JPH07318551A - クロマトグラフィ−方法及び該方法に使用するクロマトグラフィ−用充填剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】水系で生体要素（タンパク質、ＤＮＡ、糖脂質
等）及び細胞を固体表面との相互作用を外的信号（例え
ば温度）によって制御し、分離あるいは精製することが
できるクロマトグラフィ−用充填剤を使用したクロマト
グラフィ−方法提供することを目的とする。 【構成】移動相を水系に固定したままで、固定相表面の
親水性／疎水性のバランスを外的信号によって変化させ
ることが可能である充填剤を用いて溶質の分離を行うこ
とを特徴とするクロマトグラフィ−方法であり、具体的
には、アミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基等を表
面に持つ担体表面を、末端にアミノ基、カルボキシル
基、或いは水酸基等を有するポリアルキルアクリルアミ
ド或いはその共重合体で化学修飾したクロマトグラフィ
−用充填剤を用いたクロマトグラフィ−方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は水系で、生体要素（タン
パク質、ＤＮＡ、糖脂質等）及び細胞を固体表面と細胞
膜との相互作用を外的信号（例えば温度）によって制御
することが可能であるクロマトグラフィ−用充填剤を利
用して分離或いは精製することができるクロマトグラフ
ィ−方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬ
Ｃ）は移動相液体と固定相の組合せが多種多様であり、
試料に応じて種々選択できるので近年種々の物質の分
離、精製に利用されている。しかして、従来使用されて
いるクロマトグラフィ−では固定相の表面構造は変化さ
せずに、移動相中に含まれている溶質と固定相表面との
相互作用を移動相の溶媒を変化させることによって行わ
れている。例えば、多くの分野で使用されているＨＰＬ
Ｃにおいては、固定相としてシリカゲル等の担体を用い
た順相系のカラムではヘキサン、アセトニトリル、クロ
ロホルムなどの有機溶媒を移動相として使用しており、
また水系で分離されるシリカゲル誘導体を担体として用
いた逆相系のカラムではメタノ−ル、アセトニトリルな
どの有機溶媒が使用されている。

【０００３】また、陰イオン交換体あるいは陽イオン交
換体を固定相とするイオン交換クロマトグラフィ−では
外的イオン濃度あるいは種類を変化させて物質分離を行
っている。近年遺伝子工学等の急速な進歩により、生理
活性ペプチド、タンパク質、ＤＮＡなどが医薬品を含む
様々な分野に広範囲にその利用が期待され、その分離・
精製は極めて重要な課題となっている。特に、生理活性
物質をその活性を損なうことなく分離・精製する技術の
必要性が増大している。

【０００４】しかし、従来の移動相に用いられている有
機溶媒、酸、アルカリ、界面活性剤は生理活性物質の活
性を損なうと同時に夾雑物となるために、そのシステム
の改良が期待されている。また、このような物質の環境
汚染の回避という面からもこれらの物質を用いない分離
・精製システムが必要となっている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者ら
は、上記の要望を満足すべく種々検討した結果、固定相
の表面構造を、例えば温度などの外的条件を変化させる
ことによって、移動相を変化させることなく溶質と固定
相表面との相互作用を変化させることにより分離・精製
する技術を開発し、本発明を完成したもので、本発明の
目的は、外的条件を変化させることによって固定相の表
面特性を可逆的に変化させ、これによって単一の水系移
動相によって分離、精製可能なクロマトグラフィ−方法
及び該クロマトグラフィ−に使用する固定相としての充
填剤を提供する。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、移動相
を水系に固定したままで、固定相表面の親水性／疎水性
のバランスを外的信号によって変化させることが可能で
ある充填剤を用いて溶質の分離を行うことを特徴とする
クロマトグラフィ−方法であり、具体的には、アミノ
基、カルボキシル基、或いは水酸基等を表面に持つ担体
表面を、末端にアミノ基、カルボキシル基、或いは水酸
基等を有するポリアルキルアクリルアミド或いはその共
重合体で化学修飾したクロマトグラフィ−用充填剤を用
いたクロマトグラフィ−方法である。即ち、本発明を用
いることにより、外部温度を臨界温度以上にすることに
よってタンパク質や細胞などの生体要素を疎水性表面に
吸着させ、温度を低下させることにより、これを分離又
は剥離することが可能となる。従って、この際、有機溶
媒、酸、アルカリ、界面活性剤等の薬剤を全く用いない
ので、これらが夾雑物質となることを防ぎ、また、タン
パク質や細胞などの機能を維持したままでの分析と同じ
に分離にも利用することができる。

