JP2021508826A - 試料中の分析物と結合する、および/またはそれを濃縮する、および/またはそれを検出するためのセンサボディ - Google Patents
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Abstract
Description
結合した分析物の量、したがって検出されるシグナルを増加させるために、結合領域を増加させたマイクロ粒子の形態の多孔質センサマトリックスが採用されてきた[4]。しかしながら、多孔質材料はまた、非特異的に結合したシグナルを生成する実体を除去するために、より慎重な洗浄を必要とする。多孔質材料は、センサボディの多孔質の内側部分を含む表面全体が洗浄液体に曝露される必要があるため、本質的に平坦な表面を有する固体粒子と比較して追加の時間とより多くの液体体積を必要とする。また特に時間がかかるのは、洗浄溶媒によって放出された非特異的に結合したシグナルを生成する実体を多孔質マトリックスから除去することである。このプロセスは、受動拡散にのみ頼る場合、非常に遅く、むしろ非効率的であり得る。これまで、分析物と結合させるために熱応答性ポリマーおよび抗体のコンジュゲートを使用し、サンドイッチ状の立体配置を確立するために第2の色素で標識された抗体を使用するようなイムノアッセイを実行するために、熱応答性ポリマーが採用されてきた(Auditore-Hargreaves, Monji[5〜7])。溶液の温度をポリマーの臨界的な溶液温度より高い温度に設定すると、ポリマーの相変化の誘発により不特定の沈殿した集合体がin situで形成される。形成された粒子に付着したシグナルの含量は、試料中の抗原の量に比例する。この手法は、in situでのポリマーマトリックスの形成および/またはポリマー集合体の沈殿を必要とし、これらは、沈殿の前には検出および/または視覚的な認識が不可能であり、それらの規定された寸法がないため取り扱いが難しいことから、制御が難しい。
a)上記で規定された本発明によるセンサボディ、および分析物を含有する疑いのある水性試料を任意の順番で提供するステップ;
b)前記センサボディを前記水性試料に曝露し、それによって前記試料中に存在する分析物を、前記センサボディに結合させ、前記センサボディの前記間隙の細孔スペースに液体を入れるステップ
を含む、方法に関する。
c)上記で規定された分析物をセンサボディに結合させる方法を実行するステップ;
d)前記センサボディが曝露される少なくとも1つの外部条件、例えば温度、pH、塩濃度、化学物質の存在または非存在の1つを変化させることによって、前記センサボディの状態を拡張した状態から収縮した状態に変化させ、それによって前記センサボディの前記間隙の細孔スペースに含有される前記液体を押し出すステップ;
e)前記粒子が曝露される少なくとも1つの外部条件、例えば温度、pH、塩濃度、化学物質の存在または非存在の1つを変化させることによって、前記センサボディの状態を、収縮した状態から拡張した状態に変化させ、それによって前記センサボディの前記間隙の細孔スペースに液体を入れるステップ
を含み、
分析物が前記粒子に結合した場合、ステップc)の後にステップd)およびe)が実行され、分析物は、標識されているか、または標識されていないかのいずれかであり;
ステップd)およびe)は、n回繰り返され、nは、1〜1000、好ましくは1〜500、好ましくは1〜250、より好ましくは1〜100、さらにより好ましくは1〜50より好ましくは1〜40、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、さらにより好ましくは1〜20、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20の範囲の整数である、方法に関する。
− 上記で規定された結合させる方法または濃縮および/もしくは洗浄する方法を実行するステップであって、分析物は、前記センサボディに前記分析物を結合させる前、その間またはその後のいずれかにおいて、標識されているかまたは標識される、ステップ;
− 好ましくは未結合の標識の存在下で、前記センサボディに結合した標識を検出することによって、前記センサボディに結合した前記分析物を検出するステップ
を含む、方法に関する。
− 本明細書で定義される複数のセンサボディを受けるための、および分析物を含有する疑いのある水性試料を受けるための、コンテナ;
− 前記コンテナ中に含有される、本明細書で定義される複数のセンサボディであって、前記センサボディのポリマー足場は、熱応答性ポリマーで構成される、センサボディ;
− 前記コンテナ中の温度を制御し、周期的に変化させるための手段、および
− 必要に応じて、水性試料が前記コンテナ中に存在する場合、それを機械的にかき混ぜるための手段
を含む、デバイスにも関する。
− 前記コンテナ内のセンサボディ、ならびに存在する場合、前記センサボディのサイズ、外観、光の吸収、光の放出および/または蛍光の変化を検出するように構成された光学検出器
をさらに含む。このような変化は、例えば、分析物、好ましくは標識された分析物が前記センサボディに結合したときに起こり得る。またデバイスが、前記コンテナ内のセンサボディ、および前記センサボディのサイズ、外観、液体の吸収などの変化を検出するように構成された光学検出器も含む実施形態において、デバイスは、試料中の分析物を検出するためのデバイスとして効果的に使用することができる。これはなぜなら、典型的には、前記センサボディのサイズ、外観、光の吸収、光の放出および/または蛍光の変化は、分析物が前記センサボディに結合したときに起こり得るためである。
分析物が、シグナル生成手段として機能する検出可能な標識と結合するために、センサボディの体積を増加させることが望ましい。しかしながら、検出に光学的手段が使用される場合、シグナルが収集される体積単位当たり最大の可能性のあるシグナル強度を生成させるために、シグナル生成手段の体積をできる限り小さく濃縮することが非常に有用である。捕獲剤がその表面に、特に多孔質ポリマーマトリックスの曝露された表面、したがって間隙の細孔スペースの表面に固定された概説したセンサボディは、結合した材料によって生成されたシグナルを効率的に増大させることを可能にする。
本アプローチの1つの特定の利点は、センサボディ細孔のサイズ分布が調整可能であり、したがって、細孔の既定の画分が、いかなる巨大分子も吸収せず、それに対して他の細孔が、より大きい分子の取り込みに好適なサイズであるという事実によって提供される。したがって、センサボディは、本質的に巨大分子から精製された液体を吸収する。センサボディの収縮によって、液体がセンサボディ内から追い出され、より大きい細孔の表面を洗浄するためのクリーンな緩衝剤として役立つ。サイズ選択的な取り込みは、図5から理解することができる。
