JP2000140632A - 刺激応答性高分子を用いた分離材料および該分離材料を用いた分離方法 - Google Patents
刺激応答性高分子を用いた分離材料および該分離材料を用いた分離方法Info
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
- G01N30/52—Physical parameters
- G01N30/54—Temperature
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- Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 金属イオン、医薬品、生体成分などの標的物
質を分離する物質の新規な分離方法を提供すること。 【解決手段】 充填材表面が物理的刺激により化学的、
物理的な環境変化を起こすことで、標的物質との相互作
用を持つ物質の標的物質に対する相互作用を、水溶液中
で可逆的に変化させ分離する。
質を分離する物質の新規な分離方法を提供すること。 【解決手段】 充填材表面が物理的刺激により化学的、
物理的な環境変化を起こすことで、標的物質との相互作
用を持つ物質の標的物質に対する相互作用を、水溶液中
で可逆的に変化させ分離する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、水系で標的物質と特異
的に相互作用する物質の相互作用力を、物理的刺激によ
る刺激応答性高分子の構造変化および極性変化により、
可逆的に変化させることが可能であり、これを含む分離
剤を用いて金属イオン、医薬品、生体成分などの標的物
質を分離する物質の新規な分離方法および該方法に用い
る充填材等の分離材料に関する。
的に相互作用する物質の相互作用力を、物理的刺激によ
る刺激応答性高分子の構造変化および極性変化により、
可逆的に変化させることが可能であり、これを含む分離
剤を用いて金属イオン、医薬品、生体成分などの標的物
質を分離する物質の新規な分離方法および該方法に用い
る充填材等の分離材料に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体成分、医薬品の分離および精製に使
われる、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等は現
在、最も有効で効率的な手段である。さらに、近年の著
しいバイオテクノロジー技術の進歩において、組み換え
タンパク質、糖タンパク質等の生理活性物質の大量生産
が行われる中で、これら目的物質の失活を防ぎ、迅速で
かつ効率的な分離精製手法が求められている。
われる、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等は現
在、最も有効で効率的な手段である。さらに、近年の著
しいバイオテクノロジー技術の進歩において、組み換え
タンパク質、糖タンパク質等の生理活性物質の大量生産
が行われる中で、これら目的物質の失活を防ぎ、迅速で
かつ効率的な分離精製手法が求められている。
【０００３】しかしながら、上記に示したクロマトグラ
フィー的手法では目的物質となる生体成分、医薬品、組
み換えタンパク質および糖タンパク質等の溶出に際し
て、溶離液の塩濃度、有機溶媒濃度、ｐＨ濃度等を変化
させて溶出させる手法が使われている。しかしながら、
これらの手法は、例えばｐＨ濃度、有機溶媒などは、標
的物質に対して過酷な条件となることが多く、回収率が
低下することが知られている。さらに、目的物質の溶出
の際に使用した、塩、有機溶媒、ｐＨ条件等を最終的に
は脱塩、乾燥等の操作により取り除く操作を必要とする
ため、目的物質の分離および精製の後に、これら塩、有
機溶媒、ｐＨ等を除去する操作段階を経なければなら
ず、このような操作段階が多いことから、最終的な物質
の活性および回収率が低くなる。
フィー的手法では目的物質となる生体成分、医薬品、組
み換えタンパク質および糖タンパク質等の溶出に際し
て、溶離液の塩濃度、有機溶媒濃度、ｐＨ濃度等を変化
させて溶出させる手法が使われている。しかしながら、
これらの手法は、例えばｐＨ濃度、有機溶媒などは、標
的物質に対して過酷な条件となることが多く、回収率が
低下することが知られている。さらに、目的物質の溶出
の際に使用した、塩、有機溶媒、ｐＨ条件等を最終的に
は脱塩、乾燥等の操作により取り除く操作を必要とする
ため、目的物質の分離および精製の後に、これら塩、有
機溶媒、ｐＨ等を除去する操作段階を経なければなら
ず、このような操作段階が多いことから、最終的な物質