【０００７】従来のクロマトグラフィ−法では１種類の
移動相で種々の化合物が混じっている試料特に極性の大
きく異なる複数の試料を分離・分析する場合、分離が困
難であり、分離に要する時間が大変長くなってしまう。
そのため、このような試料を扱う際には有機溶媒の量や
種類を時間と共に連続的に変化させる溶媒グラディエン
ト法或いは段階的に変化させるステップグラディエント
法により分離を行っているが、本発明による温度グラデ
ィエント法或いはステップグラディエント法では有機溶
媒を使用する代わりに単一の移動相でカラム温度を連続
的或いは段階的に変化させることにより同様の分離を達
成することが可能であり、この方法を採用することによ
って、上述の夾雑物の混入を防止し、タンパク質や細胞
などの機能を維持したままで分離できると共に所望の成
分を温度をコントロ−ルすることによって短時間で分離
が可能なのである。

【０００８】本発明において使用するクロマトグラフィ
−用充填剤は、その表面に温度応答性高分子を導入し、
これによって充填剤表面の親水性／疎水性のバランス
が、例えば温度変化によって変化することが可能な充填
剤である。即ち、担体表面を温度応答性高分子である、
例えば末端にアミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基
等を有するポリアルキルアクリルアミド或いはその共重
合体で化学修飾した充填剤である。この化学修飾した充
填剤としては、例えば、表面にアミノ基、カルボキシル
基、或いは水酸基等の官能基を有するシリカ担体に前記
のポリアルキルアクリルアミド或いはその共重合体を化
学修飾したものである。そして、アミノ基、カルボキシ
ル基、或いは水酸基等の官能基を有するシリカ担体とし
ては、具体的にアミノプロピルシリカゲル、アミノセフ
ァデックス、アミノガラス、イオン交換樹脂等を挙げる
ことができる。本発明において、ポリアルキルアクリル
アミドとしては、ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルア
ミド）、ポリジエチルアクリルアミド又はポリアクリロ
イルピロリジンの何れか一種が好ましい。従って、本願
発明において使用する好ましいポリアルキルアクリルア
ミド及びその共重合体の構造式を示すと次の通りであ
る。

【０００９】

【化１】

【００１０】

【化２】

【００１１】ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）
は３２℃に下限臨界温度を有するので、該分子で化学修
飾した担体はこの臨界温度で親水／疎水に表面物性が変
化するため、これをクロマトグラフィ−の充填剤の表面
にグラフトもしくはコ−ティングして使用した場合、試
料に対する保持力が温度によって変化するため溶離液の
組成を変化させずに保持挙動を温度によってコントロ−
ルすることが可能となる。下限臨界温度を３２℃以上に
するためには、イソプロピルアクリルアミドよりも親水
性のモノマ−であるアクリルアミド、メタアクリル酸、
アクリル酸、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリド
ンなどをイソプロピルアクリルアミドと共重合させるこ
とによって調整することが可能である。また、下限臨界
温度を３２℃以下にしたいときは、疎水性モノマ−であ
るスチレン、アルキルメタクリレ−ト、アルキルアクリ
レ−トなどとの共重合によって調整することができる。

