KR101726707B1 - 생체분자 정제용 자극 반응성 중합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규하고 개선된 자극 반응성 중합체 및 생체분자의 정제를 위해 이를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

생체분자 정제용 자극 반응성 중합체{STIMULUS RESPONSIVE POLYMERS FOR THE PURIFICATION OF BIOMOLECULES}
우선권 주장 데이터
본 출원은 2010년 5월 17일 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/395,769호를 우선권 주장하며, 그의 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 단백질 정제에 유용한 중합체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 표적 분자 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 샘플로부터 표적 분자를 정제하기에 유용한 자극 반응성 중합체에 적어도 부분적으로 관한 것이다.
예를 들어 항체를 비롯한 치료성 단백질(therapeutic protein)과 같은 생체분자(biomolecule)를 효과적이고 경제적으로 대규모 정제하는 것은 바이오기술 및 약학 산업에 있어서 점점 중요한 고려점이 되고 있다. 일반적으로, 정제 공정은 매우 정교하며 값비싸고 또 다수의 상이한 단계를 포함한다. 예를 들어, 전형적으로, 단백질의 경우, 단백질은 예를 들어 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드를 삽입하는 것에 의해 목적하는 단백질을 생성하도록 엔지니어링된 포유동물 또는 세균 세포주를 사용하는 세포 배양 방법을 이용하여 생산된다. 일반적으로, 표적 단백질의 발현 이후에, 예를 들어 숙주 세포 단백질, 배지 부산물 및 DNA을 비롯한 하나 이상의 바람직하지 않은 성분으로부터 단백질을 분리하는 것은 굉장한 어려움을 제시한다. 이러한 분리는 치료성 단백질이 인간에 사용하기 위한 것이어서 식품의약국(Food and Drug Administration; FDA)의 승인을 받아야 하는 것일 때 특히 중요하다.
일반적으로, 현재 단백질에 사용되는 분리 및/또는 정제 공정은 적어도 다음 단계를 포함하다: 세포내 단백질을 회수하기 위해 또는 분비된 단백질의 경우 배지부터 단백질을 회수하기 위해 세포 용균하는 단계; 상이한 원심분리 또는 여과를 이용하여 세포 및 세포 파편를 제거하여 목적하는 단백질을 함유하는 청정한 샘플을 얻는 단계; 및 다단계 공정에서 다양한 크로마토그래피 매질을 이용하여 샘플 중의 다양한 불순물로부터 목적하는 단백질을 분리하는 단계.
고분자전해질(polyelectrolyte)를 비롯한 다양한 유형의 중합체가 생체분자, 특히 단백질 정제를 위한 하나 이상의 단계에 이용되어 왔다. 예를 들어, 단백질을 정제하기 위해 응집물에 고분자전해질을 사용하는 것은 잘 확립되어 있다(참조, 예를 들어 국제 PCT 특허출원 번호 WO2008/091740호). 이는 상기 중합체가 목적하는 종(예를 들어 표적 분자 또는 불순물)과 어느 정도의 상호작용을 가져야 한다는 일반적 특징 만을 필요로 하는 다양한 범위의 중합체를 사용하여 달성될 수 있다. 가장 일반적인 방법은 고분자전해질과 같이 이온 종을 함유하는 중합체를 사용하는 것이다. 일반적으로, 고분자전해질을 단백질 혼합물에 부가하고 또 정제는 혼합물의 하나 이상의 성분을 선택적으로 응집하는 것을 통하여 달성된다. 이러한 방법의 중요한 결점은, 잔류 중합체 오염(예를 들어 중합체 수준이 너무 높을 때) 또는 불충분한 응집(예를 들어 중합체 수준이 너무 낮을 때)을 피하기 위하여 조심스럽게 제어된 수준의 고분자전해질을 부가해야 하는 점이다. 이온 교환 및 기타 하전된 크로마토그래피 매질이 단백질 정제에 흔히 사용되고 있기 때문에, 잔류 고분자전해질이 하류 정제 단계에 사용된 매질에 결합할 가능성이 있어, 공정을 오염시키고 또 복잡하게 만든다.
최근, 생체분자의 정제를 위한 중합체 사용과 관련된 일부 문제점을 극복한 기술이 개발되었다(참조, 예를 들어 국제 PCT 공개번호 WO 2008/079302 A2호). 예를 들어, 용해성(예를 들어 숙주 세포 단백질, DNA, 세포 배양 첨가제)뿐만 아니라 불용성(예를 들어 세포 및 세포 파편) 성분 모두에 반응할 수 있는 자극 반응성 또는 "스마트(smart)" 중합체가 개발되었다(참조, 예를 들어 US 공개번호 20080255027호 및 20090036651호). 자극 반응성 중합체가 상당한 유망성을 일반적으로 보여주었지만, 이러한 중합체의 광범위한 사용이 직면하는 주요 도전은 실험실 규모에서부터 대량 생산 규모에 이르는 다양한 규모에서 생길 수 있는 간단한 자극의 존재이다.
발명의 요약
본 발명은 쉽게 측량될 수 있고 또 다양한 범위의 pH와 도전성 상에서 작용함으로써 예를 들어 치료성 단백질을 비롯한 다양한 어레이의 생체분자의 정제에 사용될 수 있게 하는, 자극 반응성 중합체를 기본한 신규 고분자전해질을 제공한다.
본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 하나 이상의 소수성 기를 포함하는 고분자전해질 주쇄(backbone)를 포함하는 자극 반응성 중합체가 제공되며, 상기 중합체는 자극을 부가한 후 샘플에서 목적하는 생체분자에 결합하여 석출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 중합체의 고분자전해질 주쇄는 적어도 2개의 반복되는 단량체 단위 또는 적어도 3개의 반복되는 단량체 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단량체 단위의 적어도 50%는 전하를 포함한다. 다른 실시양태에서, 고분자전해질 주쇄의 각 단량체 단위는 전하를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체는 폴리아민 주쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 소수성 기는 페닐기이다.
본 발명에 따른 상기 자극 반응성 중합체는 소망하는 표적 분자를 정제하는데 유용하므로 소망하는 표적 분자와 함께 샘플 내에 존재하는 바람직하지 않은 하나 이상의 물질로부터 소망하는 표적 분자를 분리하는 것에 의해 정제한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체는 그 자체가 자극 반응성 중합체에 의한 결합과 석출에 바람직한 표적 분자인 목적하는 생체분자를 결합 및 석출한다. 다른 실시양태에서, 자극 반응성 중합체는 소망하는 표적 분자와 함께 샘플 내에 존재하는 바람직하지 않은 물질인 목적하는 생체분자와 결합하여 석출한다.
일부 실시양태에서, 상기 목적하는 생체분자는 치료성 폴리펩티드(즉, 소망하는 표적 분자)이다. 일부 실시양태에서, 상기 치료성 폴리펩티드는 항체(예를 들어 모노클로날 항체)이다.
다른 실시양태에서, 상기 목적하는 생체분자는 숙주 세포 단백질, DNA, RNA, 지질, 바이러스, 내독소, 세포 배양 첨가제, 전체 세포 및 세포 파편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 중합체는 복합체(complex) 형성 염인 자극에 대하여 반응성이다.
본 발명에 기재된 중합체를 사용하는 방법도 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 자극 반응성 중합체는 독특하며 또 정제 공정에서 하나 이상의 단계를 대체하거나 개선함으로써, 하나 이상의 바람직하지 않은 물질로부터 정제되거나 분리될 바람직한 표적 분자의 전체 순도를 실질적으로 증가시키는 점에서 종래 기술에 기재된 중합체에 비하여 진보성이 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 표적 분자의 순도를 증가시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 표적 분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 용액 중의 표적 분자를 결합하기 위한 중합체에 적합한 제1 세트 조건하에서, 상기 샘플을 주쇄에 부착된 하나 이상의 소수성 기를 포함하는 고분자전해질 주쇄를 포함하는 자극 반응성 중합체와 접촉시켜 중합체와 표적 분자의 복합체를 형성하는 단계; 및
(c) 상기 복합체를 용액 밖으로 석출시키기에 적합한 제2 세트 조건하에서 상기 샘플에 자극을 부가하는 단계, 이때 복합체의 석출은 하나 이상의 불순물로부터 상기 표적 분자의 분리를 초래하여, 표적 분자의 순도를 증가시킴.
본 발명의 방법에 따른 일부 실시양태에서, 상기 방법은 복합체로부터 표적 분자를 회수하는 단계를 더 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체는 상기 표적 분자 대신, 하나 이상의 불순물과 결합하여 석출하며, 이때 중합체와 하나 이상의 불순물의 복합체의 석출은 하나 이상의 불순물로부터 표적 분자의 분리를 초래하여, 표적 분자의 순도를 증가시킨다. 따라서, 이러한 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 표적 분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 중합체가 하나 이상의 불순물을 결합하기에 적합한 제1 세트 조건하에서, 상기 샘플을 주쇄에 부착된 하나 이상의 소수성 기를 포함하는 고분자전해질 주쇄를 포함하는 자극 반응성 중합체와 접촉시켜 중합체와 하나 이상의 불순물의 복합체를 형성하는 단계; 및
(c) 복합체를 석출시키기에 적합한 제2 세트 조건하에서 상기 샘플에 자극을 부가하는 단계, 이때 상기 복합체의 석출은 하나 이상의 불순물로부터 표적 분자의 분리를 초래하므로, 표적 분자의 순도를 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체는 다음 구조를 포함한다:
Figure 112014118126727-pat00001
식 중에서, x 및 y는 중합체 중의 단량체 단위를 나타내고; R1 및 R2는 고분자전해질 주쇄 (B)의 일부를 형성하는 하전된 기이며; 또 R3은 주쇄 중의 하전된 기에 부착된 소수성 기임. 단량체 단위의 전체 수(즉, x 및 y 단량체 단위의 합)에 대한 y 단량체 단위(즉, 주쇄에 부착된 소수성 기를 갖는)의 비율은 중합체의 "소수성 변형의 %"를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체는 다음 구조를 포함한다:
Figure 112014118126727-pat00002
식 중에서, x, y 및 z는 중합체 중의 단량체 단위를 나타내고; R1, R2 및 R3은 고분자전해질 주쇄 (B)의 일부를 형성하는 하전된 기이며; 또 R4는 주쇄 중의 하전된 기에 부착된 소수성 기이고; 또 R5는 주쇄에서 하전된 기에 부착된 관능기임.
단량체 단위의 전체 수(즉, x, y 및 z 단량체 단위의 합)에 대한 y 단량체 단위(즉, 주쇄에 부착된 소수성 기를 갖는)의 비율은 중합체의 "소수성 변형의 %"를 나타낸다. 또한, 단량체 단위의 전체 수(즉, x, y 및 z 단량체 단위의 합)에 대한 z 단량체 단위(즉, 주쇄 상에서 하전된 기에 부착된 관능기를 갖는)의 비율은 중합체의 "% 관능기 변형"을 나타낸다.
일반적으로, 본 발명에 포함되는 중합체는 본 명세서에 기재된 임의 단량체 단위 x, y 또는 z의 "n" 개수를 가질 수 있는 것으로 이해되며, 상기 n은 2 또는 2 이상이다.
다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112014118126727-pat00003
식 중에서, x 및 y는 단량체 단위를 나타내고; R1 및 R2 는 고분자전해질의 주쇄를 함유하는 탄소의 일부를 형성하는 지방족 아민 기(예를 들어, 일급 또는 이급 및/또는 방향족 아민)이며; 또 R3은 아민 기 R2에 부착되고 4개 이상의 탄소 원자를 함유하는 소수성 기(예를 들어 알킬기, 알켄일기, 아르알켄일기 또는 플루오로탄소기)임. 일부 실시양태에서, x(즉, 고분자전해질 주쇄 중의 비변형 하전된 기)에 대한 y(즉, 고분자전해질 주쇄 중의 하전된 기에 부착된 소수성 기를 갖는 단량체 단위)의 비율은 0.01 내지 0.75 또는 0.05 내지 0.75이다. 따라서, % 소수성기 변형은 전체 고분자전해질 단량체 단위(즉, x+y)의 1% 내지 75% 또는 5% 내지 75%일 것이다.
더 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112014118126727-pat00004
식 중에서, R1, R2 및 R3은 고분자전해질 주쇄를 함유하는 탄소의 일부를 형성하는 지방족 아민 기(예를 들어 일급 또는 이급 아민 및/또는 방향족 아민)이고; R4는 4개 이상의 탄소원자를 함유하고 또 알켄일, 아르알킬 및 아르알켄일기로부터 선택되는 소수성 기이며; 또 R5는 4개 또는 4개 이상의 탄소원자를 함유하고 또 알킬 또는 플루오로탄소 기로부터 선택되는 소수성 기임. 고분자전해질 단량체 단위의 전체 수에 대한 y 단량체 단위의 비율은 0.01 내지 0.75이다. 고분자전해질 단량체 단위의 전체 수에 대한 z 단량체 단위의 비율은 0.05 내지 0.5이거나 또는 0.01 내지 0.5이다. 따라서, % 소수성 기 변형은 1% 내지 75%이거나 또는 5% 내지 75%이며 또 % 관능기 변형은 1% 내지 50%이거나 또는 5% 내지 50%이다.
본 발명에 따른 상기 자극 반응성 중합체를 사용하는 다른 방법은 샘플 중의 잔류 중합체의 양을 최소화하면서 목적하는 표적 분자 또는 생성물(예를 들어 항체)의 정제를 가능하게 하는 방법을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체를 사용하여 중합체의 잔류량을 최소화하면서 하나 이상의 불순물로부터 표적 분자(예를 들어 항체)를 분리하는 방법이 제공되며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 표적 분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 중합체가 하나 이상의 불순물을 결합하기에 적합한 제1 세트 조건하에서 상기 샘플을 자극 반응성 중합체와 접촉시켜 중합체와 하나 이상의 불순물의 제1 복합체를 형성하는 단계, 이때 상기 제1 세트 조건은 중합체를 부가하기 전 또는 후에 샘플의 pH 또는 염 농도를 조절하는 것을 포함함;
(c) 제2 세트 조건하에서 상기 제1 복합체를 샘플로부터 석출시키는 단계;
(d) 상기 샘플을 다가 이온과 접촉시켜 잔류 중합체와 다가 이온의 제2 복합체를 형성하는 단계,
(e) 제2 복합체를 석출시키는 단계; 및
(f) 상기 샘플로부터 표적 분자를 회수함으로써, 샘플 중의 잔류 중합체 양을 감소시키면서 샘플 중의 하나 이상의 불순물로부터 표적 분자를 분리하는 단계.
일부 실시양태에서, 상기 표적 분자는 항체이다. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 모노클로날 항체(monoclonal antibody)이다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 다양한 방법으로 표적 분자를 회수하는 것은 크로마토그래피 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 표적 분자의 회수는 여과 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체를 적용하는 2 단계 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 자극 반응성 중합체는 정제 공정의 1개 단계에서 하나 이상의 불순물을 석출하기 위해 사용될 수 있고 또 상이한 단계의 공정에서 표적 분자 또는 소망하는 생성물을 석출시키기 위하여 동일하거나 상이한 중합체가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 불순물은 숙주 세포 단백질, DNA, RNA, 항체 응집물, 바이러스, 내독소, 전체 세포, 세포 파편 및 세포 배양 첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
도 1은 폴리알릴아민 중합체와 벤질클로라이드의 반응을 도시하는 개략도이다.
도 2는 헥산산과 tert-부틸 변형된 폴리알릴아민(HC-t-BuMPAA)에 대한 반응도를 도시한다.
도 3은 헥산산 및 tert-부틸 변형된 폴리알릴아민(HC-t-BuMPAA)의 다가 이온 자극 및 pH 반응성에 대한 염화나트륨의 효과를 도시하는 그래프이다. X축은 pH를 도시하고 또 Y축은 농축물(즉, 원심분리의 결과물)의 탁도를 도시한다.
도 4는 실시예 29에 기재된 바와 같은 폴리비닐아민의 합성을 도시한다.
도 5는 중합 이후 폴리아민의 탈보호(deprotection)에 대한 반응을 도시한다.
도 6은 폴리비닐아민과 벤질클로라이드의 반응을 도시한다.
도 7은 다가 이온 자극 반응성 공중합체를 형성하기 위한 중합반응 및 반응도를 도시한다.
도 8은 실시예 35로부터 얻은 변형된 폴리비닐아민(PVA)에 대한 NMR 스펙트럼을 도시한다. 1H NMR의 적분은 약 18%의 벤질 변형 수준을 나타낸다.
도 9는 실시예 36으로부터 얻은 변형된 폴리알릴아민에 대한 NMR 스펙트럼을 도시한다. 1H NMR의 적분은 약 33%의 벤질 변형 수준을 나타낸다.
도 10은 비-자극 반응성 중합체(예를 들어 키토산) 및 자극 반응성 중합체(예를 들어 벤질 변형된 폴리알릴아민)에 대한 중합체 투여의 농축물 탁도에 대한 효과를 나타내는 그래프를 도시한다. 실시예 37에 기재된 바와 같이, X축은 중합체 투여량(wt%)이고 또 Y축은 농축물 탁도(NTU)이다.
도 11은 벤질 폴리알릴아민 자극 반응성 중합체에 대한 자극의 존재하 및 부재하에서 중합체 투여량의 효과를 나타내는 그래프를 도시한다. 실시예 38에 기재된 바와 같이, X축은 중합체 투여량(wt%)이고 또 Y축은 농축물 탁도(NTU)이다.
도 12는 생체분자의 정제에 사용된 전형적 도식을 도시한다.
도 13은 세포 배양액의 청정성을 개선하기 위하여 사용된 자극 반응성 중합체를 비롯한 정제 도식을 도시한다. 상기 자극 반응성 중합체는 하나 이상의 불순물을 제거하지만, 상기 중합체는 소망하는 표적 분자를 결합하지 않는다.
도 14는 세포 배양액의 청정성을 개선하기 위하여 사용된 자극 반응성 중합체를 비롯한 정제 도식을 도시한다. 상기 자극 반응성 중합체는 하나 이상의 불순물을 응집을 통하여 제거하지만, 상기 중합체는 소망하는 표적 분자를 결합하지 않고 또 잔류 중합체는 청정화 이후 자극을 부가하는 것에 의해 제거된다.
도 15는 세포 배양액의 청정성을 개선하기 위하여 사용된 자극 반응성 중합체를 비롯한 정제 도식을 도시한다. 상기 자극 반응성 중합체는 하나 이상의 불순물을 제거하지만, 상기 중합체는 소망하는 표적 분자를 결합하지 않고 또 잔류 중합체는 청정화 이후 부가적 흡착 여과 단계에 의해 제거된다.
상세한 설명
본 발명은 적어도 부분적으로, 하나 이상의 소수성 기에 의해 변형된 고분자전해질 주쇄를 포함하는 신규하고 개선된 자극 반응성 중합체를 제공하며, 상기 중합체 용해도는 자극 부가에 의해 변형될 수 있다.
본 명세서에 기재된 상기 자극 반응성 중합체 및 이를 사용하는 방법은, 예를 들어 단백질을 비롯한 소망하는 표적 분자의 정제뿐만 아니라 불순물, 예를 들어 숙주 세포 단백질, DNA, RNA, 지질, 내독소, 세포 배양 첨가제, 세포 및 세포 파편과 같은 바람직하지 않은 물질의 제거를 위한 개선된 범위의 pH를 제공하는 점에서 종래 기술에 기재된 것보다 더욱 효과적이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 중합체는 단순한 다가 염의 저농도에 반응성이기 때문에, 기존의 염 반응성 중합체에 대하여 개선된 확장성 및 감소된 도전성을 허용한다. 다양한 실시양태에서, 본 발명에 따른 중합체는 전체 세포, 세포 파편뿐만 아니라 다른 용해성 불순물을 세포 배양 배지로부터 효과적으로 제거할 수 있다. 상기 중합체는 또한 목적하는 단백질 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 단백질 혼합물로부터 불순물을 효과적으로 제거할 수 있다. 또한, 본 발명에 기재된 다양한 중합체는 샘플 중의 목적으로 하는 표적 분자 및 단백질/생성물을 효과적으로 포획할 수 있으므로, 샘플 중에 존재하는 하나 이상의 불순물로부터 이들을 분리하여 표적 분자의 순도를 증가시킨다.
다양한 조건 집합을 이용하여 표적 분자, 예를 들어 치료성 단백질의 정제용으로 기재된 상기 중합체를 사용하는 방법도 본 발명에 포함된다.