の活性および回収率が低くなる。
【０００４】目的物質溶出において、塩、有機溶媒、ｐ
Ｈなどのような化学的手法による溶出は、溶離液中に
塩、有機溶媒、ｐＨなどのような化学物質を使うことに
より、上記のような失活、回収率の低下などの問題が起
こる。しかし、このような化学的手法による溶出ではな
く熱、光、磁石などの物理的変化が目的物質の溶離に対
して影響を与えられるような環境をつくることができれ
ば、物理的手法による目的物質の溶出が可能となり、失
活、回収率の低下などの問題の解決になることが期待で
きる。
Ｈなどのような化学的手法による溶出は、溶離液中に
塩、有機溶媒、ｐＨなどのような化学物質を使うことに
より、上記のような失活、回収率の低下などの問題が起
こる。しかし、このような化学的手法による溶出ではな
く熱、光、磁石などの物理的変化が目的物質の溶離に対
して影響を与えられるような環境をつくることができれ
ば、物理的手法による目的物質の溶出が可能となり、失
活、回収率の低下などの問題の解決になることが期待で
きる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者ら
は、上記の問題に対して解決すべく、物理的手法による
目的物質の溶出について検討および開発を行った。その
結果、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）に目的
物質と相互作用する分子（リガンド分子）を結合させる
ことで、刺激応答性高分子とリガンド分子の複合体を合
成し、この複合体を用いて物理的刺激によりリガンド分
子と目的物質との相互作用が変化する分離材が得られる
ことを見いだし、かかる知見に基づき本発明を完成し
た。
は、上記の問題に対して解決すべく、物理的手法による
目的物質の溶出について検討および開発を行った。その
結果、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）に目的
物質と相互作用する分子（リガンド分子）を結合させる
ことで、刺激応答性高分子とリガンド分子の複合体を合
成し、この複合体を用いて物理的刺激によりリガンド分
子と目的物質との相互作用が変化する分離材が得られる
ことを見いだし、かかる知見に基づき本発明を完成し
た。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は刺激応答性高分
子と目的物質と相互作用する分子の複合体が物理的刺激
により、刺激応答性高分子の物理的、化学的変化を起こ
し、目的物質と相互作用する分子と目的物質の相互作用
の環境を物理的、化学的に変化させ分離することを特徴
とする物質の分離方法に関する。また、本発明は刺激応
答性高分子と目的物質と相互作用する分子との複合体を
化学修飾したクロマトグラフィー用充填剤の固定相に目
的物質を保持させた後、外部温度を段階的に変化させる
ことにより複合体中の目的物質と相互作用する分子と目
的物質との相互作用を変化させ、同一の移動相を通過さ
せることによって物質を分離することを特徴とする物質
の分離方法に関する。さらに、本発明は、物質の持つ分
子認識能を物理的刺激によって変化させることが可能で
ある分離材料（例えば、クロマトグラフィー用充填材）
に関する。
子と目的物質と相互作用する分子の複合体が物理的刺激
により、刺激応答性高分子の物理的、化学的変化を起こ
し、目的物質と相互作用する分子と目的物質の相互作用
の環境を物理的、化学的に変化させ分離することを特徴
とする物質の分離方法に関する。また、本発明は刺激応
答性高分子と目的物質と相互作用する分子との複合体を
化学修飾したクロマトグラフィー用充填剤の固定相に目
的物質を保持させた後、外部温度を段階的に変化させる
ことにより複合体中の目的物質と相互作用する分子と目
的物質との相互作用を変化させ、同一の移動相を通過さ
せることによって物質を分離することを特徴とする物質
の分離方法に関する。さらに、本発明は、物質の持つ分
子認識能を物理的刺激によって変化させることが可能で
ある分離材料（例えば、クロマトグラフィー用充填材）
に関する。
【０００７】本発明の方法における物理的刺激とは、例
えば温度である。温度変化により、目的物質と相互作用
する分子の分子認識能を変化させることは、例えば熱応
答性高分子との複合化により達成される。例えば、複合
体末端にアミノ基、カルボキシル基、水酸基等を有する
ポリアルキルアミドあるいはその共重合体で化学修飾し
たクロマトグラフィー充填材が挙げられる。化学修飾し
た担体とは例えば、シリカ担体などが挙げられる。
えば温度である。温度変化により、目的物質と相互作用
