JP2010522069A - バイオマーカーの収集のためのスマートヒドロゲル粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
種々の特徴(例えば、種々のポアサイズ及び/又は種々の吸引性)を有し、それぞれは、粒子の各クラスと関連する種々の検出可能な標識を有する。これは、それがどの検出可能な標識を有するかを決定することによって、粒子クラスの特性(例えば、特定の誘因物質に対する結合能力)を識別することを可能にする。例えば、PSAに対する単鎖抗体を有する粒子はFITCで標識することができ、α−メチルアシル−CoAラセマーゼ(AMACR)に対する抗体を含む粒子はTRITCで標識することができる。取り込み工程を実施した後、蛍光活性化細胞分別を用いたフローサイトメトリーにより粒子を選別し、PSA含有粒子をAMACR含有粒子から分離することができる。他の実施態様においては、捕獲粒子は、親油性カルボシアニン色素で官能化し、その脂質成分を、薄層クロマトグラフィーを用いて分離することができる。
工程1:捕獲粒子を検体を含む試料と混合し:
工程2:捕獲粒子を、捕獲されなかった溶液相部分から分離し:
工程3:検体を粒子から溶出し、分析する。
サイトメトリー、ウェスタンブロッティング、タンパク質配列決定及び代謝産物、薬剤、低分子化合物又はタンパク質の分析のための化学的分析法を含む、当該技術分野において公知の方法を用いて実施することができる。
熱応答性ポリマーゲルは、一般に、「スマートゲル」と呼ばれ、局所的な溶液温度、pH又は外部エネルギー適用の変化に応答して制御可能な、非線形な応答を示す(Saunders,et al.,1999 Advances in Colloid and Interface Science 80,1;Pelton,2000,Advances in Colloid and Interface Science 85,1)。このようなポリマーは、ゲル容量の変化をもたらす熱動力学的に有利な相分離を受ける架橋された鎖から構成される(Tanaka,et al.,1979,Phys.Rev.Lett.42,1556;Tanaka,et al.,1978,Phys.Rev.Lett.40,820)。ゲルは、容器の形状を示すために大量に合成され、又は直径4nm〜100μmの範囲の粒子中に合成することができる(Tanaka,et al.,1980,Phys.Rev. Lett.45,1636;Tanaka,et al.,1985,Phys.Rev.Lett.55,2455)。各ケースにおいて、材料の内部構造は、軟質で、多孔質構造を作製する柔軟な鎖から構成され、これは溶液の局所的な状態に従って可逆的に拡大または縮小され得る。「スマート」ポリマーの例は、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)(pNIPAm)であり、これは水中で31℃の低臨界溶液温度(LCST)を有する(Jones,2003,School of Chemistry and Biochemistry,Georgia Institute of Technology,Atlanta,GA,p.193)。この温度以下では、ポリマーマトリクスは、溶媒分子ともに膨張し、ここで、ポリマー骨格に沿って水とアミド基との間に水素結合が生じる(Jones,2003,School of Chemistry and Biochemistry,Georgia Institute of Technology,Atlanta,GA,p.193)。温度がLCSTを超えて上昇すると、水素結合が破壊され、水は内部マトリクスから排除され、一方、疎水性相互作用がイソプロピル基間で顕著になり始め、全体の容量の減少をもたらす。この技術は、同定のための生体マーカーを分離するために適用することができる。
特定の実施態様においては、本発明は、試料から分子種を分離及び捕獲するための、方法及び組成物を提供する。本発明の一実施態様においては、所定の分子サイズ、質量及び/又は親和性を有する分子種を特異的に捕獲する能力を有するスマート粒子は、様々な大きさを有する、種々の複数の分子種を典型的に含む試料から興味のある分子を単離するために用いられる。粒子は試料に添加され得、次いで、興味のある分子種を捕獲するために利用され得る。
