JP4422542B2

JP4422542B2 - 温度応答性液体クロマトグラフィー担体製造方法

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Publication number: JP4422542B2
Application number: JP2004134822A
Authority: JP
Inventors: 大史須賀; 秀昭坂井; 雅明柿本
Original assignee: Cellseed Inc
Current assignee: Cellseed Inc
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2004-03-31
Publication date: 2010-02-24
Anticipated expiration: 2024-03-31
Also published as: JP2005292106A

Description

本発明は温度という外的信号で、医薬品、生体関連物質（タンパク質、ＤＮＡ、糖脂質等）及び細胞などの有用物を固体表面の相互作用を制御することで実施される液体クロマトグラフィー用担体の製造方法に関する。

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は移動相液体と固定相の組合せが多種多様であり、試料に応じて種々選択できるので、近年、種々の物質の分離、精製に利用されている。しかし、従来使用されているクロマトグラフィーでは固定相の表面構造は変化させずに、主に移動相中に含まれている溶質と固定相表面との相互作用を移動相の溶媒を変化させることによって行われている。例えば、多くの分野で使用されているＨＰＬＣにおいては、固定相としてシリカゲル等の担体を用いた順相系のカラムではヘキサン、アセトニトリル、クロロホルムなどの有機溶媒を移動相として使用しており、また水系で分離されるシリカゲル誘導体を担体として用いた逆相系のカラムではメタノール、アセトニトリルなどの有機溶媒が使用されている。

また、陰イオン交換体あるいは陽イオン交換体を固定相とするイオン交換クロマトグラフィーでは外的イオン濃度あるいは種類を変化させて物質分離を行っている。近年遺伝子工学等の急速な進歩により、生理活性ペプチド、タンパク質、ＤＮＡなどが医薬品を含む様々な分野に広範囲にその利用が期待され、その分離・精製は極めて重要な課題となっている。特に、生理活性物質をその活性を損なうことなく分離・精製する技術の必要性が増大している。

しかし、従来の移動相に用いられている有機溶媒、酸、アルカリ、界面活性剤は生理活性物質の活性を損なうと同時に夾雑物となるために、そのシステムの改良が期待されている。また、このような物質の環境汚染の回避という面からもこれらの物質を用いない分離・精製システムが必要となっている。

このような背景のもと、これまでに種々の検討がなされてきた。その中で特に特公平０６−１０４０６１号公報で示される技術はそれらの基盤技術にあたる。ここでは、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃であるポリマーで基材表面を被覆した細胞培養支持体上にて、細胞を上限臨界溶解温度以下又は下限臨界溶解温度以上で培養し、その後、上限臨界溶解温度以上又は下限臨界溶解温度以下にすることにより培養細胞を剥離する技術が記載されている。温度応答性ポリマーが生医学分野の細胞培養材料として初めて利用された例であるが、実は、細胞とは基材表面に付着する際、細胞は自ら接着性蛋白質を分泌しそれを介して付着する。従って、ここでの基材表面から細胞が剥離するという現象は、細胞が分泌した接着性蛋白質も基材表面から剥離することも含まれる。事実、この技術で得られた細胞を再播種したり、生体組織に移植したりするとき、この基材から剥離した細胞は基材や組織と良好に付着する。これは、剥離した細胞が培養時に分泌した接着性蛋白質をそのまま保持していることを意味している。すなわち、ここでの技術が本発明でいう温度変化で吸着した蛋白質を脱離させるという温度応答性クロマトグラフィー技術のコンセプトそのものである。

このような中、特開平０５−１３３９４７号公報ではクロマトグラフィー担体として通常使われるシリカゲルやポリマーゲルへ固定化する検討がなされた。しかしながら、実施例を見る限り、実際にその担体を使ったときの溶質の分離した結果（分離チャート）は示されておらず、この担体を用いてどのような物質を分離できるのか、また具体的な課題についても何ら示されておらず、詳細は不明であった。

一方、特開平０７−３１８５５１号公報では、シリカゲル表面に温度応答性ポリマーを固定化し、その担体を用いての実際に各種ステロイド類、さらにはリンパ球の分離例が示されている。実際にシリカゲル担体表面に固定化された温度応答性ポリマーの特性で各種ステロイド類、さらにはリンパ球を分離させられていることが明確に示されている。しかしながら、ここで例示されている分離結果を見る限り、さらに分離時の理論段数を向上させることが必要であり、このような課題を解決できるような従来技術を大きく改善した革新的な技術が望まれていた。