する分子の分子認識能を変化させることは、例えば熱応
答性高分子との複合化により達成される。例えば、複合
体末端にアミノ基、カルボキシル基、水酸基等を有する
ポリアルキルアミドあるいはその共重合体で化学修飾し
たクロマトグラフィー充填材が挙げられる。化学修飾し
た担体とは例えば、シリカ担体などが挙げられる。
【０００８】温度応答性高分子の基本構成単位として
は、例えば、（メタ）Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ド、（メタ）Ｎ−アクリロイルピペリジン、（メタ）Ｎ
−プロピルアクリルアミド、（メタ）Ｎ、Ｎ−ジエチル
アクリルアミド、（メタ）Ｎ−シクロプロピルアクリル
アミド、（メタ）Ｎ−アクリロイルピロリジン、（メ
タ）Ｎ、Ｎーエチルメチルアクリルアミド、（メタ）Ｎ
−エチルアクリルアミドをはじめとする（メタ）Ｎ−ア
ルキルアクリルアミドのホモポリマーとこれらの共重合
体、また目的物質と相互作用する分子と化学的に複合化
させるためにカルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシス
クシイミド基、チオール基、イミノ基、エポキシ基等の
官能基を含むモノマーとの共重合体が挙げられる。
は、例えば、（メタ）Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ド、（メタ）Ｎ−アクリロイルピペリジン、（メタ）Ｎ
−プロピルアクリルアミド、（メタ）Ｎ、Ｎ−ジエチル
アクリルアミド、（メタ）Ｎ−シクロプロピルアクリル
アミド、（メタ）Ｎ−アクリロイルピロリジン、（メ
タ）Ｎ、Ｎーエチルメチルアクリルアミド、（メタ）Ｎ
−エチルアクリルアミドをはじめとする（メタ）Ｎ−ア
ルキルアクリルアミドのホモポリマーとこれらの共重合
体、また目的物質と相互作用する分子と化学的に複合化
させるためにカルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシス
クシイミド基、チオール基、イミノ基、エポキシ基等の
官能基を含むモノマーとの共重合体が挙げられる。
【０００９】本発明の方法において使用するポリアルキ
ルアクリルアミドとしては、例えばポリ−（Ｎ−イソプ
ロピルアクリルアミド）−色素複合体が挙げられる。目
的物質および目的物質と相互作用する分子とは、アミノ
酸、糖、核酸などからなる生体成分や分子量が１０００
以下の有機化合物などが挙げられる。刺激応答性高分子
と化学的に複合化させるリガンド分子の量は任意に制御
を行うことができるが、複合体中の構成中の０．１％〜
５０％が望ましい。また、目的物質と相互作用する分子
の複合化する量により、刺激応答性高分子の物理的、化
学的性質を変化させることができる。例えばポリ−（Ｎ
−イソプロピルアクリルアミド）の場合、ホモポリマー
では３２℃付近に下限臨界温度を有するが、目的物質と
相互作用する分子の複合化量によりこれを制御できる。
ルアクリルアミドとしては、例えばポリ−（Ｎ−イソプ
ロピルアクリルアミド）−色素複合体が挙げられる。目
的物質および目的物質と相互作用する分子とは、アミノ
酸、糖、核酸などからなる生体成分や分子量が１０００
以下の有機化合物などが挙げられる。刺激応答性高分子
と化学的に複合化させるリガンド分子の量は任意に制御
を行うことができるが、複合体中の構成中の０．１％〜
５０％が望ましい。また、目的物質と相互作用する分子
の複合化する量により、刺激応答性高分子の物理的、化
学的性質を変化させることができる。例えばポリ−（Ｎ
−イソプロピルアクリルアミド）の場合、ホモポリマー
では３２℃付近に下限臨界温度を有するが、目的物質と
相互作用する分子の複合化量によりこれを制御できる。
【００１０】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれによって何ら限定されるもので
はない。
明するが、本発明はこれによって何ら限定されるもので
はない。
【００１１】
【実施例１】目的物質として牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を用いて、目的物質と相互作用する分子としてチバ
クロンブルー分子（ＣＢ）を熱応答性高分子と複合化さ
せて、温度刺激による目的物質との相互作用の変化をク
ロマトグラム的手法により評価を行い、温度変化により
相互作用が変化し、ＢＳＡがＣＢ分子から解離すること
を確認した。 １．ポリマーの合成 １−１−ａ）カルボキシル基末端を有するポリ（ＩＰＡ
Ａｍ−ｃｏ−ＡＳＩ（Ｎ−アクリキシスクシイミド））