「検体」なる用語は、興味のある任意の分子を意味し、有機分子、無機分子、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、それらの誘導体、及びそれらの組み合わせが含まれる。検体には、分析物は、制限されないが、細胞表面から流れ、細胞から遊離する(例えば、エキソサイトーシス、溶解等により)代謝産物、分解産物、プロテアーゼ分解産物等が含まれるが、これらに限定されない。本発明の一態様においては、前記方法は、生物学的液体中の低分子量の分子、特に通常の糸球体(腎臓)ろ過により身 体から排除され、液体中で可溶性であり、浮遊するか、又はキャリアタンパク質と結合する分子(例えば、30,000ダルトン未満の分子)を捕捉することを利用し得る。一般に、本発明は、約60,000Da未満、約50,000Da未満、約40,000Da未満、約30,000Da未満、約20,000Da未満、約10,000Da未満、約8,000Da未満、約6,000Da未満、約4,000Da未満、約2,000Da未満、約 1,000Da未満を含むが、これらに限定されない、その検出が所望される興味のある任意の検体を捕獲するために用いることができ、それぞれ記載された範囲内の全ての個々の値を含む。
本発明の捕獲−粒子は、分子ふるい材料(又は分子ふるい部分)から構成され得る。これにより、材料は、多孔質、格子状、蜂の巣状であるか、又は所定の分子の質量又は重量の、他の分子を排除しながらの通過を可能にする。分子ふるいの孔のサイズは、検体が捕獲−粒子を浸透し得るか否かの決定要因である。粒子は、それ自体、任意の適切な大きさ、例えば、それぞれ記載される範囲内の全ての個々の値を含む、約10μm未満、約10μm〜約1μm、約1μm〜約100nm、約1nm〜約100nm、約5nm〜と約50nm;約10nm〜約20nm;約10nm〜約1nmであり得る。
分子ふるい材料を収縮及び/又は膨張するために用いることができる物理的及び/又は化学的な処理は、熱、電気、磁気、超音波、圧力、放射、レーザー、浸透圧、pH、塩、酵素、酸化/還元、脱水/再水和、紫外線、照射、強い赤色光の処理を含み得る。
捕獲粒子は、選択的な検体結合のために表面タンパク質特性を含み得、及び/又はこのような結合特性を付与する部分の付着により改変され得る。
親和性部分には、抗体と、検体と特異的に結合するそれらの機能的等価物とが含まれる。「免疫グロブリン」及び「抗体」は、交換可能に、及びそれらの最も広い意味において、本明細書中で用いられる。従って、それらは、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2個の無傷の抗体から構成される多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び抗体フラグメントを、それらが所望の生物学的活性を示す限り包含する。
本発明の免疫グロブリンは、ポリクローナル又はモノクローナルであり得、当該技術分野において周知の任意の方法により生成することができる
「抗体フラグメント」は、無傷の抗体の部分、好ましくはその抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体フラグメントの具体例には、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fvフラグメント、二重特異性抗体、線状抗体、単鎖抗体分子、及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれる。
本発明の二重特異性抗体は、2種の抗原結合部位を伴う小さな抗体フラグメントである。各フラグメントは、同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメインに連結された重鎖可変ドメインを含む。短かすぎて同じ鎖上の2個のドメイン間での対を形成しないリンカーを用いることにより、ドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対合することを余儀なくされ、2個の抗原結合部位を作製する。
本発明の捕獲粒子は、試料から、興味のある検体を単離するための精製プロトコルにおいて用いられ得る。上述したように、捕獲粒子は、大きさ及び親和性に基づく検体の精製を可能にし、本発明は、興味のある検体を保存及び研究するために、試料からの興味のある検体の迅速な単離を可能にする。これらの検体は、試料中の酵素又は他の分子からの分解を防止するために、捕獲粒子中に保存される。
本発明はまた、所定の分子量、粒径、又は所定の親和性の検体を、捕獲−粒子が選択的に結合するために有効な条件下で、検体を含む試料と、液相捕獲−粒子とを接触させ、次いで捕獲粒子に選択的に結合される検体を同定することにより、疾患を診断する方法を包含する。同定された濃度における試料中の検体の存在は、病状の特徴である。検体の存在を検出することは、酵素結合免疫吸着法(ELISA)、質量分析法、ラジオイムノアッセイ(RIA)、マイクロアレイ法、免疫蛍光法、ノーザンブロット、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、及びインサイチュハイブリダイゼーションのような当業者に周知の方法を用いて実施することができた。
