JP4422541B2 - 温度応答性液体クロマトグラフィー担体及びそれを用いた液体クロマトグラフィー法 - Google Patents
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また、本発明は、その温度応答性液体クロマトグラフィー担体を用いた液体クロマトグラフィー法を提供する。
ジメチルビニルシラノールの合成
還流管をつけた1Lの三口フラスコを窒素置換した後、氷浴中でエチルエーテル700mlを入れ、アニリン8.38g(0.09mol)、水1.48g(0.087mol)を加え攪拌した。50mlのエチルエーテルにあらかじめ溶解しておいたビニルジメチルクロロシラン10g(0.082mol)をゆっくりと滴下し、室温で15分攪拌した。反応は化6に示すとおりである。生成する塩を濾過により除去後、無水硫酸マグネシウムで脱水を行い、溶媒を減圧留去し、目的物を得た。収率は70%であった。
ビス(ジメチルビニルシロキシ)メチルシランの合成
還流管をつけた1Lの三口フラスコを窒素置換した後、氷浴中でエチルエーテル500ml、トリエチルアミン8.21g(0.081mol)を入れ、7.54g(0.074mol)のジメチルビニルシラノールを加え攪拌した。これへ、50mlのエチルエーテルに溶解したジメチルシラン4.24g(0.037mol)をゆっくりと滴下し、室温で20分間攪拌した。反応は化7に示すとおりである。生成する塩を濾過により除去後、エバポレーターで低沸点溶媒等を除去した。蒸留により、無色透明のビス(ジメチルビニルシロキシ)メチルシランを得た。収率は69%であった。沸点(bp)は65〜68℃(0.5torr)であった。
デンドリティックポリマーポリマーの合成
還流管をつけた100mlの三ロフラスコを窒素置換した後、このフラスコ中でビス(ジメチルビニルシロキシ)メチルシラン2.49g(0.01mol)を50mlのTHFに溶解した。Karstedt触媒(platinum(0)−1,3−divinyl−1,1,3,3−tetramethyldisiloxane complex 0.1M in xylene)を数滴加え、IRスペクトルで完全にSi−H基が消失するまで加熱還流し、室温まで冷却した。エバポレーターで低沸点溶媒等を除去後、アセトニトリルに生成物を滴下して無色粘性液状のポリマーを得た。収率は93%であった。ポリスチレンを標準とし、THFを展開溶媒とするGPC分量測定の結果、重量平均分子量は6000であった。
2種類のステロイドを精製水に溶解し、次の濃度を有するステロイド混合溶液10mlを調製した。調製後、混合液をPTFEフィルター(0.2μm)で濾過した。
試料A
1.ヒドロコルチゾン 0.03mg/ml
2.テストステロン 0.02mg/ml
上記充填剤(実施例1で作製したデンドリティックポリマーで化学修飾したシリカ担体)を充填したカラムに試料A20μl注入した。カラムはHPLC(高速液体クロマトグラフィー)に接続し、移動相に66.7mMリン酸緩衝液、流速1ml/min、UV(紫外可視吸光度検出器)により254nmの波長で検出を行った。カラムを恒温槽に設置し、カラム温度を変化させて分離能を比較した。40℃では、テストステロン(図1のピーク2)は保持時間11.4分を示したが、30℃では15.7分、20℃では21.3分、10℃では50.8分となった。このようにカラム温度を変化させることによって、担体表面の疎水性相互作用を変化させ、各ステロイドの保持時間を変化させることが可能であることを確認した。
3種類のステロイドを精製水に溶解し、次の濃度を有するステロイド混合溶液10mlを調製した。調製後、混合液をPTFEフィルター(0.2μm)で濾過した。
試料B
1.ヒドロコルチゾン 0.03mg/ml
2.酢酸プレドニゾロン 0.03mg/ml
3.テストステロン 0.02mg/ml
上記充填剤(実施例1で作製したデンドリティックポリマーに分子量3000のポリ−N−イソプロピルアクリルアミドをグラフト化したポリマーを化学修飾したシリカゲル担体)を充填したカラムに試料B20μl注入した。カラムはHPLC(高速液体クロマトグラフィー)に接続し、移動相に66.7mMリン酸緩衝液、流速1ml/min、UV(紫外可視吸光度検出器)により254nmの波長で検出を行った。カラムを恒温槽に設置し、カラム温度を変化させて分離能を比較した。40℃では、テストステロン(図2のピーク3)は保持時間13.1分を示したが、20℃では16.8分、10℃では24.5分となった。このようにカラム温度を変化させることによって、担体表面の疎水性相互作用を変化させ、各ステロイドの保持時間を変化させることが可能であることを確認した。
