JP3722842B2 - Pth−アミノ酸の分離方法 - Google Patents
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Description
本発明は、水系で固定相表面の親水性/疎水性のバランスを外的信号(例えば、温度)によって変化させてPTH−アミノ酸(アミノ酸の3−フェニル−2−チオヒダントイン誘導体)をクロマトグラフィーにより分離するPTH−アミノ酸の新規な分離方法に関する。
背景技術
蛋白質やペプチドなどのアミノ酸配列の決定はEdman分解法により、アミノ酸末端から逐次アミノ酸残基をアニリノチアゾリノンとして遊離させ、酸性下で、安定なフェニルチオヒダントイン誘導体(PTH−アミノ酸)に変換して同定される。同定には逆相カラムを用いた液体クロマトグラフィーが一般的に用いられている。蛋白質を構成する20種のアミノ酸はこの逆相カラムにより、一回の分析によりすべて分離され、比較的高感度に、1時間以内に分析が可能である。
種々の逆相系のカラムが市販されているが、固定相に多孔性のシリカゲルが用いられており、これにオクタデシルシラン基やフェニル基が化学結合により固定化され、シリカ担体表面が疎水性になっている。この逆相表面での各PTH−アミノ酸の疎水性度の違いにより分離される。クロマトグラフィー溶離液には緩衝液と水と自由に混合可能な有機溶媒の混合液が用いられている。
PTH−アミノ酸の溶出には移動相中の有機溶媒の濃度を連続的に増加させて溶出する方法と一定濃度で分離する方法がある。いずれにしても、溶出溶媒の疎水性や親水性を変化させて溶出させる。緩衝液としては、酢酸ナトリウム系や酢酸アンモニウム系が主に用いられている。有機溶媒としては、アセトニトリルやメタノールが主に用いられている。様々な分離条件、例えば、溶出液の流速、イオン強度、pHやカラム温度などにより分離能が大きく変化する。市販のカラムの種類により異なるが、一般的に高温での分離によって良好な結果が得られる。分離したPTH−アミノ酸はUV検出器により、254nmや268nmなどの波長で検出し、標準のPTH−アミノ酸の溶出時間と比較し同定される。
しかし、従来の移動相に用いられている有機溶媒や緩衝液は溶出液に夾雑物として含まれ、それらのUV吸収が非常に強くなるために、ベースラインの安定化や感度が著しく低下する欠点があった。また、連続して分析を行う前にカラムを洗浄し、初期の溶出液で平衡化する必要があるため、分析時間が長くなるという欠点もあった。しかも、このような有機溶媒や緩衝液は環境汚染を引き起こす虞れがある。したがって、これらの物質を用いない分離方法の確立が必要となってきている。
かかる問題点を解決するために、水系で生体要素(蛋白質、DNA、糖、脂質等)および細胞を固体表面との相互作用を外的信号(例えば、温度)によって制御し、分離あるいは精製することができるクロマトグラフィー用充填剤を使用したクロマトグラフィー方法が提案されている(特開平7−318551号公報参照)。この方法によれば、移動相に有機溶媒や緩衝液を使用することなく、移動相を水系に固定したままで温度変化による固定相の表面特性の制御によって生体要素や細胞の分離精製が可能となる。このため、単一の水系の移動相によって蛋白質や細胞などの生体要素の機能を維持したままで分離・回収が可能となり夾雑物の混入を防止できる。
しかしながら、特開平7−318551号公報に記載された方法で分離・精製が可能な溶質は生理活性を有する蛋白質や細胞などで、具体的には牛血清アルブミン、IgG、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、トランスフェリン、血液凝固因子等が開示されている(例えば、同公報第5頁第7欄第5行〜第10行)のみであり、その他の物質については全く教示されていない。
発明の開示