特定のキットの実施態様においては、捕獲粒子は、精製又は診断の方法における使用に適切な形態において提供される。キットは一般に、捕獲粒子、並びに説明書、及び精製または診断方法を実施するために必要な物質を提供する。これらのキットは、試料を保存する医療機関における医師による、又は血清検体の精製および単離を開始するその他の人による使用について想定されている。
界面活性剤を含まない沈殿重合により、N−イソプロピルアクリルアミド(NIPAm)及びN,N’−メチレンビスアクリルアミド(BIS)を組み込んだ捕獲粒子を生成した。BISは架橋剤として用いられ、BIS:NIPAmのモノマー比は、得られるネットワーク密度、従って平均孔径を決定する。更に、(AAc)を含む粒子の製造は、電荷ベースの親和性バイトを取り込むために製造された。
2%架橋剤を有する粒子とインキュベートした血清を、5mm長の30%アクリルアミド/ビスゲルスライスを前もって重合化した、centrilutor micro−electroeluter (Millipore)の試験管内に負荷した。電場を形成した場合、粒子が、そのタンパク質含有量を損失することなく、ゲルスライスを通って正電極へ向かって移動した。
溶液中で一工程で直接的に血清中の低分子量タンパク質の分配、アフィニティー分離、濃縮及び安定化を実施するためのヒドロゲル粒子の能力を、バイオマーカー分離及び分析に由来する血液のための新規な迅速な方法として分析した。定義によれば、ヒドロゲルは、大量の水を吸収することのできる三次元架橋ポリマーネットワークである(Pelton,R.Adv Colloid Interface Sci 2000,85,(1),1−33)。それらは、通常、架橋剤の存在下、通常、少なくとも2種の重合可能な官能基を有するモノマーであるモノマーの重合により製造される。ゲルは、非応答性(単純なポリマーネットワークは、水にさらされることにより劇的に膨潤する)又は応答性ゲル(追加の機能性を有し、溶媒中で温度(Li and Tanaka,The Journal of Chemical Physics 1990,92,(2),1365−1371)、pH(Jones and Lyon,Macromolecules 2000,33,(22),8301−8306;Moselhy et al.,Journal of Biomaterials Science,Polymer Edition 2000,11,(2),123−147)、イオン強度(Duracher et al.,Colloid & Polymer Science 1998,276,(3),219−231;Duracher et al.,Colloid & Polymer Science 1998,276,(10),920−929)、光(Sershen et al.,Temperature−sensitive polymer−nanoshell composites for photothermally modulated drug delivery,In 2000;Vol.51,pp293−298;Suzuki and Tanaka,Nature 1990, 346,(6282),345−347)及び電場(Tanaka et al.,Science,1982,218,467−9)のような特定の刺激に対する応答において変化を示す)に分類することができる。
N−イソプロピルアクリルアミド(NIPAm)を製造し、分子ふるい特性について評価した。NIPAm及びアクリル酸(AAc)をいずれも含む第二の粒子クラス、NIPAm/AAcを製造し、図1に示すように、電荷に基づいた親和性バイトを粒子中に導入した(Pelton,Adv Colloid Interface Sci 2000,85,(1),1−33;Jones and Lyon,Macromolecules 2000,33,(22),8301−8306;Saunders and Vincent,Advances in Colloid and Interface Science 1999,80,(1),1−25)。