合成 Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１５ｇ、官能基を有す
るモノマーとしてＮ−アクリロキシスクシイミド１．２
４ｇ、連鎖移動剤としてメルカプトプロピオン酸（ＭＰ
Ａ）０．２８ｇ、重合開始剤として２，２−アゾビス
（イソブチルニトリル）（ＡＩＢＮ）８２ｍｇ、溶媒と
してテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５００ｍ１を重合管
にいれ、コックを閉じた状態で重合管を液体窒素中にい
れ完全に凍結させ、次にコックを開いて真空ポンプを用
いて脱気した。次にコックを再び閉じてプロパノール中
に反応溶液の入った重合管を入れて、重合管内のサンプ
ルを完全に溶解させた。この操作を３回繰り返した（凍
結融解脱気法）。このように、十分脱気したサンプルで
減圧状態になっている重合管を７ ０℃の振とう恒温漕
に入れ、２時間、ラジカル重合反応させて片末端にカル
ボキシル基を持つコポリマーを合成した。反応後、反応
溶液を氷冷したジエチルエーテル中に滴下し、コポリマ
ーを再沈殿させてポリマーを得た。得られたポリマーを
濾取し、常温一晩減圧乾燥を行い、これをＴＨＦ溶媒に
溶かし再びジエチルエーテル中で精製を行った。得られ
たポリマーを濾取し、ゲル濾過カラムにかけて目的のポ
リマーを分取し、凍結乾燥後、ＴＨＦ溶媒に溶かし、再
び再沈殿を行い、得られたポリマーを濾取し、常温で一
晩減圧乾燥を行い目的のポリマーを得た。
Ａ）を用いて、目的物質と相互作用する分子としてチバ
クロンブルー分子（ＣＢ）を熱応答性高分子と複合化さ
せて、温度刺激による目的物質との相互作用の変化をク
ロマトグラム的手法により評価を行い、温度変化により
相互作用が変化し、ＢＳＡがＣＢ分子から解離すること
を確認した。 １．ポリマーの合成 １−１−ａ）カルボキシル基末端を有するポリ（ＩＰＡ
Ａｍ−ｃｏ−ＡＳＩ（Ｎ−アクリキシスクシイミド））
合成 Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１５ｇ、官能基を有す
るモノマーとしてＮ−アクリロキシスクシイミド１．２
４ｇ、連鎖移動剤としてメルカプトプロピオン酸（ＭＰ
Ａ）０．２８ｇ、重合開始剤として２，２−アゾビス
（イソブチルニトリル）（ＡＩＢＮ）８２ｍｇ、溶媒と
してテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５００ｍ１を重合管
にいれ、コックを閉じた状態で重合管を液体窒素中にい
れ完全に凍結させ、次にコックを開いて真空ポンプを用
いて脱気した。次にコックを再び閉じてプロパノール中
に反応溶液の入った重合管を入れて、重合管内のサンプ
ルを完全に溶解させた。この操作を３回繰り返した（凍
結融解脱気法）。このように、十分脱気したサンプルで
減圧状態になっている重合管を７ ０℃の振とう恒温漕
に入れ、２時間、ラジカル重合反応させて片末端にカル
ボキシル基を持つコポリマーを合成した。反応後、反応
溶液を氷冷したジエチルエーテル中に滴下し、コポリマ
ーを再沈殿させてポリマーを得た。得られたポリマーを
濾取し、常温一晩減圧乾燥を行い、これをＴＨＦ溶媒に
溶かし再びジエチルエーテル中で精製を行った。得られ
たポリマーを濾取し、ゲル濾過カラムにかけて目的のポ
リマーを分取し、凍結乾燥後、ＴＨＦ溶媒に溶かし、再
び再沈殿を行い、得られたポリマーを濾取し、常温で一
晩減圧乾燥を行い目的のポリマーを得た。
【００１２】１−１−ｂ）カルボキシル基末端を有する
ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ一ＡＳＩ（Ｎ−アクリロキシス
クシイミド））へのアミノヘキシルチバクロンブルー
（ＡｍＣＢ）の複合化 合成したコポリマー５．０ｇとアミノヘキシルチバクロ
ンブルー０．４３ｇをピリジン１００ｍｌ中に溶解させ
て室温で２４時間撹拌を行い、イソプロピルアミン２ｍ
ｌを添加し、さらに２４時間撹拌を行いアミノヘキシル
チバクロンブルーをコポリマーと複合化させた。撹拌終
了後、ロータリーエバボレーターで溶媒を除去し、凍結
乾燥により複合体を乾燥させた。乾燥後、これを精製水
に溶解させてゲルろ過法により目的の複合体を分取し、
これを凍結乾燥させて目的のポリマーを得た。
ポリ（ＩＰＡＡｍ−ｃｏ一ＡＳＩ（Ｎ−アクリロキシス
クシイミド））へのアミノヘキシルチバクロンブルー
（ＡｍＣＢ）の複合化 合成したコポリマー５．０ｇとアミノヘキシルチバクロ
ンブルー０．４３ｇをピリジン１００ｍｌ中に溶解させ