本発明者らは、PTH−アミノ酸の短時間かつ高感度分析を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、特開平7−318551号公報に記載された方法では遊離アミノ酸を分析することは不可能であるにも拘わらず、PTH−アミノ酸を分析することが可能であるという当業者にとっても予期しえない事実を発見し、この知見に基づいて本発明を完成した。
本発明は、移動相を水系に固定したままで、固定相表面の親水性/疎水性のバランスを外的信号によって変化させることが可能である充填剤を用いてPTH−アミノ酸のクロマトグラフィーによる分離を行うことを特徴とするPTH−アミノ酸の分離方法を提供する。
また本発明は、アミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基等を有するポリアルキルアクリルアミド或いはその共重合体で化学修飾したクロマトグラフィー用充填剤よりなる固定相にPTH−アミノ酸を保持させた後、外部温度を段階的に変化させる温度グラディエント法により固定相表面の親水性/疎水性のバランスを変化させ、同一の移動相を通過させることによってPTH−アミノ酸を分離することを特徴とするPTH−アミノ酸の分離方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図1は、実施例1に記載された分離方法により得られた17種類のPTH−アミノ酸の分析結果を示すチャートである。
図2は、実施例3に記載された分離方法により得られた14種類のPTH−アミノ酸の分析結果を示すチャートである。
図3は、実施例4において使用した20種類のPTH−アミノ酸のうち10種類のPTH−アミノ酸の温度と保持時間の関係を示すグラフである。
図4は、図3に記載されていない残りの10種類のPTH−アミノ酸の温度と保持時間の関係を示すグラフである。
図5は、実施例5に記載された分離方法により得られた6種類のPTH−アミノ酸の分析結果を示すチャートである。
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法によって分離するPTH−アミノ酸の種類は何ら限定されることなく、PTH−アミノ酸であればいかなるPTH−アミノ酸であってもよい。
本発明の方法において水系とは、水のみ、あるいは無機塩類を含む水溶液であって、有機溶媒を含まないものを意味する。また、この場合、水とは蒸留水もしくは脱イオン水、あるいは両者を表わす。
本発明の方法において用いる外的信号とは、例えば、温度変化である。温度変化によって固定相表面の親水性/疎水性のバランスを変化させることは、例えば、クロマトグラフィー用充填剤の担体表面に温度応答性高分子を導入することによって達成される。このような充填剤として、例えば、担体表面を末端にアミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基等を有するポリアルキルアクリルアミド或いはその共重合体で化学修飾したクロマトグラフィー用充填剤を挙げられる。この化学修飾した充填剤の例としては、表面にアミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基等の官能基を有するシリカ担体に前記のポリアルキルアクリルアミド或いはその共重合体を化学修飾したものを挙げることができる。アミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基等の官能基を有するシリカ担体の具体例としては、アミノプロピルシリカゲル、アミノセファデックス、イオン交換樹脂等がある。
本発明の方法において使用するポリアルキルアクリルアミドとしては、下記の式に示すポリ−(N−イソプロピルアクリルアミド)、ポリジエチルアクリルアミドおよびポリアクリロイルピロリジンのいずれか一種、或いはこれらのポリマーの構成単位とアルキルアクリレート若しくはアルキルメタクリレートとの共重合体が好ましい。
