CN107580627A - 用于生物化学反应和分析中的流动固相组合物 - Google Patents

用于生物化学反应和分析中的流动固相组合物 Download PDF

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Abstract

包含颗粒悬浮液的组合物，其中此类颗粒悬浮液具有用于许多应用的特征，所述应用包括例如限流、试剂递送和微流体系统中的用途。在所提供的一些组合物中，颗粒悬浮液包含可变形颗粒，并且在具体组合物中可变形颗粒是珠粒或凝胶珠粒。

Description

用于生物化学反应和分析中的流动固相组合物
交叉引用
本申请要求2015年5月18日提交的美国临时专利申请号62/163,238的优先权，所述申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
背景
最近历史显示在遗传学、疾病病理学、遗传病学、农业以及许多其他领域中的兴趣爆发和这些领域中的分子生物系统的分析。在此情况下还爆发了用于分析高度复杂的生物系统的分析方法和系统，所述生物系统包括例如生物化学和细胞测定系统、高通量遗传分析系统、复杂生物信息学等。
许多这些分析和/或处理系统利用流动的、固相支持体，例如颗粒、珠粒、胶体等，以用于呈现进行给定分析的组分，和/或以用于与反应物相互作用以纯化、分离、标记或以其他方式辅助分析过程。对于某些应用，这些流动固相可以通过满足许多参数中的一个或多个来受益，以便提高功效，它们通过这些功效在那些应用中起作用。本公开描述了满足这些和其他要求的方法、组合物和系统。
概述
本文描述了改进的组合物，其包含颗粒悬浮液，其中此类颗粒悬浮液具有用于许多应用的新型和有用特征，所述应用包括例如试剂递送和微流体系统中的用途。
在一方面，本公开提供一种包含颗粒悬浮液的组合物。所述颗粒悬浮液的特征可以在于具有以下一种或多种：(i)颗粒的分散性，其中悬浮液中至少95％的颗粒具有处于悬浮液的平均粒度的10％以内的粒度；(ii)具有约5kPa与100kPa之间的弹性模量的多个颗粒；(iii)约0.1cP与约100cP之间的溶液粘度；以及(iv)悬浮液中具有约1nm至约20nm的孔径的颗粒。
总体上，在一方面，提供一种包含可变形颗粒的悬浮液的组合物，所述悬浮液的特征在于以下一种或多种：
(i)颗粒的分散性，其中悬浮液中至少95％的可变形颗粒具有处于悬浮液的平均粒度的10％以内的粒度；
(ii)具有约5kPa与100kPa之间的弹性模量的多个可变形颗粒；
(iii)约0.1cP与约100cP之间的溶液粘度；以及
(iv)具有约1nm至约20nm的孔径的可变形颗粒。
在一个实施方案中，可变形颗粒可穿过比可变形颗粒更窄的微流体物理特征件。
在另一个实施方案中，微粒体物理特征件是：过滤器、障碍物、通路、通道、空间或其任何组合。
在一个实施方案中，可变形颗粒是珠粒。在一个相关实施方案中，珠粒是凝胶珠粒。
在另一个实施方案中，可变形珠粒具有选自由以下组成的组的直径：约1μm至约1mm、约10μm至约100μm、约20μm至约100μm、约30μm至约80μm以及约40μm至约60μm的直径。在一个实施方案中，可变形颗粒具有约10μm至约100μm的直径。在另一个实施方案中，可变形颗粒具有约30μm至约100μm的直径。
在另一个方面，可变形颗粒的悬浮液的特征在于约5kPa至约100kPa的剪切模量。
在另一个方面，提供一种从可变形颗粒的悬浮液中去除污染物的方法，其包括：
i)使可变形颗粒穿过筛网过滤器，该筛网过滤器的孔径小于可变形颗粒的直径；以及
ii)收集所述可变形颗粒。
在一个具体实施方案中，筛网过滤器包括约10μm至约50μm的孔径。在一个相关的实施方案中，可变形颗粒具有约10μm至约100μm的直径。在一个不同的实施方案中，可变形颗粒具有约30μm至约100μm的直径。在一个特定实施方案中，孔径是约30μm。在一个更特定的实施方案中，孔径是约41μm。在一个实施方案中，可变形颗粒是凝胶珠粒。
总体上，在另一个方面，提供一种存储寡核苷酸标记的可变形凝胶珠粒组合物的方法，其包括：
i)提供连接至寡核苷酸的可变形凝胶珠粒的组合物；以及
ii)将所述组合物在约pH 7.4下存储至少12周，其中所连接寡核苷酸的释放是至多0.025％。
在一个实施方案中，可变形凝胶珠粒具有约10μm至约100μm的直径。在一个特定实施方案中，可变形凝胶珠粒具有约30μm至约100μm的直径。
总体上，在另一方面，提供一种包含可变形颗粒的悬浮液的组合物，其特征在于：
i)所述悬浮液具有包含连接缓冲液、连接酶、寡核苷酸且不存在任何还原剂的溶液，其中所述溶液支持寡核苷酸与可变形颗粒的连接，甚至在所述还原剂不存在的情况下；
ii)可变形颗粒具有约5kPa与100kPa之间的弹性模量；以及
iii)可变形颗粒抗聚集，其中所述可变形颗粒不然在还原剂存在下将易于聚集。
在一个实施方案中，悬浮液进一步的特征在于以下一种或多种：