温度及びpHに依存する粒径を、Photon Correlation Spectroscopy(PCS,Submicron Particle Size Analyzer,Beckman Coulter)により測定した。200秒積分時間を用いた3回の測定について平均値を計算し、各測定前に10分間、溶液を熱的に平衡化した。次いで、測定した値を、ストークス−アインシュタインの関係により粒径に変換した(Pecora,Dynamic Light Scattering:Applications of Photo Correlation Spectroscopy.Springer:1985;p436)。温度の上昇に従い、NIPAmの粒径は小さくなり(図2A)、これは熱反応性ヒドロゲルの独特の特性である(Sparnacci et al.,J Biomater Sci Polym Ed 2005,16,(12),1557−74;Haruyuki Hiratani,Macromolecular Bioscience 2005,5,(8),728−733;Nahar et al.,Crit Rev TherDrug Carrier Syst 2006,23,(4),259−318;Wu et al.,Journal of Controlled Release 2005,102,(2),361−372;Zhang et al.,Biomaterials 2005,26,(16),3299−309;Woo et al.,Pharm Res 2001,18,(11),1600−6)。NIPAm/AAc粒子は、粒径に関して同じ温度依存性を示したが、それらはpH依存挙動をも示した(図2B)。低いpH(3.5)においては、AAc基はプロトン化され、温度依存性のNIPAm/AAcの粒径は、誘導体化されていない粒子と同じである。より高いpH(4.5及び6.5)においては、AAc基は部分的にプロトン化され、粒子中の対イオン侵入により得られるポリマー鎖及び浸透圧の間のクーロン力相互作用のために平均粒径が大きくなっていると思われる(Fernandez−Nieves et al.,Macromolecules 2000,33,2114−2118;Ito et al.,Langmuir 1999,15,(12),4289−4294)。
図3に概略的に示したように、溶液中で、NIPAm粒子を分子ふるい特性について試験し;ペプチドームがバイオマーカー源を豊富に含むと考えられるので(Tirumalai et al.,Molecular & cellular proteomics 2003,2,(10),1096−103;Merrell et al.,Journal of biomolecular techniques 2004,15,(4),238−48;Orvisky et al.,Proteomics 2006,6,(9),2895−902)、目的は、タンパク質及び20,000Da未満の分子量を有する低分子化合物を捕獲する粒子を作成することである。
一定量のNIPAm粒子(50μL,10mg/mL)を、標的分子種とインキュベートし、粒子を収集した(7分、25℃、16,100rcf)。上清を除去し、粒子を1mLの水に再懸濁した。遠心分離及び洗浄を3回繰り返し、粒子の蛍光強度を、FACScanフローサイトメトリー(Becton Dickinson)を用いて測定した。未処理の粒子のバックグラウンド蛍光シグナルを、全ての測定の基準として用いた。フルオレセインイソチオシアネート(FITC、MW 389Da)を、小さい分子の取り込み、並びにインキュベーション時間及び濃度における取り込みの依存を試験するためのモデルとして用いた。種々の濃度(5μM、20μM及び100μM)のFITCとインキュベートした粒子は、飽和に向かって濃度依存的取り込み速度を示した(図4A)。経時変化試験は、FITCの取り込みが10%v/v粒子濃度において急速に起こることを示した(図4B)。
粒子中に捕獲されたタンパク質の濃度は、タンパク質の排出速度、及び粒子の侵入速度及びバルク溶液中の標的タンパク質濃度の間の平衡に依存依存するので、不活性の分子ふるいは、溶液中の全ての標的タンパク質を直接的に収集及び濃縮するこができない。その結果、標的タンパク質の収集を容易にし、捕獲したタンパク質が粒子から排出されるのを防止するために親和性バイトを取り込んだ粒子が構成された。
次いで、前記結果に基づき、血清のような複合溶液中に混合されている小さい分子を捕獲するための粒子の性能を現実の世界のバイオマーカーの発見及びタイプの実験の解析を模倣するための試験を行った。血清で1:10に希釈した、FITC標識したインシュリンの一定量(最終濃度40μM)を、NIPAm及びNIPAm/AAc粒子とインキュベートした。フローサイトメトリー分析は、FITC−インシュリンを含む血清中でインキュベートしたNIPAm粒子が、コントロール粒子及び血清のみでインキュベートした粒子に比べ、蛍光強度において右方移動することを示した(図10A)。