【００１２】また、ポリジエチルアクリルアミドの下限
臨界温度は、約３０℃〜３２℃であり、この温度を境と
して親水／疎水に表面物性が変化し、前述のポリ−（Ｎ
−イソプロピルアクリルアミド）の場合と同様に、試料
に対する保持力が温度によって調整することができる。
本発明で利用される新規なクロマトグラフィ−用担体
は、化学修飾或いは高分子のコ−ティングによって作成
される。化学修飾手段としては表面グラフト法とラジカ
ル重合の２つの方法を用いることができる。またコ−テ
ィング方法としては、適用温度範囲内で不溶とした後、
不溶なものコ−ティングする。これらを図示すると、図
１の通りである。本発明のクロマトグラフィ−担体の製
造方法の具体的手段の一例として次の化学式を参照して
述べる。

【００１３】

【化３】

【００１４】Ｎ−イソプロピルアクリルアミドモノマ−
（１）、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）
（ＡＩＢＮと略記）、３−メルカプトプロピオン酸（Ｍ
ＰＡと略記）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶媒に溶
かし、液体窒素を用いて凍結脱気をした後、７０±１℃
においてテロメリゼ−ションによって重合した。これを
濃縮し、ジエチルエ−テルによって沈澱させ片末端にカ
ルボキシル基を持ったポリ（Ｎ−イソプロピルアクリル
アミド）（２）を得る。粗生成物は溶解再沈法で精製す
る。これをシリカゲルをいれたデシケ−タ−中に入れ、
常温減圧下にて乾燥する。これを乾燥酢酸エチルに溶解
し、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣと略
記）、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミドを加え室温で反応
させポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）のカルボ
キシル基を活性エステル化した後、濃縮してジエチルエ
−テル中に滴下して沈澱させる。次に常温減圧乾燥し、
活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ド）（３）を得る。これを純水に溶かしアミノ基含有担
体を加え反応してアミド結合を形成することによりポリ
（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を担体にグラフ
ト、コ−ティングしたもの（４）を得る。本発明におけ
る担体を使用して分離・精製できるものとしては生理活
性を有するタンパク質や細胞などで、具体的に牛血清ア
ルブミン、ＩｇＧ、フィブリノ−ゲン、フィブロネクチ
ン、トランスフェリン、血液凝固因子等を挙げることが
できる。

【００１５】

【実施例】次に実施例をもって、具体的に本発明を説明
する。 実施例１ （ａ）片末端にカルボキシル基を有するポリ（Ｎ−イソ
プロピルアクリルアミド）の合成法 Ｎ−イソプロピルアクリルアミド２０．０ｇ、３−メル
カプトプロピオン酸０．１９ｇ、２，２’−アゾビス
（イソブチロニトリル）０．２１ｇをそれぞれ重合管に
いれ、乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０ｍｌを加
えて溶解した。次に液体窒素下で凍結した後真空オイル
ポンプで重合管中の酸素を脱気し、減圧状態のまま重合
管をメタノ−ルに浸しＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中
の溶存酸素を取り除いた。この凍結脱気の操作を３回繰
り返し行った。脱気が完全にできたら７０±１℃のイン
キュベ−タ−で１７時間反応させた。次に、室温まで下
がったら減圧濃縮を行う乾燥ジエチルエ−テル中に滴下
させ片末端にカルボキシル基を持ったポリ（Ｎ−イソプ
ロピルアクリルアミド）を沈澱させた。この沈澱物をＰ
ＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）フィルタ−（ポ
アサイズ３．０μｍ）で濾取し、シリカゲルを入れたデ
シケ−タ−中で減圧乾燥をし、粗生成物１８．０ｇが得
られた。これを乾燥Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド３
０ｍｌに溶かした後、乾燥ジエチルエ−テル中に滴下
し、その沈澱物をテフロンフィルタ−で濾取した。これ
をデシケ−タ−中で減圧乾燥をおこない精製ポリ（Ｎ−
イソプロピルアクリルアミド）を得た。Ｎ−イソプロピ
ルアクリルアミド８．０ｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリル
アミド２．０ｇ、３−メルカプトプロピオン酸０．１８
ｇ、Ｎ，Ｎ’−アゾビスイソブチロニトリル０．１ｇを
精製したＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド５０ｍｌに溶
解し、上記と同様に脱気封管後７０±１℃で１２時間重
合した。上記と同様の再沈精製を行い、片末端にカルボ
キシル基を有するＮ−イソプロピルアクリルアミド共重
合体を得た。得られた共重合体は水溶液中で４３℃付近
で相転移を示した。合成の仕込み等に、Ｎ−イソプロピ
ルアクリルアミドモノマ−に対するＮ，Ｎ−ジメチルア
クリルアミドモノマ−の量を変化させることによって任
意の温度で相転移を示す共重合体が得られる。得られた
各ポリマ−はテトラヒドフランを溶媒としたゲル濾過ク
ロマトグラフィ−及び酸−塩基測定によりポリ（Ｎ−イ
ソプロピルアクリルアミド）が分子量１０，０００、Ｎ
−イソプロピルアクリルアミド−Ｎ，Ｎ−ジメチルアク
リルアミド共重合体が分子量８，０００であり、各分子
末端に約１個のカルボキシル基を有することを確認し
た。