拡張/収縮サイクルは、センサボディ表面における材料/液体の交換速度を増加させる機会を提供する。これは、センサボディを通って液体をポンプで能動的に送ることを可能にし、したがって試料液体とセンサボディ表面との全ての間の相互作用に必要なインキュベーション時間を低減する。したがって、結合アッセイで使用される従来のセンサマトリックスと比較して、提唱されているセンサボディおよびアッセイ方法は、インキュベーション時間の低減および結合効率の増加を可能にする。
検出粒子の合成
センサボディ重合ミックスの生成
成分1(水性相):
重合ミックス1mL当たりの成分
重合プロセスを完了させた後、油相をできる限り多く、ピペットを使用して、pNIPAM粒子を除去しないように注意を払いながら液滴リザーバから穏やかに引き出す。次いで、50μlの水中の1%(v/v)のTriton X−100をピペットで取って粒子に入れる。粒子が液滴チップの壁にくっつかないように、内容物を上下にピペッティングすることによって混合する。内容物をエッペンドルフチューブに移し、このプロセスをもう1回繰り返す。移動プロセスは、粒子の大部分がこのステップで失われないように、双眼顕微鏡下でモニターすることができる。
25μlの粒子の希釈した懸濁液を、Lejaの100μmチャンバースライド(/https://leja.nl)に移す。スライドを、加熱/冷却素子と直接接触させる迅速な温度のサイクル化が可能なペルチェ素子30×30×4.7mm、19.3W(Quick−Ohm、Kupper&Co.GmbH、#QC−71−1.4−3.7M)上に置く。全体の設備は、暗視野照明を備えた双眼顕微鏡下に置く。システムの温度が32℃未満に設定される場合、センサボディは透明であり、ほとんど目に見えない。32℃またはそれより高い温度で、センサボディは不透明になる:すなわち粒子は白色になり、縮む。再び32℃未満の温度に設定することによって、粒子は膨潤し、再び透明になる。このプロセスは可逆的であり、迅速なサイクルで多くの回数繰り返すことができる。ペルチェ素子の加熱および冷却速度が十分であり、システム全体の熱伝導率が十分であると仮定すると、20秒未満のサイクル時間(加熱、縮むこと、冷却、膨潤)を達成することができる。
成分1(水性相):
ビオチンで改変された単量体ミックスの作製:
ビオチンで改変されたアクリル酸単量体を別々の反応で作製した。反応ミックスは、アクリル酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(活性化されたアミノ反応性アクリル酸単量体)およびビオチン−dPEG7−NH2(アミノ基で終結したPEG7スペーサーアームで改変されたビオチン誘導体)からなっていた。
重合ミックス1mL当たりの成分
重合プロセスを完了させた後、油相をできる限り多く、ピペットを使用して、pNIPAM粒子を除去しないように注意を払いながら液滴リザーバから穏やかに引き出す。次いで、50μlの水中の1%(v/v)のTriton X−100をピペットで取って粒子に入れる。粒子が液滴チップの壁にくっつかないように、内容物を上下にピペッティングすることによって混合する。内容物をエッペンドルフチューブに移し、このプロセスをもう1回繰り返す。移動プロセスは、粒子の大部分がこのステップで失われないように、双眼顕微鏡下でモニターすることができる。
25μlのビオチンで改変された粒子の希釈した懸濁液を、Lejaの100μmチャンバースライド(/https://leja.nl)に移す。スライドを、加熱/冷却素子と直接接触させる迅速な温度のサイクル化が可能なペルチェ素子30×30×4.7mm、19.3W(Quick−Ohm、Kupper&Co.GmbH、#QC−71−1.4−3.7M)上に置く。全体の設備は、暗視野照明を備えた双眼顕微鏡下に置く。システムの温度が32℃未満に設定される場合、粒子は透明であり、ほとんど目に見えない。32℃またはそれより高い温度で、粒子は可視的になる:すなわちそれらは不透明になり、縮む。再び32℃未満の温度に設定することによって、センサボディは膨潤し、粒子は再び透明になる。このプロセスは可逆的であり、迅速なサイクルで多くの回数繰り返すことができる。ペルチェ素子の加熱および冷却速度が十分であり、システム全体の熱伝導率が十分であると仮定すると、20秒未満のサイクル時間(加熱、膨潤、冷却、縮むこと)を達成することができる。発明者らは、ポリマーのビオチン改変はpNIPAMセンサボディのLCST挙動を損なわないと結論付けている。
ビオチンで改変されたpNIPAM粒子が、ストレプトアビジンと特異的に結合することが可能であるかどうかを査定するために、ミックス3および4を用いて作製した粒子を、ストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲートの溶液と共にインキュベートした。ミックス1および2(ビオチン改変なし)を用いて作製した粒子を、陰性対照と同じ溶液と共にインキュベートした。
インキュベーションミックス:
センサボディとして自由に拡散可能な/浮遊性の粒子を使用して蛍光ベースのイムノアッセイの確立
ここで本発明者らは、ヒト心臓トロポニンI(cTnI)の検出のための蛍光ベースのイムノアッセイを確立するプロセスを記載する。このアッセイは、蛍光色素で標識された検出抗体を採用する。捕獲抗体をストレプトアビジンで標識し、ビオチンで改変されたpNIPAM粒子にコーティングする。捕獲抗体と結合した粒子、抗原および蛍光検出抗体のサンドイッチ複合体は、分析物を粒子表面にポンプで送り、粒子表面からあらゆる未結合の材料を取り去るための温度のサイクル化を採用するプロセスで形成される。未結合の検出抗体、したがって蛍光標識は、pNIPAM粒子の内部にトラップされた非蛍光性溶液を適用できる適切な洗浄ステップによって除去される。洗浄後、粒子に関連する蛍光シグナルが検出される。
cTnI検出抗体(クローン10C9、SDIX)を、Lightning−Link(登録商標)R−フィコエリトリン抗体標識キット(Innova Bioscience)を製造元のプロトコールに従って使用して標識し、次いで精製する。代替として、蛍光標識された抗体は、異なる業者から得てもよい。
クローンTPC−110(SDIX)は、捕獲抗体として使用される。これを、Lightning linkストレプトアビジン(Innova Bioscience)によって製造元のプロトコールに従って標識した。