タンパク質取り込みの反応速度論が非常に急速であることを証明するため、NIPAm/AAc粒子とインキュベーションした後のバルク溶液中に残存するタンパク質量を、逆相タンパク質アレイ(RPPA)(Gulmann et al,The Journal of pathology 2006,208,(5),595−606)により測定した。Bradfordアッセイのような他の方法は十分な感度を有さず、我々の目的はバルク溶液からのタンパク質除去がどのように完了するかを証明することであるので、粒子上清中のタンパク質濃度を測定するための手段としてRPPAを選択した。種々の量のNIPAm/AAc粒子(115万及び1150万)を、総量100μLのTris(pH7,50mM)中、ライソザイム(20μM)と1及び10分間インキュベートした。粒子を遠心分離した後、一定量の上清を、Aushon2470ロボットアレイヤー(Aushon Biosystems)を用いてニトロセルロースをコーティングしたスライド(FASTスライド、Whatman)にスポットした。アレイを、コロイド性金溶液、AuroDye Forte Kit(Amersham)を用いて染色し、PowerLook 1120スキャナー(Umax)を用いて画像を得、ImageQuant(GE Healthcare)を用いて画像から数値を得、SigmaPlot(Systat)に供した。1分間のインキュベーション後、115万個の粒子を含むバルク溶液は、28%の初期タンパク質量を、10分後には15%を含んでいた。更に、1及び10分間後の1150万個の粒子によって回復した溶液は、それぞれ、5%及び9%の初期量を含んでいた(図12A)。全ての経時変化実験においては、溶液からの粒子の分離が遠心分離によって得られているので、報告された掲示変化値はインキュベーション時間間隔のみを意味することに注意すべきである。その上、更に7分間、溶液と接触した粒子が遠心分離のために必要であった。
プロテオソーム解析のための血清に由来する低濃度のタンパク質バイオマーカーの候補を隔離及び濃縮するためのNIPAm及びNIPAm/AAc粒子の能力を、水中で、1:10v/vの希釈で粒子と1時間インキュベートすることにより評価した。捕捉されたタンパク質を、変性条件下、粒子から電気泳動的に溶出した。粒子を、SDS試料バッファー中、100℃で5分間加熱し、4〜20%Tris Glicineゲル(Invitrogen)に積載した。30kDa未満のバンドを切り取り、ゲル内トリプシン消化を実施した(Camerini et al.,Proteomics Clin.Appl.2007,1,176−184)。得られたペプチド断片を、LTQ−Orbitrap質量分析計(Thermo Fisher)を用いて、オンライン液体クロマトグラフィー/エレクトロスプレイイオン化質量分析(LC/ESIMS)により解析した。逆相カラムは、レーザーがけん引されたチップを供える100mmi.d.×10cmの長の融合化シリカゲルキャピラリー(Polymicro Technologies,Phoenix,AZ)中、5μm、20Åのポアサイズの18C樹脂(Michrom BioResources,CA)でスラリーパックした。試料の注入後、カラムを移動相A(0.1%ギ酸)で5分間洗浄し、200nl/分で50分間、0%移動層B(0.1%ギ酸、80%アセトニトリル)から50%移動相Bまでの、次いで更に5分間の100%Bまでの直線勾配を用いてペプチドを溶出した。LTQ質量分析器を、データ依存モードにおいて操作し、それぞれ、全てのMSスキャン後に5種のMS/MSスキャンが続き、ここでは5つの最も豊富な分子イオンが、規格化された35%の衝突エネルギーを用いて、衝突誘導性の解離(CID)について動的に選択される。MS/MSデータを、完全なトリプシン切断条件を用いて、プログラムSEQUEST(Bioworks software,Thermo)を用いたNCBI(National Center for Biotechnology Information)ヒトタンパク質データベースに対してマッチさせた。高信頼性ペプチド同定は、調査結果に対して以下のフィルター:相関スコア(XCorr)=1+について1.9、2+について2.2、3+について3.5、無作為の0.01の無作為同定について最大の可能性を適用することにより得られた。表1及び表2中で同定されたタンパク質のリストは、アルブミン及び他の大量に含まれる血清タンパク質が粒子中に存在しないことを示す。一方、同定されたタンパク質のリストは、粒子が、まれに小さいサイズの血清タンパク質及びペプチドを隔離することを示す。