이론에 얽매임 없이, 본 발명에 기재된 자극 반응성 중합체는 소망하는 표적 분자, 예를 들어 치료성 단백질 또는 소망하는 생성물, 또는 바람직하지 않은 물질, 예를 들어 숙주 세포 단백질, DNA, RNA, 지질, 내독소, 세포 배양 첨가제, 전체 세포 및 세포 파편를 비롯한 하나 이상의 불순물을 결합 및 석출하기 위해 사용될 수 있는 것으로 생각된다. 일반적으로, 본 발명에 따른 중합체에 결합된 분자는, 그것이 소망하는 표적 분자이든 바람직하지 않은 물질이든, 목적하는 생체분자로 지칭한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 사용할 특정 자극 반응성 중합체의 선택은 중합체가 어떤 것을 결합하려고 하는지에 따라 결정된다. 예를 들어, pI를 상회하는 pH에서 네트 음전하(net negative charge)를 보유하는 목적하는 생체분자(예를 들어 전체 세포, 세포 파편, DNA, 내독소, 및 단백질)인 경우, 양이온성(즉, 양으로 하전된) 고분자전해질 주쇄를 포함하는 자극 반응성 중합체가 사용하기 바람직하다. 한편, pI 미만의 pH에서 네트 양전하(net positive charge)를 보유하는 목적하는 생체분자(예컨대, 단백질)인 경우, 음이온성(즉, 음으로 하전된)인 고분자전해질 주쇄를 포함하는 자극 반응성 중합체가 사용하기 바람직하다.
양전하는 정제 공정 중에 이용된 조건하에서 중합체에 내재할 수 있거나 또는 양전하는 pH 변화로 생성되어 자극 반응성 중합체가 하전되게 할 수 있다.
생체분자의 전체 회수율에 영향을 주는 중요한 변수는 고분자전해질 주쇄 중에 잔류하는 비변형 하전된 기에 대한 소수성 변형된 기의 비율이다. 예를 들어, 소수성 기의 %가 증가함에 따라서 비-특이적 상호작용을 통한 생체분자의 손실도 증가한다. 따라서, 주어진 생체분자에 있어서, 생체분자 회수율을 최대화하기 위하여 소수성 기에 대한 하전된 기의 특정 비율이 사용될 수 있다. 또한, 높은 %의 소수성 기는 중합체 용해도와 고분자전해질 주쇄 상의 하전된 기의 효능에 영향을 줄 수 있다.
또한, 고분자전해질 폴리알릴아민의 주쇄 중의 하전된 아민 기를 벤질 클로라이드를 사용하여 변형시키는 것은 다양한 집합의 pH 조건 하에서 하전된 2급 아민을 초래한다. 그러나, 벤질 변형은 전하-전하 상호작용에 영향을 줄 수 있는 아민 기에 입체 부피(steric bulk)를 부가한다. 또한, 고분자전해질 주쇄 중의 하전된 기를 소수성 기에 의해 변형하는 것은 하전된 기의 수 감소를 초래할 수 있다. 예를 들어, 폴리알릴아민의 아민 기를 벤질 클로라이드에 의해 변형하는 것은 하전된 기가 아닌 아미드 결합의 형성을 초래하므로, 주쇄에서 하전된 기의 수 감소를 초래한다. 따라서, 하전된 기의 수 감소는 중합체의 용해도뿐만 아니라 전하-전하 상호작용을 통한 중합체의 결합능에도 영향을 줄 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 특정 중합체는 양이온성이고 또 다른 것은 음이온성이지만, 양이온성이고 하나 이상의 소수성 뿐만 아니라 음이온성 기에 의해 변형된 고분자전해질 주쇄를 포함하는 하이브리드(hybrid) 중합체도 또한 합성될 수 있다. 이러한 하이브리드 중합체의 경우, 양이온성 고분자전해질 상의 비변형 기는 복합체형성 염에 반응성인 반면에, 주쇄 상의 음이온성 변형 기는 네트 양전하를 보유하 는 목적하는 생체분자에 결합할 수 있다. 따라서, 음이온성 및 소수성 기에 대한 고분자전해질 주쇄 중의 비변형 양이온성 기의 비율은 중합체가 착화하여 상기 목적하는 생체 분자를 포획하는데 필요한 용해도 및 자극을 결정하는데 중요하다. 예를 들어, 고분자전해질 주쇄 중에 너무 적은 비변형 양이온성 기는 자극에 대한 반응이 없는 것으로 한정됨을 초래할 수 있다. 반면에, 너무 적은 음이온성 기는 목적하는 생체분자를 포획하는 능력을 제한할 수 있다.
소수성 기에 의한 고분자전해질 주쇄의 변형의 필요한 수준뿐만 아니라 사용된 자극의 유형과 양은 중합체뿐만 아니라 사용된 조건, 및 중합체 주쇄의 고유한 용해도와 분자량을 이용하여 정제될 상기 목적하는 생체분자를 기본으로 하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 사용된 자극, 예를 들어 다가 염의 양을 최소화하기 위하여, 고분자전해질 주쇄에 부착된 더 많은 소수성 기를 갖는 것이 바람직하다. 다르게는, 증가된 양의 다가 이온 자극은 소수성 변형 정도 또는 필요한 % 소수성 변형을 감소시킨다. 일부 경우에서, 예를 들어, 다가 이온 자극이 매우 높은 농도이면 소수성 변형에 대한 필요성을 완전히 제거할 수 있다. 다르게는, 중합체 분자량 증가는 고분자전해질 주쇄의 고유한 용해도를 감소시키며 또 고분자전해질 소수성 변형을 낮은 정도(5% 이하)로 허용하거나 또는 변형이 없게 한다. 그러나, 소수성 변형의 제거는 높은 중합체 투여량에서 더 낮은 분자량 또는 더 많은 용해성의 중합체 주쇄에 대한 잔류 중합체의 양을 증가시킬 수 있다.
다양한 실시양태에서, 고분자전해질 주쇄 상에서 소수성 변형의 정도는 1% 내지 85% 또는 5% 내지 50% 범위이다. 따라서, 자극 반응성 중합체에 의해 결합시키려 하는 목적하는 생체분자에 따라서, 소수성 변형의 %는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85%이다.
일부 실시양태에서, 복합체 형성 염은 자극으로 사용된다. 다양한 실시양태에서, 복합체 형성 염의 농도는 2mM 내지 500mM, 또는 25mM 내지 lOOmM이다. 예시적 복합체 형성 염은 비제한적으로 예를 들어 시트레이트, 포스페이트, 설페이트 및 EDTA와 같은 다가 이온, 및 퍼클로레이트, 도데실 설페이트 나트륨 염, 도데실 벤젠 설페이트, Fe(II)-4-클로로-2-니트로페놀 음이온, 테트라페닐 보레이트 나트륨 염 및 헥사니트로디페놀 아민(참조. 예를 들어 ANALYTICAL SCIENCES, DECEMBER 1987, VOL. 3, p. 479)과 같은 이온결합(ion-association) 염을 포함한다. 일반적으로, 당업자는 당해 분야에 공지된 다수의 복합체 형성 염을 잘 알고 있을 것이며 또 본 발명에 기재된 중합체에 대한 자극으로서 사용될 수 있다.
석출을 유도하는데 필요한 복합체 형성 염의 양은 예를 들어 pH, 샘플에서 중합체 농도 및 목적하는 생체분자의 농도와 같은 인자에 따라 달라진다. 예를 들어, 폴리알릴아민과 같은 일부 고분자전해질은 pH(아민 양성자화의 수준)에 따라 다양하게 변하는 전하 밀도를 갖는다. pH가 증가함에 따라서, 전하 밀도의 수준이 감소되므로 석출을 유도하는데 필요한 자극의 정도는 더 낮은 pH 또는 더 높은 전하 밀도 상태에 비하여 상이할 것이다.
일반적으로, 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체는 표적 분자를 함유하는 피드스톡(공급원료) 또는 표적 분자를 함유하는 샘플에 고체 형태 또는 액체 형태로 부가될 수 있다. 최종 중합체 농도는 일반적으로 0.01% 내지 2%이다. 본 명세서에 기재된 일부 방법에서, 중합체 및 목적하는 생체분자의 혼합물을 생성한 다음 자극, 예를 들어 다가 음이온과 같은 복합체 형성 염을 부가한다. 자극의 양은 중합체 농도에 따라서 달라질 수 있다. 예를 들어, 2%의 중합체 농도는 중합체 석출을 유도하는데 필요한 더 많은 양의 자극을 필요로 할 것이다. 자극 반응을 통한 완전한 중합체 석출을 보증하도록 정확한 양 또는 약간 과량으로 자극을 투여하는 것이 중요하다. 이는 과량(과잉량)이 문제가 되는 잔류 중합체를 초래하는 중합체 응집과 대조된다.
본 발명은 다수의 정제 도식에서 사용될 수 있다. 상기 자극 반응성 중합체는, 청정화하는 동안 또는 표적분자의 포획 동안 공정의 초기에서 사용이 바람직하지만 공정의 임의 단계에서 유효할 수 있다. 단일 자극 반응성 중합체 또는 중합체의 혼합물은 하나 이상의 단계로 부가될 수 있고 또 이어 하나 이상의 자극을 사용하여 석출될 수 있다. 상기 자극은 상기 목적하는 생체분자(즉, 하나 이상의 불순물 또는 소망하는 표적 분자)와의 중합체 결합 이전, 동안 또는 이후에 가해질 수 있다. 또한, 상기 자극은 일반적으로 고체 형태인 석출물의 제거 이전, 동안 또는 이후에 가해질 수 있다. 상기 석출물은 당해 분야에 공지된 하나 이상의 수법을 이용하여 및/또는 본 명세서에 기재된 수법, 예를 들어 여과, 침강, 원심분리 또는 기타 고/액 분리법 또는 동시, 병렬 또는 직렬 분리 도식으로 방법의 조합을 이용하여 제거될 수 있다.
자극 반응성 중합체의 부가는 몇 가지 방식으로 달성될 수 있다. 세포 배양 배지는 자극 반응성 중합체를 부가하지 전에 소망하는 상태, 예를 들어 pH의 조절(예를 들어 환원) 및/또는 도전성으로 조절될 수 있다. 상기 자극 반응성 중합체는 세포 배양 배지에 부가되어 혼합될 수 있다. 상기 자극 반응성 중합체는 액체 또는 고체 형태로 부가될 수 있다. 상기 중합체 함유 용액 자체는 세포 배양 배지의 pH가 소망하는 상태로 조절하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 상기 자극 반응성 중합체는 진한 아세트산 용액에 용해될 수 있다. 이 아세트산 용액의 농도는 자극 반응성 중합체 부가시 필요한 pH 조절을 제공하기 위하여 부피, 발효 용액 조건 및 단백질 농도를 기초로 하여 변경될 수 있으므로, 소망하는 중합체 농도와 용액 pH를 초래할 수 있다. 상기 자극 반응성 중합체는 자발적 응집이 생기는 농도로, 전형적으로 유형 및 % 고형분에 따라서 상기 용액이 혼탁되어 석출을 형성하기 시작하도록 0.01 내지 0.1% wt 중합체 또는 0.01 내지 0.5 % wt 중합체 범위의 농도로 부가될 수 있다. 다르게는, 상기 자극 반응성 중합체는 자발적 응집이 생기지 않지만, 중합체-생체분자 결합은 생길 수 있는 농도로, 예를 들어 전형적으로, 0.5% 내지 2% wt 중합체 범위의 농도로 부가될 수 있고, 또 상기 용액은 원래 용액보다는 청정할 수도 있고 또는 약간 더 혼탁하거나 또는 더욱 혼탁할 수 있다. 또한, 상기 자극 반응성 중합체는 자발적 응집과 중합체-생체분자 결합이 생기는 농도로 부가될 수 있다.
정제 도식에서 자극의 이용이 응집 공정의 경우에서와 같이, 중합체 과잉 투여와 관련된 문제의 일부를 경감하기 때문에 더욱 바람지하지만, 본 명세서에 기재된 중합체는 응집제(flocculant)로서 또한 사용될 수 있는 것으로 생각된다.
예시적 정제 도식에서, 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체는 발효가 완료한 후 세포 배양액에 부가되며 또 중합체는 소망하는 표적 분자가 아닌 목적하는 생체분자를 결합하도록 제제화될 수 있다. 이러한 방법에서, 자극 반응성 중합체는 제1 세트 조건하, 예를 들어 상기 목적하는 생체분자와 결합하는 중합체를 부가하기 전, 동안 또는 후에 조절될 수 있는 조건하에서 세포 배양액에 부가될 수 있다. 상기 자극 반응성 중합체가 제1 세트 조건하에서 부가되면, 자극은 제2 세트 조건하에서 부가되어, 상기 목적하는 생체분자(예를 들어 세포, 세포 파편, 숙주 세포 단백질, DNA, 내독소, 및 바이러스와 같은 하나 이상의 불순물)를 포함하는 석출물을 생성한다. 상기 고체 석출물은 이어 원심분리 및/또는 여과에 의해 제거되어 청정화된 세포 배양액(clarified cell culture fluid)을 초래한다. 생성한 청정화된 세포 배양액은 이어 크로마토그래피 매질을 이용한 포획 단계를 통과하여 소망하는 표적 분자에 결합할 수 있다. 상기 표적 분자는 상기 포획 단계로부터 용출될 수 있다. 따라서, 일부 경우에서, 청정화 단계에서 하나 이상의 불순물의 제거를 가능하게 하는 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체를 사용하는 것에 의해, 부가 단계의 수가 감소되거나/제거되거나 또는 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 자극 반응성 중합체는 중합체가 표적 분자가 아닌 목적하는 생체 분자를 결합하는 조건하에서 세포 배양액에 부가된다. 상기 자극 반응성 중합체가 소망하는 용액 조건에서 잘 혼합된 후, 상기 목적하는 생체분자를 포함하는 응집이 형성되게 한다. 상기 목적하는 생체분자를 함유하는 고체는 일차 청정화에 의해 제거된다. 생성한 세포 배양액을 수집하고 또 자극을 가하여 잔류 중합체를 석출시킨다. 석출된 잔류 중합체는 이어 이차 청정화에 의해 제거된다. 생성한 청정화된 세포 배양 용액은 크로마토그래피 매질을 이용하는 포획 단계를 통과시켜 표적 분자를 결합한다. 임의 정제 단계에서 자극 부가에 이어 일차 청정화를 이용하여 잔류 중합체를 제거할 수 있다. 임의 단계에서 잔류 중합체를 제거하거나 또는 공정을 통하여 하나 이상의 자극을 다수회 부가하기 위하여 자극을 부가할 수 있다.
다른 정제 도식에서, 자극 반응성 중합체는 중합체가 하나 이상의 불순물을 결합하기에 적합한 조건하에서 발효를 완료한 후 세포 배양액에 부가되어, 중합체가 표적 분자를 결합하지 않도록 한다. 상기 자극 반응성 중합체가 소망하는 용액 조건하에서 잘 혼합된 후, 자극을 부가하여 하나 이상의 불순물과의 고체 석출물을 형성한다. 이 고체 석출물은 원심분리 및/또는 여과에 의해 제거한다. 생성한 청정화된 세포 배양 용액은 자극 반응성 중합체를 결합할 수 있는 필터(filter)를 통과한다. 당업자는 자극 반응성 중합체를 결합할 수 있는 필터를 용이하게 선택/확인할 수 있다. 예를 들어, 중합체에 의해 결합될 상기 목적하는 생체분자에 대하여 유사한 특성을 갖는 필터가 제공될 수 있다. 다르게는, 상기 목적하는 생체분자와 동일한 전하 및 상기 자극 반응성 중합체와 반대되는 전하를 갖는 하전된 기를 보유하는 필터가 제공될 수 있다.
막, 충전 베드(packed beds) 또는 필터를 이용하여 중합체를 용액으로부터 제거할 수 있다. 예를 들어, 설폰산기를 함유하는 음이온성 막을 사용하여 폴리아민 자극 반응성 중합체를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 중합체를 석출시키는데 사용된 자극과 유사한 결합 특성을 갖는 필터가 사용될 수 있다. 상기 자극이 다가 음이온이면, 필터에 다가 음이온을 함유하는 표면을 제공하는 것은 중합체를 용액으로부터 제거할 수 있다. 예를 들어, 폴리비닐 포스페이트에 의해 변형된 막은 포스페이트 이온이 폴리아민과 복합체화될 수 있는 것과 상당히 동일한 방식으로 폴리아민에 결합할 수 있어, 석출을 유도한다. 또한, 폴리비닐 포스페이트에 의해 변형된 비드(예를 들어 폴리메타크릴레이트)가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 자극 반응성 중합체를 제거할 수 있는 필터에 의한 용액의 여과 이후, 생성한 용액은 크로마토그래피 매질을 이용하는 포획 단계를 통과하여 표적 생체분자를 결합한다. 크로마토그래피 매질, 심층 필터(depth filter) 또는 자극 반응성 중합체를 결합할 수 있는 기타 다공성 재료를 사용하여 중합체를 제거할 수 있다. 단일 단계 또는 하나 이상의 또는 복수 단계로 흡착 수단을 이용하여 중합체를 제거할 수 있다. 또한, 중합체를 혼합물에 부가한 후 임의 단계에서 흡착 수단을 통하여 중합체를 제거할 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 정제 도식의 다수의 변형에 이용될 수 있을 것으로 예상된다. 상기 자극 반응성 중합체는 청정화 및 포획 단계 모두를 대체하거나 또는 향상시키기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 2개의 개별적 자극 반응성 중합체가 사용될 수 있다; 하나 이상의 불순물을 결합하지만 표적 분자를 결합하지 않는 제1 중합체, 및 표적 분자를 결합하는 제2 중합체. 이들 2개 중합체는 별개의 단계 또는 단일 단계로 적용될 수 있다. 마찬가지로, 표적 분자를 결합할 수 있는 관능기 및 하나 이상의 불순물을 결합할 수 있는 고분자전해질 주쇄를 갖는 단일 중합체가 사용될 수 있다. 상기 단일 중합체는 단일 단계 또는 다수의 단계에서 표적 분자 및 하나 이상의 불순물을 결합할 수 있다. 상기 중합체로부터 표적 분자의 후속 용출은 몇 개의 상이한 석출/자극 부가 또는 세척 단계 후에 생길 수 있다. 상기 자극 반응성 중합체는 포획 단계 이후에 부가될 수 있고 또 바이러스 불활성화 또는 포획 단계 이후의 기타 단계로부터 생기는 현탁된 고체 및 불순물을 청정화하기 위해 사용될 수 있다. 상기 자극 반응성 중합체는 또한 연마 단계(polishing step)를 대체하거나 또는 개선할 수 있다.
일부 실시양태에서, 바이러스 불활성화 단계(즉, 용액을 낮은 pH, 계면활성제 또는 열에 노출시킴)가 포함된다. 용액 조건은 조절될 수 있고 또 샘플은 일련의 연마 단계(즉, 하나 이상의 이온 교환, 소수성 상호작용, 혼합 모드 및 기타)를 통하여 가공될 수 있다. 이어 이 용액은 바이러스 여과 및 한외여과 또는 정용여과를 비롯한 일련의 여과 단계를 거칠 수 있다. 본 명세서가 더욱 잘 이해될 수 있도록, 특정 용어를 먼저 정의한다. 부가적 정의는 상세한 설명을 통하여 설명될 것이다.