ポリ−(N−イソプロピルアクリルアミド)(PIPAAm)は32℃に下限臨界温度を有するので、該分子で化学修飾した担体はこの臨界温度で親水/疎水に表面物性が変化するため、これをクロマトグラフィーの充填剤の表面にグラフもしくはコーティングして使用した場合、試料に対する保持力が温度によって変化するため溶出液の組成を変化させずに保持挙動を温度によってコントロールすることが可能である。下限臨界温度を32℃以上にするためには、イソプロピルアクリルアミドよりも親水性のモノマーであるアクリルアミド、メタアクリル酸、アクリル酸、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドンなどをN−イソプロピルアクリルアミドと共重合させることによって調整することが可能である。また、下限臨界温度を32℃以下にしたいときは、疎水性モノマーであるスチレン、アルキルメタクリレート、アルキルアクリレートなどとの共重合によって調整することができる。
また、ポリジエチルアクリルアミドの下限臨界温度は、約30℃〜32℃であり、この温度を境として親水/疎水に表面物性が変化し、前述のポリ−(N−イソプロピルアクリルアミド)の場合と同様に、試料に対する保持力を温度によって調整することができる。本発明で利用される新規なクロマトグラフィー用担体は、化学修飾或いは高分子のコーティングによって作製される。化学修飾手段としては表面グラフト法とラジカル重合の2つの方法を用いることができる。またコーティング方法としては、適用温度範囲内で不溶とした後、不溶なものをコーティングする。
上記したように、温度応答性高分子を担体へ導入するための化学修飾法は表面グラフト法とラジカル重合法を用いることができる。表面グラフト法は一定の大きさの温度応答性高分子を始めに合成して、担体に接合する方法であるのに対して、ラジカル重合法では担体表面上でモノマーから重合させ高分子を構築する方法である。表面グラフト法に比較し、担体表面に密に温度応答性高分子を導入することが可能である。担体表面の疎水性度を増大させ、保持時間をコントロールしやすくなる。また、担体表面でのシリカゲルとの相互作用による非特異的吸着を抑えることができる。
実施例
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。
[実施例1]
ポリマーの合成
カルボキシル末端基を持つIPAAmコポリマーを分子量4000を目安として合成した。ここでコポリマーの分子量は、連鎖移動剤である3−メルカプトプロピオン酸(MPA)の量によって設定することができる。文献値より分子量4000のコポリマーを合成するには、モル比で、MPA/(IPAAm+RMA)=0.028となるようにMPAの量を調製した。
精製モノマー(IPAAm:25.0g)
疎水性モノマー(IPAAmに対しモル比で1%BMA;0.313g、3%BMA;0.972g、5%BMA;1.653g、1%HMA;0.38g)
ラジカル開始剤(AIBN;0.145g)
連鎖移動剤(MPA,1%BMA;0.662g、3%BMA;0.677g、5%BMA;0.691g、1%HMA;0.663g)
DMF(50ml)
(注)用語の説明
IPAAm:N−イソプロピルアクリルアミド
BMA:n−ブチルメタクリレート
AIBN:2,2’−アゾビス(イソブチロニトリル)
HMA:n−ヘキシルメタクリレート
MPA:3−メルカプトプロピオン酸
DMF:N,N−ジメチルホルムアミド
上記の各材料を重合管に入れ、三方活栓を取り付け輪ゴムで固定した。そして、コックを閉じた状態で重合管を液体窒素中に入れ完全に凍結させ、次にコックを開いて真空ポンプを用いて脱気した。次に再びコックを閉じてメタノール中に入れ管内のサンプルを完全に溶解させた。この操作を3回繰り返した(凍結融解脱気法)。このように、充分脱気したサンプル(減圧状態になっている重合管)を70℃の振とう恒温層に入れ、2時間ラジカル重合反応させ片末端にカルボキシル基を持つコポリマーを合成した。反応後、室温になるまで放置し、溶媒(DMF)を40℃で減圧蒸留し濃縮し、残留物を氷冷したジエチルエーテルに滴下しポリマーを得た。得たポリマーを濾取し、常温で一晩減圧乾燥し、その乾燥物をアセトンに溶かし再びジエチルエーテルで精製し、これによって得たポリマーを再び濾取しこれを常温で一晩減圧乾燥した。この後、得たポリマーを5%の溶液になるように溶かした。これを透析膜を用いて3日間透析を行った(こまめに水を取り替えた)。透析後、透析を終えた溶液を適当な容器に移し凍結乾燥器を用いて2日間凍結乾燥を行った。これによって、さらに純度の高いコポリマーを得た。
