재된 파라미터의 다수는 예컨대, 메쉬 크기, 표면적, 단분산도를 비롯하여 입자 조성물의 반응성에 기여한다.

예로서, 반응성 특징은 화학적 연결의 절단에 의해 시약을 방출시키는 능력, 보다 큰 분자를 탈동반(dis-entrain)하도록 기공 네트워크의 확대, 또는 용해시키는 능력을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 입자 조성물에 따라서 그리고 위에서 논의된 바와 같이, 몇몇 경우에, 입자 조성물은 적절한 자극, 예컨대, 화학적 자극과의 접촉 또는 열적 또는 기계적 자극에의 노출의 10분 이내에 입자로부터 시약의 완전한 또는 실질적으로 완전한 방출을 달성할 수 있다. 실질적으로 완전한 방출이란, 기재된 시간 프레임 내에 그의 시약 용량의 적어도 약 50%, 몇몇 경우에, 적어도 60%, 몇몇 경우에 적어도 70%, 몇몇 경우에 적어도 80%를 방출할 수 있는 한편, 또 다른 경우에, 시약 보유 용량의 적어도 90% 또는 심지어 적어도 95% 또는 99%를 방출할 수 있는 것을 의미한다. 몇몇 경우에, 실질적인 방출은 1초 내지 10분에 일어날 것인 한편, 몇몇 경우에, 8분 미만, 6분 미만, 5분 미만, 4분 미만, 3분 미만, 또는 그 미만이 걸릴 수 있다. 시약 방출을 측정하는 것은, 일반적으로 주어진 시약의 농도를 측정하는데 유용한 많은 방법 중 어느 하나를 이용해서 유체 부피에 분산된 유리 또는 결합되지 않은 시약을 검출함으로써 달성될 수 있다. 이러한 방법은 결합된 시약으로부터 유리된 형태를 분리시키기 위하여 임의의 입자 성분의 분리 단계들을 포함할 수 있다. 이것은 입자에 대한 시약 용량의 공지된 또는 이론적 양에 대해서 비교될 수 있거나, 또는 총 시약 용량의 대용물로서 장기 방출, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 12 또는 그 이상의 시간과 비교될 수 있고, 예컨대, 시약 용량에 대해서 방출된 시약의 할당량을 제공하기 위하여 10분 방출을 12시간 방출과 비교할 수 있다.

VI. 조성물의 조정 가능성

이상의 설명으로부터 이해되는 바와 같이, 입자 조성물은 종종 위에서 기재된 특징들 중 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상을 포함할 수 있으며, 이들은 바람직한 반응 목표를 달성하기 위하여 선택되고 조절될 수 있다. 이들 조성물은 일반적으로 위에서 기재된 특징들 모두에서 고도로 조정 가능하다는 이점을 공유한다.

VII. 입자의 변형 가능성

입자, 예를 들어, 겔 비드의 변형 가능성은 미세유체 시스템에서 유리하다. 예를 들어, 변형 가능한 입자는, 이의 변형 가능성 또는 탄성 속성 때문에, 구속물, 장애물, 필터 또는 미세유체 시스템의 기타 물리적 특징부와 같은 특징부를 통과할 수 있다. 변형 가능한 입자가 영역, 공간, 필터 장애물, 또는 변형 가능한 입자 자체보다 좁은 통로를 가진 기타 물리적 특징부를 통과하는 것 또한 가능하다.

도 1은 일련의 저속 촬영 현미경 사진에서 변형 가능한 입자인, 겔 비드를 도시하며, 이는 겔 비드의 변형 가능성을 입증한다. 도 1a에서의 백색 화살표는 미세유체 시스템 내 t-교차부에서의 2개의 겔 비드 및 겔 비드 흐름 방향을 나타낸다. 도 1b에서, 2개의 비드가 더욱 함께 이동한다. 도 1c에서, 2개의 비드가 이들이 t-교차부를 통과해서 진행함에 따라서 명확하게 변형된다.