て室温で２４時間撹拌を行い、イソプロピルアミン２ｍ
ｌを添加し、さらに２４時間撹拌を行いアミノヘキシル
チバクロンブルーをコポリマーと複合化させた。撹拌終
了後、ロータリーエバボレーターで溶媒を除去し、凍結
乾燥により複合体を乾燥させた。乾燥後、これを精製水
に溶解させてゲルろ過法により目的の複合体を分取し、
これを凍結乾燥させて目的のポリマーを得た。
【００１３】１−１−ｃ）カルボキシル基末端をポリ
（ＩＰＡＡｍ一ｃｏ−ＡＳＩ（Ｎ−アクリキシスクシイ
ミド））−アミノヘキシルチバクロンブルー複合体（ｐ
（ＮＩＰＡＡｍ−ＡｍＣＢ）のカルボキシル基末端の活
性エステル（スクシニル）化 合成したコポリマー３ｇに対してＮ，Ｎ−ジシクロヘキ
シルカルボジイミド０．５ｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシイ
ミド０．５ｇを３００ｍ１のナス型フラスコに入れＴＨ
Ｆ１００ｍｌに溶解させ、室温で４８時間撹拌を行っ
た。撹拌中に副生成物としてジシクロヘキシル尿素が析
出するので、これをろ過により取り除き、最後にジエチ
ルエーテル中で再沈殿させ、片末端をスクシニル化した
ｐ（ＮＩＰＡＡｍ）−ＡｍＣＢ複合体を得た。
（ＩＰＡＡｍ一ｃｏ−ＡＳＩ（Ｎ−アクリキシスクシイ
ミド））−アミノヘキシルチバクロンブルー複合体（ｐ
（ＮＩＰＡＡｍ−ＡｍＣＢ）のカルボキシル基末端の活
性エステル（スクシニル）化 合成したコポリマー３ｇに対してＮ，Ｎ−ジシクロヘキ
シルカルボジイミド０．５ｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシイ
ミド０．５ｇを３００ｍ１のナス型フラスコに入れＴＨ
Ｆ１００ｍｌに溶解させ、室温で４８時間撹拌を行っ
た。撹拌中に副生成物としてジシクロヘキシル尿素が析
出するので、これをろ過により取り除き、最後にジエチ
ルエーテル中で再沈殿させ、片末端をスクシニル化した
ｐ（ＮＩＰＡＡｍ）−ＡｍＣＢ複合体を得た。
【００１４】１−１−ｄ）担体への導入（１） スクシニル化したｐ（ＮＩＰＡＡｍ）−ＡｍＣＢ複合体
１．０ｇを１，４−ジオキサン１００ｍｌに溶解させ、
室温でアミノプロピルシリカゲル上に固定化した。２４
時間の撹拌の後に、あらたなスクシニル化したｐ（ＮＩ
ＰＡＡｍ）−ＡｍＣＢ複合体１．０ｇを再び１，４ージ
オキサン１００ｍｌに溶かし２４時間反応させた。この
操作をもう一度繰り返し、最後に濾取したものを、ジメ
チルホルムアミド、メタノールなどの有機溶媒や６６．
７ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍＭ〜５００ｍＭ ＮａＣ
ｌを含む）で十分洗浄し、目的とする充填材を得た。
１．０ｇを１，４−ジオキサン１００ｍｌに溶解させ、
室温でアミノプロピルシリカゲル上に固定化した。２４
時間の撹拌の後に、あらたなスクシニル化したｐ（ＮＩ
ＰＡＡｍ）−ＡｍＣＢ複合体１．０ｇを再び１，４ージ
オキサン１００ｍｌに溶かし２４時間反応させた。この
操作をもう一度繰り返し、最後に濾取したものを、ジメ
チルホルムアミド、メタノールなどの有機溶媒や６６．
７ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍＭ〜５００ｍＭ ＮａＣ
ｌを含む）で十分洗浄し、目的とする充填材を得た。
【００１５】１−１−ｅ）担体への導入（２） 片末端をカルボキシル基化したコポリマー０．６５ｇに
対して、Ｎ−エトシキカルボニル−２−エトキシ−１，
２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）３０ｍｇ、アミノプ
ロピルシリ力０．８ｇ、ＴＨＦ１００ｍｌを加え、３０
分のＮ２置換の操作の後に室温で一晩、撹拌を行った。
撹拌終了後、シリカ粒子を濾取し、同様に、片末端をカ
ルボキシル基化したコポリマー０．６ｇ、Ｎ−エトシキ
カルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン
（ＥＥＤＱ）３０ｍｇ、ＴＨＦ１００ｍｌを加え、３０
分のＮ２置換の操作の後に室温で一晩、撹拌を行った。
撹拌終了後、シリカ粒子を濾取し、ジメチルホルムアミ
ド、メタノールなどの有機溶媒や６６．７ｍＭリン酸緩
衝液（１００ｍＭ〜５００ｍＭ ＮａＣ１を含む）で十
分に洗浄し、これをｐ（ＮＩＰＡＡｍ）−ＡｍＣＢ複合
体を固定化したシリカカラム充填剤とした。
対して、Ｎ−エトシキカルボニル−２−エトキシ−１，
２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）３０ｍｇ、アミノプ