ビオチンで改変されたpNIPAM検出粒子の調製を、以下の改変を含む実施形態1に記載される方法に従って行った。例示的な実施形態においてビオチンで標識されたpNIPAM粒子を水性相に移し、不適切な粒子サイズを排除した後、粒子を、ストレプトアビジンで標識された捕獲抗体でコーティングする。
ストレプトアビジンで標識された捕獲抗体でのpNIPAMのコーティングは、PBS、0.1%のTriton X−100中で達成される。ストレプトアビジンで標識された捕獲抗体の濃度は、アクセス可能なビオチンが、pNIPAM粒子の表面(ポリマーの細孔幅に応じて、外部または内部および外部表面)上に残らないように選択される。最適な捕獲抗体濃度は、標識されたストレプトアビジンを用いた予備的な試験で、平らな表面の被覆率を決定することによって決定されている。カップリングは、エッペンドルフサーモシェーカー(Eppendorf Thermoshaker)でなされ、溶液を、5回の25℃と37℃との間の温度振動で、350rpmで30分かき混ぜる。捕獲抗体とのカップリングの後、粒子を上述したようにペレット化し、上清を交換することによって数回洗浄する。その後、pNIPAM−粒子の濃度を、計数チャンバーにおいて顕微鏡下で計数することによって決定する。
反応ミックス:
cTNI枯渇ヒトEDTA−血漿+xμlのcTNIスパイク 6μl
500mMのリン酸緩衝剤pH7.5、1MのNaCL、0.25%のTriton X−100 2μl
HBR−Plus(Scantibodies) 1μl
R−フィコエリトリンで標識された検出抗体 yμl
捕獲抗体でコーティングされたpNIPAM検出粒子 zμl
総体積 10μl
温度1:10秒にわたり37℃
温度2:10秒にわたり25℃。
各患者試料につき、反応ミックスは、以下のように構成される:
反応ミックス:
ヒト患者EDTA−血漿 6μl
500mMのリン酸緩衝剤、pH7.5、1MのNaCL、0.25%のTriton X−100 2μl
HBR−Plus(Scantibodies) 1μl
R−フィコエリトリン 標識された検出抗体 xμl
捕獲抗体でコーティングされたpNIPAM検出粒子 zμl
総体積 10μl
センサボディとして表面に固定されたスポットを使用した蛍光ベースのイムノアッセイの確立
ここで本発明者らは、基板の平らな表面に固定したセンサボディ(すなわちセンサ「スポット」)を使用したヒトcTnIの検出のための蛍光ベースのイムノアッセイを確立するプロセスを記載する。アッセイは、蛍光色素で標識された検出抗体を採用する。捕獲抗体をストレプトアビジンで標識し、固体表面上に固定したビオチンで改変されたpNIPAMセンサマトリックスにコーティングする。センサマトリックスと結合した捕獲抗体、抗原および蛍光検出抗体のサンドイッチ複合体は、分析物をセンサマトリックス表面にポンプで送り、センサマトリックス表面からあらゆる未結合の材料を取り去るための温度のサイクル化を採用するプロセスで形成される。未結合の検出抗体、したがって蛍光標識は、pNIPAMセンサマトリックスの内部にトラップされた非蛍光性溶液を適用できる適切な洗浄ステップによって除去される。洗浄後、マトリックスに関連する蛍光シグナルが検出される。
cTnI検出抗体(クローン10C9、SDIX)を、Lightning−Link(登録商標)R−フィコエリトリン抗体標識キット(Innova Bioscience)を製造元のプロトコールに従って使用して標識し、次いで精製する。
クローンTPC−110(SDIX)は、捕獲抗体として使用される。これを、Lightning linkストレプトアビジン標識キット(Innova Bioscience)を製造元のプロトコールに従って使用して標識した。
表面基板の調製:
Borofloatガラス顕微鏡スライドを、センサマトリックススポットを固定するための基板として使用した。センサマトリックスの表面へのかたい固定を可能にするために、表面を、PlusOne Bind−Silane(GE lifesciences)で、製造元のプロトコールに従って改変した。
重合ミックスの調製:
ミックス1、水性相:
マイクロドロップ(Microdrop)/自動滴下システム(Microdrop Technologies)上の、0.4〜10000mPasの粘度範囲および90μmのノズル直径での流体用圧電プリントヘッド(MD−K−140−020)を使用して、180〜380pLのスポットを生産した。使用された基板には、COC、ポリカーボネート、スライドガラスが含まれていた。
スポットした後、接着性スライドインキュベーションチャンバー(BioRad)を、スライドに付着させる。チャンバーは、重合ミックス2(油相)と共に浮遊しており、60分インキュベートする。
ストレプトアビジンで標識された捕獲抗体でのpNIPAMのコーティングは、リン酸緩衝塩類溶液(PBS)、0.1%のTriton X−100中で達成される。ストレプトアビジンで標識された捕獲抗体の濃度は、アクセス可能なビオチンが、pNIPAMセンサマトリックススポットの表面(ポリマーの細孔幅に応じて、外部または内部および外部表面)上に残らないように選択される。最適な捕獲抗体濃度は、標識されたストレプトアビジンを用いた予備的な試験で、平らな表面の被覆率を決定することによって決定されている。カップリングプロセスのために、スライドを、重合プロセスで使用されるような接着性インキュベーションチャンバーで覆う。チャンバーをストレプトアビジンで標識された抗体溶液で満たし、マイクロタイタープレートアダプターにおいて、5回の25℃と37℃との間の温度振動で、エッペンドルフサーモシェーカー上でインキュベートする。捕獲抗体とのカップリングの後、センサマトリックススポットを、上述したように40℃および15℃で5回洗浄する。スライドは、直接的にアッセイに使用するか、または最後の15℃の洗浄ステップで20mg/mLのトレハロースを含有する溶液中でインキュベートし、その後凍結乾燥してアッセイに使用するかのいずれでもよい。
検出抗体の好適な濃度の決定および検量線の作成:
反応ミックス:
cTNI枯渇ヒトEDTA−血漿+xμlのcTNIスパイク 60μl
500mMのリン酸緩衝剤、pH7.5、1MのNaCL、0.25%のTriton X−100 20μl
HBR−Plus(Scantibodies) 10μl
R−フィコエリトリンで標識された検出抗体 yμl
総体積 100μl
温度1:37℃で10秒
温度2:25℃で10秒
25サイクル。