I. 정의
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "자극" 또는 "자극(들)"은 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체에 의한 반응을 초래하는, 환경에서 물리 화학적 변화를 지칭하는 것으로 의미한다. 따라서, 본 발명은 자극에 반응성이고 또 자극이 중합체의 용해도 변화를 초래하는 신규 중합체를 제공한다. 본 명세서에 기재된 하나 이상의 중합체가 반응성인 자극의 예는, 비제한적으로, 예를 들어 온도 변화, 도전성 변화 및/또는 pH 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극은 착화제(complexing agent) 또는 복합체 형성 염을 샘플에 부가하는 것을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 자극은 일반적으로 중합체를 샘플에 부가한 후 부가된다. 상기 자극은 중합체를 샘플에 부가하는 동안 또는 부가하기 전에 부가될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "중합체" 는 2개 이상의 단량체 단위의 공유 결합에 의해 형성된 분자를 지칭한다. 이들 단량체 단위는 합성일 수 있거나 또는 천연에서 생길 수 있다. 반복 단위체에 의해 형성된 중합체는 직쇄 또는 측쇄일 수 있다. 중합체의 예는, 비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌, 폴리알릴아민, 폴리비닐알코올, 폴리스티렌 및 공중합체(예컨대 폴리스티렌-코-폴리피리딘, 폴리아크릴산-코-메틸 메타크릴레이트, pluronics, PF68 등)를 포함한다. 본 발명에 따른 실시양태에서, 중합체는 고분자전해질 주쇄를 포함한다. 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 공중합체도 본 명세서에 기재되어 있으며, 상기 공중합체는 자극에 반응성이다. 일반적으로, 중합체의 경우, 상기 단량체 단위는 동일 유형의 것인 반면에, 공중합체는 통상 상이한 유형의 단량체 단위를 가질 것으로 이해된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "자극 반응성 중합체"는 자극을 부가한 후 물리적 및/또는 화학적 특성 변화를 나타내는 중합체 또는 공중합체를 지칭한다. 전형적인 자극 반응은 중합체의 용해도 변화이다. 예를 들어, 상기 중합체 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)는 약 35℃ 아래의 온도에서 수용성이지만, 약 35℃의 온도에서 수불용성이 된다. 특정 실시양태에서, 자극 반응성 중합체는 다가 이온 자극(예컨대, 포스페이트 자극)에 대해 반응성인 폴리알릴아민 또는 폴리비닐아민 중합체이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "고분자전해질 주쇄"는 2 이상의 반복되는 단량체 단위를 포함하는 중합체를 함유하는 탄소를 지칭하며, 상기 단위의 적어도 50%, 또는 상기 단위의 적어도 55%, 또는 상기 단위의 적어도 60%, 또는 상기 단위의 적어도 65%, 또는 상기 단위의 적어도 70%, 또는 상기 단위의 적어도 75%, 또는 상기 단위의 적어도 80%, 또는 상기 단위의 적어도 85%, 또는 상기 단위의 적어도 90%, 또는 상기 단위의 적어도 95%는 하전된 관능성을 함유한다. 즉, 적어도 50%의 단량체 단위는 단위의 일부를 형성하는 하전된 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 고분자전해질 주쇄는 적어도 2 이상의 반복되는 단량체 단위를 함유하며, 상기 단위의 각각은 하전된 관능성을 함유한다. 단량체 단위의 각각이 하전된 관능성을 함유하는 중합체의 고분자전해질 주쇄의 경우, 이러한 중합체는 "연속적 고분자전해질"로 지칭될 수 있다. 예시적 고분자전해질은 비제한적으로, 폴리알릴아민, 폴리비닐아민, 폴리아크릴산, 폴리에틸렌이민, 키토산, 및 폴리비닐인산을 포함한다. 상기 단량체 단위와 상이한 하나 이상의 물질이 고분자전해질 주쇄에 결합될 수 있는 것으로 생각된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "소수성 기"는 물에 대한 친화성을 거의 갖지 않거나 전혀 갖지 않는 비극성 물질 또는 화학기를 지칭한다. 예시적 소수성 기는, 비제한적으로, 페닐기, tert-부틸기, 시클릭 탄화수소, 폴리시클릭 지방족 탄화수소, 폴리시클릭 방향족 탄화수소, 및 헥실 및 옥틸기와 같은 단쇄 탄화수소를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 소수성 기는 페닐기이다. 상기 소수성 기는 비-탄화수소일 수 있고 또 질소, 산소, 황, 인 등과 같은 헤테로원자를 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 다양한 실시양태에서, 주쇄 중의 하전된 기에 부착된 하나 이상의 소수성 기를 갖는 고분자전해질 주쇄를 포함하는 자극 반응성 중합체가 제공된다. 이론에 얽매임 없이, 고분자전해질 주쇄에 부착된 소수성 기의 개수는 중합체 용해도 변경에 중요하므로, 중합체의 자극 반응성을 개선하는 것으로 이해된다. 그러나, 자극 없이 중합체를 수불용성으로 만드는 소수성 기 개수를 갖는 것이 바람직할 수 있다.
소수성 기에 의해 변형된 고분자전해질 주쇄 중의 하전된 기의 %는 일반적으로 중합체의 "% 소수성 변형"이라 칭한다. 다양한 실시양태에서, 상기 % 소수성 변형이 중요하며 또 1% 내지 85% 또는 5% 내지 85% 범위이다. 따라서, 상기 % 소수성 변형은 적어도 l%, 또는 적어도 2%, 또는 적어도 3%, 또는 적어도 4% 또는 적어도 5%, 또는 적어도 6%, 또는 적어도 7%, 또는 적어도 8%, 또는 적어도 9%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 15%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 25%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 35%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 45%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 55%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 65%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "% 소수성 변형"은 고분자전해질 중합체 주쇄 중의 전체 고분자전해질 단량체 단위의 %로서, 일반적으로 소수성 기 변형된 고분자전해질 하전된 기에 대한 비변형 고분자전해질 하전된 기의 비율을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 고분자전해질 주쇄에 부착된 소수성 기는 또한 소수성 기에 부착된 하전된 기를 가지며, 이는 주쇄 중의 하전된 기와는 상이한 물질이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "알킬"은 일반적으로 직쇄 또는 분기된(branched) 탄화수소 사슬을 지칭한다. 직쇄 또는 분기쇄 탄화수소 사슬은 예를 들어 알칸, 알켄 및 알킨을 비롯한, 임의의 치환된 또는 비치환된 비시클릭 탄소-함유 화합물을 지칭한다. 알킬 기의 예는 저급 알킬, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸 또는 이소헥실; 고급알킬, 예를 들어, n-헵틸, n-옥틸, 이소옥틸, 노닐, 데실, 등; 저급 알킬렌, 예를 들어, 에틸렌, 프로필렌, 프로필린, 부틸렌, 부타디엔, 펜텐, n-헥센 또는 이소헥센; 및 고급 알킬렌, 예를 들어, n-헵텐, n-옥텐, 이소옥텐, 노넨, 데센 등을 포함한다. 당업자는 본 발명에 포함되는 다수의 직쇄, 즉 선형뿐만 아니라 분기된 알킬 기와 친숙할 것이다.
또한, 이러한 알킬기는 하나 이상의 수소 원자가 관능기에 의해 교체된 다양한 치환기를 함유할 수 있다. 관능기의 예는, 비제한적으로, 카복시기, 설폰기, 포스폰기 등을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "알켄일"은 탄소-탄소 결합의 적어도 하나가 탄소-탄소 이중결합인 직쇄 또는 분기된(branched) 탄화수소 사슬을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "아르알킬"은 적어도 하나의 아릴 기에 의해 말단 치환된 알킬기를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "아르알켄일"은 적어도 하나의 아릴 기에 의해 말단 치환된 알켄일기를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "아릴"은 흔히 적어도 6개의 n(파이) 전자를 포함하는, 콘쥬게이트된 이중결합의 시스템을 갖는 탄화수소 고리를 지칭한다. 아릴 기의 예는, 비제한적으로, 페닐, 나프틸, 아니실, 톨루일 및 크실레닐을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "플루오로탄소"는 하나 이상의 수소 원자가 플루오르 기에 의해 치환된 직쇄 또는 분기된 탄소 사슬을 지칭한다. 직쇄 또는 분기쇄 플루오로탄소 사슬은 일반적으로 예를 들어 알칸, 알켄 및 알킨을 비롯한 임의의 치환된 또는 비치환된 비시클릭 탄소-함유 화합물을 지칭한다. 알킬 기의 예는 저급 알킬, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸 또는 이소헥실; 고급 알킬, 예를 들어, n-헵틸, n-옥틸, 이소옥틸, 노닐, 데실, 등; 저급 알킬렌, 예를 들어, 에틸렌, 프로필렌, 프로필린, 부틸렌, 부타디엔, 펜텐, n-헥센 또는 이소헥센; 및 고급 알킬렌, 예를 들어, n-헵텐, n-옥텐, 이소옥텐, 노넨, 데센 등을 포함한다. 일반적으로, 당업자는 본 발명의 범위에 포함되는 다수의 직쇄, 즉 선형뿐만 아니라 분기된 알킬 기와 익숙할 것이다. 또한, 이러한 알킬기는 하나 이상의 수소 또는 하나 이상의 플루오르 원자가 관능기에 의해 치환된 다양한 치환기를 또한 함유할 수 있다. 관능기의 예는, 비제한적으로, 카복시기, 설폰기, 포스폰기 등을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "관능기"는 본 명세서에 기재된 중합체에 대하여 부가적 관능을 부여하는 기이다. 즉, 관능기는 소수성 기와는 구별되는 기이며, 또 고분자전해질 주쇄에, 예를 들어 주쇄 중의 하전된 기에 부착될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 관능기는 중합체의 결합 특성을 변경시키는 리간드일 수 있고, 예를 들어, 카복시산, 설폰산, 설페이트, 일급 아민, 4급 아민 및 디에틸아미노 기이다. 상기 관능기는 또한 특성을 변형할 수 있거나 또는 자극 반응을 변형시키거나 또는 중합체를 제2 자극에 대해 반응성으로 만드는 것과 같이 중합체에 부가적인 소망하는 특성을 제공할 수 있다. 자극 반응 거동을 변형시키는 예시적 관능기는, 비제한적으로, 카복시산 기(pH 반응성), 피리딘 기(pH 반응성) 및 N-이소프로필아크릴아미도 기(온도 반응)를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "리간드"는 일반적으로 다른 성분에 대한 특이적 결합능을 제공하는 성분을 지칭한다. "리간드"의 예는, 비제한적으로, 이온 교환기, 생체친화성 또는 생체특이적 기, 소수성 기, 친티올 상호작용 기, 킬레이트 또는 킬레이팅 기, 표적 화합물과 소위 파이-파이 상호작용을 갖는 기, 수소 결합기, 및 친수성 기를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "응집(flocculation)"은 하나 이상의 현탁된 불용성 또는 용해성 불순물을 제거하기 위하여 용액에 본 명세서에 기재된 중합체와 같은 응집제 부가를 지칭한다. 상기 중합체는 전형적인 고액 분리 방법을 통하여 용액으로부터 제거될 수 있는 불용성 응집물의 자발적 형성을 허용하는 농도로 용액에 부가되어야 한다.
용어 "조성물" "용액" 또는 "샘플" 본 명세서에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 바람직하지 않은 성분 또는 불순물과 함께 본 명세서에 기재된 하나 이상의 자극 반응성 중합체를 사용하여 정제하려는 표적 분자의 혼합물 또는 소망하는 생성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 샘플은 표적 분자 또는 소망하는 생성물이 분비되는 피드스톡(공급원료: feedstock) 또는 세포 배양 배지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 샘플은 하나 이상의 불순물(예를 들어 숙주 세포 단백질, DNA, RNA, 지질, 세포 배양 첨가제, 세포 및 세포 파편)과 함께 표적 분자(예를 들어 치료성 단백질 또는 항체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 샘플은 세포 배양 배지로 분비되는 목적하는 표적 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 자극 반응성 중합체를 사용하여 표적 분자가 정제될 샘플은 샘플을 자극 반응성 중합체와 접촉시키기 전에 "부분적으로 정제"된다. 부분적 정제는 샘플을 하나 이상의 정제 단계, 예를 들어 하나 이상의 비친화성 크로마토그래피 단계에 처리하여 달성될 수 있다. 상기 표적 분자는 하나 이상의 불순물을 석출시키거나 또는 표적 분자를 석출시키는 것에 의해 하나 이상의 바람직하지 않은 성분 또는 불순물로부터 분리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체는 그자체가 표적 분자 또는 생성물(예를 들어 표적 단백질 또는 폴리펩티드)인 목적하는 생체분자에 제1 세트 조건하에서 결합하며 또 제2 세트 조건하에서, 예를 들어 자극을 샘플에 부가할 때 표적 분자를 석출시킨다. 다른 실시양태에서, 목적하는 생체분자는 표적 분자 이외의 분자이다. 즉, 본 명세서에 기재된 자극 반응성 중합체에 의해 결합된 상기 목적하는 생체분자는 샘플 중의 표적 분자와 결합하는 것이 바람직하지 않은 분자일 수 있다. 이론에 얽매임 없이, 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체는 자극 부가시에 숙주 세포 단백질, DNA, 전체 세포, 세포 파편, 바이러스, 내독소, 및/또는 세포 배양 첨가제 중의 하나 이상과 반응하여 석출시킨다. 따라서, 표적 분자(예를 들어 표적 단백질 또는 폴리펩티드)는 소망하는 표적 분자를 석출하는 것에 의해 또는 소망하는 표적 분자를 함유하는 샘플에 존재할 수 있는 하나 이상의 바람직하지 않은 성분(예를 들어 하나 이상의 불순물)을 석출하는 것에 의해 본 명세서에 기재된 중합체를 사용하여 정제될 수 있다.
용어 "석출하고", "석출하는" 또는 "석출" 본 명세서에 사용된 바와 같이, 수성 및/또는 용해성 상태에서부터 비수성 및/또는 불용성 상태에 이르기까지의 결합된(예를 들어 목적하는 생체분자와의 복합체에서) 또는 미결합 중합체의 변형을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "목적하는 생체분자"는 본 명세서에 기재된 자극 반응성 중합체에 의해 결합되어 석출되는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 상기 목적하는 생체분자는 예를 들어, 소망하는 생성물 또는 목적하는 폴리펩티드(예를 들어 항체)와 같은 소망하는 표적 분자일 수 있거나, 또는 소망하는 표적 분자를 함유하는 샘플로부터 제거될 필요가 있는 바람직하지 않은 성분일 수 있다. 이러한 바람직하지 않은 성분은, 비제한적으로, 예를 들어, 숙주 세포 단백질, DNA, RNA, 단백질 응집물, 세포 배양 첨가제, 바이러스, 내독소, 전체 세포 및 세포 파편으로부터 선택된 하나 이상의 불순물을 포함한다.
본 명세서에 상호교환적으로 사용되는 용어 "표적 분자", "표적 생체분자", "소망하는 표적 분자" 및 "소망하는 표적 생체분자"는, 일반적으로 목적하는 폴리펩티드 또는 생성물을 지칭하며, 이러한 것은 상기 목적하는 폴리펩티드 또는 생성물을 함유하는 샘플에 존재할 수 있는 하나 이상의 바람직하지 않은 성분, 예를 들어 하나 이상의 불순물로부터 정제되거나 또는 분리되는 것이 바람직하다.
본 명세서에 상호교환적으로 사용되는 용어 "목적하는 단백질", "표적 폴리펩티드", "목적하는 폴리펩티드" 및 "표적 단백질"은 비제한적으로 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체를 사용하여 정제시킬 항체를 비롯한 치료성 단백질 폴리펩티드를 일반적으로 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 상호교환적으로 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 일반적으로 약 10개 아미노산보다 많은 펩티드 및 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 자극 반응성 중합체는 단백질 또는 폴리펩티드와 함께 샘플에 존재하는 하나 이상의 바람직하지 않은 성분으로부터 단백질 또는 폴리펩티드를 분리하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 성분은 정제할 단백질 또는 폴리펩티드과 함께 샘플에 존재할 수 있는 하나 이상의 불순물이다. 상기 논의한 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 자극 반응성 중합체는 자극을 샘플에 부가할 때 목적하는 단백질 또는 생성물을 특이적으로 결합하여 석출한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 자극 반응성 중합체는 자극을 부가할 때 예를 들어, 숙주 세포 단백질, DNA, 바이러스, 전체 세포, 세포 파편 및 세포 배양 첨가제와 같이, 목적하는 단백질 또는 폴리펩티드 이외의 성분을 결합하여 석출한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 자극 반응성 중합체를 사용하여 정제될 단백질 또는 폴리펩티드는 포유동물 단백질, 예를 들어 치료성 단백질 또는 요법에 사용될 수 있는 단백질을 지칭한다. 예시적 단백질은, 비제한적으로, 예를 들어, 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자와 같은 응고인자; 단백질 C와 같은 항-응고인자; 심방성 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 우로키나제 또는 인간의 뇨 또는 조직-형 플라스미노겐 활성화제(t-PA)와 같은 플라스미노겐 활성화제; 봄베신; 트롬빈; 조혈성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES(활성화되어 정상적 T-세포 발현되고 분비되는 것에 대한 조절); 인간 대식세포 염증성 단백질(MIP-1-알파); 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민; 뮐러리안-억제 물질; 렐락신 A-사슬; 렐락신 B-사슬; 프로렐락신; 마우스 고나도트로핀 관련 펩티드; 베타-락타마제와 같은 미생물 단백질; Dnase; IgE; CTLA-4와 같은 세포독성 T-림프구 관련 항원(CTLA); 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자(VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마토이드 인자; 뼈 유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6)과 같은 신경영양 인자, 또는 NGF-β와 같은 신경 성장 인자; 혈소판 유래 성장 인자(PDGF); α-FGF 및 β-FGF와 같은 섬유아세포 성장 인자; 상피 성장 인자(EGF); TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGFβ4, 또는 TGF-β5를 비롯한 TGF-알파 및 TGF-베타와 같은 형질전환 성장 인자(TGF); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-Π); des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP); CD3, CD4, CD8, CD 19 CD20, CD34, 및 CD40과 같은 CD 단백질; 에리트로포이에틴; 골형성유도성 인자; 면역독소; 뼈형성 단백질 (BMP); 인터페론-알파, -베타, 및 -감마와 같은 인터페론; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터루킨(IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 슈퍼옥사이드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 부식 촉진 인자; 예를 들어, AIDS 엔빌로프(envelope)의 일부와 같은 바이러스 항원; 수송 단백질; 귀소 수용체(homing recepotors); 어드레신; 조절 단백질; CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM과 같은 인테그린; HER2, HER3 또는 HER4 수용체와 같은 종양 관련 항원; 및 상기 수록한 폴리펩티드의 단편 및/또는 변이체를 포함한다.
또한, 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 스마트 중합체를 사용하여 정제된 단백질 또는 폴리펩티드는 항체, 기능적 단편 또는 그의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 목적하는 단백질은 면역글로불린의 Fc 영역을 함유하는 재조합 단백질이다.
용어 "면역글로불린" "Ig" 또는 "항체"(본 명세서에서 상호교환적으로 사용됨)는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 이루어지는 기본적 4개-폴리펩티드사슬 구조를 갖는 단백질을 지칭하며, 상기 사슬은 예를 들어, 사슬내 디설피드 결합에 의해 안정화되며, 항원을 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 용어 "단일-사슬 면역글로불린" 또는 "단일-사슬 항체" (본 명세서에서 상호교환적으로 사용됨)는 1개 중쇄와 1개 경쇄로 이루어지는 2개-폴리펩티드 사슬 구조를 갖는 단백질을 지칭하며, 상기 사슬은 예를 들어 사슬내 펩티드 링커에 의해 안정화되며, 항원을 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 용어 "도메인"은 예를 들어, β-병풍 구조 및/또는 사슬내 디설피드 결합에 의해 안정화된 펩티드 루프(예를 들어 3 내지 4개 펩티드 루프를 포함하는)를 포함하는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 구상 영역을 지칭한다. 도메인은 또한 본 명세서에서는 "불변" 도메인의 경우 다양한 클래스 멤버의 도메인 내에서 서열 변이성이 비교적 결여된 것 또는 "가변" 도메인의 경우 다양한 클래스 멤버의 도메인 내에서 현저한 변형을 기본으로 하여 "불변" 또는 "가변"이라 칭한다. 항체 또는 폴리펩티드 "도메인"은 흔히 당해 기술분야에서 상호교환적으로 항체 또는 폴리펩티드 "영역"으로 지칭된다. 항체 경쇄의 "불변" 도메인은 상호교환적으로 "경쇄 불변 영역", "경쇄 불변 도메인", "CL" 영역 또는 "CL" 도메인이라 지칭한다. 항체 중쇄의 "불변" 도메인은 "중쇄 불변 영역", "중쇄 불변 도메인", "CH" 영역 또는 "CH" 도메인이라 칭한다. 항체 경쇄의 "가변" 도메인은 상호교환적으로 "경쇄 가변 영역", "경쇄 가변 도메인", "VL" 영역 또는 "VL" 도메인이라 칭한다. 항체 중쇄의 "가변" 도메인은 상호교환적으로 "중쇄 가변 영역", "중쇄 가변 도메인", "VH" 영역 또는 "VH" 도메인이라 칭한다.
면역글로불린 또는 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고 또 단량체성 또는 중합체성 형태, 예를 들어, 오량체 형태로 존재하는 IgM 항체 및/또는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 존재하는 IgA 항체로 존재할 수 있다. 면역글로불린 또는 항체는 이들이 리간드 특이적 결합 도메인을 함유하거나, 또는 리간드 특이적 결합 도메인을 포함하도록 변형된 것인 한 다수종 특이적 항체 (예를 들어 2종 특이적 항체), 및 항체 단편을 포함할 수 있다. 용어 "단편"은 무손상(intact) 또는 완전한 항체 또는 항체 사슬에 비하여 더 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 사슬의 일부 또는 부분을 지칭한다. 단편은 무손상 또는 완전한 항체 또는 항체 사슬의 화학적 또는 효소적 처리를 통하여 얻을 수 있다. 단편은 또한 재조합 수단에 의해 얻을 수 있다. 재조합적으로 제조되면, 단편은 단독으로 발현되거나 또는 융합 단백질이라 불리는 대형 단백질의 부분으로서 발현될 수 있다. 예시적 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및/또는 Fv 단편을 포함한다. 예시적 융합 단백질은 Fc 융합 단백질을 포함한다.