VIII. 압축 탄성률

입자 변형 가능성의 하나의 척도는 압축 탄성률(K)이다. 유용한 입자(예컨대, 겔 비드) 변형 가능성이 일정 범위의 K값, 예를 들어, 0.1㎪ 내지 200㎪, 더욱 구체적으로는 1㎪ 내지 100㎪의 범위에서 얻어질 수 있는 것이 상정된다. 기타 유용한 범위는 10㎪ 내지 100㎪, 25㎪ 내지 100㎪, 25㎪ 내지 75㎪ 및 30kPa 내지 65㎪을 포함할 수 있다.

입자 압축 탄성률(K)은 상이한 크기의 겔 비드에 대해서 덱스트란-기반 삼투압 접근법을 이용해서 측정되었다.

실험: 57.6㎛, 64.8㎛ 및 72.1㎛의 세 크기의 겔 비드가 이들 각각의 압축 탄성률(K)에 대해서 시험되었다. 겔 비드는 다양한 농도의 덱스트란에 노출되었다(덱스트란 M_r = 70,000). 덱스트란의 증가하는 농도 퍼센트가 겔 비드에 대한 증가하는 삼투압(Pa)을 생성한다. 겔 비드의 증가하는 삼투압의 적용 과정에 걸쳐서 겔 비드가 영상화되고 크기 조절되었다. 도 2는 실험 결과의 도표를 나타낸다. y-축은 측정된 초기 부피의 겔 비드에 대한 덱스트란 처리된 겔 비드의 부피의 대수의 비로서 측정된 비드 크기를 나타낸다. x-축은 덱스트란 농도의 함수로서 시험된 삼투압(Pa)의 범위를 나타낸다.

그 결과는 시험된 삼투압(Pa) 범위에 걸쳐 상이한 비드 크기에 대한 압축 탄성률(K)의 적은 변동을 나타내었다. 3가지 겔 비드 크기의 각각에 대한 압축 탄성률(K)값은 이하의 표 1에 표시되어 있다. 표 1에 제시된 바와 같이, ㎪로서 측정된 K는, 겔 비드의 직경 증가에 따라 다소 상승한다. 그러나, ㎪ 값들 간의 단지 작지만 측정 가능한 정도의 변동이 겔 비드 크기에 관하여 관찰되었다.

출발 직경 (마이크론)	K (kPa)
57.6	35.8
64.8	36.1
72.1	40.3

IX. 전단 탄성률

변형 가능성의 다른 척도는 ㎪로서 측정 가능한 전단 탄성률(G)이다. 유용한 입자(예컨대, 겔 비드) 변형 가능성이 일정 범위의 G값, 예를 들어, 0.1㎪ 내지 200㎪, 더욱 구체적으로는 1㎪ 내지 100㎪의 범위에서 얻어질 수 있는 것이 상정된다. 기타 유용한 범위는 5㎪ 내지 약 100㎪, 10㎪ 내지 100㎪, 25㎪ 내지 100㎪, 25㎪ 내지 75㎪ 및 30kPa 내지 65㎪을 포함할 수 있다.

X. 겔 비드를 메쉬 여과하는 것에 의한 겔 비드 오염물 제거

겔 비드는 오일 중에 저장된 경우(생성 후) 또는 수성 완충액에서 세척된 경우 함께 클럼핑(clumping)될 수 있다. 큰 잔해(debris)는 또한 주위 환경으로부터 겔 비드 용액을 진입될 수 있다. 이들 클럼프/잔해는 미세유체 칩 내의 미세유체 채널을 막을 수 있어서 샘플의 손실을 초래한다. 그러나, 겔 비드는 에칭된 메쉬 또는 트랙을 이용한 그들의 제조 동안 4개 초과의 겔 비드의 클럼프를 제거하기 위하여 여과될 수 있다.

메쉬 필터는 겔 비드 클럼프 및 잔해를 제거하는데 사용되었다.

실험: 30 um 겔 비드를 메쉬 여과하였다. 겔 비드를, 30 um, 20 um, 10 um 및 5 um 메쉬 크기의 나일론 메쉬(90㎜ 직경)를 통해서 통과시켰다. 겔 비드는 작용화 전에 3회 작용화 후에 3회 여과하였다. 필터는 각 회의 여과 후에 교체되었다. 사용된 필터는 45㎖의 DNA 리게이션 완충액을 가진 50㎖ 플라스틱제 나사 캡 튜브에 배치하였다. 매쉬 유지된 겔 비드/잔해(예컨대, 섬유)를, 몇몇 경우에 300 um 플로캠(FloCam) 상에서 조사하였다. 무시 가능한 비드 손실이 관찰되었다(5㎖ 미만). 공정 타이밍은 다음과 같았다. 필터 장치를 헹구고 설정하는데 20분. 여과 1회당 5분(총 15분). 플로캠(선택적)을 통한 각 농축물 샘플을 가동시키는데 10분.