各患者試料につき、反応ミックスは、以下のように構成される:
反応ミックス:
ヒト患者EDTA−血漿 60μl
500mMのリン酸緩衝剤、pH7.5、1MのNaCL、0.25%のTriton X−100 20μl
HBR−Plus(Scantibodies) 10μl
R−フィコエリトリンで標識された検出抗体 xμl
総体積 100μl
ビオチンで改変されたpNIPAMベースの巨大増幅ビーズ(Giant Amplification Bead:GAB)を使用した、組み合わされた標的捕獲/リアルタイム標的増幅アッセイの確立
巨大増幅ビーズ(GAB)でPCRを実行するためのビオチン改変された/改変されていないpNIPAM粒子のための重合ミックスの生成
成分1(水性相):
ビオチンで改変された単量体−ミックスの作製:
重合ミックス1mL当たりの成分
重合プロセスを完了させた後、各試料に100μlのH2Oを添加する。pNIPAM粒子を水性相に移動させ、ヘキサデカン上清を除去することができる。残留した重合されなかった試薬およびTEMEDを除去するために、粒子を50℃に加熱して、粒子から液体を追い出すための収縮を容易にする。過量の液体を除去し、100μlのH2Oを添加する。冷却されると、H2Oは、拡張する粒子に吸収される。加熱、液体の除去、新しいH2Oの添加、および冷却を含む洗浄サイクルを2回繰り返した。最後に、H2Oを0.1%のTriton X100を含有するPBSと交換した。
ストレプトアビジンでのGABのコーティングは、事前に使用された洗浄緩衝剤中で達成される。ストレプトアビジンの濃度は、アクセス可能なビオチンがGABの表面上に残らないような濃度が選択される。どのような場合においても、ストレプトアビジンは、GABの架橋を回避するために過量で適用される。最適なストレプトアビジン濃度は、標識されたストレプトアビジンを用いた予備的な試験で、平らな表面の被覆率を決定することによって決定されている。ミックス2および4を用いて作製した粒子を、0.1%のTriton X−100を含有するPBS中のストレプトアビジンの溶液と共にインキュベートした。ミックス1および3(ビオチン改変なし)を用いて作製した粒子を、陰性対照と同じ溶液と共にインキュベートした。ストレプトアビジンとのカップリングの後、GABを0.1%のTriton X−100を含有する100μlのPBSで3回洗浄して、過量のストレプトアビジンを除去する。
インキュベーションミックス:
ビオチン化HIV−1 cDNAの調製
ビオチン化したリバースプライマーの存在下で逆転写を実行することによって、ビオチン化HIV−1 cDNAを生成した。反応ミックスを50℃で15分インキュベートし、反応ミックスを70℃に10分加熱することによって反応を止めた。
インキュベーションミックス:
− 精製したHIV−1 RNA(約106コピー)
− 1μMのビオチン化したリバースプライマー、5’ビオチン−ACT GAC GCT CTC GCA CCC ATC T−3’
− 1×反応緩衝剤(cDNA合成キット、Thermo Fisher)
− dNTP(各1mM)
− RevertAid逆転写酵素(200U、Thermo Fisher)
逆転写によりビオチンで標識されたHIV−1 RNAを、ストレプトアビジンで改変された巨大増幅ビーズ(GAB)上で富化する。
粒子1個当たりのインキュベーションミックス:
− 1μlのcDNAミックス(約104コピー)
− 0.1%のTriton X−100を含む49μlのPBS
− 6mMのMg2+、20mMのトリス−HCl、pH8.9、22mMのKCl、22mMのNH4Cl、5%のグリセロール、0.01%のTriton−X100および0.005%のTween20、1mg/mlのポリリン酸ナトリウムを含有する1×PCR緩衝剤
− 400μMのdNTP(Invitrogen)
− 0.8μMのフォワードプライマー:5’−GCA GTG GCG CCC GAAC AGG−3’(Metabion international AG)
− 0.8μMのリバースプライマー:5’−ACT GAC GCT CTC GCA CCC ATC T−3’(Metabion international AG)
− 0.8μMのハイブリダイゼーションプローブ:5’−Cy5−CTC CGA CGC AAC GGG CTC G−BHQ3−3’
− 凍結乾燥されたホットスタートTaq DNAポリメラーゼ(BiotechRabbit)、0.125U/μl
PCRは、あらゆる標準的なリアルタイムサイクラーで実行することができる。以下に列挙した条件がPeqSTAR96Qに適用される。
適用される加熱条件は、以下の通りである。
デジタルPCRを実行するためのpNIPAMベースの単分散デジタル増幅ビーズ(DAB)の適用
ここで本発明者らは、デジタルPCRを実行するためのpNIPAMベースのデジタル増幅ビーズ(DAB)の使用を記載する。本出願において、DABは単に、水溶液で満たされ、pNIPAMポリマーのLCSTの挙動を利用して容易に空にできるマトリックスを提供するものである。このポリマーは、粒子中に含有される水性相を油乳濁液に持ち込むことを可能にするマトリックスも提供する。マトリックスとしてDABを使用する利点は、油中の水の体積の均一なサイズ分布は、微小流体工学または他の複雑な技術的なデバイスを使用する必要なく達成できることである。この実験において、別のステップで作製されたcDNAを、PCR鋳型として使用した。鋳型としてRNAを使用する場合、粒子は、RT−PCR反応ミックスで満たすことができ、RT−PCRプロセスのプロセス全体は、DABベースで実行することができる。
デジタルPCRのためのpNIPAM粒子重合ミックスの生成
成分1(水性相):
重合ミックス1mL当たりの成分
重合プロセスを完了させた後、油相をできる限り多く、ピペットを使用して、pNIPAM粒子を除去しないように注意を払いながら液滴リザーバから穏やかに引き出す。次いで、50μlの水中の1%(v/v)のTriton X−100をピペットで取って粒子に入れる。粒子が液滴チップの壁にくっつかないように、内容物を上下にピペッティングすることによって混合する。内容物をエッペンドルフチューブに移し、このプロセスをもう1回繰り返す。移動プロセスは、粒子の大部分がこのステップで失われないように、双眼顕微鏡下でモニターすることができる。
HIV−1 cDNAを、PCRリバースプライマーの存在下で逆転写を実行することによって生成した。反応ミックスを50℃で15分インキュベートし、反応ミックスを70℃に10分加熱することによって反応を止めた。