表1.1:10v/v希釈した血清と1時間インキュベートした後のNIPAm粒子から電気的に溶出したタンパク質の質量スペクトル分析、P(pep)は、ペプチドについての確率値を示し、Sfは、タンパク質適合がどのようい良好であるかを示す最終スコアを示し、スコアは、ペプチドがスペクトルデータにランダムに適合する可能性に基づいた値を示す。受け入れ番号は、配列についてのユニークなタンパク質同定番号を示す。
体液と関連する主要な問題の1つは、収集、輸送、保存及び解析の間の試料の分解の可能性である。内因性凝固カスケード酵素、損傷された細胞から放出される酵素、外因性酵素(汚染細菌に由来する)は、図13に概略的に示すように、診断上重要なタンパク質の分解に寄与する。
この実践的な構造において、親和性バイト部分を含むコアは、NIPAmシェルによって包囲される。NIPAmシェルの分子ふるい性能はコア、並びに存在し、コア中で親和性バイトに結合するための、意図する少量かつ低分子量の分子標的と競合し得る大きい分子に由来する親和性バイト基を遮蔽するであろう。シェル溶液は、NIPAm、それぞれH2O中の0.02モル同等物のBIS及びSを溶解し、この溶液を博膜フィルターでろ過することにより製造した。減圧下、数分間、溶液を脱気し、室温で攪拌しながら2時間窒素でパージした。シェル溶液をパージしながら、NIPAm、0.08モル同等物のAAc及び0.02モル同等物のBISをH2O中に溶解し、溶液をろ過することによりコア溶液を調製した。次いで、コア溶液を脱気し、NIPAm粒子の製造について記載したようにして、70℃で窒素でパージした。いったん、溶液が70℃で平衡に達し、窒素雰囲気下で1時間攪拌したら、APS(0.005モル同等物)をコア溶液に加えた。NIPAm/AAcコア反応物を、窒素雰囲気下、70℃で3時間インキュベートした後、シェル溶液を、次いで、APSの追加の一定量を反応フラスコに加えた。次いで、反応物を窒素雰囲気下、70℃で更に3時間攪拌した。この時点で、反応物を熱から取り出し、窒素雰囲気下、室温で一晩攪拌した。次いで、NIPAm粒子について記載したようにして、粒子を集め、洗浄した。
コアシェルの直径の光散乱測定は、NIPAm/AAcコアについて1048nm及びNIPAmシェルを加えた時に1198nmの値を示した。コアシェル粒子が、NIPAm/AAc粒子と同じ分子量カットオフ(MWCO)を有するかどうかを調べるために、タンパク質分子量パーカーの溶液を用いた。溶液は、Tris(pH7,50mM)に、溶解した、アプロチニン(MW6,500Da,Sigma−Aldrich)、ライソザイム(MW14,400Da,Sigma−Aldrich)、トリプシン阻害剤(MW21,500Da,Invitrogen)、炭酸脱水酵素(MW31,000Da,Sigma−Aldrich)、オブアルブミン(MW45,000Da,Sigma− Aldrich)及びBSA(MW66,000Da,Fisher Scientific)を、それぞれそれぞれ0.5mg/mLで含む。インキュベーション時間は1時間であり、原稿に記載されたようにして粒子を洗浄した。SPD PAGE分析は、図16において、2種の粒子について、MWCO値の実質的な一致を示した。
他のプロテアーゼ、α−キモトリプシン(MW25,000Da,pI=8.75,Sigma)を、分解からタンパク質を保護する粒子の能力を証明するために用いた。ライソザイムの消化は、10mM CaCl2を含む100mM Tris HCl,pH7.8中、30℃で30分間実施した。コアシェル粒子を、前述の消化条件中、ライソザイム及びトリプシンとインキュベートした。このケースにおいては、粒子は、キモトリプシン分解からライソザイムを保護した(図17、レーン5)。ライソザイム分解は、粒子なしのインキュベーションにおいても明らかである(図17、レーン3)。
Claims (45)
- ポリマーマトリクスを含む、混合物から検体を分離するための捕獲粒子であって、
前記ポリマーマトリクスが、特定の条件下で、侵入するポリマーマトリクス由来の混合物に由来する他の化合物を排除しながら検体がポリマーマトリクスに侵入することを可能にするポアサイズを有する、捕獲粒子。 - 前記検体が:代謝産物、タンパク質、RNA、ミクロRNA、DNA、糖タンパク質、脂質、糖脂質、プロテオリピド、ホルモン、サイトカイン、成長因子、バイオマーカー、薬剤、合成有機化合物、揮発性臭気物質、毒物及び汚染物質からなる群から選択される、請求項1記載の捕獲粒子。