IPAAm copolymerの担体への導入
<活性エステル(スクシニル)化法>
上記の合成コポリマー 1モル当量
DCC 2.5モル当量
N−ヒドロキシスクシンイミド 2.5モル当量
酢酸エチル 100ml
1.ナス型コルベンに合成コポリマーを入れ、半量の酢酸エチルで溶かした。
2.N−ヒドロキシスクシンイミド(N−Hydroxysuccinimide)を加え、さらにサンプル瓶にDCC(ジシクロヘキシルカルボジイミド)を量り取り、残りの酢酸エチルで溶かして加えた。
3.4℃の氷水に浸し2時間スターラーで撹拌し、後に25℃に設定した恒温槽に入れて一晩撹拌した。
4.溶液を濾過し、副生成物であるジシクロヘキシル尿素を取り除き、減圧下で濃縮した。
5.最後にジエチルエーテルで精製し、生成物を濾取・減圧乾燥して得られたスクシニル化コポリマーを冷凍庫に保存した。
担体(シリカゲル)への結合
スクシニル化したコポリマーを、溶媒に1,4−ジオキサンを用いて、3回に分けてアミノプロピルシリカゲルと反応させた。反応温度は室温(25℃)で行った。
1.スクシニル化ポリマー(1.5g)を1,4−ジオキサン(50ml)に溶かし、振とう恒温槽中でアミノプロピルシリカゲル(3g)と一晩反応させた。
2.反応液を濾取したものと、新たなコポリマー(1.5g)を再び1,4−ジオキサン(50ml)に溶かし一晩反応させた。この操作を2回繰り返した。
3.最後に濾取したものを、メタノール(500ml)、蒸留水(1l)、超純水(500ml)で十分洗浄し、これを充填剤として減圧乾燥してデシケーターに保存した。
試料の調製
[試料A] 17種類のPTH−アミノ酸を蒸留水に溶解し、次の濃度を有するPTH−アミノ酸混合液10mlを調製した。
1.PTH−L−アルギニン塩酸塩 1.000 mg/ml
2.PTH−L−アスパラギン 0.404 mg/ml
3.PTH−L−アスパラギン酸 1.084 mg/ml
4.PTH−L−システイン酸カリウム 1.000 mg/ml
5.PTH−L−シトルリン 0.001 mg/ml
6.PTH−L−グルタミン 0.124 mg/ml
7.PTH−L−グルタミン酸 0.471 mg/ml
8.PTH−グリシン 0.103 mg/ml
9.PTH−L−ヒスチジン塩酸塩 1.000 mg/ml
10.PTH−L−ロイシン 0.014 mg/ml
11.PTH−L−リシン 0.005 mg/ml
12.PTH−DL−メチオニン 0.063 mg/ml
13.PTH−L−フェニルアラニン 0.038 mg/ml
14.PTH−L−プロリン 0.038 mg/ml
15.PTH−Δ−トレオニン 0.019 mg/ml
16.PTH−DL−トリプトファン 0.019 mg/ml
17.PTH−L−チロシン 0.077 mg/ml
[試料B] 20種類のPTH−アミノ酸を蒸留水に溶解し、次の濃度を有するPTH−アミノ酸混合液10mlを調製した。
1.PTH−DL−α−アラニン 0.423 mg/ml
2.PTH−L−アルギニン塩酸塩 1.000 mg/ml
3.PTH−L−アスパラギン 0.404 mg/ml
4.PTH−L−アスパラギン酸 1.084 mg/ml
5.PTH−L−システイン酸カリウム 1.000 mg/ml
6.PTH−L−グルタミン 0.124 mg/ml
7.PTH−L−グルタミン酸 0.471 mg/ml
8.PTH−グリシン 0.103 mg/ml
9.PTH−L−ヒスチジン塩酸塩 1.000 mg/ml
10.PTH−DL−イソロイシン 0.006 mg/ml