インキュベーションミックス:
− 精製したHIV−1 RNA(約106コピー)
− 1μMのリバースプライマー5’ ACT GAC GCT CTC GCA CCC ATC T−3’
− 1×反応緩衝剤(cDNA合成キット、Thermo Fisher)
− dNTP(各1mM)
− RevertAid逆転写酵素(200U、Thermo Fisher)
約100,000個のpNIPAM DABを反応チューブに移し、50℃に加熱して、粒子から液相を追い出した。粒子を短時間で2000gで回転させ、40℃で保持する。縮んでペレット化した粒子は一緒に強くくっついて一体化し、追い出された液体がペレットから完全に除去できるようになる。
このミックスは、以下の試薬(最終濃度)からなる:
− 6mMのMg2+、20mMのトリス−HCl、pH8.9、22mMのKCl、22mMのNH4Cl、5%のグリセロール、0.01%のTriton−X100および0.005%のTween20、1mg/mlのポリリン酸ナトリウムを含有する1×PCR緩衝剤
− 400μMのdNTP(Invitrogen)
− 0.8μMのフォワードプライマー:5’−GCA GTG GCG CCC GAAC AGG−3’(Metabion international AG)
− 0.8μMのリバースプライマー:5’−ACT GAC GCT CTC GCA CCC ATC T−3’(Metabion international AG)
− 0.8μMのハイブリダイゼーションプローブ:5’−CF647−CTC CGA CGC AAC GGG CTC G−BHQ3−3’
− 1000コピーのHIV−1 cDNA鋳型
− 凍結乾燥されたホットスタートTaq DNAポリメラーゼ(BiotechRabbit)、0.125U/μl
既定の体積を有するマイクロ区画を、フルオロカーボン油中に、例えばNovec 7500オイル(Dolomite Microfluidics、番号3200214)中に分散させたPicoSurf(商標)5%中にDABを分散させることによって作製する。重質フルオロカーボン油の代わりに、乳化剤を含む軽油、例えば5%(w/w)Span 80(Sigma Aldrich、番号85548)を含むミネラルオイル(Sigma−Aldrich、番号M5904 Sigma)を適用してもよい。
油中に懸濁したDABを、同じチャンバー中で、ペルチェ素子30×30×4.7mm、19.3W(Quick−Ohm、Kupper&Co.GmbH、番号QC−71−1.4−3.7M)上で、温度のサイクル化に供する。DABは、32℃を超えて加熱されると、DAB内部の反応ミックスが追い出されるように濃縮される。これは、個々のcDNA分子の増幅が行われるマイクロ反応区画として役立つ濃縮されたDABの周辺に単一の水性液滴を形成する。
95℃で2分の最初の変性、それに続く、45サイクルの、95℃で15秒での変性、65℃で15秒のアニーリングおよび72℃で30秒での伸長。熱プロトコールが完了したら、チャンバーの内容物を、透過した白色光ならびに励起λexc=650nmおよび>670nmのロングパス放出での蛍光モードで、21℃で画像化する。DABの総数および既定の強度の閾値より高い蛍光シグナルを有するDABの数を決定する。閾値は、これまでに実行された鋳型なしの増幅反応から得られる。反応における鋳型の数は、陽性および陰性の液滴の決定された数をポアソン統計に適用することによって決定される。
標的捕獲/デジタルPCRアッセイの組合せを実行するためのビオチンで改変されたpNIPAMベースの単分散増幅ビーズ(DAB)の適用
この実施例は、核酸標的捕獲/デジタルPCRアッセイの組合せを実行するための、pNIPAMベースのデジタル増幅ビーズ(DAB)(=本発明の実施形態による「センサボディ」)の使用を記載する。本出願において、DABは、数々の官能基を提供する。
成分1(水性相):
ビオチンで改変された単量体ミックスの作製:
ビオチンで改変されたアクリル酸単量体を別々の反応で作製した。反応ミックスは、アクリル酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(活性化されたアミノ反応性アクリル酸単量体)およびビオチン−dPEG7−NH2(アミノ基で終結したPEG7スペーサーアームで改変されたビオチン誘導体)からなっていた。
重合ミックス1mL当たりの成分
重合プロセスを完了させた後、油相をできる限り多く、ピペットを使用して、pNIPAM粒子を除去しないように注意を払いながら液滴リザーバから穏やかに引き出す。次いで、50μlの水中の1%(v/v)のTriton X−100をピペットで取って粒子に入れる。粒子が液滴チップの壁にくっつかないように、内容物を上下にピペッティングすることによって混合する。内容物をエッペンドルフチューブに移し、このプロセスをもう1回繰り返す。移動プロセスは、粒子の大部分がこのステップで失われないように、双眼顕微鏡下でモニターすることができる。
ストレプトアビジンでのDABのコーティングは、事前に使用された洗浄緩衝剤中で達成される。ストレプトアビジンの濃度は、アクセス可能なビオチンがDABの表面上に残らないように選択される。どのような場合においても、ストレプトアビジンは、DABの架橋を回避するために、過量で適用される。最適なストレプトアビジン濃度は、標識されたストレプトアビジンを用いた予備的な試験で、平らな表面の被覆率を決定することによって決定されている。
インキュベーションミックス:
ビオチン化HIV−1 cDNAを、PCRリバースプライマーの存在下で逆転写を実行することによって生成した。反応ミックスを50℃で15分インキュベートし、反応ミックスを70℃に10分加熱することによって反応を止めた。
インキュベーションミックス:
− 精製したHIV−1 RNA(約106コピー)
− 1μMのビオチン化したリバースプライマー5’ビオチン−ACT GAC GCT CTC GCA CCC ATC T−3’
− 1×反応緩衝剤(cDNA合成キット、Thermo Fisher)
− dNTP(各1mM)
− RevertAid逆転写酵素(200U、Thermo Fisher)
逆転写によりビオチンで標識されたHIV−1 RNAを、ストレプトアビジンで改変されたDAB上で捕獲する
約100000個のpNIPAM DABを反応チューブに移し、50℃に加熱して、粒子から液相を追い出した。粒子を短時間で2000gで回転させ、40℃で保持する。縮んでペレット化した粒子は強くくっついて一体化し、追い出された液体がペレットから完全に除去できるようになる。次いで、以下のインキュベーションミックスをペレットに添加する。