i)颗粒的分散性，其中悬浮液中至少95％的颗粒具有处于悬浮液的平均粒度的10％以内的粒度；
ii)约0.1cP与约100cP之间的溶液粘度；以及
iii)具有约1nm至约20nm的孔径的颗粒。
总体上，在另一个方面，提供一种使用上文所述的可变形颗粒的悬浮液过滤的方法，其包括：
i)使用所述可变形颗粒的悬浮液作为限流器；以及
ii)使待过滤的溶液穿过悬浮液。
在一个实施方案中，可变形颗粒具有约2nm至约6nm的孔径。在一个具体实施方案中，可变形颗粒具有约5nm的孔径。在一个特定实施方案中，可变形颗粒提供小于4.4nm的截止尺寸。
总体上，在另一个方面，提供一种包含颗粒的悬浮液的组合物，所述悬浮液的特征在于具有以下一种或多种：
(i)颗粒的分散性，其中悬浮液中至少95％的颗粒具有处于悬浮液的平均粒度的10％以内的粒度；
(ii)具有约5kPa与100kPa之间的弹性模量的多个颗粒；
(iii)约0.1cP与约100cP之间的溶液粘度；以及
(iv)具有约1nm至约20nm的孔径的颗粒。
以引用方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请以相同程度以引用的方式并入本文，如同这些出版物、专利或专利申请中的每一个都是特定地和单独地以引用的方式并入本文一样。
附图简述
图1是在微流体系统中流动的凝胶珠粒颗粒的一系列摄影图像。
图2是示出增加的渗透压对凝胶珠粒粒度的可变形效果的图。
图3是示出随着时间推移pH对污染率的效果的图。
详述
尽管本文已经显示并描述了本发明的各个实施方案，但是本领域的普通技术人员将清楚的是仅作为举例而提供了此类实施方案。本领域的普通技术人员可以想到众多变体、变化、以及替代，而不背离本发明。应该理解的是，可以采用本文所述的本发明的实施方案的不同替代方案。
本公开大体上提供用于生物化学反应的组合物和方法，所述生物化学反应包括作为更广泛生物化学和/或生物分析过程的一部分。本文所述的组合物和方法利用流动固相组合物，将试剂有效递送至感兴趣的反应，有时是在微流体背景中。本文所述的方法和组合物可以用于生成高度并行化的反应系统，随后分析高度复杂化的样品，包括例如在核酸分析和测序应用中。
I.一般特征
本文描述了用于生物、生物化学和/或化学处理和/或分析的处理和/或分析反应中的流动固相组合物。在一些情况下，提供了用于携带和呈现和/或递送微流体系统内的试剂的流动固相系统。在一些情况下，本文所述的组合物和/或系统被配置来满足许多不同参数中的一种或多种，所述参数有利于使用此类组合物作为试剂递送媒介物或有利于微流体系统中的其他用途。
总体上，组合物的特征可以与诸如以下各项的方面相关：微流体系统内的流动特征、与微流体系统中的用途有关并用于处理迭代分析过程的组合物的机械坚固性、试剂装载、试剂在组合物内的可利用性和可释放性、化学构成和稳定性、与反应条件的相容性以及组合物的可调节性。
本文所述的组合物可以根据所需应用大体上满足一个、若干个或大部分本文所述的参数。大体上，颗粒组合物可以由许多不同的材料产生以便满足所需参数。例如，在一些情况下，将聚合物材料用作形成本文中的颗粒组合物的基质。在一些情况下，使用聚合物网格、缠结聚合物等，因为它们为与试剂组合物的附接或缔合提供高表面积。在某些方面，采用水凝胶聚合物作为颗粒组合物的下层基质。聚丙烯酰胺聚合物适用作用于珠粒组合物的聚合物材料，包括例如线性聚丙烯酰胺、交联线性聚丙烯酰胺等。此类聚丙烯酰胺的实例包括例如线性聚丙烯酰胺，其掺入有N,N’-双(丙烯酰基)胱氨(BAC)单体以提供交联基团。在其他情况下，可以使用无机颗粒材料，诸如二氧化硅基颗粒。
本文所述的组合物的颗粒(例如，凝胶珠粒)可以如本文所述地以一个范围的尺寸使用。可以设想的是，凝胶珠粒的尺寸可以是在1μm至1mm、10μm至100μm、20μm至100μm、30μm至80μm或40μm至60μm直径之间。珠粒的示例性直径尺寸包括但不限于：30μm、40μm、50μm、55μm、57μm、60μm、64μm、70μm、72μm、75μm、100μm、125μm、150μm、200μm、250μm、500μm、750μm以及1mm。
II.流动特征
微流体系统内流动固相组分的使用依赖于那些固相组分在微流体通道和通道网络内的流动特征。在一些情况下，颗粒的流动可靠性、流速、间隔以及可包装性全部可以影响这些固体组分移动通过微流体通道的方式。总体上，在颗粒穿过微流体系统时，微流体通道可以适于在所采用的颗粒的现存参数内运行，而非配置颗粒以在微流体背景内更好运行。在另一方面，本公开涉及颗粒组合物的参数，其被提供来在微流体背景内产生更好的性能。
A.分散性
在某些应用中，这些材料移动通过微流体通道和通道网络的方式的可预测性可以显著影响总体系统的性能，所述方式例如这些珠粒流动通过该系统的速率、它们到达目的地的规则性以及避免失败事件(诸如，通道堵塞和其他失败)的能力。例如，在希望将个别珠粒或颗粒分配至微流体系统中形成的不同液滴(参见，例如，美国专利公布号2015/0005199，所述专利的全部公开内容以引用的方式并入本文)的情况下，将所需数目的珠粒精确递送至一个部分(例如，一个和唯一一个)中的能力由这些珠粒通过微流体系统的流动特征指示。