【００１６】（ｂ）片末端にカルボキシル基を有するポ
リ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の活性エステル
化 精製ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を１１．
３５ｇを乾燥酢酸エチル１００ｍｌ中に溶かし、ジシク
ロヘキシルカルボジイミド１．２３ｇ及びＮ−ヒドロキ
シこはく酸イミド０．６９ｇを加えてよく攪拌しながら
０℃で２時間、室温（２０〜２５℃）で１２時間反応さ
せた。次に、副反応物であるＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシ
ル尿素をＰＴＦＥフィルタ−で濾取し、その濾液を減圧
濃縮した後乾燥ジエチルエ−テル中に滴下し沈澱したも
のをテフロンフィルタ−で濾取して、常温減圧で溶媒を
留去したものについて、活性エステル化ポリ（Ｎ−イソ
プロピルアクリルアミド）を得た。片末端カルボン酸Ｎ
−イソプロピルアクリルアミド−Ｎ，Ｎ−ジメチルアク
リルアミド共重合体も同様にして、活性エステル化し
た。

【００１７】（ｃ）活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロ
ピルアクリルアミド）とアミノ基担体との結合 活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ド）２．０ｇを純水５０ｍｌに溶かし、アミノプロピル
シリカゲル６．０ｇを加え、１２時間室温で激しく振と
うして反応させた後冷水５００ｍｌで洗浄し、再び活性
エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）
２．０ｇを純水５０ｍｌに溶かした溶液中に加え、１２
時間室温で激しく振とうした。この操作を３回繰り返
し、冷水５００ｍｌで洗浄した後、メタノ−ル１００ｍ
ｌで洗浄し、乾燥した。活性エステル化ポリ（Ｎ−イソ
プロピルアクリルアミド）３．０ｇを６ｍｌのＮ，Ｎ−
ジメチルホルミアミドに溶解し、これを表面に一級アミ
ノ基を導入したポリスチレン微粒子浮遊液１ｍｌ（直径
１．０±０．０３μｍ、原液濃度：５×１０¹¹個／ｍ
ｌ）を２４ｍｌの純水で希釈した液に１ｍｌづつ３０分
間隔で加え、ゆっくりと転倒混和した。全量を加えた
後、４℃以下で１６時間転倒混和した。反応終了後、遠
心分離による回収と冷純化による洗浄を２回繰り返した
後、ハンクス平衡塩溶液（ｐＨ７．４）を用いて希釈し
た（６×１０⁹、６×１０¹⁰／ｍｌ）。

