JP2008241679A - 生理活性高分子物質の分離方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】移動相として中性で低塩濃度の緩衝液を用い、固定相表面に0〜80℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマーを被覆し、そのポリマー鎖の温度変化による収縮、膨潤により当該固定相表面の有効荷電密度を変えられる充填剤を用いて、固定相表面のポリマー鎖を収縮させることで保持させ、ポリマー鎖を膨潤させることで脱着させる操作を行なうこと。
【選択図】なし
Description
1−a)アミノプロピルシリカゲルへ重合開始剤の導入するために下記の化合物を使用した。
アミノプロピルシリカゲル 5g
V−501[4,4’−アゾビス(4−シアノバレリン酸(4,4’−azobis(4−cyanovaleric acid)(分子量:280・28)] 3.5g(12.5mmol)
EEDQ[N−エトキシカルボニル−2−エトキシ−1,2−ジヒドロキノリン(N−Ethoxycarbonyl−2−ethoxy−1,2−dihydroquinoline)(分子量:247.30)] 6.18g(25.0mmol)
それぞれのものを上述の割合で配合し、V−501に対しEEDQを縮合剤として使用し、これらをDMF 50mlに溶解させ、その中にアミノプロピルシリカゲルを分散させることで反応させた。これを遮光下で30分間N2(窒素)ガスでバブリングし、その後完全にN2置換し、N2風船をつけて室温で6時間反応させた。反応後、ろ過してからDMFで洗浄した。これによりシリカゲル表面に重合開始剤を導入した。
1−b)正荷電固定相表面の形成のために下記の化合物を使用した。
1−aで作製したV−501結合シリカゲル4g
IPAAm 10g
BIS[N,N’−メチレン−ビス(アクリルアミド)(N,N’−Methylene−bis(acrylamide))(分子量:154.17)] 0.27g
DMAEMA IPAAmに対してモル比で84.5:10となる量
BMA IPAAmに対してモル比で84.5:4.5となる量
上述の量で1−aで作製したV−501結合シリカゲル、IPAAm、BISをEtOH200mlに溶解させた。DMAEMAならびにBMAを添加し、これを遮光下で1時間N2バブリングした。その後、完全にN2置換し、N2風船をつけて70℃(油浴)で5時間反応させた。これにより正荷電を持つPIPAAm表面のゲル層を形成した。反応後、ろ過してからメタノールと水で洗浄した。これを充填剤として減圧乾燥してデシケーターに保存した。これをステンレスカラムに充填して分析に用いた。
(分離条件)カラムとしてポリ(IPAAm−co−DMAEMA−co−BMA)(85.5:10:4.5)ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてNa2PO3/NaHPO3緩衝液pH=7.0、イオン強度=33.4mMを用いた。結果を図1、並びに図2に示す。正荷電ゲル(ポリ(IPAAm−co−DMAEMA−co−BMA))を充填したカラムでは、イオン強度33.4mMの移動相を用いたとき、10℃ではアルブミンを保持しなかったが、40℃でアルブミンを保持した。40℃で保持されたアルブミンはカラム温度を10℃に冷却することで溶出した。これにより、本発明の技術によればアルブミンの分離が可能であることが分かる。
(分離条件)カラムとしてポリ(IPAAm−co−DMAEMA−co−BMA)(85.5:10:4.5)ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてNa2PO3/NaHPO3緩衝液pH=7.0、イオン強度=66.7mMを用いた。結果を図3に示す。正荷電ゲル(ポリ(IPAAm−co−DMAEMA−co−BMA))を充填したカラムでは、イオン強度66.7mMの移動相を用いたとき、10℃と40℃いずれの温度でもアルブミンを保持せず分離ができなかった。
実施例1−aで作製したV−501結合シリカゲル 4g、
IPAAm 10g
BIS 0.27g、
AA[アクリル酸] IPAAmに対してモル比で84.5:10になる量、
BMA IPAAmに対してモル比で84.5:4.5になる量
上述の量で1−aで作製したV−501結合シリカゲル、IPAAm、BISならびにBMAを添加し、これを遮光下で1時間N2バブリングした。その後完全にN2置換し、N2風船をつけて70℃(油浴)で5時間反応させた。これにより正荷電を持つPIPAAm表面のゲル層を形成した。反応後ろ過してからメタノールと水で洗浄した。これを充填剤として減圧乾燥してデシケーターに保存した。これをステンレスカラムに充填して分析に用いた。