일반적으로, 면역글로불린 또는 항체는 목적하는 "항원"에 대한 것이다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고 또 질병 또는 질환에 걸린 포유동물에 항체를 투여하는 것이 포유동물에서 치료 효과를 초래할 수 있다. 그러나, 비폴리펩티드 항원(종양-관련된 당지질 항원; 참조 미국 특허번호5,091,178호)에 대한 항체도 또한 고려된다. 상기 항원이 폴리펩티드이면, 막관통 분자(transmembrane molecule) (예컨대 수용체) 또는 성장 인자와 같은 리간드일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 얻은 항체를 지칭하며, 즉 상기 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 천연 산출 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위에 대한 것이다. 또한, 상이한 항원결정기(에피토프: epitope)에 대한 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제조와 대조적으로, 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 항원결정기에 대한 것이다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 균일한 집단으로부터 얻은 항체의 특징으로서 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하지 않는 것으로 이해된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 Kohler et al., Nature 256:495 (1975)에 의해 최초로 기재된 하이브리도마(hybridoma) 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(참조, 예를 들어 미국 특허번호 4,8 6,567호)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 예를 들어 Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)에 기재된 수법을 이용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
모노클로날 항체는 또한 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스(subclass)로부터 유래한 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동이면서, 사슬의 나머지는 이들이 소망하는 생물학적 활성(미국 특허번호 4,81,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984))을 나타내는 한, 다른 종 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 것으로부터 유도된 항체로부터 유도된 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동인 "키메라" 항체(면역글로불린)를 포함한다.
본 명세서에 사용될 때 용어 "초가변(hypervariable) 영역"은 항원-결합에 관여하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 상기 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"(즉 경쇄 가변 도메인 중의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인 중의 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))으로부터 얻은 아미노산 잔기 및/또는 "초가변 루프" (즉 경쇄 가변 도메인 중의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3) 및 중쇄 가변 도메인 중의 26-32(H1), 53-55 (H2) 및 96-101(H3)로부터 얻은 잔기를 포함한다; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "프레임워크(Framework)" 또는 "FR" 잔기는 상기 정의된 바와 같이 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
비-인간(예를 들어 쥐) 항체의 "인간화된 형태"는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 수용체의 초가변 영역 잔기가 소망하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트(rat), 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종(공여체 항체)로부터의 초가변 영역 잔기에 의해 교체된 인간 면역글로불린(수용체 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화된 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 정제하기 위하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린에 상응하며 또 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 그것이다. 인간화된 항체는 경우에 따라 전형적으로 인간 면역글로불린의 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 것이다. 더욱 자세하게는, 하기 참조 요망: Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체를 사용하여 분리되거나 정제된 항체는 치료 항체이다. 예시적 치료 항체는, 예를 들어, 트라츠주맙 (HERCEPTTN™, Genentech, Inc., Carter et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289; 미국 특허번호 5,725,856호); 키메라 항-CD20 "C2B8"와 같은 항-CD20 항체, 미국 특허번호 5,736,137호); 리툭시맙(RITUXAN™), 오크렐리주맙, 2H7 항체의 키메라 또는 인간화된 변이체(미국 특허번호 5,721,108호; WO 04/056312호) 또는 토시투모맙(BEXXAR™); 항-IL-8 (St John et al (1993) Chest, 103:932, 및 WO 95/23865호); 인간화된 항-VEGF 항체 huA4.6.1 베바시주맙과 같은 인간화된 및/또는 친화성 성숙된 항-VEGF 항체를 비롯한 항-VEGF 항체(AVASTIN™, Genentech, Inc., Kim et al (1992) Growth factors 7:53-64, WO 96/30046호, WO 98/45331호); 항-PSCA 항체(WO 01/40309호); S2C6 및 인간화된 그의 변이체(WO 00/75348호)를 비롯한 항-CD40 항체; 항-CD11a(미국 특허번호 5,622,700호; WO 98/23761호; Steppe et al (1991) Transplant Intl. 4:3-7; Hourmant et al (1994) Transplantation 58:377-380); 항-IgE(Presta et al (1993) J. Immunol. 151:2623-2632; WO 95/19181호); 항-CD18 (미국 특허번호 5,622,700호; WO 97/26912호); E25, E26 및 E27과 같은 항-IgE(미국 특허번호 5,714,338호; 미국 특허번호 5,091,313호; WO 93/04173호; 미국 특허번호 5,714,338호); 항-Apo-2 수용체 항체 (WO 98/51793호); cA2(REMICADE™), CDP571 및 MAK-195를 비롯한 항-TNF-알파 항체(미국 특허번호 5,672,347호; Lorenz et al (1996) J. Immunol. 156(4):1646-1653; Dhainaut et al (1995) Crit. Care Med. 23(9):1461-1469); 항-조직 인자(TF)(EP 0 420 937 Bl호); 항-인간 알파 4 베타 7 인테그린(WO 98/06248호); 항-EGFR, 키메라화된 또는 인간화된 225 항체 (WO 96/40210); OKT3와 같은 항-CD3 항체(미국 특허번호 4,515,893호); CHI-621 SIMULECT™ 및 ZENAPAX™ 와 같은 항-CD25 또는 항-tac 항체(미국 특허번호 5,693,762호); cM-7412 항체와 같은 항-CD4 항체(Choy et al (1996) Arthritis Rheum 39(1):52-56); CAMPATH-1H와 같은 항-CD52 항체(Riechmann et al (1988) Nature 332:323-337); Fc 감마 RI에 대한 M22 항체와 같은 항-Fc 수용체 항체, Graziano et al (1995) J. Immunol. 155(10):4996-5002; hMN-14와 같은 항-암태아성 항원(CEA) 항체(Sharkey et al (1995) Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s; huBrE-3, hu-Mc 3 및 CHL6을 비롯한 유방 상피세포에 대한 항체(Ceriani et al [1995] Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s; 및 Richman et al (1995) Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s); C242와 같이 결장 암종 세포에 결합하는 항체(Litton et al (1996) Eur J. Immunol. 26(1):1-9); 항-CD38 항체, 예컨대 AT 13/5(Ellis et al (1995) J. Immunol. 155(2):925-937); Hu M195와 같은 항-CD33 항체(Jurcic et al (1995) Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s 및 CMA-676 또는 CDP771; LL2 또는 LymphoCide와 같은 항-CD22 항체(Juweid et al (1995) Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s); 17-1A(PANOREX™)와 같은 항-EpCAM 항체; 압씨시마브 또는 c7E3 Fab(REOPRO™)와 같은 항-GpIIb/IIIa 항체; MEDI-493(SYNAGIS™)과 같은 항-RSV 항체; PROTOVIR™과 같은 항-CMV 항체; PR0542와 같은 항-HIV 항체; 항-Hep B 항체 OSTAVIR™과 같은 항-간염 항체; 항-CA 125 항체 OvaRex; 항-유전자형 GD3 에피토프 항체 BEC2; 항-알파 v 베타3 항체 VITAXIN™; ch-G250과 같은 항-인간 신세포 암종 항체; ING-1; 항-인간 17-1A 항체(3622W94); 항-인간 결장직장 종양 항체(A33); GD3 강글리오사이드에 대한 항-인간 흑색종 항체 R24; 항-인간 편평상피세포 암종(SF-25); 및 스마트 ID10와 같은 항-인간 백혈구 항원(HLA) 항체 및 항-HLA DR 항체 Oncolym(Lym-1)를 포함한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "오염물" "불순물" 및 "파편"은 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체를 사용하여 하나 이상의 외래 또는 부적절한 분자로부터 분리되는 목적하는 단백질 또는 폴리펩티드(예를 들어 항체)를 함유하는 샘플에 존재할 수 있는 DNA, RNA, 하나 이상의 숙주 세포 단백질(HCPs 또는 CHOPs), 내독소, 바이러스, 지질 및 하나 이상의 첨가제와 같은 생물학적 거대분자를 비롯한 외래 또는 부적절한 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 자극 반응성 중합체는 목적하는 단백질 또는 폴리펩티드 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 샘플로부터 목적하는 단백질 또는 폴리펩티드를 결합하여 석출한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 자극 반응성 중합체는 하나 이상의 불순물에 결합하고 석출함으로써, 하나 이상의 불순물로부터 목적하는 폴리펩티드 또는 단백질을 분리한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "중국 햄스터 난소 세포 단백질" 및 "CHOP"은 중국 햄스터 난소("CHO") 세포 배양물로부터 유도된 숙주 세포 단백질("HCP")의 혼합물을 지칭한다. HCP 또는 CHOP는 일반적으로 세포 배양 배지 또는 용균물(예를 들어 목적하는 단백질 또는 폴리펩티드(예를 들어 CHO 세포에서 발현된 항체 또는 이뮤노어드헤신(immunoadhesin)을 함유하는 수집된 세포 배양액) 중에서 불순물로서 존재한다. 일반적으로, 목적하는 단백질을 포함하는 혼합물 중에 존재하는 CHOP의 양은 목적하는 단백질에 대한 순도 정도의 척도를 제공한다. 전형적으로, 단백질 혼합물 중의 CHOP의 양은 혼합물 중의 목적하는 단백질의 양에 대하여 ppm으로 발현된다.
숙주 세포가 다른 포유동물 세포 유형, 대장균, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 식물 세포인 경우, HCP는 숙주 세포의 용균물에서 발견되는 표적 단백질 이외의 단백질을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "세포 배양 첨가제"는 세포 배양 또는 발효 공정을 용이하게 하거나 또는 향상시키기 위하여 세포 배양 공정에 부가되는 분자(예를 들어 비-단백질 첨가제)를 지칭한다. 본 발명에 따른 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 자극 반응성 중합체는 하나 이상의 세포 배양 첨가제와 결합하여 석출한다. 예시적 세포 배양 첨가제는 기포방지제, 항생물질, 염료 및 영양분을 포함한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "ppm", "백만 당 부"는 본 명세서에 기재된 자극 반응성 중합체를 사용하여 정제된 복수의 소망하는 표적 분자 (예를 들어 표적 단백질 또는 항체)의 정도이다. 따라서, 이러한 정도는 정제 공정 이후 존재하는 표적 분자의 양을 정량하거나 또는 바람직하지 않은 성분의 양을 정량하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단위 "ppm"은 목적하는 단백질 나노그램/밀리리터를 함유하는 용액 중의 불순물, 즉 HCP 또는 CHOP의 양을 밀리그램/밀리리터(즉, CHOP ppm= (CHOP ng/ml)/(목적하는 단백질 mg/ml)을 지칭한다. 단백질이 건조되면(예를 들어 동결건조에 의해), ppm은 (CHOP ng)/(목적하는 단백질 mg))을 지칭한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "단리하는" "정제하는" 및 "분리하는"은 표적 분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 조성물 또는 샘플로부터, 본 명세서에 기재된 자극 반응성 중합체를 사용하여 표적 분자(예를 들어, 목적하는 폴리펩티드 또는 단백질)를 정제하는 내용을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 샘플 중의 표적 분자의 정제 정도는 본 명세서에 기재된 바와 같은 자극 반응성 중합체를 사용하는 것에 의해 하나 이상의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거하는 것에 의해 증가된다. 다른 실시양태에서, 샘플 중의 표적 분자의 순도 정도는 샘플 중의 하나 이상의 불순물로부터 표적 분자를 석출 제거하는 것에 의해 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 정제 공정은 또한 하나 이상의 "크로마토그래피 단계"를 적용한다. 전형적으로, 이들 단계는 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체를 사용하여 하나 이상의 바람직하지 않은 성분으로부터 표적 분자를 분리한 후 필요한 경우 실시할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 자극 반응성 주합체를 사용하여 목적하는 폴리펩티드 또는 단백질을 단리, 분리 또는 정제하는 "정제 단계"는 "균일한" 또는 "순수한" 조성물 또는 샘플을 초래하는 전체 정제 공정의 일부일 수 있으며, 이러한 용어는 목적하는 단백질을 포함하는 조성물 중에 100 ppm 미만의 HCP, 다르게는 90 ppm 미만, 80 ppm 미만, 70 ppm 미만, 60 ppm 미만, 50 ppm 미만, 40 ppm 미만, 30 ppm 미만, 20 ppm 미만, 10 ppm 미만, 5 ppm 미만 또는 3 ppm 미만의 HCP를 포함하는 조성물 또는 샘플을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "청정화 단계"는 일반적으로 생체분자의 정제에서 하나 이상의 초기 단계를 지칭한다. 청정화 단계는 일반적으로 예를 들어 원심분리 및 심층 여과, 석출 응집 및 침강 중의 단독 또는 다양한 조합을 비롯한 하나 이상의 단계를 이용하여 세포 및/또는 세포 파편을 제거하는 것을 포함한다. 청정화 단계는 일반적으로 하나 이상의 바람직하지 않은 성분의 제거를 포함하며 또 소망하는 표적 분자의 포획을 비롯한 단계 이전에 전형적으로 실시된다. 청정화의 다른 주요 관점은 샘플 중의 용해성 및 불용성 성부의 제거이며, 이는 이후에 정제 공정에서 멸균 필터의 오염을 지체시키므로, 전체 공정을 더욱 경제적으로 만들 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본 명세서의 실시예에 기재한 바와 같이 감소된 탁도/불순물 및 하류 필터의 더 높은 처리량에 의해 드러나는 바와 같이 다양한 정제 도식에 흔히 사용되는 통상의 청정화 단계에 비하여 개선점을 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "크로마토그래피"는 혼합물 중에 존재하는 다른 분자로부터 목적하는 분석물(예컨대 표적 분자)을 분리하는 일종의 수법을 지칭한다. 통상, 목적하는 분석물은 이동상의 영향 하에서 정지 매질을 통하여 혼합물의 개별 분자가 이동하는 속도에서 차이로 인하여 다른 분자로부터 분리되거나, 또는 결합 및 용출 공정으로 분리된다.
용어 "크로마토그래피 수지" 또는 "크로마토그래피 매질"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며 또 혼합물 중에 존재하는 다른 분자로부터 목적하는 분석물(예를 들어 표적 분자)를 분리하는 임의 종류의 상(예를 들어 고상)을 지칭한다. 통상, 목적하는 분석물은 이동상의 영향하에서 정지 고상을 통하여 혼합물의 개별 분자가 이동하는 속도에서의 차이로 인하여 다른 분자로부터 분리되거나, 또는 결합 및 용출 공정으로 분리된다. 다양한 유형의 크로마토그래피 매질의 예는 예를 들어, 양이온 교환 수지, 친화성 수지, 음이온 교환 수지, 음이온 교환 막, 소수성 상호작용 수지 및 이온 교환 모노리쓰(monoliths)를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "포획 단계"는 일반적으로 표적 분자를 자극 반응성 중합체 또는 크로마토그래피 수지와 결합시키기 위해 사용된 방법을 지칭하며, 이는 표적 분자와 중합체 또는 수지의 석출물을 함유하는 고상을 초래한다. 전형적으로, 상기 표적 분자는 이어 용출 단계를 이용하여 회수되며, 이는 고상으로부터 표적 분자를 제거함으로써, 하나 이상의 불순물로부터 표적 분자의 분리를 초래한다. 다양한 실시양태에서, 상기 포획 단계는 수지, 막 또는 모노리쓰와 같은 크로마토그래피 매질, 또는 자극 반응성 중합체와 같은 중합체, 표적 분자와 결합하는 고분자전해질 또는 중합체를 사용하여 실시될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "염"은 산 및 염기의 상호작용에 의해 형성된 화합물을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 방법에 이용된 다양한 완충액에 사용될 수 있는 다양한 염은, 비제한적으로, 아세테이트(예컨대 소듐 아세테이트), 시트레이트(예를 들어 시트르산 나트륨), 클로라이드(예를 들어 염화나트륨), 설페이트(예를 들어 소듐 설페이트), 또는 칼륨 염을 포함한다.
본 명세서에 상호교환적으로 사용되는 용어 "다가 염" 또는 "다가 이온"은 하나 이상의 전하 또는 전하 함유 기를 함유하는 화합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 다가 염은 자극으로 사용되어 염 자극에 대한 중합체 반응성의 용해도 변화를 초래하며, 통상 용액의 중합체 석출을 초래한다. 사용될 수 있는 예시적 다가 염은, 예를 들어, 포스페이트 및 설페이트를 포함한다. 또한 예를 들어, 시트레이트와 같이 사용될 수 있는 대이온이 본 발명에 포함된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 다가 염이 자극으로 사용될 때, 자극 반응성 중합체와 함께 목적하는 생체분자를 함유하는 샘플에 대하여 단독 시약으로 부가될 수 있다. 다르게는, 상기 염은 기질, 예를 들어 막에 부착될 수 있다. 특정 실시양태에서, 막은 다가 염 함유 중합체 코팅인 폴리비닐 포스페이트에 의해 변형된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 자극으로 사용된 다가 이온은 온도 및 pH와 같은 다른 자극에 대하여 단백질 구조 및 안정성에 대한 유해 효과가 덜한 것으로 생각된다.
일부 실시양태에서, 다가 염은 하나 이상의 성분과 상호작용할 수 있으므로, 관련 화학종 또는 복합체를 형성한다. 따라서, 이러한 염은 "복합체 형성 염"이라 칭할 수 있다. 복합체 형성 염 및 이들의 생성 복합체의 비제한적인 예는 Cu2 + 및 Ca2+와 같은 다가 양이온 및 이들의 에틸렌디아민테트라아세테이트에서 찾을 수 있는 카복시산과의 복합체; 포스페이트(PO4 3 -) 및 시트레이트와 같은 다가 음이온 및 이들의 폴리알릴아민에서 찾을 수 있는 일급 아민과의 복합체; 및 퍼클로레이트, 도데실 설페이트 및 도데실 벤젠 설포네이트와 같은 이온결합 염 및 이들의 폴리알릴아민에서 찾아지는 일급 아민과의 복합체가다.
"이온결합 염"은 일가(양이온 또는 음이온), 부피가 크고 전하-분산된 염이다. 일부 실시양태에서, 이온결합 염은 자극으로 사용되어, 염 자극에 대한 중합체 반응성의 용해도를 변화시켜, 용액 밖으로 중합체 석출을 초래한다. 사용될 수 있는 예시적 이온결합염은 예를 들어, 퍼클로레이트, 도데실 설페이트, 도데실 벤젠 설포네이트, 테트라페닐 보레이트 및 헥사니트로디페놀 아민을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "용매"는 일반적으로 하나 이상의 다른 물질을 용해 또는 분산시켜 용액을 제공할 수 있는 액체 물질을 지칭한다. 용매는 수성 및 유기 용매를 포함하며, 유용한 유기 용매는 비극성 용매 에탄올, 메탄올, 메탄올, 이소프로판올, 아세토니트릴, 헥실렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 2,2-티오디글리콜을 포함한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 폴리펩티드의 "pI" 또는 "등전점"은 폴리펩티드의 양전하가 그의 음전하를 균형을 이루는 pH이며, pI는 폴리펩티드의 탄수화물에 부착된 아미노산 잔기 또는 시알산 잔기의 네트 전하로부터 산출될 수 있거나 또는 등전 포커싱(isoelectric focusing)에 의해 결정될 수 있다.
본 발명은 또한 비제한적인 이하의 실시예에 의해 더욱 자세히 설명된다. 이 출원뿐만 아니라 도면에서 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개 특허 출원은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
실시예
실시예 1: 청정화되지 않은 비- 발현성 세포 배양액( CCF )의 제조
대표적 실험으로서, 비-발현성 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주로부터 유래한 세포를 10L 바이오리액터(New Brunswick Scientific)에서 lOxlO6 세포/mL 밀도로 성장시키고 또 64% 생존율로 수집하였다. IgG는 1.3 g/L의 농도로 넣었다(spiked). 숙주 세포 단백질(HCP)의 수준은 ELISA(Cygnus # CM015)를 이용하여 8300 ng/mL인 것으로 밝혀졌다. 청정화되지 않은 세포 배양액의 pH는 pH 7.2이었다.