许多特定特征可以影响本文所述的颗粒的流动特征。例如，颗粒组合物中粒度的不均匀性(也称为分散性)可以影响颗粒悬浮液通过微流体通道的流动特征，因为不同尺寸的颗粒可以具有不同的流动特征，并且产生不同的潜在失败模式。根据本文所述的组合物，颗粒组合物可具有基本上单分散群体尺寸，如本文所述的，单分散群体尺寸意指悬浮液中至少80％的颗粒将是所述群体的平均粒度的+/-10％。在一些情况下，悬浮液中至少90％的颗粒将是所述群体的平均粒度的+/-10％。仍在其他情况下，悬浮液中至少95％的颗粒将是所述群体的平均粒度的+/-10％，并且仍在其他情况下，悬浮液中至少98％或甚至99％的颗粒将是所述群体的平均粒度的+/-10％。如本文所用的，粒度可以大体上被测量为颗粒的平均直径。
颗粒分散性测量可以大体上通过多种已知方法中的任一种方法来实现。例如，对于高通量测量，例如1000或更多个颗粒的测量，可以使用自动显微镜(例如，使用Morphologi G3系统)、动态成像分析(例如，使用流动监测照相机系统)和光散射(例如，使用Mastersizer 3000系统)。在一些情况下，分散性水平可以在与平均值相比的标准偏差方面测量，表示为CV％。
在一些情况下，实现所需粒度可以通过一种或多种严格控制的制备技术以及制备后分选和分级技术(例如，过滤或筛选技术)来完成。然而，在某些情况下，颗粒的性质可以阻止对颗粒群体使用基于简单尺寸排除的技术。例如，在高弹性或可变形颗粒的情况下，例如，如本文更详细描述的，筛选或过滤技术可以是无效的，因为它们更容易堵塞和结垢。另外，在弹性颗粒的情况下，变形并通过更小开口的能力导致更广泛的尺寸分布。因此，在一些情况下，颗粒群体可以经历尺寸分离/选择的替代性方法。例如，在第一种情况下，颗粒群体可以经历粒度选择的气浮过滤方式。在此类情况下，可以在浮动腔内以通过所述腔施加的上升流速提供颗粒的溶液或悬浮液。流速可以选择来使得较重的较大颗粒或聚集物的重力沉降克服上升流动并且这些颗粒下沉或至少未能到达所述腔的上部分处的洗脱端口，其中适当尺寸的颗粒可以去除。
在替代性但相关的方式中，尺寸选择可以使用向量色谱方法和系统来执行。在此类系统中，可以提供较长的通道或导管，颗粒的悬浮液穿过所述通道或导管。由于其尺寸及其易于扩散跨越流动流，较小颗粒可能在流速最大的流动通道的中心中花费更大量的时间。较大颗粒可能倾向于更缓慢扩散，并且因此可能在更缓慢流动的流部分中花费更大量的时间。提供足够长的通道，较小颗粒首先倾向于从系统中出来。
B.弹性
本公开的组合物与其通过微流体系统的流动特征相关的另一种特性是其弹性或可变形性。在一些情况下，对于其中颗粒组合物接近或甚至超过微流体通道(或其部分)的横截面尺度中的一个或多个的应用，那些组合物基本上无阻碍地穿过的能力影响那些悬浮液通过流体网络的流动。因此，本文所述的颗粒组合物可以是相对弹性的和/或可变形的。在一些情况下，本文所述的颗粒组合物将具有约5至约100kPa的弹性模量。在一些情况下，组合物将包括约5与约50kPa之间或者50至约100kPa的弹性模量。仍在其他情况下，颗粒组合物将具有以下弹性模量：约5至约10kPa、约10至约20kPa、约20至约30kPa、约30至约40kPa、约40至约50kPa、约50至约60kPa、约60至约70kPa、约70至约80kPa、约80至约90kPa、约90至约100kPa。颗粒组合物的弹性模量使用多种已知方法中的任一种方法来表征，所述方法包括例如渗透压压缩方法、微机械变形技术和离心压缩方法。
控制颗粒组合物的弹性模量可以通过控制制造过程和或固相的组成或组合物的颗粒组分来完成。例如，对于聚合物颗粒，弹性模量可以通过增加或减小颗粒内聚合物的封装水平，例如通过控制聚合物基质的次级结构、控制分子内和分子间静电相互作用或者通过控制向颗粒提供增加的刚性的交联水平或其他结构来调节。例如，在线性聚丙烯酰胺聚合物颗粒的情况下，可以增加或减少颗粒内的交联水平，例如通过增加或减少聚合物中的交联剂组分的水平，所述聚合物例如双丙烯酰胺共聚物和交联引发反应剂，例如TEMED。
C.聚集/粘附
除上文以外，颗粒组合物的另一个重要参数是其避免与系统内的其他表面粘附的能力，包括例如组合物中的其他颗粒以及微流体通道、孔、管或其他容器的表面。在与其他颗粒粘附方面，本文所述的组合物可以是非聚集的，这意味着组合物中少于10％的颗粒当悬浮在水性溶液中或者当移动通过水性环境中的微流体系统(例如包括但不限于，在非水性载体流体中的水性液滴内)时将是两个或更多个颗粒的聚集体形式。在一些情况下，少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或甚至少于1％的颗粒将表现为聚集的颗粒。
在一些情况下，可能希望使用更特殊的工具测量珠粒-珠粒相互作用力。例如，在一些情况下，珠粒-珠粒吸引可以使用施加于聚集颗粒的拉伸流动系统测量，其中控制良好的流动调节器可以用于引导控制良好的力以确定相互作用力。