겔 비드 여과는 20 um 및 10 um에서 에칭된 폴리카보네이트 트랙을 이용해서 시험되었다.

30 um 겔 비드에 대한 결과는, 일부 더 큰 오염물이 제거되었고 바람직한 메쉬가 20 um 기공(균일한 공극 크기)을 가진 나일론 메쉬 필터였던 것을 나타내었다. 여과 조건 없는 제어는 대략 200,000 겔 비드에서 발견되는 많은 클럼프(< 5 미만 또는 6 이상의 겔 비드 클럼프로 더욱 분류됨)를 나타내었다. 20 um 나일론 부직 메쉬를 통한 3회 여과 후, 90㎜ 직경은 클럼프의 수의 상당한 저감이 있었다.

실험: 54 um 겔 비드를 메쉬 여과하였다. 겔 비드를, 60 um, 41 um, 30 um 및 10 um 메쉬 크기의 나일론 메쉬를 통해서 통과시켰다. 겔 비드 여과는 20 um 및 10 um에서 에칭된 폴리카보네이트 트랙을 이용해서 시험되었다. 결과는 일부 더 큰 오염물이 제거되었고 바람직한 메쉬가 41 um 기공(균일한 공극 크기)을 가진 나일론 메쉬 필터였던 것을 나타내었다.

여과 조건 없는 제어는 대략 100,000 겔 비드에서 발견되는 많은 클럼프(< 5 미만 또는 6 이상의 겔 비드 클럼프로 더욱 분류됨)를 나타내었다. 41 um 나일론 부직 메쉬를 통한 3회 여과 후, 90㎜ 직경은 클럼프의 수의 상당한 저감이 있었다.

Y. 겔 비드 응집의 방지

본 명세서에 기재된 입자 조성물은 부착된 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 조합적 접근법에 의해 부착된 바코드를 포함할 수 있다. 몇몇 조합적 접근법에 있어서, 라이게이션 프로토콜(ligation protocol)이 비드(예컨대, 본 명세서의 어디엔가 기재된 바와 같은 탈착 가능한 비드) 상의 바코드 수순을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 조립하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 바코드가 부착될 비드의 개별의 모집단이 제공될 수 있다(참고로 본 명세서에 편입된 미국 특허 출원 공개 제US20140378349 참조). 라이게이션 프로토콜 후에 겔 비드는 클럼핑 및 고무질이 되는 경향을 갖는 것으로 판명되었다. 특정 이론에 얽매이는 일 없이, 하나의 가능한 설명은 라이게이션 프로토콜에서의 형광단의 혼입이 겔 비드의 클럼핑을 유발한다는 것이다. 다른 가능성은 라이게이션 프로토콜에서의 환원제의 존재가 겔 비드에 악영향을 미쳐서, 클렁핑 및 고무질의 관찰을 초래한다는 것이다. 라이게이션 반응에서, DTT는 최대 40㎛ 존재하였다.

실험: 겔 비드 크기의 변화 및 클럼핑은 환원제에 대한 노출 시 연구되었다. 겔 비드는 약 20㎛ TCEP(트리스(2-카복시에틸)포스핀) 환원제에서 30분 동안 인큐베이팅하여, 겔 비드의 클럼핑을 초래하였다. 보다 낮은 농도의 TCEP에서 인큐베이팅된 겔 비드는 크기가 증가하는 것으로 판명되었다.

별도의 연구에서, 에멀전 내로의 겔 비드 주입의 제조에서 고무질 겔 비드의 효과가 시험되었다. 라이게이션 프로토콜로부터의 고무질 겔 비드는 에멀전으로의 겔 비드의 불균일한 주입 및 막힘을 초래한 것으로 판명되었다. 또한 40㎛ DTT 조건 하에서의 라이게이션 프로토콜의 가동이 유체 칩에 대한 겔 비드의 불균일한 주입 및 클럼핑을 초래한 것으로 판명되었다.