本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、従来技術と全く異なった発想からの新規な温度応答性液体クロマトグラフィー担体製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、驚くべくことに、シロキサン骨格のデンドリティックポリマーをクロマト担体表面に薄層状に固定化すると、ある温度を境に急激に担体表面のクロマト分離能が異なる現象を示すことを見出した。本発明ではさらにその温度変化によるクロマト機能の応答性は担体表面に結合されるポリマー組成、量によって変わること、さらにそれはシロキサン骨格を有するデンドリティックポリマーに対しグラフト化される別のポリマー組成、量によって制御できることを見出した。本発明者らは、研究開始当初、デンドリティックポリマーの持つ立体規則性、並びに分子鎖外側の高密度に存在する官能基に着目し、このものをクロマトグラフィー担体表面に固定化すれば、担体表面に高密度に官能基を設けることができ、それに上述した温度応答性ポリマーを結合させれば、従来技術の温度応答性クロマトグラフィー担体より高性能なものが得られるものと推測していた。本発明で示される技術は、従来技術からは全く予想し得なかったもので、デンドリティックポリマー構造自身の持つ立体規則性も合わされば、従来技術には全くなかった新規なクロマトグイラフィーシステムへの発展が期待される。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。

すなわち、本発明は、シロキサン骨格のデンドリティックポリマー、或いはそれに別のポリマーがグラフト化されたポリマーが担体表面に薄層状に固定化されていることを特徴とする温度応答性液体クロマトグラフィー担体の製造方法を提供する。

本発明に記載される温度応答性液体クロマトグラフィー担体製造方法により、新規な温度応答性液体クロマトグラフィー担体、及びそれを利用した分離システムが提案される。このシステムであれば、ペプチド、蛋白質も広範囲に分離させられるようになる。また、デンドリティックポリマー自身の持つ立体規則性を活用し、溶質の分子構造の違いによる分離も可能となる。

本発明者らは、上記の要望を満足すべく種々検討した結果、固定相の表面構造を、例えば温度などの外的条件を変化させることによって、移動相を変化させることなく溶質と固定相表面との相互作用を変化させることにより分離・精製する技術を開発し、本発明を完成したもので、本発明の目的は、外的条件を変化させることによって固定相の表面特性を可逆的に変化させ、これによって単一の水系移動相によって分離、精製可能なクロマトグラフィー方法及び該クロマトグラフィーに使用する固定相としての充填剤の製造方法を提供するものである。

本発明の要旨は、移動相を水系に固定したままで、固定相表面の特性を温度によって変化させることが可能である充填剤を用いて溶質の分離を行うことを特徴とするクロマトグラフィー担体の製造方法である。即ち、本発明で得られる担体を用いることにより、外部温度を臨界温度以上にすることによってペプチドやタンパク質や細胞などの生体要素を分離することが可能となる。従って、この際、有機溶媒、酸、アルカリ、界面活性剤等の薬剤を全く用いないので、これらが夾雑物質となることを防ぎ、また、タンパク質や細胞などの機能を維持したままでの分析と同じに分離にも利用することができる。

従来のクロマトグラフィー法では１種類の移動相で種々の化合物が混じっている試料特に極性の大きく異なる複数の試料を分離・分析する場合、分離が困難であり、分離に要する時間が大変長くなってしまう。そのため、このような試料を扱う際には有機溶媒の量や種類を時間と共に連続的に変化させる溶媒グラディエント法或いは段階的に変化させるステップグラディエント法により分離を行っているが、本発明で得られる温度応答性クロマトグラフィー担体を利用した温度グラディエント法或いはステップグラディエント法では有機溶媒を使用する代わりに単一の移動相でカラム温度を連続的或いは段階的に変化させることにより同様の分離を達成することが可能であり、この方法を採用することによって、上述の夾雑物の混入を防止し、タンパク質や細胞などの機能を維持したままで分離できると共に所望の成分を温度をコントロールすることによって短時間で分離が可能となる。