실시예 2: 소수성 기에 의해 변형된 고분자전해질 주쇄를 포함하는 자극 반 응성 중합체의 합성
대표적 실험으로서, 소수성 기에 의해 변형된 폴리알릴아민(BzMPAA) 주쇄를 포함하는 자극 반응성 중합체를 합성하였다. 소수성 기에 의해 변형된 양이온성 고분자전해질 주쇄를 포함하는 중합체는 10.3 g의 40 중량% 선형 폴리알릴아민(NITTOBO, 150 kD), 2 g의 수산화리튬 및 20 mL의 50% 물/메탄올의 혼합물을 사용하여 잘 혼합될 때까지 교반하여 합성하였다. 2.1 mL의 벤질 클로라이드가 15 mL의 메탄올에 용해된 용액을 상기 중합체 용액에 부가하였다. 생성한 혼합물을 60℃에서 14시간 동안 가열하였다. 벤질 변형된 폴리알릴아민은 상기 용매와 열역학적 비혼합성의 결과로 반응 기간의 말기에 석출되었다. 상기 석출물을 30mL의 아세톤으로 세척하고 또 400mL의 1M 아세트산에 재용해시켰다. 상기 중합체는 또한 pH 7에서 50mM 인산나트륨을 사용하여 석출에 의해 정제시켰다. 도 1은 폴리알릴아민 고분자전해질 중합체와 소수성 기, 즉, 벤질클로라이드의 반응도를 도시한다.
실시예 3: 벤질 변형된 폴리알릴아민 ( BzMPAA ) 용액의 제조
실시예 2에서 얻은 중합체 10 g을 실온에서 연속적으로 교반하면서 90g의 1M 아세트산에 16시간 동안 용해시켜 BzMPAA의 10% 용액을 제조하였다. 생성한 점성 용액은 약간 흐릿하였다.
실시예 4: 비- 발현성 세포 배양액( CCF )의 청정화에서 상이한 농도의 벤질 변 형된 폴리알릴아민(BzMPAA)의 사용
실시예 3으로부터 얻은 BzMPAA를 0.2g, 0.3g, 0.4g 및 0.5g의 양으로 실시예 1로부터 얻은 청정화되지 않은 세포 배양액(CCF) 5mL 샘플에 부가하였다. 상기 샘플을 실온에서 2분간 혼합하였다. 중합체 부가는 PH를 pH 4.5 내지 5.5 범위로 감소시키므로, 혼합물의 pH는 2M 트리스 염기를 사용하여 pH 7로 조절하였다. 생성한 용액에, 중합체-표적 분자, 세포 및 세포 파편 복합체를 석출시키기 위하여 0.043g의 이염기성 인산칼륨을 부가하였다. 분산된 고체 현탁액 형태의 석출물을 연속적으로 5분간 혼합하였다. 상기 석축물을 원심분리(4000 rpm으로 1분간)에 의해 수집하였다. 각 샘플로부터 상청액을 0.2㎛ Durapore® 필터를 통하여 여과시켰다. 생성한 정제는 하기 표 1에 자세히 나타낸다.
실시예 5: BzMPAA 를 갖는 비- 발현성 CCF 의 청정화에서 상이한 pH 값의 이용
실시예 3으로부터 얻은 BzMPAA를 실시예 1로부터 얻은 5mL의 청정화되지 않은 세포 배양액을 함유하는 4개의 샘플(0.4 g 각각)에 부가하였다. 상기 샘플을 실온에서 2분간 혼합하였다. 중합체 부가는 pH를 pH 4.5 내지 5.5 범위로 감소시키기 때문에, 혼합물의 pH는 2M 트리스 염기를 사용하여 pH 5.5, 6.5, 7.5 및 8.5로 각각 조절하였다. 생성한 용액에, 중합체-표적 분자, 세포 및 세포 파편 복합체를 석출하기 위하여 0.043 g의 이염기성 인산칼륨을 부가하였다. 분산된 고체 현탁액 형태의 석출물을 연속적으로 5분간 혼합하였다. 이어 석출물을 원심분리(4000 rpm 1분간)를 통하여 수집하였다. 각 샘플로부터 얻은 상청액은 0.2㎛ Durapore® 필터를 통하여 여과하였다. 생성한 정제는 투입된 비-발현성 CHO CCF의 BzMPAA 정제를 설명하는 표 1에 상세히 기재되어 있다.
Figure 112014118126727-pat00005
실시예 6: CCF 의 청정화에서 BzMPAA 의 사용에 기인한 순도 수준에 대한 분석
실시예 4 및 실시예 5로부터 얻은 샘플은 친화성 단백질 A 분석용 HPLC 에세이를 이용하여 IgG 회수율에 대해 에세이 하였다. 용액 중에서 IgG의 수준은 다르게는 분석적 단백질 A 컬럼을 이용하여 측정하였다. 특히, Poros A/20 단백질 A 컬럼(Applied Biosystems)은 PBS에 의해 평형화시킨 다음, 0.1M 리신(pH 2)을 사용하여 용출시킨 다음 6M 구아니딘 HCl에 의해 세척하였다. IgG 표준 곡선은 일련의 다양한 주사 부피의 폴리클로날 IgG(Seracare)를 사용하여 작성하였다. 샘플을 주사하고 표준 곡선으로부터 IgG 농도를 결정하였다.
실시예 4 및 실시예 5로부터 얻은 샘플은 상업적 효소-결합된 면역흡착 에세이(ELISA) 키트(Cygnus Technologies Inc., Southport, N.C., Cygnus # CM015)를 이용하여 숙수 제포 단백질(HCP)에 대해 에세이하였다. 실시예 4 및 실시예 5로부터 얻은 샘플은 또한 표준 피코 그린 에세이(pico green assay) 및 청어 정자 DNA를 표준으로 사용하여 DNA에 대해 에세이하였다.
실시예 7: 청정화되지 않은 세포 배양액 ( CCF )의 제조
중국 햄스터 난소(CHO-DG44) 세포주 발현으로부터 유래한 세포를 10L 바이오리액터(New Brunswick Scientific)에서 lOxlO6 세포/mL 밀도까지 성장시키고 또 30% 생존율로 수집하였다. 모노클로날 항체(MAb) 역가(titer)는 0.8 g L인 것으로 결정되었다. 숙주 세포 단백질(HCP)의 수준은 ELISA 에세이(Cygnus # 3G ELISA)를 이용하여 200,000 ng/mL인 것으로 밝혀졌다. 청정화되지 않은 세포 배양액의 pH는 pH 6.9이었다.
실시예 8: 20% 벤질 변형된 폴리알릴아민(BzMPAA)의 합성
1Og의 폴리알릴아민(PAA)(Nittobo, 150 kD; 40% wt./wt.)을 100 mL 원형 바닥 플라스크에 넣고 또 3.34g의 수산화 나트륨(1.2 당량/단량체)이 25mL H2O에 용해된 용액을 자기 교반하의 실온에서 소량씩 부가하였다. 벤질 클로라이드(1.38g, 1.25mL)를 한꺼번에 부가하고, 실온에서 수분간 교반한 다음 철야로 17시간 동안 60℃로 가열하였다. 반응을 실온으로 냉각시키고 또 용매를 제거하여 중합체 석출을 유도하였다. 석출된 중합체를 물로 세척한 다음 1M AcOH 수용액(40mL) 중에서 완전한 용해가 달성될 때까지 교반하였다. 이 용액은 H2O에 의해 최종 부피 400mL (1% 중합체 용액)로 희석하고, 이염기성 인산 칼륨(K2HPO4)(3.48g)을 교반하에서 부가하고 또 용액의 pH를 약 6.8로 조절하여 변형된 중합체를 석출시켰다. 이 중합체를 유리 깔때기 위로 여과에 의해 수집하고 마지막으로 진공 오븐 중, 50-60℃에서 철야로 건조시켰다.
실시예 9: 40% 벤질 변형된 폴리알릴아민 ( BzMPAA )의 합성
1Og의 폴리알릴아민(PAA)(Nittobo, 150 kD; 40% wt./wt.)을 100 mL 원형 바닥 플라스크에 넣고 또 3.34g의 수산화 나트륨(1.2 당량/단량체)이 25mL H2O에 용해된 용액을 자기 교반하의 실온에서 소량씩 부가하였다. 벤질 클로라이드(2.30g, 2.09mL)를 부가하고, 실온에서 수 분간 교반한 다음 철야로 17시간 동안 60℃로 가열하였다. 반응을 실온으로 냉각시키고 또 용매를 제거하여 중합체 석출을 유도하였다. 석출된 중합체를 물로 세척한 다음 1M AcOH 수용액(40mL) 중에서 완전한 용해가 달성될 때까지 교반하였다. 이 용액은 H2O에 의해 최종 부피 400mL (1% 중합체 용액)로 희석하고, 이염기성 인산 칼륨(K2HPO4)(3.48g)을 교반하에서 부가하고 또 용액의 pH를 약 6.8로 조절하여 변형된 중합체를 석출시켰다. 이 중합체를 유리 깔때기 위로 여과에 의해 수집하고 마지막으로 진공 오븐 중, 50-60℃에서 철야로 건조시켰다.
실시예 10: 60% 벤질 변형된 폴리알릴아민 ( BzMPAA )의 합성
1Og의 폴리알릴아민(PAA)(Nittobo, 150 kD; 40% wt./wt.)을 100 mL 원형 바닥 플라스크에 넣고 또 3.34g의 수산화 나트륨(1.2 당량/단량체)이 25mL H2O에 용해된 용액을 자기 교반하의 실온에서 소량씩 부가하였다. 벤질 클로라이드(3.23g, 2.94mL)를 부가하고, 실온에서 수 분간 교반한 다음 철야로 17시간 동안 60℃로 가열하였다. 반응을 실온으로 냉각시키고 또 용매를 제거하여 중합체 석출을 유도하였다. 석출된 중합체를 물로 세척한 다음 1M AcOH 수용액(40mL) 중에서 완전한 용해가 달성될 때까지 교반하였다. 이 용액은 H2O에 의해 최종 부피 400mL(1% 중합체 용액)로 희석하고, 이염기성 인산 칼륨(K2HPO4)(3.48g)을 교반하에서 부가하고 또 용액의 pH를 약 6.8로 조절하여 변형된 중합체를 석출시켰다. 이 중합체를 유리 깔때기 위로 여과에 의해 수집하고 마지막으로 진공 오븐 중, 50-60℃에서 철야로 건조시켰다.
실시예 11: 디페닐 변형된 폴리알릴아민(DPhMPAA)의 합성
예시적 실험으로서, 고분자전해질 중합체 주쇄, 폴리알릴아민,을 디페닐 기에 의해 변형시켰다. 간단히 말해, lOg의 폴리알릴아민(PAA)(Nittobo, 150 kD; 40% wt./wt.)을 100 mL 원형 바닥 플라스크에 넣고 또 3.34g의 수산화 나트륨(1.2 당량/단량체)이 25mL H2O에 용해된 용액을 자기 교반하의 실온에서 소량씩 부가하였다. 이어 클로로-디페닐 메탄(3.68g, 3.23mL)을 부가하고, 실온에서 수분간 교반한 다음 철야로 17시간 동안 60℃로 가열하였다. 이어 반응을 실온으로 냉각한 다음 용매를 제거하였다. 석출된 중합체를 물로 세척하고 또 1M AcOH 수용액(40mL)에서 교반하였다. 디페닐 클로로메탄의 가수분해에 의해 생성된 잔류하는 백색 고체를 여과하였다. 이 용액을 H2O에 의해 최종 부피 400mL(1% 중합체 용액)로 희석하고, 이염기성 인산 칼륨(K2HPO4)(3.48g)을 교반하에서 부가하고 또 용액의 pH를 pH 6.8로 조절하여 변형된 중합체를 석출시켰다. 이 중합체를 유리질 깔때기 상에서 여과하고 마지막으로 진공 오븐 중에, 철야로 50-60℃에서 건조시켰다.
실시예 12: 6% 디클로로벤질 변형된 폴리알릴아민(DClBzMPAA)의 합성
다른 실험으로서, lOg의 폴리알릴아민(PAA)(NITTOBO, 150 kD; 40% wt./wt)을 lOOmL 원형 바닥 플라스크에 넣고 또 3.34g의 수산화 나트륨(1.2 당량/단량체)이 25mL의 H2O에 용해된 용액을 자기 교반하 실온에서 소량씩 부가하였다. 이어 3,4-디클로로벤질 클로라이드(1.71g, 1.21mL)를 부가하고 상기 혼합물을 실온에서 철야로 17시간 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 이어 100mL의 H2O에 의해 세척한 후, 인산을 사용하여 pH를 중성(pH 7.0)으로 조절하였다. 석출된 중합체를 여과하고, H2O에 의해 세척하고 진공 오븐 중, 60℃에서 철야로 건조시켰다. 이 중합체를 유리질 깔때기 상에서 여과에 의해 수집하고 또 진고 오븐 중 50-60℃에서 철야로 건조시켰다.
실시예 13: 10% 디클로로벤질 변형된 폴리알릴아민 ( DClBzMPAA )의 합성
다른 실험으로서, 10% 디클로로벤질 변형된 폴리알릴아민은 다음과 같이 합성하였다. 5g의 폴리알릴아민(PAA)(NITTOBO, 150 kD; 40% wt./wt)을 lOOmL 원형 바닥 플라스크에 넣고 또 1.68g의 수산화 나트륨(1.2 당량/단량체)이 40mL 50/50 H2O/1,2 디메톡시에탄(DME)에 용해된 용액을 자기 교반하 실온에서 소량씩 부가하였다. 이어 3,4-디클로로벤질 클로라이드(0.57g, 0.40mL)를 부가하고 실온에서 수분간 교반한 다음 철야로 21시간 동안 60℃로 가열하였다. 이 반응을 방치하여 실온으로 냉각하고, 진공하 60-70℃에서 DME를 제거한 다음 잔류하는 용매를 제거하였다. 석출된 중합체를 물로 세척하고, 이어 완전한 용해가 달성될 때까지 1M AcOH 수용액(20mL)에서 교반하였다. 이 용액을 H2O에 최종 부피 200mL(1% 중합체 용액)로 희석시키고, 이염기성 인산 칼륨(K2HPO4)(1.74g)을 교반하에서 부가하고 또 용액의 pH는 pH 6.8로 조절하여 변형된 중합체를 석출하였다. 이 중합체를 유리질 깔때기 상에서 여과에 의해 수집하고 마지막으로 진공 오븐에서 50-60℃에서 철야로 건조시켰다.
실시예 14: 33% 클로로벤질 변형된 폴리알릴아민(DClBzMPAA)의 합성
다른 대표적 실험으로서, 33% 클로로벤질 변형된 폴리알릴아민은 다음과 같이 합성하였다. 5g 폴리알릴아민(PAA)(NITTOBO, 150 kD; 40% wt./wt.)을 100 mL 원형 바닥 플라스크에 넣고 3.34g의 수산화 나트륨(1.2 당량/단량체)이 40mL 50/50 H2O/1,2 디메톡시에탄(DME)에 용해된 용액을 자기 교반하 실온에서 소량씩 부가하였다. 이어 4-클로로벤질 클로라이드(1.48g)를 부가하고, 실온에서 수 분간 교반한 다음 철야로 21시간 동안 60℃로 가열하였다. 다음 날, DME를 진공하 60-70℃에서 증발시키고 또 잔류하는 용매를 석출된 중합체로부터 분리하였다. 석출된 중합체를 물로 세척한 다음 1M AcOH 수용액(20mL)에 완전한 용해가 달성될 때까지 용해시켰다. 이어 이 용액을 H2O에 의해 최종 부피 200mL(1% 중합체 용액)로 희석하고, 이염기성 인산 칼륨(K2HPO4)(1.74g)을 교반하에서 부가하고 이 용액의 pH를 pH 7로 조절하여 정제된 중합체를 석출하였다. 이 중합체를 유리질 깔때기 상에서 여과에 의해 수집하고 마지막으로 진공하 50-60℃에서 철야로 건조시켰다.
실시예 15: 13% 페닐 -벤질 변형된 폴리알릴아민(DClBzMPAA)의 합성
다른 실험으로서 13% 페닐-벤질 변형된 폴리알릴아민은 다음과 같이 합성하였다. 4.7g의 폴리알릴아민(PAA)(Nittobo, 150 kD; 40% wt./wt.)을 100 mL 원형 바닥 플라스크에 넣고 3.34g의 수산화 나트륨(1.2 당량/단량체)이 40mL 50/50 H2O/1,2 디메톡시에탄(DME)에 용해된 용액을 자기 교반하 실온에서 소량씩 부가하였다. 4-페닐벤질 클로라이드(1g)를 부가하고 그 혼합물을 55℃에서 철야로 20시간 동안 가열하였다. 이 반응은 실온으로 냉각시켰다. DME는 진공하 60-70℃에서 제거하고 또 잔류하는 용매는 석출된 중합체로부터 제거하였다. 석출된 중합체는 물로 세척한 다음 1M AcOH 수용액(40mL)에 철야로 완전한 용해가 달성될 때까지 교반하였다. 이 용액을 H2O에 의해 최종 부피 200mL(1% 중합체 용액)로 희석시키고, 이염기성 인산 칼륨(K2HPO4)(1.74g)을 교반하에서 부가하고 또 정제된 중합체를 석출시키기 위하여 그 용액의 pH는 pH 7.0으로 조절하였다. 상기 중합체는 유리질 깔때기 상에서 여과에 의해 수집하고 또 마지막으로 진공 중 50-60℃에서 철야로 건조시켰다.
실시예 16: 27% 페닐 -벤질 변형된 폴리알릴아민(DClBzMPAA)의 합성
다른 실험으로서, 27% 페닐-벤질 변형된 폴리알릴아민은 다음과 같이 합성하였다. 2.8g의 폴리알릴아민(PAA)(Nittobo, 150 kD; 40% wt./wt.)을 100 mL 원형 바닥 플라스크에 넣고 3.34g의 수산화 나트륨(1.2 당량/단량체)이 40mL 50/50 H2O/1,2 디메톡시에탄(DME)에 용해된 용액을 자기 교반하 실온에서 소량씩 부가하였다. 4-페닐벤질 클로라이드(1g)를 부가하고 그 혼합물을 55℃에서 철야로 20시간 동안 가열하였다. 이 반응은 실온으로 냉각시켰다. DME는 진공하 60-70℃에서 제거하고 또 잔류하는 용매는 석출된 중합체로부터 제거하였다. 석출된 중합체는 물로 세척한 다음 1M AcOH 수용액(32mL)에 철야로 완전한 용해가 달성될 때까지 교반하였다. 이 용액을 H2O에 의해 최종 부피 200mL(1% 중합체 용액)로 희석시키고, 이염기성 인산 칼륨(K2HPO4)(1.74g)을 교반하에서 부가하고 또 정제된 중합체를 석출시키기 위하여 그 용액의 pH는 pH 7.0으로 조절하였다. 상기 중합체는 유리질 깔때기 상에서 여과에 의해 수집하고 또 마지막으로 진공 중 50-60℃에서 철야로 건조시켰다.
실시예 17: 상이한 중합체 농도를 갖는 CCF 의 청정화
예시적 실험으로서, 실시예 8 내지 16에서 상기 기재된 자극 반응성 중합체는 그 제조가 실시예 7에서 상기 기재된 CCF의 청정화에 대해 평가하였다. 실시예 8 내지 16으로부터 얻은 중합체 용액은 0.2g, 0.3g, 0.4g 및 0.5g의 양으로 청정화되지 않은 세포 배양액의 5 mL 샘플에 부가하였다. 상기 샘플을 실온에서 2분간 혼합하였다. 중합체 부가는 pH를 pH 4.5 내지 5.5 범위로 감소시키므로, 상기 혼합물의 pH는 2M 트리스 이염기성을 사용하여 pH 7로 조절하였다. 생성한 용액에, 중합체-표적 분자, 세포 및 세포 파편 복합체를 석출시키기 위하여 0.043g의 이염기성 인산칼륨을 부가하였다. 분산된 고체 현탁액 형태의 석출물을 연속적으로 5분간 혼합하였다. 이어 석출물을 원심분리(4000 rpm 1분간)를 통하여 수집하였다. 각 샘플의 상청액은 0.2㎛ Durapore® 필터를 통하여 여과하였다. 생성한 정제는 하기 표 2에 자세히 기재한다.
실시예 18: 상이한 pH 를 갖는 CCF 의 청정화
다른 실험으로서, 실시예 8 내지 16으로부터 얻은 중합체 용액을, 실시예 7에 기재된 바와 같이 5mL의 청정화되지 않은 세포 배양액을 함유하는 4개 샘플(0.4g 각각)에 부가하였다. 상기 샘플을 실온에서 2분간 혼합하였다. 중합체 부가는 pH를 pH 4.5 내지 5.5 범위로 감소시키기 때문에, 상기 혼합물의 pH는 2M 트리스 염기를 사용하여 pH 5.5, 6.5 7.5 및 8.5로 각각 조절하였다. 생성한 용액에, 중합체-표적 분자, 세포 및 세포 파편 복합체를 석출시키기 위하여 0.043g의 이염기성 인산 칼륨을 부가하였다. 분산된 고체 현탁액 형태의 석출물은 연속적으로 5분간 혼합하였다. 이어 석출물을 원심분리(4000 rpm 1분간)를 통하여 수집하였다. 이어 각 샘플로부터 얻은 상청액을 0.2㎛ Durapore® 필터를 통하여 여과하였다. 생성한 정제를 하기 표 2에 기재한다.