관찰된 겔 비드의 클럼핑 및 고무질이 라이게이션 프로토콜의 리게이션 완충액을 변경함으로써 개선될 수 있었던 것이 발견되었다. 환원제를 제거하여, 환원제를 함유하지 않거나 실질적으로 환원제를 함유하지 않는 라이게이션 프로토콜을 작성함으로써, 겔 비드에는 클럼핑 및 고무질이 없었다(데이터 제시 생략). 이것은 예를 들어 에멀전 내로의 비드 주입을 측정함으로써 측정 가능하였다(데이터 제시 생략). 또한 라이게이션 프로토콜의 라이게이션 효소 성분이 클럼핑 및 고무질의 결여를 달성하기 위하여 라이게이션 프로토콜을 행하기 전에 효소로부터 제거될 수 있었던 소정 수준의 환원제를 포함하는 것이 발견되었다. 요약하면, 겔 비드가 더 양호하게 안정화될 수 있고, 어떠한 환원제도 없이 라이게이션 프로토콜을 수행한 경우에 저감된 클럼핑 및 고무질을 나타내는 결과를 보였다. 놀랍게도, 리가제 효소로부터 환원제의 제거뿐만 아니라 개선된 겔 비드 특징이 겔 비드를 이용한 라이게이션 프로토콜 내 효소의 활성에 대한 악영향이 없었던 것이 발견되었다.

Z. 올리고뉴클레오타이드-겔 비드 연결을 보존하기 위한 pH 최적화

표지된 겔 비드, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 태그된 또는 바코드 형성된 겔 비드를 제조하고 저장함에 있어서, 오염 효과는 올리고뉴클레오타이드가 방출을 위한 어떠한 자극 없이 저장 동안 겔 비즈로부터 바람직하지 않게 방출되는 경우가 관찰되었다. pH 최적화는 이 쟁점에 대한 해법으로서 연구되었다.

실험: 최대 12주까지의 주의 과정에 걸쳐서, 바코드 형성된 겔 비드는 다양한 pH 조건에서 저장 완충액 중에 저장되었고 오염률(방출된 올리고뉴클레오타이드)이 주마다 측정되었다. 도 3에 예시된 결과는, pH 7.4가 12주의 저장 기간에 걸쳐서 오염을 저감시키는데 최적이었음을 나타내었다. 최소한 0.025% 오염이 pH 7.4에서 저장된 경우 검출되었다. pH가 증가함에 따라서, 오염률이 증가하였다. 시험된 최고 pH인 pH 8.2에서 가장 오염이 발생되었고, 여기서 최대 0.110% 오염이 검출되었다. 오염 결과는 표 2에 요약되어 있다.

pH	오염률 (주당)
8.2	0.110%
8.0	0.072%
7.8	0.050%
7.6	0.041%
7.4	0.025%

AA. 필터로서의 겔 비드의 이용

겔 비드는 이의 물리적 구조에 있어서 일정 범위의 메쉬 크기를 포함할 수 있다. 겔 비드에 제공된 메쉬 크기는 유동 제한기로서 유용할 수 있고, 이에 따라서 충분히 작은 크기의 대상체가 겔 비드 내로 그리고 심지어 겔 비드를 통해서 확산되거나 유동될 수 있는 한편, 보다 큰 크기의 대상체는 겔 비드 내로 확산되거나 유동될 수 없었다. 실험 근거는 보다 큰 메쉬 크기의 겔 비드가 겔 비드 내로 FITC-덱스트란의 확산을 초래해야만 하는 한편, 보다 작은 메쉬 크기의 겔 비드는 겔 베드 내로 확산을 허용하지 않아야 한다는 것이었다.

실험: 겔 비드의 두 상이한 메쉬 크기의 겔 비드로 시험하기 위하여 FITC-덱스트란이 사용되었다. 표 3에 나타낸 바와 같은 FITC-덱스트란의 0.1% w/w 스톡 용액이 이 연구에서 사용되었다.