控制颗粒间相互作用(例如，粘附和相互作用)可以使用许多不同的方式来执行，包括例如控制表面电荷、疏水性/亲水性、反应性官能团在表面上的存在。
D.与其他表面的相互作用
颗粒组合物也可以具有减少的粘附至系统中它们所设置的表面的倾向，所述表面例如微流体或其他导管、反应容器、孔、管等。与颗粒间聚集一样，如上文所讨论的，在某些情况下，重要的颗粒特性涉及其对不同表面的惰性，例如以便避免表面粘附。预防表面结垢、通道堵塞等的能力可能在微流体系统中有所关注。同样，在反应物和/或产物以相对低水平存在的反应系统中，反应物或产物到容器表面的非特异性吸附可以例如通过隐藏反应物或产物来偏离那些反应的分析结果。这样，配置颗粒使其对反应容器的表面是惰性的或者在一些情况下主动排斥所述表面可以是希望的。这可以通过许多方式来完成，所述方式包括例如选择具有与反应容器表面相反的净电荷的颗粒。在某些情况下，提供大体上亲水并且大体上不带电荷的颗粒组合物。在一些情况下，这可以通过由不带电荷且亲水的聚合物形成颗粒组合物来完成。聚合物的非限制性实例包括例如聚乙二醇聚合物(PEG)、聚丙烯酰胺聚合物(诸如线性聚丙烯酰胺)、纤维素聚合物、葡聚糖等。
E.溶液粘度
除了颗粒群体内个别颗粒的特性之外，本文所述的颗粒组合物可以具有满足某些有用参数的体积特性。在一些情况下，如将了解的，与流动通过微流体系统的个别颗粒的流动特征分开，颗粒悬浮液的体积粘度也可以是本文所述的颗粒悬浮液组合物的重要的流动特征。在一些情况下，含有颗粒的组合物的粘度可以被控制在所需参数内以便实现许多不同目标中的任一个。例如，在一些情况下，可能希望含有颗粒的组合物具有与组合在微流体系统内的其他流体类似的体积粘度，以便促进不同流体内的一致流速并且允许更一致的流体混合。相反，在一些情况下，体积粘度可以被控制来提供含有颗粒的组合物的基本上不同的流体特征，以便防止快速混合、以便提供不同流速或类似情况。
总体上，含有颗粒的组合物的流变性或粘度可以是在约0.5厘帕(cP)与约5000cP之间。在一些情况下，溶液粘度可以是0.5至100、0.5至50cP、1至50cP，并且在一些情况下是1至10cp。但是在其他情况下，溶液粘度可以是更高的，例如100至1000cP、100至500cP等。在某些情况下，所述粘度可以旨在类似于常见微流体系统内处理的其他流体的粘度。总体上，此类流体包括水性流体、试剂等以及分配流体，例如氟化油和表面活性剂。总体上，这些流体可以具有范围为约0.5cP至约20cP的体积粘度。这样，在一些情况下可能希望当沉积在微流体系统中时提供含有颗粒的组合物，其粘度为约0.5cP与约20cP之间、约1.0与约10.0cP之间或甚至约1.0cP与5.0cP之间。
总体上，可以通过调节许多不同参数中的一个或多个来调节含有颗粒的组合物的流变性，所述调节参数包括调节颗粒弹性、颗粒-颗粒交互性、粒度分布、颗粒浓度、温度或者通过使用粘度调节添加剂。
III.机械坚固性和可处理性：
除了理解流动颗粒相如何移动通过微流体系统之外，本文所述的颗粒系统的另一个重要参数涉及其在典型用途下的坚固性。在一些情况下，无论是在使这些颗粒悬浮液流动通过微流体系统还是通过常规处理(例如，移液、离心、重悬浮和搅拌、冷冻和解冻)，本文所述的颗粒组合物可以保持基本上完整，除非或直到在需要时施加适当刺激来破坏颗粒。总体上，颗粒组合物的坚固性大体上凭借在机械处理过程之后所得分散性水平来测量。例如，颗粒组合物可以保留上文所述的分散性度量，甚至在一个或多个移液步骤、微流体注射/移动步骤、离心步骤、涡旋步骤或其他机械处理步骤之后也是如此。
另外，颗粒组合物可以具有此类特征以便总体上促进处理，例如允许适当流动特征同时也允许基于离心的分离技术的适当密度。总体上，对于基本上水性介质中的水合颗粒，颗粒组合物可以具有约1.001与1.2之间的密度，例如具有1.00至1.10的密度。
IV.试剂装载和可用性：
在一些情况下，本文所述的颗粒组合物可以用作试剂递送媒介物，以将试剂有效载荷精确递送到微流体系统内的所需位置。如将了解的，这涉及与将试剂装载到这些颗粒中的能力以及一旦递送就接近和/或释放那些试剂的能力相关的重要颗粒参数。对于许多应用，本文所用的颗粒包含有利于试剂装载和接近测定系统内的试剂的多孔结构。此类多孔颗粒可以包括多种多孔结构中的任一种，包括例如多孔固体或半固体结构、大分子基质样结构(例如，缠结聚合物基质、交联聚合物网格结构等)。
A.网格尺寸
如将了解的，对于多孔颗粒，可以部分通过颗粒的网格尺寸和相对孔隙率来管控材料移动进出颗粒的能力。在一些情况下，较大化合物或材料将更容易扩散进出较大孔颗粒(与较小孔颗粒相比)，从而允许更快速地从颗粒扩散或者渗透到所述颗粒中。在一些情况下，可能希望的是，相对大的大分子能够有效进出颗粒。
作为实例，在一些情况下，颗粒组合物可以提供有耦接至其内部基质的试剂。在使用化学刺激物引起试剂从颗粒释放的情况下，可能希望的是允许刺激物有效扩散到颗粒中并且允许反应物从颗粒中扩散出来。