以下に本発明を具体的に示す。本発明はシロキサン骨格のデンドリティックポリマーに対し、それとは別のポリマーをグラフト化させ、クロマト担体表面へのポリマー固定量を制御する方法である。その際、デンドリティックポリマーだけが薄層状に固定化されていても担体表面に特性に温度応答性が発現する。その理由は、現時点では明確になっていないが、おそらくデンドリティックポリマー自身の持つ機能が、担体表面に薄層状に固定化され、デンドリティックポリマー分子鎖が束縛され大きく変化したためと考えられる。本発明では、クロマトグラフィー担体の親疎水性、デンドリティックポリマー分子鎖中の疎水性基の担体表面への露出程度、分子鎖の揺らぎ、分子鎖の分子認識能、排除限界、ガラス転移点等のいずれか一つ、もしくは二つ以上の因子が重なり合った結果と考えられるが、この理由は本発明の技術を何ら制約するものではない。

本発明で示すデンドリティックポリマーとはシロキサン骨格であれば特に制約されるものではないが、例えば再公表特許ＷＯ２００４／０７４１７７号公報で示されているものが挙げられ、具体的にはビス（ジメチルビニルシロキサン）メチルシラン、トリス（ジメチルビニルシロキサン）シラン、ビス（ジメチルアリルシロキサン）メチルシラン、トリス（ジメチルアリルシロキサン）シランを単独、もしくは２種以上を混合して重合したものでも良い。

本発明では、そのデンドリティックポリマーに別のポリマーをグラフト化するものである。その際、グラフト化されるポリマーは特に限定されるものではないが、本発明で薄層固定されたデンドリティックポリマーに温度応答性が発現していることから、グラフト化されるポリマーも同じように温度応答性ポリマーである方が好ましい。また、デンドリティックポリマーが構造上、疎水性基が密にキャッピングされたものであることから、それとは逆の親水性ポリマーがグラフト化されているものが好ましい。グラフトポリマーは温度応答性ポリマーと親水性ポリマーのいずれか一つ、もしくは双方を含んでいても良い。

本発明に用いる温度応答性ポリマーは下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を有するポリマー、上限臨界溶解温度（ＵＣＳＴ）を有するポリマーが挙げられるが、それらのホモポリマー、コポリマー、或いは混合物のいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特公平０６−１０４０６１号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体、ポリビニルアルコール部分酢化物が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。その際、分離される物質が生体物質であることから、分離が５℃〜５０℃の範囲で行われるため、温度応答性ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。

本発明に用いられる親水性ポリマーとしては、ホモポリマー、コポリマーのいずれであっても良い。例えば、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの含水ポリマーなどが挙げられるが、特に制約されるものではない。

本発明では、上述したポリマーがデンドリティックポリマーにグラフト化される。そのポリマーのグラフト重量はデンドリティックポリマー重量当たり１０〜２０００％が良く、好ましくは５０〜１５００％、さらに好ましくは８０〜５００％が良い。１０％以下であるとグラフトされたポリマーの効果が弱くなりグラフト化反応の際、効果を示さなくなる。一方、２０００％以上であると、グラフトポリマーの性質が強くなり、担体へ固定化後に担体に温度応答性が発現せず、好ましくない。

本発明で示すデンドリティックポリマーは末端がメチル基などの疎水性基でキャッピングされているものにデンドリティックポリマーとは別のポリマーがグラフト化されたものである。担体表面に薄層固定化した際に温度応答性を発現するにはポリマーの炭素原子濃度が０．５〜４５％であることが必要で、好ましくは１〜３０％であり、さらに好ましくは３〜２５％である。０．５％未満、もしくは４５％より高い濃度の場合では５℃〜５０℃の範囲内で担体表面の特性が変わらなくなり、本発明のポリマーとして好ましくない。

被覆されるポリマーの分子量は特に限定されるものではないが、１０００〜１０００００の範囲内が良く、好ましくは１５００〜８００００、さらに好ましくは２０００〜６５０００のものが良い。分子量が１０００以下であると、分子量が低すぎるため、金属酸化物に被覆させても十分な被覆量を得ることができず好ましくない。また、分子量が１０００００以上であると、今度はポリマーの分子量が高すぎるため、分子そのものがかさ高くなり被覆量もかえって減少してしまうこととなり好ましくない。