FITC-덱스트란
평균분자량	g mol-1	40,000	20,000	10,000	4,000
로트 번호		SLBH1157V	SLBH1156V	SLBD1132V	BCBM9769V
질량	g	0.1	0.1	0.1	0.1
물의 질량	g	9.919	9.9263	9.9455	9.958
농도	% w/w	0.9981	0.9974	0.9955	0.9942

스톡 용액을 0.055% w/w의 최종 농도까지 희석시켰다. 스톡 반경은 동적 광산란을 이용해서 각 분자량 FITC-덱스트란에 대해서 측정되었다(데이터 제시 생략). 10uL의 패킹된 겔 비드를 90uL의 FITC-덱스트란에 첨가하고 어둠 속에서 하룻밤 인큐베이팅하였다. 겔 비드의 명시야(위상-콘트라스트) 및 형광(488㎚) 이미지를 촬영하였다. 시험된 6개의 겔 비드 로트에 대해서, 겔 비드 메쉬 크기는 모든 겔 비드 로트에 걸쳐서 일정하였고 4.4㎚ 미만의 크기인 것으로 결정되었다(데이터 제시 생략).

이상의 발명은 명확성 및 이해를 목적으로 일부 상세히 기술하였지만, 본 개시내용을 읽은 당업자에게는 형태 및 세부사항에 있어서의 다양한 변화가 본 발명의 실제 범주로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있음이 명백해질 것이다. 예를 들어, 위에서 기재된 모든 기술 및 장치는 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 입자 전달은 기재된 바와 같은 배열 웰 크기조절 방법(array well sizing method)으로 실시될 수 있다. 본 출원에 인용된 모든 간행물 특허, 특허 출원, 및/또는 기타 문헌은 마치 개별의 간행물, 특허, 특허 출원, 및/또는 기타 문헌이 개별적으로 그리고 독립적으로 모든 목적을 위해 참고로 편입되도록 나타낸 바와 동일한 정도로 모든 목적을 위해 이들의 전문이 참고로 편입된다.

본 발명의 바람직한 실시형태들이 본 명세서에서 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시형태는 오로지 예시로서 제공된 것임이 당업자에게 자명할 것이다. 수많은 변형, 변화 및 치환이 이제 본 발명으로부터 벗어나는 일 없이 당업자에게 떠오를 것이다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시형태들에 대한 각종 대안이 본 발명을 실시함에 있어서 이용될 수 있는 것이 이해되어야 한다. 이하의 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하며 이러한 청구범위 및 이의 등가물의 범위 내에서의 방법 및 구조가 따라서 포함되도록 의도된다.

Claims (26)