11.PTH−L−ロイシン 0.014 mg/ml
12.PTH−L−リシン 0.005 mg/ml
13.PTH−DL−メチオニン 0.063 mg/ml
14.PTH−L−フェニルアラニン 0.038 mg/ml
15.PTH−L−プロリン 0.038 mg/ml
16.PTH−DL−セリン 0.553 mg/ml
17.PTH−Δ−トレオニン 0.019 mg/ml
18.PTH−DL−トリプトファン 0.019 mg/ml
19.PTH−L−チロシン 0.077 mg/ml
20.PTH−DL−バリン 0.024 mg/ml
[試料C] 14種類のPTH−アミノ酸を蒸留水に溶解し、次の濃度を有するPTH−アミノ酸混合液10mlを調製した。
1.PTH−L−アスパラギン酸 1.084 mg/ml
2.PTH−L−グルタミン酸 0.471 mg/ml
3.PTH−L−アスパラギン 0.404 mg/ml
4.PTH−L−グルタミン 0.124 mg/ml
5.PTH−L−ヒスチジン塩酸塩 1.000 mg/ml
6.PTH−DL−α−アラニン 0.423 mg/ml
7.PTH−L−アルギニン塩酸塩 1.000 mg/ml
8.PTH−L−プロリン 0.038 mg/ml
9.PTH−DL−メチオニン 0.063 mg/ml
10.PTH−Δ−トレオニン 0.019 mg/ml
11.PTH−L−ロイシン 0.014 mg/ml
12.PTH−L−フェニルアラニン 0.038 mg/ml
13.PTH−L−チロシン 0.077 mg/ml
14.PTH−DL−トリプトファン 0.019 mg/ml
試料Aに含まれるPTH−アミノ酸の分離
上記充填剤(PIPAAm−BMA5%で化学修飾したシリカ)を充填したカラムに試料A100μlを注入した。カラムは高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に接続し、溶出液に蒸留水を用いて、流速1.0ml/分の速度で分離を行い、紫外可視吸光度検出器により254nmの波長で検出を行った。カラムを恒温槽に設置し、カラム温度を変化させて分離能を比較した。ポリ−(N−イソプロピルアクリルアミド)は32℃で疎水性/親水性の担体表面物性が変化するが、この変化する温度を前記したように下限臨界温度という。この温度以下の5℃では、最も遅い保持時間を示すPTH−L−リシン(図1のピーク11)の保持時間は22分であったが、30℃では61分となった(図1)。このようにカラムの温度を変化させることによって、担体表面の疎水性/親水性を変化させ、各PTH−アミノ酸の溶出時間を変化させることが可能であることを確認した。
[実施例2]
試料Bに含まれるPTH−アミノ酸の分離
実施例1における試料Aに含まれるPTH−アミノ酸の分離の項に記載された分離条件と同様にして、試料Bに含まれる20種類のPTH−アミノ酸の分離を行った。
[実施例3]
試料Cに含まれるPTH−アミノ酸の分離
特開平7−318551号公報の実施例1に記載されている(a)〜(d)の方法に従ってポリ−(N−イソプロピルアクリルアミド)ゲルでグラフト化したシリカ(ポリ(IPAAm)ゲルグラフトシリカ)を作製した。これを充填剤として充填したカラムに試料C50μlを注入した。カラムは高速液体クロマトグラフに接続し、溶出液に0.5M塩化ナトリウム水溶液を用いて、流速1.0ml/分の速度で分離を行い、紫外線可視吸光度検出器により254nmの波長で検出を行った。カラムを恒温槽に設置し、カラム温度を5℃および40℃に設定して分離能を比較した。結果を図2に示す。
図2から明らかなように、カラム温度が5℃では14種類のPTH−アミノ酸の分離が困難であったが、下限臨界温度以上の40℃では表面は疎水性となり、疎水面での相互作用が強くなり、それぞれの保持時間が遅くなり、分離が可能となっている。この様にカラム温度を制御することで担体表面の物性の制御が可能であり、最適な分離条件の決定が可能となる。また、下限臨界温度はN−イソプロピルアクリルアミドモノマーに対するN,N−ジメチルアクリルアミドモノマーの量を変化させ、重合させることで、任意の温度で相転移を示す温度応答性ポリマーを合成可能である。