− 1μlのcDNAミックス(約104コピー)
− 0.1%のTriton X−100を含む49μlのPBS
標的の捕獲後、DABを50℃に加熱して、粒子から液相を追い出す。粒子を短時間で2000gで回転させ、40℃で保持する。縮んでペレット化した粒子は強くくっついて一体化し、追い出された液体がペレットから完全に除去できるようになる。
この増幅ミックスは、以下の試薬(最終濃度)からなる:
− 6mMのMg2+、20mMのトリス−HCl、pH8.9、22mMのKCl、22mMのNH4Cl、5%のグリセロール、0.01%のTriton−X100および0.005%のTween20、1mg/mlのポリリン酸ナトリウムを含有する1×PCR緩衝剤
− 400μMのdNTP(Invitrogen)
− 0.8μMのフォワードプライマー:5’−GCA GTG GCG CCC GAAC AGG−3’(Metabion international AG)
− 0.8μMのリバースプライマー:5’−ACT GAC GCT CTC GCA CCC ATC T−3’(Metabion international AG)
− 0.8μMのハイブリダイゼーションプローブ:5’−CF647−CTC CGA CGC AAC GGG CTC G−BHQ3−3’
− 凍結乾燥されたホットスタートTaq DNAポリメラーゼ(BiotechRabbit)、0.125U/μl
既定の体積を有するマイクロ区画を、フルオロカーボン油中に、例えばNovec 7500オイル(Dolomite Microfluidics、番号3200214)中に分散させたPicoSurf(商標)5%中にDABを分散させることによって作製する。重質フルオロカーボン油の代わりに、乳化剤を含む軽油、例えば5%(w/w)Span 80(Sigma Aldrich、番号85548)を含むミネラルオイル(Sigma−Aldrich、番号M5904 Sigma)を適用してもよい。
油中に懸濁したDABを、同じチャンバー中で、ペルチェ素子30×30×4.7mm、19.3W(Quick−Ohm、Kupper&Co.GmbH、番号QC−71−1.4−3.7M)上で、温度のサイクル化に供する。DABは、32℃を超えて加熱されると、DAB内部の反応ミックスが追い出されるように濃縮される。これは、個々のcDNA分子の増幅が行われるマイクロ反応区画として役立つ濃縮されたDABの周辺に単一の水性液滴を形成する。
適用される加熱条件は、以下の通りである。
デジタルElisaを確立するための、ビオチンで改変されたpNIPAMベースの単分散デジタル増幅ビーズ(DAB)の適用
ここで本発明者らは、ヒトcTnIの検出のためのデジタルイムノアッセイを確立するプロセスを記載する。このアッセイは、デジタル様式でイムノPCRを採用し、検出抗体は、DNAで標識される。捕獲抗体をストレプトアビジンで標識し、ビオチンで改変されたpNIPAM粒子にコーティングする。捕獲抗体と結合した粒子、抗原およびDNA標識検出抗体のサンドイッチ複合体は、分析物を粒子表面にポンプで送り、粒子表面からあらゆる未結合の材料を取り去るための温度のサイクル化を採用するプロセスで形成される。未結合の検出抗体、したがってDNA標識は、温度のサイクル化を採用する適切な洗浄ステップによって除去される。pNIPAMベースのDABにPCR増幅ミックスをローディングし、別の反応区画が形成されるように油中に懸濁する。後続の液滴PCRで、結合したDNA−標識を検出する。
cTnI検出抗体(クローン10C9、SDIX)を、Thunder−Link(登録商標)PLUSオリゴコンジュゲーションシステム(Innova Bioscience)を製造元のプロトコールに従って使用して標識し、次いで精製する。以下の配列が抗体にカップリングされる:
クローンTPC−110(SDIX)は、捕獲抗体として使用される。これを、製造元のプロトコールに従って、Lightning linkストレプトアビジン(Innova Bioscience)によってマークした。
ビオチンで改変されたpNIPAM検出粒子の調製を、以下の改変を含む実施形態1に記載される方法に従って行った。例示的な実施形態においてビオチンで標識されたpNIPAM粒子を水性相に移し、不適切な粒子サイズを排除した後、粒子を、ストレプトアビジンで標識された捕獲抗体でコーティングする。
ストレプトアビジンで標識された捕獲抗体でのpNIPAMのコーティングは、PBS、0.1%のTriton X−100中で達成される。ストレプトアビジンで標識された捕獲抗体の濃度は、偽陽性シグナルの出現が最小化され、優れた感度が達成されるように選択される。最適な捕獲抗体濃度は、予備的な試験で決定されている(以下を参照)。カップリングは、エッペンドルフサーモシェーカーでなされ、溶液を、5回の25℃と37℃との間の温度振動で、350rpmで30分かき混ぜる。捕獲抗体とのカップリングの後、粒子を上述したようにペレット化し、上清を交換することによって数回洗浄する。その後、pNIPAM−粒子の濃度を、計数チャンバーにおいて顕微鏡下で計数することによって決定する。粒子の濃度を約5,000/μlに調整する。粒子を20μlの単位でアリコートにする。
DNA標識検出および捕獲抗体と結合した粒子の最適な濃度は、従来のイムノPCRによって決定される。2つの抗体の濃度を系統的に変更し、トロポニン非含有の血漿(陰性対照)および既定量のスパイクされたトロポニンIを含むトロポニン非含有の血漿を使用した免疫複合体を生成した。これらを粒子上に捕獲し、洗浄し、従来のPCRに供した。それぞれの抗体の最適な濃度は、最も低い検出限界および最も広いダイナミック測定レンジによって示される。
免疫複合体の形成およびその捕獲:
反応ミックス:
ヒトEDTA−血漿 50μl
500mMのリン酸緩衝剤、pH7.5、1MのNaCL、0.25%のTriton X−100 20μl
HBR−Plus(Scantibodies) 10μl
DNA標識された検出抗体 yμl
捕獲抗体でコーティングされたpNIPAM検出粒子 20μl
総体積 約100μl