실시예 19: 다가 이온 자극의 상이한 수준에 대하여 중합체 반응성을 사용한 CCF의 청정화
다른 실험으로서, 실시예 8 내지 15에 기재된 중합체는 상이한 양의 다가 이온 자극을 이용하여 CCF의 청정화에 대해 평가하였다. 특히, 실시예 8 내지 15로부터 얻은 중합체는 실시예 7에 기재된 바와 같이 5mL의 청정화되지 않은 세포 배양액을 함유하는 4개의 샘플(0.4 g 각각)에 부가하였다. 상기 샘플을 실온에서 2분간 혼합하였다. 중합체 부가는 pH를 pH 4.5 내지 5.5 범위로 감소시키기 때문에, 상기 혼합물의 pH는 2M 트리스 염기를 사용하여 pH 5.5, 6.5 7.5 및 8.5로 각각 조절하였다. 생성한 용액에, 중합체-표적 분자, 세포 및 세포 파편 복합체를 석출시키기 위하여 0.031 내지 0.043g (50 내지 70 mM 최종 포스페이트 농도)의 이염기성 인산 칼륨을 부가하였다. 분산된 고체 현탁액 형태의 석출물은 연속적으로 5분간 혼합하였다. 이어 상기 석출물은 원심분리(4000 rpm 1분간)에 의해 수집하였다. 각 샘플로부터 얻은 상청액은 0.2 ㎛ Durapore® 필터를 통하여 여과하였다. 생성한 정제는 하기 표 2에 기재한다.
실시예 20: 통상적으로 사용된 응집제를 사용한 CCF 의 청정화
다른 실험으로서, 대조 데이터를 생성하기 위하여 통상적으로 사용된 응집제인 키토산을 CCF의 청정화에 사용하였다. Riske, F. etal.; Journal of Biotechnology, 128 (2007) 813-823에 기재된 과정에 따라 중합체 용액(2 wt%)을 제조하였다. 이 중합체 용액을, 다양한 양과 다양한 pH 조건에서, 실시예 7로부터 얻은 CCF에 부가하였다. 이 중합체에는 자극이 이용되지 않았다. 얻어진 정제는 하기 표 2에 기재한다.
실시예 21: 자극 반응성 중합체를 사용한 CCF 의 석출 이후의 순도 수준의 평 가
대표적 실험으로서, 실시예 8 내지 16에 기재된 중합체를 친화성 단백질 A 분석 HPLC 에세이를 이용하여 IgG 회수율에 대해 에세이하였다. 용액 중에서 IgG의 수준은 다르게는 분석 단백질 A 컬럼을 이용하여 측정하였다. Poros A/20 단백질 A 컬럼(Applied Biosystems)을 PBS에 의해 평형화시키고, 0.1M 리신(pH 2)에 의해 용출시키고 또 6M 구아니딘 HCl에 의해 세척하였다. IgG 표준 곡선은 일련의 다양한 주사 부피의 폴리클로날 IgG(Seracare)을 사용하여 작성하였다. 샘플을 주입하고 또 표준 곡선으로부터 IgG 농도를 결정하였다. 실시예 8 내지 16으로부터 얻은 샘플은 상업적 효소-결합된 면역흡착 에세이(ELISA) 키트(Cygnus Technologies Inc., Southport, N.C., Cygnus # 3G)를 이용하여 숙주 세포 단백질(HCP)에 대해 에세이하였다. 실시예 8 내지 16으로부터 얻은 샘플은 표준 피코 그린 에세이 및 청어 정자 DNA를 표준으로 이용하여 DNA에 대해 평가하였다. 세포 및 세포 파편의 감소를 평가하기 위하여, 4000 rpm에서 1분간 원심분리한 후 탁도를 측정하였다.
Figure 112014118126727-pat00006
Figure 112014118126727-pat00007
Figure 112014118126727-pat00008
실시예 22: 벤질 변형된 폴리에틸렌이민( BzMPEI )의 합성
다른 실험으로서, 벤질 변형된 폴리에틸렌이민 자극 반응성 중합체는 다음과 같이 합성하였다. 1Og PEI (Aldrich, 750 kD; 50% wt./wt.)를 100 mL 원형 바닥 플라스크에 넣고 또 ~3.34g의 수산화 나트륨(1.2 당량/단량체)이 25mL H2O에 용해된 용액을 자기 교반하 실온에서 소량씩 부가하였다. 벤질 클로라이드(2.30g, 2.09mL)를 부가하고, 실온에서 수 분간 교반한 다음 60℃에서 철야로 17시간 동안 가열하였다. 이 반응을 실온으로 냉각하고 또 용매를 제거하였다 석출된 중합체는 물에 의해 세척한 다음 완전한 용해가 달성될 때까지 1M AcOH 수용액(40 mL) 에서 교반하였다. 이 용액을 H2O에 의해 최종 부피 400mL(1% 중합체 용액)로 희석하고, 이염기성 인산 칼륨(K2HPO4)(3.48g)을 교반하에서 부가하고 또 이 용액의 pH는 pH 6.8로 조절하여 변형된 중합체를 석출하였다. 이 중합체는 유리질 깔때기 상에서 여과에 의해 수집하였고 또 마지막으로 진공하 50-60℃에서 철야로 건조시켰다.
실시예 23: 벤질 변형된 폴리비닐아민(BzMPVA)의 합성
대표적 실시예로서, 벤질 변형된 폴리비닐아민은 다음과 같이 합성하였다. 32g의 폴리(비닐아민)(PVA) 히드로클로라이드(MW 83,500, Air Products and Chemicals Inc.)를 측량하여 유리용기에 넣었다. 200mL H2O를 부가하고 또 26g 50% NaOH를 부가하며 또 잘 혼합될 때까지 교반하였다. 23.5g 벤질 클로라이드를 부가하고 또 70℃에서 16시간 동안 혼합하였다. 반응이 진행함에 따라서 상청액으로부터 고체의 백색 덩어리가 석출한다. 고체가 침강되도록 하고, 기울여서 상청액을 버린다. 고체를 350mL의 3% 아세트산에 철야로 용해시켰다. 360mL의 H2O를 부가하고 또 용액이 균질해질 때까지 16시간 동안 혼합하였다. 3.2 L 까지의 전체 부피를 탈이온수(DI)와 접촉시키는 것에 의해 1% w/v 용액까지 희석하였다. 중합체의 석출을 개시하기 위하여 인산나트륨을 50 mM 농도로 부가하였다. 1M NaOH를 부가하여 pH 6.8에 도달하게 하여, 부가적인 중합체 석출물을 제공하였다. 케이크를 건조시키기 위하여 여과하고 상청액을 제거하였다. 고형분을 철야로 70℃에서 건조시켰다. 균질한 용액이 생성될 때까지 3% 아세트산에 용해시켜 5% w/v 용액을 만들었다.
실시예 24: 자극 존재하의 청정화에서 변형된 및 비변형 중합체의 대조
폴리알릴아민(PAA, Nittobo, 150 kD; 40% wt./wt.) 및 실시예 10으로부터 얻은 중합체(Bz-MPAA)를 수용액에 부가하여 최종 중합체 농도 0.2% wt 및 0.4%를 각각 얻었다. 인산수소칼륨을 자극으로 사용하고 또 다양한 양과 탁도의 PAA 및 실시예 10의 중합체 용액에 부가하고 또 형성된 응집물의 성질을 기록하였다. 결과를 하기 표 3에 나타낸다.
Figure 112014118126727-pat00009
실시예 25: 자극 존재하의 청정화에서 변형된 및 비변형 중합체의 대조
비변형 중합체 폴리알릴아민(PAA, Nittobo, 150 kD; 40% wt/wt.), 폴리에틸렌이민(PEI, Aldrich, 750 kD; 50% w/wt.), 폴리비닐 아민(Poly(vinylamine) (PVA) 히드로클로라이드, MW 83,500, Air Products and Chemicals Inc.) 및 실시예 10(Bz-MPAA), 실시예 22(BzMPEI) 및 실시예 23(BzMPVA)으로부터의 변형된 중합체를 수용액에 부가하여 최종 중합체 농도 0.2 중량% 및 0.4중량%를 각각 얻었다. 인산수소칼륨(150mM)을 자극으로 사용하고 또 각 0.4% 중합체 용액에 부가하고 또 탁도 및 생성된 응집물의 성질을 기록하였다. 결과를 하기 표 4에 나타낸다.
Figure 112014118126727-pat00010
실시예 26: 헥산산 및 tert -부틸 변형된 폴리알릴아민(HC-t-BuMPAA)의 합성
3.49 g의 6-브로모헥산산을 10 mL의 40 wt% 선형 중합체 폴리(알릴아민)(150 kda, NITTOBO) 및 30 ml 수산화나트륨(1M)을 포함하는 용액에 용해시켰다. 이 혼합물을 T=50℃에서 18시간 동안 반응시키고 또 그 생성물을 수소화된 겔로서 석출시켰다. 이 석출물을 100 mg/ml 수산화리튬 용액에 용해시키고 또 2.5 mL의 tert-부틸 글리시딜 에테르를 함유하는 10 ml 메탄올과 혼합하였다. 이 혼합물을 이어 T=50℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 이 중합체 용액을 3.5 kda 분자량 컷오프 투석 튜브를 이용하여 탈이온수(DI)에 대하여 광범위한 투석(3일간)에 의해 정제하였다. 중합체 용액의 최종 온도는 7.2 wt%이었다. 합성 반응의 개략도는 하기 도 2에 도시되어 있다.
실시예 27: 트리스 완충액에 용해될 때 헥산산 및 tert -부틸 변형된 폴리알 릴아민(HC-t-BuMPAA)의 다가 자극에 대한 염화나트륨의 효과
실시예 26으로부터 얻은 600 ㎕의 HC-t-BuMPAA를 0, 0.15 또는 0.5 M 염화나트륨을 함유하는 10 mL의 25 mM 인산나트륨에 부가하였다. 이 용액의 최종 pH 는 11.6이었다. 상기 용액은 3M 아세트산을 사용하여 적정하였고, 또 용액의 탁도는 각 부가 후에 기록하였다. 도 3에 도시한 바와 같이, 인산나트륨 이외에 염화 나트륨을 부가하는 것에 의해, pH 반응성에서 각 상 전이가 생기는 변화를 관찰하였다.
실시예 28: 상이한 중합체 농도에서 중합체 HC -t- BuMPAA 를 사용한 CCF 의 청 정화
대표적 실험으로서, 청정화되지 않은 CCF는 하기와 같이 본 발명에 따른 중합체를 사용하여 청정화하였다. 실시예 26으로부터 얻은 178, 356, 또는 534 ㎕의 HC-t-BuMPAA를 25 mM 인산나트륨을 함유하는 실시예 1로부터 얻은 5mL의 청정화되지 않은 세포 배양액에 부가하고 또 25 ㎕의 3M 아세트산을 사용하여 pH 8.7로 조절하였다. 중합체를 부가한 후, 용액의 최종 pH는 3M 아세트산을 사용하여 pH 7.2로 적정함으로써 중합체-세포 복합체를 석출하였다.
분산된 고체 현탁액 형태의 석출물은 다시 5분간 더 연속적으로 혼합하였다. 석출물은 원심분리(4000 rpm 1분간)에 의해 수집하고 또 상청액은 0.2㎛ Durapore® 필터를 통하여 여과하였다. 사용된 중합체의 농도에 관해서는, 상기 방법은 100% Mab 회수율을 초래하였다.
실시예 29: 단량체로부터 폴리비닐아민 ( PVA ) 자극 반응성 중합체의 합성
일급 아민을 함유하는 반복 단위체로 이루어진 자극 반응성 중합체는 다음과 같이 단량체로부터 합성하였다. 165 g의 탈이온수 및 22.5 g의 N-비닐포름아미드 (NVF)(SIGMA-ALDRICH, 98%)를 250 mL 원형 바닥 플라스크에 넣었다. 이 플라스크는 자기 교반기와 N2 딥스틱(dipstick)을 구비하고 있었다. 상기 용액을 교반하고 0.5 시간 동안 N2를 사용하여 세정한 다음 연속 세정하면서 부가적 0.5 시간 연속적으로 45℃로 가열하였다. 개시제 용액은 0.288g의 2,2' 아조비스(2-아미디노프로판)디히드로클로라이드(ABAP) (Aldrich)를 10 mL의 탈이온수에 부가하고 용해시키는 것에 의해 제조하였다. 250 mL 원형 바닥 플라스크에 개시제 용액을 N2 분위기하에서 부가하였다. 이 용액을 질소하에서 급격히 교반하면서, 55℃에서 1시간 동안 가열한 다음, 65℃에서 2시간 동안 가열한 다음, 75℃에서 1시간 동안 가열하였다. 점성의 균일 용액을 얻으며, 이것을 실온으로 냉각하였다. 점도는 브룩필드 점도(Brookfield Viscosity) DV-II+ Pro Visocometer(세팅 100 RPM, 45% 토르크, 스핀들 #34)에 의해 측정하였다. 생성한 용액의 점도는 278-350 센티포아즈(cP)였다. 이 용액을 500 mL 플라스크로 전달하고 또 330 mL의 H20에 의해 희석한 다음 40 g의 50% NaOH를 교반과 함께 부가하였다. 이 용액을 85℃에서 8시간 동안 가열하였다.
2몰 인산나트륨 한 방울을 가수분해된 중합체에 부가하고 인산 이온 부가시 용액으로부터 생기는 백색 고체 석출물을 관찰하는 것에 의해 포스페이트 자극에 대한 민감성을 평가하였다. 가수분해된 중합체 용액에, 25% HCl을 pH 약 2에 도달할 때까지 적가하였다. 이 용액을 급격하게 철야로 교반하여 균일하고 황색인 용액을 얻었다. 이 용액에, 100 mL의 4몰 NaOH를 500 mL 이소프로필 알코올과 함께 교반하면서 부가하였다. 중합체는 탈이온수 부가에 의해 단리하였다. 고체 중합체를 진공 오븐 중, 65℃에서 철야로 건조시켰다. 부분적으로 건조한 중합체를 액체 질소를 사용하여 냉동시키고 또 미분말로 분쇄하며 또한 진공 오븐중, 65℃에서 24시간 동안 건조시켰다. 마지막으로, 40.7 g의 건조 분말을 회수하며 또 1몰 아세트산에 용해시켜 최종 농도 5% w/w를 얻었다.
폴리비닐아민 합성 공정의 개관은 도 4에 도시되어 있다.
실시예 30: 일련의 소수성으로 변형된 폴리비닐아민 ( PVA ) 자극 반응성 중합 체의 합성
실시예 29로부터 합성된 PVA를 사용하여, 3개의 별개의 소수성으로 변형된 자극 반응성 중합체를 다음과 같이 제조하였다. 실시예 29로부터 얻은 100 mL의 5% PVA 용액을 각 3개의 500 mL 유리병 1, 2 및 3에 넣었다. 이러한 3개의 유리병 각각에 100 g의 4몰 NaOH를 교반하면서 부가하였다. 이어, 50 g의 1-프로판올을 각 유리병에 보조용매로서 부가하고 또 용액을 교반한 다음 0.74 g, 1.47 g, 및 2.94 g의 벤질 클로라이드를 유리병 1, 2 및 3에 각각 부가하였다. 이 3개 유리병을 60℃에서 16시간 동안 가열하였다. 생성한 중합체는 각 개별 반응 용액의 부피를 500 mL의 탈이온수와 접촉시킨 다음 pH를 25% HCl에 의해 8로 조절한 다음 100 g의 2몰 인산 나트륨을 부가하여 개별 반응 용액으로부터 단리하였다. 포스페이트 이온을 부가하면, 고체 석출물은 진공 여과에 의해 수집되었다. 각 반응으로부터 고체를 개별적으로 탈이온수에 의해 세척하고 또 300 mL의 1몰 아세트산에 용해시켰다. 상기 중합체는 또한 개별 용액을 pH 7.4로 조절하고, 2몰 인산 나트륨을 적가하는 것에 의해 중합체를 석출시키며 생성한 고체를 여과하고, 고체를 물에 의해 세척한 다음 이소프로필로 세척하고 또 진공 오븐 중, 65℃에서 2일간 건조시키는 것에 의해 정제하였다. 건조된 중합체의 각 샘플은 액체 질소를 이용하여 냉동시키고 또 미분말로 분쇄하였다. 건조된 중합체의 회수 중량은 유리병 1, 2 및 3 각각에 대하여 1.44, 2.12, 및 2.47 g이었다. 개별 중합체를 1몰 아세트산에 용해시켜 2% 용액을 만들었다.
실시예 31: 폴리비닐아민 ( PVA ) 자극 반응성 중합체 초고분자량 폴리(N- 비닐 아세트아미드)의 가수분해를 통한 아민의 탈보호
다른 예시적 실험으로서, 초고분자량 자극 반응성 중합체는 다음과 같이 제조하였다. 초고분자량 중합체는 일반적으로 1OOO KDa과 동일하거나 그 이상인 분자량을 갖는 중합체를 지칭한다.
일급 아민을 함유하는 반복 단위체로 이루어진 자극 반응성 중합체는 다음과 같이 제조하였다. 2 리터 유리 병에 평균 분자량 4,060 kDa인 40 g의 폴리(N-비닐아세트아미드)-선형 동종중합체(POLYSCIENCES, INC.)를 급격하게 교반하면서 16시간 동안 0.8 리터의 탈이온수에 용해시켰다. 이 용액에, 140 g의 진한 HCl를 1시간에 걸쳐 연속적으로 교반하면서 부가하였다. 유리 병에 약하게 마개를 하고 또 용액을 간헐적인 회전에 의해 용액을 혼합하면서 5일 동안 99℃로 가열하였다. 5일간 가열한 후, 상기 용액을 실온으로 냉각하고 또 탈이온수를 사용하여 전체 부피를 4리터로 조절하였다. 이 용액은 급격하게 교반하면서 8몰의 NaOH를 사용하여 pH 7로 조절하였다. 가수분해된 생성물은 2몰 인산나트륨을 적가하는 것에 의해 석출물이 더 이상 관찰되지 않을 때까지 석출시켰다. 백색 석출물을 탈이온수로 세척하고 또 압축하여 과량의 물을 제거하였다. 회수된 중합체는 진공 오븐 중, 65℃에서 2일간 건조시켰다. 건조된 중하체는 액체 질소를 이용하여 냉동시키고 또 미분말로 분쇄하였다. 회수된 건조 중량은 42.5 g이었다. 2% 용액은 상기 건조된 분말을 1몰의 아세트산 및 0.08% HCl에 용해시키는 것에 의해 제조하였다. 생성한 용액은 2% 용액의 출발물질(폴리(N-비닐아세트아미드)-선형 동종중합체)과 포스페이트 또는 시트레이트 자극에 대한 반응에 대하여 비교하였다. 이는 2몰의 인산나트륨 또는 0.2몰의 시트르산 나트륨을 출발물질 및 생성한 가수분해된 중합체 모두의 50 mL 샘플에 적가하는 것에 의해 실시되었다.
생성한 가수분해된 중합체는 포스페이트 또는 시트레이트 이온의 부가에 의해 백색 덩어리로 석출하였고, 출발물질의 용액은 포스페이트 또는 시트레이트 이온 적가시 아무런 석출물이 없었으므로, 출발물질은 자극(예를 들어 포스페이트 또는 시트레이트와 같은 다가 음이온)에 대해 반응성이 아니며, 반면에 본 실시예에서 기재된 바와 같이 합성된 초고분자량 중합체는 자극(예를 들어 포스페이트 또는 시트레이트와 같은 다가 음이온)에 대해 반응성임을 나타낸다.
도 5는 폴리아민 중합체의 탈보호 고정을 도시하므로, 자극 반응성 폴리비닐아민(PVA)의 형성을 초래한다.
실시예 32: 탈보호된 폴리(N-비닐아세트아미드)를 기본으로 한 소수성으로 변형된 폴리비닐아민(PVA) 자극 반응성 중합체의 합성
실시예 31로부터 얻은 탈보호된 4,060 kDa 폴리(N-비닐아세트아미드)-선형 동종중합체로부터 얻은 PVA를 사용하여, 초고분자량 소수성으로 변형된 자극 반응성 중합체를 다음과 같이 제조하였다.