【００１８】次に本発明の担体を用いてクロマトグラフ
ィ−を行った例を示す。 実施例２ （ａ）空カラムへの充填（湿式スラリ−充填法） ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）修飾シリカゲ
ル２．０ｇを純水１０ｍｌに懸濁し、予め空カラム
（４．６φ×１５０ｍｍ）につないであるパッカ−内に
注ぎ、直ちに蓋を締め圧力が３５０ｋｇ／ｃｍ²で２時
間、３００ｋｇ／ｃｍ²で３時間純水を送液して充填し
た。 （ｂ）本発明による充填剤を用いたクロマトグラフィ−
分離例 上記のポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）修飾シ
リカゲルを固定相としたカラムに医薬品のヒドロコルチ
ゾン（１）と酢酸ヒドロコルチゾン（２）の混合物を試
料として注入した場合の分離例を示す。ヒドロコルチゾ
ン（１）と酢酸ヒドロコルチゾン（２）とを混合した試
料を注入し、これを移動相として水を毎分１．０ｍｌの
割合で流し、紫外可視吸光度検出器（測定波長２５４ｎ
ｍ）を用いて測定した。その結果を図２に示す。図２よ
り５℃、１５℃、３０℃、５０℃と温度をあげることに
より、水のみの移動相で分離可能となったことが示され
る。図２はヒドロコルチゾン（１）と酢酸ヒドロコルチ
ゾン（２）の温変化に伴う保持時間の変化を示した。図
３−ａは、ベ−スとなるアミノプロピルシリカゲル担体
を充填剤として用いた場合であり、図３−ｂは本発明を
用いた充填剤による分離の場合である。図３における温
度の影響を明らかにするために、図４において、１ｏｇ
ｋ’と１／Ｔの関係をプロットを示す。明らかにベ−ス
のシリカゲルや従来のクロマトグラフィ−における分離
とは、全く異なった保持挙動を示している。

【００１９】（ｃ）本発明による充填剤を用いたクロマ
トグラフィ分離例２ 上記のポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）修飾
シリカゲルを固定相としたカラムにベンゼン（基準物
質）および５種のステロイド医薬品との混合物を試料と
して注入した場合の分離例を示す。カラムにベンゼン
（１）、ヒドロコルチゾン（２）、プレドニゾロン
（３）、デキサメサゾン（４）、酢酸ヒドロコルチゾン
（５）、テストステロン（６）の６種を混合した試料を
注入し、これを水を移動相として毎分１．０ｍｌの割合
で流し、紫外可視吸光度検出器（波長２５４ｎｍ）を用
いて測定した。その結果を図５に示す。図５において５
０℃では、１５分以上であったテストステロンの溶出時
間をカラム温度を５℃に変化させることにより、６分以
内に短縮することができた。このように外部温度をコン
トロ−ルすることにより自由に試料の溶出時間を変化さ
せることが可能である。また、従来のクロマトグラフィ
−では有機溶媒との混合液を移動相に用いなければ分離
できなかった試料を５℃〜５０℃の適当な温度に変化さ
せることにより水のみの移動相によって完全な分離を達
成することができた。

【００２０】（ｄ）温度応答性高分子修飾表面とリンパ
球との温度制御クロマトグラフィ− 温度応答性Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−Ｎ，Ｎ−
ジメチルアクリルアミド共重合体（ＩＰＡＡｍ−ＤＭ
Ａ，組成２０％モル）をグラフトした微粒子をハンクス
平衡塩溶液に浮遊させ、ガラスカラム（８φ×３００ｍ
ｍ）に高さ１００ｍｍ程度湿式充填した。ラット腸間膜
リンパ節由来のリンパ球浮遊液（３×１０⁸ｃｅｌｌ／
ｍｌ）とポリマ−グラフト微粒子浮遊液１ｍｌ（６×１
０¹⁰個／ｍｌ）をハンクス平衡塩溶液にて湿潤させたカ
ラム上部に積層した。このカラムを恒温槽中で４０℃に
安定させた後、以下の実験を行った。溶離液として４０
℃に保温したハンクス平衡塩溶液を用いた場合は、カラ
ム下部からの溶出液中には、リンパ球の溶出は見られな
かった。続いてカラムを恒温槽中で１０℃に安定させた
後、１０℃のハンクス平衡塩溶液を溶離液として用いた
時、リンパ球は１００％溶出した。この溶出液中の生存
率を０．２％ニグロシン溶液を用いて観察した結果、カ
ラムから脱離後にリンパ球は１００％生存していること
が確認された。