約100μlの反応混合物(上記を参照)は、これまでに決定された最適な濃度を用いて調製される。捕獲は、エッペンドルフサーモシェーカーでなされ、溶液を、5回の25℃と37℃との間の温度振動で、350rpmで30分かき混ぜる。捕獲後、DABを洗浄して、非特異的に結合した検出抗体を除去する。1mLのPBS、0.1%(v/v)のTriton X−100を、粒子を含有するチューブに添加する。内容物を混合し、温度を40℃に設定する。粒子は縮み、内部の液体が追い出される。その後、粒子を、2000gおよび40℃で2分遠心分離する。ここで粒子をチューブの底部にペレット化する。上清を除去し、チューブ中に粒子を残す。1mLの20℃のPBS、0.1%(v/v)のTriton X−100をチューブに添加する。粒子は膨潤し、洗浄緩衝剤を吸収する。内容物を混合し、再び温度を40℃に設定する。この洗浄プロセスを、偽陽性シグナルが、到達する必要がある(実験的に決定される)定量化のレベルをより低くすることを可能にする範囲内になるまで数回繰り返す。その後、1×Taq DNAポリメラーゼPCR緩衝剤[20mMのトリスHCl(pH8.4)、50mMのKCl]を用いた2回の追加の洗浄ステップを実行する。
標的捕獲の後、DABを50℃に加熱して、粒子から液相を追い出す。粒子を短時間で2000gで回転させ、40℃で保持する。縮んでペレット化した粒子は強くくっついて一体化し、追い出された液体がペレットから完全に除去できるようになる。
この増幅ミックスは、以下の試薬(最終濃度)からなる:
以下の組成を有するPCR反応混合物(体積10μl)を調製する:
500nMのフォワードプライマー(5’AGCTCTTGATCCGGCAAACA3’)
500nMのリバースプライマー(5’GCGTCAGACCCCGTAGAAAA3’)
SYBR(登録商標)グリーンI核酸ゲル染色(Sigma−Aldrich、番号S9430)1:25000
1×PCR−マスターミックス
PCRグレードの水
既定の体積を有するマイクロ区画を、フルオロカーボン油中に、例えばNovec 7500オイル(Dolomite Microfluidics、番号3200214)中に分散させたPicoSurf(商標)5%中にDABを分散させることによって作製する。重質フルオロカーボン油の代わりに、乳化剤を含む軽油、例えば5%(w/w)Span 80(Sigma Aldrich、番号85548)を含むミネラルオイル(Sigma−Aldrich、番号M5904 Sigma)を適用してもよい。
油中に懸濁したDABを、同じチャンバー中で、ペルチェ素子30×30×4.7mm、19.3W(Quick−Ohm、Kupper&Co.GmbH、番号QC−71−1.4−3.7M)上で、温度のサイクル化に供する。DABは、32℃を超えて加熱されると、DAB内部の反応ミックスが追い出されるように濃縮される。これは、個々のDNA分子の増幅が行われるマイクロ反応区画として役立つ濃縮されたDABの周辺に単一の水性液滴を形成する。
サイクル1:
95℃で5分
65℃で30秒
72℃で30秒
サイクル2〜40:
94℃で30秒
65℃で30秒
72℃で30秒。
DNA標識検出抗体のDABへの非特異的な結合は、デジタルイムノPCRの適応性を限定する重要なパラメーターの代表である。非特異的に結合した標識は、増幅後に偽陽性のDABを生じる。それゆえに、デジタルイムノPCRにおいて、分析物の定量化は、陽性試料と陰性対照との間の差を決定することによって達成される。
イムノアッセイ様式での抗原の富化および検出
ここで本発明者らは、本発明によるセンサボディを使用する抗原の富化および検出を記載する。
参考文献
Claims (19)
- 分析物と結合する、および/またはそれを濃縮するためのセンサボディであって、前記センサボディは、多孔質ポリマー足場および前記ポリマー足場内の間隙の細孔スペースを含み、前記多孔質ポリマー足場は、前記センサボディが曝露される少なくとも1つの外部条件、例えばpH、温度、塩条件、化学物質の存在または非存在の変化に応答するポリマーで構成され、前記多孔質ポリマー足場に、分析物のための1つまたは複数の捕獲剤が付着している、センサボディ。
- 前記センサボディが曝露される前記少なくとも1つの外部条件の変化に応答する前記ポリマーが、熱応答性ポリマーであり、前記熱応答性ポリマーは、下限臨界溶液温度を有する熱応答性ポリマー(LCSTポリマー)であり、好ましくは、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)(pNIPAM)、ポリ[2−(ジメチルアミノ)メタクリル酸エチル](pDMAEMA)、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ(ビニルカプロラクタム)(P(VCL)、およびポリビニルメチルエーテルから選択されるか、または前記熱応答性ポリマーは、上限臨界溶液温度(UCST)を有する熱応答性ポリマーであり、好ましくは、ポリ(N−アクリロイルグリシンアミド)(PNAGA)、ポリ(アリルアミン)−co−ポリ(アリル尿素)およびその誘導体、ポリ(メタクリルアミド)、ポリ(N−アクリロイルアスパラギンアミド)、ポリ(N−メタクリロイルグルタミンアミド)、ポリ(アクリルアミド)−co−(アクリロニトリル)、ポリ(スルホベタイン)、ポリ(ホスホリルコリン)から選択されるかのいずれかである、請求項1に記載のセンサボディ。
- 前記応答性ポリマー、特に前記熱応答性ポリマーが、好ましくは、前記ポリマー内の異なるポリマー鎖間を架橋し、それらを相互接続する少なくとも1種の架橋試薬によって架橋されるか、または前記センサボディに隣接する基板、特に実質的に平坦な基板を提供すること、および前記ポリマーの異なるポリマー鎖を前記基板に、特に前記基板の表面に界面架橋することによって架橋され、より好ましくは、前記少なくとも1種の架橋試薬は、抗体でも抗体断片でもない、前記請求項のいずれか一項に記載のセンサボディ。
- 前記センサボディが、拡張および収縮した状態を可逆的にとる能力を有し、好ましくは、前記センサボディが前記拡張した状態にあるとき、前記間隙の細孔スペースが、前記センサボディの総体積の、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%の体積を有する、前記請求項のいずれか一項に記載のセンサボディ。
- 前記間隙の細孔スペースの総体積のおよそ10%〜90%が、前記分析物のアクセスが可能ではないが、溶媒、好ましくは水のアクセスが可能である、前記請求項のいずれか一項に記載のセンサボディ。
- 前記分析物が、核酸、好ましくはDNAまたはRNA、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質およびペプチド、脂質、例えばリン脂質から選択される生体分子であり、好ましくは、前記生体分子は、>0.1kDaのサイズ、例えば0.5kDa、好ましくは>5kDa、より好ましくは>10kDa、さらにより好ましくは>50kDaのサイズを有するか、または前記分析物は、ウイルスまたは細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載のセンサボディ。