- 前記ポリマーマトリクスが膨張性かつ収縮性である、請求項1記載の捕獲粒子。
- ポリマーマトリクスが膨張又は収縮する場合、ゲルマトリクスのポアサイズが、それぞれ膨張又は収縮する、請求項3記載の捕獲粒子。
- 適用された刺激に応答し、ポリマーマトリクスが膨張性又は収縮性である、請求項3記載の捕獲粒子。
- 前記適用された刺激が、熱、電気、磁気、超音波、圧力、放射、レーザー、浸透圧、又はpHの変化である、請求項5記載の捕獲粒子。
- 前記ポリマーマトリクスが、酵素を用いた処理により膨張性又は収縮性である、請求項3記載の捕獲粒子。
- 更に誘引物質を含む、請求項1記載の捕獲粒子。
- 前記誘引物質が前記捕獲粒子により隔離されている、請求項8記載の捕獲粒子。
- 前記誘引物質が前記捕獲粒子に共有結合している、請求項8記載の捕獲粒子。
- 前記誘引物質が前記ポリマーマトリクス中に組み入れられている、請求項8記載の捕獲粒子。
- 前記誘引物質が親和性リガンドである、請求項8記載の捕獲粒子。
- 前記親和性リガンドが、抗体又はタンパク質、アプタマー、核酸、薬剤、化学物質、代謝産物、脂質、糖脂質、リン脂質、ポリペプチド、親和性基又は金属基を含む、請求項12記載の捕獲粒子。
- 更に検出可能な標識を含む、請求項1記載の捕獲粒子。
- 構造モノマー及び親和性モノマーを含むコポリマーマトリクスを含む、混合物から検体を分離する捕獲粒子であって、
前記ポリマーマトリクスが、特定の条件下で、侵入するポリマーマトリクス由来の混合物に由来する他の化合物を排除しながら検体がポリマーマトリクスに侵入することを可能にするポアサイズを有する、捕獲粒子。 - 前記検体が、代謝産物、タンパク質、RNA、ミクロRNA、DNA、糖タンパク質、脂質、糖脂質、プロテオリピド、ホルモン、サイトカイン、成長因子、バイオマーカー、薬剤、合成有機化合物、揮発性臭気物質、毒物及び汚染物質からなる群から選択される、請求項15記載の捕獲粒子。
- 前記捕獲粒子が、約5〜約100kDaの分子量カットオフサイズを有する、請求項15記載の捕獲粒子。
- 前記捕獲粒子が、約20〜約50kDaの分子量カットオフサイズを有する、請求項15記載の捕獲粒子。
- 前記構造モノマーが:アクリルアミド及びその誘導体、N−アルキル置換アクリルアミド;N,N−メチレンビスアクリルアミド、N,N−シスタミンビスアクリルアミド、N−ビニルアルキルアミド、アクリル酸、メタクリル酸、アリルアミン、スチレン、ベンジルグルタメート、2−エチルアクリル酸、4−ビニルピリジン、シリコーン、ヒドロキシエチルメタクリレート、エチレンオキシド、ブチレンテレフタレート、2−アクリルアミド−2−メチル−1−プロパンスルホン酸、ビニルピロリドン、エチレン−酢酸ビニル、ラクチド、グリコリド、カプロラクトン、ヒドロキシアルカノエート、キトサン、ヒアルロン酸、デンプン、セルロース及びアガロースからなる群から選択される、請求項15記載の捕獲粒子。
- 前記構造モノマーがN−イソプロピルアクリル酸である、請求項15記載の捕獲粒子。
- 前記親和性モノマーが正に帯電した部分を含む、請求項15記載の捕獲粒子。
- 前記正に帯電した部分が:アミン基及びアミド基からなる群から選択される、請求項21記載の捕獲粒子。
- 前記親和性モノマーが、負に帯電した部分を含む、請求項15記載の捕獲粒子。
- 前記負に帯電した部分が:カルボン酸基、ヒドロキシル基、チオール基及びリン酸基からなる群から選択される、請求項23記載の捕獲粒子。
- 前記親和性モノマーが:親和性色素、ボロン酸基、核酸、糖ペプチド、糖タンパク質、シクロデキストリン、カリックスアレーン、ポルフィリン基及び脂肪族基からなる群から選択される、請求項15記載の捕獲粒子。
- 前記親和性モノマーがアクリル酸である、請求項15記載の捕獲粒子。
- 構造モノマー及び親和性モノマーを含むコポリマーマトリクスを含有するコア;及び
シェルモノマーを含むポリマーマトリクスを含有するシェルとを含む、混合物から検体を分離するための捕獲粒子であって、
前記コポリマーマトリクス及びポリマーマトリクスが、特定の条件下で、侵入するポリマーマトリクス由来の混合物に由来する他の化合物を排除しながら検体がマトリクスに侵入することを可能にするポアサイズを有する、捕獲粒子。 - 混合物を、ポリマーマトリクスが、特定の条件下で、侵入するポリマーマトリクス由来の混合物に由来する他の化合物を排除しながら検体がポリマーマトリクスに侵入することを可能にするポアサイズを有するポリマーマトリクスを含む捕獲粒子と接触させ;
捕獲粒子が検体を隔離するのに十分な時間、混合物と捕獲粒子とを接触させたままにし;
前記捕獲粒子を前記混合物から分離し;
