JP4950469B2 - 温度応答性クロマトグラフィー担体、製造方法及びそれを用いた温度応答性クロマトグラフィー法 - Google Patents
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また、本発明は、基材表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定化し、その開始剤から触媒下で原子移動ラジカル法により0〜80℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを成長反応させることを特徴とした上記温度応答性クロマトグラフィー担体の製造方法を提供する。
さらに、本発明はその温度応答性クロマトグラフィー担体を用いた温度応答性クロマトグラフィー法を提供する。
N−イソプロピルアクリルアミド20.0g、3−メルカプトプロピオン酸0.09g、2,2’−アゾビス(イソブチロニトリル)0.21gをそれぞれ重合管にいれ、乾燥N,N−ジメチルホルムアミド50mlを加えて溶解した。次に液体窒素下で凍結した後真空オイルポンプで重合管中の酸素を脱気し、減圧状態のまま重合管をメタノールに浸しN,N−ジメチルホルムアミド中の溶存酸素を取り除いた。この凍結脱気の操作を3回繰り返し行った。脱気が完全にできたら70±1℃のインキュベーターで20時間反応させた。次に、室温まで下がったら減圧濃縮を行う乾燥ジエチルエーテル中に滴下させ片末端にカルボキシル基を持ったポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)を沈殿させた。この沈殿物をPTFE(ポリテトラフルオロエチレン)フィルター(ポアサイズ3.0μm)で濾取し、シリカゲルを入れたデシケーター中で減圧乾燥をし、粗生成物19.0gが得られた。これを乾燥N,N’−ジメチルホルムアミド30mlに溶かした後、乾燥ジエチルエーテル中に滴下し、その沈殿物をテフロンフィルターで濾取した。これをデシケーター中で減圧乾燥をおこない精製ポリ(N−イソプルピルアクリルアミド)を得た。得られたポリマーはテトラヒドロフランを溶媒としたゲル濾過クロマトグラフィー及び酸−塩基測定によりポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)が分子量15,000であり、分子末端に約1個のカルボキシル基を有することを確認した。
精製ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)を11.35gを乾燥酢酸エチル100ml中に溶かし、ジシクロヘキシルカルボジイミド1.23g及びN−ヒドロキシこはく酸イミド0.69gを加えてよく攪拌しながら0℃で2時間、室温(20〜25℃)で12時間反応させた。次に副生成物であるN,N’−ジシクロヘキシル尿素をPTFEフィルターで濾取し、その濾液を減圧濃縮した後乾燥ジエチルエーテル中に滴下し沈殿したものをテフロンフィルターで濾取して、常温減圧で溶媒を留去したものについて、活性エステル化ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)を得た。
活性エステル化ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)2.0gを純水50mlに溶かし、アミノプロピルシリカゲル6.0gを加え、12時間室温で激しく振とうして反応させた後冷水500mlで洗浄し、再び活性エステル化ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)2.0gを純水50mlに溶かした溶液中に加え、12時間室温で激しく振とうした。この操作を3回繰り返し、冷水500mlで洗浄した後、メタノール100mlで洗浄し、乾燥した。活性エステル化ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)3.0gを6mlのN,N−ジメチルホルムアミドに溶解し、これを表面に一級アミノ基を導入したポリスチレン微粒子浮遊液1ml(直径1.0±0.03μm、原液濃度:5×1011個/ml)を24mlの純水で希釈した液に1mlづつ30分間隔で加え、ゆっくりと転倒混和した。全量を加えた後、4℃以下で16時間転倒混和した。反応終了後、遠心分離による回収と冷純化による洗浄を2回繰り返した後、ハンクス平衡塩溶液(pH7.4)を用いて希釈した(6×109、6×1010/ml)。得られた担体のポリマー固定化量は0.78mg/m2であった。本発明の方法がポリマーの高密度固定化に有用であることが分かった。
Claims (16)