なお、図2に示されているように、40℃では分析時間が65分になっているが、温度グラディエントをかけて分離することによって、より短時間に分離を行うことが可能となる。
[実施例4]
PTH−アミノ酸の温度と保持時間の関係の検討
実施例1の試料Aに含まれるPTH−アミノ酸の分離の項に記載された分離条件と同様にして、試料Bに含まれるアミノ酸の分離を行い、各PTH−アミノ酸の温度と保持時間の関係を調べた。カラム温度は5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃および50℃の10段階に変化させ、各々のカラム温度における各PTH−アミノ酸の保持時間を測定した。結果を図3および図4に示す。
図3および図4から、温度変化に伴って、PTH−リシンを除いて溶出時間が大きく変化する疎水性アミノ酸と変化が小さい極性アミノ酸に分類することができることが確認された。したがって、カラム温度を適切に設定することにより最適な分離条件の決定が容易になし得る。
[実施例5]
アミノプロピルシリカ表面へのラジカル重合法によるゲル層の形成
1)アミノプロピルシリカへの重合開始剤の導入
充填剤の担体であるアミノプロピルシリカ5gにDMF中で両端にカルボキシル基を有するアゾ系重合開始剤である4,4’−アゾビス(4−シアノペンタン酸)(4,4’−azobis(4−cyanopentanoic acid):V−501)3.5g(12.5mmol)を、N−エトキシカルボニル−2−エトキシ−1,2−ジヒドロキノリン(N−Ethoxycarbonyl−2−ethoxy−1,2−dihydroquinoline:EEDQ)6.18g(25.0mmol)を縮合剤として用い、窒素雰囲気下、室温で6時間反応させた。これによりアミノプロピルシリカに重合開始剤V−501をアミド結合を介して導入固定化した。
2)表面ゲル層の形成
1)で作製したV−501固定化シリカ4gに、IPAAm(イソプロピルアクリルアミド)10gおよびN,N’−メチレン−ビス(アクリルアミド)(N,N’−Methylene−bis(acrylamide))0.27g共存下でエタノール中にて窒素雰囲気下、70℃で5時間重合反応を行った。これにより担体表面にゲル層を形成した。得られた担体(ゲル(IPAAm−2%BIS)シリカ)を以下で充填剤として使用した。
試料の調製
次の6種類のPTH−アミノ酸を含有するPTH−アミノ酸混合液10mlを調製した。
1.PTH−L−グルタミン 0.124 mg/ml
2.PTH−L−グリシン 0.103 mg/ml
3.PTH−DL−α−アラニン 0.423 mg/ml
4.PTH−DL−メチオニン 0.063 mg/ml
5.PTH−L−ロイシン 0.014 mg/ml
6.PTH−L−チロシン 0.077 mg/ml
試料に含まれるPTH−アミノ酸の分離
上記充填剤(ゲル(IPAAm−2%BIS)シリカ)を充填したカラムに上記試料50μlを注入した。カラムは高速液体クロマトグラフに接続し、溶出液に蒸留水を用いて、流速1.0ml/分の速度で分離を行い、紫外可視吸光度検出器により254nmの波長で検出を行った。カラムを恒温槽に設置し、カラム温度を5℃および50℃に設定して分離能を比較した。結果を図5に示す。
図5から明らかなように、ラジカル重合法により化学修飾した担体を充填剤として用いることにより、PTH−アミノ酸の分離を簡単に行うことが可能で、温度により、保持時間をコントロールすることができる。表面グラフト法により合成した担体を用いた場合よりも、温度応答性高分子がより多く導入され、保持時間が延びており、溶出が早いアミノ酸の分離性能を向上させることができる。これは、次のような理由によるものと考えられる。