また、本発明ではグラフト化されたシロキサン骨格のデンドリティックポリマーが担体表面に薄層状に固定化する。基材上へのポリマーの被覆量が多すぎると担体表面の温度応答性は発現しなくなり、従ってポリマーの被覆量は０．０５〜８．０ｍｇ／ｍ^２の範囲が良く、好ましくは０．１〜５．０ｍｇ／ｍ^２の範囲、さらに好ましくは０．５〜３．０ｍｇ／ｍ^２の範囲が良い。０．０５ｍｇ／ｍ^２以下であると温度応答性が認められなくなり、また８．０ｍｇ／ｍ^２より高い値であっても温度応答性が認められなくなる。固定化量の測定は常法に従えば良く、例えば元素分析、ＥＳＣＡを量などが挙げられるがいずれの方法を用いても良い。

本発明では上述したポリマーをシリカゲル担体に固定化するものである。その固定化方法としては、特に制約されるものではないが、例えば５０〜８０℃のポリマー溶液中に浸漬することで固定化することができる。その際、反応液温度は特に限定されるものではなく、反応液の状態は静置させても攪拌しても良いが、担体表面に均一に固定化することを考えると後者の方が好ましい。

そのグラフトポリマーを固定化する際、反応溶媒を変えることでクロマト担体表面へのポリマー固定量をさらに厳密に制御できるようになる。これは、本発明で使用するデンドリティックポリマーが疎水性であること、一方、グラフト化されるポリマーがそれに比べて親水性であるため溶媒の種類によってはグラフトポリマーの溶解、もしくは分散状態が異なるためと考えられる。本発明ではこの現象を利用すると好都合である。そのような溶媒としては、特に制約されるわけではないが、例えば水、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノール、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、ジエチルエーテル、メチルエチルケトン等の極性溶媒、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル、ヘプタン、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、ジクロロエタン等の非極性溶媒のいずれか一つ、もしくは二つ以上の混合溶媒を利用しても良い。

本発明で示す製造方法とは上述したようなデンドリティックポリマーの持つ疎水性とグラフト化されるポリマーの持つ親水性をうまく利用するものであるが、その方法は特に制約されるものではなく、その他の方法で担体表面への固定化量を制御することでも良い。

本発明で使用する担体はクロマトグラフィー用の担体であれば特に制約されるものではないが、シロキサン骨格のデンドリティックポリマーが効率良く反応するシリカゲルが良い。その際、細孔径は特に制約されるものではないが、５０〜５０００Åが良く、好ましく１００〜１０００Å、さらに好ましくは１２０〜５００Åである。５０Å以下であると分離できる溶質の分子量のかなり低いものだけが対象となり、また５０００Å以上であると担体表面積が少なくなり分離が著しく悪くなる。

本発明で示すところの技術より、別のポリマーがグラフト化されたシロキサン骨格のデンドリティックポリマーは担体表面に強固な結合が形成される。その結合により、本発明の示す温度応答性を発現することとなる。その結合様式は共有結合であっても、或いは水素結合、疎水結合などによる吸着されたものであっても、さらにはそれらが組み合わさったものでも良く、特に限定されるものではない。

本発明で得られた温度応答性液体クロマトグラフィー担体をカラムに充填し、通常の液体クロマトグラフィー装置に取り付けて、液体クロマトグラフィーシステムとして利用される。その際、本発明の分離はカラム内に充填された担体の温度に影響される。その際、担体への温度の負荷方法は特に制約されないが、例えば担体を充填したカラムの全部、もしくは一部を所定の温度にしたアルミブロック、水浴、空気層、ジャケットなどに装着すること等が挙げられる。

その分離方法は特に限定されるものではないが、例えば、担体が充填されたカラムを一定の温度下で溶質の分離を行う方法、あらかじめ担体表面の特性が変わる温度を確認しておき、その温度を挟むようにして温度変化させながら溶質を分離する方法、得られた温度応答性液体クロマトグラフィー担体に溶質を一度吸着させ、その後、温度を変えて担体表面の特性を変化させることで吸着した溶質を遊離させる方法、２種類以上の温度応答性液体クロマトグラフィー担体を同一カラム内に充填し担体表面の特性が変わる温度を挟むようにして温度変化させながら溶質を分離する方法、温度応答性液体クロマトグラフィー担体を用い、担体表面の特性が変わる温度を挟むようにしてカラム入口端温度とカラム出口端温度を設定し、カラム内の温度を入口端から出口端まで温度勾配をつけることで溶質を分離する方法等が挙げられる。