- 基材を形成させた後に基材表面に固定化された原子移動ラジカル重合開始剤を起点に、0〜80℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーが0.08分子鎖/nm2以上の割合で高密度に固定化された担体であり、基材表面の当該ポリマーの固定化量が1.0〜10.0mg/m2であり、かつ当該ポリマー分子鎖が非架橋であって、さらに当該ポリマーが、ポリ−N−置換アクリルアミド誘導体またはその共重合体であることを特徴とするものであり、移動相を変化させることなく温度のみを変化させることによりクロマトグラフィー担体の固定相表面と分離対象となる特定物との間の疎水性相互作用を著しく変化させて特定物を分離させられる、ペプチドまたはタンパク質を分離するための温度応答性クロマトグラフィー担体。
- 基材表面の当該ポリマーの固定化量が1.0〜6.0mg/m 2 である、請求項1記載のクロマトグラフィー担体。
- 基材表面の当該ポリマーの固定化量が1.99〜4.05mg/m 2 である、請求項1又は2記載のクロマトグラフィー担体。
- ポリマーが、ポリマー分子鎖内に0〜80℃の温度範囲内で水和力が変化する性質が失われない範囲で親水性分子、疎水性分子、イオン性分子が含まれた共重合物である、請求項1〜3のいずれか1項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体。
- 基材形状が粒子状、平板状、管状である、請求項1〜4のいずれか1項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体。
- 基材を形成させた後に基材表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定化すること、
触媒下で原子移動ラジカル法により0〜80℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを重合開始剤から成長させる、
ことを含む、ペプチドまたはタンパク質を分離するための温度応答性クロマトグラフィー担体の製造方法であって、
前記ポリマーは、密度0.08分子鎖/nm 2 以上、固定化量1.0〜10.0mg/m 2 で基材表面に固定化され、そして
前記ポリマーが、ポリ−N−イソプロピルアクリルアミドまたはその共重合体である非架橋体である、
前記製造方法。 - ポリマーは、固定化量1.0〜6.0mg/m 2 で基材表面に固定化される、請求項6記載の製造方法。
- ポリマーは、固定化量1.99〜4.05mg/m 2 で基材表面に固定化される、請求項6又は7記載の製造方法。
- 原子移動ラジカル重合開始剤が、1−トリクロロシリル−2−(m−クロロメチルフェニル)エタンまたは1−トリクロロシリル−2−(p−クロロメチルフェニル)エタンである、請求項6〜8のいずれか1項記載の製造方法。
- 重合触媒が、ハロゲン化銅として塩化銅、リガンド錯体としてトリス(2−(ジメチルアミノ)エチル)アミンである、請求項6〜9のいずれか1項記載の製造方法。
- 基材がシリカゲル粒子、ガラス板、ガラス粒子である、請求項6〜10のいずれか1項記載の製造方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載の温度応答性クロマトグラフィー担体にペプチドまたはタンパク質を吸着させること、
温度を変えて担体表面の特性を変化させることにより、吸着したペプチドまたはタンパク質を遊離させること、
を含む、ペプチドまたはタンパク質のクロマトグラフィー法。 - 移動相が水系であって、温度応答性クロマトグラフィー担体表面の特性が変わる温度を挟むようにして温度変化させながらペプチドまたはタンパク質を分離、又は濃縮することを含む、請求項12記載のクロマトグラフィー法。
- 分離、又は濃縮する方法が、温度応答性クロマトグラフィー担体にペプチドまたはタンパク質を吸着させ、その後、温度を変えて担体表面の特性を変化させることにより、吸着したペプチドまたはタンパク質を遊離させることによって、ペプチドまたはタンパク質を分離または濃縮する、請求項12又は13記載のクロマトグラフィー法。
- 2種以上の温度応答性クロマトグラフィー担体が同一カラム内に充填された、請求項12〜14のいずれか1項記載のクロマトグラフィー法。
- 温度応答性クロマトグラフィー担体の表面の特性が変わる温度を挟むようにしてカラム入口端温度とカラム出口端温度を設定し、カラム内は入口端から出口端まで温度勾配をつけることによってペプチドまたはタンパク質の分離を行うことを特徴とする請求項12〜15のいずれか1項記載のクロマトグラフィー法。
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