アンジオテンシンIを精製水に溶解し、次の濃度を有する溶液5mlを調製した。調製後、溶液をPTFEフィルター(0.2μm))で濾過した。
試料C
アンジオテンシンI 0.1mg/ml
実施例4で記載したカラムに試料Cを20μl注入した。カラムはHPLC(高速液体クロマトグラフィー)に接続し、移動相に66.7mMリン酸緩衝液、流速1ml/min、UV(紫外可視吸光度検出器)により220nmの波長で検出を行った。カラムを恒温槽に設置し、カラム温度を変化させて分離能を比較した。結果を図3に示す。40℃では保持時間5.3分であったが、10℃では58.1分の長い保持時間を示した。そこで、10℃で分析を開始し、5分後より2℃/minの加熱速度で15分かけて40℃迄温度を上げると、保持時間は21.1分となった。このようにカラム温度を変化させることによって、担体表面の疎水性を変化させ溶出時間を制御することも可能である。
EGFを精製水に溶解し、次の濃度を有する溶液5mlを調製した。調製後、溶液をPTFEフィルター(0.2μm))で濾過した。
試料D
EGF 0.1mg/ml
実施例4で記載したカラムに試料Dを20μl注入した。カラムはHPLC(高速液体クロマトグラフィー)に接続し、移動相に66.7mMリン酸緩衝液、流速1ml/min、UV(紫外可視吸光度検出器)により220nmの波長で検出を行った。カラムを恒温槽に設置し、カラム温度を変化させて分離能を比較した。結果を図4に示す。40℃では保持時間1.7分であったが、10℃では7.1分の長い保持時間を示した。このように、温度変化によって保持時間を変化させることが可能であることを確認した
4種類の医薬品成分を精製水に溶解し、次の濃度を有する混合溶液10mlを調製した。調製後、混合液をPTFEフィルター(0.2μm)で濾過した。
試料E
1.カフェイン 0.05mg/ml
2.イブプロフェン 0.04mg/ml
3.o−エトキシベンズアミド 0.07mg/ml
4.ブロモワレリル尿素 0.05mg/ml
実施例4で記載したカラムに試料E20μl注入した。カラムはHPLC(高速液体クロマトグラフィー)に接続し、移動相に66.7mMリン酸緩衝液、流速1ml/min、UV(紫外可視吸光度検出器)により230nmの波長で検出を行った。カラムを恒温槽に設置し、カラム温度を変化させて分離能を比較した。10℃では5.5分から8.5分の保持時間でピークが重なるが、40℃では3.2分から6.0分の保持時間で4成分の分離が可能となる。このようにカラム温度を変化させることによって、各物質の保持時間を変化させることが可能であり、温度制御のみで分離の最適化が可能であることを確認した。結果を図5に示す。
抗てんかん薬であるプリミドンとカルバマゼピンを精製水に溶解し、次の濃度を有する混合溶液10mlを調製した。調製後、混合液をPTFEフィルター(0.2μm)で濾過した。
試料F
1.プリミドン 0.01mg/ml
2.カルバマゼピン 0.01mg/ml
実施例4で記載したカラムに試料F20μl注入した。カラムはHPLC(高速液体クロマトグラフィー)に接続し、移動相に66.7mMリン酸緩衝液、流速1ml/min、UV(紫外可視吸光度検出器)により220nmの波長で検出を行った。結果を図6に示す。カラムを恒温槽に設置し、カラム温度を変化させて分離能を比較した。40℃では、カルバマゼピン(図6のピーク2)は保持時間9.5分を示したが、10℃では16.2分となった。カラム温度を変化させることによって、抗てんかん薬の保持時間を変化させることが可能であることを確認した。
分子量の異なる7種類の多糖類高分子を精製水に溶解し、次の濃度を有する溶液を各10ml調製した。調製後、混合液をPTFEフィルター(0.2μm)で濾過した。
試料G
Shodex Standard P−82(昭光通商製)
P−400 Mw404,000 Mw/Mn 1.13 2mg/ml
P−200 Mw212,000 Mw/Mn 1.13 2mg/ml
P−100 Mw112,000 Mw/Mn 1.12 2mg/ml
P−50 Mw 47,300 Mw/Mn 1.06 2mg/ml
P−20 Mw 22,800 Mw/Mn 1.07 2mg/ml
P−10 Mw 11,800 Mw/Mn 1.10 2mg/ml