本発明で得られた温度応答性液体クロマトグラフィー担体を利用したクロマトグラフィーは、以上に示してきたように移動層を固定したまま温度だけで溶質の分離を行えるものである。その際、移動相が１００％水系が好ましいが、本発明の場合、担体表面に固定化されているデンドリティックポリマーの特性によるため移動相の組成には特に制約されるはなく、例えば移動相に溶媒含まれていても、ｐＨを変えても、塩を含んでいても良い。その際、溶媒濃度を変え、溶媒グラジエント法を併用して本発明の担体を利用しても構わない。また、移動相が１００％有機溶媒でも構わない。

以上に示してきた本発明で得られた温度応答性液体クロマトグラフィー担体、及びそれを用いたクロマトグラフィー法を用いれば、医薬品、及びその代謝物、農薬、ペプチド、蛋白質を分離することができる。その際には、カラム内の温度を変化させるだけで簡便な操作だけで分離が達成できる。

以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。

（参考例１）
ジメチルビニルシラノールの合成
還流管をつけた１Ｌの三口フラスコを窒素置換した後、氷浴中でエチルエーテル７００ｍｌを入れ、アニリン８．３８ｇ（０．０９ｍｏｌ）、水１．４８ｇ（０．０８７ｍｏｌ）を加え攪拌した。５０ｍｌのエチルエーテルにあらかじめ溶解しておいたビニルジメチルクロロシラン１０ｇ（０．０８２ｍｏｌ）をゆっくりと滴下し、室温で１５分攪拌した。反応は化６に示すとおりである。生成する塩を濾過により除去後、無水硫酸マグネシウムで脱水を行い、溶媒を減圧留去し、目的物を得た。収率は７０％であった。

（参考例２）
ビス（ジメチルビニルシロキシ）メチルシランの合成
還流管をつけた１Ｌの三口フラスコを窒素置換した後、氷浴中でエチルエーテル５００ｍｌ、トリエチルアミン８．２１ｇ（０．０８１ｍｏｌ）を入れ、７．５４ｇ（０．０７４ｍｏｌ）のジメチルビニルシラノールを加え攪拌した。これへ、５０ｍｌのエチルエーテルに溶解したジメチルシラン４．２４ｇ（０．０３７ｍｏｌ）をゆっくりと滴下し、室温で２０分間攪拌した。反応は化７に示すとおりである。生成する塩を濾過により除去後、エバポレーターで低沸点溶媒等を除去した。蒸留により、無色透明のビス（ジメチルビニルシロキシ）メチルシランを得た。収率は６９％であった。沸点（ｂｐ）は６５〜６８℃（０．５ｔｏｒｒ）であった。

（参考例３）
デンドリティックポリマーポリマーの合成
還流管をつけた１００ｍｌの三口フラスコを窒素置換した後、このフラスコ中でビス（ジメチルビニルシロキシ）メチルシラン２．４９ｇ（０．０１ｍｏｌ）を５０ｍｌのＴＨＦに溶解した。Ｋａｒｓｔｅｄｔ触媒（ｐｌａｔｉｎｕｍ（０）−１，３−ｄｉｖｉｎｙｌ−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｄｉｓｉｌｏｘａｎｅｃｏｍｐｌｅｘ０．１Ｍｉｎｘｙｌｅｎｅ）を数滴加え、ＩＲスペクトルで完全にＳｉ−Ｈ基が消失するまで加熱還流し、室温まで冷却した。エバポレーターで低沸点溶媒等を除去後、アセトニトリルに生成物を滴下して無色粘性液状のポリマーを得た。収率は９３％であった。ポリスチレンを標準とし、ＴＨＦを展開溶媒とするＧＰＣ分量測定の結果、重量平均分子量は６０００であった。

（参考例３のデンドリティックポリマーへのポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）のグラフト化反応）
トルエン１００ｍｌにＩＰＡＡｍ１１．３ｇ（１００ｍｍｏｌ）に参考例３のデンドリティックポリマー４．９ｇ（２０ｍｍｏｌ、開始剤ＡＩＢＮ１．１ｇ（６．７ｍｍｏｌ）を加え、２４時間加熱還流した。反応後室温まで冷却し吸引濾過をおこない、これを室温で一晩減圧乾燥した。その際、開始剤量を変更することでＰＩＰＡＡｍグラフト量の異なるポリマーを得た。