前記検体を前記捕獲粒子から放出することを含む、混合物から検体を分離する方法。 - 前記捕獲粒子の分離が、粒子を物理的に移動することにより実施される、請求項28記載の方法。
- 前記粒子が、磁場、電場、pH勾配、溶媒勾配、液体の流れ、マイクロ流体の流れ又は物理的力にさらすことにより物理的に移動される、請求項29記載の方法。
- 前記粒子が、粒子を基材に結合することにより物理的に移動される、請求項29記載の方法。
- 前記基材がビーズである、請求項31記載の方法。
- 前記基材が平面である、請求項31記載の方法。
- 混合物を、ポリマーマトリクスが、第一の条件下で、検体が孔を通過することを可能にするポアサイズを有し、第二の条件下で、検体が孔を通過しないことを可能にするポアサイズを有するポリマーマトリクスを含む補角粒子と接触させ;
捕獲粒子が検体を隔離するのに十分な時間、捕獲粒子を第一の条件にさらしている間、混合物と捕獲粒子とを接触させたままにし;
前記捕獲粒子を第二の条件にさらし;
前記捕獲粒子を前記混合物から分離し;
前記捕獲粒子を第一の条件に再度さらし、検体を捕獲粒子から放出させることを含む、混合物から検体を分離する方法。 - 前記検体を、検体を分解し得る混合物の他の成分から保護する、請求項34記載の方法。
- 混合物を、構造モノマー及び親和性モノマーを含むコポリマーマトリクスを含む捕獲粒子と接触させることを含む、混合物から検体を分離する方法であって、
ポリマーマトリクスが、特定の条件下で、侵入するポリマーマトリクス由来の混合物に由来する他の化合物を排除しながら、検体がポリマーマトリクスに侵入することを可能にするポアサイズを有しており;
捕獲粒子が検体を隔離するのに十分な時間混合物と捕獲粒子とを接触させたままにし;
前記捕獲粒子を前記混合物から分離し;
前記捕獲粒子から検体を放出させる方法。 - 前記検体を、検体を分解し得る混合物の他の成分から保護する、請求項34記載の方法。
- 液体を、構造モノマー及び親和性モノマーを含むコポリマーマトリクスを含有する捕獲粒子と接触させることを含む、液体中に少量存在する検体を濃縮する方法であって、
コポリマーマトリクスが、特定の条件下で、侵入するポリマーマトリクス由来の液体に由来する他の化合物を排除しながら、検体がポリマーマトリクスに侵入することを可能にするポアサイズを有しており;
前記捕獲粒子が検体を濃縮するのに十分な時間、液体と捕獲粒子とを接触させたままにし;
前記捕獲粒子を前記混合物から分離し;
適切な容量で捕獲粒子から検体を放出させ、検体の濃縮溶液を形成する方法。 - 液体中の少量の検体が、検体を濃縮しない分析法による検体の検出を阻止する、請求項38記載の方法。
- 前記検体が、前記捕獲粒子を用いた濃縮後の分析法により検出可能である、請求項39記載の方法。
- 混合物を収集するための収集装置;及び
検体を分離するのに十分な量の、構造モノマー及び親和性モノマーを含むコポリマーマトリクスを含有する捕獲粒子を含む、混合物中の検体を分離するためのキットであって、
ポリマーマトリクスが、特定の条件下で、侵入するポリマーマトリクス由来の混合物に由来する他の化合物を排除しながら検体がポリマーマトリクスに侵入することを可能にするポアサイズを有するキット。 - 前記収集装置が、バクテイナー(vacu−tainer)、管、層、カートリッジ、パッチ及びマイクロ流体素子からなる群から選択される、請求項41記載のキット。
- 容器の表面が、捕獲粒子の層でコーティングされている、請求項41記載のキット。
- 混合物から検体を分離するための自動システムであって、
前記自動化システムは、
混合物を、ポリマーマトリクスが、特定の条件下で、侵入するポリマーマトリクス由来の混合物に由来する他の化合物を排除しながら検体がポリマーマトリクスに侵入することを可能にするポアサイズを有するポリマーマトリクスを含む捕獲粒子と接触させ;
捕獲粒子が検体を隔離するのに十分な時間、混合物と捕獲粒子とを接触させたままにし;
前記捕獲粒子を前記混合物から分離し;
前記検体を前記捕獲粒子から放出し;
分析法を用いて検体を解析することを含む方法を実施する自動化システム。 - 前記分析法が:質量分析法、核磁気共鳴、赤外分析法、固相免疫測定法、ELISA、免疫沈降法、比色分析法、放射分析アッセイ、蛍光アッセイ、フロービーズ/フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング及びタンパク質配列決定からなる群から選択される、請求項44記載の自動化システム。
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