(分離条件)カラムとしてポリ(IPAAm−co−AA−co−BMA)(85.5:10:4.5)ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてNa2PO3/NaHPO3緩衝液pH=7.0、イオン強度=33.4mMを用いた。負荷電ゲル(ポリ(IPAAm−co−AA−co−BMA))を充填したカラムでは、イオン強度33.4mMの移動相を用いたとき、10℃ではリゾチームを保持しなかったが、40℃でリゾチームを保持した。これにより、リゾチームの分離が可能となった。これにより、本発明の技術によればリゾチームの分離が可能であることが分かる。
実施例1−aで作製したV−501結合シリカゲル 4g
IPAAm 10g、BIS 0.27g
BMA IPAAmに対してモル比で95:5になる量
上述の量で、実施例1−aで作製したV−501結合シリカゲル、IPAAm、BISをEtOH 200mlに溶解させた。BMAを添加し、これを遮光下で1時間N2バブリングした。その後完全にN2置換し、N2風船をつけて70℃(油浴)で5時間反応させた。これによりPIPAAm表面のゲル層を形成した。反応後ろ過してからメタノールと水で洗浄した。これを充填剤として減圧乾燥してデシケーターに保存した。これをステンレスカラムに充填して分析に用いた。
(分離条件)カラムとしてポリ(IPAAm−co−BMA)(95:5)ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてNa2PO3/NaHPO3緩衝液pH=7.0、イオン強度=33.4mMを用いた。結果を図4に示す。ハイドロゲル(ポリ(IPAAm−co−BMA))を充填したカラムでは、イオン強度33.4mMの移動相を用いたとき、10℃と40℃いずれの温度でもアルブミンを保持せず分離ができなかった。
(分離条件)カラムとしてポリ(IPAAm−co−DMAEMA−co−BMA)(85.5:10:4.5)ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてNa2PO3/NaHPO3緩衝液pH=7.0.イオン強度=25.0mMを用いた。正荷電ゲル(ポリ(IPAAm−co−DMAEMA−co−BMA))を充填したカラムでは、イオン強度10.0mMの移動相を用いたとき、10℃ではアルブミンを保持しなかったが、40℃でアルブミンを保持した。これにより、本発明の技術によればアルブミンの分離が可能であることが分かる。
(分離条件)カラムとしてポリ(IPAAm−co−DMAEMA−co−BMA)(85.5:10:4.5)ハイドロゲル修飾シリカを充填したカラム、移動相としてNa2PO3/NaHPO3緩衝液pH=7.5、イオン強度=33.4mMを用いた。正荷電ゲル(ポリ(IPAAm−co−DMAEMA−co−BMA))を充填したカラムでは、イオン強度33.4mMの移動相を用いたとき、10℃ではアルブミンを保持しなかったが、40℃でアルブミンを保持した。これにより、本発明の技術によればアルブミンの分離が可能であることが分かる。
Claims (9)
- 生理活性高分子物質の分離が、移動相として中性で低塩濃度の緩衝液を用い、固定相表面に0〜80℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電を有するポリマーを被覆し、そのポリマー鎖の温度変化による収縮、膨潤により当該固定相表面の有効荷電密度を変えられる充填剤を用いて、固定相表面のポリマー鎖を収縮させることで当該生理活性高分子物質を保持させ、ポリマー鎖を膨潤させることで当該生理活性高分子物質を脱着させることを特徴とする生理活性高分子物質の分離方法。
- 生理活性高分子物質が酸性蛋白質、又は塩基性蛋白質である、請求項1記載の生理活性高分子物質の分離方法。
- 生理活性高分子物質がアルブミンである、請求項2記載の生理活性高分子物質の分離方法。
- 緩衝液が、5〜50mMのリン酸緩衝液である、請求項1〜3いずれか1項記載の生理活性高分子物質の分離方法。
- 緩衝液のpHが6.5〜7.5である、請求項1〜4いずれか1項記載の生理活性高分子物質の分離方法。
- 荷電を有するポリマーが、ポリアルキルアクリルアミドの共重合物である、請求項1〜5いずれか1項記載の生理活性高分子物質の分離方法。
- ポリアルキルアクリルアミドが、ポリ−(N−イソプロピルアクリルアミド)、及び/またはポリ−(N,N−ジエチルアクリルアミド)である、請求項6記載の生理活性高分子物質の分離方法。
- 請求項1〜7記載の生理活性高分子物質の分離方法を利用した、生理活性高分子物質の精製方法。
- 請求項1〜7記載の生理活性高分子物質の分離方法を利用した、生理活性高分子物質の分取方法。
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