与上文相反，在其他方面，可能希望的是提供具有允许较小分子有效移动进出颗粒同时阻碍较大分子例如大分子(如寡核苷酸、蛋白质等)扩散的网格尺寸的颗粒。
这样，可能希望的是，颗粒的网格尺寸或孔径是1至20nm，在一些情况下是1-10nm，在一些情况下是1-5nm，在一些情况下是1-4nm，在一些情况下是1-3nm，在一些情况下是1-2nm。在其他情况下，孔径可以是5-20nm、5-10nm或甚至7-10nm。在希望预防较小分子扩散进入和/或扩散出孔的情况下，可能希望孔径小于1nm，例如在0.01与1nm之间。调节孔径可以通过许多方法来实现，所述方法包括例如通过增加存在于聚合物基质中的聚合物的浓度、通过调节聚合物基质中的交联水平和/或通过改变聚合聚合物上的渗透力，以引起聚合物基质收缩，从而减小孔径。
B.表面积
如先前所述的，对于许多应用，本文所述的颗粒组合物可以适用作试剂递送系统。虽然在一些情况下试剂递送方面可以通过用待递送的试剂浸渍颗粒来提供，其中此类试剂可以由物理屏障保留或者凭借与其环境的溶剂不相容性来保留。然而，在一些情况下，例如通过共价或非共价分子相互作用，试剂将化学耦接至构成所述颗粒的基质。这样，在一些情况下，颗粒组合物将具有足够大的表面积或足够数目的耦接位点，以实现在每个颗粒的基础上的所需装载能力。
D.分子密集/有限反应空间
使用多孔颗粒的另一个优点提供增强颗粒相对于周围载体流体的界限内的局部浓度的能力。在一些情况下，将希望提供尽管那些反应剂在总体介质中相对稀释但是仍迫使其中含有的反应剂之间发生紧密相互作用的多孔颗粒。
E.对刺激物的反应性、溶解性
如先前所述的，在一些情况下，颗粒可以被配置成在施加特定刺激物时释放其试剂有效载荷。在一些情况下，除了试剂释放之外或者作为试剂释放的替代方案，颗粒可以被配置成在施加刺激物时可溶解或可降解，以便促进溶剂释放，例如无论是通过从夹带中释放还是通过从颗粒基质中化学解离。
在一些情况下，本文所述的颗粒组合物将被配置成释放其试剂有效载荷和/或在所需时间框架内基本上溶解。在一些情况下，颗粒组合物将在自暴露于适当刺激物(例如，化学刺激物，诸如还原剂，任选地包括高温，例如95℃)开始的所需时间框架内释放至少90％的试剂。在一些情况下，将释放至少95％的试剂有效载荷，将释放至少98％或甚至至少99％的有效载荷。在一些情况下，从暴露于刺激物到释放的所需时间框架将小于20分钟、小于10分钟、小于5分钟、小于3分钟、小于2分钟、小于1分钟。在一些情况下，所需时间框架将是如上文所述的，但是大于1秒、大于10秒、大于20秒、大于30秒、大于40秒、大于50秒。
寡核苷酸与凝胶珠粒的附接可以通过许多方式，包括但不限于：二硫键、酯键、甲硅烷基醚接头(参见例如，美国专利申请公布号US 20130203675)、生物接头、UV可裂解接头等。
刺激物可以用于控制寡核苷酸从凝胶珠粒中释放。一种用于控制释放的方式是改变pH条件。另一种方式是通过一种或多种还原剂的作用(例如，用于释放二硫键)。
V.化学构成。
在许多应用中，颗粒组合物的重要特征涉及其与化学环境相互作用的方式。在一些情况下，这些组合物可以暴露于各种各样的化学条件，诸如极端pH、离子强度、极性试剂等。在一些情况下，对于这些组合物将希望的是对于其特征保持相对稳定，而在其他情况下，将希望的是改变的环境刺激颗粒的特征发生变化，例如以便释放与其结合的试剂。
在一些情况下，本文所述的组合物的许多应用使颗粒经历广泛不同的环境和/或机械条件，并且这些颗粒与那些环境的相容性是一种重要的特征。
A.与乳液化学的相容性
因为本文所述的颗粒组合物可以适用作用于感兴趣反应的试剂递送系统，结果这些颗粒可以大体上与相关反应条件相容。对于许多应用，此类相容性可以包括不以不利地影响潜在反应的方式与试剂相互作用的颗粒组合物。在一些情况下，相容性可以经由使用不具有过量电荷、疏水性、亲水性或极性的颗粒组合物来实现，而非如给定反应系统所耐受的。在一些情况下，颗粒组合物可以包含当用于基本上中性的pH环境(例如，在约pH 6与约pH 8之间)时基本上非离子的基质。在一些情况下，颗粒组合物内颗粒的ζ电势当处于以上所述pH范围时将是+/-0-5mV。
然而，在一些情况下，颗粒组合物将经历相对模糊的环境条件。在一些情况下，颗粒组合物将用于将待递送的试剂共同划分到非水性载体流体中的水性液滴中。在此类情况下，氟化油可以用作其中形成液滴的载体流体。在此类情况下，水相或液滴常常可以含有相对高浓度的极性化合物或表面活性剂，其用于使非水性载体流体中的液滴稳定，即减小其与其他液滴聚结的易感性。如将了解的，这些大极性表面活性剂化合物可以通过使其结垢、使其不易接近其他材料等而对材料(诸如颗粒)的表面具有显著不利影响。
颗粒组合物(例如，凝胶珠粒)可以分配到液滴中，以使得至少一部分包含颗粒。对于约1％、5％、10％、20％>、30％>、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的部分，确实如此。对于至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的部分，确实如此。对于少于约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的部分，确实如此。