ロピルシリ力０．８ｇ、ＴＨＦ１００ｍｌを加え、３０
分のＮ２置換の操作の後に室温で一晩、撹拌を行った。
撹拌終了後、シリカ粒子を濾取し、同様に、片末端をカ
ルボキシル基化したコポリマー０．６ｇ、Ｎ−エトシキ
カルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン
（ＥＥＤＱ）３０ｍｇ、ＴＨＦ１００ｍｌを加え、３０
分のＮ２置換の操作の後に室温で一晩、撹拌を行った。
撹拌終了後、シリカ粒子を濾取し、ジメチルホルムアミ
ド、メタノールなどの有機溶媒や６６．７ｍＭリン酸緩
衝液（１００ｍＭ〜５００ｍＭ ＮａＣ１を含む）で十
分に洗浄し、これをｐ（ＮＩＰＡＡｍ）−ＡｍＣＢ複合
体を固定化したシリカカラム充填剤とした。
【００１６】２．カラム充填 ｐ（ＮＩＰＡＡｍ）一ＡｍＣＢ複合体を固定化したシリ
カ０．６ｇをメタノール：２−プロパノール：水＝１：
１：１の体積比で調製した充填溶媒に分散させて、カラ
ム充填用パッカーに入れた。最初の２５ｍｌは１００ｋ
ｇ／ｃｍ2で充填を行い、その後は４００ｋｇ／ｃｍ2で
ステンレスカラム（４．６×３０ｍｍ）に充填を行っ
た。
カ０．６ｇをメタノール：２−プロパノール：水＝１：
１：１の体積比で調製した充填溶媒に分散させて、カラ
ム充填用パッカーに入れた。最初の２５ｍｌは１００ｋ
ｇ／ｃｍ2で充填を行い、その後は４００ｋｇ／ｃｍ2で
ステンレスカラム（４．６×３０ｍｍ）に充填を行っ
た。
【００１７】３．試料調製 ２−１）牛血清アルブミン（ＢＳＡ）サンプルの調製 ＢＳＡを６６．７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶
かし、濃度を７．６０ｍｇ／ｍｌに調製した。
かし、濃度を７．６０ｍｇ／ｍｌに調製した。
【００１８】４．ＨＰＬＣ測定条件 カラム：ｐ（ＮＩＰＡＡｍ）一ＡｍＣＢ 移動相：６６．７ｍＭリン緩衝液（ｐＨ７．０） 流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ 温度条件：４０℃〜２℃ 測定波長：２８０ｎｍ
【００１９】５．結果 図１にｐ（ＮＩＰＡＡｍ）−ＡｍＣＢカラムにＢＳＡ溶
液（７．６ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌインジェクシヨンし
たときの典型的なクロマトグラムを示す。インジェクシ
ヨン後、５０分に４０℃から２℃へ温度を低下させた。
また、温度が２℃に平衡化させるために２０ 分間は送
液を停止した後、初期の流速０．２ｍｌ／ｍｉｎ にも
どした。７１．２５分に溶出ピークは見られ、マイクロ
ＢＣＡタンパク質アッセイ法により褐色を示し、ゲルろ
過クロマトグラフィーの分析の結果から分子量がＢＳＡ
のそれと同じものを示すことからＢＳＡの溶出ピークで
あることを確認した。また、ｐ（ＮＩＰＡＡｍ）のみを
固定化したシリカカラムを用いて、ｐ（ＮＩＰＡＡｍ）
−ＡｍＣＢカラムを用いたときと同様な実験を行った
が、図２に示すようにＢＳＡは吸着せず、素通りした。
また、７０．９分のピークはマイクロＢＣＡタンパク質
アッセイ法によりＢＳＡではないことを確認し、またＢ
ＳＡを含まないコントロールのサンプルの場合にも認め
られたことから、不純物によるピークと思われた。これ
らの結果から温度刺激による目的物質と目的物質と相互
作用する分子との相互作用が温度のような物理的刺激に
より制御できることが確認された。
液（７．６ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌインジェクシヨンし
たときの典型的なクロマトグラムを示す。インジェクシ
ヨン後、５０分に４０℃から２℃へ温度を低下させた。
また、温度が２℃に平衡化させるために２０ 分間は送
液を停止した後、初期の流速０．２ｍｌ／ｍｉｎ にも
どした。７１．２５分に溶出ピークは見られ、マイクロ
ＢＣＡタンパク質アッセイ法により褐色を示し、ゲルろ
過クロマトグラフィーの分析の結果から分子量がＢＳＡ
のそれと同じものを示すことからＢＳＡの溶出ピークで
あることを確認した。また、ｐ（ＮＩＰＡＡｍ）のみを
固定化したシリカカラムを用いて、ｐ（ＮＩＰＡＡｍ）
−ＡｍＣＢカラムを用いたときと同様な実験を行った
が、図２に示すようにＢＳＡは吸着せず、素通りした。
また、７０．９分のピークはマイクロＢＣＡタンパク質
アッセイ法によりＢＳＡではないことを確認し、またＢ
ＳＡを含まないコントロールのサンプルの場合にも認め
られたことから、不純物によるピークと思われた。これ
らの結果から温度刺激による目的物質と目的物質と相互