（グラフトポリマーのシリカビーズへの固定化反応）
それぞれのグラフトポリマー５ｇとシリカビーズ（１２０Å、５μｍ）１０ｇをアセトン・ヘキサン混合液（１：１）２００ｍｌに加え、２４時間加熱還流した。これによりシリカ担体表面にグラフトポリマーを共有結合させた。室温まで冷却し反応液を吸引濾過した。得られた担体をアセトン１００ｍｌで十分に洗浄し、室温で一晩減圧乾燥した。得られた以下に示す担体を用い、これを充填剤として使用し、評価を行った。
担体Ａ：ＰＩＰＡＡｍグラフト化デンドリティックポリマーで結合させたシリカ担体
担体Ｂ：ＰＩＰＡＡｍグラフト化デンドリティックポリマーで結合させたシリカ担体
（担体ＡよりＰＩＰＡＡｍ固定量を５％増）
担体Ｃ：ＰＩＰＡＡｍグラフト化デンドリティックポリマーで結合させたシリカ担体
（担体ＡよりＰＩＰＡＡｍ固定量を２０％増）
担体Ｄ：デンドリティックポリマーだけを結合させたシリカ担体

２種類のステロイドを精製水に溶解し、次の濃度を有するステロイド混合溶液１０ｍｌを調製した。調製後、混合液をＰＴＦＥフィルター（０．２μｍ）で濾過した。
試料Ａ
１．ヒドロコルチゾン０．０３ｍｇ／ｍｌ
２．テストステロン０．０２ｍｇ／ｍｌ
上記担体をそれぞれ充填したカラムに試料Ａ２０μｌ注入した。カラムはＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）に接続し、移動相に６６．７ｍＭリン酸緩衝液、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、ＵＶ（紫外可視吸光度検出器）により２５４ｎｍの波長で検出を行った。カラムを恒温槽に設置し、カラム温度を４０℃でステロイドの分離を行った。得られた結果を図１に示す。担体Ａではテストステロン（図１のピーク２）は保持時間５９．６分を示したが、担体Ｂでは５４．５分、担体Ｃでは３２．９分となった。このようにＰＩＰＡＡｍ固定量を増加すると、保持時間が短くなり、ピーク形状もシャープになることを確認した。

本発明に記載される方法であれば、クロマトグラフィー担体の温度変化だけでペプチド、蛋白質も広範囲に分離させられる温度応答性液体クロマトグラフィー担体が得られる。この担体を利用したクロマトグラフィシステムは分離操作が簡便となり、分離作業の効率性が良くなる。さらに、デンドリティックポリマー自身の持つ立体規則性を活用し、溶質の分子構造の違いによる分離できる可能性もあり、本発明は医学、生物学等の分野における極めて有用な発明である。

実施例１に示すステロイドの分離をした図である。

Claims

シロキサン骨格を有するデンドリティックポリマーに対し、それとは別のポリマーをグラフト化させ、クロマト担体表面へのポリマー固定量を制御することを特徴とする温度応答性液体クロマトグラフィー担体製造方法。
デンドリティックポリマーが、ビス（ジメチルビニルシロキサン）メチルシラン、トリス（ジメルビニルシロキサン）シラン、ビス（ジメチルアリルシロキサン）メチルシラン、トリス（ジメチルアリルシロキサン）シランを単独、もしくは２種以上を混合して重合したものである、請求項１記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体製造方法。
別のポリマーが温度応答性を有するポリマー、親水性ポリマーのいずれか一つ、もしくは双方からなる、請求項１〜２いずれか１項記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体製造方法。
温度応答性を有するポリマーがポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、請求項３記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体製造方法。
グラフト化させる際の溶媒を変えることでクロマト担体表面へのポリマー固定量を制御することを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体製造方法。
溶媒がアセトン、もしくはアセトンとノルマルヘキサン混合物である、請求項５記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体製造方法。
別のポリマーのグラフト重量がデンドリティックポリマー重量当たり１０〜２０００％である、請求項１〜６いずれか１項記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体製造方法。
グラフトポリマーの炭素原子濃度が０．５〜４５％である、請求項１〜７いずれか１項記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体製造方法。
基材上へのポリマーの被覆量が０．０５〜８．０ｍｇ／ｍ ^２である、請求項１〜８いずれか１項記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体製造方法。
製造法がグラフトポリマーの溶液に基材を浸すことを特徴とする請求項１〜９いずれか１項記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体製造方法。
担体がシリカゲルである、請求項１〜１０いずれか１項記載の温度応答性液体クロマトグラフィー担体製造方法。