颗粒(诸如珠粒或凝胶珠粒)的最终稀释可以实现每个液滴一个颗粒的装载或每个液滴任何所需数目的颗粒的装载。在一些情况下，使用泊松分布引导或预测每个液滴的颗粒或珠粒的最终浓度。
本文所述的颗粒组合物的优点涉及颗粒的有利于实现泊松分布的可变形性。确切地说，颗粒的可变形性的物理特性允许更好地控制携带一个或多个颗粒的液滴的形成。与本文所述的颗粒组合物中的颗粒的可变形性相关的另一个优点是改进的在液滴内共同划分的能力。可以设想，此优点支持改进的颗粒与细胞、细胞组分或其他颗粒(性质为细胞或分子的)的共同划分。在一个实施方案中，提供单个颗粒和单个细胞的改进的共同划分。
B.离子强度和pH耐受性
与上文所讨论的极性表面活性剂一样，在一些情况下，颗粒组合物可以经历具有广泛不同的离子强度和pH的环境。在此类情况下，对于颗粒组合物可能希望不仅保留其基础结构(例如，未解离并未溶解)，而且基本上维持其体积。此耐受性可以通过许多方法赋予，所述方法包括调节如上文所述的交联水平、调节聚合物中带电荷单体水平等。
C.对刺激物的反应性
与上文相反，在一些情况下，本文所述的颗粒组合物将用于在施加特定化学或物理刺激时释放试剂有效载荷，并且此有效载荷有效且均匀发生的能力可以是一种重要的特征。许多上文所述的参数有助于颗粒组合物的反应性，包括例如网格尺寸、表面积、单分散性。
作为实例，反应性特征可以包括通过裂解化学连接来释放试剂的能力、释放夹带的较大分子的孔网络缠结或溶解的能力。根据颗粒组合物的这些类型并且如上文所述的，在一些情况下，颗粒组合物可以在施加适当刺激物(例如，与化学刺激物接触或暴露于热刺激或机械刺激)的10分钟内实现试剂从颗粒中完全或基本上完全释放。基本上完全释放一词意指颗粒可以在所述时间框架内释放其至少约50％的试剂容量，在一些情况下至少60％，在一些情况下至少70％，在一些情况下至少80％，同时仍在其他情况下至少90％或甚至至少95％或99％的试剂携带容量。在一些情况下，大量释放将发生在1秒至10分钟内，而在一些情况下可以花费少于8分钟、少于6分钟、少于5分钟、少于4分钟、少于3分钟或更少时间。测量试剂释放可以大体上通过使用适用于测量给定试剂的浓度的许多方法中的任一种检测流体体积内分散的游离或未结合试剂来实现。此类方法可以包括用于分离任何颗粒组分以便分离游离试剂与结合试剂的步骤。这可以与颗粒的试剂容量的已知量或理论量相比，或者与作为总试剂容量的代理的长期释放(例如，1、2、3、4、5、12或更多小时)相比较，例如比较10分钟释放与12小时释放以提供所释放的试剂与试剂容量的比例。
VI.组合物的可调节性
如由上文将了解的，颗粒组合物常常可以包含一个、两个、三个、四个或更多个上文所述的特征，其可被选择和调节来完成所需反应目标。这些组合物大体上共享在所有上文所述的特征中高度可调节的益处。
VII.颗粒的可变形性。
颗粒(例如，凝胶珠粒)的可变形性有利于微流体系统。例如，可变形颗粒可以由于其可变形性或弹性性质而穿过微流体系统的特征件诸如收缩、障碍物、过滤器或其他物理特征件。对于可变形颗粒甚至可以穿过具有比可变形颗粒本身更窄的通路的区域、空间、过滤器、障碍物或其他物理特征件
图1示出在一系列时间推移的显微照片中的可变形颗粒凝胶珠粒，这证实了凝胶珠粒的可变形性。图1A中的白色箭头显示凝胶珠粒流和两个凝胶珠粒在微流体系统的t-交叉口中的方向。在图1B中，两个珠粒进一步移动在一起。在图1C中，两个珠粒当它们行进通过t-交叉口后明显变形。
VIII.压缩弹性模量
颗粒可变形性的一个测量是压缩弹性模量(K)。可以设想，有用颗粒(例如，凝胶珠粒)可变形性可以在K值范围内获得。例如，0.1kPa至200kPa。更确切地说，在1kPa至100kPa的范围内。其他有用范围可以包括10kPa至100kPa、25kPa至100kPa、25kPa至75kPa以及30kPa至65kPa。
使用基于葡聚糖的渗透压方式测量不同尺寸凝胶珠粒的颗粒压缩弹性模量(K)。
实验：对三种尺寸57.6μm、64.8μm和72.1μm的凝胶珠粒测试它们的相应压缩弹性模量(K)。将凝胶珠粒暴露于不同浓度的葡聚糖(葡聚糖Mr＝70,000)。增加葡聚糖的浓度百分比对凝胶珠粒产生增加的渗透压(Pa)。在施加逐渐增加的渗透压的过程中，对凝胶珠粒成像并分级。图2示出实验结果的图。y-轴显示作为葡聚糖处理的凝胶珠粒的体积相对于测量的凝胶珠粒的初始体积的log比率的测量的珠粒尺寸。x-轴显示作为葡聚糖浓度的函数的所测试渗透压(Pa)范围。
结果指示不同珠粒尺寸的压缩弹性模量(K)相对于所测试渗透压(Pa)范围的小变化。在以下表1中示出三种凝胶珠粒尺寸各自的压缩弹性模量(K)值。如表1所呈现的，测量为kPa的K随着凝胶珠粒的直径逐渐增加而有几分升高。然而，观察到与凝胶珠粒尺寸相关的在kPa值之间的仅少量但可测量的变化。
表1.