作用する分子との相互作用が温度のような物理的刺激に
より制御できることが確認された。
【００２０】
【発明の効果】本発明における分離材料による分離方法
は、下記の利点を有する。 １）従来のクロマトグラフィーで用いられている化学的
な溶出方法に比べ、過酷な化学的条件を用いないので有
用な生体高分子の回収率が高い。 ２）また、物理的刺激による相互作用の変化により、本
来起こるべき目的分子との相互作用とは異なる相互作用
をおこすことができる。 ３）従来のアフィニティー担体ではカラムから溶出した
サンプルに対して脱塩操作、ｐＨ調製などの操作を必要
としたが、本分離材においてはこのような操作を必要と
しない。 ４）充填剤の再生が従来のアフィニティー担体と比べて
速やかに行うことができる。
は、下記の利点を有する。 １）従来のクロマトグラフィーで用いられている化学的
な溶出方法に比べ、過酷な化学的条件を用いないので有
用な生体高分子の回収率が高い。 ２）また、物理的刺激による相互作用の変化により、本
来起こるべき目的分子との相互作用とは異なる相互作用
をおこすことができる。 ３）従来のアフィニティー担体ではカラムから溶出した
サンプルに対して脱塩操作、ｐＨ調製などの操作を必要
としたが、本分離材においてはこのような操作を必要と
しない。 ４）充填剤の再生が従来のアフィニティー担体と比べて
速やかに行うことができる。
【図１】ｐ（ＮＩＰＡＡｍ）−ＡｍＣＢカラムから、Ｃ
Ｂ分子に保持されたＢＳＡ分子が温度変化により溶出す
る示すクロマトグラムである。
Ｂ分子に保持されたＢＳＡ分子が温度変化により溶出す
る示すクロマトグラムである。
【図２】ｐ（ＮＩＰＡＡｍ）カラムを用いたコントロー
ルのクロマトグラムである。
ルのクロマトグラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 秋山 義勝 東京都品川区戸越１丁目15番18号 (72)発明者 吉廻 公博 東京都台東区三ノ輪１丁目18番９号 203 号 (72)発明者 上野 勝彦 茨城県つくば市広岡670−50 Ｆターム(参考） 4G066 AA22C AC17A AC17B AC33A AC33B AD10A AD10B AD15A AD15B AE20B CA54 DA20 EA01 EA02 4J002 AB002 AD032 BG121 GB00 GD00
Claims (9)
- 【請求項１】充填材表面が物理的刺激により化学的、物
理的な環境変化を起こすことで、標的物質との相互作用
を持つ物質の標的物質に対する相互作用を、水溶液中で
可逆的に変化させ分離することを特徴とする分離方法。 - 【請求項２】物理的刺激が温度変化である請求項１の分
離方法。 - 【請求項３】刺激応答性高分子と標的物質に対して特異
的に相互作用する物質を含み、刺激応答材料高分子が物
理的刺激により構造変化を起こすことで、標的物質に対
して特異的に相互作用する物質の相互作用が化学的もし
くは物理的環境の変化を受け、標的物質との相互作用力
が物理的刺激により可逆的に変化する複合化材料を有す
る充填材を用いる請求項１の分離方法。 - 【請求項４】充填材が、担体表面に刺激応答性高分子と
標的物質に対して特異的に相互作用する物質との複合材
料で化学修飾したクロマトグラフィー用充填材である請
求項１の分離方法。 - 【請求項５】刺激応答性高分子が末端にアミノ基、カル
ボキシル基等の官能基を有するポリアルキルアクリルア
ミド或いはその共重合体である請求項３または請求項４
の標的物質の分離方法。 - 【請求項６】移動相が水である請求項５の標的物質の分
離方法 - 【請求項７】刺激応答性高分子の物理的、化学的性質を
目的物質と目的物質との相互作用する分子との複合化量
により制御する請求項１の分離方法 - 【請求項８】刺激応答性高分子と標的物質に対して特異
的に相互作用する物質を含み、刺激応答材料高分子が物
理的刺激により構造変化を起こすことで、標的物質に対
して特異的に相互作用する物質の相互作用が化学的もし
くは物理的環境の変化を受け、標的物質との相互作用力
が物理的刺激により可逆的に変化する複合化材料を含む
分離材料。 - 【請求項９】物理的刺激が温度変化である請求項８の分
離材料。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10320931A JP2000140632A (ja) | 1998-11-11 | 1998-11-11 | 刺激応答性高分子を用いた分離材料および該分離材料を用いた分離方法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10320931A JP2000140632A (ja) | 1998-11-11 | 1998-11-11 | 刺激応答性高分子を用いた分離材料および該分離材料を用いた分離方法 |