表面グラフト法は一定の大きさの温度応答性高分子を始めに合成して、担体に接合する方法であるのに対して、ラジカル重合法では担体表面上でモノマーから重合させ高分子を構築する方法である。表面グラフト法に比較し、担体表面に密に温度応答性高分子を導入することが可能である。したがって、担体表面の疎水性度を増大させ、保持時間をコントロールしやすくなる。また、担体表面でのシリカゲルとの相互作用による非特異的吸着を抑えることができる。
産業上の利用の可能性
以上詳述したように、本発明のPTH−アミノ酸の分離方法は、下記の利点を有する。
(1)移動相としてアセトニトリル、メタノール等の有機溶媒を用いる必要がなく、水系のみで分離可能である。
(2)移動相の調製が容易である。
(3)有機溶媒や酢酸緩衝液などを用いないため、不純物の混入が少なく、安定したベースラインの検出が可能であり、高感度検出が可能である。
(4)有機溶媒を用いないために、脱気操作による有機溶媒の混合組成の変化かない。
(5)再現性の高い分離が得られる。
例えば、下記の表に示すような再現性が得られた。
(注)▲1▼ 再現性に関する実験方法について
上記充填剤(ゲル(IPPAm)シリカ)を充填したカラムを接続した高速液体クロマトグラフにPTH−メチオニン(5μl)、PTH−ロイシン(10μl)、PTH−トリプトファン(20μl)、PTH−リシン(100μl)をそれぞれ5回注入し、カラム温度50℃の条件下で、それぞれの保持時間を測定し、相対標準偏差(coefficient of variation:CV)を計算し再現性を検討した。クロマトグラフィーの条件として、流速1.0ml/min、溶出液を水を用いて、254nmの紫外部吸収により各種PTH−アミノ酸を検出した。
▲2▼ C.V.値の算出法
各サンプルを一定の条件下(温度、注入量)で5回測定し、その値を用いて算術平均値及び標準偏差値を求めそこからC.V.値を算出した。
(6)温度制御することで保持時間を自由にコントロールすることが可能であり、分離精度を制御できる
(7)担体を再生する必要がなく、温度制御により何度でも繰り返し使用可能である。
Claims (8)
- 移動相を水系に固体したままで、固定相表面の親水性/疎水性のバランスを外的信号によって変化させることが可能である充填剤を用いてPTH−アミノ酸のクロマトグラフィーによる分離を行うことを特徴とするPTH−アミノ酸の分離方法。
- 外的信号が温度変化である請求項1記載のPTH−アミノ酸の分離方法。
- 充填剤が、担体表面に温度応答性高分子で化学修飾したクロマトグラフィー用充填剤である請求項1記載のPTH−アミノ酸の分離方法。
- 充填剤が、ラジカル重合法を用いて温度応答性高分子を担体表面に化学修飾したクロマトグラフィー用充填剤である請求項3記載のPTH−アミノ酸の分離方法。
- 温度応答性高分子が、末端にアミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基等を有するポリアルキルアクリルアミド或いはその共重合体である請求項3または4記載のPTH−アミノ酸の分離方法。
- ポリアルキルアクリルアミドが、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)、ポリジエチルアクリルアミドまたはポリアクリロイルピロリジンのいずれか一種である請求項5記載のPTH−アミノ酸の分離方法。
- アミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基等を有するポリアルキルアクリルアミド或いはその共重合体で化学修飾したクロマトグラフィー用充填剤よりなる固定相にPTH−アミノ酸を保持させた後、外部温度を段階的に変化させる温度グラディエント法により固定相表面の親水性/疎水性のバランスを変化させ、同一の移動相を通過させることによってPTH−アミノ酸を分離することを特徴とするPTH−アミノ酸の分離方法。
- 移動相が水系溶媒である請求項7記載のPTH−アミノ酸の分離方法。
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