起始直径(微米) K(kPa)
57.6 35.8
64.8 36.1
72.1 40.3
IX.剪切模量
可变形性的另一个测量是剪切模量(G)，其可测量为kPa。可以设想，有用颗粒(例如，凝胶珠粒)可变形性可以在G值范围内获得。例如，0.1kPa至200kPa。更确切地说，在1kPa至100kPa的范围内。其他有用范围可以包括5kPa至约100kPa、10kPa至100kPa、25kPa至100kPa、25kPa至75kPa以及30kPa至65kPa。
X.通过筛网过滤凝胶珠粒去除的凝胶珠粒污染物
凝胶珠粒当存储在油中(在生成之后)时或者当以水性缓冲液洗涤时可以结块在一起。大碎片也可以从周围环境进入凝胶珠粒溶液。这些结块/碎片可以阻塞微流体芯片内的微流体通道，从而导致样品损失。然而，可以使用筛网过滤器或径迹蚀刻过滤器过滤凝胶珠粒以在其制造期间去除>4个凝胶珠粒的团块。
采用筛网过滤器去除凝胶珠粒团块和碎片。
实验：筛网过滤30um凝胶珠粒。使凝胶珠粒穿过以30um、20um、10um和5um的筛网尺寸测试的尼龙编织网(90mm直径)。将凝胶珠粒在官能化之前过滤三次并在官能化之后过滤三次。在每轮过滤之后置换过滤器。将所使用的过滤器放置在具有45mL DNA连接缓冲液的50mL塑料螺帽管中。在一些情况下在300um FloCam上检测筛网保留的凝胶珠粒/碎片(例如，纤维)。观察到可忽略的珠粒损失(<5mL)。处理时间如下：冲洗并设置过滤器装置20分钟。每轮过滤5分钟(总计15分钟)。使每个保留物样品运行通过FlowCam 10分钟(任选地)。
使用在20um和10um处径迹蚀刻的聚碳酸酯测试凝胶珠粒过滤。
30um凝胶珠粒的结果显示去除一些较大污染物并且优选的筛网是具有20um孔(均匀孔径)的尼龙筛网过滤器。无过滤条件的对照显示在约200,000个凝胶珠粒(亚分类成<5或≥6凝胶珠粒结块)中可见的许多结块。在通过20um尼龙编织网(90mm直径)进行三轮过滤之后，存在结块数目的显著减少。
实验：筛网过滤54um凝胶珠粒。使凝胶珠粒穿过60um、41um、30um和10um的筛网尺寸的尼龙网。使用在20um和10um处径迹蚀刻的聚碳酸酯测试凝胶珠粒过滤。结果显示去除一些较大污染物并且优选的筛网是具有41um孔(均匀孔径)的尼龙筛网过滤器。
无过滤条件的对照显示在约100,000个凝胶珠粒(亚分类成<5或≥6凝胶珠粒结块)中可见的许多结块。在通过41um尼龙编织网(90mm直径)进行三轮过滤之后，存在结块数目的显著减少。
Y.凝胶珠粒聚集的预防
本文所述的颗粒组合物可以包含附接的寡核苷酸，例如条形码，所述寡核苷酸通过组合方式附接。在一些组合方式中，可以使用连接方案组装包含珠粒上的条形码序列的寡核苷酸序列(例如，如本文任何其他位置所述的可降解珠粒)。例如，可以提供单独的珠粒群体，含有条形码的寡核苷酸将附接至所述珠粒群体。(参见美国专利申请公布号US20140378349，其以引用的方式并入本文)在连接方案之后，发现凝胶珠粒具有结块和粘着的倾向。在未受限于特定理论的情况下，一种可能的解释是在连接方案中包含荧光团引起凝胶珠粒结块。另一种可能是连接方案中还原剂的存在不利地影响凝胶珠粒，从而导致观察到的结块和胶粘。在连接反应中，DTT存在高达40μM。
实验：研究凝胶珠粒尺寸和结块在暴露于还原剂时的变化。将凝胶珠粒孵育在约20μM TCEP(三(2-羧基乙基)膦)还原剂中30分钟，从而导致凝胶珠粒结块。发现在较低浓度TCEP下孵育的凝胶珠粒经历尺寸增加。
在单独的研究中，测试粘性凝胶珠粒在注射到乳液中的凝胶珠粒的制备中的作用。发现来自连接方案的粘性凝胶珠粒引起凝胶珠粒结块并不均匀注射到乳液中。还发现在40μM DTT条件下经历连接方案引起流体芯片上的凝胶珠粒不均匀注射和结块。
发现所观察的凝胶珠粒的结块和胶粘可以通过改变连接方案的连接缓冲液来补救。通过去除还原剂，形成无还原剂或基本上无还原剂的连接方案，凝胶珠粒未结块和胶粘(数据未示出)。这是可测量的，例如通过测量到乳液中的珠粒注射速率(数据未示出)来测量。还发现连接方案的连接酶组分包含一定水平的还原剂，所述还原剂可以在执行连接方案之前从所述酶中消除以实现结块和胶粘的缺乏。总之，结果显示凝胶珠粒可以更好地稳定，并且显示当在没有任何还原剂的情况下进行连接方案时结块和胶粘减少。出乎意料地，发现从连接酶去除还原剂不仅改进凝胶珠粒特征，而且对具有凝胶珠粒的连接方案中的酶活性不具有不良作用。
Z.pH优化以保留寡核苷酸-凝胶珠粒连接
在制备和存储标记的凝胶珠粒(例如，寡核苷酸加标签或条形编码的凝胶珠粒)时，观察到污染作用，其中寡核苷酸在存储期间在无任何释放刺激的情况下不理想地从凝胶珠粒中释放。将pH优化作为此问题的解决方案进行研究。
实验：在一周直至12周的过程中，将条形编码的凝胶珠粒存储在各种pH条件下的存储缓冲液并且每周测量污染率(释放的寡核苷酸)。图3所示结果显示pH 7.4对于在12周存储期过程中减少污染是最佳的。当存储在pH 7.4时检测到仅仅0.025％污染。随着pH增加，污染率增加。最大污染发生在所测试的最高pH(pH 8.2)下，其中检测到多达0.110％污染。污染结果汇总在表2中。
表2.
pH 污染率(每周)
8.2 0.110％
8.0 0.072％
7.8 0.050％
7.6 0.041％
7.4 0.025％
AA.使用凝胶珠粒作为过滤器
凝胶珠粒可以在其物理结构中包括一定范围的网格尺寸。凝胶珠粒中提供的网格尺寸可以适用作限流器,由此足够小的尺寸的物体可以扩散到或流入到凝胶珠粒并甚至通过凝胶珠粒,而较大尺寸的物体将不能扩散到或流入到凝胶珠粒中。实验基本原理是较大网格尺寸的凝胶珠粒应导致FITC-葡聚糖扩散到凝胶珠粒中，而较小网格尺寸凝胶珠粒不应允许扩散到凝胶珠粒中。
实验：FITC-葡聚糖被用来与两个不同网格尺寸的凝胶珠粒进行测试。在研究中使用表3所示的FITC-葡聚糖的0.1％w/w储备溶液。
表3.