【００２１】

【発明の効果】以上のように、温度応答性高分子を担体
表面に導入した充填剤を固定相として使用することで温
度変化による固定相の表面特性の制御が可能となり、水
中及び水系によって生理活性物質や生きた細胞の分離・
回収やその間に動く相互作用の温度制御が実現され、そ
の結果、単一の水系の移動相によってタンパク質や細胞
などの生体要素の機能を維持したままで分離・回収が可
能と成るので夾雑物の混入を防止することができた。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の担体表面の説明図

【図２】ヒドロコルチゾン（１）と酢酸ヒドロコルチゾ
ン（２）の溶離に及ぼす温度影響を示す。

【図３】ヒドロコルチゾン（１）と酢酸ヒドロコルチゾ
ン（２）の温度変化に伴う保持時間の変化を示す。ａ図
は充填剤としてアミノプロピルシリカゲル、ｂ図は本発
明の充填剤である。

【図４】移動相として水を用いた場合、カラム中のヒド
ロコルチゾン（１）と酢酸ヒドロコルチゾン（２）に対
するファント ホッフプロット図を示す。ａ図は充填剤
としてアミノプロピルシリカゲル、ｂ図は本発明の充填
剤である。

【図５】ベンゼン（１）、ヒドロコルチゾン（２）、プ
レドニゾロン（３）、デキサメサゾン（４）、酢酸ヒド
ロコルチゾン（５）、テストステロン（６）の溶離に及
ぼす温度の影響を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 桜井 靖久 東京都杉並区永福３−17−６ (72)発明者 岡野 光夫 千葉県市川市国府台６−12−12

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 移動相を水系に固定したままで、固定相
   表面の親水性／疎水性のバランスを外的信号によって変
   化させることが可能である充填剤を用いて溶質の分離を
   行うことを特徴とするクロマトグラフィ−方法。
2. 【請求項２】 外的信号が温度変化である請求項１記載
   のクロマトグラフィ−方法。
3. 【請求項３】 溶質が生体要素もしくは細胞である請求
   項１記載のクロマトグラフィ−方法。
4. 【請求項４】 充填剤が、担体表面を末端にアミノ基、
   カルボキシル基、或いは水酸基等を有するポリアルキル
   アクリルアミド或いはその共重合体で化学修飾したクロ
   マトグラフィ−用充填剤である請求項１記載のクロマト
   グラフィ−方法。
5. 【請求項５】 アミノ基、カルボキシル基、或いは水酸
   基等を表面に持つ担体に、末端にアミノ基、カルボキシ
   ル基、或いは水酸基等を有するポリアルキルアクリルア
   ミド或いはその共重合体で化学修飾したクロマトグラフ
   ィ−用充填剤よりなる固定相に溶質を保持させた後、外
   部温度を段階的に変化させる温度グラディエント或いは
   温度によるステップグラディエント法により固定相表面
   の親水性／疎水性のバランスを変化させ、同一の移動相
   を通過させることによって溶質を分離することを特徴と
   するクロマトグラフィ方法。
6. 【請求項６】 移動相が水系溶媒である請求項５記載の
   クロマトグラフィ−方法。
7. 【請求項７】 担体表面に、温度応答性高分子を導入し
   たことを特徴とするクロマトグラフィ−用充填剤。
8. 【請求項８】 温度応答性高分子が末端にアミノ基、カ
   ルボキシル基、或いは水酸基等を有するポリアルキルア
   クリルアミドである請求項７記載のクロマトグラフィ−
   用充填剤。
9. 【請求項９】 ポリアルキルアクリルアミドが、ポリ−
   （Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリジエチルア
   クリルアミド又はポリアクリロイルピロイジンの何れか
   一種である請求項８記載のクロマトグラフィ−用充填
   剤。
10. 【請求項１０】 アミノ基、カルボキシル基、或いは水
    酸基等を有する担体表面にアミノ基、カルボキシル基、
    或いは水酸基等を有するポリアルキルアクリルアミド或
    いはその共重合体を化学修飾したことを特徴とするクロ
    マトグラフィ−用充填剤。