1. 변형 가능한 입자의 현탁액을 포함하는 조성물로서, 상기 현탁액은 하기 (i) 내지 (iv) 중 하나 이상을 특징으로 하는 조성물:
   (i) 상기 현탁액 중 상기 변형 가능한 입자의 적어도 95%가 상기 현탁액에 대해서 평균입자크기의 10% 이내인 입자의 분산도;
   (ii) 약 5㎪ 내지 100㎪의 탄성률을 갖는 복수의 변형 가능한 입자;
   (iii) 약 0.1 cP 내지 약 100 cP의 용액 점도; 및
   (iv) 약 1㎚ 내지 약 20㎚의 공극 크기를 갖는 변형 가능한 입자.
2. 제1항에 있어서, 상기 변형 가능한 입자는 상기 변형 가능한 입자보다 더 좁은 미세유체 물리적 특징부(microfluidic physical feature)를 통과 가능한, 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 미세유체 물리적 특징부는 필터, 장애물, 통로, 채널, 공간 또는 이들의 임의의 조합인, 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 가능한 입자는 비드(bead)인, 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 비드는 겔 비드(gel bead)인, 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 가능한 입자는 약 1㎛ 내지 약 1㎜, 약 10㎛ 내지 약 100㎛, 약 20㎛ 내지 약 100㎛, 약 30㎛ 내지 약 80㎛ 및 약 40㎛ 내지 약 60㎛의 직경으로 이루어진 군으로부터 선택된 직경을 갖는, 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 변형 가능한 입자는 약 10㎛ 내지 약 100㎛의 직경을 갖는, 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 변형 가능한 입자는 약 30㎛ 내지 약 100㎛의 직경을 갖는, 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액은 약 5㎪ 내지 약 100㎪의 전단 탄성률(shear modulus)을 특징으로 하는, 조성물.
10. 제1항의 변형 가능한 입자의 현탁액으로부터 오염물을 제거하는 방법으로서,
    i) 상기 변형 가능한 입자의 직경보다 더 작은 공극 크기를 갖는 메쉬 필터(mesh filter)를 통해서 상기 변형 가능한 입자를 통과시키는 단계; 및
    ii) 상기 변형 가능한 입자를 수집하는 단계를 포함하는, 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 메쉬 필터는 약 10㎛ 내지 약 50㎛의 공극 크기를 갖는, 방법.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 변형 가능한 입자는 약 10㎛ 내지 약 100㎛의 직경을 갖는, 방법.
13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 가능한 입자는 약 30㎛ 내지 약 100㎛의 직경을 갖는, 방법.
14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공극 크기는 약 30㎛인, 방법.
15. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공극 크기는 약 41㎛인, 방법.
16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 가능한 입자는 겔 비드인, 방법.
17. 올리고뉴클레오타이드 표지된 변형 가능한 겔 비드 조성물을 저장하는 방법으로서,
    i) 올리고뉴클레오타이드에 결합된 변형 가능한 겔 비드의 조성물을 제공하는 단계; 및
    ii) 상기 조성물을 적어도 12주 동안 약 pH 7.4에서 저장하는 단계로서, 결합된 올리고뉴클레오타이드의 방출이 최대 0.025%인, 상기 저장하는 단계를 포함하는, 방법.
18. 제18항에 있어서, 상기 변형 가능한 겔 비드는 약 10㎛ 내지 약 100㎛의 직경을 갖는, 방법.
19. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 가능한 겔 비드는 약 30㎛ 내지 약 100㎛의 직경을 갖는, 방법.
20. 변형 가능한 입자의 현탁액을 포함하는 조성물로서,
    i) 상기 현탁액은 리게이션 완충액(ligation buffer), 리가제 효소(ligase enzyme), 올리고뉴클레오타이드, 및 임의의 환원제의 부재를 포함하는 용액을 갖되, 상기 용액은 상기 환원제의 부재 시에도 상기 변형 가능한 입자에 대한 올리고뉴클레오타이드의 리게이션을 지원하고;
    ii) 상기 변형 가능한 입자는 약 5㎪ 내지 100㎪의 탄성률을 가지며; 그리고
    iii) 상기 변형 가능한 입자는 응집에 대해 내성이 있되, 상기 변형 가능한 입자는 그 외에는 환원제의 존재 시에 응집하는 경향이 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
21. 제20항에 있어서, 상기 현탁액은, 하기 i) 내지 iii) 중 하나 이상을 추가로 특징으로 하는 조성물:
    i) 상기 현탁액 중 상기 입자의 적어도 95%가 상기 현탁액에 대해서 평균입자크기의 10% 이내인 입자의 분산도;
    ii) 약 0.1 cP 내지 약 100 cP의 용액 점도; 및
    iii) 약 1㎚ 내지 약 20㎚의 공극 크기를 갖는 입자.
22. 제1항의 변형 가능한 입자의 현탁액을 이용해서 여과하는 방법으로서,
    i) 상기 변형 가능한 입자의 현탁액을 유동 제한기(flow restrictor)로서 이용하는 단계; 및
    ii) 여과될 용액을, 상기 현탁액을 통해서 통과시키는 단계를 포함하는, 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 변형 가능한 입자는 약 2㎚ 내지 약 6㎚의 공극 크기를 갖는, 방법.
24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 변형 가능한 입자는 약 5㎚의 공극 크기를 갖는, 방법.
25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 가능한 입자는 4.4㎚ 미만의 크기 컷 오프(size cut off)를 제공하는, 방법.
26. 입자의 현탁액을 포함하는 조성물로서, 상기 현탁액은 하기 (i) 내지 (iv) 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물:
    (i) 상기 현탁액 중 상기 입자의 적어도 95%가 상기 현탁액에 대해서 평균입자크기의 10% 이내인 입자의 분산도;
    (ii) 약 5㎪ 내지 100㎪의 탄성률을 갖는 복수의 입자;
    (iii) 약 0.1 cP 내지 약 100 cP의 용액 점도; 및
    (iv) 약 1㎚ 내지 약 20㎚의 공극 크기를 갖는 입자.

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