将储备溶液稀释至最终浓度0.055％w/w。使用动态光散射测量每个分子量FITC-葡聚糖的斯托克半径(Stoke’s radius)。(数据未示出)将10uL包装的凝胶珠粒添加到90uLFITC-葡聚糖并且在黑暗中孵育整晚。获取凝胶珠粒的明视场(相位对比)和荧光(488nm)图像。对于六种测试的凝胶珠粒批号，确定凝胶珠粒网格尺寸在所有凝胶珠粒批号中是一致的并且在<4.4nm处分级。(数据未示出)。
虽然以上发明已出于清楚和理解的目的详细描述，但是本领域技术人员通读本公开将清楚的是可以做出形式和细节的各种变化而不背离本发明的真实范围。例如，上文所述的所有技术和装置可以各种组合使用。例如，颗粒递送可以使用所述阵列孔分级方法实践。在本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其他参考文献出于所有目的通过引用以其全部内容而结合，在程度上就像每个单独的出版物、专利、专利申请和/其他文件被个别地和单独地指出以出于所有目的以引用方式并入相同。
尽管本文已经显示并描述了本发明的优选实施方案，但是本领域的普通技术人员将清楚的是仅作为举例而提供了此类实施方案。本领域的普通技术人员现在将会想到众多变体、变化、以及替代，而不背离本发明。应该理解的是，本文所述的本发明的实施方案的不同替代方案可以用于实施本发明。预期的是以下权利要求书限定了本发明的范围以及由此覆盖在这些权利要求和它们的等效物的范围内的方法和结构。

Claims (26)

1.一种组合物，其包含可变形颗粒的悬浮液，所述悬浮液的特征在于以下一种或多种：
(i)颗粒的分散性，其中所述悬浮液中至少95％的所述可变形颗粒具有处于所述悬浮液的平均粒度的10％以内的粒度；
(ii)具有约5kPa与100kPa之间的弹性模量的多个可变形颗粒；
(iii)约0.1cP与约100cP之间的溶液粘度；以及
(iv)具有约1nm至约20nm的孔径的可变形颗粒。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述可变形颗粒可穿过比所述可变形颗粒更窄的微流体物理特征件。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述微流体物理特征件是：过滤器、障碍物、通路、通道、空间或其任何组合。
4.如任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述可变形颗粒是珠粒。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述珠粒是凝胶珠粒。
6.如任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述可变形颗粒具有选自由以下组成的组的直径：约1μm至约1mm、约10μm至约100μm、约20μm至约100μm、约30μm至约80μm以及约40μm至约60μm的直径。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述可变形颗粒具有约10μm至约100μm的直径。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述可变形颗粒具有约30μm至约100μm的直径。
9.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述悬浮液的特征在于约5kPa至约100kPa的剪切模量。
10.一种从如权利要求1所述的可变形颗粒的悬浮液中去除污染物的方法，其包括：
i)使所述可变形颗粒穿过筛网过滤器,所述筛网过滤器的孔径小于所述可变形颗粒的直径；以及
ii)收集所述可变形颗粒。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述筛网过滤器包括约10μm至约50μm的孔径。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述可变形颗粒具有约10μm至约100μm的直径。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述可变形颗粒具有约30μm至约100μm的直径。
14.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述孔径是约30μm。
15.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述孔径是约41μm。
16.如权利要求10-15中任一项所述的方法，其中所述可变形颗粒是凝胶珠粒。
17.一种存储寡核苷酸标记的可变形凝胶珠粒组合物的方法，其包括：
i)提供连接至寡核苷酸的可变形凝胶珠粒的组合物；以及
ii)将所述组合物在约pH 7.4下存储至少12周，其中所连接寡核苷酸的释放是至多0.025％。
18.如权利要求18所述的方法，其中所述可变形凝胶珠粒具有约10μm至约100μm的直径。
19.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述可变形凝胶珠粒具有约30μm至约100μm的直径。
20.一种包含可变形颗粒的悬浮液的组合物，其特征在于：
i)所述悬浮液具有包含连接缓冲液、连接酶、寡核苷酸且不存在任何还原剂的溶液，其中所述溶液支持寡核苷酸与所述可变形颗粒的连接，甚至在所述还原剂不存在的情况下；
ii)所述可变形颗粒具有约5kPa与100kPa之间的弹性模量；以及
iii)所述可变形颗粒抗聚集，其中所述可变形颗粒不然在还原剂存在下将易于聚集。
21.如权利要求20所述的组合物，所述悬浮液进一步的特征在于以下一种或多种：
i)颗粒的分散性，其中所述悬浮液中至少95％的所述颗粒具有处于所述悬浮液的平均粒度的10％以内的粒度；
ii)约0.1cP与约100cP之间的溶液粘度；以及
iii)具有约1nm至约20nm的孔径的颗粒。
22.一种使用如权利要求1所述的可变形颗粒的悬浮液过滤的方法，其包括：
i)使用所述可变形颗粒的悬浮液作为限流器；以及
ii)使待过滤的溶液穿过所述悬浮液。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述可变形颗粒具有约2nm至约6nm的孔径。
24.如权利要求22或权利要求23所述的方法，其中所述可变形颗粒具有约5nm的孔径。
25.如权利要求22-24所述的方法，其中所述可变形颗粒提供小于4.4nm的截止尺寸。
26.一种组合物，其包含颗粒的悬浮液，所述悬浮液的特征在于具有以下一种或多种：
(i)颗粒的分散性，其中所述悬浮液中至少95％的所述颗粒具有处于所述悬浮液的平均粒度的10％以内的粒度；
(ii)具有约5kPa与100kPa之间的弹性模量的多个颗粒；
(iii)约0.1cP与约100cP之间的溶液粘度；以及
(iv)具有约1nm至约20nm的孔径的颗粒。
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