- 前記間隙の細孔スペースが、前記分析物を含有する、またはそれを含有する疑いのある液体試料からの液体を受容するような寸法である、前記請求項のいずれか一項に記載のセンサボディ。
- 前記捕獲剤が、所与の分析物に特異的であり、抗体、抗体断片、アプタマー、シュピーゲルマーを含む核酸、分析物または分析物複合体に特異的に結合することが可能な非抗体タンパク質、例えば受容体、受容体断片、親和性タンパク質、例えばストレプトアビジン、ビオチン、Strep−tag(登録商標)、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノールなどの化学的部分、KD=10−8から10−15Mの範囲の親和性で、抗体、抗体断片、アプタマー、シュピーゲルマーを含む核酸、非抗体タンパク質、例えば受容体、受容体断片、親和性タンパク質、例えばストレプトアビジンと特異的に結合することが可能な核酸もしくは核酸類似体タグまたは類似の化学的部分から選択されるか、または疎水性分子または疎水性基を有する分子に特異的に結合することが可能な疎水性構造物から選択され、好ましくは、前記疎水性構造物は、前記分析物の前記検出が実行される条件下で、2より大きいlogDを有する、前記請求項のいずれか一項に記載のセンサボディ。
- 好ましくは自由に拡散可能な孤立粒子であるか、または基板の表面上に固定化されたスポットであるかのいずれかである、前記請求項のいずれか一項に記載のセンサボディ。
- 好ましくは自由に拡散可能な孤立粒子であり、前記孤立粒子は、球形または球状の形状を有し、好ましくは、球形または球状の形状を有し、視覚的に、好ましくは顕微鏡または他の光学的手段で観察できる明確に定められた境界を有する、請求項9に記載のセンサボディ。
- 1μmから1mmの範囲の平均直径を有する、請求項9または10に記載のセンサボディ。
- 基板の表面上に固定化されたスポットであり、前記スポットは、視覚的に、好ましくは顕微鏡または他の光学的手段で観察できる明確に定められた境界を有し、好ましくは、1μm2から1mm2の範囲の前記基板上の平均固定面積をカバーし、前記粒子の厚さは、前記スポットが曝露される前記外部条件に応じて、したがって、前記スポットが拡張した状態にあるのか、または収縮した状態にあるのかに応じて変動する、請求項9に記載のセンサボディ。
- 分析物をセンサボディに結合させる方法であって、
a)請求項1〜12のいずれか一項に記載のセンサボディ、および分析物を含有する疑いのある水性試料を任意の順番で提供するステップ;
b)前記センサボディを前記水性試料に曝露し、それによって前記試料中に存在する分析物を、前記センサボディに結合させ、前記センサボディの前記間隙の細孔スペースに液体を入れるステップ
を含む、方法。 - センサボディに結合した分析物を濃縮および/または洗浄する方法であって、
c)請求項13に記載の方法を実行するステップ;
d)前記センサボディが曝露される少なくとも1つの外部条件、例えば温度、pH、塩濃度、化学物質の存在または非存在の1つを変化させることによって、前記センサボディの状態を拡張した状態から収縮した状態に変化させ、それによって前記センサボディの前記間隙の細孔スペースに含有される前記液体を押し出すステップ;
e)前記粒子が曝露される少なくとも1つの外部条件、例えば温度、pH、塩濃度、化学物質の存在または非存在の1つを変化させることによって、前記センサボディの状態を、収縮した状態から拡張した状態に変化させ、それによって前記センサボディの前記間隙の細孔スペースに液体を入れるステップ
を含み、
前記分析物が前記粒子に結合した場合、ステップc)の後にステップd)およびe)が実行され、前記分析物は、標識されているか、または標識されていないかのいずれかであり;
ステップd)およびe)は、n回繰り返され、nは、1〜1000、好ましくは1〜500、好ましくは1〜250、より好ましくは1〜100、さらにより好ましくは1〜50、より好ましくは1〜40、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、さらにより好ましくは1〜20、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20の範囲の整数である、方法。 - 前記ステップc)〜e)の実行の間、前記センサボディが、バルクの水溶液、例えば前記水性試料によって取り囲まれており、前記ステップc)〜e)のうちの少なくとも1つの間、前記バルクの水溶液をかき混ぜることによって、前記センサボディの周辺の液体が交換される、請求項14に記載の方法。
- 試料中の分析物を検出する方法であって、
− 請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法を実行するステップであって、前記分析物は、前記センサボディに前記分析物を結合させる前、その間またはその後のいずれかにおいて、標識されているかまたは標識される、ステップ;
− 好ましくは未結合の標識の存在下で、前記センサボディに結合した前記標識を検出することによって、前記センサボディに結合した前記分析物を検出するステップ
を含む、方法。 - 単一の反応容器で実行される、請求項13〜15および16のいずれか一項に記載の方法。
- 分析物と結合する、および/またはそれを濃縮するためのデバイスであって、
− 請求項1〜12のいずれか一項で規定された複数のセンサボディを受けるための、および分析物を含有する疑いのある水性試料を受けるための、コンテナ;
− 前記コンテナ中に含有される、請求項1〜12のいずれか一項で規定された複数のセンサボディであって、前記センサボディの前記ポリマー足場は、熱応答性ポリマーで構成される、センサボディ;
− 前記コンテナ中の温度を制御し、周期的に変化させるための手段、および
− 必要に応じて、水性試料が前記コンテナ中に存在する場合、それを機械的にかき混ぜるための手段
を含む、デバイス。 - − 前記コンテナ内のセンサボディ、ならびに前記センサボディのサイズ、外観、光の吸収、光の放出および/または蛍光の変化を検出するように構成された光学検出器
をさらに含む、請求項18に記載のデバイス。
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