P−5 Mw 5,900 Mw/Mn 1.07 2mg/ml
実施例4で記載したカラムに試料G20μl注入した。カラムはHPLC(高速液体クロマトグラフィー)に接続し、移動相に66.7mMリン酸緩衝液、流速0.5ml/min、RI(示差屈折計検出器)により検出を行った。分離は10℃で行った。シリカビーズは120Å、5μmを使用した。T0=2.0ml(H2O)。得られた結果を図7に示す。これより排除限界分子量は10万程度であると思われる。
Claims (14)
- シロキサン骨格のデンドリティックポリマー、或いはそれに別のポリマーがグラフト化されたポリマーが担体表面に薄層状に固定化されていることを特徴とする温度応答性液体クロマトグラフィー担体。
- デンドリティックポリマーが、ビス(ジメチルビニルシロキサン)メチルシラン、トリス(ジメチルビニルシロキサン)シラン、ビス(ジメチルアリルシロキサン)メチルシラン、トリス(ジメチルアリルシロキサン)シランを単独、もしくは2種以上を混合して重合したものである、請求項1記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体。
- 別のポリマーが温度応答性を有するポリマー、親水性ポリマーのいずれか一つ、もしくは双方からなる、請求項1、2いずれか1項記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体。
- 温度応答性を有するポリマーが、ポリ−N−置換アクリルアミド誘導体、ポリ−N−置換メタアクリルアミド誘導体、これらの共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物のいずれか一つ、もしくは二つ以上からなる、請求項3記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体。
- 温度応答性を有するポリマーがポリ−N−イソプロピルアクリルアミドである、請求項3、4いずれか1項記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体。
- 親水性ポリマーがポリアクリルアミド、ポリ−N、N−ジエチルアクリルアミド、ポリ−N、N−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシドのいずれか一つ、もしくは二つ以上からなる、請求項3記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体。
- ポリマーの炭素原子濃度が0.5〜45%である、請求項1〜6いずれか1項記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体。
- 基材上へのポリマーの被覆量が0.05〜8.0mg/m2である、請求項1〜7いずれか1項記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体。
- 請求項1〜8記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体を用いた液体クロマトグラフィー法。
- 担体表面の特性が変わる温度を挟むようにして温度変化させながら溶質の分離を行うことを特徴とする請求項9記載の液体クロマトグラフィー法。
- 請求項1〜8記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体に溶質を吸着させ、その後、温度を変えて担体表面の特性を変化させることで吸着した溶質を遊離させることを特徴とする請求項10記載の液体クロマトグラフィー法。
- 請求項1〜8記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体を用い、担体表面の特性が変わる温度を挟むようにしてカラム入口端温度とカラム出口端温度を設定し、カラム内は入口端から出口端まで温度勾配をつけることで溶質の分離を行うことを特徴とする請求項9記載の液体クロマトグラフィー法。
- 移動相が水系である、請求項9〜12いずれか1項記載の液体クロマトグラフィー法。
- 医薬品、及びその代謝物、農薬、ペプチド、蛋白質を分離することを特徴とする請求項9〜13記載の液体クロマトグラフィー法。
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