100 g의 탈보호된 4,060 kDa 폴리(N-비닐아세트아미드) 2% 용액을 유리병에 넣었다. 이 유리병에, 100 g의 4몰 NaOH를 부가하여 pH를 약 13으로 조절하였다. 이어, 20 g의 1-프로판올을 공용매로서 상기 유리병에 부가하였다. 마지막으로, 0.58 g의 벤질 클로라이드를 부가하고 유리병에 덮개를 하였다. 이 반응을 급격하게 진탕시키면서 60℃에서 3시간 동안 가열하였다. 3시간 후, 이 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 또 그 생성물을 아세톤을 사용하여 석출한 다음 수집하였다. 생성한 고체를 탈이온수로 세척한 다음, 이소프로필 알코올로 세척하고, 또 진공 오븐 중, 65℃에서 2일간 건조시켰다. 건조 고체는 미분말로 분쇄하고 또 수집된 중합체의 최종 건조 덩어리는 1.44 g이었다. 이 건조 분말을 1몰 아세트산 및 0.08% HCl에 용해시키는 것에 의해 2% 용액을 제조하였다. 생성한 용액은 2몰 인산나트륨 또는 0.2몰 시트르산 나트륨을 0.5% 중합체 용액의 5mL 샘플에 적가하는 것에 의해 다가 이온 자극에 대한 민감성에 대해 시험하였다. 포스페이트 또는 시트레이트 이온 부가시, 백색 석출물이 관찰되므로, 다가 음이온 자극에 대한 반응성을 나타내었다.
도 6은 본 실시예에 기재된 합성 공정의 개략도를 제공한다.
실시예 33: 자극 반응성 비닐아민/ 비닐부틸에테르 공중합체( VA - co - VBE )의 합 성
다른 실험으로서, 자극 반응성 공중합체를 제조하며, 이는 소수성 기를 포함한 단량체 단위 중의 하나를 가졌다.
일급 아민 및 부틸에테르를 함유하는 반복 단위로 이루어진 자극 반응성 중합체는 다음과 같이 단량체로부터 합성하였다. 90 g의 옥탄, 2.5 g의 Span-85 (SIGMA), 16 g의 N-비닐포름아미드(NVF)(ALDRICH, 98%), 5 g의 N-부틸비닐에테르 (SIGMA), 및 30 g의 탈이온수를 250 mL 원형 바닥 플라스크에 넣었다. 이 플라스크는 자기 교반기와 N2 딥스틱을 구비하였다. 상기 용액을 교반하고 N2에 의해 1시간 동안 세정하며 온도는 55℃로 증가하였다.
0.10 g의 2,2' 아조비스(2-아미디노프로판)디히드로클로라이드(ABAP) (ALDRICH)를 10 mL의 탈이온수에 부가하여 용해시키는 것에 의해 개시제 용액을 제조하였다. 상기 개시제 용액을 질소 세정 분위기하에서 반응 용액을 함유하는 250 mL 원형 바닥 플라스크에 장입하였다. 이 용액을 연속적인 질소 세정과 함께 급격하게 교반하면서 55℃에서 1시간 동안 가열한 다음, 60℃에서 1시간 동안 가열한 다음 70℃에서 1시간 동안 가열하고, 이어 80℃에서 1시간 동안 가열하였다. 이로써 저부 위에 점성 겔 층을 갖는 2상 용액을 초래하였다. 상층을 따라내어 버렸다. 저부층에, 급격하게 교반하면서 200 mL의 탈이온수를 부가하고 또 20 g의 50% NaOH를 부가하였다. 이 용액을 80℃에서 6시간 동안 가열하였다. 6 시간 후, 상기 용액을 가열로부터 제거하고 실온으로 냉각하였다. 탈이온수를 사용하여 부피를 2L로 증가시켰다. 2몰 인산나트륨을 적가하는 것에 의해 대형 백색 석출물을 초래하여 생성물을 단리하였다. 석출물은 상청액을 따라내는 것에 의해 수집하였고 또 석출물은 탈이온수에 의해 세척하였다. 단리된 중합체를 500 mL 탈이온수, 10 g 아세트산, 및 2 g 진한 HCl에 용해시켰다. 생성한 용액은 2몰 인산나트륨 또는 0.2몰 시트르산 나트륨을 0.5% 중합체 용액을 함유하는 5mL 샘플에 적가하는 것에 의해 다가 이온 자극에 대한 민감성에 대해 시험하였다. 포스페이트 또는 시트레이트 이온 부가시, 백색 석출물이 관찰되었으므로, 상기 중합체는 다가 음이온 자극에 대해 반응성임을 나타내었다.
도 7은 본 실시예에 기재된 반응의 개략도를 도시한다. 이 실시예는 아민 또는 소수성 단량체에 의해 공중합된 하전된 관능기를 함유하는 공중합체가 다가 이온 자극에 대해 반응성임을 나타낸다.
실시예 34: 역 에멀젼 중합반응을 통하여 NVF 단량체로부터 고분자량 폴리비 닐아민(PVA)의 합성
일급 아민을 함유하는 반복 단위로 구성된 자극 반응성 중합체는 다음과 같이 단량체로부터 합성하였다. 90 g의 옥탄, 2.5 g의 Span-85 (SIGMA), 16 g의 N-비닐포름아미드(NVF)(ALDRICH, 98%), 및 30 g의 탈이온수를 250 mL 원형 바닥 플라스크에 넣었다. 이 플라스크는 자기 교반기와 N2 딥스틱을 구비하였다. 상기 용액을 교반하고 또 N2를 사용하여 1시간 동안 세정하며, 온도는 55℃로 증가하였다. 개시제 용액은 0.20 g의 2,2' 아조비스(2-아미디노프로판)디히드로클로라이드(ABAP)(ALDRICH)를 20 mL의 탈이온수에 부가하고 또 용해시키는 것에 의해 제조하였다. 개시제 용액을 질소 세정된 분위기하 반응 용액을 함유하는 250 mL 원형 바닥 플라스크에 장입하였다. 이 용액을 연속적인 질소 세정과 함께 급격하게 교반하면서 2시간 동안 60℃로 가열한 다음, 1시간 동안 75℃로 가열하였다. 저부 상에 점성 겔층을 갖는 2상 용액이 생긴다. 상부 층을 따라 내어 버렸다. 저부 층에 500 mL의 탈이온수를 부가하고 또 48 g의 50% NaOH를 급격하게 교반하면서 부가하였다. 이 용액을 16시간 동안 80℃로 가열하였다. 16시간 후 상기 용액을 열로부터 제거하고 실온으로 냉각시켰다. 탈이온수를 사용하여 부피를 1L로 증가시켰다. 생성물을 2몰의 인산나트륨을 적가하여 다량의 백색 석출물을 생성하는 것에 의해 단리하였다. 상기 석출물은 상청액을 따라 내는 것에 의해 수집하며 또 상기 석출물을 탈이온수로 세척하고 또 2시간 동안 이소프로필 알코올에 담구고 마지막으로 탈이온수를 사용하여 세척하였다. 생성한 고체 덩어리를 진공 오븐 중, 65℃에서 3일간 건조시켰다. 건조된 중합체를 액체 질소를 사용하여 냉동시키고 또 미분말로 분쇄하며 또한 1일간 건조시켰다. 생성한 건조 분말 질량은 21.5 g이었다. 이 건조된 분말을 1몰 아세트산 및 0.08% HCl에 용해시키는 것에 의해 2% 용액을 제조하였다. 생성한 용액은 2몰 인산나트륨 또는 0.2몰 시트르산 나트륨을 1% 중합체 용액의 50mL 샘플에 적가하는 것에 의해 다가 이온 자극에 대한 민감성에 대해 시험하였다.
실시예 35: 고분자량 소수성 변형된 폴리비닐아민 ( PVA ) 자극 반응성 중합체 의 합성
BASF로부터 입수가능한 루파민 9095(선형 폴리비닐아민, 평균 MW = 340 kDa, 20% 고형분, pH 7-9) 용액을 사용하여, 소수성 변형된 자극 반응성 중합체를 다음과 같이 제조하였다. 300 g의 루파민 9095(약 60 g의 폴리비닐아민)을 2리터의 유리병에 부가하였다. 이어, 40 g의 NaOH 펠릿과 500 mL의 탈이온수를 용해시키고 또 상기 유리병에 부가하였다. 이어 500 mL 1,2-디메톡시에탄(SIGMA)을 공용매로서 부가하고 또 용액이 균질해 질 때까지 상기 용액을 급격하게 교반하였다. 이어, 17.66 g 벤질 클로라이드(ACROS ORGANICS, 99%)를 반응병에 교반하면서 부가하였다. 이 용액을 자기 교반에 의해 16시간 동안 60℃로 가열하였다. 이 용액은 이어 실온으로 냉각하고 또 5리터 비이커로 전달하였다. 이어, 1500 mL의 탈이온수를 교반하면서 부가하였다. 빙초산을 사용하여 pH를 5로 조절하였다. 생성물은 250 mL 2몰 인산나트륨을 느리게 부가하는 것에 의해 석출되며, 고체를 수집하고 또 탈이온수로 세척하였다.
상기 중합체는 또한 다음 방법에 의해 정제하였다. 고체를 교반하면서 1몰 아세트산 2 리터에 용해시켰다. 탈이온수를 사용하여 전체 부피를 10 리터로 만들었고 또 pH는 50% NaOH를 적가하는 것에 의해 7로 조절하였다. 생성물은 600 g의 2몰 인산나트륨 부가에 의해 석출시켰다. 고체를 진공 여과를 통하여 단리하고 또 탈이온수로 세척하였다. 생성한 고체 덩어리는 진공 오븐 중 65℃에서 3일간 건조시켰다. 건조된 중합체는 액체 질소에 의해 냉동시켰고 미분말로 분쇄한 다음 1일간 더 건조시켰다. 생성한 건조분말 덩어리는 46 g이었다. 소량의 샘플을 1몰의 CD3COOD/D2O 산에 용해시키고 또 1H-NMR 스펙트럼을 얻으며, 이는 도 8에 도시되어 있다. 1H-NMR 피크를 적분하여 벤질 변형양을 18%로 결정하였다.
실시예 36: 소수성 변형된 폴리알릴아민을 기본한 자극 반응성 중합체의 200 g 규모 합성
본 명세서에 기재된 예시적 실험으로서, 본 명세서에 기재된 중합체는 대규모로 제조될 수 있음이 밝혀졌다.
폴리알릴아민(PAA, NITTOBO, 150 kD; 40% wt/wt.) 용액을 사용하여, 소수성 변형된 자극 반응성 중합체를 다음과 같이 제조하였다. 500 g의 폴리알릴아민 (PAA, NITTOBO, 150 kD; 40% wt./wt.) (약 200 g의 폴리알릴아민)을 4리터의 유리병에 부가하였다. 80 g의 NaOH 펠릿 및 1000 mL의 탈이온수를 용해시키고 상기 유리 병에 부가하였다. 1000 mL 1,2-디메톡시에탄(SIGMA)을 공용매로 부가하고 또 용액이 균질해 질 때까지 용액을 급격하게 교반하였다. 이어, 114 g의 벤질 클로라이드(ACROS ORGANICS, 99%)를 반응병에 부가하였다. 이 용액을 자기 교반하면서 60 ℃에서 16시간 동안 가열하였다. 이 용액을 실온으로 냉각시키고 또 10 리터 비커로 전달하였다.
이어, 1000 mL의 탈이온수를 교반하면서 부가하여 점성의 고체 덩어리가 용액 밖으로 석출되었다. 이 생성물은 또한 200 mL 2몰 인산나트륨을 천천히 부가하는 것에 의해서도 석출되며 또 고체를 수집하고 또 탈이온수로 세척하였다. 이 중합체는 또한 다음 방법에 의해 정제되었다. 고체를 3 리터의 1몰 아세트산에 교반하면서 용해시켰다. 탈이온수를 사용하여 전체 부피를 10 리터로 만들고 또 50% NaOH를 적가하는 것에 의해 pH를 7로 조절하였다. 석출물은 800 g의 2몰 인산나트륨 부가에 의해 석출하였고 또 고체를 수집하고 또 탈이온수로 세척하였다. 이 중합체는 다음 방법에 의해 더욱 정제되었다. 고체를 3리터의 1몰 아세트산에 교반하면서 용해시켰다. 탈이온수를 사용하여 전체 부피를 10리터로 만들고 또 50% NaOH를 적가하는 것에 의해 pH를 7로 조절하였다. 800 g의 2몰 인산나트륨을 부가하는 것에 의해 생성물을 석출하였고 또 고체를 수집하며 또 탈이온수로 세척하였다. 생성한 고체 덩어리는 진공 오븐 중, 65℃에서 3일간 건조시켰다. 건조된 중합체는 액체 질소를 사용하여 냉동시키고 또 미분말로 분쇄하며 또 이어 1일간 건조시켰다. 생성한 건조 분말 덩어리는 250 g이었다. 소량의 샘플을 1몰의 CD3COOD/D20 산에 용해시키고 또 도 9에 도시된 바와 같은 1H-NMR 스펙트럼을 얻었다. 1H-NMR 피크를 적분하고 벤질 변형의 양은 33%인 것으로 측정되었다.
실시예 37: CHO 세포 배양에서 자극 반응성 중합체 대 양이온성 고분자전해 질의 투여량 증가에 대한 응집 성능과 상청액 품질의 측정
본 명세서에 기재된 예시적 실험으로서, 본 발명에 따른 상기 자극 반응성 중합체는, 특정 소망하는 특성에 대해 공지된 중합체, 즉 키토산과 비교하였다.
CHO 세포 배양액은 실시예 1에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 제조하였다. 중(medium) 분자량 키토산(MMW 키토산) (Sigma-Aldrich)의 2% w/w 용액은 1몰 아세트산에서 제조하였다. 소수성 변형된 폴리알릴아민을 기본한 자극 반응성 (33%-BnPAA) 중합체의 2% w/w 용액은 실시예 # 36에 따라 제조하였다. 10 mL의 CHO 세포 배양액을 15 mL 원추형 튜브에 분산시켰다. 개별 중합체 투여량 0.0, 0.1, 0.2, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.14, 0.18, 0.22, 및 0.4% w/v를 LMW 키토산 및 33%-BnPAA 각각에 대하여 CHO 세포 배양액을 함유하는 각 원추형 튜브에 부가하였다. 33%-BnPAA 만을 함유하는 원추형 튜브의 경우, pH를 7.2로 조절하고 또 15O mM 인산나트륨을 적용하였다. 모든 원추형 튜브를 3000 RPM에서 2분간 원심분리하고 그 상청액을 기울여서 따라내고 탁도를 결정하였다.
하기 표 5 및 도 10은 비-자극 반응성 중합체(예를 들어 키토산)는 효과적인 응집을 위해 투여량 최적화를 필요로 하는 반면에, 본 발명에 따른 자극 반응성 중합체는 투여량 최적화를 필요로 하지 않음을 나타내는 대표적 실험결과를 요약하고 있다. 즉, 키토산과 같은 비-자극 반응성 중합체의 경우, 효과적 응집을 위해 최적 투여량의 중합체가 일단 부가되면, 상기 최적 투여량을 초과하는 것은 탁도 증가를 초래하며, 이는 바람직하지 않다. 한편, 본 명세서에 기재된 바와 같은 자극 반응성 중합체의 경우, 자극 반응성 중합체는 투여량 증가에 상관없이 계속 효과적인 응집제이다.
Figure 112014118126727-pat00011
Figure 112014118126727-pat00012
실시예 38: CHO 세포 배양액에서 자극이 없는 것에 대하여 다가 음이온 자극 존재하에서 자극 반응성 중합체 투여량 증가에 따른 응집 성능 및 상청액 품질의 측정
CHO 세포 배양액은 실시예 1에 기재된 방법을 이용하여 제조하였다. 소수성 변형된 폴리알릴아민 기제 자극 반응성(33%-BnPAA) 중합체의 2% w/w 용액은 실시예 #36에 따라 제조하였다. 33%-BnPAA 중합체에 대하여 개별 중합체 투여량 0.0, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.14, 0.18, 0.22, 및 0.4 % w/v를 CHO 세포 배양액을 함유하는 각 원추형 튜브에 부가하는 것을 3회 실시하였다(1회는 포스페이트에 대해 또 1회는 시트레이트에 대해 그리고 1회는 자극없이). pH를 7.2로 조절하고 또 150 mM 인산나트륨 또는 150 mM 시트르산 나트륨 자극을 적용하거나 또는 자극을 적용하지 않았다. 모든 원추형 튜브를 3000 RPM에서 2분간 원심분리하고 상청액을 따라내어 농축물 탁도를 측정하였다. 이 실시예에 기재된 실험으로부터 얻은 결과는 표 6 및 도 11에 나타낸다.
표 6 및 도 11은 자극 반응성 중합체(예를 들어 실시예 36에 기재된)는 비-자극 반응성 응집제(실시예 37에 기재된 키토산 데이터와 유사하게)로 작용하므로, 자극 없는 중합체 투여량 최적화를 필요로 함을 나타내는 대표적 실험 결과를 수록한다. 그러나, 포스페이트 또는 시트레이트와 같은 다가 이온 자극을 이용하면, 상기 자극 반응성 중합체는 농축물 탁도가 중합체 투여량 증가에 의해 영향을 받지 않므르로 투여량 최적화를 필요로 하지 않는다.
Figure 112014118126727-pat00013
Figure 112014118126727-pat00014
실시예 39: CHO 세포 배양액 중에서 비변형 자극 반응성 중합체의 투여량 증 가에 따른 응집 성능 및 상청액 품질의 측정
다른 실험으로서, CHO 세포 배양액에서 비변형 자극 반응성 중합체에 따른 응집능과 상청액 품질은 본 명세서에 기재된 바와 같이 측정하였다.
CHO 세포 배양액은 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 비변형된 폴리알릴아민 기제 자극 반응성 중합체의 2% w/w 용액은 폴리알릴아민(PAA, NITTOBO, 150 kD; 40% wt./wt.)을 1몰 아세트산에 용해시키는 것에 의해 제조하였다. 10 mL의 CHO 세포 배양액을 15 mL 원추형 튜브에 현탁시켰다. 개별 중합체 투여량 0.0, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.14, 0.18, 0.22, 및 0.4 % w/w를 CHO 세포 배양액을 함유하는 각 원추형 튜브에 부가하였다. pH는 7.2로 조절하고 또 150 mM 인산나트륨 자극을 적용하였다. 모든 원추형 튜브를 3000 RPM에서 2분간 원심분리하고 또 상청액을 따라내어 탁도를 측정하였다.이 실시예에 기재된 실험으로부터 얻은 결과는 표 7에 나타낸다.
Figure 112014118126727-pat00015
실시예 40: CHO 세포 배양액에서 자극 반응성 중합체의 응집 성능, 침강 시 간 및 상청액 품질의 측정
CHO 세포 배양액은 실시예 1에 기재된 방법을 이용하여 제조하였다. 소수성 변형된 폴리알릴아민 기제 자극 반응성(33%-BnPAA) 중합체 10% w/w 용액은 실시예 # 36과 유사하게 제조하였다. 50 mL의 CHO 세포 배양액을 2개 100 mL 유리 눈금 실린더에 넣었다. 실린더의 하나에는, 자극 반응성 중합체를 0.5% 투여량으로 부가하고, 2몰의 트리스 염기를 적가하는 것에 의해 pH를 7로 조절하며, 또 인산나트륨 농도는 2몰 인산 나트륨 용액을 부가하는 것에 의해 50 mM로 만들고, 상기 용액을 2부간 교반하였다. 인산나트륨 및 pH 조절은 자극 반응성 중합체와 세포, 세포 파편, 불순물, 잔류 중합체의 복합체를 석출하기 위하여; 고체를 응집하기 위하여; 또 입자 크기를 증가시키기 위하여 실시하였다. 인산나트륨 부가 및 pH 조절 이후, 자극 반응성 중합체 처리된 공급원에서 대형의 응집된 입자가 발견되었다. 눈금이 매겨진 실런더는 2분간 교반하며 아무것도 부가하지 않았다. 실리더 양쪽은 분포되지 않은 것을 1시간 동안 1시간의 말기에, 상기 상청액을 통기시키고 또 탁도를 기록하였다.
스마트 중합체를 갖는 실린더 중의 고체상은 더 빨리 침강될 뿐만 아니라 불명확한 침강 프론트(settling fron)일 수 있는 미처리 실린더 중의 고체상에 대하여 명확한 침강 프론트(고체에서 액체상으로 급격한 전이)임이 관찰되었다.
이러한 실험의 결과는 표 8에 요약한다. 침강 프론트(settling front)에 관한 측정은 미처리 실린더에 대하여 대강의 추정 값인데 이는 침강 프론트가 상당히 분산되어 있어 명확하게 정의되지 않기 때문이다.