| US09/532,285 US6641735B1 (en) | 2000-03-23 | 2000-03-23 | Separatory material with the use of stimulus-responsive polymer and separation method by using the separatory material |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000140632A true JP2000140632A (ja) | 2000-05-23 |
Family
ID=31189799
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10320931A Pending JP2000140632A (ja) | 1998-11-11 | 1998-11-11 | 刺激応答性高分子を用いた分離材料および該分離材料を用いた分離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000140632A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001074482A1 (fr) * | 2000-04-05 | 2001-10-11 | Japan Chemical Innovation Institute | Nouveau materiau utilise pour la separation et procede de separation |
| WO2002030564A1 (en) * | 2000-10-13 | 2002-04-18 | Amersham Biosciences K.K. | Stimulus responsive affinity chromatographic material and separation/purification method |
| CN114849606A (zh) * | 2022-03-31 | 2022-08-05 | 中国科学院兰州化学物理研究所 | 凝胶型液相色谱填料的制备及利用其检测减水剂复配液中葡萄糖酸钠、糖稀和白糖的方法 |
-
1998
- 1998-11-11 JP JP10320931A patent/JP2000140632A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001074482A1 (fr) * | 2000-04-05 | 2001-10-11 | Japan Chemical Innovation Institute | Nouveau materiau utilise pour la separation et procede de separation |
| WO2002030564A1 (en) * | 2000-10-13 | 2002-04-18 | Amersham Biosciences K.K. | Stimulus responsive affinity chromatographic material and separation/purification method |
| US7012136B2 (en) | 2000-10-13 | 2006-03-14 | Amersham Biosciences Kk | Stimulus responsive affinity chromatographic material and separation/purification method |
| US7355020B2 (en) | 2000-10-13 | 2008-04-08 | Ge Healthcare Bio-Sciences Kk | Stimulus responsive affinity chromatographic material and separation/purification method |
| CN114849606A (zh) * | 2022-03-31 | 2022-08-05 | 中国科学院兰州化学物理研究所 | 凝胶型液相色谱填料的制备及利用其检测减水剂复配液中葡萄糖酸钠、糖稀和白糖的方法 |
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