Figure 112014118126727-pat00016
실시예 41: 상이한 분자량을 갖는 폴리아민을 사용한 청정화 성능의 대조
상이한 분자량을 갖는 일련의 중합체를 얻고, 변형시키고, 또 세포 배양액을 응집하고, 석출하여 정제하기 위하여 사용하였다. 다음 방법에 의해 일급 아민 반복 단위체를 갖는 15kD, 85kD, 150kD, 350kD, 600-950kD 및 2000-4000kD의 분자량을 갖는 중합체를 얻고 및/또는 변형시켰다.
15kD 폴리알릴아민 중합체는 NITTOBO로부터 입수하였고 실시예 36과 유사한 방법을 이용하여 벤질화(공유적으로 부착된 벤질 기 및 정제됨)시켰다. 85kD 벤질화된 폴리비닐아민 중합체는 실시예 23에 의해 제조하였다. 150kD 벤질화된 폴리알릴아민은 실시예 36에 따라서 제조하였다. 350kD 벤질화된 폴리비닐아민 중합체는 실시예 35에 의해 제조하였다. 950kD 폴리비닐아민 중합체 주쇄는 80℃에서 8시간 동안 2 당량의 염기를 사용하여 폴리민 VZ(BASF)를 가수분해시키는 것에 의해 제조하였다. 비변형 2000-4000kD PVA는 실시예 31에 따라서 제조하였다. 벤질화된 2000-4000kD 중합체는 실시예 32에 따라서 제조하였다. 약 12xl06 세포/mL의 CHO DG44 세포 배양액을 응집시키고, 석출하고 또 정제하기 위하여 상기 중합체를 사용하였고 또 < 50%의 세포 생존율로 수집하였다. 상기 응집은 0.2% 및 0.4% w/w의 중합체 투여량으로 실시하였다. 50 mM 인산나트륨의 용액 자극 및 2몰 트리스 염기를 사용한 pH 7로 조절을 적용하였다.
집단 크기의 관찰을 기록하고 또 작은 집단은 +로 표시하고 또 매우 큰 집단은 +++++로 표시하였다. +++++로 표시된 바이얼은 응집물의 현탁액에 비하여 더욱 완전한 영역 분리를 나타내었다. 더 큰 응집물/입자는 급격한 고체 액체 계면을 가지면서 신속하게 침강함을 알 수 있다. 결과를 표 9에 나타내며, 이는 상이한 분자량의 폴리아민을 사용한 응집 결과를 나타낸다.
Figure 112014118126727-pat00017
실시예 42: 상이한 소수성 변형의 폴리아민을 사용한 청정화 성능의 대조
CHO 세포 배양액은 실시예 1에 기재된 방법을 이용하여 제조하였다. 실시예 31, 32, 33 및 35에 기재된 중합체 샘플을 다음을 제외하고는 실시예 38에 기재된 바와 같은 세포 배양액에 부가하였다: 중합체 투여량은 표 10에 기재된 바와 같이 0.1 wt% 내지 0.6 wt% 사이였다. 초기 세포 배양액 탁도는 ~900 NTU이었고 또 중합체 처리되지 않은 농축물은 212 NTU의 탁도를 가졌다. pH를 7.2로 조절하고 또 50 mM 인산나트륨 자극을 인가하였다. 모든 원추형 튜브를 3000 RPM에서 2분간 원심분리시키고 그 상청액을 따라내어 농축물 탁도를 측정하였다. 이 실시예에 기재된 실험의 결과는 하기 표 10에 나타내며, 상이한 중합체 투여량에서 상이한 소수성 변형의 성능을 나타낸다.
표 10은 소수성 기 및/또는 중합체 분자량의 성질을 변경하는 것에 의해 자극에 대한 반응 및 생성한 농축물 탁도가 달라질 수 있음을 보여준다.
Figure 112014118126727-pat00018
실시예 43: 하류 여과에 대한 자극 반응성 중합체를 사용하여 얻은 감소된 탁도의 효과
후속 원심분리 및 심층 여과 단계에 대한 자극 반응성 중합체의 영향을 평가하기 위하여, 다음 과정을 실시하였다. PTG1 항체를 발현하는 DG44 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주는 10L 바이오리액터(NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC)에서 약 15x106 세포/mL 밀도로 성장시키고 또 <50% 생존율로 수집하였다. 소수성 변형된 폴리알릴아민 기제 자극 반응성(33%-BnPAA) 중합체의 10% w/w 용액은 실시예 36과 유사하게 제조하였다.
DG44 CHO 세포 배양액의 1개 분획은 0.2% 자극 반응성 중합체 33%-BnPAA에 의해 처리한 반면에 DG44 CHO 세포 배양액의 다른 분획은 처리하지 않았다. 자극 반응성 중합체 처리된 세포 배양액에, 2몰 인산나트륨을 적가하는 것에 의해 인산나트륨 농도를 50 mM로 만들고 또 2몰 트리스 염기를 적가하는 것에 의해 pH를 7.2로 조절하였다. 인산나트륨 및 pH 조절은 자극 반응성 중합체 및 세포, 세포 파편, 불순물, 잔류 중합체의 복합체를 석출시키고, 또 고체를 응집시키며 또 입자 크기를 증가시키기 위하여 실시하였다. 인산나트륨 부가 및 pH 조절 후, 자극 반응성 중합체 처리된 피드(feed)에서는 대형 덩어리 입자가 관찰되었다. 양쪽 분획을 3000 RPM에서 5분간 원심분리하고 그 상청액을 따라내어 탁도를 측정하였다. 33%-BnPAA 중합체 처리된 피드에 대한 농축물 탁도는 10 NTU로 측정된 반면에, 미처리 피드에 대한 농축물 탁도는 60 NTU로 측정되었다.
각 피드에 대한 심층 필터 처리량은 다음 방법에 의해 측정하였다. 23 cm2 의 비표면적을 갖는 X0HC Millistak+® Pod 일회용 심층 필터(MILLIPORE)가 각 피드에 대해 사용되었다. 심층 필터는 연동펌프 및 인-라인 압력 센서를 구비하였다. 상기 필터는 제조사의 지시에 따라서 탈이온수에 의해 세정한 다음 피드를 100 LMH로 펌핑하고 또 여액을 수집하였다. 33%-BnPAA 중합체 처리된 피드 여액에 대한 수집된 탁도는 6 NTU이었고 또 미처리 피드 여액에 대한 수집된 탁도는 9 NTU 이었다. 33% BnPAA 중합체 처리된 피드에 대한 필터 처리량은 10 psi에서 1304 L/m2 이었고, 이때, 실험은 피드 제한으로 인하여 중지되었다. 미처리 피드에 대한 필터 처리량은 206 L/m2 이었고, 이때 상기 실험은 압력 제한으로 인하여 중지되었다.
실시예 44: 자극 반응성 중합체에 의한 모델 단백질 스트림의 정제에 이어 친화성 수지를 사용한 포획
후속 정제 단계에 대한 자극 반응성 중합체의 효과를 더욱 잘 평가하도록, 모델 피드를 다음 과정에 따라서 제조하였다. CHO 세포 배양액은 실시예 1과 유사한 방법을 사용하여 제조하였다. 초기 피드 HCP 수준은 ~ 210,000ppm이었다. 소수성 변형된 폴리알릴아민 기제 자극 반응성(33%-BnPAA) 중합체의 양은 실시예 36과 유사하게 제조하였다. CHO 세포 배양액의 1개 분획은 0.1%의 자극 반응성 중합체 33%-BnPAA와 처리시켰고, 한편 CHO 세포 배양액의 다른 분획은 0.4%의 자극 반응성 중합체 33%-BnPAA와 처리하였고, 또 CHO 세포 배양액의 제3 분획은 처리하지 않았다. 자극 반응성 중합체 처리된 세포 배양액에, 2몰 인산나트륨을 적가하는 것에 의해 인산나트륨 농도를 5O mM로 만들었고, 또 2몰 트리스 염기를 적가하는 것에 의해 pH를 7.2로 조절하였다. 인산나트륨 및 pH 조절은 자극 반응성 중합체 및 세포, 세포 파편, 불순물, 잔류 중합체의 복합체를 석출시키고 또 고체를 응집시키며 또 입자 크기를 증가시키기 위하여 실시하였다. 인산나트륨 부가 및 pH 조절 후 대형 입자 집단이 자극 반응성 중합체 처리된 피드에서 관찰되었다. 세포 배양액의 각 분획을 심험실 규모 버켓 원심분리기에서 3000 RPM으로 5분간 원심분리하였다. 각 농축물의 탁도를 기록하고 표 11에 보고하였다. 농축물은 0.2㎛ Durapore® 필터로 여과하였다.
여액 풀(pool)은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (ProSep Ultra Plus®), 결합-및-용출 양이온 교환 크로마토그래피(ProRes S®), 및 막 흡착제 음이온 교환 크로마토그래피 플로우-쓰루 모드(flow-though mode) (ChromaSorb ®)로 이루어진 3단계 크로마토그래피를 기본한 정제를 통하여 정제하였다. 정제는 표 12에 기재된 방법에 따라 크로마토그래피 작업으로 실시하였다. 각 단계에 대한 풀은 ELISA에 의한 숙주 세포 단백질(CHOP)에 대해 분석하였고, 여과된 단백질 A(L ProA)는 ELISA에 의해 분석하며, 잔류 DNA는 PicoGreen ® 에세이에 의해 분석하며, 탁도 , 응집된 단백질(AGG) %는 크기배제 HPLC에 의해 분석하였고, 또 단백질 농도는 UV 흡수에 의해 분석하였다.
Figure 112014118126727-pat00019
Figure 112014118126727-pat00020
Figure 112014118126727-pat00021
실시예 45: 자극 반응성 중합체에 이어 양이온 교환 수지에 의한 포획을 이 용한 모델 단백질 스트림의 정제
후속 정제 단계에 대한 자극 반응성 중합체의 효과를 더욱 잘 평가하기 위하여, 하기 과정을 실시하였다. PTG1 항체를 발현하는 DG44 중국 햄스터 난소(CHO)를 10L 바이오리액터(New Brunswick Scientific)에서 약 15x106 세포/mL 밀도로 성장시키고 또 HCP 수준 ~142000 ppm 수준으로 <50% 생존율로 수집하였다.
소수성 변형된 폴리알릴아민 기제 자극 반응성(33%-BnPAA) 중합체 용액은 실시예 #36과 유사하게 제조하였다. CHO 세포 배양액의 1개 분획은 0.1% 자극 반응성 중합체 33%-BnPAA에 의해 처리하였고, CHO 세포 배양액의 다른 분획은 0.4% 자극 반응성 중합체 33%-BnPAA에 의해 처리하였으며, 또 CHO 세포 배양액의 세번째 분획은 처리하지 않았다. 자극 반응성 중합체 처리된 세포 배양액에, 2몰 인산나트륨을 적가하는 것에 의해 인산나트륨 농도를 50 mM로 만들고 또 pH는 2몰 트리스 염기를 적가하는 것에 의해 7.2로 조절하였다. 인산나트륨 및 pH 조절은 자극 반응성 중합체, 및 세포, 세포 파편, 불순물, 잔류 중합체의 복합체를 석출하고, 또 고체를 응집시켜 입자 크기를 증가시키기 위하여 실시하였다. 인산나트륨 부가 및 pH 조절 후, 자극 반응성 중합체 처리된 피드에서 대형 응집 입자가 관찰되었다. 상기 세포 배양액의 각 분획을 실험실 규모의 버켓 원심분리기 중, 3000 RPM에서 5분간 원심분리하였다. 각 농축물의 탁도를 기록하고 또 표 13에 보고하였다. 농축물은 0.2 ㎛ Durapore® 필터를 통하여 여과하였다.
여액 풀(pool)은 결합-및-용출 양이온 교환 크로마토그래피(ProRes S®), 및 막 흡착제 음이온 교환 크로마토그래피 플로우-쓰루 모드(flow-though mode) (ChromaSorb ®)로 이루어진 2단계 크로마토그래피를 기본한 정제를 통하여 정제하였다. 정제는 표 12에 기재된 방법에 따라 크로마토그래피 작업으로 실시하였다. 각 단계에 대한 풀은 숙주 세포 단백질(CHOP)은 ELISA에 의해 분석하였고, 여과된 단백질 A(L ProA)는 ELISA에 의해 분석하며, 잔류 DNA는 PicoGreen ® 에세이에 의해 분석하며, 탁도, 응집된 단백질(AGG) %는 크기배제 HPLC에 의해 분석하였고, 또 단백질 농도는 UV 흡수에 의해 분석하였다.
Figure 112014118126727-pat00022
실시예 46: 인산 2- 히드록시에틸메타크릴레이트(PAHEMA)에 의해 변형된 폴리 에틸렌 막 표면
다른 실험으로서, 막을 다가 이온 자극을 혼입하도록 변형시키며, 이때 상기 막은 잔류 자극 반응성 중합체의 제거를 위해 사용될 수 있다.
PAHEMA의 16% 수성 혼합물은 다음 성분 16g의 PAHEMA (Aldrich #695890, 75% PAHEMA 및 25% BisHEMPA), 0.2 g의 Irgacure 2959, 93.8 g의 물에 따라 제조하였다. 폴리에틸렌 막(0.65㎛, UPDP MILLIPORE)은 메탄올로 미리습윤(prewetted)시키고 또 물로 교환하고 PAHEMA 제제에 의해 처리하였다. 이 샘플을 UV 광에 노출시키고, 메탄올 및 물에 의해 세척하며, 또 건조시켰다. 이 막 변형에 의해 막에 부가된 중량은 4.4%이었다. 막의 적외선 스펙트럼은 강한 메타크릴레이트 카보닐 흡수를 나타내었다. 상기 막을 메틸렌 블루(양으로 하전된 염료)에 의해 염색하면 시안 광학 밀도 1.43을 갖는 진한 청색을 나타내었다.
실시예 47: 인산 2- 히드록시에틸메타크릴레이트(PAHEMA)에 의해 변형된 친수 성 폴리에틸렌 막 표면
PAHEMA의 16% 수성 혼합물은 다음 성분 16g의 PAHEMA (Aldrich #695890, 75% PAHEMA 및 25% BisHEMPA), 0.2 g의 Irgacure 2959, 93.8 g의 물에 따라 제조하였다. 친수성 막(0.65㎛, MPLC MILLIPORE)은 PAHEMA 용액과 직접 접촉시켰다. 상기와 같은 UV 노출 및 세척으로 7.6%가 부가된 막을 얻었다. 이 막의 적외선 스펙트럼은 강한 메타크릴레이트 카보닐 흡수를 나타내었다. 상기 막을 메틸렌 블루(양으로 하전된 염료)로 염색하면 시안 광학 밀도 1.45의 진한 청색을 나타내었다.
실시예 48: 인산 히드록시에틸메타크릴레이트(PAHEMA)에 의해 변형된 친수성 폴리메타크릴레이트 수지
다른 실험으로서, 자극을 포함하도록 수지를 변형시키며, 이때 변형된 수지는 잔류 중합체를 제거하기 위해 사용될 수 있었다.
용액은 다음 조성으로 제조하였다: 60 ml 알릴 글리시딜 에테르(AGE), 11Og 4M NaOH, 12g 소듐 설페이트. 이 용액에 60mL의 ToyoPearl65C 배지를 부가하고 또 이 혼합물을 회전 혼성화기(hybridizer) 중, 50℃에서 16시간 동안 두었다. 배지를 분리하고 또 표준 과정에 의해 세척하였다. PAHEMA 그라프팅(grafting) 용액은 다음과 같이 제조하였다: 1.Og PAHEMA, 0.06g 암모늄 퍼설페이트, 9.0g 물. 이 용액에 5mL의 AGE 변형된 ToyoPearl 배지를 부가하였다. 이 혼합물을 혼성화기 중, 80℃에서 16시간 동안 두었다. 표준 과정에 의한 분리 및 세척으로 PAHEMA 변형된 수지를 얻었다. 이 생성물은 양으로 하전된 염료인 메틸렌 블루의 0.01% 수용액으로 처리되면 진한 청색으로 염색되었다.
실시예 49: 인산 2- 히드록시에틸메타크릴레이트(PAHEMA)에 의해 변형된 친수 성 폴리에틸렌 막 표면과 자극 반응성 중합체 결합
PAHEMA 변형된 MPLC 막(실시예 47)은 하기 실험 과정을 이용하여 100, 10, 및 1 ppm PAA를 각각 함유하는 3개 용액으로부터 폴리알릴아민(PAA) 중합체를 포획하기 위하여 사용하였다. 막 디스크 20mm는 15cc 셀 홀더 직경으로 가공하였다. PAA 용액은 1.5cc/sec로 가공하였다. 상기 막을 세포 홀더 내외에서 lOOmL PBS 완충액에 의해 세척하였다. 가공된 막은 폰세아우 에스(Ponceau S)에 의해 염색시켰다.
폰세아우 에스는 양으로 하전된 표면에 강하게 흡착하는 음으로 하전된 염료이다. PAA가 PAHEMA 변형된 막에 흡수되면, 그 표면은 음전하에서 양전하로 전환된다. 이러한 전환은 상기 가공된 용액을 폰세아우 에스에 의해 염색하는 것에 의해 용이하게 관찰할 수 있다. 폰세아우 에스에 의한 양호한 염색 정도는 맥베쓰 밀도계(Macbeth Densitometer)를 이용하여 측정된 바와 같은 마젠타 광학 밀도이다. 막의 상류 및 하류측 모두에서 다양한 가공된 막(즉, PAA가 로딩된)에 대한 마젠타 광학 밀도는 표 14에 나타낸다.
1 ppm 경우에서 볼 수 있는 바와 같이, PAA 전부는 막의 상류측에서 포획된다. 15mL의 가공 용액의 경우, 이것은 4.8 마이크로그램 PAA/cm2 막 표면에 상응한다.
Figure 112014118126727-pat00023
따라서, 이 실시예로부터 얻은 결과를 기초로 하여, 본 명세서에 기재된 변형된 막 및 수지는 잔류 중합체의 수준을 감소시키거나 또는 잔류 중합체를 완전히 제거하기 위하여 사용될 수 있다고 결론지을 수 있다.
본 명세서는 본 명세서에 참조에 의해 본 명세서에 포함된 인용 문헌으로부터 가장 완전히 이해된다. 본 명세서 내부의 실시양태는 본 발명에서 실시양태의 설명을 제공하며 그의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다. 당업자는 다수의 다른 실시양태가 본 발명에 포함되는 것을 숙지하고 있을 것이다. 모든 공개문헌 및 발명은 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함되다. 본 명세서의 내용과 모순되거나 또는 일치하지 않는 참조에 의해 포함된 물질의 정도는, 본 명세서가 그러한 물질을 대체할 것이다. 본 명세서에 참고문헌의 인용은 그러한 문헌이 본 발명의 종래 기술이라고 인정하는 것은 아니다.
다르게 나타내지 않는 한, 청구범위를 비롯한 본 명세서에서 사용된 성분, 세포 배양액, 처리 조건 등의 양을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에서 용어 "약"에 의해 어느 정도 변형될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 다르게 정의하지 않는 한, 숫자 변수는 대략적이며 본 발명이 추구하려는 소망하는 특성에 따라서 다양하게 달라질 수 있다. 다르게 나타내지 않는 한, 일련의 요소 앞에 나타나는 용어 "적어도"는 이러한 일련의 매 요소를 지칭하는 것으로 이해된다. 당업자들은 통상의 실험 이외의 것, 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 다수의 등가물의 이용을 주지하고 있거나 숙지하고 있어야 한다. 이러한 등가물은 이하의 특허청구범위에 포함되는 것으로 이해된다.
본 발명의 다수의 변형 및 변이는, 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않고 실시될 수 있다. 본 명세서에 기재된 특정 실시양태는 실시예에 의해서만 제공되며 어떠한 의미로든 제한을 의미하지 않는다. 본 명세서 및 실시예는 예시적인 것으로만 제시된 것이며, 본 발명의 진정한 범위와 정신은 이하의 특허청구범위에 의해 나타냄을 이해해야 한다.

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  35. (a) 표적 분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 상기 샘플을 주쇄에 부착된 하나 이상의 소수성 기를 포함하는 고분자전해질 주쇄를 포함하는 가용성 다가 이온 반응성 중합체와 접촉시켜 중합체와 하나 이상의 불순물의 복합체를 형성하는 단계, 이때 다가 이온은 중합체 부가하는 동안 또는 후에 부가됨;
    (c) 상기 복합체를 용액 밖으로 석출시켜 하나 이상의 불순물로부터 표적 분자를 분리하는 단계;
    를 포함하는, 샘플 중에서 하나 이상의 불순물로부터 표적 분자를 분리하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 다가 이온이 포스페이트 또는 시트레이트인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 가용성 다가 이온 반응성 중합체가 공중합체인 방법.
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